Biotecnologia Molecular: Avanos e Aplicaes

Aplicaes e Avanos na rea da Biotecnologia Vegetal

M. Margarida Oliveira(1,2) (1) Dep. Biologia Vegetal, Fac. Cincias de Lisboa, Campo Grande, 1700 Lisboa (2) IBET/ITQB, Apartado 12, 2781-901 Oeiras do metabolismo secundrio das plantas, embora o metabolismo humano fornea proteco suficiente contra essas substncias naturais. Esta situao claramente evidencia que o que natural no bom por inerncia. Um processo levado a cabo pelos agricultores ao longo dos tempos, e de forma gradualmente mais eficiente, tem sido o tornar comestveis plantas que o no eram. Os princpios estabelecidos por Mendel, no sc. XIX, fundamentaram o melhoramento convencional por cruzamento e seleco, em que progenitores seleccionados so cruzados para permitir obter na descendncia as melhores caractersticas de cada um. Neste processo so combinados milhares de genes e obtm-se numerosas variaes pelo que o desenvolvimento de uma variedade de sucesso pode demorar muitos anos (at 12 anos no caso dos cereais, ou largas dezenas de anos no caso de plantas de ciclo de vida mais longo). Os conhecimentos adquiridos pelos melhoradores relativamente polinizao cruzada, combinados com mtodos cada vez mais sofisticados de deteco das caractersticas de interesse, permitiram acelerar este processo. de processos biolgicos para obter produtos teis. A biotecnologia moderna explora, em grande parte, o conhecimento que adveio da descoberta da estrutura da dupla hlice de DNA (1950s) para actuar ao nvel dos genes, seleccionando caractersticas de interesse e evitando as no desejveis. Os ganhos que se podem atingir pela biotecnologia de plantas tm reflexo sobre os agricultores, a indstria alimentar, os consumidores e, sobretudo, o meio ambiente. Por exemplo a produo de plantas recorrendo a menores gastos de energia, pesticidas, fertilizantes e gua, ou a produo de plantas com nveis mais reduzidos de compostos alergnicos ou txicos, ou com melhores qualidades para armazenamento ou processamento, ou melhores qualidades nutricionais, so alguns dos numerosos exemplos de aplicaes da biotecnologia vegetal. Na biotecnologia vegetal, o domnio da cultura in vitro (ou cultura de tecidos) de plantas teve importncia crucial. A cultura in vitro compreende a cultura de clulas, tecidos ou rgos, em condies de asspsia e meios de cultura artificiais (contendo compostos como gua, sais minerais, vitaminas, fonte de carbono e reguladores de crescimento). Algumas das reas de aplicao da cultura in vitro incluem a micropropagao, a cultura de meristemas (e produo de plantas isentas de doenas), a embriognese somtica, a variao somaclonal, a seleco in vitro , a cultura de protoplastos e a hibridao somtica, de entre outras. Em termos gerais, estas tecnologias permitem por exemplo, propagar em larga escala plantas de qualidade superior (milhares, ou mesmo bilies), sem destruir a planta-me; obter plantas fceis de transportar para diversos

Todas as formas de melhoramento de plantas envolvem a seleco. Desde h 10.000 anos que este processo se realiza, por meios progressivamente mais cientficos, conduzindo a maiores ganhos em produtividade, qualidade e diversidade das plantas exploradas. As plantas, porque no se podem deslocar, desenvolveram mecanismos sofisticados de defesa contra herbvoros, patogneos e outros agentes de stress. Alguns produtos do metabolismo secundrio das plantas tm forte aco txica e podem funcionar como defesas. Nestes produtos incluem-se, por exemplo, a amigdalina (existente na amndoa amarga e que gera o cianeto - glicsido cianognico que inibe a citrocomo oxidase interrompendo a respirao celular), a nicotina (o sulfato de nicotina um insecticida potente), cardenlidos (esterides glicosilados, como a digitoxigenina, muito txicos por inibirem as bombas de Na +-K+ ), a solanina (existente nas batateiras selvagens), psoralenos (existentes no aipo selvagem) e muitos outros compostos pouco recomendveis na alimentao humana e animal. As plantas cultivadas para uso alimentar so mais sensveis s pestes que as selvagens porque foram seleccionadas para isso mesmo, para reduzir a sua toxicidade. Apesar disso, nos pases industrializados, 99% de todas as substncias carcinognicas que o homem consome na sua dieta so compostos

