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J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128 Visite www.DeepL.com/pro para mais informações.
DOI 10.1007/s10815-010-9495-3
REPRODUÇÃO ASSISTIDA
Eclosão assistida na reprodução assistida: um estado da arte
Mohamad Eid Hammadeh -
Constanze Fischer-Hammadeh - Khaled Refaat Ali
Recebido: 16 agosto 2010 / Aceite: 11 outubro 2010 / Publicado online: 2 novembro 2010
Springer Science+Business Media, LLC 2010
Resumo A Organização Mundial de Saúde estima que um
em cada seis casais sofre algum atraso na conceção e um
número crescente requer tratamento através dos
procedimentos de conceção assistida (CA) de fertilização
in vitro (FIV) ou de injeção intracitoplasmática de
espermatozóides (ICSI). A exposição dos ovócitos e dos
embriões às condições artificiais da cultura in vitro pode
ter efeitos negativos sobre a capacidade do embrião para
sofrer uma eclosão normal, o que resulta em baixas taxas
de implantação após a FIV e a transferência de embriões.
Os embriões humanos resultantes da superovulação
desenvolvem-se mais lentamente in vitro do que os
embriões in vivo, manifestam um grau relativamente
elevado de anomalias citogenéticas e sofrem fragmentação
celular. A rutura artificial da zona pelúcida é conhecida
como eclosão assistida (AH) e existem algumas provas de
que os embriões que foram submetidos a manipulação da
zona para eclosão assistida tendem a implantar-se um dia
mais cedo do que os embriões não eclodidos. Desde então,
tem sido utilizada uma variedade de técnicas para auxiliar
a eclosão de embriões, incluindo a dissecação mecânica
parcial da zona, a perfuração da zona e o afinamento da
zona, utilizando tyrodes ácidos, proteinases, piezon
implantam
Cápsula Esta revisão irá considerar o impacto das condições da FIV
na fisiologia da zona pelúcida, o endurecimento da zona, as
diferentes técnicas de incubação assistida, quem pode beneficiar da
incubação assistida e os potenciais perigos
M. E. Hammadeh ( ) . C. Fischer-Hammadeh
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, Unidade de Tecnologia
manipuladores vibradores e lasers. Esta revisão analisará o
impacto das condições de FIV na fisiologia da zona
pelúcida, o endurecimento da zona, as diferentes técnicas
de incubação assistida, quem pode beneficiar da incubação
assistida e os potenciais perigos.
Palavras-chave Incubação assistida . Zona pelúcida .
Implantação . LASER . Perfuração da zona . Solução de
Tyrode
Introdução
Apesar dos numerosos progressos registados na FIV e na
ICSI, a taxa de implantação dos embriões substituídos
continua a ser baixa, estimando-se que até 85% dos
embriões substituídos não se implantam [1]. Foi relatado
que a taxa de implantação por transferência de embriões
em programas de FIV/ICSI é de 10% a 15% para
transferências de dia 2 ou dia 3 e de 23% a 25% para
transferências de blastocistos. A capacidade de um embrião
se desenvolver e implantar está principalmente relacionada
com a qualidade dos gâmetas de origem e com as
características intrínsecas do embrião, tais como a sua
constituição cromossómica e a qualidade do seu citoplasma
[2]. No entanto, algumas proporções de gâmetas euplóides
os embriões com pleno potencial de desenvolvimento não se
de Reprodução Assistida, Universidade de Saarland,
Homburg/Saar, Alemanha
correio eletrónico: mehammadeh@yahoo.de
K. R. Ali
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, Universidade Al-Azhar,
Assuit, Egipto
120 J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128
devido a dificuldades de eclosão [2]. Várias abordagens
para melhorar a taxa de implantação têm sido propostas
e praticadas. Estas incluem [1] melhorar a técnica de
transferência de embriões, [3] melhorar a recetividade
endometrial, e
[4] melhorar a capacidade de implantação do embrião. A
incubação assistida (AH) foi proposta como um método
para melhorar a capacidade de implantação dos
embriões. A eclosão assistida envolve a rutura artificial
da zona pelúcida, tendo sido empregues várias técnicas
de AH, incluindo o afinamento da zona, a perfuração da
zona (rutura através da formação de um orifício) e a
remoção completa da zona, a utilização de
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128

químicos, outras técnicas mecânicas e a utilização de lasers [29], para que as células trofoectodérmicas interajam com as
[5]. Na última década, a AH tem sido oferecida a pacientes células endometriais e ocorra a implantação. A eclosão do
mais velhas, bem como àquelas com embriões congelados embrião é um processo pelo qual o blastocisto expandido
e descongelados ou que sofreram falhas recorrentes de passa por ciclos
FIV-ET. O efeito da AH, no entanto, ainda é discutível [6-
9]. A eclosão assistida foi descrita pela primeira vez por
Cohen et al. que relataram a primeira gravidez após
eclosão assistida em 1988 [10]. Este trabalho pioneiro foi
seguido de numerosas publicações. Algumas destas
publicações relataram um aumento significativo na taxa de
gravidez e/ou implantação em todas as pacientes [11];
outras publicações relataram uma melhoria significativa
em pacientes com um mau prognóstico, nomeadamente
mulheres com mais de 38 anos de idade, pacientes com
zonas espessas e pacientes com falhas repetidas de
implantação [12-14]; enquanto um terceiro grupo de
publicações relatou uma melhoria não significativa na taxa
de gravidez em pacientes com mau prognóstico [11, 15-
18]. Pelo contrário, algumas publicações não registaram
qualquer melhoria na gravidez ou na implantação [19-21].

Estrutura e função da zona pelúcida

O oócito humano e o embrião inicial estão rodeados por

uma matriz acelular de 13 a 15 μm de espessura, a zona
pelúcida [22], que é composta por glicoproteínas, hidratos
de carbono e proteínas específicas da zona pelúcida. A
zona pelúcida tem duas camadas, a exterior é espessa,
enquanto a interior é fina mas resistente [3]. A zona
pelúcida é de importância estrutural e funcional durante a
fertilização e o desenvolvimento pré-implantação. Está
envolvida na ligação dos espermatozóides, na indução da
reação de acrossoma e promove a fusão do óvulo [23].
Após a fertilização, a zona pelúcida bloqueia a
polispermia, impede a dispersão dos blastómeros e ajuda
no transporte oviductal, evitando também o contacto com
outras células (revestimento epitelial do aparelho
reprodutor, leucócitos, espermatozóides e outras células do
embrião) [24]. A compactação é a formação das junções
estruturais entre os blastos. Quando a compactação ocorre,
a zona pelúcida deixa de ser essencial [25].
Para assegurar a função acima referida, o endurecimento
da zona ocorre naturalmente e é evidenciado por uma
maior resistência à dissolução por diferentes agentes
químicos [22].

