3

Isolamento e Preparação de Microrganismos

Resumo
Os microrganismos são predominantes como fonte de novas enzimas, enquanto os animais
órgãos e materiais vegetais contribuem com muito menos de 10% cada para a quantidade total
de enzimas processadas.
Os microrganismos podem ser obtidos através de triagem ou através de coletas de cepas. Embora os
métodos de engenharia genética ocupem agora um lugar firme para melhorar a actividade ou
estabilidade das enzimas existentes, o rastreio de culturas de organismos ainda
continua a ser a principal forma de encontrar novas atividades.
No modelo taxonômico ainda válido, os microrganismos podem ser classificados em
três domínios de eubactérias, archaea e eucariotos. Os três domínios se ramificaram
partiram muito cedo na evolução, unidos por um ancestral comum; a imagem correspondente das
relações entre os domínios e reinos é denominada “árvore filogenética universal”.
Para obter propriedades industrialmente úteis, o isolado original de um microrganismo é
bastante modificado em laboratório; entre as técnicas utilizadas estão métodos não genéticos, como
mutação com agentes inespecíficos ou recombinação durante
propagação e engenharia genética com mutações e recombinações in vitro,
pressão de seleção in vivo e repressão ou eliminação de vias metabólicas menores com
desequilíbrio metabólico resultante.
Como resultado desta modificação, melhorias progressivas nos rendimentos do
produtos desejados foram alcançados, como o aumento na produção de penicilina
de 1–10 µg mL–1 na década de 1940 para 85 mg mL–1 50 anos depois, tudo isso sem
Engenharia genética. Um dos melhores exemplos de engenharia metabólica em aminoácidos
a produção de ácido, a formação de l-lisina a partir da glicose, inclui contornar a regulação de
feedback através de mutantes auxotróficos ou a triagem de mutantes resistentes a toxinas. O tipo
selvagem de Brevibacterium lactofermentum não produz lisina,
mas a incorporação de ambas as medidas aumentou o rendimento para 50 g L–1:
Devido à maior capacidade de lidar com grandes quantidades de amostras através de triagem de alto
rendimento, HTS, métodos de triagem convencionais, como isolamento de microrganismos na
vizinhança de habitats específicos, seleção de cepas que são taxo nomicamente próximas de
sucessos anteriores, e as culturas de enriquecimento são cada vez mais substituídas
ou complementado por métodos de PCR e rRNA, por clonagem para alta expressão com
hospedeiros altamente transformáveis, ou usando pares de primers relacionados em PCR com base
em
Biocatálise. Andreas S. Bommarius e Bettina R. Riebel
Direitos autorais © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.
ISBN: 3-527-30344-8
44
funções enzimáticas auxiliadas pelo aumento do sequenciamento do genoma para enzimas
semelhantes em
organismos diferentes.
3.1
Introdução
A fonte mais proeminente de enzimas são os microrganismos. Mesmo na década de 1980,
órgãos animais e materiais vegetais contribuíram apenas com 8% e 4%, respectivamente, para
a quantidade total de enzimas processadas. Desde o advento do DNA recombinante
tecnologia e requisitos aprimorados para qualidade uniforme, os microrganismos têm
ganhou ainda mais espaço como fonte de enzimas.
Os microrganismos podem ser classificados em três domínios: eubactérias, archaea e
eucariotos (fungos). O domínio responsável pelos representantes mais numerosos é o das
eubactérias. Figura 3.1. elucida a conexão entre os três domínios, que se ramificaram muito cedo na
evolução, com toda probabilidade mais do que um
bilhões de anos atrás.
As estruturas e sequências moleculares geralmente revelam mais relações evolutivas do que os
fenótipos clássicos, particularmente entre os microrganismos.
Consequentemente, a base para a definição de táxons mudou progressivamente de
do nível do organismo na época de Darwin para o celular e depois para o molecular
nível. Comparações moleculares mostram que a vida neste planeta se divide em três grupos
primários, comumente conhecidos como eubactérias, arqueobactérias e
eucariontes, cada um contendo dois ou mais reinos (Woese, 1990). Neste modelo
(ver, no entanto, o Capítulo 16, para visões muito novas sobre este tópico), todos os domínios estão
unidos
na base e, portanto, todos derivam de um ancestral comum. Relações entre os
domínios ou reinos podem ser representados como uma árvore, chamada de “árvore universal”.
árvore filogenética”. A árvore filogenética universal não abrange apenas toda a vida existente,
mas sua raiz e ramificações mais antigas representam estágios no processo evolutivo
antes do surgimento dos tipos celulares modernos (Woese, 2000). A evolução do
célula é uma interação entre variação derivada verticalmente e variação adquirida horizontalmente.
As entidades celulares primitivas eram necessariamente mais simples e mais modulares em design
3 Isolamento e Preparação de Microrganismos
Figura 3.1 Relação entre os três domínios (Woese, 1990).
45
do que as células modernas. Conseqüentemente, a transferência horizontal de genes foi generalizada
desde o início, dominando a dinâmica evolutiva. A raiz da filogenética universal
árvore representa o primeiro estágio na evolução celular quando a célula em evolução se tornou
suficientemente integradoe estável aos efeitos erosivos da transferência horizontal de genes
para que verdadeiras linhagens de organismos existam.
