Introdução à Reprodução Humana Assistida

Profª. Ana Clara Coelho Esteves

Descrição

A história da Reprodução Humana Assistida (RHA) e as noções de Gametogênese, anatomia e fisiologia dos
sistemas reprodutores feminino e masculino, assim como os principais conceitos e as técnicas realizadas
na Reprodução Assistida.

Propósito

Compreender o histórico da Reprodução Assistida e seus principais conceitos, relembrando a anatomia e

fisiologia dos sistemas reprodutores feminino e masculino e os principais eventos da reprodução humana,
como base para a expansão do conhecimento no universo da RHA.

Objetivos
Módulo 1

Histórico e técnicas de Reprodução Assistida

Reconhecer a história e os principais conceitos de Reprodução Assistida.

Módulo 2

A fisiologia da reprodução humana

Descrever o sistema reprodutor feminino e masculino e a fisiologia da reprodução.
 Introdução
A dificuldade em se ter um filho é uma condição que afeta não só casais que não conseguem
engravidar naturalmente, mas também pacientes que têm sua fertilidade ameaçada - quando não
destruída - por tratamentos médicos (radio e quimioterapia), mulheres que não possuem parceiro e
desejam ser mães independentes, e casais homoafetivos.

As técnicas de Reprodução Assistida surgiram com o objetivo de contornar o impeditivo em questão

e ajudar essas pessoas, dando a elas uma possibilidade adicional de completar ou aumentar suas
famílias.

Cada vez mais individualizados, os tratamentos de Reprodução Assistida objetivam ampliar a gama
de pacientes a serem atendidos, com a esperança de que as tecnologias auxiliares que surgem e se
aperfeiçoam continuamente possam prover as ferramentas necessárias para problemas ainda sem
solução, mas que em um futuro próximo poderão ser resolvidos, trazendo alegria a um número ainda
maior de pessoas.

Para entender o papel das técnicas de Reprodução Assistida, é necessário entender também o que
acontece na forma natural e fisiológica da reprodução, para saber os problemas que podem surgir e
como contorná-los. Assim, vamos seguir a evolução dos conhecimentos iniciando como se segue a
evolução de um embrião. Prontos? Vamos lá!

AVISO: orientações sobre unidades de medida.

Orientações sobre unidades de medida

Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de tecnologia e
didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número e a unidade (ex.: 25
km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem seguir o padrão internacional de
separação dos números e das unidades.
 1 - Histórico e técnicas de Reprodução
Assistida
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer a história e os
principais conceitos de Reprodução Assistida.

Introdução à Reprodução Assistida

A Reprodução Assistida consiste no conjunto de técnicas de manipulação laboratorial de gametas em

alguma fase do processo, com o objetivo de auxiliar na gestação, quando essa não pode ser alcançada de
forma natural, ou seja, quando o casal ou paciente apresenta algum fator de infertilidade.

Gametas
São as células germinativas femininas e masculinas - oócitos e espermatozoides, respectivamente - resultantes
do processo de divisão meiótica que, juntas, dão origem ao embrião.
 Mas o que é infertilidade?

A infertilidade é a impossibilidade de alcançar uma gestação após 12 meses de relações sexuais regulares
e sem uso de contraceptivo. Esse período pode variar de acordo, principalmente, com a idade da mulher, que
é o fator mais sensível ao tempo quando falamos em Reprodução Assistida. A infertilidade pode ser:

Primária
Quando não se alcança nenhuma gravidez

Secundária
Quando não se consegue alcançar uma gravidez após uma primeira concepção bem-sucedida.

Concepção
Pode ser entendida como sinônimo de gravidez, ou seja, a geração de um bebê.

Desse modo, as técnicas de Reprodução Humana Assistida (RHA) podem ajudar casais com algum fator de
infertilidade, mulheres que desejam engravidar de forma independente (sem parceiro) e casais
homoafetivos, bem como oferecem a possibilidade de preservação de fertilidade para pacientes
oncológicos, por exemplo.

Técnicas de Reprodução Assistida

As técnicas empregadas na Reprodução Assistida podem ser de baixa ou alta complexidade, e permitem
contornar os fatores (sociais, anatômicos, endócrinos, indicações médicas, entre outros) que, de algum
modo, interferem no sucesso da gestação – seja ela de planejamento imediato seja apenas de um desejo
futuro.

As técnicas de baixa complexidade não requerem manipulação de oócitos e pré-embriões em um

laboratório e são, em geral, mais acessíveis, como veremos a seguir:

Calendário indicando o período fértil.

Coito programado

O crescimento dos folículos ovarianos da paciente é acompanhado por ultrassonografia e a relação

sexual é programada para o período ovulatório.

Esquema ilustrativo de uma inseminação artificial, com catéter posicionado no interior do útero.

Inseminação intrauterina

O sêmen passa por capacitação laboratorial e a amostra resultante é inseminada no útero da mulher.

Já as técnicas de alta complexidade requerem que os oócitos sejam manipulados e fertilizados em

laboratório, para que possa haver a transferência de um pré-embrião de volta ao útero posteriormente. Elas
se resumem em fertilização in vitro (FIV), que pode ser convencional ou por injeção intracitoplasmática de
espermatozoide (ICSI), brevemente descritas a seguir:
 FIV convencional

Simula o que ocorreria naturalmente na trompa uterina e consiste em colocar oócitos em uma gota de
meio de cultivo com espermatozoides, que, por sua vez, vão fecundar os oócitos sem maiores
interferências.
close

FIV com ICSI

É mais invasiva, uma vez que os espermatozoides são selecionados pelo embriologista sob
visualização microscópica, para depois serem injetados nos oócitos (um espermatozoide por oócito)
por meio da utilização de microagulhas.

Atenção
A fertilização in vitro é considerada um procedimento de alta complexidade por exigir equipamentos mais
especializados, além de manipulação dos oócitos em laboratório, para sua realização.

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Inseminação intrauterina X FIV
convencional X FIV com ICSI
Neste vídeo, a biomédica Beatriz Campos, faz uma comparação entre a inseminação intrauterina, FIV
convencional e FIV com ICSI, abordando a indicação e as diferenças metodológicas. Ah! fique tranquilo,
alguns termos empregados no vídeo vocês irão conhecer quando começarem a explorar mais o mundo da
reprodução humana assistida!

História da Reprodução Assistida

É verdade que, quando pensamos em Reprodução Assistida, pensamos em fertilização in vitro, no famoso
“bebê de proveta”, exatamente por este ter sido um procedimento de maior complexidade que trilhou um
longo caminho até permitir que diversos fatores de infertilidade fossem driblados com a geração de um
bebê em laboratório. Assim, é principalmente em torno dele que gira a nossa história, mas vamos caminhar
pelos passos dados até o sucesso da técnica ser alcançado.

Curiosidade
Os primórdios do saber científico dentro da Reprodução Assistida registram a primeira inseminação artificial
canina em 1779, feita por um italiano, e a primeira intrauterina em humanos, no final do século XVIII,
realizada por um médico inglês.

A inseminação perdeu espaço com o advento da fertilização in vitro, mas hoje vem conquistando novamente
seu lugar no tratamento de casais inférteis. Desde quando a pesquisa animal ainda estava ajudando a
 fundamentar a prática, os oócitos e pré-embriões eram recuperados por meio de lavagem das trompas e
cavidade uterinas - procedimento realizado em alguns animais até o dias atuais.

Esquema 3D ilustrando o procedimento de aspiração folicular.

Entretanto, cientistas começaram a perceber, entre a década de 1960 e início da 1970, que essa técnica
impedia a recuperação dos oócitos nas pacientes com trompas uterinas danificadas ou bloqueadas,
fazendo-se necessária uma forma de acesso direto para captação dos oócitos. Assim, a laparoscopia se
mostrou eficiente e se tornou a técnica de escolha para coleta de oócitos maduros na época. Hoje, os
oócitos são coletados por aspiração folicular com acesso transvaginal e punção ovariana.

Laparoscopia
É uma técnica de cirurgia minimamente invasiva. Normalmente, consiste em um ou dois pequenos cortes para
inserção de uma microcâmera que permite a visualização do interior da cavidade peritoneal e, desse modo, guia
os procedimentos cirúrgicos realizados naquele local.

Como não existiam cursos de aperfeiçoamento específicos para laboratório, as técnicas eram adquiridas
por aprendizagem na prática. Os procedimentos laboratoriais eram realizados por profissionais com
experiência em embriologia experimental e biologia veterinária. Os laboratórios de fertilização in vitro, que
hoje possuem padrões de filtragem de ar, temperatura e umidade ideais exigidos pelos órgãos reguladores
para seu funcionamento, no início, eram frequentemente improvisados em salas de cirurgia pré-existentes,
nas quais não era incomum se deparar com profissionais fumando e se alimentando entre os
procedimentos.

A Reprodução Assistida teve contribuição de muitas áreas de atuação. Os equipamentos hoje utilizados nos
laboratórios foram baseados e adaptados de antecedentes que outrora desempenhavam outras funções.

Exemplo
O primeiro microscópio invertido foi desenvolvido em 1850 e o primeiro micromanipulador para
microcirurgias em células foi inventado em 1912, ambos nos Estados Unidos da América. As primeiras
incubadoras datam do Egito Antigo, quando eram usadas para chocar ovos; no século XIX, foram
substituídas por redomas aquecidas de vidro que, na década de 1960, foram substituídas por incubadoras
de dióxido de carbono e, nos anos 1970, por incubadoras de jaqueta aquecida.
O primeiro laboratório especialmente dedicado e elaborado para a realização de fertilização in vitro foi
construído em Cambridgeshire, no Reino Unido, em 1980, pelos pioneiros Robert Edwards e Patrick Steptoe,
diretor científico e médico, respectivamente, e Jean Purdy, enfermeira que frequentemente tem seu papel
omitido, mas com função primordial no trabalho junto a Edwards e Steptoe, atuando principalmente no
controle de qualidade do laboratório.

O planejamento desse local veio depois de centenas de tentativas de fertilização que resultaram em dois
nascimentos de bebês vivos. Ao mesmo tempo, várias outras clínicas eram construídas em outros locais do
mundo, como Austrália, Estados Unidos, Índia, Áustria, França, Holanda, Suécia e Espanha. Em 1985, esse
novo campo de atuação emergente estava sendo referido como Tecnologia da Reprodução Assistida.

Patrick Steptoe.
O nascimento de Louise Brown foi noticiado em diversos jornais, como mostra a imagem.

Ainda em um laboratório um tanto quanto improvisado, Patrick Steptoe e Robert Edwards conseguiram
sucesso na técnica de FIV e relataram o nascimento do primeiro “bebê de proveta”. Louise Brown nasceu
saudável, de parto cesárea, em 25 de julho de 1978 – e é por isso que comemoramos o dia do embriologista
nessa data!

Naquela época, a possibilidade de sucesso de um tratamento de Reprodução Assistida não passava de 5%,
enquanto hoje podemos ver taxas de implantação girando em torno de 50%. Isso certamente se deve ao
aprimoramento do ambiente em que todo o tratamento se passa.

Desde o nascimento desses primeiros bebês, equipamentos e técnicas utilizados no laboratório de FIV
sofreram drásticas evoluções. As incubadoras, que antes eram basicamente redomas de vidro, hoje são
detalhadamente adaptadas ao cultivo embrionário, podendo inclusive possuir câmeras em seu interior para
monitorar o desenvolvimento dos pré-embriões (incubadoras time-lapse). Os meios de cultivo passaram de
composições simples com soluções salinas e plasma sanguíneo a complexos meios otimizados, de modo a
oferecerem exatamente os nutrientes que o pré-embrião precisa; os profissionais estão cada vez mais
especializados; as técnicas de biópsia e análise genética embrionária são cada vez mais precisas e
abrangentes, e assim por diante.
Incubadora usada para gerar o primeiro bebê de proveta (modelo “redoma de vidro”).

O primeiro bebê de proveta no Brasil expand_more

No Brasil, celebramos em 07 de outubro de 1984 – apenas seis anos após o primeiro bebê de
proveta do mundo – o nascimento de Anna Paula Caldeira, primeiro bebê brasileiro resultante de FIV
(e estima-se que tenha sido o 700º de todo o mundo), pelas mãos do pioneiro Milton Nakamura.

Nilson Donadio, também pioneiro na área, reivindica que, meses antes do nascimento de Anna Paula,
ele próprio teria obtido o nascimento de um bebê por meio de fertilização in vitro, mas foi mantido
em sigilo por questões éticas. Assim, a prioridade histórica fica com Nakamura, por ter sido o
responsável pela divulgação midiática do evento.
Foto de uma ICSI prestes a acontecer. A agulha maior segura o oócito e a menor injeta um único espermatozoide em seu citoplasma.

Com o passar do tempo, foi sendo notado um obstáculo para o sucesso da FIV convencional: o fator de
infertilidade de origem masculina. Assim, em 1992, foi desenvolvida pelo italiano Gianpiero Palermo a ICSI,
grande avanço posterior ao advento da fertilização in vitro. A técnica consiste na injeção de um único
espermatozoide no citoplasma de cada oócito, possibilitando a paternidade biológica mesmo quando a
quantidade de espermatozoides disponíveis é pequena ou quando não estão disponíveis no ejaculado – ou
seja, nos casos em que são recuperados cirurgicamente do testículo ou epidídimo.

A procura por tratamentos de reprodução assistida vem crescendo não só no Brasil, mas também em todo o
mundo. Na América Latina, o Brasil lidera o ranking dos países que mais realizaram técnicas de Reprodução
Assistida, com 83 mil bebês brasileiros nascidos a partir dessas técnicas em 25 anos. Apesar de a maioria
das clínicas ser particular, tratamentos gratuitos são oferecidos em algumas seletas instituições, como o
Hospital Pérola Byington, em São Paulo.

Saiba mais
Nesses locais onde os tratamentos são livres de custo, costumam ser realizadas as técnicas de baixa
complexidade, ou FIV com estimulação mais branda, que resulta na formação de uma quantidade menor de
oócitos e, consequentemente, pré-embriões.
Conceitos importantes na Reprodução
Assistida
Para entrarmos no universo da Reprodução Humana Assistida mais detalhadamente, faz-se necessário
recordar alguns conceitos relevantes.

Você certamente já ouviu falar nos tipos de divisão celular importantes para a geração de células
germinativas, formação de um novo indivíduo, crescimento, renovação e diferenciação celular.
Provavelmente também lembra que uma dessas divisões é reducional – reduz o número de cromossomos
na célula – e a outra não. Vamos relembrar a diferença entre elas e seus resultados?

Processo de mitose.
 Mitose

É o processo de multiplicação celular em que uma célula-mãe duplica seu conteúdo e depois divide-se,
dando origem a duas células-filhas com o mesmo conteúdo celular original. É por meio desse processo
que o zigoto se divide em duas células, que continuam se multiplicando até formar o pré-embrião, o
embrião, o feto, o bebê e o indivíduo adulto.

O ser humano realiza mitose desde seu primeiro estágio celular diploide até o momento de sua morte.

Processo de meiose.

Meiose
 É o processo de divisão celular que resulta em células com a metade do número de cromossomos da
célula original (célula-mãe), como é o caso da formação das células germinativas ou gametas (oócitos e
espermatozoides) dos organismos de reprodução sexuada.

Assim, as células-mãe são diploides, enquanto as células originadas do processo meiótico são haploides.

Vale lembrar que haploidia é a característica de células que possuem apenas um conjunto de
cromossomos, como os gametas humanos (oócitos e espermatozoides). A designação mais comum para
os organismos haploides é “n”. A fusão de dois núcleos celulares com conteúdo haploide (n) resulta em
uma célula com núcleo diploide (2n), ou seja, contendo dois conjuntos de cromossomos – como acontece
na união do espermatozoide (n) com o oócito (n), formando o zigoto (2n), que dará origem ao pré-embrião,
por meio da mitose.

Diploidia é a característica de células que possuem seus cromossomos organizados em pares homólogos,
chamados de cromossomos homólogos, ou seja, são os cromossomos herdados do pai e da mãe que
compõem um mesmo par e possuem informações genéticas correspondentes, bem como estrutura e
tamanho semelhantes. Seres humanos são organismos diploides.

Cromossomos
São estruturas compostas de cadeias de DNA (ácido desoxirribonucleico) que carregam a informação genética
do indivíduo. Podem ser somáticos (autossomos) ou sexuais.

Saiba mais
Células diploides, caso se unissem, formariam um indivíduo tetraploide (com 4 conjuntos de cromossomos).
Por essa razão, é necessária a formação de células haploides (gametas) para a fertilização. O resultado
dessa união é o ser humano apresentando dois conjuntos de 23 cromossomos (23 pares) em suas células
(exceto células germinativas), sendo 22 pares de cromossomos somáticos (ou autossomos) e 1 par de
cromossomos sexuais.

Mas qual a diferença entre cromossomos somáticos e cromossomos sexuais?

Chamamos de cromossomos somáticos aqueles que não são ligados às características sexuais dos
indivíduos. O ser humano possui 44 (22 pares) autossomos.

Já os cromossomos sexuais são aqueles que determinam as características ligadas ao sexo do indivíduo.
Nos seres humanos, mulheres carregam duas cópias do cromossomo X, razão pela qual o cariótipo
feminino normal é descrito como 46,XX, significando 46 cromossomos no total, sendo os sexuais XX. Já os
homens com cariótipo normal são descritos como 46,XY, ou seja, além dos autossomos, carregam uma
cópia do cromossomo X e uma do cromossomo Y, podendo passar qualquer uma das duas à sua prole. Por
essa razão, é dito que o homem é quem determina o sexo da criança, uma vez que a contribuição materna
só pode ser um cromossomo X. Desse modo, se a criança herdar um cromossomo Y do pai, terá o cariótipo
masculino; se herdar o cromossomo X, esse se juntará ao cromossomo X herdado da mãe e resultará em
um cariótipo feminino.

Ilustração do cariótipo humano normal, evidenciando a diferença entre os cromossomos sexuais.

Como nós sabemos, os gametas são as células germinativas resultantes do processo de divisão meiótica
(haploides) que, juntas, dão origem ao pré-embrião (diploides).

Esquema ilustrativo das células germinativas e do produto de sua união, com respectivos materiais genéticos.

E o que definimos como um embrião?

Existe uma divergência de opiniões quanto à adequabilidade do termo “embrião”, de forma que alguns
profissionais preferem utilizar o termo “pré-embrião” para designar o produto da união dos gametas durante
os primeiros 14-16 dias de desenvolvimento, e “embrião" para o período que se segue, até a oitava semana
de gestação, quando o produto da concepção passa, então, a ser chamado de “feto”. Sendo assim, no que
se refere à Reprodução Humana Assistida, estaríamos trabalhando com pré-embriões em laboratório. No
entanto, para fins didáticos, podem ser encontrados ambos os termos “pré-embrião” e “embrião”. Mas
daremos aqui preferência ao termo “pré-embrião”.

Saiba mais
O período máximo de cultivo laboratorial é de 14 dias (como estabelecido pela última Resolução nº
2.294/2021 do Conselho Federal de Medicina), ainda que na prática terapêutica não seja visto o cultivo
posterior ao sétimo dia de desenvolvimento embrionário.

Para a formação do pré-embrião, é necessária a fecundação, que acontece quando o espermatozoide

consegue penetrar o oócito. Mas antes de falar da fecundação propriamente dita, vamos relembrar o que
são os espermatozoides e os oócitos.

Espermatozoides

Apresenta três partes em sua estrutura: cabeça, peça intermediária e cauda. A cabeça de um
espermatozoide morfologicamente normal apresenta aspecto oval e achatado, e abriga o núcleo celular
contendo as informações genéticas do pai biológico (conjunto de cromossomos n); também ali está
presente uma estrutura conhecida como acrossomo, responsável por abrigar as enzimas necessárias para
que o espermatozoide consiga fecundar o oócito. Na peça, estão localizadas as mitocôndrias, que geram a
energia necessária ao movimento dos espermatozoides. A cauda, também chamada de flagelo, é
responsável pela movimentação espermática.
Estrutura do espermatozoide.

Oócitos

Carrega o conjunto de cromossomos (n) contendo as características genéticas da mãe biológica. Seu
citoplasma (também chamado ooplasma) é cercado por uma camada glicoproteica, chamada zona
pelúcida, com um pequeno espaço entre eles, chamado espaço perivitelínico, onde se situa o primeiro
corpúsculo polar (cujas composição e origem estudaremos mais à frente), indicativo de que o oócito está
maduro e pronto para ser fertilizado. Logo após a zona pelúcida, o oócito é envolto por uma camada de
células que compõem a corona radiata e que desempenham importante papel na fecundação. Após
fertilização do oócito e exclusão do segundo corpúsculo polar, o gameta passa a ser chamado de óvulo.

Estrutura do oócito.

O processo de fecundação segue as seguintes etapas:

I
A fecundação se inicia nas
células da corona radiata, que
por meio da quimiotaxia
(liberação de sinais químicos
de atração) atraem os
espermatozoides na direção
do oócito.

II
Seguindo sua passagem pela
corona radiata, os
espermatozoides chegam à
zona pelúcida, cujas
glicoproteínas possuem a
função, entre outras, de
ligação com os receptores
presentes na membrana dos
espermatozoides.

III
Após atravessarem a zona
pelúcida, a membrana
plasmática do
espermatozoide se funde com
a do oócito, e o material
genético do espermatozoide é
liberado no ooplasma.

Todas as etapas descritas acima são também uma forma de seleção espermática.
 Fecundação.

Chamamos de fertilização se a fecundação tiver sucesso e houver formação dos pró-núcleos feminino e
masculino e posterior início das divisões celulares (clivagem celular).

Mas o que é o pró-núcleo?

Como o próprio nome diz, são núcleos anteriores ao núcleo verdadeiro da célula diploide eucarionte. São
estruturas vesiculares que podem ser observadas no citoplasma do zigoto e contêm o material genético do
oócito e do espermatozoide, separadamente, antes que esses sofram singamia e se tornem um único
núcleo com dois conjuntos de cromossomos.

Zigoto
Estágio de célula diploide, resultante da união do oócito com o espermatozoide, prévio à primeira divisão
celular.

ingamia
Processo de união dos dois pró-núcleos para que formem um único núcleo diploide.

Quando a fertilização correta do oócito é verificada sob aumento microscópico, percebe-se a presença de
dois pró-núcleos: um feminino e um masculino. O pró-núcleo masculino se forma perto do local onde o
espermatozoide entra, enquanto o pró-núcleo feminino se forma no pólo citoplasmático do fuso meiótico.
Zigoto humano, corretamente fertilizado, com dois pró-núcleos no centro do ooplasma.

Saiba mais
O processo da fecundação ocorre sempre que o espermatozoide encontra o oócito “por si só”, ou seja,
dentro da Reprodução Assistida, aconteceria nos casos de coito programado, inseminação intrauterina e FIV
convencional. Na ICSI, as barreiras dos oócitos não são vencidas pelo próprio espermatozoide, uma vez que
existe seleção artificial do espermatozoide (pelo embriologista) e que este é injetado por inteiro no
citoplasma do oócito com auxílio de microagulhas.

O processo de desenvolvimento embrionário segue a partir das etapas abaixo:

2º e 3º dias - Clivagem
Sabemos que a fecundação ocorre naturalmente nas trompas uterinas, e ainda ali se inicia a
clivagem celular do pré-embrião, ou seja, ocorrem inúmeras divisões mitóticas durante o
caminho percorrido na trompa uterina. A clivagem subdivide o zigoto primeiramente em duas
células; então, em quatro; depois em oito e assim por diante.
 4° dia - Mórula
Após quatro dias da fecundação, o pré-embrião entra na fase de mórula, que representa o
estágio de desenvolvimento embrionário em que observamos uma massa compacta de
células, sem limites de membranas distinguíveis e, portanto, o número dessas células pode
ser estimado entre 16 e 32, mas não pode ser claramente identificado.

5° dia - Blastocisto
Por volta do quinto dia de desenvolvimento, o pré-embrião alcança a cavidade uterina no
estágio de blastocisto, apresentando dois grupos de células diferenciadas: células da massa
celular interna (MCI), que darão origem ao feto, e células do trofectoderma, que darão início à
placenta. Além desses dois grupos celulares, está presente a blastocele, que consiste em
uma cavidade observada no pré-embrião em estágio de blastocisto, preenchida por líquido.

6° ao 9° dia - Implantação
Até então, o pré-embrião ainda possui a zona pelúcida, mas quando atinge esse estágio inicia
o hatching (eclosão), ou seja, as células do trofectoderma rompem a zona pelúcida e
começam a “invadir” o endométrio, para formação da placenta. Assim, uma vez na cavidade
uterina, ocorre a implantação, também chamada de nidação, ou seja, momento em que o pré-
embrião inicia sua adesão ao endométrio.

Trofectoderma
Camada única de células que delimita o blastocisto. São as células que, após a implantação do embrião no
endométrio, darão origem à placenta.
Esquema representativo do desenvolvimento embrionário, da ovulação até a implantação.

Devemos, ainda, relembrar alguns conceitos genéticos, que serão extremamente essenciais durante o
estudo da Reprodução Assistida, visto que algumas das técnicas disponíveis incluem análise genética do
pré-embrião. Vale, portanto, recordarmos os conceitos de euploidia e algumas outras definições, como
veremos a seguir:
Euploidia

Caracteriza o conjunto cromossômico numericamente correto, ou seja, com 22 pares de autossomos e 1

par de cromossomos sexuais, totalizando 46 cromossomos.
Aneuploidia

É caracterizada pela alteração do número de cromossomos de um indivíduo, com aumento ou diminuição

da quantidade de cópias de um tipo de cromossomo. As mais comuns são monossomias (condição em
que está presente apenas uma cópia de um determinado cromossomo, e não duas cópias, como seria o
normal no conjunto euploide) e trissomias (condição em que estão presentes três cópias de um
determinado cromossomo, e não duas). Destaca-se também a nulissomia, condição em que ambas as
cópias de um determinado cromossomo estão ausentes.
 Mosaicismo

Condição em que um pré-embrião não apresenta alterações cromossômicas em todas as suas células.
Em um mesmo pré-embrião, podemos encontrar diferentes linhagens celulares, ou seja, podemos
encontrar células euploides e aneuploides (e diferentes tipos de aneuploidia), constituindo o pré-embrião.

Saiba mais
As doenças monogênicas são aquelas que afetam apenas um gene e também são conhecidas como
doenças mendelianas. Tão importante quanto esse conceito é o da translocação, definida como a alteração
cromossômica na qual ocorre rearranjo cromossômico parcial – uma porção de um determinado
cromossomo é substituída por uma porção de um cromossomo não homólogo, e vice-versa.
Todos esses conceitos serão revisados e contextualizados ao longo do conteúdo que veremos a seguir,
permitindo assim a percepção de cada um deles de maneira mais detalhada.
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

Vimos que a Reprodução Assistida consiste no conjunto de técnicas de manipulação laboratorial de

gametas em alguma fase do processo, com o objetivo de auxiliar na gestação, quando essa não pode
ser alcançada de forma natural. Em quais casos podem ser aplicadas as técnicas de Reprodução
Assistida?

I. Para casais com fator de infertilidade de origem masculina ou feminina.

II. Para casais homoafetivos.

III. Para mulheres que desejam ter filhos sozinhas, sem parceiro.

IV. Para pacientes oncológicos que desejam preservar sua fertilidade antes do tratamento de rádio e/ou
quimioterapia.

É correto o que se afirma em:

A I, II e III

B I, III e IV

C I, II e IV

D II, III e IV
 E I, II, III e IV

Parabéns! A alternativa E está correta.

As técnicas de Reprodução Assistida não se limitam a casais heterossexuais que desejam ter filhos e
não conseguem por conta própria, podendo também ser aplicadas em outros contextos, como, por
exemplo, casais homoafetivos, mulheres que desejam ter filhos sozinhas e pacientes oncológicos que
desejam preservar sua fertilidade antes do tratamento.

Questão 2

Vimos que as técnicas de Reprodução Assistida são divididas em alta e baixa complexidade. Assim, o
que diferencia os tratamentos de baixa e alta complexidade em Reprodução Assistida?

A O tempo de duração do procedimento.

B Os medicamentos utilizados no preparo da paciente.

C A necessidade de manipulação de oócitos e pré-embriões em laboratório.

D O risco do tratamento oferecido.

E Apenas o custo dos procedimentos.

Parabéns! A alternativa C está correta.

 As técnicas de alta complexidade são aquelas que exigem manipulação de oócitos e pré-embriões em
laboratório, enquanto as de baixa complexidade não exigem manipulação de gametas, ou exigem
manipulação apenas do sêmen.

2 - A fisiologia da reprodução humana

Ao final deste módulo, você será capaz de descrever o sistema reprodutor
feminino e masculino e fisiologia da reprodução.

Sistema reprodutor masculino

O sistema reprodutor masculino contempla os testículos, um sistema de dutos (que inclui epidídimo, ducto
deferente, ducto ejaculatório e uretra) e as glândulas acessórias (vesículas seminais, próstata e glândulas
bulbouretrais – essas últimas também conhecidas como glândulas de Cowper), além de estruturas de
apoio, como pênis e escroto, conforme observamos imagem abaixo.
Sistema reprodutor masculino.

A principal função dessas estruturas é produzir e armazenar espermatozoides, permitir a maturação

espermática e contribuir com secreções para formação do sêmen, além de possibilitar o transporte do
sêmen, desde sua formação até sua ejaculação. A seguir, detalhamos as características de algumas dessas
estruturas e suas funções:

Testículos

Os testículos são as gônadas masculinas responsáveis pela produção de espermatozoides e do hormônio

testosterona. Possuem cerca de 5cm de comprimento e 2,5cm de diâmetro, e estão localizados no escroto,
que pode ser definido basicamente como uma bolsa de pele, também chamado de bolsa escrotal.

Os testículos possuem, em seu interior, cerca de 900 túbulos seminíferos contorcidos, onde ocorre a
produção dos espermatozoides.

Epidídimo e ductos deferentes

Uma vez produzido nos túbulos seminíferos, o esperma é lançado ao epidídimo, que é um órgão em forma
de vírgula, de aproximadamente 4 centímetros de comprimento, que se localiza posteriormente ao testículo.
O epidídimo consiste em ductos enrolados (que, se fossem desenrolados, mediriam aproximadamente 6
metros de comprimento) e corresponde ao local de maturação dos espermatozoides, ou seja, é no
epidídimo que os espermatozoides adquirem motilidade e a capacidade de fertilizar um oócito.

Em certo ponto, os ductos do epidídimo tornam-se menos enrolados e com diâmetro maior. A partir de
então, passam a ser chamados de ductos deferentes. Esses ductos possuem cerca de 45cm de
comprimento e contornam o epidídimo em direção à uretra. Têm a função de transportar os
espermatozoides do epidídimo até a uretra, bem como armazená-los. Os ductos deferentes se alargam na
ampola do canal deferente, logo antes de entrar no corpo da glândula prostática.

Vesículas seminais e próstata

As vesículas seminais, que se localizam uma de cada lado da próstata, secretam seu conteúdo na
terminação prostática da ampola. A próstata, por sua vez, secreta seu conteúdo nos ductos prostáticos.
Ambos os conteúdos da ampola e dos ductos prostáticos são conduzidos aos ductos ejaculatórios, que
desembocam na uretra, último local de passagem do sêmen antes de ser ejaculado.

Uretra

Sabe-se que a uretra é o local de passagem da urina, mas é por ela também que o sêmen passa ao ser
ejaculado. Parte da uretra passa pela próstata, mas sua maior parte está localizada ao longo do corpo
esponjoso do pênis. A uretra contém muco proveniente majoritariamente das glândulas bulbouretrais
(glândulas de Cowper), que se localizam próximas à origem da uretra.

Vale lembrar que o sêmen é o conjunto dos espermatozoides, do líquido do canal deferente
(aproximadamente 10% do total do sêmen) com as secreções da próstata (cerca de 30%) e vesículas
seminais (em torno de 60%), e do muco produzido pelas glândulas bulbouretrais.

Fisiologia do sistema reprodutor masculino

Nos homens, assim como nas mulheres, ocorre a liberação do hormônio liberador de gonadotropina (GnRH)
pelo hipotálamo. O GnRH, por sua vez, atua na hipófise, que libera hormônio luteinizante (LH), cuja principal
função é estimular a secreção de testosterona pelos testículos, e hormônio folículo estimulante (FSH), cuja
atuação primária é na estimulação da espermatogênese (produção de espermatozoide).

A liberação de GnRH pelo hipotálamo é feito de forma pulsátil e cíclica, padrão de liberação também seguido
pela hipófise na liberação de LH. Já o FSH aumenta e diminui de maneira discreta a cada mudança na
secreção de GnRH, tendo uma resposta mais perceptível às alterações a longo prazo do GnRH. Ambos os
hormônios LH e FSH atuam em células-alvo localizadas nos testículos.

Como mencionado, o LH estimula a produção de testosterona que, ao longo da vida do homem,

desempenha importantes papéis.

No feto, a testosterona é, inicialmente, secretada pelas cristas genitais e, posteriormente, pelas células de
Leydig presentes nos testículos fetais, desempenhando importantes papéis ainda na vida fetal, quando
induz a formação do pênis, do saco escrotal, da próstata, das vesículas seminais e dos dutos genitais
masculinos, enquanto suprime a formação dos órgãos reprodutores femininos.

Nos adultos, a testosterona continua sendo produzida pelas células de Leydig presentes no tecido testicular,
quando essas são estimuladas pelo LH. Essas células estão presentes no recém-nascido, desaparecendo
após algumas semanas e ressurgindo na puberdade, com o aumento de LH.

A secreção de testosterona pelos testículos inibe a secreção de GnRH pelo hipotálamo por feedback
negativo, o que consequentemente diminui a produção de FSH e LH. Com a diminuição nos níveis de LH, cai
também a produção de testosterona.

O ciclo também funciona de modo reverso: quando os níveis de testosterona estão baixos, o hipotálamo
aumenta a produção GnRH atuante na hipófise, que por consequência aumenta a secreção de LH e FSH.
Com o aumento dos níveis de LH, as células de Leydig são mais estimuladas a produzir testosterona.

Já o FSH atua nas células de Sertoli localizadas nos túbulos seminíferos, induzindo o seu crescimento e a
produção de secreções necessárias para a espermatogênese. A testosterona também tem seu papel na
espermatogênese. Veremos esse fenômeno mais à frente, quando estudarmos a “Gametogênese”.
Ocorre, ainda, o feedback de FSH: quando a espermatogênese acontece de forma intensa, isso inibe a
produção de FSH pela hipófise. Por outro lado, quando a produção de espermatozoides pelos tubos
seminíferos diminui, ocorre um aumento na produção de FSH.

No esquema abaixo, vemos ilustrada a regulação hormonal do sistema reprodutor masculino.

Sistema reprodutor feminino

O sistema reprodutor feminino é composto externamente pela vulva, que compreende o monte púbico, os
grandes lábios, os pequenos lábios, o vestíbulo da vagina, o clitóris, o bulbo do vestíbulo e as glândulas
vestibulares maiores, e internamente pelos ovários, trompas uterinas, útero e vagina. Os órgãos genitais
externos femininos são separados dos órgãos internos pelo hímen – membrana que cobre o óstio vaginal e
que normalmente é rompido durante a primeira relação sexual com penetração.

O sistema reprodutor feminino desempenha duas funções principais:

O preparo do corpo para a gestação, que inclui o ciclo menstrual, no qual ocorrem oogênese
(processo de formação dos gametas femininos) e desenvolvimento dos folículos no ovário,
ovulação, espessamento do endométrio e menstruação – ou gravidez.
 O período da gestação em si (caso ocorra fertilização do óvulo), quando o sistema reprodutor
desempenha a função de transporte do óvulo fertilizado até o útero, implantação do pré-
embrião no endométrio, nutrição primária do embrião, formação da placenta, gravidez e parto.

Sistema reprodutor feminino.

As estruturas internas que compõem o sistema reprodutor feminino são essenciais para que uma mulher
possa ter uma gestação. Os ovários são as gônadas ou glândulas sexuais femininas, que produzem os
oócitos. Estes, por sua vez, são carregados pelas trompas até o útero, que se conecta com a vagina pelo
canal cervical. Como essas estruturas são as que estão mais diretamente envolvidas na reprodução, vamos
revisá-las com mais detalhes:

Ovário
Ilustração com detalhe do ovário.

Os ovários possuem forma de amêndoa e medidas variáveis de acordo com a fase reprodutiva na qual a
mulher se encontra. São os órgãos reprodutivos que dão origem, nutrem e preparam os oócitos para que
eles possam ser ovulados.

Trompas uterinas
Também conhecidas como tubas ou trompas de Falópio, possuem cerca de 10 a 12cm e têm a função de
carregar os oócitos dos ovários até o útero. São divididas em:

1. Porção intramural: atravessa a parede uterina.

2. Istmo: parte estreita das trompas, entre a porção intramural e a ampola.
3. Ampola: segmento mais longo e mais largo das trompas, é o local no qual normalmente ocorre a
fertilização do oócito.
4. Infundíbulo: extremidade afunilada com projeções irregulares chamadas fímbrias, que se projetam sobre
o ovário.

Representação do sistema reprodutor feminino com indicação das diferentes partes das tubas uterinas.
Útero
O útero é um órgão em formato de pêra invertida, oco, com paredes musculares grossas e contráteis. Pode
ser dividido em 4 partes:

1. Fundo: parte arredondada acima do nível de entrada das trompas.

2. Corpo: parte principal do útero, que se inicia abaixo do nível de entrada das trompas e se estende até o
colo – as partes laterais mais altas do corpo uterino, onde se inserem as trompas, são denominadas
cornos uterinos.
3. Istmo: constrição de aproximadamente 1 centímetro que marca a separação entre o corpo e o colo do
útero.
4. Colo do útero: também conhecido como cérvix ou cérvice, é cilíndrico e se estende até a abertura no
interior da vagina, com a qual forma um ângulo geralmente acentuado.

Se alguma malformação estiver presente, pode dificultar a gravidez ou até mesmo, ser um fator de
infertilidade, por comprometer a implantação e desenvolvimento do embrião. As malformações uterinas
podem resultar em útero didelfo, útero bicorne septado, útero bicorne com um único colo, útero septado,
útero arqueado e útero unicorne.

Malformações uterinas.

A parede do útero é revestida externamente pelo peritônio, abaixo do qual se encontra o miométrio, uma
espessa camada de músculo liso. Em seu interior, o útero é revestido pelo endométrio, que possui células
que respondem aos hormônios sexuais.

Saiba mais
O endométrio é a camada que fica espessa durante o ciclo menstrual como forma de preparo para nutrir o
pré-embrião nos estágios iniciais e, caso não haja gravidez, é expelida em forma de menstruação.
Fisiologia do ciclo menstrual
A fisiologia do sistema reprodutor feminino envolve 5 principais hormônios:

Hormônio liberador de gonadotropina (GnRH), liberado pelo hipotálamo.

Hormônio folículo estimulante (FSH) e hormônio luteinizante (LH), secretados pela hipófise, em resposta
à liberação do GnRH.

Estrogênio e progesterona, secretados pelos ovários, em resposta ao FSH e ao LH.

Esquema da fisiologia endócrina do sistema reprodutor feminino, com feedbacks apontados.

A intensidade com a qual esses hormônios são secretados varia de acordo com as diferentes fases do ciclo
menstrual (também chamado – e mais corretamente descrito – de ciclo sexual mensal), que tem duração
média de 28 dias e cuja irregularidade está frequentemente associada à diminuição da fertilidade. O único
hormônio que possui certa constância em sua liberação é o GnRH, que não tem grande variação de
concentração ao longo do ciclo.

