Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologias
Manipulação de Gametas e Embriões

Fertilização in vitro e
Cultivo de Embriões

Priscila Marques Moura de Leon

Dra., Médica Veterinária
Profa, PNPD Biotecnologia/UFPel
 Fertilização in vitro - FIV
• Parte do processo de Produção in vitro de Embriões
(PIV)

MIV FIV CIV

Objetivos da FIV:
 Acelerar a produção de animais
geneticamente superiores;
 Tratamento de infertilidade;
 Científico
 Respaldo para técnicas como: Clonagem,
Transgênese, Sexagem, Criopreservação
 Histórico FIV
• Século XIX: foi observada pela primeira vez, a fecundação de
um óvulo de estrela-do-mar com a posterior formação da
primeira célula do futuro embrião (Heman Fol, 1980)
Invertebrados marinhos a fecundação ocorre
externamente ao sistema reprodutor da fêmea.

• Século XIX: estudo da manipulação de embriões. Os primeiros

trabalhos experimentais em embriologia de mamíferos foram
realizados com coelhos

Oócito grande
Ovulação induzida pelo acasalamento
 Histórico FIV
• Van Beneden, 1875: descrição dos estágios
embrionários pré-implantacionais;

• Walter Heape, 1890: transferência de embriões

para o oviduto;

• Lewis e Gregory, 1929: realização de um filme

das sucessivas clivagens de uma mórula em
cultivo;

Dificuldades relativas à compreensão das

necessidades nutricionais e limitações das
condições de cultivo.
 Histórico FIV
• Wesley Whitten, 1950: meios de cultivo suplementado com
albumina sérica bovina (BSA), promovendo a clivagem de
embriões de camundongo até blastocisto.

''Whitten effect'' ou ''Whitten medium''

• Ralph Brinster, 1950: desenvolveu a técnica da cultura de

embriões utilizada atualmente, em microgotas.
 Histórico FIV
• Chang, 1959: relatou o nascimento do primeiro mamífero
(coelho) gerado a partir da técnica de FIV.
• Whittingham, 1968: camundongos
• Steptoe & Edward, 1978: estabeleceram um
novo marco na história da FIV no mundo,
com o sucesso do nascimento do primeiro
bebê humano.

Louise Brown e Robert Edward

Julho, 2008
 Nobel de Medicina 2010
• O pesquisador britânico Robert Edwards
ganhou o Prêmio Nobel de Medicina 2010 por
suas pesquisas sobre a fecundação in vitro;
• Professor emérito da Universidade de
Cambridge;
• A pesquisa foi realizada com o cirurgião
ginecológico Patrick Steptoe, que morreu em
1988;
• “As conquistas [de Edwards] tornaram possível
tratar a infertilidade, uma condição médica
que aflige uma grande proporção da
humanidade, incluindo mais de 10% de todos
Robert Edward
os casais”;
• “Aproximadamente 4 milhões de pessoas
nasceram graças à fertilização in vitro”.
 Histórico FIV
• Década de 70 → animais de produção. Relatos de sucesso no
nascimento de filhotes após maturação in vitro.
• Sreenan et al, 1970: produção de embriões bovinos;
• Crosby et al., 1971: filhotes saudáveis de ovelhas;
• Leman & Dziuk, 1971: suínos;
• Brackett et al., 1982: nascimento de um terneiro sadio produzido por
FIV, ocorrido no dia 9 de Junho de 1981.
 22 doadoras e 7 receptoras, sêmen a fresco e congelado;
 Coleta cirúrgica: foram recuperados 177 oócitos, 52% fertilizados;
 1 doadora gestando um embrião no estágio de 4 células;
 O terneiro nasceu pesando 45kg sem alterações no desenvolvimento.

• Palmer et al. 1991: 2 potros nascidos de FIV;

Principais etapas da Produção in vitro de Embriões

1. Coleta de Oócitos (Aspiração Folicular)

2. Maturação in vitro de Oócitos
3. Capacitação Espermática
4. Fecundação In vitro
5. Seleção dos Zigotos
6. Cultivo Embrionário
7. Transferência dos Embriões
8. Diagnóstico de Gestação
9. Nascimento
 Fertilização in vitro

Etapas prévias a FIV:

• Coleta dos CCOs;
• Maturação in vitro dos CCOs → MII;

