UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA – DCT

BACHARELADO EM FARMÁCIA

Marcele Silva Peixoto

Caracterização parcial e avaliação da atividade biológica de polissacarídeos

produzidos por fungos filamentosos isolados no semiárido nordestino

JEQUIÉ- BA
SETEMBRO/2023
 Marcele Silva Peixoto

Caracterização parcial e avaliação da atividade biológica de polissacarídeos

produzidos por fungos filamentosos isolados no semiárido nordestino

Relatório parcial apresentado à

Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia como parte das exigências do
Programa Institucional de Bolsa de
Iniciação em Desenvolvimento
Tecnológico e Inovação (PIBITI).

Orientador: Prof. Me. Danyo Maia

Lima

JEQUIÉ- BA
SETEMBRO/2023
 FOLHA DE APROVAÇÃO

Marcele Silva Peixoto

Caracterização parcial e avaliação da atividade biológica de

polissacarídeos produzidos por fungos filamentosos isolados
do semiárido nordestino

Data de aprovação: Jequié–BA: 13 de setembro de 2023.

Orientador

Prof. Me. Danyo Maia Lima

 Sumário

Resumo 6
1 INTRODUÇÃO 7
2 REVISÃO DE LITERATURA 9
2. 1 Reino Fungi 9
2.2 Fungos Filamentosos 9
2.3 Pleurotus djamor 10
2.4 Aspergillus niger 10
2.5 Polissacarídeos 11
2.6 Caracterização química 12
2.7 Atividades biológicas de polissacarídeos fúngicos 13
3 OBJETIVOS 15
3.1 Objetivo Geral 15
3.2 Objetivos Específicos 15
4 MATERIAL E MÉTODOS 16
4.1 Micro-organismo 16
4.2 Condições de cultivo 16
4.3 Planejamento experimental 17
4.4 Extração do polissacarídeo da parede celular do fungo 17
4.5 Caracterização química do polissacarídeo através da análise de
espectroscopia no Infravermelho e de Ressonância Magnética Nuclear 18
4.6 Tratamento estatístico 19
4.7 Atividades biológicas 19
4.7.1 Avaliação da capacidade inibitória da α-amilase 19
4.7.2 Animais 19
4.7.3 Atividade Antinociceptiva 20
4.7.4 Atividade Antioxidante 20
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 22
5.1 Pleorotus djamor 22
5.1.1 Extração de polissacarídeos e delineamento experimental
Box-Behnken 22
5.1.2 Caracterização do polissacarídeo obtido de P. djamor 25
5.1.2.1 Análise de espectroscopia no infravermelho (FT-IR) 25
5.1.2.2 Análise de espectroscopia por ressonância magnética nuclear
 (RMN) 26
5.2 Aspergillus niger 28
5.2.1 Extração de polissacarídeos 28
5.2.2 Caracterização do polissacarídeo obtido de A. niger 30
5.2.2.1 Análise de espectroscopia no infravermelho (FT-IR) 30
5.2.2.2 Análise de espectroscopia de ressonância magnética nuclear
(RMN) 31
5.2.3 Avaliação da capacidade inibitória da α-amilase 32
5.2.4 Avaliação da capacidade antinociceptiva 33
5.2.5 Avaliação da atividade antioxidante 34
6 CONCLUSÃO 5
7 CONSIDERAÇÕES GERAIS 6
REFERÊNCIAS 7
 Resumo

Os fungos são utilizados nas indústrias alimentícia, farmacêutica, dentre outras,

como participantes de processos biotecnológicos. Os polissacarídeos são
biomoléculas complexas e abundantes na biosfera, obtidas a partir do
metabolismo primário de fungos e que apresentam importância econômica, sendo
alvo de interesse para atividades biológicas. Nesse sentido, esse estudo teve
como objetivo obter e caracterizar polissacarídeos isolados da parede celular do
fungo Pleurotus djamor CCMB 366 e do fungo Aspergillus niger ATTC 1004,
como também avaliar as atividades biológicas antinociceptiva e antioxidante do
A. niger. As melhores condições de extração de polissacarídeos de P. djamor
foram de 13, 90°C e 180 minutos para pH, temperatura e tempo de extração,
respectivamente. Enquanto que para o A. niger o ponto de extração ideal foi de 180
minutos para o tempo e 13 para o pH. As análises de espectroscopia indicaram a
presença de ligações glicosídicas do tipo (1→3)(1→6) nos polissacarídeos. Os
procedimentos para avaliar atividades biológicas mostraram-se dose-dependente na
inibição da dor e da ação de radicais livres, podendo, portanto serem aplicados para as
finalidades propostas, sendo, contudo, necessário mais estudos para elucidar os
mecanismos de ação precisos envolvidos.

Palavras-chave: Pleurotus djamor, metodologia de superfície de resposta,

Aspergillus niger, polissacarídeos.
 7

1 INTRODUÇÃO

O reino Fungi é onipresente na natureza. Os fungos podem estabelecer

relações benéficas com os indivíduos, visto que estão fisiologicamente presentes
nas microbiotas, além da sua larga participação em ciclos ecológicos na
reciclagem de nutrientes. São também utilizados nas indústrias alimentícia,
farmacêutica, médica, dentre outras, como participantes de processos
biotecnológicos, confirmando potencial a ser explorado em pesquisas posteriores
(Li et al., 2021c; Lim et al., 2020).
A maioria dos fungos é multicelular, formando por estruturas filamentosas
ramificadas ou hifas com diâmetros típicos de 2 a 18 µm, com ou sem paredes
transversais ou septos (Fukuda et al., 2009).
Na investigação por elementos naturais para tratamentos farmacológicos
mais seguros e eficazes, os fungos são excelentes candidatos por apresentarem
metabólitos ativos (Vieira Gomes et al., 2019). Os polissacarídeos são
biomoléculas complexas - consistidos por vários monossacarídeos unidos por
ligações glicosídicas em cadeias que variam em grau e em ramificação - e
abundantes na biosfera, obtidas a partir do metabolismo primário de fungos e
classificadas em semi sintéticas e naturais (Rodrigues Barbosa et al., 2020).
Quanto às suas variadas propriedades biológicas como ação
antinociceptiva (Valasques et al., 2014), antioxidante (Maity et al.,2021a), entre
outras, e variam de acordo com suas características intrínsecas às espécies. Desse
modo, os polissacarídeos de parede celular têm papel cêntrico na discussão da
bioquímica dos fungos. A parede celular é constituída principalmente por
glucanos e quitina (Barbosa; Carvalho Junior, 2020).
A metodologia de superfície de resposta (MSR) é um método matemático
e estatístico que proporciona uma resposta otimizada influenciada por vários
fatores como pH, temperatura e tempo de extração (Box; Draper, 1959).
Conforme o potencial medicinal de polissacarídeos obtidos de fungos
relatados na literatura, este estudo direcionou-se à obtenção e análise da
caracterização estrutural dos polissacarídeos potencialmente biotecnológicos da
 8

