Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais

Programa de Pós Graduação em Tecnologia de Produtos e Processos

Produção, imobilização e
caracterização de beta-
glicosidase para aplicação
na degradação de celulose
de um novo Aspergillus
versicolor

Docente: Fernanda Badotti

Discentes: Brenda Palhares, Laíza Alves, Társsia Alves

Belo Horizonte, 2022

Sumário
1. Introdução
2. Materiais e Métodos
3. Resultados e Discussão
4. Conclusão
5. Referências Bibliográficas

2
Introdução

➢ Fator de impacto: 6,953

3
Introdução
Fungos
➢ Heterotróficos
➢ Eucarióticos
➢ Unicelulares ou multicelulares

Exemplos: bolores, cogumelos e leveduras

Figura 1. Estrutura Fúngica

4
Introdução
Aspergillus versicolor
➢ Fungo Filamentoso
➢ Odor característico de mofo
➢ Crescimento lento

Ambientes
Solo
marinhos
Ambientes
Plantas internos do
ar Figura 2. Fungo Aspergillus versicolor
5
Introdução
Camptotheca acuminata
➢ Árvore de folha caduca
➢ Nativa da China e do Tibete

Figura 3. Camptotheca acuminata

6
Introdução
𝛽-glicosidases

Figura 4. Ilustração de uma ligação glicosídica

7
Introdução
Celulose
➢ Estrutura da parede celular
dos vegetais;
➢ Componente natural
renovável mais abundante;
➢ Matérias primas para etanol
celulósico. Figura 5. Estrutura da Celulose

8
 Introdução
Substrato mais barato
Bons produtores de
Fungos Filamentosos como fonte de energia e Redução de custo
𝛽-Glicosidase
carbono

𝛽-Glicosidase (purificadas e
caracterizadas) Diferentes fungos Baixo rendimento Novas cepas

Condições de cultivo e Otimização das

Aumento do
composição do meio condições de Baixo custo
fermentação rendimento da enzima

Baixa estabilidade e Melhora a

reutilização
Imobilização da MnO2 por adsorção
enzima termoestabilidade e
eletrostática
reutilização
9
 Metodologia Isolamento

Preparo da amostra Inoculação e

purificação

Figura 6.Sementes de Camptotheca

acuminata Figura 7. Meio líquido de batata dextrose Figura 8. Triagem de cepas que podem produzir10a
beta-glicosidase. (PDA-esculina)
Metodologia Identificação

Morfológica Sequenciamento
genético

● Macroscópica ● Extração de DNA fúngico pelo método CT

● Microscópica ● Identificação analisando sequência 18s

● Sequência obtidas alinhadas por BLAST

● análise evolutiva: MEGA X.

11
MetodologiaOtimização das condições
Desenho Plackett-
Projeto experimental
Cultivo Burman para a
composto central
fermentação

● Os esporos foram cultivados em placa;
● Extraídos com solução salina estéril e filtrados:
Obtenção do micélio.
● Inoculação em caldo dextrose batata
para a produção de beta-glicosidase
● Incubação da cepa: a 25°C, 7 dias, 150 rpm
● Centrifugação de amostras:
Obtenção de sobrenadante (atividade enzima)
● Software para fazer o desenho Plackett-Burman
● 11 variáveis selecionadas
(pré-experimento e literatura )
● 12 ensaios para investigar os efeitos dos
parâmetros
● Realizado triplicata e média como resposta.
● A análise de variância (significância).
● Obtenção das concentração ideal das
condições operacionais (influenciadas por
variáveis
independentes);
● Resultados do PB: 4 variáveis selecionadas
(farelo de trigo,
aveia, KCl e velocidade de rotação) )
influência na produção de beta-glicosidase
● 30 experimentos foram conduzidos em
triplicata
12
● Calculou a interação das variáveis.
Metodologia
Medição da atividade da
beta-glicosidase
● A atividade foi detectada com o
substrato pNPG e calculando a
liberação de p-nitrofenol
● A reação foi terminada com Na2CO3 e
registrando sua absorvância
● Uma unidade de atividade de beta-
glicosidase foi definida como a
quantidade de enzima que produz 1 mol
de p-nitrofenol em 1 minuto a 37°C.
Purificação de beta-glicosidase
● Protocolo: precipitação de sulfato de
amônio, cromatografia de interação
hidrofóbica, cromatografia de troca iônica e
cromatografia de filtração em gel;
● O peso molecular da beta-glicosidase:
cromatografia de filtração em gel.
● A proteína foi analisada por eletroforese em
gel;
13
● A concentração proteica foi medida pelo
Metodologia
Nanopartículas magnéticas de MnO2

