1991_Book_Micropropagation

Problems in tissue culture: culture contamination

Problemas na cultura de tecidos: contaminação da cultura

A.C. CASSELLS].

Introdução

A contaminação na cultura de tecidos pode se originar de duas fontes, seja por meio do
transporte de microrganismos na superfície ou nos tecidos dos explantes, ou por meio de
procedimentos falhos em laboratório. As superfícies das plantas são habitats para
microrganismos (Campbell, 1985). No decurso do crescimento e desenvolvimento da planta,
muitos microrganismos que habitam a superfície e a rizosfera podem entrar nos tecidos da
planta através de aberturas naturais, feridas, etc. de forma oportunista e em graus variáveis
colonizar os tecidos da planta. Além disso, patógenos facultativos e obrigatórios podem
colonizar plantas de forma semelhante, ser assistidos por vetores ou possuir mecanismos de
penetração na planta hospedeira (Tarr, 1972; Matthews, 1981). As plantas podem, assim,
desenvolver 'floras' endofíticas de composição de espécies variáveis consistindo em
microrganismos inter e intracelulares, incluindo vírus, viróides, procariontes (bactérias e
agentes semelhantes a bactérias) e fungos. No estabelecimento de culturas de tecidos,
dependendo do explante usado, microrganismos de superfície e endofíticos podem ser
transportados para a cultura. Na cultura do meristema, dependendo do tamanho do
meristema, a maioria dos organismos será eliminada, enquanto na folha, pecíolo ou explante
do caule, a maioria, senão todos os microrganismos nos tecidos podem ser transportados.
Muitos dos microrganismos que provavelmente estão presentes intercelularmente, em tecidos
de plantas serão capazes de crescer no meio de cultura de tecidos de plantas, embora alguns
possam ser inibidos pela alta concentração de sal ou sacarose e o pH (Cassells et al., 1988 )
Organismos adaptados podem ultrapassar rapidamente os tecidos vegetais de resposta mais
lenta. Microrganismos menos bem adaptados podem proliferar nos tecidos do explante,
aproveitando o suprimento de nutrientes mais abundante do vazamento dos tecidos
danificados. Uma forma de enriquecimento ocorre e pode acelerar a morte dos explantes.
Estes últimos microrganismos podem causar um efeito de 'halo' em torno do explante que
pode ser visto pelo exame da cultura contra a luz de fundo.

Neste capítulo, é feita uma distinção entre organismos expressos e organismos subliminares,
ou seja, cuja presença não é detectada pelas observações realizadas. Os microrganismos
latentes ou subliminares podem ser rapidamente expressos na transferência para novos
meios, e. na transferência do Estágio 2 para 3, particularmente onde a concentração de sal e
sacarose no meio é reduzida (Cassells et al., 1988). Contaminantes de cultura de tecidos,
mesmo aqueles que são subliminares, podem causar perdas econômicas para o
micropropagador, ao ultrapassar a cultura, matando o explante ou tornando-o impróprio para
subcultura. Este problema é exacerbado quando o contaminante não é expresso durante os
estágios iniciais para ser expresso a jusante da produção. Em segundo lugar, contaminantes
subliminares podem afetar a produtividade in vitro e das plantas descendentes (Long et al.,
1988; Leifert et al., 1989a). Incluídos nos contaminantes não expressos ou subliminares podem
estar patógenos latentes da cultura ou de outras culturas. Ambas as classes podem causar
perdas econômicas quando as microplantas são expostas a diferentes regimes de nutrientes
ou ambientes (Hayward, 1974). As perdas econômicas dependem do tipo de negócio em que o
micropropagador está (Jones, 1986), viz. fornecimento de culturas in vitro a viveiros externos
para crescimento ou crescimento interno. Aqueles que comercializam internacionalmente em
culturas in vitro estão particularmente em risco quando a inspeção fitossanitária está
envolvida e uma única cultura contaminada detectada pode resultar na destruição de toda a
remessa. Em culturas comercializadas, microplantas, etc., onde o estado de saúde é
certificado, os clientes podem tomar medidas legais e reclamar perdas consequentes por mau
desempenho.
Por todas as razões anteriores, o micropropagador deve exercer controle de qualidade sobre a
produção (Cassells, 1990a). A base dos aspectos fitopatológicos do controle de qualidade são:

1. Conhecimento da extensão e história natural de possíveis contaminantes da cultura,

incluindo patógenos específicos (Preece, 1988; Tabelas I e 2, Fig. I).

