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Esta publicação, Microalgas de Águas Continentais: Potencialidades e Desafios do
Cultivo, é o segundo volume de um conjunto de três, que foram escritos como parte
das atividades do Projeto Microalgas, desenvolvido com o objetivo de estudar as
2 MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS
VOLUME 2
microalgas como fonte alternativa de energia e de coprodutos de valor agregado

com possibilidades de aplicações biotecnológicas.
Nos capítulos deste volume são apresentadas informações quantitativas sobre
PRODUÇÃO DE
trabalhos científicos, revisões de literatura e publicações que tratam do tema
microalgas. Além disso, é apresentado um roteiro para a realização de buscas
nas principais bases de dados mundiais. Na sequência, é discutido o biodiesel
produzido a partir das microalgas, as técnicas de cultivo destes microrganismos
BIOMASSA E
para essa finalidade e as exigências climáticas para o cultivo massal em diferentes
regiões do Estado do Paraná. Também é considerado o aproveitamento de resíduos
agroindustriais paro o cultivo de microalgas, como forma de destinação desses
resíduos. Fotobiorreatores abertos e fechados para o cultivo massal são abordados
COPRODUTOS
e os principais fatores bióticos e abióticos que podem influir na eficiência do
cultivo são descritos. Também é apresentado um estudo de caso com dados reais
PRODUÇÃO DE BIOMASSA E COPRODUTOS

MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS
de um fotobiorreator aberto. Uma coleção de microalgas foi montada durante o
Diva Souza Andrade e Arnaldo Colozzi Filho | Editores

desenvolvimento do projeto e detalhes sobre a amostragem, o isolamento das
microalgas para obtenção de culturas puras, a caracterização morfológica dos
isolados obtidos, a preservação dos cultivos ex situ e a determinação da viabilidade
celular dos isolados obtidos e depositados na coleção são apresentados. Técnicas
de biologia molecular foram utilizadas para a caracterização das microalgas
e os resultados do sequenciamento completo de microalgas e dados sobre o
levantamento dos gêneros de microalgas que ocorrem nas águas continentais do
Estado do Paraná são discutidos. Também são abordados, a partir de dados de
pesquisa, temas relacionados à composição lipídica das microalgas, a produção e
concentração de proteínas, pigmentos, clorofila e outras moléculas de importância
bioquímica, com relações entre as condições de cultivo e a produção dessas
DIVA SOUZA ANDRADE
moléculas. Por fim, são fornecidas informações sobre a possibilidade de utilização
das cianobactérias, microalgas fixadoras de nitrogênio atmosférico, para a
ARNALDO COLOZZI FILHO
inoculação de leguminosas e gramíneas. EDITORES
Essas informações abrem novas possibilidades de utilização de inoculantes
microbianos nas culturas agrícolas no Brasil.
ISBN 858818449-4
9 788588 184497
Diva Souza Andrade
Arnaldo Colozzi Filho
Editores
Capa 2 - Alisson.indd 1 15/08/2014 16:46:08

CARLOS ALBERTO RICHA
Governador do Estado do Paraná
NORBERTO ANACLETO ORTIGARA

Secretário de Estado da Agricultura
e do Abastecimento
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ - IAPAR
FLORINDO DALBERTO
Diretor-Presidente
ARMANDO ANDROCIOLI FILHO

Diretor de Pesquisa
ALTAIR SEBASTIÃO DORIGO

Diretor de Administração e Finanças
ADELAR ANTONIO MOTTER

Diretor de Gestão de Pessoas
MARCOS VALENTIN FERREIRA MARTINS

Diretor de Inovação e Transferência de Tecnologia

VOLUME 2
PRODUÇÃO DE
BIOMASSA E
COPRODUTOS
Diva Souza Andrade
Editores
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ

Londrina
2014
5 Livro Microalgas V2.indb 1 30/07/2014 09:46:55

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ
Editor ExEcutivo
Álisson Néri
rEvisão
diagramação
imprEssão
Midiograf
distribuição
Área de Difusão de Tecnologia - ADT
adt@iapar.br | (43) 3376-2373
tiragEm: 1.000 exemplares
Trabalho realizado em parceria com a Fundação de Apoio
à Pesquisa e ao Desenvolvimento do Agronegócio (FAPEAGRO).
Todos os direitos reservados.
É permitida a reprodução parcial, desde
que citada a fonte.
É proibida a reprodução total desta obra.
Esta publicação, MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS: PRODUÇÃO DE BIO-

MASSA E COPRODUTOS é o segundo volume de um conjunto de três, que foram escritas
como parte das atividades do “Projeto Microalgas”. Este projeto de pesquisa foi desenvolvi-
Paranaense de Energia Elétrica – COPEL /Geração de Energia e a Fundação de Apoio a

Pesquisa e ao Agronegócio – FAPEAGRO, durante os anos de 1989 a 2014, com o objetivo
de estudar as microalgas como fonte alternativa de energia e de coprodutos de valor agrega-
do com possibilidades de aplicações biotecnológicas. As publicações apresentam dados de
pesquisa obtidos durante o desenvolvimento do projeto, analisados à luz das informações
existentes na literatura. As opiniões expressas nesta publicação são de seus autores e não
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
M626 Microalgas de águas continentais / editores: Diva Souza

Andrade, Arnaldo Colozzi Filho. – Londrina : IAPAR, 2014.
3v. : il. ; 24 cm.
Produção de biomassa e coprodutos - v.3. Coleção IPR de

microalgas.
ISBN 978-85-8818-449-7 (obra compl.)
1. Microalga – Cultivo. 2. Microalga – Biotecnologia. I.

Andrade, Diva Souza. II. Colozzi Filho, Arnaldo.
CDU 582.26
Impresso no Brasil / Printed in Brazil

2014

Editores
Diva Souza Andrade
Engenheira Agrônoma, doutora em Ciências Biológicas
Pesquisadora, Instituto Agronômico do Paraná
Londrina, Paraná, Brasil
diva@iapar.br

Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia
Pesquisador, Instituto Agronômico do Paraná
acolozzi@iapar.br

Autores
Adriano Rausch Souto
Engenheiro Sanitário, doutor em Agronomia
adriano@iapar.br
Admilson Lopes Vieira

Engenheiro Químico, doutor em Engenharia Química
Professor, Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus
Londrina
lopesvieira@utfpr.edu.br
Alexandra Scherer
Engenheira Agrônoma, doutora em Agronomia
Professora, Universidade Norte do Paraná
ascherer2000@gmail.com
Antônio Costa
Engenheiro Agrônomo, doutor em Agronomia
antcosta@iapar.br

acolozzi@iapar.br

Cássio Egidio Cavenaghi Prete
Engenheiro Agrônomo, doutor em Fitotecnia
Professor, Universidade Estadual de Londrina
cassio@uel.br
Diva Souza Andrade

Engenheira Agrônoma, doutora em Ciências Biológicas
diva@iapar.br
Elisângela Andrade Angelo

Bióloga, mestre em Ciências de Alimentos
Companhia Paranaense de Energia
Curitiba, Paraná, Brasil
elisangela.angelo@copel.com
Fernanda de Almeida Fin de Lima

Química, mestre em Engenharia Química
fer_fin@hotmail.com
Freddy Zambrano Gavilanes

Engenheiro Agrônomo
Portoviejo, Manabí, Equador
freddyzg_86@hotmail.com
Gabriela da Silva Machineski

Engenheira Agrônoma
gabymachine@yahoo.com.br

Gisele Milani Lovato
Bióloga, mestre em Microbiologia
gimilanibio@yahoo.com.br
Graziela Moraes de Cesare Barbosa

Engenheira Agrícola, doutora em Agronomia
graziela_barbosa@iapar.br
Helder Rodrigues da Silva

Biólogo, mestre em Bioenergia
heldersrodrigues@hotmail.com
Iara Cintra de Arruda Gatti

Química, doutora em Agronomia
Professora, Universidade Norte do Paraná
iaracintra@gmail.com
João Henrique Caviglione

caviglione@iapar.br
Juscélio Donizete Cardoso

Farmacêutico bioquímico, doutor em Microbiologia
Professor colaborador, Universidades Federal da Paraíba
João Pessoa, Paraíba, Brasil
juscelio.cardoso@gmail.com

Kelly Campos Guerra Pinheiro de Goes Olivieri
Bióloga, mestre em Biotecnologia
k.goes@yahoo.com.br
Krisle da Silva
Engenheira Agrônoma, doutora em Microbiologia Agrícola
Pesquisadora, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Boa Vista, Roraima, Brasil
krisle.silva@embrapa.br
Lisandra Ferreira de Lima

Engenheira Química, doutora em Engenharia Química
Professora, Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus
Londrina
lisandra@utfpr.edu.br
Lucas Alves Maroubo

Engenheiro Ambiental
lucasmaroubo@hotmail.com
Maria Aparecida de Matos

Química, mestre em Química dos Recursos Naturais
Analista em Ciência e Tecnologia, Instituto Agronômico do Paraná
mariamatos@iapar.br
Maria Elisabeth da Costa Vasconcellos

Engenheira Agrônoma, mestre em Estatística e Experimentação
Agronômica
Analista em Ciência e Tecnologia, Instituto Agronômico do Paraná
bethvasc@iapar.br

Michele Regina Lopes da Silva
Bióloga, doutora em Agronomia
michele@iapar.br
Patrícia Cristina Gomes

Bióloga, doutora em Zootecnia
patriciacristinagomes@gmail.com
Rafael Bruno Guayato Nomura

Farmacêutico bioquímico
rafaelguayato@gmail.com

Prefácio
Coleção
Microalgas de Águas Continentais
É
nosso dever preservar o meio ambiente para as
futuras gerações, um compromisso que afeta
praticamente todas as áreas da atividade hu-
mana e, em particular, leva à busca de alternativas
renováveis de energia para a promoção do desenvol-
vimento econômico e social.
Com essa preocupação, Instituto Agronômico do
Paraná (IAPAR), Companhia Paranaense de Energia
Elétrica (COPEL) e Fundação de Apoio à Pesquisa e
ao Desenvolvimento do Agronegócio (FAPEAGRO)
iniciaram o PROJETO MICROALGAS, em 2009, com
o objetivo de investigar o potencial desses microrga-
nismos como alternativa energética.
-
quantidade e qualidade do material graxo e dos co-

produtos que possam vir a ser de interesse tecnológi-
co e comercial.
Como resultado, além do fortalecimento da pes-
quisa em energias renováveis, chegou-se a uma vas-
ta diversidade de informações úteis à comunidade
-
ca brasileira e mundial, compiladas em três volumes

(dois técnicos e um catálogo da coleção de microal-
gas), que são um marco para as entidades envolvidas
e para toda a sociedade paranaense.
Florindo Dalberto
Diretor-Presidente do IAPAR

Prefácio
Volume II
Produção de Biomassa e Coprodutos
A
ocorrência de microalgas em diversos ambien-
tes, principalmente em ambientes aquáticos
marinhos e continentais confere a esse grupo
de microrganismos uma imensa versatilidade metabó-
lica. Sua participação em diversos processos de impor-
tância ecológica é bastante conhecida, sendo destacado
CO2, contribuindo não apenas para a disponibilidade de