Processo de incubação

Ao atingir o estádio de blastocisto, uma combinação de

lisinas "proteases" produzidas pelo embrião clivado
(trofoectoderme) e/ou pelo útero, contribuem para a
dissolução da zona [26-28].
Além disso, a expansão física da massa embrionária
reduz a espessura da zona em preparação para a eclosão
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de contracções e expansões até se tornar quase invisível de lisina de zona. Assim, a otimização das condições de
[30]. A elasticidade e o adelgaçamento da zona pelúcida cultura pode ultrapassar essa deficiência in vitro [39].
são fundamentais para o sucesso da eclosão, que é um Também demonstraram
pré-requisito para a implantação [29].
Existem dois estudos observacionais que demonstram
que um local de eclosão natural se desenvolve
normalmente na proximidade da massa celular interna
(MCI) dos blastocistos em humanos, enquanto o do rato
se encontra no lado oposto à MCI [31, 32]. Assim,
Hirotoshi et al. levantaram a hipótese de que a escolha do
local de AH poderia ser importante para o
desenvolvimento da eclosão [33].

A razão de ser da incubação assistida

Uma observação importante que levou à introdução

clínica da incubação assistida foi a constatação de que os
embriões fertilizados microcirurgicamente com lacunas
artificiais na sua zona parecem ter elevadas taxas de
implantação [34], e que os embriões clivados com um
bom prognóstico de implantação têm uma espessura de
zona reduzida [35].
Além disso, Wright et al. [36] relataram que alguns
embriões apresentavam variação na espessura da zona no
seu estágio inicial de desenvolvimento e que o afinamento
da zona é um processo ativo. Em contrapartida, os zigotos
que não se clivaram não apresentaram qualquer alteração
na espessura da zona pelúcida em cultura [37]. Alguns
[38], mas não outros [39], demonstraram que a espessura
da zona pelúcida está correlacionada com a idade da
paciente. Foi sugerido que a falha na rutura da zona e a
subsequente eclosão prejudicada explicam, pelo menos
em parte, as taxas de implantação relativamente baixas
após técnicas de reprodução assistida [40].
Os embriões podem ter intrinsecamente uma zona
pelúcida espessa (>15 Am), ou pode suspeitar-se que
ocorre um endurecimento secundário da zona pelúcida
durante a cultura in vitro e após a criopreservação [39].
A relação entre a espessura da zona e a implantação foi
questionada, sugerindo que o fator limitante para uma
eclosão bem sucedida não é a espessura total mas a
resistência da fina camada interna [3]. Além disso, não
existe correlação entre a espessura da zona pelúcida e a
dureza da zona pelúcida [39]. Como resultado, a remoção
química do exterior da zona pelúcida do embrião do Dia 3
não tem impacto na taxa de implantação, enquanto a
criação de um orifício na zona pelúcida pode melhorar a
implantação do embrião [15]. Ao contrário da espessura e
da dureza da zona, a razão de ser do procedimento de
incubação assistida pode ser a superação de uma
deficiência na produção de uma lisina embrionária
intrínseca que promove a eclosão após a expansão do
blastocisto [39]. Schiewe et al. referiram que as condições
de cultura subóptimas podem, por conseguinte, ser
responsáveis por uma diminuição qualitativa da produção
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128 121

que alguns embriões podem sofrer uma redução ou mesmo
uma incapacidade completa de segregar o "fator de
eclosão" (uma deficiência quantitativa),
independentemente das condições de cultura ou de uma
possível lisina uterina, que pode inibir a eclosão normal. No
entanto, o conceito de um fator uterino permanece elusivo
devido à falta de provas directas. Nesta situação, o
adelgaçamento artificial ou a abertura da zona pelúcida
numa fase de desenvolvimento mais precoce pode aumentar
a incidência de eclosão.
[14]. Os métodos mecânicos e químicos requerem grande
competência técnica para produzir microfuros uniformes,
bem controlados e normalizados, utilizando micropipetas
montadas em micromanipuladores. É importante minimizar
o tempo que o embrião está fora da incubadora e otimizar as
metodologias para reduzir

Mecanismo de AH

Embora o mecanismo pelo qual a incubação assistida

promove a implantação do embrião permaneça pouco
claro, existem explicações possíveis. A janela de
implantação é o período crítico em que o endométrio
atinge o seu estado recetivo ideal para a implantação. A
maioria dos embriões eclode durante este período, o que
sugere que é essencial uma sincronização precisa entre o
embrião e o endométrio [41].
A implantação precoce tem sido associada a uma
gravidez viável subsequente, ao passo que a implantação
tardia tem sido associada a uma elevada incidência de
aborto [42]. Os embriões com lacunas artificiais nas suas
zonas iniciam a eclosão mais cedo do que os embriões com
zonas intactas [43]. Por conseguinte, pode postular-se que
a eclosão assistida facilita a implantação ao permitir um
contacto mais precoce entre o embrião e o endométrio.
Além disso, embora a maioria das moléculas seja capaz de
atravessar a zona pelúcida, a taxa de transporte pode estar
relacionada com a espessura da zona. O transporte
bidirecional de metabolitos e factores de crescimento
através da zona pelúcida pode ser alterado devido à
presença de um espaço artificial [15, 34]. Este contacto
pode permitir uma exposição mais precoce dos embriões a
factores de crescimento vitais. Relativamente ao
mecanismo de reforço do AH, os dados experimentais no
modelo de ratinho demonstraram um aumento da formação
de blastocistos embrionários (no dia 5) num grupo eclodido
(no dia 3) em comparação com o controlo. Teoricamente, o
AH abre vias importantes para transportar nutrientes do
meio de incubação. Estes nutrientes melhoram o
desenvolvimento do embrião e a formação de blastocistos
[44].

Técnicas de incubação assistida

Desde a primeira técnica de incubação assistida que

utilizou um método mecânico, foram propostas várias
abordagens [45], incluindo a incisão mecânica da zona
[43]; a perfuração química da zona com meio ácido [46]; o
desbaste químico da zona [47]; a incubação assistida por
laser [33] e, mais recentemente, a tecnologia piezoeléctrica
122
Variações de pH e de temperatura que podem ser
prejudiciais ao desenvolvimento do embrião. A
micromanipulação é feita no dia 2 ou mais tarde (depois
de a aderência entre os blastómeros ter aumentado), em
embriões que são escolhidos para substituição.
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hidrostática injectada após a descongelação aumenta a taxa
de implantação em comparação com embriões de controlo
[52].
Cong Fang e colegas do First Affiliated Hospital of Sun
Yat-Sen University, Guangdong, People's

Técnicas mecânicas

A técnica de incubação assistida que utiliza a dissecção

parcial da zona (PZD) para criar uma abertura artificial da
zona pelúcida de embriões clivados precocemente foi
descrita pela primeira vez por Cohen et al. [46]. Enquanto
o embrião é estabilizado por uma pipeta de retenção, a
zona pelúcida é perfurada com uma microagulha que é
empurrada tangencialmente através do espaço entre a
zona pelúcida e os blastómeros até perfurar novamente a
zona pelúcida. O embrião é libertado da pipeta de
retenção. A pequena parte da zona presa contra a
microagulha é então esfregada contra a pipeta de retenção,
abrindo assim a área entre os dois lados perfurados pela
microagulha. O mecanismo de PZD é rápido de executar,
mas produz orifícios de tamanhos variáveis que podem
nem sempre ser óptimos [48]. Foi descrito um
refinamento da PZD em que é efectuado um segundo
corte na zona pelúcida sob o primeiro corte, num ângulo
reto, deixando um orifício em forma de cruz na superfície
da zona pelúcida (PZD tridimensional) [49]. Este método
permite a criação de aberturas maiores, ao mesmo tempo
que permite a proteção do embrião pelos retalhos da zona
pelúcida durante a transferência do embrião. Nijs et al.
[50] descreveram uma técnica de fricção da zona para a
eclosão assistida, reduzindo a espessura da matriz através
de uma fricção suave com uma microagulha. Não é feita
qualquer abertura na zona pelúcida, pelo que o risco de
perda de blastómeros e de invasão de microrganismos ou
células imunitárias é minimizado. No entanto, deve ter-se
cuidado ao transferir embriões duplos ou triplos após este
procedimento, por receio de aumentar a incidência de
gravidezes múltiplas [51].