2. Preparação adequada da planta doadora (Debergh & Maene, 1981), incluindo tratamentos
para reduzir ou eliminar patógenos e endófitos promíscuos (Cassells, 1986; Cassells et al.,
1988) com base em técnicas de triagem de som.

3. Confirmação do status axênico (livre de contaminantes) das culturas no Estágio 1 (ou antes
da multiplicação clonal em massa) após o emprego de estratégias para obter culturas
saudáveis e novamente com base em métodos de triagem confiáveis.

4. Monitoramento rigoroso da produção para confirmar o status axênico das culturas. Na

produção em grande escala, isso exigirá a produção de amostragem e depende de um
protocolo de amostragem apropriado (Cassells, 1990b).

5. A consciência de que o espectro de microrganismos contaminantes pode se alterar com o

tempo na cultura. Isso é um reflexo de uma mudança na origem da contaminação daqueles
associados à planta doadora para aqueles que habitam o laboratório, incluindo a equipe
(Tabela 3; Leifert et al., 1989b). Também pode ocorrer contaminação introduzida por ácaros,
etc. (Blake, 1988).

6. Monitoramento da progênie com base na amostragem da produção. Isso pode ser realizado
em associação com o teste da estabilidade genética da produção (Cassells, 1990a). A
preocupação subjacente é que organismos latentes podem estar presentes clonalmente
abaixo do nível de detecção. Estes só podem ser expressos ou detectáveis em tecidos em
maturação ou maturidade das plantas descendentes.
Para os fins deste artigo, todos os microrganismos presentes em culturas de tecidos serão
considerados potencialmente prejudiciais e considerados contaminantes.

2. Os efeitos de microrganismos contaminantes em culturas in vitro

É difícil obter informações sobre perdas por contaminação na micropropagação por motivos
comerciais, mas a indústria está preparada coletivamente para reconhecer a gravidade do
problema (Wright, 1986). As perdas podem ser prontamente atribuídas ao excesso de culturas
no Estágio 1, o que pode impedir a introdução na cultura de genótipos específicos, e à
contaminação laboratorial devido à falha dos sistemas, infestação por ácaros e tripes (Blake,
1988) ou técnica estéril inadequada. Os últimos são passíveis de melhoria por meio de práticas
de trabalho aprimoradas, enquanto os primeiros não devem resultar em grandes perdas, visto
que as entradas para o Estágio 1 são relativamente baixas. Perdas mais sérias podem ser
atribuídas a perdas tardias no Estágio 2 ou em estágios subseqüentes, quando os insumos são
altos em mão de obra, materiais, custos, etc. Perdas em grande escala deste tipo são mais
prováveis de ser uma consequência de um monitoramento inadequado da produção
combinada com a multiplicação clonal de estoque infectado subliminarmente. Quando tal
contaminação subliminar é expressa, e. na transferência para um meio não supressor, resulta
em perda. Discutivelmente, muitos micropropagadores não avaliam a ameaça representada
pela contaminação subliminar, a menos que expressa em perdas catastróficas como acima.
Quanto mais a jusante que a contaminação é expressa, maiores são as perdas potenciais, seja
devido à transmissão clonal latente de contaminantes, patógenos da cultura ou patógenos
facultativos. As últimas perdas podem exceder os custos de produção, incluindo despesas
gerais e lucro quando um cliente processa por danos devido a perdas consequentes.
Argumenta-se aqui que, por todas as razões acima, serviços fitopatológicos adequados devem
ser usados pelo micropropagador para atingir altos padrões de controle de qualidade. A
produção deve ser baseada apenas na multiplicação de estoques axênicos e deve envolver
monitoramento contínuo. A triagem deve envolver indexação de cultura para patógenos
cultiváveis e indexação sensível específica para patógenos conhecidos da cultura (Cassells,
1990b).

