CAPÍTULO 1

A SILVICULTURA CLONAL

Nas últimas décadas, tem-se assistido a um constante aumento no

interesse pela silvicultura clonal, decorrente tanto das vantagens do processo
quanto da possibilidade de contornar problemas de determinadas doenças,
heterogeneidade e profundidade dos plantios florestais. A área dos plantios
clonais vem ampliando cada vez mais em todo território brasileiro, graças a
disponibilidade de clones selecionados para as mais diversas regiões e
propósitos comercias, aliando a um custo competitivo. Além disso, esse
aumento tem possibilitado a implantação de projetos de reflorestamento em
áreas até então não indicadas, dada a falta de material genético via seminal
adaptado a atender a tal propósito.
Diante de crescente interesse pelo uso de clones nos projetos florestais,
tanto pelas grandes empresas quanto pelos pequenos investidores, inclusive
produtores rurais, tem-se percebido consideráveis avanços tecnológicos nos
processos de seleção, de clonagem de árvores e nas práticas silviculturais
adotadas na implantação e condução dos plantios florestais. Em razão da
importância dos plantios clonais, a denominação “silvicultura clonal” tem sido
empregada para designar o conjunto de técnicas silviculturais adotadas em um
programa de implantação e manejo de uma floresta clonal. Dessa forma, em
termos gerais, a “silvicultura clonal” pode ser caracterizada como a que
compreende o processo de formação de uma floresta clonal, desde a seleção
da árvore superior, multiplicação vegetativa, avaliação de árvores selecionadas
em teste clonal, produção de mudas, o estabelecimento e a condução da
floresta clonal até a colheita florestal.
Historicamente, a silvicultura clonal foi estabelecida a muitos anos para
Cryptomeria japonica no Japão sendo também conhecida e aceita para as
espécies populus spp. e Salix spp. Nas zonas temperadas e várias outras
espécies florestais em diferentes partes do mundo. (OHBA, 1993; ZSUFFA ET
AL., 1993).
Nas regiões tropicais e subtropicais, atualmente, o Eucalyptus constitui-
se em um dos gêneros mais explorados e tem merecido atenção especial na
silvicultura clonal. A importância das espécies de Eucalyptus em um programa
de silvicultura clonal advém, principalmente, dos interesses econômicos, das
experiências adquiridas na silvicultura em varias condições ambientais, do
domínio da tecnologia para as mais diversas aplicações, do uso dos produtos
advindos das árvores, da existência da grande variabilidade genética das
populações para os mais variados propósitos comercias, para razoável
facilidade de propagação vegetativa, aliada as características de rápido
crescimento (XAVIER, 2002; ASSIS; MAFIA, 2007).
No Brasil, relatos apontam que as plantações colônias com Eucalyptus
aumentam consideravelmente a partir da década de 1970; A heterogeneidade
dos plantios e a incidência de cancro foram decisivas para o desenvolvimento
da técnica de estaquia em escala operacional, considerado hoje referencia
mundial no controle de doenças dessa espécie (ALFENAS et al., 2004). Em
termos gerais, as características da silvicultura clonal são justificadas por:
uniformidade dos plantios, possibilitando maior controle sobre a qualidade dos
produtos; aproveitamento de combinações genéticas raras, como híbridos de
Eucalyptus grandis x E. urophylla ; maximização do ganho em profundidades
silvicultural e quantidade tecnológica da madeira em uma única geração de
seleção; possibilidade de contornar problemas de doenças, como “cancro”
(Cryphonectia cubensis); possibilidades de duas , três e quatro cotações
economicamente viáveis; custo acessível e competitivo para as empresas;
experiências adquiridas e avanços técnicos/científicos ao longo dos anos na
silvicultura; e opções de técnicas de propagação vegetativa em
desenvolvimento em diversas áreas da ciência.
A silvicultura clonal com Eucalyptus é uma das mais evoluídas e se
encontra bem estabelecida; os resultados verificados em campo tem levado à
sua implementação de forma intensiva e em diferentes regiões do mundo
(Figura 1.1 A). Outro exemplo de silvicultura clonal no Brasil refere-se à
heveicultura, em que a clonagem foi alternativa para contornar o problema de
doenças, produtividade de látex e adaptação local (Figura 1.1 B). No
estabelecimento de um programa de heveicultura é possível encontrar vários
clones apropriados para diferentes regiões brasileiras, tendo-se como forma
principal de produção de mudas o processo de propagação vegetativa por
enxertia.
 No caso das espécies do gênero Pinus, dado a sua grande importância
econômica a silvicultura clonal almejada há vários anos, porém, em razão da
grande dificuldade de clonagem por vias tradicionais, a clonagem em nível de
famílias selecionadas tem sido adotada. O desenvolvimento de técnicas
biotecnológicas mais avançadas, como a embriogênese somática, tem
proporcionado um grande avanço nesse sentido, embora as dificuldades ainda
persistam quando se objetiva a multiplicação de materiais não-juvenis.
Em outras espécies florestais, a silvicultura clonal está em nível de
desenvolvimento no Brasil, com diferentes graus de avanço. As espécies
liquidambar (Liquidambar styraciflua), grevílea (Grevillea robusta), erva-mata
(Ilex paraguariensis), compresso (Compressus lusitanica), teca (Tectona
grandis), criptoméria (Cryptomeia japonica), acácia-negra (Acacia mearnsii),
pupunha (Bactris gasipaes), paricá (Schizolobium amazonicum), entre outras,
porém se enquadradas nesse grupo.
Os avanços na biotecnologia tem encontrado na silvicultura clonal um
veículo para sua expansão e implementação de novas tecnologias voltadas à
área florestal. Entre estas tecnologias, a cultura de tecidos por meio da
micropropagação e embriogênese somática tem sido alvo de vários alvos de
pesquisa, assim como a possibilidade de implementação da transformação
genética para obtenção de plantas com desempenho silvicultural e tecnológico
de interesse comercial.
 Princípios Biológicos da Silvicultura Clonal

Para maior compreensão da silvicultura clonal, o entendimento dos

princípios específicos da biologia e dos conceitos de multiplicação das plantas
torna-se pré-requisito. Para as plantas superiores de forma geral, a propagação
pode ser conseguida pelas vias sexuada e assexuada; a primeira caracteriza-
se por ter a semente como elemento de propagação, enquanto a segunda tem
nos propágulos vegetativos o meio de multiplicação da planta. Estas formas de
propagação de plantas podem ter seus elementos de propagação conceituados
como:
Semente: elemento de reprodução das plantas que resulta da
fecundação e desenvolvimento de óvulo maduro, compreendendo o embrião,
as substâncias de reserva e um ou mais tegumentos. Normalmente, é o
resultado da recombinação genética entre plantas. A também o termo Semente
Sintética, usando para embriões produzidos via embriogênese somática, os
quais são posteriormente encapsulados.
Propágulo Vegetativo: em geral, é qualquer estrutura que serve para
propagação ou manipulação vegetativa de uma planta. É o elemento de
propagação da planta que não envolve recombinação genética, permitindo a
reprodução fiel do genótipo da planta, dada a totipotência da célula vegetal.
A propagação vegetativa somente é possível devido a capacidade que
células, parte de órgãos ou órgãos tem para regenerar órgãos ou plantas, em
razão da sua totipotência. Essa é a capacidade de qualquer célula do
organismo vegetal de regenerar uma planta completa.
Uma célula reprogramada se torna totipotente, ou seja, adquire a
habilidade de reproduzir uma planta inteira, da mesma forma que uma oosfera
fertilizada. Assim, enquanto na micropropagação a remeristematização leva à
formação de gemas e raízes, no caso da embriogênese somática, leva à
formação de embriões. Porém, o embrião é uma estrutura bipolar, ao passo
que os meristemas são unipolares.
Para melhor entendimento das implicações das formas de propagação
da silvicultura e pressupondo que um organismo pode ser descrito por seu
fenótipo (F), que resulta dos efeitos genotípicos (G), dos efeitos ambientais (E)
e da interação “genótipo x ambiente” (GE), elas podem ser representadas
conforme a expressão mostrada na figura 1.2.

Assim, na propagação vegetativa ou assexuada de plantas, a

constituição genérica é mantida inalterada das plantas resultantes, formando
clone. Entretanto, se a propagação realizar-se por via sexuada, a semente
constitui a fonte de propágulo, acarretando variação genotípica entre as plantas
descendentes (família).
Como conseqüência, da forma de propagação, pode-se observar para
que as variações fenotípicas entre plantas propagadas assexuadamente,
oriundas de um mesmo antecessor, são decorrentes apenas das variações
ambientais (e’). Entretanto, quando a propagação se realiza por meio de
sementes, as variações observadas entre as plantas são proporcionadas pelas
variações genéticas (g’) e, também, do ambiente (e’), bem como pela interação
entre ambas (g’e’).
Uma das principais implicações da forma de propagação das plantas
está no fato de os plantios via propagação assexuada constituírem-se em
populações com maior uniformidade em ambiente homogêneo (Figura 1.3 A)
em relação àquelas oriundas de sementes (Figura 1.3 B), o que se torna
vantajoso em muitas situações no campo da silvicultura intensiva, como é o
caso do eucalipto e da seringueira. No entanto, a uniformidade genética das
populações clonais pode torná-las mais vulneráveis às variações adversas no
ambiente.

Clonagem de Árvores e a Silvicultura Clonal

A silvicultura clonal, como um sistema silvicultural, surgiu no início do

século XX e baseava-se na enxertia como processo de propagação.
Entretanto, os procedimentos adotados seguiam práticas horticulturais, que na
maioria das vezes eram consideradas inapropriadas para a silvicultura, em
razão dos custos de propagação e do desconhecimento da especificidade dos
clones (LIBBY; AHUJA, 1993).
Com os avanços na propagação vegetativa e sua efetiva aplicação na
silvicultura, os conceitos de “silvicultura clonal” tornaram-se mais abrangentes
que os da “clonagem de árvores”, praticada nos dias atuais. A silvicultura clonal
significa muito mais do que simplesmente clonar uma árvore. No entanto, a
clonagem constitui-se em um pré-requisito para esta silvicultura.

Caracterização da Clonagem de Árvores

De modo geral, o termo “clone” significa um grupo de plantas

geneticamente idênticas, derivadas assexuadamente de um antecessor
comum. Entretanto, esse termo pode ser caracterizado de três formas: 1)
historicamente, o “clone” constitui-se de um grupo de plantas obtidas a partir de
propágulos vegetativos de uma planta, como, por exemplo, o processo de
clonagem pela propagação vegetativa via estaquia de Eucalyptus, utilizado na
formação de florestas clonais; 2) culturas de células que, por intermédio da
tecnologia desenvolvida na biologia, tem permitido o desenvolvimento da
chamada linha celular, em que, a partir de diferentes células de um mesmo
organismo, obtêm-se diferentes clones; e 3) o desenvolvimento da tecnologia
de manipulação de DNA tem permitido o seqüenciamento e a clonagem de um
simples gene. Nesse último caso, com a implementação da engenharia
genética, a partir da década de 1970, a manipulação do DNA tornou-se
possível, permitindo a introdução de genes de uma espécie no genoma de
outra, de forma controlada, gerando os chamados “organismos transgênicos”.
Na silvicultura clonal, o termo clone refere-se a um grupo de plantas
obtidas a partir de propágulos vegetativos de uma planta. Nesse caso, todo o
processo envolvido no programa de silvicultura clonal inicia-se com a seleção
de árvores superiores, que darão origem aos clones por meio do processo de
clonagem.
A clonagem de árvores é praticada há várias décadas com os mais
variados propósitos, podendo ser citados como exemplos:
1. Multiplicação de genótipos selecionados para uso em programas de
melhoramento genético, visando formar pomares de sementes, bancos clonais
para hibridação etc.
2. Multiplicação de clones selecionados, visando compor bancos clonais.
3. Pesquisa em geral, devido à uniformidade e repetibilidade das plantas
oriundas de um mesmo clone.
4. Conservação de germoplasma.
5. Multiplicação vegetativa de mudas oriundas de sementes quanto a
quantidade desejada para propagação é insuficiente para o programa proposto.
Nesse caso, enquadram-se as sementes provenientes de coleções de
procedências, famílias selecionadas e cruzamentos controlados.
6. Método alternativo de propagação de plantas, principalmente nas
situações em que a propagação sexuada (semente) é difícil e de alto custo.
7. Multiplicação vegetativa de genótipos selecionados (clones) para
atender aos propósitos da silvicultura clonal.
Outras aplicações da propagação vegetativa podem se tornar evidentes,
dependendo da espécie e do uso desta na silvicultura. Portanto, a silvicultura
clonal assume dimensões adicionais, que se destacam em relação à simples
clonagem de árvores.

Caracterização da Silvicultura Clonal

Tem sido desenvolvida uma caracterização mais precisa da silvicultura

clonal, que, isoladamente ou em combinação com outras técnicas silviculturais,
distingue-se do mero uso da clonagem de árvores. Assim, com base em Libby
e Ahuja (1993), o que realmente qualifica a silvicultura clonal são algumas
características básicas:
1. O fato de a clonagem de árvores constituir um pré-requisito para a
silvicultura clonal, por ser a técnica básica na produção de mudas nessa
atividade.
2. Necessidade de conhecimento sobre o desempenho do clone. A
utilização de testes clonais é um instrumento importante na avaliação dos
clones, em razão da utilização almejada; o desempenho do clone pode ser
acompanhado ao longo do ciclo de produção, bem como o comportamento em
diferentes sítios. Informações sobre a especificidade de uso aliadas ao
desenvolvimento silvicultural indicarão o uso mais apropriado.
3. Conhecimento das técnicas mais adequadas de propagação e manejo
em viveiro de determinado clone, dada a necessidade de atender à produção
de mudas clonais.
4. Necessidade de adequação de práticas silviculturais em que a definição
de espaçamento de plantio, nutrição, tratos culturais e ciclos de rotação
econômica deve atender às exigências de comportamento e uso final de um
determinado clone.
5. A diversidade genética entre os clones deve ser conhecida, visto que os
plantios clonais apresentam, em geral, menor base genética em relação aos
plantios via semente.
6. Possibilidade de captura de ganho genético adicional em relação ao
processo sexuado. Isso se deve ao fato de que, na seleção do clone, captura-
se, além da variação genética aditiva, a variação não-aditiva. Nessas
condições, combinações genéticas raras e favoráveis para determinadas
situações podem ser clonadas, antecipando resultados que demandariam
longo tempo no processo sexuado para recomendações comerciais.
7. Possibilidade de utilização de genótipos de alta produtividade,
adaptação e uniformidade a custos competitivos, o que torna a silvicultura
clonal um atrativo do ponto de vista comercial.
8. Oportunidade de usar tecnologias inovadoras, como a transformação
genética, na obtenção de plantas de interesse comercial, as quais podem ser
multiplicadas para um projeto de floresta clonal.
A silvicultura clonal deve ser qualificada como aquela em que o clone
deve ser bem conhecido quanto aos aspectos silviculturais e de uso final,
visando atender requisitos técnicos e econômicos. Dessa forma, é uma
silvicultura que compreende todo o processo de formação da floresta clonal,
desde a seleção da árvore superior, passando pela multiplicação vegetativa,
avaliação em teste clonal, produção de mudas, até o estabelecimento da
floresta no campo. A clonagem de árvores é, portanto, apenas parte integrante
da silvicultura clonal.

Silvicultura Clonal, Genética e Biotecnologia

A silvicultura clonal é um ramo da silvicultura que tem permitido grandes

avanços na utilização de algumas espécies florestais. Dada a importância da
silvicultura clonal, modelos de desenvolvimento vêm sendo ajustados e
propostos, sendo o melhoramento genético parte integrante do programa
clonal. As estratégias clonais devem estar diretamente ligadas ao
melhoramento genético, uma vez que seleções sem recombinações futuras
conduzem a um programa estático, sem processo posterior.
O sucesso da silvicultura clonal é dependente da obtenção de clones
com características desejáveis ao processo produtivo. Assim, combinações
genéticas com características que atendam à demanda devem ser
selecionadas na população ou obtidas mediante melhoramento genético.
Em um moderno programa de silvicultura clonal, ações de melhoramento
genético são complementares e essenciais, pois um apropriado programa de
melhoramento genético florestal constitui suporte ao fornecimento de novos
clones que atendam à necessidade dessa silvicultura.
Novos desenvolvimentos em biotecnologia e suas aplicações em
espécies florestais têm contribuído para ampliar o potencial da silvicultura
clonal. Essas tecnologias têm proporcionado oportunidades de multiplicação
rápida e eficiente de genótipos selecionados, constituindo-se em uma
importante ferramenta para o melhoramento genético florestal, entre outras
aplicações. Contudo, muitas dessas tecnologias ainda carecem de
desenvolvimentos básicos para uma real aplicação na área florestal. Na
silvicultura clonal, o melhoramento genético e a biotecnologia são
interdependentes e complementares e alavancam o desenvolvimento da
silvicultura.
 Capítulo 2

BIOLOGIA DA PROPAGAÇÃO CLONAL

No processo evolutivo das técnicas de propagação de plantas, o

desenvolvimento da ciência, aliado ao processo produtivo, mostrou-se sempre
necessário para alcançar os objetivos almejados na multiplicação e
preservação de material genético selecionado. O conhecimento de algumas
áreas da propagação de plantas é considerado imprescindível ao bom
desempenho no processo de multiplicação destas. Hartmann et al. (2002), por
exemplo, citam a arte da propagação, a ciência da propagação e o
conhecimento das plantas.
A arte da propagação: o sucesso da propagação de plantas requer
domínio da técnica para manipulação adequada do seu crescimento.
Características como habilidade, prática, dedicação e experiência pessoal na
condução do processo de propagação das plantas são indispensáveis. A
existência de informações científicas de determinadas técnicas e uma ampla
aplicação destas, para as mais variadas espécies e usos, facilitam a adoção de
uma em detrimento da outra de forma mais racional e viável na propagação
daquela planta.
A ciência da propagação: a propagação de plantas requer perspicácia
e conhecimento quanto à morfogênese, desenvolvimento e crescimento, bem
como conhecimento básico de física, química, nutrição e aspectos de ecologia
do ambiente de propagação. Esses conhecimentos podem ser obtidos
empiricamente durante o processo de propagação das plantas e incrementadas
pelo conhecimento adquirido no ensino formal de química, física, botânica,
genética e fisiologia de plantas, assim como pelas informações científicas
advindas dos avanços obtidos na pesquisa científica.
O conhecimento das plantas: no processo evolutivo das técnicas de
propagação, as várias técnicas foram avaliadas, aperfeiçoadas e, ou, ajustadas
às diferentes exigências fisiológicas e ambientais de cada espécie, em função
dos objetivos desejados, das experiências adquiridas, dos avanços
tecnológicos e da estrutura disponível. Assim, o sucesso da propagação está
no conhecimento das plantas e das técnicas adequadas a ela em uma dada
condição e necessidade.
As três áreas de conhecimento da propagação de plantas mencionadas
são complementares e necessárias, em que a teoria compartilhada com a
prática, aliada ao conhecimento da planta que está sendo multiplicada,
permitem alcançar os objetivos com maior eficiência e qualidade.
A maioria das espécies lenhosas normalmente é de natureza
heterozigótica, imposta pela alogamia quase que obrigatória no processo de
reprodução de plantas; na maioria das espécies, a forma principal e natural de
propagação é por via seminal. Diante disso, a alternativa utilizada no setor
florestal para obtenção de materiais superiores, visando atingir determinados
propósitos, foi o uso da propagação vegetativa no processo de produção de
mudas clonais.
As expressões “propagação vegetativa”, “propagação assexuada” e
“propagação clonal” de plantas têm sido utilizadas rotineiramente para designar
a multiplicação e produção de novas plantas usando propágulos vegetativos de
uma planta ou clone específico. No entanto, em algumas situações,
determinada expressão pode ser preferida em função dos objetivos que esta
busca enfocar; assim, a expressão “propagação assexuada” tem sido utilizada,
principalmente, quando se pretende referenciar o modo de reprodução de uma
planta; a expressão “propagação vegetativa” tem sido utilizada mais para
referenciar a forma de propagação de uma planta em um processo de
produção de mudas; e, quando se tratar de produção de mudas de um
determinado clone; a expressão “propagação clonal” tem sido empregada.
Logicamente que essas expressões têm sido utilizadas de forma indiscriminada
e que em muitas situações elas são formas alternativas de expressar o modo
de propagação de uma determinada planta. Outras expressões, como
“propagação agâmica” e “propagação somática”, também são encontradas na
literatura para referenciar esse tipo de propagação de plantas. No entanto, de
modo geral, a expressão “propagação vegetativa” tem sido aquela com maior
difusão nas diversas áreas que atuam com a propagação de plantas.
 Princípios Biológicos da Propagação de Plantas

Na propagação vegetativa, a mitose é o processo responsável pelo

controle, desenvolvimento e crescimento das plantas, na qual é mantida a
identidade genética da planta matriz. Dessa forma, um propágulo constitui-se
de parte de uma determinada planta usada para produzir uma ou mais novas
plantas. Entre os vários tipos de propágulos incluem-se as sementes
(propagação sexuada), estacas, estruturas florais, segmentos vegetativos e
vários tipos de estruturas especializadas, como gemas, calos, bulbos, estolões.
O uso de um propágulo em detrimento de outro está em função dos objetivos
desejados, da espécie, da disponibilidade de material vegetativo e da estrutura
de propagação disponível.
A ciência da propagação de plantas baseia-se em alguns dos princípios
básicos da biologia. Em um processo de organogênese in vitro, por exemplo,
segundo Peres (2002), várias são as etapas envolvidas na regeneração de
uma planta (Figura 2.1).

“Organogênese” significa o processo de neoformação de partes aéreas,

raízes ou de outros tipos de explantes, na condição in vitro ou in vivo,
contrastando com a “embriogênese”, na qual se forma uma estrutura
semelhante ao embrião, com eixo polar (radícula – parte aérea) completo. A
condição in vitro indica, literalmente, no vidro, termo aplicado para designar
crescimento de células, tecidos ou órgãos vegetais em meio de cultura, sob
condições assépticas.
 “Desdiferenciação” constitui-se no processo pelo qual uma célula
diferenciada perde suas características específicas, reassumindo atividades
meristemáticas, ou seja, trata-se de um processo de alcançar um estado
meristemático não diferenciado em células previamente diferenciadas.
O termo “competência” é usado para descrever o potencial de uma
determinada célula ou tecido em se desenvolver em uma forma particular,
como, por exemplo, a competência para iniciar enraizamento adventício, um
embrião ou uma flor. O desenvolvimento da competência por um tecido requer
certa quantidade de tempo e, ou, exposição a um sinal endógeno ou exógeno.
A “indução” indica o que causa a iniciação ou desenvolvimento de uma
estrutura ou processo. O termo “determinação” refere-se ao grau de
comprometimento que um grupo de células tem perante um direcionamento
naquele momento. A “diferenciação” significa as mudanças fisiológicas,
morfológicas e anatômicas que ocorrem em uma célula, tecido, órgão ou
planta, durante o desenvolvimento do estado meristemático ou juvenil para o
adulto.
Todo o processo de regeneração de uma planta pela propagação
vegetativa somente é possível dada a totipotencialidade das células vegetais
em manifestar, em momentos diferentes e sob estímulos apropriados, a
potencialidade em iniciar um novo indivíduo multicelular. Em vista da
“totipotência” que toda célula viva possui, esta tem potencial para produzir um
organismo inteiro, desde que possua informação genética para tal expressão
gênica. O termo “expressão gênica” refere-se aos padrões de desenvolvimento
e crescimento das plantas, decorrente da informação genética contida no
genoma daquela planta, associada às condições ambientais. Dessa forma, as
variações fenotípicas observadas em plantas são manifestações resultantes
das informações genéticas para formação de suas estruturas, padrões de
crescimento e funções, exercendo controle primário no processo de
propagação.
Embora a organogênese seja um processo considerado empírico,
segundo Peres (2002), o desenvolvimento de um protocolo é facilitado se
forem seguidos alguns princípios e conhecimentos fisiológicos. De acordo com
esse autor, normalmente o sucesso da propagação por organogênese in vitro é
dependente principalmente da etapa de aquisição de competência, pois,
quando um explante falha em desenvolver organogênese in vitro, esta se dá
normalmente na etapa de aquisição de competência. Contudo, pouco se
conhece, até o momento, sobre os mecanismos envolvidos nesse processo.
De acordo com o exposto, o conhecimento dos princípios básicos da
biologia ajuda a compreender melhor a propagação de uma planta, facilitando a
sua multiplicação clonal, assim como acompanhar a história do
desenvolvimento do organismo durante o seu ciclo vital, ou seja, a “ontogenia”
da planta.

Ação Hormonal nas Plantas

Hormônios vegetais são um grupo de substâncias orgânicas de

ocorrência natural que, em pequenas concentrações, influenciam os processos
fisiológicos de crescimento, diferenciação e desenvolvimento (DAVIES, 1995).
São substâncias conhecidas há muito tempo, porém sua ação nas plantas foi
melhor entendida nos últimos anos.
Entre os hormônios de plantas mais conhecidos e de interesse na
propagação de plantas, destacam-se as auxinas, giberelinas, citocininas,
etileno e ácido abscísico. Em certas condições, essas substâncias possuem
efeito quando aplicadas nas plantas exogenamente, sendo denominadas de
reguladores de crescimento vegetal e, ou, fitorreguladores.
Auxinas: São compostos com atividade biológica similar àquela do
ácido indol-3-acético (AIA), incluindo a capacidade de promover o alongamento
de coleóptilos de segmentos de caules, divisão celular em culturas de calos em
presença de citocininas, formação de raízes adventícias em folhas ou caules
destacados e outros fenômenos do desenvolvimento relacionados com a ação
do AIA (TAIZ; ZEIGER, 2004).
Segundo Válio (1985), as auxinas são sintetizadas nas plantas,
principalmente em regiões de crescimento ativo, como meristema apical,
gemas auxiliares e folhas jovens, sendo translocadas para diferentes órgãos,
de acordo com o mecanismo de transporte polar e basípeto. O AIA é a principal
auxina nos vegetais superiores (TAIZ; ZEIGER, 2004); segundo esses autores,
embora quase todos os tecidos vegetais sejam capazes de produzir baixos
níveis de AIA, os meristemas apicais, as folhas jovens, os frutos e as sementes
em desenvolvimento são os principais locais de síntese desse hormônio.
A aplicação da auxina em órgãos isolados promove aumento da
resposta, paralelamente ao aumento da concentração até certo nível, após o
qual ocorre efeito inibitório. Entretanto, a resposta da planta à auxina endógena
ou exógena varia tanto com a natureza do tecido quanto com a concentração
da substância presente.
As principais aplicações das auxinas na propagação de plantas são a
indução de raízes adventícias em estacas e o controle da morfogênese na
micropropagação. Segundo Taiz e Zeiger (2004), as auxinas também
promovem o crescimento de caules e coleóptilos, inibem o crescimento das
raízes, regulam a dominância apical, retardam o início da abscisão foliar e
regulam o desenvolvimento das gemas florais e frutos.
Fisiologistas têm buscado definir o modo de ação química das auxinas
nas plantas. Acredita-se que a promoção de crescimento pelas auxinas ocorre
por meio de dois mecanismos: a) pela promoção de transporte de íons H+ pelas
paredes celulares, aumentando sua extensão; e b) pela indução da transcrição
de RNAm específico necessário para promover o crescimento. Em
morfogênese, a aplicação de auxina parece capaz de apagar programas de
diferenciação celular, revertendo células em estado de diferenciação e
reabilitando a divisão celular.
Dentro do grupo auxinas, Taiz e Zeiger (2004) salientam que o AIA
ocorre em todos os vegetais, mas outros compostos relacionados apresentam
atividade auxínica; mostarda e milho contêm ácido indol-3-butírico (AIB). Além
do AIA, várias outras substâncias com funções regulatórias de crescimento
semelhantes e com aplicação na propagação das plantas são produzidas
sinteticamente: ácido indol-3-butírico (AIB), ácido naftalenoacético (ANA), 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D), entre outros.
Citocininas: Constituem um grupo de hormônios de grande importância
no crescimento das plantas, tendo em vista os efeitos na divisão celular e
diferenciação de gemas. Os meristemas dos ápices radiculares são as regiões
da planta de maior síntese de citocininas livres, as quais parecem se mover
pelo xilema até a parte aérea, juntamente com a água e os sais minerais
absorvidos pelas raízes (TAIZ; ZEIGER, 2004).
 O equilíbrio entre auxina e citocinina é uma das relações primárias na
propagação de plantas, em que uma alta relação auxina/citocinina favorece o
enraizamento; uma baixa relaçãofavorece a formação de brotações; e um alto
nível de ambas favorece o desenvolvimento de calo. Vale salientar também
que a interação entre citocinina, ácido abcísico e giberelinas controla a
dormência de sementes.
Além dos efeitos na divisão celular, as citocininas também são
importantes na morfogênese in vitro pela indução do caule, no crescimento de
caules e raízes, na expansão foliar, no movimento dos nutrientes, no
retardamento da senescência foliar, entre outros (DAVIES, 1995; TAIZ:
ZEIGER, 2004).
As citocininas de maior interesse na propagação de plantas e de
ocorrência natural são a zeatina (ZEA) e a isopenteniladenina (2iP). Quanto às
citocininas produzidas sinteticamente, além das citadas anteriormente, existem
a 6-benzilaminopurina (BAP), a cinetina (KIN) e o thidiazuron (TDZ).
Giberelinas, Ácido Abscísico e Etileno: As giberelinas ocorrem em
altas concentrações nas sementes imaturas e nos frutos em desenvolvimento e
possuem importante função na germinação e no controle da dormência.
Ocorrem também em altas concentrações em ápices caulinares, sendo
transportadas no interior da planta pelo xilema e floema (DAVIES, 1995). Entre
as funções nas plantas estão aquelas relacionadas com a promoção do
alongamento de brotações por meio da divisão celular e alongamento, além da
regulação da transição da fase juvenil para a adulta em muitas plantas
lenhosas. Mais de 125 formas de giberelinas foram encontradas nas plantas,
embora somente algumas se apresentem fisiologicamente ativas e, em
particular GA1 e GA4, sejam responsáveis pelos efeitos nas plantas, sendo as
demais precursores ou metabólicos (TAIZ; ZEIGER, 2004). O ácido giberélico
(GA3) é uma das mais importantes como produto comercial.
O ácido abscísico enquadra-se na classe de inibidores de crescimento e
é considerado importante em muitas atividades das plantas. Na propagação de
plantas, esse inibidor está envolvido na germinação e dormência, bem como na
embriogênese e produção das sementes (HARTMANN et al., 2002).
O etileno é um regulador de crescimento gasoso com estrutura química
muito simples e que, segundo Hartmann et al. (2002), pode ter efeitos
profundos no crescimento das plantas, incluindo a epinastia, quando em alta
concentração, senescência e abscisão de folhas e frutos, promoção do
florescimento, estimulação das gemas laterais e estimulação da produção do
látex. Na propagação, o etileno pode induzir enraizamento adventício, estimular
a germinação em algumas sementes e superar a dormência.
Outros hormônios: além das substâncias citadas, outros compostos
químicos naturais ocorrem em plantas e são considerados como hormônios.
Incluem-se nesta classe as poliaminas, os brassinoestereoides, os jasmonatos,
os salicilatos, alguns complexos oligossacarídeos e inositol trifosfato.

Juvenilidade e Maturação em Plantas Lenhosas

As plantas apresentam ao longo da sua vida consecutivos períodos de

crescimento vegetativo (formação de caule, folhas e raízes) e de
desenvolvimento reprodutivo (formação de flores, frutos e sementes),
determinados por padrões sazonais baseados em mudanças climáticas
(temperatura, luz e, ou, precipitação) e pela resposta às mudanças durante o
ciclo de vida.
Ciclos de vida superiores a dois anos caracterizam as plantas perenes,
as quais apresentam repetidos ciclos vegetativo-reprodutivos, anualmente,
binualmente ou em períodos mais longos. Em geral, arbustos têm maior
período de juvenilidade em relação às árvores e, embora a fase madura ocorra
em plantas herbáceas anuais e perenes, esta é geralmente menor quanto à
duração; as mudanças nas características morfofisiológicas associadas às
trocas de fase são menos distintas do que em outras plantas (HACKETT,
1987). As mudanças ocorridas durante esses ciclos apresentam grande
importância no processo de propagação de plantas, em que podem ser
caracterizadas as seguintes fases (Figura 2.2):
Fase juvenil: é caracterizada pela predominância de características
juvenis, correspondente ao estádio inicial de crescimento vegetativo das
plantas após a germinação e, em algumas plantas, pela incapacidade dos
meristemas apicais em induzir florescimento mesmo que condições favoráveis
para isso existam.
 Fase de transição juvenil/adulta: caracteriza-se pela transição entre a
fase vegetativa e produtiva, ou seja, pela passagem da planta da fase juvenil
para uma condição madura.
Fase adulta: corresponde àquela fase com predominância das
características maduras em relação às juvenis. É caracterizada principalmente,
pela fase reprodutiva das plantas, ou seja, pela fase em que ocorre o
florescimento e frutificação da planta.

O ciclo de vida de muitas espécies refere-se às fases juvenil e adulta,

nas quais as características morfológicas e fisiológicas são diferentes. Após a
germinação da semente, a planta inicia uma fase de crescimento vegetativo
muito rigoroso, durante a qual a floração não pode ser induzida, mesmo que as
condições externas sejam favoráveis (SALISBURY; ROSS, 1978). Assim, a
fase juvenil de algumas plantas é caracterizada pelo não florescimento, grande
vigor e presença de espinhos; e a fase adulta, pelo florescimento e frutificação,
reduzido vigor e ausência de espinhos (HARTMANN et al., 2002).
Quanto à regulação da troca de fase, evidências predominantes
sugerem que a planta necessita ter um determinado tamanho antes de entrar
na fase adulta (HACKETT, 1987). Além disso, segundo Hackett e Murray
(1993), as mudanças ocorridas em função da trocas de fase com o
desenvolvimento da planta variam de espécie para espécie, e as maiores
alterações ocorrem no período precedente à maturação, resultando em formas
transicionais. Segundo esses autores, as características relacionadas à
maturação são estáveis, porém reversíveis, para determinadas características,
variando em decorrência do tempo de desenvolvimento. Para Greenwood
(1992), a maturação é uma determinação celular regulada por fatores
intrínsecos e extrínsecos das células do meristema apical.
A maturação frequentemente é confundida com a idade cronológica,
embora seja reversível sob certas condições, e a idade, provavelmente não. De
modo geral, com o avanço da idade, a planta ou órgão tende à senescência e
morte, enquanto o meristema apical adulto de plantas pode ter sua juvenilidade
restaurada, ou seja, rejuvenescida (HUANG et al., 1990). Segundo Hackett e
Murray (1993), as características de maturação se arquivam em função de sua
relativa estabilidade e são transmitidas por meio das divisões celulares de uma
geração somática para a próxima.
Com base na conceituação de maturação apresentada por Fortanier e
Jonkers (1976), podem-se descrever três tipos de idade em uma planta:
Idade cronológica: refere-se ao tempo decorrido desde a germinação
da semente até a data de observação da planta, ou seja, é a idade registrada
do tempo de vida de uma planta ou propágulo.
Idade ontogenética: refere-se à passagem da planta por sucessivas
fases de desenvolvimento, as quais incluem embriogênese, germinação,
crescimento vegetativo e reprodutivo. Corresponde à maturação da planta,
passando pela fase juvenil, de transição juvenil-adulta e adulta.
Idade fisiológica: corresponde ao aspecto de vigor fisiológico da planta,
como sanidade e status nutricional e hídrico. Refere-se aos aspectos negativos
da idade, como perda de vigor, aumento da suscetibilidade às condições
adversas ou a deterioração em geral.
De modo geral, em algumas espécies florestais, há um gradiente da
juvenilidade ontogenética em direção à base da árvore, sendo ele variável
entre espécies (HACKETT, 1987), o que promove aumento da maturação em
função da maior proximidade com o meristema apical (GREENWOOD;
HUTCHISON, 1993). A maior juvenilidade da região basal das plantas se deve
ao fato de que os meristemas mais próximos da base foram formados em uma
fase com maior grau de juvenilidade, dada a proximidade com a fase de
germinação, do que os das regiões terminais, que possuem maior grau de
maturação (Figura 2.3).
 O conhecimento do gradiente de juvenilidade em plantas lenhosas é de
grande importância em um processo de propagação clonal, uma vez que a
origem dos propágulos vegetativos utilizados possui efeito marcante na
produção de mudas e no comportamento da futura planta. Os propágulos
vegetativos de diferentes posições da planta retêm os níveis específicos de
juvenilidade (ou maturidade) quando são retirados da planta e propagados
vegetativamente. Como resultado, a morfologia e a fisiologia das plantas
resultantes dos propágulos oriundos das diferentes partes da planta matriz
podem apresentar diferenças significativas dentro das três categorias de fase:
juvenil, juvenil/adulta e adulta.
O conhecimento da espécie, a definição dos objetivos a serem
alcançados com determinada técnica de propagação vegetativa, a escolha e o
uso correto dos propágulos vegetativos são de extrema importância. Quando
desejado um comportamento mais juvenil da planta a ser propagada, devem-se
utilizar propágulos oriundos das partes mais juvenis (fase juvenil) da planta
matriz. Por outro lado, quando se deseja uma planta com comportamento
maduro, tal como a manifestação do florescimento precoce e porte reduzido,
devem-se preferir propágulos oriundos das partes mais adultas (fase adulta) da
planta matriz.
Na propagação vegetativa das plantas, os conceitos apresentados
anteriormente são de grande importância, em razão dos diferentes tipos de
propagação de plantas e dos objetivos almejados. A compreensão do ciclo de
vida das plantas facilita o entendimento da biologia da propagação e serve
como suporte nas atividades de multiplicação clonal em espécies florestais. O
entendimento da troca da fase juvenil para a adulta permite conduzir com maior
sucesso o processo de clonagem de árvores selecionadas, resultando em
maior eficiência da etapa de seleção, melhoramento e clonagem e,
consequentemente, em uma silvicultura clonal mais eficiente.

Efeitos da Maturação

Na propagação clonal em espécies florestais, as principais

conseqüências da mudança da fase juvenil para adulta de uma planta estão
relacionadas a efeitos no crescimento, efeito topófise e ciclofíse, mudanças nas
características foliares e caulinares, capacidade de enraizamento, competência
reprodutiva, alterações bioquímicas e expressão gênica.
A mudança de fase em espécies florestais é um fenômeno bem mais
complexo, em que está envolvido um número bem maior de alterações do que
as aqui apresentadas, as quais, na sua maioria, ainda não são bem conhecidas
e entendidas.

Hábito e Vigor de Crescimento das Plantas

Entre os principais efeitos da maturação relacionados com o hábito de

crescimento e os efeitos no crescimento em altura e diâmetro das plantas.
O crescimento das brotações das plantas pode variar em função da
maturidade dos propágulos que as originaram. Segundo Greenwoog e
Hutchison (1993), na propagação vegetativa pela enxertia ou estaquia, por
exemplo, as plantas originadas de propágulos juvenis possuem maior
tendência em apresentar hábito de crescimento ortotrópico do que aquelas
plantas originadas de propágulos mais maduros. Dependendo da espécie,
podem-se observar plantas com nítido hábito de crescimento plagiotrópico
quando esta se origina de propágulo vegetativo maduro na propagação clonal.
O crescimento plagiotrópico refere-se à situação em que algumas plantas
propagadas vegetativamente têm crescimento desviado da posição vertical
(ortotropia) e continuam seu crescimento de forma similar a uma ramificação
lateral (crescimento plagiotrópico).
Segundo dados experimentais de Greenwood e Hutchison (1993) e
Parker et al., (1998), árvores originadas por enxertia ou enraizamento de
estacas de propágulos juvenis de Tsugar canadensis e Pinus taeda, tendem a
exibir maior número de brotações por unidade de área, bem como maior
tendência ao crescimento ortotrópico, em comparação com aquelas de
propágulos maduros.
Em Araucaria angustifolia e Coffea arabica, mudas produzidas por
enraizamento de estacas coletadas de brotações laterais continuam tendo
crescimento plagiotrópico, enquanto estacas coletadas de brotações da parte
apical se desenvolvem normalmente (HARTMANN et al., 2002), sendo a
mesma resposta encontrada em Platamus accidentalis (LAND et al., 1995).
Para espécies do gênero Eucalyptus, não foram encontrados estudos
referentes aos efeitos de gradientes de maturidade dos propágulos utilizados
na propagação. Contudo, em viveiro e campo, podem-se observar plantas com
características que lembram o crescimento plagiotrópico (Figura 2.4).
 Na literatura têm sido amplamente abordados os conceitos de topófise e
ciclófise, embora estes ainda não sejam bem compreendidos. Em espécies
florestais, esses efeitos possuem especial importância, tendo em vista as
dificuldades encontradas na propagação vegetativa em várias situações na
produção de mudas. No caso em estudo, topófise refere-se ao efeito na
propagação clonal resultante da diferença de estádio de desenvolvimento
potencial fisiológico do meristema apical, quando comparado com outras áreas
meristemáticas da planta, independente do processo de maturação do
meristema apical (DODD: POWER, 1998). Em outras palavras, o fenômeno de
topófise pode ser entendido como um efeito da origem do propágulo vegetativo
que se manifesta nos processos assexuados de reprodução, por meio do
menor ou maior desempenho na propagação vegetativa. A ciclófise refere-se
ao efeito na propagação clonal decorrente do processo de maturação do
meristema apical. É o estádio em que se encontram as regiões meristemáticas
da planta no momento da seleção do propágulo vegetativo (DODD; POWER,
1998). Pode-se dizer que o efeito topófise relaciona-se com a idade fisiológica,
e o efeito ciclófise, com a idade ontogenética.
Os termos topófise e ciclófise podem se confundir quando analisados
quanto à morfologia dos propágulos vegetativos envolvidos no processo de
propagação clonal. Nesse processo, a minimização desses efeitos está na
utilização de propágulos vegetativos fisiologicamente mais novos e em idade
ontogenética mais juvenil quanto possível. Exceções são apresentadas em
algumas coníferas florestais, com Araucaria angustifolia, na qual pode ser
observado que os propágulos vegetativos provenientes das brotações apicais
(ortotrópicas) originam plantas com crescimento tipicamente na vertical,
enquanto propágulos provenientes das brotações laterais (plagiotrópicas)
resultam em plantas com crescimento na horizontal, independentemente da
idade dos propágulos vegetativos.

Crescimento em Altura e Diâmetro das Plantas

Informações científicas contemplando a influência do grau de maturação

do propágulo vegetativo no crescimento em altura e diâmetro das plantas
propagadas vegetativamente são pouco conhecidas e compreendidas. No
entanto, segundo Greenwood e Hutchison (1993), a capacidade de
crescimento em altura e diâmetro de uma planta pode ser afetada pelo uso de
propágulos vegetativos provenientes de árvores de diferentes idades. Segundo
esses autores, pesquisas demonstram redução na capacidade de crescimento
em altura e diâmetro, com envelhecimento ontogenético, na propagação clonal
por enxertia e, ou, por estaquia a partir de propágulos com diferentes idades.
Elas salientam ainda, que isso pode ser decorrente do acréscimo da
capacidade de enraizamento com o aumento da maturação, em que menores
crescimentos em altura e diâmetro podem ser decorrentes de um menor vigor
do sistema radicial em propágulos mais maduros utilizados em um processo de
propagação clonal. Propágulos vegetativos mais juvenis não somente
produzem maior crescimento do caule, como também sustentam maior
produção de folhas e biomassa (GREENWOOD, 1992).
O estágio juvenil possibilita o maior crescimento vegetativo da planta e a
produção de grande área foliar, como também a produção de fotoassimilados a
serem, posteriormente, utilizados no desenvolvimento dos frutos e do sistema
radicular, facilitando a absorção de água e íons do solo (BOLIANI, 1986).
Alguns autores têm sustentado que o reduzido crescimento em diâmetro
e altura em árvores mais velhas se deve ao aumento da complexidade e
tamanho da árvore, isto é, à idade e não à maturação (HACKETT, 1987;
ZIMMERMANN et al., 1985, citados por GREENWOOD; HUTCHISON, 1993).
Contudo, de acordo com esses autores, o fato de enxertos de mesmo tamanho
inicial, de árvores com idades diferentes, apresentarem taxas de crescimento
diferenciadas indica que o decréscimo do potencial de crescimento é também
relacionado às características de maturação. A mesma conclusão pode ser
extraída de pesquisa realizada por Parker et al., (1998), que, avaliando mudas
originárias de enxertia em plantas de Pinus elliotti, após seis anos no campo,
observaram crescimentos em altura e diâmetro significativamente superiores
em mudas resultantes de enxertos com idade de 6 a 9 anos (juvenis), em
comparação com aquelas de enxertos com idades acima de 40 anos. Enfim,
as informações científicas indicam que menor vigor pode ser decorrente do
envelhecimento, da maturação ou de ambos.
 Anatomia Foliar e Caulinar

Durante o desenvolvimento ontogenético, a planta apresenta uma série

de alterações morfológicas relacionadas com partes foliares e caulinares, como
mudanças de forma, dimensão, pigmentação (clorofila e antocianina), atividade
fotossintética, entre outras. Segundo vários autores (BOLIANI, 1986;
HACKETT, 1987; FOUDA, 1996; HARTMANN et al., 2002), essas mudanças
decorrem da troca da fase juvenil para a adulta, afetando sensivelmente a
propagação vegetativamente das plantas. Em Eucalyptus, por exemplo, na fase
juvenil as folhas são largas, extensas e sem pecíolo, enquanto na fase adulta
são alongadas e apresentam um pecíolo distinto (Figura 2.5 A). Diferenças
similares podem ser observadas em algumas espécies do gênero Pinus (Figura
2.5 B).

Em algumas situações, tem sido relatada a maior resistência foliar a

doenças com o envelhecimento ontogenético; segundo Greenwood e
Hutchison (1993), especula-se que seja devido à maior resistência e
penetração do fungo. Conforme Fouda (1996), folhas de Ramos juvenis
apresentam forma mais cônica, epiderme recoberta por uma fina camada de
cutícula com alta densidade estomatal e mesofilo espesso com ductos de
resina menores e em menor concentração do que em folhas adultas, ramos
juvenis apresentam córtex, floema, zona cambial, medula e raios do xilema e
floema mais espessos do que adultos.
Em Tectona grandis, o número de elementos de vaso e comprimento e a
largura dos elementos de vaso e de fibra forem menores em estacas caulinares
oriundas de plantas juvenis, com dois meses de idade (HUSEN; PAL, 2006).
Esses valores cresceram com o aumento da idade da planta matriz, sendo
maiores naquelas de 30 anos. Segundo os autores, as referidas características
anatômicas podem ser usadas como marcadores confiáveis do grau de
maturação na espécie estudada e, talvez, em outras espécies.

