Indução de embriogênese somática em plantas lenhosas

Tasiu Isah

Abstract
A embriogênese somática, o programa de desenvolvimento in vitro pelo qual as células somáticas são
reprogramadas para passar por mudanças celulares e moleculares que as tornam competentes para produzir
embriões somáticos, foi alcançado com muitas plantas lenhosas. O programa envolve as etapas de aquisição
de competência, indução e expressão da via morfogênica pelas células e tecidos cultivados. A capacidade de
expressar o programa em células / tecidos cultivados é regulada por muitos fatores, incluindo genótipo, tipo
de explante e idade e condições de cultura. Em muitas plantas lenhosas, a embriogênese somática foi
alcançada com explantes imaturos maduros ou ambos. Os tecidos juvenis como embriões zigóticos imaturos
e maduros são considerados os melhores explantes para estabelecer culturas embriogênicas em plantas
lenhosas e o potencial para obter o declínio das culturas com o aumento da maturidade do explante.

Palavras-chave: Plantas lenhosas Árvores Explante Embrião zigótico Tecido embriogênico Embriogênese
somática Abreviações SE Embriogênese somática PGRs Reguladores de crescimento de plantas LCO Lipo-
quito-oligossacarídeos AGPs Proteínas de arabino galactan PEM Massa primária do embrião

Introdução
As plantas lenhosas são árvores ou arbustos com sementes de vida longa que produzem caules que
apresentam um aumento progressivo do diâmetro com o avanço da idade, por meio da adição de tecido
lenhoso pela atividade do câmbio vascular (Hackett 1985).
A propagação dos membros raros e em perigo através das sementes é limitada por desafios na
obtenção de sementes, sua produção em maior número, mas com menor viabilidade, bem como vários
requisitos para germinação (Winkelmann 2013). Os outros métodos de propagação vegetativa de estacas e
métodos tradicionais são empregados para a propagação e com muitas espécies se mostrando uma tarefa
difícil de alcançar (Winkelmann 2013). A tecnologia in vitro oferece uma estratégia alternativa de
propagação para aumentar os métodos convencionais. Embora a propagação in vitro seja uma alternativa, ela
se mostra difícil de ser proposta, pois a resposta depende da espécie, do genótipo, do estado fisiológico do
tecido e das condições de cultivo (von Aderkas e Bonga 2000). Mesmo assim, avanços são feitos na
propagação em massa e o número de plantas lenhosas propagadas por meio da cultura de tecidos está
aumentando em um ritmo rápido (Winkelmann 2013; Varshney e Anis 2014).
A embriogênese somática, um dos programas de desenvolvimento in vitro que mostra a totipotência
celular das células vegetais, é um programa embriogênico pelo qual as células somáticas são induzidas a
desenvolver células embriogênicas que mais tarde passam por muitas mudanças morfológicas e bioquímicas
para produzir embriões bipolares sem conexão vascular com o tecido embrionário (Quiroz-Figueroa et al.
2006).
A tecnologia oferece a capacidade de produzir um grande número de plantas lenhosas e clones elite e
pode ser útil na propagação em grande escala de árvores de alto valor. O programa embriogênico in vitro
compreende uma sequência de etapas definidas que incluem a formação e proliferação de tecido
embriogênico, maturação e germinação de embriões, e esforços sinceros foram feitos para melhorar a
embriogênese somática em muitas plantas lenhosas, mais no estágio de maturação (Thorpe e Stasolla 2001) .
A competência para o programa é o estado das células para responder à via organogênica por meio
da resposta aos sinais epigenéticos necessários para comprometer as células com a embriogênese somática.
A capacidade de uma única célula de expressar o programa depende de ser competente ou recalcitrante
(Loidli 2004; Verdeil et al. 2007).
A recalcitrância à embriogênese somática é encontrada com algumas plantas lenhosas, mas nas bem-
sucedidas, diferentes tecidos ou tecidos em vários estágios de desenvolvimento da mesma espécie ou
genótipo dão uma resposta diferente (Roberts et al. 1989; Jain et al. 2005; Bonga et al. . 2010). A aquisição
de competência embriogênica por células somáticas envolve a reprogramação de padrões de expressão
gênica levando a mudanças na fisiologia, metabolismo e morfologia das células cultivadas (Feher et al.
2003; Namasivayam 2007).
As características das plantas lenhosas que as tornam mais interessantes para propagação através do
programa incluem um período sazonal para o qual o tecido do explante adequado para o início das culturas
pode ser obtido e um compromisso de longo prazo necessário para uma pesquisa eficaz devido ao seu
crescimento lento na natureza (Bonga 1987; Tulecke 1987; Winkelmann 2013).
Desde a primeira indução de embriões somáticos relatada (Reinert 1958; Steward et al. 1958) e nas
primeiras espécies lenhosas (Rao 1965), o progresso é feito de aspectos fisiológicos nos primeiros anos para
mecanismos moleculares que regulam o programa, mas a maior parte dos estudos em coníferas e árvores
florestais (Tautorus et al. 1991; Attree e Fowke 1993; Minocha e Minocha 1995; Dong e Dustan 2000;
Stasolla et al. 2003, 2004; Stasolla e Yeung 2003; Karami et al. 2009; Teixeira da Silva e Malabadi 2012).
As condições de cultura e a juvenilidade do explante são os principais determinantes da indução da
embriogênese com essas plantas e, como mostrado em várias espécies e genótipos, a via é expressa apenas
quando embriões zigóticos ou gametófito feminino são usados para o início das culturas (para discussão, ver
Borchert 1976; Kendurkar et al. 1995; Elhiti e Stasolla 2011; Pullman e Bucalo 2011).
A necessidade de explante juvenil para estabelecer tecidos embriogênicos sugeriu uma difícil
reprogramação do programa de desenvolvimento somático para a embriogênese nas culturas da maioria dos
membros quando outros explantes não juvenis são usados (Pullman e Bucalo 2011). O tempo necessário
para expressar a competência embriogênica in vitro, definida como uma mudança na expressão gênica de
somático / gametofítico para embriogênico e posterior formação do tecido depende da espécie / genótipo e
das condições culturais (Namasivayam 2007) e na maioria das plantas lenhosas, qualidade de os embriões
obtidos e a taxa de conversão em plântulas foram pobres. Nas últimas décadas, os esforços foram na
propagação clonal de espécies lenhosas por meio da embriogênese somática para facilitar a propagação em
massa para conservação e transformação genética. Muitos progressos foram feitos nas condições que
controlam a indução de embriões somáticos e estágios posteriores de desenvolvimento com muitos gêneros
de plantas lenhosas como Populus, Betula, Tectona, Eucalyptus, Quercus, várias espécies de Pinus,
Pseudotsuga e em muitos outros (detalhes ver Ahuja 1993; Jain et al. 1995a, b, 1999a; Klimaszewska et al.
2007, 2015; Gomez-Garay et al. 2014).
Nas últimas décadas, o aumento das informações sobre a fase inicial da embriogênese somática de
plantas lenhosas mostrou um estágio de iniciação crítico como uma "mudança" que determina o rendimento
e a qualidade dos embriões. Portanto, aumentar o número de embriões induzidos em culturas, melhorar sua
qualidade e conversão em plântulas viáveis por meio da manipulação das condições de cultura para
estabelecer protocolos eficientes e confiáveis precisam de refinamento. O sucesso na direção depende da
compreensão dos estágios iniciais da embriogênese, cruciais para a conclusão bem-sucedida de outros
estágios. Apesar das limitações, a propagação eficiente de muitas plantas lenhosas através da via
embriogênica somática foi firmemente estabelecida, especialmente em membros que não podem ser
propagados por outros métodos vegetativos, enquanto em outros, vários atributos precisam ser estudados
(Thorpe e Stasolla 2001; Jain et al. . 2005).
Muitos estudos sobre o desenvolvimento (maturação) de embriões somáticos em plantas lenhosas
têm sido realizados, mas menos atenção é dada ao pré-requisito da fase de indução para outros estágios da
embriogênese somática. Nesta revisão, serão discutidos eventos, dificuldades e o papel dos tecidos do
explante na fase de indução da embriogênese somática de plantas lenhosas.