• Frequentemente uso de sêmen congelado

• Capacitação espermática:
 Testículo: imaturo, infértil e imóvel;
 Epidídimo: motilidade e maturação
(maturam por 10-15 dias);
 Trato genital feminino: Capacitação.
 Capacitação Espermática
Conceito:
Capacitação é o processo que torna os espermatozoides aptos a
fecundar. Não há modificações morfológicas, e sim modificações
bioquímicas e ultraestruturais.
 Remoção de componentes decapacitantes oriundos do
plasma seminal ;
 Modificações bioquímicas que desestabilizam a membrana
plasmática e fazem a hiperativação espermática;
 Essencial para a reação de acrossomo e penetração
espermática.
Duração média in vivo:
• Trato reprodutivo Bovino: 6 a 7 horas
• Trato Reprodutivo Suíno: 1 a 2 horas
 Capacitação Espermática
• No oviduto:
• Bicarbonato, albumina, ROS e Glicosaminoglicanas (presentes no muco
uterino) induzem a capacitação;
• Espermatozoides ligam-se ao epitélio do oviduto através de proteínas da
membrana;
• Existe a formação de um reservatório de espermatozoides, que são liberados
gradualmente para atingir o local de fertilização em momentos diferentes, e assim
uma maior probabilidade de fertilizar o oócito (no inicio do istmo).
• Reação Acrossômica:
• Ocorre na presença de Cálcio extracelular;
• É a fusão da membrana plasmática do espermatozoide com a membrana externa
do acrossomo. Ocorre após a ligação do espermatozóide com a zona pelúcida (ZP3).
Com função de dissolução da camada glicoproteica do oócito e penetração na zona
pelúcida;
• Realizada por enzimas hidrolizantes: Hialuronidase e Acrosina;
• Hialuronidase: desdobramento do ác. Hialurônico, componente da matriz celular
das células da granulosa que envolvem o oócito;
• Acrosina: enzima proteolítica que digere a zona pelúcida do oócito;
Capacitação Espermática
• Dura cerca de 7 horas;
• Interação com fatores capacitantes
(Bicarbonato, Albumina, Íon Cálcio,
Glicosaminoglicanos e ROS);
• Cobertura glicoproteica e proteínas
seminais são removidas;
• Maior permeabilidade a Ca2+ e
incremento do metabolismo celular;
• ↓ Colesterol: Fosfolipídeos;
• O processo de capacitação ocorre no
útero e tubas uterinas;
• Hipermotilidade (entrada no oócito);
• .
Reação do Acrossomo:
• Presença de Íon Cálcio extracelular;
• Espermatozoide liga-se a zona
pelúcida e sofre a reação
acrossomática;
• Formação de vesículas e exposição
da membrana interna.
 - ZP3

Acrosina, Esterase, Fosfolipase A2, Fosfatases

àcidas, Aril amidase, Aril sulfatase,...
 Capacitação Espermática In vitro
 Métodos de Capacitação In vitro:
 Método de “Swim Up”: baseado na mobilidade dos
espermatozoides vivos e sem patologias.
 Espermatozoides viáveis se desprendem de um pellet nadando
para a superfície e tornando-se capacitados. Estes
espermatozoides poderão ser utilizados em: IA, FIV e ICSI.
 Gradiente Descontínuo (Gradiente de Percoll): o princípio da técnica
é baseado na força centrífuga de passagem dos espermatozoides
entre duas camadas de substância coloidal com diferentes
concentrações.
 Células sedimentam de acordo sua própria densidade. As
camadas irão reter espermatozoides mortos e debris celulares. O
pellet formado contém apenas espermatozoides viáveis.
 Capacitação Espermática In vitro
 Heparina: glicosaminoglicana utilizada como agentes capacitante in
vitro;
Desencadeia reações bioquímicas na membrana plasmática do
espermatozoide;
 Concentração de 2 a 100 µg/mL de meio (depende do macho/método
de separação espermática) (mais frequente em bovinos 10 µg/mL);

 Objetivos dos Métodos de Capacitação In vitro:

 separar os espermatozoides do líquido seminal e diluentes;
 Obter espermatozoides com 70% de motilidade progressiva;

 Gradiente de Percoll [↓ Heparina]

 Swim Up [↑ Heparina]
 Capacitação Espermática In vitro
 Swim Up:
 utilizada em espermatozoides com
motilidade normal;
• 1mL de meio de capacitação é adicionado
a 1 palheta de sêmen;
• Meio TALP suplementado com BSA e
piruvato, 37-39°C (1h);
• Lavagens + Centrifugação;
• Eliminação do sobrenadante (900µL) +
incubação 40 – 60 min;
• Seleção sptz com motilidade progressiva
(sobrenadante);
• Concentração e motilidade dos sptz e
ressuspende em meio de FIV;
 Capacitação Espermática In vitro
 Gradiente de Percoll: (solução sílica coloidal)
 Mais utilizado atualmente;
 Aumenta a recuperação de sptz móveis;
 Filtração dos sptz através de gradientes com
diferentes densidades;
 30%, 45% e 90%
 Sptz é depositado no topo da coluna;
 Centrifugado 200g/20-30 min;
 Ressuspende e centrifuga para eliminar Percoll;
 Densidades inferiores: sptz imóveis e debris
celulares (70%);
 Densidade superiores: sptz móveis (90 -100%);
 Concentração e ressuspende em meio de FIV;
Subfertilidade → menor gradiente (a partir de 40%) e volume menor
 Preparo da Dose Inseminante