Capacidade de Enraizamento Adventício

Uma das mais consistentes expressões da maturação em plantas

lenhosas refere-se ao potencial da regeneração; em que a redução da
capacidade do enraizamento de propágulos vegetativos, com o envelhecimento
ontogenético, tem sido considerada um dos principais efeitos na propagação
clonal.
Vários estudos indicam que o potencial de enraizamento de propágulos
vegetativos, obtidos em diferentes alturas da planta matriz, varia com o
gradiente de maturação. Assim, propágulos coletados do ápice e dos ramos
laterais das plantas geralmente apresentam menor potencial de enraizamento
do que aqueles coletados das regiões mais próximas à base da árvore, embora
ocorram grandes variações em se tratando de espécies.
Para a maioria das espécies lenhosas, estacas de mudas juvenis
enraízam facilmente, enquanto outras provenientes de plantas mais velhas o
fazem com maior dificuldade, ou definitivamente não enraízam. Vale salientar
que a juvenilidade muitas vezes se perde antes mesmo de a planta alcançar a
maturação reprodutiva.
Estudos em plantas de Tsugar heterophylla têm indicado que o potencial
de enraizamento de propágulos coletados de diferentes alturas da árvore
matriz traz evidências da existência de um gradiente de maturação, com o grau
de maturação aumentando à medida que se aproxima do ápice da planta
(GREENWOOD; HUTCHISON, 1993).
O gradiente de maturação e seus efeitos no enraizamento podem variar
entre as diferentes espécies. Para Eucalyptus grandis, por exemplo, trabalhos
têm mostrado que estacas cotiledonares têm alto potencial de enraizamento,
enquanto estacas coletadas acima do 15° nó apresentam baixo enraizamento
ou não enraízam (HACKETT, 1987). Para Eucalyptus viminalis e Eucalyptus
pauciflora. Hackett (1987) relata que o alto potencial de enraizamento é perdido
completamente após o quarto nó. Em Eucalyptus camadulensis, esse mesmo
autor relata enraizamento de 40-50% em estacas do centésimo nó e, em
Eucalyptus deglupta, 100% de enraizamento em estacas coletadas acima do
centésimo nó.
Há varias décadas tem sido estudado o efeito da idade sobre o
enraizamento de estacas de Hevea brasiliensis (seringueira). Grego___ (1951)
afirma que, além da diminuição dos índices de enraizamento com o aumento
da idade da planta fornecedora de propágulos, o tempo de enraizamento
também é bastante influenciado. Segundo esse autor, nessa época, dados
experimentais com matrizes de Hevea brasiliensis, indicaram que estacas
obtidas com plantas de um mês de idade apresentaram 95% de enraizamento
aos 28 dias, sendo observada redução gradual do percentual de enraizamento
e aumento do tempo de resposta ao enraizamento à medida que as estacas
foram obtidas de matrizes mais velhas. Estas resultaram em apenas 7,5% de
enraizamento aos ____dias em plantas com 13 meses de idade e nenhuma
resposta a partis dos 24 meses de idade nas condições experimentais
adotadas. Também Stahel (1947) afirma que a propagação de Hevea
brasiliensis por estacas é bem sucedida somente quando estacas são
coletadas de plantas muito novas ou de partes basais do caule de plantas mais
velhas.
Para Ilex paraguariensis (erva-mate), Sand (1989) obteve enraizamento
de 91,7% e 39,4% em estacas caulinares e foliares respectivamente,
provenientes de plantas matrizes de um ano de idade e de apenas 6,8% e
2,6% para aquelas oriundas de plantas de 60 anos. Esses resultados indicam
que o fator de juvenilidade se perde após ____ anos de idade, sem, no entanto,
ter ainda alcançado a maturação reprodutiva, a qual se iniciaria após o quinto
ano de vida.
Além do aumento dos percentuais de enraizamento em propágulos mais
juvenis, a melhor qualidade e a maior rapidez de formação do sistema radicial
também têm sido citadas (GOMES, 1987), denotado pelo aumento no vigor
radicial (número e comprimento de raízes), relatado por Schneck (1996). Sand
(1989) avaliou o comprimento médio das maiores raízes de estacas oriundas
de plantas de erva-mate com ____ meses, 18 meses e 60 anos de idade, em
comparação com estacas oriundas de rebrotes de plantas de 60 anos, e obteve
11,5; 10,6; 8,4;___ 5,8cm, respectivamente, para os quatro tratamentos,
ressaltando a importância do fator juvenilidade dos propágulos no vigor do
sistema radicial.
De maneira geral, pode-se admitir que, quanto mais juvenil for o
propágulo vegetativo a ser propagado, maior é a chance de sucesso de
enraizamento, quer em termos de percentual, rapidez de formação e qualidade
das raízes, quer pela capacidade de crescimento da nova planta.

Competência Reprodutiva

A competência reprodutiva, definida como a capacidade das plantas

para formação de estruturas reprodutivas sob condições naturais ou induzidas,
tem sido utilizada tradicionalmente como critério para caracterizar a fase adulta
da planta, ou seja, a mudança da fase juvenil para adulta (HACKETT;
MURRAY, 1993; HARTMANN et al., 2002). Na maioria dos casos, a produção
regular de flores é o único critério prático para identificação do final da fase
juvenil de uma planta (HACKETT, 1987).
Entretanto, recentemente esse critério de troca de fase tem sido
bastante questionado, uma vez que a inaptidão de plantas jovens em florescer
não necessariamente indica incompetência reprodutiva, visto que a
manipulação das condições ambientais e, ou, tratamentos hormonais podem
induzir a floração repetidamente nessas plantas (GREENWOOD; HUTCHISON,
1993). Na grande maioria dos casos, porém, a competência reprodutiva se
manifesta quando a planta apresenta tamanho mínimo e entra no estado
maduro.
 Na maioria das coníferas, características como a relação estróbilos
masculinos e femininos produzidos têm sido usadas como melhor indicador do
estado de maturação, quando comparado à competência reprodutiva. De modo
geral, quanto maior a idade destas plantas, maior a produção de estróbilos
masculinos em relação aos femininos (GREENWOOD, HUTCHISON, 1993).

Alterações Bioquímicas

Uma serie de estudos têm sido conduzidos em espécies lenhosas

visando a identificação de marcadores bioquímicos de juvenilidade dos
propágulos. Em Castanea sativa, Vasquez e Gesto (1982) encontraram
maiores teores endógenos de substâncias promotoras de enraizamento em
propágulos juvenis. Garcia et al. (2000) avaliaram possíveis diferenças na
composição proteica de vários órgãos juvenis e adultos de plantas de oliveira
(Olea europeae) e concluíram que a composição proteica de órgãos adultos e
juvenis de uma mesma planta ou de plantas diferentes foi qualitativamente
similar; contudo, pelo menos um grupo de polipeptídeos de 29 KDa foi mais
fortemente expresso em tecidos adultos. Relações similares também foram
obtidas em vários cultivares de diferentes origens genéticas.
Níveis endógenos de reguladores de crescimento têm sido medidos em
tecidos juvenis e maduros de várias espécies por diferentes autores. Segundo
extensa revisão feita por Hackett (1987), há diferenças nos conteúdos
endógenos de auxinas e outros promotores entre tecidos juvenis e adultos; os
maiores teores foram encontrados em propágulos juvenis, em relação aos
maduros. Estudos realizados por Mullins (1995), Fouret et al. (1986) e
Moncalén et al. (2001) resultaram na conclusão de que propágulos maduros
apresentaram maior conteúdo de ABA, quando comparado aos juvenis.
Resultados similares foram encontrados para cultivares de macieira. Moncalén
et al. (2001) e Andrés et al. (2002), concluíram que a relação citocinina/IAA
decresce com o decorrer da maturação de propágulos. Day et al. (1995)
constataram que folhas juvenis continham mais citocininas ativas do que folhas
adolescentes ou adultas. Geneve (1985, citado por HACKETT, 1987) encontrou
diferenças significativas no conteúdo de etileno em tecidos maduros e juvenis,
porém elas não afetaram o percentual de enraizamento.
 Em estudo com Pinus radiata, Fraga et al. (2002) concluíram que
indivíduos juvenis foram caracterizados por menor grau de metilação de DNA e
alta relação de poliaminas livres e poliaminas solúveis conjugadas com ácido
perclórico, enquanto árvores adultas mostraram maior grau de metilação no
DNA e baixa relação de poliaminas livres e poliaminas solúveis conjugadas
com ácido perclórico. Com base nesses resultados, os autores propuseram que
ambos os indicadores estariam relacionados com a perda da habilidade
morfogênica com o avanço da maturação e, consequentemente, com a não-
aptidão de estabelecimento in vitro de propágulos adultos de Pinus radiata.

Além das variações entre tecidos juvenis e adultos citadas

anteriormente, outra têm sido relatadas, como a concentração de proteínas
solúveis em tecidos, a concentração de proteínas solúveis em tecidos, a
concentração de DNA em folhas (ALI; WESTWOOD, 1996), o teor de
poliaminas (REY et al., 1994) e o conteúdo de clorofila (HUANG et al., 2003) e
de antocianina nas folhas (GREENWOOD, 1992; HACKETT; MURRAY, 1993).

Expressão Gênica

A expressão gênica também é influenciada pelos efeitos da maturação

dos tecidos vegetais, pois ativação ou suspensão gênica transcricional ocorre
de forma diferenciada ao longo do desenvolvimento das plantas. Pesquisas
têm reportado o efeito da idade ontogênica dos propágulos na expressão
gênica, principalmente dos genes relacionados à fotossíntese. Hutchison et al.
(1990) mostraram que a família do gene CAB é mais fortemente expressa em
propágulos juvenis de plantas de Larix sp. crescendo sob condições de luz, em
relação a propágulos adultos. Esses autores não encontraram diferenças na
expressão dos genes rbc S com a idade. Woo et al. (1994) demonstraram que
os pecíolos juvenis e adultos de Hedera helix crescidos in vitro responderam
diferentemente à expressão de HW 101 e HW 103 mRNA. Na sequência, Kuo
et al. (1995) descreveram um sistema de fosforilação em Sequoia no qual uma
proteína de 32 kDa pode ser fosforilada somente em tecidos adultos, enquanto
naqueles juvenis uma proteína de 31 kDa foi fosforilada.
 De modo geral, existem poucas informações disponíveis quanto ao
relacionamento entre a expressão gênica e a mudança de fase (maturação) em
plantas lenhosas. Os modelos que buscam explicar a regulação da expressão
gênica na maturação são mais especulativos do que preditivos.

Rejuvenescimento e Revigoramento

Na silvicultura clonal, a seleção dos clones ocorre normalmente na fase

adulta da árvore devido à maior confiança no processo seletivo, uma vez que a
árvore expressa o seu máximo potencial silvicultural, tecnológico, adaptação a
sítios específicos, entre outras, na idade de rotação desejada, para
determinada finalidade.

Em geral, a eficiência no processo seletivo dos clones é inversamente

relacionada com a facilidade de propagação vegetativa. Dessa forma, para
obtenção de sucesso na multiplicação de plantas adultas, é necessário explorar
a maior capacidade de propagação de material juvenil, seja pela utilização de
propágulos provenientes de partes juvenis da planta, seja pela promoção de
rejuvenescimento de partes da planta adulta.

Rejuvenescimento pode ser considerado uma forma de reverter a planta

do estádio adulto para o juvenil, recuperando a competência da totipotência.
Em geral, algumas características relacionadas à maturação mostram-se mais
fáceis de serem revertidas do que outras, e os respectivos tratamentos para
promoção do rejuvenescimento influenciam de forma diferenciada, sugerindo
que o rejuvenescimento ocorre em termos relativos e não absolutos
(HACKETT; MURRAY, 1993). De modo geral, pode-se dizer que a maturação é
estável, mas reversível ou manipulável em certas condições, e que o
rejuvenescimento pode ocorrer de forma total, parcial ou progressiva.

Uma série de métodos para reverter ou manter a juvenilidade das

plantas têm sido descritos: aplicação de ácido giberélico; propagação
vegetativa seriada; poda drástica ou poda de gemas apicais; neodiferenciação
de gemas; apomixia; meiose para células; indução de ramos adventícios em
porções de raízes; utilização do crescimento juvenil originado dos esferoblastos
(crescimento em forma de “verrugas” que às vezes são encontradas no caule),
entre outros. Hackett (1987) cita a propagação sexuada natural como o método
mais eficiente em promover o rejuvenescimento de partes adultas de uma
planta, uma vez que origina a parte mais juvenil da planta (embrião) a partir da
parte mais madura (órgão frutífero).

Entretanto, os métodos de rejuvenescimento mais utilizados na área

florestal relacionam-se à propagação vegetativa seriada pela enxertia, pela
estaquia e pela micropropagação, sendo os demais menos estudados e
relatados, resultando em menor conhecimento dos seus efeitos sobre o
rejuvenescimento ou maturação da juvenilidade.

Com a relação ao revigoramento, essa metodologia consiste em adotar

práticas culturais que propiciam maior vigor fisiológico à planta, de forma que
origine propágulos vegetativos com melhor desempenho na propagação clonal.
Assim, a adoção de manejo nutricional e hídrico busca uma melhoria na
condição fisiológica da planta, assim como o uso da poda drástica visa a
indução de brotações dormentes em regiões mais juvenis, constituindo um
método de revigoramento eficiente em um processo de propagação clonal.

Rejuvenescimento por Enxertia Seriada

Neste processo, propágulos maduros são enxertados em partes juvenis

de um porta-enxerto e, a partir de sua brotação, são coletados novos
propágulos, os quais são novamente enxertados em um novo porta-enxerto
juvenil, e assim seriadamente, até obter os resultados desejados (Figura 2.6).
Dessa forma, o rejuvenescimento pela enxertia seriada consiste em enxertar
em série propágulos vegetativos do clone desejado.

A enxertia seriada é um método de rejuvenescimento que demanda

muito tempo (ELDRIDGE et al., 1994), podendo ainda apresentar problemas de
incompatibilidade (KIM et al., 1993) em algumas espécies florestais. Para
Eucalyptus e Pinus este método de rejuvenescimento tem sido aplicado em
algumas circunstâncias nos programas de silvicultura clonal.

O grau de rejuvenescimento obtido depende do número de reenxertias

do enxerto no porta-enxerto juvenil, bem como da espécie/clone envolvida
(HUANG et al., 1990). Resultados experimentais têm mostrado que duas (KIM
et al., 1993), quatro (KAO; HUANG, 1993; ASSIS, 1996) ou quatro a seis
(ELDRIDGE et al., 1994) reenxertias são suficientes para rejuvenescer o
material até o ponto de ele enraizar facilmente, tendo-se suas variações em
termos de espécie/clone.

A técnica de rejuvenescimento por enxertia seriada foi empregada com

sucesso na obtenção de material juvenil satisfatório para o enraizamento de
estacas de matrizes selecionadas de Pinus oocarpa e Pinus caribaea var.
hondurensis, após a terceira enxertia seriada (MURAYAMA; FERRARI, 1988).
Em experimentos de enxertia seriada com Eucalyptus trabutii, Siniscalco e
Pavolettoni (1988) concluíram que propágulos adultos foram revertidos a
condições juvenis de forma gradual, conforme os sucessivos ciclos de enxertia.
Nas seis reenxertias feitas, os resultados de sobrevivência dos enxertos
encontrados foram: 52%, 69%, 78%, 71%, 57% e 76%, respectivamente, da
primeira até a sexta reenxertia.
 Para seringueira (Hevea brasiliensis), Muzik e Cruzado (1958), testando
o enraizamento de propágulos oriundos de plantas com uma e cinco enxertias
seriadas (matrizes de 8 a 10 anos de idade), obtiveram em torno de 30% de
enraizamento em oito semanas com estacas coletadas de plantas com a quarta
e quinta reenxertias. Segundo esses autores, estacas coletadas do clone
original e da primeira, segunda e terceira enxertias não obtiveram nenhuma
resposta para enraizamento.
O fato de enxertar propágulos adultos de uma planta em porta-enxertos
juvenis promover o rejuvenescimento evidencia a translocação de substâncias
da parte juvenil (porta-enxerto) para a parte adulta (enxerto), induzindo um
estádio mais juvenil nesta última. No entanto, Hackett (1987) salienta que o
potencial de enraizamento (que atualmente ainda é a maior expressão de
maturidade ou juvenilidade) de tecidos juvenis e adultos é uma característica
das células do sítio de iniciação radicial, não sendo, portanto, relacionado à
translocação de promotores ou inibidores.
Alternativamente, o rejuvenescimento pela enxertia seriada feita in vitro,
denominada de enxertia in vitro ou microenxertia, pode ser obtido com maior
rapidez e eficiência em comparação à enxertia convencional, uma vez que
propágulos de menor dimensão e mais juvenis são utilizados. A microenxertia
ou enxertia in vitro consiste em enxertar, sob condições assépticas, um
meristema ou ápice caulinar sobre um porta-enxerto estabelecido in vitro.
Aplicações de enxertia in vitro, visando o rejuvenescimento de algumas
espécies de plantas, são descritas por diversos autores. Pliego-Alfaro e
Murashige (1987) e Zaczek e Steiner (1997), por exemplo, obtiveram
resultados satisfatórios mediante o uso de enxertia in vitro com explantes
coletados de plantas adultas, mostrando a restauração da competência ao
enraizamento para Persea americana e Quercus rubra. Huang et al. (1996)
afirmaram que sucessivas enxertias in vitro, em curtos intervalos de tempo, a
partir de ápices meristemáticos extraídos de tecidos adultos de Sequoia
sempervirens, restauraram características juvenis mais rapidamente, podendo
essa técnica ser aplicada com o propósito de rejuvenescimento. Kretzschmar e
Ewald (1994) e Ewald e Kretzschmar (1996) também confirmaram a influência
do rejuvenescimento por meio da enxertia in vitro em explantes oriundos de
árvores adultas de Larix na propagação clonal desta espécie. Em Eucalyptus,
Bandeira (2004) concluiu que a enxertia in vitro apresenta potencial de
aplicação no rejuvenescimento de clones adultos de interesse comercial.

Rejuvenescimento por Estaquia Seriada

Neste processo, propágulos maduros (estacas) são enraizados e, a

partir de sua brotação, são coletados novos propágulos (estacas), os quais são
novamente enraizados, e assim seriadamente, até obter os resultados
desejados. Dessa forma, o rejuvenescimento pela estaquia seriada consiste em
enraizar em série propágulos adultos do clone desejado.
O efeito da confecção de estacas a partir de brotações daquelas
enraizadas, em relação ao rejuvenescimento em Eucalyptus spp., resultando
em efeito positivo sobre o enraizamento, foi citado por Eldridge et al., (1994).
Segundo esses autores, resultados satisfatórios no enraizamento de
Eucalyptus, decorrentes do efeito do rejuvenescimento, podem ser obtidos
após duas ou mais gerações de estaquia seriada.
De acordo com Wendling (2002), em avaliação de miniestaquia seriada
em quatro clones de Eucalyptus grandis, após sete subcultivos, essa técnica
mostrou-se mais eficiente no rejuvenescimento de clones com menor grau de
juvenilidade, para as características de enraizamento, sobrevivência e vigor
radicial e aéreo. O reaparecimento de características morfológicas juvenis e a
melhoria no enraizamento de estacas pelo uso da estaquia seriada também
foram mencionados por Bonga e Aderkas (1993).
Entretanto, apesar dessas citações de uso da estaquia seriada visando o
rejuvenescimento em espécies florestais, ainda existem poucos relatos com
base científica, embora a técnica seja considerada potencial para esse
propósito.

Rejuvenescimento por Micropropagação

O rejuvenescimento por micropropagação consiste em estabelecer em

cultura in vitro explantes do clone desejado e subcultivar sucessivamente em
meio de cultura adequado com reguladores de crescimento, o que resulta em
plantas com características mais juvenis.

Em muitos casos, os resultados obtidos pelo uso da micropropagação

visando obter efeitos de rejuvenescimento são comparáveis aos da enxertia e
estaquia seriada. Nessas condições, rejuvenescimento parcial tem sido obtido
pelos sucessivos subcultivos de meristemas apicais de brotos
micropropagados, proporcionando melhoria no enraizamento de gemas
alongadas in vitro. Segundo Bonga e Aderkas (1993), após cinco ou seis
subcultivos in vitro, clones adultos de Eucalyptus são considerados
suficientemente rejuvenescidos ou com reatividade capaz de permitir uma
subsequente propagação por estaquia. Entretanto, vale salientar que as
dificuldades inerentes ao processo de micropropagação, bem como a própria
resposta das espécies à cultura in vitro, proporcionam respostas diferenciadas,
em, que somente após alguns subcultivos pode-se avaliar a resposta do
rejuvenescimento.

Segundo Franclet et al. (1987), a técnica da micropropagação é eficiente

no rejuvenescimento de propágulos maduros, embora muitas espécies
arbóreas maduras não possam ser micropropagadas em escala comercial,
provavelmente em razão da falta de otimização das condições de cultura in
vitro e do número insuficiente de subcultivos adotados. Em experimento
conduzido com explantes de Sequoias sempervirens coletados de árvores com
50 e 500 anos de idade, esses autores chegaram à conclusão de que o
principal fator de rejuvenescimento pela micropropagação foi o tempo de
exposição dos explantes à citocinina BAP (benzilaminopurina). Assim, menores
períodos entre um subcultivo e outro aumentaram o rejuvenescimento,
principalmente dos propágulos das árvores de 500 anos.

Uma aplicação direta do rejuvenescimento pela micropropagação

seriada na área florestal é a propagação clonal pela microestaquia, a qual é
baseada no máximo de aproveitamento da juvenilidade dos tecidos vegetais,
cujo desenvolvimento e aplicação em Eucalyptus tiveram como origem os
trabalhos realizados por Assis et al. (1992). Na propagação clonal de alguns
clones de Eucalyptus pela microestaquia no Brasil, onde o objetivo principal é a
melhoria do desempenho de enraizamento das microestacas, resultados
satisfatórios têm sido obtidos após 10 a 12 subcultivos pela micropropagação;
os efeitos de rejuvenescimento alcançados são atribuídos principalmente aos
subcultivos intensivos e à utilização da citocinina BAP (benzilaminopurina) aos
meios de cultura.

Titon (2001), avaliando a sobrevivência na saída da casa de vegetação,

o enraizamento na saída da casa de sombra e a sobrevivência das mudas aos
50 dias, observou, em clones de Eucalyptus grandis, resultados superiores na
microestaquia em relação à miniestaquia. Essa diferença foi mais pronunciada
em clones com maior dificuldade de enraizamento, indicando, nesses casos,
possível efeito de rejuvenescimento dos clones com o uso da microestaquia.
Para o mesmo experimento, as mudas oriundas da microestaquia
apresentaram altura e diâmetro de colo aos 50 dias e peso de matéria seca de
raiz aos 28 dias iguais ou superiores aos da miniestaquia, reforçando a
suposição de maior grau de juvenilidade das microestacas.

Também resultados de pesquisa obtidos por Xavier et al. (2001)

apontaram a eficiência do rejuvenescimento de dois clones híbridos de
Eucalyptus grandis pela micropropagação, a qual foi constatada pela
superioridade dos resultados obtidos na microestaquia sobre a miniestaquia,
em relação ao percentual e à velocidade de enraizamento. No entanto, tem
sido constatado que, após algum período de coleta de microestacas nas
microcepas, estas têm perdido gradativamente o grau de juvenilidade obtido
pelo rejuvenescimento quanto ao enraizamento, indicando que o
rejuvenescimento obtido pela micropropagação não é permanente. Da mesma
forma, o uso de mudas de microestacas não reproduz os mesmos efeitos de
juvenilidade das mudas de micropropagação.

Apesar das dificuldades encontradas para propagação clonal pela

micropropagação de clones de Eucalyptus, esta tem sido considerada a
principal técnica potencial para incrementar o enraizamento de gemas
alongadas in vitro, principalmente devido aos recentes avanços com plantas
transgênicas, embriogênese somática e tecnologia de sementes sintéticas
usadas para restaurar a condição juvenil de plantas fisiologicamente maduras.
 De modo geral, a micropropagação tem sido considerada uma técnica
com grande potencial no rejuvenescimento de espécies florestais. Contudo,
essa técnica ainda carece de desenvolvimento cientifico para sua plena
utilização, além de ser onerosa e exigir mão-de-obra especializada.

Revigoramento Vegetativo

De modo geral, pode-se caracterizar o revigoramento como certas

práticas culturais que objetivam propiciar maior vigor fisiológico em brotações
da planta, de forma que proporcione propágulos vegetativos vigorosos e
responsivos à propagação clonal.

Existem inúmeras formas de se obter o revigoramento vegetativo, e uma

das principais, na silvicultura clonal, é pelas podas drásticas ou corte raso.
Nesse processo, propágulos juvenis são obtidos pelo abate de árvores adultas
selecionadas, buscando induzir o crescimento de gemas dormentes existentes
na base da cepa. Esse procedimento de obtenção de propágulos vegetativos
está baseado no fato de que as características juvenis são mantidas naquela
porção de crescimento da árvore. Assim, com base no gradiente de
juvenilidade em árvores, brotações juvenis surgem a partir de gemas
dormentes presentes na porção de cepa remanescente, após serem dadas as
condições para crescimento em função da retirada do efeito de dominância
apical exercido pela parte aérea decepada pelo abate da árvore. Esse sistema
tem sido usado com sucesso na produção de estacas mais juvenis de
Eucalyptus, em que, após a decepa da árvore, as brotações obtidas são
utilizadas como a base para propagação clonal comercial desta espécie.
Outras formas de obtenção de brotações juvenis, fundamentadas nesses
princípios citados, como o anelamento e o uso do fogo na base da planta
matriz, também são citadas (ALFENAS et al., 2004).

O revigoramento por tratos silviculturais também têm sido adotado com

eficiência no processo de propagação clonal. E entre estes, citam-se
adubações, irrigações e manejo direcionado para obtenção de maior número
possível de brotações vigorosas.
 Outra forma de revigoramento em plantas são as podas sucessivas, as
quais visam aumentar a produção de propágulos vigorosos e manter a
juvenilidade destes. Esse procedimento é o que vem sendo adotado em jardins
clonais, nos seus diferentes sistemas de manejo das cepas, em que estas são
mantidas baixas, buscando manter produção de brotações juvenis aptas à
formação de propágulos com bom potencial de enraizamento.

O melhor conhecimento das exigências nutricionais, hídricas e de

manejo dos clones componentes de programas de silvicultura clonal também
leva à formação de brotações mais vigorosas e aptas para o processo de
propagação vegetativa. Em Eucalyptus, isso comprova pelo fato de que clones
com maior tempo no programa de clonagem respondem melhor ao
enraizamento e à formação das mudas, visto seu melhor conhecimento e
ajuste mais refinado de suas exigências.

Em algumas situações, ocorre certa confusão entre revigoramento e

rejuvenescimento: revigoramento refere-se ao vigor fisiológico proporcionado
pela prática adotada, enquanto o rejuvenescimento obtido pelas diferentes
técnicas citadas anteriormente busca a obtenção de uma reversão da
maturação para uma condição mais juvenil.

Seleção e Manutenção da Juvenilidade

A retenção da fase juvenil nas plantas é de grande importância em um

processo de propagação clonal que visa obter sucesso no enraizamento de
propágulos vegetativos, visto os efeitos apresentados anteriormente.

No processo de propagação clonal, a coleta de propágulos vegetativos

provenientes das partes da planta que apresentam características juvenis
constitui-se em pré-requisito para o sucesso da propagação. Entretanto, na
silvicultura clonal, a maioria dos clones é selecionada na fase adulta e não
mais apresenta brotações com as características juvenis, limitando esse
procedimento. Como alternativa, técnicas que visam a indução de brotações
nas partes que retêm essas características juvenis constituem-se no primeiro
passo para a obtenção de propágulos vegetativos adequados ao processo de
propagação clonal. Para muitas espécies florestais, esse procedimento pode
ser obtido pelo abate da árvore adulta selecionada, e, a partir das brotações
emitidas na base da cepa, coletam-se os propágulos vegetativos para obtenção
das mudas. Contudo, na maioria das coníferas esse procedimento não se
aplica, visto a dificuldade e, ou, incapacidade de indução de brotações na cepa
da árvore após abate.

Outro procedimento que objetiva a retenção das características juvenis

são as podas severas regulares da planta ainda na fase juvenil, de modo que
não permita que esta alcance sua fase de maturidade.

Estabilidade Genética e Longevidade dos Clones

Em um programa de silvicultura clonal intensiva, a constituição genética

dos clones selecionados deve ser mantida inalterada, visto a seleção ter
ocorrido naquela condição. Dessa forma, a estabilidade genética dos clones
constitui-se em pré-requisito indispensável em um processo de propagação
clonal em diversos ciclos.

Relatos indicam a existência de espécies que são propagadas

vegetativamente por muitos anos, presumindo-se que não tenham ocorrido
alterações genéticas durante esse período. Libby e Ahuja (1993) comentam
que clones de alguns híbridos de Populus spp. e de Cryptomeria japonica vêm
sendo propagados vegetativamente por mais de 100 anos, em larga escala,
sem mostrar sinais de desestabilização genética, embora haja mudanças no
vigor e na resistência a pragas e doenças.

Para Libby e Ahuja (1993), se a senescência é meramente ou

principalmente o acúmulo de patógenos, hoje em dia existem técnicas
disponíveis de limpeza clonal, sem se recorrer à meiose. Por outro lado, se a
senescência é realmente o ponto final de um processo de desenvolvimento
programado, há técnicas para reversão.
 De modo geral, entre as técnicas de propagação clonal utilizadas
atualmente na área florestal, a estaquia e a enxertia não apresentam
alterações genéticas consideráveis ao longo da propagação clonal; contudo, a
micropropagação apresenta maior possibilidade de ocorrência da variação
somaclonal (BONGA; ADERKAS, 1993; HARTMANN et al., 2002), a qual
constitui uma variação espontânea entre plantas regeneradas em propagação
in vitro sendo transmitida sexuadamente.

Efeito “C” (Efeito da “Clonagem”)

O “efeito C” ou “efeito da clonagem”, amplamente conhecido no setor

florestal, refere-se aos efeitos não-genéticos decorrentes das interações de
ações no processo de produção de mudas, interações com o meio ambiente,
interação nutricional e fisiológica (efeito ciclófise e topófise), o qual modifica a
resposta esperada na clonagem, ou seja, crescimento por igual das plantas
originárias de um mesmo clone.

Segundo Scarassati (1993), o efeito “C” que causa essa alteração nos
clones não pode e não deve ser visto como uma anomalia do desenvolvimento
da planta, e sim como um fator que não pode ser controlado durante o
processo e, ou, que, por falta de conhecimento adequado, não é controlado. De
forma geral, o efeito “C” pode ser agrupado em efeito decorrente das variações
ambientais, das variações do padrão de qualidade das mudas produzidas e dos
aspectos de morfologia e fisiologia dos propágulos vegetativos utilizados na
propagação clonal.

Entre os efeitos ambientais, podem-se citar aqueles relacionados com a

densidade de plantio, competição nutricional, diferenças entre a região de
seleção e a região do plantio do clone (interação clone x ambiente), idade de
avaliação, entre outros. Quanto aos efeitos decorrentes do padrão de qualidade
das mudas, estes são aqueles atribuídos à desuniformidade no processo de
produção destas, levando à heterogeneidade na sua qualidade, gerando assim
padrões de respostas de crescimento desiguais no futuro plantio clonal.

O efeito “C” decorrente dos aspectos de morfologia e fisiologia dos

propágulos vegetativos recai, principalmente, sobre os efeitos ciclófise e
topófise. Com o advento das técnicas de miniestaquia e microestaquia, as
variações em termos morfológicos e fisiológicos entre mudas de um mesmo
clone têm sido reduzidas (diminuição do efeito “C”), em razão de uma menor
variação nos padrões de propágulos utilizados.

Frampton e Foster (1993) afirmaram que o efeito “C” tem merecido a

atenção da comunidade científica e que sua quantificação tem sido realizada
de diversas maneiras, como a instalação de testes clonais para mensurar a sua
magnitude em decorrência do efeito da idade ontogenética.
 Capítulo 3

Propagação Clonal Por enxertia

As técnicas de propagação vegetativa constituem-se, atualmente, em
um dos principais processos de produção de mudas e são à base da
silvicultura clonal, sobretudo pela sua efetividade em capturar os ganhos
genéticos obtidos dos programas de melhoramento.

Historicamente, a propagação clonal de espécies florestais vem sendo

usada; conforme a literatura, em Cryptomeria japonica os japoneses a utilizam
há muitos anos (BONGA; ADERKAS, 1992). Segundo Eldridge. (1994), antes
de 1960, na área florestal, os únicos gêneros de produção de madeira foram
Populus e o Salix em climas temperados e Criptomeria e Cunninghamia em
climas subtropicais. Êxito na propagação vegetativa de outras espécies
florestais, como Picea, Pinus, Sequoiadendron, Eucalyptus, entre outras, foi
obtido nas ultimas décadas, o que incentivou a silvicultura clonal.

A propagação clonal ou propagação vegetativa de plantas somente é

possível devido à capacidade que as células, partem de órgãos ou órgãos têm
de regenerar órgãos ou plantas completas, em razão de sua totipotencia.
Assim, entre as varias técnicas de produção vegetativa em espécies florestais,
destacam-se a enxertia, a estaquia e suas variações e a micropropagaçao.
Particularmente para Eucalyptus, a estaquia e a miniestaquia são as principais
técnicas utilizadas na produção de mudas, visando atender a programas de
silvicultura clonal, ao passo que a enxertia é a forma mais adotada na
clonagem da seringueira.

Enxertia
Enxertia é a arte de unir partes de uma planta em outra que lhe sirva de
suporte e de estabelecimento de comunicação com o sistema radicular, de
forma que as duas partes diferentes passem a constituir apenas uma, embora
em nível genótipo cada uma delas mantenha sua individualidade.
 Conforme mencionado, a enxertia é constituída por duas partes básicas:
o porta-enxerto (Figura 3.1). O termo porta-enxerto, popularmente conhecido
como cavalo, constitui a parte inferior da planta enxertada, a qual desempenha,
principalmente, funções de absorção de água e de fixação da planta enxertada,
podendo este ser de origem seminal ou de propagação vegetativa. O termo
enxerto, popularmente conhecido cavaleiro, refere-se a um propágulo
vegetativo que, ao se unir ao porta enxerto, constitui a parte superior da planta
enxertada, desempenhando funções do caule e copa (condução, fotossíntese,
florescimento, frutificação, etc.).

Figura 3.1 – planta de castanha-mineira (Bombax sp.) propagada por

meio da enxertia.

Por ser uma técnica conhecida há muitas décadas, a enxertia possui

variações diversas nos seus procedimentos operacionais e técnicos,
decorrentes das espécies, da metodologia empregada, da habilidade do
executor, do desenvolvimento de pesquisa, entre outras. Atualmente, existem
mais variados tipos de literatura sobre o assunto, algumas de cunho mais
técnico, outras de forma mais pratica.
 União e Formação do Enxerto
O sucesso da enxertia é fundamentalmente composto por três eventos
básicos: adesão entre as partes (enxerto e porta-enxerto); proliferação de calo
entre as partes; diferenciação vascular, unindo as duas partes enxertadas
(HARTMANN et al., 2002). Dessa forma, após o preparo do porta-enxerto,
estes são unidos, visando manter o contato entre ambos. Após a operação de
enxertia ter sido realizada, a união entre as duas partes inicia-se pela divisão
de células, formando um calo composto de tecido cicatricial (células), com
posterior diferenciação vascular (Figura 3.2).

Figura 3.2 – Figura ilustrativa das fases da união e formação da

propagação pela enxertia.

Fonte HARTMANN et al. (2002)

O calo constitui-se de uma massa de células do parênquima que se

forma no local de contato entre as duas partes da planta enxertada. Este calo é
formado a partir dos tecidos vivos das plantas e é um importante processo de
cicatrização e sucesso da enxertia.

O cambio vascular é o tecido vegetal situado entre o floema e o xilema,

o qual é constituído por células meristemáticas capazes de se dividir e formar
novas células. Para o sucesso da enxertia é essencial que os câmbios do porta
enxerto e do enxerto estejam em contato direto, permitindo a comunicação
vascular entre as partes enxertadas.

Tipos de Porta-enxertos
Os porta-enxertos são basicamente originados da propagação seminal
ou vegetativa, os quais podem influenciar o desenvolvimento e crescimento da
planta enxertada, bem como os objetivos desejados com a técnica.

O porta enxerto de origem seminal, ou seja, proveniente de plantas

produzidas via semente, possui algumas vantagens, como a simplicidade e
economia na sua produção. Por ser de origem seminal, os riscos de transmição
de vírus para o enxerto são reduzidos. o sistema radicular é pivotante,
possibilitando à planta enxertada melhor fixação no solo. As características de
juvenilidade estão mais presentes no porta-enxerto, o que permite maior êxito
da enxertia. Como desvantagem, destaca-se a existência da variabilidade
genética entre os porta enxertos, o que pode levar a uma variabilidade de
respostas no crescimento e desempenho das plantas enxertadas.

Com relação ao porta-enxerto formado por propagação vegetativa,

espera-se maior homogeneidade de resposta da enxertia, visto maior
uniformidade proporcionada pelo clone. Em outras situações, as condições
fisiologias intrínsecas do porta-enxerto podem levar a resultados desejáveis na
planta enxertada, aliado ao fato de se poder selecionar clones com alta aptidão
para enxertia.

Relação entre Enxerto e Porta-

enxerto
A utilização da enxertia pode resultar em plantas com padrões de
crescimento diferente daqueles que ocorriam naturalmente se cada parte
crescesse separadamente. Alguns desses efeitos são de grande importância
na silvicultura, enquanto outros são indesejáveis e devem ser evitados.

Essas alterações, segundo Hartmann et al. (2002), podem resultar em:

características especificas de cada uma das partes do enxerto que não podem
ser encontradas na outra parte, como Por exemplo, resistência a certas
doenças, insetos ou nematóides, ou tolerância a certas adversidades
ambientais ou condições do solo; interações entre enxerto e porta-enxerto, que
alteram o tamanho, crescimento, produtividade, qualidade dos frutos ou outros
atributos silviculturais; e reações de incompatibilidade.

É difícil identificar, na pratica, quais efeitos estão influenciando de forma

dominante em uma determinada interação enxerto e porta-enxerto, em certo
ambiente. Resultados de longo prazo dependem de interações de enxerto e
porta-enxerto, meio ambiente, forma de propagação e manejo da planta.

Incompatibilidade na Enxertia
O termo incompatibilidade pode ser entendido como uma série de falhas
na união resistente do enxerto com o porto-enxerto (Figura 3.3). Garner (1995)
afirma que a indicação mais confiável de incompatibilidade é a quebra do ponto
de união, particularmente quando a combinação sobreviveu durante uma
estação de crescimento e a quebra é total. Segundo esse autor, em algumas
espécies e a combinação de enxerto e porta-enxerto, os sintomas de
incompatibilidade podem ocorrer vários anos após a enxertia, sendo o
momento muito influenciado pelas condições ambientais do local de plantio.
 (Figura 3.3) – Incompatibilidade em planta enxertada de Ilex
paraguariensis: crescimento do enxerto superior ao do porta enxerto.

Segundo Hartmann et al. (2002), os sintomas de incompatibilidade

podem ser: falha no pegamento dos enxertos, morte prematura da planta (de
um a dois anos após a enxertia), crescimento anormal da planta (baixo vigor,
amarelecimento e queda prematura de folhas), crescimento diferenciado entre
enxerto e porta-enxerto. Entretanto, conforme esses autores, a quebra lisa das
plantas no ponto de união do enxerto e porta-enxerto, geralmente de um a dois
anos após a enxertia, e a presença de massas de tecidos parenquimáticos e/ou
tecido de casca na união são os dois sintomas mais confiáveis de
incompatibilidade.

Em hevea brasiliensis, Moraes (2000) afirma que o primeiro sintoma da

incompatibilidade no clone IPA1 foi a ausência de escoamento do látex no
caule, abaixo da união do enxerto, devido à coagulação dele nos lactíferos,
seguida de necrose da casca em enxertos com três a quatro lançamentos
foliares e morte do enxerto após a anelamento completo da casca. De acordo
com Moraes et al. (2001), a extrema sensibilidade desse clone às substancias
cianogênicas reforça a hipótese de a incompatibilidade apresentada com
clones de copa de outras espécies de Hevea pode ser decorrente da
translocação de glicosídios cianogênicos da copa para o caule do IPA1, com
liberação de HCN, atingindo níveis tóxicos.

As causas da incompatibilidade não são bem esclarecidas (GARNER,

1995). Para esse autor, a sugestão é de que substâncias essenciais de
natureza enzimática ou hormonal sintetizadas pela parte superior do enxerto
seriam alteradas com a sua passagem pela união do enxerto com o porta-
enxerto, levando à morte deste. Segundo Hartmann et al. (2002), em alguns
casos, acredita-se que essa incompatibilidade possa ser resultante da falta de
um elemento mineral essencial ou substancia de crescimento, o que às vezes
pode ser resolvido mantendo-se algumas folhas no porta enxerto. Estes
autores afirmam que a teoria de que vírus sejam responsáveis por certas
incompatibilidades também tem sido aceita.

Tipos de enxertia
Por se tratar de uma técnica de propagação vegetativa antiga, inúmeras
metodologias foram desenvolvidas e aprimoradas no decorrer dos anos. A
literatura apresenta os mais variados tipos de enxertia, os quais são
decorrentes da diversidade de respostas das espécies, do tipo de material
vegetativo, bem como da facilidade, custo e operacionalidade. Contudo, a
enxertia é agrupada em três categorias distintas: garfagem, borbulhia e
encostia.

Garfagem

Este tipo de enxertia caracteriza-se por empregar como enxerto um

seguimento caulinar, com tamanho variável em função da espécie e do tipo de
garfagem. Em geral, entre os tipos de garfagem mais praticados na silvicultura,
têm-se a garfagem em fenda, garfagem em dupla fenda, garfagem em fenda
incrustada, garfagem em fenda lateral, garfagem em meia fenda, garfagem em
fenda a cavalo, garfagem a inglês simples e a garfagem a inglês complicado.

Garfagem em fenda: também chamada de garfagem de topo, fenda cheia ou

fenda completa. Consiste em decepar o porta-enxerto a uma certa altura do
coleto da planta (variável entre espécies e condições da enxertia) e, neste,
efetuar uma fenda para encaixe do enxerto, o qual deve ser preparado em
forma de cunha (figura 3.4). após preparação das duas partes, porta-enxerto e
enxerto, deve-se promover a união por meio do encaixe justaposto com o
auxilio de um fitilho, para garantir o sucesso da técnica. Opcionalmente, pode-
se cobrir o enxerto com um saco plástico para minimizar a perda excessiva da
turgidez, e os danos mecânicos e causados por insetos, principalmente
formigas. No caso de ser realizada diretamente em porta-enxertos
estabilizados em campo (enxertia de campo), além do saco plástico, é
recomendada também a colocação de um saco de papel pardo, visando
propiciar melhor pegamento, em vista do sombreamento proporcionado.

Garfagem em dupla fenda: semelhante à garfagem em fenda, porem nesta

utiliza-se dois enxertos de diâmetros menores que os do porta-enxerto (Figura
3.5). também deve ser observado o contato entre as camadas cambiais.

Garfagem em fenda incrustada ou garfagem em meia fenda: trata-se de um

tipo de enxertia por garfagem em que os enxertos apresentam-se
sensivelmente mais finos que os porta-enxertos (Figura 3.6). Assim, faz-se a
incrustação do enxerto, de forma triangular, na lateral do porta-enxerto
decepado e, no porta-enxerto, um corte transversal, de forma que permita uma
adequada união entre as duas partes.

Garfagem em fenda lateral: consiste em inserir o enxerto na lateral do porta-

enxerto, de modo que permita a efetivação da enxertia (Figura 3.7).

Garfagem em fenda a cavalo: é o contrário da garfagem em fenda, ou seja, o

enxerto consiste em uma fenda e o porta enxerto em uma cunha, para o
encaixe de união das duas partes (Figura 3.8).
Garfagem a inglês simples: neste tipo de garfagem, faz-se um corte em bisel
tanto no porta-enxerto como no enxerto, de forma que permita uma adequada
união entre as duas partes (Figura 3.9).

Garfagem a inglês complicado: após o corte em bisel, acrescenta-se um

novo corte em bisel em um terço da extensão do bisel, em abas as partes
(Figura3.10). este tipo de garfagem, em relação à garfagem em inglês simples,
permite maior área de união entre o enxerto e o porta enxerto e melhor fixação.
 Borbulhia

É o enxerto feito empregando-se uma borbulha ou gema destacada do

ramo com certa porção de casca. É tida como a mais simples e de fácil
execução. O enxerto tende a formar uma união mais forte que os demais tipos.

Segundo Paiva e Gomes (2005), esse tipo de enxertia é mais utilizado

em plantas mais jovens, podendo a borbulha ser com gema ativa ou dormente.
Entre as diferentes modalidades de enxertia por borbulhia, relacionam-se a
borbulhia em “T” normal, borbulhia em “T” invertido, borbulhia em janela,
borbulhia em escudo e borbulhia anelar.

Borbulhia em “T” normal invertido: este tipo de enxertia consiste em

promover um fendilhamento na casca do porta-enxerto na forma de um T, onde
é inserido o enxerto ( Figura 3.11) . O enxerto constitui-se na gema com uma
porção da casca aderida, obtida da planta da qual se deseja o desenvolvimento
da parte aérea. O tipo em T normal diferencia do tipo T invertido apenas na
posição como é efetuado o fendilhamento no porta-enxerto.

Borbulhia em janela: também denominada borbulhia tipo placa; consiste em

fazer duas incisões longitudinais e duas transversais no porta-enxerto, de modo
que possa permitir a inserção de uma borbulha (Figura 3.12).

Borbulhia em escudo: neste tipo de enxertia (Figura 3.13), promove-se a

retirada da porção da casca do porta-enxerto em que será substituída pelo
enxerto (borbulha).