-
vos do planeta, como também para a redução dos riscos
apresentados pelos gases do efeito estufa. Além disso,
-
trogênio atmosférico em vida livre ou em associações, o
que as coloca numa posição de destaque como micror-
ganismos que participam nos dois processos responsá-
veis pela manutenção da vida em nosso planeta.
Além de sua importância ecológica, muitas microal-
de biomassa que pode ser utilizada como fertilizantes,

enriquecendo os solos e outros ambientes, bem como
apresentam facetas metabólicas como a produção de
pigmentos e lipídeos em quantidades que as tornam po-
tenciais candidatas à utilização em programas de gera-
ção de energia, através da produção de biocombustíveis.
-

ção comercial e tecnológica das microalgas no Brasil é
-
cassez de estudos e informações sobre o potencial de
aproveitamento econômico de suas capacidades, ou à
indisponibilidade de técnicas adequadas para seu culti-
vo e utilização industrial. Nesse sentido, as informações
contribuição inestimável a pesquisadores, professores

e indústrias, podendo proporcionar ferramentas para
estudos aplicados e para o desenvolvimento de méto-
dos e técnicas que levem ao aproveitamento, em larga
escala, das microalgas no cenário nacional.
Nos dois capítulos iniciais deste volume, o leitor
obterá informações sobre como realizar levantamentos
-
ções que ajudem a nortear programas de pesquisa ou
desenvolvimento e inovação tecnológica voltados para
a utilização prática de microalgas.
No terceiro capítulo o leitor é apresentado à capa-
cidade de produção de biodiesel pelas microalgas. In-
formações sobre o processo produtivo em si, bem como
óleo e produção do biodiesel de microalgas são apre-

sentadas de maneira clara e didática, constituindo-se
não apenas em uma grande fonte de informação, como
também numa leitura aprazível sobre um tema pouco
conhecido.
O capítulo seguinte aborda, de maneira clara e ob-
de microalgas com potencial de utilização para a pro-

dução de biodiesel em relação às condições de cultivo.

São apresentados, ainda, resultados de um minucioso
estudo do clima do Estado do Paraná quanto à aptidão
para o cultivo massal de microalgas, facilitando a deci-
são em relação à forma mais adequada de cultivo. Uma
vasta coleção de mapas torna a visualização das carac-
terísticas climáticas do Estado bastante objetiva.
-
mo, reduzir a produção de resíduos, mas muitas ativi-
dades ainda geram quantidades consideráveis de ma-
teriais residuais que, muitas vezes, são descartados no
meio ambiente ou acumulam-se por longos períodos
em depósitos sem que tenham uma destinação adequa-
da. No quinto capítulo é considerado o aproveitamento
de resíduos agroindustriais no cultivo de microalgas
destinadas à produção de biodiesel. A caracterização
ocorrência e cultivo de microalgas nesses materiais são

-
cia das cadeias produtivas da agroindústria brasileira,
com uma destinação mais adequada e racional de seus
resíduos.
cultivo de microalgas em biorreatores de bancada. São

-
res abióticos como luminosidade e fotoperíodo, pH do
meio de cultivo e fontes de nitrogênio sobre a produção
de biomassa de microalgas. Essas informações são de
grande utilidade na hora de optar por um determinado
tipo de biorreator e pela composição do meio de cultivo,
já que a relação entre esses fatores e a qualidade das mi-
croalgas obtidas é apresentada e seus impactos sobre a
produção de proteínas são discutidos.

O sétimo capítulo deste livro considera as possibi-
lidades de utilização dos fotobiorreatores de bancada e
no cultivo massal de microalgas em sistemas abertos no
Estado do Paraná. Aqui, detalhes sobre os componen-
tes e tipos de cultivo massal, meios de cultivo, avaliação
do crescimento e da produção de biomassa e processa-
mento da biomassa de algas são apresentados. Um es-
tudo de caso do norte do Estado do Paraná apresenta
dados reais em relação à escolha e preparo da área para
cultivo, bem como à construção dos fotobiorreatores
abertos. Finalmente, são apresentados dados sobre a
validação de sistemas de cultivo de duas espécies de mi-
croalgas para a produção de biodiesel estabelecidos no
norte do Estado do Paraná.
No oitavo capítulo desta obra o leitor é apresenta-
do a uma série de informações quanto a métodos rela-
cionados ao estabelecimento da Coleção IPR de micro-
algas. São fornecidos detalhes sobre a amostragem, o
isolamento das microalgas para obtenção de culturas
puras, a caracterização morfológica dos isolados obti-
dos, a preservação dos cultivos ex situ e sobre a deter-
minação da viabilidade celular dos isolados obtidos e
de registro e depósito dos espécimes para o estabeleci-

mento da Coleção IPR de microalgas. Essas informações
podem servir de base para trabalhos semelhantes que
venham a ser desenvolvidos por outras instituições em
outras regiões do País.
O capítulo seguinte aborda a utilização de técnicas
de biologia molecular para a caracterização das micro-
algas. São apresentadas informações sobre a utilização
de técnicas de PCR e RFLP e sequenciamento de genes

-
tados na Coleção IPR. Também são apresentados re-
sultados do sequenciamento completo de microalgas e
dados sobre o levantamento dos gêneros de microalgas
que ocorrem nas águas continentais do Estado do Pa-
raná. A associação de técnicas básicas, apresentadas no
capítulo anterior, com as modernas ferramentas de bio-
logia molecular apresentadas neste capítulo torna mais
O décimo capítulo aborda assuntos relacionados

à composição lipídica das microalgas que, por sua vez,
está relacionada à capacidade de produção e às proprie-
dades do biodiesel de microalgas obtido. O leitor encon-
trará, ainda, informações referentes às microalgas (Cya-
nophyta e Chlorophyta), pertencentes à Coleção IPR, no
que diz respeito à sua composição lipídica. Essas infor-
mações podem ser de grande relevância no momento
de escolher microalgas dessa coleção para determina-
dos tipos de cultivo, visando à produção de proteínas
ou de biodiesel.
No capítulo seguinte são apresentados resultados
de análises bioquímicas das microalgas de águas conti-
nentais. O leitor encontrará informações sobre a produ-
outras moléculas de importância bioquímica pelas mi-

croalgas constantes da Coleção IPR. São apresentados,
ainda, resultados sobre a relação entre as condições de
-
se destinam, seja para a produção de biomassa, biodie-

sel, proteínas ou pigmentos de importância industrial.
No décimo segundo capítulo são fornecidas infor-

mações sobre a possibilidade de utilização das ciano-
-
férico, em inoculação de cultivos de leguminosas e
gramíneas. Nos dados apresentados podemos observar
que esses microrganismos atuam como promotores do
crescimento de culturas como o milho e o trigo, além
de interagirem de forma positiva com rizóbios utiliza-
dos na inoculação de leguminosas. Essas informações
abrem uma nova avenida de possibilidades de utiliza-
ção de inoculantes microbianos nas culturas agrícolas
no Brasil.
É gratificante descobrir que, em um espaço de
tempo relativamente curto, o cenário brasileiro saiu da
quase total ausência de informações sobre o potencial
das microalgas em diferentes aplicações, bem como
sobre técnicas para seu cultivo, manejo e demais
O potencial de emprego desses microrganismos para

a produção de biodiesel, sobretudo nos dias atuais,
quando cresce a conscientização sobre a importância
de fontes alternativas para a obtenção de combustíveis
“limpos”, merece mais destaque e atenção por parte dos
segmentos de pesquisa, desenvolvimento e inovação
tecnológica. Para o setor industrial de inoculantes,
abre-se uma possibilidade a mais, capaz de ajudar a
otimizar a utilização das fábricas, relativamente ociosas
em períodos de entressafra.
A possibilidade de cultivar microalgas sem que seja
necessário utilizar áreas destinadas à agricultura volta-
da para produção de alimentos torna esses microrga-
-
diesel em comparação a outras fontes como mamona,

dendê e outras culturas que representariam a incorpo-
ração de novas áreas para cultivo ou a redução de áreas
destinadas a culturas alimentícias. Esta obra represen-
ta um avanço importantíssimo para as futuras gerações,
oferecendo informações que podem contribuir para o
aperfeiçoamento da matriz energética de nosso País,
sem causar mais impactos negativos ao meio ambiente.
Ricardo Silva Araujo, Ph.D.

Diretor de Qualidade da Total Biotecnologia
Indústria e Comércio S/A

Sumário
PARTE 1
ESTADO DA ARTE SOBRE O CULTIVO DE MICROALGAS ......... 33
CAPÍTULO 1
ESTRATÉGIAS DE BUSCA
DE ARTIGOS CIENTÍFICOS
COM ENFOQUE EM MICROALGAS PARA BIOENERGIA .......... 35
Introdução ................................................................. 37
1.1 Plataformas de Dados Bibliográficos Online ................ 39
1.2 Metodologia de Busca .............................................. 41

1.3 Metodologia de Busca no SCOPUS .............................. 41
1.4 Busca Utilizando o Termo Microalgae ......................... 42
1.5 Busca Refinada ....................................................... 47
1.6 Busca Utilizando o Termo Microalgae and Biofuel* ...... 52

Considerações Finais .................................................... 57
Referências ................................................................ 58

CAPÍTULO 2
MINERAÇÃO TEXTUAL DE ARTIGOS SOBRE O CULTIVO

HETEROTRÓFICO DE MICROALGAS ................................... 59
Introdução ................................................................. 61
2.1 Mineração Textual .................................................. 62
2.2 Banco de Dados de Artigos Científicos ........................ 64
2.3 Publicações Sobre Cultivo Heterotrófico de Microalgas . 66

2.3.1 Evolução temporal ......................................................... 67
2.3.2. Localização das publicações ..................................... 67
2.3.3 Principais institutos e pesquisadores ...................... 70
2.3.4 Principais categorias de revistas ............................... 74
2.3.5 Principais palavras-chave ............................................ 77
2.3.6 Principais artigos ............................................................ 80
Referências ................................................................ 85

CAPÍTULO 3
VANTAGENS E DESAFIOS DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL

DE MICROALGAS ........................................................... 89
Introdução ................................................................. 91
3.1 Processo de Produção de Biodiesel a partir
de Microalgas ......................................................... 95
3.1.1 Seleção de local e da microalga ................................. 96
3.1.2 Técnicas de cultivo.......................................................... 97
3.3 Cultivo de Microalgas .............................................. 103
3.3.1 Meios de cultivo .............................................................. 116
3.3.2 Colheita da biomassa microalgal .............................. 122
3.3.3 Sedimentação por gravidade ..................................... 123
3.3.4 Floculação e coagulação ............................................. 127
3.3.5 Centrifugação .................................................................. 134
3.3.6 Flotação ............................................................................. 140
3.3.7 Filtração .............................................................................. 141
3.4 Processamento da Biomassa ..................................... 143
3.5 Extração de Óleo (Ruptura Celular e
Extração dos Lipídios) ............................................. 145
3.6 Produção de Biodiesel ............................................. 153
Referências ................................................................ 161

PARTE 2
DESAFIOS DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA

PRODUÇÃO DE BIOMASSA .............................................. 173
CAPÍTULO 4
POTENCIAL CLIMÁTICO PARA O CULTIVO DE MICROALGAS

EM SISTEMAS ABERTOS NO ESTADO DO PARANÁ ............... 175
Introdução ................................................................. 177
4.1 Exigências Climáticas para a Produção Massal de
Microalgas ................................................................. 178
4.2 Caracterização Climática (Temperatura e PAR) do Paraná
183
4.3 Temperatura do Ar no Paraná ................................... 184
4.4 Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR) ................. 188
Referências ................................................................ 198