Aquisição de competências e processo de indução

Como as células somáticas cultivadas não são embriogênicas, são necessários estímulos para que
adquiram competência para a embriogênese somática. A aquisição do estado depende da desdiferenciação
que requer a ativação da divisão celular necessária para a manutenção do destino celular no novo programa
de indução dos embriões durante as vias de embriogênese somática direta e indireta. Uma comunicação
direta célula a célula retém o estado por meio de rodadas de divisões celulares (Pedroso e Pais 1995b; van
Arnold et al. 2002). As células embriogênicas competentes são células em um estado intermediário entre
somático e embriogênico, e a condição permite que elas respondam ao novo sinal de desenvolvimento (Yang
e Zhang 2010). A natureza dos "estímulos" necessários para adquirir e expressar a embriogênese in vitro
varia e é identificada pelo ensaio experimental de diferentes condições até que uma adequada seja
encontrada. A resposta é variável com genótipo, espécie, condição de cultura, fonte do explante (juvenil ou
maduro) e hormônios endógenos no explante (Jimenez 2001, 2005; Jimenez e Thomas 2005; Park et al.
2011; Moon et al. 2013).
Mas, as mudanças que as células somáticas precisam se tornar competentes para expressar a
embriogênese somática ainda não são claras, nenhum sinal aplicável que torne as células embriogênicas é
aceitável (Mordhorst et al. 1997; Namasivayam 2007; De-la-Pena et al. 2015). A aquisição da competência é
seguida pela proliferação das células, expressão da embriogênese in vitro por meio da diferenciação de
embriões somáticos. A maior densidade de células embriogênicas e não embriogênicas na cultura melhora a
proporção de células embriogênicas e o número de embriões produzidos (De Vries et al. 1988; Dodeman et
al. 1997; Jimenez 2001; Tokuji e Kuriyama 2003).
A divisão e a proliferação das células embriogênicas ocorrem de maneira coordenada, mas a perda da
sincronia resulta na reentrada na via embriogênica para formar uma nova geração de tecido embriogênico e a
repetição da divisão resulta na proliferação contínua de cultura embriogênica (van Arnold et al. 2002; You et
al. 2006). Nesse estágio, um estudo morfológico da aquisição de competência nas células mostrará três
formas de células:
(1) células que surgem devido à quebra da divisão sincronizada na fase inicial do desenvolvimento
embriogênico. Em angiospermas, eles são referidos como massas pró-embriogênicas, calos embriogênicos,
massa embriogênica, calos embriogênicos friáveis, massas embriogênicas embriogênicas em estágio pré-
globular ou com gimnospermas, agregados de células embriogênicas, massa suspensora embriogênica.
(2) Um grupo de células determinado a se desenvolver em embriões somáticos devido à perda
anterior da divisão síncrona que permitiu que células específicas entrassem no programa embriogênico,
encontrado na embriogênese somática direta ou recorrente e
(3) tecido embriogênico composto de compacto, duro e Massa de células em forma de calo nodular
delimitada por epiderme distinta. A primeira e a segunda são mais encontradas nas culturas embriogênicas
de plantas lenhosas e mudam da primeira para a última, ou vice-versa (Quiroz-Figueroa et al. 2006).
Os tecidos embriogênicos podem apresentar uma variedade de atributos morfológicos, incluindo
células pequenas com citoplasma denso e cabeças embriogênicas, a massa translúcida de tecido em contraste
com o tecido não embriogênico de cor escura. No entanto, características únicas podem ser encontradas em
um determinado grupo de plantas ou espécies lenhosas. Por exemplo, a massa do calo embriogênico no
abeto prateado pode ser distinguida como células pequenas e longas e incolores com pequenos núcleos e
grandes vacúolos e, quando corados, os núcleos aparecem vermelhos e longos (NawrotChorabik 2008).
Em algumas coníferas, o tecido embriogênico é composto de uma massa translúcida de pequenas
células altamente citoplasmáticas contendo embriões filamentosos imaturos com suspensor bem
desenvolvido e embrião próprio, enquanto o tecido não embriogênico carrega células parenquimatosas de
cor marrom ou verde sem estrutura específica (Stasolla et al. 2002) . Na maioria das coníferas, a
embriogênese somática é semelhante, embora requisitos específicos da espécie possam existir nos estágios
de diferenciação e maturação (Tautorus et al. 1991; Stasolla et al. 2002; Teixeira da Silva e Malabadi 2012).
A indução do tecido embriogênico depende de muitos fatores, incluindo a seleção adequada do
explante (juvenil ou maduro), os meios de cultura, os reguladores de crescimento de plantas (PGRs)
suplementados, outras substâncias de crescimento e o ambiente físico. Uma indução limitada ou falha pode
ser atribuída a um desequilíbrio na ordem dos fatores (Thorpe e Stasolla 2001; Pullman e Bucalo 2011). A
indução começa com a cultura de embriões zigóticos imaturos maduros selecionados ou outros explantes
juvenis em meio semissólido corrigido com PGRs, frequentemente a alta concentração de 2,4-D.
No entanto, o estágio de desenvolvimento do explante, a espécie, o genótipo e a concentração de
PGRs na cultura de mídia influenciam a frequência da indução (Litz et al. 1998). Por exemplo, calo
embriogênico foi induzido a partir de óvulos imaturos (Moore 1985), nucelo e explantes ovulares de Citrus
limon e C. volckameriana (Saad 1975) em meios corrigidos com 2,4-D, sem PGRs nos meios de cultura
(Sim et al. 1988 ; Wu et al. 1990) ou mesmo com adjuvantes de crescimento como o hidrolisado de caseína,
leite de coco e suco de laranja (Gosal et al. 1995). Em carvalho pedunculado e séssil, a indução das culturas
embriogênicas foi associada ao estágio de desenvolvimento do explante de embrião zigótico, e o explante de
embrião zigótico imaturo mostrou maior frequência de indução de 52-70% dentro de 5-7 semanas (Chalupa
2005). A frequência de indução tão baixa quanto 3–5% e alta quanto 50% foi obtida com Picea sitchensis
usando explantes de embriões zigóticos maduros e imaturos (Krogstrup et al. 1988; van Arnold e Woodward
1988).
O calo embriogênico foi obtido a partir do hipocótilo e da radícula de embriões zigóticos imaturos,
enquanto com outras regiões, o calo não embriogênico foi obtido em pinheiro (Jain et al. 1989). A
frequência de indução direta de embriões dependeu da área de explante foliar em Camellia japonica
(Pedroso e Pais 1995a). No pinheiro radiata, o tecido embriogênico foi iniciado pela cultura de
megagametófitos maduros contendo embriões imaturos no estágio inicial da fase pré-cotiledonar e o início
das culturas melhorou quando os embriões dissecados da semente foram cultivados (Walter et al. 2005).
 Após a indução bem-sucedida, as culturas embriogênicas continuam a crescer para produzir nova
massa quando regularmente subcultivadas em meio de manutenção fresco corrigido com auxinas ou
citocininas em concentração inferior ou igual ao meio de indução até que as culturas sejam estabelecidas
(Park 2002). No caso das coníferas, o crescimento heterogêneo é frequentemente observado nos tecidos
embriogênicos, e muitos modelos de proliferação de tecidos, incluindo embriogênese de clivagem, a
formação de novos embriões a partir de células do suspensor ou divisão celular assimétrica de células
individuais, foram propostos (van Arnold e Hakman 1988; Elhiti e Stasolla 2012). No entanto, a
poliembrionia de clivagem parece mais plausível, pois o mecanismo ocorre durante o desenvolvimento in
vivo de embriões sob certas condições (Elhiti e Stasolla 2012).
A manutenção a longo prazo das culturas no estado embriogênico é necessária para estudos sobre
embriogênese somática, e a espécie / genótipo é importante para a manutenção do estado (Breton et al. 2006;
Das e Rahman 2013). As culturas embriogênicas de Cryptomeria japonica eram compostas de misturas de
massa embriogênica primária e calos, mas quando a massa embriogênica era cultivada em um meio
separado, a capacidade embriogênica foi perdida. No entanto, a adição de aditivos como L-glutamina
restaurou a capacidade embriogênica com aumento da biomassa e acúmulo de glutamina (Ogita et al. 2001;
Klimaszewska et al. 2015).
Culturas embriogênicas de citros foram retidas por muitos anos em meios corrigidos com a mesma
concentração de PGRs ou reduzida ou mesmo outros adjuvantes de crescimento por meio de subcultura
regular (Gosal et al. 1995). Bambusa beecheyana jovem calo embriogênico induzido por inflorescência
reteve a competência por mais de 7 anos de cultura (Chang 1995). Mas, em tamarillo (Cyphomandra
betacea), culturas embriogênicas foram induzidas com vários explantes e a cultura prolongada resultou em
alteração genética das culturas (Canhoto et al. 2005; Correia et al. 2009). Portanto, é importante encontrar
uma condição de armazenamento confiável para fornecer tecido embriogênico para clonagem de árvores por
meio da embriogênese somática, pois a cultura prolongada às vezes resulta em uma alteração genética nas
células com perda acompanhada de potencial embriogênico ou formação de embriões anormais (Roth et al.
1997; Tremblay et al. 1999; van Arnold et al. 2002; Celestino et al. 2014; Landey et al. 2015).
Embora a criopreservação tenha se mostrado uma aplicação significativa na conservação de
germoplasma, sua aplicação pode não ser adequada para o armazenamento de longo prazo de tecidos
embriogênicos de plantas lenhosas devido à modificação que induz na composição genética das culturas
criopreservadas através da alteração no nível de metilação do DNA em tecidos embriogênicos . Na pupunha,
por exemplo, um nível elevado de metilação do DNA no tecido embriogênico leva a uma má recuperação da
planta das culturas, mas o novo crescimento dos tecidos em 24 semanas diminuiu o nível de metilação do
DNA global acompanhado de uma resposta embriogênica melhorada (Heringer et al. 2013).
Para uma planta lenhosa, o explante, a região particular e até mesmo o tamanho são necessários para
a indução bem-sucedida de calos embriogênicos e a expressão do programa embriogênico in vitro; A região
do hipocótilo superior do embrião zigótico é a mais responsiva para a indução de tecido embriogênico
(Thorpe e Stasolla 2001; Pullman e Bucalo 2011). O programa genético para a indução de tecido
embriogênico torna-se gradualmente reprimido com o aumento da maturidade do explante de embrião
zigótico e uma vez que o meristema apical se forma, o potencial para obter tecido embriogênico fica
comprometido (Bonga et al. 2010).