Borbulhia anelar: consiste em remover a casca na porção do porta-enxerto

em todo o perímetro do caule, o qual é substituído por uma borbulha anelar
correspondente à porção retirada (Figura3.14)
 Encostia

Apesar de ser uma técnica mais antiga, é também menos empregada,

principalmente quando se trata da propagação de plantas em larga escala, por
ser mais complicada e morosa, além de produzir plantas de pior conformação.
O processo de enxertia por encostia consiste em promover a união entre o
porta-enxerto e o enxerto, quando estes ainda não foram separados de sua
planta de origem. A separação da planta é realizada apenas após a
constatação da união e sucesso da enxertia.

Em virtude da não-separação do enxerto e porta-enxerto da planta

matriz antes do pegamento do enxerto, a encostia torna-se uma alternativa
para o resgates de árvores adultas que não possam ser resgatadas por outro
método.

As modalidades mais comuns desse tipo de enxertia são a encostia no

topo do porta-enxerto e a encostia lateral.

Encostia lateral: neste tipo de enxertia, tanto o porta-enxerto quanto o enxerto

mantêm-se ligados à suas respectivas plantas de origem. Dessa forma, a
enxertia realiza-se pela encostia das duas partes, de forma que estas possam
se unir (Figura 3.15). após a efetivação da união, é realizada a separação do
enxerto de sua planta de origem, e do porta-enxerto é retirada a parte aérea
correspondente ao enxerto realizado.
Encostia no topo do cavalo: consiste em um tipo de enxertia semelhante à
enxertia por encostia lateral, porém neste é retirada a parte aérea do porta-
enxerto correspondente ao enxerto (Figura 3.16).
 Outros tipos

Variações dos tipos de enxertia apresentadas anteriormente podem

ocorrer em função da espécie utilizada, das condições ambientais, dos
objetivos a serem alcançados, entre outros fatores. Assim, em algumas
situações podem ser encontradas as seguintes terminologias: minienxertia,
microenxertia, sobre-enxertia, enxertia natural, enxertia intermediária e a
denominada enxertia topgrafting.

Minienxertia: também conhecida como minigarfagem, caracteriza-se pelo uso

de enxertos e porta-enxertos com dimensões menores do que aquelas usadas
na enxertia convencional. Entre os principais objetivos deste tipo de enxertia
destacam-se o uso de material vegetativo mais juvenil e a redução do tempo na
produção da muda enxertada. Os procedimentos operacionais da minienxertia
são similares aos da enxertia por garfagem. Com exceção do diâmetro dos
porta-enxertos e enxertos (Figura 3.17).

Neste método, visando maior facilidade operacional, a junção pode ser

feita com o uso de canudinhos de plástico, bem como qualquer outro material
que seja eficiente para este objetivo. Em seringueira, Lemos Filho et al. (1994)
estudaram a técnica de minienxertia e concluíram que a substituição do
amarrilho com fita ráfia pela sua fixação com um grampo de cabelo comum,
alem de permitir uma perfeita visualização do posicionamento das partes
enxertadas, reduziu significativamente o tempo e o espaço físico requerido
para enxertia, sem reduzir o pegamento. Em seus estudos, a sobrevivência
variou de 72% a 74%, quando a enxertia foi realizada em julho e setembro,
respectivamente. No entanto, as enxertias realizadas na época de maiores
temperaturas resultaram em maior rapidez de cicatrização.
 Em erva-mate, Wendling e Hoffmann (2005) descreveram a técnica de
mini-enxertia com a utilização de canudinhos de plástico e grampos de cabelo
para a fixação enxerto/porta-enxerto, obtendo-se índices de pegamento acima
de 80% na saída da casa de vegetação. Em Eucalyptus grandis, os resultados
indicam um percentual de pegamento de 50% a 70% com propágulos de
árvores adultas (Figura 3.17).

Microenxertia: por definição, consiste em enxertar, sob condições

assépticas, um meristema apical ou ápice caulinar sobre um porta-enxerto
estabelecido in vitro. Assim, como na enxertia realizada na condição ex vitro, a
enxertia in vitro consiste na arte de unir partes de uma planta (enxerto) em
outra que lhe servira de suporte e de estabelecimento de comunicação com o
sistema radicular (porta-enxerto), de tal forma que as duas partes de plantas
diferentes passam a constituir apenas uma, embora em nível genotípico cada
uma delas mantenha sua individualidade. As principais diferenças com enxertia
ex vitro se referem ao fato de a enxertia in vitro ser conduzida em condição
asséptica (cultura de tecidos) e as dimensões, tanto do enxerto quanto do
porta-enxerto, serem bastante reduzidas. As principais vantagens e objetivos
deste tipo de enxertia são: contornar problemas de incompatibilidade
encontrados na enxertia convencional, obtenção de plantas isentas de
patógenos (limpeza clonal), rejuvenescimento de clones adultos, realização de
estudos sobre a detecção precoce da incompatibilidade e como método
alternativo para a propagação vegetativa de certas espécies lenhosas. Mais
detalhes podem ser vistos no capítulo 5 (propagação in vitro de espécies
florestais), no item “Enxertia in vitro”.

Enxertia intermediária: constitui-se no enxerto inserido entre o porta-enxerto e

outro enxerto. Este enxerto pode ser originado de uma terceira planta, onde os
objetivos podem minimizar problemas de incompatibilidade, controlar doenças,
obter formas especiais, controle de crescimento de enxerto etc. como exemplo,
tem-se o caso da seringueira, em que se pode obter um porta-enxerto com
características de sistema radicular resistente e com bom desenvolvimento, o
enxerto intermediário de um clone de alta produtividade de látex e boa
conformação do painel e a copa originada de um terceiro clone com resistência
a certas enfermidades. Segundo Carmo e Gomes (1985), esta enxertia é uma
técnica que envolve dupla enxertia, no intuito de formar o que se chama de
tricomposto.

Enxertia natural: caracteriza-se pelo contato radicular e, ou, parte aérea entre
duas plantas. A enxertia natural radicular pode acontecer em viveiro
(propagação de mudas por raízes nuas) ou no campo (compatibilidade e
pressão de crescimento). Segundo Ferreira et al. (1999), o conhecimento da
possibilidade de ocorrência da enxertia natural de raízes é fundamental para a
realização de diagnose e explicação de transmissibilidade de doenças
radiculares e vasculares causadas por fungos, bactérias vírus, fitoplasmas e
protozoários.
Sobre-enxertia: também conhecida por enxertia de copa, a sobre-enxertia, ou
substituição da parte aérea, é a operação que tem por finalidade o
aproveitamento de plantas formadas com alteração da variedade da copa. O
seu emprego é indicado para plantas de idade não muito avançadas e sadias
ou para plantas com problemas na parte aérea. Com a sobre-enxertia se ganha
tempo, pois o porta-enxerto se encontra perfeitamente implantado, e as
produções se tornam mais precoces. Para se proceder à sobre-enxertia,
decepa-se a copa, deixando brotar de quatro a cinco ramos, sobre os quais se
fará a enxertia da variedade desejada. É o processo indicado para Hevea
brasiliensis, quando em plantas adultas a parte aérea encontra-se atacada por
patógenos prejudiciais ao seu desenvolvimento. Pinheiro et al. (1998) e
Embrapa (1989) recomendam o método de enxertia de copa para o
estabelecimento de seringais em áreas de ocorrência de enfermidades, como
no caso da doença denominada ‘mal das folhas”. No caso de Ilex
paraguariensis (erva-mate), a técnica da sobre-enxertia também pode ser
utilizada para troca de material genético da copa por outro de maior interesse
(Figura 3.18A).

Enxertia topgrafting: também conhecida como topworking, caracteriza-se pela

enxertia realizada em partes da copa de árvores adultas (Figura 3.18B) e serve
como ferramenta para acelerar os programas de melhoramento, visando na
maioria das vezes, alcançar objetivos específicos de floração precoce no
enxerto - em geral, já no primeiro ano após a enxertia (LOTT et al., 2003). Tem
sido utilizada em Pinus, onde em uma árvore adulta podem ser feitos vários
enxertos de árvores superiores. Após seu florescimento, ocorre a polinização
natural ou controlada entre os melhores indivíduos.
Fatores que Influenciam o Sucesso da Enxertia.

Para que a enxertia tenha sucesso, conforme mencionado por Gomes

(1987), Paiva e Gomes (2005) e Hartmeann et al. (2002), alguns requisitos básicos
devem ser observados:

Afinidade entre as plantas: Do ponto de vista botânico, o porta-enxerto e o enxerto

devem ser o mais próximos possível quanto ao grau de parentesco. De modo geral, o
maior sucesso da enxertia ocorre dentro do mesmo clone, seguido pela enxertia entre
clones dentro de espécies, enxertia entre espécie dentro de gênero, enxertia entre
gêneros dentro de famílias e, por fim, enxertia entre famílias.

Analogia entre as plantas: Deve ser respeitada uma certa semelhança em relação a
fisiologia, anatomia, consistência dos tecidos, porte e vigor, bem como exigências com
relação ao clima e as propriedades do solo. A analogia na anatomia torna-se
necessária para promover uma estreita associação entre os tecidos, de modo a
formarem uma conexão continua para o deslocamento das substancias de
crescimento. Quanto a consistência, plantas com tecidos lenhosos são incompatíveis
com as de tecidos herbáceos. No que ser refere ao vigor, as plantas devem ser, tanto
quanto possível, semelhantes, para melhor harmonizar o desenvolvimento; a diferença
de vigor pode causar má ligação entre enxerto e porta-enxerto e engrossamento
exagerado de uma das partes.

Vigor e estágio de desenvolvimento: A enxertia é mas bem sucedida em plantas

vigorosas. De forma geral, a cicatrização (soldadura) torna-se mais fácil sempre que
os tecidos postos em contato forem o mais vigorosos fisiologicamente possível e
quanto mais próximo for o grau de maturação; e os mais juvenis respondem mais
rapidamente e de forma adequada ao processo de propagação vegetativa.

Condições ambientais durante e após a enxertia: Época do ano, temperatura,

umidade, ventos e outros fatores ambientais influenciam o sucesso da enxertia e são
básicos para a escolha do melhor momento para a realização da enxertia. Tanto as
altas como as baixas temperaturas, a baixa umidade e alta luminosidade podem
causar dessecação rápida do enxerto. De modo geral, temperaturas entre 20 e 30º C
são tidas como as ideais para um bom pegamento, desenvolvimento e crescimento do
enxerto, por favorecerem boas condições para o metabolismo da planta.

Espécie de plantas e tipo de enxertia: O tipo de enxertia a ser empregado e a parte

da planta onde se executa a operação (coleto, zona do caule, ápice do ramo etc.)
devem ser escolhidos em função da preferência das plantas envolvidas e do tipo de
porta-enxerto disponível.

Tipo de propágulo utilizado na enxertia: Entre as diferentes técnicas de enxertia, o

tipo de propágulo utilizado varia com a espécie, bem como a técnica a ser adotada.
Fatores de propagação: Durante e após a enxertia, fatores como o status nutricional
e hídrico, tanto do porta-enxerto como do enxerto, devem ser mantidos o mais
vigorosos possível. Tipo de recipiente e substrato utilizado na produção do porta-
enxerto, tratamentos químicos e reguladores de crescimento devem ser observados
em função da espécie, tipo de enxertia, das condições ambientais e dos objetivos a
serem alcançados com a planta a ser obtida pela enxertia. Os materiais (fitilho,
sacolas plásticas etc.) e instrumentos (canivetes, tesoura de poda etc.) utilizados na
execução da enxertia devem ser o mais adequados possível, conforme o tipo de
enxerto, as espécies e as condições locais da propagação.

Objetivos a serem atingidos com a enxertia: Deve-se atentar para os objetivos a

serem alcançados com a enxertia para escolha do tipo de propágulo e técnica a ser
usada.

Contaminações por pragas e doenças: Deve-se procurar minimizar os efeitos de

contaminação pelo uso de instrumento e estruturas adequadas e livres de
contaminantes, pela escolha das plantas livres de microorganismos, bem como evitar
situações de exposição da planta enxertada às condições que permitam as
contaminações.

Tutoramento do enxerto: Em algumas condições e tipo do enxerto realizado, o

tutoramento visa garantir uma adequada união do enxerto com o porta enxerto, até
que haja condições de sustentação própria.

Amarrio: A manutenção do contato entre enxerto e porta-enxerto deve ser promovida

até a completa união. Podem ser usados diversos materiais, como fita de polietileno
de 1,2 cm de largura, também chamado fitilho. Esses materiais também têm o objetivo
de evitar o ressecamento da parte enxertada. Os materiais indicados são os fitilhos,
que permitem uma certa expansão com o aumento do diâmetro do enxerto, evitando a
ocorrência de “enforcamento”. Aliado a isso, são recomendados também os fitilhos
biodegradáveis, uma vez que não necessitam ser removidos do enxerto.
Habilidade do enxertador: Constitui-se em um dos principais fatores, pois a enxertia
carece de um bom treinamento e habilidade de quem a pratica. O operador deve ser
muito cuidadoso; trabalhar com ferramentas bem afiadas; executar os cortes com
firmeza, para deixá-los lisos e sem dilaceração dos tecidos; praticar a operação com
rapidez, para evitar exposição dos cortes; e apertar o amarrilho firme e uniformemente.
Algumas vezes, a definição do tipo de enxertia a ser realizada é feita em função da
habilidade do enxertador.

Razões Para o Uso da Enxertia na Área Florestal

Entre as várias aplicações da enxertia na área florestal, destacam-se:

1) Perpetuação de clones que não podem ser propagados economicamente ou

mantidos por estacas, divisões ou outros métodos assexuados;
2) Manutenção das características genéticas da planta que se quer multiplicar;
3) Em certas condições, propicia floração e frutificação precoce;
4) Resistência a certas doenças e pragas em função do porta-enxerto;
5) Formação de pomares de produção de sementes;
6) Obtenção de formas especiais no crescimento da planta;
7) Restauração de plantas, substituindo a copa;
8) Possibilidade de fixação de híbridos;
9) Possibilidade de transformar plantas estéreis em produtivas, inoculando-lhes
ramos ou gemas frutíferas;
10) Como técnica de resgate vegetativo de genótipos selecionados, visando
atender aos objetivos de clonagem, principalmente para aqueles que não
possuem a capacidade de emitir brotações basais ou que não podem ser
podados drasticamente;
11) Como técnico de rejuvenescimento de clones.

Entretanto, na área florestal, a enxertia apresenta algumas desvantagens,

como a possibilidade de transmissão de viroses, menor longevidade das plantas,
normalmente apresenta baixos índices de pegamento e alto risco de
rejeição/incompatibilidade em algumas espécies.
 Entre os diferentes tipos de enxertia, para os gêneros Eucalyptus e Pinus
merece destaque a garfagem em fenda simples, que tem sido utilizada principalmente
para resgate vegetativo de árvores superiores, visando a formação de pomares para
atender aos programas de melhoramento genético. No caso da Seringueira, a enxertia
por borbulhia tem sido a principal técnica usada na produção de mudas objetivando o
estabelecimento de plantações clonais.

Enxertia na Clonagem de Seringueira (Hevea spp.)

A utilização de clones de seringueira na formação de plantios comerciais,

destinados à exportação de látex, deve-se ao fato de estes contornarem a alta
variabilidade genética da espécie quando propagada por via sexuada (semente), em
termos de produção de látex, resistência a doenças, entre outras características.
Assim, foi a partir de 1936, com o uso da enxertia, que se estabeleceram os primeiros
plantios clonais, a partir de árvores selecionadas nos plantios de pés-francos
(MEDRADO, 1992). Segundo Souza et al. (1990), a expansão da heveicultura no
sudeste da Ásia é resultado da utilização da propagação vegetativa via enxertia, o que
propiciou a seleção e a clonagem de material genético mais produtivo, melhorando a
produtividade dos plantios.

Segundo Pereira (1992) e Alvarenga e Carmo (2008), a propagação vegetativa de

seringueira é feita preferencialmente pela enxertia por borbulhia, a qual tem sido
usada e recomendada para a produção de mudas de seringueira há varias décadas,
apresentando sucessivas melhorias ao longo do tempo, visando principalmente a
redução do tempo de formação das mudas. Atualmente, uma série de métodos de
enxertia por borbulhia é encontrada em literatura, entre os quais podem ser citados os
descritos a seguir, com base em Pereira (1986, 1992):

Enxertia madura ou convencional: Consiste na inclusão de uma gema dormente

em porta-enxertos de 10 a 12 meses de idade e diâmetro de 2,5 a 5 cm do coleto.
Pode ser feita no viveiro ou diretamente no local definitivo consistindo de duas incisões
paralelas, ligadas nas extremidades superiores por uma terceira, dando ao corte a
conformação de U invertido. Da haste clonal é destacado um fragmento de casca e
lenho, contendo uma gema dormente, do qual são aparadas as bordas do escudo,
destacando-se a casca da parte lenhosa. O escudo é inserido na janela aberta no
porta-enxerto após o rebatimento da lingueta, procedendo-se o amarrio com fitilho de
plástico. Três semanas após, e feita à verificação do pegamento, retirando-se o fitilho
e deixando o enxerto aberto, por uma semana, para aclimatação. Em seguida, a haste
do porta-enxerto é decepada.

Enxertia verde: Também conhecida por enxertia herbácea, é feita em U normal ou

invertido quando os porta-enxertos apresentam em torno de 1 cm de diâmetro a 5 cm
do coleto e idade entre 4 e 6 meses. Difere da enxertia madura por empregar gemas
verdes obtidas de brotações laterais com 6 a 8 semanas de idade e por apresentar
taxas de pegamento superiores, acima de 90%.

Enxertia verde precoce: É realizada em porta-enxerto com 2 ou 3 meses de idade,

previamente plantados em sacos plásticos e com o uso de gemas verdes coletadas
em hastes clonais de 6 a 8 semanas de idade.

Enxertia por garfagem herbácea: Consiste no plantio do porta-enxerto em saco

plástico e decepa da haste em torno de 3 a 5 cm acima do substrato, quando a muda
apresenta 2 meses de idade, seguida da abertura de uma fenda central, onde é
inserido o garfo com duas semanas de desenvolvimento. Essa técnica apresenta baixo
pegamento, devido ao excesso de látex no tecido de união do enxerto com o porta-
enxerto, dificultando a formação do calo.

Enxertia de copa: Constitui-se de um arranjo horticultural em que se procede a

substituição de uma copa de seringueira suscetível às enfermidade folhares por outra
resistente. A enxertia de copa em seringueira envolve uma dupla enxertia, com o
objetivo de formar um individuo composto, onde o sistema radicular é de uma planta
(porta-enxerto), o painel de corte é de um clone de alta produtividade e a copa é de
um outro clone resistente a enfermidades. Segundo Pinheiro et al. (1988), essa técnica
constitui-se em um dos meios mais eficazes para o estabelecimento de seringais nas
áreas de ocorrência de enfermidades, como o mal das folhas, a mancha areolada e
outras, em forma epidêmica. Para esses autores existe o consenso de que nas áreas
úmidas da Amazônia é necessário lançar mão da enxertia de copa para realizar a
heveicultura, usando-se clones de porta-enxerto e de copa com resistência às
enfermidades. Na Malásia e na Índia, aliada a redução de problemas com
enfermidades, a enxertia de copa é adotada para solução de problemas como
suscetibilidade de clones de alta produção à quebra pelos ventos (MORAES;
MORAES, 1998).

Geralmente, para a multiplicação vegetativa dos clones de interesse

comercial, torna-se indispensável a instalação de um jardim clonal, visando a
produção para o fornecimento de hastes com borbulhas para a enxertia dos porta-
enxertos. Quanto ao material genético a ser utilizado, para varias regiões brasileiras
existem recomendações técnicas dos clones com maior potencialidade de produção e
adaptabilidade local. Na literatura, vários autores citam resultados obtidos em diversas
regiões, principalmente para o estado de São Paulo (CARDOSO, AGUE, 1990;
GONÇALVES et al., 1993, 1994; ALVARENGA; CARMO, 2008); contudo, esses
resultados não devem ser extrapolados ou generalizados, tendo em vista as variações
edafoclimáticas pertinentes a cada local (MACEDO et al., 2003).

Embora a enxertia tenha se constituído em um grande avanço na

heveicultura mundial, vale salientar que ela ainda apresenta uma série de
inconvenientes como os resultados com a possibilidade de incompatibilidade entre
enxerto e porta-enxerto em função da variabilidade das mudas obtidas de sementes
que prejudicam os plantios comerciais (MEDRADO, 1992; ALVARENGA; CARMO,
2008).
 CAPITULO 4

Propagação Clonal pela Estaquia

Estaquia é o processo de propagação vegetativa que consiste em colocar um

segmento caulinar, foliar ou radicular em meio adequado para enraizamento e
desenvolvimento da parte aérea, visando a formação de uma muda. A estaquia
constitui-se em uma das principais técnicas de propagação vegetativa de clones
selecionados visando atender aos objetivos da Silvicultura clonal, dada a
aplicabilidade técnica, operacional e custo de produção competitivo em relação as
demais técnicas de propagação assexuada.

Antes que a genética florestal fosse reconhecida como tal, os japoneses

usavam a propagação vegetativa em Cryptomeria japônica, enquanto Cunnimghamia
lanceolata, tem sido multiplicada por meio de estacas enraizadas na China por
diversos séculos. Em Pinus, ZaK e Mcalpine (1957, citados por MALAVASI, 1994)
obtiveram sucesso no enraizamento, apesar da falta de conhecimento; entretanto,
verificou-se que tal enraizamento não desenvolvia caule normal.

No âmbito das angiospermas (folhosas), espécies de clima temperado, como

as dos gêneros Platanus, Salix, Populus e Morus, também sendo propagadas
vegetativamente há muito tempo. No entanto, a propagação de espécies de clima
tropical por esse método é um tanto quanto recente, destacando-se a propagação de
Eucalyptus, Ilex paraguariensis, Salix Hunboldtiana, Erythrina sp. e várias espécies
das famílias Myrtaceae, Moraceae, Leguminosae, Bignoniaceae etc.

Para o gênero Eucalyptus, os trabalhos de propagação vegetativa tiveram inicio

nos anos 50, com pesquisadores franceses e Australianos, no Marrocos e norte da
África, os quais multiplicaram várias espécies por enraizamento de estacas obtidas de
mudas de origem seminal. No entanto, a clonagem de árvores adultas por meio de
estaquia somente foi obtida com sucesso no início da década de 1970, na Austrália
(ALFENAS et al., 2004). No Brasil, os trabalhos pioneiros com sucesso no
enraizamento de estacas de Eucalyptus, em nível experimental, remontam ao ano de
1975, conforme relatado por Ikemori (1975), sendo a técnica adotada em escala
comercial, quatro anos mais tarde. Contudo, dada a importância da Silvicultura clonal
de Eucalyptus no Brasil, a propagação vegetativa pela estaquia foi aperfeiçoada diante
das dificuldades existentes para obtenção de material vegetativo com grau de
juvenilidade e vigor fisiológico adequado ao enraizamento de estacas, culminando com
o desenvolvimento de técnicas de miniestaquia e microestaquia (ASSIS et al., 1992;
XAVIER; COMÉRIO, 1996; ASSIS, 1997; ALFENAS et al.,2004).

Enraizamento Adventício

Na produção de uma muda por estaquia, o enraizamento constituí-se de um

processo complexo, o qual envolve o redirecionamento do desenvolvimento de células
vegetais totipotentes para a formação de um meristema direcionado à formação de um
novo sistema radicular. Dessa forma, na propagação vegetativa por enraizamento de
estacas, o sistema radicular é denominado adventício, ou seja, a raiz é formada a
partir da estaca constitui-se em uma raiz adventícia, em razão desta ter sido
introduzida em um local diferente daqueles onde se forma no curso normal de
desenvolvimento da raiz.

Segundo Hartmann et al.(2002), durante o processo de enraizamento de

estacas ocorrem algumas fases, que podem ser identificadas nos seguintes estádios:
1- desdiferenciação, 2- formação de raízes inicias; 3- desenvolvimento de raízes
iniciais em primórdios radiculares; 4- crescimento e emergência dos primórdios
radiculares. Conceitualmente, essas fases podem ser expressas como:

Desdiferenciação: processo de alcançar um estado meristemático não

diferenciado em células préviamente diferenciadas. Ou seja, é a capacidade de
células diferenciadas para iniciar a divisão e formar um novo ponto
meristemático de crescimento.

Formação das raízes iniciais: a partir das células diferenciadas no estádio 1

ocorre a formação das raízes iniciais, ainda não perceptíveis.

Desenvolvimento dos primórdios de raiz reconhecível: neste estádio as

raízes iniciais se desenvolvem das raízes reconhecíveis e tornam-se perceptíveis, as
quais proporcionarão o crescimento radicial.
 Crescimento e emergência radicular: constitui-se no último estádio da
enraizamento de estacas, em que ocorre a formação radicial suficiente para
proporcionar a sustentação da nova planta.

Para fins práticos e de generalizações, alguns autores, como Fitt- Neto (1992),
dividem a rizogênese em apenas duas fases: 1- Indução: etapa de processos
moleculares e bioquímicos, sem alterações visíveis ; e 2- Formação: correspondente a
divisões celulares e crescimento das novas raízes.

Na estaquia, a raiz pode ser originada de uma raiz pré-formada, de raiz iniciais
latentes ou induzida de uma parte do caule. Quanto à origem da raiz adventícia, em
estacas caulinares de plantas lenhosas, esta pode ser de células parenquimáticas
vivas ( quando jovens), raio vascular/ medular, câmbio, floema, calos internos e
externos, de canais resiníferos, córtex ou lenticelas ( HARTMANN et al., 2002). Para
Eucalyptus, de acordo com os resultados obtidos por Goulart (2007), a formação
endógena de primórdios radiculares e a proliferação e a formação de uma massa de
células desorganizadas (calos), em miniestacas caulinares apicais herbáceas de
clones Eucalyptus grandis x E. urophylla foram observadas com até 12 dias de idade,
a partir do câmbio vascular.

Podem-se considerar dois padrões básicos de emergência do sistema radicular

adventício: direto e indireto. No primeiro caso, o enraizamento adventício ocorre com a
emergência da raiz diretamente da estaca, enquanto no caso do enraizamento indireto
ocorre a formação de calo preliminarmente ao crescimento do sistema radicular.

Tipos de Estaca

Na propagação vegetativa de plantas podem ser usados três tipos de estaca:

foliar, caulinar e radicular. Destas, a estaca caulinar é a mais utilizada na Silvicultura.

Estaca foliar:é de aplicação rara na silvicultura, tendo maior expressão de uso

na floricultura. Esta estaca pode ser constituída pelo pecíolo e pelo limbo
da folha ou apenas pelo limbo foliar da planta da qual se deseja multiplicar
 vegetativamente. Em espécies florestais o enraizamento de estaca foliar
normalmente é difícil, limitando sua aplicação na produção de mudas.

Estaca radicular: como o próprio nome indica, é obtida a partir de segmentos

das raízes da planta que se deseja propagar. À semelhança da estaca foliar,
é pouco comum na silvicultura, limitando-se a algumas espécies nas quais o
processo é possível, como cerejeira (Prunus avium) e liquidambar
(Liquidambar styraciflua).

Estaca caulinar: Constitui-se de segmentos de ramos contendo gemas apicais

e, ou, laterais, sendo o tipo mais difundido e de uso mais comum na propagação
vegetativa por enraizamento de estacas na silvicultura clonal.

As estacas caulinares podem ser classificadas, quanto à sua consistência, em

herbáceas, semilenhosas ou lenhosas. A estaca herbácea possui maior capacidade
para regeneração de uma nova planta, devido à sua maior juvenilidade fisiológica; no
entanto, dada a sua consistência tenra, apresenta o inconveniente de ter baixa
resistência à desidratação, com posterior deterioração em condições ambientais
adversas no processo de enraizamento. Por sua vez, a estaca lenhosa apresenta
maior capacidade de sobrevivência, porém possui maior dificuldade em enraizar
devido ao maior grau de maturação fisiológica e de lignificação da estaca. Quanto à
estaca semilenhosa, esta apresenta consistência intermediária entre a estaca
herbácea e a lenhosa.

No que se refere à posição de origem das estacas caulinares na brotação,

estas podem ser classificadas em apicais, medianas e basais.

Normalmente a estaca apical possui consistência herbácea e, por possuir a

gema apical, facilita a propagação vegetativa por enraizamento, o que permite a
obtenção de uma muda de melhor qualidade e com maior facilidade de manejo.
Quanto ao tamanho ou comprimento, as estacas caulinares podem ser classificadas
em grandes, médias e pequenas, em função da espécie, da operacionalidade e dos
padrões estabelecidos para o processo de enraizamento desejado.
 De modo geral, a escolha da estaca apropriada (consistência, posição e
tamanho) deve ser feita com base na facilidade de enraizamento da espécie/ clone,
no padrão de muda desejada e nas facilidades disponíveis(infraestrutura física, técnica
, pessoal e orçamentária) para a propagação vegetativa.

As estacas caulinares são preparadas mantendo-se as folhas- em geral, um a

dois pares de folhas- as quais são reduzidas pela metade ou proporcionalmente ao
tamanho da estaca confeccionada. Normalmente, a presença de folhas em uma
estaca caulinar possui a função de estimular o enraizamento, por meio do
fornecimento, principalmente de carboidrato e hormônios. O carboidrato produzido é
importante na sobrevivência da estaca, garantindo melhores condições fisiológicas no
processo de enraizamento. O hormônio normalmente produzido nas folhas constitui-
se de auxinas, que são transportadas para a base da estaca devido o movimento polar
basípeto, o qual pode ser imprescindível no sucesso de enraizamento daquela estaca.

Outro detalhe que merece importância refere-se ao fato de confeccionar a

estaca mantendo-se um par de folhas, visando a obtenção de um sistema radicular
com melhor distribuição radicular, uma vez que estacas com apenas uma folha podem
levar ao enraizamento apenas do lado em que a folha esteve presente, pela maior
atividade fisiológica e facilidade de translocação de substâncias que atuam no
enraizamento adventício.

Em Eucalyptus, as estacas caulinares herbáceas apicais com dimensões

variando entre 4 e 6 cm de tamanho com dois pares de folhas formadas reduzidas a
metade(figura 4.1) constituem-se no principal tipo de estaca utilizada na produção de
mudas clonais, objetivando atender aos programas de silvicultura clonal no Brasil.

Conforme mostrado na Figura 4.1, na muda produzida pelo enraizamento

adventício de uma estaca, a região de transição entre o sistema radicular e a parte
aérea da planta é denominada “colo”, enquanto na muda produzida pela germinação
de uma semente esta região de transição é denominada de “coleto”. Da mesma forma,
nas mudas produzidas a partir da germinação de uma semente, o sistema radicular
formado constitui-se de uma raiz pivotante originada do eixo embrionário, da qual se
formará um sistema radicular do tipo axial, enquanto no processo de estaquia o
sistema radicular formado é do tipo fasciculado, constituído de raízes primarias,
originadas da região do colo, e de raízes secundárias, formadas a partir das primárias.
 Aspectos Bioquímicos da Rizogênese

Conforme mencionado no capitulo 2, o conhecimento dos princípios básicos da

biologia ajuda a compreender melhor a propagação de uma planta, facilitando a sua
multiplicação vegetativa, assim como acompanhar a historia do desenvolvimento
durante o seu ciclo vital, ou seja, a “ontogenia” da planta. O enraizamento adventício a
partir de uma estaca envolve consideráveis atividades metabólicas durante as fases
de rizôgenese, as quais são responsáveis pelo desenvolvimento e crescimento do
novo sistema radicial (figura 4.2)

Considerando a produção de mudas clonais, vêm-se desenvolvendo técnicas

destinadas à propagação vegetativa de plantas, as quais têm dependido, basicamente,
do potencial rizogênico dos propágulos. Em virtude disso, segundo Hartmann et al.(
2002), os avanços no conhecimento e na identificação dos processos que
acompanham e controlam a rizogênese são de vital importância , uma vez que podem
levar à identificação de compostos que possibilitem a seleção precoce de material apto
para enraizar. Existem inúmeros compostos que podem estar envolvidos na regulação
de do potencial rizogênico de propágulos; entre estes, encontram-se as peroxidases,
os compostos fenólicos, os carboidratos e as relações hormonais internas.

Peroxidases

São enzimas presentes em todas as plantas verdes, alguns fungos e bactérias

aeróbicas (SIEGEL, 1993), que são requeridas para catalisar o ultimo passo
enzimático na biossíntese de lignina, catabolismo de hormônios, defesa e oxidação
fenólica ( CHRISTESEN et al., 1998). Estudos químicos tem demonstrado que as
peroxidases participam de forma direta e indireta em diversos eventos fisiológicos,
incluindo a dormência, a tolerância ao frio, a germinação, a resistência ao parasitismo
(GASPAR et al., 1982) e a biossíntese do etileno (GASPAR et al., 1982; ZANOL,
1996).

Uma alta atividade de peroxidases tem sido relacionada com o aumento do

percentual de formação de raízes, sugerindo a atividade de peroxidase como um
marcador da habilidade de formação de raízes (DRUART et al.; 1982; OERTLI, 1978).
Segundo Thompson et al (1987), a peroxidase é um dos marcadores bioquímicos que
podem ser importantes para o entendimento do processo de envelhecimento das
plantas, apresentando um padrão geral de aumento da atividade com o aumento da
senescência dos órgãos e tecidos.

Há poucos estudos sobre a atividade de peroxidases e a juvenilidade ou

maturidade de um tecido ou planta , porém, uma vez que plantas juvenis teriam maior
adaptação às pressões do ambiente, poderia se imaginar que estas apresentariam
maior atividade de peroxidases. Para Sequóia sempervirens, Huang et al., (2002),
obtiveram rejuvenescimento do material adulto após cinco enxertias seriadas, o que
estava associado com a diminuição do conteúdo de isoenzimas de peroxidase.

Compostos fenólicos

Vários estudos tem sido realizados com a finalidade de buscar possíveis

relações entre compostos fenólicos e o potencial rizogênico dos propágulos.
Inicialmente, ressaltava-se o efeito inibitório dos fenóis sobre a formação de raízes (
KEFELI; KADYROV.1971), porém Haissig (1974) sugere que a formação de
primórdios radiculares necessita de conjugados AIA- fenóis, sintetizados com a
participação de enzimas como peroxidases e polifenol oxidases. Segundo Debergh e
Read (1991), um grupo especial de compostos fenólicos são protetores de auxinas
por atuarem como antioxidantes, inibindo a oxidação do AIA.

Outros trabalhadores indicam que, em geral, monofenóis e m-difenóis

estimulam a oxidação do AIA, enquanto o-difenóis, p- difenóis e polifenóis inibem
essa reação(LEE er al., 1982). Pode-se citar ainda a não-relação do conteúdo de
fenóis totais sobre o número de raízes em plantas de Castanea Sativa (bom
enraizamento) e Salix viminalis( baixo enraizamento), observada por Gesto et al.
(1977), e a correlação positiva entre o enraizamento e o conteúdo de fenóis orto-
diidróxi e totais em espécies de gênero Prunus ( RANA; CHADHA, 1989).

A utilização dos teores de fenóis totais no monitoramento da rizogênese está

relacionada, além da sua relação inversa com a peroxidase, com a participaçao do AIA
e de outros compostos importantes para o enraizamento, como teor de lignina (DRU
ART et al., 1982; SINGEL, 1993).

Tem sido observado também que fenóis do tipo flavonóide poderiam participar
na regulação de transporte polar das auxinas (JACOBS; RUBERY,1988) citados por
TAIZ; ZEIGER, 2004), o que poderia levar à acumulação de AIA na base de
propágulos. Para a aceleração na emergência de raízes com a adição do composto
fenólico floroglucinol ao meio da cultura in vitro, além do empedimento da formação de
calos.

Existem poucos estudos acerca do conteúdo de fenóis e da juvenilidade ou

maturidade de um tecido ou planta. Vierling et al.(1992), trabalhando com Prunus
domestica, encontram maior conteúdo de fenóis em folhas juvenis quando
comparadas com as adultas, sendo o mesmo comportamento observado em gemas
de Castanea sativa x Castanea crenata por Mato et al. (2002). Em Eucalyptus,
Goulart (2007),concluiu que as respostas dos clones de Eucalyptus grandis x E.
urophylla à aplicação dos cofatores ácido cafeico, ácido clorogênico e a hidroquinona
melhoram os índices de enraizamento e sobrevivência de três clones; a fenilalanina e
o floroglucinol proporcionam efeito benéfico em dois clones; e somente o ácido
cafeico, o triptofano e, principalmente, a prolina apresentam efeito benéfico nos quatro
clones estudados.

Fatores Importantes no Enraizamento de Estacas

Entre os principais fatores que afetam a propagação vegetativa pelo

enraizamento de estacas estão aqueles relacionados com o genótipo, as condições
fisiológicas e de nutrição mineral de planta fornecedora das estacas, os substratos de
enraizamento, a armazenamento de estacas, a sanidade e aplicação de reguladores
de crescimento, assim como os fatos relacionados com a manipulação das condições
ambientais, principalmente luminosidade, temperatura e umidade.

Genótipo

A capacidade de enraizar difere drasticamente entre as espécies florestais,

podendo estas ser classificadas em: espécie de fácil enraizamento; espécies com
respostas crescentes ao enraizamento quando são proporcionadas condições
adequadas de controle ambiental e manejo da fonte de propágulo vegetativo; e
espécies com resposta pequena ou nenhuma aos estímulos para enraizamento.

Na área florestal observam-se variações entre espécies existentes, bem como

entre os clones de uma mesma espécie, quanto ao percentual e à qualidade de
enraizamento. Resultados da literatura indicam que os valores de enraizamento
podem variar de 0 % a 100% para Eucalyptus spp. (HIGASHI et al.,2000a) e para Ilex
paraguariensis (TAVARES et al., 1992. Segundo Assis e Teixeira (1998), existem
várias evidências de que a formação de raízes adventícias em seguimentos de caule é
geneticamente controlada, o que pode ser demonstrado pela grande variação
observada entre as espécies e clones, como, por exemplo, a maior capacidade de
enraizamento de estacas de Eucalyptus camaldulensis e Eucalyptus urophylla
comparadas com as de Eucalyptus globulus, assim como a grande variabilidade de
respostas de enraizamento de estacas entre clones de Eucalyptus urophylla. No
entanto, para Ilex paraguariensis, estimativas obtidas por Correa (1995) dos
coeficiente de herdabilidade, associados ao caráter de enraizamento de estacas em
três procedências e em nível de individuo, indicaram baixa magnitude para todas as
procedências, tanto no sentido amplo quanto no sentido restrito.

Condições Fisiológicas da Planta Matriz

No transcorrer do seu desenvolvimento, as plantas lenhosas passam por mudanças

morfológicas e fisiológicas que influenciam seus hábitos de crescimento, vigor,
filotaxia, forma e estrutura da folha, presença de espinhos, anatomia do caule,
capacidade de enraizamento ou florescimento, entre outras, conhecidas como
mudança da fase juvenil para a adulta ou madura.

Segundo Hackett (1987), uma das mais consistentes expressões da maturação em

plantas lenhosas tem sido a transição da alta para a baixa capacidade de
enraizamento de estacas. Em algumas espécies lenhosas, estacas de mudas jovens
provenientes de sementes enraízam facilmente, enquanto outras provenientes de
plantas mais velhas enraízam esporadicamente ou não. Vale salientar que em
espécies com facilidade de propagação vegetativa a idade ontogenética da planta-
matriz pode exercer pouca influência no enraizamento, ao passo que em espécies
com maior dificuldade de propagação a idade ontogenétca pode ser fator decisivo no
processo e enraizamento de estacas.
 Na propagação vegetativa é muito importante a identificação de quais árvores ou
partes da árvore se apresentam juvenis, visto que, em algumas espécies,
especialmente lenhosas, existe um gradiente de juvenilidade em direção à base da
árvore, o qual é variável entre espécies. Dessa forma, estacas coletadas mais
próximas dessas porções são mais fáceis de enraizar do que aquelas coletadas de
áreas maduras da árvore (Hackett, 1987).

Para se conseguir a propagação de plantas na fase adulta, é necessário explorar a

maior capacidade de enraizamento de material juvenil, seja pela utilização de
propágulos provenientes de partes juvenis da planta, seja pela promoção do
rejuvenescimento de partes da planta adulta, restaurando sua competência ao
enraizamento.

Quanto à manipulação das condições ambientais e status fisiológico da planta

matriz, visando a obtenção de estacas adequadas ao enraizamento, essas são
variáveis em função da matriz e das condições ambientais locais. Assim, estacas
devem ser coletadas no seu máximo vigor vegetativo e de turgidez, visto a sua
vulnerabilidade ao estresse hídrico, diante da dificuldade de reidratação dos tecidos
sem a presença de um sistema radicular.

A época do ano pode exercer grande influência no enraizamento das estacas, pelo
fato de as condições fisiológicas da planta matriz serem influenciadas pelas variações
sazonais. Dessa forma, para cada planta e condição ambiental específica, deve-se
determinar qual a melhor época de colheita de estacas, bem como a influência da
época na produção e qualidade das brotações destinadas ao processo de estaquia.

Nutrição Mineral da Planta Matriz

A nutrição mineral pode influenciar o enraizamento de estacas de duas formas

distintas: em decorrência do vigor vegetativo da planta matriz da qual se coletam as
brotações e do próprio status nutricional do propágulo coletado.

O conteúdo de carboidrato dos propágulos vegetativos tem sido considerado por

muitos pesquisadores um fator importante no sucesso do enraizamento, embora ainda
haja controvérsias acerca dessa constatação. A iniciação radicial requer energia e,
portanto, altos níveis de carboidratos nas estacas têm sido relacionados como
importantes para obtenção de sucesso e maior velocidade no enraizamento (Chalfun,
1989; Hartmann et al. , 2002). Assim, segundo Malavasi (1994), os carboidratos não
possuem função reguladora no enraizamento, porém são fontes de energia e de
carbono para a síntese de outras substâncias essenciais à formação de raízes.
 Para Okoro e Grace (1976), o conteúdo de carboidratos não influenciou a maior
capacidade de enraizamento de estacas de Populus euramericana (com alta
capacidade de enraizamento) em relação ás de Populus tremula (com baixa
capacidade de enraizamento), e sim a existência de raízes pré-formadas naquela e
não nesta, além de um transporte mais efetivo de carboidratos para a região basal da
estaca, onde ocorre o enraizamento. O mesmo comportamento foi observado por
Welander (1995) para propágulos de Betula pubescens.

Para Modak et al. (1990), a imersão das estacas e, ou, o pincelamento destas com
solução de sacarose 0,1% e 1% resultaram em maiores índices de enraizamento para
Adhatoda vasica; conforme Rana e Cadha (1989), o percentual de enraizamento de
plantas do gênero Prunus foi positivamente correlacionado com o conteúdo total de
carboidratos.

Evidências indicam que estacas provenientes de plantas bem nutridas, porém com
teores de nitrogênio (N) menores que plantas bem supridas deste nutriente, enraízam
com facilidade (Fachinello, 1986; Menzies, 1992). De acordo com Hartmann et al.
(2002), geralmente o enraizamento é negativamente correlacionado com o conteúdo
de N, o que pode ser confirmado pelos resultados obtidos por Rana e Chadha (1989).
Nessa situação, o maior índice de enraizamento foi atribuído ao maior acúmulo de
carboidratos ou à redução dos níveis de citocininas na estaca (Fachinello, 1986). Alta
relação C/N é outro índice que tem sido correlacionado positivamente com o
percentual de enraizamento.

Em estudos de nutrição realizados em Juniperus virginiana, as concentrações

internas de amido e sacarose dos propágulos na época de sua excisão foram
significativamente correlacionados com o percentual de enraizamento e comprimento
das raízes (Henry et al., 2002). No mesmo estudo, embora a fertilização das planas
doadoras de propágulos com N afetasse o enraizamento, não foi encontrada
correlação significativa entre os níveis internos de N nas folhas e o enraizamento.

De modo geral, existem evidências de que o enraizamento adventício demanda

grande gasto de energia, e o manejo fisiológico para aumentar os carboidratos na
planta matriz se torna, muitas vezes, essencial para alcançar resultados satisfatórios
na propagação por estaquia.

Diversos outros elementos minerais têm sido relatados como importantes no

processo de enraizamento. O boro (B) faz parte da síntese do RNA, atua no processo
de divisão celular (Malavasi, 1994), regula os níveis de auxinas pelo aumento da
atividade da AIA oxidase (Blazich, 1987) e é necessário para a emissão de novas
raízes (Mavasi, 1994). O zinco (Zn) participa da síntese do triptofano, que é o
precursor do AIA (Blazich, 1987; Malavasi, 1994). O manganês (Mn) atua como
ativador da AIA oxidase, a qual destrói as auxinas endógenas (Blazich, 1987),
afetando negativamente o enraizamento.

O potássio atua na ativação de grande número de enzimas e está envolvido no

controle estomático (Malavolta et al., 1997) e transporte de carboidratos. Paula et al.
(2000), em estudos com um clone de Eucalyptus, verificaram que as doses de K
influenciaram significativamente a produção de estacas por cepa, o comprimento dos
brotos, o número de raízes e o peso seco destas. Para a taxa de enraizamento,
número de brotos por estacas e comprimento das raízes, não houve efeito significativo
nas doses de K.

Em trabalho de enraizamento de miniestacas de clones de Eucalyptus realizado

Higashi et al. (2000b), foi constatada a correlação negativa entre o teor de fósforo e
magnésio e a taxa de enraizamento das miniestacas. Segundo esses autores,
concentrações de fósforo nas brotações maiores que 3,5Kg-1 estavam associadas a
baixa taxa de enraizamento das miniestacas.

O cálcio (Ca) é requerido para elongação e divisão celular (Marschenr, 1995), o que
sugere uma grande importância desse elemento na iniciação radicular (Blazich, 1977).
Trabalahando com Eucalyptus, Higashi et al. (2000b) concluíram que, quanto mais
elevado o teor de Ca, maior a taxa de enraizamento entre todos os clones de
Eucalyptus testados. Maiores índices de enraizamento entre os clones foram
observados quando as concentrações de Ca nas brotações encontravam-se acima de
5,5 g/Kg-1. Trabalhando com aplicações de Ca (2000) concluíram que houve diferença
na resposta ao enraizamento e peso seco da parte aérea a radicial em função do
clone; os maiores pesos secos da parte radicial estavam entre as dose de 6 e 7 g/L-1
de cloreto de cálcio e doses acima de 12 g/L-1 causaram queima nas folhas devido a
elevada salinidade.

