O que é biotecnologia da reprodução?

Estratégias associadas à técnicas reprodutivas que trazem grandes

benefícios do ponto de vista de eficiência reprodutiva e facilidade de
dispersão do material genético.

Limitações dos processos reprodutivos naturais

 Baixo aproveitamento de gametas;
 Obtenção de um ovócito viável a cada ciclo estral;
 Longos períodos de anestro pós-parto;
 Reduzido n° de descendentes na vida produtiva;
 Reduzido n° de fêmeas servidas.

Melhoramento genético – seleção de animais – ferramentas (biotecnologia)

Biotecnologias da reprodução
 IA e IATF;
 Ultrassonografia;
 MOET;
 OPU-PIV;
 MOIFOPA;
 Clonagem;
 Transgênese;

Reduzido emprego da inseminação artificial

 A detecção de cio é fator limitante para o emprego da l.A.;
 A baixa taxa de ciclicidade é fator limitante para o emprego da
l.A.;

Maneiras de melhorar a eficiência reprodutiva de vacas inseminadas

artificialmente

 Indução da ciclicidade e da ovulação por tratamentos;

Sexagem de sêmen

Citometria de fluxo:
o Raio laser ilumina as células numa corrente líquida ultrafina;
o Detectores analisam a luz espalhada e emitida pelos corantes
fluorescentes
aderidos ao DNA das células;
o As células são reconhecidas e selecionadas;
o Diferença no peso do DNA total entre o cromossomo X e Y.

Ultra-sonografia como ferramenta para melhorar a eficiência

reprodutiva
o Diagnóstico de falha de ovulação;
o Diagnóstico precoce da gestação;
o Identificação de gêmeos;
o Sexagem fetal;
o Perda embrionária precoce;
o Infecções sub-clínicas (pós-parto)

Múltiplas ovulações e transferência de embriões (MOET)

o Conservação de raças;
o Produção de um n° de descendentes muito superiores ao que
seria possível obter fisiologicamente;

Demais aplicações da TE

Base técnica para implementação de biotécnicas

 o bipartição embrionária
o sexagem de embriões
o produção de clones
o análise do genoma
o produção de animais transgênicos

Vantagens zootécnicas da TE
o Maior acurácia dos testes de progênie;
o Aumento de gestações gemelares;
o Aumento no n° de descendentes de animais superiores;
o A doadora não sofre estresse pós-parto;

Etapas da TE
o Seleção ginecológica e zootécnica de doadoras e receptoras;
o Sincronização da doadora e receptora;
o Superovulação da doadora;
o Coleta de embriões da doadora;

Transferência de embriões

o Podem ser feitas 6 a 8 coletas/doadora/ano

o Média de embriões/coleta: 5, V de 3 torna-se antieconômico
o Prenhez|coleta: 2,6 é considerado muito bom; 1,8 a 2,3 ainda é
econômico

Aspiração folicular associada à produção in vitro de embriões (OPU-

PIV)
o Aumentar o n° de nascimentos por fêmea de alto valor genético.

MOIFOPA
o Resgatar oócitos oriundos de folículos pré-antrais a partir do
ambiente ovariano, cultivá-los in vitro até a maturação,
possibilitando sua utilização em outras biotécnicas como FIV,
transgênese e clonagem.
Clonagem
Pega o oócito do animal tira o núcleo e coloca em uma célula diploide, manda pulsos
elétricos e a célula é incorporada com os pulsos e começa a fazer mitose

Biotecnologia

Avanços biotecnológicos:
o Revolucionar aspectos da nossa vida e de nossa relação com a
natureza;
o Uso dos organismos vivos para solucionar problemas ou
desenvolver produtos novos e úteis;
o Manipulação de microorganismos;

Biologia molecular
Utilização de células e moléculas biológicas para a solução de
problemas ou produção de produtos úteis;