Efeitos de explante
A juvenilidade do explante determina a indução
A indução do tecido embriogênico e embriogênese somática foi relatada usando vários explantes de
tecido somático / gametofítico de muitas plantas lenhosas (para exemplos, ver Tabela 1). A resposta varia
entre variedades, clones, arranjos experimentais e até mesmo nas espécies para as quais foi alcançada,
estudos sobre fatores que regulam a indução e regeneração de embriões precisam ser aprimorados. O estado
interno das células do explante é de primordial importância para a indução e expressão da via embriogênica
in vitro em plantas lenhosas. No entanto, acredita-se que os PGRs aplicados exógenos aos meios de cultura
determinam a formação de tecido embriogênico ou o padrão de desenvolvimento de embriões somáticos
(Tisserat et al. 1979; Feher et al. 2003; Feher 2008).
Além de outros fatores de cultura, o número de embriões induzidos por explante ou frequência de
formação de tecido embriogênico ao longo de um determinado número de dias é afetado pelo estágio de
desenvolvimento das espécies lenhosas e o explante usado (Verhagen e Wann 1989; Park et al. 2011 ; Elhiti
e Stasolla 2011). Por exemplo, embriões pré-cotiledonares imaturos ou maduros em estágio cotiledonar
foram usados para estabelecer culturas embriogênicas em pinheiros e abetos (Becwar et al. 1988). Em
espécies de Picea e Pinus taeda, gametófito feminino inteiro ou segmento cotiledonar foram empregados
(Krogstrup 1986; Gupta e Durzan 1987; Lelu e Bornman 1990; Becwar et al. 1990).
Embriões zigóticos imaturos e em estágio pré-cotiledonar foram usados para estabelecer culturas
embriogênicas em Araucaria augustifolia e megagametófitos de sementes imaturas resultaram em frequência
de indução de 2,2%. Mas, quando os explantes atingiram o estágio cotiledonar, a capacidade embriogênica
não foi atingida (Astarita e Guerra 1998). Em Picea abies e C. japonica, a taxa de indução de embriões
somáticos correlacionou-se com o estágio de desenvolvimento do explante embrionário (van Arnold et al.
1996; Ogita et al. 1999), enquanto em P. marina e P. abies, tecidos embriogênicos foram obtidos de mudas
(Attree et al. 1990) e agulhas de uma árvore de abeto da Noruega de 7 anos (Ruaud et al. 1992). Da mesma
forma, em A. augustifolia até 38,5% de culturas embriogênicas iniciadas nas mesmas condições de cultivo
(Silveira et al. 2002). Em Abies alba 9 A. cephalonica, A. alba 9 A. numidica e P. abies, a frequência de
formação de calos embriogênicos depende do genótipo da planta-mãe (Salajova et al. 1996; van Arnold et al.
1996).
Para uma planta lenhosa, as melhores culturas embriogênicas são obtidas de tecidos juvenis como
gametófitos masculinos / femininos e acessórios ou embriões zigóticos maduros / imaturos. Porém, menos
do tecido somático maduro já que a indução do tecido embriogênico / embriogênese é difícil, e mesmo
assim, em uma frequência baixa em comparação com o juvenil (Schuerman e Dandekar 1993; Jain et al.
1995a, b, 1999a, b, 2000 , 2005; Pullman e Bucalo 2011).
Isso parece ser devido à facilidade com que embriões zigóticos maduros podem ser extraídos e
embriões com sementes maduras de coníferas, por exemplo, mantêm a viabilidade por um período mais
longo de armazenamento e a principal influência do genótipo na embriogênese (Bonga e von Aderkas 1992;
Bonga 2004).
Além disso, em tecidos juvenis como embriões zigóticos, acredita-se que os genes para a
embriogênese zigótica são ativos e, como resultado, as células expressam facilmente o programa
embriogênico in vitro. Este pode ser o motivo pelo qual o potencial para induzir o tecido embriogênico
declina com a maturidade do explante de embrião zigótico, e torna-se difícil adquirir competência
embriogênica com o aumento da maturidade do explante somático, embora não se aplique a algumas plantas
lenhosas (Wann 1988; Elhiti e Stasolla 2011 )
Por exemplo, em Camellia japonica 70% dos embriões zigóticos imaturos produziram calos
embriogênicos enquanto 12% dos embriões zigóticos maduros formaram calos embriogênicos (Vieitez e
Barciel 1990). Culturas embriogênicas podem ser estabelecidas a partir de explantes maduros como
fragmentos de folhas, segmentos de caule e internodo, a antera ou células somáticas de gametófitos /
amentilhos masculinos em espécies de carvalho e a competência embriogênica retida por vários anos por
meio de subcultura regular. Mas, folhas tenras e explantes ovulares não produziram tecido embriogênico
(Chalupa 1995a).
Em muitas angiospermas lenhosas e gimnospermas, o tecido embriogênico e a embriogênese
somática foram alcançados a partir de explantes de embriões zigóticos, mas em poucas espécies com tecidos
maduros (Jain et al. 1995a, b, 1999a, b, 2000; von Aderkas e Bonga 2000; Bonga et al . 2010). A primeira
incidência de formação de tecido embriogênico e indução de embriogênese somática de tecidos somáticos
maduros foi do explante de folhas de Ceratozamia mexicana de 25 a 30 anos (Chavez et al. 1992).
Na maioria das espécies lenhosas para as quais a formação de tecido embriogênico e a expressão da
embriogênese somática foram obtidas a partir de tecidos somáticos maduros, o tecido embriogênico se
forma em baixa frequência como em Ocotea catharinensis (Moura-Costa et al. 1993), Quercus suber
(Fernandez-Guijarro et al. 1995), onde menos de 5% do explante cultivado formou o tecido embriogênico.
Em Rosewood, o explante cotiledonar coletado 90 dias após a floração produziu o maior número de
embriões somáticos e a indução embrionária começou a partir do sétimo dia. Mas com explantes de 120 dias
pós-florescimento, a indução começou após 20 dias com baixa frequência de indução e aumento da
formação de calo. Cotilédones maduros de sementes secas tornaram-se marrons e calejados após 4 semanas
sem indução da embriogênese (Sita 1999).
A formação de tecido embriogênico e a expressão da embriogênese somática podem ocorrer dentro
de 14–21 dias após a antese com explantes de gafanhotos negros (Arrillaga et al. 1994). Em Cercis
canadensis, explante de embrião zigótico 117 dias pós-antese produziu calos ou raízes, mas embriões
somáticos diretos induzidos de explantes pós-antese de 96 a 100 dias de idade (Trigiano et al. 1988).
 Os explantes de raízes podem ser usados para estabelecer culturas embriogênicas, embora existam
poucos relatos com as plantas lenhosas, e mesmo assim, em baixa frequência. Em Nothapodytes
nimmoniana, raiz e vários explantes de mudas assépticas de 3 a 4 semanas de idade foram usados para obter
calos embriogênicos (Fig. 1a-d). A frequência de produção de calos embriogênicos mostrou diferenças
marginais com vários explantes e idade das culturas, mas foi maior com explante de embrião zigótico. A
frequência de formação de embriões foi influenciada por PGRs suplementados nos meios de cultura
(experiência de laboratório).