Expansão mecânica da zona pelúcida

Esta técnica foi inspirada nos efeitos naturais de expansão

dos blastocistos na ZP. Este AH mecânico não afina nem
rompe a ZP; em vez disso, expande/estica a ZP através da
pressão hidrostática injectada para ajudar no processo de
eclosão do embrião. Um estudo recente foi efectuado
através da aplicação deste novo método a embriões
congelados e descongelados do dia 3 (D3) para
determinar se poderia melhorar a sua capacidade de
implantação. Partiu-se do princípio de que o
endurecimento da ZP em embriões congelados e
descongelados é mais pronunciado do que em embriões
frescos. Afirmou-se que a expansão mecânica da ZP de
embriões D3 congelados e descongelados com pressão
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128 123

República da China, realizou o estudo em indivíduos que Recentemente, foi introduzida a tecnologia piezoeléctrica
tinham sido submetidos aos seus primeiros ciclos de para a perfuração da zona pelúcida [14]. Enquanto uma
FIV/ICSI (2006-2008) para avaliar se uma nova técnica pipeta de suporte segura o embrião, os movimentos
de AH melhora as taxas de implantação e de gravidez vibratórios produzidos por um impulso piezoelétrico
clínica. As pacientes foram submetidas a uma transferência regulado por um controlador são utilizados para esculpir
de embriões descongelados e foram distribuídas uma zona limitada de
aleatoriamente por dois grupos. No grupo AH: Os
embriões foram transferidos após a utilização de pressão
hidrostática injectada para expandir a ZP de embriões D3
criopreservados e descongelados. No grupo sem AH
(controlos): As agulhas ICSI foram usadas para perfurar os
embriões, mas não para expandir a ZP. Os embriões foram
assim transferidos sem a realização de AH.
Os investigadores, no entanto, relataram taxas mais
elevadas de implantação e gravidez clínica no grupo AH
em comparação com os controlos, apesar da transferência
do mesmo número de embriões. O estudo concluiu que a
expansão mecânica da ZP é um método potencialmente
seguro e eficaz para melhorar o resultado [52].

Técnicas químicas

A incubação assistida utilizando ácido de Tyrode foi

descrita em pormenor por Cohen et al. [15, 46]. O embrião
é fixado numa pipeta de suporte e uma microagulha é
aplicada a uma área da zona pelúcida que cobre o espaço
perivitelino vazio ou fragmentos extracelulares (ou seja,
uma área sem blastómeros). A microagulha é pré-carregada
com ácido de Tyrode antes de cada micromanipulação,
utilizando uma sucção controlada pela boca. A solução
ácida é expelida suavemente numa pequena área até a zona
ser rompida. A sucção é aplicada imediatamente após a
rutura da zona pelúcida para evitar que o excesso de ácido
entre no espaço perivitelino. Esta técnica exige um
manuseamento muito rápido, a fim de evitar a exposição
desnecessária do embrião à solução ácida. O ácido pode ser
prejudicial para os blastómeros adjacentes à parte
perfurada da zona pelúcida. A zona dissolve-se em
contacto com o ácido, pelo que o embrião é imediatamente
retirado e enxaguado várias vezes para remover qualquer
vestígio do ácido.
O afinamento cruzado da zona pelúcida com ácido de
Tyrode foi descrito em ratos e em seres humanos [3].
Envolve uma aplicação biaxial do ácido para fazer uma
área de afinamento cruzado em cerca de um terço da
circunferência da zona pelúcida, sem criar uma abertura.
Os embriões são lavados sem o ácido. Tucker et al.[3], no
seu estudo, não conseguiram verificar a eficácia deste
método, concluindo que a zona pelúcida humana, com duas
camadas, tem de ser totalmente rompida, ao contrário da
do rato.

Tecnologia Piezo
124 J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128
área cónica na zona pelúcida. Cinco a oito aplicações em
Aplicação clínica da AH
áreas adjacentes podem ser usadas para produzir um
grande orifício, o que facilita a eclosão completa do
É importante concentrar-se em quem pode beneficiar desta
blastocisto.
técnica, uma vez que vários estudos não demonstraram
qualquer aumento de
Incubação assistida por laser

A perfuração da zona assistida por laser foi relatada pela

primeira vez em 1991 por dois grupos liderados por Tadir
[53] e Palankar [54]. O laser é uma ferramenta ideal para
procedimentos microcirúrgicos, uma vez que a energia é
facilmente focada na área visada, produzindo um orifício
controlado e preciso, consistente entre operadores. O feixe
de laser pode ser dirigido através de uma lente ótica
tangencial ao embrião através da zona pelúcida, num
modo sem contacto, ou o laser pode ser guiado através de
uma fibra ótica que toca o embrião, num modo de
contacto. Inicialmente, o modo sem contacto foi adotado
para a micromanipulação de gâmetas utilizando vários
comprimentos de onda laser. Subsequentemente, a
abordagem de contacto foi utilizada com um comprimento
de onda ultravioleta (UV) fornecido por uma pipeta de
vidro ou um comprimento de onda infravermelho (IR)
fornecido por uma fibra de quartzo [53]. No entanto, as
vantagens técnicas do modo sem contacto e o potencial da
radiação UV para causar efeitos mutagénicos nocivos
levaram à preferência geral pelo modo sem contacto,
utilizando o laser de díodo IR de 1,48 μm (1 480 nm)
[55].
Inicialmente, o laser foi utilizado para criar um único
orifício de espessura total através da zona pelúcida. Mais
recentemente, Blake et al.[56] demonstraram um aumento
significativo da eclosão in vitro, utilizando o laser para
diluir a zona pelúcida sem criar um orifício. Um outro
estudo revelou uma taxa de gravidez clínica mais elevada
quando se utiliza o laser para diluir uma área alargada da
zona pelúcida, em comparação com a produção de um
único orifício de espessura total [57]. Tanto a microscopia
eletrónica ligeira como a microscopia eletrónica de
varrimento não revelaram alterações degenerativas ultra-
estruturais da zona pelúcida de oócitos e embriões após a
perfuração da zona assistida por laser [58], e os relatórios
sobre as crianças nascidas após esta técnica foram
tranquilizadores [59, 60]. A microdissecção da ZP
assistida por laser pode ser efectuada com elevada
precisão e repetibilidade, sem impacto negativo no
desenvolvimento embrionário in vitro. A técnica é fácil de
executar e muito eficaz no que diz respeito ao tempo total
necessário e pode ser efectuada num ambiente estéril sem
quaisquer micromanipulações adicionais [61-65].
Utilizando o laser de díodo infravermelho de 1,48-μm, é
possível abrir a zona mesmo em blastocistos largamente
expandidos sem danos visíveis no blastocisto. A
segurança do feixe de laser de díodo de 1,48-μm foi
avaliada em oócitos e zigotos de ratinho e humanos.
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128 125