CAPÍTULO 5
POTENCIALIDADES E LIMITAÇÕES DO USO DE RESÍDUOS

AGROINDUSTRIAIS NO CULTIVO DE MICROALGAS PARA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL .............................................. 203
Introdução ................................................................. 205
5.1 Caracterização Físico-Química dos Resíduos
como Meio de Cultura para Microalgas ....................... 207
5.2 Ocorrência de Microalgas em Resíduos Agroindustriais . 217

5.3 Cultivos de Microalgas em Resíduos Agroindustriais ..... 225
Referências ................................................................ 239
CAPÍTULO 6
CULTIVO DE MICROALGAS EM FOTOBIORREATORES DE

BANCADA: FATORES ABIÓTICOS ...................................... 243
Introdução ................................................................. 245
6.1 Efeito do Fotoperíodo no Cultivo de Microalgas ........... 246
6.2 Cultivo de Microalgas em Fotobiorreator
de Polietileno ........................................................ 252
6.3 Meios de Cultivo: pH e Concentração
de Nitrato de Sódio ................................................ 254

6.3.1 Preparo do inóculo de ambiente de cultivo ......... 255
6.4 Densidade Ótica e Teor de Proteína na
Biomassa de Microalgas .......................................... 258
6.5 Biomassa de Microalga em Função do pH
e Nitrato de Sódio .................................................. 263
Referências ................................................................ 266
CAPÍTULO 7
CULTIVO DE MICROALGAS EM FOTOBIORREATORES FECHADOS

E EM SISTEMAS ABERTOS ............................................... 269
Introdução ................................................................. 271
7.1 Classificação e Componentes para Produção
Massal de Microalgas em Sistemas Fechados e Abertos . 274
7.2 Tipos e os Métodos de Cultivo Massal de Microalgas ..... 277
7.3 Fotobiorreatores Fechados e Sistemas Abertos ............ 278
7.4 Fotobiorreatores em Bancada em Casa de Vegetação ... 280
7.5. Fotobiorreatores hexaédricos fechados ..................... 282

7.5.1. Alimentação e dispositivo de coleta ....................... 282

7.5.2 Produção de biomassa de Chlorella
vulgaris em fotobiorreatores fechados .................... 284
7.6 Construção de Sistema Aberto de Cultivo
de Microalgas no Norte do Paraná ............................ 285
7.6.1 Infraestrutura de apoio ................................................. 286
7.6.2 Escolha da área, preparo do terreno
e fundações ..................................................................... 287
7.6.3 Execução do sistema de produção aberto ............ 289
7.6.4 Layout da plataforma de “raceways” ....................... 291
7.6.5 Validação do sistema de produção .......................... 295
7.6.6 Coleta da biomassa algal, lavagem
e desinfecção do sistema de cultivo ....................... 295
7.6.7 Cultivo de Chlorella sorokiniana e Neochloris
oleoabundans em “raceways”............................................... 296
7.6.2 Composição da biomassa da
Chlorella sorokiniana após extração
de lipídeos totais .......................................................... 298
Referências ................................................................ 299

PARTE 3
DESAFIOS PARA O ISOLAMENTO, MANUTENÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO
DE MICROALGAS ...........................................................
303
CAPÍTULO 8
COLETA, ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO

MORFOLÓGICA E MANUTENÇÃO IN VIVO
DE MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR ................................... 305
Introdução ................................................................. 307
8.1 Coleta e Preparo de Amostras para Isolamento
de Microalgas ex situ ............................................... 309
8.1.1 Coleta de material biológico....................................... 309
8.1.2 Preparo de amostras para isolamento .................... 314
8.2 Métodos de Isolamento para Obtenção
de Culturas Axênicas ............................................... 315
8.2.1 Isolamento em meio de cultivo sólido ................... 315
8.2.2 Isolamento em meio de cultivo líquido ................. 320
8.3 Caracterização Morfológica ...................................... 322
8.3.1 Morfologia de colônias de microalgas
em meio sólido ................................................................ 324
8.3.2 Caracterização morfológica celular ......................... 324

8.3.3 Análise de diversidade morfológica
de colônias e celulares ................................................. 326
8.4 Preservação dos Cultivos Unialgais ex situ ................. 327
8.4.1 Cultivos de microalgas in vivo ................................... 328
8.4.2 Cultivos in vivo por congelamento
a ultrabaixas temperaturas ........................................ 333
8.6 Viabilidade Celular, Uso de Corantes Vitais
e Contagem nas Células Viáveis ............................... 340
8.6.1 Contagem de células viáveis de microalgas......... 340
8.6.2 Testes de viabilidade celular de microalgas
com corantes azul metileno ...................................... 341
8.6.3 Medidas de viabilidade e observações
microscópicas ................................................................. 343
8.7 Registro/Depósito das Estirpes para o
Estabelecimento da Coleção IPR de Microalgas ................ 345
Referências ................................................................ 346

CAPÍTULO 9
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
DE MICROALGAS ........................................................... 353
Introdução ................................................................. 355
9.1 Caracterização das Estirpes da Coleção
IPR de Microalgas ................................................... 356
9.1.1 Análise BOX-PCR para caracterizar
estirpes de microalgas .................................................. 356
9.1.2 Diversidade genética de estirpes
de microalgas.................................................................. 364
9.2 Agrupamento de Estirpes de Microalgas
pela Técnica PCR-RFLP ............................................. 367
9.3 Análise de Genes Específicos .................................... 371
9.4 Sequenciamento dos Genes 16S e 18S
RNA das Microalgas ................................................ 373
9.4 Ocorrência de Gêneros de Microalgas
em Águas Continentais do Paraná ............................. 376
9.5 Sequenciamento de Microalgas ................................ 377
9.6 Sequenciamento do Genoma
de Microalgas ............................................................. 379
Referências ................................................................ 386

PARTE 4
MICROALGAS: COPRODUTOS DA BIOMASSA

E POTENCIAL USO COMO BIOFERTILIZANTES ..................... 393
CAPÍTULO 10
PRODUÇÃO DE LIPÍDEOS PELAS MICROALGAS

DA COLEÇÃO IPR ........................................................... 395
Introdução ................................................................. 397
10.1 Cultivo das Microalgas ........................................... 398
10.2 Produção de Biomassa pelas Microalgas.................... 399
10.3 Alteração do pH e a relação entre biomassa
e densidade ótica do cultivo ................................... 401
10.4 Lipídeos em Microalgas .......................................... 404
10.5 Produção de lipídeos pelas microalgas
da Coleção IPR ...................................................... 411
Referências ................................................................ 415

CAPÍTULO 11
PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS E PIGMENTOS

PELAS MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR .............................. 419
Introdução ................................................................. 421

11.1 Cultivo das Microalgas ............................................ 422
11.2 Produção de Proteína pelas Microalgas ..................... 424
11.3 Produção de Pigmentos pelas Microalgas .................. 426
11.4 Produção de Clorofila-a e Formação de
Feofitina-a em Pigmentos Produzidos
pelas Microalgas ................................................... 431
11.5 Produção de Carotenoides Totais pelas Microalgas ...... 437
Referências ................................................................ 440
CAPÍTULO 12
INOCULAÇÃO DE CIANOBACTÉRIAS EM
LEGUMINOSAS E GRAMÍNEAS ......................................... 445
Introdução ................................................................. 447
12.1 Potencial da Inoculação de Cianobactérias ................ 449

12.2 Interação entre Cianobactérias e
Outros Microrganismos ........................................... 451
12.3 Metabólitos de Cianobactérias
de Interesse Agronômico ........................................ 452
12.4 Caracterização de Cianobactérias da Coleção IPR ....... 453
12.5 Produção de Hormônios por Cianobactérias ............... 455
12.6 Quantificação in vitro da FBN em Cianobactérias
da Coleção IPR ...................................................... 456
12.7 Inoculação de Cianobactérias em Milho,
em Casa de Vegetação ............................................ 459
12.8 Inoculação do Trigo com Cianobactérias .................... 463
12.9 Dupla Inoculação: Rizóbios
e Cianobactérias ......................................................... 466
Referências ................................................................ 476

PARTE 1
ESTADO DA ARTE SOBRE O

CULTIVO DE MICROALGAS

CAPÍTULO 1
ESTRATÉGIAS DE BUSCA
DE ARTIGOS CIENTÍFICOS
COM ENFOQUE EM MICROALGAS
PARA BIOENERGIA
Freddy Zambrano Gavilanes
Maria Elisabeth da Costa Vasconcellos
Diva Souza Andrade

Produção de Biomassa e Coprodutos 37
Introdução
Neste capítulo, o objetivo é apresentar o caminho para
de interesse em uma plataforma online e, também, conhecer

o número e o desenvolvimento (incremento) das publicações
relacionadas com o tema microalgas e bioenergia ao longo do
tempo.
-
-
denciar as áreas de pesquisas em ascensão, a produtividade de
instituições e países, revistas, autores, artigos e instituições em
da pesquisa e para isso é necessário estabelecer critérios para
para a seleção dos artigos de interesse.

Nas últimas décadas, o tema microalgas tem sido abordado
em diversas pesquisas de grande interesse mundial, e isso se
deve principalmente à capacidade desses microrganismos em
curto tempo de crescimento comparado com culturas oleagino-
ser empregada como matéria-prima para a produção de bio-

combustíveis, produção de fármacos, alimentação humana e
animal, entre outras aplicações. Nas ultimas três décadas, uma
-
ção da biomassa de microalgas para produção de biocombustí-
veis, principalmente para produção de biodiesel.
A revisão sistemática (RS) e a meta-análise (MA) relaciona-
-
clusões da busca (SAMPAIO et al., 2007). Neste sentido as RS e
MA são métodos sistemáticos para evitar vícios (viés) e possibi-
litar uma análise mais objetiva dos resultados facilitando uma

38 Microalgas de Águas Continentais | Volume 2
síntese conclusiva de determinada pesquisa. Ainda na área da

medicina, um trabalho interessante que pode ser aplicado em
qualquer área descreve as cinco principais etapas de uma busca
na revisão sistemática (KHAN et al., 2003). Recentemente, dois
trabalhos de revisão sistemática foram publicados sobre o tema
biocombustíveis e sinergismo de coprodutos dessa atividade
industrial (MARTIN et al., 2014; SILVA et al., 2014).
A partir da internet as facilidades para o uso das bases de
dados têm sido ampliadas. A escolha da base de dados é impor-
-
trônica é uma habilidade de uma RS ou busca, considerada
termos e palavras chave.

Com o uso do SCOPUS (www.scopus.com/) que é uma das
maiores base de dados de resumos e citações de artigos para
Microalgae (microalgas), Microalgae and Bioenergy (bioener-

gia) e Microalgae and Biofuel* (biocombustível), ao longo dos
anos. Os objetivos foram determinar o número de documen-
tos publicados por ano, número de documentos publicados por
países, os tipos de documentos publicados, as principais áreas
das publicações, as instituições que desenvolveram pesquisa
no tema com o número de publicações geradas e as principais
revistas e editoras com o número de publicações.
embora cada uma delas tenha métodos e objetivos diferentes,

Neste capítulo, os objetivos foram também, registrar as dife-
-
-
nergia e mostrar também o aumento de publicações nesta área
nas últimas décadas.
Para simular um exemplo de busca a base escolhida foi
a Scopus por ser mais abrangente e possuir maior número de
publicações (artigos, livro, anais de congressos) relacionadas
com o tema de interesse. Microalgas e bioenergia.