Maturidade do explante e rejuvenescimento para indução de calos embriogênicos

A escolha do explante para a indução de tecido embriogênico de uma planta lenhosa requer um
estudo meticuloso da resposta à condição de cultura pelo material de partida maduro ou juvenil selecionado.
O uso de tecido somático maduro para a indução de tecido embriogênico e embriogênese somática em
plantas lenhosas envolve o rejuvenescimento do material de origem do explante (completo ou parcial) e a
otimização do equilíbrio dos PGRs nos meios de cultura para obter alta indução de culturas embriogênicas
(von Aderkas e Bonga 2000) . O estresse celular também é cada vez mais reconhecido por desempenhar um
papel vital na aquisição de competência embriogênica em plantas lenhosas, e acredita-se que exista uma
estreita relação entre as vias de sinalização que levam ao estresse e morfogênese por meio da expressão dos
genes relevantes. Isso levou à hipótese de que a embriogênese somática é uma resposta ao estresse pelas
células vegetais cultivadas durante a adaptação à condição in vitro (para revisão, ver Zavattieri et al. 2010).
O uso de estresse osmótico, principalmente quando combinado com 2,4-D nos meios de cultura, é
uma estratégia promissora para induzir competência embriogênica para explantes ou culturas de plantas
lenhosas. A aplicação de estresse nutricional que envolve a diluição da força da composição do meio de
cultura junto com 2,4-D pode aumentar a competência embriogênica das culturas. Por exemplo, o pré-
condicionamento de explante provou ser de aplicação na indução de competência embriogênica em tecido
maduro usando tratamentos indutores de estresse e fome de sacarose (Kochba e Button 1974; Fraser e
Harvey 1986; Merckie et al. 1995; Bonga 1996; Feher 2015).
Em Kalopanax septemlobus, enxertos seriados de brotos maduros de 40 anos de idade foram
empregados para rejuvenescer o explante e 90% dos calos induzidos pelos explantes. Porém, apenas 0,4%
dos calos eram embriogênicos e a alta concentração de sacarose no meio de cultura induziu a embriogênese
somática. O tratamento com 2–10% de água de coco aumentou a formação de embriões com efeito sinérgico
quando 7% de sacarose e 10% de polietilenoglicol foram adicionados ao meio de cultura (Moon et al. 2008).
O rejuvenescimento do explante de tecido maduro para aumentar o potencial morfogênico do explante no
meio corrigido com citocinina foi empregado com muitas plantas lenhosas, e certas zonas dos explantes
maduros são morfologicamente competentes do que outras (Cortizo et al. 2009; Bonga et al. 2010 ; Zhang et
al. 2010).
Microestacas são as melhores zonas no caso de Cedrus (Renau-Morata et al. 2005), botão vegetativo
em Pinus (De Diego et al. 2010), broto basal para Sequoia (Boulay 1987), enquanto em P. glauca,
embriogênese somática foi obtido a partir de brotos rejuvenescidos de uma árvore somática de 10 anos
(Klimaszewska et al. 2011). O tratamento do explante com ditiotreitol a 0,1% antes da cultura reduziu o
efeito de escurecimento do tecido com iniciação aprimorada da embriogênese usando cúpula de broto apical
de P. patula madura. A estratégia poderia, portanto, ser empregada em protocolo de embriogênese somática
para coníferas (Malabadi e van Staden 2003, 2005; Teixeira da Silva e Malabadi 2012).
Oaks e membros do gênero Populus mostram o alto potencial embriogênico de explantes maduros e
juvenis, mas os Oaks mostram maior potencial embriogênico do que outras plantas lenhosas (Chalupa
1995a; Michler e Bauer 1991). Na maioria dos membros lenhosos do gênero Betula, culturas embriogênicas
podem ser obtidas a partir de explantes juvenis e o potencial embriogênico era baixo com diferenças
genotípicas tão baixas quanto 2–8% em B. pendula (Kurten et al. 1990; Chalupa 1995b). O mais antigo
explante de abeto do qual culturas embriogênicas foram obtidas são agulhas de mudas somáticas de 3 anos
de idade (Harvengt et al. 2001).
O fator de juvenilidade do genótipo para a indução da embriogênese somática de plantas lenhosas
pode ser explicado, no nível fisiológico, pelo estágio do ciclo celular das células dos explantes, a
disponibilidade para transportar PGRs para dentro das células para 'ligar' os genes de indução e os
capacidade metabólica das células. A estação de coleta do explante também influencia o grau de
competência embriogênica e a quantidade de calos embriogênicos produzidos por um explante selecionado.
No entanto, os fatores que limitam a competência do explante para a embriogênese somática na planta
lenhosa ainda são desconhecidos. Acredita-se que a frequência de iniciação de culturas embriogênicas,
assim como com outras formas de vida vegetal, depende das condições de cultura, do genótipo e do explante
de uma espécie lenhosa.

Moléculas de sinalização
As moléculas de sinalização celular também podem ser empregadas nos meios de cultura para
induzir a aquisição de competência e a expressão da embriogênese somática. Os íons de cálcio
desempenham um papel celular importante como um segundo mensageiro em transduções de sinal e muitos
eventos fisiológicos celulares que regulam a morfogênese em plantas (Poovaiah e Reddy 1993). O papel dos
íons de cálcio exógenos e endógenos na embriogênese somática é conhecido em muitas plantas lenhosas e
envolve a regulação da abundância dos transcritos gênicos através do gene AUX / IAA indutível pela
auxina, a indução de proteínas de transferência de lipídeos e sua captação aumentada dos meios de cultura
durante a transferência para meio sem auxina. A diferenciação de embriões somáticos está associada a uma
maior absorção de íons de cálcio acompanhada por um maior número de embriões produzidos que podem
atingir a maturidade (Feher et al. 2003; Singla et al. 2006, 2007).
Da mesma forma, uma concentração elevada de íons de cálcio neutralizou o efeito inibitório do 2,4-
D na indução do embrião somático (Anil e Rao 2000; Malabadi e van Staden 2006). Os íons de cálcio
também estão associados à morte celular programada, para a qual mudanças transitórias na forma livre têm
efeitos duradouros nas mudanças no citosólico e na parede celular ou nas concentrações associadas à
membrana, com efeitos no desenvolvimento de embriões somáticos (Ning et al. 1999; Wang et al. 2001;
Lecourieux et al. 2002; Altamura et al. 2015).
O ácido salicílico afeta muitos processos fisiológicos nas plantas, agindo como um sinal que detecta,
amplifica e transmite informações da célula e pode desempenhar um papel significativo na indução da
embriogênese somática (Tuteja et al. 2010) em plantas lenhosas. Por exemplo, concentrações aplicadas
exogenamente de ácido salicílico e forma acetilada aumentaram a embriogênese somática em Pinus
roxburghii (Malabadi et al. 2008a, b).