Relembrando
O ciclo sexual mensal tem início no primeiro dia da menstruação e possui dois resultados principais:
liberação de apenas um oócito maduro por ciclo (na maioria das vezes), e preparo do endométrio para
implantação do eventual pré-embrião.

O FSH e o LH são liberados de maneira cíclica pela hipófise ao longo do ciclo, o que acarreta em respostas
ovarianas igualmente cíclicas. Esses hormônios atuam nas células-alvo ovarianas, que possuem receptores
específicos para FSH e LH.

No momento do nascimento, as meninas apresentam, em seus ovários, folículos primordiais – oócitos

estagnados em prófase da divisão meiótica, envolvidos por uma camada de células da granulosa.

Na puberdade, com o aumento da secreção de FSH e LH, em cada ciclo sexual mensal cerca de 6 a 12
desses folículos primordiais se tornam primários, com aumento do tamanho do oócito em seu interior e da
quantidade de camadas de células da granulosa. Por fora dessas células da granulosa, são formadas várias
camadas celulares formando a teca, que se diferencia em:

Teca interna – responsável pela liberação de estrogênio e progesterona.

Teca externa – responsável pela formação da cápsula do folículo em desenvolvimento.

As células da teca interna, junto com as células da granulosa, também secretam o líquido folicular (rico em
estrogênio), cujo acúmulo forma o antro do folículo – caracterizando esse estágio como folículo antral. Até
aqui, o desenvolvimento folicular foi estimulado principalmente por FSH.

A partir desse momento, ocorre um crescimento acelerado do folículo, cuja causa é multifatorial:

Há um aumento no número de
receptores de FSH na
superfície das células da
granulosa, devido ao aumento
da concentração de
estrogênio. Isso torna as
células ainda mais sensíveis à

ã d FSH f it d
 ação do FSH, por um efeito de
feedback positivo.

A estimulação pelo LH é
possibilitada pela união do
FSH ao estrogênio, que se
combinam para promover
receptores de LH nas células
originais da granulosa. Por
sua vez, o LH acelera a
secreção do líquido folicular, o
que aumenta ainda mais a
concentração de estrogênio.

A alta concentração de
estrogênio combinada à
grande quantidade de LH
hipofisário estimulam a
proliferação das células da
teca.

Nesse processo de crescimento dos folículos antrais, os oócitos também aumentam de tamanho, mas
permanecem aderidos às células da granulosa, localizadas em um polo do folículo.

Aqui vamos retomar a informação de que 6 a 12 folículos são recrutados por mês para complementar
dizendo que apenas um deles chega ao estágio de folículo maduro, com diâmetro aproximado de 15mm –
ou seja, apenas um oócito é liberado por mês (normalmente), o que impede que mais de uma criança seja
gerada em cada gravidez.

Sendo assim, os outros folículos sofrem atresia. Não se conhece muito bem o mecanismo pelo qual isso
acontece, mas é sugerido que as altas taxas de FSH foliculares causem um feedback negativo, diminuindo a
secreção de FSH hipofisário. Desse modo, o folículo dominante continuaria a crescer devido aos
mecanismos de feedback intrínsecos, enquanto os outros folículos se tornariam atrésicos.

Quando e como ocorre a ovulação?

A ovulação ocorre aproximadamente na metade do ciclo mensal – em um ciclo de 28 dias, ocorreria no 14º
dia, por exemplo. O folículo se rompe e libera o líquido viscoso contido em seu interior que, por sua vez,
carrega o oócito maduro com uma massa de células ao seu redor, incluindo as células da granulosa,
denominada corona radiata. Esse processo é desencadeado por um aumento na secreção de LH hipofisário
nos dois dias anteriores, que atinge um pico 16 horas antes da ovulação, aproximadamente. A secreção de
FSH também sofre aumento nesse período e, junto ao LH, atua no rápido crescimento final do folículo.

O LH também atua transformando as células tecais em células produtoras de progesterona, o que causa um
aumento na concentração desse hormônio e uma diminuição na concentração de estrogênio, cerca de um
dia antes da ovulação. É seguro dizer que o pico de LH é imprescindível para que a ovulação aconteça.

Após a ovulação, as células da granulosa e da teca interna que remanescem no folículo se transformam em
uma massa celular com inclusões lipídicas denominada corpo lúteo, cuja função é a produção de
progesterona (principalmente) e estrogênio, nos 7 a 8 dias posteriores à ovulação. Depois desse período, o
corpo lúteo perde sua função secretora, involui e se transforma no corpus albicans, que eventualmente será
reabsorvido.

Representação do crescimento folicular, liberação hormonal e espessamento endometrial durante o ciclo menstrual.

Gametogênese
Os gametas derivam de células germinativas primordiais que se formam na segunda semana do
desenvolvimento embrionário e, por volta da quinta semana, essas células chegam às gônadas em
formação. Durante essa migração e quando chegam ao local das futuras gônadas, as células germinativas
primordiais passam por divisões mitóticas a fim de se proliferarem.

Mas, afinal, o que é a gametogênese?

Resposta
É o processo pelo qual são originadas as células germinativas (gametas). A gametogênese masculina é
chamada de espermatogênese, enquanto a feminina é chamada de oogênese. A gametogênese é
necessária para reduzir o número cromossômico das células (de diploides para haploides, por meio da
meiose), bem como completar sua maturação, diferenciando-as em gametas.

A meiose consiste, na verdade, em duas divisões celulares: meiose I e meiose II. No início da meiose I, as
células germinativas masculinas e femininas (espermatócitos e oócitos primários) replicam seu DNA, de
forma que os 46 cromossomos ficam com estrutura dupla (cromátides-irmãs).

Aqui vale lembrar a mitose, na qual ocorre esse mesmo processo, porém como se trata de apenas uma
divisão celular (e não duas como na meiose), na metáfase os cromossomos se alinham na placa equatorial
da célula para que cada uma de suas cromátides seja puxada para polos opostos da célula a fim de formar
duas células com o mesmo conteúdo cromossômico.

Entretanto, na metáfase da primeira divisão meiótica, os cromossomos homólogos se alinham em pares na

placa equatorial, de forma que cada uma das duas células-filhas recebe um cromossomo com cromátides-
irmãs, totalizando 23 cromossomos com estrutura dupla. Aqui as células filhas já são haploides, uma vez
que contêm apenas uma cópia de cada cromossomo. Assim, na segunda divisão meiótica (meiose II), as
cromátides-irmãs serão separadas, e o resultado final da meiose será quatro gametas com 23
cromossomos de estrutura simples em cada um.
 Etapas da gametogênese.

As células com anomalias numéricas cromossômicas podem se originar na meiose ou mitose. Caso ocorra
erro na divisão mitótica ou meiótica, podem ser originadas células-filhas com número alterado de
cromossomos. Se no pareamento de cromossomos homólogos, ambos forem puxados para o mesmo polo
celular (não disjunção cromossômica), o resultado será uma célula com 22 e uma célula com 24
cromossomos, por exemplo, que ao se unirem a uma célula com 23 cromossomos resultam em uma célula
com 45 (monossomia) e uma com 47 cromossomos (trissomia), respectivamente.

Caso isso ocorra na meiose e essas células com número alterado se unam a uma célula de 23
cromossomos na fertilização, elas formarão indivíduos com alteração cromossômica numérica em seu
cariótipo.

Exemplo
Uma alteração desse tipo bastante conhecida é a síndrome de Down, em que o indivíduo apresenta três
cópias do cromossomo 21 em seu cariótipo (que será representado por 47, XX ou 47, XY, trissomia do
cromossomo 21).

Por outro lado, se essa não disjunção cromossômica ocorrer na divisão mitótica embrionária pós-
fertilização, pode gerar um indivíduo mosaico, que apresenta células com alteração numérica e células
normais.

A variabilidade genética se deve a dois eventos que acontecem na meiose:

looks_one
 Crossover, quando as cromátides de cromossomos homólogos trocam segmentos durante o pareamento.

looks_two
Distribuição aleatória de cromossomos homólogos (podendo ser de origem paterna ou materna) para as
células-filhas.

Espermatogênese
A espermatogênese acontece na puberdade e é responsável pela transformação de espermatogônias em
espermatozoides. Quando o menino nasce, ele possui em seus testículos células germinativas imaturas, que
pouco antes da puberdade se transformam em células-tronco espermatogoniais e, em seguida, em
espermatogônias tipo A, o que marca o início da espermatogênese. As espermatogônias do tipo A sofrem
uma série de divisões para sua multiplicação e a última dessas divisões resulta em espermatogônias do tipo
B, que por sua vez dividem-se em espermatócitos primários. Ao final da meiose I, esses se transformam em
espermatócitos secundários que, durante a segunda divisão meiótica, formam espermátides haploides.

Denomina-se espermiogênese o período da espermatogênese em que as espermátides passam por

diversas alterações morfológicas, resultando em espermatozoides. A espermiogênese inclui:

Formação do acrossomo – estrutura contendo importantes enzimas que auxiliam na penetração do

oócito e suas camadas circundantes para fecundação.
Condensação do núcleo.
Formação da peça intermediária e da cauda.
Perda de grande parte do citoplasma e corpos residuais, que são fagocitados pelas células de Sertoli.

Espermatogênese.
Retomamos aqui o hormônio LH, secretado pela hipófise, que estimula a produção de testosterona nos
testículos pelas células de Leydig. A testosterona tem seu papel na espermatogênese atuando no
crescimento e na divisão das células germinativas - primeiro estágio da formação dos espermatozoides. Já
o FSH estimula as células de Sertoli, que possuem papel fundamental na espermiogênese (conversão de
espermátides em espermatozoides).

Curiosidade
A espermatogênese dura cerca de 74 dias e cerca de 300 milhões de espermatozoides são produzidos
diariamente. Depois de sua formação completa, os espermatozoides são lançados no lúmen dos túbulos
seminíferos e daí percorrem o caminho pelo sistema reprodutor masculino até serem ejaculados no sêmen.

Oogênese
O processo de diferenciação da oogônia em oócito maduro é chamado de oogênese. Diferentemente da
gametogênese masculina, que se inicia na puberdade, a gametogênese feminina se inicia ainda durante o
desenvolvimento fetal. As células germinativas primordiais femininas se diferenciam em oogônias quando
chegam às gônadas embrionárias. Ali, multiplicam-se por diversas divisões mitóticas e, por volta do terceiro
mês do desenvolvimento embrionário, agrupam-se em conjuntos envolvidos por células foliculares.

Parte dessas oogônias entram em divisão meiótica e param em prófase I (prófase da primeira divisão
meiótica, ou meiose I), sendo então chamadas de oócitos primários, e outra parte continua se multiplicando.
Esse período, ainda no terceiro mês do desenvolvimento embrionário, é quando as células germinativas no
ovário alcançam seu número máximo (em torno de 7 milhões). A partir desse momento, muitas oogônias e
oócitos primários sofrem atresia e degeneram, até o sétimo mês de desenvolvimento embrionário, quando
cada oócito primário restante, junto com as células foliculares que o envolvem, forma um folículo primordial.

Saiba mais
Estima-se que o número de oócitos primários no nascimento seja em torno de 700 mil.

Durante a infância, ocorre degeneração de muitos outros oócitos, de modo que no início da puberdade
restam por volta de 40 mil, dos quais menos de 500 chegarão a ser ovulados – razão pela qual refere-se à
urgência do relógio biológico da mulher, uma vez que nascem com número finito de gametas.

Os oócitos primários ficam estagnados em prófase I até a puberdade.

Quando a puberdade é atingida, cerca de 6 a 12 folículos primordiais são recrutados a cada mês, mas em
geral apenas um chegará ao estágio de folículo maduro, ocorrendo atresia dos demais. Seguindo o
recrutamento inicial, os folículos primordiais passam ao estágio de folículos primários, com o surgimento de
células granulosas. Essas células, assim como o oócito, secretam uma camada de glicoproteínas na
superfície do oócito, formando a zona pelúcida.
Com o crescimento do folículo, as células granulosas se organizam em células secretoras (teca interna) e
uma cápsula fibrosa (teca externa), começam a criar um antro preenchido por fluido, e os folículos passam
a ser denominados folículos antrais ou vesiculares. As células granulosas imediatamente circunjacentes
aos oócitos permanecem intactas e são denominadas cumulus oophorus (ou cúmulo oóforo). Esses
folículos vão aumentando de tamanho com o crescimento do antro e, próximo à ovulação, são chamados de
folículos vesiculares maduros ou folículos de Graaf, lembrando que apenas um folículo alcança essa
maturidade.

Maturação folicular.

Nas horas que se seguem, após o pico de LH até a ovulação, a meiose I - que até então estava estagnada
em prófase - se completa, resultando na expulsão do primeiro corpúsculo polar, que fica localizado no
espaço perivitelínico, entre o citoplasma do oócito (também chamado ooplasma) e a zona pelúcida, e
contém 23 cromossomos de estrutura dupla. O que acontece na meiose dos gametas femininas é que as
células-filhas geradas são de tamanhos desiguais. O oócito secundário ou oócito maduro (que é o gameta
resultante), recebe a maior parte do citoplasma, enquanto as outras células-filhas - os corpúsculos polares -
não recebem quase nada.

O oócito entra então na meiose II e aproximadamente três horas antes da ovulação entra em metáfase,
etapa na qual fica estagnado. A segunda divisão meiótica só se completa se houver fertilização do oócito.
Nesse caso, ocorre a liberação de um segundo corpúsculo polar, bem como a formação dos pró-núcleos
masculino e feminino no ooplasma.

No esquema abaixo conseguimos observar um resumo da oogênese e do desenvolvimento folicular.

Oogênese.

Fecundação e desenvolvimento embrionário

até o estágio de blastocisto

Reprodução natural
Na reprodução natural, após a ovulação, o oócito maduro é captado pelas fímbrias das trompas uterinas e,
caso não haja fecundação, percorre o caminho das trompas até chegar ao útero e ser eliminado na
menstruação.

Se, por outro lado, houver encontro dos espermatozoides com o oócito ovulado, a fecundação ocorre na
ampola da tuba uterina.

Não são todos os espermatozoides contidos no sêmen ejaculado que conseguem chegar até os oócitos.
Essa seleção é chamada de capacitação espermática e é composta por algumas etapas, são elas:
As substâncias presentes no
sistema reprodutor feminino
neutralizam os inibidores da
atividade dos
espermatozoides que se
encontravam no sistema
masculino.

Os espermatozoides
precisam, inicialmente, se
desvencilhar do plasma
seminal. No momento da
ejaculação, o sêmen
apresenta aspecto viscoso,
mas tende a se liquefazer
após alguns minutos. Essa
separação, que acontece
quando os espermatozoides
passam pelo colo uterino, é
necessária para expor o
acrossomo da cabeça dos
espermatozoides.

Nas tubas uterinas, os

espermatozoides entram em
contato com sua superfície
mucosa, o que permite
interações epiteliais entre eles
e consequente remoção de
uma camada de
glicoproteínas e outras
proteínas seminais presentes
na membrana plasmática do
espermatozoide, permitido
i i ã d d
 assim a exposição adequada
do acrossomo para a reação
acrossômica.

Uma vez que passam pelo colo uterino, os espermatozoides podem sobreviver por aproximadamente 72
horas. Seu caminho até as trompas uterinas é facilitado por contrações uterinas e das próprias trompas –
em menor escala, pela própria propulsão proporcionada pelo movimento dos flagelos.

O acrossomo dos espermatozoides carrega enzimas proteolíticas e hialuronidase, cuja função é desfazer as
ligações entre as células da granulosa do oócito. Nesse momento, muitos espermatozoides estão passando
pelas células da granulosa ao mesmo tempo, e alguns deles vão atingir a zona pelúcida.

Os espermatozoides se ligam à zona pelúcida do oócito, que é uma camada glicoproteica, por meio de
receptores específicos. Aqui é o momento da reação acrossômica, em que o acrossomo do espermatozoide
libera todo seu conteúdo, a fim de possibilitar a penetração do espermatozoide no oócito.

Logo após a entrada do primeiro espermatozoide e fusão de sua membrana com a membrana
citoplasmática do oócito (que é a fertilização propriamente dita), ocorre uma reação na zona pelúcida com
alteração de sua estrutura e composição, o que impede a ligação e penetração de outros espermatozoides,
evitando assim a poliespermia (fertilização do oócito por mais de um espermatozoide). Após a fertilização,
o oócito é ativado metabolicamente e passa a ser chamado de óvulo. A ativação oocitária é induzida,
provavelmente, por fatores contidos no espermatozoide.
Esquema das etapas envolvidas na fertilização.

Outro acontecimento que se segue imediatamente após a fertilização é a finalização da segunda divisão
meiótica e consequente expulsão do segundo corpúsculo polar contendo 23 cromossomos de estrutura
simples. Os 23 cromossomos restantes no ooplasma formam então um núcleo vesicular - o pró-núcleo
feminino. Do mesmo modo, o conteúdo do núcleo do espermatozoide, que agora se encontra no ooplasma,
também forma um núcleo vesicular - o pró-núcleo masculino.

O pró-núcleo feminino é, então, atraído em direção ao pró-núcleo masculino, até o momento em que seus
envoltórios se dissolvem e os cromossomos se alinham. Nesse momento, forma-se uma nova membrana,
única, em torno dos cromossomos pareados, em um processo chamado singamia. Assim, é formado o
núcleo da primeira célula embrionária: o zigoto.

Vale recapitular que os principais eventos resultantes da fertilização são:

Restauração da diploidia celular

Sendo resultado de uma combinação de materiais genéticos metade materna e metade
paterna, o zigoto possui uma constituição cromossômica diferente de ambos os pais.

Determinação do sexo genético do embrião

O óvulo possui, inevitavelmente, um cromossomo X. Assim, quando esse se une ao material
genético de um espermatozoide carregando um cromossomo Y, forma um embrião
masculino; caso o espermatozoide carregue um cromossomo X, o embrião gerado será
feminino.

Início da divisão embrionária

O zigoto inicia o processo de clivagem. Quando não há fertilização, normalmente o oócito se
degenera aproximadamente 24h após a ovulação.
Reprodução assistida
Nos tratamentos de Reprodução Assistida, algumas etapas da reprodução natural são contornadas, de
acordo com o fator de infertilidade do casal e tratamento proposto. Veremos os tratamentos com mais
detalhes em outro momento, mas, de modo geral, acontece o seguinte:

Inseminação intrauterina expand_more

Nesse procedimento (também conhecido como inseminação artificial), o homem coleta o sêmen por
meio de masturbação e a amostra é enviada ao laboratório de andrologia para capacitação artificial
dos espermatozoides, mimetizando o que aconteceria no trato reprodutor feminino. A amostra
capacitada é introduzida e injetada no útero da mulher por meio de um cateter devidamente
posicionado pelo médico.

Tratamentos de alta complexidade expand_more

Nos tratamentos de alta complexidade (FIV convencional e FIV com ICSI), não ocorre a ovulação
nem a ejaculação no interior do canal vaginal. O sêmen é coletado por meio de masturbação e
enviado ao laboratório de andrologia para capacitação, assim como ocorre com a inseminação
intrauterina. O líquido folicular contendo os oócitos é aspirado e enviado ao laboratório de
embriologia, onde o embriologista localizará o complexo cúmulo-oócito (CCO) e, em seguida,
preparará os oócitos para a fertilização.

FIV convencional expand_more

Na FIV convencional, os espermatozoides previamente capacitados são postos em contato com o

CCO em uma gota de cultivo. Assim, a penetração das células da granulosa e da zona pelúcida, bem
como a união da membrana do espermatozoide com a do oócito, ocorre do mesmo modo que
aconteceria normalmente na ampola das trompas uterinas em uma fertilização natural.

FIV com ICSI expand_more

 Nesse procedimento, são contornadas ainda mais etapas. Após localização dos CCOs pelo
embriologista, ocorre a retirada das células da granulosa de forma mecânica e enzimática, em um
processo chamado denudação. Assim, é possível identificar os oócitos maduros (que apresentam o
primeiro corpúsculo polar). Uma pequena quantidade da amostra contendo os espermatozoides
capacitados é colocada em uma substância viscosa, que diminui a velocidade de deslocamento dos
espermatozoides. Assim, o embriologista consegue selecionar o melhor espermatozoide, baseado
em sua motilidade e morfologia aparente. Cada espermatozoide selecionado é, então, injetado no
citoplasma de um oócito maduro.

Tanto na FIV convencional como na FIV com ICSI, a fertilização é verificada no dia seguinte à fecundação
dos oócitos, quando são observados dois pró-núcleos (um masculino e um feminino, morfologicamente
indistinguíveis) e dois corpúsculos polares. Na inseminação intrauterina, uma vez que a fertilização ocorre
da mesma forma que a natural (com exceção do preparo seminal), o sucesso do tratamento só pode ser
identificado com exame de sangue indicando se há ou não gravidez, aproximadamente duas semanas após
o tratamento.

Desenvolvimento embrionário
Na reprodução natural, o zigoto inicia a clivagem ainda nas trompas uterinas, chegando à cavidade uterina
por volta do quinto dia após a fertilização. Esse momento é quando o pré-embrião atinge o estágio de
blastocisto, rompe a zona pelúcida em um processo chamado hatching (ou eclosão), e inicia sua
implantação no endométrio.

Desenvolvimento embrionário desde a ovulação até a implantação embrionária.

Enquanto na reprodução natural o pré-embrião passa por todos esses estágios, deslocando-se da ampola
da trompa para a cavidade uterina, na reprodução assistida esses estágios são acompanhados em
laboratório. A equipe médica, os embriologistas e os pacientes tomam a decisão de qual será o melhor
momento para transferir o pré-embrião de volta para o útero. Atualmente, é mais comum a transferência em
estágio de blastocisto, mas não é incomum serem observadas transferências em D+3, existindo argumentos
contra e a favor de ambos.

Na Reprodução Assistida, o desenvolvimento embrionário é acompanhado em laboratório. Após a

fertilização in vitro, o pré-embrião é mantido em uma incubadora que simula as condições intrauterinas. Seu
desenvolvimento é acompanhado pelo embriologista, que faz observações pontuais ao longo dos dias.

No desenvolvimento embrionário correto, espera-se que o pré-embrião evolua da seguinte forma

(considerando D0 = dia da fecundação):

D+1
(primeiro dia do
desenvolvimento
embrionário)
Observação entre 16 e 18
horas após
fecundação/injeção
intracitoplasmática do
espermatozoide: zigoto
apresentando dois
corpúsculos polares no
espaço perivitelínico e dois
pró-núcleos simétricos e
justapostos.

D+2
(segundo dia do
desenvolvimento
embrionário)

Ob ã t 43 45h
Observação entre 43 e 45h
após fecundação/injeção: pré-
embrião com 4 células.

D+3
(terceiro dia do
desenvolvimento
embrionário)
Observação entre 67 e 69h
após fecundação/injeção: pré-
embrião com 8 células.

D+4
(quarto dia de
desenvolvimento
embrionário)
Observação entre 94 e 96h
após fecundação/injeção: pré-
embrião com membranas
celulares indistinguíveis, em
estágio de compactação,
sendo observada uma massa
compacta de células. A esse
estágio damos o nome de
mórula.

D+5
(quinto dia de
desenvolvimento)

Ob ã t 114 118h
 Observação entre 114 e 118h
após fecundação/injeção: pré-
embrião em estágio de
blastocisto, com massa
celular interna, blastocele e
trofectoderma bem definidos.

Abaixo, demostramos o desenvolvimento embrionário capturado em quatro diferentes estágios.

Zigoto.
Estágio de clivagem (D3).

Blastocisto (D5).
Blastocisto após eclosão (D6).

video_library
Reprodução humana assistida X reprodução
natural
Neste vídeo, a biomédica Beatriz Campos estabelece um comparativo entre a reprodução humana assistida
e a natural até o desenvolvimento embrionário.
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1
Vimos que a gametogênese é o processo pelo qual são originadas as células germinativas (gametas). A
gametogênese masculina é chamada de espermatogênese, enquanto a feminina é chamada de
oogênese. Nos homens, em qual dessas estruturas ocorre a produção dos espermatozoides?

A Epidídimo

B Ductos ejaculatórios

C Túbulos seminíferos

D Saco escrotal

E Próstata

Parabéns! A alternativa C está correta.

Os espermatozoides são produzidos nos túbulos seminíferos localizados nos testículos, que está
contido dentro da bolsa ou do saco escrotal. No epidídimo, os espermatozoides adquirem a sua
maturidade. A próstata produz um líquido alcalino que compõe o sêmen. Os ductos ejaculatórios
conduzem os espermatozoides e o líquido seminal para a uretra, por onde serão ejaculados.

Questão 2

Vimos que fertilização é o nome dado para indicar que o processo de fecundação, ou seja, o encontro
dos gametas masculinos e femininos quando ocorre de forma correta. Após a fertilização, vários
processos são observados. Sobre os resultados encontrados após a fertilização, analise as afirmativas
seguir:

I. Após a fecundação, ocorre um zigoto haploide.

II. Ocorre a determinação do sexo genético no embrião.

III. Ocorre a formação de dois pró-núcleos seguidas de divisão celular do tipo meiose.

É correto o que se afirma em:

 A I

B II

C III

D I e II

E II e III

Parabéns! A alternativa B está correta.

Após a fertilização ocorre a restauração da diploidia celular, pois dois gametas haploides se unem para
formar uma célula diploide (zigoto). Em seguida, esse zigoto inicia uma série de divisões celulares do
tipo mitose, aumentando assim o número de células. Essas primeiras divisões são conhecidas como
estágio de clivagem embrionária. Além disso, é nessa etapa que ocorre a determinação do sexo
genético do embrião.

Considerações finais
A Reprodução Humana Assistida evoluiu muito desde o seu início e ainda está em constante evolução! As
técnicas são aperfeiçoadas e otimizadas a cada dia para melhor atender aos interesses dos pacientes.

Ao longo deste conteúdo, conhecemos a história dessa ciência, relembramos conceitos importantes e
visitamos a anatomia e o funcionamento fisiológico dos sistemas reprodutores femininos e masculinos,
bem como dos primeiros dias do desenvolvimento embrionário. Esses assuntos são essenciais para uma
boa compreensão do funcionamento das técnicas que assistem os pacientes em seu planejamento
reprodutivo.

Nosso caminho por essa ciência tão fascinante está apenas começando. Estaremos juntos explorando de
maneira mais detalhada e específica o universo da Reprodução Assistida.

headset
Podcast
Antes de finalizarmos, a biomédica Beatriz Campos responde algumas perguntas contando um pouco mais
sobre sua experiência na área.

Explore +
Para ampliar seus conhecimentos sobre o conteúdo, assista aos vídeos abaixo no YouTube:

Um jeito divertido de entender fertilização, no canal DW Brasil.

ICSI Footage no canal Fertillity Associates, em que você consegue ver a técnica de ICSI.

Time-Lapse (embryoscope) | IPGO, do canal TV fertilidade.

Referências
AUSTRALIAN GOVERNMENT. Human embryo – a biological definition. In: National Health and Medical
Research Council. Canberra, Australia, 2006.

BRINSDEN, P. R. Thirty years of IVF: The legacy of Patrick Steptoe and Robert Edwards. In Human Fertility.
Informa Healthcare. Cambridge, Reino Unido. 2009, p. 137-143.

JOHNSON, M. H. Robert Edwards: the path to IVF. Biomed Online. Reino Unido. 2011. p.35.

LUNA, N. A personalização do embrião humano: da transcendência na biologia. Mana, v. 13, n. 2, p. 411-440,

2007.

MOURA, M. D.; SUZA, M. C. B.; SCHEFFER, B. B. Reprodução assistida: um pouco de história. Rev. SBPH, v.
12, n. 2, 2009.

NIEDERBERGER, C.; PELLICER, A.; COHEN, J.; et al. Forty years of IVF. Fertil Steril, v. 110, n. 2, p. 185-324,
2018.

PEREIRA, D. H. M. A história da reprodução humana no Brasil. Femina, n. 39, v. 2, p. 59-64, 2011.

STEPTOE, P. C.; EDWARDS, R. G. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet, v. 2, n. 8085, p.
366, 1978.

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Estrutura laboratorial
e o biomédico na
reprodução
assistida
Prof. Caio Luis Vieira Werneck

Descrição

Laboratório de reprodução assistida: estrutura, legislação, mercado de trabalho, habilitação e atribuição do

biomédico.

Propósito

A compreensão do funcionamento de uma profissão com interação multidisciplinar e a visão do propósito e

das possibilidades na reprodução assistida são importantes para estimular o lado crítico, interativo e
empático do aluno, potencializando o profissional.
Objetivos

Módulo 1

A clínica e a legislação em reprodução humana assistida

Descrever a estrutura, a legislação e o mercado de trabalho em reprodução assistida.

Módulo 2

O papel do biomédico na embriologia e na reprodução assistida

Descrever a atuação do biomédico na reprodução assistida.

Introdução
Você já teve a oportunidade de entrar em um laboratório de reprodução assistida? Tem ideia de sua
estrutura, áreas necessárias, equipamentos utilizados ou profissionais envolvidos na mágica de gerar
uma vida fora do corpo humano? Sabe o que deve e o que não deve ser praticado na área?

Muito além da tecnologia, da organização, dos protocolos e da metodologia, a reprodução assistida é

uma área em que o cuidado, o carinho e o acolhimento ao casal são de suma importância. Trabalhar
com reprodução é intervir no momento mais íntimo de um casal. Ninguém geraria seus filhos em um
laboratório por opção. Nossos pacientes só existem por uma necessidade da saúde básica, portanto
sempre será dever do profissional biomédico atender com ética e respeito. Mas, acima disso, a
humanização faz toda a diferença. Empatia pelo casal, pelos embriões e pelas células trabalhadas é
essencial.

A partir de agora, vamos conhecer um pouco mais sobre a estrutura laboratorial, as legislações e o
importante papel do biomédico na reprodução assistida. Vamos juntos?
 Orientação sobre unidade de medida
Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de
tecnologia e didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número
e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem
seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades.

1 - A clínica e a legislação em reprodução humana

assistida
Ao final deste módulo, você será capaz de descrever a estrutura, a legislação e o mercado de
trabalho em reprodução assistida.

Estrutura de uma clínica de reprodução assistida

Em uma clínica de reprodução assistida, temos um objetivo em comum com o paciente: o projeto de uma
família. Ao se trabalhar o conceito de projeto de uma família, é automático embutir nos profissionais,
pacientes e estudantes que uma clínica não se preza a apenas “fazer bebês”. Talvez, como objetivo final,
sim, sempre teremos a concepção de uma nova vida saudável, porém, dentro do conceito mais amplo do
planejamento familiar, os tratamentos de reprodução assistida (TRA) desempenham função muito
importante na preservação da fertilidade e do potencial reprodutivo do indivíduo ou do casal.

Para tal objetivo ser cumprido com êxito, uma clínica possui uma equipe multidisciplinar composta por:
equipe de higiene, recepção, administração, financeiro, marketing, psicologia, enfermagem, farmacêuticos,
médicos e embriologistas. A perfeita sincronia entre os diversos setores que a compõem é indispensável
para que o trabalho possa fluir de forma eficiente.

Além de recepção, consultórios, leitos de recuperação, salas administrativas, estoque, antecâmaras,

lavatórios cirúrgicos e outras estruturas de suporte, uma clínica necessita de um centro cirúrgico, de uma
criogenia e de um laboratório de fertilização in vitro. Tudo seguindo as normativas da RDC nº 23, de 27 de
maio de 2011.

Vamos agora conhecer pelo que cada um desses locais é responsável:

Centro cirúrgico
Para realizar a coleta dos óvulos, é necessário um centro cirúrgico. Ela é feita por meio de uma
microcirurgia, por via vaginal, na qual uma agulha transfixa a parede da vagina até que atinja os ovários. É
um procedimento de ultrassom guiado em que é possível visualizarmos os folículos ovarianos previamente
estimulados e aspirar seu conteúdo, provavelmente, com a captura de um óvulo por folículo. Apesar de
simples, é um procedimento que demanda sedação da paciente e recuperação em leito aos cuidados de
equipe de enfermagem.
O centro cirúrgico é necessariamente dotado de mesa cirúrgica ginecológica, foco, carrinho de parada e
materiais cirúrgicos em geral.

Como outros procedimentos podem acontecer no mesmo centro cirúrgico, ele pode ser mais bem equipado
com, por exemplo, microscópio cirúrgico, muito utilizado para biópsia testicular masculina.

Lembrando que procedimentos cirúrgicos só podem ser realizados por médicos especialistas.

Criogenia
A sala de criogenia é uma estrutura à parte do laboratório. Tanques de nitrogênio não podem ser
armazenados dentro do laboratório de fertilização in vitro.

A criogenia necessita ser dotada de exaustão, próxima ao piso, uma vez que o nitrogênio gasoso é mais
denso que o ar ambiente.
Tanques de nitrogênio para criopreservação.

Quando falamos em criogenia e no contato do profissional da área com o gás nitrogênio, é importante
respondermos a uma pergunta:

O nitrogênio é um gás tóxico?

O nitrogênio não é um gás tóxico, estando presente em aproximadamente 78% do ar que respiramos
diariamente, porém o risco de quebra de um tanque e de perda de grandes volumes de nitrogênio líquido
para o ambiente é potencialmente fatal. Isso ocorre pois, à temperatura ambiente, o nitrogênio líquido se
vaporiza para o estado gasoso.

Qualquer elemento químico em estado gasoso ocupa um volume muito superior ao ocupado em estado
líquido. Com esse aumento de volume — e de pressão, consequentemente —, boa parte do oxigênio do
ambiente pode ser expulsa. O profissional que estiver nessa sala pode sofrer hipóxia, pela falta de oxigênio,
mas nunca sofrerá intoxicação pelo nitrogênio.
À temperatura ambiente, o nitrogênio líquido passa para o estado gasoso. Note na imagem a “nuvem” branca.

Laboratório de fertilização in vitro

Esse é o local onde o profissional biomédico exerce a maior parte da sua função. O laboratório é uma sala
limpa, e isso indica que diversas estruturas são necessárias, como barreiras de ar (air lock), sistema de
ventilação e exaustão próprio com séries de filtros (mantas biológicas, filtros de poeira fina, filtros de carvão
ativado e filtros absolutos), paredes com revestimento epóxi e cantos arredondados e pisos sem frestas.
Em relação aos equipamentos, os utilizados para a parte da andrologia são: cabine de segurança biológica,
centrífuga e microscópio óptico. Esses são os básicos, mas equipamentos como incubadora, banho seco e
banho-maria podem ser utilizados, a depender da rotina laboratorial.

Os equipamentos mais utilizados para a parte da embriologia são: cabine de fluxo laminar com
aquecimento, estereoscópio (lupa), microscópio invertido com micromanipulador acoplado e incubadora.
Esses são os básicos, mas equipamentos, como laser, incubadora vertical e aquecedor de tubo podem ser
utilizados, a depender da rotina laboratorial.

Microscópio invertido com micromanipulador acoplado.

 Saiba mais

Nas clínicas de reprodução assistida, temos ainda uma sala destinada ao estoque de materiais e uma sala
de acondicionamento, segregação e descarte de materiais, chamada de expurgo.

video_library
Estrutura de uma clínica de fertilização in vitro na
prática
Neste vídeo, conheça os diferentes espaços da clínica de fertilização in vitro, as atividades desenvolvidas
em cada um, os padrões de segurança necessários e as atribuições do biomédico naquele espaço.

Qualidade ambiental
Segundo a RDC vigente para laboratórios de reprodução assistida (RDC nº 23, de 27 de maio de 2011), a
qualidade ambiental deve ser controlada pelo menos duas vezes ao ano. Esse controle consiste em análises
microbiológicas para fungos e bactérias das áreas limpas, análise da contagem de partículas presentes no
ar ambiente do laboratório, dos fluxos laminares e das cabines de segurança biológica, limpeza dos ductos
do ar-condicionado, medida do número de trocas do volume do ar ambiental por hora e a vazão da exaustão
do ar da criogenia. A assepsia do laboratório é de suma importância para evitar que microrganismos
cresçam no meio de cultivo e inviabilizem o cultivo embrionário.
Todas essas análises precisam ser documentadas em relatórios que devem ser impressos e armazenados
por período mínimo de um ano e atualizados a cada seis meses para a inspeção anual da Anvisa (Agência
Nacional de Vigilância Sanitária), sob pena de infração, penalidade e, em casos mais graves, fechamento da
clínica.

Importante sempre lembrar que, para alcançar a qualidade ambiental máxima, diversas medidas e posturas
podem ser adotadas, como: não utilizar perfumes ou produtos que exalem cheiro quando se está no
laboratório; escovar corretamente as mãos antes de entrar no laboratório; utilizar corretamente
equipamentos de proteção individual (EPIs), como máscara, touca, jaleco, luvas e propés em tempo integral
e, principalmente, durante o manuseio de amostras; e não aglomerar dentro do laboratório (visitas não são
bem-vindas).
A utilização de EPIs é essencial para a rotina do laboratório de reprodução assistida.

Saiba mais

Perfumes são produtos que liberam os compostos orgânicos voláteis que são conhecidos por serem
prejudiciais ao desenvolvimento embrionário. Os filtros de ar dos laboratórios são equipados com camadas
de carvão ativado justamente para evitar a presença desses compostos no ar laboratorial.

Ética na reprodução humana assistida

A ética na reprodução humana assistida é um tema que deve ser sempre debatido e conversado. Diversas
possibilidades surgem ao longo de um tratamento e, atualmente, poucas regulamentações existem. Sendo
assim, a moral e a ética do profissional ainda são decisivas na hora de seguir com um trabalho pautado em
boas práticas médicas.

O processo de reprodução assistida é pautado pela confiança entre profissional e paciente baseada em comportamento ético.

A seguir, levantamos alguns pontos éticos com os quais sempre nos deparamos ao longo da jornada de
embriologistas, mas é importante ressaltar que não há defesa ou acusação aqui. Apenas trataremos do
cenário ético atual da reprodução assistida no Brasil.
Idade para tratamento

Atualmente, mulheres de até 50 anos podem utilizar as técnicas de reprodução assistida sem nenhum
entrave ético. Acima dos 50 anos, é possível que mulheres utilizem as técnicas de reprodução assistida,
porém só com o aval do Conselho Regional de Medicina, que certamente solicitará algumas avaliações
psicológicas para essa paciente. Por outro lado, homens de qualquer idade podem se submeter aos
tratamentos de reprodução assistida, independentemente da sua idade.

Seleção de sexo do embrião

Sempre foi proibida a escolha de sexo do embrião no Brasil. Essa seleção somente é possível quando há
doenças hereditárias relacionadas ao sexo, como a hemofilia, o daltonismo ou a distrofia muscular.

Casais sorodiscordantes

É possível, atualmente, com as ferramentas que os tratamentos de reprodução assistida proporcionam,

fazer com que um casal soro discordante tenha uma gestação sem risco de transmissão da doença para
o outro parceiro.
Casais homoafetivos

A reprodução assistida permite que casais homoafetivos tenham a possibilidade de constituir famílias
com o material genético de pelo menos um dos dois pais. O que permite essa possibilidade é o fato de
que, atualmente, uma criança pode ser registrada com dois pais ou duas mães, desde que comprovado
junto ao cartório que o bebê é fruto de um tratamento de reprodução assistida, com o laudo e a
declaração que a clínica fornece.

