Biotecnologia na Agricultura

Transgênicos

Prof. Humberto M. F. Madeira

 O QUE SÃO?

Organismo Transgênico
Organismo cujo genoma foi modificado com
a introdução de DNA de outro organismo,
ou

Organismo geneticamente modificado

(OGM)
 O QUE SÃO?

TRANS: para além de

GENE: A unidade fundamental, física e funcional, da

hereditariedade, que carrega informação de uma geração para
outra; um segmento de DNA, composto de uma região
transcrita e uma seqüência reguladora que torna possível a
transcrição.
BIOLOGIA MOLECULAR
Mercado Mundial
Os 21,4 milhões de hectares de culturas GM no Brasil correspondem a:

Soja - 16,2 milhões de hectares (71%) *

Milho - 5,0 milhões de hectares (31%) *
Algodão - 0,15 milhão de hectares (16%) *

*Valores aproximados
SOJA

Dos 21,4 milhões de hectares de culturas GM

cultivadas no Brasil em 2009, 16,2 milhões de
hectares foram plantados com soja tolerante
a herbicida pelo sétimo ano consecutivo,
ultrapassando os 14,2 milhões de hectares em
2008.
O índice de adoção bateu um recorde de
70,9%, maior que os 65% registrados em 2008,
com benefício para 150 mil agricultores.
MILHO

Em 2009, o Brasil plantou 5 milhões de

hectares de milho Bt (resistente a
insetos) em ambas as safras (verão e
inverno).
A área de milho Bt cresceu 3,7 milhões de
hectares, o equivalente a aproximadamente
400% sobre 2008, e foi de longe o maior
aumento absoluto para qualquer cultura GM
em qualquer país em 2009.
O índice de adoção do milho foi de 30,5%.
ALGODÃO

Foram cultivados 145 mil hectares de

algodão GM em 2009, dos quais 116 mil
hectares foram de algodão Bt (resistente a
insetos) e 29 mil hectares de algodão
tolerante a herbicida.
Opinião Pública
http://www.greenpeace.org/brasil/transgenicos/noticias/n-o-foi-dessa-vez-monitoramen
Os 7 pecados capitais dos transgênicos

1. Contaminação genética
2. Ameaça à biodiversidade
3. Dependência dos agricultores
4. Baixa produtividade
5. Desrespeito ao consumidor (rotulagem)
6. Uso excessivo de herbicida
7. Ameaça à saúde humana
• Assunto sensível
• Impacto na adoção
• Caso Monsanto (anos 90)
• Ação de ONG’s, defesa do consumidor
• Risco: medida dos efeitos de uma ocorrência em
termos da sua probabilidade e da magnitude de suas
consequências

• Princípio da Precaução (Rio92): é a

garantia contra os riscos potenciais que, de acordo
com o estado atual do conhecimento, não podem ser
ainda identificados. Este Princípio afirma que a
ausência da certeza científica formal, a existência de
um risco de um dano sério ou irreversível requer a
implementação de medidas que possam prever este
dano.
• Equivalência substancial: equivalência à
antecedente natural, não diferindo dela nos aspectos
cor, textura, teor de óleo, composição e teor de
aminoácidos, e de nenhuma outra característica
bioquímica. Define testes a serem feitos, conforme o
caso.
Nodari & Guerra, 2001
Legislação
1995 – Lei nº 8.974, Lei de Biossegurança:
Estabelecimento de normas para uso das técnicas de engenharia
genética e liberação no meio ambiente de OGM’s.
Criação da CTNBio – Comissão Técnica Nacional de
Biossegurança.

1998 – Comunicado nº 54 da CTNBio:

Parecer favorável a liberação comercial da soja Roundup Ready, da
empresa Monsanto, sem exigir o EIA/RIMA e sem elaboração
de normas relacionadas a segurança alimentar.