taxas de gravidez quando a eclosão assistida é efectuada
em grupos não seleccionados (Quadro 1).
No entanto, foram sugeridos alguns factores para
identificar grupos de pacientes que podem beneficiar da
incubação assistida, incluindo o número de insucessos
anteriores de FIV, a idade da paciente, a substituição de
embriões criopreservados e a espessura da zona pelúcida.
As variações nas técnicas utilizadas, nas pacientes
seleccionadas e nos desenhos dos estudos dificultam a
comparação entre estudos e o agrupamento de dados
O potencial da AH no insucesso recorrente da FIV
O aumento da incidência de embriões cariotipicamente
anormais [15] pode ser o endurecimento espontâneo da
zona devido a alterações endócrinas relacionadas com a
idade e/ou a ausência de lisinas dos tecidos circundantes,
que podem atuar sobre os embriões in vivo [17, 72]. Estas
condições ambientais controlam a eclosão. No entanto, é e,
em certa medida, um declínio na recetividade uterina [16,
73]. Embora a eclosão assistida possa beneficiar as
mulheres mais velhas, é pouco provável que a sua taxa de
gravidez volte a ser a observada nas mulheres mais jovens
(Tabela 2).

O insucesso repetido e inexplicável da FIV está associado Embriões congelados e descongelados

a uma menor probabilidade de gravidez nos ciclos de
tratamento subsequentes. As taxas de gravidez e de
implantação parecem aumentar significativamente com a
incubação assistida em mulheres com insucesso
inexplicável e recorrente da implantação em pelo menos
dois, e normalmente mais, ciclos anteriores de FIV. No
entanto, é claro que seria preferível identificar as pacientes
que beneficiariam da incubação assistida antes de terem
ciclos de FIV sem sucesso [70] (Figs. 1, 2)
O potencial da AH na idade feminina avançada
Está bem estabelecido que as taxas de sucesso da FIV
diminuem com o avanço da idade materna e foram feitas
muitas sugestões para explicar esta redução da fertilidade
[71]. Uma dessas sugestões é que pode haver um
endurecimento espontâneo da zona devido a alterações
endócrinas relacionadas com a idade e/ou a ausência de
lisinas dos tecidos circundantes, que podem atuar sobre os
embriões in vivo [17, 72].
Tais condições ambientais ou controlam a eclosão
importante reconhecer que pode haver outros factores que
reduzem a fertilidade em mulheres mais velhas, como a
redução da qualidade e quantidade de oócitos 'reserva
ovariana' [71], uma
Pensa-se que a cultura in vitro excessiva de embriões
criopreservados, e/ou exacerbada pelo processo de
congelação-descongelação, induz alterações na matriz
glicoproteica que levam ao endurecimento da zona [77].
Check et al. [78] relataram a melhoria das taxas de
implantação e de gravidez quando a incubação assistida foi
efectuada em embriões em fase de seis a oito células. Além
disso, Tao e Tamis [79] relataram um resultado bem-
sucedido da incubação assistida quando utilizada em
embriões congelados e descongelados no estágio de duas
células.
Nijs et al. [51] observaram um aumento significativo da
taxa de implantação após a transferência de embriões
congelados e descongelados na sequência da aplicação da
fricção da zona. Além disso, um estudo prospetivo
controlado e aleatório realizado por Nagy et al. [80]
apresentou um aumento significativo das taxas de
implantação e de gravidez após a eclosão assistida por
laser e a remoção de blastómeros degenerados, tendo Tao e
Tamis [79] relatado embriões descongelados em duas fases
celulares.
Zona pelúcida espessa
Um estudo sobre a incubação assistida em doentes com
uma zona pelúcida espessa com mais de 15 μm sugeriu
uma im-

Quadro 1 Estudos sobre incubação assistida em doentes não seleccionadas após FIV

Tipo de AHNo . de pacientesTaxa de implantação (%)Taxas de gravidez (%) Ref.

AH Control AH Controlo P AH Controlo P

o
PZD 15 15 25 6 <0.023 47 13 <0.05 [47]
Ácido Tyrode's 69 68 28 21 NS 54 47 NS [15]
Ácido Tyrode's 110 108 18.9 21.9 NS 44.6 37 NS [3]
PZD após ICSI 60 60 17.9 17.1 NS 42.1 38.1 NS [66]
126 J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128
Laser 111 121 11.8 7.1 <0.05 39.6 19 <0.05 [4]
Ácido Tyrode's 13 7 9.6 10.7 NS 23 42 NS [67]
Laser 96 103 - - - 30.2 29.1 NS [68]
Laser após ICSI 51 52 17.3 20.8 NS 33.3 40.3 NS [69]
Tyrode ácido após ICSI 27 25 - - - 44 40 NS [11]
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128
Fig. 1 Diagrama de árvore para as taxas de gravidez em pacientes com >2 insucessos anteriores de FIV submetidas a incubação assistida versus
pacientes sem incubação assistida
taxa de implantação comprovada [15]. Este facto levou
alguns a introduzir a eclosão assistida selectiva em
embriões de mau prognóstico (zona pelúcida espessa, baixa
taxa de desenvolvimento e fragmentação excessiva), mas
são necessários mais estudos.
Resultados da AH
A realização rotineira ou universal da eclosão assistida em
todos os embriões em pacientes de FIV/ICSI não é
científica nem apropriada. Ensaios aleatórios de incubação
assistida em todos os embriões, sem qualquer seleção,
revelaram que não há diferença nas taxas de implantação e
de gravidez entre os grupos de tratamento e de controlo [7,
66].
Numa meta-análise recentemente publicada de estudos
controlados e aleatórios sobre eclosão assistida para todas
as pacientes tratadas com FIV/ICSI (13 estudos de 165
preenchiam os critérios de seleção); os resultados da meta-
análise não puderam ser aceites devido à heterogeneidade
dos estudos, que pode dever-se às diferentes técnicas
utilizadas ou às diferentes populações de pacientes
estudadas [70]. Por outro lado, existem provas
convincentes na literatura de que a incubação assistida
pode aumentar a capacidade de implantação de alguns dos
embriões. As indicações propostas para a eclosão assistida
são a idade materna avançada (≥37 anos), a FSH basal
elevada da mulher e dois ou mais abortos anteriores.
Fig. 2 Diagrama de árvore para as taxas de implantação em pacientes com >2 insucessos anteriores de FIV submetidas a incubação assistida
127
tentativas falhadas de FIV, embriões com zona pelúcida
espessa (>15 μm), morfologia embrionária anormal ou
deficiente, fragmentação citoplasmática e taxa de
desenvolvimento retardada [16, 81, 82].
Sallam et al. concluíram, após a realização de uma série
de análises de sensibilidade, que a incubação assistida
melhora significativamente a taxa de gravidez, a taxa de
implantação e a taxa de gravidez em curso para pacientes
com mau prognóstico tratadas com FIV/ICSI,
particularmente aquelas com dois ou mais insucessos
anteriores [70].
Isto está de acordo com as recomendações do Comité de
Prática da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva,
depois de rever os diferentes relatórios publicados sobre o
papel da incubação assistida na FIV, sugerindo que a
incubação assistida pode ser clinicamente útil e que os
programas individuais de TARV devem avaliar as suas
próprias populações de doentes para determinar quais os
subgrupos que podem beneficiar do procedimento. A
realização rotineira ou universal da incubação assistida no
tratamento de todas as pacientes de FIV parece, neste
momento, não ser justificada [7].
Risco potencial de AH
O procedimento de incubação assistida pode estar
associado a complicações específicas independentes do
procedimento de FIV
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versus pacientes sem incubação assistida
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128 129