Reprodução post mortem

Um tema muito delicado e, ainda, sem jurisprudência definida. Fato é que, se o material biológico do ente
falecido foi congelado em vida e todos os consentimentos expressos de sua parte estavam assinados, a
vontade explicitada em vida vai prevalecer. Se o ente falecido optou pelo descarte da amostra em caso de
morte, ela será descartada. Se o ente falecido optou por deixar sob a responsabilidade de alguém, esse
alguém pode dar o destino que bem entender à amostra, seja utilizá-la, seja descartá-la.
Doação de gametas e embriões

A doação, no Brasil, é permitida, desde que de forma anônima e sem compensação financeira. Para a
doação de gametas femininos, é necessário apenas que a mulher tenha mais de 18 anos e menos de 35
anos. Para a doação de gametas masculinos, basta que o homem tenha mais de 18 anos e qualidade
seminal normal. Exames para o rastreio de ISTs (infecções sexualmente transmissíveis) e o exame de
cariótipo são obrigatórios. Ao casal ou paciente receptor — de embriões ou gametas — são reportadas as
características fenotípicas do doador ou doadores, bem como o tipo sanguíneo e a idade.

Redução embrionária

Prática ilegal no Brasil. Em alguns países, objetivando a maior chance de gestação durante a transferência
embrionária, são transferidos diversos embriões. Após o resultado da gestação, em um momento em que
a visualização do saco gestacional e o batimento cardíaco fetal (BCF) estão em evidência, é permitida a
retirada de alguns dos embriões implantados para que o restante da gestação ocorra com somente um ou
dois embriões.
Útero de substituição

É permitido, desde que algum parentesco de primeiro ou segundo grau seja comprovado. Na falta de
parentesco de sangue, a legislação permite, após parecer psicológico, que o parentesco afetivo seja
utilizado (relação de amizade, carinho e afeto). É proibido qualquer tipo de compensação financeira pelo
procedimento.

Pesquisa com embriões humanos

Para realizar pesquisas com embriões humanos, o pesquisador deve sempre submeter seu trabalho ao
CONEP (Comitê Nacional de Ética em Pesquisa).

Embriões excedentes
 Até maio de 2021, não havia regulamentação que limitasse o número de embriões produzidos por meio
das técnicas de reprodução assistida. Tudo era permitido. Porém, a resolução do CFM nº 2.294, de 27 de
maio de 2021, trouxe luz à essa questão: o número total de embriões gerados em laboratório não pode
ser maior que 8 (oito). Caso sejam coletados mais de oito óvulos, o casal progenitor pode decidir pelo
congelamento ou descarte dos óvulos excedentes.

Descarte de embriões

Até maio de 2021, embriões criopreservados por período superior a três anos podiam ser descartados se
assim o casal progenitor desejasse. Porém, após a resolução do CFM nº 2.294, de 27 de maio de 2021, o
descarte só pode ser efetuado, independentemente do prazo, mediante autorização judicial.

Mercado de trabalho na área de reprodução assistida

Atualmente, o Brasil é o país que mais realiza a fertilização in vitro, inseminação artificial e transferência
embrionária na América Latina. Durante 25 anos, o Brasil foi responsável pelo nascimento de 83 mil bebês
provenientes dos tratamentos de reprodução assistida (SBRP, 2019).

Além disso, a busca pelas técnicas de reprodução assistida aumentou em 18% nos últimos anos,
principalmente entre as mulheres após 35 anos, fato relacionado com o destaque da mulher na sociedade e
a entrada delas no mercado de trabalho, adiando o sonho de engravidar. A busca de maturidade, de
estabilidade financeira, a escolha do parceiro certo, entre outros motivos que levam as mulheres a terem
cada vez mais uma gravidez tardia podem vir acompanhados de uma baixa reserva ovariana e da qualidade
dos óvulos, aumentando a procura pelos tratamentos de reprodução assistida (FERTILITY, 2019).
O crescente mercado abre portas para profissionais altamente qualificados, especializados e atualizados. É
importante relatar que as técnicas de reprodução assistida são de alto custo, por conta de sua tecnologia,
sendo necessária uma mão de obra qualificada para oferecer serviços de qualidade.

Como mencionado, a equipe em um laboratório de reprodução assistida é multidisciplinar e, nos bastidores,

destacam-se os profissionais que trabalham nos laboratórios com manipulação dos gametas, embriões e
congelamento, pois eles apresentam importantes atribuições para o sucesso do tratamento. Por exemplo, a
manipulação errada de um gameta ou a seleção de espermatozoides viáveis podem levar a insucesso no
tratamento.

Dentro desse contexto, destaca-se o profissional biomédico, que pela formação profissional pode atuar e se
especializar nessa área.

Mas como é o mercado de trabalho para os graduandos e graduados em Biomedicina?

Os alunos que querem trabalhar na reprodução assistida frequentemente recebem a informação de que “o
mercado de trabalho da reprodução assistida é muito fechado”.

Mas o que isso significa?

Resposta

A realidade é que há poucas vagas no mercado de reprodução assistida. Podemos citar, por exemplo, que
em todo o estado do Rio de Janeiro existem apenas sete grandes clínicas de reprodução assistida. Esses
laboratórios possuem, em média, cinco embriologistas em atuação. Isso dá uma média de 35
embriologistas em atividade em todo o estado.

Ao ver esses dados, você deve estar pensando que isso é muito pouco, e é verdade. Mas isso não significa
que não há vagas. A rotatividade existe: pessoas se mudam, clínicas crescem e precisam de mais
embriologistas, enfim, o mercado não fica parado! Vagas surgem e bons profissionais, com o perfil
procurado, nunca ficam sem emprego. A persistência é importante para abrir portas, mas é bom ter em
mente o real motivo pelo qual se deseja trabalhar na área. É importante entender o que a profissão significa
e, se isso tocar seu íntimo, dedique-se e siga em busca da carreira.
Lembre-se, principalmente, de que a reprodução humana necessita de pessoas humanas e empáticas. Lidar
com o momento mais íntimo de um casal não é fácil, pois todos gostariam que a reprodução ocorresse de
forma natural; e, no caso de um insucesso no tratamento, é exigido do profissional um apelo emocional e
empático muito grande. Trabalhamos com as sementes da vida, carregamos os sonhos dos casais em
nossas mãos!
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

“Qualidade, qualidade, qualidade… nunca essa palavra foi tão disseminada. Aliás, nos últimos tempos,
tem havido uma reorganização dos conceitos de qualidade porque na verdade a qualidade sempre foi
procurada pelos consumidores, exigida pelas autoridades e desejada pelos produtores. No início da
construção do que entendemos como civilização, a qualidade estava presente na ausência de arestas
das rodas de charretes e nos procedimentos corretos de estocagem de vinhos em barris de carvalho. O
que ocorreu foi que, com a criação da ISO em 1947 e com a modernização da indústria associada à
globalização, deu-se uma importância à qualidade de produtos e serviços, que antes existia de forma
desorganizada e regional.” (Texto extraído de Procedimento Operacional Padrão, por Renato Lima
Duarte)

O que precisa ser mensurado em um laboratório de reprodução assistida para que a qualidade
ambiental seja garantida?
 A Concentração dos níveis de gás carbônico ambiental.

B Análises químicas para metais pesados.

Concentração dos níveis de nitrogênio presente no ar das cabines de segurança

C
biológica.

D Análises microbiológicas para fungos e bactérias.

E Concentração de radioisótopos presentes no meio de cultivo.

Parabéns! A alternativa D está correta.

As análises microbiológicas para fungos e bactérias nos informam que o trabalho tem sido feito da
maneira correta, sem contaminações. A assepsia do laboratório é de suma importância para evitar que
microrganismos cresçam no meio de cultivo e inviabilizem o cultivo embrionário.

Questão 2

A nova resolução do CFM nº 2.294, de 27 de maio de 2021, limitou a 8 (oito) o número máximo de
embriões a serem produzidos dentro de laboratório de reprodução assistida. Nessas condições, qual
alternativa a seguir seria plausível, ética e legal, caso a paciente coletasse o total de nove óvulos:

A Congelamento ou descarte dos óvulos excedentes somente com autorização judicial.

B Descarte de todos os óvulos e nova tentativa em próximo ciclo de indução.

C Fertilização de todos os óvulos e descarte dos embriões excedentes a oito formados.

 D Congelamento ou descarte dos óvulos excedentes a critério exclusivamente do casal.

Fertilização de todos os óvulos e descarte dos embriões excedentes a nove formados

E
com autorização judicial.

Parabéns! A alternativa D está correta.

Tanto o congelamento quanto o descarte de gametas femininos não passam por critérios éticos, uma
vez que são consideradas apenas células “normais” do nosso corpo. Biologicamente, a cada ciclo
menstrual um óvulo não fertilizado naturalmente é perdido e outras dezenas sofrem atresia para o
desenvolvimento do folículo dominante.

2 - O papel do biomédico na embriologia e na

reprodução assistida
Ao final deste módulo, você será capaz de descrever a atuação do biomédico na reprodução
assistida.
Habilitação do biomédico na reprodução assistida
Antes de começarmos a discorrer sobre o papel do biomédico, é importante salientar o que esse
profissional precisa fazer até estar, de fato, regulamentado para atuar na área. Para atuar em laboratórios de
reprodução humana, o biomédico necessita estar habilitado para tal, conforme Resolução nº 78, de 29 de
abril de 2002. A resolução dispõe que o biomédico poderá atuar desde que comprovada a realização de
estágio com duração igual ou superior a 500 (quinhentas) horas em instituições oficiais ou particulares
reconhecidas pelo órgão competente do Ministério da Educação ou em laboratórios conveniados com
instituições de nível superior ou em cursos de especialização ou pós-graduação reconhecidos pelo MEC.

Mesmo com essa informação em mente, buscar a habilitação correta pode parecer um processo um tanto
confuso. Isso porque a mesma Resolução relata mais de 30 possibilidades de habilitação para o
profissional biomédico, e algumas delas podem gerar confusões, como reprodução humana e análises
clínicas ou mesmo fisiologia, fisiologia geral e fisiologia humana.

Qual dessas habilitações seria a mais correta a ser seguida? expand_more

Não há resposta correta. Atualmente, no Brasil, existem profissionais com todas essas habilitações
trabalhando dentro de laboratórios de reprodução assistida. Além disso, não são apenas biomédicos
que atuam dentro desses laboratórios. Temos casos de biólogos, enfermeiros, médicos, veterinários,
farmacêuticos e biotecnólogos exercendo a reprodução assistida. Ou seja, não há apenas uma
graduação ou habilitação correta, mas sim algumas possibilidades plausíveis.

O importante é que, uma vez habilitado, o biomédico pode atuar dentro da reprodução assistida. O
ramo profissional a ser seguido (embriologia ou andrologia) é uma questão de adaptação,
oportunidades, afinidade pela rotina e até mesmo de habilidade manual.
Os embriologistas precisam de habilidade manual para, por exemplo, manipular ovócitos e espermatozoides no microscópio invertido com
manipulador.

Quanto às características necessárias para ser um bom profissional, é sempre importante ressaltar o
objetivo pelo qual trabalhamos: auxiliar casais no sonho da maternidade/paternidade. Com isso em mente,
podemos avaliar que qualquer erro dentro do laboratório pode ser fatal e levar um filho a ser gerado com
gametas trocados ou em barriga errada.

Logo, a atenção, o compromisso, a responsabilidade e o foco são características extremamente

necessárias aos biomédicos que querem seguir nessa profissão. Habilidades manuais e práticas podem ser
moldadas a partir do treino, mas foco, compromisso, atenção e responsabilidade são inerentes a qualquer
profissional.

Além disso, a atenção às aulas de embriologia, o conhecimento do desenvolvimento embrionário, a

familiarização com termos técnicos pertencentes à área da reprodução assistida, o desenvolvimento da
língua inglesa, a busca por cursos e a presença em congressos são ótimos meios para que as portas
comecem a se abrir.
Por último, a dedicação do profissional é sempre muito bem-vista. Na reprodução, não há dias em que não
abrimos o laboratório. O cultivo embrionário dura seis dias e, sendo assim, se tivermos um paciente na
segunda-feira, o caso desse paciente só será finalizado, dentro do laboratório, no domingo. Logo, todo dia é
dia de trabalho. Lógico que escalas e revezamentos são montados, mas, em relação a serviços, o biomédico
tem demanda todos os dias!

Atuação do biomédico na reprodução assistida

Atuação do biomédico no laboratório de andrologia

É no laboratório de andrologia que se trabalha com os gametas masculinos, os espermatozoides.
Antigamente, era comum considerar o laboratório de andrologia como o primeiro passo do biomédico na
sua carreira dentro da reprodução assistida.

Nos últimos anos, porém, essa ideia tem se modificado e a profissão de andrologista tem se fortalecido
cada vez mais não como um estágio inicial da carreira, mas como uma ramificação possível do profissional
biomédico dentro do laboratório de reprodução assistida.
Mas, voltando para a atuação do biomédico propriamente dita, ela está presente em diversos momentos,
conforme demonstramos a seguir:

Avaliação seminal (espermograma)

A avaliação seminal é a principal ferramenta para se avaliar o fator masculino de infertilidade.

No espermograma é realizada a aferição dos parâmetros macroscópicos, químicos e microscópicos da

amostra seminal.

Vamos agora conhecer um pouco sobre o espermograma, mas fique tranquilo, pois em outro momento será
possível entender melhor as análises, os parâmetros e os padrões de referência, além de compreender as
indicações e os principais achados desse exame.

A seguir estão listadas algumas das análises que o biomédico pode realizar durante o espermograma:

Tempo de liquefação

O sêmen é um líquido que, ao ser ejaculado, apresenta-se grumoso, com diversos pontos de
coagulação (essa coagulação se dá, principalmente, pela presença das proteínas secretadas
pelas vesículas seminais — semenogelina, fibronectina e lactoferrina). É esperado que a
liquefação desses grumos aconteça de forma espontânea.

Cor

O ê d t b l t V i õ d d
 O sêmen deve se apresentar na cor branca opalescente. Variações da cor ou da sua
opacidade podem indicar alterações. Por exemplo, a coloração amarelada pode indicar
presença de leucócitos, evidenciando possíveis processos inflamatórios ou presença de
células epiteliais, acusando processos descamativos ou obstrutivos.

Volume

O volume seminal normal é superior a 1,5mL.

pH

O valor de pH normal do sêmen é igual ou superior a 7,2.

Concentração seminal

É um dos parâmetros mais utilizados na investigação da infertilidade masculina. A

concentração normal é superior a 15 milhões de espermatozoides por mililitro ejaculado.

Motilidade

Os espermatozoides são classificados, de acordo com sua motilidade, em:

Móveis progressivos (apresentam deslocamento rápido e direcional).

Móveis não progressivos (não apresentam deslocamento significativo — “movimento in

situ”).

Imóveis (não possuem movimento aparente algum).

Número total de espermatozoides

É t l b ld t id d t
 É a contagem global de espermatozoides da amostra.

Morfologia

Avalia a morfologia dos espermatozoides. Essa avaliação é feita a partir de lâminas de

esfregaço seminal com coloração específica para espermatozoides.

Celularidade

Algumas células não pertencentes à linhagem espermática podem estar presentes no sêmen,
porém sempre em concentração inferior a 1 milhão por mililitro.

Esquema ilustrando algumas alterações que o biomédico pode achar no espermograma.

Performando testes seminais

À parte da avaliação seminal com o objetivo de rastreio e diagnóstico, alguns testes seminais podem ser
realizados com o intuito de se entender melhor a funcionalidade dos espermatozoides presentes no
ejaculado. São eles:

Processamento seminal expand_more

O processamento seminal consiste exatamente em fazer o processo de capacitação espermática no

ambiente in vitro, ou seja, no laboratório.

Sobrevivência espermática expand_more

É um teste em que os espermatozoides são deixados, após a capacitação, em meio de cultivo por 24
horas. O normal é que pelo menos 58% deles permaneçam com o batimento flagelar evidenciado
após esse período.

Vitalidade expand_more

O teste da vitalidade é realizado por meio da penetração de corantes nos espermatozoides. A

vitalidade é um teste com aplicabilidade específica — por exemplo, quando não se vê motilidade
nenhuma na amostra avaliada para verificar a viabilidade dos espermatozoides.

Ativação expand_more

Para amostras com astenozoospermia absoluta (existem espermatozoides, porém eles não se
movem), é possível tentar realizar a ativação da motilidade espermática com o uso da pentoxifilina,
que é um composto que age de forma excitatória, estimulando o batimento flagelar do
espermatozoide.
Astenozoospermia absoluta
Defeitos na motilidade do espermatozoide.

Fragmentação do DNA espermático expand_more

Trata-se de um exame à parte. Serve para definir o percentual de espermatozoides que possuem seu
material genético livre de fragmentações para o diagnóstico da infertilidade masculina. O normal é
que a amostra apresente pelo menos 70% dos espermatozoides com material genético livre de
fragmentações.

Congelamento seminal expand_more

Os espermatozoides podem ser criopreservados para seu uso posterior. A adição de crioprotetores à
amostra seminal com o intuito de preservação da fertilidade é uma técnica bem difundida e com
resultados consistentes.

Em diversos momentos e por diversos motivos, a criopreservação seminal mostra papel

fundamental: quando realizada antes de procedimentos esterilizantes; quando realizada antes de
oncotratamentos; para pacientes que necessitam viajar ou trabalhar no dia do tratamento; para
preservar materiais de difícil obtenção, como os das biópsias testiculares; e pelos mais variados
motivos pessoais.

Criopreservados
Congelados a temperaturas muito baixas.

Captura em material de biópsia testicular expand_more

Por diversas razões, fisiológicas ou não, os espermatozoides podem não estar presentes no
ejaculado. Quando isso ocorre, é possível buscar os espermatozoides por meio de microcirurgias
nos epidídimos ou nos testículos. A indicação do procedimento, o local da captura e a técnica de
obtenção ficam a critério do médico urologista. Porém, quando o material entra no laboratório para
 pesquisa de espermatozoides e análise, o trabalho de encontrar raros espermatozoides no meio de
todo tecido cirúrgico é completamente do andrologista/embriologista.

Atuação do biomédico no laboratório de embriologia

O embriologista é um profissional altamente treinado. O treinamento completo pode durar de dois a cinco
anos, em média. Técnicas mais complexas e precisas compõem a rotina desse profissional.

Lidar com óvulos e embriões exige técnicas refinadas e atenção a todo e qualquer momento.
Conhecimentos na embriologia geral também são de suma importância, não pela prática do dia a dia — que
acaba sendo uma rotina protocolar —, mas sim pelo fato de que, ao se entender a fisiologia do
desenvolvimento embrionário, melhores escolhas podem ser feitas, como o melhor estágio de evolução
para se realizar uma transferência, uma biópsia ou um congelamento embrionário.

Esse conhecimento e essas decisões podem elevar o grau de individualização do desenvolvimento

embrionário para cada paciente e melhorar os resultados finais. É bom ter sempre em mente que, mesmo
que uma atitude ajude apenas um único casal de forma específica, isso significa uma família a mais que
realizou o sonho da maternidade/paternidade.

Comentário
Números e estatísticas não significam nada em reprodução humana. O sonho de um único casal é motivo
suficiente para lutarmos por um resultado de sucesso sem medir esforços. Ajudar uma família a ser feliz
não tem preço!

Os trabalhos do laboratório de embriologia se iniciam sempre no dia anterior. Ovócitos e embriões são os
representantes mais frágeis e delicados do laboratório.
Placas de cultivo, meios de cultivo e lavagem, enfim, tudo deve estar sempre aquecido a 37°C e
devidamente gaseificado com CO2 (dióxido de carbono) para manutenção do pH do meio de cultivo. A regra

é: ovócitos e embriões devem estar sempre dentro das incubadoras. A exceção é retirá-los de forma rápida
e precisa para os procedimentos estritamente necessários.

Mas quais seriam os procedimentos estritamente necessários?

Antes de conhecê-los, é importante mencionar que aqui abordaremos de forma rápida as atribuições do
biomédico embriologista. Em outro momento, você visitará as técnicas de maneira mais aprofundada.
Preparado? Vamos lá!

Punção folicular

Na punção, o médico irá inserir uma agulha via vaginal (e ultrassom guiada) até atingir a parede dos ovários
e penetrar em cada um dos folículos ovarianos que foram previamente estimulados por aproximadamente
10 dias. É um procedimento cirúrgico simples. Com isso, é possível aspirar todo o conteúdo dos folículos e
encaminhar esse líquido folicular para o laboratório.
 Ilustração do processo de punção folicular.

Ao chegar no laboratório, o líquido é disposto em placas e começa a busca pelos óvulos — em meio a todo
sangue, células e restos ovulares. Isso exige técnica e percepção. Tudo dentro de um laboratório é pensado
para que os óvulos não sofram nessa transição do in vivo para o in vitro. A temperatura das superfícies e do
meio de cultivo, o tipo de meio de cultivo utilizado, os gases presentes, o manuseio e a esterilidade dos
materiais, enfim, tudo objetiva a manutenção da melhor qualidade e estabilidade ambiental possível.
Com o auxílio de um estereoscópio, os embriologistas começam a buscar pelos óvulos. Nesse momento os
óvulos estão acompanhados de diversas células aderidas ao seu entorno — as células do cumulus
oophorus.

Com uma pipeta pasteur, cuidadosamente os separamos do líquido folicular e os limpamos do líquido
folicular residual, para depois guardá-los em uma placa com meio de cultivo limpo, aquecido e estabilizado.
Após finalizar a coleta de todos os óvulos, eles são transferidos para a incubadora.

Na incubadora, os controles são absolutos e instantâneos e servem para mimetizar o ambiente in vivo,
proporcionando temperatura, osmolaridade, gases e pH adequados. É na incubadora que os óvulos e
embriões passam pelo cultivo in vitro.

Incubadora para cultivo embrionário.

Atenção!
Óvulos e embriões só saem da incubadora nos momentos necessários! Não abrimos a incubadora só para
ver como os óvulos ou embriões estão. Tudo deve ser cronometrado e ocorrer sempre no tempo certo e de
acordo com a devida necessidade.

Denudação

Os óvulos são coletados com as células do cumulus oophorus aderidas a eles. Para podermos trabalhar e
enxergar os óvulos com clareza, precisamos retirar essas células. A esse processo damos o nome de
denudação. Ele pode ocorrer em duas etapas: química e mecânica.

Denudação química

A etapa química é similar ao que ocorre in vivo. Na cabeça dos espermatozoides encontramos a
enzima hialuronidase. Na denudação química, passamos os óvulos por essa mesma enzima (porém
sintética), que age retirando a maior parte das células do cumulus oophorus. Após concluir essa etapa,
as poucas células aderidas restantes só podem ser retiradas com a denudação mecânica.
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Denudação mecânica

A etapa mecânica consiste em passar esses óvulos por um filamento (micropipeta) extremamente
fino. O calibre é de aproximadamente 140 micrômetros (μm). E por que esse calibre? Porque esse
tamanho é bem próximo ao diâmetro dos óvulos. Logo, os óvulos entram nesse capilar tão justos que
as células ao seu redor vão sendo retiradas de forma mecânica ao entrar em atrito com a parede do
capilar.

Micrômetros
Um micrômetro é igual a um décimo do milímetro e equivale, por curiosidade, à espessura de um fio de
cabelo.
Depois de realizadas essas duas etapas, visualizamos com toda a clareza o óvulo. Após isso, finalmente,
podemos avaliar sua maturidade.

Classificação ovocitária

Primeiro, devemos avaliar a morfologia ovocitária. Os óvulos são células redondas e estão envoltos por uma
fina membrana glicoproteica chamada zona pelúcida. O espaço entre a membrana celular do óvulo e a zona
pelúcida é chamado de espaço perivitelíneo.

Os óvulos podem ser captados em três momentos distintos da sua maturidade morfológica:

Vesícula germinativa (VG)

Denotada pela presença da vesícula germinativa (núcleo celular) aparente. Em termos genéticos, o óvulo
está na prófase I da divisão meiótica. Para os tratamentos de reprodução assistida, os óvulos VGs não têm
aplicação. São extremamente imaturos e não há como aproveitá-los no tratamento. Não há chance de
sucesso com eles e, por isso, são sempre descartados.
Metáfase I (MI)
Denotada pela ausência da vesícula germinativa e pela não extrusão do corpúsculo polar. Em termos
genéticos, os óvulos estão na metáfase I da divisão meiótica. Os óvulos em MI têm chance (reduzida) de
sua fertilização ocorrer com sucesso — algo em torno de 20% a 30%.

Metáfase II (MII)
Apresenta corpúsculo polar aparente. Em termos genéticos, o óvulo está na metáfase II da divisão meiótica.
Os óvulos em MII são maduros e têm bom potencial de fertilizar e seguir adiante. Eles fertilizam em taxas
que variam em torno de 70% a 90%, a depender do fator de infertilidade do casal — ou seja, o motivo de o
casal não estar conseguindo engravidar.

FIV (fertilização in vitro) convencional

Este é o método de fertilização in vitro mais próximo ao natural possível. Nele, colocamos os
espermatozoides em uma placa junto com os óvulos e guardamos dentro da incubadora para que o
encontro dos gametas ocorra de forma espontânea.

Logo, assim como naturalmente ocorreria, os espermatozoides necessitam nadar até os óvulos, fertilizando-
os de forma natural e ativa, porém, in vitro.

Ilustração de fertilização in vitro convencional.

ICSI (injeção intracitoplasmática de espermatozoide)

Ilustração de fertilização com ICSI.

Este é o método de fertilização mais comentado e, no Brasil, também o mais praticado.

À ICSI pertence a imagem clássica da reprodução assistida em que um óvulo é segurado por uma
micropipeta e um espermatozoide dentro de uma microagulha é injetado dentro de seu ooplasma.

Verificação da fertilização

Ocorre quando observamos se o encontro do óvulo com o espermatozoide (seja por FIV convencional ou
por ICSI) aconteceu com sucesso. Isso pode ser aferido com o decorrer de aproximadamente 20 horas do
processo de fertilização. A ideia nesse ponto é verificar alguns sinais que o agora chamado zigoto (nome
que define embrião com apenas uma célula) nos evidencia.

Zigoto humano com os dois pronúcleos isolados.

Os sinais mais marcantes são os chamados pronúcleos masculino e feminino. São os primeiros núcleos
visíveis que o zigoto apresenta, um do pai e o outro da mãe.

Somado a outro sinal, a duplicação do corpúsculo polar denota que a fertilização teve sucesso.

Cultivo celular
Depois de verificarmos a fertilização, os embriões que tiveram sucesso começam seu desenvolvimento. Ao
longo dos anos, embriologistas estudaram a evolução adequada do embrião durante os dias iniciais que
seguem sua formação. Sabemos como o embrião deve estar em cada um dos dias subsequentes à
fertilização para podermos dizer sobre a qualidade embrionária e as chances desse embrião de se tornar
um “bebê em casa”.
 Processo de desenvolvimento embrionário nos primeiros dias.

Nesse momento, cada laboratório escolhe em seus protocolos quais serão os dias de verificar e avaliar os
embriões. Existem laboratórios que avaliam os embriões todos os dias. Existem laboratórios que só avaliam
caso seja necessário realizar algum procedimento, como, por exemplo, transferências, congelamentos,
trocas de meio etc. Não há correto e incorreto aqui.

Transferência embrionária
Independentemente do dia escolhido para a transferência embrionária, é nessa etapa que fazemos o
encontro da progenitora com o futuro bebê. Nesse momento o embrião deixa o ambiente in vitro e retorna
ao ambiente in vivo.

Biópsia embrionária

É por meio da biópsia que temos a possibilidade de realizar o teste genético do embrião. As possibilidades
de leitura dessa técnica vão desde doenças hereditárias que podem acometer um único gene específico até
a leitura cromossomal embrionária completa em busca de possíveis aneuploidias.

Saiba mais

A genética está de mãos dadas com a reprodução humana. A evolução de uma auxiliou a evolução da outra
em um ciclo sinérgico muito positivo que se estabeleceu. Mesmo realizando a biópsia, não compete ao
biomédico embriologista realizar as análises genéticas (MEDICINA S/A, 2021). Atualmente, cerca de 50%
dos tratamentos em reprodução assistida realizam a biópsia. Esse é um mercado em expansão que
necessita de mão de obra especializada, e o biomédico pode sim atuar nessa área.

Vitrificação

A técnica de criopreservação consiste em preservar por meio do frio extremo (-196 graus Celsius —
temperatura do nitrogênio em seu estado líquido) o material biológico, conservando sua viabilidade.

Congelamento ovocitário

Em 2012, a criopreservação de óvulos deixou de ser considerada uma técnica experimental, sendo realizada
por meio de vitrificação. Desde então, vem se difundindo e sendo requisitada mais e mais. A preservação da
fertilidade feminina é um dos temas mais amplos e atualmente discutidos no âmbito da reprodução
assistida, uma vez que o relógio biológico das mulheres é muito rígido e curto.

Saiba mais

O consenso científico é de que a idade máxima para se preservar a fertilidade feminina com bom potencial
de resultado é 35 anos (frisando que, quanto mais jovem for a mulher, maior será a qualidade e o número
dos óvulos criopreservados).

Congelamento embrionário
 São muitos os fatores que culminam no congelamento embrionário: excesso de embriões formados,
impossibilidade de se transferir a fresco, adiamento da maternidade/paternidade e diversos e variados
motivos pessoais. O congelamento embrionário é realizado por meio da vitrificação e é uma técnica muito
bem estabelecida e com resultados muito consolidados. É seguro que seja realizado sem prejudicar a
viabilidade do embrião.

Aquecimento
Todas as células que foram vitrificadas (sejam óvulos ou embriões) podem ser aquecidas para retomar seu
metabolismo celular e suas funções fisiológicas. A técnica de aquecimento envolve o movimento contrário
dos crioprotetores. Se na vitrificação o movimento era de adição de agentes crioprotetores, no aquecimento
o movimento é de retirada desses agentes.

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Taxas de indicadores de performance
Como estimar as taxas de sucesso da reprodução assistida? E quais variáveis influenciam essas taxas de
sucesso? Neste vídeo, o especialista fala sobre os indicadores de performance que servem para demonstrar
as taxas de sucesso da reprodução assistida.

Atribuições e responsabilidades do biomédico no

laboratório de reprodução assistida
O trabalho do biomédico dentro do laboratório de reprodução assistida (como embriologista ou
andrologista) é repleto de técnicas e trabalhos em bancada no melhor estilo “mão na massa”. Mas o outro
lado dessa rotina é igualmente importante, e é aí que surge a pergunta:

Podemos atuar somente como embriologistas ou como andrologistas?

Resposta
A resposta é sim e não. A rigor, sim, temos essas duas vertentes de atuação, mas há casos em que
biomédicos são contratados para trabalhar com uma demanda específica — como levantamento de dados,
pesquisa, manutenção geral do laboratório ou outras demandas laboratoriais quaisquer.

Esse trabalho além da bancada começa no preparo do laboratório. Esse preparo inclui entender e efetuar as
devidas medições das condições ambientais e das microcondições do cultivo, sejam elas dos gametas ou
dos embriões.

Condições mensuráveis

Algumas condições mensuráveis são importantes para a qualidade ambiental, como a temperatura
ambiente, a umidade relativa do ar, a temperatura das superfícies e o nível dos tanques de nitrogênio líquido.
A temperatura do laboratório de embriologia deve ser controlada a fim de evitar a proliferação de microrganismos e proteger as amostras.

A temperatura ambiente de um laboratório não deve ser inferior a 23°C e nem superior a 30°C. Essa margem
garante tanto o conforto térmico de quem trabalha quanto o menor índice de proliferação de
microrganismos como fungos e bactérias.

A umidade relativa do ar deve permanecer entre 30% e 70%. Mantê-la acima da margem inferior garante a
umidade relativa satisfatória para o ar que respiramos, sem afetar a saúde do profissional, assim como
mantê-la abaixo da margem superior ajuda a prevenir a proliferação de microrganismos como fungos e
bactérias.

A temperatura das superfícies (incluem-se aqui aquecedores de tubos, banho-maria, banho seco e afins)
deve ser sempre verificada e mantida no ideal de trabalho — geralmente, 37°C. Isso é importante para
minimizar oscilações que possam interferir no cultivo embrionário quando, por alguma necessidade, o
embrião tem que sair da incubadora para ser manipulado. Considera-se essa importância, uma vez que
variações na temperatura podem gerar oscilações na capacidade de dissolução dos gases no meio de
cultivo e, com isso, gerar oscilações de pH que podem ser fatais aos gametas e embriões.

O nível dos tanques de nitrogênio, utilizados para armazenar todo o material criopreservado em uma clínica,
deve ser sempre checado e mantido acima dos níveis críticos com boa margem de segurança.

Um tanque de criogenia pode comportar, em média, mais de 200 amostras. Se, por falta de verificação, um
tanque perder todo o seu nitrogênio, todos esses gametas ou embriões serão perdidos. Isso é inconcebível
dentro da reprodução assistida!
As incubadoras podem ser consideradas, sem exagero, o coração do laboratório, por causa de sua
importância. A menor variação em suas condições pode acabar com o cultivo embrionário e levar à falha os
casos que estiverem em cultivo. Tudo dentro da incubadora é controlado e essas condições devem ser
medidas e mantidas diariamente.

Há condições mensuráveis que influenciam diretamente o microambiente de cultivo interno das

incubadoras, como temperatura, concentração de gases (CO2, O2 e N2), umidade (presente ou ausente) e

pH.

Concentração de gases

Os gases de cultivo são de suma importância: o CO2 mantém o pH ideal, o O2 em baixas concentrações

(próximo a 5%) evita a oxidação dos componentes do meio de cultivo, o N2 é o gás que, ao ser injetado no

microambiente da incubadora, consegue expulsar o O2 para manter a hipóxia do cultivo embrionário.

Umidade
Quanto à umidade, ela é um fator relativo. Existem incubadoras que trabalham de forma seca e existem
incubadoras que trabalham de forma úmida. O importante é que a incubadora seca não pode nunca ter
água, e a incubadora úmida não pode nunca ter seu aporte hídrico findado. Caso contrário, as condições
não se manterão dentro do ideal.

pH

Quanto ao pH, o importante é aferi-lo sempre, pelo menos, ao se trocar o lote do meio de cultivo com o qual
se trabalha. Caso o pH não esteja dentro do ideal, do fisiológico, tanto os gametas quanto os embriões
podem sofrer perdas das capacidades fisiológicas, com o ambiente demasiadamente acidificado ou
alcalinizado.

Condições não mensuráveis

Outras condições ditas não mensuráveis são igualmente importantes, como a manutenção e limpeza dos
equipamentos, das superfícies, do chão e das paredes e a troca do lixo. A limpeza dos equipamentos deve
ser feita de forma programada, e existem diferentes níveis para fazê-las.
Há processos de limpeza diários, mais simples, rápidos e focados em pontos específicos. Assim como
existem processos de limpeza semanais ou mensais que demandam dedicação temporal importante, por se
aprofundarem mais nos equipamentos ou no ambiente e, muitas vezes, exigir o desmonte de peças ou o
arraste de equipamentos.

O mesmo ocorre com a manutenção dos aparelhos, que pode seguir um esquema muito similar, com
ajustes simples que podem ser feitos de forma diária. Porém a manutenção feita por equipe especializada
com a devida calibração de ajuste dos equipamentos (e não mais só sua calibração) deve ser realizada, no
mínimo, anualmente.

Além disso, o mesmo pode ocorrer com os resíduos sólidos em saúde. Os resíduos produzidos por
procedimentos em laboratório de reprodução assistida se enquadram, segundo a RDC nº 222, de 28 de
março de 2018, nos grupos:

Grupo A expand_more
No Grupo A, estão os resíduos infectantes e subgrupo A1, devendo todo ele ser acondicionado em
saco branco leitoso com o símbolo de risco infectante. Esse resíduo deve ser retirado diariamente e
transportado em recipiente rígido, impermeável, resistente à punctura, ruptura e vazamento, com
tampa provida de controle de fechamento e identificado para deposição final.

O acondicionamento e o descarte dos resíduos do grupo A devem ser feitos em recipiente com o símbolo de infectante.

Grupo B expand_more

No grupo B, enquadram-se os resíduos químicos. As substâncias que apresentam peculiaridade

devem ser segregadas em embalagens individuais, sinalizadas por meio de símbolo e frase de risco
associados à periculosidade do resíduo químico, e devem ser submetidas a tratamento antes da
disposição final ambientalmente adequada.

Acondicionamento dos resíduos do grupo B.

Grupo E expand_more

No grupo E estão os materiais perfurocortantes, que devem ser descartados em recipientes

identificados, rígidos, providos com tampa e resistentes à punctura, ruptura e vazamento.
 Grupo D expand_more

Caso dentro do laboratório seja feita a separação de resíduos recicláveis (papel e plástico) —
pertencentes, segundo a mesma RDC, ao Grupo D —, não há necessidade de eles serem retirados
diariamente.

Os resíduos do grupo D, quando destinados à reciclagem, devem ter o símbolo indicativo no seu local de acondicionamento.

Comentário

Não temos resíduos do grupo C, pois nesse tipo de laboratório não é utilizado material radioativo.

Quais seriam as origens dos resíduos?

Os resíduos do subgrupo A1 são provenientes de restos de punções foliculares, de amostras seminais, de

meios de cultivo, enfim, de fluidos orgânicos ou de qualquer material que entre em contato com eles e que,
por isso, acabam sendo tratados como produtos de risco infectante. Os resíduos do grupo E são quaisquer
materiais perfurocortantes utilizados durante a rotina, como, por exemplo, agulhas. Os resíduos do grupo B
são os restos de cortantes empregados. Já os resíduos do grupo D compreendem papel, plástico e outras
texturas provenientes de embalagens de produtos, caixas de materiais, frascos e as mais variadas fontes.

Além desse trabalho de controle e, principalmente, da manutenção das condições ambientais e

microambientais, o trabalho do biomédico passa por outras duas vertentes extremamente importantes: o
contato com o paciente e a elaboração e liberação de laudos.

O contato com o paciente pode ocorrer em diversos momentos, a depender da rotina de trabalho da clínica
em que o biomédico se encontra. Esse contato pode ser feito antes do início do tratamento para esclarecer
as dúvidas dos pacientes que não conseguem encontrar informações acessíveis ao público leigo sobre o
assunto; para informar sobre a evolução laboratorial dos embriões; para informar sobre a qualidade dos
embriões a serem transferidos; para informar sobre o resultado de um descongelamento ou de uma biópsia
embrionária; ou para qualquer outra coisa, quando a demanda existir.

Comentário

Por isso, a qualidade que um biomédico que trabalha com reprodução humana mais deve exercitar é a
empatia. A reprodução é o momento mais íntimo de um casal, e entrar nesse meio requer muito cuidado,
muito acolhimento e muita empatia pela história de cada casal.

Já em relação à liberação de laudos, responsabilidade é a palavra de ordem. Um laudo laboratorial, mesmo

que simples, como o espermograma, pode ter um impacto gigante na conduta que o médico seguirá e no
tratamento ao qual o casal terá que se submeter. E, ainda falando de responsabilidade: um laudo de um
tratamento ou de uma análise genética equivocada pode influenciar a transferência ou o descarte do
embrião errado. Esse erro é inconcebível dentro da reprodução assistida!
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1
Qual das alternativas a seguir cita duas atividades competentes ao profissional biomédico no exercício
de sua função como andrologista ou embriologista?

A Realização de exames de gravidez e análise seminal.

B Realização do cultivo embrionário e de hemogramas.

C Realização da curva glicêmica e de análise seminal.

D Realização de análise seminal e cultivo embrionário.

E Realização do cultivo embrionário e testes genéticos.

Parabéns! A alternativa D está correta.

A análise seminal é um papel clássico do biomédico exercendo a função de andrologista, e o cultivo

embrionário é a função clássica do biomédico exercendo a função de embriologista. Na reprodução
assistida, o biomédico não realiza exames de sangue, como curva glicêmica, hemograma e teste de
gravidez, e não realiza exames genéticos; apenas faz a coleta de material de biópsia para análise
genética.