Triagem ou Coleta de Cultura?
Os microrganismos podem ser obtidos por triagem ou por coleta de cepas. Coleções de cepas foram
coletadas e preparadas em muitos laboratórios que lidam com tecnologia enzimática. Além disso,
muitos países criaram sistemas nacionais
coleções administradas por agências governamentais (Tabela 3.1); essas coleções surgiram
originalmente da necessidade de deposição de cepas reivindicadas em pedidos de patente.
Nos Estados Unidos, a ATCC (American Type Culture Collection) em Rockville/
MD (American Type Culture Collection, PO Box 1549, Manassas, VA 20108, 703-
365-2700) atua como coleção nacional de cepas; a agência correspondente na Alemanha, por
exemplo, é a DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen e.V., Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig/Alemanha). Cada
cepa recém-depositada é numerada e uma amostra (geralmente liofilizada) pode ser
encomendado por um pequeno pagamento, hoje muitas vezes através da Internet (no caso de
organismos não patogénicos e se encomendado a partir de um endereço institucional; os
regulamentos têm
reforçada devido a preocupações de segurança em relação ao potencial bioterrorismo).
(Alternativamente, no caso de organismos mais comuns, o cDNA ou o DNA genômico podem ser
ordenado em vez de todo o organismo. 3.2
Triagem de novas atividades enzimáticas
Existe uma série de técnicas para obtenção de novas atividades enzimáticas:
y triagem de novas atividades em diferentes ambientes (solo, áreas poluídas, profundidade
aberturas de ventilação) (este capítulo),
descoberta de novas atividades não naturais de enzimas existentes
y utilização de novas condições de reação, de meios de reação alterados (Capítulo 12),
ou de novos efetores, como íons metálicos,
y aplicações de técnicas de engenharia genética, como engenharia de proteínas (Capítulo 10) ou
evolução dirigida (Capítulo 11), e
y combinação de catálise química e enzimática para obtenção de novos catalisadores (Capítulo 18)
Na era da tecnologia do DNA recombinante e das metodologias baseadas na engenharia genética,
por que a busca por novos microrganismos ou novas atividades enzimáticas ainda é
tão importante?
Do ponto de vista económico, a indústria farmacêutica é provavelmente a
indústria mais importante que utiliza microorganismos. Praticamente todos os antibióticos
clinicamente importantes são produzidos por micróbios, bem como por muitos hormônios
esteróides,
como bactérias geneticamente modificadas para a produção de insulina humana e
hormônio do crescimento humano, agentes antivirais e antitumorais, como interferons, sangue
produtos como fatores de coagulação sanguínea e eritropoietina, e uma variedade de vacinas e
anticorpos monoclonais para diagnóstico.
Em geral, os microrganismos oferecem uma solução prática para o desafio de adquirir e
desenvolver atividades enzimáticas: são fáceis de manter, apresentam crescimento rápido,
e pode ser persuadido a se concentrar na produção de apenas um composto principal desejado.
Eles são extremamente versáteis e hoje em dia acredita-se que para cada produto alvo um
microrganismo ou catalisador enzimático derivado de um microrganismo possa ser
encontrado. Um bom exemplo do direcionamento de um microrganismo para a produção de
um produto importante é Corynebacterium glutamicum. Esta bactéria foi projetada
na década de 1950 para produzir grandes quantidades de ácido l-glutâmico, usado especialmente em
Leste Asiático como intensificador de sabor. Curiosamente, o mesmo organismo uma geração
depois
foi empregado nas décadas de 1980 e 1990 para engenharia metabólica para o
produção em grande escala de outro aminoácido, a l-lisina, utilizado na alimentação animal para
complementar dietas ricas em rações à base de milho, pobres em lisina.
Os métodos de engenharia genética, por outro lado, apesar de todos os progressos, apresentam uma
uma série de desafios, tais como (i) dobramento incorreto que deve ser contornado por
desnaturação da uréia com posterior renaturação; (ii) padrões ausentes ou incorretos
de glicosilação de proteínas de organismos eucarióticos em bactérias como E. coli;
e (iii) clivagem ausente ou incompleta do resíduo de metionina N-terminal por
procariontes. Mais importante ainda, tais técnicas ocupam agora um lugar firme para melhorar a
atividade ou estabilidade enzimática existente. Contudo, a triagem de culturas de organismos
continua a ser a principal forma de encontrar novas atividades. Organismos podem
3 Isolamento e Preparação de Microrganismos
47
ser obtido através de coleções de culturas conforme descrito acima ou, pelo menos em um estágio
inicial
fase, a partir de amostras de solo, de habitats aquosos ou de material animal ou vegetal. A obtenção
de micróbios dos seus habitats naturais pertence ao campo da ecologia microbiana (ver abaixo).
Os critérios para o sucesso de um processo de triagem com o objetivo de são:
1. O organismo deve fornecer a enzima desejada com bom rendimento e dentro de um período de
tempo razoavelmente curto, se possível, em cultura submersa.
2. O organismo deve produzir a enzima com nutrientes baratos e acessíveis.
3. O organismo deve ser separável do meio de fermentação e o
A enzima deve ser excretada extracelularmente e facilmente separável do caldo de fermentação.