Quadro 2 Estudos de incubação

assistida em pacientes com Tipo de AHNo . de pacientesTaxa de implantação (%)Taxas de gravidez (%) Ref.
idade feminina avançada
AH Controlo AH Controlo P AH Controlo P

Ácido Tyrode's 38 28 22 6 <0.001 58 21 <0.005 [74]

Ácido Tyrode's 211 174 3.75 3.55 NS 8.9 5.1 NS [75]
Ácido Tyrode's 45 42 11.5 4 <0.05 31 19 <0.05 [13]
PZD após ICSI 22 22 4.3 1.6 NS 9.1 4.5 NS [76]
PZD após ICS 30 29 5.5 6.9 NS 10 17.2 NS [76]
Ácido Tyrode's 20 26 4.8 3 NS 15 11.5 NS [76]

incluindo danos letais ao embrião e danos a blastómeros substituição da PZD por eclosão quimicamente assistida
individuais com redução da viabilidade do embrião. Além para obter uma eclosão completa tem
disso, a manipulação artificial da ZP tem sido associada a
um risco aumentado de gémeos monozigóticos [83, 84].
Um orifício na zona pelúcida provocado por qualquer
técnica pode privar o embrião da sua camada protetora, que
o protege de quaisquer factores prejudiciais no trato
reprodutor feminino, tais como toxinas, microrganismos ou
células imunitárias. Os blastómeros podem ficar presos em
orifícios mais pequenos da zona pelúcida durante o
processo de eclosão e, por conseguinte, podem não
conseguir completar a eclosão [29].
Alternativamente, os blastómeros podem perder-se
através de orifícios maiores antes da formação de junções
apertadas, podendo causar gémeos monozigóticos, morte
embrionária ou mesmo vesiculação [46, 80]
Os gémeos monozigóticos são mais comuns em
mulheres que participam num programa de FIV do que na
população em geral. Numa revisão clínica de 2.163 ciclos
de FIV, foram encontrados seis casos de gravidez de
gémeos idênticos [85]. Três deles tinham sido tratados com
Tyrode ácido para criar orifícios maiores (20 mm), e dois
deles tinham sido submetidos a inseminação subzona. A
incidência crescente de gémeos monozigóticos foi também
referida numa revisão de 674 embriões transferidos que
foram submetidos a dissecção parcial da zona (PZD).
Foram encontrados gémeos monozigóticos em oito (1,2%)
deles, em comparação com nenhum dos 559 embriões que
não foram eclodidos [83].
A maior incidência de gémeos monozigóticos após a
eclosão assistida pode resultar de duas razões. Primeiro,
uma abertura pequena e estreita na zona pelúcida,
especialmente a criada pela PZD, pode prender o
blastocisto em eclosão em forma de figura 8. A subdivisão
do blastocisto pode levar à formação de gémeos
monozigóticos [83]. A segunda razão é a eclosão
prematura dos blastómeros, que pode resultar no
desenvolvimento de outro embrião idêntico. Os
blastómeros humanos estão unidos por junções apertadas
que só se tornam aparentes após o estádio de 6 células [86].
A associação frouxa torna possível a perda de blastómeros
quando é criado um grande orifício numa fase precoce. A
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é aconselhado por muitos investigadores. No entanto, as
grandes aberturas na zona pelúcida podem aumentar
negativamente o risco de eclosão prematura dos
blastómeros. Sugere-se vivamente que a eclosão
quimicamente assistida deve ser utilizada com precaução,
de modo a não induzir grandes aberturas que possam estar
implicadas na herniação de blastómeros e na indução de
gémeos monozigóticos [87].

Conclusão

Esta revisão sugere que o uso rotineiro da incubação

assistida é inadequado, tendo em conta a falta de provas
de benefícios universais e os riscos potenciais. No
entanto, existem provas de que a incubação assistida é
benéfica em determinadas circunstâncias, como em
pacientes com um mau prognóstico, incluindo aquelas
com dois ou mais ciclos de FIV falhados e má qualidade
embrionária e mulheres mais velhas com mais de 38 anos
de idade) [11]. Foram observadas taxas clínicas de
gravidez e implantação mais elevadas após a incubação
assistida. No entanto, as taxas de parto não melhoraram
significativamente, possivelmente porque as pequenas
dimensões das amostras nos estudos que comunicaram as
taxas de parto não tiveram poder suficiente para detetar
uma diferença. Este ponto de vista é consistente com as
directrizes da Sociedade Americana de Medicina
Reprodutiva [7].
Existem muitas técnicas atualmente utilizadas para
auxiliar a eclosão, que podem diferir tanto em termos de
eficácia como de riscos. Embora o equipamento possa ser
dispendioso, a técnica assistida por laser parece ter o
menor risco potencial associado e é relativamente simples
de executar com consistência entre operadores. É
necessária uma investigação adequada, provavelmente
multicêntrica, para confirmar qual a técnica mais segura a
utilizar e para identificar os doentes que beneficiariam da
incubação assistida antes de terem tido repetidos ciclos de
tratamento sem sucesso. Nesta revisão, procede-se a uma
análise exaustiva e focalizada da maioria das
investigações e estudos relativos à AH existentes na
literatura. Tendo em consideração o mais atualizado, que
trata da técnica de expansão mecânica, com ênfase na
necessidade urgente de ensaios para melhorar o potencial
da AH. Seleção adequada dos candidatos a diferentes AH
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128 131

15. Cohen J, Alikani M, Trowbridge J, Rosenwaks Z. Melhoria da

é de extrema importância. Existem fortes indícios de que a implantação por eclosão assistida selectiva utilizando a perfuração
AH com laser é atualmente considerada a melhor técnica da zona de embriões humanos com mau prognóstico. Hum
em termos de segurança e eficácia. Reprod. 1992;7:685- 91.