Ações Judiciais – IDEC e Greenpeace:

Suspensão da autorização dada pela CTNBio para a soja Roundup
Ready ser comercializada.
2001 – Decreto nº 3.871, Rotulagem de Alimentos
Transgênicos:

Alimentos embalados.
Presença de OGM’s acima de 4%.
Rótulos com a seguinte expressão: “(tipo do produto)
geneticamente modificado” ou “contém (tipo de
ingrediente) geneticamente modificado”.
Aplicabilidade apenas para produtos autorizados pela
CTNBio, com autorização para comercialização
fornecidas pelos órgãos competentes.
Apenas alimentos destinados ao consumo humano.
2003 – Medida Provisória nº 113 (Lei nº 10.688):

Justificativa: Teoria do Fato Consumado.

Liberação da comercialização da soja transgênica – safra de

2003 – sem sujeição à Lei de Biossegurança.

Proibição de sua comercialização como semente.

Rotulagem para presença de OGM superior a 1%.

Safra de soja de 2004 e posteriores deveriam observar a Lei de

Biossegurança.
2003 – Decreto nº 4.680, Novo Regulamento sobre
Rotulagem de Alimentos Transgênicos:

Novo limite para a rotulagem: 1%.

Utilização no rótulo da seguinte expressão: "(nome do produto)

transgênico", "contém (nome do ingrediente ou ingredientes)
transgênico(s)" ou "produto produzido a partir de (nome do
produto) transgênico“.

Dever de informar a natureza transgênica do produto.

Estende a rotulagem para produtos comercializados a granel ou

in natura, além dos embalados.
2003 – Decreto nº 4.680, Nova Lei de Rotulagem de
Alimentos Transgênicos:

Engloba alimentos destinados ao consumo animal.

Rotulagem para alimentos ou ingredientes produzidos a

partir de animais alimentados com rações contendo
OGM’s, devem informar: "(nome do animal) alimentado
com ração contendo ingrediente transgênico" ou "(nome
do ingrediente) produzido a partir de animal alimentado
com ração contendo ingrediente transgênico"
• 2003 – Decreto nº 4.680, Nova Lei de Rotulagem de
Alimentos Transgênicos, algumas lacunas da nova
Lei:

– Alimentos fornecidos em padarias, restaurantes,

confeitarias.

– Fiscalização do cumprimento da Lei.

2003 – Medida Provisória nº 131 (Lei nº 10.814):

Liberação da comercialização da soja transgênica – safra de

2004 – sem sujeição à Lei de Biossegurança.

Condições:
Subscrição do Termo de Compromisso, Responsabilidade e
Ajustamento de Conduta.

Responsabilização dos produtores de OGM’s por danos

causados ao meio ambiente e a terceiros, inclusive por
contaminação cruzada.
2003 – Lei Estadual nº 14.162/Paraná, proibindo:

O cultivo, importação, industrialização e

comercialização de OGM’s no Estado do Paraná.

A utilização do Porto de Paranaguá para a exportação

e importação de OGM’s.

O tráfego de tais organismos pelo Estado.

STF: declaração de inconstitucionalidade da lei

estadual.
2004 – Medida Provisória nº 223 (Lei nº 11.092):

Liberação do plantio da safra 2005 de soja

geneticamente modificada.

Condições:
Subscrição do Termo de Compromisso, Responsabilidade e
Ajustamento de Conduta.
Responsabilização dos produtores de OGM’s por danos
causados ao meio ambiente e a terceiros, inclusive por
contaminação cruzada.

Sanções: impossibilidade de empréstimos e

financiamentos.
2005 – Nova Lei de Biossegurança - Lei nº 11.105:
Estabelece “normas de segurança e mecanismos de
fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção,
a manipulação, o transporte, a transferência, a
importação, a exportação, o armazenamento, a
pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação
no meio ambiente e o descarte de organismos
geneticamente modificado – OGM e seus derivados,
tendo como diretrizes o estímulo ao avanço científico
na área de biossegurança e biotecnologia, a proteção à
vida e à saúde humana, animal e vegetal, e a
observância do princípio da precaução para a proteção
do meio ambiente” (art. 1º).
2005 – Nova Lei de Biossegurança - Lei nº 11.105:

– Cria o Conselho Nacional de Biossegurança (CNBS).