1.1 Plataformas de Dados Bibliográficos Online

As bases de dados internacionais possibilitam acesso rápido
-
mas técnicas, dados estatísticos, patentes, ensaios, estudos de
em várias regiões do mundo. Existem diferentes bases de dados
está a
-
mentais e de interesse geral. Essa plataforma possui perto de
700.000 referências cobrindo as área de ciência, tecnologia,
ciências biomédicas, econômica, social e humanas. Esse banco
de dados é compilado pelas bibliotecas nacionais de vários paí-
ses europeus.
A base de dados SciELO -
periódicos de acesso gratuito na internet publicados no Bra-

sil, Argentina, Chile, Colômbia, Costa Rica, Cuba, Espanha,
Áreas de Ciências Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrá-

rias, Ciências Exatas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais
Aplicadas, Ciências Humanas, Letras e Artes.
A Editora Springer (http://www.springer.com/) possui uma
Coleção de 1.384 publicações periódicas nas áreas de Ciências
Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrárias, Ciências Exa-
tas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais Aplicadas e Ciên-
cias Humanas.
Nesta área, ainda pode ser citada a plataforma Wilson
(http://www.ebscohost.com/wilson) que é uma Coleção de
periódicos com textos completos cobrindo as áreas de Ciências
Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrárias, Ciências Exa-
tas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais Aplicadas, Ciên-
bases de dados de resumos publicadas pela H. W. Wilson.

Na Science Direct -
ódicas da
Áreas de Ciências Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrá-
rias, Ciências Exatas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais
Aplicadas, Ciências Humanas e Letras e Artes. O período dispo-
nível online varia a partir de 1993, não é gratuito e precisa-se
de ter subscrição, para poder acessar a plataforma.
A base de dados Scopus fornece a conexão entre o meio
ambiente e uma variedade de disciplinas, tais como agricul-
tura, educação, direito, saúde e tecnologia. Alguns dos tópicos
cobertos referem-se à mudança climática no mundo, poluição,
agricultura sustentável, energia renovável e reciclagem. A
maioria teve início em 1990, com alguns conteúdos a partir de
1948 que foram incluídos.
Scopus é a maior base de dados de referências e resumos
de literatura e de fontes de alta qualidade na internet. Apesar
do caráter multidisciplinar de sua coleção, seu acervo compre-
ende mais de 4.300 periódicos nas áreas de ciências da vida e
mais de 6.800 títulos em ciências da saúde. Entre suas opções
-
ção deste, assim como a busca simples por palavras chave e
Scopus -
outros produtos-chave da , tais como: ScienceDirect e

Scirus, com o objetivo de evitar a duplicação de esforços dos
pesquisadores em trabalhos de busca da informação e acelerar
o avanço das pesquisas.
Tanto Science Direct como Scopus são dois portais da Elsevier
ao seu conteúdo multidisciplinar. Essas duas plataformas

proporcionam excelentes meios de busca de artigos nas principais
Scopus, além de
ter muita informação recompilada, tem o seguimento das refe-
Scopus nos

muitas categorias, o que na Science Direct somente pode ser

feito por título, tema, ano, tipo de documento.
1.2 Metodologia de Busca

Na primeira etapa deve se formular as questões para a
forma clara. Antes de iniciar o trabalho de revisão as ques-

tões não ambíguas e estruturadas devem ser formuladas. Uma
do protocolo são permitidas somente se caminhos alternati-
busca. No exemplo deste capitulo (microalgae; microalgae and

bioenergia e microalgae and biofuel).
está buscando na base de dados. Neste processo deve comparar
deve estabelecer critérios para a seleção dos artigos a partir

-
car exclusões. Na ultima etapa deve preparar o resumo crítico
foram incluídos na revisão. Apresentar uma conclusão infor-

mando a evidência sobre a quantidade relevante de trabalhos
encontrado.
1.3 Metodologia de Busca no SCOPUS

Para ter acesso à plataforma , o primeiro passo
é acessar a página principal da web site http://www.scopus.
login. Após o login, abrirá uma nova janela do
navegador, na qual vai aparecer a página principal do sistema

Scopus; nessa página existe a opção

ou avançadas.
Na área de (busca) Search é necessário colocar o tema de
-
combustível, então, a busca será Microalgae and Biofuel.
Com o Scopus, pode-se iniciar a busca com uma pesquisa
-
veis de publicações com os quais se possa trabalhar. A caixa
-
nir um limite para a pesquisa clicando em limit to (limitar a)
ou exclude (excluir) para resultados selecionados nas seguintes
categorias: Source title (Título da fonte), Author name (Nome do
autor), Year (Ano), Document type (Tipo de documento) ou Sub-
ject area (Área de interesse). No caso da busca deste trabalho
.
detalhes da pesquisa obtida clicando no título do artigo. Abre-

-se uma nova página que contém o resumo e as referências do
artigo, além de mais informações, como Web Cites (Citações na
Web), Patent Cites (Citações em patentes), (Links
para bibliotecas) e Find related documents -
tos relacionados).
Essa nova página da busca, também permite imprimir,
exportar, enviar por correio eletrônico ou agregar a uma lista
na caixa correspondente. Este processo deve ser feito para cada

um dos trabalhos de interesse detectados na busca para recu-
perar as referências.
1.4 Busca Utilizando o Termo Microalgae

O termo microalgas engloba uma grande variedade de
micro-organismos fotossintéticos que desempenham ampla
gama de funções. Na busca feita em 12 de junho de 2014, na

plataforma , o número de publicações geradas desde

1963 com o tema Microalgae somam se um total de 10.037
nota-se que nos últimos cinco anos o maior número de publica-

ções foi em 2013 com 1.673, em seguida em 2012 com 1.208,
2011 com 931, 2010 com 688 e 2009 com 497 documentos por
ano (Figura 1.1a).
Em relação ao número de documentos publicados sobre
microalgas por países, os Estados Unidos lideram o número de
publicações com 1.797, seguidos de China com 1.016, Espanha
Na busca por forma de documento, o maior número de

publicações até a atualidade foi na forma de artigo cientí-
-
mentos publicados (Figura 1.2a).
As cinco áreas que mais contribuíram com as publicações
foram Agricultura e Ciências Biológicas com 4.177 seguidas de
Ciências e Ambiente com 3.049, Bioquímica Genética e Gené-
tica Molecular com 2.274, Engenharia Química com 1.920 e
Na busca por instituição, dentre as que mais geraram

publicações estão (Figura 1.3a):
1.
2. (França): 90 publicações;
3. (China): 88 publicações;
4.
(França): 81 publicações;
(Austrália):
78 publicações.

As principais revistas ou editoras que se destacaram em

número de publicações foram (Figura 1.3b):
1. Bioresource Technology: 661 publicações;

2. Journal of Applied Phycology: 326 publicações;
3. : 203 publicações;
4.
Journal of Phycology: 138 publicações.
1800
1600
1400
Número de documentos
1200
1000
800
600
400
200
0
1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020
Anos
Colômbia 70
Chile 95
Brasil 285
Austrália 565
França 681
Espanha 717
China 1016
Estados Unidos 1797
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Figura 1.1. Número de documentos publicados a partir de 1963 até

12/06/2014, abordando o tema microalgae por: (a) ano
e (b) países. Fonte: SCOPUS, 2014.

142
1 os de ocumentos
202 18
17
22
77
97
Art o
on er nc er
7780 e s o
Art o m reso
nde n do
tu o de ro
e uen s es u s s
Not
A ri ultura e Ci n ias Biol i as
Ci n ia e Ambiente
Bio u mi a en ti a e en ti a ole ular
46 En enharia u mi a
10
munolo ia e i robiolo ia
8 4
u mi a
41
1 erra e Ci n ias lanetárias
En enharia
Ener ia
edi ina
10 0
04
1 20
22 4
Figura 1.2. Distribuição do número de publicações a partir de 1963

até 12/06/2014 abordando o tema Microalgae por: (a)
tipos de documentos e (b) de acordo com as áreas. Fon-
te: SCOPUS 2014.

Centro de n esti a iones Biolo i as

0
el oroeste
F E E Centre de antes 1
Uni ersit o ueensland
onash Uni ersit
Ben urion Uni ersit o the e e

C arine and Atmospheri
8
esear h
C Centre ational de la
81
e her he ienti i ue
ean Uni ersit o China 88
Uni ersite de antes 0
Uni ersidad de Almeria
0 20 40 60 80 100
Número de u c es er d s
Biote hnolo and Bioen ineerin 1
drobiolo ia 6
ournal o E perimental arine Biolo and

128
E olo
ournal o h olo 1 8
arine E olo ro ress eries 16
A ua ulture 20
ournal o Applied h olo 26
Bioresour e e hnolo 661
0 200 400 600 800

Número de u c es
Figura 1.3. a) Número de publicações geradas com a busca com o

tema microalgas a partir de 1963 até 12/06/2014 e de
acordo com as áreas: a) por instituições; b) por revistas

1.5 Busca Refinada

A bioenergia ou energia da biomassa é um tipo de energia
-
-
os seres vivos ou seus resíduos. Suas formas mais conhecidas

são o biocombustível (Biodiesel, Bioetanol e o Biogás) ou a
biomassa sendo as microalgas matéria prima importante para
geração de bioenergia.
Microalgae and Bioenergy
foi feita. Sabendo se que as pesquisas com este tema se inicia-
ram na década de oitenta, resultando em aumento das publica-
o tema Microalgae and Bioenergy por período de 1986 até 2014.

O resultado obtido foi um total de 207 documentos. Nota-se
que, nos últimos cinco anos, o maior número de publicações foi
com 28 e 2010 com 21 documentos (Figura 1.4a). Em relação

ao número de documentos publicados por países observa se
que os Estados Unidos lideram com 66, seguido da China com
24, Reino Unido com 17, Índia com 16, Austrália com 13. Na
América do Sul foram encontradas 7 publicações com o tema,
sendo 4 do Brasil, 2 da Argentina e 1 do Chile (Figura 1.4b).
O maior número de publicações a partir de 1986 até 12
junho de 2014 foi na forma de artigos com 131, revisão com
e capítulos de livro com três tipos de documentos publicados
Ciência e Ambiente com 83, seguida da Engenharia Química

70
60
40
20
10
0
1 80 1 8 1 0 1 2000 200 2010 201 2020
Anos
16
17
66
0 10 20 0 0 50 60 70
Figura 1.4. Número de publicações abordando o tema Microalgae

and Bioenergy
até 12/06/2014: (a) ano e (b) países. Fonte: SCOPUS
2014.

1 1 1
1 1
11
2
1 1
Arti o e is o
Con er n ia paper Arti o impreso
Cap tulo de li ro i ro
e is o de o eren ias Errata
e ueno in u rito esumo reportado
re de u c es
1
26 8
2
Ci n ia e Ambiente
En enharia u mi a
41 Ener ia
4 munolo ia e i robiolo ia
En enharia
u mi a
edi ina
6 F si a e Astronomia
Figura 1.5. Número de publicações abordando o tema microalgae

and bioenergy de acordo com: (a) tipo (formato) e. (b)
grandes áreas das publicações
1986 até 2014. Fonte: SCOPUS 2014.