Mudanças iniciais
Mudanças epigenéticas
 O início dos eventos envolvidos na fase de indução da embriogênese somática de plantas lenhosas
inclui a reprogramação do padrão de expressão gênica nas células somáticas, produção de muitas proteínas e
compostos envolvidos na aquisição de competência embriogênica através da reorganização do metabolismo
celular e mudança de desenvolvimento (De Jong et al. 1993; Feher 2008).
As alterações epigenéticas durante a indução são as alterações genéticas, celulares e fisiológicas
causadas pelos fatores de cultura da condição que ativam ou desativam os genes envolvidos no processo de
indução, por meio da alteração do potencial transcricional. A natureza e a extensão das mudanças são
variáveis e são consideradas "motivadores" principais nas diferenças observadas nos potenciais
embriogênicos nas culturas de plantas lenhosas, com base na espécie, genótipo, tipo de explante e condição
fisiológica e condições de cultura in vitro. As alterações, principalmente, constituem remodelamento da
cromatina que envolve modificação das histonas, metilação do DNA e interferência do RNA. Essas
mudanças epigenéticas estão recentemente recebendo atenção crescente da pesquisa em relação ao seu papel
durante a embriogênese somática, mais especialmente na fase de indução envolvendo a transição do estado
somático para embriogênico, e foram observadas em pelo menos dezoito espécies de plantas, mas, apenas
quatro das espécies mostraram modificação de histona (De-la-Pena et al. 2015 e referências nele).
Sobre o papel da modificação das histonas durante a indução da embriogênese somática nas plantas,
poucos estudos recentes mostraram que as mudanças dinâmicas na estrutura da cromatina se correlacionam
com a mudança na expressão dos genes envolvidos na indução do programa. Um desses estudos recentes é a
indução da embriogênese somática em Coffea canephora, onde os níveis de expressão de H3K9me2 e
HeK27me3 mostraram uma expressão diminuída correlacionada com o início da expressão de LEC1, BBM1
e WOX4 durante os eventos iniciais da embriogênese somática (Nic- Can et al. 2013).
A mudança no padrão de expressão dos genes envolvidos na modificação e remodelação da
cromatina também foi mostrada para ocorrer em Q. suber, onde uma diminuição na expressão da expressão
de QsHDA19 ocorre no início da diferenciação do calo. Isto foi seguido por expressão gradualmente
aumentada entre o embrião cotiledonar imaturo para o embrião com cotilédones completamente
diferenciados. No entanto, a expressão diminuída transitória de QsPICKLE; Os genes QsHDA6 e QsVAL1
ocorreram durante a transição do calo para o estágio de embrião maduro, e QsHUB1 e QsHUB2 mostraram
um aumento transitório na expressão em estruturas caulogênicas brancas e em embriões cotiledonares
imaturos. A expressão mais elevada ocorreu em embriões cotiledonares opacos brancos, enquanto a
expressão de QsAUR3 foi expressa preferencialmente em embriões cotiledonares imaturos (Perez et al.
2015; Dela-Pena et al. 2015).
A segunda e mais estudada mudança epigenética envolvida nos estágios iniciais da embriogênese
somática em plantas lenhosas é a metilação do DNA. A metilação do DNA catalisada pelo DNA (citosina-5
-) - metil transferase envolve a adição do grupo metil à citosina, principalmente citosina adjacente à guanina
nas plantas, para modificar a função do DNA. Esta mudança epigenética muda continuamente para atender
às necessidades celulares durante a indução e expressão da embriogênese somática em plantas lenhosas.
Acredita-se que um grau variável de metilação seja necessário em vários estágios da embriogênese somática,
e a falha da metilação pode levar ao comprometimento da sobrevivência dos embriões produzidos (Monk et
al. 1987; Okano et al. 1999; Nic-Can et al. . 2013; Nic-Can e De-la-Pena 2014).
Acredita-se que a exigência de níveis diferenciais de metilação em diferentes estágios seja regulada
pelos PGRs aplicados exogenamente nos meios de cultura por meio de seus efeitos na expressão de genes,
além de outros fatores de condição de cultura (Levanic et al. 2009). Pelo menos, auxinas e citocininas
mostraram-se necessárias durante os estágios iniciais do desenvolvimento de embriões somáticos por seu
papel na expressão dos genes envolvidos na metilação do DNA, enquanto para as fases subsequentes, ácido
abscísico, ácido giberélico e produção de etileno são necessários (Feher 2015).
No caso do papel desempenhado pelas auxinas na aquisição de competência embriogênica, vários
estudos com muitas espécies lenhosas têm mostrado o (s) efeito (s) da omissão de auxinas nos meios de
cultura durante a indução da embriogênese somática, embora marcas epigenéticas iniciadas por uma anterior
etapa são reconhecidas por desempenhar um papel no desenvolvimento dos embriões somáticos (Jain et al.
1995a, b; De-laPena et al. 2015).
O (s) efeito (s) das auxinas na aquisição de competência embriogênica envolvem a regulação do
nível de metilação do DNA, com efeitos estimuladores na divisão e diferenciação celular.
A metilação controlada por auxina é mediada por S-adenosilmetionina e S-adenosil cisteína por meio
dos efeitos da produção de etileno induzida por 2,4-D, levando ao aumento do acúmulo da proporção de S-
adenosil cisteína e S-adenosilmetionina, resultando em alteração do nível de metilação do DNA. No
momento em que o 2,4-D é omitido nos meios de cultura, no caso de espécies lenhosas que requerem tais
transferências, o DNA pouco metilado apresenta aumento constante da metilação com a progressão da
embriogênese, sugerindo o papel na indução da diferenciação em somáticos células ao estado embriogênico
(von Aderkas e Bonga 2000).
Além disso, acredita-se que os tecidos embriogênicos tenham menor grau de metilação do DNA do
que os não embriogênicos; assim, a hipometilação está associada aos tecidos embriogênicos e a
hipermetilação à progressão da embriogênese somática, embora essas proposições não sejam verdadeiras em
alguns casos relatados. Por exemplo, no ginseng siberiano, calos embriogênicos mostraram 11,2% de
metilação contra 16,99% no não embriogênico (Chakrabarty et al. 2003).
Em Q. suber, uma expressão correlacionada de genes que codificam DNA metiltransferase com o
avanço na embriogênese foi mostrado para ocorrer durante a embriogênese somática de micrósporos e
explante de embrião zigótico imaturo (Rodriguez-Sanz et al. 2014a). Da mesma forma, a expressão
transitória de Met1-5, um gene da DNA metiltransferase da cenoura, após a indução da embriogênese
somática usando 2,4-D e antes da formação de aglomerados de células embriogênicas apoiou o papel
proposto de hipometilação de DNA e sinais que levam à indução de embriogênese somática (Yamamoto et
al. 2005; De-la-Pena et al. 2015).
No entanto, em Pinus pinaster, nenhuma diferença significativa foi observada no padrão de metilação
do DNA dos dois calos (Klimaszewska et al. 2009). A avaliação das mudanças epigenéticas nas culturas
embriogênicas é realizada principalmente com base na análise de metilação do DNA devido a uma
compreensão abrangente do mecanismo em comparação com outras modificações epigenéticas. No entanto,
como muitos fatores afetam as mudanças nos níveis de metilação do DNA, incluindo a idade da linha
celular, composição genética do explante, PGRs e condições de cultura, estado fisiológico do explante e
ambiente de incubação da cultura, as moléculas secretadas de culturas, entre outros, a técnica empregada no
estudo epigenético da metilação do DNA durante as fases de indução e expressão da embriogênese somática
em plantas lenhosas é crucial para determinar o padrão de metilação. Esse problema continua sendo uma
tarefa difícil para as espécies lenhosas para as quais o estágio de desenvolvimento do tecido do explante
desempenha um papel crítico na determinação da indução de tecido embriogênico e embriogênese somática,
além de muitos problemas fisiológicos como a exsudação de fenólicos. Vários estudos têm mostrado que as
moléculas orgânicas que são secretadas pelos explantes / culturas para a mídia como os fenólicos, sob a
condição de cultura, são inibidoras da resposta embriogênica por meio de seus possíveis efeitos no nível de
metilação do DNA (Causevic et al. 2005; Kouakou et al. . 2007; Nic-Can et al. 2015).
Em experimentos envolvendo a adição de inibidores de metilação de DNA às culturas, uma inibição
efetiva da embriogênese somática foi demonstrada em várias espécies, dependendo do estágio de
desenvolvimento dos embriões somáticos e dos tratamentos com os inibidores. Por exemplo, em Medicago
truncatula, o tratamento de culturas embriogênicas com azaC diminuiu a produção de embriões somáticos e
a perda de embriões foi encontrada devido ao aumento da desmetilação de rDNA (Santos e Fevereiro 2002).
No entanto, em alguns casos, a adição do inibidor não inibiu a embriogênese, enquanto, em outros, a
promoção foi observada (Leljak-levanic et al. 2004; Klimaszewska et al. 2009). Parece que o efeito dos
inibidores na embriogênese somática é dependente da concentração, espécie e genótipo com base no grau de
seus efeitos na enzima de metilação do DNA, o experimento de Nic-Can et al. (2015) apóia essa proposição.
Quanto ao papel inibitório dos fenólicos na embriogênese, possivelmente ocorre por meio de
distúrbios do metabolismo celular necessários à formação de uma estrutura embriogênica complexa a partir
das células somáticas. Este pode ser o principal mecanismo que leva à fraca resposta embriogênica
observada na maioria das plantas lenhosas, já que a exsudação de uma variedade de compostos fenólicos no
meio de cultura ocorre nas plantas do que em qualquer outra forma de vida vegetal.
A menor resposta embriogênica pelo explante maduro também pode ser explicada pelo maior grau de
produção de fenólicos e exsudação que eles mostram em comparação com o explante juvenil. Porém,
pesquisas futuras nesta direção com o objetivo de elucidar o mecanismo dos fenômenos e as mudanças
moleculares envolvidas forneceriam uma explicação clara do papel dos fenólicos na expressão ou repressão
da competência embriogênica, bem como na expressão da embriogênese somática em plantas lenhosas.
O papel de diferentes metiltransferases na indução de embriogênese somática nas plantas e como os
vários compostos fenólicos inibem as enzimas quando exsudados em meios de cultura por uma espécie
lenhosa, levando a uma menor resposta à embriogênese ou formação de embriões anormais em suas culturas
também precisam mais estudos. A maior resposta embriogênica pelo explante juvenil de espécies lenhosas
como o embrião zigótico é altamente provável de ser devido ao baixo nível de metilação no DNA das
células.
A diminuição do potencial embriogênico com o aumento da maturação do explante de embrião
zigótico também é provavelmente devido ao aumento da metilação do DNA nas células do explante de
embrião zigótico com o avanço no desenvolvimento, a fim de conferir estabilidade ao genoma. Esta
proposição é apoiada por estudos onde foi demonstrado que a diminuição na metilação do DNA está
associada à resposta embriogênica de um explante de embrião zigótico (Viejo et al. 2010).
As diferenças dependentes do genótipo na resposta embriogênica de um explante também podem ser
devido às diferenças no grau de metilação do DNA em suas células, com base no estágio de
desenvolvimento. Como o mecanismo pelo qual a hipometilação do DNA afeta a embriogênese somática, a
indução em plantas lenhosas ainda não está clara. Parece pré-requisito para o sucesso da embriogênese
somática e que a manutenção de certo nível é necessária, pelo menos para a transição das células somáticas
para o estado embriogênico.
De forma semelhante, deficiências na metilação global quantitativa da citosina têm um importante
efeito exercendo sobre a indução da embriogênese somática. Um estudo detalhado das mudanças
epigenéticas envolvendo a modificação das histonas e o nível de metilação do DNA é uma promessa no
entendimento das mudanças epigenéticas envolvidas na indução da embriogênese somática em plantas
lenhosas.
Os trabalhos recentes em C. canephora por Nic-Can et al. (2013) e com muitas outras plantas, por
exemplo, os trabalhos de Chupeau et al. (2013), RodriguezSanz et al. (2014b), Perez et al. (2015),
Wickramasuriya e Dunwell (2015), sugeriram as mudanças dinâmicas reguladas na estrutura da cromatina
durante a embriogênese somática em plantas lenhosas. Os fatores, mecanismo e moduladores ou 'condutores'
das mudanças envolvidas na superação da 'barreira' somática para o estado embriogênico por meio das
mudanças epigenéticas envolvendo a remodelação da cromatina e a expressão de genes-chave que
participam do processo de indução também não foram respondidos .
O papel desempenhado pela DNA metiltransferase durante a embriogênese somática nas plantas
também é mal compreendido, especialmente sua participação em vários estágios do programa. Estudos sobre
mudanças nas marcas de histonas durante a embriogênese somática nas espécies lenhosas parecem
promissores na resolução de muitas questões "pendentes" na resposta embriogênica inferior das plantas
lenhosas.
Os estudos recentes sobre mudanças dinâmicas na remodelação da cromatina envolvendo a
modificação das histonas, levando à expressão / repressão de genes envolvidos na embriogênese somática,
estão fornecendo informações sobre as mudanças epigenéticas envolvidas durante a indução da
embriogênese somática em plantas lenhosas.
O nível de metilação do DNA pode ser avaliado usando muitas abordagens e técnicas, incluindo
análise global, regional, de todo o genoma, análise por sequenciamento, detecção de padrões de metilação,
análise CpG individual e muitos outros (De-la-Pena et al. 2015 ) Dentre as muitas técnicas desenvolvidas, o
método do bissulfito a partir do qual muitos métodos, incluindo extensão de primer de nucleotídeo único
sensível à metilação, PCR específico para metilação, análise de restrição de bissulfito combinada, além de
muitos outros mais recentes, parece interessante para empregar nos estudos de transição de células
somáticas. a um estado embriogênico em plantas lenhosas.
Os estudos globais de metilação do DNA que permitem avaliar a extensão das mudanças durante o
crescimento e desenvolvimento de embriões somáticos, especialmente na fase de indução, e muitas técnicas
moleculares e analíticas também podem ser empregadas para tais estudos. Embora a metilação global do
DNA dê mudança epigenética geral durante o desenvolvimento dos embriões, é importante avaliar a
metilação específica do local do DNA para uma informação abrangente sobre a metilação durante a indução
da embriogênese somática em plantas lenhosas.
As técnicas analíticas amplamente utilizadas como cromatografia líquida de alto desempenho têm se
mostrado úteis na avaliação de mudanças na metilação do DNA como em C. canephora e Castanea sativa
onde a metilação foi efetivamente analisada durante a embriogênese somática (Viejo et al. 2010; Nic-Can et
al. 2013). A aplicação da técnica de polimorfismo amplificado sensível à metilação que utiliza um par de
enzimas de restrição sensíveis à metilação tem se mostrado útil na identificação de genes sob controle
genético em culturas de tecidos vegetais (Miguel e Marum 2011).
Usando Rosa hybrida cv. Carefree, Xu et al. (2004) identificaram a ocorrência de desmetilação da
citosina externa com maior frequência durante a embriogênese somática usando a técnica. Embora ainda não
seja empregada nos estudos de embriogênese somática em qualquer espécie lenhosa, a análise in situ que usa
imunolocalização combinada com microscopia confocal para localizar 5mC em um momento exato e celular
terá aplicação significativa nos estudos de sítios de metilação durante a embriogênese dos lenhosos plantas.
Em geral, além da quantificação de 5mC, é de alto valor ao avaliar a extensão da metilação do DNA e seu
papel na embriogênese somática nas plantas, para avaliar o local de metilação específico para obter
informações adequadas sobre o padrão de metilação.