Síntese de Imobilização da beta- Caracterização de

nanopartículas glicosidase nanopartículas
magnéticas de MnO2

● As nanopartículas de Fe3O4 ● A solução de imobilização: solução ● Os grupos funcionais foram

foram sintetizadas de
tampão NaAc-HAc (pH 5,0) com
● As nanofolhas de MnO2 foram 0,01 g/mL de Fe3O4@MnO2.
depositadas nela.
● A beta-glicosidase purificada foi
adicionada à solução e agitada a 4°C
por 12 h.
● O composto resultante foi lavado
com tampão NaAc-HAc 20 mM (pH
5,0) até que nenhuma atividade fosse
detectada
● liofilizaram e obtiveram a enzima
identificados usando espectroscopia
de infravermelho com transformada
de Fourier, microscopia e
microscópio eletrônico de varredura
por emissão de campo
● A análise elementar por
microscópio eletrônico de varredura
por emissão de campo
14
Metodologia
Propriedades da beta-glicosidase
● 30°C a 70°C na atividade (livres e imobilizadas)
● A termoestabilidade foi avaliada pela detecção de sua
TEMPERATURA t1/2
● T 1/2 foi calculado determinando sua atividade residual a
cada 10 min.
● Três tampões diferentes com pH 3-6, pH 7-8, pH
pH 9-10.

● A atividade residual foi medida em condições

padrão.
● substrato: pNPG, lactose, celobiose, amigdalina,
esculina, beta-arbutina, fucoidan, gentiobiose, tre halose,
Especificidade sacarose, xilana e CMC.
● Uma unidade de atividade de beta-glicosidase é definida
como a quantidade de enzima que libera 1 µg de
● açúcares
10 mgredutores em 1+min.
de celobiose enzimas livres e imobilizadas , em
tubo de ensaio;
hidrólise catalítica
● Reação foi conduzida a 50°C e a glicose gerada foi
15
detectada em intervalos de 2h.
● As beta-glicosidases imobilizadas foram misturadas com
Resultados e Discussão
Isolamento e triagem de fungos endofíticos para produção de beta
glicosidase

Figura 9. (A) Resultados de triagem de meio de esculina. Conforme observado, 1-7 foram as cepas isoladas
nas placas de PDA-esculina, 8 foram as costas de S7 na placa de PDA. (B) Atividade enzimática da beta-
glicosidase por triagem das cepas. 16
Resultados e Discussão
Identificação molecular e observação morfológica de S7

Figura 10. (C) Árvore filogenética de S7 e cepas relacionadas com base na sequência 18s. (D) A morfologia dos
conídios S7, em 40× eb em 100×. 17
Resultados e Discussão
Otimização das condições para a produção de beta-glicosidase

Triagem dos principais fatores afetantes

➢ A atividade da beta-glicosidase como variável de resposta (25–359 U/mL);

➢ Resultados do delineamento PB e a Análise ANOVA:
○ Farelo de trigo, farelo de aveia, KCl, KH2PO4 e velocidade de rotação
exerceram efeito positivo na produção de beta-glicosidase,
○ Lactose,CMC, peptona, xilana, MgSO4 e KNO3 exibiram um efeito negativo na
produção de beta-glicosidase

18
Resultados e Discussão
Otimização por metodologia de superfície de resposta
Tabela 1. Fatores e níveis de experimentos de superfície de resposta

19
Resultados e Discussão

Figura 11. Superfície de resposta usando parâmetros de fermentação como variantes na produção de beta-glicosidase
(A) Plotagem tridimensional do farelo de aveia e farelo de trigo e (B) Plotagem tridimensional do KCl e farelo de trigo.

20
Resultados e Discussão

Figura 12. Superfície de resposta usando parâmetros de fermentação como variantes na produção de beta-glicosidase
(C) Plotagem tridimensional da rotação e farelo de trigo e (D) Plotagem tridimensional do KCl e farelo de aveia.
21
Resultados e Discussão

Figura 13. Superfície de resposta usando parâmetros de fermentação como variantes na produção de beta-glicosidase
(E) Plotagem tridimensional do rotação e farelo de aveia e (F) Plotagem tridimensional da rotação e o KCl.

22
Resultados e Discussão
Purificação de beta-glicosidase
produzida por S7

Fig. 14. (A) Análise SDS-PAGE de beta-glicosidase. M,

marcadores de proteína padrão; 1, beta-glicosidase bruta;
2, após precipitação com sulfato de amónio; 3, após
cromatografia de interação hidrofóbica; 4, após
cromatografia de troca iônica; Pista 5, após cromatografia
de filtração em gel.
23
Resultados e Discussão
Caracterização de Fe3O4@MnO2 e
Fe3O4@MnO2@beta-glicosidase

Fig. 15. (A) Espectro FT-IR do Fe3O4@MnO2 com e sem

beta-glicosidase.
24
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢Efeitos da temperatura na atividade e
estabilidade da beta-glicosidase

Fig. 16. Propriedades enzimáticas de beta-

glicosidases livres (ÿ) e imobilizadas (•). (A) O
efeito da temperatura na atividade de beta-
glicosidases livres e imobilizadas.