Enfim, o estado nutricional da planta matriz mostra-se de grande importância não

apenas quanto ao aspecto do seu vigor vegetativo e da produção de brotações, mas
também a concentração de elementos minerais apresenta, nas estacas, efeito
altamente significativo nos índices de enraizamento e na velocidade formação das
raízes. Destaca-se a grande necessidade de pesquisas que procuram avaliar a
influência de vários elementos minerais isoladamente ou em conjunto em relação ao
seu comportamento no tocante à capacidade e vigor e enraizamento em estacas de
diferentes espécies florestais.

ARMAZENAMENTO DAS ESTACAS

Preconiza-se que o tempo transcorrido entre a coleta, o preparo das estacas e a

colocação em meio de enraizamento deve ser o menor possível. Entretanto, em
algumas situações ocorre a necessidade de armazenamento das estacas devido a
certas condições operacionais, como a distância da colheita das brotações ao local de
enraizamento e a quantidade de mudas a ser produzida.

No armazenamento das estacas busca-se a minimização do seu estresse hídrico,

prevenção de doenças e manutenção de vigor. Assim, o sucesso e o tempo de
armazenamento dependem da umidade relativa, temperatura, espécie, patógenos,
condições de crescimento da planta matriz e época de coleta das brotações
destinadas ao processo de estaquia.

Entre algumas práticas que visam melhorar as condições de armazenamento das

estacas, destacam-se a redução da temperatura, o aumento da umidade, a redução
da luz e a ampliação de antitranspirantes. Essas condições buscam manter o vigor, a
turgescência e a minimização das atividades metabólicas das brotações, objetivando
garantir o máximo potencial da estaca.

O sistema mais frequentemente empregado é o de manter a base das estacas

mergulhada em água, dentro de baldes ou caixas. No entanto, caso permaneçam
durante muito tempo mergulhadas em água, pode ocorrer anaerobiose, ou seja, a falta
de oxigenação das estacas, resultando em perdas de seu potencial. Além disso, o
armazenamento das estacas em água pode facilitar a contaminação por patógenos,
dada a facilidade de disseminação a partir de uma estaca infectada.

Tem sido recomendado e de fundamental importância manter túrgidas as estacas ,

vendo que o estresse hídrico, além do dessecamento, pode alterar os níveis de
hormônio (como ácido abísico, citocinina e etileno) e interferir negativamente no
enraizamento. Para Eucalyptus, por exemplo, recomenda-se que o período entre a
confecção das miniestacas e o plantio no substrato, na casa de vegetação, seja
inferior a três horas (Alfenas et al., 2004). Resultados obtidos por Goulart (2007)
evidenciaram que o tempo de armazenamento de miniestacas de clones de
Eucalyptus grandis x E. urophylla teve influencia marcante no enraizamento e
crescimento das mudas, concluindo-se, assim, que os clones estudados responderam
mais eficientemente ao enraizamento quando se realizou o plantio logo após a coleta
das miniestacas, diante do efeito negativo observado do armazenamento desses
propágulos,mesmo quando executado por um curto período de tempo. Vale salientar
também que o enraizamento pode ser comprometido pela rápida penetração de ar
(embolia) nos vasos do xilema, no momento da confecção da estacas, interrompendo
a continuação da coluna liquida e interpondo grande resistência ao fluxo de água
(Maestri et al., 2000).

Sanidade das Estacas

Durante o período de enraizamento torna-se necessário promover certa proteção às

estacas, em função de sua exposição a diversos tipos de patógenos, resultando essa
proteção em maior sobrevivência e qualidade das raízes (Paiva; Gomes, 2005). Para
Eucalyptus, esses autores recomendam a imersão das estacas em solução de
Benomyl na concentração de 0,2% por 20 minutos, logo após serem preparadas. A
base da estaca é novamente tratada com o fungicida Captan (ou outro) a 2%, no
momento da aplicação do regulador de crescimento. Dentro da casa de vegetação,
recomendam-se aplicações preventivas de fungicidas semanalmente – de preferência
com alternância de produtos – para evitar o desenvolvimento de resistência por parte
de fungos. Para a erva-mate (Ilex paraguariensis), Graça et al. (1988) recomendam a
desinfestação das estacas com imersão em hipoclorito de sódio 1% v/v (5 minutos),
lavagem em água corrente (5 minutos) e imersão em Benomyl 0,5% p/v (15 minutos).

Ferreira (1997) recomenda o uso de materiais e equipamentos livres de patógenos

na propagação de plantas, por meio da lavagem em água corrente ou aspergida,
seguida de imersão durante três minutos em 120 g de Captan veiculado em solução
de 780 mg L-1 de cloro + 0,05% de espalhante adesivo, seguindo-se ou não de nova
imersão ou enxágue com água pura. Esse autor cita ainda como alternativa a
desinfestação das caixas e recipientes com vapor ou água quente a partir de 70 °C por
três minutos. Alfenas et al. (2004) recomendam também a desinfestação das caixas e
recipientes com vapor ou água quente a 80 °C por 30 segundos.

A condição de limpeza das brotações que darão origem às estacas é de

fundamental importância no controle da ocorrência de doenças. No caso de plantas
matrizes localizadas em condições de muita poeira, as estacas terão muito mais
chances de sofrerem com doenças no ambiente de enraizamento.
 Atualmente, o tratamento químico preventivo com fungicidas é questionado, sendo
recomendadas práticas para evitar a contaminação das brotações nas árvores
matrizes no campo ou no jardim clonal e aplicações curativas, conforme a
necessidade, no ambiente de propagação, ou seja, eliminar a fonte de inoculo visando
a não-utilização de tratamento químico preventivo e, ou, curativo (Alfenas et al., 2004).

Aplicação de Reguladores de Crescimento Vegetal

Para formação de raízes adventícias em estacas, é necessária a presença de

certos níveis de substâncias de crescimento natural na planta, sendo umas mais
favoráveis que outras. Várias substâncias, quando aplicadas exogenamente,
promovem ou inibem a iniciação de raízes adventícias, dependendo da espécie, do
estado de maturação, entre outros fatores.

Existem diversas substâncias com propriedades reguladoras de crescimento

vegetal, sendo as auxinas as de maior interesse no enraizamento de estacas.
Aplicações exógenas de auxinas podem proporcionar maior porcentagem, velocidade,
qualidade e uniformidade de enraizamenteo (Hackett, 1987; Hartmann et al., 2002),
embora a sensibilidade das células vegetais e clones seja variável, mostrando que as
respostas positivas não são universais.

Dentro do grupo das auxinas encontram-se diversas substâncias com atividades

reguladoras de crescimento, como ácido indol-3-acético (AIA), ácido indol-3-butírico
(AIB), ácido naftalenoacético (ANA) e o 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4 D), podendo
estes vir a ser tóxicos quando em concentrações acima das indicadas.

O AIB tem apresentado maior eficiência na promoção de raízes adventícias em

estacas de espécies florestais, visto a sua menor mobilidade e maior estabilidade
química no interior da estaca. A concentração utilizada varia de acordo com a
espécies, clone, estado de maturação, tipo de estaca, condições ambientais, forma e
tempo de aplicação, entre outros, com variação de 20 a 10000 mg L-1, sendo as
maiores concentrações utilizadas em estacas mais lenhosas, de enraizamento mais
difícil. É recomendável a realização de testes com diferentes concentrações de
regulador caso não se disponha de informações a esse respeito para a espécie que
será propagada.

Vale ressaltar que os reguladores, em concentrações adequadas, promovem o

enraizamento, porém, em concentrações supraótimas, podem inibi-lo. De acordo com
Alvarenga e Carvalho (1983) e Hartmann et al. (2002), quando a auxina é aplicada em
estacas, ocorre aumento da sua concentração, a partir do qual qualquer acréscimo de
seu nível se torna inibitório.

Na estaquia comercial de Euclyptus grandis, E. urophylla e seus híbridos, por

exemplo, o AIB tem sido usado com sucesso no enraizamento em concentrações de
6000 a 8000 mg L-1, aplicado via pó ou via líquida. Entretanto, no caso da miniestaquia
dessa mesma espécie, resultados positivos nos índices de enraizamento e
sobrevivência das miniestacas podem ser alcançados com maior eficiência nas
concentrações entre 1000 e 2000 mg L-1 para alguns clones e com a não-aplicação
desse regulador em outros com maior facilidade de enraizamento. Para erva-mate, a
concentração de 6000 mg L-1 tem sido a mais recomendada. Em espécies que
apresentam facilidade de enraizamento, como a maioria das plantas em estado juvenil
(coleta de estacas em mudas novas), não se justifica o gasto e o trabalho de se fazer
tratamento com regulador de crescimento em estacas.

Conforme mencionado anteriormente, a aplicação dos reguladores de crescimento

pode ser feita via líquida ou pó. Na via líquida, as bases das estacas são imersas na
solução do regulador por períodos variáveis, em função das concentrações e do tipo
de material; entretanto, recomenda-se adequar soluções que permitam um tempo de
aplicação em torno de 10 segundos. Na aplicação via pó, as bases das estacas são
introduzidas no regulador de crescimento e, em seguida, devem ser estaqueadas.
Como vantagens da aplicação via pó citam-se a fácil disponibilidade comercial e a
simples e fácil aplicação; como desvantagens, tem-se dificuldade de obtenção de
resultados uniformes na distribuição do regulador e maior dificuldade de fixação deste
mesmo somente na base da estaca, após estaqueamento. A aplicação via líquida tem
como vantagens economia de reagentes na preparação da solução, facilidade e
rapidez de uso, tratamento e resultados uniformes; como desvantagens, tem-se a
dificuldade de preparação/armazenamento da solução, a necessidade de experiência
prática e a baixa disponibilidade de preparações comerciais, quando comparada à
forma de pó.

Substratos

O substrato utilizado para o enraizamento das estacas constitui-se de grande

importância na propagação. De modo geral, o substrato possui as funções de servir de
sustentação das estacas durante o período de enraizamento e proporcionar aeração
adequada ao desenvolvimento das raízes, bem como proporcionar condições de
umidade e nutrição para o crescimento do sistema radical.

De maneira geral, os substratos utilizados no enraizamento devem ser

suficientemente porosos para possibilitar boa aeração para a estaca, pois o oxigênio é
indispensável à respiração das raízes que surgem, e, ao mesmo tempo, armazenar
certa quantidade de água, suficiente para o desenvolvimento inicial da muda e permitir
a sobrevivência no campo por um determinado tempo.

As estacas de muitas espécies de plantas enraízam com facilidade em uma grande

diversidade de tipos de substrato. No entanto, em espécies de difícil enraizamento, o
substrato pode influenciar tanto no percentual de enraizamento quanto na qualidade
do sistema do sistema radial formado. Os tipos mais comuns de substrato são a
vermiculita, a turfa, a serragem semidecomposta, a areia, a casca de arroz
carbonizada, a moinha de carvão, o composto orgânico, a terra de subsolo, as fibras
de coco e diversas combinações entre estes. Não há consenso quanto ao melhor,
sendo recomendável testar nas condições ambientais e com a espécie a ser
propagada.

Na clonagem de Eucalyptus, o substrato mais utilizado na propagação por estaquia

tem sido constituído de vermiculita, ou desta em combinação com casca de arroz
carbonizada, composto orgânico ou outros materiais. Vale salientar que a qualidade da
muda desejada, o processo de propagação, a disponibilidade e o custo de constituinte
do substrato são fatores de relevância na tomada de decisão.

Rizobacterização

A utilização de rizobactérias no processo de enraizamento adventício de

estacas tem sido pouco explorada; no entanto, segundo Alfenas et al. ( 2004), a
rizobacterização do substrato no processo de propagação vegetativa constitui-se em
uma tecnologia altamente promissora. Resultados de pesquisas recentes têm
mostrado que isolados de rizobactérias selecionados, quando aplicados em minijardim
clonal de clones de Eucalyptus, proporcionam maior produção e pré disposição dos
brotos ao enraizamento. Alem disso, certos isolados incorporados ao substrato de
enraizamento de estacas e miniestacas calinares de clones de Eucalyptus podem
promover incremento na biomassa e qualidade do sistema radicular, cujo os ganhos
nos índices de enraizamento podem ultrapassar 100%, dependendo do clone e do
isolado de rizobactérias (TEIXERIA, 2001; ALFENAS et al., 2004). Esses mesmos
autores também evidenciaram, concomitantemente aos ganhos em enraizamento,
maior incremento na biomassa aérea das mudas enraizadas e efeito positivo no
biocontrole para certas doenças importantes na produção de mudas clonais de
Eucalyptus.

Fatores Ambientais

Entre as várias condições ambientais que afetam a propagação clonal em

espécies florestais e que têm sido manipuladas pela ação do ser humano pro processo
de enraizamento de estacas, dentro de certos limites, encontram-se fatores
relacionados com a luminosidade, a temperatura e a umidade.

Luminosidade

Em todos os tipos de crescimento vegetal, a luz é de suma importância, pelo

fato de construir fonte de energia para fotossíntese e ser indispensável para a síntese
de carboidratos e auxinas. A luz afeta também a síntese de outros compostos, como
substâncias de crescimento endógenas e cofatores de enraizamento que
desempenham importante função no enraizamento ( THOMPSON, 1992).

A irradiância, o fotoperíodo e qualidade da luz cuja as necessidades são

variáveis segundo a espécie, devem ser adequados para a manutenção de uma taxa
fotossintética razoável, que garanta um suplemento de carboidratos suficiente para a
sobrevivência das estacas e iniciação radicular, sem comprometer o vigor vegetativo
das estacas.

A literatura não é clara quanto aos efeitos de diferentes intensidades luminosas

sobre o enraizamento, em virtude, principalmente, das condições ambientais
específicas de cada local. Entre tanto, nas condições brasileiras, a maioria dos
estudos mostra que a diminuição nos níveis da luz natural promove aumento no
enraizamento de estacas.

Para Hartmamn et al. (2002), condições de alta luminosidade tendem a

promover nas estacas maior síntese de citocinas, substancias estas que estariam mais
relacionadas ao crescimento da parte área em detrimento do sistema radicial. Para
Thompson (1992), o excesso de luminosidade promove o fechamento estomático das
folhas dos propágulos, reduzindo a fotossíntese liquída e, conseqüentemente, a
produção de carboidratos é posterior enraizamento.

Em algumas situações, a diminuição dos níveis de luz no interior de uma casa

de vegetação visa a redução da quantidade de energia, buscando contribuir para o
controle da temperatura e umidade no ambiente de enraizamento. Contudo, segundo
Alfenas et al. ( 2004), devem ser evitados ambientes de enraizamento com valores
inferiores a 150 µM de fótons s -¹ m-², na maior parte do período diurno.

Condições de luminosidade baixa e luz difusa favorecem a ocorrência de

doenças causadas por fungos apodrecedores de propágulos, como Botrytis cinérea,
Rhictonia spp. e Cylindrocladium spp. ( ALFENAS et al., 2004).

Temperatura

A temperatura tem importante função regulatória no metabolismo das plantas e

afetam o enraizamento das estavas. Assim, a temperatura, tanto do ambiente quanto
do substrato que suporta a estaca, é um fator importante na propagação vegetativa
das plantas, pois condiciona e regula a produção de raízes adventícias ( CHALFUN,
1989). Devem propiciar condições para que acha indução desenvolvimento e
crescimento das raízes, como também a manutenção e sobrevivência das folhas,
gemas e ramos, sendo as oscilações altamente prejudiciais ( BERTOLOTI;
GONÇALVES, 1980).

Em espécies florestais, um bom enraizamento pode ser conseguido em amplo

intervalo de temperatura, variando entre 15 e 35 º C. No entanto, recomenda-se como
faixa ideal entre 25 e 30º C ( BERTOLOTI; GONÇALVES,1980). É recomendável que
a temperatura na base da estaca seja superior à temperatura ambiente, em torno de 4
a 5º C ( VALLE; CALDEIRA, 1979; HIGA, 1983; GOMES, 1987), em vista de
proporcionar maior atividade deste local. Nessas condições ocorre a redução da perda
de água pela parte área, prolongando assim o seu bom estado fisiológico e
aumentando a precocidade e percentagem de raízes formadas ( BORBA; CORRÊIA,
1983).

As temperaturas do ar excessivamente altas devem ser evitadas, pois podem

promover a brotação da parte área antes do enraizamento levando a um consumo
excessivo de reservas, devido à elevação da transpiração e, conseqüentemente,
perda de água pelas folhas. Além disso, as estacas podem não resistir à perda
excessiva de água em razão do comprometimento na manutenção das folhas, gemas
e ramos.

Por outro lado, as baixas temperaturas diminuem o metabolismo das estacas,

levando a um maior tempo para o enraizamento, ou, até mesmo, não proporcionam
condições adequadas para indução, desenvolvimento e crescimento radicial.

Umidade

O sucesso no enraizamento depende, em parte, da capacidade do sistema de

propagação em proporcionar condições de turgidez ao propágulo até que este forme
suas próprias raízes e absorva água. Desse modo, a umidade do ar ao redor da
estaca tem um grande efeito no seu status hídrico, visto que as estacas não possuem
meios para absorver água e nutrientes. No entanto, o excesso também é prejudicial
por dificultar trocas gasosas, propiciar o desenvolvimento de doenças, impedir o
enraizamento e provocar a morte dos tecidos.

A formação de raízes adventícias claramente envolve o crescimento e a

síntese de novos compostos, que, por sua vez, são diretamente influenciados pelo
estresse hídrico. Dessa forma, a pressão de turgor é essencial para promover a força
necessária à expansão celular, facilitando a emergência das novas raízes dos
propágulos. É recomendado que a coleta dos propágulos seja feita de plantas matrizes
em estado túrgido. Dessa forma, se coleta realizar-se no campo deve ser feita
preferencialmente pela manhã ou em dias nublados pu chuvosos.

A presença de folhas nas estacas é um forte estímulo para a formação de

raízes; com tudo, a perda de água pela transpiração pode levar à sua morte antes da
formação de raízes ( HARTMANN et al.,2002). Para contornar o problema da
transpiração excessiva, deve-se manter a umidade do ar acima de 80%, conservando-
se assim a turgescência dos tecidos; entretanto, deve-se evitar a saturação do ar, por
questões já mencionadas.

Água de boa qualidade com pH em torno do neutro é de suma importância para

o sucesso no enraizamento. O uso de água poluída pode acarretar danos,
principalmente pela proliferação de patôgenos e entupimento do sistema hidráulico da
casa de vegetação e proporcionar condições de desenvolvimento de algas.
 As variações na umidade são prejudiciais ao enraizamento e responsáveis pela
desidratação dos tecidos, prejudicando diretamente o processo de enraizamento,
levando, muitas vezes à morte das estacas.

Estruturas de Propagação

As condições ambientais são bastante variáveis nas diversas regiões do

mundo, sendo, em algumas situações, restritivas a propagação vegetativa de plantas.
Em um processo de enraizamento de estacas devem-se buscar adequar às condições
ambientais, principalmente aquelas relacionadas à luminosidade, temperatura e
umidade, de forma a proporcionar condições de respostas favoráveis à propagação
vegetativa. Dessa forma, a otimização do enraizamento de estacas tem sido feitas por
meio da utilização de estruturas de propagação, como casa de vegetação, visando
condicionar os fatores ambientais de enraizamento.

Casa de Vegetação

Diante da dificuldade de enraizamento da maioria das espécies florestais, como

comentando anteriormente, a utilização de casa de vegetação tem sido recomendada
na maioria das situações, as quais proporcionam condições ambientais favoráveis à
propagação vegetativa. Em relação à umidade do ar no interior de uma casa de
vegetação, é recomendado que seja mantida sempre alta, a fim de minimizar a perda
de água pelas folhas das estacas colocadas para enraizar. Em geral, valores
superiores a 80% são recomendados, sendo, porém, necessários refinamentos em
cada condição ambiental e de estrutura. Para a manutenção de condições de alta
umidade do ar, são adotados sistemas de nebulização intermitente, com bicos de alta
pressão e baixa vazão, controlados automaticamente por umidostato, interligados com
timer, de forma a não permitir umidade excessiva, que é prejudicial ao enraizamentp.

No controle da temperatura, os altos valores podem ser reduzidos pelo uso de

tela de polietileno (sombrite) ou malhas termorrefletoras sobre a estrutura de casa de
vegetação, buscando minimizar a quantidade de energia que entra no seu interior.
Todavia, na utilização de sombreamento como forma de diminuir a temperatura no
interior da casa de vegetação, diminui-se também a radiação solar e, por
conseqüência, a capacidade fotossintética da planta, podendo prejudicar o
enraizamento das estacas. Alternativamente, a estrutura de casa de vegetação pode
conter sistema de janela laterais e zenitais e, ou, sistema de circulação de ar forçados,
os quais, por controle de termostatos, permite manter padrões preestabelecido de
acordo com as condições desejadas para o enraizamento das estacas.

Nas situações de temperaturas baixas, se casa de vegetação não permitir um

efeito estufa satisfatório, um sistema de aquecimento deve se incorporado à estrutura,
sendo esse acionado por termostato, dentro de uma faixa de temperatura desejável
para o enraizamento das estacas. Os sistemas que produzem calor abaixo das
bancadas ou bandejas de enraizamento tem sido os mais recomendados por
propiciarem aumento de temperatura, sobre tudo no substrato de enraizamento.
Sistemas de aquecimento instalado na parte superior da casa de vegetação não são
tão eficiente, por fazerem o aquecimento de cima para baixo, o que resulta em maior
gasto de tempo e energia para obtenção de determinada temperatura, além de
poderem ser danosos às estacas, pela seca excessiva da lâmina de água depositada
sobre as folhas. Quanto ao tipo de veículo usado para promover o aquecimento, a
água quente tem sido a mais recomendada, em razão de propiciar maior uniformidade
e eficiência no aquecimento.

Nas condições tropicais e subtropicais, a luz não constitui fator limitante ao

processo de enraizamento. Geralmente, a intensidade luminosa precisa ser reduzida,
tendo em vista a associação de controle junto à temperatura e umidade.

Dessa forma, dependendo das condições ambientais de onde se pretende

realizar o enraizamento de estacas, deve se observar qual o melhor modelo de casa
de vegetação que proporcionará as condições adequadas para propagação, a um
custo compatível com as reais necessidades. Assim, em regiões em que as condições
de temperatura, luz e umidade são próximas das idéias para a propagação de uma
determinada planta, estrutura simples podem ser tão eficiente quanto estrutura
totalmente automatizadas e com auto grau de implementação da tecnologia
disponível.
 Casa de Sombra e Área de Pleno Sol

Após a etapa de enraizamento em casa de vegetação, as estacas enraizadas

são transferidas para a aclimatação em casa de sombra, visando proporcionar
condições de vigor fisiológico e resistência à muda, para posterior crescimento e
formação nas condições ambientais naturais. A casa de sombra ou aclimatação nada
mais é que uma estrutura com sombreamento em torno de 50%, obtido normalmente
por meio do uso de sombrite. Nessa estrutura, o sistema de irrigação é formado por
bicos aspersão, com vazão maior e pressão menor do que aquelas utilizadas na casa
de vegetação, buscando dar condições rusticidade no controle das condições
ambientais.

Após a aclimatação em casa de sombra, as mudas de estaquia são

transferidas para área com sol pleno, onde completaram o seu crescimento. Quando
atingirem os padrões de diâmetro e altura recomendados para seu plantio ou venda (
variáveis em função da espécies e do tipo e tamanho da embalagem usada na sua
produção), as mudas deveram sofrer um processo de rustificação ou endurecimento, o
qual consiste, normalmente, na redução de freqüência de irrigações e adubações (
principalmente aquelas contendo nitrogênio, como uréia e sulfato de amônia). Vale
salientar que alguns viveiros florestais, destinados à produção de mudas clonais de
Eucalyptus, estão adotando a cobertura com plásticos transparente em toda extensão
do pátio de crescimento e rustificação das mudas, como forma de maximizar o
controle das atividades de formação das respectivas mudas produzidas. Essa
estratégia visa ter maior controle sobre as etapas de produção das mudas clonais em
todo sua formação, sobre todo nos períodos de maior incidência de chuvas. Em suma,
objetiva-se maior controle dos processos de enraizamento das estacas em casa de
vegetação e aclimatização das mudas enraizadas em casa de sombra e todo o
processo de crescimento e rustificação da muda para o plantio no campo.

Jardim Clonal

Esta é uma área de grande importância para viveiros com grande volume de
produção de mudas, visto estes terem a finalidade da produção de brotações para o
obtenção das estacas para a propagação vegetativa pela estaquia. Esta área constitui-
se do plantio de clones já selecionados originados da estaquia ou outra técnica de
propagação vegetativa em um local especifico próximo ao viveiro podendo ser
implantado diretamente no campo, em espaçamento variáveis com forme a espécie (
0,5 X 0,5m; 3,0 X 1,0m; 3,0 X 0,5m; 2,0X1,0m; 1,5 X1,5m; 1,0X1,0m ), onde as cepas
são mantidas sobre podas constantes. Alternativamente, com o advento da
miniestaquia, os jardins clonais tem sido implantados em locais protegidos e em
condições envasadas, como em canaletões. Nesses jardins, o manejo das cepas
fornecedoras de estacas constitui-se de tratos silviculturais constantes, como poda de
manutenção de cepas e para a coleta de estacas, adubações, irrigações e controle de
plantas invasoras, pragas e doenças.

Nos jardins clonais de campo, visando a diminuição da contaminação por

patôgenos em vista dos respingos de água da chuva e, ou, irrigação, tem sido
recomendado o uso de cobertura morta, que pode ser conseguida com uma serie de
materiais, como grama seca, acículas de pínus, casca de arroz, casca de cavacos
secos de madeira, entre outros, dependendo da disponibilidade e custo. Além disso,
ela também proporciona a manutenção de temperatura e umidade mais uniforme no
solo, bem como redução da ocorrência de plantas indesejáveis e da possibilidade de
compactação deste ( ALFENAS et al., 2004).

Para plantas do gêneros Eucalyptus e Pinus, os minijardins clonais tem

substituídos os jardins clonais de campo, sendo estes usados somente em casos
excepcionais, como área de estoque de materiais genéticos e bancos de
germoplasma. Para outras espécies, no entanto, onde a silvicultura clonal esta em
fase de implementação e ainda não é tão intensiva, os jardins clonais de campo tem
papel fundamental na produção de estacas para propagação clonal.

As estruturas de propagação também tem sido implementadas no controle das

condições ambientais e status fisiológico da planta matriz, visando a obtenção de
estacas adequadas ao enraizamento. De modo geral, em função do clone e das
condições ambientais locais, as estruturas empregadas possuem diferentes gruas de
sofisticação. Na clonagem de Eucalyptus, por exemplo, nos minijardins clonais tem
sido utilizadas estruturas com cobertura plástica transparente, buscando proteger as
minicepas, sobre tudo nos períodos chuvosos, contra encharcamento excessivo do
substrato, lixiviação dos nutrientes e de grandes incidências de doenças.

Atualmente, é recomendada a utilização de um sistema de cobertura plástica

preferencialmente móvel ( retrátil) para otimizar as condições de luminosidade natural
no jardim. Por outro lado, tem sido sugerida a suplementação de luz artificial e o
controle da temperatura no minijardim clonal como alternativa para maximização das
condições fisiológicas das cepas, principalmente em regiões com grandes variações
ambientais, visando a obtenção de brotações fisiologicamente adequadas à
propagação vegetativa pela estaquia durante todo o ano. Entretanto, pesquisas nesse
sentido ainda carecem de desenvolvimento para substanciar cientifica e tecnicamente
o emprego dessas estruturas no controle das variáveis ambientais em jardins clonais.

Estaquia na Silvicultura Clonal de Eucalyptus

Entre os métodos em escala comercial de propagação clonal, a estaquia é a
principal técnica usada na silvicultura clonal intensiva de Eucalyptus. No entanto,
devem-se ressaltar como principais desvantagens e, ou, limitações da propagação
vegetativa por estaquia dos plantios clonais; a não-ocorrência de ganhos genéticos
adicionais a partir da primeira geração de seleção; a dificuldade de obtenção de
enraizamento em algumas espécies e clones; e a dificuldade de ocorrência de
enraizamento em plantas não-juvenis.

Dos métodos de reprodução vegetativa de Eucalyptus desenvolvidos em escala

comercial, a estaquia é uma técnica cujos princípios dão bem conhecidos, resultando
em uma ampla adoção da técnica na clonagem dessa espécie, a qual permitiu o
desenvolvimento da silvicultura clonal de forma intensiva em diversas partes do
mundo.

Dada a importância do gênero Eucalyptus no atual cenário da silvicultura clonal,

nos últimos anos foram desenvolvidas metodologias de propagação vegetativa que
aperfeiçoaram a técnica de estaquia, denominadas de miniestaquia e microestaquia,
as quais proporcionaram a minimização de algumas dificuldades no processo de
produção de mudas de certos clones e espécies, principalmente no que concerne a
enraizamento, formação das mudas e desenvolvimento da futura arvore.

Historicamente, foi a dificuldade de propagação vegetativa pela estaquia de

clones de Eucalyptus que despertou o interesse por técnicas alternativas de clonagem,
como a micropropagação, porem, em virtude dos problemas encontrados, esta técnica
ainda não se tornou viável do ponto de vista técnico e econômico para uso em larga
escala. No entanto, foi a partir da micropropagação que se desenvolveu a
microestaquia e, mais tarde, a miniestaquia, tornando-se um marco na evolução dos
sistemas de clonagem do Eucalyptus, sendo estas técnicas criadas e desenvolvidas
no Brasil na década de 1990 (ASSIS, et al., 1992; XAVIER; COMÉRCIO, 1996; ASSIS,
1997; WENDLING, 1999; HIGASHI et AL., 2000a). Após a implantação da
microestaquia em escala comercial (XAVIER; COMÉRCIO, 1996), a micropropagação
tornou-se uma etapa prévia a multiplicação clonal para o rejuvenescimento in vitro dos
clones de Eucalyptus. No entanto, dadas as dificuldades técnicas, econômicas e
operacionais da micropropagação em atender à demanda de rejuvenescimento dos
clones visando a microestaquia, desenvolveu-se a miniestaquia como técnica utilizada
pelas empresas florestais brasileiras na propagação clonal de Eucalyptus.

Propagação Clonal de Eucalyptus pela Estaquia

A propagação clonal de Eucalyptus por estaquia constitui-se no enraizamento de

estacas caulinares semilenhosas, com 6-10 cm de comprimento, obtidas das porções
intermediarias das brotações provenientes de cepas de clones selecionados.

O processo de clonagem por estaquia objetivando o plantio clonal para fins

comerciais pode ser esquematizado nas seguintes fases: Fase 1: seleção da arvore
superior (em plantio comercial ou em teste de progênies) com base em características
que atendam aos objetivos a serem alcançados com a clonagem; Fase 2: avaliação
clonal das arvores superiores em áreas experimentais (teste clonal), buscando a
confirmação da seleção realizada e definição das técnicas silviculturais a serem
adotadas; Fase 3: estabelecimento de áreas de multiplicação vegetativa (jardim
clonal), a fim de obter brotações suficientes para confecções das estacas necessárias
ao processo de produção de mudas por estaquia em viveiro florestal, de acordo com a
demanda do plantio; Fase 4: implantação e condução da floresta clonal comercial.

Jardim Clonal em Eucalyptus

Uma vez selecionada a arvore matriz, em plantios comerciais ou em plantio

experimentais, entre as varias formas de resgate vegetativo para o processo de
clonagem, o uso de brotações provenientes de arvores decepadas tem sido p método
mais empregado, visto a facilidade e operacionalidade técnicas desse procedimento.
Assim, após a árvore selecionada ter sido abatida, a cepa remanescente, com 20 a 30
cm de altura, emite novas brotações, as quais são colhidas após 30-50 dias, visando
atender a demanda de estacas para o processo de multiplicação vegetativa daquela
arvore selecionada, atendendo, assim, as fases 1 e 2, conforme mencionado
anteriormente.
 No estabelecimento de áreas de multiplicação vegetativa, para atender a
produção comercial de determinado clone, o uso de jardim clonal tem sido a forma
mais utilizada, permitindo um manejo intensivo e ajustado para obtenção de brotações
em quantidade e qualidade, destinadas ao êxito do enraizamento das estacas. A
freqüência das coletas no jardim clonal varia, em media, de 7 a 45 dias, a qual é
função da espécie/clone, do ambiente e do método de coleta (seletiva ou poda
drástica). Assim, o jardim clonal constitui-se do plantio de clones selecionados,
originados normalmente da estaquia, em um local especifico próximo ao viveiro,
implantado diretamente no campo em espaçamentos variados, com adensamento em
torna de 40.000 plantas/há, sendo o mais utilizando nas empresas florestais
brasileiras.

No sistema de jardim clonal adensado, as cepas são mantidas sob tratos

culturais intensivos, como podas constantes e manejo sob tratos culturais intensivos,
como podas constantes e manejo nutricional e hídrico ajustado as condições de cada
clone. As cepas em jardins clonais normalmente são mantidas a uma altura de 20 a 30
cm do solo, objetivando manter o vigor fisiológico, sanidade e produção e produção de
estacas em quantidade e qualidade semelhantes ao processo de enraizamento pela
estaquia, visando a produção comercial de mudas clonais. Alternativamente, o uso de
banco clonal ou plantio clonal comercial, como fonte de material vegetativa; entretanto,
as condições de manejo das cepas são dificultadas e a qualidade das estacas obtidas
pode interferir no sucesso do enraizamento.

No Brasil, o sistema de jardim clonal tem sido substituído pelo minijardim clonal,
em razão de suas vantagens técnicas.

Enraizamento das Estacas

Quanto ao processo de enraizamento, as estacas utilizadas possuem, em média,

de 6 a 10 cm de comprimento, com um par de folhas reduzidas normalmente à sua
metade, consistência semilenhosa e originadas das partes intermediarias das
brotações. Para maior eficiência do enraizamento, as estacas recebem em sua base
aplicação de AIB, com concentração em torno de 6.000 mg L-1. Em seguida, são
estaqueadas em recipientes, contendo o substrato para desenvolvimento do sistema
radicular. Esse material, uma vez estaqueado, permanece na casa de vegetação por
um período de 20 a 45 dias, o qual é variável com a região, a época do ano, a espécie
e o clone envolvido. Após esse período, as estacas enraizadas são transferidas para
aclimatação em casa de sombra, permanecendo nesse local por 8 a 15 dias, sendo,
então, levadas para um local de pleno sol, onde completam seu desenvolvimento e
recebem os tratamentos finais, antes de serem levadas para plantio no campo (Figura
4.3).

Normalmente, as mudas produzidas por enraizamento de estacas estão aptas a

serem plantadas em campo quando atingem 90 a 120 dias de idade. Vale salientar
que em algumas regiões onde as condições ambientais são naturalmente favoráveis
ao enraizamento e com pequena variação de estrutura mais simples, como casa de
sombra, podem ser utilizadas de forma eficiente no enraizamento das estacas,
dispensando, assim, estruturas mais sofisticadas de casa de vegetação climatizada no
processo de propagação pela estaquia.

As dificuldades de propagação vegetativa encontradas em algumas espécies,

envolvendo material adulto e variação entre clones, aliadas ao desenvolvimento do
processo de estaquia, resultaram nos atuais processos denominados de miniestaquia
e microestaquia, conforme mencionado a seguir.

Figura 4.3 – Estaquia de Eucalyptus grandis x E. urophylla. A: jardim clonal com sistema de
fertirrigação; B: estaca pronta para estaqueamento; C: estaqueamento após
aplicação de AIB na base da estaca; D: fase de enraizamento das estacas em
casa de sombra (alternativa 1); E: fase de enraizamento das estacas em casa de
vegetação climatizada (alternativa 2); F: muda de estaca enraizada, com 90 dias
de idade, pronta para plantio.

Propagação Clonal de Eucalyptus pela Miniestaquia

A miniestaquia é uma variação da técnica de estaquia e foi desenvolvida a partir

da década de 1990 para Eucalyptus. De maneira geral, a miniestaquia é similar à
técnica de estaquia convencional, porem apresenta variações metodológicas que
permitem a otimização do enraizamento e qualidade da muda clonal, principalmente
de clones com maior dificuldade de propagação vegetativa. Além dessa espécie, essa
técnica tem sido avaliada para varias outras de interesse comercial, com resultados
promissores.

A miniestaquia consiste na utilização de brotações de plantas propagadas pelo

método de estaquia convencional como fonte de propágulos vegetativos. Em uma
seqüência esquemática dessa técnica, inicialmente, faz-se a poda do ápice da
brotação da estaca enraizada e, após a emissão de brotações das gemas axilares na
porção remanescente da muda, são coletadas miniestacas para enraizamento, e
assim, sucessivamente, novas coletas são realizadas em intervalos variáveis,
sucessivamente, novas coletas são realizadas em intervalos variáveis, em função do
crescimento e vigor das brotações. Dessa forma, a parte basal da brotação da muda
podada constitui uma minicepa (com 6 a 10 cm de altura), que fornecerá as brotações
(miniestacas) para formação das futuras mudas clonais. O conjunto das minicepas
constitui-se no minijardim clonal, que fornecerá as miniestacas para a produção de
mudas.

As miniestacas normalmente possuem dimensões que variam de 4 a 8 cm de

comprimento, contendo de uma três pares de folhas, variável em função do
clone/espécie. As folhas geralmente são recortadas ao meio, visando evitar o excesso
de transpiração, facilitar a chegada da água de irrigação ao substrato (evitar o feito
guarda-chuva) e evitar o recurvamento das miniestacas devido ao peso da água sobre
a superfície das folhas.

De modo geral, a miniestaca-padrão de clones de Eucalyptus, normalmente

usada na produção comercial de mudas clonais, constitui-se da parte apical da
brotação e com consistência herbácea, diferenciando da estaca convencional, a qual
normalmente é formada das porções intermediarias das brotações e possui
consistência semilenhosa. Além disso, o minijardim clonal, no caso da miniestaquia,
esta instalando dentro do viveiro florestal em condições protegidas pelo envasamento
das cepas, diferindo do sistema da estaquia, em que o jardim clonal esta localizado
em condições de campo.

Minijardim Clonal de Eucalyptus

O minijardim clonal pode ser definido como a área de multiplicação vegetativa

formada por um conjunto de minicepas. Objetivando fornecer miniestacas para o
processo de miniestaquia (Figura 4.4). No caso da miniestaquia de Eucalyptus, a
denominação de minijardim clonal tem sido adotada pela maioria das empresas do
setor florestal, assim como o termo hidrojardim clonal também tem sido utilizado por
alguns viveiros florestais, quando este é estabelecido em sistemas hidropônicos
(CAMPINHOS et al., 1999). Também tem sido encontrada na literatura a denominação
de jardim miniclonal (WENDLING, 1999; XAVIER, 2002), embora na prática dos
viveiros florestais o termo jardim seja asado de forma genérica.

O manejo do minijardim clonal pode ser realizado por meio de diversos sistemas;
a condução das minicepas pode ser diretamente em tubetes, em tubos PVC, em vasos
diversos, em sistema de hidroponia com leito de areia ou inundação temporária, além
de variações destes. A recomendação geral quanto ao ambiente do minijardim clonal é
de que ele deve ser instalado em canteiros suspensos e sob cobertura com plástico
transparente, com possibilidade de teto retrátil, visando a otimização dos nutrientes
pela chuva, a promoção de maior controle nutricional e fitossanitário, além da proteção
que esse tipo de cobertura pode oferecer contra danos ambientais adversos. Quanto à
suplementação de Liz artificial em jardim clonal, segundo Assis (2001), em regiões
com dias curtos e poucos ensolarados, experiências obtidas com fotoperíodo de
14h/1000 luz indicaram maior predisposição ao enraizamento, minimizando os efeitos
de sazonalidade observados nas regiões subtropicais, como o Sul do Brasil.

O manejo de minijardim clonal nos diferentes sistemas consiste no

acondicionamento das minicepas nos respectivos recipientes onde recebem os tratos
culturais (adubação, irrigação, controle fitossanitário etc.) e as podas nos períodos
recomendados. O manejo do minijardim clonal no sistema de tubetes apresenta
variação no que tange ao suprimento de nutrientes às minicepas, a qual pode ser pelo
sistema de subirrigação ou irrigação por inundação intermitente, em que a água,
juntamente com os nutrientes, é fornecida na base do tubete, em tempos
programados.

Figura 4.4 – Tipos de minijardim clonal d clones de Eucalyptus. A: minijardim clonal em tubete
com sistema de irrigação por aspersão; B: detalhe de uma minicepa em tubete; C:
minijardim clonal em canaletão (em calha de cimento-amianto) com sistema de
fertirrigação por gotejamento e com cobertura retrátil; D: detalhe do caneletão; E:
minijardim clonal em caneletão (em alvenaria) com sistema de fertirrigação por
gotejamento e com cobertura retrátil; F: detalhe do caneletão; G: minijardim clonal
em tubete com subirrigação/inundação intermitente; H: detalhe do sistema de
subirrigação/inundação.

O minijardim clonal em caneletão nada mais é do que um sistema semi-

hidrôponico composto por uma calha de cimento-amianto ou de alvenaria, ou mesmo
de outro material similar, com comprimento e largura variáveis, que contem no seu
interior material inerte (geralmente areia) para a sustentação das minicepas, sendo
geralmente alocadas em torno de 100 minicepas por metro quadrado. Nesse sistema,
normalmente a irrigação e nutrição são fornecidas via sistema de gotejamento, sendo
alguns sistemas completamente automatizados. A nutrição mineral utilizada no
minijardim clonal é composta por macro e micronutrientes e variável; o fator material
genético (clone), o ambiente e o sistema de condução das minicepas são
determinantes para a melhor formulação e balanço dos elementos que compõem tal
solução nutritiva.
 Alternativamente aos sistemas de minijardins clonais apresentados, Assis
(2001) comenta sobre a possibilidade do sistema de jardim clonal virtual, o qual
consiste em usar o ápice caulinar de uma miniestaca enraizada. Assim, cada
miniestaca enraizada produz pelo menos uma outra miniestaca, que é
subseqüentemente enraizada. Dessa forma, a primeira miniestaca enraizada que
forneceu uma nova miniestaca para enraizamento é conduzida para formação da
muda para plantio comercial, e a nova muda de miniestaca enraizada será fonte
novamente de uma outra miniestaca, e assim sucessivamente. No entanto, esse
sistema possui algumas desvantagens, como dificuldades na programação de coleta e
manutenção das condições idéias de nutrição e vigor fisiológico.

Quanto aos aspectos de sobrevivência das minicepas nas sucessivas coletas

das miniestacas, esta tem variado em função do manejo e sistema de condução das
minicepas (tubete, canaletão etc.). Tem sido observado, em algumas situações
práticas percentual elevado de sobrevivência das minicepas com mais de 100 coletas
realizadas, indicando a sustentabilidade de produção de miniestacas nos atuais
sistemas de minijardim clonal adotados nesse processo de propagação clonal de
Eucalyptus. No entanto, algumas empresas florestais, visando a maximização da
produção das mudas clonais e controle fitossanitário tem adotado a renovação do
minijardim clonal semestralmente.

Quanto à produtividade das minicepas, o numero de miniestacas obtidas varia

enormemente em função da espécie/clone, sistema e manejo do minijardim clonal,
condições ambientais e vigor fisiológico das minicepas. De forma geral, em função dos
diferentes minijardins clonais utilizados nas empresas florestais, da espécie/clone, das
condições ambientais, da estrutura física e da qualificação pessoal, os valores médios
encontrados nas empresas florestais brasileiras em sistema de canaletão de areia tem
sido entre 8.000 e 15.000 miniestacas/m²/ano.

Outro fator importante a ser considerado na condução e manejo do minijardim

clonal refere-se ao fato de as diferenças observadas de vigor fisiológico entre as
minicepas decorrentes do efeito “C” acarretam respostas diferenciadas no
enraizamento das miniestacas e no vigor de crescimento das mudas oriundas de um
mesmo clone. Como alternativa, tem sido proposta a seleção de cepas com maior
vigor fisiológico na implantação do minijardim clonal, objetivando uma padronização
(redução do efeito “C”) e maximização no processo de produção de miniestacas e do
enraizamento e crescimento das mudas.

Enraizamento das Miniestacas de Eucalyptus

 Na produção de mudas de Eucalyptus por miniestaquia (Figura 4.5), a coleta de
miniestacas no minijardim clonal normalmente é realizada de forma seletiva e
contínua, em períodos a serem definidos conforme o vigor das brotações, colhendo-se
todas aquelas que atendam ao padrão de miniestaca preestabelecido. A forma de
preparo das miniestacas pode ser com ou sem o ápice, sendo a primeira mais
recomendada em vista do maior vigor fisiológico e de formar uma muda com
dominância apical, não necessitando, portanto, de podas subseqüentes.

Figura 4.5 – Produção de mudas clonais de Eucalyptus por miniestaquia. Estaqueamento de

miniestacas (A); miniestacas em casa de vegetação para armazenamento (B);
detalhe da muda de miniestaca no tubete (C); estrutura de casa de vegetação com
bandejas colocadas diretamente no piso (D) e em mesas suspensas (E); estrutura
de casa de sombra para aclimatação das miniestacas enraizadas em bandejas
colocadas diretamente no piso (F) e em mesas suspensas (G); estrutura de pleno
sol para formação e rustificação da muda em bandejas direto no piso (H) e em
mesas suspensas (I); detalhe de uma muda clonal pronta para plantio no campo
(J).

Após coletadas, as miniestacas devem ser acondicionadas em recipientes, os

quais devem proporcionar condições de manutenção do vigor, turgidez e sanidade,
para que elas possam chegar ao local de estaqueamento em perfeitas condições
fisiológicas. Assim, devem se preferir recipientes que proporcionem condições de
baixa luminosidade e temperatura e alta umidade. Nas situações em que tem sido
adotados recipientes contendo água (como, por exemplo, caixa de isopor), deve-se
tomar cuidado para que as estacas não permaneçam por muito tempo na água, sob
pena de diminuir sua capacidade de enraizamento, em virtude da anaerobiose. O
período entre a confecção das miniestacas e o estaqueamento no substrato devera
ser o mais reduzido possível.