4. O organismo deve ser não patogênico, deve ser geneticamente estável e
não deve produzir compostos indesejados ou mesmo tóxicos.
3.2.1
Taxas de crescimento na natureza
Os habitats naturais dos microrganismos são extremamente diversos. Qualquer habitat adequado ao
crescimento de organismos superiores também permitirá o crescimento microbiano, mas
há também muitos habitats, como fontes termais ou sulfurosas, que são desfavoráveis a outros
organismos, mas onde microorganismos (archaea) podem existir e florescer.
Apesar da adsorção a qualquer microambiente ou superfície minúscula, as concentrações de
nutrientes são geralmente muito mais baixas (frequentemente 100 a 1000 vezes) na natureza do que
estão nas condições normais de cultura laboratorial. Assim, os microrganismos em estado natural
habitats são frequentemente sujeitos a condições pobres em nutrientes, resultando em níveis muito
mais baixos
conta em relação a uma espécie individual. Assim, os organismos na natureza devem ser capazes de
adaptar-se rapidamente a uma rápida mudança na disponibilidade de nutrientes. Este requisito é
provavelmente uma das principais razões para a existência de mecanismos regulatórios altamente
sofisticados.
mecanismos e também fornece a diversidade de dietas nas quais os microrganismos
pode alimentar.
Períodos prolongados de crescimento exponencial (ver Capítulo 8, Seção 8.2) na natureza
são raros; o crescimento ocorre mais frequentemente em surtos, quando o substrato se torna alguns
disponíveis,
seguida por uma fase estacionária prolongada, após o esgotamento do substrato. Por exemplo, o
tempo de geração de Escherichia coli no trato intestinal é de cerca de 12 horas,
enquanto na cultura cresce muito mais rápido, com uma taxa de divisão aproximadamente a cada
20-30 minutos.
3.2.2
Métodos em Ecologia Microbiana
Raramente um ambiente natural contém apenas um único tipo de microrganismo. Em
na maioria dos casos, uma variedade de organismos está presente e é particularmente desafiador
para
3.2 Triagem de novas atividades enzimáticas
48
o microbiologista deve desenvolver métodos e procedimentos que permitam o isolamento e a
cultura dos organismos de interesse. A técnica mais comum é a cultura de enriquecimento.
Neste método, são utilizados um meio e um conjunto de condições de incubação que são
seletivo para o organismo desejado. Culturas de enriquecimento são frequentemente estabelecidas
colocando o inóculo diretamente num meio altamente seletivo; muitos comuns
os procariontes podem ser isolados desta forma. Essa cultura de enriquecimento seleciona
para a maior taxa de crescimento (ver Capítulo 8, Seção 8.2) ou para organismos que podem
utilizar a fonte de carbono (C) ou nitrogênio (N) oferecida no meio. Por aplicativo
de uma pressão de seleção apropriada (Capítulo 11, Seção 11.2), a atividade desejada
pode ser filtrado de uma série de organismos, por exemplo, fornecendo uma única fonte de N no
meio que é transformado pelo organismo em crescimento, quebrando
a mesma ligação desejada posteriormente na biotransformação. Um bom exemplo é a triagem de
hidantoinases através do fornecimento de hidantoínas ao meio (Capítulo 7, Seção
7.2.2.3).
Frequentemente, o objectivo de um estudo de cultura de enriquecimento é obter uma cultura pura.
Neste contexto, “puro” significa livre de elementos vivos estranhos e, portanto,
contendo apenas um tipo de organismo. Ao examinar uma cultura microscopicamente, é
quase impossível detectar um contaminante perdido porque a sensibilidade da luz
microscópio está baixo. Com uma lente média de 100×, o tamanho do campo é tal que se o
a contagem bacteriana é 106
células mL–1, em média haverá apenas uma célula/campo. Se um
contaminante numerado 104
células mL–1, seria necessário examinar 100 campos para
detectar um único contaminante. As culturas puras podem ser obtidas de várias maneiras; a maioria
freqüentemente usados são os métodos de placa listrada, agitação de ágar e diluição líquida.
Pela colheita repetida e re-semeadura de uma colónia bem isolada, obtém-se normalmente uma
cultura pura.
3.3
Desenvolvimento de tensão
Micróbios industrialmente úteis são um subconjunto único de todos os microrganismos que
estão disponíveis: enquanto os micróbios isolados da natureza exibem o crescimento celular como
seu
principal propriedade fisiológica, os microrganismos industriais são na maioria das vezes
organismos
que foram selecionados cuidadosamente para uma formação de produto específica e ideal
(Capítulo 8, Seção 8.2.). Mesmo que o micróbio industrial seja um que tenha sido
isolado por técnicas tradicionais, torna-se um organismo altamente modificado antes de
entra na produção em grande escala.