parede celular do fungo comestível Pleurotus djamor CCMB 366, fungo

filamentoso não tóxico com variedade de atividades biológicas, utilizando o
delineamento experimental Box-Behnken. De igual modo, objetivou-se
prospectar a parede celular do fungo filamentoso Aspergillus niger ATCC 1004.
Nessa perspectiva, propõe-se a otimização da extração de polissacarídeos obtidos
da parede celular como também realizar a caracterização parcial química do
composto obtido por análise espectrométrica de infravermelho e de ressonância
magnética nuclear, assim como avaliar os potenciais antinociceptivo e
antioxidante do A. niger.
 9

2 REVISÃO DE LITERATURA

2. 1 Reino Fungi

O Reino Fungi possui uma árvore filogenética numerosa. Os fungos são

organismos eucarióticos que possuem papel vital na vida e manutenção do
planeta, uma vez que apresentam diferentes padrões de desenvolvimento, estilos
de vida, capacidades funcionais e morfológicas, variando de leveduras
unicelulares à fungos filamentosos - organismos multicelulares formados por
hifas e que apresentam aparência de bolor ou com corpos de frutificação,
formando cogumelos (Erkmen, 2021; Lim et al., 2020). Esses microrganismos
apresentam características como a reprodução sexuada ou assexuada através de
esporos, sua estrutura contém uma parede celular rígida (devido à presença de
quitina) e quimicamente complexa, formada por polissacarídeos, polifosfatos e
íons inorgânicos (Fukuda et al., 2009) – diferente da parede celular encontrada
em vegetais – e constituem nutrição por absorção de substâncias orgânicas
dissolvidas no meio (Margulis; Chapman, 2009). Um dos filos mais estudados é
o Basidiomycota.

Os basidiomicetos são conhecidos no aspecto de cogumelos, sendo,

portanto, terrestres, em sua maioria, e por possuírem basidiósporos como esporos
sexuais e conídios como esporos assexuados (Fazenda et al., 2008).

Fungos podem tanto ser parasitas de plantas quanto podem causar diversas
doenças em animais, inclusive no ser humano (Madigan et al., 2016). Entretanto,
também apresentam um grande potencial de aplicação nas diferentes áreas
industriais, assim como na área ambiental, devido à sua capacidade de produzir
variados metabólitos secundários ativos com diversos tipos de aplicações
farmacêuticas e terapêuticas (Salehi et al., 2016).

2.2 Fungos Filamentosos

Fungos filamentosos são organismos heterotróficos - decompositores de

matéria orgânica - caracterizados pela capacidade de formar hifas tubulares
alongadas, septadas ou asseptadas, que se propagam por exocitose, permitindo
 10

que o fungo alcance longas distâncias (Steinberg et al., 2017). Um esporo pode
gerar várias hifas e, consequentemente, uma rede denominada de micélio,
responsável por adquirir nutrientes para o crescimento e constituição de novos
esporos (Harris, 2019).

As habilidades intrínsecas ao crescimento em altas taxas e às elevadas

densidades de biomassa suportadas por substratos de baixo custo são atributos do
aumento da produtividade dos fungos filamentosos (Ward, 2012). Diante disso,
demonstram significativa participação na economia, respectivo à sua relevância
biotecnológica. A presença de compostos fenólicos, terpenos, esteróides e
polissacarídeos garantem as diversas atividades biológicas já reconhecidas tanto
na área industrial quanto na medicina (Bellettini et al., 2019).

2.3 Pleurotus djamor

Os cogumelos do gênero Pleurotus ssp. são um dos mais cultivados

comercialmente em todo o mundo e possuem grande diversidade. As espécies
desse gênero distribuem-se mundialmente, sendo um dos mais conhecidos o P.
djamor (ostra rosa) – amplamente cultivado na China (Caldas; Zied; Sartorelli,
2022).
O Pleurotus djamor é uma espécie caracterizada por ter basidiomiceta que
varia em cor de branco a salmão profundo (Menolli; Breternitz; Capelari, 2014) e
que apresenta condições de crescimento em diferentes temperaturas ao longo do
ano (Sharma et al., 2021). Foi identificado como não tóxico naturalmente e
possui variedade de atividades fisiológicas descritas na literatura: antioxidante,
antimicrobiana, antiplaquetária (Maity et al., 2021a), inclusive, algumas
atividades biológicas foram citadas utilizando polissacarídeos de P. djamor (Li et
al., 2021a). Assim, o polissacarídeo de parede celular do cogumelo P. djamor
apresenta potencial farmacológico e segurança para utilização.

2.4 Aspergillus niger

 11

Os fungos do filo Ascomycota compreendem um enorme e diverso grupo

rentável, como leveduras de cerveja, cogumelos, bolor de maturação do queijo,
entre outros (Margulis, Chapman, 2009). Diante disso, mostram-se versáteis
metabolicamente e, por conseguinte, são requeridos nas indústrias para produção
de pigmentos, alimentos humanos e enzimas, por exemplo (Cousin, 2014).
O fungo filamentoso Aspergillus niger, como outros de seu gênero,
apresenta resistência a variadas condições ambientais e é de grande importância
na pesquisa médica, pois possui capacidade de crescer em substratos
diversificados e alta atividade enzimática (Scazzocchio, 2019). O A. niger,
caracterizado por apresentar coloração preta e produzir micotoxinas (ocratoxina
A), está presente, principalmente, em material vegetal em decomposição. Por
suas características benéficas e maléficas, o A. niger é significativo
economicamente na indústria, na farmacologia e na agricultura, estando
relacionado à disponibilidade de carbono e nutrientes disponíveis no ambiente
para seu crescimento e produção de enzimas (Meijer et al., 2011).