O processo de enraizamento e formação das mudas de miniestacas segue os

mesmos procedimento da técnica de estaquia, ou seja, estas são colocadas para
enraizamento em casa de vegetação (permanência de 15-30 dias), seguindo
posteriormente para a casa de sombra (permanência em torno de 8 dias), para
aclimatação, e finalmente para pleno sol, para formação final da muda. Os períodos de
permanência das miniestacas em casa de vegetação, conforme descrito, dependem
do clone/espécie envolvido, das condições ambientais de enraizamento, da época do
ano e do seu estado nutricional e fisiológico (XAVIER, 2002).
 Tem sido observado, para alguns clones de Eucalyptus, que não há necessidade
de aplicação de AIB para estimular o enraizamento. No entanto, concentrações em
torno de 2.000 mg L-¹ de AIB tem proporcionado melhores resultados de enraizamento
para clones com maior dificuldade de propagação (WENDLING, 2002). Dessa forma,
recomenda-se que se proceda a testes com diferentes concentrações de AIB para
cada espécie/clone, tipo de material e tempo de aplicação, a fim de definir estratégia
de utilização.

Os tratos culturais de irrigação, nutrição e manejo das miniestacas enraizadas

seguem os mesmos procedimentos adotados no processo de propagação por
estaquia; normalmente, as mudas produzidas estão aptas para plantio no campo a
partir de 70 dias do estaqueamento.

Algumas características têm sido utilizadas no controle da qualidade das mudas

de miniestaquia para fins de plantio comercial, podendo-se citar: altura: 20-40 cm;
diâmetro de colo: > 2mm; idade: 70-150 dias; numero de folhas: ≥ 3 pares de folhas;
sanidade: muda livre de doenças e pragas; aspectos nutricionais: sem sintomas de
desequilíbrio nutricional; rusticidade: grau de amadurecimento suficiente para
sobrevivência no campo; sistema radicular: ativo e bem agregado ao substrato, sem
sintomas de enovelamento e geotropismo negativo; parte aérea: sem danos
mecânicos e com haste única na posição mais vertical possível; e os outros
parâmetros, em função das exigências operacionais e do clone/espécie propagado.

Propagação Clonal de Eucalyptus pela Microestaquia

Com base em recomendação técnica de rejuvenescimento de clones de

Eucalyptus por meio da micropropagação, principalmente para aqueles com maior
dificuldade de enraizamento pela macroestaquia (estaquia convencional e
miniestaquia), a técnica de microestaquia foi desenvolvida buscando aproveitar o
máximo da juvenilidade fisiológica dos propágulos vegetativos, a fim de maximizar o
enraizamento das estacas no processo de propagação clonal (ASSIS et al., 1992;
XAVIER; COMÉRIO, 1996; ASSIS, 1997, 2001).

Dessa forma, no processo de propagação clonal pela microestaquida, o

laboratório funciona como local de rejuvenescimento de clones e posterior produção
de mudas micropropagadas, visando suprir a demanda de material rejuvenescido para
a formação de um jardim clonal, o qual tem sido denominado microjardim clonal. A
partir do microjardim clonal formado, a condução desde segue os mesmos princípios
operacionais de manejo e controle adotados no processo de miniestaquia, assim como
nos processos de enraizamento e formação da muda clonal.

Assim, operacionalmente, a microestaquia diferencia-se da miniestaquia

basicamente pela origem do material que compõe o jardim microclonal (figura 4.6), ou
seja, na microestaquia a origem das microcepas é de mudas micropropagadas e, na
miniestaquia, de mudas propagadas pela macroestaquia (estaquia convencional ou
miniestaquia). Quanto aos aspectos fisiológicos, espera-se que as microcepas tenham
maior grau de juvenilidade e vigor em relação às minicepas, visto estas terem sido
rejuvenescidas pela micropropagação, de modo que no processo de propagação
vegetativa as microestacas, comparativamente às miniestacas, apresentam melhor
resposta em termos de vigor e percentual de enraizamento. Aliado a isso, na
microestaquia, não se recomenda aplicação de AIB.

Resultados de pesquisas que avaliam as técnicas de miniestaquia e

microestaquia de Eucalyptus foram apresentados por Xavier et al. (2001), os quais
concluíram que a técnica de microestaquia mostrou resultados superiores aos obtidos
pela miniestaquia, principalmente em relação ao percentual e à velocidade de
enraizamento de dois clones híbridos de Eucalyptus grandis. Também Titon (2001)
concluiu que clones de Eucaluptus grandis com maior dificuldade de enraizamento
apresentaram maior resposta ao rejuvenescimento in vitro pelo usa da microestaquia,
resultando em maior eficiência no enraizamento, expressa pelo percentual de
enraizamento, velocidade e qualidade do sistema radicular formado.

Figura 4.6 – propagação de clones de eucalyptus pela miniestaquia e

microestaquia. A: muda de estaquia e formação da minicepa para a miniestaquia; B e
C: gema alongada pela micropropagação e muda micropropagada destinada à
formação da microcepa; D: minicepa/microcepa formada; E: miniestaca/microestaca;
F: estaqueamento para enraizamento de miniestaca/microestaca; G: muda de
miniestaca/microestaca formada.

Atualmente, uma das principais limitações à doação da técnica de microestaquia

é a necessidade de mudas rejuvenescidas pela micropropagação, a qual é
dependente, portanto, da existência de uma estrutura física e operacional de um
laboratório de cultura de tecidos, assim como de protocolos de micropropagação
ajustados para diferentes espécies/clones (ASSIS et al., 1992; XAVIER; COMÉRIO,
1996; ASSIS, 1997, 2001). Entretanto, a existência de laboratórios de cultura de
tecidos com protocolos eficientes de micropropagação que promovam o
rejuvenescimento de clones para terceiros torna o usa da microestaquia mais
acessível ao setor florestal brasileiro.

Estaquia x Miniestaquia x Microestaquia em Eucalyptus

Resultados de pesquisas e experiências obtidas no setor produtivo indicam a

ocorrência de variações quanto ao tamanho das cepas, estacas, freqüência de coleta
e produtividade obtida na área de multiplicação vegetativa dos jardins clonais, entre e
dentro das técnicas de estaquia, miniestaquia e microestaquia. O mesmo é observado
quanto ao processo de enraizamento à adoção ou não de regulador para
enraizamento (AIB). Em geral, essas variações observadas são resultantes da técnica
de propagação adotada, decorrente das estacas e do manejo empregado (tabela 4.1).

No caso da miniestaquia e da microestaquia, alem das variações mencionadas,

as diferenças de manejo adotado quanto a controle fitossanitário e aspectos
nutricionais disponíveis são observadas na Tabela 4.1.

O padrão geral das miniestacas e das microestacas confeccionadas pode variar

de forma significativa, em razão da espécie/clone. Geralmente, as miniestacas e
microestacas são confeccionadas levando-se em consideração o tamanho médio (6
cm); outras, porém, são definidas em função do numero de folhas remanescentes, o
que varia de acordo com o tamanho dos internódios e vigor, resultando então em
tamanhos variáveis entre 4 e 8 cm.

Nesse mesmo enfoque, nota-se que as minicepas formadas a partir das

miniestacas, em vez da estaca, resultarão em melhor desempenho no processo de
produção e maior sobrevivência nas coletas sucessivas, bem como fornecerão
miniestacas com maior potencial de enraizamento e formação de mudas por
miniestaquia, tanto qualitativa quanto quantitativamente.

Em termos gerais, como miniestaquia e microestaquia são técnicas

desenvolvidas recentemente, ainda se dispõe de poucos estudos científicos que
avaliem suas vantagens e desvantagens ou limitações como métodos de propagação
vegetativa. No entanto, algumas vantagens em relação à estaquia convencional são
conhecidas: 1) redução dos efeitos de variações sazonais no enraizamento das
miniestacas/microestacas; 2) maior facilidade no controle de patógenos, bem como
das condições nutricionais e hídricas no jardim; 3) maior produtividade, uma vez que
as operações de manejo do jardim, coleta e confecção de miniestacas/microestacas
são mais fáceis e rápidas de serem executadas; 4) maior produção de propágulos
(miniestacas/microestacas) por unidade de área e em melhor unidade de tempo; 5)
possibilidade da coleta das miniestacas/microestacas ser realizada em qualquer
horário do dia; 6) melhor resposta ao enraizamento das miniestacas/microestacas em
termos de velocidade e de qualidade do sistema radicular (vigor, uniformidade, volume
e arquitetura); 7) formação da muda em menor tempo, resultando na redução de
investimentos, principalmente estruturas de casa de vegetação, devido ao menos
tempo de permanência para enraizamento; e 8) necessidade de reguladores e
crescimento para enraizamento em menores concentrações ou mesmo a não
utilização destes para alguns clones.

Em se tratando de desvantagens de miniestaquia/microestaquia em relação à

estaquia convencional, podem-se citar: 1) maior sensibilidade das
miniestacas/microestacas às condições ambientais; 2) necessidade de maior rapidez
entre a coleta dos propágulos no jardim e a sua estaquia em casa de vegetação,
necessitando-se de um cronograma de produção mais bem elaborado; 3) necessidade
de maior qualificação da mão-de-obra; e 4) maior controle sobre as atividades de
manejo, sobretudo quanto aos aspectos nutricionais e hídricos, das mudas, visto a
maior sensibilidade destas.

No que se refere à miniestaquia em relação a microestaquia, espera=se que

esta proporcione melhores resultados no processo de propagação clonal; entretanto,
como principais desvantagens têm-se as limitações quanto à obtenção de material
rejuvenescido em laboratório de micropropagação, bem como o maior tempo de
obtenção de mudas micropropagadas para formação do microjardim clonal.

Aplicabilidade na Clonagem de Eucalyptus

No novo cenário florestal que se apresenta atualmente, toda tecnologia que

facilita ou ate mesmo possa viabilizar comercialmente a produção de determinados
clones é atrativa. Nesse sentido, a biotecnologia tem apresentado oportunidade na
clonagem massal de genótipos superiores – base para o processo de transformação
genética -, no incremento de programas de melhoramento floresta, entre outras
aplicações.
 O primeiro caso é o que mais tem atraído a atenção, principalmente em se
tratando de clones de difícil enraizamento pela técnica de estaquia convencional e
miniestaquia. Nessa situação, a micropropagação tem sido considerada uma técnica
eficiente no rejuvenescimento de clones, tornando-os aptos economicamente ao
processo de produção de mudas. Por outro lado, a produção comercial de mudas de
clones pela micropropagação ainda não se justificou, técnica e economicamente.

O rejuvenescimento de clones torna-se importante, pelo fato de o processo de

maturação ser um fenômeno que geralmente afeta espécies lenhosas de acordo com
o seu envelhecimento ontogenético, em que uma das mais importantes consequencias
para a clonagem é a redução ou, até mesmo, a perda da capacidade de enraizamento
que se verifica em plantas adultas (GOMES, 1987; GREENWOOD; HUTCHISON
1993; LIBBRY; AHUJA, 1993). Com base nessas constatações e visto o processo de
seleção de clones em Eucalyptus ocorrer basicamente na fase adulta, o enraizamento
de propágulos vegetativo provenientes dessas plantas constitui-se em um grande
desafio.

Na figura 4.7 é apresentada, de forma resumida, uma tendência evolutiva nos

processos de produção massal de mudas do gênero Eucalyptus, por meio da
propagação vegetativa. Assim, pode-se observar incremento da participação da
biotecnologia, mais especificamente da micropropagação, a cada etapa do avanço da
pesquisa e implementação em nível operacional. No entanto, vale salientar que a
micropropagação via embriogênese somática para Eucalyptus ainda carece de
desenvolvimento cientifico quanto à sua aplicação no rejuvenescimento de clones
selecionados e como técnica de propagação massal por meio de embriões
encapsulados, chamado de ‘’sementes sintéticas’’.

Figura 4.7 – Evolução e tendências na propagação clonal de Eucalyptus.

A alternativa da miniestaquia precedendo a microestaquia tem sido considerada

uma boa estratégia, em razão de a primeira não necessitar de estruturas de
laboratório de cultura de tecidos (micropropagação), reduzindo, portanto, os custos na
produção de mudas. Isso é justificado em algumas situações, em que a estaquia
seriada, por meio da técnica de miniestaquia, pode apresentar resultados eficientes
tanto quanto os da microestaquia, ou nos casos em que a diferença entre as duas
técnicas não compensa o investimento da microestaquia.

Em outras situações, a miniestaquia mostra-se como opção em certos clones

que apresentam dificuldades no cultivo in vitro (recalcitrância, necessidades de ajuste
de meio de cultura etc.), inviabilizando sua multiplicação vegetativa pela
micropropagação. Portanto, cabe ao técnico avaliar qual a melhor opção para sua
situação, pois cada técnica apresenta vantagens e dificuldade, associadas ao custo e
tempo necessários para alcançar os objetivos propostos. Deve-se considerar que
certos clones são de difícil propagação vegetativa e o rejuvenescimento pode não
resolver eficientemente o problema da produção de mudas.

Por outro lado, existem clones com grande facilidade de propagação vegetativa
cojos procedimentos, mais simples e de menor custo, como a estaquia e miniestaquia,
podem ser suficientes para atender ao processo de produção massal de mudas de
Eucalyptus.

Vale salientar que resultados de um viveiro e campo são extremamente

importantes, visando a confirmação da melhor estratégia a ser adotada, pois cada
empresa apresenta um conjunto de clones e condições ambientais próprias,
associadas a uma condição operacional e orçamentária.

Estaquia na Clonagem da Seringuei (Hevea spp.)

Na propagação vegetativa por estaquia de arvores selecionadas de seringueira,

Santos (1986) obteve resultados de enraizamento superior a 60% para estacas
obtidas a partir de material juvenil, sem a utilização de reguladores de crescimento.
Em termos de estaquia a partir de material vegetativo adulto de clones selecionados, a
seringueira tem sido considerada uma planta de difícil enraizamento. De modo geral, a
falta de resposta ao enraizamento das estacas de material adulto, os problemas com a
ausência de raiz pivotante e a formação de um sistema radicular adventício bastante
superficial têm limitado o uso da estaquia como técnica de propagação de mudas
comerciais de clones de seringueira (SANTOS, 1986; PEREIRA, 1992).

Segundo Bernardes (2006)¹, houve tentativas de utilização comercial da estaquia

para produção de mudas de seringueira; entretanto, diante do fato de somente serem
obtidos resultados satisfatórios de enraizamento para materiais juvenis, ainda resta a
necessidade de desenvolvimento da técnica para materiais adultos selecionados para
que ela se torne de uso comercial. Além disso, diante da dificuldade de encontrar um
clone que reúne as características de interesse comercial, a opção pela propagação
vegetativa via enxertia tem sido preferida, por possibilitar reunir dois ou três clones em
uma única planta.
 Estaquia na clonagem de Pinus

Em se tratando de espécies do gênero Pinus, a propagação vegetativa por

estaquia tem sido estudada há várias décadas. De modo geral, as espécies dese
gênero são classificadas como de difícil enraizamento, chegando este a ser impossível
em um grande número delas quando utilizado material não proveniente de mudas
(juvenil). No entanto espécies de Pinus tropicais, como Pinus caribeae e Pinus
oocarpa, têm apresentado índices de enraizamento satisfatórios com o uso de material
juvenil. Furlan (2002), por exemplo, obteve 90$ de enraizamento para P. caribaea var.
hondurensis conduzido em minijardim clonal no sistema hidropônico.

Em programas das árvores superiores ocorre com plantas em idade de rotação

comercial, dificultando o processo de resgate vegetativo pelo enraizamento das
estacas, em razão do grau de maturidade da planta selecionada. A transição da fase
juvenil para a adulta é bastante abrupta em coníferas, uma vez que estacas caulinares
de plantas acima de um ano mostram redução na competência para o enraizamento.
Segundo Diaz-Sala et al. (1996), em Pinus taeda essa diminuição não está
relacionada com a disponibilidade de auxina no local de formação de raízes ou com o
transporte de auxina, mas com a competência das células em iniciar divisões celulares
em resposta à auxina.

Um dos entraves no enraizamento de estacas de Pinus é a incapacidade de

rebrota das cepas após o corte raso, característica inerente à maioria das espécies
plantadas no Brasil. Além disso, estas não respondem a outras técnicas para a
indução de brotações basais, como a anelamento e o tratamento com fogo na base.
Assim, o resgate vegetativo de árvores superiores tem sido realizado com material
maduro da copa, por intermédio da enxertia. Mesmo com condições especiais de
fertilização e irrigação, o material adulto enxertado não fornece brotações com boa
capacidade de enraizamento das estacas. As poucas estacas que conseguem
enraizar apresentam, na maioria das vezes, crescimento plagiotrópico característico
da fase adulta. Esse efeito é mais eminente de acordo com o local( altura) da retirada
do galho na copa para enxertia, desse modo, tem sido recomendado reverter o grau
de maturação das brotações para aumentar o índice de enraizamento e para maior
determinação do crescimento ortotrópico das mudas propagadas por estaquia.

Entre os vários métodos de rejuvenescimento que podem ser empregados para

Pinus, tem se destacado a enxertia seriada, principalmente para as espécies tropicais.
Resultados satisfatórios em termos de enraizamento têm sido obtidos com Pinus
oocarpa e Pinus caribeae,enquanto com P. taeda esse procedimento não tem sido
suficiente para melhorar os índices de enraizamento das estacas.

Uma alternativa indicada para aumentar a eficiência da enxertia seriada em

Pinus tem sido a utilização da microenxertia sobre porta-enxertos germinados in vitro,
visto a maior juvenilidade destes, juntamente com as condições fisiológicas e
nutricionais mais adequadas. Além disso, não haveria grandes problemas de
contaminação e recalcitrância, comuns no cultivo in vitro, de gemas de Pinus, o que
tem inviabilizado o rejuvenescimento de gemas por cultura de tecidos. No entanto,
esses métodos de rejuvenescimento ainda não estão bem estabelecidos para Pinus o
que os silvicultores a trabalhar com os materiais em fase juvenil, antes de a maturação
ocorrer.

Como alternativa na clonagem de Pinus por meio do enraizamento de

miniestacas, tem sido adotada a multiplicação de famílias selecionadas ainda na fase
juvenil, ou seja, a partir de mudas de sementes ainda na fase juvenil. Dessa forma,
com base nas informações de famílias avaliadas em testes de progênies, são
identificados os melhores cruzamentos e, destes, são produzidas mudas como fonte
de micicepas, visando a produção de miniestacas para o processo de produção de
mudas por minestaquia. Esse sistema de propagação de famílias superiores Pinus por
miniestaquia permite: multiplicação de materiais superiores com qualidade insuficiente
de sementes; estabelecimento de jardins clonais mais eficientes; aumento da
uniformidade nos plantios; propagação de mudas oriundas de sementes híbridas;
redução da polinização massal controlada; aumento da propagação de vários
genótipos.

Além do inconveniente de não se conseguir clonar um genótipo adulto

específico, o qual permitira melhor as condições de propagação (solução nutritiva,
tempo de casa de vegetação, qualidade dos brotos etc.) e de plantio (adubação,
nutrição, manejo etc.), deve-se ter cuidado com a manutenção da variabilidade das
mudas propagadas cuidado com a manutenção da variabilidade das mudas
propagadas vegetativamente por miniestaquia, principalmente nos viveiros onde os
minijardins são retroalimentados com mudas enraizadas do mesmo lote de sementes
para o qual foi estabelecido o minijardim. Isso é decorrente do fato de na propagação
vegetativa de famílias ocorrer a clonagem de vários materiais onde podem existir
genótipos com maior capacidade de enraizamento do que outros, o que levaria a uma
maior multiplicação destes sem a garantia de seu desempenho individual no campo, já
que a seleção foi realizada em nível de famílias e não em nível de indivíduos.
 Uma maneira de evitar esse problema seria a formação do minijardim somente
com mudas originárias de semente ou com o monitoramento da variabilidade das
mudas com uso de marcadores moleculares antes do estabelecimento das plantas
propagadas vegetativamente no minijardim.

Outra estratégia para formação do minijardim clonal é o uso de mudas

propagadas por embriogênese somáticos. Nesse caso, a estratégia tem sido utilizar
embriões somáticos obtidos de cones imaturos; destes, uma parte é criopreservada e
da outra são obtidas mudas para testes de campo. Após a avaliação de campo, a
partir dos clones selecionados, são resgatados os embriões criopreservados, os quais
serão fonte de material vegetativo para composição do minijardim. Dessa forma, a
adoção dessa técnica permite a formação do minijardim com material juvenil. Entre
tanto, até o presente momento, essa estratégia ainda carece de maior refinamento
para maior eficiência de resgate e clonagem via embriogênese somática, além dos
elevados custos envolvidos.

Em se tratando da clonagem em nível de famílias selecionadas (propágulos

juvenis), as tecnologias desenvolvidas indicam a viabilidade do sistema de
enraizamento, propiciando benefícios consideráveis à implementação da silvicultura
clonal de Pinus. Segundo Assis(2001), as espécies de Pinus elliotti e Pinus taeda
apresentam bons resultados – com enraizamento de 85% e 76%, respectivamente –
quando derivadas de material juvenil. Resultados semelhantes são relatados por
Rocha e Niella(2001) no Nordeste da Argentina. No entanto, ainda existem alguns
impedimentos para tornar a propagação vegetativa de Pinus comercialmente viável.
De acordo com Alcântara(2005), miniestacas juvenis de Pinus taeda apresentam
enraizamento heterogêneo nas diferentes estações do ano, sendo o inverno a época
mais favorável para a sua coleta, o que pode inviabilizar a produção durante o ano.

Estaquia na Clonagem de Espécies Nativas

Pouco se conhece sobre a propagação vegetativa pela técnica de enraizamento

de estacas e o resgate vegetativo de arvores selecionadas de espécies florestais
nativas brasileiras. A maior parte da produção de mudas dessas espécies ainda é por
meio de sementes, e muitas destas ainda apresentam algum tipo de limitação quanto
à produção de mudas para atender à demanda comercial.
 Para espécies nativas, o início do processo de clonagem das árvores
selecionadas constitui-se em um grande desafio, uma vez que, de forma contraria às
espécies de Eucalyptus, na maioria das vezes não é possível a adoção da decepa da
arvore selecionada para o resgate do material vegetativo com características mais
juvenis e propicio ao enraizamento pelo processo de estaquia.

Ao longo dos últimos anos, vários trabalhos vêm sendo realizados visando o
desenvolvimento da estaquia para diferetes espécies florestais nativas do Brasil, como
erva-mate (Ilex paraguariensis), pinheiro-brasileiro (Araucária angustifólia), pau-
brasil(Caesalpinia echinata), aroeira( Schinus terebinthifolius), pau-de-leite (Sapium
glandulatum), fícus (Ficus enormis), corticeira-do-banhado (Erythrina crista-galli),
corteceira-do-mato(Erythrina falcata), pau-de-sangue (Croton celtidifolius), araticum-
de-porco (Rollinia rugulosa), cedro-rosa (Cedrela fissilis), mogno (Swietenia
macrophylla), angico-vermelho (Anadenanthera macrocarpa), entre outras. De modo
geral, os estudos têm-se concentrado em matérias juvenis, na definição da
concentração de reguladores de crescimento, do tipo de substrato, da época de ano
resgate das matrizes, alem da avaliação da potencialidade da miniestaquia. No
entanto, os resultados obtidos para enraizamento são bastante variáveis entre as
espécies estudas: algumas apresentam enraizamento acima de 90%,enquanto outras
simplesmente não enraízam.

A utilização da técnica de miniestaquia como método de propagação vegetativa

vem sendo estudada por vários autores, como Gratti(2002), santos(2002), Xavier e
Santos(2002), Wendling e Souza Júnior(2003), Xavier et al. (2003ª), Souza Junior et
al. (2005) e Wendling et al. (2005). De modo geral, os índices de enraizamento
oscilam de acordo com os estados de maturação das brotações utilizadas na formação
das miniestacas. Os estudos têm indicado que a multiplicação vegetativa por
miniestaquia a partir de material juvenil de origem seminal, para algumas espécies
florestais nativas, é tecnicamente viável, tornando-se uma alternativa para a produção
de mudas destas durante todo ano, sobretudo nas situações em que a semente é
insumo limitante. Como exemplo, a eficiência da miniestaquia a partir de material
juvenil de cedro-rosa (Cedrela fissilis) foi comprovada por avier et al. (2003b).

Em relação à propagação vegetativa por miniestaquia a partir de arvores

selecionadas na idade adulta, ainda percebe-se grande dificuldade em estabelecer um
processo viável de propagação vegetativa pela miniestaquia. Xavier e Santos (200),
por exemplo, obtiveram para mogno, cedro-rosa, jequitibá e angico-vermelho
enraizamento abaixo de 5%, o qual foi atribuído ao provável elevado grau de
maturação do material utilizado, visto que todas as árvores selecionadas tinham idade
superior a 20 anos.

Os relatos da literatura a respeito da propagação vegetativa de espécies nativas

pela estaquia ainda são muito superficiais, não fornecendo tecnologia suficiente para o
desenvolvimento de uma silvicultura clonal delas. Mesmo para espécies com interesse
comercial, como é o caso da erva-mate, a propagação por estaquia é um tema de
interesse desde a década de 1930; vários autores mencionam a dificuldade em
encontrar uma técnica adequada. Segundo wendling (2004) os protocolos de estaquia
desenvolvidos para a propagação vegetativa dessas espécies têm apresentado uma
serie de limitações para sua adoção em escala comercial, principalmente no que se
refere a métodos eficientes de rejuvenescimento de material adulto, desenvolvimento
das técnicas de manejo do ambiente de propagação, manejo das estacas pós-
enraizamento em relação à nutrição, sistemas de enraizamento e condução que não
necessitem de transplante das estacas enraizadas, alem do baixo vigor do sistema
radicular formado.
 CAPÍTULO 5
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ESPÉCIES FLORESTAIS

Os progressos obtidos nas últimas décadas nas áreas de biologia molecular e

genética têm permitido um avanço considerável da biotecnlogia, merecendo destaque
na área florestal, principalmente aquela relacionada com a propagação in vitro com a
engenharia genética.
Biotecnologia compreende muitas técnicas que usam organismos vivos para produzir
ou modificar um produto, para melhorar plantas ou animais ou para desenvolver
microorganismos para usos específicos (HAINES, 1994). A biotecnologia é o
desenvolvimento de produtos por processos biológicos, utilizando-se a tecnologia do
DNA recombinante, cultura de células e tecidos etc., uso industrial para a produção de
álcool ou cultura de tecidos para extração de produtos secundários (BORÉM, 1997).
Entre as várias técnicas biotecnológicas, a propagação de plantas in vitro tem atraído
a atenção dos pesquisadores desde o inicio do século XX. No Brasil, os primeiros
trabalhos foram desenvolvidos na década de 1950, com a criação de vários
laboratórios de cultura de tecidos no período de 1970 a 1980 (TORRES et al., 1998).
Entre as várias técnicas de cultura de tecidos de relevada importância, relacionam-se
a micropropagação, cultura de embriões, polinização in vitro, cultura de protoplastos e
microenxertia. No entanto, na área florestal, a micropropagação tem sido a técnica
mais difundida e com aplicações práticas comprovadas. Apesar de ser recente na área
florestal, encontra-se embutida nos programas de melhoramento que, na maioria das
vezes, objetivam a maximização ou manutenção do valor genético do clone a ser
propagado, permitindo, assim, acelerar os métodos convencionais de propagação
vegetativa, entre outras finalidades.
Entre as varias aplicações da cultura de tecidos na área florestal, destacam-se
aquelas relacionadas com: conservação de gemoplasma in vitro; aceleração dos
programas de melhoramento, pela multiplicação de clones superiores, visando a
produção de mudas; rejuvenescimento de clones selecionados na fase adulta;
potencial de obtenção de sementes sintéticas (embriões somáticos); potencial de
introgressão de genes de interesse para a espécie-alvo por meio de polinização in
vitro, cultura de embriões, fusão de protoplastos; limpeza clonal, buscando a obtenção
de culturas sem a presença de vírus e bactérias indesejáveis na propagação in vitro; e
possibilidade de patenteamento de processos/materiais obtidos por meio da
biotecnologia, além de constituir base para outras técnicas biotecnológicas, como a
transformação genética.
Em vista das potencialidades de aplicação das técnicas de cultura de tecidos e células
em espécies florestais, inúmeros trabalhos têm sido desenvolvidos no intuito de tornar
essa tecnologia acessível e economicamente viável. No entanto, algumas
desvantagens e dificuldades desse processo podem ser enumeradas: alto
investimento em instalação e treinamento de pessoal;necessidade de desenvolvimento
de protocolos diferenciados para diferentes espécies ou grupos de clones; ocorrência
de recalcitrância das culturas à propagação in vitro de espécies lenhosas; e risco da
contaminação das cultuaras por microorganismos.
O desenvolvimento da cultura de tecidos requer conhecimento multidisciplinar, oriundo
da fisiologia, bioquímica, nutrição, genética bem como de outras áreas, de acordo com
a técnica e os objetivos a serem alcançados.

Laboratório de Cultura de Tecidos

A organização de um laboratório de cultura de tecidos de planas depende de suas

finalidades, recurso financeiro disponível, estrutura física e do número de
pesquisadores e funcionários que nele vão trabalhar. Assim, um laboratório destinado
exclusivamente à micropropagação, com base em protocolos estabelecidos, pode ser
implantado de forma mais rudimentar e com menor investimento em relação àquele
que realiza pesquisa com diferentes sistemas, em que os aspectos bioquímicos,
genéticos, estruturais, entre outros, dependem de várias outras facilidades
laboratoriais para atingir os objetivos desejados.
Um dos principais objetivos no planejamento de um laboratório de cultura de tecidos é
o atendimento ao critério de obtenção de alto grau de assepsia, segundo o qual as
plantas deverão desenvolver-se, preferencialmente, na ausência absoluta de
quaisquer microorganismos.
No planejamento de um laboratório, uma consideração é quanto a minimização da
possibilidade de contaminação acidental. Assim, a divisão dele em compartimentos, de
maneira que as diferentes operações sejam executadas em ambientes separados e ao
mesmo tempo interligados, deve ser contemplada.
Preferencialmente, um laboratório de cultura de tecidos de plantas deverá ser
constituído de uma sala de preparação de meios, sala de transferências, sala de
incubação de culturas e uma sala de lavagem e esterilização; a comunicação entre as
salas deve obedecer à facilidade de movimentação das culturas e de pessoal, bem
como a minimização da sua contaminação acidental.
Sala de preparo de meio de cultura: constitui-se na dependência do laboratório de
maior circulação de pessoal, principalmente em razão de as diversas atividades do
laboratório serem realizadas nessa área. É onde se efetuam as preparações de meio
de cultura e de soluções diversas, necessárias para o cultivo in vitro. Normalmente,
nesta sala encontram-se disponíveis os reagentes, equipamentos e utensílios diversos
para atender às atividades de cultura de tecidos (figura 5.1).

Sala de transferência ou inoculação: nesta área realizam-se atividades inerentes à

excisão, inoculação e transferência das plantas cultivadas in vitro para meio de cultura.
Assim, é recomendado que a atividade seja realizada em um local o mais asséptico
possível e com o mínimo de circulação de pessoal.Isso visa minimizar a possibilidade
de contaminação acidental das culturas por microorganismos diversos, durante o
processo de transferência dos explantes para novos meios de cultura e, ou, condições
de cultivo. Assim, a sala de transferências deve ser, preferencialmente, isolada e com
entrada controlada de pessoas, localizada o mais próximo possível da sala de
incubação. Em algumas situações em que ocorrem limitações do espaço, as
transferências são realizadas dentro da própria sala de incubação. Normalmente, esta
sala é composta por câmeras de fluxo laminar para transferência de cultuaras e
estantes para armazenamento temporário do meio de cultura autoclavado, além de
outros utensílios necessários a essa atividade (figura 5.2).
Sala de incubação ou crescimento: esta área é destinada ao desenvolvimento e
crescimento das culturas de acordo com o propósito de cultivo in vitro (figura 5.3).
Assim, é constituída, principalmente, por prateleiras para acomodação dos recipientes
de cultura,sistema de controle ambiental (temperatura, luz e umidade), agitadores
orbitais para condução de algumas culturas em meio líquido e área destinada ao
cultivo em condições de escuro total. Nas condições de cultura, normalmente, o
fotoperíodo é mantido em 16 horas de luz, por meio de comutadores eletrônicos, com
intensidade luminosa em torno de 20 a 70 mmol m-² s-¹.
A temperatura desta sala é mantida, em geral, em torno de 27°C, por meio de ar
condicionado, visto ser essa condição adequada à maioria das espécies de plantas de
clima tropical. Quanto à umidade relativa do ar dentro da sala de crescimento, esta
deve ser mantida entre 60 e 70%. O uso de desumidificadores somente é necessário
em casos em que a umidade relativa do ar da sala mostra-se prejudicial ao cultivo.

Sala de lavagem e esterilização: também denominada sala de limpeza, destina-se a

descarte de meios de cultura utilizados e de material vegetal descartado na
transferência, lavagem de vidrarias em geral, bem como a autoclavagem desses
materiais para eliminação de microorganismos. A esterilização de vidraria, meio de
cultura e utensílios que serão utilizados na transferência de culturas deve ser realizada
de modo que evite resíduos que possam ser fonte de inóculo e que venham a ser foco
de contaminação das culturas. Pela sua natureza,esta sala deve ser alocada o mais
distante possível da sala de incubação, visando a prevenção da contaminação das
culturas.
Outras estruturas: também deve ser observada a alocação de um almoxarifado e
áreas destinadas à propagação das plantas nas condições ex vitro, como casa de
vegetação e área de aclimatação de mudas. Deve-se prever espaço para a área
administrativa do laboratório, onde são alocados um escritório, sanitário e cantina, os
quais são instalações necessárias para o uso do pessoal envolvido com o laboratório.
Na figura 5.4 é apresentado um exemplo da distribuição das dependências de um
laboratório de cultura de tecidos destinado a produção de mudas micropropagadas
pela proliferação de gemas axilares de espécies lenhosas. Na distribuição das
dependências foram observadas as questões de operacionalidade e minimização de
riscos de contaminações acidentais, bem como a inclusão de janelas de vidro, visando
facilidade de visitação do local sem a necessidade de entrar nas dependências do
laboratório.
Entre os vários equipamentos necessários às atividades de cultura de tecidos, têm-se:
altoclave, câmara de fluxo laminar, balança de precisão e analítica, estufa de
secagem, destilador e deionizador de água, forno de micro-ondas, aparelho de banho-
maria, aquecedor de água, lavador de pipeta, freezer, refrigerador, peagômetro,
agitador magnético, dessecador, bico de Bunsen, microscópico estereoscópico,
agitador orbital, entre outros. Logicamente, essa relação de equipamentos é
dependente da estrutura do laboratório, de seus propósitos, recursos financeiros
disponíveis e pessoal envolvido.
Na condução e manipulações gerais no laboratório, os frascos de cultura de diversas
dimensões, suporte para tubos de ensaio, frascos para reagentes e vidrarias de
laboratório são necessários; a maior ou menor demanda para cada um depende do
tipo de atividade principal do laboratório.
Em geral, a estrutura do laboratório e seus equipamentos são dependentes dos
objetos a serem alcançados pela cultura de tecidos, das técnicas adotadas, do pessoal
envolvido, do grau de refinamento e facilidade a ser obtido nas atividades, bem como
dos recursos financeiros e da infraestrutura disponível.
 Figura 5.4 – Exemplo ilustrativo da distribuição das dependências de um
laboratório de cultura de tecidos destinado à produção de mudas micropropagadas de
espécies florestais. (-)janelas de vidro.

Meios Nutritivos

Os meios nutritivos utilizados em culturas de células, tecidos e órgãos de plantas

possuem como principal função fornecer substâncias essenciais para o crescimento e
controlar, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro (CALDAS et al.,
1998).
Dessa forma, diversos estudos foram e estão sendo desenvolvidos com o intuito de
atender às especificidades das mais variadas espécies de plantas e tipo de cultura, e
várias composições de meio de cultura podem ser encontradas na literatura.
Os meios de cultura, de forma geral, constituem-se de água, macro e micronutrientes,
carboidratos, vitaminas, aditivos diversos, agentes solidificantes, e reguladores de
crescimento.
Água: é o componente utilizado em maior quantidade na preparação dos meios de
cultura, cuja fonte dever ser bem definida. Assim, em um laboratório de cultura de
tecidos, deve-se ter disponível água filtrada, destilada e deionizada, buscando obter a
purificação necessária ao tipo de meio de cultura e precisão experimental desejada.
Macronutrientes: são os elementos minerais exigidos em maior quantidade pelas
plantas, os quais são fornecidos na forma de sais inorgânicos, constituídos por
nitrogênio (N), fósforo (P), potássio (K), cálcio (Ca), magnésio (Mg) e enxofre (S). A
absorção desses nutrientes pelo explante é diretamente influenciada pela sua
concentração e pela concentração dos demais, pelo pH do meio de cultura, pela
temperatura, pela forma de fornecimento e condição fisiológica do explante.
Micronutrientes: os principais micronutrientes presentes em meio de cultura são boro
(B), molibdênio (Mo), cobalto (Co), manganês (Mn), Zinco (Zn), cobre (Cu), ferro (Fe),
sódio (Na) e cloro (Cl). Alguns desses elementos podem também ser fornecidos por
meio de quelatos (EDTA). Outros micronutrientes, como o silício (Si) e níquel (Ni), não
têm sido incluídos nos meios de cultura em vista de seus efeitos ainda não terem sido
comprovados.
Carboidratos: na condição in vitro, as plantas normalmente crescem em umacondição
heterotrófica, dependendo de uma fonte externa de energia. Neste sentido, os meios
de cultura compõe-se de uma fonte de carboidrato, a qual fornece energia e
esqueletos de carbono utilizados na biossíntese de polissacarídeos, aminoácidos e
proteínas. Dentre as fontes de carboidrato mais comuns em meios de cultura, a
sacarose é a mais utilizada.
Vitaminas: algumas vitaminas têm sido adicionadas aos meios de cultura, embora os
efeitos benéficos delas sejam particulares para cada espécie e tipo de explante
utilizado na propagação in vitro. O ácido nicotínico, piridoxina, tiamina e o mioisonitol
têm sido os mais utilizados nos meios de cultura.
Outros aditivos: muitas substâncias foram e são ainda testadas em meios de cultura,
buscando maximizar a propagação in vitro de determinadas culturas. Assim, algumas
misturas complexas, como a água de coco e o extrato de levedura, têm sido incluídas
no meio de cultura. Alguns aminoácidos, como glicina, glutamina e riboflavina, também
têm sido utilizados. Antibióticos e fungicidas também podem ser incluídos nos meios
de cultura para controle de contaminações microbianas provenientes, muitas vezes, de
infecções sistêmicas das plantas matrizes. No controle de oxidação por compostos
fenólicos, antioxidantes, como o ácido cítrico, ácido ascórbico, PVP
(polivinilpirrolidona), entre outros, têm sido incluídos no preparo do meio de cultura
como alternativa para contornar esse problema. O carvão ativado constitui-se em outro
aditivo bastante utilizado nos meios de cultura, tendo como ações principais a
adsorção de substâncias tóxicas presentes no meio e, em algumas condições,
melhorar e regular o crescimento da planta in vitro.
Agentes gelificantes: os meios de cultura podem ser líquidos ou sólidos. Os meios
líquidos normalmente são de preparo mais fácil e baratos, além de proporcionarem
maior homogeneidade dos ingredientes, em relação ao meio sólido. No entanto,
dependem de algum tipo de suporte (“pontes” de papel filtro) ou de agitação para obter
a oxigenação necessária ao crescimento do explante. Em relação aos meios
semissólidos ou sólidos, normalmente estes são gelificados com ágar, polissacarídeo
extraído de algas marinhas, sendo a consistência do meio em função da concentração
utilizada (normalmente na faixa de 0,4% a 1% p/v para cultura de plantas), do pH do
meio, da concentração dos sais e da presença de certas substâncias, como carvão
ativado. Outros agentes gelificantes, como gomas produzidas por bactérias, têm sido
usados, a exemplo do Gelrite™ e Gel-Gro™, os quais são utilizados em menor
concentração em relação ao ágar, além de proporcionar um meio de cultura mais
transparente. A preferência por um ou outro agente gelificante vai depender da
espécie de planta, do custo, das condições in vitro desejadas e do nível de pureza do
produto.
Reguladores de crescimento: são de grande importância no meio de cultura, dada
sua atuação no crescimento e controle, em grande parte, do padrão de
desenvolvimento in vitro das plantas. A utilização e os teores de cada regulador variam
em função dos objetivos da cultura, da espécie e do tipo de explante cultivado. Entre
as várias classes conhecidas de reguladores de crescimento, as auxinas e citocininas
são, sem dúvida, as mais importantes na regulação do crescimento e morfogênese na
cultura de tecidos e órgãos vegetais. As auxinas estão envolvidas na divisão e
alongamento celular e na síntese de parede celular, sendo a principal auxina natural o
AIA (ácido indol-3-acético). Entretanto, devido a essa auxina natural o AIA (ácido
naftalenoacético), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e o AIB (ácidoindol-butírico).
Em relação à citocinina, uma das principais funções desse regulador de crescimento
na cultura de tecidos é a indução de gemas adventícias, bem como a proliferação de
gemas axilares pela supressão da dominância apical, como também a formação de
calos e outros processos envolvendo a divisão celular. As citocininas comumente
aplicadas são BAP (6-benzilaminopurina), cinetina (6-furfurilaminopurina), TDZ
(thidiazuron), 2-iP (isopentiniladenina) e zeatina ( -[4-hidroxi-3-metilbut-2entil]),
sendo as duas últimas citocininas naturais (BONGA; VONM ADERKAS, 1992).
Normalmente, o tipo de citocinina e a sua concentração são os fatores que mais
influenciam o sucesso da multiplicação in vitro, sendo as concentrações de auxinas
frequentemente baixas, se comparadas com as de citocininas, para manter um
balanço auxina/citocinina menor que 1 (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
O modo de interação entre auxinas e citocininas é frequentemente dependente da
espécie da planta e do tipo de tecido utilizado na cultura. A maneira complexa com
que os reguladores de crescimento e as células interagem sugere que, se o tecido não
está em um estádios responsivo, não ocorre resposta à sua aplicação. A ausência na
resposta a um regulador de crescimento é freqüentemente um problema maior quando
explantes de plantas adultas são utilizadas, em comparação com material juvenil
(BONGA; VON ADERKAS, 1992). Normalmente, a definição do tipo e do balanço
hormonal citocinina/auxina para uma determinada resposta morfogenética do tecido ou
órgão em cultura in vitro constitui-se em uma das primeiras etapas na propagação por
cultura de tecidos.
Na tabela 5.1 estão relacionados alguns meios de cultura usados no cultivo de
espécies florestais, onde variações destes são as mais diversas possíveis, na tentativa
de adequá-los à planta em cultivo. Entre eles, o meio de cultura MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962),assim como suas variações, tem sido o mais adotado nos trabalhos de
pesquisa/desenvolvimento envolvendo espécies lenhosas, como o Eucalyptus.
Quanto a preparação dos meios de cultura, diferentes procedimentos podem ser
adotados. O uso de soluções-estoque, como a de micronutrientes, mil vezes nmaior
que a concentração final permite maior flexibilidade e praticidade em situações de uso
de meio de cultura com concentrações variadas, como na pesquisa. Em outras
situações, pode-se adotar a preparação de meio em concentração dez vezes maior
que a concentração final e porções conservadas no congelador em sacos plásticos
divididas nas quantidades desejadas.
Atualmente, os meios nutritivos mais utilizados na cultura de tecidos de plantas podem
ser encontrados prontos para uso, disponíveis nas mais diferentes concentrações e
quantidades. Esse tipo de meio é adequado nas situações de produção massal de
plantas que têm definidas as concentrações e componentes do meio.
Outro fator importante para o meio de cultura é o controle do pH, pois este influencia
diretamente a solubilidade dos sais, a absorção de nutrientes e reguladores de
crescimento, além de afetar a eficiência do agente solidificante. Para as culturas in
vitro de plantas, o pH em torno de 5,6 tem sido o mais utilizado.
Tabela 5.1 – Composição dos meios decultura MS, JADS, B5, WHITE, QLP e WPM, comumente utilizados na área florestal

FÓRMULA CONCENTRAÇÃO (mg. )

COMPOSTO
QUÍMICA MS JADS B5 WHITE QLP WPM
MACRONUTRIENTES
Sulfato de Amônia (NH4)2SO4 - - 134,0 - - -
Nitrato de Amônia NH4NO3 1650,0 324,0 - - 400 400
Nitrato de Potássio KNO3 1900,0 809,0 2500,0 80,0 1800 -
Cloreto de Cálcio CaCl2.2H2O 440 - 150 - - 96
Sulfato de Potássio K2SO4 - - - - - 990
Nitrato de Cálcio Ca(NO3)2.4H2O - 1181,0 - 300,0 200 556
Fosfato de Potássio KH2PO4 170,0 408,0 - - 2700 170
Sulfato de Magnésio MgSO4.7H2O 370,0 739,5 250,0 720,0 3600 370
Fosfato de Sódio NaH2PO4.H2O - - 150,0 16,5 - -
Sulfato de Sódio Na2SO4 - - - 200,0 - -

MICRONUTRIENTES
Ácido Bórico H3BO3 6,2 3,1 3,0 1,5 1000 6,2
Molibdato de Sódio NaMoO4.2H2O 0,25 0,15 0,25 - 30 0,25
Cloreto de Cobalto CoCl2.6H2O 0,025 0,25 0,025 - - -
Sulfato de Manganês MnSO4.4H2O 22,3 - - 5,3 10000 -
Sulfato de Manganês MnSO4.H2O - 16,9 10,0 - - 22,3
Sulfato de Zinco ZnSO4.7H2O 8,6 4,32 2,0 3,0 1000 8,6
Sulfato de Cobre CuSO4.5H2O 0,025 1,25 0,025 0,010 10 0,25
Sulfato de Ferro II FeSO4.7H2O - 55,6 - - 27800 27,8
Óxido de Molibdênio MoO3 - - - 0,01 - -
Iodeto de Potássio KI 0,83 - 0,75 0,75 - -
Continua...
 FÓRMULA CONCENTRAÇÃO (mg. )
COMPOSTO
QUÍMICA MS JADS B5 WHITE QLP WPM
QUELATOS
Sódio EDTA Na2EDTA.2H2O 37,3 74,5 * - 37300 -
Sódio EDTA Na2EDTA - - - - - 37,2
Sulfato de Ferro Fe2(SO4)3 27,8 - * 2,5 - -

CARBOIDRATOS, VITAMINAS, ADITIVOS, ÁGAR, E REGULADORES DE CRESCIEMNTO

Ácido nicotínico - 0,5 0,5 1,0 0,5 0,001 0,5
Piridoxina-HCL - 0,5 0,5 1,0 0,1 0,0005 0,5
Tiamina-HCL - 0,1 0,5 10,0 0,1 0,001 1,0
L-Arginina - - 7,0 - - - -
L-Glutamina - - 146,0 - - - -
L-Cisteína - - 2,5 - - - -
Pantotenato de Cálcio - - 2,5 - - - -
Ácido Fólico - - - - - 0,00001 -
Biotina - - - - - 0,0001 -
Ac. p-aminobenzóico - - - - - 0,001 -
Riboflavina - - - - - 0,0001 -
Glicina - 2,0 2,0 - 3,0 - 2,0
Mioinositol - 100,0 100,0 100,0 - 50 100
Sacarose - 30000,0 30000,0 20000,0 - - 20000,0
Ágar - (1) (1) (1) (1) (1) (1)
Reg. de Crescimento - (2) (2) (2) (2) (2) (2)
MS: MURASHIGE e SKOOK (1962); JADS: GONÇALVES et al. (1982); WHITE: WHITE (1943); B5: GAMBORG et al. (1968); QLP: QUOIRI e
LEPROIVE (1977); WPM: LLOYD e MCCOWN (1981). (1): Definido em função da qualidade e consistência desejada. (2): Definido em função
do balanço hormonal desejado.
*: A formulação usa a preparação comercial “sequestrene”.
Micropropagação em Espécies Florestais

A micropropagação pode ser enquadrada como uma técnica de propagação vegetativa

in vitro; comparada a outras técnicas, tem, sido considerada aquela que mais se
difundiu nos últimos anos, com aplicações comprovadas em diversas espécies de
plantas. Apesar de recente na área florestal, ela se encontra embutida nos programas
de pesquisa, onde tem sido utilizada na conservação de germoplasma, produção de
plantas livres de doenças, multiplicação rápida de plantas em períodos de tempo e
espaço físico reduzidos, rujevenescimento clonal e produção de mudas de clones
selecionados. Em Eucalyptus, por exemplo, tem sido usada, principalmente, no
rejuvenescimento de clones de difícil propagação vegetativa por estaquia, além de
constituir base para o emprego de outras técnicas biotecnológicas, como a
transformação genética.
Todos os envolvidos com a micropropagação reconhecem que o desenvolvimento
dessa técnica requer conhecimento multidisciplinar, advindo sobretudo da fisiologia,
nutrição, genética e bioquímica. Além disso, a micropropagação não deve ser
visualizada isoladamente, e sim em conjunto com as técnicas convencionais de
propagação de plantas.
Nos esquemas-padrão da micropropagação, os estádios de desenvolvimento da
propagação in vitro são constituídos de fases que incluem desde a seleção do
explante e obtenção de uma cultura livre de contaminantes, até a multiplicação dos
propágulos vegetativos, enraizamento e aclimatação das mudas obtidas na condição
ex vitro. Dessa forma, pode-se dividir a micropropagação nas seguintes fases:
Fase I – seleção de explantes, desinfestação e estabelecimento da cultura nas
condições in vitro.
Fase II – multiplicação dos propágulos mediante sucessivas subculturas em
meio de cultura adequado à propagação.
Fase III – enraizamento dos propágulos vegetativos obtidos no estádio
anterior.
Fase IV – aclimatização das plantas obtidas na condição “in vitro” para a
condição ex vitro.
Em função da espécie e dos objetivos a serem alcançados, algumas dessas fases
podem ser mais prolongadas e, ou, uma fase pode ser adicionada, bem como outras
não serem necessárias. A experiência e a estrutura disponível, entre outros fatores,
são determinantes na definição da estratégia mais adequada para o sucesso
desejado. Assim, em algumas situações, um estádio “0” tem sido considerado, o qual
corresponde ao tratamento dado à planta matriz para fornecimento de explantes mais
adequados e responsivos ao cultivo in vitro. Em outras situações, no estádio II,
correspondente a multiplicação das culturas, uma fase de alongamento da cultura
multiplicada tem sido adicionada, visando a obtenção de propágulos alongados mais
adequados para melhor resposta na fase de enraizamento. O sistema de
micropropagação pode também ser simplificado pela eliminação da fase de
enraizamento in vitro, onde os propágulos alongados são enraizados diretamente no
substrato em condições ex vitro.
Nos esquemas-padrão e em função do explante utilizado e de sua subseqüente
manipulação, a micropropagação pode ser conduzida da seguinte forma:
1 – Multiplicação por meio da proliferação de gemas axilares.
2 – Multiplicação mediante indução de gemas adventícias por organogênese.
3 – Multiplicação via embriogênese somática.
A utilização de uma em detrimento da outra varia com a espécie, os objetivos a serem
alcançados, o domínio da técnica e as disponibilidades estruturais e orçamentárias. No
entanto, a micropropagação mediante proliferação de gemas axilares tem sido a mais
utilizada e com respostas satisfatórios na propagação in vitro, visto sua aplicabilidade
em espécies lenhosas. Os outros dois sistemas de micropropagação, apesar de
suapotencialidade na área florestal, ainda carecem de desenvolvimento científico que
os tornem de uso rotineiro.