Questão 2

Diversas funções extras são atribuídas ao biomédico para que a funcionalidade do laboratório seja
garantida e para que, de forma geral, o trabalho seja entregue com total qualidade. Qual das opções a
seguir destaca as atividades necessárias para que essa qualidade no cultivo embrionário seja atingida?

A Aferição dos níveis de CO2 das incubadoras e contagem de radioisótopos ambientais.

B Aferição da umidade relativa do ar ambiental e contagem de radioisótopos ambientais.

 Verificação da temperatura das superfícies e aferição da pressão atmosférica
C
ambiental.

D Aferição do pH dos meios de cultivo e contagem de radioisótopos ambientais.

E Aferição do pH dos meios de cultivo e verificação das temperaturas das superfícies.

Parabéns! A alternativa E está correta.

O pH e a temperatura são imprescindíveis para o cultivo embrionário. O pH ideal é próximo ao pH

fisiológico do nosso organismo (geralmente, 7.3). Já a temperatura ideal também é sempre a
fisiológica, sendo 37°C a mais próxima do ideal e estável. Níveis de umidade são essenciais para a
manutenção da qualidade do ar para trabalhar e para impedir o crescimento microbiano. A pressão
atmosférica ambiental e a contagem de radioisótopos ambientais não são condições mensuráveis em
um laboratório de reprodução assistida.

Considerações finais
Ao longo deste conteúdo, passamos por diversos pontos do funcionamento de um laboratório de
reprodução assistida. Vimos sua complexa estrutura e entendemos sua dinâmica. A conclusão final a que
chegamos é: os detalhes importam.

Talvez a característica mais importante do olhar do biomédico que atua na área seja sempre esse foco nos
detalhes. Eles importam no desfecho de um caso (quando temos que olhar atentamente a qualidade do
cultivo embrionário, por exemplo), e esses detalhes podem ser simples de se perceber. Uma simples
avaliação de temperatura, de umidade, de concentração de gases ou de pH pode nos mostrar algum detalhe
que está prejudicando o bom funcionamento do laboratório.

Porém, é importante não esquecer que o detalhe está presente e é igualmente importante no fator humano
que acolhe o paciente. O respeito ao paciente, a forma humana de tratar, o entender do porquê de se fazer
 isso ou aquilo… embriologistas não são máquinas, são seres humanos, e devem agir sempre como tal. A
empatia com o paciente cria um vínculo muito importante. Além disso, embriologistas são seres pensantes,
não apenas máquinas que pipetam e injetam, transferem e congelam embriões.

Lembre-se sempre: o tratamento de reprodução ocorre quase que de maneira virtual. O paciente precisa
acreditar no que estamos realizando. Por atuarmos em nível microscópico, ninguém consegue ter certeza
do nosso trabalho — exceto nós mesmos. Sendo assim, a ética está sempre acima de tudo. Logo, o foco no
detalhe do trabalho executado garante que erros graves, como troca de amostras, nunca aconteçam.

Além disso, o laboratório é o coração de uma clínica e deve ser respeitado como tal. A qualidade final do
resultado de um tratamento está intimamente relacionada com o bom funcionamento do laboratório.

headset
Podcast
Antes de finalizarmos, o especialista Caio Werneck conversa com a especialista Vanessa Amil sobre a
carreira do biomédico na reprodução assistida, falando sobre os prós, contras e desafios dos biomédicos
embriologistas.

Explore +
Para aprofundar seus conhecimentos sobre o conteúdo:

Leia o texto Lixo Laboratorial, de Caio Werneck e Maria Cecília Cardoso, disponível no site da Sociedade
Brasileira de Reprodução Humana (SBRH), que fala mais sobre resíduos sólidos na reprodução assistida.
Acesse o site da Sociedade Brasileira de Reprodução Humana (SBRH), na seção do Comitê de
Embriologia, em que você encontra diferentes materiais sobre a legislação e novidades em reprodução
humana assistida. Vale a pena visitar!

Acesse a Resolução do CFM nº 2.294, de 27 de maio de 2021, para saber mais sobre as questões éticas
da reprodução assistida.

Referências
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 12º Relatório do Sistema Nacional de Produção de
Embriões SisEmbrio. Consultado na internet em: 17 nov. 2021.

CAETANO, J. P. J. et al. Medicina Reprodutiva – SBRH. São Paulo: Segmento Farma, 2018.

DONAIDO, N. F. et al. Reprodução Assistida e Genética – SBRH. São Paulo: Segmento Farma, 2021.

DUARTE, R. L. Procedimento Operacional Padrão: A Importância de se Padronizar Tarefas nas BPLC.

Consultado na internet em: 17 nov. 2021.

MATOS, F. Brasil lidera ranking da América Latina em reprodução assistida, aponta levantamento.
Sociedade Brasileira de Reprodução Assistida. SBRA. 2019. Consultado na internet em: 17 nov. 2021.

MEDICINA S/A. Investimento em genética expande mercado de reprodução assistida. Consultado na

internet em: 17 nov. 2021.

MOORE, K. L.; PERSAUD, T. V. N.; TORCHIA, M. G. Embriologia Clínica. 11. ed. Guanabara Koogan. 2020.

NAZARI, S. et al. Maturation capacity, morphology and morphometric assessment of human immature
oocytes after vitrification and in-vitro maturation. Iranian Journal of Reproductive Medicine, v. 9, n. 3, p. 209-
216, 2011.

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Investigação da infertilidade e propostas de tratamento
Prof.ª Rejane Cristina Malavazzi Casare

Descrição

Prática clínica da infertilidade: conceitos, fatores, diagnóstico e tratamento.

Propósito

Compreender os conceitos e os principais fatores de infertilidade feminina, masculina e do casal é

importante para investigar e identificar a causa da infertilidade e decidir pelos melhores tratamentos.

Objetivos

Módulo 1

Infertilidade
 Reconhecer os conceitos, os fatores e o diagnóstico da infertilidade.

Módulo 2

Tratamento da infertilidade
Identificar os diferentes tipos de tratamento para a infertilidade.

Introdução
Em 25 de julho de 1978, nasceu Louise Brown, a primeira criança concebida por fertilização in vitro
(FIV) da história. Junto com ela, nascia um novo mundo de possibilidades e esperança para muitos
casais inférteis que sonhavam com filhos biológicos.

A partir da década de 1980 e ao longo dos anos, o avanço da reprodução assistida mudou o futuro
de milhares de famílias, permitindo a gestação àqueles que não podiam conceber naturalmente. A
tecnologia possibilitou diagnóstico mais eficiente e fez com que os fatores relacionados à
infertilidade, tanto da mulher quanto do homem, fossem diagnosticados e tratados de forma mais
eficaz e direcionada.

Neste conteúdo, vamos conhecer os principais conceitos, fatores, diagnóstico e os possíveis

tratamentos para infertilidade.

Orientação sobre unidade de medida

Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de
tecnologia e didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número
e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem
seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades.
1 - Infertilidade
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer os conceitos, os fatores e o diagnóstico
da infertilidade.

Infertilidade: principais conceitos

A infertilidade pode ser definida como ausência de gestação em 12 meses ou mais de relações sexuais
frequentes (no mínimo, duas vezes na semana) sem o uso de qualquer método anticoncepcional.

Estima-se que 15% da população mundial tenha problemas para engravidar. Dados de setembro de 2020,
publicados pela Organização Mundial da Saúde, sugerem que 48 milhões de casais e 186 milhões de
indivíduos sofrem de infertilidade no mundo todo (OMS, 2020).

A infertilidade é dividida em:

Infertilidade primária

É a ausência de gestação clínica. Ela pode ser problema do casal (de um indivíduo ou de ambos). Por
exemplo, o casal nunca engravidou e a mulher nunca ficou grávida de outro parceiro: infertilidade
primária do casal e da mulher. O casal nunca engravidou e o homem nunca engravidou de outra parceira:
infertilidade primária do casal e do homem.

Infertilidade secundária

É a incapacidade de levar uma gestação a termo após ter tido gestações clínicas anteriores (com ou sem
sucesso). Nesse caso, consideramos infertilidade do casal e dos parceiros separadamente.
estação a termo
É o período da gravidez em que o bebê se encontra pronto para nascer, ou seja, com todos os órgãos
amadurecidos. Consideramos uma gestação a termo a partir das 38 semanas.

Veja alguns exemplos de tipos de infertilidade:

Infertilidade secundária do casal

Um casal que já engravidou junto e, independentemente do desfecho (parto ou abortamento),

não conseguiu chegar à gestação a termo.

Infertilidade primária do casal e secundária da mulher

Um casal que nunca engravidou junto (infertilidade primária do casal), mas a mulher já teve
uma gestação de outro parceiro (infertilidade primária do casal e secundária da mulher).

Infertilidade primária do casal e secundária do homem

Um casal que nunca engravidou junto (infertilidade primária do casal), mas o homem já
engravidou outra parceira (infertilidade primária do casal e secundária do homem).

Infertilidade primária do casal e secundária do homem e da mulher

O casal nunca engravidou junto, mas ambos têm filhos de gestações anteriores (infertilidade
primária do casal e secundária do homem e da mulher).
É importante destacar alguns termos importantes relacionados à infertilidade:

Fecundabilidade

É a probabilidade de alcançar uma gestação em um ciclo menstrual (em torno de 20%).

Fecundidade

É a capacidade de alcançar uma gestação a termo em um ciclo menstrual (em torno de 15%).

Estéril

Quando um dos parceiros apresenta incapacidade de conceber, como a mulher que não tem útero ou o
homem que apresenta microcalcificações testiculares.

Subestéril

Quando é possível reverter o caso, por exemplo a mulher que tem como causa de infertilidade problemas na
ovulação ou o homem que apresenta problemas hormonais ou na mobilidade dos espermatozoides.

Fatores da infertilidade
A infertilidade pode ser feminina, masculina ou do casal.

Mas o que causa a infertilidade?

Existem diferentes fatores tanto nos homens como nas mulheres que são responsáveis por causar a
infertilidade. Além disso, eles podem também ser uma soma de fatores (mistos) e não ter causa aparente.
 Vejamos com mais detalhes os casos femininos e masculinos.

Fatores da infertilidade feminina

Para entender a fisiologia feminina, é preciso compreender num primeiro momento a fisiologia ovariana e o
ciclo menstrual feminino, por isso não deixe de assistir ao vídeo a seguir.

video_library
Fisiologia hormonal e ciclo menstrual feminino x
infertilidade
Neste vídeo, a especialista irá explicar fatores importantes da fisiologia hormonal que podem levar à
infertilidade feminina.

Além da fisiologia hormonal, precisamos também conhecer outros fatores

relacionados à infertilidade feminina. Vejamos.

Fator uterino
Dizemos que a infertilidade feminina se deve a um fator uterino, quando encontramos alterações
especialmente na anatomia do útero que podem atrapalhar a fertilidade. Essas alterações podem ocorrer
por diferentes causas:

Miomas expand_more
 São tumores benignos formados por tecido muscular liso. Estima-se que 80% das mulheres em
idade fértil tenham miomas em algum momento da vida (BRASIL, 2019). Eles podem ser
classificados de acordo com a sua localização, conforme observamos na imagem a seguir:

Esquema comparando um útero normal (esquerda) e um útero com mioma (direita).

Cada tipo de mioma apresenta uma relação com a fertilidade. Vamos entender melhor:

Miomas subserosos: são exteriores ao útero e podem ser pediculados, ou seja, ligados ao útero por
um pedículo vascular. Em geral, não causam prejuízo à fertilidade ou à qualidade de vida. Podem ser
vistos em exames de imagem (ultrassonografia, ressonância etc.) ou percebidos no exame clínico
físico (quando são muito grandes). De modo geral, não precisam ser abordados, exceto os miomas
gigantes.

Miomas intramurais: apresentam a maior porção localizada no músculo uterino (miométrio) e, como
principal consequência, causam dismenorreia (cólica menstrual). Podem ter componentes serosos,
quando abaúlam a serosa uterina, ou seja, a membrana que recobre externamente o útero (neste
caso, sem prejuízo à fertilidade). Quando têm componentes submucosos, distorcem o endométrio
(camada que recobre internamente o útero) e comprometem a fertilidade.

Miomas submucosos: são os que mais atrapalham a fertilidade, já que sua maior porção se localiza
dentro da cavidade uterina, abaulando-a. A irregularidade causa uma distorção na anatomia do útero,
além de alterar a vascularização local. O tumor ainda funciona como um corpo estranho,
estimulando o sistema imunológico. Tudo isso impede o embrião de nidar. Se possível, devem ser
abordados cirurgicamente via histeroscopia antes da transferência embrionária.

baúlam
É o sinônimo de curvar, dobrar, arredondar e arquear.

idar
Refere-se ao momento de implantação de um embrião de mamífero na parede uterina que ocorre durante a
blástula.

isteroscopia
É a inspeção endoscópica do interior do útero. Permite a avaliação de alterações anatômicas e funcionais do
endométrio/endocérvice como vascularização, espessura, fase do ciclo, concentração glandular e presença de
sinais indicativos de infecção.

Malformações mullerianas expand_more

Este fator de infertilidade feminina decorre de defeito na formação do aparelho genital que ocorre
por volta da 12ª semana de gestação. A incidência varia entre 3% e 5% na população geral, mas, se
considerarmos mulheres que tiveram abortamentos recorrentes, pode chegar a 25% (FEDERAÇÃO,
2019).

Malformações mullerianas.

A única malformação mulleriana que deve ser abordada cirurgicamente é o septo uterino, por via
histeroscópica, sem prejuízo à fertilidade da mulher. Outras malformações como útero didelfo, útero
bicorno ou útero unicorno não podem e nem devem ser corrigidas.

Úteros arqueados são apenas variações da anatomia uterina habitual, não precisam ser abordados e
não atrapalham a fertilidade. As tentativas de unificar úteros bicornos resultaram em reduções
importantes do tamanho da cavidade endometrial e presença de grande área de fragilidade da
musculatura uterina, favorecendo a ruptura (rotura) do útero em caso de gestação.

Mulheres com malformações mullerianas podem engravidar, inclusive naturalmente. Entretanto,

devem ser orientadas quanto ao aumento de riscos no trabalho de parto prematuro, abortamento,
entre outros.
 Geralmente, a presença dessa malformação está associada a alterações no sistema urinário e,
nesses casos, devem ser investigadas conjuntamente.

Sinéquias expand_more

São colamentos (aderências) entre as paredes uterinas. Geralmente são cicatrizes formadas por
manipulação cirúrgica prévia, como curetagens, ablação endometrial e histeroscopias. Devem ser
corrigidas por meio de histeroscopia, pois, assim como os miomas submucosos e os septos
uterinos, qualquer fator que modifique a anatomia da cavidade uterina interfere na capacidade de
implantação embrionária.

Útero normal (esquerda) e sinéquias uterinas (direita).

Pólipo expand_more

É um prolongamento do endométrio que forma uma estrutura alongada que se projeta para dentro
da cavidade uterina. Geralmente tem uma artéria central irrigando sua estrutura. Pela irregularidade
do endométrio, essa patologia pode causar aumento do fluxo menstrual (pela maior superfície de
sangramento), infertilidade e até abortamento. O pólipo deve ser, portanto, retirado. Além do
prolongamento do endométrio, outros pólipos podem ser observados, conforme se vê na figura a
seguir:
 Pólipos uterinos e endometriais.

Fator tubo-peritoneal

Caracterizado pela alteração da permeabilidade ou motilidade das trompas, o fator tubo-peritoneal pode ser
causado por doença inflamatória pélvica (DIP), que em muitos casos são assintomáticas. Além disso,
cirurgias prévias como apendicectomia (cirurgia para tratar apendicite) e retirada de cistos ovarianos podem
ocasionar aderências (cicatrizes no peritônio) e prejudicar a motilidade tubária.

Doença inflamatória pélvica é causada por microrganismos.

Outro fator tubo-peritoneal, também chamado de peritoneal, é a endometriose. Ela se caracteriza pela
presença do endométrio (tecido que reveste o interior do útero) fora da cavidade uterina, causando
aderências na pelve como se fosse uma cola. Além disso, pode fazer com que órgãos “grudem” uns nos
outros, ocasionando obstrução das trompas e alterando a estrutura da pelve.

Saiba mais

Em muitos casos, os sintomas são desproporcionais à doença, então uma paciente pode ter poucos
sintomas, mas doença bastante avançada e vice-versa.
 Endometriose.

Fator cervical

Quando são observadas alterações no canal vaginal ou na produção do muco cervical, é importante verificar
a presença de estenose (estreitamento) ou irregularidades no canal cervical — como abaulamentos
ocasionados pelo aparecimento de miomas cervicais.

Essas irregularidades uterinas podem ser consequência de cirurgias prévias no colo, como a cirurgia de alta
frequência (CAF), muito empregada para tratar alterações cervicais como lesões precursoras de cânceres
do colo do útero.

Curetagens por abortamentos ou pós-parto também podem lesar o colo.

Atenção!

Na ausência de alterações cervicais físicas (abaulamentos e estenoses), o fator cervical causado por
problemas na produção do muco é o mais difícil de ser detectado, pois o muco cervical está relacionado
com a interação com o espermatozoide e, assim, é necessário realizar testes mais específicos.
Fator ovulatório

Existem diferentes disfunções na ovulação. Hoje vamos aprender dois tipos. Na síndrome do folículo não
roto (LUF), o folículo ovariano é recrutado, cresce, mas não rompe. Pode ser comum em mulheres com
endometriose. Já a síndrome dos ovários policísticos (SOP) é uma das causas de infertilidade mais
conhecidas e prevalentes, cursa com alterações hormonais que levam ao não recrutamento folicular e à
anovulação (ausência de ovulação).

Síndrome dos ovários policísticos (SOP).

Saiba mais

Segundo a Federação Brasileira das Associações de Ginecologia e Obstetrícia (Febrasgo), na população

brasileira essa disfunção ovariana é encontrada entre 6% e 16% das mulheres (FEDERAÇÃO, 2019).

Para o correto diagnóstico da SOP, usamos os critérios de Rotterdam, em que é necessária a presença de
dois entre os três critérios expostos a seguir:

Anovulação crônica (ciclos hipomenorreicos) expand_more

Ausência de menstruação por 90 dias ou mais ou ocorrência de menos de nove ciclos menstruais
em um ano.
 Ovários policísticos à ultrassonografia expand_more

Mais de 10 folículos antrais ou volume ovariano maior que 12 cc.

Esta ultrassonografia mostra mais de 10 folículos antrais em uma paciente com SOP — na foto, estão representados pelas bolhas com
líquido.

Hiperandrogenismo (ou excesso de androgênios) clínico ou laboratorial expand_more

Tem prevalência entre 5% e 10% da população feminina em idade fértil (FEDERAÇÃO, 2019). Quando
presente, o hirsutismo é o melhor e mais confiável marcador de hiperandrogenismo. Além disso, a
maioria das pacientes que desenvolvem SOP, apresentam acne, alopecia com padrão androgenético
e virilização. A SOP pode estar associada a outras alterações sistêmicas como acantose nigricans,
ou seja, a presença de manchas escurecidas no pescoço, na axila e virilha.

c
Centrímetros cúbicos, unidade de medida volumétrica.

irilização
Aparecimento de características masculinas exageradas, mas esse sinal clínico é mais raro.

adrão androgenético
Queda mais acentuada na região frontal do couro cabeludo e menos nas regiões laterais e posterior, como é o
padrão mais prevalente de calvície nos homens.
lopecia
Queda de cabelo.

irsutismo
Crescimento de pelos indesejáveis no peito e nas costas e o aparecimento de acne.

Fatores da infertilidade masculina

A infertilidade masculina é causada por problemas seminais. Estima-se que a incidência de

oligozoospermia grave e azoospermia cheguem a 12% de toda a população masculina infértil
(PASQUALOTTO, 2007).

Veja algumas condições que podem acometer a fertilidade masculina:

ligozoospermia
Baixa contagem de espermatozoides (inferior a 15 milhões de espermatozoides/mL). É considerada grave
quando a contagem é inferior a 5 milhões de espermatozoides/mL.

zoospermia (Astenozoospermia)
Motilidade insuficiente.

Doenças
O it ( l b ) i f õ i l ( i b l t l) t
 Orquites (por exemplo, caxumba), infecções, varicocele (varizes na bolsa escrotal) etc.

Injúrias

Traumas diretos, torções etc.

Quimioterapia

Interfere no crescimento e na multiplicação dos espermatozoides. Após o tratamento

quimioterápico, a produção de esperma diminui ou para completamente. O risco de
infertilidade nos homens após a quimioterapia depende da idade, do tipo de medicamento
utilizado e da dose administrada.

Radioterapia

Utiliza radiação ionizante para destruir as células cancerígenas. Dependendo do local da

incidência de radiação, como, por exemplo, no tratamento do câncer de testículo, em que a
radiação é feita diretamente nesse órgão, ocorrendo a eliminação das células cancerígenas e
das células que originam os espermatozoides.

Fatores externos

Algumas substâncias inalatórias voláteis (por exemplo, agrotóxicos) podem causar

problemas seminais, assim como atividade física extenuante, criptorquidia (testículo intra-
abdominal), uso de esteroides e hormônios masculinos, vasectomia etc.
 Fatores genéticos

A fibrose cística ou microdeleções do cromossomo Y (pequenas deleções dos genes no

cromossomo Y).

A microdeleção do cromossomo Y ocorre no braço longo desse cromossomo, com destaque para a região
Yq, que contém genes importantes para a espermatogênese e apresenta sub-regiões denominadas AZFa,
AZFb e AZFc. Na figura a seguir, vemos um esquema do cromossomo Y.

Estrutura do cromossomo Y. Note as sub-regiões AZFa, AZFb e AZFc.

Quaisquer deleções nessas sub-regiões diminuem a probabilidade de espermatozoides viáveis no testículo.

No entanto, o local das deleções é determinante, como veremos a seguir.

Microdeleções na sub-região AZFa expand_more

Levam à azoospermia, com ausências de células germinativas nos testículos e apenas células de
Sertoli, uma condição chamada de síndrome das células de Sertoli (SO). Além disso, homens com
essa microdeleção apresentam concentração plasmática de hormônio luteinizante (LH) e
testosterona normais, mas concentração de hormônio folículo estimulante (FSH) elevada. Lembre-se
de que o FSH atua nas células de Sertoli, localizadas nos túbulos seminíferos, induzindo o
crescimento e a produção de secreções necessárias para a espermatogênese.

Microdeleções na sub-região AZFb expand_more

 Causam a interrupção da meiose I durante a espermatogênese, não ocorrendo a produção de
espermatozoides. Assim, as células germinativas param em espermátides primárias.

Microdeleções na sub-região AZFc expand_more

É a deleção mais comum entre os homens inférteis, mas não é muito grave. Homens com essa
deleção apresentam diminuição na espermatogênese, podendo ocorrer oligozoospermia severa ou
até azoospermia com poucas espermátides maduras ou células de Sertoli no tecido testicular. No
entanto, é possível encontrar espermatozoides viáveis no testículo. Uma opção para homens com
essa alteração genética, seria realizar a biópsia do testículo para obter espermatozoides viáveis.

Além de deleções no cromossomo Y, a fragmentação do DNA espermático está intimamente relacionada

com a diminuição da fertilidade, afetando a qualidade e a função dos espermatozoides. A integridade do
DNA também é importante para o desenvolvimento normal do embrião. As razões para essas alterações
ainda não estão esclarecidas, mas estudos mostram que há perda do potencial reprodutivo do sexo
masculino com o passar da idade.

Além disso, o estresse oxidativo, resultante do aumento da produção de espécies reativas de oxigênio ou
reservas baixas de antioxidantes, é responsável pela maior parte da fragmentação do DNA. O dano ao DNA
também pode estar relacionado a mutações e aneuploidias resultantes das alterações na disjunção
cromossômica e da segregação meiótica.

Investigação da infertilidade
Normalmente, falamos em infertilidade do casal e dos parceiros separadamente, mas sempre que possível
devemos abordar a investigação de ambos os parceiros, visto que a causa da infertilidade pode ser
multifatorial. Assim, o ideal é realizar a pesquisa simultaneamente, verificando tanto os fatores femininos
quanto os masculinos.

Saiba mais

Muitas vezes o diagnóstico de infertilidade afeta o casal, levando-os a sentimentos de impotência, raiva,
negação, depressão, tristeza e provocando discórdia. Por esse motivo, é muito importante uma abordagem
multiprofissional visando ao acolhimento.
 Quando devemos iniciar a investigação da infertilidade?

Na mulher, a idade é, isoladamente, o fator determinante do sucesso do tratamento. Ainda hoje, é o melhor
indicador de qualidade oocitária. Por esse motivo, a idade da mulher determina a quantas tentativas ela
deve se expor antes de iniciar as investigações ou procurar um especialista.

Casais cujas mulheres têm até 35 anos devem iniciar a investigação após 12 meses de tentativas de
gravidez sem sucesso. Já casais cujas mulheres têm entre 35 e 39 anos são aconselhados a fazer os
exames após 6 meses de tentativas. Recomenda-se que mulheres de 40 anos ou mais procurem um
especialista assim que manifestar o desejo reprodutivo.

Os homens, diferentemente das mulheres, têm produção constante de espermatozoides, o que leva em
torno de 70 dias. O relato de tentativas em relacionamentos anteriores e de dificuldades de gestação deve
ser valorizado.

Atenção!

As investigações podem iniciar imediatamente nos casos em que o casal, mesmo jovem, tenha fatores de
risco para infertilidade, como a baixa reserva ovariana, ooforectomia (retirada cirúrgica do ovário) unilateral,
endometriose grave, cirurgia ovariana, história familiar de insuficiência ovariana precoce, quimioterapia
prévia ou história de irradiação.

Investigação da infertilidade feminina

Dosagem hormonal

A investigação da infertilidade feminina inicia com exames laboratoriais de sangue. Para isso, devemos
coletar o sangue periférico para dosagem hormonal durante o segundo e o quarto dia do ciclo menstrual,
mais preferencialmente no terceiro dia.

Aqui é importante lembrar que o ciclo menstrual inicia no primeiro dia da menstruação e é nesse dia que
ocorre o recrutamento folicular para ovulação. Após a ovulação, inicia-se a fase lútea, que sempre dura 14
dias. Se a mulher não engravidou nesse ciclo, ela tem que, obrigatoriamente, menstruar 2 semanas após a
ovulação. O que determina a duração do ciclo menstrual é a fase folicular, ou seja, quanto tempo demora o
recrutamento, a maturação e a rotura folicular.
 Nos casos de ciclos irregulares com tendência a oligomenorreia (pouca ou nenhuma menstruação) e data
da última menstruação (DUM) superior a 35 dias, o sangue deve ser coletado imediatamente e não esperar
a mulher menstruar, pois ela pode ter distúrbios hormonais.

Os anticoncepcionais alteram o resultado dos exames, portanto, é necessário que a

mulher interrompa seu uso por pelo menos 40 dias.

Na avaliação hormonal são dosados os hormônios FSH, estradiol, LH e progesterona. Vamos conhecê-los.

Dosagem de FSH expand_more

O hormônio FSH é liberado pela hipófise anterior em resposta ao hormônio GnRH produzido pelo
hipotálamo. Ele atua nos ovários estimulando o crescimento folicular, que passa a liberar estradiol. À
medida que a concentração de estradiol aumenta, ocorre, por feedback negativo, a redução dos
níveis de FSH. A dosagem de FSH com valores superiores a 10-12mUI/mL no início do ciclo pode
indicar reserva ovariana já em declínio. Além disso, quanto maior o FSH no início do ciclo, maior o
“esforço” do organismo para ovular o único óvulo.

Mulheres na menopausa apresentam altos níveis de FSH, geralmente acima de 30pg/ml.

enopausa
É um marco temporal e retroativo, caracterizado pela ausência de sangramento vaginal por 1 ano completo.
Normalmente, as mulheres apresentam altos níveis de gonadotrofinas e baixos níveis de estradiol e
progesterona.`
 Dosagem de estradiol expand_more

O hormônio estradiol aumenta progressivamente com o desenvolvimento folicular, passando de 40-

60pg/mL na fase inicial do ciclo menstrual e chegando entre 200 a 400pg/mL no período pré-
ovulatório. No útero, o estradiol liberado pelos ovários estimula a proliferação gradativa do
endométrio (camada de revestimento uterino interno), que no período menstrual tem espessura de
até 4mm e aspecto ecogênico (esbranquiçado) ao ultrassom (US). Os valores de referência variam
entre os laboratórios, mas normalmente as dosagens de estradiol devem estar entre 22pg/mL e
218pg/mg na fase menstrual/folicular; e, entre o segundo e quinto dia, 40pg/mL. Durante o período
ovulatório, entre 40,3 e 511,3pg/mL; e, na fase lútea, entre 25,3 e 288,6pg/dL. Mulheres na
menopausa sem reposição hormonal apresentam valores menores que 47pg/mL. O estradiol menor
que 7pg/mL indica baixa reserva ovariana, quando verificado entre o segundo e o quinto dia.

Dosagem de LH expand_more

Assim como o FSH, o hormônio LH é produzido em resposta ao GnRH e atua nos ovários. Níveis de
estrogênio acima de 200pg/mL por mais de dois dias desencadeiam o pico do LH, que leva à
retomada da meiose pelo oócito e à digestão da membrana celular, liberando-o (ovulação). Qualquer
alteração na dosagem do LH indica ausência de ovulação.

Dosagem de progesterona expand_more

Após a ovulação, nos ovários forma-se o corpo lúteo, cuja função é produzir progesterona
(principalmente) e estrogênio durante sete a oito dias após a ovulação. A progesterona é
responsável por preparar o útero para a implantação e a nutrição do embrião até a formação da
placenta. Caso a fecundação não ocorra, o corpo lúteo perde sua função secretora, involui e se
transforma no corpus albicans, que eventualmente será reabsorvido. Na fase folicular, a dosagem
deve estar entre 0,10-1,6ng/mL; na fase lútea entre 2,5-32ng/mL; na menopausa, entre 0,06-
1,6ng/mL; e na gravidez >250ng/mL.

Saiba mais
Como distúrbios de tireoide e prolactina podem cursar com irregularidade menstrual, é importante também
realizar a dosagem de prolactina e hormônios tiroidianos (TSH e T4).
 Dosagem de prolactina expand_more

Hormônio produzido pela hipófise anterior após estimulação do GnRH que atua nas mamas. O ideal
é que a prolactina seja menor que 25ng/mL, entretanto, valores entre 40 e 60ng/mL podem ser
aceitáveis. Pacientes com prolactina elevada (hiperprolactinemia) podem apresentar quadros de
infertilidade pelo bloqueio da ovulação, hipogonadismo, galactorreia (saída de secreção pelos ductos
mamários) e osteopenia.

Normalmente, o aumento da prolactina está relacionado à utilização de medicamentos como

neurolépticos, antidepressivos tricíclicos, alguns anti-hipertensivos, medicamentos de ação
gastrointestinal e alguns inibidores seletivos da recaptação da serotonina. Ainda, algumas drogas
ilícitas como heroína, cocaína, anfetamina e morfina podem aumentar a produção de prolactina.

Dosagem de hormônios tiroidianos (TSH e T4 livre) expand_more

Na mulher, o hipertireoidismo é comumente associado à irregularidade menstrual. Já o

hipotireoidismo costuma levar à oligomenorreia (ciclos longos) e à anovulação. Tanto o hiper quanto
o hipotireoidismo causam amenorreia (alterações de fluxo menstrual). O hipotireoidismo não tratado
durante a gestação aumenta o risco de aborto espontâneo, trabalho de parto prematuro, sofrimento
fetal, hipertensão induzida pela gestação, descolamento prematuro da placenta e baixo peso do
recém-nascido.

Ultrassonografia pélvica transvaginal

A ultrassonografia pélvica transvaginal (USTV) permite uma boa avaliação do fator uterino. Miomas, pólipos,
malformações uterinas e cistos de ovário podem ser diagnosticados nesse exame, além do padrão do
endométrio.
 Ultrassonografia transvaginal mostrando mioma uterino subseroso com 5cm de diâmetro.

Saiba mais
A USTV permite melhor avaliação dos órgãos pélvicos femininos (útero e ovários) quando comparada à
ultrassonografia via transabdominal.

A USTV pode ser realizada de forma seriada para avaliar os padrões ovulatório e endometrial. Para isso, a
primeira USTV deve ser feita entre o 10º e o 12º dia do ciclo e repetida periodicamente a cada um ou dois
dias até a rotura folicular.

Na análise do ciclo ideal, vemos o endométrio espessar-se e adquirir o padrão trilaminar perto da ovulação.
O folículo rompe quando atinge o diâmetro médio entre 20 e 24mm, geralmente. Nesse período, é
interessante que o endométrio tenha, pelo menos, 7mm. Após a ovulação, o endométrio adquire uma
aparência luteinizada (esbranquiçada) pela presença abundante de glicogênio nas células. Em caso de
fecundação e nidação, o glicogênio fornece o aporte energético para o embrião.

Atenção!
Para avaliação de reserva ovariana, é interessante realizar o USTV no período correspondente à fase lútea
final até a fase folicular inicial (três dias antes de menstruar ou até o 5º dia do ciclo).

Na avaliação da infertilidade durante a USTV, vamos detectar apenas fatores uterinos ou ovulatórios, não
sendo esse um exame de escolha para a investigação da infertilidade por fatores tubários.

Histerossalpingografia (HSG)

Este é o único exame que permite avaliar a permeabilidade tubária — se as trompas estão livres e abertas
para a captação do óvulo. Entretanto, não existe exame capaz de avaliar a funcionalidade das trompas, ou
seja, se elas são realmente capazes de captar o óvulo e levá-lo fecundado até o útero.

O exame deve ser realizado até o 10º dia do ciclo (sempre antes da ovulação), mas sem que a mulher esteja
menstruada. Em casos de atraso menstrual, a possibilidade de gestação deve, obrigatoriamente, ser
descartada, pois pode levar a um possível abortamento ou gravidez ectópica.

Para o exame, injeta-se um contraste iodado pelo canal cervical, que preenche a cavidade uterina e
extravasa pelas trompas. Ao mesmo tempo, é feita radiografia da região para avaliar o trajeto do contraste
(verificando o aparelho reprodutor feminino). Durante o exame, a aplicação do contraste pode causar
desconforto, como uma cólica menstrual forte. Uma opção é realizar o exame sob sedação.

Cuidado com mulheres que têm alergia a frutos do mar, elas podem ser alérgicas a
iodo também e sofrer reações ao contraste.

Com esses exames em mãos, pode-se identificar o fator de infertilidade e considerar tratamento ou
encaminhamento para o especialista.

Exames adicionais

Existem ainda exames adicionais que podem ser feitos na mulher. Vamos conhecê-los?

Dosagem do hormônio anti-Mulleriano (AMH) expand_more

É o indicador mais confiável de reserva ovariana disponível na atualidade. O AMH é uma substância
produzida pelas células da granulosa de folículos de até 6mm de diâmetro. Assim, quanto mais
óvulos, mais folículos antrais, mais células da granulosa, portanto, maior serão os níveis de AMH.
Diferentemente das outras dosagens hormonais (como FSH, LH e estradiol), não há necessidade de
fazer o exame em uma época específica do ciclo menstrual. Entretanto, anticoncepcionais podem
alterar o exame em até 20%. O ideal é suspender seu uso para dosagem mais fidedigna. A
interpretação é feita de acordo com um gráfico que mostra faixas de reserva adequada, alta ou baixa
de acordo com a idade.

Dosagens de androgênios (hormônios masculinos: androstenediona, 17 hidroxiprogesterona,

estosterona total e frações) expand_more

Essa dosagem é importante para atender ao critério utilizado para o diagnóstico de SOP, mas lembre-
se de que deve ser verificada também a ovulação e ser realizada a ultrassonografia para avaliação
dos folículos. Nos casos de SOP, há uma elevação desses hormônios (hiperandrogenismo). No
 entanto, esse aumento também é verificado em outras doenças como hiperplasia adrenal congênita,
tumor adrenal, câncer de ovário e adenoma de hipófise.

Dosagens do marcador tumoral Ca-125 expand_more

É um marcador de injúria peritoneal. Esse marcador pode estar aumentado em doenças como cisto
ovariano (em casos de malignidade, os valores podem dobrar) e na endometriose. O Ca-125 não é
um bom marcador para diagnóstico de endometriose, mas pode ser dosado durante o
acompanhamento após a cirurgia de remoção do tecido endometrial, por exemplo.

Ressonância nuclear magnética da pelve expand_more

Pode ser uma importante aliada na avaliação do fator uterino, como miomas e malformações
Mullerianas, e do fator de infertilidade do tubo-peritoneal, como no estadiamento da endometriose
quando o US de mapeamento não foi suficiente.

Mapeamento da endometriose expand_more

Trata-se de uma US transvaginal com preparo intestinal para procurar endometriose profunda. Pode-
se realizar esse exame adicional na suspeita clínica de endometriose (infertilidade associada a
cólicas menstruais, especialmente as que vão aumentando de intensidade conforme o tempo) ou na
presença de alterações de outros exames como o US transvaginal, a histerossalpingografia ou a
dosagem de Ca-125. O mapeamento da endometriose é um exame operador dependente; por esse
motivo, o ideal é realizá-lo com pessoa especializada e experiente, já que as alterações vistas podem
ser bastante sutis. O exame apenas detecta alterações causadas pela endometriose profunda (graus
III e IV), lesões que realmente causam distorções, como aderências, espessamentos em ligamentos,
invasão de órgãos como vagina, alças intestinais, bexiga etc., endometriomas e kissing ovaries.

É importante relatar que a ausência de lesões sugestivas de endometriose nos exames de imagem,
seja no mapeamento ou na ressonância, não exclui a presença de endometriose! A endometriose
leve é detectada somente em cirurgia, idealmente videolaparoscópica.

Videolaparoscopia expand_more
 É indicada na presença de achados compatíveis com fatores tubários ou doenças pélvicas:
endometriose, DIP, gestação ectópica prévia e infertilidade sem causa aparente (ISCA) de mais de
dois anos, especialmente em casais jovens. Durante a videolaparoscopia, pode-se realizar a
cromotubagem intraoperatória, um exame com o mecanismo semelhante à histerossalpingografia,
ou seja, o azul de metileno é injetado pelo canal cervical durante a cirurgia e espera-se o corante sair
pelas trompas sob visualização direta de obstruções ou dilatações.

A principal vantagem da videolaparoscopia é a possibilidade de corrigir possíveis fatores durante o

intraoperatório, como aderências, implantes de endometriose, salpingoplastia (recuperação das
trompas), salpingectomia (remoção das trompas de falópio) ou hidrossalpinge (para retirada de
líquido nas trompas). Esses fatores reduzem em 30% a chance de gestação do casal, mesmo em
terapias de alta complexidade.

ndometriomas
Cistos de endometriose de coloração marrom ou "achocolatada" por conter sangue envelhecido.

issing ovaries
Ovários aderidos e unidos na face posterior do útero, como se estivessem se beijando.

Investigação da infertilidade masculina

Como já vimos, a infertilidade masculina normalmente é causada por problemas seminais. O principal
exame para a investigação da infertilidade masculina é o espermograma, que fornece dados da
espermatogênese e da permeabilidade do trato reprodutivo, ou seja, se há alguma obstrução que impede a
passagem do espermatozoide. Entre as análises realizadas por esse exame, destacam-se: volume,
concentração (contagem total e de leucócitos), motilidade, morfologia dos espermatozoides e pH.