Em particular: genoma dos organismos;

o Conjunto de informações genéticas
- Codificadas em moléculas de DNA

Transferência de embriões

Biotécnica que permite recolher embriões de uma fêmea doadora e

transferi-los para fêmeas receptoras com a finalidade de se levar à
gestação destes embriões;
o Fêmea doadora: animal de genética superior;
Aumenta-se o n° de descendentes produzidos em sua vida
reprodutiva;

o Rápida expansão genética;

o Aumento da intensidade de seleção;
o Aumento da produção de carne e leite;
o Pesquisas de interação genótipo- ambiente/ materno-fetal;
o Conservação de raças em perigo de extinção;

Seleção de doadoras
o Alta qualidade genética
o Melhor do rebanho
o Livre de doenças
o Fértil
o Vacinada
 o Ciclo regular
o Bom estado nutricional
o Excelente fenótipo
o Histórico reprodutivo conhecido
o Histórico dos pais

Superovulação
o Protocolos de superovulação:
Interferem na maturação dos folículos;

Ovinos e Caprinos
o Aspiração Folicular para Produção in vitro de Embriões
o Colheita e Transferência de Embriões
A receptora tem que entrar em cio no mesmo dia da doadora
Pega doadora induz o cio após 10 dias aplica FSH, invés de ter um folículo, você terá um monte,
dia 14 aplica prostaglandina para ter luteolise, após entrar no cio insemina a vaca, depois de
formar o embrião é recolhido 7 dias depois

Respostas ao tratamento superovulatório

 2/3 DAS VACAS RESPONDEM À SUPEROVULAÇÃO;
 10 ESTRUTURAS COLHIDAS POR VACA;
 60% DAS ESTRUTURAS COLHIDAS SÃO VIÁVEIS;
 60% DE GESTAÇÃO NA TRANSFERÊNCIA A FRESCO;
 50% DE GESTAÇÃO COM EMBRIÕES CONGELADOS;

Fatores que afetam a SOV (Superovulação)

Relacionados ao tratamento:
 Duração do tratamento;
 Momento do ciclo estral em que se inicia a SOV;
 Dose do hormônio;
 Tipo de hormônio utilizado;
 Via de administração do hormônio
 Partida do hormônio;
Doadoras: respondem ao 1°, 2° e 3° tratamentos superovulatorios;
Resposta a tratamentos subsequentes: é menor em consequência da
produção de anticorpos contra as gonadotrofinas;
Soluções:
o Aumentar o intervalo entre os tratamentos hormonais;
o Usar gonadotrofinas derivadas da mesma espécie que está
sendo tratada;

Fatores que afetam a SOB

Relacionados ao animal e ao seu ambiente:

 Folículo dominante;
 Histórico reprodutivo;
 Estado nutricional;
 Estação do ano;
 Idade do animal / Raça;
 Tratamentos repetidos;
 Condição individual;

Superovulação
Efeitos de tratamento superovulatório:
 Defeitos genéticos nos oócitos;
 Super ou submaturidade dos oócitos;
 Limitação na capacidade do útero para suportar um n°
aumentado de fetos;
Coloca com o aplicador, põe a seringa com ar para inflar e põe a pinça
Classificação dos embriões
o Coleta de oócitos não fecundados (NF);
o Embriões avaliados em grau 1 e 2: podem ser transferidos à
fresco ou congelados;
o Grau 3: apenas transferidos à fresco;
o Não suportariam os processos de congelamento e
descongelamento;

Embriões defeituosos
Embriões descartados:
o Blastômeros de tamanhos variáveis, não uniformes;
o Restos celulares na mórula;
o Blastômeros indistintos;
o Forma anormal da mórula ou blastocisto;
Seleção e preparo da receptoras

Taxa de gestação após a transferência de embrião:

o Bastante influenciada pelas condições e preparo das
receptoras;