Micropropagação pela Proliferação de Gemas Axilares

Esta técnica envolve o isolamento in vitro de órgãos meristemáticos pré-formados,

como gemas axilares ou meristemas apicais, os quais são estimulados a crescer
mediante a adição de reguladores de crescimento no meio de cultura, dando origem a
novas partes aéreas que, por sua vez, repetem o mesmo processo. Assim, os tufos de
partes aéreas são formados e subdivididos em conjuntos menores, dando origem a
novos explantes.
Esta técnica baseia-se na proliferação de gemas pré-formadas, a qual reproduz in vitro
um fenômeno natural, levando a um sistema com grande facilidade de controle. Além
disso, esse sistema de micropropagação apresenta fidelidade genética muito alta, em
que as gemas pré-formadas, pelo fato de possuírem determinação para o crescimento
vegetativo e satisfeitas as necessidades nutricionais, irão se desenvolver naturalmente
em plantas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
De modo geral, este sistema de micropropagação é geralmente mais simples que os
outros, sendo a taxa de propagação relativamente rápida; as plantas resultantes
desses processo apresentam bom crescimento, provavelmente devido ao
rejuvenescimento promovido por sucessivos subcultivos (PIERIK, 1997).
A micropropagação pela proliferação de gemas axilares constitui-se em um sistema de
propagação in vitro, o qual segue fases que vão desde o isolamento do explante até a
obtenção da muda micropropagada. A seguir são apresentadas as diferentes fases
inerentes a esse sistema de micropropagação, usualmente adotado na propagação in
vitro de espécies florestais.

Iniciação e Estabelecimento da Cultura in vitro

Esta etapa inicia-se com a seleção dos explantes mais adequados para a
micropropagação e termina com a obtenção de uma cultura livre de contaminantes e
suficientemente adaptada às condições in vitro. A condição da planta matriz, a
descontaminação e o manejo dos explantes iniciais são os principais aspectos a
serem considerados.
Esta fase é a mais crítica para a maioria das plantas lenhosas, principalmente matrizes
no estádio adulto, onde, além das dificuldades de resposta do propágulo vegetativo à
propagação clonal, normalmente esses explantes apresentam altas taxas de
contaminação.

Seleção do Explante

A partir da seleção da árvore que se deseja micropropagar, busca-se

identificar a fonte de explante que possa apresentar melhores condições de
resposta ao cultivo in vitro. Assim, torna-se importante a identificação de partes
da planta que possam responder satisfatoriamente à propagação vegetativa,
atendendo aos objetivos almejados, e que não apresentem limitações quanto à
contaminação in vitro.

De forma geral, em função do gradiente de maturação das árvores e

dos objetivos a serem alcançados, buscam-se partes da planta que
apresentem resposta à propagação in vitro. Em relação aos objetivos a serem
alcançados pela micropropagação, devem-se identificar inicialmente partes da
planta que atendam a tal propósito, ou seja, explantes que expressam maior
grau de juvenilidade ou maior grau de maturidade. Uma vez identificada essa
fonte de explantes na árvore a ser propagada, busca-se obter propágulos com
maior vigor vegetativo e com menor nível de contaminantes possível, visando a
melhor resposta na propagação in vitro.

Em razão de grande variabilidade, as espécies florestais apresentam

respostas diferenciadas à propagação vegetativa, dificultando o
estabelecimento de um único protocolo de seleção de explantes. Para
Eucalyptus spp.,os explantes de árvores selecionadas podem ser obtidos de
várias maneiras: 1) indução de brotações epicórmicas em ramos obtidos de
partes da árvore selecionada, de onde serão coletados os explantes para o
isolamento in vitro – essa indução de brotações epicórmicas pode ser feito na
própria árvore ou pela retirada dos ramos e colocaçao em condições
ambientais controladas; 2) alternativamente, pode-se fazer a propagação
vegetativa por estaquia ou por enxertia, a partir dos propágulos obtidos da
parte desejada da árvore selecionada – nesse caso, as brotações emitidas na
propagação, tanto na enxertia como a estaquia, são utilizadas como fontes de
explantes iniciais à micropropagação; e 3) em algumas circunstâncias, os
explantes iniciais à propagação in vitro podem ser obtidos a partir das
brotações emitidas nas cepas após o abate da árvore. Em todos esses caso, o
tipo de explante mais utilizado tem sido ápices caulinares e gemas xiliares.

Em Eucalyptus benthamii, Hansel et AL. (2005) obtiveram resultados

promissores no uso de ápices caulinares diretamente de brotações de cepas
de plantas estabelecidas no campo. Em erva-mate, segundo Mroginski et AL.
(1997), para micropropagação de árvores adultas, as melhores fontes de
explantes correspodem àqueles obtidos a partir de segmentos nodais coletados
em mudas adquiridas pelo enraizamento de estacas.

Para canela-sassafráz (Ocotea odorífera), sucesso foi obtido com

explantes oriundos de brotações epicórmicas induzidas em ramos selecionados
de árvores adultas, os quais foram colocados em condições de casa de
vegetação com controle ambiental e fitossanitário (JANKOWSKI; GRAÇA,
1993).

Em todos esses procedimentos de seleção de explantes, os fatores

mais importantes a serem considerados são aqueles relacionados com o grau
de juvenilidade do propágulo vegetativo, o nivel de controle da contaminação e
o vigor vegetativo da planta fornecedora de explantes. Assim, o objetivo básico
é a obtenção de um explante livre de contaminantes, vigoroso fisiologicamente
e que responda satisfatoriamente à propagação in vitro.

Desinfecção dos Explantes

Após definida a fonte de explante mais adequado aos objetivos a

serem alcançados com a micropropagação e que apresente potencial de
resposta à propagação in vitro, ainda há necessidade de desinfestações que
garantam a assepsia dos propágulos vegetativos a serem introduzidos in vitro.

Várias substâncias com ação germicida são utilizadas na desinfestação

dos explantes, sendo comum o etanol e os compostos a base de cloro, como
hipoclorito de sódio e de cálcio. As concentrações das soluções desinfestantes,
assim como as combinações dos princípios ativos desinfestantes e os tempos
de exposição, podem variar bastante. Em alguns casos, são utilizadas algumas
gotas de detergentes adicionadas às soluções à base de cloro para melhorar o
contato destas com os tecidos, bem como para diminuir a oxidação destes. A
permanência dos explantes durante algumas horas em água destilada tem sido
adotada, para lavagem dos fenóis.

Nesta fase, o objetivo principal é a desinfestação superficial do

explante, buscando eliminar os contaminantes que possam interferir ou mesmo
impedir o sucesso da propagação in vitro. Assim, para cada espécie e tipo de
explante, o nível de contaminação, juntamente com a sensibilidade dos tecidos,
determinará a melhor estratégia de ação e de produtos a ser utilizada para
obter sucesso.
 Como exemplo, Correia et al., (1995), trabalhando com brotos
epicórmicos de 5 cm de comprimento de plantas propagadas por estacas de
Eucalyptus grandis x E. urophylla, utilizaram solução de detergente comercial a
3% (v/v) durante 15 minutos e, após, os explantes foram lavados em solução
de Benlate® (1gL-¹) durante 30 minutos. Em câmara de fluxo laminar, os brotos
foram imersos em solução de NaClO a 1% (v/v) com acréscimo de Tween 20%
a 0,01% (v/v) durante 15 minutos e lavados por quatro vezes em água
destilada e esterilizada.

Para desinfestação de ápices caulinares de Eucalyptus benthamii,

Hansel et al. (2005) obtiveram resultados satisfatórios com a imersão em álcool
70% (1 min), NaCl 2% (5 min) e enxágue por três vezes em água destilada.

Batista et al. (1999), visando identificar tratamento asséptico dos

explantes e controle da oxidação fenólica na propagação in vitro de clones de
seringueira ( Hevea brasiliensis), obtiveram melhor resultado para gemas
axilares coletadas de plantas com 3 anos de idade, com o uso de hipoclorito de
sódio (0,75% de cloro ativo) por 30 minutos e com imersão em água corrente
das gemas axilares, por 24 horas, e inoculação em meio contendo 200 mg L-¹
de PVP.

Isolamento, indução e estabelecimento da cultura in vitro

Após a desinfestação dos explantes, a fase seguinte refere-se ao

isolamento destes em meio de cultura, em condições asséptica. Nesta fase,
deve-se proceder à manipulação dos explantes em câmara de fluxo laminar, a
fim de contornar, o máximo possível, os efeitos de contaminações acidentais.
Na maioria dos caso, os explantes isolados constituem-se de ápices e, ou, de
gemas axilares excisadas na forma de “Y”, onde se busca a proliferação dos
meristemas presentes nas gemas apicais e nas gemas axilares.

Em se tratando de espécies lenhosas, conforme mencionado, entre os

meios de culturas básicos mais utilizados estão o MS (MURASHIGE; SKOOG,
1962), JADS ( GONÇALVES et el., 1982), WHITE ( WHITE, 1943), B5
(GAMBO et al., 1968), QLP (QUOIRIN; LEPOIVRE, 1977) e WPM (LLOYD;
McCOWN, 1981). Na etapa de isolamento especificamente, os meios mais
concentrados, como o MS, apresentam melhores resultados quando diluídos
em um meio ou um quarto de seus componentes originais, pois as espécies
lenhosas possuem crescimento lento comparativamente às herbáceas
(BONGA; VON ADERKAS, 1992).

Adicionalmente ao meio de cultura, têm sido acrescentados

reguladores de crescimento, a fim de suportar um balanço hormonal que
proporcione reatividade das gemas. Entre os reguladores de crescimento mais
utilizados, a citocinina BAP (bensilaminopurina) e as auxinas AIA (ácido
indolacético) e ANA (ácido naftalenoacético) tem sido aquelas com melhores
resultados em proporcionar um balanço hormonal com respostas satisfatórias
na indução de gemas em espécies florestais.

Nesta fase de isolamento, que o risco de contaminação ainda é alto,

têm sido adotados tubos de ensaio como recipientes, onde são cultivados
explantes individuais, visando minimizar perdas excessivas. Em relação à
consistência do meio de cultura, os geleificados têm sido os mais utilizados e
detrimento dos meios líquidos.

Após o isolamento do explante, espera-se a ocorrência da indução a

partir do crescimento do meristema presente nas gemas apicais e, ou, nas
gemas axilares. Entretanto, vários problemas podem surgir durante a fase de
indução do explante isolado, em razão da espécie e do tipo de explante usado.
Assim, normalmente, em espécies florestais tem sido adotada uma incubação
inicial no escuro, visando contornar os efeitos negativos provocados pela
oxidação de compostos fenólicos que são liberados pelas células danificadas
pelo corte na preparação do explante. Como alternativa, em algumas
situações, a utilização de antioxidantes, como o PVP (polivinilpirrolidona) e
carvão ativado, adicionados ao meio de cultura, pode inibir os efeitos negativos
da oxidação fenólica. Também em algumas situações, a transferência
sucessiva com maior freqüência dos explantes, com retirada das porções
oxidadas pode proporcionar maior reatividade inicial das gemas e minimizar a
oxidação fenólica.

Ocorrida a indução, a incubação das culturas tem sido feita sob

fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro e intensidade de luz de 20
a 70 mmol m-² s-¹, em ambiente com temperatura em torno de 27°C.

Nesta etapa de estabelecimento, busca-se obter uma cultura livre de

contaminantes, suficientemente adaptadas às condições in vitro, com respostas
uniformes e reativa a condições de cultura. Assim, a duração desta fase é
variável, visto esta ser dependente sobretudo da espécie e da reatividade dos
explantes iniciais e de sua subseqüente resposta ao cultivo in vitro.

Multiplicação e Alongamento

Uma vez obtidas as condições desejadas na etapa de estabelecimento

da cultura in vitro, a etapa seguinte refere-se à multiplicação da cultura para
obtenção da quantidade de mudas micropropagadas desejadas.

Nesta fase, os objetivos principais são os de obtenção de alta taxa de

multiplicação com o mínimo de variação de explante para explante, livre de
contaminantes que prejudiquem a micropropagação, gemas reativas e que
produzam partes aéreas com qualidade suficiente para a fase seguinte. Assim,
devem ser observadas as questões de qualidade e da quantidade de gemas
que atendam aos objetivos a serem alcançados com o progresso da
micropropagação.

Segundo Grattapaglia e Machado (1998), o conjunto de variáveis que

podem ser manipuladas para otimizar esta fase refere-se à composição do
meio de cultura,às condições ambientais de crescimento e aos cuidados na
manipulação do material durante as subculturas. Dessa forma, alguns fatores
afetam o desenvolvimento das culturas durante a fase de multiplicação, como a
freqüência das subculturas, o tipo e tamanho dos explates subcultivados e os
cuidados no procedimento de repicagem.
 De modo geral, o sucesso desta fase é dependente da fase anterior,
em que a obtenção de culturas reativas, estáveis na cultura in vitro e com bom
padrão de qualidade é determinante. Em espécies lenhosas, a seleção do
explante mais adequado à cultura in vitro é de vital importância no sucesso da
micropropagação, tendo em vista os efeitos variáveis do gradiente de
maturidade. Assim, além do genótipo,os efeitos proporcionados pela atividade
fisiológica constituem-se nos principais desafios a serem vencidos na obtenção
de explantes que atendam aos objetivos almejados.

Em relação aos meios de cultura, condições de incubação, entre outros

fatores, as observações apresentadas no item anterior são validas para esta
fase, em que os principais desafios estão em encontrar as combinações e os
tipos de reguladores de crescimento que proporcionem o crescimento
desejado.

Nesta fase da propagação in vitro, para algumas espécies florestais, e

dependendo dos procedimentos adotados na manipulação e das respostas dos
explantes, uma fase adicional de alongamento das gemas multiplicadas torna-
se necessária para a obtenção de gemas alongadas o suficiente para obter
respostas satisfatórias na fase de enraizamento. Para Eucalyptus,
normalmente neste estágio da micropropagação adota-se uma fase inicial de
multiplicação do material vegetativo, visando a obtenção de material suficiente
para atender a uma segunda fase, onde as gemas multiplicadas são induzidas
ao alongamento. A resposta à maior ou menor taxa de multiplicação ou
alongamento, normalmente, tem sido estabelecida pelo balanço hormonal dos
reguladores de crescimento citocininas (BAP) e auxinas (AIA, ANA).

De maneira geral, durante cada subcultivo as gemas respondem de

acordo com o explante. Assim, normalmente, em um subcultivo, o explante
inicialmente se restabelece nas condições de cultura in vitro após o estresse
sofrido pela repicagem. Em seguida, o explante passa por uma fase de
crescimento e multiplicação exponencial, em que é observado o aumento da
massa vegetal. Na etapa final, o explante inicia um processo de senescência
em função de diversos estresses, como deficiência nutricional decorrente do
esgotamento do meio de cultura, falta de água no meio, acúmulo de etileno e
outros gases no frasco, além de barreiras físicas ao crescimento, visto a
limitação imposta pelo recipiente. Dessa forma, para cada espécie em
micropropagação, deve-se observar seu crescimento para determinação do
período mais adequado para cada subcultivo, a fim de obter a resposta
desejada com a micropropagação in vitro.

Vale salientar que, dependendo dos objetivos da micropropagação,

deve-se atentar para o tempo e número de subcultivos necessários das
culturas na multiplicação, até alcançar estágios vegetativos com reatividade
das gemas de acordo com interesses da propagação. Para Eucalyptus, se o
objetivo é o de rejuvenescimento de clones selecionados na idade adulta,
visando o melhoramento da capacidade de enraizamento, tem sido observado
algum nível de resposta a partir do sexto subcultivo, o qual é variável com a
espécie, o clone, o tipo de explante utilizado (aspectos fisiológicos e
ontogenéticos), entre outros fatores.

Enraizamento e Aclimatização

Esta fase caracteriza-se pela indução de raízes adventícias nas gemas

alongadas na fase de multiplicação/alongamento, visando a obtenção de
plântulas para posterior transplante para as condições ex vitro. Em geral, o
sucesso desta etapa é dependente da obtenção de gemas alongadas com boa
reatividade e com qualidade suficiente que permitam o desenvolvimento e
crescimento radicular satisfatório, objetivando a transferência para condições
ex vitro.

Da mesma maneira que na fase anterior, esta etapa é função da forma

de manipulação, tipo e tamanho das gemas subcultivadas, do meio de cultura
utilizado e das condições ambientais a que estão submetidos os explantes.
Nesta fase, um dos principais fatores relacionados com o meio de cultura
refere-se ao componente reguladores de crescimento, em que o balanço
hormonal entre citocinina e auxina é fundamental na determinação da resposta
satisfatória de enraizamento.
 Observa-se, de modo geral, que em espécies lenhosas o processo de
enraizamento apresenta maior dificuldade à medida que se trabalha com
material de idade ontogenética mais avançada. De certa forma, do ponto de
vista prático da micropropagação, a maior capacidade de enraizamento
adquirida na propagação in vitro deve-se à restauração da competência de
enraizamento, a qual é considerada sinônimo de rejuvenescimento. Com
alguns clones de E. citriodora, verificou-se que as culturas multiplicaram bem
após quatro subcultivos mensais, mas o enraizamento foi abaixo de 5%. Após
o oitavo subcultivo, foi possível enraizar 40% das partes aéreas; após o 12%, o
enraizamento atingiu 70 a 80% (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

Uma vez obtido o enraizamento das gemas alongadas. Estas são

transferidas da condição in vitro para a aclimatização e rustificaçao ex vitro.
Esta fase constitui-se em uma etapa bastante critica, pois as plântulas
enraizadas passam de uma situação de reduzido fluxo transpiratório, devido à
baixa intensidade de luz e à elevada umidade relativa, para um ambiente que
demanda um incremento na taxa de transpiração, ficando suscetíveis ao
estresse hídrico. Nessa transferência de ambiente, as plântulas passam de
uma condição heterotrófica para uma autotrófica; de uma condição de alta
disponibilidade de nutrientes para outra em que precisam rapidamente
incrementar a absorção de sais; e, finalmente, saem de um ambiente asséptico
para um em que estão sujeitas ao ataque de microrganismos saprofíticos e
patogênicos.

O sucesso nesta etapa de transferência da condição in vitro para a ex

vitro é dependente de vários fatores, entre os quais a qualidade das plântulas
obtidas na fase de enraizamento, a espécie e as estruturas de aclimatização.
Alguns exemplos com espécies florestais mostram que essa transferência varia
bastante com as condições especificas nas quais está sendo realizada a
micropropagação. Como exemplo, a aclimatização das plântulas enraizadas de
caixeta (Didymopanax morototoni) foi realizada por meio da abertura gradual
dos frascos de cultura, lavagem das raízes em água corrente, utilização de
extratos esterilizado e cobertura das plântulas com garrafas plásticas
transparentes, obtendo-se uma sobrevivência em torno de 65% (MANTOVANI
et al., 1999). Para peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron), a indução de
raízes foi de 80%, utilizando-se o meio de cultura WPM em tratamento pulso
com 10 mM de solução de AIB, durante 15 minutos; em seguida, as plântulas
foram transplantadas, apresentando taxas de sobrevivência superiores a 90%
em casa de vegetação climatizada (RIBAS et al., 1999b). Vale salientar que,
uma vez obtida a aclimatização das plântulas enraizadas na condição ex vitro,
os procedimentos de manejo das mudas tendem a seguir os padrões de
formação e rustificação de mudas em geral.

Na busca de otimização do processo de micropropagação, para

algumas espécies e situações, a fase de enraizamento in vitro pode ser
eliminada pelo enraizamento das gemas alongadas diretamente na condição ex
vitro. Segundo Xavier e Comércio (1997), para clones de Eucalyptus spp., o
enraizamento ex vitro das gemas alongadas in vitro em casa de vegetação
climatizada apresenta certas vantagens, como o desenvolvimento de um
sistema radicular mais completo e funcional, desenvolvimento de maior número
de raízes secundarias, formação da raiz sem a passagem intermediaria de
calo, eliminação de uma etapa da micropropagação, redução de custos de
mão-de-obra, infraestrutura e tempo de formação da muda. Além dessas
vantagens, esses autores enfatizam ser o enraizamento ex vitro vantajoso por
evitar a manipulação de plantas de raiz nua e por levar a redução de tempo de
formação da muda, aumento da capacidade produtiva do laboratório e
eliminação de uma fase a mais no desenvolvimento da pesquisa (enraizamento
in vitro). Os resultados obtidos nesta pesquisa para três clones de Eucalyptus
grandis x E. urophylla indicaram que o procedimento recomendado na
produção de mudas prontas para o plantio em campo, técnica e
economicamente, é aquele em que gemas alongadas in vitro são transferidas
para enraizamento em casa de vegetação, sem aplicação de regulador de
crescimento na base das microestacas e permanência de 15 dias, aclimatação
em casa de sombra por mais de 10 dias e crescimento e rustificação em pleno
sol até completar 90 dias de idade. Os melhores resultados obtidos por Xavier
e Comércio (1997) foram de 95% para enraizamento na saída da casa de
vegetação é de 90% para o índice de aproveitamento final de mudas aptas
para plantio no campo.
 Realizada a etapa de enraizamento in vitro ou ex vitro das gemas
alongadas e satisfeitas as condições de aclimatização, obtém-se finalmente a
muda micropropagada. Vale salientar que a micropropagação pela proliferação
de gemas axilares provenientes de plântulas, assim como de material adulto,
tem sido uma das utilizadas com sucesso em várias espécies vegetais,
inclusive em espécies lenhosas, como Eucalyptus. Entretanto, um problema
relativamente comum nesse método de micropropagação é a contaminação do
material por microrganismos, principalmente bactérias endógenas (PIERIK,
1997), o que constitui um entrave ao estabelecimento das culturas.

Aplicação da Micropropagação na Área Florestal

A micropropagação oferece a possibilidade de propagação de árvores

selecionadas em todas as idades, constituindo-se em uma alternativa em
relação aos métodos clássicos de propagação vegetativa. A micropropagação
pela proliferação de gemas axilares de várias espécies de Eucaliptus é relatada
na literatura, em que os objetivos almejados são os mais diversos. Na
silvicultura clonal de Eucalyptus, ele tem sido usada como técnica de
rejuvenescimento de clones selecionados ( figura 5.5), objetivando a melhoria
do enraizamento no processo de propagação de mudas por microestaquia,
com inúmeras vantagens relatadas por Assis et al. (1992), Xavier e Comércio
(1996), Assis (1997), Xavier et al. (2001, 2007), Titon et al. (2002), entre outros.

Quanto ao Pinus, no Brasil, estudos relacionados com a

micropropagação pela proliferação de gemas axilares são bastante reduzidos,
visto as limitações impostas pela espécie na propagação clonal. Entretando, os
objetivos estão relacionados com a propagação vegetativa e o
rejuvenescimento de clones selecionados em um programa de silvicultura
clonal da espécie, assim como base para regeneração de plantas transgênicas
(XAVIER et al., 2007).

Várias outras espécies florestais têm sido alvo de pesquisa com

micropropagação no Brasil, porém na maioria das vezes ainda em fase inicial
de estudo. Entre várias espécies estudadas, podem-se relacionar erva-mate
(Ilex paraguariensis) (MROGINSK et al.,1997), caixeta (Didymopanax
morototoni) (MANTOVANI et al., 1999), seringueira ( Hevea brasiliensis)
(BATISTA et al., 1999), peroba-rosa ( Aspidosperma polyneuron) ( RIBAS et
al., 1999 a, b 2005), urucum (Bixa orellana) (D’ SOUZA; SHARON, 2001;
PAIVA NETO, 2002), copaíba (Copaifera martii) ( NOLETO; SILVEIRA, 2002),
paricá (Schizolobium amazonicum ) ( CORDEIRO et al., 2002) e acácia-negra
(Acacia mearnsii) ( BORGES JÚNIOR et al., 2004).

Micropropagação via Organogênese

Este sistema de micropropagação baseia-se na indução de gemas

adventícias diretamente sobre um explante ou sobre uma massa de células
não organizadas, denominada calo. Assim, os eventos organogênicos
acontecem mediante a desdiferenciação e rediferenciação celular, sendo
dependente da retomada da atividade meristemática em células maduras
diferenciadas ou em um tecido calogênico desorganizado.

Quando as gemas se formam diretamente sobre os explantes, a

organogênese é denominada direta, ocorrendo em tecidos que apresentam
potencial morfogênico na planta in vivo, mas que em geral não se expressa,
como folhas, segmento caulinar e de raízes, entre outros. Quando a formação
da gema é precedida pela formação de calo, a organogênese é denominada
indireta, de onde surgem gemas que crescem e se desenvolvem em novas
partes aéreas.

Em geral, as gemas adventícias formadas diretamente do tecido do

explante, sem a formação prévia de calos, proporcionam um método de maior
confiabilidade na micropropagação. Entretanto, a indução direta de gemas é
dependente da natureza do órgão de onde se derivou o explante, sendo
bastante dependente do genótipo da planta (GEORGE, 1993).
 Tanto a micropropagação pela proliferação de gemas axilares quanto a
micropropagação pela indução de gemas adventícias por organogênese levam
à formação de uma planta a partir da produção de gemas unipolares, que
depois de alongadas, devem ser enraizadas em outra etapa da produção da
muda.

O processo de organogênese in vitro é considerado complexo, com a

atuação de múltiplos fatores externos e internos, envolvendo interação entre a
fonte de explante, o meio de cultura e fatores do ambiente (GEORGE, 1993;
PIERIK, 1997; JOY IV; THORPE, 1999). Depende também da ação de
reguladores de crescimento, em particular auxinas e citocininas, bem como da
capacidade do tecido em responder a essas mudanças hormonais durante o
período de cultivo.

Fases da Organogênese

As principais fases envolvidas na rota morfogênica in vitro são a

indução e a de expressão, ou seja, indução das células em adquirir
competência organogênica e a expressão desse potencial no desenvolvimento
de órgãos (ZIV, 1999). O conceito de competência vem da idéia de que todas
as células nucleadas são totipotentes e, portanto, capazes de formar um outro
individuo dos quais eles eram originalmente derivados (JOY IV; THORPE,
1999).

De modo geral, três fases fisiológicas estão envolvidas na

organogênese: 1 – aquisição da competência, por meio da qual a célula se
torna capaz de indução na presença de um indutor; 2 - indução ou
determinação de uma célula ou células em se diferenciar e produzir o orgão de
escolha; e 3 – crescimento e expressão da diferenciação (CHRISTIANSON;
WARNICK, 1988). Assim, a otimização da organogênese depende de
requerimentos temporais para cada uma dessas fases, os quais, normalmente,
são empiricamente determinados para uma dada espécie e , usualmente, para
diferentes genótipos dentro da espécie.
 Conforme mencionado anteriormente, para a micropropagação pela
proliferação de gemas axilares, na indução de gemas adventícias por
organogênese, esta também é dependente de estágios vegetativos que levem
à obtenção de mudas micropropagadas. Assim, deve-se atentar para as
observações feitas quanto a seleção de explantes, desinfestaçao e
estabelecimento da cultura nas condições in vitro; à multiplicação da cultura
nos sucessivos subcultivos em meio de cultura adequado à propagação; e ao
enraizamento das gemas alongadas no estagio anterior e subseqüente
aclimatação dessas plantas obtidas para a condição ex vitro. Logicamente,
esses estágios apresentam particularidades inerentes ao processo
organogênico, as quais devem ser ajustadas em função da espécie, dos
objetivos e das limitações impostas pela técnica.

Aplicações da Micropropagação via Organogênese na Área Florestal

Na área florestal, este sistema de micropropagação é aplicado na

conservação de germoplasma in vitro, onde estudos em espécies florestais têm
demonstrado a capacidade de manutenção do potencial morfogênico após
longos períodos de subcultivo de calos em Pinus (GLADFELTER; PHILLIPS,
1987; WAGLEY et al., 1987) e Eucalyptus (WARRAG et al., 1991; ITO et al.,
1996). Tem sido também usado como ferramenta auxiliar nos programas de
propagação clonal pelo desenvolvimento de protocolos eficientes de
regeneração em diversas espécies, bem como na obtenção de plantas
transgênicas, via transformação genética (WALTER, 2004; MERKLE; NAIRN,
2005 A; POUPIN; ARCE-JOHNSON, 2005).

Protocolos eficientes de micropropagação de Eucalyptus pela via

organogênica também foram apresentados por Subbaiah e Minocha (1990),
Tibok et al. (1995), Chen et al. (1996), Azmi et al. (1997), Mullins et al. (1997),
Ho et al. (1998) e Bandyopadhyay et al. (1999), os quais utilizaram materiais
juvenis como fonte de explantes como cotilédones e hipocótilos. Trabalhos de
organogênese in vitro utilizando explantes foliares de clones micropropagados
de Eucalyptus grandis foram realizados por Lainé e David (1994). Trabalhos
desenvolvidos por Alves et al. (2004a, b) avaliaram o potencial da
organogênese in vitro na regeneração de clones de Eucalyptus grandis x E.
urophylla, concluindo-se que entre os principais fatores envolvidos estão o tipo
de explante utilizado, as condições ambientais de propagação, os meios de
cultura usados e as combinações de reguladores de crescimento específicas
para cada clone.

Micropropagação via Emriogênese Somática

Embriogênese somática, adventícia ou assexual pode ser descrita

como o processo pelo qual células somáticas desenvolvem estruturas
semelhantes a embriões zigóticos, por meio de uma sequência ordenada de
estágios embriogênicos característicos, sem ocorrência de fusão dos gametas
(GUERRA et al., 1998; JIMÉNEZ, 2001). Durante o seu desenvolvimento,
embriões somáticos passam por estágios similares àqueles observados na
embriogênese zigótica, caracterizando-se como estrutura bipolar sem nenhuma
conexão vascular como o tecido materno (HOWELL, 1998; VICIENT;
MARTINEZ, 1998).

A embriogênese somática pode ser natural ou in vitro. No primeiro

caso, células do tecidos embrionários podem ser direcionadas para esta rota
de desenvolvimento, como acontece com o sistema da embriogenia adventícia
ou nuclear em Citrus spp., onde os embriões apomíticos originam-se por
gemação a partir de células do núcleo. Esses embriões apomíticos são
genericamente idênticos à planta-mãe, tendo-se como conseqüência desse
fenômeno a perpetuação de populações clonais por meio de sementes
(GUERRA et al.,1998).

Na embriogênese somática in vitro, o processo constitui-se na cultura

dos tecidos, objetivando a formação de embriões sem a ocorrência de
fertilização. Por meio de estímulos ambientais ou químicos aplicados aos
explantes em cultura, células somáticas são induzidas a formarem embriões,
os quais podem ser posteriormente convertidos em plantas, passando por
estágios semelhantes aos observados na embriogênese zigótica.

De modo geral, o embrião somático passa pelos estágios de

desenvolvimento pró-embrionários e embrionários propriamente ditos: globular,
cordiforme, torpedo e cotiledonar (GUERRA et al.,1998); entretanto, o tamanho
final dos cotilédones é usualmente reduzido, não havendo o desenvolvimento
de endosperma e da camada protetora da semente (HARTMANN et al., 2002).
Uma particularidade dos embriões somáticos é a presença de um sistema
vascular fechado, sem conexão vascular com os tecidos do explante inicial
(GUERRA et al., 1998).

Os padrões básicos de expressão da embriogênese somática in vitro

ocorrem de forma direta e indireta sobre o explante em cultura. Na
embriogênese direta, os embriões somáticos formam-se diretamente sobre a
superfície dos explantes. Na embriogênese indireta, a partir de explantes em
cultura, são induzidos calos embriogênicos inicialmente e, em uma fase
subseqüente, na superfície do calo formado são induzidos os embriões
somáticos indireta é o método mais comum para regeneração de embriões
somáticas para uso pratico e tem sido descrita para varias espécies (BAJAJ,
1995).

Esforços para induzir embriogênese somática têm sido observados

para muitas espécies de interesse econômico. Os métodos utilizados envolvem
mudanças no meio de cultura, estabelecimento de diferentes tipos ou
concentrações de reguladores de crescimento e/ou controle de outras
condições de cultura, como densidade de células, nutrientes ou iluminação. A
característica notável da embriogênese somática é que simples manipulações
podem desencadear séries de eventos que levam à formação do embrião
(HOWELL, 1998).

Fases da Embriogênese Somática

 De maneira geral, as fases envolvidas na embriogênese somática in
vitro podem ser resumidas na determinação da melhor fonte do explante (foliar,
caulinar, radicular e influorescência), iniciação das culturas embriogênicas,
multiplicação/manutenção e cultura massal e, finalmente, desenvolvimento e
maturação dos embriões somáticos (GUERRA et al., 1998).

A etapa inicial do processo de embriogênese somática in vitro consiste

em determinar na planta matriz a melhor fonte de explante. Após esta etapa, os
explantes são inoculados em meio de cultura contendo reguladores de
crescimento, de forma a estimular a iniciação da fase de embriogênese
somática. Na fase seguinte, a embriogênese somática pode ocorrer de forma
direta, em que os embriões são formados diretamente no tecido, ou de forma
indireta, com formação de calos e surgimento de regiões friáveis, normalmente
brancos translúcidos, denominados de massas ou complexos celulares pró-
embrionários.

Na fase de manutenção, multiplicação e cultura massal, são

determinadas as condições adequadas para o estabelecimento de ciclos
repetitivos de divisão celular e o controle dos processos de diferenciação, de
maneira de que as culturas sejam constituídas por células pró-embrionarias ou
embriões em estágios iniciais de desenvolvimento. Esta fase, normalmente,
caracteriza-se pela redução dos níveis de auxinas no meio de cultura, bem
como de outros fatores, dependendo da espécie em estudo.

A fase seguinte da embriogênese somática consiste em estimular a

progressão das fases iniciais para as fases tardias, interrompendo os ciclos
repetitivos de divisão celular por meio de estímulos fisiológicos, bioquímicos e
ambientais para diferenciação celular, para ciclos de desenvolvimento e de
maturação, objetivando promover um grande número de embriões somáticos
maduros, aptos a se converterem em plantas.

No caso de espécies lenhosas, na Figura 5.7 é apresentado um

esquema de embriogênese somática indireta para urucum (Bixa orellana L.),
tendo como explante inicial embriões zigóticos – protocolo este desenvolvido
por Paiva Neto (2002).
 Fatores Envolvidos na Embriogênese Somática

Entre os vários fatores que podem interferir na embriogênese somática in vitro

estão aqueles relacionados com material genético (espécie e clone), tipos de explante
(foliar, caulinar, radicular, inflorescências), condições de cultura, como a luz
(intensidade, qualidade e fotoperíodo), meio de cultura utilizado (composição e
concentrações dos componentes), agentes gelificantes, pH do meio de cultura e,
principalmente, os reguladores de crescimento (tipo, concentração e período de
exposição do explante). O conhecimento dos processos e fatores que controlam a
embriogênese zigótica é de fundamental importância para se obter sucesso nas
diferentes fases que compreendem o processo da embriogênese somática in vitro
(GUERRA et al., 1998).

O fator genético é de extrema relevância, uma vez que a variabilidade genética

existente nas diferentes espécies e entre os indivíduos na própria espécie pode
apresentar requerimentos e respostas diferenciadas quanto à cultura para a indução
de estruturas embriogênicas.

No tocante ao tipo de explante a ser utilizado, vale salientar que ele pode
apresentar respostas diferentes em função da parte da planta onde foi coletado, pois
vários tecidos da mesma planta ou tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento
podem resultar em diferentes respostas quanto à indução de tecido embriogênico
(VENDRAME, 1994). Entre os vários tecidos utilizados como fonte de explantes para
obtenção de embriões somáticos, têm-se os discos foliares, segmentos internodais,
hipocólitos, cotilédones e tecidos florais. De modo geral, os tecidos derivados de
partes mais juvenis, como aqueles de embriões imaturos, têm apresentado as
melhores respostas à indução de embriogênese.

Em relação aos reguladores de crescimento especificamente, funções básicas

têm sido consideradas em relação ao processo de embriogênese somática, como a
iniciação e manutenção de culturas embriogênicas, o desenvolvimento de embriões e
a conversão dos embriões em plantas (BECWAR, 1993). As auxinas têm sido a classe
de reguladores de crescimento que tem apresentado resultados satisfatórios em várias
espécies para culturas de embriões somáticos, sendo o 2,4-D, em particular, o mais
utilizado (WANN, 1989). Uma característica de grande interesse, segundo Parrot et
al. (1991), é que, em concentrações adequadas de auxina, um embrião somático pode
dar origem a outros embriões somáticos, em um processo denominado embriogênese
repetitiva, recorrente ou secundária. Esses ciclos de embriogênese repetitiva para
perpetuar o estado embriogênico indefinidamente e produzir um grande numero de
embriões, o que faz da embriogênese somática um ferramenta poderosa capaz de ser
explorada para diversos objetivos, como a propagação em massa e a reprodução de
plantas transgênicas.

Aplicações da Embriogênese Somática na Área Florestal

Entre as várias aplicações da embriogênese somática in vitro, esta é tida como

potencial na multiplicação clonal de plantas, onde apartir da embriogênese repetitiva,
teoricamente, uma cultura iniciada de um único explante pode produzir um número
ilimitado de embriões, tornando o processo altamente atrativo para a produção maciça
de plantas (GUPTA et al., 1991). Aliado a isso, existe a possibilidade de produção
artificial de sementes pelo encapsulamento dos embriões somáticos, chamadas
comumente de sementes sintéticas (TERMIGNONI et al., 1996), com um mínimo de
manipulações e espaço físico de laboratório (BONGA; VON ADERKAS, 1992;
GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

O embrião somático, por apresentar um sistema radicular e caulinar na mesma

unidade, em muitas das situações mostra-se mais vantajoso em relação ao sistema de
micropropagação via gemas adventícias, por exemplo. Nesse caso, enquanto o
embrião somático desenvolve um sistema radicular pivotante, na organogênese ele é
adventício.

Com o desenvolvimento dessa tecnologia, a embriogênese somática in vitro

constitui uma alternativa na propagação de plantas, principalmente de clones
selecionados em um programa de silvicultura clonal. Alternativamente, a embriogênes
somática apresenta-se como uma técnica capaz de superar alguns problemas na
propagação em massa, especialmente para certas plantas lenhosas de difícil
enraizamento.

Outras aplicações da embriogênese somática in vitro dizem, respeito à sua

utilização como ferramenta na transformação genética, hibridação somática e
criopreservação.

Entre as limitações apresentadas pela embtiogênese somática, dificultando sua

utilização como sistema de micropropagação, estão à necessidade de obtenção de um
sistema de embriogênese reproduzível em larga escala (GRATTAPAGLIA;
MACHADO, 1998), a variabilidade genética indesejável introduzida pelo processo, a
perda da capacidade regenerativa pelos subcultivos sucessivos (PIERIK, 1997;
GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998) e a dificuldade ou impossibilidade de se
estabelecer um sistema de introdução por embriogênese somática em alguns
genótipos/espécies (PIERIK, 1997).

Nos últimos anos, vários trabalhos têm englobado um grande número de

espécies incluindo algumas dos gêneros Pinus e Eucalyptus, porém essa tecnologia
ainda se encontra em fase de desenvolvimento, limitando a sua aplicação na área
florestal em um processo comercial de produção de mudas. No caso de Eucalyptus,
podem-se citar trabalhos como Eucalyptus citriodora (MURALIDHARAN;
MASCARENHAS, 1987, 1995; MURALIDHARAN et. al., 1989), E. grandis (WATT et.
al.,, 1991; MAJOR et. al., 1997; TITON, 2005; CARVALHO, 2007), E. dunni
(TERMIGNONI et. al., 1996), E. nitens (RUAUD et. al., 1997; BANDYOPADHYAY et.
al., 1999; BANDYOPADHYAY; HAMILL, 2000), E. urophylla (TIBOK et. al., 1995;
ARRUDA et. al., 2000; CARVALHO, 2007), E. tereticornis (PRAKASH; GURUMURTHI,
2005) e E. globulus (NUGENT et. al., 1997, 2001; BANDYOPADHYAY et. al., 1999;
PINTO et. al., 2002). No entanto, um dos principais entraves à propagação clonal via
embriogênse somática é a baixa taxa de conversão de embriões somáticos em
plantas. Alida à técnica de clonagem de Eucalyptus utilizada atualmente em escala
comercial, a embriogênese somática apresenta grande potencial para
rejuvenescimento de materiais selecionados de difícil enraizamento, assim como na
regeneração de plantas transformadas genericamente. Uma vez obtidas estas plantas,
o material pode ser multiplicado em grande escala pela técnica de microestaquia,
difundida nas empresas florestais.

Para Pinus taeda e P. radiata tem sido proposta a clonagem de famílias

superiores através da embriogênese somática a partir de material vegetativo ainda na
fase juvenil, por meio de embriões zigóticos imaturos, em que são obtidos embriões
somáticos individualizados por planta, sendo em seguida criopreservados (XAVIER et.
al., 2007). Uma parte desses embriões somáticos é germinada, visando a obtenção de
mudas para serem implantadas no campo para seleção de árvores superiores em uma
determinada idade, de acordo com o interesse comercial. Assim, após a seleção da
árvore de interesse, o processo de multiplicação vegetativa em escala comercial inicia-
se a partir do resgate dos embriões criopresevados daquele material genético.