• Determinação da Concentração Espermática

• Avaliação da Motilidade Celular

Cálculo da Dose Inseminante

1 x 106 sptz/mL
 Fecundação
• A ligação dos espermatozoides ao oócito é mediado por receptores
espermáticos presentes na zona pelúcida;
– ZP1 (estrutural), ZP2 (ligação 2ª) e ZP3 (receptor1º - reação do acrossoma);
– Ação enzimática (Reação Acrossômica) e mecânica (Hipermotilidade).

• Oócito: ativado pelo sptz (segmento equatorial do sptz entra em

contato com a membrana plasmática do oócito)
– Aumento do cálcio no oócito;
– despolarização da membrana plasmática;
– exocitose dos grânulos corticais (enzimas hidrolíticas, proteinases e
peroxidases)→ Endurecimento da Zona Pelúcida;
– ZP1F, ZP2F e ZP3F (Hidrólise);
• Zona Pelúcida perde receptores espermáticos;
• Resistente a digestão enzimática e penetração espermática;
Fecundação

Tremoleda et al., 2006.

Fecundação

1. Sptz penetra no cumulus;

2. Reconhecimento Zona
Pelúcida:
a) Ligação ZP3
b) Ligação ZP2
c) Penetração Zona Pelúcida
3. Fusão Oócito/Sptz;
4. Ativação do Oócito e Bloqueio
da Zona Pelúcida;
5 e 6. Formação dos Pró-Núcleos;
 Fases da Fecundação
I. Passagem do espermatozoide pela Coroa Radiada:
• Ação da Hialuronidase;
• Movimentos espermáticos;
II. Penetração na Zona Pelúcida:
• Enzimas proteolíticas: Acrosina, estearases e
neuraminidases;
• Ocorre a Reação Zonal (Endurecimento da Zona Pelúcida)
→ impede polispermia;
III. Fusão das membranas do Oócito e Sptz:
• Membranas se rompem
• Cabeça e cauda do sptz penetram no citoplasma de oócito;
IV. Término da 2ª divisão meiótica do oócito
V. Formação do Pró-núcleo masculino
VI. Lise da membrana do pro-núcleo
 Fases da Fecundação
I. Passagem do espermatozoide pela coroa radiada
II. Penetração na zona pelúcida
III. Fusão das membranas do oócito e sptz
IV. Término da 2ª divisão meiótica do oócito:
• Óvulo maturo, extrusão do 2º Corpúsculo Polar;
• Formação do Pró-Núcleo Feminino;
V. Formação do Pró-núcleo masculino:
• Núcleo do sptz aumenta;
• Formação do Pró-Núcleo Masculino;
• Cauda degenera;
VI. Lise da membrana do pro-núcleo:
• Agregação dos cromossomos para divisão celular mitótica;
• Primeira Clivagem embrionária;
Fecundação
Fecundação
 Fecundação In Vitro
• Após maturação dos oócitos e separação dos sptz viáveis;
• Ambiente adequado para a capacitação espermática e
fecundação;
• Meio de FIV: vários meios comerciais;
• Co-cultivo: 18 a 22 horas, estufa 5% de CO2 a 37-39°C;
• Concentração espermática: 1x106 a 1x 107 sptz/mL;
• Sptz são adicionados a gota de fertilização com os oócitos em
MII;
Meio FIV: subsídio para a
fertilização pelo sptz.
• Heparina;
• Hipotaurina;
• Epinefrina;
• Cálcio;
• Ex: Fert-TALP, TALP-FIV;
Vídeo - Fecundação In Vitro

http://www.youtube.com/watch?v=NjnFBGW3Fmg

http://www.youtube.com/watch?v=gtPd4Yn_18c&feature=related
 FIV Equinos:
 Causas do Insucesso:
 Resistência do
Espermatozoide a
Capacitação;
 Endurecimento da zona
pelúcida prévio;
 ↓ Tx de recuperação de
Oócitos maturados in vivo;
 ↓ Tx de Maturação in vitro;

Tremoleda et al., 2006.