O mais recente estdio de desenvolvimento da tecnologia

de melhoramento de plantas a moderna biotecnologia. A biotecnologia envolve a manipulao

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perturbar o resto do genoma. O ltimo exemplo recorre a tcnicas que hoje em dia se designam por tcnicas de engenharia gentica e permitem obter plantas transgnicas. Embora as tcnicas de hibridao convencional, associadas ou no a cultura de tecidos, tambm permitam regenerar indivduos com combinaes de genes que na natureza nunca ocorreriam, tem sido a obteno de plantas transgnicas que tem gerado mais polmica. Em termos sucintos, esta tecnologia recorreu, numa primeira fase, a um vector natural de transformao gentica de plantas, o Agrobacterium tumefaciens (uma bactria do solo, da famlia do Rhizobium). O Agrobacterium tem mecanismos que lhe permitem detectar uma ferida numa planta, aproximar-se dela e transferir para as clulas vegetais uma poro de DNA, em cadeia simples e protegida por protenas bacterianas, que se integra no ncleo da clula vegetal, restaurando a dupla cadeia, e que vai comandar na planta uma srie de acontecimentos proveitosos para a bactria (Figura 1). As alteraes verificadas so o crescimento de um tumor (causado pela produo de hormonas pelo

Bactria com o Ti-plasmdio

Infeco de plantas feridas e transferncia de DNA para as clulas

Ti -plasmdio (responsvel pela virulncia)

Induo pelo T-DNA de: 1 - crescimento independente de hormonas, 2 - sntese de opinas

Planta com agrobactrias vivendo em "crown gall"

Figura 1 . Exemplo da colonizao gentica de plantas pelo Agrobacterium tumefaciens na natureza.

pases, sem preocupaes com introduo de novas doenas ou ainda, recuperar espcies em vias de extino. As potencialidades da cultura de tecidos tm sido exploradas para criar variao gentica (somaclonal) permitindo obter indivduos resistentes a factores de stress, bitico ou abitico, ou com caractersticas melhoradas (i.e.: aumento da produo de acar na cana-de-acar, resistncia ao fungo Fusarium em tomateiro, resistncia a
COCH 3 OCH 3

uma bacteriose em batateira...). Estas tcnicas permitiram ainda regenerar indivduos resultantes de cruzamentos com pouca viabilidade (por salvamento de embries), obter hbridos somticos, obter variao gentica por mutagnese in vitro (por radiao X ou gama ou aplicao de qumicos) ou introduzir, em variedades de elite, quantidades reduzidas de informao gentica que permitiram importar uma ou outra caracterstica de interesse sem
COCH 3 H 3CO OCH 3

(Acetosseringona)
COCH 3 H3 CO A vir OCH 3

H3 CO

OH

OH

OH

A vir

A vir

vir G

vir G*

PlasmdioTi

Regio devirulncia

D T-DNA

Plasmdio Ti

Cromossoma bacteriano

Figura 2. Esquema da interaco molecular estabelecida entre a planta e o Agrobacterium, que resulta na activao dos genes de virulncia e transferncia do T-DNA, em cadeia simples, delimitado por sequncias de extremidade (borders) e protegido por protenas de virulncia.