Seleção das fêmeas receptoras

o Boas reprodutoras;
o Trato genital livre de infecções;
o 3 meses após o parto (não em lactação!);
o Sexualmente maduras;
o Ciclos normais;
o Boas condições e sem peso excessivo;
Sincronização do cio entre doadora e receptora
o Resultados ótimos: a receptora deve estar em cio com um
limite de 12 horas em relação a doadora;
o Taxa de gestação: cai drasticamente se a diferença for maior
de 24 horas;

Taxas de gestação
o Transferência de embriões congelados: 45 a 55% de gestação;
o Transferência de embriões não congelados: 62,5% de gestação;
o Estabelecimento da gestação: depende da produção do anti-
luteolítico interferon trofoblástico pelo concepto em tempo
hábil;

Criopreservação de embriões
Meio de congelamento: PBS + 10% de BSA + 10%glicerol;

Palheta:

Criopreservação de embriões
1. Colocar os embriões em 3 banhos de PBS + 10% de albumina sérica
bovina;
2. Colocar os embriões em PBS + 10% de albumina sérica bovina + 5%
de glicerol (5 minutos);
3. Colocar os embriões em PBS + 10% de albumina sérica bovina +
10% de glicerol (10 a 20 minutos);
4. Colocar os embriões em palhetas;
Fatores que afetam a sobrevivência do embrião após o
descongelamento
o Pressões osmóticas dos meios;
o Natureza e extensão do "seeding";
o Contaminantes microbiológicos na vidraria, congelador e no
armazenamento;
o Falhas no congelador;
o Sincronismo e natureza da receptora nas reposições
embrionárias;

Técnicas de resfriamento e congelamento de embriões bovinos

o Os embriões são resfriados rapidamente a 0°C;
o 0°C a - 6° ou 7°C (1°C/min);
o Manter essa temperatura por mais 15 minutos: forma-se um
pequeno cristal de gelo ao meio (seeding) que minimiza as
flutuações de temperatura;
o Resfriar de -6° C a -30°C (5°C/min);
o Quando as palhetas atingirem -30°C são mergulhadas em
nitrogênio líquido imediatamente;

Fecundação In vitro em bovinos (18/08)

FIV é a segunda etapa de PIVE (Produção in vitro de embrião)

Não necessita a utilização de hormônio para impulsionar os folículos
Punciona os folículos e recolhe os oócitos, após isso, classifica os
oócitos

PIVE
1ª etapa (MIV): classificar os oócitos, fazer a maturação do núcleo
dos oócitos para completar a metáfase 2.
- maturação do citoplasma, para os grânulos se distribuírem de
maneira correta para não ocorrer polispermia
2ª etapa (FIV): capacita os espermatozoides para fertilizar
3ª etapa (CIV): cultivos dos embriões

Aplicações da PIV
 Maior obtenção de descendentes
 Aproveitamento de fêmeas com infertilidade adquirida
 Morte - final da vida produtiva
 Geração de grande número de embriões para pesquisas
 Aumenta a pressão de seleção e diminui o intervalo entre
gerações

Fatores decisivos
 Maturação, capacitação dos ovócitos
 Capacitação espermática
 Fecundação in vitro
 Condições de cultivo dos embriões

OVOGÊNESE: vida fetal

 Ovogônias – Mitose – ovócitos primários – meiose – bloqueio

FOLICULOGÊNESE:
 Primordiais - Primários (ZP) – Secundários - Terciários (Graff) -
40d - Pré-ovulatório
 Pré antrais = primordiais, primários, secundários (bloqueio
meiótico)
 Antrais= terciários (Graff)
Fêmea nasce com os oocitos em prófase 1, e na puberdade entra
em metáfase 2 para poder ovular
Maturação nuclear no laboratório
 18 a 22 horas;
 Estádio de diplóteno da prófase I da 1ª divisão meiótica para o
estádio de metáfase II;