3.3.1
Gama de Produtos Industriais de Microrganismos
Os produtos microbianos de interesse industrial podem ser de vários tipos principais. As células
eles próprios podem ser a fonte de interesse, como no fermento para panificação ou nos cogumelos
cultivada para alimentação. Outra fonte são bbactérias usadas para inoculação em produtos
alimentícios produtos, como lactobacilos em laticínios e embutidos. Como dito acima, em com. Em
comparação com enzimas de origem animal ou vegetal, as enzimas produzidas por microrganismos
são frequentemente o produto desejado e estão se tornando cada vez mais
importante. Uma série de enzimas comercialmente importantes são produzidas em processos
microbianos em larga escala, incluindo enzimas de digestão de amido (amilases), enzimas de
digestão de proteínas (proteases como renina, subtilisina, termolisina) e enzimas de digestão de
gordura (lipases). Tabela 3.2). Uma importante enzima industrial é a glicose
isomerase, utilizada em grandes quantidades para a produção de adoçante frutose a partir de
glicose (Capítulo 7, Seção 7.3.1). Outra enzima importante é a penicilina aci lase, utilizada
industrialmente na fabricação de penicilinas semissintéticas (Capítulo 7,
Seção 7.5.1). Enzimas industriais já atingiram mercado anual de US$ 1,6
bilhão (Demain, 2000).
Os metabólitos microbianos também contribuem para a lista de produtos, como com
fermentações para produtos importantes como etanol, ácido acético, n-butanol ou ácido láctico
ácido; factores-chave de crescimento, tais como aminoácidos ou vitaminas; ou farmacologicamente
compostos ativos, como antibióticos, esteróides ou alcalóides. Farmacologicamente ativo
agentes são geralmente categorizados como metabólitos secundários, o que na maioria das vezes
implica
produção na fase estacionária (não associada ao crescimento) da fermentação (Capítulo ter 8, Seção
8.2) e coincide com a regulação metabólica que difere daquela
de metabólitos primários. Os metabólitos secundários não são imediatamente necessários para
crescimento bacteriano e não são produzidos a partir de fontes de C ou N no meio, mas
dos próprios intermediários metabólicos. Metabólitos secundários podem inibir o crescimento
quando interferem no metabolismo bacteriano; processos de fermentação devem ser
concebido em conformidade para contornar tais problemas.
Ao longo dos anos, à medida que os processos microbianos em larga escala foram aperfeiçoados,
várias cepas industriais foram depositadas em coleções de cultura. Quando um
patenteado um novo processo industrial, o requerente da patente é obrigado a depositar uma cepa
capaz de realizar o processo em uma coleção de culturas reconhecida.
Embora estas colecções culturais possam servir como fontes imediatas de culturas, devem
Deve ser entendido que a maioria das empresas industriais estará relutante em depositar os seus
melhores culturas.
3.3.2
Melhoria de tensão
Para obter propriedades industrialmente úteis, um isolado original de um microrganismo é
bastante modificado em laboratório. A maioria dos organismos está alterada
y geneticamente por mutação espontânea, mutação com agentes inespecíficos, como
químicos (MNNG) ou luz UV forte, ou recombinação durante a propagação (este
não deve ser confundido com organismos geneticamente modificados onde mutações
e recombinações são introduzidas in vitro), ou
y por pressão de seleção in vivo (veja acima), ou
y por repressão ou eliminação de vias metabólicas menores com resultante desequilíbrio
metabólico.
Como resultado desta modificação, deverá ser alcançada uma melhoria progressiva no rendimento
do produto desejado. Um dos primeiros exemplos mais dramáticos de
tal melhoria é a produção de penicilina, o antibiótico produzido pelo
fungo Penicillium chrysogenum. Quando a penicilina foi produzida pela primeira vez em um grande
escala no final da década de 1940, foram obtidos rendimentos de 1–10 g · L–1. Ao longo dos anos,
como resultado da melhoria da deformação, juntamente com mudanças no meio e nas condições de
crescimento, o rendimento aumentou para cerca de 85 g · L–1. Notavelmente, esse aumento
foi obtido sem engenharia genética, mas apenas por seleção para mutações naturais e para
acasalamento.
Se a via metabólica de um substrato como a glicose até um produto final desejado como a lisina for
bem compreendida, pode-se tentar redirecionar um fluxo maximamente alto.
na direção do produto final. A mudança desejada nas taxas de fluxo no metabolismo com o
propósito de otimizar o rendimento do produto é chamada de engenharia metabólica (Capítulos 15 e
20). Exemplos de engenharia metabólica em aminoácidos
A produção inclui contornar a regulação de feedback, identificando mutantes auxotróficos e triagem
de mutantes que são resistentes a um análogo tóxico do desejado.
metabólito (Demain, 2000).
3 Isolamento e Preparação de Microrganismos
51
No exemplo mais bem documentado da formação de lisina, o produto é formado
do aspartato que reage via aspartilfosfato e aspartato semialdeído para
lisina. O tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum não produz lisina.
Com as seguintes etapas o rendimento pode ser aumentado para 50 g L–1:
1. S-(2-Aminoetil)-l-cisteína (AEC), H2N-CH2-CH2-S-CH2-CH(NH2)-COOH, um
análogo da lisina, atua como um inibidor de falso feedback da aspartoquinase, que produz
aspartilfosfato a partir do aspartato. O inibidor simula, para a aspartoki nase, a ausência de lisina e
treonina e, como consequência, a AEC no mutante sensível não é mais inibida pela lisina e pela
treonina. O resultado foi
um aumento de rendimento de 0 a 16 g L–1.