Fatores que Influenciam a Micropropagação

 As várias fases da micropropagação – seja ela via gemas axiliares,
organogênese ou embriogênese somática – dependem do controle de grande número
de variáveis; entretanto, o maior desafio encontra-se na determinação adequada do
material vegetal em si. Não menos importante, a manipulação do explante em todos os
passos até o transplante da planta produzida deve merecer a devida atenção,
sobretudo em relação às características do explante utilizado, ao procedimento de
subcultura adotado e às condições ambientais utilizadas durante o processo de
propagação in vitro. A seguir são discutidos alguns fatores que devem ser
considerados e que normalmente influenciam o sucesso da micropropagação.

Genótipo

O fator genético é de extrema relevância, uma vez que a variabilidade genética

existente nas diferentes espécies e entre os indivíduos na própria espécie pode
apresentar requerimentos e respostas diferenciadas quanto à propagação in vitro, seja
ela pela micropropagação por gemas axilares, organogênese ou embriogênese
somática. Além disso, as plantas variam consideravelmente na sua capacidade de
resposta no cultivo in vitro, em função do tipo de explante utilizado.

Fonte do Explante

O estado fisiológico e fitossanitário da planta cujos explantes são retirados tem

grande influência no posterior comportamento das culturas. Plantas sem sintomas de
deficiência nutricional ou hídrica, em geral, fornecem explantes melhores. A retirada
dos explantes deve ser feita de preferência a partir de brotações juvenis, que são
formadas durantes a fase ativa de crescimento da planta.

Outra condição a ser verificada é a sanidade da planta-mãe, a qual é

importante, visto que determinará a facilidade de desinfestar o explante durante o
isolamento. Apesar de se realizar desinfestação dos explantes, diversos
microrganismos de natureza endógena não são expostos aos agentes desinfestantes
e devem ser controlados na planta matriz.

Outro fator a ser considerado é a questão da juvenilidade do explante.

Normalmente, explantes provenientes de plantas juvenis são mais facilmente
propagados do que aqueles provenientes de partes da planta que expressam
condições madura. Assim, preferencialmente, deve-se optar por explantes juvenis,
porém se isso não for possível, deve-se promover o rejunescimento de partes da
planta doadora por tratamentos especiais antes da excisão dos tecidos.
Alternativamente, a indução de tecidos juvenis pode ser promovida por meio de podas
drásticas, quebrando a dominância apical e estimulando o desenvolvimento de gemas
na porção inferior da planta mais próxima da raiz. No caso de árvores que têm a
capacidade de rebrota da cepa cortada, o abate do individuo é comum, sendo indicado
também o anelamento parcial na base do tronco quando o abate não é possível.

Condições de incubação

De modo geral, os efeitos do oxigênio e dióxido de carbono, o tamanho do

recipiente, a temperatura, a umidade e a luz devem ser considerados ao definir as
condições de cultura de tecidos vegetais. Normalmente, as condições ambientais de
incubação na sala de crescimento são de um fotoperíodo mantido em 16 horas,
proporcionado por comutadores eletrônicos, com intensidade luminosa em torno de 30
a 60 mmol m¯²s¯¹; a temperatura desta sala é mantida, em geral, em torno de 27 ±1°C,
por meio de ar condicionado, visto ser esta condição adequada à maioria das espécies
de plantas de clima tropical. Quanto à umidade relativa do ar dentro da sala de
crescimento, esta deve ser mantida entre 60 e 70%.

Outro fator de importância refere-se ao microambiente dentro dos recipientes

de cultura, o qual é função do tamanho e do tipo de tampa e frasco utilizado e da
quantidade de meio de cultura presente no recipiente.

Contaminação

Na introdução de explantes em condições in vitro a contaminação é bastante

freqüente, por eles estarem expostos às condições naturais, que são fontes de
microrganismos. Apesar de a maioria desses microrganismos não ser patogênica, o
seu crescimento é acelerado no meio de cultura, a ponto de competirem por nutrientes
com os explantes, prejudicando o desenvolvimento destes (YAMAZAKI, 1995).

A desinfestação, o isolamento e a indução in vitro constituem uma das

principais etapas do processo de micropropagação; no caso de espécies lenhosas,
essa fase demanda bastante esforço no sentido de contornar os efeitos prejudiciais
das contaminações.
 Oxidação fenólica

Tecidos recém-excisados de espécies lenhosas, principalmente as folhosas,

tendem a secretar pigmentos escuros no meio de cultura, sobretudo polifenóis
oxidados e taninos, em resposta ao ferimento sofrido. Esses compostos inibem o
crescimento das raízes e podem chegar a matar o explante. Explantes originados de
plantas adultas tendem a produzir mais fenóis (CHALUPA, 1987 citado por THORPE
et. al., 1991).

A presença de compostos fenólicos em grande quantidade é um problema nos

tecidos de espécies lenhosas, pois são precursores da síntese de lignina. O problema
pode ser reduzido por meio de lavagem dos explantes em água corrente antes da
desinfetação, utilização de substâncias antioxidantes, incubação inicial dos explantes
no escuro ou sob intesidade luminosa reduzida, utilização de meios de cultura mais
diluídos, redução da concentração de fitorreguladores e transferências freqüentes dos
explantes (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

Hiper-hidricidade

A hiper-hidricidade, antes denominada vitrificação, é um distúrbio fisiológico

caracterizado por folhas translúcidas, espessas, encaracoladas em folhosas,
alongadas e com as acículas freqüentemente colocadas entre si em coníferas. O caule
apresenta-se espesso, hiper-hidríco e quebradiço. Os tecidos apresentam os
processos de lignificação e formação de cutícula reduzidos, e o tamanho das células é
maior devido à difusão excessiva de água (GASPAR et. al., 1987; BOULAY, 1985
citados por THORPE et.al., 1991).

Os ramos hiper-hídricos são difíceis de multiplicar e enraizar (BOULAY, 1985

citado por THORPE et. al., 1991) e, quando transferidos para o solo, murcham
rapidamente, sendo muito suscetíveis às infecções, acarretando baixa sobrevivência
das plantas (GASPAR et al., 1987 citados por THORPE et al., 1991).

Vários fatores podem contribuir para a indução da hiper-hidricidade, entre os

quais se encontram os ambientais, como a temperatura elevada e baixa intensidade
luminosa, a alta umidade relativa contínua do frasco de cultura, a baixa transpiração
dos explantes, o potencial hídrico do meio, a composição dos macro e micronutrientes
no meio, o tipo e concentração dos reguladores de crescimento usados (PASQUAL et.
al., 1997).

Automatização da Micropropagação

A biotecnologia vegetal tem aberto novas possibilidades de obtenção de

plantas, porém muitas vezes a propagação em larga escala mediante técnicas de
propagação in vitro, em quantidade e qualidade, tem sido fator limitante para muitas
espécies de plantas, principalmente para as lenhosas. Conforme Penchel et. al.,
(2007), inovações em aspectos específicos têm sido propostas, como a manipulação
da atmosfera e, ou, do ambiente in vitro com a propagação fotoautotrófica; o uso de
recipientes de cultivo alternativos, como aqueles recobertos com filmes que permitem
trocas gasosas para a propagação fotoautotróficas; novas fontes de iluminação à base
de diodos –LEDs e lâmpadas fluorescentes catódicas frias – CCFLs; novas
concepções de biorreatores, para viabilizar a produção econômica de mudas em
maiores escalas; técnicas de criopreservação; automatização das operações dos
sistemas de cultura de tecidos, entre outras.

O interesse pela automatização na cultura de tecidos tem despertado a

atenção de pesquisadores e profissionais dessa área, principalmente com relação à
aplicação da tecnologia em escala comercial, visando a necessidade de minimizar
custos na micropropagação. Segundo Penchel et. al. (2007), três alternativas
principais têm sido aplicadas na automação/mecanização: automação/mecanização
dos procedimentos rotineiros da micropropagação (preparo de meios de cultura,
repicagem das culturas e aclimatação das plantas propagadas); novas tecnologias
baseadas na utilização de sistemas de propagação em meio líquido; e sistemas de
cultivo in vitro alternativos. De modo geral, na busca de uma produção eficiente e
automatizada na micropropagação de plantas, preferencialmente, o sistema de
produção tem evoluído de uma pequena escala de pesquisa para um sistema de
cultura de alto volume e alta eficiência e utilizando meio de cultura líquido, objetivando
principalmente facilitar o manuseio.

Considerações sobre micropropagação

Ao decidir pela micropropagação, deve-se primeiramente avaliar o valor

genérico do clone a ser propagado, os objetivos a serem alcançados com a técnica,
assim como a disponibilidade de infra-estrutura, orçamentária e de pessoal
especializado. Deve-se estar ciente da variabilidade no processo de micropropagação
entre diferentes clones da mesma espécie e entre as espécies, pois não existe uma
receita única em que deverá ser ajustada uma metodologia ao clone em questão.

Entre as desvantagens e dificuldades do processo de micropropagação

encontram-se: alto investimento em instalações e treinamento de pessoal;
desenvolvimento de protocolos diferenciados para diferentes espécies ou grupos de
clones; contaminação do meio de cultura com microrganismos; e perigo associado
com a micropropagação horticultural, isto é, a possibilidade da disseminação acidental
de plantas doentes ou mutantes (quimeras). O custo da muda micropropagada deve
ser ponderado, pois, quando se deseja obter plantas livres de patógenos ou material
geneticamente modificado, por exemplo, uma vez obtida a muda de interesse, esta
pode ser multiplicada por outras técnicas de propagação de plantas técnica e
economicamente viáveis na área comercial.

Varias empresas florestais brasileiras fizeram investimentos nessa área na

década de 1980, porém muitos laboratórios foram fechados posteriormente, por
problemas metodológicos ainda existentes na cultura de tecidos e por falta de mão-de-
obra especializada. Atualmente, com o advento da microestaquia, a micropropagação
tem merecido atenção especial para a propagação clonal de Eucalyptus, visando
atender à fase de rejuvenescimento in vitro.

O desenvolvimento e a implementação da técnica de produção de mudas via

embriogênese somática também abrem perspectivas enormes para a adoção da
propagação in vitro de espécies florestais em um curto espaço de tempo.

Enxertia in vitro

Com o desenvolvimento das técnicas biotecnológicas, a propagação in vitro

tem sido considerada de grande importância, seja como técnica principal ou como
técnica auxiliar no desenvolvimento de outras. Entre as técnicas de propagação in
vitro, a micropropagação tem sido a mais difundida e com a aplicação comprovada
para as mais diversas finalidades. Por outro lado, a enxertia in vitro, apesar de pouco
utilizada, constitui-se em uma técnica com alto potencial de aplicação na propagação
clonal de várias espécies lenhosas, tendo como principais vantagens e objetivos
contornar problemas encontrados na enxertia ex vitro, como a incompatibilidade e
como técnica de limpeza clonal, além do propósito de rejuvenescimento de clones.
 A enxertia in vitro constiste em enxertar, sob condições assépticas, um
meristema apical ou ápice caulinar sobre um porta-enxerto estabelecido in vitro.
Assim, como na enxertia realizada na condição ex vitro, a enxertia in vitro consiste na
arte de unir partes de uma planta (enxerto) em outras que lhe sirva de suporte e de
estabelecimento de comunicação com o sistema radicular (porta-enxerto), de forma
que as duas partes de plantas diferentes passem a constituir uma somente, embora,
em nível genotípico, cada uma delas mantenha sua individualidade. As principais
diferenças em relação à enxertia ex vitro referem-se ao fato de a enxertia in vitro ser
conduzida em condições assépticas (culturas de tecidos) e as dimensões, tanto do
enxerto quanto do porta-enxerto, serem bastante reduzidas.

Em algumas literaturas, tem sido utilizada a terminologia microenxertia como

forma de referenciar a enxertia in vitro. No entanto, para o presente propósito, a
microenxertia será usada apenas nas situações em que a enxertia in vitro utilizar
merismas apicais como enxertos.

Historicamente, a enxertia in vitro foi inicialmente desenvolvida por Murashige

(1974), buscando a regeneração de plantas cítricas livres de vírus. Posteriormente,
essa técnica foi aperfeiçoada por Navarro et. al., (1975), os quais otimizaram a
metodologia aplicada na limpeza clonal de espécies Citrus. A partir de então, essa
técnica vem sendo aplicada para as mais variadas espécies, incluindo as espécies
florestais.

A Técnica de Enxertia in vitro

As principais etapas envolvidas na enxertia in vitro são o alinhamento entre o

câmbio vascular do enxerto e o do porta-enxerto; a adesão entre as partes enxertadas
mediante a proliferação de um calo na região de conexão; a diferenciação do câmbio
vascular ao longo da região de interface; e a diferenciação de tecidos vasculares
secundários a partir da atividade de novo câmbio vascular na região de união
(MOORE, 1984; ERREA et. al., 1994; HARTMANN et. al., 2002).

De modo geral, a enxertia in vitro envolve quatro etapas principais,

caracterizadas pela obtenção do porta-enxerto; obtenção e preparo do enxerto;
execução de enxertia propriamente dita; e aclimatação da planta enxertada na
condição ex vitro.
 Obtenção do Porta-Enxerto

Geralmente, os porta-enxertos são obtidos de sementes germinadas in vitro.

No entanto, dependendo do interesse e da disponibilidade, o porta-enxerto pode
proceder de gemas alongadas pela micropropagação (GEORGE, 1993). Alguns
aspectos positivos de se utilizar como porta-enxertos plântulas oriundas de sementes
referem-se ao fato de se tratar de um processo de produção simples e de custo
reduzido. Aliado a isso, muitas plântulas não retêm vírus que freqüentemente ocorrem
na planta matriz, e o sistema radicular desenvolvido pode ser aproveitado, uma vez
que fornece o suporte requerido para a planta enxertada. No entanto, a variabilidade
genética observada entre esses propágulos pode conduzir a diferenças de resposta
quanto ao crescimento e desenvolvimento do enxerto.

O uso de material clonal (gemas alongadas obtidas a partir a multiplicação

vegetativa in vitro) como porta-enxerto apresentam-se como alternativa para aquelas
espécies que demonstram dificuldades na produção de sementes viáveis, bem como
limitações quanto ao conhecimento da procedência e, ou, dos objetivos desejados.
Além disso, os porta-enxertos obtidos de propágulos vegetativos proporcionam maior
uniformidade e manutenção das características desejáveis (JORNARD, 1986),
merecendo destaque a transmissão de tolerância a certas doenças (HARTMANN et.
al., 2002), além da influência que exercem sobre o crescimento e desenvolvimento dos
enxertos.

Execução da enxertia in vitro

A enxertia in vitro propriamente dita ocorre em condições assépticas,

normalmente em câmara de fluxo laminar, onde, com uma pinça e um bisturi, prepara-
se o enxerto e, em seguida, o porta-enxerto. Após o devido preparo do porta-enxerto e
do enxerto, em condições assépticas, sob lupa binocular e com o auxilio de uma pinça,
é realizada a união de ambas as partes. Após a união, a planta enxertada é transferida
para um recipiente contendo meio de cultura e, em seguida, para uma sala de cultura
no laboratório, com condições ambientais controladas.

Bandeira (2004) utilizou a técnica de enxertia in vitro na propagação de clones

de Eucalyptus urophylla x E. grandis. No preparo dos porta-enxertos, empregou
plântulas germinadas in vitro, com 45 a 60 dias de idade e aproximadamente 2,0 cm
de altura. Sob condições assépticas, as plântulas foram colocadas sobre papel-filtro
umedecido com água deionizada estéril, sendo decapitadas no ponto imediatamente
abaixo do par de folhas cotiledonares. Durante a manipulação dos porta-enxertos,
apenas uma porção terminal do sistema radicular desses explantes foi retirada, no
intuito de facilitar a inoculação desse material vegetal nos tubos de ensaio após a
enxertia in vitro. Em seguida, foi realizada a abertura da fenda no porta-enxerto,
visando receber o enxerto. A obtenção dos enxertos se deu a partir de gemas
alongadas in vitro dos clones de Eucalyptus urophylla x E. grandis, com 30 dias de
cultivo, de onde foram extraídos os ápices caulinares, apresentando aproximadamente
1 cm de comprimento e dois a três pares de folhas totalmente expandidas. As gemas
alongadas in vitro foram retiradas dos frascos e colocadas sobre papel-filtro
umedecido com água deionizada e autoclavada; em seguida, foi realizado o corte em
bisel na porção terminal do ápice caulinar. Após o devido preparo do porta-enxerto e
do enxerto, foi realizada a união de ambas as partes. Em seguida, as plantas
enxertadas foram inoculadas e meio de culturas MS contido em tubos de ensaio (25 x
150 mm), que foram transferidos para uma sala de incubação, com condições
ambientais controladas de temperatura, luz e umidade.

No trabalho desenvolvido por Bandeira (2004), a etapa de aclimatização das

mudas enxertadas foi realizada em condições ex vitro; aos 50 dias de idade, as
plantas foram transferidas para a casa de vegetação, sendo as condições de umidade
em torno de 80% e a temperatura de 27 °C. No ato da transferência, os enxertos foram
cuidadosamente manipulados e o plantio realizado de forma que a região de união do
enxerto apresentasse a distância de aproximadamente 1 cm acima do nível do
substrato. As plantas foram transplantas para tubetes plásticos de 55 cm³, contendo
como substrato vermiculita de granulometria média e nutrição composta por 8 kg m¯³
de N:P:K (8:28:16). Após 25 dias em casa de vegetação, as plantas foram transferidas
para a casa de sombra (sombrite 50 %), onde permaneceram por sete dias, sendo
nessa etapa tutoradas com hastes de madeira. Em seguida, foram transferidas para a
condição de pleno sol, para rustificação. Durante o crescimento dos enxertos na
condição ex vitro, as plantas receberam nutrição suplementar e irrigação conforme a
necessidade para obtenção de uma vigorosa e sadia.

Na figura 5.9 é apresentado um esquema de enxertia in vitro para clones de

Eucalyptus urophylla x E. grandis, desenvolvido por Bandeira (2004), em que se
obtiveram 93% de sucesso no pegamento dos enxertos e 87% de sobrevivência na
aclimatação ex vitro das mudas enxertadas in vitro.
Figura 5.9 – Enxertia in vitro para clones de Eucalyptus urophylla e E. grandis. A:
fontes do enxerto – gemas alongadas in vitro pela micropropagação; B: fonte do porta-
enxerto-plântulas germinadas in vitro; C: enxerto preparado para a enxertia; D: porta-
enxerto pronto para receber o enxerto; E: planta enxertada; F: planta enxertada aos 50
dias de idade, na condição in vitro; G: detalhe da região de conexão entre o enxerto e
o porta-enxerto.

Fonte: Bandeira (2004).

Fatores que Influenciam o Sucesso da Enxertia in vitro

Entre os vários fatores que influenciam o sucesso da enxertia in vitro, merecem

destaque aqueles relacionados com a espécie de planta e o tipo de enxertia, a
afinidade e analogia entre as plantas, as condições ambientais de incubação do
enxerto, as contaminações endógenas e a habilidade manual do enxertador. Caso a
enxertia tenha a finalidade de limpeza clonal, deve-se considerar ainda patógeno a ser
eliminado (PAZ; PASQUAL, 1998).
 Em relação à espécie, os efeitos do genótipo podem ser marcantes,
principalmente para espécies florestais, em que a propagação vegetativa se mostra
com certa dificuldade. Algumas espécies florestais são recalcitrantes na
micropropagação, o que inviabiliza o sucesso da enxertia in vitro.

Outro fator a ser considerado é a analogia e afinidade entre o porta-enxerto e

enxerto, pois deve-se planejar o crescimento de ambas as partes para que elas
estejam adequadas no momento da realização da função do tamanho do enxerto a ser
utilizado na enxertia in vitro, bem como da resposta esperada deste.

As condições ambientais de incubação do enxerto devem ser observadas, pois

para algumas espécies florestais, como o Eucalyptus, na maioria das vezes, uma fase
inicial de 7 a 15 dias no escuro mostra-se vantajosa no pegamento do enxerto. Após
esse período, o enxerto deve ser transferido para condições de fotoperíodo de 16
horas, comumente adotadas nas salas de incubação de cultura.

As contaminações endógenas constituem-se em fator de grande importância,

visto a enxertia in vitro ser conduzida nas condições de cultura de tecidos. Assim, as
observações normalmente feitas para uma propagação in vitro, pelo sistema de
micropropagação, também são válidas para a propagação vegetativa por enxertia in
vitro.

Por fim, porém não menos importante, a habilidade manual do enxertador

merece toda a atenção possível. Devido ao reduzido tamanho, tanto do enxerto quanto
do porta-enxerto, a enxertia normalmente é realizada sob lupa binocular e com
manuseio de pinça e bisturi. Aliado a isso, geralmente o material vegetativo
manuseado é tenro, exigindo destreza e rapidez na execução in vitro.

Aplicações da Enxertia in vitro na Área Florestal

Entre as diversas técnicas de propagação vegetativa, a cultura de tecidos vem

se tornando uma importante ferramenta no atendimento das estratégias de
melhoramento genético de diferentes espécies. Entre as técnicas de cultura de
tecidos, alguns trabalhos com a enxertia in vitro vêm sendo conduzidos, especialmente
em espécies lenhosas de interesse comercial, como, por exemplo, as frutíferas de
maneira geral, e algumas espécies florestais de importância econômica, visando
atingir deferentes propósitos.
 Entre os principais objetivos no uso da propagação clonal pela enxertia in vitro
está a possibilidade de obtenção de explantes livres de contaminações, pela utilização
de ápices meristemáticos sem contaminação por microrganismos indesejáveis
(principalmente vírus) na propagação in vitro, constituído a chamada “limpeza clonal”.
Merece destaque também a aplicação da enxertia in vitro como técnica de
rejuvenescimento em espécies florestais, quando realizada de forma seriada, além dos
propósitos da condução de estudos relacionados ao fenômeno da incompatibilidade
entre enxertos e porta-enxertos.

Alguns trabalhos que envolvem estudos relacionados com o rejuvenescimento

são encontrados para Acacia mangium (MONTEUUIS, 1995), Persea americana e
Quercus rubra (PLIEGOALFARO; MURASHIGE, 1987; ZACZEK; STEINER, 1997),
Sequoila sempervirens (HUANG et. al., 1992), Larix decídua (KRETZSCHMAR;
EWALD, 1994; EWALD; KRETZSCHMAR, 1996) e Anacardium occidentalle
(MNENEY; MANTELL, 2OO1).

Em Eucalyptus, a enxertia in vitro ainda é pouco estudada, no entanto,

segundo Bandeira (2004), essa técnica apresenta potencial de aplicação no que
concerne à propagação clonal de certas espécies, as quais apresentam dificuldades
no que se refere às demais técnicas de propagação vegetativa. Ademais, essa técnica
pode ser utilizada para limpeza clonal, rejuvenescimento de clones adultos de
interesse comercial, bem como em associação a programas de hibridação e formação
de pomares de sementes de indivíduos superiores.
 Capítulo 6

Seleção Clonal
A seleção é um assunto de grande relevância na silvicultura clonal, visto que a
simples propagação vegetativa dos clones não é a garantia de um bom desempenho.
Assim, devem-se empregar critérios técnicos claros e bem estabelecidos em um
programa de seleção, em que a maior ou menor importância de cada critério depende
do estádio de desenvolvimento e local de atuação da empresa, bem como da
disponibilidade e do interesse da pesquisa na área do conhecimento.

O processo de seleção clonal envolve várias etapas, desde a seleção das

árvores superiores até a recomendação do clone para plantio, após a confirmação da
sua superioridade em testes clonais específicos. No entanto, a etapa de seleção clonal
é uma das mais caras e demoradas do melhoramento florestal.

O custo da avaliação clonal refere-se, principalmente, à manutenção de

grandes áreas com testes clonais e avaliações periódicas, que muitas vezes não
apresentam a mesma produtividade da floresta comercial. As áreas com testes clonais
são influenciadas diretamente pelo número de clones avaliados por unidade de tempo,
maior é a possibilidade de sucesso com a seleção. Contudo, o número de clones deve
ser compatível com os interesses, a disponibilidade de material genético e a situação
ambiental envolvida.

Outro ponto que merece destaque na seleção clonal é a idade de avaliação. No

melhoramento florestal, a idade de seleção que tem proporcionado maior
confiabilidade aos resultados é aquela representada pela idade de rotação da floresta
(colheita), embora o maior ganho genético por unidade de tempo não ocorra
necessariamente naquela idade. Assim, a demora na etapa de seleção, devido à idade
de avaliação dos testes clonais, é um entrave à recomendação de novos clones,
tornando-se um desafio que pode ser contornado com a adoção de estratégias que
aumentam os ganhos por unidade de tempo, uma vez que os melhores clones podem
ser identificados precocemente e, assim, transferidos para a produção comercial mais
rapidamente.
 Seleção de Árvores Superiores
Todo o processo envolvido em um programa de silvicultura clonal inicia-se com
a seleção da árvore superior, a qual irá originar o futuro clone por meio do processo de
clonagem. Nesse sentido, a correta escolha das árvores superiores deve ser feita de
maneira criteriosa, de forma prática e baseando-se em fundamentos científicos, os
quais são variáveis em função da metodologia de seleção, da espécie, da
disponibilidade de material genético, do tempo, das estruturas de apoio e,
principalmente, dos objetivos almejados com o processo seletivo. De modo geral, a
seleção da árvore superior pode ser realizada em áreas de florestas naturais, em
plantios comerciais e em áreas de florestas naturais, em plantios comerciais e em
áreas experimentais, como a dos testes de progênies.

Seleção Fenotípica
A seleção fenotípica é usualmente a mais utilizada no melhoramento vegetal
devido a sua plasticidade, baixo custo, rapidez, além de refletir bem a interação
“genótipo x ambiente”, que atua fortemente em espécies florestais, em vista de seu
ciclo longo. Entretanto, deve-se ter cuidado na avaliação de características com
coeficiente de herdabilidade baixo, pois nesses casos os efeitos ambientais
influenciam fortemente os resultados da seleção. Quando indivíduos superiores são
selecionados na época de corte, ou seja, em idades mais avançadas, a escolha
fenotípica é facilitada, mas os efeitos de competição (água, luz, espaço, nutrientes
etc.) estão mais acentuados, podendo provocar sérios erros na seleção fenotípica
(MORI, 1987; HERNANDEZ; ADAMS, 1992).

A seleção fenotípica de árvores superiores pode ser empregada em uma área

de ocorrência natural da espécie, onde normalmente ocorrem outras espécies
vegetais. Nessa situação, em geral, há uma concorrência desuniforme entre as
árvores da espécie selecionada e entre as demais de outras espécies, em razão de
uma distribuição aleatória dos indivíduos no espaço e tempo, dificultando o processo
de seleção. Normalmente, esse tipo de seleção é dificultado pela baixa freqüência com
que os indivíduos superiores ocorrem e pela grande influência dos efeitos ambientais,
obrigando o uso de altas intensidades de seleção. Contudo, essas árvores
selecionadas podem ser de grande valor genotípico, podendo proporcionar ganhos
imediatos na silvicultura clonal. Em algumas situações, como no caso de muitas
espécies florestais nativas, esse tipo de floresta constitui-se na única fonte disponível
para seleção de árvores superiores, visando o estabelecimento de um programa inicial
de silvicultura clonal.

O processo de seleção em plantios comerciais, normalmente implantados com

uma mesma espécie, em espaçamento regular e com árvores em uma mesma espécie
idade, é mais preciso, principalmente em razão da possibilidade comparativa e da
maior freqüência de árvores com as características desejadas. No processo de
seleção fenotípica de árvores superiores, a eficiência da seleção é dependente da
existência de uma boa variabilidade genética expressa pelo fenótipo das árvores alvo
de seleção dentro da população. Vale salientar que a seleção em plantios comerciais
constituiu a forma empregada no início da silvicultura clonal de Eucalyptus no Brasil,
sobretudo devido à existência de grande variabilidade genética das populações desta
espécie e de sua aplicabilidade (necessidade de resultado em curto prazo,
operacionalidade e eficiência obtida nos processos seletivos dos clones).

Independentemente da área onde será realizada, é importante que a população

submetida à seleção dos indivíduos superiores apresente variabilidade genética e
características adequadas ao produto que será obtido da futura floresta clonal. Para
isso, é fundamental a definição correta de critérios para a seleção.

Seleção Genotípica
O processo seletivo não deve se basear apenas nos dados observados na
avaliação de campo, devido aos vários fatores que podem estar influenciando o
comportamento do genótipo. Aos dados fenotípicos devem ser aplicadas funções
(métodos de seleção) que os transformam em dados genéticos/genotípicos e,
consequentemente, permitem maior precisão de seleção (RESENDE, 2005). No
entanto, esse procedimento requer a instalação de testes genéticos para aplicação
dos diferentes métodos de seleção disponíveis no melhoramento genético.

A possibilidade de uso de testes de progênies para seleção de árvores

superiores, visando a clonagem, tem sido considerada a forma mais adequada e de
maior eficiência, principalmente nas situações em que o programa clonal baseia-se em
características de baixa herdabilidade. Nessa situação, o uso de índice de seleção
combinado, com seleção entre e dentro de famílias, possibilita maiores ganhos em um
primeiro estádio, superando a simples seleção fenotípica. Os testes de progênies
instalados em locais representativos fornecem informações sobre o desempenho e o
valor genético das famílias mais produtivas e de maior estabilidade fenotípica (PIRES,
1996; CRUZ; CARNEIRO, 2003). Além disso, o estabelecimento de delineamentos
genéticos permite, entre outras coisas, reduzir a idade de seleção, consttuindo-se em
uma seleção precoce. Entretanto, vale ressaltar que a seleção de árvores superiores
em testes de progênies e, ou, com controle genético acarreta maior investimento em
testes de campo, tempo e recursos humanos na condução experimental.

Em Eucalyptus, nos programas mais avançados de silvicultura clonal, a

seleção de árvores superiores em testes de progênies tem sido empregada, visando
superar as seleções de árvores baseadas simplesmente nas características
fenotípicas, como aquelas realizadas em plantios comerciais sem controle genético.
Além disso, é comum a instalação de testes de progênies de Eucalyptus,
principalmente em razão do atual domínio da técnica de polinização controlada, o que
permite a síntese de híbridos inter e intraespecíficos. Os resultados desses
cruzamentos são famílias de alto valor, em que os melhores indivíduos são
selecionados e incluídos em um programa de clonagem visando a silvicultura clonal.
Segundo Assis e Mafia (2007), o aproveitamento comercial da heterose em híbridos
de Eucalyptus, por intermédio da clonagem, é um dos grandes responsáveis pela
rápida evolução da produtividade florestal nos últimos anos e um dos exemplos mais
bem sucedidos do uso de híbridos em espécies florestais.

Critérios de seleção
A seleção das árvores superiores considera, entre outras coisas, os indivíduos
que mais se destacaram em um determinado ambiente. Por isso, é importante verificar
todos os fatores que podem ter afetado o desenvolvimento e as características das
árvores para que o processo de seleção seja o mais eficiente possível. Para
Gonçalves (1990), o crescimento de um povoamento florestal é resultante de
processos fisiológicos, condicionados por um complexo de fatores de fatores
biológicos e ambientais. Nesse sentido, os principais determinantes biológicos da
produtividade florestal são a variabilidade genética, a densidade do povoamento, a
competição entre plantas e a intensidade de pragas e doenças. Assim, devem-se
minimizar os efeitos que possam refletir em um diferencial competitivo a favor de
algumas plantas, evitando selecionar indivíduos na bordadura do plantio, próximo a
clareiras, em depressões no terreno, próximo a curvas de níveis, ou seja, evitar a
seleção em microclimas que não representam as condições gerais do povoamento.

Os critérios utilizados na seleção do clone geralmente são definidos em função

da espécie florestal, da disponibilidade de infra-estrutura, do tempo e dos recursos
financeiros, assim como dos objetivos a serem alcançados, como, por exemplo, a
produção de madeira para celulose, carvão, serraria etc. Na silvicultura clonal de
Eucalyptus, a seleção de clones visando atender a indústria de celulose tem
considerado, normalmente, as seguintes características na seleção da árvore superior:
volume produzido, resistência a pragas e doenças, forma do tronco, desrama natural,
características de copa, composição e característica da casca, aptidão à rebrota,
aptidão ao enraizamento no processo de propagação vegetativa, densidade da
madeira e rendimento em celulose. O conhecimento dessas características é
importante para a definição do ideótipo desejado, o que facilita o processo de seleção.

A variabilidade genética e a qualidade dos indivíduos de uma população onde

será realizada a seleção das árvores superiores irão indicar a intensidade de seleção,
que nada mais é do que a relação entre o número de árvores selecionadas e o número
de árvores avaliadas. De modo geral, quanto maior a intensidade de seleção, maior é
a chance de ser encontrado algum clone comercial entre as árvores selecionadas. No
entanto, a utilização de alta intensidade de seleção implicará custos mais elevados,
em razão de um maior número de indivíduos avaliados inicialmente.

Uma estratégia eficiente para a seleção deve levar em consideração que o

desempenho de um genótipo em relação a outros varia de acordo com o ambiente, de
modo que genótipos superiores em um ambiente podem não o ser em outro, o que é
denominado de interação “genótipo x ambiente”. A maioria das espécies florestais
apresenta grande interação “genótipo x ambiente”, principalmente em virtude do longo
período de rotação. No entanto, uma forma de explorar beneficamente toda a
interação é a seleção clonal, ou seja, a seleção em ambiente mais semelhante
possível aos locais dos futuros plantios comerciais. A possibilidade de sucesso com a
seleção local é maior, visto os indivíduos estarem em contato com as futuras
condições ambientais de plantio e se destacarem dos demais, utilizando os mesmos
recursos disponíveis. No entanto, esse fato não impede que indivíduos selecionados
em um determinado local possam sobressair também em outro ambiente diferente.

A seleção de árvores superiores em diferentes idades é outro aspecto

importante a ser considerado, embora ainda seja motivo de poucos estudos no
melhoramento florestal. Tem sido recomendado selecionar os indivíduos superiores na
idade de rotação comercial, visto a seleção fenotípica ser facilitada pela estratificação
do povoamento, que ocorreu em função dos efeitos de competição mais acentuados.
Por outro lado, tem sido cada vez mais desejada a seleção de árvores em idades
precoces, visando diminuir o tempo requerido para avaliação e seleção, maximizando
os ganhos genéticos por unidade de tempo, além de proporcionar vantagens
adicionais, como experimentos menos duradouros, maior facilidade na obtenção de
dados e maior adaptabilidade às mudanças de objetivos. Contudo, avaliações em
estádios muito juvenis podem ter sua eficiência comprometida, devendo ser tratada
com devidas precauções e de acordo com as medições estabelecidas para a seleção.

As avaliações de sanidade devem constar de todo processo de seleção, visto

serem uma das grandes preocupações da silvicultura clonal, em razão dos riscos
advindos do plantio clonal, pela sua menor variabilidade genética. O ideal é fazer uma
monitoração da ocorrência dos fatores bióticos durante todo o desenvolvimento da
planta, pois na época. Ademais, o vigor da árvore superior na época de seleção não é
uma garantia de resistência aos agentes bióticos, pois essas árvores podem ter se
desenvolvido sem a presença da praga. Por isso, as avaliações da ocorrência de
pragas nas árvores selecionadas devem ser muito rigorosas e, consequentemente, as
árvores que apresentarem do processo de seleção, evitando o comprometimento de
futuros plantios em larga escala.

Resgate e Multiplicação da Árvore

Selecionada
Após a seleção das árvores superiores, as fases subseqüentes referem-se ao
seu resgate e multiplicação vegetativa. No entanto, essas etapas podem apresentar
alguns entraves no que se refere à multiplicação vegetativa, visto que na maioria dos
casos a seleção da árvore selecionada ocorre na idade adulta, pelo fato de o processo
seletivo ser preferencialmente realizado na idade de rotação.

Das técnicas de propagação vegetativa indicadas para resgate e multiplicação

clonal de árvores selecionadas, o enraizamento de estacas e a enxertia têm sido as
mais utilizadas na silvicultura clonal, principalmente em se tratando da planta na idade
adulta.
 Indução de Brotações Basais pela
Decepa
Esse processo consiste em decepar a árvore selecionada, buscando propiciar
a emissão de brotações na base da cepa, as quais são posteriormente enraizadas. O
objetivo é a obtenção de brotações com maior grau de juvenilidade, uma vez que, em
espécies florestais, há um gradiente de maturação em virtude da maior proximidade
com o meristema apical com o envelhecimento ontogenético. Como o interesse é a
propagação vegetativa, quanto maior o grau de juvenilidade dos propágulos, maiores
as chances de sucesso na sua clonagem.

Entretanto, vale salientar que esse procedimento é o restrito às espécies com

potencial de rebrota das cepas, o que limita sua aplicação a muitas espécies florestais,
como a maioria dos Pinus em idade adulta, onde ocorre grande dificuldade de rebrota.
Esse processo também é limitado para aquelas árvores com impedimentos ao corte,
por questões legais e, ou, operacionais. No que tange às espécies do gênero
Eucalyptus, essa técnica de resgate de árvores selecionadas encontra-se bem
estabelecida (figura 6.1).
 Resgate pela Enxertia
Em espécies nativas, dadas as limitações de conhecimento técnico e de ordem
legal, o início do processo de clonagem torna-se um grande desafio, uma vez que, de
forma contrária à das espécies de Eucalyptus, na maioria das vezes não é possível a
decepa das plantas para o resgate da árvore selecionada. Nessa situação, a forma
indicada tem sido o processo de multiplicação vegetativa por meio da enxertia, a partir
de enxertos obtidos na copa das árvores selecionadas. Nesse procedimento, as
brotações colhidas na copa são usadas na confecção dos enxertos, os quais são
enxertados sobre porta-enxertos formados a partir de mudas produzidas por meio de
sementes.

Uma vez obtida a planta pela enxertia, a parte aérea da planta enxertada
constitui-se em fonte brotações para confecção de estacas para enraizamento,
visando obtenção das mudas clonais destinadas ao processo de clonagem daquela
árvore selecionada.

A preferência pelo porta-enxerto formado a partir de origem seminal deve-se ao

fato de este ser juvenil, o qual poderá induzir juvenilidade no enxerto, proporcionando
assim melhor resposta das brotações no processo de propagação vegetativa da árvore
selecionada.

Em algumas circunstâncias, quando os resultados obtidos por esse processo

ainda não são satisfatórios, recomenda-se a realização de enxertia, estaquia e, ou,
micropropagação seriada, conforme detalhes abordados no capítulo 2 – Biologia da
Propagação Clonal, item Rejuvenescimento e Revigoramento.

Para Eucalyptus e Pinus, o resgate de árvores superiores tem sido aplicado em

alguns programas de silvicultura clonal. Mais detalhes acerca de técnica de enxertia
de espécies florestais podem ser encontrados no capítulo 3 – Propagação Clonal pela
Enxertia.
 Outras Técnicas de Resgate de
Árvores Selecionadas
Existem várias técnicas de resgate, em que a planta selecionada é mantida
intacta em sua condição de campo. A utilização destas juntamente com as técnicas de
enxertia permite continuar realizando as avaliações na própria árvore selecionada e
possibilita o resgate de árvores que estão em áreas de produção de sementes (APS),
pomares de sementes ou em testes de progênies, sem prejudicar a produção de
sementes e, ou, comprometer os resultados dos experimentos.

Em algumas situações tem sido possível a utilização do anelamento na base

do tronco da árvore selecionada, objetivando a indução de brotações basais. As
brotações que ocorrem abaixo do ponto de anelamento (figura 6.2 a) são utilizadas na
propagação clonal pela estaquia. Entretanto, a eficiência desse método é dependente
da espécie/genótipo, da época do ano, das condições ambientais e fisiológicas da
planta, assim como da intensidade e praticidade do anelamento realizado.

Procedimentos de indução de brotações basais pela ação do fogo também têm

sido relatados na literatura (figura 6.2 b). Segundo Alfenas et al. (2004), para
Eucalyptus, esse método consiste em promover a aplicação de fogo de forma
controlada na base do tronco da árvore selecionada, para estimular a indução de
brotações basais. Segundo esses autores, tal método é baseado no princípio da
degradação de auxinas endógenas pelo calor, de modo a desequilibrar a relação
auxina/citocinina, promovendo a indução de brotações na região do coleto,
imediatamente abaixo da área afetada pelo fogo. Vale destacar o risco do uso do fogo
em relação a incêndios florestais, requerendo maiores cuidados e tempo na sua
execução, assim como as respostas diferenciadas entre plantas/espécies em relação
aos efeitos da ação do fogo.

O uso de brotações epicórmicas induzidas em partes de ramos e galhos da

árvore selecionada constitui-se em outra opção potencial para o resgate de material na
idade adulta. Nesse método, faz-se a coleta de galhos e, ou, ramos, os quais são
colocados em condições ambientais adequadas de umidade e temperatura para
emissão de brotações epicórmicas (figura 6.2 c). Essas brotações, ao atingirem
tamanho adequado, são estaqueadas, micropropagadas e, ou, enxertadas para
formação das mudas clonais. A eficiência de obtenção de brotações epicórmicas a
partir de ramos de árvores adultas para o resgate vegetativo foi avaliada por Rosa et
al. (2003) para IIlex paraguariensis, os quais concluíram que a técnica se mostrou
viável. As mesmas conclusões foram obtidas por Souza Junior et al. (2003), com
ramos destacados de cepas de Eucalyptus benthamii de 14 anos e Eucalyptus dunnii
de 10 anos de idade.

Alternativamente, o resgate da árvore selecionada pode ser feito por meio da

micropropagação. Como exemplo da aplicação dessa técnica, pode ser citado o
trabalho realizado em Eucalyptus benthamii por Hansel et al. (2005), com o resgate de
plantas estabelecidas no campo pelo uso de ápices caulinares. Entretanto, dadas as
limitações técnicas e de custos operacionais impostas por essa tecnologia, conforme
apresentado no capítulo 5 – Propagação in vitro de Espécies Florestais, seu uso tem
sido restrito.

Testes Clonais
Uma vez resgatada e multiplicada vegetativamente a árvore selecionada, a
instalação de testes clonais é recomendada, visando a seleção efetiva dos melhores
clones para o uso comercial. O teste clonal consiste no estabelecimento de
experimentos para confirmação e, ou, comparação de clones de árvores selecionadas
em condições de campo, instalados segundo em delineamento experimental em locais
representativos para indicação do desempenho do futuro plantio com os clones
selecionados.

As aplicações dos testes clonais na área florestal são decorrentes do fato de

que as árvores, uma vez clonadas, são resultado de fatores genéticos e ambientais,
que em conjunto expressam o comportamento daquele indivíduo propagado. De modo
geral, o conjunto de plantas de um determinado clone, ao ser propagado, possui uma
mesma constituição genética, sendo as variações observadas entre elas decorrentes
de fatores não-genéticos, como técnica de propagação, forma e tipo de propágulo
vegetativo utilizado, manejo e condições ambientais (temperatura, luz, água, entre
outras) na produção da muda e no crescimento das plantas nas condições de campo.
Assim, tornam-se de suma importância os testes clonais na avaliação do
comportamento dos clones quanto à sua resposta aos fatores não-genéticos, de
acordo com os objetivos de Avaliação definidos, uma vez que estes podem variar no
tempo e no espaço. Entretanto, vale salientar a existência de limitações na realização
dessa etapa, tanto em termos econômicos quanto técnicos e operacionais.

Meta dos Testes Clonais

Os testes clonais objetivam, entre outros, avaliar o desempenho clonal,
conhecer as interações “genótipo x ambiente”, comparar tipos de propágulos, estimar
parâmetros genéticos, estimar o efeito “C” (efeito de “clonagem”), assim como servir
como área de demonstração do desempenho da futura floresta clonal a ser formada.

Desempenho clonal
A silvicultura clonal por meio da propagação vegetativa de genótipos
selecionados tem permitido o estabelecimento de florestas clonais, proporcionando
maior uniformidade, melhor adaptação dos clones aos ambientes de plantio, maior
produção, racionalização das atividades operacionais e redução na idade de corte e
nos custos de colheita e transporte. No entanto, é imprescindível a instalação de
testes clonais para que se possam selecionar efetivamente os melhores clones e obter
informações prévias do desempenho destes, de extrema importância para a previsão
dos benefícios da utilização de um possível plantio clonal (figura 6.3)

Geralmente, os programas de silvicultura clonal baseiam-se, em uma primeira

etapa, na identificação e, ou, confirmação dos clones a serem utilizados quanto a sua
produtividade e manejo mais adequado. Assim, torna-se de suma importância que
esse teste clonal possa predizer o comportamento dos clones em teste, de modo que
reflita o mais próximo possível a condição comercial de plantio a ser adotado, visando
dar maior segurança nas interpretações e possibilidades de extrapolação para a área
operacional.

Na silvicultura clonal de Eucalyptus, os testes clonais têm sido instalados

utilizando delineamentos experimentais com parcelas de uma planta, parcelas lineares
de 5 a 10 plantas e parcelas quadrangulares de 4 a 49 plantas, além de plantios piloto,
como formas alternativas de buscar maior eficiência no processo seletivo. As
variações observadas são decorrentes, principalmente, de experiência da empresa,
espécie florestal, objetivos a serem alcançados, tempo disponível para obtenção de
resultados, disponibilidade de áreas para testes e de mudas, bem como da
disponibilidade.
 Avaliação da Interação Clone x
Ambiente
Esta avaliação busca identificar as possíveis interações entre “clone x sítio”,
“clone x nutrição”, “clone x espaçamento de plantio”, entre outros efeitos que possam
provocar mudanças no desempenho dos clones na sua classificação (ranking). Isso se
torna importante, uma vez que as áreas de plantio apresentam variações
edafoclimáticas e as práicas silviculturais estão em constante avanço.

Comparação de Tipos de Propágulos

Um dos principais objetivos deste tipo de comparação está relacionado à
quantificação das diferenças entre plantas oriundas da propagação vegetativa (clones)
e da propagação sexuada (sementes). Também, alguns testes buscam avaliar o
desempenho de desenvolvimento de clones oriundos de diferentes processos de
propagação vegetativa, como a estaquia, miniestaquia, microestaquia e
microporpagação, assim como de fatores relacionados com a idade ontogenética.

