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Braslia, D F

Dezembro, 2003
22
ISSN 1516-4349
Autores
Graziella S. Figueiredo
Biologia graduanda UniCEUB,
RHAE CNPq.
Ana Cludia M. Reis
Biologia graduanda - FTB,
RHAE-CNPq.
Adauto Silva Castro
Assistente de Operaes I,
Embrapa Recursos Genticos
e Biotecnologia, Farmcia
graduando - UnB;
Tula Beck Bisol
Qumica, Assistente de
Operaes I, Embrapa
Recursos Genticos e
Biotecnologia,
Carlos Rodrigues
Borges Neto
Eng. Agr.,Dr. Produo Vegetal
Tcnico de Nvel Superior
III, Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia
Reao de Sequenciamento de DNA e
Purificao - Protocolos Otimizados
Introduo
Uma das etapas mais onerosas do servio de seqenciamento de DNA a prpria
reao de seqenciamento. Esta reao similar a uma reao de PCR, onde uma
pequena amostra de DNA amplificada milhares de vezes in vitro, porm, de forma
diferente da reao de PCR, apenas um primer utilizado para sntese das fitas, no
dequenciamento de DNA.
So adicionados na reao de seqenciamento: um tampo Save Money, (que
usado para manter o pH da soluo e ajustar a concentrao de MgCl
2
, e como o
prprio nome sugere, substitui parte dos Kits comerciais de seqenciamento que tem
alto custo no mercado aproximadamente US$ 2.000,00 o valor de um Kit para
1.000 reaes.Os fragmentos de DNA a serem amplificados, um iniciador (primer)
sentido 5-3 (forward) ou 3-5 (reverse), e um kit contendo nucleotdeos livres
(dntps), nucleotdeos marcados com fluorescncia (ddntps), e a enzima Taq
polimerase.
Durante a reao, o primer liga-se seqncia complementar e os nucleotdeos so
incorporados de acordo com a fita molde. Ocorre tanto a incorporao dos
nucleotdeos livres no marcados, quanto a dos nucleotdeos marcados com
fluorescncia. Estes nucleotdeos so chamados de nucleotdeos de terminao, por
que, cada vez que um nucleotdeo de terminao incorporado, a leitura da fita molde
interrompida, gerando um fragmento de tamanho respectivo ao local onde o
nucleotdeo de terminao foi incorporado. No final da reao so gerados fragmentos
de vrios tamanhos diferentes e tambm h sobra de primers, ddntps, alguns sais
entre outros resqucios. A purificao do DNA amplificado visa eliminar tais resduos
aumentando a qualidade das seqncias produzidas. Tais fragmentos so submetidos
eletroforese, aps a purificao, e lidos por um feixe de laser no seqenciador
automtico de DNA.
Um dos fatores que torna o servio de seqenciamento em larga escala bastante
oneroso o preo dos reagentes. Atualmente, um dos kits de reao de
seqenciamento mais utilizado o BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit com
2 Reao de Sequenciamento de DNA e Purificao - Protocolos Otimizados
8mL, que custa US$ 2000,00.
Neste trabalho, foram avaliados dois aspectos: o efeito
da reduo da concentrao do kit Big Dye
Terminator na reao de seqenciamento e o impacto
final desta reduo na qualidade das seqncias e na
reduo dos custos.
Materiais e Mtodos
Os trabalhos iniciais foram realizados utilizando-se 2uL
de BigDye num volume total de reao de 10uL. Ento,
montou-se a reao em uma placa de PCR, nas
seguintes propores: 2uL de DNA, 3uL de gua milliQ,
2uL de tampo Save Money, 1uL de primer 3,2 mM e
2uL de BigDye.
Posteriormente, testou-se uma diluio do BigDye,
utilizando-se ento 1uL por reao. As propores
utilizadas foram: 2uL de DNA, 3uL de gua milliQ, 3uL
de Save Money, 1uL de primer e 1uL de BigDye,
totalizando um volume final de 10uL.
Aps a reao em cadeia da polimerase, as placas
(PCR Optical 96 well reaction plate number N - 801
0560) so retiradas dos termocicladores, recebem
isopropanol na concentrao de 65%. So seladas com
adesivo resistente a lcool (Adhesive PCR Film N
21950), misturadas por inverso durante trs vezes, a
seguir permanecem ao abrigo da luz em temperatura
ambiente durante 15 minutos. Posteriormente so
centrifugadas por 45 minutos a 3400rpm. O excesso
de isopropanol descartado e as placas so invertidas
em papel toalha. Acrescenta-se etanol 60% e
centrifuga-se mesma velocidade por 10 minutos.
Descarta-se novamente o excesso de etanol e
invertem-se as placas sobre o papel toalha, repetindo-
se este processo por mais uma vez. Para secar, as
placas so submetidas a um spin at 300rpm com as
placas invertidas sobre o papel toalha e posteriormente
encaminha-se para estufa a 37 C durante 15
minutos. Aps secas, as placas recebem 10mL de
formamida e so encaminhadas para o termociclador
para a reao desnaturao. Aps essa etapa, as
placas so encaminhadas para o Sequenciador
Automtico de DNA, modelo ABI 3700 Prism
Analyzer.
Resultados e Discusso
O seqenciamento automtico permite que amostras
sejam seqenciadas em larga escala. Em nosso
Laboratrio, so seqenciadas 1.152 amostras
diariamente, 5.760 amostras semanalmente. A
purificao, embora indispensvel para preservao
dos capilares do Seqenciador Automtico de DNA e
para garantir a qualidade das seqncias produzidas,
um procedimento muito barato custando apenas 2%
do valor total de uma placa seqenciada.