2. A lisina é formada a partir do aspartato e do piruvato; o piruvato, entretanto, também é
consumido para a síntese de alanina. A descoberta de um auxotrófico de alanina, um
mutante que precisa de adição externa de alanina para crescimento porque não pode
catalisar uma etapa precursora da alanina, foi responsável por um aumento de rendimento de
16 a 33 g L–1.
3. α-clorocaprolactama e γ-metil-l-lisina inibem enzimas que estão no
caminho metabólico para a lisina. Depois que os respectivos mutantes foram encontrados, o
rendimento
poderia ser aumentado para 43 g L–1.
4. O β-fluoropiruvato inibe uma enzima que está localizada em um desvio da lisina
metabolismo, com o resultado de que mais carbono flui para a lisina. O rendimento
foi aumentado para 50 g L–1.
No futuro, a engenharia de caminhos em cepas será ainda mais facilitada
pela disponibilidade de dados de genoma e expressão gênica. Recentemente (abril de 2003), o
o sequenciamento de aproximadamente 110 genomas procarióticos foi concluído; para
os resultados, consulte www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes. Existem várias forças motrizes
para melhoria no campo da engenharia metabólica.
y o crescente campo da genômica (Capítulo 15); sequenciamento do genoma e a análise de
microarranjos de DNA para expressão de certos genes darão informações sobre
controles transcricionais de vias inteiras, identificando genes responsáveis por alta
produtividade como exemplo (Stafford, 2001).
y desenvolvimentos em apbiologia molecular aplicada, como otimização do promotor para
expressão genética especializada (Capítulo 4), juntamente com métodos combinatórios
como mutagênese aleatória e recombinação genética (Capítulo 11) (Stafford,
2001); combinar esses métodos pode criar caminhos artificiais com melhor
enzimas dentro da mesma célula-alvo.
y A necessidade de recursos renováveis para síntese de produtos químicos no que diz respeito aos
aspectos ambientais (Capítulo 20).
3.3 Desenvolvimento de Deformações
52
3.4
Extremófilos
Uma área de pesquisa muito interessante em biologia e biotecnologia é o tema da
extremófilos. A vida na Terra adaptou-se ao longo da evolução, até mesmo para
habitats extremos (embora haja evidências de que os organismos tiveram que se adaptar
condições mais frias na Terra ao longo da evolução inicial). Habitats “extremos”
abranger a gama de condições conforme descrito
Temperatura: –5 a +110 °C
Pressão hidrostática: 0,1 a 120 MPa
Atividade aquática: 0 a 0,6
(corresponde a uma concentração de sal até e além de 6 m)
pH: pH 1–12

As três estratégias da natureza para a adaptação aos fatores de estresse ambientais

são evitação, tolerância e adaptação. Muitos organismos são bem sucedidos no
evitar o estresse sob condições extremas de pH e concentração de sal, utilizando cosmotropos ou
solutos compatíveis para neutralizar valores extremos de pH ou para
compensar a alta pressão osmótica entre o núcleo interno das células e o exterior
espaço da membrana. Como cosmotrópicos (= “formadores de estrutura”, o oposto são caotrópicos
= “quebradores de estrutura”). Moléculas como glicerol, betaína, prolina ou N-acilamino
ácidos podem funcionar. Os íons também podem atuar como cosmotrópicos (ou caotrópicos), cujo
potencial pode ser lido a partir de sua posição relativa na série de Hofmeister (Hofmeister,
1888):
←⎯⎯⎯⎯⎯ Aumento dos cátions de efeito caotrópico Al3+, Ca2+, Mg2+, Li+
, Na+, K+, NH4+, (CH3)4N+ânions SCN–, I–, ClO4–, Br–, Cl–,SO42–,HPO42–, citrato3–
Aumentando a estabilização ⎯⎯⎯⎯⎯→

As condições isotérmicas e isobáricas de um habitat requerem adaptação como estratégia

em pressões e temperaturas incomuns. Microrganismos extremofílicos são adaptados
sobreviver em nichos ecológicos e produzem biocatalisadores únicos que funcionam
sob condições extremas comparáveis às prevalecentes em vários processos industriais.
Os extremófilos podem ser divididos em grupos de acordo com:
1. tolerância à temperatura,
2. concentração de sal,
3. faixa de pH,
4. ou condições de pressão.

anúncio 1) Temperatura. Para microrganismos psicrofílicos, as faixas de temperatura

entre 0 °C < Topt < 20 °C, para termofílico 50 °C < Topt < 80 °C, e para hipertermófilo 80 °C <
Topt < 120 °C. A temperatura cria desafios, a baixa temperatura causa a formação de cristais de gelo
dentro da célula e a alta temperatura causa
desnaturação de biomoléculas (Capítulo 17) e aumento na fluidez da membrana celular
para níveis letais. Os organismos mais hipertermofílicos podem existir acima de 100 °C,
com Pyrolobus fumarii (Crenarchaeota), um quimiolitoautotrófico redutor de nitrato
capaz de crescer em temperaturas de até 113 °C (Blochl, 1997).
anúncio 2) Sal. Microrganismos halofílicos toleram concentrações de sal de 0–6 m.