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tecido infectado) e a sntese de compostos dos quais a bactria se alimenta (fontes de carbono e azoto) as opinas. A regio que estas bactrias transferem s clulas vegetais delimitada por sequncias especficas de DNA. Se forem removidos todos os genes oncognicos e de sntese das opinas e no seu lugar forem colocados genes de interesse (por exemplo genes de resistncia a doenas ou outros) a bactria continua a ser capaz de efectuar a transferncia do DNA. Assim, estas bactrias tm sido utilizadas como escravas no processo de engenharia gentica de plantas, sendo eliminadas aps a transferncia do DNA. Os ensaios de transformao gentica so desenvolvidos, regra geral, com culturas de plantas in vitro (crescendo em meios de cultura que lhes fornecem todos os nutrientes e reguladores de crescimento necessrios) e as bactrias so colocadas em contacto com feridas recentes criadas nas plantas. Aps um perodo de co-cultura, as bactrias so eliminadas com antibiticos especficos e novos rebentos (ou embries somticos) so induzidos no material transformado, normalmente sujeito a presso selectiva para eliminar os tecidos no transgnicos (Figura 3). Este processo, no entanto, est dependente de uma interaco hspede/hospedeiro, que nem sempre se estabelece. Para obviar este problema alargando a gama de plantas transformveis, foram desenvolvidos mtodos alternativos com os quais foi possvel efectuar transferncia de DNA para plantas que no so hospedeiras do Agrobacterium. Alguns destes mtodos so, por exemplo, o bombardeamento com micropartculas (normalmente de ouro e com cerca de 1 micrmetro de dimetro), revestidas com o DNA e impulsionadas por presso de gs ou descarga elctrica, para entrarem no tecido vegetal. A obteno de protoplastos (clulas vegetais desprovidas da parede celular, por degradao enzimtica da parede celulsica e lamela mdia pectnica) e a permeabilizao qumica ou fsica da membrana plasmtica tambm permite a entrada de DNA em soluo e sua integrao no genoma. H muitos outros mtodos como o microlaser, a microinjeco ou os vectores virais, que tambm podem ser utilizados, embora no sejam to comuns como os anteriores. Os fragmentos de DNA que se inserem na clula vegetal tm de ser reconhecidos pela planta do ponto de vista molecular, ou seja, tm de ter sinais de expresso eucariotas, e devem tambm possibilitar formas de seleco das clulas transformadas e eliminao das no transformadas. comum, por exemplo, a introduo de um gene marcador de resistncia a um antibitico ou herbicida. Os genes de resistncia a antibiticos so, por norma, genes isolados de bactrias comuns na natureza (existentes no nosso intestino ou nos alimentos que consumimos), e que dispem desses genes naturalmente. Os genes de resistncia ou tolerncia aos herbicidas so tambm isolados de bactrias do solo que degradam esses compostos (herbicidas biodegradveis), embora outros possam provir de plantas selvagens naturalmente resistentes. Alguns destes genes codificam enzimas que degradam os herbicidas que bloqueiam a via de sntese de aminocidos (i.e.: o caso da fosfinotricina) ou codificam enzimas insensveis ao herbicida, o que restabelece a sntese normal de produo de aminocidos aromticos (i.e.: gene de resistncia ao glifosato) (Figura 5). A cultura do tecido transformado na presena do agente selectivo permite seleccionar as clulas transformadas e, a partir da, em condies adequadas, regenerar as plantas transgnicas.

Cultura in vitro de material vegetal ( plntulas micropro pagadas e germinantes)

Ferimento do material vegetal ( seccionamento)

Infeco dos explantes com a suspenso bacteriana

Leitura da absorvncia a 600 nm

Aplicao sobre a zona de ferida (24-48h) Incubao numa soluo diluda de bactrias ( durante alguns segundos a alguns minutos) e transferncia dos explantes para meio fresco para cocultura com as bactrias

Agrobacterium

Cultura em meio lquido com agitao (adio ou no de acetosseringona)

Aps a cocultura: - Transferncia dos explantes para meio de cultura fresco com antibiticos para eliminar as bactrias

Induo de rebentos transformados em de cultura selectivo e na presena dos fitorreguladores adequados

meio

Figura 3. Como se modifica geneticamente uma planta (in vitro) via Agrobacterium .