Modificações citoplasmáticas
 Reorganização das organelas citoplasmáticas, migração dos
grânulos corticais e alterações dos padrões de síntese proteica;
 A transcrição de genes só voltará a ocorrer após a transição
materno-zigótica;
 No início a transcrição ocorre pelo gene da mãe depois ocorre
pelo zigoto
Aspiração folicular
 Doadora viva
 sonda guiada por ultrasom
 “ovum pick up" (OPU)

Aspiração folicular

Pode-se obter oócitos de fêmeas:

 A partir dos 6 meses de idade;
 Vacas prenhes até o 3° mês de gestação;
 Vacas 2 a 3 semanas após o parto;

Periodicidade:
 Intervalos de 2 semanas, durante várias semanas ou meses;
 Não é necessário o tratamento das doadoras com
gonadotrofinas;
 Não precisa a utilização de FSH

Superovulação x OPU
 OPU (pulsão folicular): benéfico especialmente em novilhas
jovens, pois a estimulação hormonal pode provocar edema
mamário e síndrome de ovário cístico;
 Superovulação: feita repetidas vezes, pode provocar ainda
relaxamento dos ligamentos do úbere;

Coleta dos ovócitos após a morte

Folículos de
Utilização de percoll em diferentes densidades
Índices após transferência
 % prenhez
 Embriões transferidos a fresco e congelados

EFICIÊNCIA DA PIV
 Maior n° embriões viáveis
 Produtos nascidos normais

Índices obtidos com a PIV

o 40 - 50 % ovócitos até blastocisto
o 20 - 60 % gestação
Interferem: Laboratório - pessoal - metodologia
Fundamental: matéria prima:
condição atual doadoras + sêmen

OPU – FIV

Resultados variáveis – metodologia

Raças européias: 3,3 embriões viáveis/sessão (FSH a cada 2 sem.)

Raças zebuínas: Nelore 26,7 ovócitos/sessão de aspiração folicular e
a produção de 9,9 embriões/ sessão (Nonato Jr. et al., 2004)

Limitações da FIV
o Menor congelabilidade
o Índices de prenhez reduzidos
o Síndrome do terneiro grande
o Maior mortalidade perinatal
o Anomalias congênitas
o Desvio da proporção sexual
o Problemas atribuídos às alterações celulares de ordem genética
e estrutural dos embriões.
o Manipulações e/ou os métodos de cultivo in vitro provocam
alterações estruturais e funcionais nos embriões.

Considerações finais
Produção animal: limitações da FIV; adequadas a realidade; não
substituem manejo alimentar e sanitário deficientes.

25/07

TE clássica:
 Super ovulação (SOV), aplicas FSH na doadora
 IA na doadora, a receptoras tem que estar em cio nesse mesmo
dia
 Lavagem uterina, no dia 7 na doadora
  Selecionar embriões
 Pega os embriões inseminados e faz TE na receptora que
precisa ter corpo lúteo D7

PIV
 OPU (punção folicular)
 Classificar os oócitos (quanto mais celular do cumulus
compacta melhor)
 MIV (maturação) de meiose tem que ir para metáfase 2 quando
enxerga-se o corpúsculo polar, maturação do citoplasma é a a
qq
 Capacitação espermática
 FIV fertilização in vitro, 24h
 CIV, 7/8d Cultivo em vitro, formação do embrião, clivagem
 TE receptoras; CL 7/8d

TIFOI

 Sincronização vaca ovuladora; folículo dominante (FD), 10mm

 OPU (punção folicular)
 Classificação dos oocitos
 Sincronização vaca ovuladora; FD, 10mm
 Oócitos – FD
 IA
 Lavagem uterina D7
 TE receptora CL D7

MOIFOPA

 Tentar recuperar folículos pré antrais de vacas mortas

 Fatiamento para recolher o oocitos pre antrais das vacas que já
morreu
 Classificação

Clonagem

 Célula somática (2n)