Referências

1. Edwards RG. Abordagens clínicas para aumentar a recetividade

uterina durante a implantação humana. Hum Reprod. 1995;10
Suppl 2:60-6.
2. Huisman GJ, Fauser BC, Eijkemans MJ, Pieters MH. Taxas de
implantação após fertilização in vitro e transferência de um
máximo de dois embriões que passaram por três a cinco dias em
cultura. Fertil Steril. 2000;73:117-22.
3. Tucker MJ, Luecke NM, Wiker SR, Wright G. Chemical removal
of the outside of the zona pellucida of day 3 human embryos has
no impact on implantation rate. J Assist Reprod Genet. 1993;10:187-
91.
4. Antinori S, Panci C, Selman HA, Caffa B, Dani G, Versaci C.
Desbaste da zona com a utilização de laser: uma nova abordagem
para a eclosão assistida de em seres humanos. Hum Reprod.
1996;11:590-4.
5. Valojerdi MR, Eftekhari-Yazdi P, Karimian L, Ashtiani SK.
Effect of laser zona pellucida opening on clinical outcome of
assisted reproduction technology in patients with advanced
female age, recurrent implantation failure, or frozen-thawed
embryos. Fertil Steril. 2008;90:84-91.
6. Das S, Blake D, Farquhar C, Seif MMW. Incubação assistida na
conceção assistida (FIV e ICSI). Cochrane Database Syst Rev.
2009;(2):CD001894. doi:10.1002/14651858.CD001894.
7. Practice Committee of Society for Assisted Reproductive
Techonology; Practice Committee of American Society for
Reproductive Medicine, The role of assisted hatching in in vitro
fertilization: a review of the literature. Um parecer do Comité.
Fertil Steril. 2008;S196-98.
8. Margalioth EJ, Ben-Chetrit A, Gal M, Eldar-Geva T.
Investigação e tratamento de falhas de implantação repetidas após
FIV-ET. Hum Reprod. 2006;21:3036-43.
9. Primi MP, Senn A, Montag M, Van der Ven H, Mandelbaum J,
Veiga A, et al. Estudo europeu multicêntrico prospetivo e
aleatório para avaliar a utilização da incubação assistida com um
laser de díodo e o benefício de um tratamento
imunossupressor/antibiótico em diferentes populações de
doentes. Hum Reprod. 2004;19:2325-33.
10. Cohen J, Malter H, Fehilly C, et al. Implantação de embriões
após abertura parcial da zona pelúcida do oócito para facilitar a
penetração do esperma . Lancet. 1988;II:162.
11. Mansour RT, Rhodes CA, Aboulghar MA, Serour GI, Kamal A.
A transferência de embriões sem zona melhora o resultado em
doentes com mau prognóstico: um estudo prospetivo controlado e
aleatório. Hum Reprod. 2000;15:1061-4.
12. Antinori S, Selman HA, Caffa B, Panci C, Dani GL, Versaci C.
Abertura da zona de embriões humanos utilizando um laser UV
sem contacto para incubação assistida em pacientes com mau
prognóstico de gravidez. Hum Reprod. 1996;11:2488-92.
13. Magli MC, Gianaroli L, Ferraretti AP, Fortini D, Aicardi G, Montanaro
N. Recuperação do potencial de implantação em embriões com mau
prognóstico através de assisted zona hatching. Hum Reprod.
1998;13:1331-5.
14. Nakayama T, Fujiwara H, Yamada S, Tastumi K, Honda T, Fujii
S. Aplicação clínica de um novo método de incubação assistida
utilizando um piezo-micromanipulador para embriões de baixa
qualidade morfológica em pacientes inférteis de mau prognóstico.
Fertil Steril. 1999;71:1014-8.
132 J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128
avaliação da morfologia do esperma e do embrião. Fertil Steril.
16. Demirel LC, Evirgen O, Al-Hasani S. The role of assisted
1991;56:696-706.
hatching in human IVF. Middle East Fert Soc J. 2002;7:6-12.
35. Cohen J, Inge KL, Suzman M, Wright G. Video cinematography of
17. Tucker MJ, Morton PC, Wright G, Ingargiola PE, Sweitzer CL,
fresh and cryopreserved embryos: a retrospective analysis of
Elsner CW, et al. Melhoria do resultado da injeção
embryonic morphology and implantation. Fertil Steril. 1989;51:820-
intracitoplasmática de esperma: a cocultura ou a incubação
7.
assistida melhoram as taxas de implantação? Hum Reprod.
1996;11:2434-7.
18. Chao KH, Chen SU, Chen HF, Wu MY, Yang YS, Ho HN. A
incubação assistida aumenta a taxa de implantação e de gravidez
da fertilização in vitro (FIV) - transferência de embriões (TE),
mas não a da FIV - TE tubária em pacientes com insucessos
repetidos de FIV. Fertil Steril. 1997;67:904-8.
19. Frydman N, Madoux S, Hesters L, Duvernoy C, Feyereisen E,
Le Du A, et al. Um estudo aleatório controlado em dupla
ocultação sobre a eficácia do desbaste da zona pelúcida com
laser no nascimento de bebés vivos em casos de idade feminina
avançada. Hum Reprod. 2006;21:2131-5.
20. Hurst BS, Tucker KE, Awoniyi CA, Schlaff WD. A incubação
assistida não aumenta o sucesso da FIV em pacientes com bom
prognóstico . J Assist Reprod Genet. 1998;15(2):62-4.
21. Lanzendorf SE, Nehchiri F, Mayer JF, Oehninger S, Muasher
SJ. Um estudo prospetivo, aleatório e duplamente cego para a
avaliação da incubação assistida em pacientes com idade
materna avançada. Hum Reprod. 1998;13:409-13.
22. Bleil JD, Wassarman PN. Structure and function of the zona
pellucida: identification and characterisation of the proteins of
the mouse oocytes zona pellucida. Dev Biol. 1980;76:185-202.
23. Van Duin M, Polman JE, DeBreet IT, et al. A proteína
recombinante da zona pelúcida humana zona pelúcida3
produzida por células de ovário de hamster chinês induz a
reação de acrossoma do esperma humano e promove a fusão
esperma-ovo. Biol Reprod. 1994;5:607-17.
24. Modliniski JA. The role of the zona pellucida in the
development of mouse eggs in vivo. J Embryol Exp Morphol.
1970;23:539-51.
25. Trounson AO, Moore NW. The survival and development of
sheep eggs following complete or partial removal of the zona
pellucida. J Reprod Fertil. 1974;41:97-108.
26. Gordon JW, Dapunt U. A new mouse model for embryos with a
hatching deficiency and its use to elucidate the mechanism of
blastocyst hatching. Fertil Steril. 1993;59:1296-301.
27. Schiew MC, Araujo E, Asch RH, Balmaceda JP. Caracterização
enzimática do endurecimento da zona pelúcida em óvulos
humanos e embriões. J Assist Reprod Genet. 1995;12:2-7.
28. Letterie GS. Assisted hatching: relative techniques and clinical
outcomes. Assist Reprod Rev. 1997;8:116-25.
29. Cohen J. Assisted hatching of human embryos (incubação
assistida de embriões humanos). J In Vitro Fertil Embryo
Transf. 1991;8:179-90.
30. Cole RJ. Observação cinematográfica do blastocisto e da zona
pelúcida do blastocisto do rato. J Embryol Exp Morphol.
1967;17:481-90.
31. Veeck LL, Zaninovic N. Blastocyst hatching. Em: Veeck LL,
Zaninovic N, editores. An atlas of human blastocysts (Um atlas
de blastocistos humanos). Londres: Informa Healthcare; 2003. p.
159-71.
32. Gonzales DS, Jones JM, Pinyopummintr T, Carnevale EM,
Ginther OJ, Shapiro SS, et al. Trophectoderm projections: a
potential means for locomotion, attachment and implantation of
bovine, equine and human blastocysts. Hum Reprod.
1996;11:2739-45.
33. Hirotoshi M, Hidehiko M, Noriko F, Junko M, Azusa K, Tatsuhiro
T. Relevância do local de eclosão assistida em blastocistos
humanos descongelados: um relatório preliminar. Fertility and
Sterility, In Press, Corrected Proof, Disponível online em 2 de
março de 2010.
34. Cohen J, Alikani M, Malter HE, Adler A, Talansky BE, Rosenwaks
Z. Dissecção parcial da zona ou inseminação subzonal de
esperma: alternativas de fertilização microcirúrgica baseadas na
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128 133