2.5 Polissacarídeos

A parede celular é uma matriz que delimita as células fúngicas e garante

flexibilidade, rigidez e proteção contra condições ambientais extenuantes
(Tzelepis; Karlsson, 2019). Portanto, é altamente mutável e permite diversos
processos como crescimento celular e o desenvolvimento de tipos especializados
de células (Cortés et al., 2019). A organização da parede celular varia entre as
espécies (Colosimo et al., 2021).
A parede celular fúngica é composta por duas camadas principais de
polímeros conectados, sendo a maioria formadas por uma estrutura semelhante
de polissacarídeos do tipo quitina, mananas, α-glucanas, β-1,3-D-glucanas, β-1,6-
D-glucanas e de proteínas (Tzelepis; Karlsson, 2019). O principal glucano de
parede celular fúngica é o β-(1,3)-D-glucano (Cortés et al., 2019).
Dessa forma, os polissacarídeos são macromoléculas de alto peso
molecular encontradas em todos os organismos vivos. São constituídos de
unidades monossacarídicas unidas por ligações glicosídicas formadas pela
 12

eliminação de uma molécula de água entre o grupo hidroxila hemiacetal de um

resíduo e um grupo hidroxila primário ou secundário de outro resíduo próximo.
São classificados como homopolissacarídeos, quando contém apenas um tipo de
unidade monomérica, ou heteropolissacarídeos quando são compostos por dois
ou mais tipos diferentes de monômeros em sua composição (Fukuda et al., 2009).

Sabido que a biomassa fúngica constitui uma estimada fonte de proteínas,

lipídios e principalmente de polissacarídeos com inúmeras propriedades
benéficas para a saúde humana, animal e vegetal, diversos métodos são aplicados
para o isolamento, purificação e caracterização destes polissacarídeos,
principalmente com uso de solventes orgânicos e álcoois (Fukuda et al., 2009). À
vista de suas atividades essenciais, são aplicados na área farmacêutica em
formulações de fármacos - ausência ou baixa toxicidade, biodegradabilidade,
biocompatibilidade e baixo custo (Maity et al., 2021b) -, bem como visando suas
propriedades biológicas como antioxidantes, anti-inflamatórias,
antienvelhecimento, neuroprotetoras e imunológicas (Salehi et al., 2016).

2.6 Caracterização química

As atividades biológicas dos polissacarídeos correlacionam-se com sua

composição química e com suas características estruturais - massa molecular,
configuração anomérica, conformação das cadeias, composição dos
monossacarídeos, presença de grupamentos, posição das ligações glicosídicas
entre os resíduos, dentre outras (Li et al., 2017; Silva et al., 2006). As glucanas
são os homopolissacarídeos mais comuns e os mais estudados em relação à
atividade biológica.

O espectrômetro de infravermelho fornece uma análise de espectros

complexos, identificando características estruturais específicas recorrendo ao
sinal característico da carboxila e, até mesmo, da presença de proteína (Silva et
al., 2006). A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma
poderosa ferramenta para determinar estruturas polissacarídicas, pois contêm
informações sobre a estrutura de polissacarídeos e oligossacarídeos (Cui, 2005).
 13

2.7 Atividades biológicas de polissacarídeos fúngicos

As diferenças em aspectos como estrutura molecular, composição

monomérica, tipo de ligação glicosídica predominante e a conformação estrutural
das cadeias principais são responsáveis pelas diferenças nas atividades biológicas
dessas biomoléculas (De Almeida; Da Silva, 2021).
Os polissacarídeos são um tipo de importante modificador da resposta
biológica (Li et al., 2017). A produção de radicais livres derivados de oxigênio
não controlados é prejudicial às células e pode desencadear reações em cadeia,
levando à multiplicação de novos radicais livres e a alguns danos. Desse modo,
estudos vêm demonstrando que muitos polissacarídeos bioativos naturais
desempenham um papel importante na prevenção de danos oxidativos em
organismos vivos (Chen et al., 2018), mostrando-se com grande potencial entre
as fontes de antioxidantes naturais (Sugiharto, 2019).

Ademais, eventos patológicos endógenos e exógenos podem resultar na

estimulação de cascatas bioquímicas desencadeando o processo de inflamação e
início da dor (Gao et al., 2021). A lesão pode levar à uma contínua sinalização
nociceptiva (Mehanna et al., 2018); podendo durar até anos em algumas
condições inflamatórias - dor crônica (Gordon; Love, 2004). Diante disso, apesar
da eficácia dos medicamentos disponíveis para o manejo da dor, ainda existe a
necessidade de novas substâncias com menos efeitos adversos (De Souza
Sampaio et al., 2020), assim, os polissacarídeos por sua atividade antinociceptiva
podem ser reconhecidos como alternativa (Mazumder et al., 2021; Moreno et al.,
2016; Sindhu et al., 2021). O efeito antinociceptivo pode ser atribuído à inibição
de prostaglandinas e leucotrienos nas vias centrais e periféricas da dor (Carrasco-
González; Serna-Saldívar; Gutiérrez-Uribe, 2017).

Além disto, o processo de oxidação é imprescindível para muitos

organismos, visto que garante a produção de energia, entretanto de modo
descontrolado é responsável pelo aparecimento de muitas patologias como
processos degenerativos no envelhecimento (Ding et al., 2010). Espécies reativas
de oxigênio (ERO) são essenciais, em baixos níveis, para o processo de apoptose,
 14

por exemplo, mas, em níveis elevados resultam em estresse oxidativo que

culmina em perda de homeostase (Yu et al., 2017).