3. Organismos associados às superfícies das plantas

Os principais microrganismos associados às superfícies das plantas são fungos, incluindo

leveduras (Fig. 1), bactérias (Tabela 1) e molicutos (micoplasmas, espiroplasmas e organismos
relacionados; Tabela 2) (Bove, 1988). Não é apropriado reviev. ' a extensa literatura da área
aqui (ver, por exemplo, Campbell, 1985), mas algumas generalizações podem ser feitas.
Deixando de lado as formas dominantes, os microrganismos que habitam as superfícies das
plantas devem derivar nutrição da planta. Assim, áreas onde os alimentos são mais
abundantes, por ex. nectários, feridas, tecido senescente, são mais propensos a sustentar
grandes populações (Preece, 1988). Também é importante lembrar que as populações de
bactérias e fungos podem se acumular em resíduos de insetos. Além disso, fendas, cabelos
densos e superfícies mucilaginosas podem abrigar microorganismos. Consequentemente, os
microrganismos podem escapar dos efeitos dos esterilizantes de superfície no Estágio 1.
Também é apropriado no presente contexto considerar todos os microrganismos que habitam
a superfície como endófitos facultativos potenciais, isto é, eles podem entrar nos tecidos do
hospedeiro através de aberturas naturais ou feridas, ou, como patógenos fracos, são capazes
de colonizar os tecidos do hospedeiro. Da mesma forma, a rizosfera, incluindo microrganismos
de rizoplano, pode se estabelecer dentro dos tecidos do hospedeiro. A consequência da
entrada nos tecidos do hospedeiro é que tais microrganismos podem escapar dos efeitos dos
esterilizantes de superfície para subsequentemente colonizar o explante ou invadir a cultura
no Estágio 1 ou meios subsequentes. Em resumo, deve-se prestar muita atenção na seleção do
explante para evitar fontes de explante que são mais propensas a abrigar microorganismos e
que, em virtude da superfície ou caráter do explante, podem escapar dos efeitos dos
esterilizantes de superfície. Além do protocolo delineado por Debergh & Maene (1981) para o
Estágio 0 que visa reduzir a contaminação microbiana da planta doadora, estratégias para
coletar explantes de plantas no campo foram propostas (Duhem et a!., 1988; Enjalric et a!.,
1988).

4. Microrganismos endofíticos

Da Seção 2, segue-se que relações promíscuas podem ser estabelecidas entre os tecidos da
planta e uma ampla gama de microorganismos que habitam a superfície da planta. Em alguns
casos, a colonização pode ser localizada; em outros, dependendo da anatomia dos tecidos etc.,
a colonização pode ser sistêmica ou quase isso. No caso de microrganismos patogênicos que
possuem mecanismos para entrar na planta, pode haver patogênese ou latência. Esses
microrganismos endofíticos intercelulares escapam aos efeitos dos esterilizantes de superfície.
Uma segunda classe de microrganismos endofíticos são as formas intracelulares. Estes incluem
vírus e viróides e procariotas geralmente fastidiosos, os últimos incluem as formas L de
bactérias comuns associadas a plantas, e. de Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium e
Pseudomonas (Madoff, 1981), procariotos sem parede (McCoy, 1981) e as bactérias fastidiosas
associadas a tecidos vasculares de plantas (Davis et a!., 1981). Esses microrganismos variam
em cultivabilidade de intratáveis (bactérias fastidiosas) a não cultiváveis (vírus e viróides). Eles
também podem ser latentes e a distribuição pode ser restrita ao floema ou xilema, localizada
ou sistêmica; a replicação pode ser cíclica (Matthews, 1981). Patógenos intracelulares são
geralmente transmitidos por vetores, embora alguns possam se espalhar pelo contato entre
plantas infectadas e saudáveis (Matthews, 1981; Walkey, 1985). Eles são capazes de
transmissão clonal em propágulos vegetativos ou em propagação vegetativa.

s. Contaminação endofítica da planta de estoque

Dada a gama de microrganismos que habitam as superfícies das plantas e a variedade de

patógenos vegetais, não é surpreendente que a investigação tenha mostrado a presença de
microrganismos intercelulares em todos os tecidos da planta (Bastiaens, 1983). Isso é
particularmente verdadeiro para plantas em propagação de longo prazo ou em áreas de alta
diversidade biológica. As plantas cultivadas anualmente a partir de sementes tendem a ser
menos contaminadas. Da mesma forma, as safras de longo prazo tendem a acumular
microorganismos intracelulares. É bastante comum para células de colheitas propagadas
vegetativamente, e. batata, para abrigar complexos de vírus (de Bokx, 1972), ou seja, hospedar
mais de um e, às vezes, vários vírus.