Alguns testes realizados no espermograma.

Em caso de alteração no espermograma, deve-se solicitar um novo exame com intervalo de três meses para
reavaliar os padrões, que podem ser transitórios ou permanentes. É importante relatar que nem sempre as
alterações no espermograma são encontradas de forma isolada, é comum que o homem tenha dois ou mais
parâmetros alterados.

Persistindo a alteração, o andrologista ou urologista deve ser consultado para aprofundar a investigação
com alguns exames adicionais, como ecografia de bolsa escrotal (que investiga, por exemplo, a varicocele),
exames de sangue para análise do padrão hormonal (FSH, LH e testosterona), teste de capacitação e até
mesmo uma avaliação genética.

Atenção!
Sempre que o espermograma apresentar resultados anormais e antes da realização da reprodução
assistida por causa da infertilidade masculina, deve-se realizar o teste de capacitação, que avalia a
quantidade e a qualidade dos espermatozoides recuperados.

Vale lembrar que os espermatozoides ejaculados só são capazes de fecundar o

ovócito após certas modificações na sua estrutura que ocorrem no trato
reprodutivo feminino, no processo chamado de capacitação espermática.

No entanto, às vezes, os espermatozoides em contato com as secreções do trato genital feminino

apresentam modificações ou remoções de componentes da membrana, desestabilizando a membrana
plasmática e impedindo a sua fusão com o oócito e, assim, a fecundação.

Acompanhe a seguir algumas etapas do teste de capacitação.

Os espermatozoides são colocados em condições que mimetizem o ambiente encontrado no

aparelho reprodutor feminino.

Após um período, é verificada a quantidade de espermatozoides móveis presentes na

amostra.
 A quantidade de espermatozoides móveis recuperados vai indicar a real fertilidade do
homem, uma vez que a motilidade após a capacitação indica que esses são os gametas
capazes de fecundar os ovócitos.

Além disso, dependendo da concentração final dos espermatozoides móveis recuperados,

consegue-se definir qual técnica de reprodução assistida será empregada — inseminação
artificial intrauterina ou fertilização in vitro (FIV).

Saiba mais
Normalmente, se, após o teste de capacitação, forem recuperados menos que 5 milhões de
espermatozoides móveis/mL, é indicada fertilização in vitro. Além disso, a injeção intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI) trouxe uma possibilidade de gestação com o próprio material genético para homens
com fator masculino importante.

Podemos realizar também alguns testes complementares, como os testes genéticos para a verificação da
microdeleção do cromossomo Y e da fragmentação do DNA. Para a verificação da microdeleção do
cromossomo Y, é solicitado um exame para avaliar o cariótipo sempre que o paciente apresentar
azoospermia ou oligozoospermia grave.

Saiba mais

Também é possível investigar a fragmentação do DNA espermático com técnicas como a de Tunel, teste do
cometa e dispersão da cromatina, por exemplo.

Podemos ainda realizar a dosagem de alguns hormônios, por exemplo, a dosagem plasmática dos
hormônios tireoidianos (TSH e T4 Livre), uma vez que a função reprodutiva masculina, assim como a
feminina, é afetada tanto pelo hipo quanto pelo hipertireoidismo, podendo acarretar disfunções eréteis. O
hipertireoidismo pode causar alterações de motilidade dos espermatozoides; já o hipotireoidismo pode
favorecer a teratozoospermia (presença de espermatozoides com formato anormal).
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

Um casal está tentando engravidar há 12 meses sem método anticoncepcional e mantendo relações
sexuais frequentes. O esposo tem 40 anos e dois filhos de uma união anterior, com 10 e 5 anos. Ela tem
29 anos, ciclos regulares, mas nunca engravidou. Assim, eles nunca tiveram filhos juntos. Esse é um
exemplo de:

A Infertilidade secundária do casal, do marido e da mulher.

B Infertilidade secundária do casal. Primária do marido e da mulher.

C Infertilidade primária do casal e da mulher. Secundária do marido.

D Infertilidade primária do casal, do marido e da mulher.

Infertilidade primária do casal e da mulher. O marido não é caracterizado como infértil,

E
pois já tem filhos.

Parabéns! A alternativa C está correta.

A infertilidade primária é a ausência de gravidez clínica. No exemplo, como a mulher nunca engravidou,
dizemos que ela tem uma infertilidade primária. Como o casal está tentando ter filhos há 12 meses e
não conseguiu nenhuma gestação, dizemos que a infertilidade do casal também é primária. Já o
homem, como teve dois filhos com outra mulher, dizemos que é um caso de infertilidade secundária.

Questão 2

Vimos que quando um casal investiga a infertilidade, devemos realizar diferentes exames tanto no
homem como na mulher. A seguir, são listados vários exames que podem ser realizados nas mulheres
e nos homens. Assinale a alternativa que relata quais exames são realizados de rotina, ou seja, que
fazem parte da investigação básica do casal infértil.

Exames laboratoriais (hormonais), ultrassonografia transvaginal (USTV), USTV seriada,

A
histerossalpingografia e espermograma.

Exames laboratoriais (hormonais), ultrassonografia transvaginal (USTV), USTV seriada,

B
histerossalpingografia e teste de fragmentação espermática.

USTV seriada, histerossalpingografia, espermograma, teste de fragmentação

C
espermática e dosagem do hormônio anti-Mulleriano.

Exames laboratoriais (hormonais), ultrassonografia transvaginal (USTV), espermograma

D
e mapeamento de endometriose.

Espermograma, teste de fragmentação espermática, mapeamento de endometriose e

E
videolaparoscopia.

Parabéns! A alternativa A está correta.

São exames de rotina as dosagens de hormônios, realizadas com exames de sangue periférico tanto no
homem como na mulher. Na mulher, são exames de rotina as dosagens de hormônios, realizadas no
sangue periférico, a ultrassonografia transvaginal para verificação de alterações no útero, ovários e
trompas de falópio; USTV seriada para acompanhar a ovulação; histerossalpingografia para observar o
funcionamento da trompa de falópio; espermograma para analisar a qualidade e quantidade de
 espermatozoides. Os exames de fragmentação espermática, a dosagem de hormônio anti-Mulleriano,
mapeamento de endometriose e videolaparoscopia fazem parte da investigação mais aprofundada da
infertilidade e não devem ser solicitados como rotina para todos os casais.

2 - Tratamento da infertilidade
Ao final deste módulo, você será capaz de identificar os diferentes tipos de tratamento para a
infertilidade.

Introdução aos tratamentos da infertilidade

Quando constatamos a infertilidade, traçamos um plano de tratamento de acordo com o fator de sua causa.
Como sabemos, as técnicas na reprodução assistida são divididas em baixa e alta complexidade, como
veremos a seguir:

Tratamentos de baixa complexidade

São aqueles em que a fecundação acontece naturalmente, dentro do organismo da mulher, como o
coito programado (CP) e a inseminação intrauterina (IIU).
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Tratamentos de alta complexidade

São aqueles em que a fecundação acontece pela manipulação de gametas no laboratório, como a FIV
(fertilização in vitro) e a ICSI (injeção intracitoplasmática de espermatozoide).

Podemos dividir esses tratamentos como uma escada de quatro degraus, em que o tratamento só deve ser
iniciado após as tentativas naturais (primeiro degrau) e sempre da menor complexidade para a maior
complexidade.
 Escada de tratamento de infertilidade.

Todos os tratamentos de fertilização podem ser feitos durante o ciclo natural, mas não é o que
normalmente acontece. Geralmente, preferimos usar drogas indutoras de ovulação para aumentar a
quantidade de óvulos disponíveis em cada ciclo e, assim, aumentar as chances de fecundação. No entanto,
o que vai variar para cada procedimento são as medicações e as doses utilizadas.

Tratamento de baixa complexidade

Durante os ciclos de baixa complexidade, tanto no coito programado quanto na inseminação intrauterina
(IIU) teremos basicamente três etapas:

Indução da ovulação;

Trigger ovariano: desencadeamento da ovulação;

Suporte de fase lútea.

Agora vamos entender cada uma das fases para cada tipo de tratamento.

Coito programado (CP)

O coito programado, namoro programado ou estimulação da ovulação, é o segundo degrau da nossa escada
de tratamento de infertilidade. É uma técnica pouco invasiva, que visa à estimulação da ovulação com
 medicamentos e estabelece uma janela ideal para o casal realizar as relações sexuais, aumentando a
chance da fecundação que ocorre de forma natural.

O coito programado é indicado para mulheres que têm dificuldade de ovulação,

como pacientes com síndrome do ovário policístico ou com LUF. Assim, é
necessário excluir os outros fatores de infertilidade do homem e da mulher.

O tratamento começa ao menstruar, quando fazemos uma US transvaginal para avaliar endométrio e
ovários. Com a espessura endometrial adequada (geralmente menor que 4mm) e ovários sem cistos ou
folículos dominantes, iniciamos a indução de ovulação, com indutores de ovulação. Normalmente, optamos
pelos indutores orais, como o citrato de clomifeno ou o letrozol, e orientamos a paciente a usar a
medicação do terceiro ao sétimo dia do ciclo.

itrato de clomifeno
É um agonista parcial. Ele estimula a liberação de FSH e o crescimento folicular. Agonistas são fármacos que
ao se ligarem ao receptor mimetizam a ação dos compostos endógenos. Dizemos que um agonista é parcial
quando a ligação ao receptor ocorre de forma mais branda quando comparada à molécula endógena.

etrozol
É um inibidor não esteroidal da aromatase, o que resulta na inibição da biossíntese de estrogênio a partir dos
androgênios no folículo ovariano e, consequentemente, estimula a liberação dos hormônios GnRH pelo
hipotálamo. Em seguida, estimula a liberação do FSH pela hipófise, o que leva ao crescimento folicular.

Para a indução de ovulação, é essencial o acompanhamento do ciclo com ultrassonografias ou ecografias

de controle ovulatório, com início geralmente no 10º dia do ciclo e realizada a cada dois dias (ou a critério
médico) até a ovulação. Durante o exame, é verificado o crescimento folicular pela medição do tamanho dos
folículos.
Quando o folículo chega em torno de 18mm ou mais, é desencadeada a ovulação, fazendo o Trigger
ovariano. No entanto, a ausência de folículos recrutados no 10º dia pode indicar ausência de resposta ao
tratamento, nesse caso sugerimos a complementação com mais indutores (geralmente, gonadotrofinas
injetáveis).

Além disso, caso a ultrassonografia mostre o recrutamento de cinco ou mais folículos, é indicado conversar
com o casal sobre os próximos passos, uma vez que as tentativas naturais estão contraindicadas pelo risco
de gestação múltipla. As opções do casal são o cancelamento de ciclo, ou seja, evitar as relações até a
menstruação, ou então converter o tratamento para uma técnica de alta complexidade.

Para o Trigger ovariano, usamos medicação que desencadeia a ovulação, em geral, o hormônio
gonadotrófico humano (HCG). Também conhecido como hormônio da gravidez, o HCG é uma molécula
muito parecida com a molécula de LH. Ao ser administrada, o organismo entende como se estivesse
acontecendo o pico endógeno de LH, favorecendo a ovulação.

Ela pode ser de origem natural (purificada) ou recombinante (produzida com

técnicas de engenharia genética).

Após 36 horas do Trigger ovariano, é esperado que ocorra a ovulação. Para confirmar, normalmente é
realizada outra US. É também nesse intervalo de tempo que vamos orientar o casal a ter relações sexuais.
Caso haja a ovulação, iniciamos a suplementação de progesterona, para o suporte da fase lútea (“ajudar” o
corpo lúteo a manter os níveis adequados de progesterona).

A suplementação geralmente é feita por via oral (10mg de 12 em 12 horas) ou vaginal (200mg de 12 em 12
horas) durante 14 dias, o tempo que o corpo lúteo atua. A desvantagem da suplementação por via vaginal é
que a mulher deve ficar deitada por pelo menos 40 minutos após a aplicação.

Atenção!

Existe também progesterona injetável, mas no Brasil é mais difícil de ser encontrada.
Além disso, após duas semanas da ovulação, realizamos o exame de gravidez. É feita a dosagem sanguínea
do hormônio βHCG (fração beta do hormônio de gonadotrofina coriônica). Se o resultado do βHCG for
positivo, repetimos o exame em 48 horas e mantemos o suporte até as 12 semanas de gestação ou até o
obstetra suspendê-lo. Se o resultado do βHCG for negativo, devemos suspender a progesterona e aguardar a
menstruação. A partir daí, decidimos por um novo ciclo de CP ou partimos para a inseminação intrauterina.

É importante ressaltar que o coito programado é indicado para o casal por até seis
meses. Após esse tempo, devemos sugerir a inseminação intrauterina ou FIV. Se o
casal quiser iniciar a inseminação antes desse tempo, também é possível.

Inseminação intrauterina (IIU)

A inseminação intrauterina (IIU) é uma técnica que inocula os espermatozoides dentro do útero, quando as
mulheres estão ovulando. Esse procedimento facilita o encontro do óvulo com o espermatozoide e a
fertilização de forma natural.

Esquema da inseminação intrauterina (IIU).

Essa técnica é indicada especialmente para casais jovens, com bom prognóstico, que apresentem
infertilidade causada por fator cervical, fator masculino leve (por exemplo, uma oligozoospermia leve, ou
seja, 12 milhões de espermatozoides/mL com amostra de 3mL), infertilidade sem causa aparente (ISCA)
especialmente em casais jovens (mulheres com menos de 35 anos), inseminação com sêmen de doador,
seja por motivo de azoospermia masculina ou em casal homoafetivo feminino.

Assim como no coito programado, precisamos de pelo menos uma trompa prévia. A IIU segue basicamente
os mesmos passos do coito programado, com as etapas de indução de ovulação e Trigger iguais ao CP.

Após o Trigger ovariano, o casal é orientado a realizar o procedimento de

inseminação.

Para isso, é necessário o processamento seminal, após a coleta do sêmen por masturbação. Durante o
processamento, são selecionadas as formas normais e móveis, e esse líquido rico em espermatozoides de
boa qualidade é injetado dentro do útero da mulher por meio de um fino cateter de silicone.

Os protocolos de inseminação variam. Algumas clínicas preferem fazer inseminação logo antes da
ovulação; outras, após terem visto o corpo lúteo na US; há ainda clínicas que fazem um esquema de dupla
inseminação, ou seja, uma antes da ovulação e outra após verem corpo lúteo.

Comentário

O suporte de fase lútea também pode ser realizado com progesterona via oral (20mg/dia) ou via vaginal
(400mg de progesterona micronizada por dia) após a visualização do corpo lúteo na US.

O exame de gravidez deve ser realizado 14 dias após a ovulação. Assim como no CP, o recrutamento de
cinco ou mais folículos é indicação de interrupção do ciclo. Além disso, após o segundo ou terceiro ciclo de
IIU, caso não ocorra a gestação, é recomendado um tratamento de alta complexidade (FIV ou ICSI).

Tratamento de alta complexidade

Os tratamentos de alta complexidade (FIV clássica ou ICSI) são procedimentos que necessitam de uma
maior carga hormonal e devem ser realizados no centro cirúrgico, sendo, portanto, um procedimento mais
invasivo. Como nós sabemos, a fecundação ocorre no ambiente laboratorial, sendo que na FIV, o óvulo
coletado é colocado dentro de uma gota rica em espermatozoides e um deles fecundará o óvulo
espontaneamente. Já na ICSI, o espermatozoide é escolhido e colocado dentro do óvulo denudado através
de uma micro agulha – na figura a seguir entendemos um pouco sobre essa diferença.
 Esquema comparando a FIV e a ICSI.

Você sabe quais são as principais indicações para esse tratamento?

As indicações para o tratamento de alta complexidade são:

Falha dos métodos de baixa complexidade.

Fator tubário importante: obstrução tubária bilateral, salpingectomia (retirada das trompas)
bilateralmente.

Infertilidade por fator tubário após 12 meses de cirurgia laparoscópica para correção.

ISCA de longa data, especialmente em pacientes mais velhas, com baixa reserva ovariana.

Fator masculino grave, como a azoospermia. Nesses casos, atualmente a ICSI tem preferência em
relação à FIV clássica.

Os protocolos e medicações utilizadas para FIV e ICSI são: primer ovariano, estimulação ovariana, bloqueio
ovariano, Trigger ovariano, coleta oocitária, manipulação de gametas, cultura embrionária, suporte de fase
lútea, transferência embrionária e exame de gravidez.

Entretanto, o protocolo e as medicações variam entre as clínicas de reprodução assistida. Vamos entender
melhor cada etapa.

Primer ovariano

Etapa não obrigatória e realizada apenas em alguns protocolos.

Para esse preparo, podemos usar hormônios do tipo anticoncepcionais ou até estrogênio isoladamente.
Essas medicações têm como objetivo o bloqueio leve do eixo hipotálamo-hipófise-ovário, evitando que haja
recrutamento precoce de algum folículo — o que garante crescimento do folículo o mais homogêneo
possível e evita disparidades entre os tamanhos. Geralmente, fazemos esse bloqueio antes da próxima
menstruação, a que marca o início do ciclo.

Se for usado estrogênio isolado, iniciamos o tratamento após a ovulação do ciclo anterior e aguardamos a
menstruação. Caso seja feito com anticoncepcional, podemos iniciar ao menstruar e utilizar a medicação
durante 7 a 15 dias, a depender da necessidade. Assim que ocorrer a menstruação, iniciamos o estímulo.

Indução da ovulação
Diferentemente dos ciclos anteriores de baixa complexidade, o nosso objetivo aqui é conseguir uma grande
quantidade de óvulos para serem manipulados no laboratório, ou seja obter mais de 5 óvulos, o ideal seria
de 10 a 20 óvulos.

Para isso, administramos gonadotrofinas (FSH, LH) injetáveis ou subcutâneas ou a combinação das duas.
Os estímulos começam entre o primeiro e o terceiro dia da menstruação e devem ser feitos de forma diária
até o Trigger ovariano.

Saiba mais
Atualmente, existe a gonadotrofina de efeito prolongado, que pode ser administrada no 1º dia de estímulo e
só precisará de complemento a partir do 8º dia. A vantagem é a comodidade da paciente, a desvantagem é
que não há possibilidade de ajuste de dose nesses primeiros sete dias de estímulo.
 Após o início das medicações, faremos um US geralmente após cinco ou seis dias do início da medicação,
para acompanhar a resposta ovariana e o crescimento dos folículos. Se necessário, deve-se ajustar a
posologia. A partir desse período, a avaliação deve ser realizada em dias alternados.

Bloqueio da ovulação

Como a fertilização será realizada no laboratório, é imprescindível que os óvulos sejam captados ainda
dentro dos folículos ovarianos (na etapa de punção folicular). Assim, precisamos evitar o pico de LH, o que
acontece quando o folículo chega a um tamanho de aproximadamente 20mm de diâmetro. Por isso é
realizado o bloqueio da ovulação, ou seja, ao mesmo tempo que estimulamos o recrutamento e o
crescimento folicular, impedimos a ovulação.

Existem diferentes protocolos de estímulos e ciclos a depender do fator de infertilidade do casal, mas eles
são divididos em bloqueio tardio (esquema curto ou protocolo curto) e bloqueio prévio (esquema longo ou
protocolo longo). Vamos conhecê-los melhor a seguir:

Bloqueio tardio

É realizado entre o 5º e o 8º dia após a estimulação ovariana, ou quando os folículos atingem tamanho de
até 14mm. Nesse momento, é iniciado o bloqueio com antagonista de GnRH (bloqueio imediato dos
receptores hipofisários que impedem a produção de gonadotrofinas e, consequentemente, que haja o
disparo da ovulação) e mantido até o Trigger ovariano. Esse protocolo pode ser usado para pacientes com
SOP.

Bloqueio prévio

É iniciado no ciclo anterior, normalmente no 21º dia do ciclo, com um agonista de GnRH, que inicialmente
estimula a liberação das gonadotrofinas e depois provoca um bloqueio da ovulação. Após 7-15 dias de
medicação, a paciente deve menstruar e, em seguida, no segundo ou terceiro dia de menstruação, são
realizados o exame de US e dosagem hormonal para confirmar o bloqueio. Uma vez confirmado o
bloqueio, é realizada a estimulação. Esse protocolo pode ser usado para pacientes com endometriose. O
bloqueio longo também pode ser realizado com antagonistas de GnRH e progesterona.

ntagonista
Fármaco que, ao se ligar ao receptor, bloqueia os efeitos de compostos endógenos.

Trigger ovariano
Quando os folículos atingem o diâmetro de 18mm, realizamos o Trigger ovariano de forma semelhante ao
que estudamos nos tratamentos de baixa complexidade. Transcorridos aproximadamente 36 horas dessa
etapa, os folículos estão maduros o suficiente para ocorrer a ovulação, assim, o ideal é marcar a punção
folicular após 34,5 e 36 horas dessa etapa.

Exemplo
Uma paciente que realiza o Trigger ovariano às 22h de uma segunda-feira, sua ovulação acontecerá em
torno das 10h da manhã da quarta-feira. Como queremos pegar os óvulos ainda dentro dos folículos e com
a maior taxa de maturação possível, a punção deve ser realizada entre 8h30 e 10h da quarta-feira.

Coleta oocitária

A coleta oocitária acontece no centro cirúrgico, em uma sala próxima ao laboratório de alta complexidade. É
preciso orientar que a paciente venha em jejum, pois ela será sedada. A coleta acontece com uma agulha
guiada por US acoplada ao transdutor transvaginal, que chega até o ovário e aspira o conteúdo de cada um
dos folículos. Esse líquido folicular é levado até o laboratório. A expectativa é de que haja um óvulo dentro
de cada folículo. Esse processo é feito com todos os folículos recrutados dos dois ovários.

Suporte de fase lútea

No ciclo de alta complexidade, o início do suporte da fase lútea acontece logo após
a captação oocitária.

A paciente é orientada a utilizar a progesterona assim que chega em casa. Utilizamos preferencialmente
progesterona via vaginal e em maior dose do que nos ciclos de baixa complexidade, chegando a 800mg de
progesterona micronizada ao dia, dose que deve ser mantida até o exame de gravidez.

Manipulação de gametas

Essa é a parte específica do laboratório, os espermatozoides devem ser coletados e preparados; colocados
em contato com os óvulos e fecundados de acordo com a técnica escolhida. Aqui não descreveremos como
isso é realizado. Não se preocupe, você conhecerá as técnicas em outro momento!

Cultura embrionária
No dia seguinte à fecundação, o embriologista checa a evolução e o crescimento embrionário. O que
procuramos é um óvulo fecundado com dois pró-núcleos. A partir daí, mantemos os embriões em cultura
entre 2 e 7 dias até a transferência ou até o congelamento embrionário.
Transferência embrionária
Acontece entre o segundo e o sétimo dia após a coleta oocitária. É feita pelo médico por meio de um cateter
de silicone bastante flexível que entra pelo canal cervical. Esse processo é guiado por US transabdominal,
para que os embriões sejam depositados na parte fúndica do útero, onde o endométrio geralmente é mais
espesso e onde o embrião nidaria naturalmente. Essa etapa deve ser feita da forma mais delicada e sem
traumas, pois qualquer injúria endometrial ou contração uterina pode reduzir as chances de sucesso do
tratamento.

Teste de gravidez

Assim como nos tratamentos anteriores, mantemos a administração de progesterona até a coleta para o
exame de gravidez que, nesse caso, é solicitada entre o 9º e o 11º dia após a transferência dos embriões. O
teste realizado também é o βHCG.

Resultados positivos de βHCG

Devem ser confirmados após 48 horas do primeiro resultado e novamente 48 horas após o segundo
exame.

close
Resultados negativos de βHCG

O ideal é entrar em contato com o médico para conversar sobre os próximos passos.

Em caso de gravidez, solicitamos uma ecografia obstétrica via transvaginal após 4 ou 5 semanas, para ver a
localização do saco gestacional. É possível visualizá-lo quando a dosagem do βHCG é superior a 1.00UI/mL.
Após a visualização do saco gestacional, a paciente é acompanhada pelo obstetra de sua confiança.

Atenção!
É necessário que a mulher faça complementação de ácido fólico ou metilfolato mesmo antes de começar
os tratamentos, para a redução do risco de malformações do sistema nervoso central do feto,
especialmente defeitos de fechamento do tubo neural.

Até aqui vimos as principais etapas do tratamento empregando embriões sem estar congelados. No
entanto, as técnicas de alta complexidade podem ser realizadas com embriões que foram criopreservados,
ou seja, embriões que não foram transferidos podem ser congelados e utilizados em um novo tratamento.
Mas como será o preparo da mulher no caso da transferência de embriões descongelados?

Nesse caso, apenas precisamos estimular o crescimento endometrial para receber os embriões. A
estimulação é realizada apenas por medicamentos orais ou é transdérmica, normalmente com o estrogênio.
O crescimento endometrial é acompanhado pela US. Quando o endométrio atinge diâmetro médio maior
 que 7 ou 8mm, está na hora de iniciar a progesterona, em dose de 600 a 800mg/dia. A transferência é feita
de acordo com o estágio em que o embrião foi congelado.

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Tratamento de alta complexidade
Neste vídeo, a especialista fará uma revisão sobre o tratamento de alta complexidade, abordando
detalhadamente cada etapa do ciclo .

Saiba mais

O Duo-stim (dupla estimulação) é utilizado quando não se obtém a quantidade desejada de óvulos durante a
primeira coleta. O protocolo do primeiro estímulo é basicamente o mesmo de um ciclo de FIV com as
mesmas etapas, mas realizamos o trigger ovariano com agonista de GnRH, e não com HCG. Após a primeira
coleta dos óvulos, interrompemos as medicações por 4 dias e recomeçamos o estímulo no 5º dia,
reiniciando o estímulo ainda na fase lútea, logo após a coleta. A expectativa é aumentar a quantidade de
óvulos recuperados no segundo estímulo, ou mesmo uma maior quantidade de oócitos recuperados no
menor espaço de tempo.

Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

Imagine o seguinte caso: uma mulher de 30 anos tenta engravidar há um ano. Na investigação, o
médico constata que ela tem boa reserva ovariana, ambas as trompas pérvias (sem alterações) e o
marido apresenta espermograma normal. A mulher conta que os ciclos menstruais são irregulares e
fica mais de dois meses sem menstruar. Com os exames, o diagnóstico é de síndrome dos ovários
policísticos (SOP). Qual o primeiro tratamento que o médico vai propor ao casal?

A Videolaparoscopia.

B Inseminação intrauterina.

C Indução da ovulação por coito programado.

D Fertilização in vitro.

E Continuar tentando sem nenhum tratamento por mais um ano.

Parabéns! A alternativa C está correta.

No caso retratado, o casal tem um problema diagnosticado e deve ser tratado adequadamente. Como a
paciente tem SOP e nenhum outro sinal clínico aparente, o fator ovulatório parece ser a causa da
infertilidade. Desse modo, a melhor alternativa é o coito programado. A inseminação intrauterina é
utilizada para reverter infertilidades por causa de fatores cervicais ou um fator masculino leve — a
princípio esse casal não tem nenhum desses. A videolaparoscopia seria indicada se não tivesse fator
aparente ou existisse fator tubário. Fertilização in vitro é uma solução um tanto invasiva para ser a
primeira opção ao casal jovem com pouco tempo de tentativa.

Questão 2

Um casal está tentando engravidar há quatro anos. Hoje, a mulher tem 40 anos de idade. Na
investigação da infertilidade, foi observado que a mulher apresenta obstrução tubária bilateral e o
homem tem espermograma com fator masculino grave: oligozoospermia severa. Qual tratamento o
médico indicaria para esse casal?
 A Coito programado.

B Inseminação intrauterina.

C Videolaparoscopia.

D Tentar gestação por seis meses espontaneamente.

E ICSI.

Parabéns! A alternativa E está correta.

O casal tem vários fatores de infertilidade: idade da mulher (óvulos perdem qualidade com o passar da
idade), trompas fechadas e fator masculino severo. Somente o fator masculino já indicaria a ICSI. Se
tivessem espermograma e trompas normais, a alta complexidade ainda seria a melhor opção pela
idade da mulher.

Considerações finais
Ao longo deste conteúdo, tratamos dos vários aspectos da fertilidade humana, os principais conceitos, as
causas da infertilidade masculina e feminina e os principais exames realizados, desde os exames básicos
até as técnicas mais avançadas.

Conhecemos também os principais tratamentos de baixa e alta complexidade, abordando como é feito o
preparo medicamentoso do(a) paciente nas diferentes etapas de cada uma das técnicas.
 Atualmente, mais de 10% dos casais em idade reprodutiva no mundo são inférteis. Os avanços
tecnológicos, no diagnóstico e nos tratamentos em reprodução assistida, permitem que na maioria dos
casos esse quadro seja revertido e o casal tenha sucesso na gravidez.

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Podcast
Neste podcast, a médica Rejane Casares entrevista o Dr. Bernardo Sobreiro sobre a infertilidade masculina.

Explore +
Para saber mais sobre os assuntos tratados neste conteúdo:

Consulte O guia completo dos tratamentos para infertilidade, da Clínica de Reprodução Assistida Viventre.
Disponível em E-book.

Leia o artigo Propedêutica básica da infertilidade conjugal, de Rívia Mara Lamaita e colaboradores,
Revista Feminina, 2020, v. 48, n° 5, p. 311-315.

Visite o site da Sociedade Brasileira de Reprodução Humana, lá você encontra publicações, artigos
científicos e oferta de cursos.

Acesse o site do Instituto Paulista de Ginecologia e Obstetrícia (IPGO) e clique na aba “Fertilização” para
saber mais sobre os tratamentos de infertilidade, protocolos, medicamentos, como aumentar o sucesso
do tratamento e como realizá-lo em mulheres más-respondedoras.

Consulte a lista de medicações Indutores de ovulação preparada especialmente para você. A lista traz as
medicações utilizadas durante o tratamento da infertilidade.
Referências
BORGES, C. H. S.; MACEDO, L. C. Infertilidade masculina decorrente de microdeleções no cromossomo Y.
Science Direct, Reprodução & Climatério, set./dez., 2016, v. 31, n. 3, p. 169-174 .

CAETANO, J. P. J.; MARINHO, R. M.; PETRACCO, A.; LOPES, J. R. C.; FERRIANI, R. A. Medicina reprodutiva.
São Paulo: SBRH, 2018. [Segmento Farma, cap. 1-4]

FEBRASGO. Federação Brasileira das Associações de Ginecologia e Obstetrícia. Feminina, 2019, v. 47, nº 9,
68 p .

JAFFE, R. B. et al. Neuromodulatory regulation of gonadotropin-releasing hormone pulsatile discharge in

women. Am. J. Obstet. Gynecol., nov. 1990, v. 163, (5 Pt 2) , p. 1.727-1731.

MAIS, V. et al. The dependency of folliculogenesis and corpus luteum function on pulsatile gonadotropin
secretion in cycling women using a gonadotropin-releasing hormone antagonist as a probe. J. Clin.
Endocrinol. Metab., jun. 1986, v. 62, n. 6, p. 1.250-1.255.

ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE (OMS). Infertility, 14 set. 2020. Consultado na Internet em: 30 set.
2021.

PASQUALOTTO, F. F. Investigação e reprodução assistida no tratamento da infertilidade masculina. Rev.

Bras. Ginecol. Obstet., 2007, v. 29, n. 2, p. 103-112 .

SPEROFF, L.; GLASS, R. H.; KASE, N. G. Endocrinologia ginecológica clínica e infertilidade. 5. ed. São Paulo:
Manole, 1986.

STOCCO, C.; TELLERIA, C.; GIBORI, G. The molecular control of corpus luteum formation, function and
regression. Endocr. Rev., fev. 2007, v. 28, n. 1, p. 117-149.

VELDE, E. R.; PEARSON, P. L. The variability of female reproductive ageing. Hum. Reprod. Update, mar./abr.
2002, v. 8, n. 2, p. 141-154.

YILDIZ, B. O. Diagnosis of hyperandrogenism: clinical criteria. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., jun.
2006, v. 20, n. 2, p. 167-176.
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O Laboratório de Reprodução Humana Assistida
Prof.ª Ana Clara Coelho Esteves

Descrição

Técnicas de preparo seminal, de fertilização in vitro e transferência embrionária.

Propósito

Compreender as técnicas empregadas na rotina dos laboratórios de andrologia e embriologia envolvidas

nos diversos tratamentos de reprodução assistida.

Objetivos

Módulo 1

Laboratório de andrologia e inseminação intrauterina (IIU).

 Descrever as técnicas empregadas no laboratório de andrologia e de inseminação intrauterina (IIU);

Módulo 2

Laboratório de embriologia e técnicas de fertilização in vitro

Descrever as técnicas de fertilização in vitro;

Módulo 3

Técnicas especiais empregadas no laboratório de embriologia.

Reconhecer as técnicas especiais empregadas no laboratório de embriologia clínica.

Introdução
Muito do que está envolvido nos tratamentos de reprodução humana assistida acontece nos
bastidores da clínica nos laboratórios de andrologia e embriologia. Neles é onde acontece todo o
preparo dos gametas, prévio à sua utilização nos procedimentos.

No laboratório de andrologia realizamos análise diagnóstica e processamento terapêutico seminal.

Na análise diagnóstica ‒ o espermograma ‒ observamos todas as características macroscópicas e
microscópicas da amostra ejaculada, o que resulta em um parecer pontual sobre aquela amostra.

Já no processamento terapêutico, processamos e capacitamos a amostra para que seja utilizada

nos tratamentos de infertilidade ‒ sejam inseminação intrauterina, fertilização in vitro, ou mesmo
congelamento da amostra para preservação da fertilidade.

Vamos conhecer também o laboratório de embriologia, onde são realizadas as técnicas de alta
complexidade, e também saber mais sobre os procedimentos às quais estão relacionadas.

Nesse laboratório, manipulamos oócitos e embriões, desde a punção ovariana para aspiração do
líquido folicular, contendo os complexos cumulus-oócito, até o momento da transferência ou
criopreservação dos embriões formados.
Algumas das etapas compreendidas nesse processo são: identificação e denudação dos oócitos,
classificação da maturação oocitária, fecundação dos oócitos, verificação da fertilização, cultivo
embrionário, avaliação da morfologia e desenvolvimento dos embriões, criopreservação de oócitos e
embriões, e transferência embrionária.

Também veremos algumas técnicas especiais que figuram no dia-a-dia dos embriologistas, como
obtenção cirúrgica de espermatozoides, técnicas alternativas de seleção espermática (em casos
como alto índice de fragmentação de DNA e alteração da morfologia espermática) e eclosão
assistida, para auxiliar embriões a saírem da zona pelúcida em situações específicas, como
espessamento de zona e criopreservação prévia.

Orientação sobre unidade de medida

Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de
tecnologia e didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número
e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem
seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades.
1 - Laboratório de andrologia e inseminação intrauterina
(IIU).
Ao final deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas empregadas no laboratório
de andrologia e de inseminação intrauterina (IIU).

Introdução à análise seminal

O sêmen é um fluido orgânico cuja principal função é transportar os espermatozoides desde os testículos
até o oócito, para que ocorra a fecundação e, consequentemente, a gravidez. Para que o espermatozoide
consiga ser ejaculado, são produzidas as secreções pelo aparelho genital masculino, que se misturam aos
espermatozoides produzidos nos testículos, formando o sêmen em si.

Cada secreção tem a sua função para que o espermatozoide consiga percorrer todo o caminho até o
encontro com o oócito. O líquido vesicular tem função na coagulação e na manutenção da alcalinidade do
pH; a secreção prostática possui enzimas proteolíticas que ajudam na liquefação seminal; e as glândulas
bulbouretrais realizam a lubrificação.

Espermograma
A análise seminal ou espermograma é um exame que fornece informações importantes sobre a produção
de espermatozoides e das funções secretoras das glândulas acessórias (próstata e vesícula seminal), e
consiste na avaliação macroscópica e microscópica do sêmen, como veremos a seguir.
Para a realização do espermograma, é indicada a abstinência sexual entre 2 e 7 dias, já que sabemos que
um período menor ou maior pode alterar os resultados do exame.

Exemplo

Se o paciente tem ejaculações frequentes, o volume e a concentração diminuem, ficando predominantes os

espermatozoides mais jovens e móveis. Um período prolongado de abstinência ejaculatória, por sua vez,
influencia negativamente a motilidade e a vitalidade dos espermatozoides, uma vez que a concentração de
espermatozoides inativos aumenta.

É importante lembrar que um único espermograma não é diagnóstico definitivo da qualidade seminal, uma
vez que diferentes amostras de um mesmo paciente podem apresentar variações e sofrer alterações devido
à ação de fatores externos, como alguns medicamentos, por exemplo.

Assim, para um panorama mais fidedigno de avaliação da qualidade seminal, é aconselhável que o
espermograma seja repetido em um período de dois a três meses.
O método de coleta é, de preferência, a masturbação, realizada em uma sala isolada, próxima ao laboratório,
utilizando um frasco coletor estéril, atóxico (feito de polipropileno) e previamente identificado, com boca
larga, e sem o uso de lubrificante.

Após a coleta, o paciente preenche um questionário, informando se houve perda de amostra, já que a
primeira parte do ejaculado é a que possui a maior concentração de espermatozoides.

Para cada paciente é preenchido um prontuário no qual anotamos os horários de coleta e de início da
análise. A análise deve ser realizada em até uma hora após a ejaculação, e, além disso, a amostra não pode
sofrer bruscas alterações de temperatura, devendo ser mantida sempre entre 25°C e 37°C.

Ao chegar no laboratório, a amostra passará por uma análise macroscópica, que consiste na verificação da
presença de coágulos, liquefação, viscosidade, aspecto, cor, pH, e volume seminal. Na avaliação
microscópica, por sua vez, observamos a concentração, motilidade dos espermatozoides e concentração de
células redondas.

Saiba mais

Os valores de referência, tanto para os parâmetros macro quanto para os microscópicos, são definidos pela
Organização Mundial de Saúde (OMS) e estabelecidos a partir da média de diversas análises seminais
provindas de homens de diferentes nacionalidades, que foram capazes de engravidar suas esposas por
método natural em até um ano.
 Liquefação

Em condições fisiológicas, o sêmen fica em forma de coágulo logo após a ejaculação. Esse coágulo tem
como função proteger os espermatozoides do pH ácido da vagina. O coágulo se forma a partir de proteínas
secretadas pelas vesículas seminais.

O coágulo deve se desfazer naturalmente e assumir um aspecto líquido em até 30 minutos. Essa liquefação
é enzimática e acontece por causa das proteases prostáticas.

Se o sêmen não se liquefizer em 60 minutos, essa amostra teve liquefação incompleta ou ausente
(condição relacionada a alterações prostáticas), podendo precisar de liquefação mecânica ‒ quando
aspiramos e soltamos o sêmen manualmente com auxílio de uma pipeta.

roteases
Enzimas que digerem proteínas.

Viscosidade
Após a completa liquefação, observamos a viscosidade da amostra: com o auxílio de uma pipeta sorológica
estéril, a amostra deve gotejar ou formar um filamento de até 2cm ‒ nesse caso, consideramos uma
viscosidade normal. Caso a amostra apresente um filamento maior do que 2cm, a viscosidade é aumentada.

Volume

Para medir o volume da amostra pipetamos toda a amostra com o auxílio de uma pipeta graduada estéril.
De acordo com a OMS, o valor de referência para o volume é de 1,4mL (WHO, 2021).