Os organismos vivem dentro de uma variedade de salinidades, desde água que é essencialmente
destilada
a soluções salinas saturadas. Halofilia refere-se aos requisitos iônicos para a vida em
altas concentrações de sal: um halófilo deve lidar com o estresse osmótico. Algumas arqueias
pode suportar longos períodos em NaCl saturado.
ad 3) pH. Os acidófilos podem sobreviver em pH 0–5, e os alcalófilos em pH 9–12. Biológico
os processos tendem a ocorrer na faixa intermediária do espectro de pH, e o pH intracelular do
citoplasma está geralmente entre pH 5,0 e 7,5. Arquéias acidofílicas
florescer sob acidez extrema; por exemplo, Ferroplasma acidarmanus foi
descreveu o crescimento em pH 0 na drenagem ácida de minas em Iron Mountain, CA, EUA,
prosperando em uma mistura de ácido sulfúrico e altos níveis de cobre, arsênico, cádmio e
zinco com apenas uma membrana celular e sem parede celular (Edwards, 2000).
anúncio 4) Pressão. Microrganismos piezofílicos ou barofílicos toleram pressões de
50-110 MPa. A pressão desafia a vida porque força a ocorrência de mudanças de volume. Isto
comprime o empacotamento de lipídios e as membranas tornam-se menos fluidas. O crescimento
ocorre
até 70–80 MPa; piezófilos foram observados na faixa de 50–80 MPa.
Os piezófilos ocorrem nas profundezas do oceano, como nas proximidades de aberturas marítimas
profundas. No
No fundo da Fossa das Marianas, o local mais profundo conhecido no oceano, a pressão mede 110
MPa.
Mesmo os organismos extremofílicos e suas proteínas contêm os mesmos 20 aminoácidos
ácidos com ligações semelhantes às dos mesófilos. Como a diferença na entalpia livre
entre estados dobrados e desdobrados de proteínas globulares ∆GN → G é apenas cerca de
45 ± 15 kJ mol–1 a sequência e a estrutura das proteínas extremofílicas devem diferir daquelas das
espécies comuns. Contudo, a questão principal, nomeadamente qual
propriedades causam o aumento na temperatura de desnaturação de proteínas termoestáveis, ainda é
debatido (Rehaber, 1992). Análises teóricas e experimentais
mostrou que a estabilidade térmica é amplamente alcançada por pequenas, mas relevantes,
mudanças em
diferentes locais na estrutura envolvendo interações eletrostáticas e efeitos hidrofóbicos
(Karshikoff, 2001). Não há evidências de um determinante comum
ou para apenas um efeito causando termoestabilidade.
Comparações estruturais recentes entre enzimas de mesófilos e termófilos validaram numerosos
efeitos estabilizadores de proteínas, incluindo hidrofóbicos
interações, eficiência de empacotamento, pontes salinas, ligações de hidrogênio, estabilização de
loop e
resistência à destruição covalente, uma causa talvez evoluindo de outras
(Zeikus, 1998).
Com cada vez mais estruturas cristalinas se tornando disponíveis, surgem opiniões de que
interações eletrostáticas são um fator importante que confere termoestabilidade às proteínas. Esta
opinião é apoiada pelo número crescente de pontes salinas encontradas
em muitas proteínas termoestáveis e hipertermoestáveis (Tabela 3.3) (Karshikoff,
2001); A comparação dos resíduos da superfície do capsídeo na lumazina sintase de Bacillus subtilis
(mesofílico) e Aquifex aeolicus (hipertermofílico) mostra resíduos significativamente mais
carregados do que resíduos polares na proteína hipertermofílica.
3.4.1
Extremófilos na indústria
Embora os extremófilos tenham fornecido dados que são básicos para a ciência biológica, incluindo
informações sobre o enovelamento de proteínas (ver a seção anterior), os extremófilos certamente
têm o potencial para apoiar indústrias multibilionárias, incluindo agricultura, síntese química,
detergentes para a roupa e produtos farmacêuticos (Rothschild,
2001). Enzimas funcionais e estáveis são procuradas para ambientes economicamente preferíveis,
como altas temperaturas, necessárias para um alto rendimento espaço-tempo; ou
para uma solução de substrato processável ou um ambiente quimicamente desafiador, como
como uma solução alcalina de detergente para a roupa.
Enzimas de extremófilos, como as termozimas, têm potencial tanto como
próprios produtos, ou como catalisadores, ou podem ser usados como fontes de ideias para
modificar enzimas derivadas de mesófilos. A maioria das termozimas mantém sua
propriedades termorresistentes quando expressas em um organismo mesófilo como
3 Isolamento e Preparação de Microrganismos
Proteína Topt Ns Nr
Rubredoxina (Pyroccocus furiosus) 100 4 4,2
Glutamato desidrogenase (Pyrococcus furiosus) 100 42 25
Glutamato desidrogenase (Thermatoga maritima) 80 30 24
Proteína ribossômica (Thermus thermophilus) 75 9 6,8
Superóxido dismutase (Mn, Fe) (Thermus thermophilus) 75 10 10,1
Malato desidrogenase (Thermus flavus) 75 17 16,7
3-isopropilmalato desidrogenase (Thermus aquaticus) 75 29 19,5
Fator de alongamento Tu (Thermus aquaticus) 75 36 28,3
Seril-tRNA sintetase (Thermus thermophilus) 75 36 28,6
Tabela 3.3 Correlação entre número de pontes salinas e maior resistência à temperatura.