– Reestrutura a CTNBio.
– Dispõe sobre a Política Nacional de Biossegurança
(PNB).
– Possibilidade de interposição de recurso de decisão da
CTNBio.
– Libera o plantio comercial dos alimentos modificados
geneticamente.
2006 – Lei Estadual nº 14.861/Paraná:

Rotulagem de alimentos ou ingredientes que contenham ou

sejam produzidos a partir de OGM’s no estado do Paraná.

Embalagens devem conter um símbolo, formando por um

triângulo amarelo com uma letra “T” no seu interior:

Prazo para adequação: 60 dias, a contar de 23/03/2006.

Mesmas diretrizes do dispositivo federal, salvo no que se

refere ao limite superior máximo para a rotulagem.
Protocolo de Cartagena - 2000
Protocolo de Cartagena - 2000
Protocolo de Cartagena - 2000
Protocolo de Cartagena - 2000
Protocolo de Cartagena - 2000
Protocolo de Cartagena - 2000
 MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

• Biolística ou Biobalística
• Agrobacterium
• Transformação de protoplastos
Agrobacterium
Sementes comerciais de tomate, limpas e prontas para transformação.
Sementes são tratadas com 50% hipoclorito de sódio, 0,1% Tween para
impedir crescimento de microrganismos.
As sementes esterilizadas são colocadas em placas de Petri com meio
nutriente para germinação. (Murashige & Skoogs – MS)
Após 07 dias as plântulas estão no estágio em que os cotilédones
podem ser cortados para transformação (explantes).
 Os explantes de cotilédones são pré-condicionados para
transformação em placas alimentadoras. A placa alimentadora é
composta de MS-ágar e uma camada de suspensão de calo de fumo.
 Um papel de filtro é colocado para separar os explantes da suspensão
de células de fumo. A camada alimentadora produz compostos que
estimulam o Agrobacterium a transferir DNA e a preparar os cotilédones
para crescimento
Os explantes dos cotilédones são retirados em meio MS
líquido. As células injuriadas pelo corte serão o ponto de
entrada de DNA do Agrobacterium.
Após uma noite de pré-condicionamento, os explantes competentes
são expostos a Agrobacterium
O excesso de Agrobacterium é absorvido dos explante para papel
de filtro, para evitar crescimento excessivo durante o co-cultivo
Os explantes são co-cultivados com Agrobacterium por 48 horas
para que aconteça a transformação
Os explantes são colocados em meio com antibiótico para seleção de
transformantes. O meio contém ribosídeo de zeatina, um regulador de
crescimento
As placas MSZ (MS + zeatina) são preparadas e deixadas secar.
Resistência à canamicina é o marcador seletico e a zeatina ribosídeo
estimula as células transformadas a se regenerar.
Os explantes são colocados em MSZ e kanamicina e colocados em
incubadora para regeneração

DIA 01
O calo inicial é formado. O calo se forma no local da injúria e é o
resultado do crescimento estimulado pelo regulador de
crescimento, a zeatina ribosídeo.
03 semanas
Brotos se formam, são transferidos para novo meio MSZ; eliminam-se
os explantes
06 semanas
Os brotos se regeneraram a partir do calo e estão prontos para
serem transferidos para meio de enraizamento. Esse meio não
possui zeatina, mas contém canamicina para seleção dos
transformantes.
09 semanas
Plântulas totalmente diferenciadas enraizando em meio MS +
canamicina.