As instituições que geraram mais publicações foram

(Figura 1.6a):
1. (EUA): 7 publicações;
2.
4.
As principais revistas ou editoras que tiveram mais publi-

cações foram (Figura 1.6b):

2. : 9 publica-
ções;
3. Biomass and Bioenergy: 9 publicações;
4. : 8 publicações;
: 7 publica-
ções.

ampereen e nillinen liopisto 4
hio tate Uni ersit 4
ational ene able Ener aborator
Ban or Uni ersit
Finnish En ironment nstitute
Uni ersit o ir inia
A nstitut ational de a
Uni ersit t Biele eld
Conseil national de re her hes Canada
he Uni ersit o eor ia
0 1 2 4 6 8
Número de u c es
Ener Con ersion and ana ement

Applied i robiolo and Biote hnolo
ournal o Biote hnolo
hotos nthesis esear h 4
Applied Bio hemistr and Biote hnolo 4
Current pinion in Biote hnolo 4
Biote hnolo or Bio uels 4
los ne
Al al esear h
ene able and ustainable Ener e ie s
Applied Ener 8
Biomass and Bioener
AC ational eetin Boo o Abstra ts
0 10 1 20 2 0 40 4
Número de u c es
Figura 1.6. Número de publicações abordando o tema (microalgae

and bioenergy) geradas por: (a)Instituições; (b) Revistas
SCOPUS 2014.

1.6 Busca Utilizando o Termo Microalgae and

Biofuel*
A busca pelo título, resumo e palavras-chave dos termos
microalgae and biofuel*
de recuperar os possíveis sinônimos deste termo. O número

de documentos publicados por ano, com relação aos termos
(microalgae and biofuel*), pesquisados na plataforma Scopus
estão apresentados na Figura 1.7a. Nesta busca obteve se um
resultado de 1.624 documentos. Estas publicações começaram
-
os termos de busca microalgae and biofuel* são: Estados Unidos,

China, Índia, Austrália e Coréia do Sul. O Brasil aparece em 16°
lugar com um total de 33 documentos (Figura 1.7b).
tipos de documentos publicados, referentes a busca na plata-

forma Scopus.
As áreas de pesquisa com maior número de documentos
usando os termos Microalgae and Biofuel* são: Engenharia
Química com 711; Ciências Ambientais com 606; Bioquímica,
Genética e Biologia Molecular com 412; Energia com 311;
1.8b).

600
Numero de documentos 500
00
00
200
100
0
1970 1980 1990 2000 2010 2020
nos
e 9
o om 26
r s
or do u 74
Austr 82
nd 96
n 207
st dos n dos 41
0 100 200 00 400 00 600

Número de documentos u c do or s
Figura 1.7. Número de documentos publicados obtidos pela pesquisa
a busca dos termos, microalgae and biofuel* (a) por ano

e (b) por países. Fonte: SCOPUS, 2014.

1 1 42 4
1 4
208 11
2 4
41 606
412
En enharia u mi a
Ci n ia e Ambiente
Ener ia
En enharia
munolo ia e i robiolo ia
u mi a
Figura 1.8. Número de documentos encontrados com a busca, utili-
Microalgae and Biofuel*. Pesquisa rea-
áreas de pesquisas. Fonte: SCOPUS 2014.

As instituições em que se encontram os maiores números

de documentos em relação a esta busca são (Figura 1.9a):
1. Chinese Academy of Science (China): 32 publicações;

2. (EUA): 32 publica-
ções;
3. (China): 27 publica-
ções;
4. -
cações;
(Australia): 23 publicações.
As revistas em que aparece maior número de documentos

em função dos termos pesquisados são (Figura 1.9b):

2.
3. Journal of Applied Phycology: 43 publicações;
4. Biomass and Bioenergy: 36 publicações;
Abstracts

Uni o ueensland 20
Uni nd de antander 21
orea Ad nst o e h 21
sin hua Uni 21
a enin en Uni and es C 21
onash Uni 2
at en Ener ab 2
at Chen un Uni 2
Uni innesota C 2
Chinese A 2
0 10 1 20 2 0
Número de u c es
ene able and ustainable Ener e ie s 2
Applied Bio hemistr and Biote hnolo 2
Applied i robiolo and Biote hnolo 2
Biote hnolo Ad an es 24
Al al esear h 0
AC ational eetin Boo o Abstra ts
Biomass and Bioener 6
Applied Ener 2
0 0 100 1 0 200 2 0 00 0
No de er od cos e ed tor s
Figura 1.9. Número de publicações de acordo com os termos de
partir de 1979 até 12/06/2014: (a) por Instituições (b)

por Períodicos. Fonte: SCOPUS 2014.

Considerações Finais
Desde o ano 1963 até 2014 usando a base de dados SCO-
PUS com o termo Microalgas foram encontrados 10.037 docu-
mentos publicados. No ano de 2013 teve maior número de
Quando os termos Microalgae, Microalgae and Bioenergy e

Microalgae and Biofuel -
ais das publicações foram observados nos EUA e China.
Na plataforma Scopus Microalgae, foi
observado incremento no percentual de publicações em vários
Microalgae and Biofuel os
mesmo padrão de percentagem de incremento nestes países foi

observado com a busca com Microalgae and Bioenergy.
Ás áreas que obtiveram maior número de publicações até
a atualidade com o termo Microalgae foram as da Agricultura
e Ciências Biológicas, seguidas de Ciências Ambientais; com o
termo Microalgae and Bioenergy foram Ciências Ambientais e
Engenharia Química; já com os termos Microalgae and Biofuel,
a Engenharia Química e Ciências Ambientais lideram sendo as
publicações escritas mais na forma de artigo seguidas daquelas
escritas na forma de resumo de conferência.
Entre as principais instituições que geraram mais publi-
cações com o termo Microalgae destaca-se a
(Espanha), (França). Com o termo
Microalgae and Bioenergy a (Estados Unidos
da América, EUA) e (Canadá) e
com o termo Microalgae and biofuel Chinese Academy of Scien-
ces (China) e (Estados Unidos da América,
EUA).
Estudos com o tema envolvendo microalgas são de grande
interesse mundial, com pesquisas importantes nos diferentes
continentes, especialmente no Americano com os Estados Uni-

dos e no Asiático com a China. Na América do Sul observou-

-se tendência de incremento das publicações em alguns países
liderados pelo Brasil.
Referências
KHAN, K.; R. KUNZ; J. KLEIJNEN; G. ANTES. Five steps to conducting a
systematic review. J R Soc Med., v. 96, n. 3, p. 118-121. 2003.
MARTIN, M.; A. J. E. FONSECA. A systematic literature review of biofuel
synergies. L. U. Linköping University Environmental Technology and
SAMPAIO, R.; M. MANCINI. Estudos de revisão sistemática: um guia para

Rev. Bras. Fisioter, v. 11, n. 1,
p. 83-89. 2007.
SILVA, V.; E. LOPES; E. ANDRADE; R. SOUSA; M. ZANGERONIMO; L.
PEREIRA. Use of biodiesel co-products (Glycerol) as alternative sources
of energy in animal nutrition: a systematic review Uso de co-productos
de biodiesel (Glicerol) como fuentes alternativas de energía en la
alimentación animal: una revisión sistemática. Arch Med Vet v. 46, p.
111-120. 2014.

CAPÍTULO 2
MINERAÇÃO TEXTUAL DE ARTIGOS

SOBRE O CULTIVO HETEROTRÓFICO
DE MICROALGAS
Elisângela Andrade Angelo

Introdução
As microalgas representam um grupo bastante diverso de
demonstrado ampla versatilidade metabólica. Destaca-se que
-
-
síntese e também oxidar fontes de carbono, e espécies fotohe-
-
-ROCHA, 2004).
Desde o início dos estudos sobre a produção de microalgas,
tem predominado o cultivo baseado no metabolismo fotoauto-
1996). No entanto, é importante considerar a versatilidade das

microalgas ao se desenvolver sistemas de produção. A escolha
de qual o melhor sistema para o cultivo envolve vários fatores
como: objetivo da produção (produto ou processo almejado),
bem como as características da microalga. Destaca-se que cada
-
gicos próprios.
com a literatura, esta forma de cultivo apresenta a vantagem

de não necessitar de uma fonte luminosa, o que permite a pro-
dução em maiores volumes e com altas densidades, já que não
-
-
-
ção e, em geral, as espécies de microalgas com esta forma de
metabolismo apresentam altas produtividades. As principais

pode encarecer o processo; grande demanda por gás oxigênio
2007; CHENG et al., 2009; SHEN et al., 2010; PEREZ-GARCIA

et al., 2011).
mostrar promissor, ainda há muitas perguntas sobre este pro-

cesso de produção. Desta maneira, o presente capítulo tem por
sobre os grupos de pesquisas que o estudam. Estes resultados
convênio entre o Instituto Agronômico do Paraná, Companhia

Paranaense de Energia e Fundação de Apoio à Pesquisa e ao
Desenvolvimento do Agronegócio.
2.1 Mineração Textual
que tem como objetivo descobrir padrões implícitos, com-

preensíveis e úteis com base em documentos de textos (BAO
ampla, denominada: Descoberta de Conhecimento em Banco

de Dados, representada pela sigla KDD (no inglês:
Discovery in Databases). Esta área do conhecimento começou a
ser desenvolvida principalmente na década de 1980, quando já
era comum a existência de grandes bancos de dados, que torna-
vam muito difícil a busca manual por informações relevantes
(NEVES, 2012).
O KDD consiste, basicamente, em cinco etapas (BAO et al.,
2012):
1.

questões espera-se que o processo responda;

2. Escolha do banco de dados, o qual deve apresentar po-
tencial para responder às expectativas levantadas na
primeira etapa;
-
ferências indesejáveis em processamentos posteriores,
bem como, adequar a linguagem do banco de dados às
4. Mineração dos Dados corresponde à análise dos da-

-
vantes;
-
las e sumários, o que facilita a análise geral do tema.
A aplicabilidade do KDD é bastante ampla, indo desde o

setor comercial e industrial, ao acadêmico e onde a análise de
dados permite uma melhor compreensão do estado da arte do
tema em estudo, o que facilita o avanço da pesquisa, bem como
a inovação tecnológica.
Destaca-se que na mineração textual, geralmente, são utili-
-
vel por um software. Os artigos e patentes são exemplos destes
textos, pois apresentam uma disposição padrão de seus itens,
tais como: título, autores, palavras-chaves, entre outros (DING;
FU, 2012; VENTURA; SILVA, 2012).
O KDD apresenta metodologias e ferramentas próprias,
dados, como o Scopus, apresentam ferramentas que permitem

uma mineração textual prévia, bem como o levantamento de
informações relevantes.
Tendo em vista que este estudo visava um mapeamento
(Search
Technology). Este programa foi desenvolvido para a minera-
ção textual e permite responder às seguintes perguntas sobre o

tema: quem são e onde estão os pesquisadores? O que eles pes-

quisam? Como está a evolução da quantidade de publicações
ao longo dos anos? O programa também permite compreender
as relações entre autores, instituições e países; as tendências,
bem como a evolução de indicadores (PORTER, 2004; 2012).
Embora o permita a mineração em artigos
e patentes, este estudo focou na mineração textual de artigos
-
tas adequadas do -
ração textual, com os seguintes objetivos:
1. Observar a evolução das publicações sobre cultivo he-
e autores que trabalham com este tema;
dos principais autores;

-
bre o tema;
-
pais países e autores;
-
7. Ranquear os artigos mais citados sobre o tema;
2.2 Banco de Dados de Artigos Científicos
-
ria da ciência, o que possibilita reconhecer seu histórico, evo-
lução, bem como, apontar para desenvolvimentos futuros. Para
ser publicado na forma de artigo, a regra geral é que o estudo

para as publicações, dando maior credibilidade aos estudos e

pesquisadores (GRUSZYNSKI; GOLIN, 2006). Embora exista
crítica a este processo, ele é o predominante no meio acadê-
mico nas várias partes do mundo.
títulos cresceu expressivamente (GRUSZYNSKI; GOLIN, 2006).