A fim de diminuir prejuízos ao corpo humano, antioxidantes são utilizados

com a finalidade de atenuar o dano oxidativo de um tecido por intermédio do
crescimento das defesas naturais das células (Sun et al., 2009). Extratos fúngicos
são fonte altamente promissora de atividade antioxidante, pois possuem potencial
de inibição em vários estágios do seu desenvolvimento, principalmente nos
polissacarídeos. Alguns estudos apontaram que os polissacarídeos podem
melhorar a capacidade de eliminar radicais livres através da inibir a peroxidação
lipídica (Wang, Zhi-Jun et al., 2017).
 15

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Otimizar a extração e caracterizar parcialmente polissacarídeos da parede

celular dos fungos filamentosos Pleurotus djamor CCMB 366 e Aspergillus niger
ATCC 1004, com finalidade de instituir potenciais para as atividades
antinociceptiva e antioxidante.

3.2 Objetivos Específicos

● Utilizar a ferramenta de Metodologia de Superfície de Resposta (MSR),

através do modelo experimental Box-Behnken com condições definidas de
temperatura, pH e tempo, com vistas à realizar a otimização dos estudos
de extração dos polissacarídeos;
● Realizar a caracterização química dos polissacarídeos usando a
metodologia de Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV) e
Espectroscopia de Ressonância Magnética (RMN).
● Analisar o potencial antinociceptivo e antioxidante de
polissacarídeos de A. niger ATCC 1004.
 16

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Micro-organismo

A cepa de P. djamor CCMB 366 foi cedida pela Coleção de Culturas de

Micro-organismos da Bahia (CCMB, UEFES - Feira de Santana, Brasil).
O fungo A. niger ATCC 1004 foi obtido da Coleção de Microrganismos de
Referência em Vigilância Sanitária (FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil).

4.2 Condições de cultivo

O inóculo do fungo P. djamor foi realizado em placa de Petri contendo

meio de cultivo Ágar Batata Dextrose (BDA) durante 7 dias à temperatura de
28ºC (BOD SL200/90 Incubadora- SOLAB). Em meio líquido foi inoculado em
vidraria Erlenmeyer de 250 mL contendo 125 mL de meio composto de 10g/L de
D-glicose, 5 g/L de peptona, 3g/L de extrato de levedura e 3g/L de extrato de
malte. Cada um dos frascos foi inoculado com três discos de ágar, com 1,5 cm de
diâmetro cada - aproximadamente, 107 UFC de P. djamor. O cultivo submerso
foi realizado em um agitador rotativo (Incubadora shaker SL 222, SOLAB) a 150
rpm com 30°C por 5 dias. O meio líquido contendo a biomassa do fungo
cultivado foi filtrado à vácuo (bomba de filtro de vácuo TE-0582, TECNAL) e,
posteriormente, empregada (seca) para a extração dos polissacarídeos de parede
celular.

O A. niger foi mantido em BDA durante 5 dias a 30°C (BOD SL200/90

Incubadora- SOLAB). A inoculação foi em meio líquido seguindo metodologia
de Manera et al. (2011) com adaptações. Foram usados três discos de ágar,
correspondendo à 107 UFC. O cultivo submerso foi realizado a 150 rpm por 120
horas a 30°C em agitador rotativo (Incubadora Shaker SL 222, SOLAB). O meio
de cultura líquido, após cultivo, foi filtrado a vácuo (bomba de filtro de vácuo
TE-0582, TECNAL), e a biomassa seca em estufa à 50ºC e seguida da extração
(Dong et al., 2009).
 17

4.3 Planejamento experimental

A partir da biomassa fúngica seca do P. djamor foram empregues soluções

de hidróxido de sódio em diferentes concentrações, com diferentes temperaturas
e tempos de extração. O planejamento experimental Box-Behnken (Box;
Behnken, 1960) analisou a influência da temperatura em °C, do tempo de
extração em minutos e do pH, na extração dos polissacarídeos de parede celular
como variáveis independentes. Foram realizados 15 ensaios estudando as
variáveis em 3 níveis, assim os pontos de temperatura analisados foram 70, 80 e
90°C, o tempo em 60, 120 e 180 minutos e o pH foi de 11, 12 e 13 (Valasques et
al., 2014).

Para o design experimental da atividade antioxidante do A. niger, foi

aplicado o delineamento fatorial de 3 níveis da metodologia de superfície de
resposta com pH e tempo de extração. Foi estudado em 3 níveis de variação,
tendo como ponto central o valor de pH 12 e 120 minutos para o tempo de
extração

4.4 Extração do polissacarídeo da parede celular do fungo

Para cada um dos 15 ensaios experimentais do P. djamor foram utilizados

0,65g de biomassa fúngica seca e 32,5 mL de solução de hidróxido de sódio,
seguindo a temperatura, o tempo e o pH previamente estabelecidos. A suspensão
de cada ensaio foi centrifugada (Modelo 206 BL-EXCELSA) a 8.000 g durante
15 min. Foram adicionados ao sobrenadante etanol absoluto (três vezes o volume
inicial), agitado e mantido por 12 horas a 4°C. A suspensão obtida foi
centrifugada a 8.000 g durante 15 min e o precipitado contendo o polissacarídeo
foi reservado enquanto o sobrenadante foi descartado. O polissacarídeo bruto foi
seco a 50°C (Dong et al., 2009). Por conseguinte, observou-se o rendimento em
gramas da extração de polissacarídeo em cada um dos quinze ensaios.
Para o teste de atividade antinociceptiva do A. niger, a extração ocorreu
com 50mL de hidróxido de sódio 0,1M pH 13 para cada 1g de biomassa seca
 18

triturada à 90ºC por 180 minutos (Mendes, et al., 2023). A suspensão foi
centrifugada (Modelo 206BL-EXCELSA) a 8.000 g por 15 min. O precipitado
foi descartado e adicionou-se ao sobrenadante três vezes o volume de etanol
absoluto (12 horas à 4°C). O polissacarídeo precipitado foi isolado através de
uma centrifugação a 8.000g durante 15 min e, posteriormente, foi liofilizado.
Para testar a atividade antioxidante do A. niger, 0,5g da biomassa seca e
triturada foi adicionada a 50 mL de solução de hidróxido de sódio em diferentes
valores de pH (11, 12 e 13) e tempos de extração (60, 120 e 180 minutos) e
temperatura de 90ºC. A suspensão foi centrifugada (Modelo 206BL-EXCELSA)
a 8.000 g durante 15 min. O precipitado foi descartado e foi adicionado ao
sobrenadante três vezes do volume de etanol absoluto, com agitação vigorosa e
foi deixado por 12 horas a 4°C. Os polissacarídeos precipitados foram isolados
através de uma centrifugação a 8.000g durante 20 min e o sobrenadante
descartado. O precipitado obtido foi seco a 50°C até que fosse observado o peso
constante. Os polissacarídeos totais foram determinados pelo método de fenol-
ácido sulfúrico (Dubois, et al. 1956). O rendimento final foi avaliado com (p/p)%
de polissacarídeos por unidade de massa de biomassa seca.