11 semanas
Plântulas enraizadas são transferidas para caixas com solo.
Aclimatação ao ar e solo por 4-5 dias

13 semanas
Plantas transgências prontas para serem transferidas para casa de
vegetação. Duas variedades mostradas: Moneymaker e Motelle

15 semanas
Da casa de vegetação para o campo

1 mês
TIPOS DE OGM’S
O CASO DA SOJA RR
O CASO DA SOJA RR

16/09/2003
 O CASO DA SOJA RR

• Soja: flor pequena (0,5 cm), perfeita, pólen

cai sobre órgão feminino com flor fechada
• Menos de 0,5% de fertilização cruzada
• Pólen muito pesado para ser carreado pelo
vento
• Pode ser transportado por insetos
 MELHORAMENTO
CONVENCIONAL

• Polinização artificial
• Cruzamento entre dois ancestrais, gerando
híbrido
• Ancestral recorrente (a ser melhorado)
• Ancestral doador (gene de interesse)
• Retrocruzamentos
• Seleção
• Linhagens elite, limitando diversidade
ENGENHARIA GENÉTICA
STS – (mutagênese EMS- etil
metanosulfato)
Tolerância à sulfoniluréia
DuPont
Synchrony STS: chlorimuron e
thifensulfuron
• Glifosato: inibe enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-
fosfato-sintase – presente em bactérias, fungos
e plantas, mas não em animais,
• Síntese de aminoácidos aromáticos (vitaminas,
fitohormônios, ligninas)
• Agrobacterium tumefasciens CP4
• um gene dominante
• 150 companhias – mais de 1000 variedades
• Primeiras 4-6 semanas sem daninhas
• ou somente as primeiras 4-6 semanas de competição
• Aplicação de glifosato: 10-28 dias, daninhas <30 cm
• Regiões mais frias: 1 aplicação; mais quentes, 2.
• Arkansas: 1a. Aplicação: 10-14 dias após plantio
2a. Aplicação: 7-10 dias depois da 1a.
aplicação
• Partículas de ouro (1,3 a 3,0 µm) – 1500 km/h
• Agrobacterium tumefasciens CP4
• Embriões imaturos
• 5-7 camadas de células
• Plasmolizados, protoplastos
• Controle de daninhas simplificado
• Controle de mais amplo espectro
• Menos danos à soja
• Mais flexibilidade na hora da aplicação
• Menos preocupação com efeito residual
• Preço competitivo
• Redução na quantidade total de herbicida
(20%)
O CASO DO MILHO BT
 O CASO DO MILHO BT
• Bt – Bacillus thuringiensis
• ocorrência natural em solos
• produz proteínas em forma de cristal que
seletivamente mata certos grupos de insetos
 As proteínas “Cry” são toxinas no trato
digestivo dos insetos
 As enzimas digestivas convertem a pré-
toxina para sua forma tóxica
 A toxina se liga a receptores no tecido
epitelial causando rompimento das células
 O inseto perde a capacidade de digestão
 O CASO DO MILHO BT

• Insetos param de se alimentar 2 h após

primeira mordida

• Se toxinas em quantidade suficiente

forem ingeridas, morte em 2-3 dias
• Aventis StarLink

• Se toxinas em quantidade suficiente

forem ingeridas, morte em 2-3 dias
• Papaya resistente ao vírus da mancha
anelar do mamão, cultivado no
Havaí

• EMBRAPA
 NOVAS GERAÇÕES

• 2a. Geração – valor nutritivo

• Tomate com mais licopeno
• Milho com beta-caroteno
• Canola com vitamina A

• 3a. Geração – imunização

• Bananas com vírus inativados de cólera
• Banana com vírus da hepatite B

• 4a. Geração - Biofábricas

TERCEIRA GERAÇÃO
The End
MÉTODOS DE DETECÇÃO
Fundamentos da análise de OGMs
- Presença de nova seqüência de DNA - (PCR)
- Presença de nova proteína - (ELISA)

Célula transgênica Célula normal

Joint Workshop on Method Development in
Relation to Regulatory Requirements for
the Detection of GMOs in the Food Chain

Internacional Life Sciences Institute (ILSI)

The European Commission`s Joint Research Centre (JRC)
Bruxelas, 11-13 de dezembro de 2000
União Européia
Reconhece que não se pode excluir a possibilidade de
presença acidental de OGM, ocorrida durante cultivo,
colheita, armazenamento e transporte. Estabelece o
limite máximo de 1% para presença acidental de DNA
e/ou proteína resultante de modificação genética.