Nos últimos anos, além das tradicionais revistas impressas, tem
se desenvolvido uma mídia eletrônica, a qual tem se dedicado
É notório que a quantidade de informação nas últimas

décadas não tem precedentes na história, o que levou muitos a
informações não foi diferente, o que resultou na publicação de

maior quantidade de artigos. A fim de facilitar a busca por estes
bancos de dados eletrônicos, nos quais os artigos de diferentes

revistas (impressa e/ou eletrônica) são cadastrados. Estes
bancos de dados facilitam o acesso, o resgate de informações,
permitem maior interatividade entre os pesquisadores, bem
como facilitam a navegabilidade eletrônica (GRUSZYNSKI;
GOLIN, 2006).
determinadas áreas e outros multidisciplinares. Nesse estudo,
para busca de artigos: Web of Science e Scopus Basic Research.

Web of Science Thomson
Reuters, empresa do setor de jornalismo que atua em vários seg-
mentos do ramo e é considerada uma das maiores do mundo.
Web of Science é um dos mais tradicionais bancos de dados de
pesquisa de artigos científicos e até junho de 2013 contava
de 1898.

Scopus Basic Research é a maior base de dados para
de registros, sendo que os mais antigos datam de 1823. Este

banco de dados é administrado pela Elsevier, a maior editora
científica do mundo.
2.3 Publicações Sobre Cultivo Heterotrófico

de Microalgas
microalgae heterotrophic
escolhidos. Destaca-se que só foram considerados os artigos em
que estes termos apareciam juntos no título, palavras-chaves
ou no resumo. Após o levantamento, os resultados das pesqui-
sas nas duas bases foram integrados e trabalhados em conjunto.
, versão 7.0, foi
feita a integração entre as pesquisas nos dois bancos de artigos.
do texto.
-
trabalhou-se com um conjunto de 493 artigos. Foram incluídos

no conjunto tanto os artigos que tinham como tema central
programa Excel, versão 2010, onde foram trabalhados.

2.3.1 Evolução temporal

O primeiro item avaliado foi a evolução das publicações
ao longo dos anos (Figura 2.1). Nota-se que nos últimos anos
a quantidade de trabalhos sobre o assunto aumentou consi-
deravelmente; sendo que os últimos 10 anos correspondem a
interesse pelo tema, com tendência de continuidade das pes-

quisas; trata-se, portanto, de um tema com características de
emergente. No ano de 2011 foram publicados 63 artigos sobre
tema; e até junho de 2012 foram publicados 40 artigos.
u nt d de de
u c es
60
20
0
1978 1991 1996 2001 2006 2011
no
Figura 2.1.
de microalgas entre 1978 e junho de 2012.
2.3.2. Localização das publicações

Em relação à localidade da pesquisa, constatou-se que
os artigos provinham de 48 países. Na Figura 2.2 apresenta a
quantidade de publicações dos 10 principais países. A Figura
2.3 apresenta a evolução das publicações dos EUA e China,

principais países que publicam sobre o tema, correspondendo

-
nesta área, sendo que a China iniciou suas publicações apenas

em 1997, seguido por um crescimento acentuado de suas pes-
-
ções e a China cor
rt os
80
70
60
50
0
0
20
10
0
ses
Figura 2.2. Quantidade de artigos dos 10 países que mais publica-
Com a mineração textual, é possível ver -

ções entre as publicações dos diferentes países, autores ou insti-
tuições. Com base nos dados, foram feitas análises estatísticas de
a interação não apenas considerando a quantidade de trabalhos

publicados juntos, mas a representatividade desta quantidade
frente ao conjunto global de publicações de cada país. Dessa
maneira, é possível mapear as relações de trabalho. A Figura 2.4
apresenta o mapa de correlações de publicações dos 20 princi-
o.

u nt d de de
u c es
1
12
10
0
1991 199 1997 2000 200 2006 2009 2012
nos
2 2
Figura 2.3. Evolução das publicações dos EUA e China entre 1991 e
Analisando-se a Figura 2.4, nota-se que os EUA apresen-

tam forte correlação com México e Canadá, provavelmente
correlação com Holanda, China e Suíça. A sinergia entre alguns

países europeus também pode ser percebida, como é o caso da
Suécia, Reino Unido e Alemanha. Em relação ao Brasil, nota-se
que o país encontra-se isolado em termos de publicação sobre
este tema, o que pode ser prejudicial para a evolução nacional
destas pesquisas.

Figura 2.4. Mapa das correlações entre os 20 países que mais pu-
Quanto mais forte o tracejado, maior a correlação en-
tre os países.
2.3.3 Principais institutos e pesquisadores
publicam sobre o tema. Destaca-se que entre as cinco princi-

pais, duas são chinesas: Universidade de Hong Kong e Acade-
mia Chinesa de Ciências. Nos EUA destaca-se a Universidade

de Maryland, porém diferente da China, observa-se que as pes-

quisas norte-americanas encontram-se mais difusas em vários
principais instituições ao longo dos anos, a partir de 1990.
rt os
18
16
12
10
nos
Figura 2.5. Quantidade de publicações das principais instituições,

-
Em relação aos autores, o que mais publica sobre o cultivo
publicações em 1991 e, desde então, tem mantido certa cons-

High cell density culture of microalgae in heterotrophic

growth Biodiesel production by microalgal bio-
technology
tornando-o uma referência no tema. Outros autores chineses
Entre os autores que desenvolvem pesquisas nos EUA,
Yanna Liang, Nicolas Sarkany, R. W. Barclay, Paul Chen.

A Figura 2.6 apresenta o mapa de relações entre os 20
principais autores de acordo com o levantamento feito. Já a
Figura 2.7 apresenta a correlação entre estes autores.
Figura 2.6. Mapa que representa as interações entre os 20 autores

-
croalgas.

Figura 2.7. Mapa das correlações entre os 20 autores que mais pu-
Quanto mais forte o tracejado, maior a correlação entre

os países.
Pode-se observar claramente que há três grupos de autores

que publicam com frequência em conjunto, isto pode ser perce-

dos em conjunto nestes grupos (Figura 2.7). Os demais auto-

res, embora apresentem publicações em conjunto, a correlação
estatística entre eles é baixa. Devido à sua representatividade,
a correlação de F. Chen com outros autores foi baixa (entre
observar a interação deste autor com outros como: R. Johns, Y.

Jiang e Z. Y. Wen.
2.3.4 Principais categorias de revistas
acordo como os temas mais comuns dos artigos que elas publi-
uma análise dos artigos levantados. Destaca-se que algumas

-
-
nologia e, ao mesmo tempo, também da categoria das enge-
nharias. Além disso, para facilitar a análise dos dados, algumas
-
-
a distribuição dos artigos levantados de acordo com as catego-

rias das revistas, entre 1990 e 2012 (primeiro semestre).
Analisando-se a Figura 2.8, percebe-se que a área relacio-
nada à Biologia Aquática manteve-se em destaque ao longo dos
que teve início entre pesquisadores desta área. Estes micror-

-
cultura. Destaca-se que os trabalhos pioneiros dos EUA foram
publicados nesta categoria de revistas. Porém, entre 2010-2012
observou-se aumento dos artigos em revistas sobre Biotecnolo-
gia e Microbiologia Aplicada, sendo que esta categoria passou
a ser a mais representativa (PEREZ-GARCIA et al., 2011).

100
90
80
70
60
50
0
0
20
10
0
1990 199
1995 1999
2000 200
2005 2009
2010 2012
Figura 2.8. Quantidade relativa das publicações em relação às ca-

tegorias das revistas, entre 1990 e primeiro semestre
de 2012.
O estudo procedeu relacionando-se as categorias das

publicações com os principais países (Figura 2.9) e com os
principais autores (Figura 2.10). Analisando-se a Figura 2.9,
percebe-se que a China destaca-se na área de biotecnologia
e microbiologia aplicada, porém são escassos os trabalhos
chineses em categorias como Ecologia e Ciências Ambientais.
Em relação aos autores (Figura 2.10), percebe-se que F.

Chen é uma referência para questões biotecnológicas sobre o
assunto. Quando o enfoque é em Ecologia e Ciências Ambien-
tais, os autores de referência seriam G. Bourdier e C. Amblard,
que, juntamente com D. Bradkey Eyre, são também os que mais
apresentam artigo na categoria Biologia Marinha, Aquicultura
e Piscicultura.

corr nc
100
90
80
70
60
50
0
0
20
10
0
utores
Figura 2.9. Quantidade relativa das publicações em relação às cate-

gorias das revistas, entre 1990 e primeiro semestre de
2012: Categorias em relação aos países.
corr nc
100
90
80
70
60
50
0
0
20
10
0
utores
Figura 2.10. Quantidade relativa das publicações em relação às ca-

tegorias das revistas, entre 1990 e o primeiro semes-
tre de 2012: Categorias em relações aos autores.

2.3.5 Principais palavras-chave
o escopo geral da pesquisa, as palavras-chaves tendem a repre-

sentar ainda melhor o estudo, pois foram escolhidas pelos pró-
prios autores. Desta maneira, a mineração textual no campo
das palavras-chaves pode resultar em informações importantes.
No entanto, esta análise requer um trabalho detalhado de lim-
necessário analisar termos técnicos. Neste estudo, as palavras-

-chaves foram agrupadas nas seguintes categorias principais:
Taxonomia; Bioquímica e Genética; Ecologia; Microbiologia
básica de microalgas; Ambiental/Toxicologia (termos relacio-
nados ao tratamento de resíduos e toxicidade ambiental das
microalgas); Produtos microalgais; Meios de cultivo e técni-
cas de produção; Biologia Aquática. A Figura 2.11 apresenta
a porcentagem das palavras-chaves presentes nos artigos, nas
categorias citadas anteriormente.
Analisando-se a Figura 2.11, percebe-se que os artigos con-
centram-se mais nas pesquisas aplicadas, que visam a produção
destaque para: lipídios (poli-insaturados e para produção de

biodiesel) e pigmentos. As categorias relacionadas à produção
cultivo e separação de microalgas ainda são um gargalo tecno-
escala. Desta maneira, esta área ainda necessita de desenvol-
na frequência recorrente com que estes temas são abordados

nos artigos.