6. Triagem de plantas doadoras para microrganismos contaminantes

Provavelmente, a principal fonte de contaminação na cultura de tecidos é a planta doadora. Se

explantes axênicos forem estabelecidos, a contaminação subsequente será devido a técnicas
ou procedimentos defeituosos e é potencialmente controlável. Conclui-se, portanto, que é
lógico fazer a triagem das plantas doadoras em busca de indivíduos 'limpos', rejeitando plantas
altamente contaminadas. Em segundo lugar, pode ser mais fácil detectar contaminantes nos
tecidos maduros da planta doadora, onde a expressão de sintomas e / ou altas populações
podem existir, do que em culturas in vitro onde os sintomas e as populações podem ser
suprimidos. Uma estratégia proposta seria rastrear a presença de organismos cultiváveis por
indexação de cultura em meios fúngicos e bacteriológicos. Testes específicos para patógenos
de cultura conhecidos também devem ser realizados (Tabela 3; Cassells, 1990b). Os últimos
testes devem ser para organismos inter e intracelulares. Com base nessas informações, plantas
individuais podem ser rejeitadas ou aceitas como doadoras de explante. As plantas
contaminadas podem ser tratadas, e. cultivado sob condições de Estágio 0 com ou sem
antibióticos ou sujeito a terapia de calor, cultura de meristema, etc. (ver Cassells, 1986, 1987;
Cassells et al., 1988). Essa abordagem serve a dois propósitos. Em primeiro lugar, o
micropropagador pode reduzir potencialmente as perdas no Estágio 1. Em segundo lugar, o
micropropagador sabe quais organismos provavelmente serão transmitidos para a cultura no
Estágio 1. O último é valioso quando a eliminação de patógenos da cultura está envolvida, uma
vez que o monitoramento a jusante pode ser planejado. Algumas palavras de cautela devem
ser introduzidas ao discutir a aplicação de antibióticos em plantas e tecidos vegetais. Em
primeiro lugar, a aplicação de antibióticos a plantas é proibida ou restringida em muitos países
e devem ser feitas investigações locais sobre a legislação. Em segundo lugar, quando
permitido, apenas os antibióticos de primeira geração podem ser permitidos. Também é
necessário que o usuário determine a sensibilidade ao antibiótico do organismo alvo e a
concentração inibitória mínima (CIM) antes da aplicação do antibiótico. Quando a aplicação é
em plantas intactas, pode ser difícil atingir a CIM nos tecidos-alvo devido às barreiras de
permeabilidade e à falta de transporte direcionado. Argumentos semelhantes se aplicam ao
uso de produtos químicos antivirais (Cassells, 1983). Um risco do uso de produtos químicos
antifúngicos, antibacterianos e antivirais é que o modo de ação pode ser bioestático em vez de
biocida. Para uma revisão mais detalhada do uso de antibióticos, ver Russell & Quesnel (1983).

7. Métodos e metodologia de triagem

7.1. Triagem de contaminantes cultiváveis

Felizmente, a maioria das bactérias que habitam as plantas são capazes de crescer em meios
relativamente simples (Lelliott & Stead, 1988; Schaad, 1980). No entanto, dois fatores podem
produzir resultados falsos. Em primeiro lugar, a presença de taninos nos extratos de seiva pode
inibir o crescimento de microrganismos. Isso pode ser evitado através da cultura de discos de
tecido de explante em meios bacteriológicos. Em segundo lugar, a amostragem da cultura
pode resultar no teste do material de escape. Aqui, é provavelmente melhor rastrear a base do
explante ou obter amostras superiores e basais, deixando a seção intermediária para a
subcultura. Uma outra fonte de erro importante pode ser o procedimento de amostragem
inadequado (Cassells, I 990b). A contaminação não pode ser distribuída aleatoriamente, ou
seja, ter uma distribuição de Poisson, ao longo da produção. Se explantes individuais
contaminados no Estágio I forem passados para a produção, a porcentagem de progênie
contaminada refletirá a porcentagem que os explantes parentais fizeram para a produção
total. Se, no entanto, a contaminação entrar no sistema durante a produção, ela pode ser
aleatória, e. devido a contaminação aérea ou transmitida por ácaros, ou pode ser em blocos, e.
onde, durante uma execução de produção, a técnica do operativo falhou e toda a produção
posterior desse lote foi contaminada. As necessidades de amostragem devem refletir este
problema e são melhor acomodadas por amostragem aleatória em um nível adequado.
Quando a contaminação é detectada, o lote em questão deve ser rastreado in toto. Para
facilitar esta abordagem, é necessária uma rotulagem informativa e de fácil leitura. Isso pode
ser alcançado em parte pelo uso de etiquetagem de preço / data que pode ser codificada por
cores ou mais eficientemente pelo uso de etiquetagem de código de barras computadorizada.