Ns: número de pontes salinas;
Nr: número de pontes salinas estatisticamente esperadas para aquela estrutura proteica.
Fonte: Karshikoff (2001).
55
Escherichia coli (Niehaus, 1999). Enquanto os halófilos (Margesin, 2001) e os piezófilos (Abe,
2001) têm atraído a atenção, o principal aspecto de interesse para aplicação biotecnológica continua
sendo a estabilidade térmica, concentrando o interesse nos termófilos.
ou mesmo hipertermófilos. O aumento da temperatura tem uma influência significativa sobre
a biodisponibilidade e solubilidade de compostos orgânicos (não na solubilidade de O2,
no entanto, que é quase zero em temperaturas extremofílicas!). As aplicações atuais das
extremozimas incluem:
y amilases e glucoamilases estáveis ao calor de organismos como Pyrococcus woesei
ou Thermococcus profundus para a degradação do amido. Enzimas termoestáveis
pode melhorar os processos industriais de bioconversão de amido, reduzindo as etapas com
mudanças de temperatura e simplificação das condições através da redução de sal e maior
acidez (Niehaus, 1999).
y conversão de glicose em uma mistura de 55% de frutose-glicose (milho rico em frutose
xarope, HFCS) realizado com glicose isomerase (GI) (ver Capítulo 7, Seção
7.3.1 e Capítulo 19, Seção 19.1), um mercado enorme. Para atingir os 55% desejados
concentração de frutose, igual em doçura ao mesmo peso de sacarose, sem a etapa de concentração
cromatográfica atualmente necessária, a reação
teria que ser executado a 110 °C. Apesar do desenvolvimento de um IG termoestável melhorado a
partir de enzimas mesófilas (Crabb, 1997), a aplicação de um GI termofílico
isomerase de glicose, como GI de Thermus maritima (estável até 100 °C com
uma meia-vida de 10 minutos a 115 °C) poderia aproximar essa visão da aplicação industrial.
e degradação de proteínas. As enzimas proteolíticas são responsáveis pela maior aplicação
comercial de enzimas em todo o mundo (Niehaus, 1999). As serina proteases são usadas em
detergentes de linha alcalina para lavanderia doméstica. Uma variedade de proteases estáveis ao
calor, algumas
com meia-vida de 4 h a 95 °C, foram identificados em archaea hipertermofílicas
pertencente aos gêneros Desulfococcus, Sulfolobus, Staphylothermus, Thermococcus,
e Pyrococcus (Niehaus, 1999). A lavagem a temperaturas mais elevadas reduz o
quantidade de detergente sem diminuir a eficiência da lavagem.
y cepas resistentes a solventes. Considerando que solventes orgânicos podem ser aplicados para
formações de biotrans (Capítulo 12) (Nicolova, 1993) e solventes hidrofóbicos especialmente
são compatíveis com a atividade enzimática (Capítulo 12, Seção 12.1), solventes hidrofóbicos ou
orgânicos, como tolueno ou benzeno, são tóxicos para os organismos vivos porque
eles se acumulam e rompem as membranas celulares. Curiosamente, a tolerância aos solventes
orgânicos, que afinal constituem outro ambiente extremo, pode em grande parte
ser encontrado em mesófilos. A maioria das cepas de Pseudomonas tolera tolueno, heptanol,
e dimetil ftalato, enquanto apenas duas cepas de águas profundas, um típico extremofílico
fonte, mostram tolerância contra benzeno e tolueno (Isken, 1998).
e por último não menos importante, DNA polimerases (E.C. 2.7.7.7). Em vez do Klenow termolábil
enzimas usadas nas primeiras versões de PCR (reação em cadeia da polimerase, Capítulo 4,
3.4 Extremófilos
56
Seção 4.3), que deveria ser reabastecido a cada novo ciclo, a aplicação de
polimerases estáveis ao calor de organismos como Thermus aquaticus (polímera Taq), Pyrococcus
woesii (polimerase Pwo), Pyrococcus furiosus (polimerase Pfu),
ou Thermococcus litoralis (Vent polimerase) facilitou a automação da térmica
processo de ciclagem.
3.5
Triagem Rápida de Biocatalisadores
Várias publicações recentes mostraram (Winson, 1997) que o método de triagem de um grande
número de amostras de outra forma indeterminadas para determinados alvos com
um ensaio para uma atividade ou propriedades específicas, a abordagem de triagem aleatória, tem
cresceu aos trancos e barrancos devido à maior capacidade de lidar com grandes quantidades
de amostras por triagem de alto rendimento (HTS).
y Em vez do número convencional de 96 poços em uma placa, placas de 384 poços e
até placas de 1.536 poços estão agora em uso.
y Sistemas robóticos com capacidade de localizar colônias únicas em uma placa, de cultivar
colônias em uma placa e de inocular em cultura líquida permitem a triagem de até 1.000
cepas por semana. Dada a necessidade de rastrear cerca de 10 a 100.000 cepas para
para encontrar um biocatalisador útil, isso significa que se poderia esperar que o processo levasse
10-100
semanas para um avanço.
y As empresas farmacêuticas hoje podem testar até 50.000 compostos por dia para
atividade farmacológica (com até 20 testes de atividade simultaneamente), 30 vezes
a capacidade em comparação com até três anos antes.