Expressão genetica
A indução efetiva da competência é a ativação da expressão dos genes que participam da indução da
embriogênese e da resposta ao estresse, visto que o programa é considerado fenômeno induzido pelo estresse
(Zavattieri et al. 2010). As mudanças são necessárias para toda a ocorrência da embriogênese somática
devido à expressão necessária dos genes candidatos necessários para a indução e podem ser direcionadas
para melhorar a indução e a qualidade dos embriões somáticos (Tautorus et al. 1991).
O aumento das informações sobre as fases iniciais mostrou a importância da iniciação como uma
chave de desenvolvimento crucial dos 'genes de indução' que determinam a produção e a qualidade dos
embriões somáticos (van Zyl et al. 2002; Stasolla e Yeung 2003; Stasolla et al. 2003)
As mudanças na expressão gênica envolvem uma rede de genes responsáveis pela síntese de
proteínas associadas à resposta ao estresse (já que uma resposta embriogênica é um fenômeno induzido pelo
estresse), metabolismo primário, síntese da parede celular e divisão celular (Grosset et al. 1990; Yu et al.
1999; Feher et al. 2003).
Essas mudanças levam a uma mudança molecular no metabolismo celular e na sinalização que
podem servir como marcadores para a identificação e melhoria da indução da embriogênese somática (para
revisão, ver Feher et al. 2003; Namasivayam 2007; Feher 2008; Karami et al. 2009). Uma expressão
regulada positivamente de genes envolvidos na embriogênese somática observada durante os estágios finais
do programa também sugeriu um papel não direto desempenhado pelos genes na fase de indução da
transição do estado vegetativo para o embriogênico (Arroyo-Herrera et al. 2008; Karami et al. . 2009).
Por exemplo, na Noruega, as linhagens celulares competentes e detidas no desenvolvimento do abeto
vermelho mostraram regulação positiva de 29% dos genes durante o desenvolvimento da massa embrionária
primária (PEM) em embriões seguida por regulação negativa nos estágios iniciais da embriogênese e, em
seguida, uma regulação positiva no desenvolvimento embrionário tardio (van Zyl et al. 2003; Stasolla et al.
2004).
Estudos sobre as vias de sinalização molecular têm mostrado vias de desenvolvimento conservadas
na embriogênese de angiospermas lenhosas e gimnospermas. Mas, a embriogênese difere daquela de outras
gimnospermas em uma variedade de genes transcritos; 30% do mRNA encontrado nos embriões de pinheiro
em desenvolvimento estão ausentes nas marcas de sequência expressa de outras coníferas (Cairney e
Pullman 2007).
Cerca de 70% dos genes de embriogênese no proteoma de Arabidopsis expressos durante a
embriogênese também foram encontrados na embriogênese de coníferas; O mRNA de sequência semelhante
a genes que regulam o desenvolvimento de sementes em Arabidopsis foi encontrado em coníferas (Cairney e
Pullman 2007).
As diferenças observadas entre a embriogênese das gimnospermas e das angiospermas estão na
estrutura e no desenvolvimento devido à sutil interação molecular, controle da expressão espacial e temporal
dos genes da embriogênese e reguladores de poucas proteínas únicas (Cairney e Pullman 2007).
Essas informações são em grande parte baseadas em demarcações espaço-temporais em informações
moleculares geradas a partir da planta modelo Arabidopsis thaliana, cuja compreensão da complexa e
regulada rede de genes envolvidos na embriogênese tem auxiliado no entendimento da embriogênese de
gimnospermas e angiospermas. No entanto, as diferenças na regulação molecular da embriogênese somática
na planta modelo e coníferas podem surgir principalmente devido a variações na expressão gênica,
particularmente as diferenças temporais durante a transição entre estágios de desenvolvimento (Cairney e
Pullman 2007; Spencer et al. 2007; Vestman et al. 2011; Trontin et al. 2015).
Mais conhecimento e interpretação dos dados genômicos ainda são necessários para uma
compreensão mais abrangente da expressão gênica e mudanças moleculares na aquisição de competência
embriogênica e expressão em angiospermas lenhosas e gimnospermas.

Os genes
 Muitos genes desempenham um papel significativo na indução da embriogênese em uma planta
lenhosa, e sua expressão transitória pode ser um marcador de aquisição e expressão de competência
embriogênica. Os genes estão envolvidos em vários aspectos do processo de indução, incluindo
diferenciação celular, expressão de totipotência e compromisso com a embriogênese (Elhiti et al. 2013).
Sua expressão é necessária para a aquisição de competência embriogênica e expressão da
embriogênese somática devido ao papel significativo que desempenham no controle de diversos aspectos da
embriogênese em plantas. A identificação dos genes fornece uma visão sobre o papel que desempenham na
indução e expressão da embriogênese. Em vários casos, sua expressão é essencial para alterar o destino de
células somáticas cultivadas para o estado embriogênico. Por exemplo, a expressão de um membro da
família do gene YUC que codifica a flavina monooxigenase mostrou ser necessária para estabelecer o
processo de iniciação da diferenciação de embriões somáticos através da síntese de auxina mediada pela
flavina monooxigenase YUC (Cheng et al. 2007).
O receptor quinase de embriogênese somática (SERK) identificado pela primeira vez em culturas
embriogênicas derivadas de hipocótilo de Daucus carota (Schmidt et al. 1997) desempenha um papel na
aquisição de competência embriogênica em células vegetais. A expressão transitória do gene em células
somáticas cultivadas de uma planta lenhosa pode ser um marcador para a aquisição de competência
embriogênica em resposta à exposição prolongada ao 2,4-D. A expressão do gene cessa após a indução de
embriões globulares com competência aprimorada para embriogênese somática devido à superexpressão de
SERK1 durante a transição de células somáticas para o estado embriogênico (Saze et al. 2003; Thakare et al.
2008).
Por exemplo, a expressão SERK1 continuou no desenvolvimento de estruturas embriogênicas de
Helianthus, mas parou após 7 dias de desenvolvimento (Thakare et al. 2008). Os genes LEAFY
COTYLEDON inicialmente identificados em Arabidopsis desempenham um papel regulador central nos
processos que ocorrem durante as fases iniciais e finais da embriogênese somática (Muller 1963; Gaj et al.
2005). Por exemplo, a expressão restrita e alta de mRNA de TCL1L em embriões jovens e imaturos mostrou
seu papel na regulação de eventos principais na aquisição de competência embriogênica (Harada 2001;
Kwaaitaal et al. 2005).
Os genes BABY BOOM que foram primeiro isolados de culturas de embriões de micrósporos de
Brassica napus promovem a proliferação celular e morfogênese durante a embriogênese de plantas (Boutilier
et al. 2002). O papel promotor dos genes na expressão da embriogênese quando PGRs exógenos não foram
aplicados nos meios de cultura sugeriu seu mecanismo de ação por meio da estimulação da produção de
hormônios endógenos em plantas e aumento da sensibilidade das células aos hormônios (Jimenez 2001,
2005; Boutilier et al. 2002; Jimenez e Thomas 2005; Feher 2008).
WUSCHELL causa desdiferenciação quando expressa em células somáticas, levando à produção de
embriões somáticos a partir de células embriogênicas, promovendo a transição e identidade das células de
vegetativo para embriogênico. Por exemplo, no café, o PGA6 desempenha um papel regulador crítico na
indução da embriogênese por meio da manutenção da identidade celular (Zuo et al. 2002; Arroyo-Herrera et
al. 2008).
Como poucos estudos experimentais foram realizados sobre o processo de indução em plantas
lenhosas, o estado de conhecimento sobre os genes e sua expressão durante os estágios iniciais da
embriogênese, crítico para os estágios subsequentes, ainda é limitado. Estudos moleculares sobre a indução
de embriões ou tecido embriogênico também são limitados, mais especialmente com explantes juvenis que
são mais responsivos à formação de tecido embriogênico com as espécies lenhosas.