1996;18:52-62.
36. Wright G, Wiker S, Elsner C, et al. Observações sobre a
morfologia dos zigotos, pronúcleos e nucléolos humanos e
implicações para a criopreservação. Hum Reprod. 1990;5:109-
15.
37. Chan PJ. Developmental potential of human oocytes according to
zona pellucida thickness. J In Vitro Fertil Embryo Transf.
1987;4:237-41.
38. Loret De Mola JR, Garside WT, Bucci J, Tureck RW, Hyener S.
Análise da zona pelúcida humana durante a cultura: correlação
com o diagnóstico e o ambiente hormonal pré-ovulatório. J Assist
Reprod Genet. 1997;14:332-6.
39. Schiewe MC, Hazeleger NL, Sclinenti C, Balmaceda JP.
Caracterização física dos mecanismos de eclosão de blastocistos
através da utilização de um modo anti-eclosão do rato . Fertil
Steril. 1995;63:288-94.
40. Edwards R, Mettler LE, Walters DW. Identical twins and in vitro
fertilisation. J In Vitro Fertil Embryo Transf. 1986;3:114-7.
41. Liu HC, Cohen J, Alikani M, Noyes N, Rosenwaks Z. Assisted
hatching facilitates earlier implantations. Fertil Steril. 1993;60:871-
5.
42. Liu HC, Rosenwaks Z. Early pregnancy wastage in in in-vitro
fertilization patients. J In Vitro Fertil Embryo Transf. 1990;8:65-
72.
43. Malter HE, Cohen J. Formação de blastocistos e eclosão in vitro
após perfuração da zona de embriões de ratos e humanos. Gamete
Res. 1989;24:67-80.
44. Hershlag A, Feng HL. The effect of pre-freeze assisted hatching
on post-thaw survival of mouse embryos. Fertil Steril.
2005;84:1752-4.
45. Cohen JH, Mather H, Wright G, Kort H, Massey J, Mitchell D.
Partial zona dissection of human oocytes when failure of zona
pellucida penetration is anticipated. Hum Reprod. 1989;4:435-
42.
46. Cohen J, Elsner C, Kort H, et al. Prejuízo do processo de eclosão
após FIV no ser humano e melhoria da implantação por eclosão
assistida usando micromanipulação. Hum Reprod. 1990;5:7-13.
47. Khalifa EAM, Tucker MJ, Hunt P. Cruciate thinning of the zona
pellucida for more successful enhancement of blastocyst hatching
in the mouse. Hum Reprod. 1992;7:532-6.
48. Cohen J, Feldberg D. Effects of the size and number of zona
pellucida openings on hatching and trophoblast outgrowth in the
mouse embryo. Mol Reprod Dev. 1991;30:70-8.
49. Cieslak J, Ivatchnenko V, Wolf G, Sheleg S, Verlinsky Y.
Dissecção tridimensional parcial da zona pelúcida para
diagnóstico genético pré-implantação e incubação assistida. Fertil
Steril. 1999;71:308- 13.
50. Nijs M, Vanderzwalman P, Bertin G, et al. Gravidezes obtidas
após amolecimento da zona de embriões humanos cultivados in
vitro ou congelados-descongelados. Hum Reprod. 1992;7:82.
Abstract 141, (Abstract Book 2), Resumo da 8ª Reunião Anual da
ESHRE, The Hague, Netherlands.
51. Nijs M, Vanderzwalmen P, Segal-Bertina G, et al. Uma gravidez
gemelar monozigótica após aplicação de zona rubbing num
blastocisto congelado- descongelado. Hum Reprod. 1993;8:127-
9.
52. Cong F, Tao L, Ben-Yu M, Guang-Lun Z, Canquan Z. Expansão
mecânica da zona pelúcida de embriões humanos congelados e
descongelados: um novo método de incubação assistida. Fertility
and Sterility, In Press, Corrected Proof, Disponível online em 26
de setembro 2009.
53. Tadir Y. Dez anos de manipulação de gâmetas e embriões
assistida por laser . Contemp Ob/Gyn. 1998;9:2-10.
54. Palankar D, Ohad S, Lewis A, Simon A, Shenker J, Penchas S.
Técnica para microcirurgia celular utilizando o excimer laser de
193 nm . Laser Surg Med. 1991;11:580-6.
55. Rink K, Delacretaz G, Salathe RP, et al. Microperfuração sem
contacto da zona pelúcida do ratinho com um laser de díodo de
1,48um fornecido por uma objetiva. Laser Surg Med.
134 J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128
56. Blake DA, Forsberg AS, Johansson BR, Wikland M. Laser zona
pellucida thinning-alternative approach to assisted hatching.
Hum Reprod. 2001;16:1959-64.
57. Mantoudis E, Podsially BT, Gorgy A, Venkat G, Craft IL. Uma
comparação entre incubação assistida por laser de quartzo, parcial e
total em pacientes com infertilidade selecionada. Hum Reprod.
2001;16:2182-6.
58. Obruca A, Strohmer H, Blaschitz A, Schonickle E, Dohr G,
Feichtinger W. Observações ultra-estruturais em oócitos
humanos e embriões pré-implantatórios após a abertura da zona
com um laser de érbio: ítrio-alumínio granada Er: (YAG). Hum
Reprod. 1997;12:2242-5.
59. Germond M, Nocera D, Senn A, Rink K, Delacnetaz G, Fakan
S. Microdissecção da zona pelúcida de ratos e humanos
utilizando um feixe de laser de díodo de 1,48 Am: eficácia e
segurança do procedimento. Fertil Steril. 1995;64:604-11.
60. Kanyô K, Konc J. Um estudo de acompanhamento de crianças
nascidas após a eclosão assistida por laser sem contacto de 96
partos, 134 bebés. Hum Reprod. 2000;15:63. Abstract 0-156,
(Abstract Book 1), Resumo da 16ª Reunião Anual da ESHRE,
Bolonha, Itália.
61. Hseih YY, Huang CC, Cheng TC, Chang CC, Tsai HD, Lee
MS. A incubação de embriões assistida por laser é melhor do
que o método químico para aumentar a taxa de gravidez em
mulheres com idade avançada. Fertil Steril. 2002;78:179-82.
62. Makrakis E, Angeli I, Agapintou K, Pappas K, Dafereras A,
Pantos K. Laser verus mechanical assisted hatching: a