7.2. Microrganismos específicos do frasco de triagem

O teste de microrganismos específicos por métodos clássicos envolveu o uso de meios

selecionados, testes microscópicos e bioquímicos para bactérias (Bradbury, 1988) e
organismos semelhantes a bactérias, e inoculação de plantas de teste para vírus (Matthews,
1981). No entanto, esses métodos podem ser muito trabalhosos, caros e lentos. Um
diagnóstico mais rápido de bactérias e leveduras pode ser alcançado pelo uso de kits de teste
comerciais. Embora satisfatórios para contaminação 'laboratorial', a principal aplicação desses
kits é nos setores animal, médico e alimentar e, conseqüentemente, a composição do kit pode
não ser ideal para a identificação de bactérias associadas a plantas (Collins & Lyne, 1985).
Também estão disponíveis comercialmente um número crescente de kits de ELISA e sondas de
DNA. O ELISA, em particular, obteve ampla aceitação (Miller, 1990). Também é possível
aumentar ou comprar anticorpos (McAskill, 1990) e construir kits de ELISA pelo uso de
intensificadores de sinal marcados com enzimas comerciais (Amersham PIc, Oxford, UK). Um
cuidado com relação ao uso de kits comprados e, na verdade, anti-soro interno, é que ele pode
ser específico de uma cepa muito restrita. Assim, as cepas que não reagem podem passar na
detecção. Sempre que possível, devem ser realizados testes de confirmação, por ex. testes de
inoculação de plantas para vírus (AAB / CMI, 1970 até o momento). Embora possa ser viável
realizar a indexação de cultura interna e ELISA usando anti-soro adquirido, a triagem
especializada ou o teste de confirmação podem ser mais apropriadamente contratados para
laboratórios comerciais. Para as principais safras mundiais, por ex. batata, pode ser possível
obter culturas certificadas livres de doenças de laboratórios comerciais / estaduais. Para
culturas ornamentais, este material pode estar disponível em departamentos universitários ou
fontes comerciais.

Em qualquer caso, o laboratório fornecedor pode, exclusivamente, ter a experiência necessária

para fornecer serviços fitossanitários para o micropropagador.

8. Triagem de culturas de tecidos e plantas descendentes

8,1 Triagem de culturas de estágio 1

A contaminação no Estágio 1 se origina do explante (ou procedimentos defeituosos, veja

abaixo) e pode invadir o meio e, assim, ser detectada visualmente ou passar subliminarmente
com o risco de expressão downstream (consulte a Seção B). A questão da transferência do
inóculo nas superfícies do explante foi mencionada acima e a preparação do explante pode ser
inadequada (ver George & Sherrington, 1984; Duhem et al., 1988; Enjalric et al., 1988). Onde o
explante parecer não contaminado, pode ser necessário aumentar o volume do material para
fornecer o material adequado para o teste. Isso pode envolver a transferência para a mídia do
Estágio 2. Baixo título de contaminantes pode frustrar a detecção em extratos de seiva de
explantes primários devido à ação inibitória de produtos vegetais. Este problema pode ser
superado na fase de aumento de volume. O enriquecimento de contaminantes também pode
ser obtido através da cultura de seções de tecido, em vez de extratos de seiva, em meios
bacteriológicos (Cassells, 1990b). A triagem deve incluir os dois elementos padrão. Em
primeiro lugar, o teste de organismos cultiváveis e, em segundo lugar, a triagem de patógenos
conhecidos da cultura. Apenas as culturas negativas em ambos os aspectos devem ser
multiplicadas por clonagem no Estágio 2. As culturas contaminadas devem ser mortas por
autoclavagem, etc., antes de serem descartadas para evitar a contaminação do laboratório.