Marcadores moleculares
A indução do tecido embriogênico leva a mudanças morfológicas e de desenvolvimento nas células
cultivadas, e vários sistemas e recursos podem ser empregados para estudar sua progressão durante a
aquisição de competência, indução e expressão da embriogênese. O rastreamento de células de vídeo pode
ser empregado para rastrear a progressão das células somáticas para embriogênicas e após a expressão do
programa (Toonen et al. 1994; Feher 2005).
Estudos histoquímicos revelaram informações sobre o acúmulo de produtos de armazenamento
durante a fase de indução no abeto branco (Joy et al. 1991; Yeung 1995). A deposição de calosidade nas
paredes das células embriogênicas e a formação da matriz extracelular glicoproteínica ao redor das células
superficiais dos embriões globulares poderia ser um marcador citológico de divisão celular e indução de
diferenciação embriogênica (Dubois et al. 1990; Pedroso e Pais 1995b; Mihaljevic et al. 2011).
 Em várias gimnospermas, a embriogênese parece depender da morte de certas células nos
agrupamentos de células para ajudar a alimentar outras células durante o desenvolvimento adequado do
embrião. No entanto, um equilíbrio entre o desenvolvimento, a sobrevivência dos embriões e a morte celular
programada junto com a eliminação do suspensor são de extrema importância para a eficiência do programa
(Bozhkov et al. 2002).
A morte celular programada desempenha um papel significativo nos estágios iniciais da
embriogênese em coníferas (Filonova et al. 2002). Esses autores sugeriram comunicação intercelular
importante para a aquisição de competência embriogênica durante os estágios iniciais da embriogênese
nessas plantas e foi confirmada por estudos moleculares. A quitinase e os lipo-quito-oligossacarídeos
(LCOs) afetam os estágios iniciais do desenvolvimento do embrião somático, embora a ação da quitinase
ainda não esteja clara.
Eles podem estar envolvidos em um papel regulador envolvendo proteínas arabinogalactan (AGPs) e
LCOs (Dyachok et al. 2002). Os AGPs modificados com quitinase atuam como moléculas extracelulares
para controle e manutenção da competência embriogênica nas culturas (van Hengel et al. 2001; Dyachok et
al. 2002). Além disso, a relação entre os AGPs, a quitinase e os LCOs e o mecanismo de estimulação da
embriogênese está bem documentada (van Hengel et al. 2001; Dyachok et al. 2002; Wiweger 2003). Os
LCOs podem atuar como moléculas sinalizadoras que estimulam a formação de PEM e o desenvolvimento
inicial do embrião no abeto da Noruega e o PEM nas culturas embriogênicas compostas de misturas de PEM
e embriões somáticos em vários estágios de desenvolvimento (Dyachok et al. 2002).
As culturas embriogênicas de Larix occidentalis foram caracterizadas pelo acúmulo de lipídios e
ribossomos no citoplasma com um aumento gradual da proteína nos vacúolos (Bonga et al. 1995). O
aumento do acúmulo de proteínas no meio de cultura 10 min após a inoculação foi observado em culturas
em suspensão embriogênica de A. augustifolia. A quantidade da proteína extracelular aumentou no meio de
cultura por até 5 dias, correspondendo à transição da fase lag para a fase exponencial do crescimento das
culturas (Astarita e Guerra 1998; Guerra et al. 2000).

Aspectos fisiológicos, bioquímicos e estruturais da indução

Acumularam-se informações sobre os aspectos estruturais, fisiológicos e bioquímicos da indução da
embriogênese somática em plantas lenhosas, mas pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que
regulam o programa. Como resultado, a identificação de marcadores moleculares específicos do estágio
embrionário confiáveis que podem ser uma ferramenta para melhorar a qualidade dos embriões somáticos
que é de extrema importância para a compreensão dos estágios de desenvolvimento ainda precisam ser
desenvolvidos (Jain et al. 1995a, b, 1999a, b; Pullman et al. 1999; Jain et al. 2000, 2005; Karami et al.
2009).
Recentemente, a abordagem mais usada para encontrar mudanças durante a transição de células
somáticas cultivadas do estado somático para embriogênico envolve a comparação de mudanças
proteômicas e genômicas entre calosidades e os tecidos embriogênicos induzidos ou embriões somáticos.
Muitos estudos recentes sugeriram abordagens proteômicas importantes para encontrar estágios específicos
de embriões em muitas culturas de plantas lenhosas (Lippert et al. 2005; Pan et al. 2009; Gomez-Garay et al.
2013).
A identificação e a análise do papel desempenhado pelos marcadores de proteína da embriogênese
somática forneceram a possibilidade de descobrir o potencial embriogênico de muitas culturas de plantas
lenhosas, mesmo antes que mudanças morfológicas ocorram e informações moleculares sobre a indução
(Tchorbadjieva et al. 2005; Teyssier et al. 2014).
Uma comparação de calos embriogênicos e não embriogênicos, por exemplo, auxiliou na
caracterização da proteína extracelular, proteínas semelhantes à germinação e seus papéis na indução da
embriogênese somática em P. Caribbean (Domon et al. 1994). A aplicação de estudos proteômicos está cada
vez mais desvendando a importância do estresse para o programa por meio da indução de genes relevantes
envolvidos e das proteínas expressas durante a transição de células somáticas cultivadas para embriogênicas
e durante as fases posteriores do desenvolvimento in vitro de embriões. Em muitos casos, a expressão desses
genes se correlaciona com a ativação de enzimas da via glicolítica (Marsoni et al. 2008; Rode et al. 2011).
Vários processos de sinalização também estão envolvidos nas células e entre as células adjacentes
antes da expressão da competência embriogênica em culturas. Os PGRs suplementados em meios de cultura
são moléculas de sinalização importantes que regulam o crescimento e o desenvolvimento de células
vegetais cultivadas, e um pulso de auxina endógena é o primeiro sinal para a indução de embriogênese
somática (Wiweger 2003).
O papel da auxina exógena em meios de cultura, 2,4-D em particular, para a indução da
embriogênese somática em plantas lenhosas foi documentado em várias espécies (Litz et al. 1998; Jain et al.
2000, 2005; Raghavan 2004). Os efeitos das auxinas, além de vários outros fatores de cultura, envolvem a
modulação do conteúdo endógeno no ambiente celular das células cultivadas por meio da regulação negativa
da expressão de genes relevantes e mudanças no nível de metilação do DNA (para revisão, ver Jimenez
2001, 2005; Feher et al . 2002; Jimenez e Thomas 2005; Feher 2008).
As células vegetais produzem auxina endógena (IAA) que, em níveis mais elevados, está associada
ao aumento da resposta à embriogênese somática. O primeiro estágio da indução envolve a formação de
células embriogênicas com subsequente formação de PEM (Jimenez 2001; Feher et al. 2003). Um gradiente
de auxina polar é essencial na padronização durante o estágio inicial do programa, e distúrbios no gradiente
de transporte podem resultar na formação de embriões portadores de anormalidades e morte celular
programada alterada (Abrahamsson et al. 2012).
A biossíntese da auxina e a relocalização através do transporte de gradiente polar é de papel crucial
na ativação da maquinaria de resposta da auxina, resultando na padronização dos embriões e são de grande
importância para o estabelecimento da organização corporal dos embriões. Os efeitos da auxina levam à
reorganização da arquitetura da parede celular por meio da alteração da estrutura do citoesqueleto com
efeitos resultantes no estabelecimento e diferenciação do destino celular (Stasolla et al. 2004).
A regulação do padrão de desenvolvimento prossegue por meio da modificação da parede celular,
começando da fase de indução até o estágio inicial e final da embriogênese (Trontin et al. 2015). Em P.
abies, a auxina é necessária para a formação e proliferação do PEM e a depleção no meio de cultura
bloqueou o desenvolvimento de PEM com a morte significativa das células (Dyachok et al. 2002; van
Arnold et al. 2002).
Em muitas plantas lenhosas, a redução da concentração de auxina ou citocinina estimula a indução da
embriogênese somática do calo embriogênico devido à mudança na expressão de genes que regulam o ciclo
celular, a formação da parede celular, a biossíntese de hormônios endógenos e a transcrição associada à
expressão do programa (Carron et al. 1995; Chalupa 1995a, b; Feher 2008).
Isso pode ser explicado pela necessidade de controle estrito do ciclo celular para embriogênese
somática, formação adequada de componentes da parede celular e sinalização de hormônios endógenos
necessária para 'ligar' genes envolvidos na transição do programa somático para embriogênico e para regular
posteriormente etapas (Pedroso e Pais 1995b; Yang e Zhang 2011).
Em Oaks, a indução da embriogênese somática ocorreu em meios de iniciação de cultura ou na
transferência para diferentes meios sem PGRs ou através da manipulação do equilíbrio dos PGRs nos meios
de cultura e a embriogênese somática repetitiva mostrou ocorrência comum (Chalupa 1995a). Em muitos
sistemas de plantas lenhosas, indutores não-PGR foram empregados para a indução, mas na maioria dos
casos em que os PGRs não estavam envolvidos, os embriões somáticos induzidos sem a formação de calos
intermediários, ou seja, embriogênese somática direta (Kamada et al. 1989, 1993; Pasternak et al. 2002).
Por causa da resposta contrastante ao fenômeno da embriogênese somática mostrado por diferentes
plantas lenhosas em várias configurações experimentais (Jain et al. 2000, 2005) é difícil fazer uma
declaração conclusiva sobre a visão geral do papel desempenhado pelos hormônios endógenos e PGRs em a
indução da embriogênese somática nessas plantas. No entanto, o estudo lado a lado de diferentes espécies /
genótipos sob a mesma configuração experimental pode dar um papel particular desempenhado pelos
indutores e se os resultados se aplicam a outros membros lenhosos (Kaplan e Cooke 1997; Jimenez 2001).