No primeiro caso, a principal preocupação está na seleção da fonte de semente a ser

usada, que na maioria das vezes serve como testemunha na definição da adoção da
clonagem para aquele local. Ou seja, como a maioria dos plantios comerciais iniciais é
oriunda de sementes, a expectativa é de encontrar clones que apresentem respostas
silvicultural e tecnológica superior. Outro fator importante está na obtenção de mudas
dos clones com padrões de formação (tamanho, vigor e estado fisiológico) o mais
uniforme possível e em quantidade suficiente, dentro de cada clone/tratamento, para o
estabelecimento do referido teste.

Em relação a avaliação do desempenho de desenvolvimento de clones

oriundos de diferentes processos de propagação vegetativa, podem-se citar como
exemplo os trabalhos realizados por Oliveira (2003) e Santos (2003), os quais
avaliaram o desempenho de clones híbridos de Eucalyptus spp., propagados pelas
técnicas de estaquia micropropagação, microestaquia e miniestaquia, quanto às
características de crescimento em altura e diâmetro (dap), bem como a produção de
biomassa da parte aérea, em diferentes locais do Estado de Minas Gerais. De acordo
com os resultados obtidos, conclui-se que os efeitos das técnicas de propagação não
resultaram em diferenças expressivas no crescimento em altura, dap e biomassa da
parte aérea, nas avaliações aos 4, 8, 16, e 24 meses de idade, para os clones
estudados.

Estimativa De Parâmetros Genéticos

Neste caso, parâmetros genéticos podem ser usados para predição de ganho
na utilização da propagação clonal, estimados a partir de um teste clonal. Assim, a
variação entre clones é usada na estimativa da variância genética total e para o
cálculo da herdabilidade no sentido amplo de um determinado caráter. Similarmente, a
estimativa de covariância permite estabelecer correlações entre caracteres e, ou,
idades. Os delineamentos experimentais usados são os mais variados, porém dentro
de uma estrutura que permite interpretações com base nos conceitos da genética
quantitativa. Na literatura, a estimativa de parâmetros genéticos tem sido abordada por
alguns especialistas da área de melhoramento genético, como Resende (2002), que
detalha procedimentos na obtenção dessas estimativas.

Estimativa do efeito “c”

Nesta meta, um dos principais objetivos é quanto à avaliação dos efeitos da
ciclófise e topófise, visto estas provocarem desempenho diferencial no comportamento
das plantas de um mesmo clone, quando estabelecidos em condições de campo.
Assim, esses fatores não somente contribuem para a variação dentro de clones, como
causam diferenças entre tipos de propágulos, possibilitando a estimativa de bias
referentes a esse tipo de efeito. Neste estudo, o interesse está na determinação da
dimensão desse efeito no resultado de uma avaliação clonal de um determinado clone,
grupo de clones, espécies etc.
 Demonstração/promoção da silvicultura
clonal
Neste caso, a localização do teste clonal constitui um dos principais fatores a
serem considerados, visto ser o objetivo principal, visto ser o objetivo principal a
demonstração e, ou, a promoção de clones visando a divulgação da silvicultura clonal
ou a apresentação destes para fins comerciais. Assim, os itens comentados
anteriormente se enquadram nessa situação, tomadas as suas devidas dimensões e
objetivos.

Fontes De Variação Na Avaliação Clonal

Além do genótipo, que está ligado intimamente à existência de variação
genética disponível na população amostrada para seleção, existem outros fatores que
podem interferir no comportamento dos clones, entre os quais se relacionam os efeitos
da competição entre plantas, do espaçamento de plantio, da idade de avaliação e das
características do local.

Competição Entre Plantas

As árvores de um mesmo genótipo, de modo geral, competem por um mesmo
recurso limitado, com as mesmas capacidades de uso de recursos e espaço
(LINDGREN, 1993). Assim, nos testes clonais em que todos os genótipos estão sob as
mesmas condições ambientais, a seleção de clones deve ser favorável àqueles que
melhor se desenvolvam “cooperativamente” dentro do plantio.

A competição tem lugar entre organismos coabitando em um mesmo ambiente,

quando a soma das suas necessidades excede os suprimentos disponíveis
(BERTOLOTI, 1986). Desse modo, devem ser consideradas as mudanças que podem
ocorrer no comportamento dos genótipos, como o desenvolvimento da floresta, devido
ao fenômeno da competição entre árvores, provocando mudanças na expressão
fenotípica (KAGEYAMA, 1983).
 A quantidade de plantas em determinada área afeta a dinâmica de crescimento
do povoamento, principalmente de espécies de rápido crescimento. De modo geral, a
demanda pelos fatores de crescimento (água, luz, nutrientes e espaço) é mais elevada
em populações mais densas. Assim, os níveis de competição intra e, ou,
interespecífica são influenciados pela densidade populacional utilizada, determinando
a intensidade de estresse a que as plantas estarão submetidas (LEITE, 1996; LELES
et al., 1998).

A competição intergenotípica é aquela que ocorre entre plantas com genótipos

diferentes, onde as variações resultantes do ambiente sobrepõem-se às variações
genéticas. Já a competição intragenotípica é aquela que se estabelece entre plantas
de um mesmo clone, atribuindo-se as diferenças observadas no crescimento delas ao
ambiente variável.

Segundo Nogueira (1999) a competição por espaço, ar, luz, umidade e

nutrientes, durante o desenvolvimento do povoamento, gera diferenciação entre as
plantas. As árvores mais rigorosas tendem a aumentar anualmente sua altura, o
tamanho do tronco, o comprimento dos ramos e o número de folhas; portanto, exigem
aumento contínuo de espaço para garantir sua sobrevivência e manifestar suas
condições vitais. Essas árvores mais vigorosas e mais adaptadas sobrepujarão as
menos adaptadas.

A maioria das espécies de rápido crescimento, como o Eucalyptus, é sensível a

competição, ocorrendo, durante seu crescimento, intensa segregação do talhão em
árvores dominantes, codominantes e dominadas. O tempo para definição dos estratos
varia de acordo com o espaçamento, a espécie, a capacidade produtiva, a variação
genética, o regime de manejo e a interação entre os fatores (PATINÕ-VALERA, 1986).
Assim, a competição está sujeita à influência sistemática da densidade de plantio, da
fertilidade do solo e das condições de cultivo.

Espaçamento de Plantio
Na silvicultura clonal, o espaçamento utilizado em um plantio pode afetar
substancialmente o crescimento, devido à competição entre as árvores vizinhas pelos
mesmos recursos. Além disso, segundo Mora (1986), há tendência de aumentar a
interação dos clones com o espaçamento de acordo com o aumento da idade. Isso se
justifica pelo fato de que o efeito do espaçamento torna-se mais marcante conforme
cresce a competição, o que está diretamente relacionado com a idade.
 Como a avaliação precoce é desejável nos testes clonais, Bouvet (1997)
recomenda a utilização de pequenos espaçamentos para o estabelecimento de testes
clonais de Eucalyptus, pois assim há aceleração da maturação do genótipo,
propiciando alta correlação juvenil-adulta e evitando, também, o agravamento da
competição intraclonal. Ademais, testes clonais em espaçamentos reduzidos permitem
a formação de blocos mais densos e melhor controle da matocompetição, devido à
rapidez de fechamento das copas; em uma mesma aérea, há possibilidade de testar
mais clones, aumentando assim a intensidade de seleção e a possibilidade de ganho
genético, além de reduzir os custos de manutenção. Por sua vez a utilização de
diferentes espaçamentos possibilitará a identificação daquele mais adequado para
uma determinada finalidade comercial.

O espaçamento entre árvores deve estar relacionado com os objetivos da

floresta, pois a disposição das plantas influencia o manejo a ser adotado, o custo da
colheita e a idade da rotação (COUTO, 1977), bem como as características da
madeira produzida. Segundo esse autor, plantios mais adensados provocam
colonização e saturação mais precoce do ambiente de implantação, levando a uma
estagnação do crescimento. Espaçamentos mais amplos apresentam crescimento
contínuo das plantas até idades mais avançadas, quando começa a ocorrer a
competição. Práticas de manejo como o controle de matocompetição, desrama,
adubação, entre outras, são afetadas pelo espaçamento, pois, quanto maior o número
de plantas por área, maior será a utilização dos recursos naturais disponíveis no
ambiente. Assim, para a definição do espaçamento a ser adotado na formação da
floresta devem-se considerar vários fatores econômicos e silviculturais, além da
espécie e, ou, clone utilizados no plantio.

Avaliação Experimental
A avaliação experimental é considerada passo primário na seleção de clones
para a implantação de um programa comercial de reflorestamento. De forma geral, a
estratégia mais recomendada tecnicamente divide o processo em quatro fases: 1)
seleção inicial de grande número de árvores superiores, as quais são propagadas
vegetativamente, constituindo os clones; 2) análise rápida destes clones selecionados
em teste clonal por meio de uma avaliação precoce em relação à idade de rotação
desejada para o uso daquele material clonal; 3) implantação de um teste clonal para
avaliação mais minuciosa do desempenho de um número moderado de clones
selecionados na fase anterior; e 4) avaliação do desempenho comercial (plantio piloto)
de um número reduzido de clones selecionados anteriormente. Na prática, algumas
dessas estapas podem ser eliminadas por questões relacionadas a custo ou tempo
disponível para a seleção de clones para um determinado programa de silvicultura
clonal, bem como é dependente da espécie e dos riscos que a empresa pretende
correr.

Nessas avaliações, principalmente na última fase, são avaliados os materiais

genéticos comerciais (clones ou sementes melhoradas) como testemunha, visando
uma analise comparativa de produtividade comercial. Em outros casos, são incluídos
clones comprovadamente superiores em escala comercial como testemunha, para fins
de interpretações estatísticas e evidenciar os possíveis efeitos ambientais. Nesses
ensaios, as avaliações devem considerar os efeitos da repetibilidade do desempenho
do clone (função principal dos aspectos de propagação vegetativa) e de sua
estabilidade em uma classificação clonal ao longo de sua avaliação.

Nos programas de silvicultura clonal de Eucalyptus, por exemplo, visando o

reflorestamento para atender a demanda da indústria de celulose e energia para
siderurgia, a etapa inicial ocorre com grande número de clones, em que se adotam
parcelas pequenas e em vários locais, com a seleção acontecendo aos dois a três
anos de idade, com base em características silviculturais e tecnológicas. Na segunda
etapa, os melhores clones selecionados na etapa inicial são avaliados em
experimentos maiores (teste clonal ou plantio piloto), a fim de avaliar o desempenho
representativo em plantio comercial.

Local
A capacidade produtiva do local é um dos principais fatores que influenciam o
comportamento de um clone. Essa influencia ocorre devido às diferenças nas
características físico-químicas do solo, na drenagem, no relevo, no subsolo e nos
tratos culturais em anos anteriores. Assim os fenótipos das árvores estabelecidas em
diferentes locais podem ser influenciados, positiva ou negativamente, pelo ambiente
no qual crescem e competem, gerando interações “genótipo x ambiente” (PATINÕ-
VALERA, 1986). Woods et al. (1995) relatam que apenas a preparação do local e o
controle de plantas daninhas foram suficientes para uma redução efetiva da
variabilidade presente no microambiente nas características do padrão de campo,
permitindo um crescimento mais homogêneo das árvores, que, sem competição
ambiental, expressaram o seu verdadeiro potencial genético mesmo quando avaliadas
em uma idade precoce.

A interação “clone x ambiente” ocorre quando genótipos apresentam

desempenho diferenciado em vários ambientes, de forma que genótipos superiores
em determinados ambientes podem não o ser em outros e vice-versa. Isso pode faze
com que a média dos clones em um ranking de genótipos mude substancialmente de
um ambiente para outro. Além disso, há tendência de essa interação se manifestar
com maior intensidade com o passar da idade, visto ocorrer a ocupação plena do sítio,
independentemente do espaçamento adotado no inicio; isso provoca a competição
pelos recursos, levando a um aumento na variação entre plantas dentro da parcela.

Segundo Mori (1987), ambientes mais produtivos possuem maior

disponibilidade de recursos para o desenvolvimento e propiciam crescimento mais
homogêneo da maioria dos indivíduos. No entanto, quando a capacidade produtiva
não atende às necessidades individuais das plantas, a competição entre indivíduos se
estabelece mais cedo, provocando redução na uniformidade do plantio.

As diferentes características qualitativas e quantitativas de interesse

apresentam graus distintos de interação, ou seja, há características que sofrem mais o
efeito do ambiente do que outras. As características controladas por poucos genes são
menos afetadas pelo ambiente, mostrando-se mais estáveis em diversos locais. Com
as características sob controle de muitos genes ocorre o inverso: há menor controle
genético, com maior influência do ambiente (GOMES, 1996). Segundo Bergmann
(1998), a interação com o local provoca influência significativa no desempenho das
plantas, principalmente na sobrevivência.

Outros
Além das fontes de variações citadas anteriormente, outras têm sido relatadas,
como a qualidade das mudas, o manejo silvicultural adotado, o comportamento dos
clones e a taxa de mortalidade, os quais podem contribuir para a heterogeneidade das
plantas de um mesmo clone dentro da parcela experimental ou mesmo em um plantio
comercial. Esses fatores devem ser considerados na escolha das técnicas
experimentais e na condução do teste clonal.

A variância dentro dos clones se deve apenas à variância ambiental dentro da

parcela, uma vez que os clones são propagados vegetativamente. Na fase inicial, a
qualidade da muda, ligada a aspectos fisiológicos, parece influenciar o crescimento,
aumentando a variância dentro do clone; entretanto, com o desenvolvimento há
tendência de uniformização (KIKUTI, 1988).

Um dos fatores responsáveis pelas variações dentro de um mesmo clone,

segundo Scarassati (1993), é o “efeito C”, que não pode nem deve ser visto como
anomalia do desenvolvimento da planta, e sim como um fator que não pode ser
controlado durante um processo e, ou, por falta de conhecimento adequado. Esse
autor classifica as causas do “efeito C” em três componentes: 1)efeito ambiental; 2)
padrão de qualidade das mudas; 3) aspectos morfológicos e fisiológicos. Por outro
lado, Xavier e Comério (1996) sugerem a utilização de material vegetativo
rejuvenescido in vitro como forma de promover a minimização do efeito “C” (efeito da
clonagem), levando, consequentemente, à maior homogeneidade e produtividade
florestais. Embora a influência do efeito”C” seja reduzida com o passar do tempo,
pesquisas têm evidenciado que se deve tomar precaução na produção de propágulos
para implantação dos testes clonais, afim de que haja equilíbrio dentro de tratamentos
e entre estes (clones), principalmente quando for desejável a seleção precoce
(FLAMPTON; FOSTER, 1993).

Mudança drástica no ambiente dos povoamentos florestais podem ser

produzidas quando da utilização intensiva de práticas de manejo florestal, visto que o
ambiente pode ser mudando durante o cultivo pela utilização de adubações,
irrigações, podas ou desbastes, além de outros tratos culturais, que podem influenciar
diretamente o solo e o crescimento das árvores. Ainda que aparentemente o ambiente
não mude por influência externa, conforme as árvores crescem, os genótipos
apresentam a tendência de modificar o ambiente em que vegetam.

A mortalidade de plantas na parcela experimental também constitui efeito que

pode afetar a avaliação clonal, visto reduzir o número de plantas úteis a serem
avaliadas, provocando heterogeneidade no plantio e, consequentemente, aumentando
a variância entre os clones e dentro destes. Além da mortalidade natural atribuída a
fatores aleatórios, existe a tendência de se elevar a mortalidade das árvores à medida
que a densidade populacional aumenta.

Características Avaliadas
O teste clonal permite proceder à caracterização dos genótipos nos seus
aspectos morfológicos, fisiológicos e nutricionais. Desse modo, podem-se analisar,
além dos critérios silviculturais (volume da árvore, tolerância às pragas e doenças,
capacidade de autodesrama, tamanho da ramificação, conteúdo de casca, capacidade
de brotação e de enraizamento etc.), as propriedades da madeira de acordo com os
objetivos do plantio. Isso faz com que as técnicas e métodos de melhoramento
empregados nas empresas de celulose sejam diferentes, por exemplo,daqueles
utilizados nos setores siderúrgico, moveleito, etc. Assim, quando se trata em qualidade
da madeira ou outra característica de alto valor agregado, a atenção deve ser
redobrada no que se refere à idade de avaliação dos materiais genéticos e com o
coeficiente de herdabilidade de certas características.

Como visto, as diferentes características qualitativas e quantitativas de

interesse para o melhoramento apresentam graus distintos de interação, ou seja, há
características que sofrem mais o efeito do ambiente (poligênicas) do que outras
(oligogênicas), em razão de as espécies florestais estarem mais sujeitas a grandes
variações climáticas pelo longo ciclo, podendo influir nos resultados de uma seleção.
Com isso, há tendência de a interação “clone x ambiente” se manifestar com maior
intensidade em idades mais avançadas do plantio clonal.

A maioria dos caracteres de interesse econômico considerados no julgamento

de um material genético manifesta-se de maneira quantitativa e sofre acentuada
interferência dos efeitos ambientais, exigindo, assim, tratamento estatístico adequado,
número suficiente de repetições e maior uniformidade do ambiente (CHAVES, 1985;
SILVA, 1990).

Com o intuito de simplificar o número de caracteres avaliados e devido à

insensibilidade à densidade do local, a altura das árvores tem sido adotada como a
principal característica para o melhoramento visando a produção de madeira. Desse
modo, segundo Foster (1993), muitas pesquisas têm sido desenvolvidas considerando
a altura para uma seleção indireta, sendo esta potencialmente capaz de indicar o
provável desempenho futura da árvore. Essas informações podem ser usadas para
uma filtragem, com eliminação dos materiais/clones de péssimo desenvolvimento.

Quando o objetivo da seleção é definido com base em vários caracteres de

interesse econômico, estando implícito que se deseja melhorar simultaneamente
vários deles, é comum o emprego de índices de seleção. Nesse caso, o programa de
seleção genética deve estar bem estruturado, com programas computadorizados
(RESENDE, 1994).
 Segundo Hernandez e Adams (1992), a utilização de vários componentes para
o índice de seleção pode requerer informações a priori, que não podem estar
disponíveis, devendo ser obtidas por meio de estimativas de outra população. Embora
esse problema seja comum para qualquer critério de seleção precoce, ele se torna
mais sério quando o numero de características incluídas aumenta. Para obter os
custos de associar uma característica extra, avalia-se a informação obtida nos
componentes da densidade individual e compara com os ganhos adicionais esperados
do incremento na eficiência.

Os testes clonais também têm sido usados com muita frequência para verificar
a resistência dos clones a determinada doença, principalmente quando se tem
conhecimento de alguma ocorrência importante na região do plantio. Na maioria das
vezes, o delineamento experimental utilizado permite a inoculação do patógeno em
relação ao qual se deseja avaliar o nível de resistência do clone.

Quando possível, outras características devem ser empregadas no processo

de seleção, como, por exemplo, a eficiência nutricional, que é a capacidade de
absorção e, ou, de utilização de nutrientes para a síntese de biomassa, podendo ser
utilizada como característica auxiliar na seleção dos clones, priorizando, entre os
clones mais produtivos, aqueles mais eficientes na utilização de nutrientes (GOMES,
1996). A arquitetura da copa da árvore também pode ser usada como critério de
avaliação, pois a as folhas e os galhos são rotas condutoras para a precipitação
interceptada e podem ter grande influência na umidade do solo e no ciclo hidrológico
da floresta (LELES, 1998).

Delineamento Experimental
Ao instalar um teste clonal, de acordo com os objetivos a serem alcançados, a
definição do delineamento experimental é de suma importância, uma vez que as
informações obtidas a partir deste devem ter a maior confiabilidade. Assim, a definição
de delineamento experimental, número de repetições, tamanho e forma das parcelas
deve ser considerada de acordo com os objetivos a serem alcançados na
experimentação, de forma a satisfazer um mínimo de confiabilidade nos dados
obtidos.
 Fatores Envolvidos na Definição do
Delineamento
Existe certo consenso na área florestal quanto à adoção do delineamento em
blocos ao acaso, tendo em vista as diferenças entre os locais do plantio poderem
serem ajustadas para a seleção, minimizando os efeitos do local. No entanto, um dos
inconvenientes desse delineamento é a ocorrência de uma grande variabilidade de
ambientes a serem testados.

A resposta de uma planta ao ambiente se deve à sua constituição genética e,

geralmente, varia com a idade. Desse modo, o delineamento experimental deve ser
compatível com a época em que o experimento for avaliado e com a variável de maior
importância, em razão da necessidade de se aumentar a precisão experimental de
acordo com o incremento da idade de avaliação.

Outro fator importante a ser considerado na escolha do delineamento

experimental é em relação ao número de tratamentos (clones) a serem avaliados em
um ensaio. Ele deve ser compatível com os interesses e a realidade da empresa,
porém um maior número de clones aumenta a probabilidade de se obter um clone
ideal para uma condição específica, bem como maior segurança contra pragas e
doenças. Em geral, para um dado delineamento experimental, um tamanho menor de
parcela tem sido utilizado à medida que se aumenta o número de tratamentos (clones)
a serem testados, tendo em vista a limitação do tamanho do experimento. Além disso,
a formação de grandes blocos experimentais pode provocar uma indesejável
heterogeneidade ambiental dentro de cada bloco.

O ambiente onde será instalado o teste clonal também deve ser considerado
na definição do delineamento experimental, visto a interação com o local provocar
influência significativa no desempenho das plantas, principalmente na sobrevivência.
Assim, a precisão experimental é afetada, diante de uma grande mortalidade, pela
redução do número de plantas úteis a serem avaliadas, provocando a
heterogeneidade no plantio e, consequentemente, aumento da variância dentro do
experimento (BERGMANN, 1998).

Um fator envolvido na precisão dos resultados de um experimento é o número

de repetições. De modo geral, o aumento do número de repetições tem sido mais
eficiente que o tamanho da parcela para elevar a precisão experimental (STORCK;
UITDEWILLIGEN, 1980; CHAVES, 1985; VALLEJO; MENDONZA, 1992). Dessa
forma, na definição do delineamento experimental é necessário conjugar tamanho e
forma de parcela com o número de repetições para obter as melhores estimativas dos
parâmetros dos genótipos, bem como considerar os valores de herdabilidade no
sentido amplo para cada caráter alvo da seleção clonal, conforme apresentado por
Resende (1995).

Tipo e Forma Da Parcela Experimental

Um aspecto de grande relevância na avaliação clonal é a determinação do
conjunto de técnicas estatístico-experimentais adequadas ao processo de seleção
clonal. Segundo Oliveira e Estefanel (1995), os pesquisadores, muitas vezes, adotam
delineamentos experimentais empiricamente usando tamanhos práticos no sentido da
condução do experimento, da área disponível ou de sua experiência. De modo geral,
cada empresa florestal adota um tamanho de parcela experimental de acordo com
suas necessidades e peculiaridades, não existindo uma padronização dos testes
clonais no Brasil.

Na determinação da melhor parcela experimental, além da precisão estatística,

outros fatores importantes devem ser considerados, como número de tratamentos,
número de repetições, uso de bordadura, tipo da cultura, nível de tecnologia
empregado e disponibilidade de recursos financeiros ( VALLEJO;MENDONZA;1992,
VIANNA,1999). Assim, segundo Oliveira e Estefanel (1995) e Viana (1999), o tamanho
e a forma das parcelas não podem ser generalizados, pois variam com o solo, as
condições climáticas e a cultura. A seguir são mencionados os principais tipos e
formas de parcela experimentais utilizados na Avaliação clonal, sobretudo para a
cultura de Eucalyptus no Brasil.

Parcela de Planta Única

A redução máxima do tamanho da parcela pode ser alcançada com a utilização
de uma única planta como unidade experimental. O uso de parcelas de planta única
permite aumento de no número das repetições sem aumentar o tamanho do
experimento. Além disso, segundo Storck e Uitdewilligen (1980), Chaves (1985) e
Vallejo e Mendonza (1992), o aumento do número de repetições tem sido mais
eficiente que o do tamanho da parcela para elevar a precisão experimental. Dessa
forma, na definição do delineamento experimental pode-se conjugar tamanho e forma
de parcela com o número de repetições para obter as melhores estimativas dos
parâmetros dos genótipos.

Segundo Andrade (2002), é evidente que para um mesmo experimento, avaliar

um maior número de plantas leva a maior eficácia. No entanto, especialmente nas
etapas iniciais do programa de avaliação de clones, quando há centenas de
tratamentos (clones) para serem avaliados e não há possibilidade de obter grande
quantidade de mudas para todos os clones, é impossível utilizar parcelas maiores.
Esse autor relata que, mesmo com parcelas de uma planta, é possível identificar com
eficiência os melhores clones. Vale ressaltar que o emprego de parcelas de planta
única é melhor para classificar os clones de modo que os melhoristas possam
identificar os mais promissores e passá-los para as outras fases da experimentação,
pois na classificação inicial dos clones o que deseja é que as classes sejam
identificadas em função das diferenças significativas e não devido a fatores aleatórios,
podendo descartar os materiais com comportamento inferior.

Algumas considerações devem ser feitas com relação a perda de plantas na

parcela única. A perda da planta equivale a perda da parcela, e os procedimentos
estatísticos para parcela perdida podem ser empregados na analise dos dados. Por
outro lado, a perda de poucas plantas em uma parcela com maior número de plantas
causa pequeno efeito se o número de plantas remanescentes fornecer uma média
razoável da produtividade da parcela. Desse modo, em locais com maior probabilidade
de ocorrer taxa alta de mortalidade das plantas, deve-se evitar o uso de parcelas de
planta única.

Atualmente, a seleção precoce em experimentos com parcelas de planta única

está sendo adotada na experimentação clonal em várias empresas que utilizam o
Eucalyptus, principalmente as do setor de papel e celulose (RESENDE;
BARBOSA,2005). Embora essas estratégias sejam necessárias e usualmente
empregadas, principalmente na avaliação de um grande número de clones, elas
podem não proporcionar uma informação adequada da produtividade. Além disso,
para maior precisão de definição, devem-se considerar outros fatores importantes,
como a sustentabilidade ou a qualidade da madeira (VIVALDI, 1990).
 Parcela Linear
As parcelas lineares vêm sendo utilizadas na silvicultura clonal de Eucalyptus,
principalmente em uma etapa inicial, em que se encontra um grande número de clones
e existe grande variação de ambientes e serem avaliados.

A grande utilização da parcela experimental com cinco a dez plantas em linha

se deve em parte à sua praticidade de instalação e mensuração na idade de
avaliação, pois é relativamente fácil a identificação da parcela e das eventuais falhas
(plantas mortas) dentro das parcelas. Outro motivo é a capacidade de visualizar o
comportamento do clone na linha. Ademais, o uso da seleção precoce e de parcelas
lineares tem permitido aumentar o número de materiais avaliados, o que é altamente
desejável, visto que a avaliação de maior número de clones eleva a probabilidade de
encontrar um genótipo que atenda aos objetivos do melhoramento.

Os procedimentais experimentais adotados no melhoramento de plantas têm

por objetivo avaliar materiais genéticos em diferentes fases do programa. Entretanto,
para que resultados experimentais apresentem interesse cientifico, é essencial que
eles sejam reproduzíveis. A precisão de um experimento está relacionada, portanto,
com a capacidade que este tem de levar a resultados que possam ser reproduzidos
com segurança (CHAVES, 1985). Segundo Gomes e Couto (1985), é possível reduzir
significativamente a área destinada aos experimentos florestais por meio de adoção de
parcelas lineares com várias plantas, sem, contudo, afetar a precisão experimental.

Parcela Quadrada
Quando se discute o tamanho das parcelas, além do número de plantas
propriamente ditas, há outros aspectos importantes, como o formatos da parcela e a
necessidade de bordadura. Uma possibilidade é o emprego de parcelas quadradas,
utilizando-se uma linha de plantas como bordadura interna no experimento. Com essa
estratégia, pretende-se reduzir a competição intergenotípica, que pode favorecer os
clones que apresentam crescimento inicial rápido, particularmente durante e após o
fechamento das copas, tendendo a perpetuar e ser cada vez mais expressiva, fazendo
com que o erro resultante do efeito de parcelas vizinhas tenha influência sistemática
nos efeitos dos genótipos (FRAMPTON; FOSTER, 1993). No entante, segundo
Andrade et al. (1997), o uso de bordadura interna em experimentos com apenas
clones superiores de Eucalyptus para evitar a competição intergenotípica é
desnecessário.

A questão da necessidade de bordadura nas parcelas é polêmica, mas vem

sendo utilizada em certos casos. Normalmente, adota-se uma bordadura dupla externa
ao experimento; em algumas situações de parcelas quadradas maiores de 16 (4x4)
plantas, pode-se adotar também uma bordadura simples interna na parcela. O objetivo
principal da bordadura externa ao experimento refere-se ao fato de esta isolá-lo de
efeitos externos, enquanto a bordadura interna busca minimizar os efeitos da
competição entre clones nas parcelas vizinhas. Recomenda-se que, na adoção de
bordadura interna, as plantas utilizadas sejam do mesmo clone. Assim, se for
considerada uma bordadura interna simples em uma parcela experimental de 49 (7x7)
plantas, têm-se, como parcel útil a ser avaliada, 25 (5x5) plantas centrais. No caso da
parcela linear, pode-se também adotar uma bordadura simples na linha de plantio, e a
primeira e a ultima planta seriam consideradas para tal fim.

Andrade (2002) relata que existem inúmeros trabalhos realizados com plantas
anuais que mostram, a partir de um número constante de plantas por parcela, a
vantagem do emprego de mais de uma linha de plantas por parcela. Segundo esse
autor, no caso de trigo, a utilização de parcelas quadradas forneceu dados úteis para
recomendação de cultivares; o desempenho obtido em parcelas experimentais foi igual
ao observado em nível de propriedade rural para os mesmos cultivares. No entanto,
na área florestal há uma desconfiança referente aos resultados encontrados nos
experimentos, mesmo utilizando parcelas quadradas, e não há nenhum relato
cientifico comparando o desempenho de clones de Eucalyptus em experimento e,
posteriormente, em plantios comerciais.

Plantio Piloto
As facilidades resultantes da redução do tamanho da parcela são
inquestionáveis, mas questiona-se se os resultados experimentais obtidos com
parcelas pequenas podem ser extrapolados para as condições de cultivo extensivo.
Especialmente, os profissionais que trabalham na área de manejo levantam dúvidas
sobre essa possibilidade, sendo comum na área florestal o emprego dos denominados
plantios piloto dos clones que estão em fase de recomendação comercial, para
aumentar a confiabilidade dos resultados antes do plantio em grande escala. Essa
estratégia é eficiente para identificação do verdadeiro potencial dos novos clones,
visando plantio comercial.
 Os plantios piloto na área florestal têm sido empregados geralmente em uma
fase final da seleção clonal. A partir da avaliação dos clones em parcelas menores e
em idades precoces, seriam selecionados os melhores clones, os quais seriam
novamente avaliados em parcelas maiores e em regiões representativas da área de
produção da empresa. O estabelecimento do plantio piloto aumenta a probabilidade de
obter um clone ideal que se adapte a uma condição específica, bem como fornece
informações com maior segurança a respeito de pragas e doenças. Ademais, as
avaliações realizadas nessas áreas permitem uma estimativa mais precisa da
produtividade esperada com o plantio do clone selecionado e do seu comportamento
em plantio maiores.

Um grande problema de estabelecimento de plantio piloto é o aumento de mais

uma fase de experimentação, o que torna o tempo de recomendação de material
genético maior. Além disso, a falta dos princípios básicos da experimentação agrícola,
ou seja, casualização, repetição e controle local, também é questionada, pois sem
estes é difícil proceder às análises estatísticas, as quais irão permitir a diferenciação
criteriosa entre is tratamentos (clones).

Uma estratégia muito utilizada na instalação de plantios piloto é a introdução

de materiais genéticos comerciais (clones ou sementes melhoradas) como
testemunha, visando uma análise comparativa de produtividade comercial. Em outros
casos, são incluídos clones comprovadamente superiores em escala comercial como
testemunha para fins de interpretações estatísticas e evidenciar os possíveis efeitos
ambientais. Nesses ensaios, as avaliações devem considerar os efeitos da
repetibilidade do desempenho do clone (função principal dos aspectos de propagação
vegetativa) e de sua estabilidade em uma classificação clonal ao longo de sua
avaliação.

Determinação do tamanho da parcela

Experimental
Conforme mencionado anteriormente, uma limitação quando se avalia um
grande número de clones tem sido o tamanho das parcelas, devido ao alto custo de
implantação, baixa disponibilidade de mudas, escassez de mão-de-obra, limitações de
área, aumento da área a se controlada e das avaliações periódicas. Assim, em um
programa de melhoramento que visa a obtenção de clones superiores de Eucalyptus,
a etapa de avaliação é a mais cara e demorada. Segundo Gomes (1984), é possível
reduzir significativamente a área destinada aos experimentos florestais por meio de
estudos relacionados ao tamanho das parcelas, sem contudo, afetar a precisão
experimental.

Entre os vários métodos de determinação do tamanho das parcelas

experimentais relatados na literatura, a maioria utiliza testes de uniformidade, a partir
dos quais são calculadas as variâncias e os coeficientes de variação das diferentes
dimensões de parcela (VIANA, 1999). Dos métodos aplicáveis à uniformidade, aquele
da curvatura máxima da função do coeficiente de variação experimental (CV exp) tem
se mostrado mais consistente (STORCK; UITEDEWILLIGEM, 1980).

Segundo Storck e Uitedewilligem (1980), o método da máxima curvatura entre

os coeficientes de variação e os respectivos tamanhos de parcelas, conforme descrito
por Federer (1955), é o precursor de muitos outros, como o método da máxima
curvatura modificado (LESSMAN; ATKINS, 1963), método da máxima curvatura entre
os coeficientes de variação e tamanho da parcela de Thomas (1974), método da
máxima curvatura entra as variâncias por unidade básica e o tamanho da parcela de
Thomas (1974) e método de regressão múltipla (LUGO, 1977).

Segundo Zanon e Storck (1997), para as espécies florestais em plantios com

espaçamentos regulares, o método para determinar tamanho ótimo de parcela
considerado o mais apropriado é o de Gomes (1984), em razão de ter sido
desenvolvido especialmente para o caso. O método consiste em determinar o
tamanho ótimo de parcelas experimentais considerando o coeficiente de correlação
interclasse relativo às árvores úteis dentro de cada parcela e define como tamanho
ótimo da parcela o número de árvores úteis que minimiza a variância média de um
tratamento.

Enfim, na definição do número de plantas na parcela, devem ser utilizadas

metodologias de determinação do tamanho da parcela experimental, considerando-se
as características do teste clonal, os objetivos da avaliação e o bom censo, de modo a
atender aos critérios estatísticos e silviculturais envolvidos na seleção e
recomendação clonal.

Resultados experimentais obtidos por Silva (2001), avaliando testes clonais de

Eucalyptus, levaram a conclusão de que o tamanho mínimo da parcela experimental,
com base nos métodos de máxima curvatura modificado pelo coeficiente de correlação
interclasse e pela análise visual, em programas iniciais para a seleção de clones, de 5
a 10 plantas, indica boa precisão experimental, sendo recomendado, principalmente,
em situação com limitações de mudas, teste de grande número de clones e avaliações
de cunho preliminar e em idade precoce. No entanto, o autor ressaltou que, para
melhor conhecimento do clone para uso comercial, parcelas quadradas maiores e, ou
plantios piloto são os mais indicados.

Seleção Precoce
Na silvicultura clonal, a demora na etapa de avaliação é um dos entraves à
recomendação de novos clones, devido ao ciclo de vida das espécies florestais. Desse
modo, a seleção precoce pode diminuir o tempo requerido para avaliação e seleção,
maximizando os ganhos genéticos por unidade de tempo, além de proporcionar
vantagens adicionais, como experimentos menos duradouros, maior facilidade para
tomada de dados e maior adaptabilidade às mudanças de objetivos (REZENDE et al.,
1994).

A seleção precoce e uma forma de seleção indireta, em que caracteres

avaliados em idades prévias à de rotação são utilizados como preditores de caracteres
economicamente importantes na idade de rotação (RESENDE, 1994). Assim, a
utilização de resultados preliminares obtidos deve ser feita com cautela, pois estudos
conduzidos por Mora (1986), para três caracteres (DAP, altura e densidade básica),
indicaram haver alteração na classificação dos clones; houve tendência de a interação
clone x ambiente se manifestar com mais intensidade com o acréscimo da idade.

No emprego da seleção precoce de forma eficiente, deve-se considerar a

correlação juvenil-adulta para as características em questão. Desse modo, estudos
sobre a correlação juvenil-adulta têm sido conduzidos, podendo ser implementada a
seleção em idades precoces, quando houver correlações significativas para as
características estudadas (SOUZA, 1994). Segundo Riittres e Perry (1987), há muitass
dúvidas e controvérsias sobre a possível correlação existente entre as características
estimadas precocemente em idades inferiores e o verdadeiro desempenho obtido na
idade de rotação, e esse aspecto vem sendo estudado para diversas espécies de
coníferas, com Pinus taeda e Pseudotsuga menziesii. Entretanto, Greaves et al. (1997)
acreditam que existe correlação entre as diferentes idades e a densidade da madeira
das plantações de Eucalyptus em crescimento, embora essa correlação ainda não
tenha sido relatada geneticamente.

Vários métodos têm sido propostos, visando medir a confiabilidade de um

caráter avaliado na fase juvenil como indicador do comportamento do individuo na
idade de rotação: o estudo da flutuação de parâmetros genéticos e fenotípicos no
decorrer da idade, a estimativa da correlação genética nas diferentes idades, as
estimativas das respostas correlacionadas com a seleção, a estimativa do coeficiente
de determinação (R²) e a estimativa da interação genótipo x idade, que ainda é pouco
estudada e não permite generalizações (REZENDE et al.; 1994; PEREIRA et al. 1997;
WU, 1998)

É importante ressaltar que métodos de seleção mais elaborados devem ser

aplicados na seleção precoce, de forma que se possa suprir, em parte, a falta de
informações em uma idade mais avançada. Esforços também devem ser feitos no
sentido de reduzir o intervalo de gerações por meio da agilização das atividades
operacionais, realizadas a partir do momento da seleção até a instalação do teste de
progênie do ciclo subseqüente.

Segundo Kageyama (1983), Bertolucci e Penchel (1993) e Resende et al.

(1994), a seleção precoce é possível para Eucalyptus, já que os resultados de
pesquisa, considerando características silviculturais, indicam altas correlações entre
idades inferiores à de rotação desejada. Essa estratégia tem sido utilizada,
principalmente, nos programas iniciais de testes clonais, em que normalmente tem
sido avaliado grande número de clones, dos quais selecionan-se aqueles com maior
potencial para uma avaliação mais detalhada em um novo teste clonal ou plantio
piloto.

Rezende et al.(1994) demonstraram a eficiência da seleção precoce em escala

operacional, uma vez que o pequeno erro cometido ao selecionar antecipadamente
um clone é superado pela utilização de material geneticamente superior. Além disso,
verificaram, também, a eficiência da seleção precoce como forma de diminuir o tempo
requerido para avaliação e seleção, maximizando o ganho genético por unidade de
tempo, sem, contudo, provocar, a redução da precisão na avaliação. Entretanto, deve-
se considerar a possibilidade de ocorrer diferenças entre a madeira no estado juvenil e
na idade adulta (idade de rotação). Por isso, é necessário o desenvolvimento de
técnicas para identificação precoce de clones superiores, com vistas ao
estabelecimento de estratégias de seleção.

Aquisição de Clones
A maioria das espécies florestais apresenta grande interação “genótipo x
ambiente”, dificultando a utilização de clones nos ambientes nos quais eles não foram
testados. No entanto, nas situações em que há interesse de plantar e não há clones
superiores próprios, a aquisição destes pode ser uma alternativa viável. Essa
estratégia tem sido adotada por empresas que não tem um programa de seleção
clonal consolidado ou quando não existem disponibilidade de clones que atendam
satisfatoriamente aos seus objetivos. A aquisição de clones tem apresentado ganhos
em programas iniciais de silvicultura clonal, porém, em programas mais avançados e
consolidados de silvicultura clonal, os resultados obtidos, na maioria das vezes, não
são muito expressivos.

A introdução de clones diretamente na produção também tem sido usada com

sucesso para resolução de problemas específicos, como é o caso da cultura da
seringueira. Segundo Nass et al. (2001), houve a introdução de clones de seringueira
de alta produtividade da Malásia para serem utilizados diretamente nas regiões do
Brasil onde não há ocorrênciade fungo Microcyclus ulei.

Os clones disponíveis no mercado podem estar nas diferentes etapas do

processo de seleção clonal da empresa de origem, podendo ser desde árvores
superiores selecionadas até clones comerciais, plantados em grandes áreas. De modo
geral, quanto maior o conhecimento sobre o clone disponível para comercialização,
maior será a probabilidade de sucesso com a aquisição, considerando-se a maior
afinidade e as peculiaridades do local de plantio. Além disso, alguns fatores gerais
devem ser considerados na hora de escolher um clone, entre os quais podem-se
destacar: conhecer muito bem as condições ambientais do local onde será plantado o
clone; definir as características desejáveis e a finalidade do plantio; preferir clones que
foram plantados e se destacaram na região; e testar os clones antes do plantio em
grande escala.

Diante da impossibilidade de obter todas as informações desejáveis a respeito

de um determinado clone, a alternativa utilizada tem sido um levantamento da
genealogia e da origem do clone, buscando referências como indicativo do
desempenho clonal esperado.

Atualmente, o intercâmbio de clones de Eucalyptus entre as empresas do setor

florestal brasileiro está passando por uma fase de discussão, pois a lei de proteção de
cultivares é recente e tem despertado dúvidas, sobre as suas vantagens e
desvantagens. Entretanto, tem sido encarada como um incentivo ao investimento na
área de melhoramento, sendo razoável admitir que se tenha retorno sobre o
investimento protegido com a comercialização do cultivar (clone), como é comum no
setor agrícola. No entanto, pode haver a troca de clones entre programas, desde que
haja um acordo formal entre as instituições envolvidas, para que o material possa a
ser utilizado sem restrições legais. Outro fator complicador do intercâmbio de clones
entre empresas florestais é a troca da identificação inicial do clone. Isso porque,
quando o direito de multiplicação de determinado clone é concedido a outra empresa,
o código normalmente é trocado, podendo ocorrer a aquisição de materiais genéticos
existentes na própria empresa, obviamente com denominação distinta. Nesse sentido,
a identificação clonal deve ter uma atenção especial em todo programa de silvicultura
clonal.

Identificação Clonal
Na silvicultura clonal, um dos pontos fundamentais no desenvolvimento
confiável do processo de clonagem refere-se à correta identificação dos clones. De
modo geral, a correta identificação é de importância fundamental no manejo dos
clones em relação à documentação pertinente ao registro no banco de germoplasma,
na identificação da planta (clone), na seleção e avaliação do material genético, na
proteção legal de cultivares, bem como na correta identificação e recomendação dos
clones nos programas de silvicultura clonal.

A identificação clonal mostra-se também de grande importância nos programas

de melhoramento florestal, em que as fases de conservação, seleção, melhoramento
genético e propagação de material selecionado exigem precisão nas informações de
pedigree e documentação do germoplasma.

Segundo Cheliak (1993), os caracteres usados na identificação e certificação

devem ser quantificáveis e de origem com controle genético. Esses dois pontos chave
devem ser considerados quando o objetivo é certificar clones, variedades ou famílias.
Deve-se ressaltar que as influências ambientais em muitos caracteres podem reduzir a
sua aplicabilidade e devem ser consideradas. Para esse autor, os principais critérios
passíveis de serem utilizados na identificação clonal constituem-se das características
morfológicas, bioquímicas e em nível de genes.

Em relação às características morfológicas, elas são as mais prontamente

disponíveis. Dependendo do modo de controle genético, elas podem ser distinguidas
em duas classes: as controladas por um simples gene e as que são controladas por
mais de um gene. As características controladas por um simples gene normalmente
estão associadas a genes deletérios ou mutantes letais, e aliado à dificuldade de
identificação e disponibilidade de variação, limitam a sua aplicação nos processos de
certificação. Por sua vez, as características controladas por mais de um gene
apresentam dificuldade na correta identificação, bem como, na maioria dos casos, são
influenciadas pela ação do ambiente, exigindo maior rigor na sua mensuração.

A identificação clonal com base nas características bioquímicas, em alguns

casos, pode ser realizada por meio dos metabólicos secundários, como alcanos,
taninos, monoterpenos, entre outros. Na identificação em nível de genes, a utilização
da tecnologia de marcadores izoenzimaticos e dos marcadores moleculares constitui-
se em critério com grande aplicação, tendo em vista os avanços obtidos nos últimos
anos nessa área da ciência.

A escolha do critério de identificação mais apropriado dependerá de fatores

como natureza dos objetivos a serem alcançados (certificação de procedências,
famílias, clones etc.), tipo de material disponível para análise (como sementes ou
propágulos vegetativos), quantidade de material disponível e número de indivíduos
para identificação, bem como disponibilidade a aplicabilidade da técnica de
identificação no caso especifico (CHELIAK, 1993).

Uma vez realizada a identificação do clone, com base nos critérios

apresentados anteriormente, a atribuição de codificação visa facilitar o controle
durante o processo de seleção, produção de mudas e manejo comercial. Assim, tem
sido recomendado, como padrão de codificação, utilizar as iniciais do nome da
empresa e o número da árvore selecionada. Como exemplo, um clone de Eucalyptus
desenvolvido pela Universidade Federal de Viçosa, o qual se originou da 120’ árvore
selecionada, poderia ter sua nomenclatura alfanumérica com UFV 120. Esse tipo de
nomenclatura, uma vez padronizada entre as empresas do setor florestal, minimizaria
as possíveis confusões na identificação do clone dentro da empresa e na
eventualidade de intercâmbio de material clonal com outras empresas do setor.

Vale salientar que o Serviço Nacional de Proteção de Cultivares, com base na

Lei 9.456/97 e publicação no DOU de 4/2/2002, estabelece as instruções para
execução dos ensaios de distinguibilidade, homogeneidade e estabilidade de
cultivares de Eucalyptus. O direito de produção de cultivares de Eucalyptus é
garantido medido um “Certificado de Proteção de Cultivar”, que visa controlar a
utilização de plantas ou de suas partes re reprodução ou de multiplicação vegetativa
no País. Com base nessa regulamentação, algumas empresas florestais possuem
registro de alguns clones de importância econômica , objetivando a preservação das
vantagens competitivas advindas do trabalho de melhoramento genético por elas
desenvolvido.