Objetivos: Baixa tolerância com contaminação involuntária

Tolerância zero com produtos não-autorizados
Preservação de identidade
Possibilidade de escolha dos consumidores

Necessidade de métodos de detecção

Detecção de DNA recombinante

Material genético (DNA) presente em pequena quantidade

DNA introduzido corresponde a uma parcela ínfima do total.

Necessidade de um método sensível e poderoso

Uso de PCR (Polimerase Chain Reaction) na

amplificação de sequências de DNA introduzidas por
engenharia genética.
 Etapas da PCR
PCR

normal DNA

Eletroforese
_

transgênica DNA

P T N
+
Pontos críticos para aplicação da PCR

• Extração do DNA da amostra

• Presença de inibidores da polimerase
• Condições específicas para cada reação

Limitações da PCR

• Falsos resultados positivos devido a contaminação.

• Falsos resultados negativos.
• Análises conduzidas em laboratórios especializados.
Detecção de novas proteínas

• Baseada no uso de anticorpos.

• Alta especificidade e afinidade pela proteína-alvo.

O que são os anticorpos?

Anticorpos são proteínas produzidas com a função de defesa

contra organismos invasores e toxinas.
Domínios
variávies

Cadeias leves

Cadeias pesadas Região Fc

 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Incubação Lavagem Desenvolvimento de cor

amostra
+

amostra
-
Atrativos dos métodos imunológicos

• Usados em análises clínicas há anos

• Robustos e formatos aplicáveis em condições de campo
• Custo por análise relativamente baixo
• Relativamente sensíveis (0,5-1%)

Desvantagens dos métodos imunológicos

• Necessidade de proteína pura para produção de anticorpos
• Produção de anticorpos pode ser cara
• Isolamento do anticorpo específico pode ser difícil
• Conformação da proteína pode afetar a reação
A PCR e ELISA são utilizados em pesquisa e análises
clínicas. Porém, a análise de um alimento traz limitações
adicionais.
Métodos de detecção de DNA e proteína foram
originalmente utilizados para distinguir entre os
organismos transformados e os não-transformados,
não para avaliar produtos, nem serem aplicados em
outras matrizes, por exemplo, produtos alimentícios.

Alguns desafios impostos aos métodos de análise:

• diferentes matrizes alimentares

• materiais de referência positivos e negativos apropriados
• como expressar e interpretar os resultados
Como expressar e interpretar os resultados ?

A estimativa da quantidade de material geneticamente

modificado é uma medida indireta

O percentual é calculado a partir da relação entre

amplificação do DNA alvo e de um DNA controle
externo ou de gene de referência (naturalmente
presente)

Etapas: 1. Calibração
2. Quantificação
 1. Calibração
A partir de amostras com quantidades conhecidas de material
GM (DNA alvo) determinar a correspondência com quantidade
do DNA referência

%GM 0 0,1 0,2 0,5 1 2 5 10

DNA alvo

DNA referência

O ponto de equivalência permite relacionar intensidade da

banda do DNA de referência e percentual de OGM.
Quantidade X do DNA de referência equivale a um conteúdo de Y %
de material GM na amostra
 Quantificação de material geneticamente modificado
2. Quantificação
Amplificação simultânea de quantidades fixas de amostra com
diferentes quantidades de DNA referência, equivalendo a
diferentes porcentagens de material GM.
%OGM 0 1 2 5 10 20 50 100

DNA alvo
DNA referência

DNA alvo com a mesma intensidade do DNA referência quando

adicionado a uma concentração equivalente a 5 % de GM

Conteúdo GM = 5 %
Avaliação do uso de PCR na detecção de OGMs em
alimentos
• Mais sensíveis do que os métodos imunológicos.

• Capacidade de detectar DNA depende da integridade da

amostra extraída.
• Capacidade de detecção depende do conhecimento da seqüência
de DNA introduzida
• Supõe que o DNA -alvo e o gene de referência sejam degradados
igualmente.
• Análise é afetada pelo número de cópias do transgene e do gene
referência.
• Materiais de referência devem ser constituídos da mesma matriz
do material a ser testado.
Avaliação do uso de métodos imunológicos na detecção
de OGMs em alimentos

• Mais baratos e rápidos que DNA, mas menos sensíveis.