4.5 Caracterização química do polissacarídeo através da análise de

espectroscopia no Infravermelho e de Ressonância Magnética Nuclear

Os polissacarídeos dos fungos foram caracterizados utilizando

espectrômetro de Infravermelho (IR) com transformadas de Fourier (modelo
Varian Inova 500). O polímero seco foi moído e pressionado em pellets para
medição espectral FT-IR, com 20 varreduras na faixa de frequência de 4000-
500cm-1.
Para a análise espectroscópica de RMN todos os espectros foram
registrados a 343 K em um espectrômetro (Varian Inova 500), observando 1H a
500 MHz e 13C a 125 MHz e usando sonda direta. As amostras foram
dissolvidas em D2O/DMSO (6:1) e transferidas para o tubo de RMN. O DMSO
foi usado como referência de mudança química.
 19

4.6 Tratamento estatístico

Foi realizado com auxílio do software Statistica® versão 7, incluindo a

análise de variância (ANOVA). Todos os dados foram apresentados como média
± desvio padrão (SD).
Para avaliação da atividade antioxidante, os dados foram expostos como
média ± desvio padrão (SD) baseados nos experimentos independentes.
Diferenças significativas foram detectadas por ANOVA e com pós-teste de Tukey
usando GraphPad 7.00.

4.7 Atividades biológicas

4.7.1 Animais

Foram utilizados camundongos Balb-C machos pesando entre 20-30g. Os

animais permaneceram em ambiente climatizado, sob o ciclo claro e escuro (12
h/12h), com temperatura de 22 ± 2ºC e livre acesso à água e comida. Os
experimentos em modelo animal obtiveram a aprovação do projeto pelo Comitê
de Ética de Experimentação Animal da Universidade Federal da Bahia, Campus
Anísio Teixeira, (protocolo 077/2019). Os camundongos foram distribuídos
homogeneamente e ambientados ao laboratório pelo menos uma hora antes dos
testes, realizados na fase clara do ciclo. O número de animais e a intensidade dos
estímulos foram mínimos.

4.7.2 Atividade Antinociceptiva

O efeito antinociceptivo foi pelo teste de contorção abdominal induzida

por ácido acético 0,6% (Sigma-Aldrich®), pela via intraperitoneal (i.p.) (0,1
mL/10g), de acordo com procedimentos previamente descritos por Koster,
Anderson & Beer (1959) e Vacher, Duchêne-Marullaz & Barrat (1964). Os
animais (n=06) foram pré-tratados com polissacarídeo nas concentrações de 30 e
60mg/kg pela via intraperitoneal (i.p.), os controles positivos (C+) Indometacina
(10mg/kg) e negativos (C-) diluente de água destilada foram administrados via
oral (v.o.). Após 30 minutos, (C-) diluente de água destilada e de 01 hora da (C+)
 20
Indometacina, os animais foram colocados em caixas separadas e receberam uma
injeção de ácido acético 0,6% pela i.p. O teste foi iniciando com as contagens
durante 20 minutos das contorções da parede abdominal, seguidas de contorções
do tronco e extensão dos membros posteriores.

4.7.3 Atividade Antioxidante

A atividade antioxidante das amostras de polissacarídeos de A. niger

ATCC 1004 foram avaliadas utilizando os métodos de sequestro de radical livre
DPPH (2,2-difenil-1- picrilidrazilo) e do radical ABTS+ (2,2'-azino-bis (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfónico), descrito por Rufino et al., (2007), com
adaptações. Nos dois ensaios foram utilizadas amostras nas concentrações (0,8,
1,6, 2,4, 3,2, 4,0, 4,8, 5,6 e 6,4 mg/mL).

Para o de ensaio DPPH foram adicionados 100µL de cada concentração da

amostra em 3,9 mL de uma solução de metanol de DPPH (0,06 mM). A
absorbância foi medida à 517 nm depois de 20 min à 25°C.

Já no ensaio de ABTS+, foi preparado o radical ABTS por reação da

concentração de sal ABTS (7 mM) com persulfato de potássio (2,45 mM) e a
mistura foi colocada ao abrigo de luz à temperatura ambiente durante 16 h antes
da utilização. Já a solução de ABTS+ em estoque foi diluída com etanol
(absorbância de 0,7 ±0,005 nm) e incubada com 30µL da amostra e 3,0mL da
solução etanólica de ABTS. A absorbância foi medida em 734 nm após 6
minutos de incubação. Nos dois experimentos os valores foram expressos como a
concentração de amostra necessária para reduzir 50% dos radicais livres (EC50).
Nos dois ensaios (DPPH e ABTS+ ), a atividade antioxidante foi observada
utilizando o Trolox como controle positivo.
 21

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Pleorotus djamor

5.1.1 Extração de polissacarídeos e delineamento experimental Box-Behnken

A metodologia de superfície de resposta (MSR) é uma técnica estatística

que apoia o planejamento de experimentos na investigação da melhor condição
de variáveis para obtenção das respostas requeridas. O delineamento de Box-
Behnken aplicado neste estudo permitiu ensaios com um maior número de
fatores.
Os tratamentos experimentais foram variados aleatoriamente para detectar
a presença de possíveis erros sistemáticos, totalizando 15 ensaios, incluindo três
repetições no ponto central. A variação do rendimento em massa de
polissacarídeo do P. djamor CCMB 366 foi sob diferentes condições de extração
(pH, temperatura e tempo de extração) conforme Tabela 1.

