In vitro shoot bud differentiation from leaf segments of Achras sapota

S.D. PUROHIT*, A. SINGHVI and R. NAGORI

https://link.springer.com/content/pdf/10.1023%2FB%3ABIOP.0000024284.84740.75.pdf
Diferenciação in vitro de gemas brotadas dos segmentos foliares de Achras sapota

A diferenciação direta dos brotos foi alcançada nos segmentos foliares de Achras
sapota cv. Bola de críquete inoculada no meio de Schenk e Hildebrandt suplementado com 5,0
µM de thidiazuron e 8,88 µM de benzilaminopurina. As folhas da parte média dos brotos e os
segmentos obtidos da parte média das folhas apresentaram maior potencial para regenerar os
brotos. O exame histológico dos brotos em brotação em desenvolvimento mostrou sua
regeneração de novo com clara conexão vascular com os tecidos mãe.

Achras sapota (Sapotaceae), natural do México (Singh et al. 1970), é amplamente

cultivada por seus deliciosos frutos ricos em açúcar em muitos países tropicais, incluindo a
Índia. A falta de métodos adequados para reprodução e longo ciclo de reprodução dificulta a
melhoria desta planta. A tecnologia de DNA recombinante está surgindo como uma alternativa
importante para o melhoramento genético de plantas lenhosas, incluindo árvores frutíferas
(Khurana e Khurana 1999). A capacidade de regenerar plantas inteiras a partir de tecidos
somáticos é um pré-requisito para a transformação mediada por Agrobacterium ou biolística.
O desenvolvimento de um sistema regenerativo para sua integração no programa de
manipulação genética é uma necessidade imperativa em A. sapota. Nesta espécie, foram
relatadas culturas de mesocarpo e endosperma (Bapat e Narayanaswamy 1977, Litz 1989),
indução de calos e embriogênese precoce (Sachdeva e Mehra 1986) e micropropagação
através de ramificação axilar aprimorada de nós cotilédones (Purohit e Singhvi 1998).
O presente trabalho relata a diferenciação direta de brotações em A. sapota a partir de
segmentos foliares. Culturas proliferativas de brotos de Achras sapota L. cv. Bola de críquete
(com média de 6 nós) mantida em meio Schenk e Hildebrandt (1972; SH) contendo 8,88 µM de
6-benzilaminopurina (BAP) e que passaram por seis passagens de subcultura foram utilizadas
para obter explantes foliares (Purohit e Singhvi 1998 ).
As folhas da parte apical, média e basal da parte aérea foram colhidas e cortadas em 3
segmentos designados como partes proximal, média e distal, perpendiculares à costela média.
Eles foram então colocados em meio nas placas de Petri com o lado abaxial voltado
para o meio. As seguintes composições do meio foram testadas: SH + BAP (2,22 - 22,2 µM); SH
+ cinetina (Kn) (2,32 - 23,23 µM); SH + tidiazurão (TDZ) (5,00 - 10,00 µM); SH + BAP (8,88 µM) +
TDZ (1,00 - 10,00 µM), SH + ácido a-naftaleno acético (NAA) (2,69 - 26,85 µM); SH + ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D) (2,26 - 22,62 µM); SH + BAP (8,88 µM) + NAA (2,69 - 10,74 µM).
Todas as culturas foram mantidas sob temperatura de 28 ± 2 ° C, fotoperíodo de 16 horas com
irradiância de 45 µmol m-2 s-1 e umidade relativa de 60 - 70%.
Cada experimento foi repetido três vezes com 20 repetições. Seções de mãos livres do
desenvolvimento de brotos de brotações nos segmentos foliares foram branqueadas em
solução de hipoclorito de sódio a 2% (cloro ativo a 2%) por 10 - 20 s.
Após lavagem cuidadosa com água destilada, eles foram mantidos em solução de ácido
acético a 1,0% (10 - 20 s) para obter transparência. As seções foram subsequentemente
coradas com safranina (4-5 min) e montadas em 30-40% de glicerina. As observações foram
feitas sob contraste de fase (microscópio Nikon, Tóquio, Japão) e fotografias tiradas.
Reguladores de crescimento de plantas são necessários para a indução de brotações
nos segmentos foliares. Embora o BAP sozinho (8,88 µM) tenha induzido brotações em 18%
dos explantes, a melhor resposta foi obtida quando 8,88 µM de BAP foi combinado com 5,0
µM de TDZ (Fig. 1A, B, Tabela 1). TDZ e Kn, por outro lado, evocaram respostas
comparativamente ruins quando usadas individualmente. O enraizamento ocasional foi
observado na concentração de 1,0 µM de TDZ. A incorporação de auxinas (NAA e 2,4-D)
individualmente causou calos ou enraizamento induzido em alguns casos (Fig. 1C). Uma
combinação de diferentes concentrações de NAA com 8,88 µM de BAP induziu gemas de
brotação em todos os tratamentos, mas a porcentagem de resposta e o número de brotações
por segmentos de folhas em regeneração foram muito baixos em comparação com o BAP
usado isoladamente. Concluiu-se, portanto, que 8,88 µM de BAP combinado com 5,0 µM de
TDZ foi o melhor tratamento para indução do número máximo de gemas de brotação (ca. 25
por explante) em uma porcentagem maior (35%) de explantes foliares. O alongamento dos
brotos de brotação e sua multiplicação adicional estão sendo tentados para recuperar
plântulas completas através da nova rota adventícia de micropropagação.