Casos especiais de embriogênese

A embriogênese somática prossegue através de estágios de aquisição e expressão de competência em
todas as categorias de formas de vida vegetal, exceto em alguns casos em que as células não requerem uma
mudança na mudança de desenvolvimento devido à sua natureza embriogênica inerente. A embriogênese
direta que é observada em muitas plantas lenhosas procede de células embrionárias primárias determinadas
com necessidade de poucos PGRs exógenos para a divisão celular e expressão da embriogênese, enquanto a
embriogênese indireta envolve a indução-proliferação de calos e o desenvolvimento de calos embriogênicos
que requerem PGRs para a divisão mitótica e estado embriogênico (Evans et al. 1981; Sharp et al. 1982; van
Arnold et al. 2002).
 Às vezes, a proliferação limitada de calos ocorre antes da indução de embriões somáticos a partir do
explante, como em Theobroma cacao (Duhem et al. 1989). Embriogênese somática secundária, a produção
de embriões somáticos a partir de embriões primários (induzida por vias diretas ou indiretas) também é
comum com plantas lenhosas (Polito et al. 1989; Michler e Bauer 1991; Chalupa 1995a, b).
A formação de embriões somáticos secundários ocorre quando os genes e as mudanças de
remodelação necessárias ao final da embriogênese tornam-se atrasados ou alterados, bloqueando assim a
transição dos embriões somáticos produzidos para as plântulas. A freqüência de indução e a eficiência do
fenômeno variam com as espécies lenhosas; embriogênese secundária, quaternária ou mesmo recorrente é
encontrada, mais com coníferas (Tautorus et al. 1991).
O fenômeno é observado tanto com culturas estabelecidas em meio líquido quanto semissólido. Nas
espécies lenhosas, embriões primários e secundários induzidos em uma frequência mais alta em meio
líquido do que semissólido e embriões primários desenvolvidos a partir de células proembriogênicas em
meio primário, enquanto muitos embriões secundários anormais foram produzidos em meio líquido (Preece
e Bates 1995).
A indução de embriões primários e posteriormente a embriogênese secundária podem mostrar
demarcações nítidas no desenvolvimento ou não, e a competência pode ser mantida por um período de
subcultura estendido. Em Eucalyptus, a embriogênese somática secundária induzida de explantes de
embriões zigóticos juntamente com a formação e proliferação de calos embriogênicos (Muralidharan e
Mascarenhas 1995; Pinto et al. 2008).
As culturas embriogênicas mantidas por mais de 9 anos por meio de subcultura regular mantiveram a
competência com embriogênese somática de alta freqüência e regenerabilidade ao longo do período.
Polembrionia, a produção de muitos embriões de uma única célula e embriogênese de clivagem, produção
de embriões através da divisão da massa de células suspensoras embrionárias em duas ou mais unidades com
cada uma se desenvolvendo em embriões, encontrados na embriogênese zigótica de gimnospermas e comuns
com coníferas são encontrados em embriogênese in vitro de plantas lenhosas (para detalhes, ver Jain et al.
1995a).

Dificuldades
Estudos sobre a embriogênese somática em plantas lenhosas têm mostrado que muitas dificuldades
são encontradas na fase de indução e nos estágios posteriores (experiência de laboratório). O resultado
prático do programa é fortemente impedido pela identidade genética e estado fisiológico de espécies
lenhosas selecionadas para propagação clonal (Park et al. 1998; Bonga et al. 2010). Também é limitado aos
estágios iniciais do desenvolvimento do embrião em algumas coníferas perenes de alto valor industrial (Park
2010). Na maioria das coníferas, as culturas embriogênicas podem ser obtidas apenas a partir de explante de
embrião zigótico, mas, com muitas angiospermas lenhosas, as culturas foram obtidas de explantes diferentes
de embriões zigóticos em um número significativo de espécies (para obter detalhes, consulte Jain et al.
1995a, b; Pullman e Bucalo 2011).
Além das dificuldades na indução de embriões somáticos (por vias diretas ou indiretas) com os
vários tipos de explantes, a maturação e a conversão dos embriões em plântulas são outro problema. Os
embriões induzidos tendem a mostrar uma variedade de anormalidades morfológicas, incluindo variação no
tamanho, a forma e o número de cotilédones em estágios posteriores e com a maioria das espécies são
maiores do que os embriões zigóticos. Além disso, sua taxa de conversão em plântula é menor como por
exemplo em Q. robur, onde a embriogênese direta e indireta foram obtidas de muitos tipos de explantes, mas
a eficiência da conversão de embriões em plântula foi baixa (Chalupa 1995a).
Em Vitis rupestris, apenas 3% dos embriões se desenvolveram em plântulas completas (Jayasankar et
al. 2003). As dificuldades atribuídas à espécie ou genótipo, propagação com explantes maduros por meio da
embriogênese somática, o tempo necessário para testar o protocolo de propagação e menos foco de pesquisa
de instituições acadêmicas são outros problemas (Winkelmann 2013). A contaminação de culturas por
fungos e bactérias endofíticas, raramente relatada na literatura, é outro problema durante o estabelecimento
das culturas (Ewald et al. 2000; Winkelmann 2013).
A exsudação de compostos fenólicos do explante / culturas para os meios de cultura, levando ao
efeito de escurecimento e morte do tecido do explante ou culturas, é outro problema sério em seus estudos.
O uso de explantes de embriões zigóticos para estabelecer culturas embriogênicas superou o problema em
muitas espécies e se mostrou uma estratégia promissora para obter tecido embriogênico com plantas
lenhosas (Akhtar 1997, 2013; Pandey 1998).
Conclusão e perspectivas
Embora a revisão não seja exaustiva de toda a literatura disponível sobre o tema, devido à sua ampla
abrangência, tanto quanto possível, foi abordada literatura relevante. Vários dos problemas encontrados na
indução da embriogênese somática em plantas lenhosas; muitas décadas atrás, ainda não foram resolvidos,
apesar dos esforços incansáveis de pesquisa.
Isso pode ser atribuído a dificuldades inerentes ao estudo do estágio em comparação com outros
estágios da embriogênese somática de plantas lenhosas, devido às muitas dificuldades encontradas em suas
culturas. Da mesma forma, os estudos moleculares são difíceis devido a uma variedade de compostos que as
plantas exalam nos meios de cultura que são inibidores da resposta embriogênica por meio de seus efeitos
epigenéticos na expressão de genes envolvidos na indução da embriogênese somática. Embora as condições
fisiológicas necessárias para a indução da embriogênese somática com vários explantes em um determinado
estágio de desenvolvimento sejam conhecidas para muitas espécies lenhosas, menos se sabe sobre os
processos fisiológicos envolvidos na indução.
Essas informações podem facilitar a identificação de células competentes para (ou "pretendendo")
melhorar a eficiência da produção de embriões somáticos em culturas de plantas lenhosas. É aceito que o
tecido juvenil é o melhor explante para obter culturas embriogênicas na maioria das plantas lenhosas, o
problema do baixo potencial embriogênico de explantes maduros ainda não é devidamente compreendido
em nível molecular. No entanto, acredita-se que seja devido à hipermetilação do DNA em células do tecido
maduro.
O uso de agentes hipometilantes de DNA nas culturas ou estratégias de rejuvenescimento de
explantes parece promissor em estudos do potencial embriogênico de culturas de plantas lenhosas. O
embrião zigótico e os tecidos reprodutivos com seus acessórios são os melhores explantes para uso no
estabelecimento de culturas embriogênicas de plantas lenhosas.
O potencial de competência embriogênica diminui com o aumento da maturidade do explante usado
para estabelecer culturas. Além disso, o potencial para induzir e obter um maior número de embriões
somáticos das culturas diminui com a diminuição da juvenilidade do explante usado. No entanto, ainda não
se sabe se o tecido juvenil como meristema apical poderia dar uma resposta semelhante aos tecidos
reprodutivos, embrião zigótico ou megagametófito. Nesse caso, as semelhanças / diferenças fisiológicas,
morfológicas, celulares e moleculares entre esses explantes e a comparação com a competência da
embriogênese somática de explantes maduros precisam ser estudadas.
A indução da embriogênese somática a partir do tecido vegetativo de plantas lenhosas de elite e
ameaçadas de extinção juntamente com a produção em massa em culturas em suspensão são estratégias para
o baixo custo e a propagação de alto volume das plantas. Estudos sobre a indução e fatores endógenos /
exógenos que regulam a transição de células somáticas para a via embriogênica em plantas lenhosas irão
auxiliar futuros estudos de engenharia genética em aplicações de embriogênese somática para clonagem em
larga escala de árvores para uso máximo pela humanidade.