Tabela 1: Planejamento Box-Behnken aplicado na otimização da extração de

polissacarídeo de P. djamor.
Temperatura Tempo
Experimento pH Rendimento
(ºC) (min.) observado
1 90 (+1) 11 (-1) 120(0) 0,0013
2 90 (+1) 12 (0) 60(-1) 0,0019

3 90 (+1) 12 (0) 180(+1) 0,0031

4 90 (+1) 13 (+1) 120(0) 0,0068

5 80 (0) 11 (-1) 60(-1) 0,0005

6 80 (0) 11 (-1) 180(+1) 0,0004

7C 80 (0) 12 (0) 120(0) 0,0005

8C 80 (0) 12 (0) 120(0) 0,0005

9C 80 (0) 12 (0) 120(0) 0,0023

10 80 (0) 13 (+1) 60(-1) 0,0066

11 80 (0) 13 (+1) 180(+1) 0,0096

12 70 (-1) 11 (-1) 120(0) 0,0001

 22

13 70 (-1) 12 (0) 60(-1) 0,0004

14 70 (-1) 12 (0) 180(+1) 0,0006

15 70 (-1) 13 (+1) 120(0) 0,0041

(C): ponto central; Os valores codificados são apresentados em parênteses conforme

descrito no modelo Box-Behnken.

A ANOVA é uma ferramenta que permite a avaliação da significância da

regressão usada e a qualidade de seu ajuste às respostas, dessa forma permitiu,
por meio dos rendimentos observados no conjunto de dados experimentais,
realizar a análise de variância descrita na Tabela 2.

Tabela 2. ANOVA no modelo de regressão para otimização de polissacarídeos obtidos

do P. djamor CCMB 366.
Fonte de
SQ Gl MQ Fcalculado Ftabelado
variação R2
Regressão 0,000114 9 1,26574E-05 9,520413 4,7724
Resíduo 0,000007 5 1,3295E-06
Falta de
0,000004 3 0,000001 0,945
ajuste 1,385031 19,1642
Puro erro 0,000002 2 0,000001
SQ total 0,000121 14
SQ: Soma quadrática; Gl: Graus de liberdade; MQ: Média quadrática

A adequação do modelo foi verificada por meio da distribuição de Fisher

(teste F) e pelo coeficiente de determinação R2, além disso o modelo indicou um
ajuste adequado (Fcalculado < Ftabelado) através da análise de variância. O R2 obtido
(0,94) significa que 94% dos resultados observados são explicados pelo modelo
experimental aplicado.
Desse modo, os resultados obtidos são confiáveis, assim as condições de
otimização podem ser utilizadas na extração de polissacarídeos de P. djamor
CCMB 366.
Segundo os efeitos das variáveis demostram a superfície de resposta
(Figuras 1 e 2) o ponto ótimo de rendimento (máximo) está na parte superior
 23

esquerda. As condições ideais para a extração de polissacarídeos da parede

celular do fungo em estudo tendenciam para valores de 13, 90°C e 180 minutos
para pH, temperatura e tempo de extração, respectivamente. Dessa maneira, os
locais em vermelho mais intenso correspondem às zonas ótimas de extração.

Figura 1: Gráficos de superfície de resposta da otimização da extração de

polissacarídeos de P. djamor CCMB 366. (A): pH e Temperatura. (B): Tempo e
Temperatura. (C): Tempo e pH.
 24

Figura 2: Gráficos de contorno da otimização da extração de polissacarídeos de parede

celular de P. djamor CCMB 366. (A): pH e Temperatura, (B) Tempo e Temperatura e
(C) Tempo e pH.

A partir da análise da Figura 1 e Figura 2 infere-se que o pH é a variável

que mais influencia no rendimento dos polissacarídeos extraídos da parede
celular de P. djamor CCMB 366, sendo o pH 13 mais relevante na resposta
desejada. A extração alcalina causa a destruição da parede celular do fungo
facilitando a liberação do polissacarídeo durante o processo (Leong; Yang;
Chang, 2021).

5.1.2 Caracterização do polissacarídeo obtido de P. djamor

5.1.2.1 Análise de espectroscopia no infravermelho (FT-IR)

A análise do espectro de infravermelho foi realizada para identificar os

principais grupos funcionais que estão presentes na amostra do polímero (Figura
3).
 25

Figura 3: Espectro FT-IR de polissacarídeo obtido da parede celular de P. djamor

CCMB 366.

A figura 3 mostra que os sinais entre 2500–3700 cm-1 e 900–1700 cm-1 são
bandas de absorção característicos de polissacarídeos (Li et al., 2021b). A banda
característica em torno de 3444 cm-1 está relacionada à vibrações O-H
(estiramento) (Gunasekaran; Govindan; Ramani, 2021b). A banda em em torno
de 2924 cm-1 está associado à vibração da ligação simples C-H (Li et al., 2021a).
A banda em torno de 1647 cm-1 é referente à vibração de estiramento assimétrico
da ligação C-O (Wang et al., 2021). As bandas na região entre 1400-1200 cm-1
correspondem às vibrações de ângulo variável de C–H ou às vibrações de
estiramento simétrico de C–O em –COO (Li et al., 2021b). Os sinais entre 1200
e 1000 cm-1 são devido às vibrações C–OH ou C–O–C (estiramento). As bandas
entre 700-500 cm-1 podem estar relacionados à vibração do grupo hidroxi
envolvido em uma ligação de hidrogênio (Gunasekaran; Govindan; Ramani,
2021a).

5.1.2.2 Análise de espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros de RMN 1H e 13C do polissacarídeo de parede celular de P.

djamor CCMB 366 estão apresentados na Figura 4.
 26

Figura 4. Espectro de RMN de polissacarídeo isolado de Pleurotus djamor

CCMB 366 (A) RMN 13C. (B) RMN 1H

Os sinais químicos no espectro da Figura 4A apresentam características

de polissacarídeos. Os deslocamentos δC105ppm e δC102ppm são inerentes de
ligações β de carbonos anoméricos, assim há, pelo menos, 2 carbonos
anoméricos. Os deslocamentos em 87ppm e 83ppm sugerem ligação em carbono
3, assim é possível que existam 2 monossacarídeos de ligação β-(1→3). Os
deslocamentos δC 78,7 / 78,3ppm, δC 77,7 / 76,2ppm, δC 72,44 / 71,7ppm e δC
63,9 / 63,5ppm, são atribuídos aos C-2, C-4, C-5 e C6 dos monossacarídeos.
Entretanto, a análise do espectro de 1H (Figura 4B) identifica um sinal em δH
5,4ppm, atribuído à sobreposição dos sinais dos hidrogênios anoméricos ligados
 27

aos carbonos em δC 105 e δC 102ppm. Sinais entre δH 3,35 e δH 4,56

correspondem aos hidrogênios H-2, H-3, H-4, H-5 e H-6.