Fig. 1. Efeito de PGRs na diferenciação de brotações em explantes foliares de A. sapota

cultivados em meio SH. Diferenciação e proliferação de gemas de brotação com 8,88 µM de
BAP e 5,0 µM de TDZ (A, B), indução de raízes com 26,85 µM de NAA (C) e seção transversal do
explante foliar cultivado, mostrando brotações de brotações adventícias e sua conexão
vascular com o tecido mãe (D )

A seção transversal do explante foliar cultivado coletado no primeiro dia mostrou

histologia normal da folha mostrando epiderme, mesofila e feixes vasculares. Cada uma dessas
camadas de tecido consistia em células diferenciadas e possuía organização celular
característica de uma folha de dicotiledônea normal. Após 18 dias, foi observada proliferação
de novas células na região do meio diafragma. Essas células continuaram se dividindo,
formando um grupo de pequenas células. Dentro de 22 dias em cultura, esse grupo de células
tornou-se pronunciado e poderia ser facilmente identificado como um meristemóide, o
precursor de um broto adventício. A proliferação contínua de pequenas células meristemóides
resultou em rápida expansão da área superficial e do volume total. Uma conseqüência dessa
expansão da massa celular foi a protrusão de um primórdio de botão acima da superfície da
folha que se tornou visível após 32 - 34 d em cultura. Após 40 dias, os primórdios das gemas
progrediram para o estágio inicial do desenvolvimento adventício das gemas. Tais botões de
brotação mostraram clara conexão vascular com os tecidos mãe (Fig. 1D).

Os dados apresentados acima demonstram claramente que a regeneração adventícia

das gemas é possível nos segmentos foliares de A. sapota cv. Bola de críquete. Hormônios que
controlam o processo organogenético em tecidos vegetais e órgãos cultivados in vitro já foram
examinados por muitos investigadores e o papel do BAP na diferenciação adventícia de gemas
foi demonstrado (por exemplo, Tanimoto e Harada, 1982). Nos estudos atuais, o BAP parece
ser mais eficaz que o Kn na indução de gemas adventícias nos segmentos foliares de A. sapota.
O BAP em combinação com o IAA isolado (Arockiasamy et al. 2002) ou junto com o sulfato de
adenina (Mishra 2002) foi considerado útil na diferenciação dos brotos das brotações dos
explantes foliares de Eryngium e Cajanus, respectivamente. TDZ, uma substância semelhante à
citocinina, tem sido efetivamente usada para induzir a regeneração de brotações em explantes
foliares de muitos dicotiledôneas (Huettman e Preece 1993). Fiola et al. (1990) mostraram que
o TDZ de alguma forma interage com citocininas para aumentar sua atividade. Nos explantes
foliares de A. sapota, uma combinação de TDZ com BAP provou ser estimulante na indução de
gemas adventícias. Resultados semelhantes também foram relatados para Picea glauca (Ellis et
al. 1991). Tanto a posição da folha na parte aérea quanto a parte da folha influenciam a
capacidade de regenerar brotações adventícias in vitro. Novas folhas próximas à ponta da
parte aérea e parte basal da folha apresentaram maior capacidade de regeneração (Caboni e
Tonelli, 1999), enquanto um gradiente de resposta da ponta à base da parte aérea, com as
folhas distais sendo mais responsivas e tendendo a formar mais brotações por folha em
regeneração foi relatada em Malus domestica (Fasolo et al. 1989). Nos segmentos foliares de
A. sapota da parte média das folhas, obtidos do segundo ou terceiro nós dos brotos
desenvolvidos in vitro, regeneraram mais brotos de broto. Os brotos das brotações podem
originar-se endogenamente do câmbio perivascular ou exogenamente das células epidérmicas
únicas, mas mostram filamentos procambiais definidos nos tecidos maternos, estabelecendo
uma conexão condutora entre os rebentos jovens e o sistema vascular da planta mãe (Haccius,
1978). Os estudos histológicos da presente investigação estabeleceram claramente a origem
endógena dos brotos da parte aérea, mostrando a continuidade da vascularização.