 Clivagem Embrionária
• Zigoto (1 cél.) sofre → Divisões Mitóticas repetidas;
• Inicia-se cerca de 24 a 30 h após a fecundação;
• Os Blastômeros tornam-se menores a cada divisão;
• Durante a clivagem o zigoto permanece dentro da zona pelúcida;
• Estágios Embrionários:
• Zigoto, 2 células, 4 células, 8 células;
• formação da Mórula (12 a 32 blastômeros);
• Compactação: polarização dos blastômeros e achatamento;
• Blastocisto: diferenciação celular e formação da blastocele;
Fecundação e clivagem
Embrionária Equina:

Tremoleda et al., 2006.

 Clivagem
Embrionária:

Cultivo embrionário por

7 dias.

Allen, 2005.
 Estágios do
Desenvolvimento
Embrionário:
 Zigoto 2 células 4 células 8 células

16 células/Mórula Mórula Compactação/ Blastocisto

Blastocisto inicial
Vídeo – Desenvolvimento Embrionário

http://www.youtube.com/watch?v=sIxBCxPW2Fc&feature=related
 Formação do Blastocisto
• Formação da cavidade blastocística;
– 32 céls suíno; 64 céls no bovino;
128 céls coelho;

• Partes Embrionárias:
– Trafoblasto: fina camada externa que
formará a placenta;
– Embrioblasto: grupo de blastômeros
localizados que dará origem ao embrião
– Pólo Embrionário: local da implantação
embrionária;
 Desenvolvimento e Cultivo
Embrionário In vitro
• Eventos do desenvolvimento:
– Clivagem, Ativação do genoma embrionário *ponto crítico
– Agregação e Compactação dos blastômeros
– Diferenciação do Trofoblasto e Embrioblasto;
– Formação e expansão da blastocele;
– Rompimento da zona pelúcida;
• Embriões produzidos in vitro são mais sensíveis ao cultivo que
os produzidos in vivo;
• Fatores Intrínsecos (não controlamos);
• Fatores Extrínsecos: meio, pH e condições ambientais;
 Desenvolvimento e Cultivo
Embrionário In vitro
• Meio de cultivo: nutrição celular e suporte para o desenvolvimento
embrionário;
• Potássio e cloro em concentração mais elevada, cálcio mais baixo que
meio de fertilização (fluído oviduto);
• Piruvato é essencial na clivagem (a partir de mórula que o embrião
consegue utilizar glicose como fonte de energia);
• Amilase e lactato dehidrogenase na conversão do piruvato em glicose;
• Aminoácidos (substrato energético, síntese proteica e reguladores do
pH): glutamina, glicina, alanina, prolina;
• pH é crítico: 7,3 a 7,5 (influência nas reações bioquímicas) (HEPES:
tampão orgânico)
• Vitaminas (HAM’s F10): incrementam o desenvolvimento;
• Soro Fetal Bovino (proteínas, Ac. Graxos, glicídios, hormônios, vitaminas
e fatores de crescimento).
 Protocolo PIV
• MIV: gotas de100 µl de TCM 199, 20-30 CCOs/gota;
• Capacitação: Gradiente de Percoll com SP-TALP;
• FIV: gotas de 100 µl de FERT-TALP, 20 CCOs + 1x 107 sptz/ml;
• CIV: Retirada das céls. do cumulus por pipetagem, cultivo
gotas de 100 µl de KSOM (+10% SFB e 4mg/ml de BSA),
renovação do meio de cultivo a cada 2 dias.

• Avaliações:
– Clivagem: 24 horas de cultivo (48 h após a FIV).
– Embriões de 2, 4 ou 8 células → retirada das estruturas não clivadas
– D7: estágio de blastocisto (transferência dos embriões)
 Resultados esperados na FIV
• Bovinos:
– Tx de Clivagem: 70% – 80%;
– Tx de Blastocisto: 35% - 50%
– Tx de prenhes: 60%
• Homem:
– Tx de Clivagem: 60 – 80%;
– Tx de desenvolvimento embrionário: 35 – 40%;
– Tx de gravidez: 25%;
• Ovinos e Caprinos:
– Tx de Clivagem: 50% - 80%;
– Tx de Blastocisto: 30% - 45%;
– Tx de prenhes: 60%
• Equinos:
– ICSI
 Fatores que afetam os resultados da FIV

• Sêmen (efeito macho): variações de 10 a 50% na Tx blastocisto;

• Oócitos: 0% a 75% (idade doadora e seleção dos oócitos);
• Interações embrionária (retirada das estruturas não clivadas);
• Tamanho da gota de cultivo e nº de oócitos/gota;
• Fatores de crescimento (IGF, EGF, TGF, PDGF);
• Meios e condições de cultivo;
• Transferência dos embriões (regressão do Corpo Lúteo);
• Variabilidade da Superovulação;