5.2 Aspergillus niger

5.2.1 Extração de polissacarídeos

O planejamento de três níveis foi aplicado para determinar as melhores

condições para a extração de polissacarídeos. Os resultados experimentais são
apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Planejamento experimental de fatorial de três níveis aplicado na

determinação do tempo ótimo e pH da extração de polissacarídeos de A. niger.

Temperatura
Experimento pH Rendimento Rendimento
(ºC) encontrado esperado
(%) (%)
1 180 (+1) 11 (-1) 3,48 3,37
2 180 (+1) 12 (0) 4,56 4,98

3 180 (+1) 13 (+1) 7,30 6,98

4 120 (0) 11 (-1) 2,94 2,76

5C 120 (0) 12 (0) 3,60 3,54

5C 120 (0) 12 (0) 3,40 3,54

5C 120 (0) 12 (0) 3,70 3,54

6 120 (0) 13 (+1) 4,48 4,72

7 60 (-1) 11 (-1) 2,38 2,65

8 60 (-1) 12 (0) 2,96 2,60

9 60 (-1) 13 (+1) 2,88 2,95

(C): ponto central; Os valores codificados são apresentados nos parênteses

conforme descrito na metodologia do modelo Box-Behnken.

A partir dos resultados obtidos com a aplicação da Metodologia de

Superfície de Resposta, foi possível construir os gráficos de superfície e de área
(Figura 5).
 28

A B

(A) Gráfico de superfície de resposta (B) Gráfico de área

Foi possível estipular que o ponto de extração ideal foi de 180 minutos
para o tempo e 13 para o pH, obtendo um rendimento máximo de polissacarídeos
na faixa de 7,3% (Figura 5A). No gráfico (Figura 5B), foi possível compreender
que a redução de tempo e pH foi diretamente proporcional ao rendimento de
polissacarídeo, portanto também diminuiu. Esta diminuição está relacionada à
estrutura molecular de um polissacarídeo que apresenta quantidade significativa
de hidroxilas.

A Tabela 4 mostra a Análise de Variância (ANOVA), obtida a partir da

avaliação do tempo e pH na extração de polissacarídeos obtidos de A. niger.

Tabela 4. Análise de Variância (ANOVA) aplicada à otimização de tempo e pH

de polissacarídeos obtidos de A. niger.

Fonte de
SQ Gl MQ Fcalculado Ftabelado
variação R2
Regressão 17,27857 5 3,455714 27,4 5,50
Resíduo 0,630519 5 0,126104
Falta de
0,58385 3 0,194618 0,96
ajuste 8,34 19,16
Puro erro 0,04667 2 0,023333
 29

SQ total 17,9091 10
SQ: Soma quadrática; Gl: Graus de liberdade; MQ: Média quadrática

A partir da análise da tabela acima, deduz-se que o modelo está bem

ajustado, pois o Fcalculado é maior do que Ftabelado para regressão (27,4 > 5,5),
com um intervalo de confiança de 95%. O R2 obtido foi equivalente a 0,96,
assim 96% dos resultados podem ser explicados pelo modelo experimental
aplicado. Desse modo, os resultados demonstram um tratamento estatístico
representativo e confiável.

5.2.2 Caracterização do polissacarídeo obtido de A. niger

5.2.2.1 Análise de espectroscopia no infravermelho (FT-IR)

A Figura 6 mostra o resultado dos testes espectroscópicos que permitiram

a identificar os grupos funcionais característicos.

Figura 3. Espectro de polissacarídeo FT-IR produzido a partir de A. niger.

 30

As bandas na região entre 3436 cm-1 e 3125 cm-1 correspondem ao

estiramento axial O-H (Valasques et al., 2017), a região de 2922,2 cm-1
representa o estiramento axial C-H, a banda na região de 1368,3 cm-1 relaciona-se
a vibração de flexão do grupo CH2 (Wang et al., 2017) e a banda na região de
1055,3 cm-1 pode ser descrita como uma vibração de deformação axial de grupos
de C-O-C presentes em um anel de seis átomos de carbono, característicos dos
polissacarídeos (Valasques et al., 2017). A banda na região de 858cm-1 indica a
presença de ligação β-glicosídica (Valasques et al., 2014). A partir da análise
feita, as substâncias presentes na amostra trata-se de polissacarídeo, pois contém
bandas características além de uma absorção na região de 1200-900 cm-1.

5.2.2.2 Análise de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)

A análise dos espectros do polissacarídeo de parede celular foi avaliado

para determinar os sinais característicos de hidrogênio (1H) e de carbono (13C)
presente na amostra (Figuras 7 e 8).

Figura 7. Espectros de RMN de 1H de polissacarídeo de A. niger.

De acordo com a figura 7, o pico mais alto é atribuído ao carbono α

anomérico (5,00 ppm) e um sinal próximo a 4,7 ppm relacionado ao carbono β.
 31

Para a análise de 13C, 12 sinais foram encontrados (Figura 8).

Figura 8. Espectros de RMN 13C do polissacarídeo de A. niger.

Segundo os dados, o polímero isolado possui um carbono anomérico α

representado pelo sinal intenso em 99.2 ppm ligado a um carbono C6 em 66,0
ppm, assim como possui um carbono anomérico β em 108 ppm ligado a um
carbono C3 em 82,9 ppm, sendo, provavelmente, um polissacarídeo de ligações α
e β.

5.2.3 Avaliação da capacidade antinociceptiva

O resultado do teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético

é apresentado na Figura 9.