prospective study of clinical outcomes. Fertil Steril.
2006;86:1596-600.
63. Lanzendorf SE, Ratts VS, Moley KH, Goldstein JS, Dahan MD,
Odem RR. A randomized, prospective study comparing laser-
assisted hatching and assisted hatching using acidified medium.
Fertil Steril. 2007;87:1450-7.
64. Sagoskin AW, Levy MJ, Tucker MJ, Richter KS, Widra EA.
Eclosão assistida por laser em pacientes com boa pronose
submetidos a transferência de embriões por fertilização in vitro:
um estudo controlado e aleatório. Fertil Steril. 2007;87:283-7.
65. Huai L, Avner H, Gerald M, Matthew A. Um estudo
retroprospectivo que compara três técnicas diferentes de
incubação assistida. Fertil Steril. 2009;91:1323-5.
66. Hellebaut S, DeSutter P, Dozortseu D, Onghena A, Oian C, Dhont
M. A incubação assistida melhora as taxas de implantação após
fertilização in vitro ou injeção intracitoplasmática de esperma
em todas as pacientes? Um estudo prospetivo e aleatório. J
Assist Reprod Genet. 1996;13:19-22.
67. Hurst BS, Tucker KE, Awoniyi CA, Scwaff WD. A incubação
assistida não aumenta o sucesso da FIV em pacientes com bom
prognóstico . J Assist Reprod Genet. 1998;15:62-4.
68. Antinori S, Versaci C, Dani L, et al. Eclosão assistida por laser
nos extremos do espetro da FIV. Primeiro ciclo e após 6 ciclos:
um ensaio prospetivo aleatório. Hum Reprod. 1999;14:122.
Resumo 0-221 (Livro de Resumos I), Resumo da 15ª Reunião
Anual de o ESHRE, Tours, França.
69. Baruffi R, Mauri AL, Peterson C, et al. Eclosão assistida com
um díodo laser em pacientes com menos de 37 anos de idade
sem falha anterior de implantação: um estudo prospetivo
aleatório. Hum Reprod. 1999;14:121. Resumo 0-218 (Livro de
Resumos I), Resumo da 15ª Reunião Anual da ESHRE, Tours,
França.
70. Sallam HN, Sadek S, Agameya A. Assisted hatching-a meta-
analysis of randomized controlled trials (incubação assistida -
uma meta-análise de ensaios clínicos aleatórios). J Assist
Reprod Genet. 2003;20:332-42.
71. Lass A, Coucher C, Duffy S. 1000 ciclos de fertilização in-vitro
iniciados em mulheres com 40 anos ou mais. Fertil Steril.
1998;70:1030-4.
72. Dokras A, Sargent IL, Ross C, Gardner RL, Barlow DU. The
human blastocyst: morphology and human chorionic gonadotro-
phin secretion in vitro. Hum Reprod. 1991;6:1143-51.
J Assist Reprod Genet (2011) 28:119-128
73. Meldrum DR. Female reproductive ageing: ovarian and uterine
factors. Fertil Steril. 1993;59:1-5.
74. Schoolcraft WB, Schlenker T, Jones GS, Jones Jr HW.
Fertilização in vitro em mulheres com 40 anos ou mais. The
impact of assisted hatching. J Assist Reprod Genet. 1995;12:581-
3.
75. Bieder D, Liushits A, Yonish M, Yemini Z, Mashiach S, Dor J.
Eclosão assistida por perfuração da zona de embriões humanos
em mulheres de idade avançada. Hum Reprod. 1997;12:317-20.
76. Edirisinghe WR, Ahnonkitpanit V, Promviengchai S, et al. Um
estudo que não conseguiu determinar benefícios significativos da
incubação assistida: pacientes seleccionados por idade avançada,
espessura da zona dos embriões e tentativas anteriores falhadas. J
Assist Reprod Genet. 1999;16:294-301.
77. Carroll J, Depypene H, Mathews CD. Freeze-thaw induced
changes of the zona pellucida explains decreased rates of
fertilisation in frozen-thawed mouse oocytes. J Reprod Fertil.
1990;90:547-53.
78. Check JH, Hoover L, Nazari A, O'Shaughnessy A, Summers D.
The effect of assisted hatching on pregnancy rates after frozen
embryo transfer. Fertil Steril. 1996;65:254-7.
79. Tao J, Tamis R. Application of assisted hatching for 2-day-old,
frozen-thawed embryo transfer in a poor-prognosis population.
J Assist Reprod Genet. 1997;14:128-30.
80. Nagy ZP, Rienzi L, Iacobelli F, et al. Eclosão assistida por laser e
remoção de blastómeros degenerados de animais congelados -
descongelados
135
embriões melhora as taxas de gravidez. Fertil Steril. 1999;S4
(Resumo 0-009).
81. Stein A, Rufas O, Amit S, et al. Eclosão assistida por dissecção
parcial da zona do pré-embrião humano em pacientes com falhas
recorrentes de implantação após fertilização in vitro. Fertil Steril.
1995;63:838-41.
82. Montag M, van der Ven H. Eclosão assistida por laser na
reprodução assistida . Croat Med J. 1999;40:398-403.
83. Hershlag A, Paine T, Cooper GW, Scholl GM, Rawlinson K,
Kvapil G. Gémeos monozigóticos associados à incubação
assistida mecânica. Fertil Steril. 1999;71:144-6.
84. Schieve LA, Meikle SF, Peterson HB, Jeng G, Burnett NM,
Wilcox LS. Does assisted hatching pose a risk for monozygotic
twinning in pregnancies conceived through in vitro fertilization?
Fertil Steril. 2000;74:288-94.
85. Alikani M, Noyes N, Cohen J, Rosenwaks Z. A gemelaridade
monozigótica no ser humano está associada à arquitetura da zona
pelúcida . Hum Reprod. 1994;9:1318-21.
86. Dale B, Gualtieri R, Talevi R, Tosti E, Santella L, Elder K.
Intercellular communication in the early human embryo. Mol
Reprod Dev. 1991;29:22-8.
87. Tzong S, Su-Ru C, Heng-Kien A, Yi-Yi C, Ko-Yi W, Chii-Ruey
T. Herniated blastomere following chemically assisted hatching
may result in monozygotic twins. Fertil Sterilt. 2001;75:442-4.