Os métodos convencionais de triagem, como
y isolamento de microrganismos na vizinhança de habitats com maior concentração do substrato,
como alcanos, na vizinhança de poços de petróleo,
seleção de cepas com base na proximidade taxonômica de cepas anteriores bem-sucedidas,
e
enriquecimento de culturas,
estão sendo cada vez mais substituídos ou complementados por novos métodos.
Exemplos de tais métodos novos são:
y Métodos de PCR e rRNA, baseados em parte em sequências de nucleotídeos publicadas de
proteínas com perfil de atividade semelhante;
y clonagem para alta expressão (Capítulo 4) com hospedeiros altamente transformáveis, como
E. coli ou Aspergillus oryzae;
seleção de células únicas por meio da identificação de células interessantes, principalmente em
suportes sólidos, com a atividade desejada, e coleta com braços robóticos para posterior cultivo; e
Juntamente com o aumento do sequenciamento do genoma, aceleração da busca por enzimas
semelhantes em diferentes organismos usando pares de primers relacionados em PCR.
3 Isolamento e Preparação de Microrganismos
57
O sistema de ensaio ideal para HTS incluiria a manipulação automatizada de
poços e cada um deve ser testado para uma variedade de atividades simultaneamente. Um de
o principal desafio é desenvolver um ensaio simples e sensível o suficiente para detectar atividades
enzimáticas que possam estar abaixo do seu nível ideal nas condições do ensaio.
Atualmente, novos métodos colorimétricos, de luminescência e de fluorescência têm sido
estabelecido em HTS com testes compostos multiplex automatizados (normalmente 10–20
compostos por poço) (Winson, 1997).
As mesmas estratégias de triagem podem ser aplicadas à engenharia de atividades usando evolução
dirigida (Capítulo 11), uma vez que a seleção de células únicas é importante para a triagem de
mutantes. A detecção da diversidade genética através de mutagênese aleatória pode ser alcançada
usando o Sistema de Ensaio de Esferas Enzimáticas de Fluorescência (FEBAS), no qual um
substrato distribuído torna-se um produto localizável por fluorescência após catálise por
enzimas ligadas às contas. Com este método, volumes tão pequenos quanto 750 nL podem ser
triados em gotas de 0,5–3,5 nl, e as células que apresentam o produto de interesse podem ser
identificado por Varredura Nanoespectroscópica Confocal (CNS) (Winson, 1997).
Outra estratégia explora os ácidos nucleicos de diversos organismos onde é
não é necessário isolar as próprias bactérias. Esta abordagem tem benefícios particulares porque
apenas uma pequena fração dos organismos num determinado habitat é cultivável.
(Tabela 3.4).
Condições de cultura desconfortáveis (como é frequentemente o caso dos extremófilos) ou
até mesmo a incapacidade de cultura pode ser evitada pela clonagem dos ácidos nucleicos de
esses organismos em vetores de expressão de plasmídeos e fagos baseados em E. coli, denominados
“bibliotecas genômicas” (Capítulos 4 e 11). The Diversa Company (San Diego, CA,
EUA) é especializada em melhorar a acessibilidade de enzimas de organismos que de outra forma
não seriam cultiváveis. O procedimento é fortemente dependente da fonte do genoma
DNA, pois o DNA para a construção dessas bibliotecas deve ser totalmente puro. Em especial
casos, uma etapa intermediária de cultura de enriquecimento primário pode ser necessária,
com subsequente purificação do DNA genômico de tais culturas. Triagem destes
bibliotecas consistem
As células hospedeiras são cultivadas para atingir a expressão máxima de inserções clonadas. Um
simples
mas é utilizado um ensaio de fluorescência altamente sensível, com um substrato de baixa
fluorescência resultando num produto altamente fluorescente. Após clones ativos adequados terem
obtido, a inserção é sequenciada e o quadro de leitura aberto resultante é
identificado. O gene alvo é subclonado (transferido para um vetor mais adequado, provavelmente
eliminando regiões não codificantes naquela inserção genômica) para expressão de alto nível. A
recente aplicação da filogenia molecular (Capítulo 14) a amostras ambientais resultou na descoberta
de uma abundância de amostras únicas e anteriormente
microrganismos não reconhecidos. A grande maioria desta diversidade microbiana tem
mostrou-se refratário ao cultivo. As células foram encapsuladas em microgotículas de gel para
cultivo microbiano massivamente paralelo sob condições de baixo fluxo de nutrientes, seguido por
citometria de fluxo para detectar microgotículas contendo microcolônias (Zengler,
2002). A técnica foi aplicada a amostras de água do mar e solo. O
capacidade de cultivar e investigar organismos anteriormente não cultivados em cultura pura
serve dois objetivos: (i) fornecer uma fonte de novas funções enzimáticas microbianas; e
(ii) melhorar a compreensão da fisiologia microbiana e da adaptação metabólica