Como foi dito, no LQC utilizamos uma técnica de cromatografia de troca aniónica

para fazer a separação dos compostos que pretendemos determinar, sequida de

quantificação por espectrofotometria.

Para eluição cromatográfica utilizamos o kit commercial CleanEasy, que que inclui os
components necessários à análise, colunas de cromatografia e tampões de eluição
Para iniciar a análise temos que ter em atenção a intergridade do kit e a qualidade
da amostra, que tem que vir acondicionada ao abrigo da luz para evitar a degradação
dos components que pretendemos analisar e qualidade dos resultados
Para leitura fotométrica final utilizamos …..

● A cromatografia de troca aniónica é utilizada em laboratório para separar e

purificar substâncias com cargas negativas, nomeadamente proteínas,
aminoácidos e açúcares/carboidratos. Explora as diferenças nas cargas
superficiais líquidas das moléculas para separar seletivamente moléculas com
carga negativa. Esta separação é feita utilizando uma resina carregada
positivamente, sob forma de pequenas esferas ou partículas dispostas em coluna.
● O princípio da cromatografia de troca aniónica é baseado na carga superficial
líquida das proteínas, e no facto que esta carga superficial muda com o pH da
solução e é determinada pelo seu ponto isoelétrico (pI).
● O pI de uma proteína é o pH no qual ela não possui carga líquida. Abaixo do pI, a
proteína tem uma carga positiva, enquanto acima do pI, ela tem uma carga
negativa, e quanto maior a dierença de pH para o pI, maior a intensidade desta
carga.
● Portanto, conhecendo as características da substância-alvo e fazendo variar o pH
da nossa solução conseguimos separar eletivamente a substância que
pretendemos determinar no passo de eluição.

Com a utilização do kit commercial CleanEasy

fazemos a determinação de ALA e PBG em paralelo, com a eluição de cada analito
em sua coluna propria.
O proesso passa por
Pré-tratamento das colunas de preparação de amostras (incolor, azul
Acondicionamento (coluna dupla)
Aplicação da amostra (coluna dupla)
Lavagem (coluna dupla), 3x
Separação das colunas duplas (5-ALA: coluna incolor, PBG: coluna azul)
Coluna incolor (5-ALA):
Eluição
Derivatização banho de água em ebulição a 100 °C, durante 10 minutos. De
seguida, arrefeça imediatamente o tubo de ensaio até à temperatura ambiente
utilizando um banho de gelo ou água fria. Pipete 7,0 ml de reagente Ehrlich
(preparado de fresco, consulte a secção 4.2.2) para o tubo de ensaio e agite durante
5 segundos num agitador vortex. De seguida, a amostra é incubada durante 15
minutos à temperatura ambiente até o desenvolvimento completo da cor
(formação de um complexo de cor vermelha). Atenção: O tubo de ensaio para o
branco deverá ser preparado como uma amostra.
Coluna azul (PBG):
Eluição
Derivatização a amostra é incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente
até o desenvolvimento completo da cor (formação de um complexo de cor
vermelha) Atenção: O tubo de ensaio para o branco deverá ser preparado como
uma amostra.
Leitura fotométrica: As amostras são medidas em cuvetes com percurso ótico de 1
cm a 553 nm (= E553) contra o branco
A medição´das amostras é feita após o ajuste do branco e calibração com calibrador
preparado…
O cálculo do valor a reportar é efetuado …..
Os resultados são apresentados nas unidades …..