Utilizando-se 2uL de BigDye por reao, os resultados
obtidos foram: num total de 53.568 seqncias
obtidas, 43.872 (81,90%) foram seqncias vlidas
(phred 20, mnimo de 250 bases). Utilizando-se 2uL
por reao, possvel realizar 4.000 reaes com um
kit, a um custo de US$ 0,50 por reao.
No teste com 1uL de BigDye por reao, os resultados
foram: num total de 125.664 seqncias obtidas,
100.279 (79,80%) foram seqncias vlidas (phred
20, mnimo de 250 bases). Utilizando-se 1uL por
reao, a economia no gasto do BigDye foi de 50%,
resultando um gasto de US$ 0,25 por reao. Um kit
passou a ser suficiente para 8.000 reaes. Os
resultados obtidos esto relacionados na Tabela 1.
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Reao de Sequenciamento de DNA e Purificao - Protocolos Otimizados
Tabela 1: Seqncias vlidas produzidas e respectivas economia (em dlares norte-americanos) na utilizao do Kit BigDye
Terminator
s a i c n q e S
) % ( s a d i l V
o a e r / o t s u C
) $ S U (
o a e r / a i m o n o c E
) $ S U (
a c a l p / a i m o n o c E
) $ S U (
t i k / s e a e R
e y D g i B
L u 2 9 , 1 8 0 5 , 0 - - 0 0 0 4
L u 1 8 , 9 7 5 2 , 0 5 2 , 0 4 2 0 0 0 8
Comparando-se os resultados obtidos utilizando-se 1uL
de BigDye com os resultados obtidos utilizando-se 2uL
de BigDye, conclui-se que o gasto diminuiu em 50%,
enquanto que a qualidade das seqncias vlidas teve
uma variao de apenas 2,1% , plenamente aceitvel
para o tipo de servio executado.
As Figuras 1 e 2 mostram eletroferogramas de
amostras seqenciadas aps reao utilizando 1uL e
2uL de BigDye respectivamente. Analisando-se os dois
eletroferogramas, observa-se que a qualidade obtida
nas duas amostras muito semelhante, padro que foi
observado de forma geral nos testes realizados.
Figura 1: Eletroferograma obtido com
utilizao de 1uL do Kit BigDye Terminator.
Figura 2: Eletroferograma obtido com
utilizao de 2uL do Kit BigDye Terminator .
4 Reao de Sequenciamento de DNA e Purificao - Protocolos Otimizados
Exemplares desta edio podem ser adquiridos na:
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
Servio de Atendimento ao Cidado
Parque Estao Biolgica, Av. W/5 Norte (Final) -
Braslia, DF. CEP 70.770-900 - Caixa Postal 02372
PABX: (61) 448-4600 Fax: (61) 340-3624
http://www.cenargen.embrapa.br
e.mail:sac@cenargen.embrapa.br
1
a
edio
1
a
impresso (2003): 150 unidades
Presidente: Luzemar Alves Duprat
Secretrio-Executivo: Maria Jos de Oliveira Duarte
Membros: Maurcio Machaim Franco
Regina Maria Dechechi G. Carneiro
Luciano Loureno Nass
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares Campos Carneiro
Supervisor editorial: Maria Jos de Oliveira Duarte
Normalizao Bibliogrfica: Maria Alice Bianchi
Editorao eletrnica: Giscard Matos de Queiroz
Comit de
publicaes
Expediente
Circular
Tcnica , 22
Ministrio da Agricultura,
Pecuria e Abastecimento
Concluso
Pode-se concluir que a diluio do BigDye de 2uL para
1uL economicamente vantajosa para servios de
seqenciamento de DNA em larga escala, por que gera
uma economia de 50% no gasto de BigDye por reao,
o que resulta em uma economia de US$ 24,00 por
placa formato 96 poos. Alm disso, do ponto de vista
dos resultados obtidos, pode-se afirmar que a diferena
entre a qualidade das seqncias utilizando-se ambos
os volumes desprezvel.
Bibliografia Recomendada
EMBRAPA. Plataforma de Sequenciamento de DNA.
Sequenciamento de DNA utilizando o Seqenciador
ABI Prism 3700. Disponvel em: http://
www.cenargen.embrapa.br/laboratorios/psd/
composicao.html; acesso em: 20/11/03.
FIOCRUZ. Ps Graduao em Cincias da Sade.
Tcnicas Bsicas de Biologia Molecular. Disponvel
em:< http://www.cpqrr.fiocruz.br/ensino/> acesso
em: 23/11/03.
LABORATRIO GENESIS. Sequenciamento de DNA.
Disponvel em: <http://educacao.genesisdbm.com.br/
sequenciamento.shtml> acesso em: 18/10/03.
NASCIMENTO, A. A.C. ;ESPERAFICO, E. M. ;
LARSON, M. L. P. MONESI, N.; ROSSI, N.M.M.;
RODRIGUES, V. Tecnologia do DNA Recombinante.
Universidade de So Paulo: Faculdade de Medicina de
Ribeiro Preto, 84p. 1999.
PUCPR. Manipulao do DNA Tecnologia do DNA
Recombinante. Disponvel em: <http://www.pucpr.br/
educacao/academico/paginaspessoais/professores/
mira/bbasica/manipdna.html> acesso em: 5/ 11/03.