8,2. Triagem de culturas do Estágio 2

Recomenda-se que apenas as culturas axênicas sejam proliferadas no Estágio 2. É discutível,

entretanto, se o status axênico pode ser alcançado para todas as culturas a um custo
econômico na micropropagação comercial. Deve ser apreciado que a magnitude deste
problema depende da origem da planta, do conhecimento de sua patologia e da
disponibilidade de procedimentos de triagem. Se a recomendação de que apenas as culturas
axênicas são proliferadas no Estágio 2 for seguida, então qualquer contaminação surgindo no
Estágio 2 virá de técnicas ou procedimentos defeituosos. As principais fontes são
instrumentos, onde a levedura pode passar pelo procedimento de esterilização com álcool,
esporos resistentes ao calor, e. Bacilos, que podem passar por esterilização por chama, ou
contaminação por bactérias, etc., que podem vir do micropropagador (ver Tabela 4). Os
microorganismos também podem entrar no sistema por falha da capela de fluxo laminar,
meios ou equipamentos não completamente esterilizados. A contaminação também pode
ocorrer nas salas de crescimento, onde a troca é possível entre o interior do recipiente de
cultura e a atmosfera externa. Este último pode ser evitado pelo uso de recipientes
permeáveis a gases selados (Cassells, 1990a).

Leifert et al. (1989b) monitoraram a variedade de bactérias cultiváveis isoladas de culturas ao

longo do tempo e forneceram valiosa confirmação dessa tendência, observando uma variação
com o tempo de bactérias associadas a plantas para ambientais! bactérias associadas a
humanos (Tabela 4). Aqueles que fazem a triagem de microrganismos cultiváveis devem estar
cientes dessa mudança no espectro de contaminantes.
8,3. Seleção do Estágio 3 e estágios subsequentes Para satisfazer os padrões de controle de
qualidade, todos os estágios de produção devem ser monitorados como no Estágio 2 de
produção. Igualmente importante, as plantas descendentes devem ser rastreadas
particularmente para patógenos conhecidos da cultura que podem, abaixo do nível de
detecção, ter sido transmitidos clonalmente na produção. Até o momento, existem poucos
estudos publicados sobre a detecção em culturas de tecidos de microrganismos intracelulares.
Gallenberg & Jones (1985) relataram a detecção de vírus de batata em culturas nodais de
batata. Mais investigações nesta área são urgentemente necessárias para confirmar a
generalidade das descobertas de Gallenberg e Jones. Uma estratégia de triagem integrada
proposta é apresentada na Tabela 5.

9. Conclusões

Muitas das generalizações tentadas nesta contribuição são baseadas em dados limitados.
Compreensivelmente, poucos micropropagadores despendem esforços na identificação de
contaminantes que invadem as culturas de estágio 1 e, por razões comerciais, eles relutam em
discutir seus métodos de triagem e os contaminantes encontrados. Houve algumas exceções
notáveis, por exemplo, o trabalho de Leifert et al. (1989a, b) e artigos apresentados em
Cassells (1988). À medida que a indústria amadurece e em face da resistência do consumidor
(Cassells, 1990a), padrões de controle de qualidade também surgirão. Além do reforço das
abordagens de triagem sugeridas aqui, um sistema de classificação para culturas também pode
ser necessário (ver Tabela 6 para categorias básicas). Será observado na Tabela 6 que
nenhuma categoria 'axênica' é proposta. Isso é um reconhecimento dos problemas associados
à confirmação de que o material in vitro é totalmente livre de contaminantes.

A falta de status axênico não representa um problema sério no comércio intra-estadual, onde
as plantas micropropagadas se integram aos esquemas de certificação de safras existentes
com base na observação e triagem da safra (Goff, 1986). A certificação de culturas para o
comércio internacional apresenta problemas mais sérios. A concessão de certificados
fitossanitários e inspeção fitossanitária de microplantas dependentes de exame visual é
inadequada pelas razões discutidas acima. As culturas de tecidos, ao contrário do material
vegetal vivo (in vivo), têm percebido vantagens na redução do risco de entrada de pragas
(Kahn, 1986). No entanto, existe o risco de que possam abrigar patógenos subliminarmente
latentes ou patógenos potenciais do hospedeiro ou de outras safras no país de importação. No
caso de alto risco, as autoridades de quarentena podem insistir em testes ou cultivo em
quarentena. Como Kahn (1986) apontou, a iniciativa é das autoridades quarentenárias do país
importador.