25
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢Efeitos da temperatura na atividade e
estabilidade da beta-glicosidase

Fig. 17. Propriedades enzimáticas de beta-

glicosidases livres (ÿ) e imobilizadas (•). (B)
Estabilidade térmica de beta-glicosidases livres e
imobilizadas a 50°C.

26
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢Efeitos do pH na atividade e
estabilidade da beta-glicosidase

Fig. 18. Propriedades enzimáticas de beta-

glicosidases livres (ÿ) e imobilizadas (•). (C) O
efeito do pH na atividade de beta-glicosidases
livres e imobilizadas.

27
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢Efeitos do pH na atividade e estabilidade
da beta-glicosidase

Fig. 19. Propriedades enzimáticas de beta-

glicosidases livres (ÿ) e imobilizadas (•). (D)
estabilidade do pH de beta-glicosidases livres e
imobilizadas.

28
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases livres e imobilizadas

➢ Parâmetros cinéticos da beta-glicosidase

○ A beta-glicosidase imobilizada sugeriram uma afinidade de substrato menor
do que a beta-glicosidase livre.
○ Impedimento estéreo criado pelo MnO2

29
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢ Efeitos do aditivo na atividade da
beta-glicosidase

Fig. 20. Propriedades enzimáticas de beta-glicosidases

livres (ÿ) e imobilizadas (•). (E) Efeito de inibição da glicose

30
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢ Efeitos do aditivo na atividade da beta-
glicosidase

Fig. 21. Propriedades enzimáticas de beta-glicosidases

livres (ÿ) e imobilizadas (•). (F) do etanol sobre a atividade
da beta-glicosidase livre e imobilizada.

31
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢ Efeitos do aditivo na atividade da beta-
glicosidase

Fig. 22. Propriedades enzimáticas de beta-glicosidases

livres (ÿ) e imobilizadas (•). (G) Influência dos íons metálicos
na atividade de beta-glicosidases livres e imobilizadas.

32
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢ Especificidade do substrato da beta-
glicosidase

Fig. 23. (H) Especificidade do substrato da beta-glicosidase

livre e imobilizada.

33
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢ Estabilidade de armazenamento e
reutilização

Fig. 24. Aplicação da beta-glicosidase. (A) Estabilidade

de armazenamento de beta-glicosidases livres (ÿ) e
imobilizadas (•).
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Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢ Estabilidade de armazenamento e
reutilização

Fig. 25. Aplicação da beta-glicosidase. (B)

Reutilização da beta-glicosidase imobilizada.

35
Resultados e Discussão
Caracterização de beta-glicosidases
livres e imobilizadas
➢ Aplicação da beta-glicosidase

Fig. 26. Aplicação de palha de trigo hidrolisante de

beta-glicosidase. (C) Eficiência da hidrólise da
celobiose das beta-glicosidases livres (ÿ) e
imobilizadas (•). (

36
Conclusão
Enzima imobilizada era
03 potencial como
biocatalisador para
hidrólise de celulose.
As condições finais de
otimização revelaram a
maior produção
enzimática. Beta-glicosidase
01 02 apresentaram maior
capacidade de
reutilização e
estabilidade de
armazenamento.

37
Referências Bibliográficas
Chao Huang , Yue Feng, Gopal Patel, Xiao-qian Xu, Jun Qian, Qun Liu, Guo-yin Kai. Production, immobilization
and characterization of beta-glucosidase for application in cellulose degradation from a novel
Aspergillus versicolor. Revista Internacional de Macromoléculas Biológicas. Volume 177 , 30 de abril de
2021 , Páginas 437-446. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2021.02.154
Bongomin, F., Batac, CR, Richardson, MD et al. “Uma revisão de onicomicose devido a espécies de
Aspergillus” .Mycopathologia 183, 485-493 (2018);
Lorence A, Nessler CL. “Camptothecin, over four decades of surprising findings”. Phytochemistry. 2004
Oct;65(20):2735-49. doi: 10.1016/j.phytochem.2004.09.001. PMID: 15474560;
Rameshwar T. et al. “Bioprospecção de celulases funcionais de metagenoma para produção de
biocombustíveis de segunda geração: uma revisão Crítico”. Rev. Microbiol. , 44 ( 2018 ) , págs. 244 - 257;

Madigan, M. T. et al. “Microbiologia de Brock”. 14 ed. Porto Alegre, 2016;

38
Referências Bibliográficas
Daroit, D. J. “Caracterização de uma beta-glicosidase de Monascus purpureus”. Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, 2007;

Figura 1: Madigan, M. T. et al. “Microbiologia de Brock”. 14 ed. Porto Alegre, 2016

Figura 2: https://fungi.myspecies.info

Figura 3.: www.epharmacognosy.com

Figura 4: https://pt.sawakinome.com

Figura 5: https://www.todamateria.com.br/celulose

Figura6: https://ndgbotanicals.com/product/camptotheca-acuminata

Figura 7: https://plastlabor.com.br/microbiologia-para-industria/industria-farmaceutica/
39
Obrigada!
40