Amostras com volume inferior são classificadas com hipospérmicas. Essa alteração pode estar relacionada
à obstrução do ducto ejaculatório, ausência congênita bilateral dos vasos deferentes ou inflamação crônica.
Um volume aumentado, por sua vez, pode ser causado por processos inflamatórios agudos nas glândulas
anexas.
Aspecto
O sêmen normal tem aspecto homogêneo e cor cinza/branco opalescente. A amostra pode apresentar
mudança de coloração devido às infecções ou doenças sistêmicas, ou uso de medicamento.

Exemplo

Quando a amostra tem presença de hemácias (hematospermia), fica avermelhada; amostras amarelas
podem ser indicativas de infecção ou icterícia; já amostras translúcidas, em geral, possuem baixa
concentração de espermatozoides.

pH

O pH é o balanço de secreções alcalinas das vesículas seminais e da secreção ácida prostática. Em

condições normais, o sêmen é um pouco alcalino ‒ apresentando valor entre 7,2 e 7,8. Para medir o pH, é
utilizado o papel indicador de pH.

Concentração espermática
A concentração espermática está associada à produção espermática pelos testículos. Para a avaliação da
concentração, pode ser utilizado um dispositivo específico, chamado câmara de Makler, ou um dispositivo
utilizado para contagem de células em geral (câmara de Neubauer, por exemplo).

No caso da câmara de Makler, dispositivo mais comumente utilizado nos laboratórios de Reprodução
Assistida, são colocados 10µL de sêmen liquefeito e homogeneizado no centro do dispositivo, que são
cobertos com uma lamínula especial.
Essa câmara possui um quadrante com 100 quadrados ‒ medindo 0,1mm X 0,1mm cada um ‒ e
profundidade de 0,01mm, o que permite que os espermatozoides nadem livremente mesmo com a lamínula.

Para determinar a concentração de espermatozoides por mL, conta-se a quantidade de espermatozoides

presentes em 10 quadrados (uma fileira ou coluna) e multiplica-se por 106.

Câmera de Makler sendo carregada com amostra para análise.

Vamos a um exemplo prático ?

Fotografia de visão microscópica de amostra seminal analisada na câmara de Makler.

Contando 42 espermatozoides em uma fileira de 10 quadrados, a amostra tem 42 x 106/mL (42 milhões de
espermatozoides por mililitro). Essa avaliação é feita em microscópio óptico com aumento de 200x.

Para saber o número total de espermatozoides na amostra, multiplica-se o resultado da concentração por
mililitro pelo volume total da amostra ejaculada. Por exemplo, uma amostra com 3mL de volume com uma

concentração de 42 x 106/mL tem 126 x 106 (126 milhões) de espermatozoides.

De acordo com a OMS, o valor de referência para a concentração seminal é de 16 x 106/mL (16 milhões de
espermatozoides por mililitro)(WHO, 2021). Para amostras que apresentem concentração espermática
inferior a esse valor, utilizamos a nomenclatura de oligozoospermia. Falamos em azoospermia quando há
ausência de espermatozoides na amostra.
Concentração espermática normal.

Oligozoospermia.
 Azoospermia.

Motilidade

A motilidade espermática é definida como o movimento espontâneo do espermatozoide, e sua avaliação

deve ser feita logo após a liquefação do sêmen. A contagem é realizada na câmara de Makler, em
microscópio óptico com aumento de 200x.

De acordo com a OMS, os espermatozoides são classificados em quatro grupos:

 Moveis rápidos progressivos (A):

Espermatozoides que apresentam uma velocidade rápida, tanto de forma linear quanto
realizando curvas durante o trajeto;

Lentos progressivos (B):

Espermatozoides que nadam de forma lenta, linear ou realizando curvas durante o trajeto;

Não progressivos (C):

Espermatozoides que têm movimento sem progressão, ou seja, não saem do lugar;

Imóveis (D):

Espermatozoides que não apresentam movimento algum.

Geralmente, contamos em duplicata 100 espermatozoides (totalizando 200 espermatozoides ao final das
duas contagens) com auxílio de um contador de células. Após as duas contagens, é feita a média aritmética
e calculada a porcentagem dos tipos de motilidade encontradas, de acordo com a OMS.

Também segundo a OMS, a motilidade progressiva (A+B) deve ser maior do que 30%, e a motilidade total
(A+B+C) maior do que 42% (WHO, 2021). Utilizamos a nomenclatura astenozoospermia para amostras com
motilidade espermática inferior a esses valores.

Morfologia
A morfologia espermática caracteriza-se pela forma do espermatozoide, porém não deve ser considerada
como indicador absoluto de infertilidade. Para avaliação desse parâmetro, a OMS recomenda o critério de
Tygerberg, descrito em 1986 por Kruger et al. (WHO, 2021). Avaliamos todas as partes do espermatozoide
para determinar um padrão de normalidade.

Nessa classificação, dividimos a observação do espermatozoide em três partes: cabeça, peça intermediária
e cauda.

Estrutura do espermatozoide.

Ao realizar leitura da morfologia espermática, começamos observando a cauda, depois a peça intermediária
e, por último, a cabeça. Abaixo, descrevemos estas estruturas:

Cabeça expand_more

Deve possuir formato oval e superfície lisa, com cerca de 5-6µm de comprimento e 2,5-3,5µm de
largura. Deve, ainda, apresentar uma porção mais clara, o acrossoma — que ocupa de 40 a 70% da
área da cabeça —, e uma região posterior mais escura, que corresponde ao núcleo.
 Peça intermediária expand_more

É a parte que une a cauda do espermatozoide à cabeça, apresenta 1,5x o comprimento da cabeça, e
largura superior à da cauda.

Cauda expand_more

Deve ter aproximadamente 45µm de comprimento, ser mais fina do que a peça intermediária e se
apresentar uniforme, reta e desenrolada.

A figura a seguir representa as alterações dos espermatozoides com suas respectivas nomenclaturas.

Representação das alterações morfológicas dos espermatozoides e respectivas nomenclaturas, de acordo com a classificação de Kruger.

E como podemos fazer a leitura da morfologia seminal?

Para a realização da leitura da morfologia seminal, realiza-se um esfregaço com 10µL de sêmen liquefeito.
Após seca, a lâmina é corada pelo método panótico rápido e a leitura é realizada em um microscópio óptico,
sob imersão em óleo, com aumento de 1000x.

sfregaço
Também chamado de “lâmina de extensão”, é a lâmina preparada com uma fina camada de sêmen para
posterior coloração e análise.
étodo panótico
Método de coloração baseado no princípio de coloração hematológica, composto por três substâncias
diferentes (uma fixadora e outras duas corantes).

Lâmina contendo o esfregaço do sêmen mostrando os espermatozoides.

Contam-se 100 espermatozoides, classificando-os de acordo com as alterações. O valor de referência

indicado pela OMS para a morfologia espermática é de 4% (WHO, 2021).

A alteração da morfologia espermática em uma amostra é caracterizada como teratozoospermia.

Testes complementares
Além dessa análise seminal básica da infertilidade masculina, existem outras análises que nos dão mais
informações quanto à função espermática. Veja a seguir:

Leucospermia

A leucospermia é definida por uma quantidade maior que 1 milhão de células redondas por mililitro de
sêmen.

Para a realização dessa análise, durante a verificação da concentração espermática, quantificamos também

o número de células redondas na amostra. Quando encontramos mais de 1,0 x 106/mL de células redondas,
realizamos o teste de endtz, ou teste da peroxidase, com o qual vamos conseguir diferenciar e quantificar as
células germinativas imaturas dos leucócitos.
Na imagem ao lado, vemos a diferenciação das células redondas, utilizando o teste de endtz. A letra N
representa uma célula peroxidase negativa (células germinativas) e a letra P, uma célula peroxidade positiva
(leucócitos).

Teste de endtz.

Saiba mais

O teste de Endtz nos dá informação para o tratamento de uma possível infecção. Pacientes com
leucospermia, geralmente, apresentam elevadas quantidades de espermatozoides imaturos e com alteração
de morfologia.

Vitalidade

Outro teste complementar é o de vitalidade, que realizamos quando a amostra tem menos de 30% de
motilidade progressiva. Esse teste nos ajuda a verificar se os espermatozoides estão imóveis por causa de
um defeito estrutural ou pela morte celular.

Para realização desse teste, fazemos uma lâmina de esfregaço seminal que, posteriormente, passa por um
processo especial de coloração. Os espermatozoides com a membrana intacta (vivos) são capazes de
excluir o corante; já os mortos, que não possuem membrana íntegra, são corados. Esse teste nos auxilia no
diagnóstico de necrozoospermia.
ecrozoospermia
Quantidade de espermatozoides vivos abaixo do valor de referência.

Teste de vitalidade.

Na imagem ao lado, conseguimos observar o resultado de um teste de vitalidade. Os espermatozoides

corados com a cabeça em rosa são considerados mortos (D) e os não corados são considerados vivos (L).

Outro teste que avalia a vitalidade espermática é o teste hiposmótico (HOS), que consiste na adição de um
meio com baixa osmolaridade à amostra, o que causa um “inchaço" na cauda do espermatozoide cuja
membrana celular está íntegra.

smolaridade
Concentração total de todos os solutos na solução.

Avaliação de aglutinação

Quando realizamos as contagens ‒ tanto de concentração quanto de motilidade seminal, observamos se os

espermatozoides estão aglutinados, ou seja, se estão “presos” um ao outro pela cauda ou pela cabeça.

Essa aglutinação é causada pela presença de anticorpos antiespermatozoides (AAE) em caso de

rompimento da barreira hematotesticular, podendo ser por trauma cirúrgico ou infecção.

Na imagem a seguir, conseguimos observar os tipos de aglutinação que podemos encontrar durante
avaliação da amostra seminal na câmara de Makler.

arreira hematotesticular
Barreira física entre os vasos sanguíneos e os túbulos seminíferos, formada pelas células de Sertoli.

Representação dos tipos de aglutinação.

Saiba mais
A presença de AAE prejudica a motilidade espermática, já que os anticorpos aglutinam ou imobilizam os
espermatozoides.

Fragmentação de DNA
Outro exame importante na análise seminal é o de fragmentação do DNA espermático, no qual analisamos
se existem quebras de fita única ou dupla na cadeia de DNA. Essas quebras podem ser ocasionadas por
apoptose, durante a espermatogênese, problemas no empacotamento da cromatina na formação dos
espermatozoides e pela ação de espécies reativas de oxigênio.
 A fragmentação do DNA espermático pode ser devida a varicocele, idade paterna avançada, infecção
genital, tabagismo e obesidade.

E como podemos analisar a fragmentação do DNA espermático?

Existem quatro técnicas para analisar a fragmentação do DNA espermático: TUNEL (Terminal
Deoxynucleotidyl Transferase Uracil Nick End Labeling), Teste do cometa (comet assay), Teste da dispersão
da cromatina (SCD- Sperm Chromatin Dispersion), SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay).

Vamos conhecer cada uma delas?

spécies reativas de oxigênio

Compostos químicos resultantes da ativação ou redução do oxigênio molecular ou derivados dos produtos da
redução.

Técnica TUNEL, mostrando espermatozoides com o DNA fragmentado corados em verde e com DNA íntegro em azul.
 Técnica TUNEL

Esta técnica, avalia diretamente a fragmentação de DNA da amostra. É capaz de diferenciar, por meio de
diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado.

Teste do cometa, mostrando vários graus de fragmentação do DNA evidenciados pelo comprimento e intensidade da cauda.

Teste do cometa

É realizado por eletroforese. Para tal, adicionamos uma solução que remove as proteínas. Logo em
seguida, são adicionados géis de agarose em uma lâmina e submetidos à corrente elétrica. Como o DNA
do espermatozoide possui carga negativa, naqueles que apresentarem fragmentação ocorrerá uma
migração do DNA para fora do núcleo, formando, assim, uma aparência de cometa.
Técnica de dispersão da cromatina espermática.

Técnica de dispersão da cromatina espermática

Consiste na resposta diferenciada do espermatozoide quando entra em contato com a solução que
quebra proteínas. A desnaturação e a extração das proteínas nucleares formam um halo ao redor da
cabeça do espermatozoide quando o DNA está íntegro. Assim, ocorre ausência do halo em
espermatozoides com fragmentação de DNA.
Esquema mostrando um resultado da fragmentação de DNA pela técnica de SCSA.

Técnica de SCSA

A técnica de SCSA é realizada por citometria de fluxo e permite a análise de grande número de células.
Para sua realização, são associados fluorocromos para a diferenciação de espermatozoides
fragmentados dos não fragmentados.

Preparo seminal
Como já vimos, o sêmen é composto pelo plasma seminal, que auxilia os espermatozoides a atravessarem
o muco cervical, que, por sua vez, tem como função natural selecionar os espermatozoides viáveis.
 Para os tratamentos de reprodução assistida ‒ tanto a inseminação intrauterina (IIU) quanto a fertilização in
vitro clássica (FIV) e a injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) ‒, essa etapa de seleção natural
é driblada, pois removemos o plasma seminal com as técnicas de preparo seminal.

Assim, conseguimos preparar uma amostra com maior concentração de espermatozoides e com melhor
motilidade, e retiramos as células germinativas, debris, espermatozoides inviáveis. A técnica escolhida para
realizar o preparo seminal vai depender da qualidade seminal, ou seja, da concentração e motilidade
seminal.

ebris
Sujeiras, elementos que não fazem parte do sêmen propriamente dito.

Sperm wash
Para amostras com oligozoospermia severa é realizada a técnica de sperm wash, que consiste em
concentrar todos os elementos do sêmen, incluindo os espermatozoides móveis e imóveis ‒ aumentando a
concentração da amostra.

Para a realização dessa técnica, adicionamos, em um tubo cônico de 15mL, meio de cultivo tamponado à
amostra seminal liquefeita, homogeneizamos e centrifugamos. Após a centrifugação, removemos o
sobrenadante e ressuspendemos o pellet em uma pequena quantidade de meio tamponado;
homogeneizamos e realizamos uma nova análise da amostra para determinar as novas concentração e
motilidade espermática.

eio de cultivo tamponado

Meio de cultivo cujo pH não sofre grandes variações em condições ambiente (e, por isso, é usado quando
fazemos algum procedimento que vá manter os gametas fora da incubadora por um período maior do que dois
minutos).

ellet
Amostra concentrada ao fundo do tubo, que se distingue do sobrenadante.
 Esquema mostrando a técnica de Sperm wash.

Swim-up
Para amostra com oligozoospermia grave, leucospermia e boa motilidade, ou seja, amostras com motilidade
acima de 30%, realizamos a técnica de swim-up, que consiste na migração dos espermatozoides contra a
gravidade, como o próprio nome da técnica diz (“nadar para cima”), resultando na seleção de
espermatozoides móveis na alíquota superior.

Para a realização dessa técnica colocamos 1mL de meio de cultivo tamponado em um tubo cônico de 15mL
e adicionamos 1mL da amostra seminal liquefeita no fundo dele. Deixamos a amostra em um bloco
aquecido com angulação de 45° por 60 minutos.

Após esse período, retiramos uma alíquota de 0,5mL do sobrenadante e colocamos em outro tubo cônico.
Realizamos uma nova análise da amostra para determinar a concentração e a motilidade espermática.

Esquema ilustrando a técnica de Swim-up.

 Gradiente descontínuo de densidade

Outra técnica utilizada nos tratamentos de reprodução assistida é o gradiente descontínuo de densidade.
Podemos realizar essa técnica em amostras normozoospermicas (que apresentam resultados ideais em
relação aos valores de referência) ou limítrofes.

Esse preparo tem como princípio a seleção dos espermatozoides por meio da passagem da amostra por
duas camadas de densidades distintas, a de 90% e a de 45%. A diferença de densidade do meio se dá a
partir da concentração de partículas de sílica recobertas por polivinilpirrolidona (PVP). Essa técnica
seleciona os espermatozoides com melhor motilidade e morfologia. A seguir, demonstraremos as etapas
que envolvem a realização deste processo:

olivinilpirrolidona (PVP)
É uma substância viscosa que faz com que os espermatozoides se movimentem mais lentamente.
Depositamos em um tubo cônico 1,0mL do meio com maior densidade (90%), para formar a camada
inferior. Depois, cuidadosamente, adicionamos o mesmo volume do meio de menor densidade (45%) para
formar a camada superior.

Por último, adicionamos, cuidadosamente, no máximo 3,0mL da amostra de sêmen liquefeita, sobre as
camadas.

Caso a amostra tenha mais de 3,0mL, indica-se fazer dois gradientes.

Em seguida, centrifugamos a amostra durante 20 minutos e, ao final, retiramos o pellet.
 Após retirar o pellet, este é depositado em um tubo limpo e, em seguida, adicionamos entre 2,0 e 3,0mL de
meio de cultivo tamponado, para, então, seguir as mesmas etapas do sperm wash.

Finalizada essa etapa, realizamos uma nova análise da amostra para determinar a concentração e a
motilidade espermática resultantes.

Em amostras com contagens limítrofes de concentração e motilidade, podemos realizar um mini

gradiente, para o qual usamos 0,5mL, em invés de 1,0mL, de volume das camadas do gradiente e
adicionamos, no máximo, 1,0mL de sêmen.

Saiba mais

Essas três técnicas ‒ sperm wash, swim-up e gradiente descontínuo de densidade ‒ são as principais.
Entretanto, existem as variações, como, por exemplo, realizar um sperm wash na amostra e, com o pellet,
 realizar o swim-up. Outra variação é realizar a técnica de gradiente descontínuo de densidade e, após a
segunda centrifugação, realizar o swim-up.

Preparo seminal para casais sorodiscordantes

Em casais sorodiscordantes, nos quais pode ocorrer de apenas um cônjuge ser afetado, ou ambos, por uma
doença viral infecciosa sexualmente transmissível, e que necessitam realizar algum tratamento de
fertilização in vitro, realizamos a lavagem do sêmen com o intuito de retirar totalmente o plasma seminal da
amostra, pois é nele que se encontram as partículas virais.

Assim, diminuímos o risco de contaminação. As principais infecções que podem se beneficiar desse
preparo são HIV, hepatite B e hepatite C.

Nessas amostras de pacientes com carga viral positiva, realiza-se um gradiente descontínuo de densidade,
com dupla lavagem do pellet em meio de cultura tamponado, que podem ser seguidas por um swim-up,
dependendo da qualidade seminal.

Uma parte da amostra é congelada e a outra é enviada para a realização do exame de carga viral, o PCR
(Reação em Cadeia da Polimerase). Se o resultado desse exame for negativo, podemos utilizar a amostra
congelada em um tratamento de fertilização in vitro. Caso o resultado seja positivo, encaminhamos o
paciente para um infectologista.

video_library
Preparo seminal
Neste vídeo, a especialista fala sobre os objetivos do preparo seminal e apresenta as principais técnicas
utilizadas neste processo.

Ejaculação retrógrada
Alguns pacientes podem apresentar ejaculação retrógrada, na qual o volume do ejaculado não passa pelo
ducto deferente e acaba refluindo para a bexiga, sendo liberado na urina.

Nesses casos, o paciente precisa realizar um preparo pré-coleta, com a ingestão de bicarbonato de sódio
em doses previamente recomendadas pelo médico, para manter o pH da urina neutro, e esvaziar a bexiga
duas horas antes da coleta. A coleta é feita por masturbação e, logo após, o paciente realiza a coleta de
urina em um frasco estéril.

Logo quando a urina chega ao laboratório, realizamos a leitura do pH, para verificar se ele não está ácido, o
que seria prejudicial aos espermatozoides. Depois, separamos a urina em tubos cônicos de 15mL e
centrifugamos. Todos os pellets são, então, colocados juntos em um novo tubo cônico, e a eles
adicionamos 5,0mL meio de cultivo tamponado para lavagem (sperm wash).

Retiramos o sobrenadante e realizamos uma nova lavagem. Após esse processamento, realizamos uma
análise da amostra para determinar a concentração e a motilidade dos espermatozoides.

Inseminação intrauterina (IIU)

A inseminação intrauterina é um tratamento de baixa complexidade para o qual manipulamos apenas o

sêmen, a fim de capacitá-lo. Esse processo é realizado no laboratório de andrologia e visa processar e
preparar o sêmen de forma que a amostra inseminada contenha os melhores espermatozoides. A IIU, em
geral, é um procedimento rápido e indolor, que não necessita de sedação.
Para esta técnica, elegemos o preparo seminal adequado de acordo com a qualidade da amostra seminal.
Uma vez terminada a etapa de preparo, a amostra capacitada resultante é carregada em uma seringa de
1mL e inseminada no útero da paciente por meio de um cateter previamente posicionado pelo médico.

Processo de inseminação intrauterina.

Recomendação
A paciente deve estar com a bexiga cheia (para melhor posicionamento do útero) e em posição
ginecológica.
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

O espermograma é um exame que fornece informações importantes sobre a produção de

espermatozoides e das funções secretoras das glândulas acessórias. Sobre esse exame, é correto
afirmar:

A Um único espermograma fornece diagnóstico definitivo da qualidade seminal.

B Consiste na avaliação de parâmetros macro e microscópicos.

C Avalia somente motilidade dos espermatozoides.

D Não avalia a morfologia dos espermatozoides.

 E É indicada abstinência de 10 dias.

Parabéns! A alternativa B está correta.

Um único espermograma não é diagnóstico definitivo da qualidade seminal, uma vez que diferentes
amostras de um mesmo paciente podem apresentar variações e sofrer alterações devido à ação de
fatores externos. O período de abstinência indicado é de 2 a 7 dias.

A amostra passará por uma análise macroscópica, que consiste na verificação da presença de
coágulos, liquefação, viscosidade, aspecto, cor, pH, e volume seminal. Já na avaliação microscópica,
observamos a concentração, motilidade dos espermatozoides e concentração de células redondas.

Questão 2

As técnicas de preparo seminal nos permitem preparar uma amostra com maior concentração de
espermatozoides e com melhor motilidade, e retirar as células germinativas, debris e espermatozoides
inviáveis.

Qual processamento realizamos em uma amostra com volume de 3,0mL, viscosidade normal, pH 7,2,
liquefação completa de 30 minutos, com concentração de 120 milhões /mL, 74% de motilidade
progressiva, sendo que o paciente possui sorologia de HIV reagente?

A Gradiente de densidade

B Swim-up +Lavagem

C Lavagem

D Swim-up + Gradiente

E Gradiente + lavagem + lavagem + Swim-up

 Parabéns! A alternativa E está correta.

Como o paciente possui HIV, realizamos o processamento para casais sorodiscordantes, no qual a
principal preocupação é a retirada de todo o plasma seminal, para que não haja carga viral na amostra.
Outro detalhe importante é que se trata de uma amostra com boa qualidade, ou seja, conseguimos
realizar todos os processamentos.

Assim para pacientes com carga viral positiva, realiza-se um gradiente descontínuo de densidade, com
dupla lavagem do pellet em meio de cultura tamponado, que podem ser seguidas por um swim-up,
dependendo da qualidade seminal.

2 - Laboratório de embriologia e técnicas de fertilização

in vitro
Ao final deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas de fertilização in vitro

Punção ovariana
Sabemos que as técnicas de alta complexidade são definidas pela necessidade de manipulação de oócitos
e embriões em laboratório, mas você sabe como são obtidos os oócitos?

Após a estimulação ovariana controlada, ocorre a punção ovariana com aspiração folicular para obtenção
dos oócitos. Com a paciente sedada e em posição ginecológica, o médico utiliza um transdutor de
ultrassom transvaginal com um guia acoplado.

O ultrassom permite localizar os ovários e visualizar os folículos em seu interior, enquanto o guia permite o
movimento controlado de uma longa agulha, com a qual o médico puncionará cada folículo para aspirar
todo o líquido nele contido, tendo em mente que, teoricamente, cada folículo contém um oócito.

Saiba mais

É possível não encontrarmos oócito em alguns folículos, seja porque ele não se soltou da parede folicular e,
por isso, não foi aspirado ou porque o folículo realmente não continha oócito. Em alguns casos, pode
ocorrer o que chamamos de Síndrome do Folículo Vazio, quando nenhum ou a maioria dos folículos não
fornece oócito algum. Essa síndrome pode ter várias causas, sendo a maioria ligada à medicação da
estimulação ovariana controlada.

Ilustração 3D do processo de aspiração folicular.

Existem sistemas diferentes de aspiração folicular: com seringas (manualmente) ou com bombas de
aspiração automática. Independentemente da técnica utilizada, uma vez aspirado, o líquido folicular é
encaminhado ao laboratório de embriologia para ser analisado pelo embriologista.

Quando analisamos o líquido folicular (em uma placa, como na figura a seguir), buscamos o complexo
cumulus-oophorus (CCO), que, a olho nu, se apresenta como pequenas estruturas com aspecto semelhante
à clara de ovo.

A análise é feita com auxílio de um estereomicroscópio (ou “lupa”) e, com ele, conseguimos visualizar o
oócito no interior do CCO.

Uma vez verificada a presença de oócito, com uma pipeta Pasteur de vidro, transferimos esse CCO para
outra placa contendo meio de cultivo tamponado, na qual ficarão todos os CCOs identificados até o término
da análise de todo o líquido folicular aspirado pelo médico.

Punção ovariana com esteroscoópio.

Uma vez finalizada a análise dos líquidos foliculares, os CCOs são trocados de placa, sendo, agora,
colocados em uma com meio de cultivo não tamponado, para serem incubados até a hora da denudação
enzimática/ mecânica ou da FIV convencional.

Fertilização in vitro (FIV) convencional

A FIV convencional é feita duas horas (h) após a punção oocitária e consiste em colocar os CCOs em
contato com os espermatozoides recuperados após processamento seminal, em placa e meio de cultivo
específicos.

Não existe consenso sobre uma concentração ideal de espermatozoides na amostra capacitada a ser
utilizada na FIV convencional, mas os profissionais costumam trabalhar com valores entre 50 e 500 mil
espermatozoides/mL, a depender da quantidade de CCOs a serem inseminados.

Por necessitar de uma quantidade mínima razoável de espermatozoides pós-capacitação, com boa
motilidade, não é um procedimento indicado em casos de fator masculino severo.

E como ocorre a fecundação nesta técnica?

A fecundação ocorre
similarmente à natural, com
as células da granulosa (que
fazem parte do CCO)
desempenhando papel
fundamental na seleção do
espermatozoide que

i á f tili ó it
 conseguirá fertilizar o oócito
— motivo pelo qual elas não
são retiradas.

No dia seguinte à
coincubação dos gametas,
procedemos com a
denudação dos óvulos para
verificar se a fertilização
ocorreu. Um zigoto
corretamente fertilizado,
como já vimos, deve
apresentar dois pró-núcleos e
dois corpúsculos polares
entre 16 e 18h após a
fecundação.

Aqueles que apresentarem

fertilização incorreta são
descartados, enquanto os
outros são mantidos em
cultivo para que possamos
acompanhar seu
desenvolvimento até o
momento da criopreservação
ou transferência.

Denudação oocitária
A denudação do oócito nada mais é do que a retirada das células do cumulus e da corona radiata, o que
permite a verificação do estágio de maturação oocitária. É feita em duas etapas: química e mecânica.
 A etapa química da denudação simula o que aconteceria na fecundação natural: lavamos os CCOs em uma
solução de hialuronidase, que, naturalmente, seria liberada pelo acrossomo do espermatozoide.

orona radiata
Células da corona radiada são aquelas células mais internas do cumulus, imediatas à zona pelúcida.

Denudação oocitária com pipetador stripper.

Como consequência dessa lavagem, as interações celulares são enfraquecidas e as células do cumulus se
dissolvem. Dessa forma, as poucas células restantes do cumulus e as da corona radiata são retiradas de
forma mecânica.

Para isso, utiliza-se um pipetador, chamado stripper, ao qual acoplamos capilares com pontas bem finas
(135 - 170µm de diâmetro) e, com eles, fazemos rápidos movimentos de sugar e soltar os oócitos,
passando-os por diversas gotas de meio de cultivo tamponado, até vermos com clareza a zona pelúcida, o
espaço perivitelínico (que, nos oócitos maduros, contém o corpúsculo polar) e o citoplasma oocitário.

Após a etapa de denudação, os oócitos imaturos são descartados e os maduros podem ser criopreservados
ou submetidos à ICSI.
 Fertilização in vitro com ICSI
A FIV com ICSI é realizada aproximadamente 4h após a punção ovariana, podendo haver variação nesse
tempo de acordo com o protocolo de cada clínica.

Para tal procedimento, preparamos uma placa específica com pequenas gotas de meio tamponado, na qual
são colocados os oócitos maduros, e uma gota de PVP, na qual é colocada uma pequena alíquota da
amostra contendo os espermatozoides capacitados.

Essas gotas são cobertas com óleo mineral ou de parafina, de uso específico para laboratórios de
reprodução assistida, para evitar evaporação dos meios. Essa placa é, então, levada ao microscópio com
sistema micromanipulador, em cujos suportes acoplamos microagulhas que nos permitem manipular os
gametas com precisão.

VP
É uma substância viscosa que faz com que os espermatozoides se movimentem mais lentamente.

Micromanipulador.

Esse microscópio nos permite um aumento de até 400x, o que nos auxilia na avaliação da morfologia dos
espermatozoides para sua seleção. Apesar disso, alguns profissionais preferem trabalhar com aumento de
200x, por oferecer um campo mais amplo de visão.

Mas qual é o jeito correto para fazermos esta avaliação?

Resposta
Não existe certo ou errado ‒ como estamos vendo, os protocolos podem variar entre as clínicas e o modo
de trabalho de cada profissional, em várias etapas ‒, o importante é que o método de escolha seja validado
para a aplicação na rotina.

O sistema de micromanipulação pode ter injetores pneumáticos (cuja regulação dos movimentos é à base
de ar) ou hidráulicos (que usam óleo para regular os movimentos). Os injetores regulam a pressão de
aspiração/ejeção das microagulhas.

O sistema de micromanipulação tem dois sistemas injetores, um de cada lado: de um lado, conectamos a
microagulha de holding; com diâmetro maior, vai estabilizar o oócito na posição correta para ser injetado; do
outro lado, conectamos a agulha de injeção, com diâmetro menor e um bisel na ponta, e que será usada
para quebrar a cauda dos espermatozoides, aspirá-los e injetá-los nos oócitos.

Detalhe com as agulhas do micromanipulador.

O oócito deve ser posicionado de forma que o corpúsculo polar fique para cima ou para baixo (na posição
de 12h ou 6h), porque, teoricamente, o fuso meiótico estaria na porção citoplasmática próxima ao local em
que o corpúsculo foi expulso. Qualquer perturbação no fuso meiótico poderia ser prejudicial à conclusão da
meiose e ao posterior desenvolvimento do zigoto.

Dessa forma, essas posições oferecem menos risco de interferência no fuso quando a agulha de injeção
entra no oócito. Após a ICSI, os óvulos são transferidos para uma placa com gotas de meio de cultivo não
tamponado com pH e temperatura previamente equilibrados, e voltam para a incubadora.

Saiba mais

A ICSI possibilita a fertilização do oócito em casos de fator masculino grave, uma vez que só precisamos de
um espermatozoide para ser injetado no interior de cada oócito.
Cultivo embrionário
Após o procedimento de fertilização in vitro, os óvulos voltam à incubadora e ali permanecem até o dia da
transferência ou criopreservação embrionária. A função das incubadoras é mimetizar as condições das
trompas e cavidade uterinas, que seriam o local de fertilização e desenvolvimento embrionário em
condições naturais.

O gás que supre as incubadoras ‒ seja apenas gás carbônico ou uma mistura desse gás com oxigênio e
nitrogênio ‒ tem a função de regular o pH do meio de cultivo, proporcionando aos embriões um pH
semelhante ao do ambiente uterino. Para regular o pH do meio, regulamos a porcentagem de gás injetado
na incubadora.

Quando aumentamos a concentração de gás, ao reagir com os componentes do meio de cultivo, ele o torna
ácido, diminuindo seu pH; quando diminuímos a concentração de gás, o pH do meio aumenta.

Existem diferentes tipos de incubadoras: verticais, de bancada, secas, úmidas, monogás, trigás, com
sistema de monitoramento ou sem. Vamos, agora, conhecer as principais.

Incubadoras verticais
Incubadora vertical.

As incubadoras verticais são mais antigas, mas ainda utilizadas em muitos laboratórios. Apesar das
incubadoras verticais oferecerem mais espaço para acomodar placas, são mais instáveis, uma vez que
possuem apenas uma porta e, ao abri-la, o ambiente de todas as placas é influenciado.

Além disso, a limpeza das incubadoras verticais é demorada e requer que elas sejam desmontadas para que
todas as peças sejam lavadas individualmente.

Incubadoras de bancada
Já as incubadoras de bancada ocupam menos espaço e sua manutenção é mais rápida e simples, motivo
pelo qual elas vêm sendo a opção mais escolhida atualmente. Além disso, a limpeza das incubadoras de
bancada não requer retirada de peças.

Incubadoras de bancada - trigás.

Essas incubadoras, ainda que possuam modelos diferentes, costumam ter nichos separados e se
estabilizam mais rapidamente após a abertura das tampas.

Incubadoras de bancada com time-lapse

As incubadoras com sistema de monitoramento (sistema de time-lapse) são as mais modernas (e mais
caras) e, apesar de seu uso ser bastante comum nas clínicas dos países de primeiro mundo, no Brasil, ainda
ocupam um tímido espaço no mercado.
Incubadora de bancada com time-lapse.

As incubadoras com time-lapse são incubadoras de bancada com câmeras internas acopladas que
registram o desenvolvimento dos embriões, fotografando-os a cada período determinado
(aproximadamente 10 minutos).

Assim, forma-se um vídeo do desenvolvimento embrionário que nos permite analisar cada etapa do
processo. Essas incubadoras têm placas especiais de cultivo, projetadas de forma que os embriões
permaneçam dentro do campo de abrangência da câmera, permitindo que as fotos sempre compreendam a
totalidade do embrião, para que nenhum detalhe seja perdido.

Saiba mais

As incubadoras com time-lapse, geralmente, possuem programas próprios que nos permitem marcar o
horário em que cada evento aconteceu ao analisar o vídeo: por exemplo, podemos registrar o momento de
aparecimento e desaparecimento dos pró-núcleos, da primeira divisão celular, de início e término da
compactação, de início da formação do blastocele, entre outros.

Como foi dito, a maioria das clínicas brasileiras possui incubadoras sem sistema de monitoramento. Dessa
forma, para acompanharmos o desenvolvimento embrionário, é necessário retirar a placa da incubadora e
levá-la ao microscópio. Assim, observamos e anotamos cada estágio pontualmente.

Lembrando que, nessas placas, os embriões se encontram em meio de cultivo não tamponado; por isso, o
procedimento de observação deve ser rápido (menos de dois minutos, idealmente) para não desestabilizar
 as condições de pH e temperatura nas quais os embriões se encontram.

As observações estáticas não nos permitem saber o que aconteceu previamente ao que estamos
observando, por exemplo: se, ao avaliar a fertilização, o zigoto apresenta apenas um pró-núcleo, não temos
como saber se é apenas um caso de assincronia, de singamia, ou se, realmente, só houve aparição de um
pró-núcleo.

Essa é uma vantagem do sistema de monitoramento que nos permitiria esclarecer essa dúvida ao
analisarmos os registros feitos, que nos oferecem observação dinâmica.

Como nosso objetivo é tirar os embriões das incubadoras, o mínimo possível para não os expor às
condições ambientes, fazemos observações estáticas em momentos críticos do desenvolvimento:

bservações estáticas
Aquelas que fazemos apenas quando retiramos a placa da incubadora e observamos os embriões ao
microscópio.

ssincronia
Assincronia da aparição dos pró-núcleos é quando os pró-núcleos feminino e masculino aparecem em tempos
diferentes.

ingamia
União dos pró-núcleos, formando um envoltório nuclear único.

bservação dinâmica
É aquela oferecida pelo sistema de monitoramento de time-lapse, em que vemos um vídeo do desenvolvimento,
e não apenas uma “foto" de um momento pontual.
 No primeiro dia (D1)

Para verificar se a fertilização ocorreu corretamente

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No terceiro (D3) e no quinto dia (D5)

Caso o cultivo seja até o estágio de blastocisto.

Situações especiais incluem observação no segundo dia (D2) ‒ geralmente se o cultivo for até D3, para
termos mais dados sobre a evolução do embrião ‒ e no sexto ou sétimo (D6/ D7), caso o embrião não tenha
alcançado o estágio de blastocisto no quinto dia.

Saiba mais

É incomum observarmos o quarto dia de desenvolvimento, a não ser que seja necessário obter mais
informações, a fim de tomar alguma decisão sobre transferência ou criopreservação. Não é incomum que
os embriões atrasem um pouco seu desenvolvimento e acabem alcançando o estágio de blastocisto
expandido no sexto ou ‒ apesar de menos frequente ‒ sétimo dia de cultivo.

Transferência embrionária
A última etapa do tratamento de fertilização in vitro que envolve o laboratório é a transferência embrionária.
Para esse procedimento, os embriões a serem transferidos se encontram, inicialmente, em uma placa com
meio de cultivo, que permanece na incubadora até o momento da transferência.

O preparo da paciente para a transferência embrionária requer que ela esteja com a bexiga cheia para ajudar
no posicionamento e visualização do útero. Na anatomia feminina sem alterações, o útero é anterovertido e
localizado atrás da bexiga. Quando a bexiga enche, "empurra" o útero, deixando-o mais alinhado com o canal
vaginal, o que facilita a passagem do cateter contendo o(s) embrião(ões).

nterovertido
Flexionado para a “frente" do corpo, sobre a bexiga, formando um ângulo de aproximadamente 90º com o canal
vaginal.

Útero em posição normal (anterovertido).

A transferência embrionária não requer sedação, salvo alguma indicação médica específica. A paciente é
preparada em posição ginecológica e, com auxílio de ultrassonografia abdominal, o médico insere um fino
cateter guia pelo canal vaginal, atravessando o colo uterino e posicionando-o, por fim, a alguns centímetros
do fundo do útero.

Atenção!

Apesar de, em geral, ser um procedimento rápido e indolor, a paciente pode sentir uma leve cólica durante o
posicionamento do cateter-guia, especialmente durante a passagem pelo colo do útero e, principalmente, se
houver estenose. Também pode ser um procedimento incômodo e um pouco mais demorado se a anatomia
uterina for alterada.

stenose
Estreitamento do colo do útero, colo muito “fechado”. Em alguns casos, é necessário dilatar o colo com um
aparelho especial para permitir a passagem do cateter.

Uma vez que o cateter-guia esteja devidamente posicionado, é o momento do embriologista trazer o cateter
interno contendo os embriões a serem transferidos. Esse cateter passa por dentro do cateter-guia
previamente posicionado e avança um pouco mais, ficando a aproximadamente 1cm de distância do fundo
uterino, local onde os embriões serão depositados.
 Se os embriões forem depositados muito próximos ao fundo do útero, o risco de gravidez ectópica
aumenta; por isso, a distância de aproximadamente 1cm é recomendada.

ravidez ectópica
É definida pela implantação do embrião em local que não seja a cavidade uterina. O local mais comum de se
ocorrer gravidez ectópica é nas trompas de Falópio, mas também pode ocorrer no cérvix (colo), ovários e até
mesmo no abdômen, fora do útero. O feto não sobrevive à gravidez ectópica.

Embriologista carregando um cateter para transferência embrionária.

No laboratório, o embriologista lava o cateter com meio de cultivo, aspirando o meio com uma seringa de
1mL, acoplando-a ao cateter e pressionando seu êmbolo, para que o meio corra por dentro do cateter.

Uma vez terminada essa etapa de lavagem (que é opcional e pode variar de acordo com o protocolo local), a
seringa permanece acoplada no cateter e, para carregar os embriões, o embriologista deve pegar na
incubadora a placa na qual eles estão contidos e aspirá-los na extremidade do cateter oposta à qual a
seringa está acoplada. O cateter contendo os embriões é, então, levado até o médico.