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Indicador da presso no tubo de ligao ao aparelho Indicador da presso na garrafa

Disco de ruptura ( ex: 1300 Psi)

Suporte do disco de ruptura

Hlio

Macrocarrier ON OFF 1 Vac Vent Hold 2 Fire 3 A Parafuso de fixao Suporte do macrocarrier

social). Assim, por exemplo, a modificao de plantas para melhorar o seu crescimento em condies adversas, reduzir os danos para o ambiente pela menor e melhor utilizao de agroqumicos (pesticidas e fertilizantes), ou para rentabilizar o processamento de produtos reduzindo gastos energticos, so de particular importncia a nvel ambiental. No domnio da introduo de resistncia a doenas, uma das estratgias de pesquisa de genes de interesse tem sido a procura de indivduos naturalmente resistentes, a identificao das bases moleculares dessa resistncia e o isolamento dos genes e sua transferncia para plantas sensveis. o caso dos genes das endotoxinas do Bacillus thuringiensis (uma bactria do solo que utilizada como pesticida natural desde h vrias dezenas de anos), que tm tambm sido transmitidos s plantas para lhes conferir a capacidade de se defenderem elas prprias dos ataques de alguns insectos. Estas toxinas acumulam-se normalmente na bactria sob a forma de cristais, os quais, por ingesto pelo insecto, so degradados nas condies alcalinas do seu tracto digestivo libertando a toxina activa que se liga a receptores especficos e afecta a permeabilidade membranar das clulas epiteliais do mesentrio. Desta forma as clulas afectadas rompem e a larva morre. Com a vantagem sobre certos insecticidos tradicionais (i.e: organosfosfatos) de atingirem uma gama de insectos bastante mais restrita (preservando, por exemplo abelhas e joaninhas, as toxinas Bt tm vindo a ser estudadas e modificadas no sentido de cada vez serem mais especficas. H, por exemplo, toxinas Bt especficas para larvas de lepidpteros, colepteros ou dpteros. Para alm da identificao de toxinas Bt naturais de maior especificidade, tem-se investido no sentido da modelao da cadeia peptdica, por forma a utilizar apenas a poro de DNA que codifica a regio activa do pptido, e

Material vegetal A

4 Vaccum

5 Vent

Cmara em vcuo durante o bombardeamento

Figura 4. Aspecto de um sistema de bombardeamento utilizado para transformao gentica de plantas. As micropartculas revestidas pelo DNA so colocadas sobre o macrocarrier e disparadas sobre o material vegetal pela presso do gs libertado aquando da ruptura do disco de ruptura. O macrocarrier travado numa rede de paragem, no sendo assim projectado sobre o material.

Figura 5. Alguns herbicidas e locais de interferncia na via de sntese de aminocidos. O gene de resistncia ao glifosato, introduzido em plantas por engenharia gentica, cria uma via alternativa insensvel ao composto. O gene de tolerncia fosfinotricina codifica uma enzima que degrada o composto.

A engenharia gentica de plantas (EGP) forneceu, em 1984, a primeira planta geneticamente transformada por aco do homem. De ento para c, esta poderosa tecnologia tem sido largamente explorada e j permitiu obter resultados ainda h pouco tempo impensveis. Como qualquer nova tecnologia de futuro promissor, a EGP foi agarrada por empresas, de dimenso gradualmente crescente, que investiram fortemente na investigao e que comearam a produzir produtos de interesse comercial cerca de 10 anos depois da primeira planta transgnica ter sido anunciada. Desta forma claramente

se percebe que um dos objectivos da EGP atingir vantagem econmica comparativamente s tecnologias convencionais (objectivo comercial). Contudo, como ferramenta poderosa que , a EGP tem vindo a ser utilizada para estudar as funes in vivo dos genes das plantas e tem contribudo fortemente para o avano do conhecimento do funcionamento vegetal (objectivo cientfico). As potencialidades da EGP e o avano do conhecimento alargaram ainda o leque de aplicaes, estendendo ao ambiente e sade e segurana alimentar dois outros grandes objectivos da sua aplicao (objectivos de natureza ecolgica e