 Pega um oócito (2n) tira o núcleo e coloca junto a célula
somática com pulsos elétricos para ocorrer a formação de
embrião
M

TIFOI: TRANSFERÊNCIA INTRAFOLICULAR DE OVÓCITOS

IMATUROS
Manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré antrais
(MOIFOPA)

Folículo antral: quando contém líquido

Folículo Pré antral: quando não contém líquido

Moifopa
 Visa a recuperação de um grande n° de oócitos inclusos nos
folículos pré-antrais (FOPA) e cultivo in vitro até sua completa
maturação;
 Ferramenta importante para estudar a foliculogênese;
 Alternativa para o fornecimento de milhares de oócitos viáveis,
inclusos em FOPA em diversos estádios de desenvolvimento,
para as biotécnicas de fecundação in vitro e clonagem;

Folículo
 Unidade morfofuncional do ovário;
 Constituído por um oócito circundado por células da granulosa
e tecais;
A) Folículos pré-antrais;
B) Folículos antrais;

FOPA
 Representam cerca de 90 a 95% de toda população folicular;
 Armazenam a grande maioria dos oócitos presentes em ovários
mamíferos;

Folículos pré-antrais:
 Folículos primordiais, intermediários, primários e secundários;
 99,9% dos folículos não chegam até à ovulação e é eliminado
por meio da atresia folicular;

Métodos utilizados para auxiliar o transporte e/ou a conservação de

ovários
 Transporte de ovários, complexos cúmulos oócito (CCOs) ou
folículos, pode-se utilizar tubos de ensaio de vidro ou
poliestireno, mantidos em banho-maria à 38.39°C

Perdas foliculares por degeneração folicular

 Pode ser influenciada:
1. Tipo de ovário utilizado como doador de FOPA;
2. Meio utilizado no isolamento folicular;
3. Composição do meio de cultivo.

Objetivos: Manipulação de Oócitos Inclusos em FOPA - MOIFOPA

 1. resgatar ou isolar os FOPA a partir dos ovários antes que eles
se tornem atrésicos;
2. cultivar os FOPA e, consequentemente, os oócitos imaturos
neles inclusos, até o estádio de maturação, prevenindo-os da
atresia.

Atresia
 Processo fisiológico que pode ocorrer por via degenerativa e/ou
apoptótica;

Vantagens da biotécnica de MOIFOPA

o Aumento da eficiência reprodutiva de animais de alto valor
zootécnico ou em perigo de extinção;
o Redução do intervalo entre gerações;
o Recuperação de rebanhos eliminados por problemas sanitários;
o Utilização de ovários de animais portadores de patologias de
ovidutos e/ou útero;
Permite a obtenção de descendentes de um animal mesmo após a
sua morte;
o Otimização da utilização de biotécnicas como a FIV, clonagem,
transgênese e transferência de embriões;
 Padronização das biotécnicas de FIV, clonagem e transgênese;
 Pesquisa fundamental: fonte abundante de informações a
respeito da foliculogênese na fase pré-antral;

Clonagem

o Técnicas de duplicação utilizadas em genes, células, tecidos,

órgãos e seres vivos;
o Ocorrem naturalmente em organismos unicelulares e plantas;
o Indivíduos resultantes são gerados de outros pré-existente;
o Mesmas características genéticas cromossômicas do "doador"

TRANSFERÊNCIA NUCLEAR
Aplicações Potenciais
I. Ciência Básica
II. Conservação Animal
III. Produção de Animais Transgênicos
IV. Produção Animal
V. Medicina (Associada ou não à Transgenia)

Proteínas recombinantes
o Proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados;
 o Hormônio de crescimento humano: nanismo;
o Anticoagulantes: dissolve trombos;
o Anticorpos monoclonais: testes diagnósticos;

Biotecnologia moderna
o Manipulação do material genético e reprogramação de
microorganismos;

Produção:
o Química;
o Farmacêutica;
o Alimentos;
o Agrícola;