Após o devido posicionamento do cateter trazido pelo embriologista, o médico (ou o embriologista, a
depender do protocolo local) pressiona a seringa delicadamente para depositar os embriões no local
desejado. Apesar de haver diferenças nos protocolos de carregamento do cateter, é costumeiro deixar uma
pequena bolha de ar antes e/ou depois dos embriões.
 E você sabe por que isso é feito? expand_more

Isso é feito porque o ar, quando visualizado no ultrassom, fica branco, o que ajuda a referenciar a
posição dos embriões no útero após a transferência, uma vez que os embriões em si não podem ser
visualizados na imagem do ultrassom.

Terminada a transferência, o cateter é retirado e entregue ao embriologista, que o levará ao laboratório para
verificar se os embriões não ficaram grudados no cateter. Caso isso aconteça, o processo é refeito e os
embriões são transferidos novamente.

A transferência embrionária pode ser realizada no ciclo a fresco ou em um ciclo com embriões
descongelados e preparo endometrial específico. O estágio de desenvolvimento dos embriões a serem
transferidos varia de acordo com o caso. Essa é uma decisão conjunta da equipe médica e de
embriologistas, que vão sugerir a melhor conduta em cada caso, respeitando, claro, a decisão dos
pacientes.

video_library
Transferência embrionária
Neste vídeo, a especialista explica os detalhes da transferência embrionária.
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

Os oócitos são obtidos por punção ovariana com aspiração do líquido folicular. Uma vez aspirado, o
líquido folicular é encaminhado ao laboratório de embriologia para ser analisado pelo embriologista. O
que o embriologista procura identificar no líquido folicular?
 A Oócitos sem células à sua volta

B Óvulos

C Complexo cumulus-oophorus

D Embriões

E Apenas células da granulosa oocitária

Parabéns! A alternativa C está correta.

No líquido folicular, o embriologista identifica o oócito envolto pelas células da granulosa, CCO
(complexo cumulus-oophorus), que se apresenta como pequenas estruturas com aspecto semelhante à
clara de ovo.

As células da granulosa (que fazem parte do CCO) desempenham papel fundamental na seleção do
espermatozoide que conseguirá fertilizar o oócito.

Questão 2

Os tratamentos de reprodução assistida podem ser de alta ou baixa complexidade. Um dos tratamentos
de alta complexidade é caracterizado por injetar um único espermatozoide no interior de cada oócito
maduro, sendo este previamente denudado. Sobre esse procedimento, considere as afirmativas a
seguir:

I- Trata-se do procedimento de FIV com ICSI.

II- Para esse procedimento, costuma-se posicionar o oócito com o corpúsculo polar na posição de 3h
ou 9h, para que o espermatozoide não seja injetado de uma forma que perturbe o fuso meiótico.

III- Para esse procedimento, não é necessário nenhum equipamento específico além da lupa
(estereomicroscópio).
IV- Qualquer perturbação no fuso meiótico poderia ser prejudicial à conclusão da meiose e ao posterior
desenvolvimento do zigoto.

Estão corretas as afirmativas:

A I, II e III

B I e IV

C II e III

D I, II e IV

E II e IV

Parabéns! A alternativa B está correta.

Para a FIV com ICSI, o oócito deve ser posicionado com o corpúsculo polar para cima ou para baixo
(posição das 12h ou 6h), sendo necessário um sistema de micromanipulação e microscópio com
aumento de 200-400x. Portanto, as afirmativas I e IV estão corretas.
3 - Técnicas especiais empregadas no laboratório de
embriologia
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer as técnicas especiais empregadas no
laboratório de embriologia clínica.

Técnicas alternativas de obtenção de espermatozoides

Até agora falamos sobre pacientes que possuem espermatozoides no ejaculado; porém, existem os
pacientes azoospermicos, ou seja, que apresentam ausência de espermatozoides no ejaculado.
 Os casos de azoospermia podem ser classificadas como azoospermia não obstrutiva ou azoospermia
obstrutiva.

Azoospermia obstrutiva

Nestes casos, a espermatogênese e os níveis hormonais de FSH, LH e testosterona são normais. O que
ocorre é a obstrução no sistema de dutos de transporte dos espermatozoides, impedindo a passagem
desses gametas. Pode ser causada por vasectomia, traumas, epididimites, cirurgias inguinais, entre
outras causas.
close

Azoospermia não obstrutiva

Nestes casos não ocorre a espermatogênese.

É indicativo de que, em algum momento, houve uma agressão ao testículo — como a varicocele,
orquite, criptorquidia, quimioterapia, entre outras causas.

asectomia
Cirurgia de esterilização masculina, na qual o médico corta os ductos deferentes, responsáveis por levar os
espermatozoides dos testículos ao pênis.

pididimites
Inflamações no epidídimo.
Nesses casos de azoospermia no ejaculado, uma alternativa é tentar a obtenção de espermatozoides por
métodos cirúrgicos. Dentre os métodos de recuperação cirúrgica de espermatozoides, encontram-se:

Aspiração Percutânea de Espermatozoides do Epidídimo expand_more

Neste método, também conhecido como PESA (na abreviação do termo em inglês), o epidídimo é
puncionado com uma pequena agulha e seringa para retirada dos espermatozoides.

Esquema mostrando a aspiração de espermatozoides pela técnica de PESA.

É no epidídimo que os espermatozoides completam sua maturação; por isso, é a técnica mais
utilizada em casos de azoospermia obstrutiva ou vasectomia.

Aspiração Microcirúrgica de Espermatozoides do Epidídimo expand_more

A técnica conhecida como MESA (na abreviação em inglês) segue o mesmo princípio da PESA,
porém com um grau maior de complexidade, uma vez que o urologista utiliza um microscópio para
localizar os espermatozoides no epidídimo. Essa técnica é utilizada em casos especiais, como
epidídimos de volume reduzido.
 A figura ilustra a ampliação do epidídimo, local em que os espermatozoides são coletados por aspiração.

Aspiração de Espermatozoides do Testículo expand_more

Esta técnica, conhecida como TESA (na abreviação em inglês), é indicada em casos de azoospermia
obstrutiva e não obstrutiva, impossibilidade de ejaculação e ausência de espermatozoides em
amostras do epidídimo, esta técnica consiste em aspirar parênquima testicular.

Esquema mostrando a aspiração de espermatozoides pela técnica de TESA.

A amostra aspirada segue para o laboratório, onde é feita a dissecção dos túbulos seminíferos para
confirmar a presença de espermatozoides. Também está indicada nos casos de suspeita de defeito
de maturação dos espermatozoides (que ocorre no epidídimo).

Extração de Espermatozoides do Testículo expand_more

Esta técnica, conhecida como TESE (na abreviação em inglês), também é utilizada para obtenção de
parênquima testicular (como na TESA). Nesse método é feita a biópsia de um pequeno fragmento de
parênquima testicular, retirado com pinça ou tesoura, após pequenas incisões.

Esquema mostrando a biopsia do tecido - extração de um pequeno fragmento de parênquima testicular durante a TESE.
 O fragmento retirado segue o mesmo processamento laboratorial que a TESA, ou seja, é dissecado
até que permita a visualização dos túbulos seminíferos.

Extração de Espermatozoides do Testículo por Microdissecção expand_more

A técnica conhecida como micro-TESE (na abreviação em inglês), é semelhante à TESE. Seu
diferencial é que esta técnica utiliza um microscópio cirúrgico que permite melhor visualização dos
túbulos seminíferos e identificação das áreas com maior probabilidade de produção ativa de
espermatozoides (espermatogênese).

Microdissecção do testicular realizada na Micro-TESE. A espermatogênese provavelmente é mais ativa na imagem superior.

zoospermia obstrutiva
Causada por alguma obstrução nos canais do sistema reprodutor masculino, que impediria a passagem e
ejaculação dos gametas.

Nos casos de PESA ou MESA, podemos realizar a técnica de sperm wash na amostra, a fim de concentrar os
espermatozoides. Nessas técnicas geralmente são encontrados poucos espermatozoides, e com baixa
motilidade. Quando há necessidade de realizar essas técnicas para a obtenção dos espermatozoides,
realiza-se obrigatoriamente a ICSI.

Nessas amostras, também podemos realizar o teste hiposmótico (HOS). Nesse caso, com o auxílio da
agulha de ICSI, colocamos somente a cauda do espermatozoide na solução e verificamos se ocorre o
inchaço seguido de uma curvatura na cauda, indicando viabilidade celular.

Outro teste que podemos realizar nessas amostras é o teste de flexibilização da cauda. Com o auxílio de
uma agulha de ICSI, manipulamos a cauda do espermatozoide para cima e para baixo: os espermatozoides
que obtiverem um movimento da cauda independente da cabeça podem ser utilizados.
Quando há movimento de toda a estrutura do espermatozoide, considera-se o espermatozoide inviável para
o procedimento.

Técnicas alternativas de seleção espermática

Existem algumas técnicas para seleção de espermatozoides que se baseiam em características específicas.
Vamos conhecê-las?

PICSI

Abreviação do termo em inglês que designa Injeção Intracitoplasmática Fisiológica de Espermatozoide,

essa técnica tem por objetivo selecionar espermatozoides teoricamente livres de fragmentação de DNA. Um
alto índice de fragmentação do DNA espermático pode reduzir as chances de gravidez, causar abortos ou
síndromes genéticas.

Para sua realização, os espermatozoides são colocados em uma placa específica contendo ácido
hialurônico. O princípio é que espermatozoides maduros se ligariam ao ácido. Entretanto, não existem
estudos comprovando que espermatozoides maduros apresentam menores índices de fragmentação em
seu DNA.

Dessa forma, é necessário que mais estudos sobre essa relação sejam realizados, uma vez que até o
momento eles não mostram diferenças significativas nas taxas de nascidos vivos com espermatozoides
selecionados por PICSI ou por ICSI.

Super ICSI/ IMSI

Seleciona espermatozoides baseando-se em sua morfologia, eles são analisados e escolhidos pelo
embriologista com ajuda de uma magnificação de 6000 vezes — aproximadamente 10 vezes mais do que
em uma ICSI comum.

Apesar dessa alta magnificação proporcionada, essa tecnologia não garante que o espermatozoide
selecionado será geneticamente saudável, uma vez que não é possível verificar sua carga genética, apenas
sua morfologia.
 Microfluídica

Atualmente com uso crescente no mercado, essa técnica é baseada na capacidade dos espermatozoides
de nadarem através de microcanais. Dessa forma, seleciona espermatozoides baseando-se em sua
morfologia e motilidade, sem os efeitos negativos causados pela centrifugação. Também tem se mostrado
eficiente em selecionar espermatozoides com DNA íntegro.

Saiba mais
A centrifugação — necessária em técnicas como gradiente de densidade e sperm wash — tem efeito
prejudicial na integridade espermática, especialmente por aumentar os índices de fragmentação de DNA.

video_library
Técnicas alternativas de seleção espermática
Neste vídeo, a especialista apresenta as principais alternativas de seleção espermática, demonstrando seu
passo a passo, aplicação e vantagens e desvantagens.

Assisted Hatching (Eclosão Assistida)

Já comentamos sobre esse termo em momentos anteriores, mas agora vamos retomá-lo e explicá-lo com
mais detalhes.

Na fecundação natural, o oócito é fertilizado nas trompas, vai se dividindo e multiplicando suas células
enquanto se desloca em direção ao útero. Quando chega na cavidade uterina, por volta do quinto dia de
desenvolvimento, rompe a zona pelúcida e o trofoblasto começa a invadir o endométrio, no processo
chamado de nidação, que define o início da implantação do embrião.
O rompimento da zona pelúcida (eclosão) ocorre porque, quando o embrião atinge o estágio de blastocisto,
ele continua multiplicando suas células e aumentando o tamanho da blastocele. Esse aumento do tamanho
do embrião, como um todo, vai pressionando a zona pelúcida por dentro, que vai afinando até o momento da
eclosão.

Também é comum que o embrião passe por algumas contrações e reexpansões para auxiliar o processo de
eclosão. É assim que o trofoblasto fica livre para iniciar o processo de implantação.

Contudo, em alguns casos, a zona pelúcida pode apresentar condições que dificultam seu afinamento e
eclosão do embrião. Isso acontece, por exemplo, em embriões desvitrificados, uma vez que o processo de
criopreservação “endurece" a zona pelúcida, de modo que ela perde sua “elasticidade" e, portanto, o embrião
tem mais dificuldade para eclodir.

Nesse caso, pode ser que ele precise de um número maior de contrações e reexpansões do que precisaria
naturalmente — gastando mais energia celular, o que pode ser prejudicial no momento da implantação
(outro processo que requer energia) — e, às vezes, pode nem conseguir eclodir, o que resultaria em
impossibilidade de implantação, uma vez que o trofoblasto precisa estar exposto para iniciar a nidação no
endométrio.

Zonas pelúcidas mais espessas, escuras ou densas que o ideal, também prejudicam a eclosão embrionária.

Assim sendo, nos casos em que a zona pelúcida do embrião apresente características que possam ser
prejudiciais à eclosão, realizamos um procedimento chamado de assisted hatching (AH), com o intuito de
facilitar a saída do embrião e, consequentemente, sua implantação. Esse procedimento pode ser feito de
três formas: química, mecânica e com laser.

AH químico

Uma pequena abertura é feita na zona pelúcida, com ácido de Tyrode.

AH mecânico

T bé h id di ã i ld (PZD) ét d i t f
 Também conhecido como dissecção parcial da zona (PZD), esse método consiste em fazer
uma pequena incisão na zona pelúcida, com auxílio de microagulhas. Foi o primeiro método
de AH utilizado.

AH com laser

Método mais utilizado atualmente, consiste em abrir um orifício na zona pelúcida do embrião
com auxílio de pulsos de laser. Para isso, é necessário um equipamento especial acoplado ao
micromanipulador.

Ilustração demonstrando o procedimento de AH.

Após o procedimento de AH, o embrião é transferido ao útero da paciente, e agora conseguirá sair da zona
pelúcida e se implantar no endométrio mais facilmente.
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

Vimos que existem algumas técnicas para seleção de espermatozoides que se baseiam em
características específicas. Em relação a elas, assinale as afirmativas a seguir:

I. A PICSI tem por objetivo selecionar espermatozoides teoricamente livres de fragmentação de DNA.

II. A super ICSI/ IMSI seleciona espermatozoides baseando-se em sua morfologia, com um aumento de
6000 vezes.

III. A super ICSI é capaz de selecionar espermatozoides geneticamente saudáveis.

É correto o que se afirma em:

A I

B II

C III

D I e II

E I e III

Parabéns! A alternativa D está correta.

A super ICSI não garante que o espermatozoide selecionado será geneticamente saudável, pois, mesmo
com a alta magnificação proporcionada, essa tecnologia não consegue verificar sua carga genética,
apenas sua morfologia. Portanto, as afirmativas I e II estão corretas.

Questão 2

Nos casos em que a zona pelúcida do embrião apresente características que possam ser prejudiciais à
sua eclosão, realizamos um procedimento chamado de assisted hatching (AH). Sobre essa técnica, é
correto afirmar que:

A Pode ser feita de três formas: química, mecânica e com laser.

B O método mais utilizado de AH hoje em dia é o químico.

 C O AH com laser também é conhecido como PZD.

O AH mecânico consiste em abrir um orifício na zona pelúcida do embrião e, para sua

D
realização, é necessário um equipamento especial acoplado ao micromanipulador.

O AH químico consiste em fazer uma pequena incisão na zona pelúcida e requer o

E
auxílio de microagulhas para ser realizado.

Parabéns! A alternativa A está correta.

AH químico é feito por uma pequena abertura na zona pelúcida, com ácido de Tyrode. Já o AH
mecânico, também conhecido como dissecção parcial da zona (PZD), consiste em fazer uma pequena
incisão na zona pelúcida, com auxílio de microagulhas. Foi o primeiro método de AH utilizado.

AH com laser: Método mais utilizado atualmente, consiste em abrir um orifício na zona pelúcida do
embrião com auxílio de pulsos de laser. Para isso, é necessário um equipamento especial acoplado ao
micromanipulador.

Considerações finais
Vimos que, no laboratório de andrologia, podem ser realizados diversos métodos de análise e preparo
seminal, tanto diagnósticos quanto terapêuticos. A escolha do processamento seminal depende do
procedimento que será realizado e da qualidade da amostra.

Já no laboratório de embriologia, acontecem todas as técnicas em que há manipulação de oócitos e

embriões, como fertilização in vitro e as etapas que a antecedem, cultivo embrionário e preparo do cateter
para transferência dos embriões.

Além disso, existem técnicas especiais que têm o objetivo de auxiliar no sucesso do tratamento de
reprodução assistida, como a obtenção cirúrgica de espermatozoides, as técnicas alternativas de seleção
 espermática e a técnica de eclosão assistida. Todas essas técnicas são realizadas pelos embriologistas.

O laboratório de reprodução assistida é o coração da clínica, onde acontecem os eventos mais importantes.
Por isso, deve ser um ambiente com rigoroso controle de qualidade e com profissionais capacitados.

headset
Podcast
Antes de finalizarmos, a biomédica Beatriz Campos bate um papo com a biomédica Ana Clara Esteves sobre
a sua experiência no laboratório de Andrologia e embriologia.

Explore +
Para aprofundar seus conhecimentos sobre o tema:

Leia o manual de laboratório da OMS para exame e processamento do sêmen humano. Disponível no site do
PNCQ.

Leia Sperm Preparation and Selection Techniques, de Beydola e colaboradores, e Sperm processing and
selection, de Sharma e Agarwal (2020), para aprofundar seus conhecimentos em técnicas de separação e
seleção espermática.

Leia o artigo Sperm Retrieval Techniques for Assisted Reproduction, de Esteves e colaboradores (2011), para
mais detalhes sobre as técnicas especiais de coleta de espermatozoides.
Referências
AZAMBUJA, R. et al. Reprodução assistida: técnicas de laboratório. 1 ed. Porto Alegre, RS: AGE, 2017.

ESTEVES, S.C. et al. An update on sperm retrieval techniques for azoospermic Clinics Review. 68(S1), pp.
99-110.

ESTEVES, S.C.; ROQUE, M. Extended indications for sperm retrieval: summary of current literature. F1000
Research, 2019, pp. 1-12.

GOSPODINOVA, M. et al. Developing a method for sperm selection trough Cumulus Ligands. Annual of Sofia
University “St. Kliment Ohridski” Faculty of Biology Book 4 — Scientific Sessions of the Faculty of Biology
2019, volume 104, pp. 335-347.

KEEL, B.A.; MAY,J.V.; JONGE, C.J. Handbook of the assisted reproduction laboratory. Florida: CRC press LLC,
2000.

PAREKATTIL, S. J. et al. Male infertily. Sperm Processing and Selection, 2020.

SIMON, L. et al. Sperm DNA fragmentation: consequences for reproduction. Advances in Experimental
Medicine and Biology. 2019.

The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Sperm retrieval for obstructive
azoospermia. American Society for Reproductive Medicine. 2006; 86(Suppl 4):S115–120.

OMS. Laboratory manual for the examination and processing of human semen. 6. ed. Geneva: World Health
Organization, 2021.

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Técnicas complementares na reprodução
assistida
Profª. Vanessa Nayane Pino Perez

Descrição

Técnicas complementares da reprodução humana assistida. Técnicas e indicações de criopreservação da

fertilidade. Tipos de diagnósticos pré-implantacionais e suas indicações.

Propósito

É importante compreender que, na reprodução assistida, existem técnicas complementares às técnicas

convencionais. Com elas, é possível preservar os gametas, embriões, tecidos ovarianos e óvulos, detectar
alguns problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade e alcançar maior probabilidade de
uma gravidez bem-sucedida.

Objetivos
Módulo 1

Diagnóstico genético pré-implantacional

Reconhecer os tipos de diagnóstico pré-implantacionais.

Módulo 2

Criopreservação
Descrever as técnicas de preservação da fertilidade.
Introdução
A fertilização in vitro (FIV) representa uma revolução no tratamento de casais com problemas de
infertilidade. Durante a realização da FIV, é possível utilizar técnicas complementares que têm como
objetivo superar problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade. Essas técnicas
surgiram como modo de aumentar as possibilidades de uma gravidez bem-sucedida e são
procedimentos realizados de acordo com as necessidades particulares de cada paciente. Consistem
em exames ou tratamentos que visam analisar, identificar e tratar problemas específicos que
possam causar a infertilidade ou a transmissão de doenças, especialmente aquelas de origem
genética. Assim, ao longo deste conteúdo vamos conhecer as principais técnicas complementares
empregadas em reprodução assistida, são elas: o teste genético pré-implantacional (PGT) e a
criopreservação de gametas e embriões.

Orientação sobre unidade de medida

Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de
tecnologia e didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número
e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem
seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades.
1 - Diagnóstico genético pré-implantacional
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer os tipos de
diagnósticos pré-implantacionais.

Introdução ao diagnóstico genético pré-

implantacional
O diagnóstico genético pré-implantacional (preimplantation genetic testing, PGT) é um teste que foi
inicialmente idealizado para detecção de mutações gênicas a fim de evitar a transmissão de doenças
hereditárias aos filhos.

O primeiro relato de sucesso com esta técnica ocorreu em 1990, com a detecção de uma doença de
herança recessiva ligada ao cromossomo X, a adrenoleucodistrofia. Para isso, foi realizada biópsia
embrionária em estágio de clivagem, a técnica de PCR (do inglês, polymerase chain reaction), verificada a
sexagem embrionária e foram excluídos os embriões do sexo masculino, possivelmente portadores do X
alterado e candidatos a ter a doença.

Em 1992, o mesmo grupo reportou o uso do PGT de forma ainda mais específica – para evitar fibrose
cística. Portanto, o PGT poderia evitar inúmeros casos de doenças geneticamente transmissíveis e
 incuráveis. Além disso, eles viram que alterações estruturais, como as translocações robertsonianas e as
translocações recíprocas, poderiam ser indicações para análise dos embriões.

Cariótipo apresentando translocação robertsoniana.

Translocações robertsonianas
Forma comum de rearranjo cromossômico que pode ocorrer nos cinco pares de cromossomos acrocêntricos,
ou seja, quando o centrômero está mais próximo das extremidades do que do centro, são eles os
cromossomos 13, 14, 15, 21 e 22.

Translocações recíprocas
Quando existe uma troca de partes de informações entre cromossomos diferentes.

A genotipagem do antígeno leucocitário humano (do inglês, Human Leukocyte Antigen) é outra aplicação do
PGT que, além de auxiliar na detecção de embriões afetados, pode contribuir para o tratamento de irmãos
que necessitam transplante de medula óssea compatível. A aplicação inicial do PGT evoluiu para uma visão
mais ampla do embrião, o rastreamento das aneuploidias, principal causa do insucesso reprodutivo. Logo, a
identificação dos embriões euploides compreende atualmente a imensa aplicação da biópsia embrionária
como forma de melhorar a eficácia da fertilização in vitro.

Diferentes tipos de testes genéticos pré-

implantacionais
No PGT, o conteúdo cromossômico total de uma ou poucas células é analisado com alta sensibilidade e
especificidade. No entanto, as células são obtidas a partir de um método invasivo e é necessário um alto
investimento para o laboratório com equipamentos especializados para a biópsia, como o laser.

Além disso, esse procedimento deve ser conduzido por embriologistas altamente
treinados para evitar viés dependente do operador nos resultados e para garantir o
mínimo impacto na viabilidade do embrião.

As denominações para os testes genéticos pré-implantacionais foram sofrendo alterações ao longo dos
anos. De acordo com a classificação mais recente da Sociedade Internacional de Diagnóstico Genético Pré-
implantacional (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society - PGDIS), as siglas utilizadas nos
diferentes testes genéticos pré-implantacionais são:

PGT-A (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidies)

O PGT-A (teste pré-implantacional de aneuploidias) é o mais comumente solicitado nos tratamentos de FIV
e tem como objetivo fazer um screening genético para identificar alterações quantitativas nos 23 pares de
cromossomos, apontando monossomias que podem ser parciais ou totais, trissomias, nulissomias etc.
Dentre as trissomias mais comuns e compatíveis com a vida estão:

Síndrome de Down
Trissomia do cromossomo 21.

Síndrome de Edwards
Trissomia do cromossomo 18.

Síndrome de Patau
Trissomia do cromossomo 13.

Alterações quantitativas ligadas aos cromossomos sexuais também podem ser compatíveis com a vida,
podendo aparecer na forma de trissomia (XXY - Síndrome de Klinefelter) ou monossomia (X0 - Síndrome de
Turner).
Monossomia do cromossomo X.

Trissomia do cromossomo sexual.

 As demais monossomias e trissomias diversas que são frequentemente encontradas nos laudos de PGT-A
durante a rotina laboratorial são consideradas incompatíveis com a vida, seja por não permitirem o processo
de implantação, seja por desencadearem uma implantação seguida de aborto precoce.

Atenção!
Apesar das causas da aneuploidia ainda não serem bem compreendidas, sabemos que o mecanismo
cromossômico mais comum é a não disjunção meiótica pela falha da separação correta de um par de
cromossomos durante uma das duas divisões meióticas – geralmente durante a meiose I.

Os critérios de indicação para a realização do PGT-A, mais comumente empregados, são a idade materna
avançada (>38anos), falhas repetidas de implantação, abortos recorrentes e fator masculino grave. Além
disso, o uso do PGT auxilia no aumento de transferência de um único embrião, diminuindo o risco de
gestações múltiplas.

PGT-M (Preimplantation Genetic Testing for Monogenic

disorders)
O PGT-M (teste pré-implantacional para identificação de doenças monogênicas) é o teste indicado para
casais com alto risco pessoal ou familiar para doenças monogênicas. Para casais com risco aumentado de
gerarem filhos com doenças genéticas, o PGT-M pode ser realizado para selecionar embriões que não
tenham a mutação. Acompanhe a seguir:

Doenças monogênicas
Doenças monogênicas são um grupo de doenças genéticas causadas por uma mutação ou alteração na
sequência de DNA de um gene específico e transmitidas de forma hereditária.

Padronização para Doença Monogênica

Em geral, é necessário fazer um estudo genético prévio da família, chamado de Padronização

para Doença Monogênica.

Detecção do histórico familiar

O PGT M t t é té i i di d it t i ã d d h ditá i é
 O PGT-M, portanto, é a técnica indicada para evitar a transmissão de doenças hereditárias pré-
existentes, como Fibrose Cística, Síndrome do X-Frágil, Distrofia Muscular, Doença de
Huntington, Anemia Falciforme entre outras.

Como você deve ter percebido, o critério para indicação do PGT-M é o histórico familiar. Atualmente, o PGT-
M é realizado para mais de 400 desordens gênicas, incluindo aquelas manifestadas desde o momento do
nascimento, até as manifestações tardias, na vida adulta.

PGT-HLA (Preimplantation Genetic Testing for Human

Leukocyte Antigen)
Neste caso, não se trata de evitar a transmissão de uma doença pré-existente ao futuro filho, como no PGT-
M, ou evitar aneuploidias, como no PGT-A.

O objetivo do PGT-HLA (teste pré-implantacional para a tipagem do HLA) é gerar uma gravidez a partir da
seleção de um embrião com HLA compatível ao de uma criança afetada por um distúrbio genético que
necessite de transplante de células-tronco hematopoiéticas (como nos casos de talassemia, leucemia etc.),
para que tenha chance de cura ou expectativa de vida prolongada.
 Após a seleção por PGT-HLA e o nascimento desse bebê, as células tronco hematopoiéticas são coletadas
do sangue do cordão umbilical ou da medula óssea do irmão doador compatível, ou de uma combinação de
ambas as fontes, e utilizadas para transplante no irmão afetado. O PGT-HLA consiste na determinação
indireta do HLA para identificar haplótipos compatíveis entre os embriões testados e a criança afetada.

Haplótipos
Haplótipo corresponde à combinação de um grupo de alelos de loci adjacentes, que fazem parte do mesmo
cromossomo, geralmente herdados como uma unidade. Um haplótipo pode ser formado por um ou vários
alelos, ou até pelo cromossomo inteiro.

PGT-SR (Preimplantation Genetic Testing for Structural

Chromosomal rearrangements)
PGT-SR (teste pré-implantacional para a detecção de alterações cromossômicas) é o teste genético que
identifica alterações cromossômicas envolvendo rearranjos estruturais nos embriões. Vamos entender
melhor?

family_restroom
Indivíduos com rearranjo estrutural balanceado

Nos casos em que um dos parceiros é portador de um rearranjo estrutural balanceado, como uma
translocação ou inversão, esse rearranjo resulta de uma quebra, recombinação ou troca
cromossômica, seguida de reconstituição em uma combinação diferente da normalidade e geralmente
não causa fenótipo no portador (um dos parceiros).
close

family_restroom
Embriões com possíveis rearranjos estruturais desbalanceados

Porém, os embriões gerados por esse indivíduo podem apresentar rearranjos estruturais
desbalanceados (ganho ou perda de um segmento cromossômico), que podem levar a falha de
 implantação, aborto espontâneo ou síndromes genéticas. Como exemplo, podemos citar as
translocações robertsonianas como as mais comumente encontradas.

Rearranjo estrutural balanceado

Alterações estruturais sem a perda ou acréscimo do material genético.

PGT-P (Preimplantation Genetic Testing for Polygenic

disorders)
O PGT-P (teste pré-implantacional para doenças poligênicas) é a técnica mais recente de todas e ainda
pouco difundida. As doenças poligênicas são influenciadas por variantes genéticas em mais de um gene. A
combinação das variantes nesses genes afeta a probabilidade de desenvolver condições poligênicas
durante o curso da vida de um indivíduo.

Durante a classificação dos embriões por esta técnica, cada embrião recebe uma
pontuação chamada "Índice Genômico". Esse índice é calculado a partir da
combinação de pontuações poligênicas de diferentes preditores de doenças e pode
ser usado para comparar o risco geral de doença entre embriões e
consequentemente auxiliar na decisão de qual embrião selecionar para fazer a
transferência.

Esse índice é utilizado para o cálculo do risco proporcional do desenvolvimento futuro da doença em
comparação com o risco médio dessa mesma doença na população em geral. Diferentemente do que
vemos no PGT-A, no qual os embriões são classificados como “normal” ou “alterado”, ou no PGT-M, em que
recebemos o laudo de cada embrião como “portador” ou “afetado”, no PGT-P cada embrião recebe uma
“razão de risco” de desenvolvimento futuro de cada uma das doenças disponíveis para teste.

Saiba mais
As doenças poligênicas avaliadas pelo PGT-P são: diabetes tipo 1 e tipo 2; câncer de mama, de testículo, de
próstata; melanoma maligno; carcinoma basocelular; esquizofrenia; doença arterial coronariana;
hipercolesterolemia; hipertensão; risco de ataque cardíaco.

Por outro lado, o PGT-P é uma ferramenta de avaliação de risco e não um método de diagnóstico. Com o
uso dessa metodologia, há risco de descartar embriões que poderiam ter um desfecho saudável em relação
à doença poligênica testada. A maioria dessas doenças é influenciada também por fatores ambientais
(estilo de vida, hábitos alimentares) e esses fatores não podem ser considerados na análise embrionária.

NICS (Non-Invasive Preimplantation Aneuploidy Testing)

NICS (teste genético pré-implantacional não invasivo para aneuploidias) é um método não invasivo de
screening cromossômico baseado no sequenciamento do DNA genômico secretado no meio de cultura
durante o desenvolvimento embrionário.

Placa de cultivo embrionário individual.

Recentemente, o NICS-PGT-A com a análise do cfDNA (DNA livre circulante) embrionário liberado para o
meio de cultura foi proposto como uma alternativa para superar a biópsia embrionária para teste de
aneuploidia.

Para essa análise, é retirado o meio de cultura no qual o embrião se desenvolveu até o estágio de
blastocisto e enviado para análise genética.

No entanto, o NICS ainda apresenta certas limitações, entenda:

Resultados falso negativos

Estudos mostram resultados falso negativos, ou seja, quando a análise do DNA obtido a partir dos
meios de cultivo identificou alterações cromossômicas em embriões cromossomicamente normais.
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Possível contaminação
 Nesse caso, o erro foi atribuído pelos pesquisadores a uma possível contaminação por células
foliculares maternas que rodeiam o óvulo, denominadas células da granulosa.

Ainda é cedo para adotar o diagnóstico genético pré-implantacional não invasivo (NICS), pois outros
estudos precisam ser realizados para garantir a efetividade da técnica que, quando estiver pronta para ser
colocada em prática, representará um ponto de cisão entre o antes e o depois na medicina reprodutiva de
precisão.

Interpretação de resultados
Antes de conhecermos as técnicas propriamente ditas, precisamos entender algumas definições e
conceitos para compreender melhor o que estamos investigando e o que será encontrado no laudo do
exame. Algumas dessas definições você já conhece, são elas:

Embrião euploide

É um embrião geneticamente normal, com 46 cromossomos completos, incluindo 22 pares de

autossomos e um par de cromossomos sexuais.

Embrião aneuploide

É b iã ti t lt d O d há d h d t
 É um embrião geneticamente alterado. Ocorre quando há perdas ou ganhos de segmentos
cromossômicos. Dessa forma, a falta de um cromossomo resultando em somente uma cópia
de um cromossomo específico se caracteriza como monossomia; a presença de um
cromossomo a mais, resultando em três cópias de determinado cromossomo, é
caracterizada como trissomia.

Mosaico

O mosaicismo ocorre quando um embrião apresenta células euploides e aneuploides como

resultado de erros na divisão celular (mitose) produzidos durante o desenvolvimento
embrionário.

Além desses conceitos precisamos conhecer outros, são eles:

Embrião afetado expand_more

Quando o embrião apresenta genes da doença monogênica familiar estudada.

Embrião não afetado expand_more

Embrião que, após análise genética para doença monogênica, não apresenta a doença familiar
estudada.

DNA não detectado ou inconclusivo expand_more

O embrião não tem a informação cromossômica necessária para a análise, o que pode ser
justificado por qualidade embrionária inadequada e/ou degradação do DNA obtido. Ainda durante a
biópsia celular, tais células podem ser perdidas, o que pode contribuir para esse resultado. Quando o
laudo aponta DNA não detectado ou inconclusivo, caso seja tomada a decisão de repetir a análise
com uma rebiópsia, é preciso descongelar o embrião para refazer o procedimento de retirada das
células e posterior recongelamento, para a espera do resultado da nova análise.

Deleção/Duplicação Parcial expand_more

Indica que uma parte de um cromossomo está ausente ou adquirida. Deleções e duplicações
diagnosticadas em um feto ou em nascidos vivos são geralmente associadas com anomalias físicas
ou cognitivas. O relatório vai mostrar um “- / + p ou q” com a região do cromossomo que é deletada
ou duplicada, respectivamente.
 Anormal Complexo expand_more

Uma amostra embrionária será classificada como anormal complexa se houver uma combinação de
cinco ou mais achados anormais, incluindo monossomia, trissomia e duplicação/deleção.

Técnicas de biópsia embrionária

Para realizar as técnicas de PGT, é recomendado que a paciente realize técnica de injeção
intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) e não a fertilização in vitro convencional a fim de evitar a
contaminação de células remanescentes do cumulus ou células espermáticas residuais anexadas à zona
pelúcida.

Durante a formação do blastocisto, as células embrionárias se diferenciam nas linhagens de massa celular
interna (MCI) e trofectoderma. Isso ocorre pela formação de uma cavidade (blastocele) preenchida com
fluido, devido à bomba de sódio e potássio.

Esquema representado o estágio de blastocisto.

Para biópsia das células embrionárias, é necessário primeiramente fazer uma abertura da zona pelúcida
(ZP). Para isso, podemos realizar três diferentes procedimentos, são eles: manipulação mecânica,
perfuração química com ácido Tyrode ou perfuração a laser. A perfuração a laser é mais fácil, rápida, precisa
e trata-se da metodologia mais utilizada mundialmente.

Existem diferentes tipos de técnicas para a retirada do material embrionário a ser analisado, vamos
conhecê-las?
Biópsia de blastômeros (embrião em estágio de
clivagem)
São removidos 1 ou 2 blastômeros (células) do embrião. Inicialmente, as biópsias embrionárias eram
frequentemente realizadas no estágio de clivagem (embrião com 6 a 8 células). Essa técnica apresenta
certa limitação, pois a quantidade de material genético analisado é pequena (menos representativa da
totalidade do embrião) e é um estágio que, por ser inicial, pode apresentar maiores taxas de mosaicismo – é
sabido que o embrião pode “corrigir" o mosaicismo ao longo do seu desenvolvimento, pela multiplicação de
maior quantidade de células saudáveis que afetadas – podendo ocorrer em até 60% das análises.

Biópsia de blastômero (retirada de célula no estágio de clivagem).

Já no estágio de blastocisto, a incidência de mosaicismo cai drasticamente, pelo número de células

analisadas ser maior e, portanto, uma amostra mais representativa do todo. Logo, a realização da biópsia na
fase de clivagem pode indicar um alto índice de falso positivo para aneuploidia.

A vantagem da biópsia nesse estágio de desenvolvimento (estágio de clivagem) é oferecer tempo suficiente
para o resultado da análise ser liberado em 24 horas, possibilitando a transferência do embrião a fresco
(embriões que são transferidos no mesmo ciclo de indução).
 Biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de
blastocisto)
Essa técnica é a mais utilizada atualmente. É realizada uma abertura na ZP, no terceiro, quarto ou quinto dia
de desenvolvimento embrionário. As células são aspiradas e excisadas com auxílio do laser para a quebra
das ligações celulares, ou aspiradas e feita a dissecção mecânica das células biopsiadas.

Excisão
Remoção de parte de um órgão ou tecido com instrumento cortante – nesse procedimento o instrumento
cortante que utilizamos é o laser.

Devido à quantidade de células retiradas (de 6 a 8 células), esse método proporciona uma melhor precisão
diagnóstica. O estágio de blastocisto demonstra ser menos sensível a possíveis danos durante a biópsia,
pois as células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna) são deixadas intactas.

A biopsia de trofectoderma apresenta uma maior acurácia e diminui a incidência de possíveis resultados
errôneos para mosaicismo. No entanto, ela requer o cancelamento da transferência embrionária no mesmo
ciclo, sendo necessária a criopreservação do embrião para transferência em ciclo posterior.
Imagem ilustrativa da biópsia de trofectoderma (retirada de célula no estágio de blastocisto).

Curiosidade
O primeiro humano nascido vivo de uma transferência embrionária em estágio de blastocisto após biópsia
de trofectoderma foi relatado em 2005.

Biópsia de corpúsculo polar

O primeiro corpúsculo polar é expelido nos oócitos maduros, enquanto o segundo corpúsculo polar é
extruído após a fertilização. Eles não têm um papel aparente no desenvolvimento embrionário e não são
parte integrante do embrião, mas ambos contêm material genético materno (o primeiro contém o conjunto
de cromossomos duplicados resultante da primeira divisão meiótica e o segundo contém o conjunto de
cromossomos simples resultante da segunda divisão meiótica).

Morfologia do primeiro corpúsculo polar.

 Morfologia do primeiro corpúsculo polar.

A remoção de ambos os corpúsculos polares para fins de PGT é considerada menos invasiva do que as
abordagens que envolvem a biópsia de células em estágios embrionários posteriores. Essa técnica envolve
a remoção de ambos os corpúsculos polares com o intuito de obter uma melhor acurácia no diagnóstico do
oócito. Essa análise pode ser usada para determinar aneuploidias relacionada a meiose materna,
translocações cromossômicas balanceadas derivadas da mãe e para detecção de doenças monogênicas
do genoma materno, permitindo a transferência dos embriões a fresco.