5 5 1
1
26
11
11
16
Figura 2.11. Distribuição das palavras-chaves dos artigos pesquisa-

dos.
Em pesquisas e desenvolvimentos tecnológicos que envol-

vem microrganismos é essencial saber quais são as espécies
-
riram palavras-chave referentes à taxonomia da microalga do
estudo. Foram citados 32 diferentes gêneros de microalgas,
sendo os mais comuns (ordem decrescente de ocorrência, as
porcentagens consideram apenas as citações dos nomes de
gêneros): Chlorella Cryphecodinium
Tetraselmis Chlamydomona
Vários autores citam o gênero Chlorella como um dos mais

et al., 2012; PEREZ-GARCIA et al., 2011). Neste levantamento,

as espécies de Chlorella citadas nas palavras-chaves foram: C.
emersonii, C. minutissima, C. protothecoides, C. pyrenoidosa, C.
vulgaris, , C. saccharophila, . Sendo
que a espécie C. protothecoides foi a mais citada: correspondeu
por C. vulgaris
no cultivo de C. protothecoides em meio à base de

-1
extrato de levedura e glicose. Os trabalhos de Miao e Wu (2006)

indicam que a composição da biomassa de C. protothecoides
ela é mais promissora para aproveitamento da porção lipídica.

Outro destaque na análise da taxonomia é a citação repre-
sentativa da classe Bacillariophyta, a qual pertence as diatomá-
Tabela 2.1. Composição da biomassa de C. protothecoides em cultivo
Proteínas
Lipídios
Carboidratos
Umidade
Outros
Fonte: Miao e Wu (2006).

2.3.6 Principais artigos
estabelecer o ranking dos artigos, de acordo com a quantidade
antigos tendem a serem os mais citados, por isto, a compara-

ção foi feita considerando cada ano isoladamente. A Tabela
2.2 apresenta os artigos mais citados, publicados entre 2008 e
2011. Observa-se que alguns destes artigos não tinham como
-
mações relevantes sobre esse tema.
Tabela 2.2. Artigos mais citados ranqueados durante a mineração

textual.
Título do artigo Ano Autores
Cultivation,
photobioreactor Chen, Chun-Yen; Yeh,
design and harvesting Kuei-Ling; Aisyah,
2011
of microalgae for Rifka; Lee, Duu-Jong;
biodiesel production: A Chang, Jo-Shu.
critical review
Huang, GuanHua;
Biodiesel production
Chen, Feng; Wei, Dong;
by microalgal 2010
biotechnology
Gu.
Biomass and lipid

productivities of
Chorella vulgaris
Liang, Yanna; Sarkany,
under autotrophic, 2009
Nicolas; Cui, Yi.
heterotrophic and
mixotrophic growth
conditions
The technology of
2008 Eriksen, Niels Thomas
microalgal culturing

Além dos artigos ranqueados entre os mais citados, outras
microalgas merecem destaque, por também focarem em pon-

tos relevantes para o desenvolvimento deste tema; a Tabela 2.3
apresenta informações sobre alguns destes artigos.
Tabela 2.3.
de microalgas.
Título do artigo (primeiro autor,

Comentários
ano de publicação)
Dentre as fontes testadas,

nitrogen sources for biomass
as melhores foram glicose
and lipid production by
e peptona bacteriológica.
Chlorella saccharophila under
Comparando com o cultivo
heterotrophic conditions
and development of Nile red
resultou em concentração de
uorescence based method for
quanti cation of its neutral lipid
content (Muge Isleten-Hosoglu,
maior.
2012)17.
Estuda a mudança na
composição da biomassa em
função do meio de cultivo
The dynamics of heterotrophic
cultivo. Propõe um modelo para
Siegles, 2011)18.
da microalga Auxenochlorella
protothecoides.
Best practices in heterotrophic

Revisão geral sobre as
high-cell-density microalgal
microalgas que crescem em
processes: achievements,
potential and possible
possibilidades de técnicas e
limitations (Fabian Bumbak,
meios para este cultivo.
2011)2.

Improvement of medium
composition for heterotrophic com a glicose como fonte de
cultivation of green microalgae, carbono. A concentração celular
Tetraselmis suecica, using -1
) foi de 2 a 3
response surface methodology
19
. T. suecica.
Heterotrophic cultures of Revisão geral sobre microalgas
microalgae: Metabolism and
potential products (Octavio interesse que podem ser obtidos
4
. nesta forma de cultivo.
extrato de levedura e nitrato de

Heterotrophic Culture of
potássio sobre o crescimento
Chlorella protothecoides in
de 4 cepas de Chlorella
Various Nitrogen Sources for
protothecoides. O cultivo é fed-
Lipid Production (Y. Shen,
bach e a maior concentração de
2010)20.
biomassa seca obtida foi 17 g
L-1.
High-density fermentation A máxima densidade conseguida
of microalga Chlorella -1
(167
protothecoides in bioreactor for horas de cultivo) em um meio
microbio-diesel production (Wei a base de minerais, extrato de
14
. levedura e glicose.
O aumento de escala não
Large-scale biodiesel production
from microalga Chlorella
a produção de biomassa; em
protothecoides through
biorreator de 11.000 L alcançou
heterotrophic cultivation in
densidade de 14,2 g L-1. Estuda
2007).21
Heterotrophic high-cell-density O estudo visa à produção

de pigmentos em cultivo
cultures of Galdieria sulphuraria
and production of phycocyanin resultados satisfatórios
(OLAV SUNE GRABERHOLT,
2007)22. -1
dia-1).

Cultiva em condições
Biodiesel production from Chlorella protothecoides e

heterotrophic microalgal oil compara formas de obtenção do
13
. biodiesel a partir da biomassa,
bem como as características
Testa um meio a base de

High quality biodiesel
hidrolisado de milho, para
production from a microalga
C.
Chlorella protothecoides by
protothecoides
heterotrophic growth in
custos. Estuda o biodiesel obtido
23
.
do processo.
Kinetic and stoichiometric

relationships of the energy O estudo apresenta informações
and carbono metabolismo relevantes sobre o metabolismo
in the culture of Microalgae
(KATARZYNA CHOJNACKA, diferentes formas de cultivo.
2004)1.
Revisão com várias informações

sobre o cultivo e as
High cell density culture of
características de microalgas. É
microalgae in heterotrophic
o primeiro artigo de Chen que
growth (FENG CHEN, 1996)10.
ganhou destaque em termos de
quantidade de citações.
Heterotrophic production of
O foco é a produção de ômega-3
long-chain omega-3-fatty-
com microrganismos, com
destaque para as microalgas
like microorganisms (W. R.
BARCLAY, 1994)24.

A mineração textual é uma importante metodologia para
-
nado tema. Neste estudo, esta metodologia permitiu observar a
dos anos. Percebeu-se que a quantidade de publicações vem

-
gente.
Os principais países que publicam sobre o cultivo hetero-
suas pesquisas mais tardiamente, porém, conta com o autor

que mais publica sobre o tema: Feng Chen, da Universidade de
Honk Kong. As publicações chinesas sobre o cultivo heterotró-
-
aos campos de publicação sobre este tema, destacando-se nas

seguintes categorias: Biologia marinha, aquática e piscicultura
-
Os principais gêneros de microalgas citados nas palavras-

-chaves dos artigos são Chlorela, Cryphecodinium,
Tetraselmis e Chlamydomonas. Entre as espécies, as que mais
constaram nas publicações foram Chlorela protothecoides e C.
vulgaris; as quais vem se mostrando promissoras para o cultivo
Por ser uma tecnologia emergente, percebe-se que o cul-

-
vimento tecnológico. No entanto, esta área vem se mostrando
promissora, sendo que há trabalhos que citam sua aplicabi-
lidade para produção de vários compostos. Percebe-se que é
cedo para pensar na viabilidade econômica do processo, pois
ainda não se tem toda a tecnologia desenvolvida; porém, como

desenvolvido, a incorporação destas tecnologias já maduras

pode contribuir para a aplicabilidade desta forma de cultivo
de microalgas.
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CAPÍTULO 3
VANTAGENS E DESAFIOS
DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL
DE MICROALGAS
Lisandra Ferreira de Lima

Lucas Alves Maroubo
Admilson Lopes Vieira

Introdução
Pesquisas recentes têm focado no desenvolvimento de tec-
nologias para a produção de biodiesel, um combustível biode-
ou totalmente o diesel, por motivos econômicos e ambientais.

Uma das principais vantagens da substituição do diesel conven-
cional pelo biodiesel é a redução considerável na emissão de
poluentes atmosféricos ao meio ambiente (FERRERO, 2011).
-
rias-primas, incluindo gorduras animais, óleos vegetais, ou
Entretanto, do ponto de vista econômico, devem ser adotados
produção do biodiesel (AHMAD, 2011a).

Estes critérios de seleção se baseiam nos seguintes aspec-
tos: teor de lipídio por área cultivada; período de cultivo da
espécie; existência de um balanço energético favorável; preço
da matéria-prima compatível com a necessidade de fornecer
biodiesel a preços competitivos; possibilidade de aproveita-
mento do subproduto da extração do óleo, principalmente para
-
2006).
Atualmente, no Brasil, a principal matéria-prima para a
produção de biodiesel é o óleo de soja, conforme mostrado
na Figura 3.1, com dados extraídos da página 19 do Boletim
Mensal dos Combustíveis Renováveis, mês de fevereiro/2014
(BRASIL, 2014a).
A partir de um ponto de vista socioeconômico e ambiental,
novos estudos para produção de biodiesel têm incluído tecno-
-
setor alimentício. Um exemplo que se enquadra neste contexto

é o aproveitamento da biomassa proveniente de determinadas

espécies de microalgas, constituídas por grande quantidade de
lipídios que servem como insumo para a produção de biodiesel
(FERRERO, 2011).
2 9
20 5
Fonte: Baseado nos dados de Brasil (2014a).
Figura 3.1.
de biodiesel no Brasil em 2013 (acumulado até novem-
bro).
Todas as células vegetais e consequentemente, as células

de microalgas apresentam lipídios na sua composição (RICH-
MOND; HU, 2013). É certo que nem todas as microalgas são
culturas tradicionais de extração de óleo. No entanto, algu-
em sua composição, valor muito superior à soja, que alcança,
(CAVALCANTE et al., 2011). A produção de biodiesel a partir

de microalgas, apesar de incipiente, possui numerosas vanta-
gens sobre os cultivos clássicos, dentre as quais se destacam:

a) Muitas espécies de microalgas apresentam altas con-

centrações de lipídios em suas estruturas. Comumen-
te os níveis de lipídios nestas microalgas estão entre
e das condições de cultivo (MATA; MARTINS; CAETA-

NO, 2010);
b) O cultivo de microalgas não participa do impasse en-
tre segurança alimentar e energética, por não ser uma
forma convencional de alimentação como a soja e a
canola, por exemplo, e não competirem pelo solo de
agriculturas tradicionais (DEFANTI; SIQUEIRA; LI-
NHARES, 2010);
c) Devido a estes dois fatores anteriormente citados, há
-
-
rável entre a área agricultável e a composição lipídica
da biomassa (DEMIRBAS, 2010);
d) As microalgas apresentam-se enorme diversidade eco-
-
ca, o que permite a seleção de estirpes mais adequadas
a determinadas condições, locais de cultivo e sistemas
de se adaptar a diversos ambientes, podendo assumir

vários tipos de metabolismo em resposta às mudanças
das condições ambientais (MATA; MARTINS; CAETA-
em água marinha ou salobra e até em resíduos agroin-

dustriais e sanitários (DERNER et al., 2006; DEFANTI;
SIQUEIRA; LINHARES, 2010; ARCEO, 2012);
e) As microalgas têm crescimento contínuo e apesar das
restrições climáticas ou estacionais a que estão sub-
-
peratura e incidência luminosa podem ser controlados