• Extremamente dependente da capacidade de extrair a proteína-alvo

• Afetados pela desnaturação e degradação da proteína.

• Potencial reatividade cruzada com outras proteínas.

• Variabilidade da expressão gênica.

Considerando as limitações dos métodos e também os
decorrentes da matriz alimentar, outros pontos devem ser
valorizados no processo de análise:

Amostragem
Amostragem

Preparoda
Preparo da Métodode
Método de Materiaisde
dereferência
referência
Materiais
amostra
amostra detecção
detecção

Avaliaçãodos
Avaliação dos
métodos
métodos
Amostragem

• Tamanho da amostra
• número de amostras testadas
Influencia na capacidade do ensaio resultar em
positivo ou negativo.

Amostragem parece ser a maior fonte de variabilidade

dos resultados.
Necessidade de harmonização internacional
Amostragem

EUA União Européia

Diretrizes para amostragem Diretrizes para

de grãos, semelhantes aos amostragem de grãos e
métodos para verificar derivados.
contaminação por fungos.
Amostragem intermitente. Amostragem contínua.

Apenas métodos Maior aplicação de

imunológicos são métodos baseados em
aplicáveis. PCR.
Preparo de amostras

Qualidade da extração sustenta a validade da análise

Quantidade, qualidade e integridade do material

extraído, seja proteína ou DNA
(Inibidores, matriz alimentar, armazenamento da
amostra, grau de processamento)
• Condições ótimas de extração devem ser determinadas
empiricamente
• Métodos de extração devem ser validados
Materiais de referência certificados (MRC)

Essenciais para avaliar a confiabilidade e reprodutibilidade

dos métodos e estabelecimento de curvas de calibração
para métodos quantitativos.

• Métodos de produção de MRC devem ser semelhantes

aos utilizados para a produção das amostras.
• Desenvolvimento de MRC com proteína-alvo ou DNA
degradados (simulação do processamento).
• Desenvolvimento de MRC para produtos não-autorizados na
Europa.
• Necessidade de desenvolvimento de materiais de referência
certificados de aceitação internacional.
Materiais de referência certificados (MRC)

Prioridades:

1. Desenvolvimento de MRC para análise de DNA

2. Desenvolvimento de MRC matriz-específicos

3. Desenvolvimento de MRC para análise de proteína

4. Estabelecimento de zero absoluto

5. Desenvolvimento de MRC de alimentos processados

Avaliação de desempenho dos métodos

Objetivos:

• Avaliar os diferentes métodos disponíveis.

• Comparar os resultados obtidos por diferentes métodos.

• Estabelecer critérios de aceitação/rejeição dos resultados.

• Estabelecimento de critérios de avaliação quanto a:

precisão, especificidade, sensibilidade, exatidão, aplicação,
mais do que prescrever um procedimento.
Avaliação de desempenho dos métodos

Resultados de estudos de validação inter-laboratoriais:

• Revelam boa reprodutibilidade entre os laboratórios.

• Bons resultados na detecção de teores próximos ou

superiores a 1%, contudo, variabilidade aumenta muito
abaixo desse valor.

• Reforçam a importância de materiais de referência

certificados.
Conclusões:
• Atualmente existe grande variedade de métodos de análise.

• Já existem métodos validados.

• Os métodos devem ser validados por testes envolvendo

pelo menos 12 laboratórios.
• Escolha dos métodos (DNA ou proteína) recai sobre aquele
que melhor atende às necessidades.
• Tolerância zero é impossível.

• Qualquer limite de tolerância constitui uma medida

arbitrária.
• Abandono de listas negativas
Perspectivas

• Com a introdução de mais de um gene e cruzamento entre

linhagens transgênicas, as incertezas associadas com os
métodos de DNA irão aumentar.

• Desenvolver competência na amostragem, análise e

quantificação de OGMs em ingredientes e produtos finais.

• Desenvolvimento de MRC é prioritário.