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no sentido de aumentar a especificidade. Na Figura 6, visvel o aspecto de uma campo no tratado com pesticidas e plantado com algodo sensvel ( esquerda) e resistente ( direita) ao insecto Helicoverpa armigera. As plantas resistentes expressam o gene da endotoxina do Bacilus thuringiensis var. Kurstaki (Novillo et al., 1999). Para reduzir as hipteses de aparecimento de insectos resistentes importante cultivar sempre uma fraco de terreno com plantas sensveis, os refgios. Como outras protenas, as toxinas Bt so molculas biodegradveis, e alm disso so tambm sensveis radiao ultra-violeta, pelo que no permanecem muito tempo no solo. Existem diversas outras estratgias de introduo de resistncia a insectos, baseadas em genes de plantas naturalmente resistentes. o caso, por exemplo, de genes que codificam inibidores das proteinases dos insectos. Um destes genes, isolado de tomateiro, j foi introduzido em arroz conferindo-lhe resistncia broca do caule. Outros agentes de stress bitico, como vrus, bactrias, fungos e nemtodes, tambm j foram ultrapassados em vrias plantas por estratgias de engenharia gentica A modificao gentica de plantas para obteno de polmeros biodegradveis que podem substituir os plsticos tambm j uma realidade. Igualmente a expresso em plantas de genes que codificam protenas teraputicas (como a somatotropina) est a surgir como uma importante alternativa aos sistemas de produo de frmacos actualmente existentes, j que as plantas tm a vantagem adicional de minimizar os potenciais contaminantes virais. Tambm o enriquecimento nutricional de produtos alimentares utilizados em larga escala em regies de extrema pobreza (como a introduo da via de sntese da prvitamina A em arroz), a produo de
Figura 6 . Aspecto de campos de algodo sensvel ( esquerda) e transgnico ( direita) ao insecto Helicoverpa armigera (Novillo et al., 1999).

vacinas em alimentos para permitir proteger largas faixas de populao em regies de difcil acesso ou a produo de plantas de elevada qualidade e robustez para cultivo em zonas pobres so formas de permitir melhorar a qualidade de vida minorando os contnuos ataques natureza para obter solos arveis. De facto actualmente observamos as sistemticas destruies de reas de floresta natural e as exploraes de terrenos marginais, que levam contnua degradao e poluio do nosso planeta e a perdas anuais da ordem dos 22 bilies de toneladas de solo. A substituio dos pesticidas convencionais tambm urgente, j que conduz poluio de solos e cursos de gua com substncias de longa persistncia, txicas para o Homem e outros animais. Criar condies de segurana alimentar a nvel mundial pode prevenir a guerra. Um povo com fome vai procurar alimento onde este existir. Com as actuais taxas de crescimento populacional ser necessrio que, dentro de 3 ou 4 dezenas de anos, 85% da produo mundial de alimento seja assegurada pelos pases pobres, situando-se um quarto dessa produo na China. A China vai precisar de cerca de 40% de aumento da produo de carne. Por alguma razo a China investe actualmente em larga escala na rea da Biotecnologia.

Na India, um pas em que 70% da populao se dedica agricultura, 400 milhes de pessoas vo para a cama com fome e os terceiros filhos de cada casal nascem com falta de peso por deficincias nutricionais. Prev-se, por exemplo, que j em 2015, Bombaim seja uma cidade com mais de 26 milhes de pessoas e outras cidades dos pas atinjam nmeros prximos. Desde a dcada de 80 que, neste pas, a biotecnologia tem vindo a ser encarada uma prioridade em reas como a agricultura, sade, ambiente, desenvolvimento de recursos humanos, indstria, segurana e assuntos ticos. Diversos genes de resistncia a doenas de plantas foram j introduzidos em arroz e esto a ser testados no Punjab por populaes locais. Quando nos anos 50 foi necessrio, para alimentar a populao crescente, aumentar drasticamente a produo vegetal, num processo que hoje referido como a revoluo verde, recorreu-se utilizao massiva de agroqumicos que muitas empresas ainda hoje teimam em no abandonar. urgente comear a aplicar as novas tecnologias que permitiro no futuro obter melhor qualidade e produtividade com menos consequncias nefastas para o ambiente e para a sade. A esta nova revoluo chama-se j a segunda revoluo verde ou a revoluo

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duplamente verde (Doubly-green Revolution). A engenharia gentica de plantas no , de forma alguma a soluo nica, mas uma pea chave num programa mais vasto de educao social e ambiental para o melhoramento da alimentao, explorao agrcola sustentvel e qualidade de vida.
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