Os corpúsculos podem ser removidos juntos após a fertilização, para detecção de aneuploidias, ou
separadamente para os casos de doenças monogênicas. Devido às informações desta técnica serem
limitadas apenas ao material genético materno, ela não é amplamente utilizada, destinando-se mais para
casos específicos.

Saiba mais
Estudos mostram que a biópsia de corpúsculo polar pode aumentar a taxa de fragmentação embrionária e a
parada do desenvolvimento, sugerindo que mesmo essa manipulação aparentemente pouco invasiva pode
impactar negativamente a viabilidade do embrião.

Biópsia da blastocele
A descoberta de DNA adequado para amplificação e teste genético na blastocele resultou em grande
interesse sobre o potencial para uma nova era de testes genéticos pré-implantação minimamente invasivos.
Para tal procedimento, uma micropipeta de ICSI perfura o trofectoderma no lado oposto da MCI e o fluido é
cuidadosamente aspirado, deixando o embrião totalmente colapsado.

Preparação do Tubing (tubo para armazenar as células para envio ao laboratório de genética).

O colapso dinâmico e a re-expansão da cavidade é um fenômeno frequentemente observado durante o

cultivo de blastocisto in vitro antes da eclosão. Embora a biópsia de blastocele seja um conceito atraente,
esse tipo de procedimento não é comumente utilizado por apresentar dificuldades em obter uma
amplificação consistente do DNA, o que consequentemente restringe a análise genética. A quantidade de
DNA presente na blastocele varia consideravelmente e parece ser indetectável em alguns embriões (ou está
presente em um estado que impossibilita a amplificação) e a principal causa da falha na detecção de DNA
provavelmente deriva de sua natureza degradada.

Técnicas de análise genética - plataformas

de diagnóstico
Inicialmente, a técnica de FISH (Hibridação in situ por fluorescência) foi utilizada para diagnóstico genético
com blastômeros. O teste foi idealizado para detecção dos cromossomos 13, 18 e 21, mas expandiu para
até 12 cromossomos. Para isso, uma ou duas células embrionárias (blastômeros) eram incubadas com
sondas fluorescentes específicas e, em seguida, as alterações cromossômicas numéricas ou estruturais
apenas em 12 cromossomos eram avaliadas. Porém, com o desenvolvimento de técnicas que permitem a
análise de todos os 24 cromossomos (22 autossomos, X e Y), com amplificação do genoma completo em
uma única célula, o CCS (do inglês, comprehensive chromossome screening), a técnica FISH praticamente
caiu em desuso.

Agora vamos conhecer as outras técnicas utilizadas para análise genética pré-implantacional. Você vai
notar que essas técnicas são as mesmas empregadas na biologia molecular, no diagnóstico de doenças
genéticas e em alguns diagnósticos laboratoriais:

Hibridização genômica comparativa (CGH)

Essa foi a primeira técnica de CCS a ser disponibilizada em larga escala e envolve o isolamento e a
marcação fluorescente de DNA obtido de biópsia de blastômero, comparando com o DNA do cariótipo de
um indivíduo normal.

O CGH convencional foi substituído pelo CGH-array (a-CGH), que envolve a hibridização do DNA a um
microarranjo com cerca de 3 mil a 4 mil fragmentos do DNA humano. A limitação dessa técnica para PGT
se dá pela pequena quantidade de DNA. Isso pode contribuir para uma taxa de erro de 2% a 5%. Essa
metodologia tem sido aplicada desde 2010, e tem sensibilidade para detectar perda ou ganho em todos
os cromossomos em um único procedimento.

Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)

O microarranjo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP microarrays) detecta pares de nucleotídeos

únicos do DNA genômico que são altamente variáveis dentro de uma espécie. O microarranjo geralmente
avalia aproximadamente 300 mil SNPs ao longo do genoma de referência, sendo possível identificar
aneuploidias de número de cromossomos.

Algumas limitações do SNP incluem a não detecção das anomalias estruturais abaixo de 5Mb e de
rearranjos cromossômicos balanceados. De forma geral, a técnica de SNP para PGT é considerada
demorada, de alto custo e complexa.
 Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR)

A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) foi desenvolvida como um método para identificar
aneupolidias nos 24 cromossomos. Neste método, ocorre uma etapa de pré-amplificação do DNA seguida
de PCR multiplex na amostra. A vantagem do qPCR é o curto tempo para análise (cerca de 4 horas). A
taxa de erro para esta técnica é de 0,21% por embrião euploide. A técnica é realizada no trofectoderma,
mas não pode ser realizada com blastômero, além de só permitir a leitura simultânea de um reduzido
número de amostras. Também não é capaz de detectar aneuploidias segmentais. Por outro lado, a
técnica de PCR é amplamente utilizada para o diagnóstico de doença monogênica (PGT-M).

Sequenciamento de nova geração (NGS)

O sequenciamento de nova geração (NGS) para PGT ultimamente é a técnica mais utilizada no mundo
para o diagnóstico de aneuploidias (PGT-A). Ela inclui amplificação completa do DNA genômico, seguida
de preparação de uma base de dados comparativa padrão com marcação e fragmentação do DNA antes
do PCR.

O NGS permite a identificação de aneuploidias de cromossomos inteiros, mosaicismo, número de cópias

de mitocôndrias; pode ser utilizada para rastreamento de desordem de um único gene e para
translocações. A taxa de erro da técnica varia entre 0,8% a 1,71%. A sensibilidade e a especificidade do
NGS para detecção de aneuploidias cromossômicas são de 100% e 99,98%, respectivamente.

Aneuploidias segmentais
As aneuploidias segmentais (parciais) afetam apenas uma parte do cromossomo. Do ponto de vista biológico,
essas alterações são geradas principalmente por erros na divisão celular meiótica, que ocorrem durante a
gametogênese, bem como erros mitóticos que acontecem durante desenvolvimento embrionário.
 Ilustração de um cariótipo apresentando translocação balanceada.

Comparado com o a-CGH, o NGS tem a vantagem de ser realizado com menores custos e o
sequenciamento de várias amostras simultaneamente.

Dentre as limitações da técnica encontram-se a impossibilidade de detecção de translocações balanceadas

e a dificuldade de interpretação de aneuploidias segmentadas secundárias.

Visão geral
As técnicas de avaliação do perfil genético dos embriões humanos obtidos via tratamentos de Reprodução
Humana Assistida estão em constante e rápida evolução, com acurácia cada vez maior, o que, associado à
alta proficiência do embriologista responsável pela biópsia, vitrificação e desvitrificação desses embriões,
resulta em taxas crescentes de gestação associadas a menores taxas de abortamento.

No entanto, devemos sempre levar em consideração que mesmo a melhora nas técnicas ainda não é
suficiente para “compensar” a deficiência na amostra fornecida para análise. Nesse contexto, vamos
analisar três fatores sobre a biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto), são eles:

Vitrificação
Congelamento ultrarrápido no qual o material fica em estado vítreo.

Desvitrificação
Descongelamento do material biológico que está em estado vítreo, restabelecendo o desenvolvimento celular.
 Biópsia de blastocisto X Biópsia de única célula
Por mais que a biópsia de blastocisto forneça múltiplas células em comparação à biópsia de
uma única célula (que ocorria no estágio de clivagem), essa amostra não é “homogênea” e,
portanto, o conceito base das análises clínicas de que “a parte representa o todo” não é
perfeitamente aplicável aqui.

Células removidas para biópsia

Na biópsia de blastocisto, as células removidas pertencem a uma pequena parte do
trofectoderma que, por sua vez, é um agrupamento celular já diferenciado dentro do embrião
e pode não obrigatoriamente representar o embrião como um todo e as células da massa
celular interna, responsável pela formação do embrião propriamente dito. Prova disso são os
conhecidos casos de mosaicismo.

Capacidade de autocorreção
Soma-se a isso o pouco conhecimento que ainda temos sobre a real capacidade de
autocorreção que esses embriões possam ter para corrigir essas aneuploidias observadas
nesse estágio de desenvolvimento, e ainda o impacto negativo que a biópsia pode causar em
blastocistos de prognóstico ruim.

Por esse conjunto de fatores, é fundamental e obrigatório um correto aconselhamento genético realizado
por um geneticista, bem como um perfeito esclarecimento dos prós e contras da técnica, esclarecendo para
o paciente as limitações que a envolvem. Considerando todos os pontos listados acima, a genética da
reprodução, quando corretamente indicada e realizada, permite resultados fantásticos, evitando doenças e
aumentando o sucesso dos tratamentos.

Atenção!
O diagnóstico genético para seleção de sexo é proibido no Brasil, mas pode ser indicado para casais que
apresentem alguma doença ligada aos cromossomos sexuais X ou Y, como, por exemplo, o X-frágil (doença
que gera uma deficiência mental e, embora aconteça em ambos os sexos, é mais grave nos homens).

Passo a passo do tratamento de fertilização in vitro com biópsia embrionária.

video_library
Epigenética
Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil define o que é epigenética e correlaciona epigenética e reprodução
humana assistida.
Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?

Questão 1

O diagnóstico genético pré-implantacional (PGT) é uma técnica complementar na Reprodução

Assistida. Ele permite o estudo de alterações genéticas e cromossômicas no embrião antes de sua
implantação no útero. Inicialmente, esse teste foi desenvolvido para detectar que tipo de alteração
genética?

A Para detecção de mutações gênicas.

B Para detecção de desordens numéricas.

 C Para detecção de mutações poligênicas.

D Para detecção de rearranjos estruturais desbalanceados.

E Para seleção de um embrião com HLA compatível ao de uma criança afetada.

Parabéns! A alternativa A está correta.

Incialmente, a técnica de PGT foi implementada para avaliar as mutações gênicas que eram
transmitidas hereditariamente. O primeiro relato de sucesso com o PGT foi para a detecção de uma
doença de herança recessiva ligada ao cromossomo X, a adrenoleucodistrofia.

Questão 2

Para a realização da análise genética pré-implantacional existem diferentes tipos de materiais que
podem ser analisados. Qual o material que apresenta maior acurácia dos resultados e diminui a
incidência de possíveis resultados errôneos para mosaicismo?

A Blastômero.

B Trofectoderma.

C Corpúsculo polar.

D Blastocele.

E Células da granulosa.
 Parabéns! A alternativa B está correta.

A biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto) atualmente é a técnica mais utilizada.

Nessa técnica, são retiradas de 6 a 8 células do embrião e enviadas para análise, proporcionando
melhor precisão diagnóstica.

2 - Criopreservação
Ao final deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas de
preservação da fertilidade.

Criopreservação de oócitos e embriões

A partir do primeiro relato de nascimento após fertilização in vitro (FIV) em 1978 e do rápido progresso nas
técnicas de reprodução assistida, surgiu a necessidade de um programa de criopreservação eficaz.
Inicialmente, devido às baixas taxas de sucesso, todos os embriões provenientes de ciclos de FIV eram
transferidos. Entretanto, o enorme avanço nas técnicas laboratoriais levou não apenas ao aumento das
taxas de gestação, mas também ao aumento de gestação múltipla. Uma maneira de diminuir o número de
embriões a serem transferidos e a incidência de gestações múltiplas seria armazenar os embriões
excedentes para um potencial uso futuro, por meio da criopreservação.

Falando em criopreservação, você sabe o que é isso?

A criopreservação envolve o armazenamento de células e tecidos por longos períodos em temperatura

muito baixa (-196°C).

Criopreservação.

Antigamente, transferências de embriões criopreservados apresentavam menor taxa de gestação quando

comparadas à transferência de embriões a fresco. Porém, com a introdução da técnica de vitrificação em
1999, houve completa revolução no campo da criopreservação, resultando em melhores taxas de
sobrevivência à criopreservação e resultados clínicos.

Além disso, a criopreservação de embriões tornou-se essencial para a melhoria da segurança e eficácia dos
tratamentos de reprodução assistida, e atualmente é um processo bem estabelecido.

Saiba mais
Em 1984 foi relatado o primeiro nascimento de uma criança proveniente de embrião descongelado.

Apenas mais recentemente, com a introdução da criopreservação de oócitos, a técnica tornou-se disponível
como uma opção adicional de preservação de fertilidade em mulheres, visto que não necessita do material
genético masculino, reservando à mulher a capacidade de procriar com um parceiro escolhido no futuro.
Curiosidade
A primeira publicação relatando o nascimento de uma criança oriunda de oócitos criopreservados ocorreu
em 1986, pelo protocolo de congelamento lento.

Duas técnicas básicas são aplicadas à criopreservação: o congelamento lento controlado, muito utilizado
nos primórdios da reprodução assistida, e o resfriamento ultrarrápido por vitrificação, que atualmente é a
técnica mais utilizada e muito bem estabelecida.

Vamos conhecer um pouco mais sobre essas técnicas. Mas antes vamos entender como ocorre a
criopreservação.

Princípios fisiológicos da criopreservação

Os princípios fisiológicos da criopreservação e suas restrições são de grande importância para
compreender o sucesso (ou insucesso) da técnica. A principal causa de morte celular no processo da
criopreservação é a criolesão (lesão pelo frio).

Mas o que é criolesão?

Sua ocorrência é explicada por diversas teorias, como formação de cristais de gelo
intracelular, volume celular mínimo e transição de fases da membrana, danos à
membrana celular e alterações no funcionamento do metabolismo, tanto celular
quanto mitocondrial.

O que é feito para evitar a criolesão? Vamos entender?

Princípio da criopreservação
C i t lidifi l ã i d t t d i id d
 Consiste em solidificar a solução por meio de um aumento extremo de sua viscosidade em
temperatura extremamente baixa (-196°C, temperatura do nitrogênio líquido). Com intuito de
preservação celular durante essa exposição a temperaturas não fisiológicas, é necessário a
adição dos chamados crioprotetores.

Crioprotetores

O objetivo da adição de crioprotetor é causar efluxo da água celular que, ao ser resfriada,
pode formar os cristais de gelo, lesionando a célula. Crioprotetores são substâncias que
atuarão no espaço intracelular ou extracelular dependendo do seu tipo: permeáveis à
membrana plasmática (etilenoglicol, glicerol, dimetilsulfóxido, propanediol, acetamida) ou não
permeáveis à membrana plasmática (sacarose, trealose).

Crioprotetores não permeáveis à membrana plasmática

Atuam por meio de um efeito osmótico, induzindo a desidratação celular durante o resfriamento e
regulando sua hidratação no aquecimento, prevenindo a formação dos cristais de gelo.

Crioprotetores permeáveis à membrana

Atuam de forma dupla: atingem o meio intracelular, por difusão passiva, com a função de substituir a
água intracelular e reduzir o seu ponto de congelamento. Além disso, por permanecerem em altas
concentrações no meio extracelular, auxiliam a desidratação celular, evitando a formação dos cristais de
gelo.

Os meios utilizados para a criopreservação contêm os dois tipos de crioprotetores,

uma vez que essa combinação permite preservar o equilíbrio osmótico entre os
meios intra e extracelular.
Técnica de criopreservação de embrião e oócitos
Para o sucesso da técnica, as condições devem ser otimizadas para minimizar a incidência de lesões e
manter alta a taxa de sobrevivência. Existem duas técnicas que podem ser aplicadas à criopreservação:

Congelamento Lento

Como o próprio nome diz, o congelamento lento é uma técnica mais demorada, e tem a necessidade de
utilizar equipamentos especiais e caros. Essa técnica consiste na adição de crioprotetores ao material e seu
posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas, ou seja, na diminuição gradual e constante da
temperatura.

Em 1971 foi registrada sua primeira utilização com sucesso, quando o congelamento ainda ocorreu de
forma rudimentar e com rampas de temperatura pouco controladas. Com esse registro e aumento do
alcance do procedimento, vários equipamentos para controlar a rampa (variação) de temperatura de
resfriamento surgiram no mercado.

Cryobath fechado (foto superior) e aberto (foto inferior).

Em um protocolo de congelamento lento clássico, estabelecido e utilizado desde meados dos anos 1980, as
células são expostas a baixas concentrações de crioprotetores, e a temperatura é gradativamente diminuída
de 0,3°C a 0,5°C por minuto, até alcançar a temperatura entre -30°C e -65°C, e então é adicionado o
nitrogênio líquido (-196°C), no qual ocorrerá o armazenamento. Durante esse processo, um delicado
equilíbrio é mantido pela indução de cristais de gelo extracelulares. Ainda que algumas alterações nos
protocolos de congelamento lento tenham contribuído para maiores taxas de sucesso, a eficiência clínica
desta técnica ainda é questionável.

Acima, verificamos uma foto de um modelo de equipamento utilizado para o congelamento lento (embriões
e oócitos). Na imagem, vemos que o equipamento está conectado a um aparelho que controla a rampa de
resfriamento.

Vitrificação

Tem como foco evitar a formação de cristais de gelo, tanto nas soluções extra quanto nas intracelulares. Os
embriões e os oócitos são expostos a taxas extremamente rápidas de resfriamento, antes da submersão
em nitrogênio líquido e em soluções com altas concentrações de crioprotetores em volumes muito baixos
(<1µL), criando o que é conhecido como estado vítreo.

Atualmente, a técnica de escolha para o congelamento de oócitos e embriões é a

vitrificação, devido à menor chance de ocorrer dano celular, sendo importante
ressaltar que o uso dos crioprotetores representou um grande avanço na criogenia.
A vitrificação tem somado qualidade ao tratamento de reprodução assistida, com
melhores taxas de sobrevivência e desenvolvimento embrionário pós
descongelamento, o que permite a programação da transferência embrionária para
um momento mais adequado, social e fisiologicamente.

Existem diferentes tipos de meios de cultura comercializados, no entanto, todos são muito similiares, visto
que contêm duas soluções base utilizadas em duas etapas distintas: equilibration solution (ES) e vitrification
solution (VS).

O oócito ou embrião é colocado no meio ES, no qual, inicialmente, tem a saída de água, sendo, depois,
reidratado com a entrada dos meios crioprotetores.

Após essa fase, o oócito ou embrião é submerso no meio VS com posterior inserção na palheta de
vitrificação, onde sofrerá mais desidratação para posterior imersão no nitrogênio líquido.
Placa, soluções e palhetas utilizados durante a técnica de vitrificação.

Existem dois sistemas de vitrificação: aberto e fechado.

No sistema aberto, a amostra entra em contato direto com o nitrogênio líquido no momento da imersão. No
sistema fechado, a amostra é contida em um invólucro selado (uma capa de plástico semelhante a um
canudo, com as extremidades fechadas) que impede o contato direto com o nitrogênio líquido.

Palheta com sistema aberto.

 Sistema fechado. O “canudo” amarelo (invólucro) com amostra.

Estudos mostram que o sistema aberto consegue fazer a rampa de resfriamento mais rapidamente que o
sistema fechado, no qual há primeiro o resfriamento do invólucro para posterior resfriamento da amostra.
Isso torna o sistema aberto mais seguro no que se refere à formação dos cristais de gelo.

Palheta aberta submersa no nitrogênio líquido.

Saiba mais
Para o congelamento de oócitos e embriões a concentração do agente crioprotetor utilizada deve seguir a
indicada pelo fornecedor.
Além disso, estudos mostram que a vitrificação tem melhor taxa de sobrevida, fazendo com que,
atualmente, poucas clínicas no mundo utilizem o congelamento lento. No Brasil, somente uma clínica ainda
utiliza essa metodologia.

Descongelamento de oócitos e embriões

O descongelamento ou aquecimento é o processo inverso da criopreservação. Nesse caso, retiramos os
crioprotetores em três etapas: thawing solution (TS) - solução de descongelamento -, diluent solution (DS) -
diluente - e washing solution (WS) - solução de lavagem - para a reidratação do embrião.

Placa de descongelamento. Palheta submersa na primeira etapa do descongelamento (TS).

Após a finalização desse processo, o embrião e o oócito ainda necessitam de tempo para a completa
reidratação até retomar o tamanho normal.
Blastocisto após descongelamento.

Blastocisto 3 horas após descongelamento.

video_library
Criopreservação de embrião e oócitos
Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil mostra as técnicas de congelamento e descongelamento de
oócitos e embriões e pontua as suas principais diferenças.

Indicações da criopreservação de embriões

Em algumas situações clínicas, a paciente poderá ter indicação de congelamento total dos embriões
produzidos naquele ciclo de FIV, seja devido a alguma doença, alteração ou risco clínico, seja por não
desejar a transferência a fresco naquele momento.

As indicações que justificam o congelamento embrionário são: baixa reserva ovariana, teste genético pré-
implantacional, cavidade uterina inadequada, progesterona elevada, risco de síndrome do hiperestímulo
ovariano e embriões excedentes.

Agora, vamos conhecer melhor cada uma dessas indicações.

Baixa reserva ovariana

Esse diagnóstico advém dos testes de reserva ovariana basal realizados (dosagem de FSH,
LH, estradiol, progesterona e AMH – hormônio antimülleriano). A opção para esse casal é a
realização da FIV (fertilização in vitro) e o congelamento dos embriões para que possa ter um
número maior de embriões (acúmulo de embriões), permitindo que, no futuro, tenham
embriões que possibilitem o aumento da prole.

Teste genético pré-implantacional

A ó lti d b iõ bl t i t bi i d d t f id
 Após o cultivo dos embriões, os blastocistos biopsiados podem ser transferidos no mesmo
dia, caso o estudo genético seja feito imediatamente (esse procedimento só é possível se a
clínica estiver localizada na mesma cidade do laboratório de análise genética). Na maioria
dos centros, pela indisponibilidade desse imediatismo, é necessário o congelamento destes
embriões para que haja tempo do resultado ser disponibilizado. Nesses casos, o blastocisto
euploide será transferido em outro ciclo.

Cavidade uterina inadequada

O congelamento embrionário pode ser indicado em alguns casos, devido a doenças que
diminuem as chances de implantação. Doenças como adenomiose, miomatose e
endometriose podem tornar inadequada a cavidade uterina e assim reduzir o sucesso do
tratamento.

Progesterona elevada

Durante a FIV, o estímulo hormonal responsável pelo recrutamento folicular pode alterar o
endométrio, fator importante para o processo do tratamento. Caso ocorra aumento da
progesterona plasmática acima de 1.500pg/mL no dia do gatilho com o HCG (gonadotrofina
coriônica humana), o ideal é o congelamento embrionário total, visto que essa situação está
associada à baixa taxa de gravidez.
 Risco de síndrome do hiperestímulo ovariano

A Síndrome da Hiperestimulação Ovariana (SHO) é uma complicação decorrente do estímulo

ovariano com indutores de ovulação, podendo levar a quadros graves. Geralmente ocorre
devido a uma resposta exacerbada dos ovários ao estímulo hormonal e resulta em um
número grande de oócitos. Assim, quando ocorrer esta síndrome, a criopreservação de
embriões é indicada por ser uma tática importante para minimizar o risco de
hiperestimulação em pacientes suscetíveis, visto que a transferência a fresco desencadeia
um novo pico de HCG.

Embriões excedentes

Segundo a resolução do Conselho Federal de Medicina (CFM) n° 2.294, de 27 de maio de

2021, não é permitido o descarte de embriões viáveis e a quantidade de embriões a serem
transferidos é limitada (< 37 anos até 2 embriões,> 37 anos até 3 embriões). Sendo assim,
após a transferência dos embriões, os excedentes viáveis devem ser criopreservados.

Indicações da criopreservação de oócitos

A indicação da criopreservação de oócitos são as seguintes:

Baixa reserva ovariana

Nesses casos, podem ser realizados vários ciclos com criopreservação de oócitos, e quando for
alcançado o número desejado de oócitos, realiza-se o descongelamento e prossegue-se com a FIV.
 Preservação social

Consiste naqueles casos em que as pacientes desejam adiar a gravidez devido a diversas razões
pessoais.

Pacientes oncológicas

Visto que uma das grandes complicações do tratamento para o câncer é a esterilidade ou perda da
função gonadal, faz-se necessária a criopreservação dos gametas femininos para preservação da
fertilidade.

Doação de oócitos

Os gametas são criopreservados nesses casos quando não há sincronização entre o ciclo da doadora e o
preparo endometrial da receptora.

Criopreservação de sêmen e
espermatozoides obtidos por biópsia
O congelamento de espermatozoides humanos começou a ser introduzido na prática clínica e laboratorial a
partir de 1960, e desde então é considerado uma parte fundamental dentro das técnicas de reprodução
humana assistida (TRA).

Apesar de não ser possível recuperar a motilidade de todos os espermatozoides

que eram inicialmente móveis, a técnica passou a ganhar importância
especialmente em casos de pacientes ainda sem filhos que seriam submetidos a
tratamento de quimioterapia ou radioterapia, que os deixariam inférteis, subférteis
ou com prognóstico desconhecido.
Para que a amostra de sêmen fosse criopreservada de maneira segura, foram desenvolvidos
industrialmente inúmeros crioprotetores para serem adicionados aos espermatozoides.

O mecanismo de ação deles deve garantir a proteção das estruturas intracelulares. Como já sabemos, a
função dos crioprotetores é retirar água dos gametas, evitando a formação de cristais de gelo. Quanto mais
permeável a membrana plasmática do gameta, melhor será a resposta do espermatozoide ao processo de
criopreservação.

Aspectos laboratoriais da criopreservação de

espermatozoides
O sucesso da criopreservação dos espermatozoides é afetado pela taxa de resfriamento durante o
congelamento. No congelamento rápido, a água presente no meio intracelular congela, causando danos às
organelas pela formação de cristais de gelo. Se a taxa de congelamento for baixa, as células serão
danificadas em razão da formação lenta de gelo no meio extracelular, aumentando a concentração de
solutos extracelulares e, por causa dessa diferença de osmolaridade, a água sai das células, resultando em
desidratação.

Atenção!
Para evitar uma lesão ao espermatozoide, é realizado o rígido controle das taxas de congelamento e são
adicionados à amostra de sêmen os crioprotetores e diluentes.

O crioprotetor mais utilizado é o glicerol, que foi descoberto em 1949. As concentrações de glicerol no
volume final mais adequadas para a proteção durante o congelamento são de 6% e 7%. Quando combinados
aos diluentes, a sobrevivência espermática é maior do que com uso exclusivo do glicerol. Atualmente, os
diluentes que contêm gema de ovo, tampões, citrato e sacarose são os mais indicados.
Técnica para criopreservação de espermatozoides
obtidos por biópsia e sêmen
A adição e a remoção do crioprotetor em concentração proporcional provoca estresse momentâneo na
membrana plasmática dos espermatozoides.

Vamos entender melhor:

Adição do crioprotetor
Quando a adição do crioprotetor é feita na mesma concentração de uma só vez, o estresse na membrana
plasmática dos espermatozoides é muito alto.

Redução do dano
Esse dano pode ser diminuído e a sobrevivência dos espermatozoides aumentada se a adição do
crioprotetor for de forma lenta (em gotas), em velocidade de cerca de 1mL por minuto.

Após a adição total do crioprotetor, o material é armazenado em recipiente criogênico (criotubo) e

submetido ao vapor de nitrogênio e em seguida submerso em nitrogênio líquido (-196°C).

Recipientes criogênicos (Criotubos) que armazenam o sêmen na criopreservação.

Saiba mais
Antes do congelamento, avaliamos os parâmetros seminais (concentração, motilidade e vitalidade). A baixa
qualidade seminal pode ser devido a varicocele, fator hormonal, genético, traumas etc. Quando o paciente
apresenta uma amostra com alteração significativa, mas é possível selecionar espermatozoide para realizar
a FIV, conversamos com ele e explicamos qual seria a recuperação da amostra e orientamos quantas
amostras ele precisará criopreservar para um tratamento.

Os parâmetros seminais devem ser avaliados antes do congelamento. Essa análise é realizada no laboratório de andrologia.

Para o descongelamento, a maneira mais comum é retirar o material congelado do nitrogênio líquido e
deixá-lo à temperatura ambiente até sua total liquefação. Após o descongelamento, é feito o processo de
capacitação espermática, que consiste em separar os melhores espermatozoides do líquido seminal, pelas
técnicas laboratoriais que eliminam da amostra os espermatozoides imóveis, os detritos celulares, os
leucócitos e as células imaturas.

Recomendação
Os espermatozoides obtidos a partir de biópsia de testículo devem ser criopreservados da mesma maneira
que aqueles provenientes do sêmen.

Apesar dos inúmeros avanços na área da criopreservação, ainda há muitos vieses da técnica a serem
aprimorados. Durante essa avaliação, é fundamental avaliar alguns indicadores após o descongelamento da
amostra, como a qualidade seminal. Vamos entender o porquê?

Qualidade seminal

A diminuição da qualidade do sêmen, principalmente da sua motilidade, e o aumento da

fragmentação de DNA são fatores esperados após o descongelamento da amostra e, por
essa razão, são também exemplos de indicadores de que a técnica precisa ser refinada. Além
disso, as taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra antes da
criopreservação. Amostras de sêmen de baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos
ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade.
 Motilidade dos espermatozoides

A motilidade dos espermatozoides é o aspecto mais afetado pelo processo de

criopreservação, pois lesiona algumas estruturas celulares dos gametas. As mitocôndrias são
as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos espermatozoides, agindo
como fornecedoras de energia para a cauda e promovendo o movimento flagelar
característico dos espermatozoides. Aparentemente o que provoca a diminuição da atividade
mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o aumento dos níveis de
apoptose celular.

Diminuição da atividade mitocondrial

As mitocôndrias são as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos

espermatozoides, agindo como fornecedoras de energia para a cauda e promovendo o
movimento flagelar característico dos espermatozoides. Aparentemente o que provoca a
diminuição da atividade mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o
aumento dos níveis de apoptose celular.

Taxas de recuperação

As taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra seminal antes da

criopreservação. Amostras de sêmen de baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos
ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade.

Indicações da criopreservação do sêmen e dos

espermatozoides obtidos por biópsia
A criopreservação de sêmen deve ser considerada como procedimento preventivo diante das seguintes
situações: antes de quimioterapia e radioterapia; antes de cirurgia de testículo ou próstata; em caso de
dificuldade de coleta ou ausência do companheiro no dia do tratamento de reprodução assistida; em
indivíduos que vão realizar cirurgia de vasectomia e desejam preservar a fertilidade futura; em indivíduos
que trabalham em profissões de alto risco para fertilidade (indústrias químicas, exposição aos agrotóxicos e
pesticidas e exposição a radiações ionizantes); em amostras obtidas por técnicas cirúrgicas, do epidídimo
e/ou testículo.

Dentre as técnicas de recuperação cirúrgicas estão:

PESA (do inglês, Aspiração Percutânea de Espermatozoides do Epidídimo);

MESA (do inglês, Aspiração Microcirúrgica de Espermatozoides do Epidídimo);

TESA (do inglês, Aspiração de Espermatozoides do Testículo);

TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo);

Micro-TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo por Microdissecção).

Congelamento de tecido ovariano e ovário

A criopreservação de tecido ovariano é atualmente o método de escolha para preservar a fertilidade de
pacientes jovens com diagnóstico de câncer. O primeiro país a relatar o nascimento de uma criança após a
criopreservação de tecido ovariano com autotransplante ortotópico (implante do fragmento de tecido
ovariano retirado do próprio ovário da paciente) foi a Bélgica, em 2004.

A técnica aplicada foi baseada em experimentos que demonstraram, pela primeira

vez, a possibilidade de êxito em transplantes ortotópicos (transplantar o órgão na
posição anatômica original). Nos anos seguintes, com o aprimoramento das
técnicas, outros nascimentos esporádicos provenientes tanto de gestação
espontânea quanto de fertilização in vitro, foram reportados.

Exemplo
Em 2009, um grupo espanhol reportou o nascimento de gêmeos após tratamento quimioterápico e
criopreservação de tecido ovariano, seguido de transplante, estimulação ovariana induzida e vitrificação dos
oócitos.
As dificuldades de se criopreservar o ovário e o tecido ovariano humano se devem à hipóxia dos tecidos, à
não revascularização, à permeabilidade ineficaz do crioprotetor e à complexidade da foliculogênese, além
do risco de se transplantar células malignas, principalmente na vigência de neoplasias.

Técnica de criopreservação de tecido ovariano e ovário

A partir de um procedimento cirúrgico, realizado por videolaparoscopia (com visualização utilizando
câmeras de vídeo especializadas), é retirada uma parte ou todo o ovário, de acordo com a indicação. O
tecido ovariano é cortado em fatias finas da região cortical, onde estão presentes os folículos primordiais, e
incubado por 5 minutos em meio de cultura suplementado e tamponado, antes da criopreservação.

A desidratação acontece em duas fases:

Primeira fase

Na primeira, o tecido é imerso no meio de cultivo, ao qual são adicionados dimetilsulfóxido (DMSO) e
sacarose em concentrações de 2,0mol/L e 0,1mol/L, respectivamente, por 5 minutos.

Segunda fase

Na segunda fase, o tecido é adicionado ao meio suplementado com DMSO (dimetilsulfóxido), PROH (1,2-
propanodiol) e sacarose, em concentrações de 2,0mol/L, 2,0mol/L e 0,2mol/L, respectivamente, também por
5 minutos.
Imediatamente após a segunda fase, as tiras desidratadas devem ser aspiradas com pipeta Pasteur e
vagarosamente liberadas diretamente no nitrogênio líquido. Após estarem congelados, os fragmentos de
tecido ovariano podem permanecer armazenados por tempo indeterminado.

Por exemplo, após o tratamento de quimioterapia ou radioterapia, há uma chance considerável de a mulher
entrar na menopausa precocemente. Caso isso aconteça, os fragmentos do ovário criopreservados poderão
ser descongelados e reimplantados no organismo da paciente de forma a proporcionar a chance de uma
gravidez futura. A seguir vemos um esquema mostrando o passo a passo da técnica do congelamento de
tecido e ovário.

Passo a passo da técnica do congelamento de tecido e ovário.

Descongelamento do tecido ovariano e ovário

O processo de descongelamento consiste em expor o recipiente ou a palheta em que o tecido está
armazenado, a uma temperatura de 37°C por um minuto, e submergir o material em um gradiente
decrescente de sacarose, cuja função é regular a troca de crioprotetor por meio de cultura essencial.

Atenção!
Após o descongelamento do tecido ovariano, ele deve ser reimplantado no sítio ortotópico ou heterotópico
(transplantar o órgão em outra posição anatômica diferente da orignal), dependendo da técnica e do
objetivo do reimplante.

Indicação para a criopreservação de tecido ovariano e

ovário
Pacientes que, após o diagnóstico do câncer, não têm tempo suficiente para congelamento de
oócitos/embriões ou contraindicação para receberem estimulação ovariana com hormônios são candidatas
à técnica. Além disso, essa é a única opção para preservação de fertilidade em meninas antes da
puberdade.

Falta pouco para atingir seus objetivos.

Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1

Vimos alguns métodos de criopreservação de embriões e oócitos. Sobre esses métodos, analise as
afirmativas a seguir.

I. A vitrificação consiste na adição de crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em

rampas de temperaturas lentas.

II. A eficiência da técnica de criopreservação pelo método lento ainda é questionável.

III. No congelamento lento, os embriões e os oócitos são expostos a taxas extremamente rápidas de
resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido.

IV. Existem dois tipos de palhetas de vitrificação (sistema aberto e sistema fechado).

É correto o que se afirma em:

A I e II.

B I e III.

C I e IV.

D II e III.

E II e IV.

Parabéns! A alternativa E está correta.

O congelamento lento é uma técnica que tem eficiência questionável, pois consiste na adição de
crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas. A
vitrificação é uma técnica de criopreservação ultrarrápida. Os oócitos e os embriões são armazenados
em palhetas que podem ser abertas ou fechadas, e expostos a taxas extremamente rápidas de
resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido.

Questão 2

Aprendemos que a criopreservação de sêmen e espermatozoides obtidos por biópsia é realizada por
uma técnica diferente da empregada para a criopreservação de oócitos e dos embriões. Sobre a
criopreservação dos espermatozoides obtidos pelo sêmen ou por biópsia, analise as afirmativas a
seguir e assinale a alternativa correta:

O congelamento dos espermatozoides e do sêmen não é afetado pela taxa de

A
resfriamento.

B O crioprotetor mais empregado durante o congelamento do sêmen é o dimetilsulfóxido.

A criopreservação de espermatozoides provenientes da biópsia testicular é igual à

C
criopreservação do sêmen.

Na criopreservação dos espermatozoides, não são empregados os diluentes, pois eles

D
diminuem a sobrevivência espermática.

Após a criopreservação, o descongelamento deve ser realizado em uma rampa de

E
temperatura, com declínio lento da temperatura.

Parabéns! A alternativa C está correta.

Os espermatozoides devem ser criopreservados pela mesma técnica, independentemente se foram

obtidos pelo sêmen ou por biópsia testicular. O sucesso da criopreservação dos espermatozoides é
afetado pela taxa de resfriamento durante o congelamento. O crioprotetor mais utilizado é o glicerol e,
para aumentar a sobrevivência espermática, devemos utilizar diluentes. O descongelamento dos
espermatozoides após a criopreservação deve ser realizado a temperatura ambiente.
Considerações finais
Ao longo deste conteúdo, estudamos algumas técnicas complementares realizadas durante a reprodução
assistida auxiliando na identificação de causas de infertilidade e aumentando o sucesso dos tratamentos.

Vimos que o PGT é um teste realizado a partir da análise de células embrionárias, retiradas do embrião por
biópsia e posteriormente analisadas em laboratório especializado, de acordo com a doença a ser
identificada. Esse procedimento é indicado para casais que tenham alto risco de transmissão de doenças
genéticas para seus filhos. Este teste é dividido em, PGT-A, PGT-M PGT-HLA, PGT-SR, PGT-P e NICS e pode
ser realizado em embriões no estágio de clivagem ou de blastocisto. Entretanto, estudos mostram que,
quando realizada no estágio de blastocisto, a técnica demonstra ser menos prejudicial ao embrião, pois as
células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna) são deixadas intactas.

Aprendemos também que a criopreservação de gametas e embriões é uma técnica complementar que visa
preservar a fertilidade tanto masculina quanto feminina. Essa técnica consiste na conservação de gametas
ou embriões em baixas temperaturas para que sejam utilizados em tratamentos futuros de reprodução
assistida (transferência embrionária ou fertilização in vitro).

headset
Podcast
Neste podcast, a especialista Vanessa Nayane Pino Perez falará sobre como entrou para a reprodução
assistida, a rotina, os procedimentos e os cuidados que devem ser tomados em diferentes procedimentos e
muito mais. Vamos lá?
Explore +
Leia o livro Reprodução Assistida, disponível na página da internet da REDLARA.

Referências
ALMODIN, C. G.; COSTA, R. R. Criopreservação em Reprodução. Dental Press, 2014.

AZAMBUJA, R. et al. Reprodução assistida: Técnicas de Laboratório. Porto Alegre: Age, 2017.

BORGES, E.; CORTEZZI, S. S.; FARAH, S. Reprodução humana assistida. Rio de Janeiro: Atheneu, 2011.

BORGES JUNIOR, E.; BRAGA, D. P. A. F.; SETTI, A. S. Reprodução humana assistida: Associação estudo
Sapientiae. 2. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2020.

DZIK, A. et al. Tratado de reprodução assistida. Segmento Farma, 2011.

MARINHO, R. M. Preservação da fertilidade: uma nova fronteira em medicina reprodutiva e oncologia. 1. ed.
Rio de Janeiro: MedBook, 2015.

TREFF, N. R. et al. Preimplantation genetic testing for polygenic disease relative risk reduction: evaluation
of genomic index performance in 11,883 adult sibling pairs. Genes. 2020; 11, 648.

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