Figura 9. Avaliação da administração intraperitoneal de (1→3)(1→6)-β-D-

glucogalactano de parede celular de A. niger no teste de contorção abdominal
 32
induzida por ácido acético (0,6%) em camundongos (n= 06). Os animais
foram pré-tratados, de acordo os grupos com as amostras de polissacarídeos
(30 e 60mg/kg), (C+) Indometacina (10mg/kg) e Controle (C-) diluente de água
destilada. As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste ANOVA
One-Way, seguida do teste de múltipla comparação Bonferroni. As variações
diferem respectivamente de forma significativa onde: (*) p < 0,05, quando
comparado o grupo Controle (C-) aos demais grupos e (#) quando comparado
grupo Controle (C+) aos demais grupos.

O grupo controle (C-) apresentou o maior número de contorções. A

inibição de contorções foi dose-dependente - reduzido na dose mais alta de 60
mg/kg de polissacarídeo. A resposta de inibição do número de contorções com o
uso do polissacarídeo foi maior do que com a utilização do fármaco padrão
indometacina mesmo não sendo estatisticamente significativa. Estes resultados
demonstram o potencial antinociceptivo do polissacarídeo.
Observa-se que no teste há indução nociceptiva química. A resposta
inflamatória local se inicia com a via de biossíntese de prostaglandinas,
resultando na sensação de dor (Mazumder et al., 2021). Há também aumento de
serotonina, histamina, bradicinina e outros reguladores inflamatórios (Gao et al.,
2021).

5.2.4 Avaliação da atividade antioxidante

O DPPH é um radical livre instável e pode aceitar um átomo de

hidrogênio ou elétrons para formar uma molécula estável. Sendo amplamente
utilizado na avaliação da atividade de eliminação de radicais livres (Qu et al.,
2016).
A partir da análise da Figura 10, observou-se que a atividade de
eliminação de radicais DPPH foi dependente da concentração. Na maior
concentração utilizada (6,4mg/ml), houve atividade de eliminação de radicais
DPPH do polissacarídeo (82,12%) e do Trolox (98,51%). O valor EC50 calculado
(Tabela 5) foi de 4,632mg/mL, indicando que o polissacarídeo tem o potencial
antioxidante.
 33

Figura 10. Atividade antioxidante do polissacarídeo isolado do fungo

filamentoso Aspergillus niger ATCC 1004 frente ao radical livre de DPPH
(%).

O radical ABTS é aplicado na avaliação da atividade antioxidante de

extratos naturais (Ye et al., 2016). A partir da análise do gráfico (Figura 11),
inferiu-se que a capacidade de sequestrar radical livre ABTS também foi dose-
dependente. A atividade máxima de eliminação do radical ABTS foi na
concentração de 6,4mg/mL, atingindo 75,94% de atividade, e o valor de EC50
calculado (Tabela 5) foi de 3,765 mg/mL.

Figura 11. Capacidade de eliminação do radical ABTS (%) por polissacarídeo

isolado do fungo filamentoso Aspergillus niger ATCC 1004.
 34

Tabela 5. Valores de EC50 para polissacarídeos isolados do fungo filamentoso

Aspergillus niger ATCC 1004 em propriedades antioxidantes.

Atividade antioxidante EC50a (mg/mL)

Capacidade de eliminação no radical DPPH 4,632±0.21

a
Valor de EC50: a concentração efetiva em que os radicais DPPH e ABTS foram
eliminados em 50%; O valor EC50 foi obtido por interpolação a partir da análise
de regressão linear.

Diante disso, foi observado que o polissacarídeo exibiu um grau variável

de atividade de eliminação de radicais livres de maneira dependente da
concentração.
 37
6 CONCLUSÃO

Neste estudo foram obtidos resultados da otimização da extração de

polissacarídeos do fungo filamentoso P. djamor a partir do empregodo MSR
através do delineamento de Box-Behnken como uma ferramenta bem sucedida. O
rendimento máximo observado, utilizando as condições otimizadas foi sob as
variáveis de pH 13, temperatura de 90°C e 180 minutos de tempo extração. A
caracterização parcial do polissacarídeo pelo método de Espectroscopia no
Infravermelho e por Ressonância Magnética Nuclear denotaram, por intermédio
das vibrações de estiramento, as características das ligações dos grupos no
polissacarídeo, sendo obtido um polissacarídeo do tipo β-(1→3) da parede celular de
P. djamor CCMB 366.
Ademais, quanto às atividades biológicas, percebeu-se dose-dependência.
A analgesia do polissacarídeo foi avaliada a partir do teste de contorções
abdominais induzidas por ácido acético, ilustrando a atividade antinociceptiva
periférica. Na maior concentração de polissacarídeo (60 mg/kg) o número de
contorções foi reduzido, sendo menor que o observado quando utilizado o
fármaco padrão indometacina.
O polissacarídeo apresentou potencial em sequestro de radicais livres
DPPH e ABTS, mas não em capacidade máxima de atividade antioxidante. Neste
contexto, o polissacarídeo produzido por Aspergillus niger ATTC 1004
demonstrou ser um produto com aplicação biológica na ação em desordens
bioquímicas associadas ao estresse oxidativo.
Esses resultados apontam que o (1→3)(1→6)-β-D-glucogalactano da
parede celular de A. niger pode ser utilizado com potencial antinociceptivo e
antioxidante.
 38
7 CONSIDERAÇÕES GERAIS

Através da aplicação do planejamento foi observado as condições ótimas

de extração do polissacarídeo do fungo Pleurotus djamor CCMB 366 e do fungo
Aspergillus niger ATTC 1004, bem como caracterizar parcialmente os
polissacarídeos de parede celular através das espectroscopias no infravermelho e
de ressonância magnética nuclear. Ademais, foi possível avaliar as atividades
antinociceptiva e antioxidante dose-dependente do polissacarídeo de parede do A.
niger, sendo necessário mais estudos para elucidar os mecanismos de ação
precisos envolvidos.
O fungo Aspergillus niger ATTC 1004 não constava no cronograma e nem
neste projeto, entretanto seus resultados foram incluídos, uma vez que foram
realizados em paralelo aos experimentos do fungo Pleurotus djamor CCMB 366.
 39
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