(FERRERO, 2011; OSHE et al., 2007);

f) O cultivo de microalgas não exige aplicação de herbi-
cidas ou pesticidas (ARCEO, 2012);
superiores as das plantas terrestres (SCRAGG et al.,

2002; DEMIRBAS, 2010). Segundo Arceo (2012), as
mais CO2
h) Após a extração lipídica para produção de biodiesel,
para a produção de coprodutos, inclusive outras for-

mas de combustíveis, assunto a ser tratado posterior-
mente.
Mesmo com tantos pontos favoráveis ao aproveitamento

da biomassa microalgal para a produção de biodiesel, desa-
o processo mais competitivo economicamente. Operações de

colheita da microalga e de extração do óleo ainda não estão
totalmente elucidados e provocam um acréscimo considerável
potencialidades da microalga como matéria prima e as etapas

de obtenção dos lipídios oriundos das microalgas disponíveis
à produção de biodiesel, visto que após a obtenção do óleo, o
processo segue caminho semelhante ao processo produtivo de
outras matérias primas já estabelecidas, como a soja. Conjun-
tamente, uma visão macroscópica dos custos do processo será
apresentada, como ferramenta inicial decisória das operações

3.1 Processo de Produção de Biodiesel a partir

de Microalgas
O processo de produção de biodiesel a partir de microal-
gas pode ser seccionado em várias etapas. No modelo proposto
(Figura 3.2), inicia-se com a seleção das espécies de microal-
gas e a implementação do sistema de cultivo microalgal. Em
seguida, após o crescimento da cultura microalgal, a biomassa
é colhida e processada para a extração do óleo que, através de
Fonte: Adaptado de Mata, Martins e Caetano (2010).
Figura 3.2. Etapas do processo de produção de biodiesel a partir de

microalgas.

3.1.1 Seleção de local e da microalga
ela será cultivada.

Estas escolhas, quando o objetivo principal é a produção
de biodiesel, devem ser pautadas tanto sobre aspectos econô-
micos quanto sobre aspectos biológicos (ou metabólicos).
-
nômicos relevantes são: a disponibilidade da cepa da espécie
desejada (facilidade de obtenção), os custos de aquisição da
cepa e de manutenção do cultivo (meios de cultivo, condições
de cultivo, etc.).
Os aspectos biológicos (ou metabólicos) que devem ser
que interferem diretamente sobre os custos de produção, são:
crescer e se desenvolver em meios de cultivo de baixo

custo;
Resistência da espécie frente a fatores físicos e quími-
cos, como por exemplo, tensões de cisalhamento e
stress químico, além de fácil adaptabilidade ao meio;
Produtividade de biomassa, que indica a taxa de ganho
de massa total de microalgas em um determinado
volume sob certo período (massa/(volume*tempo));
Conteúdo lipídico (ou teor lipídico), que indica o
percentual de lipídios presentes na biomassa seca de
Produtividade lipídica, que indica a taxa de ganho de

massa lipídica em um determinado volume sob certo
período (massa/(volume*tempo));
Composição lipídica, que indica o percentual de cada
ácido graxo presente na biomassa microalgal em rela-
ção aos ácidos graxos totais desta mesma biomassa

Genética do material que deve se manter estável e

com características conservadas mesmo após sucessi-
As microalgas podem ser cultivadas a partir de uma grande

variedade de métodos, desde os mais estritamente controlados,
como os laboratoriais, até os menos previsíveis, como os tan-
ques ao ar livre. Portanto, o cultivo de microalgas pode ser
executado em diferentes sistemas, com volumes e característi-
-
ciente é o processo, no entanto, mais oneroso também, devendo
3.1.2 Técnicas de cultivo

Os sistemas abertos são mais simples e com menor custo
de instalação, podendo variar desde as lagoas sem nenhum
racewayponds (tan-
ques de recirculação a céu aberto) e o sistema turfscrubber1.
Estes sistemas podem ser construídos de materiais acessíveis
como PVC (cloreto de polivinila) e tem como restrição a pro-
todo seu volume. Este fato limita os cálculos de produtividade

por volume, sendo melhores expressos por área (BENEMANN;
OSWALD, 1996).
Dentre os sistemas fechados, os fotobiorreatores se sobres-
saem como principal sistema de cultivo microalgal em maio-
res escalas (BJERK, 2012). Chama-se fotobiorreator um reator
transparente (vidro ou plástico) que pode ter inúmeras geo-
metrias (BITOG et al., 2011; TAMBURIC et al., 2011), sendo
a tubular a mais convencional, com a disposição planejada de
1“Consiste na utilização de uma comunidade de espécies de algas filamentosas,
bactérias, fungos entre outras associadas, que se desenvolvem sobre uma tela por
onde flui uma solução com excesso de nutrientes”(BJERK, 2012).

bióticos e abióticos do cultivo de microalgas tais como pH,

temperatura, velocidade de agitação e aeração.
Do ponto de vista operacional, diversas literaturas apre-
sentam comparações entre sistemas abertos e fechados para
cultivo de microalgas. A Tabela 3.1 apresenta uma compilação
destas comparações:
Tabela 3.1. Comparativo entre sistemas fechados e abertos para o

cultivo de microalgas.
Sistemas fechados Sistemas abertos

(fotobiorreatores) (tanques)
Crescimento 2 a 4 semanas 6 a 8 semanas
Controle da
Fácil Difícil
contaminação
Risco de contaminação Alto
Esterilidade Possível Nenhuma
Ação de chuvas Afeta a produção
Controle do processo Fácil Difícil
Controle das espécies Fácil Difícil
Mistura Uniforme Muito baixa
Batelada ou Batelada ou
Regime operacional
semicontínuo semicontínuo
Depende da Depende da
Espaço requerido
produtividade produtividade
Alta (20-200 m-1) )

-1

Densidade
populacional (células Alta Baixa
microalgais)
Investimento Alto Baixo
Tanques <
Custo operacional
Fotobiorreatores
Reprodutividade Fácil Difícil
Alta Baixa
Controle da Temperatura mais

Difícil
temperatura uniforme
Produtividade Baixa
produtivo
Depende da
refrigeração- mas é
Depende da
Perda de água maior
refrigeração
Acentuada por
evaporação
Baixa a Alta Muito baixa

nas microalgas
Evaporação em
Baixo Alto
crescimento médio
Controle de
Alto Baixo
transferência gasosa
Depende do pH, (Maior) depender do

Perda de CO2
alcalinidade, etc. pH, alcalinidade, etc.
Tanques <
Inibição por O2 Possível
Fotobiorreatores
Concentração da Tanques <

biomassa Fotobiorreatores

Qualidade da biomassa Alta Baixa
Ampliação da escala Difícil Difícil

Fonte: (ARCEO, 2012; DEMIRBAS, 2010; MATA et al., 2010)
Um tóp
Figura 3.2, mas que vale a pena ser mencionado é a foto-con-
versão máxima da biomassa. Este fator promove a compreen-
são sobre o desenvolvimento da microalga e dos fatores termo-
fechado ao aberto.
A produção da biomassa microalgal é resultado direto da
foto-conversão, ou seja, respeitando a primeira lei da termodi-
que incide sobre o organismo em biomassa, fotossíntese. Neste

sentido, a produtividade de biomassa pode apresentar grande
variabilidade, principalmente em função das diferentes locali-
teórica da foto-conversão em qualquer organismo fotossinteti-

-
radiação solar que chega à superfície do planeta. No mesmo

-
tempo, considerando a disponibilidade plena de nutrientes:
d
);

microalgas ();
iii) Conteúdo energético das microalgas por unidade de
biomassa (Ee)
luminosa em biomassa (Ec);
A taxa de produção de microalgas pode ser descrita con-

forme indicado na Equação 1:
(Equação 1)
Onde:
Pa = taxa de produção de biomassa por área por tempo
(kg/m2.d);
d
=
(MJ/m2.d);
PAR = porcentagem de radiação absorvida pelos
-
c
=
e
= conteúdo energético por unidade de biomassa
(MJ/kg).
solar ( d) pode ser calculada com base na média de incidência

solar diária da região em estudo multiplicada pela quantidade
de horas correspondente a um dia (t), seguido de um fator de
conversão de unidades (fc) (Equação 2):

(Equação 2)
Onde:
Ps = média da potência incidida sobre a superfície da
região (MW/m2);
t = tempo de incidência (t = 1 dia = 24 h);
fc = fator de conversão de unidades (fc = 1Wh =
0,0036 MJ).
Essa densidade será dependente prioritariamente da locali-

-
cia solar diária na região, maior será a quantidade de energia
fornecida à microalga.
O conteúdo energético por unidade de biomassa (Ee) pode
ser calculado a partir da composição celular e de seus respecti-
O PCI, quantidade de energia liberada pela combustão

completa do material, quando os produtos estiverem na fase
vapor, pode ser calculado de inúmeras maneiras, dentre elas,
Dentre os constituintes da biomassa podem-se considerar ape-

nas os lipídios, as proteínas e os carboidratos, pois são os com-
ponentes mais abundantes, compondo quase a totalidade da
matéria microalgal. O cálculo do conteúdo energético de cada
ado de acordo com a Equação 3:
(Equação 3)
Onde:
L = porcentagem de lipídios presentes na biomassa
PCIL
P = porcentagem de proteínas presentes na biomassa

PCIP
C = porcentagem de carboidratos presentes na
PCIC
Segu
carboidratos são respectivamente: 37 MJ/kg, 23 MJ/kg e 16
MJ/kg. Baseado nestes valores é possível concluir que quanto
maior a produção lipídica ou menor produção de carboidratos,
menor será a taxa de produção de biomassa. Uma maneira sim-
ples de compreender esta relação é que o aumento de lipídios
ocorre quando o crescimento é suprimido, pois o carbono utili-
-
nosa em biomassa (Ec
fatores, destacam-se: as técnicas, as condições e os meios de

cultivo.
3.3 Cultivo de Microalgas

Segundo Derner et al. (2006), o crescimento de uma popu-
lação de microalgas é resultado de uma interação entre fatores
biológicos, físicos e químicos. Os fatores biológicos se relacio-
nam às taxas metabólicas da espécie cultivada, o tamanho das
cia de outros organismos sobre o
desenvolvimento microalgal (OSHE et al., 2007).
-
cionadas diretamente com o crescimento microalgal. A maioria
-
2
)

necessário para a construção de sua biomassa através da fotos-

síntese (DERNER et al., 2006; OSHE et al., 2007). As caracte-
rísticas das principais formas de metabolismo das microalgas
estão apresentadas na Tabela 3.2.
Tabela 3.2. Características das diferentes formas de metabolismo

das microalgas.
Metabolismo Fonte de energia Fonte de carbono
Fonte: Adaptado de Chen et al. (2011).
maioria das microalgas, sua manutenção deve ser efetivada

com cautela, de modo a encontrar um ponto ótimo de inten-
sidade luminosa que proporcione a maior taxa fotossintética.
A temperatura tem o seu principal efeito sobre os proces-
-
vive numa ampla faixa térmica, porém, só há incremento na
desenvolvimento das microalgas.

Do ponto de vista químico, a disponibilidade de nutrientes,
a salinidade e o pH interferem no crescimento das microalgas
(DERNER et al., 2006; OSHE et al., 2007). Para as microalgas
apresentarem ótimo crescimento são necessários macronu-
trientes (C, N, O, H, Ca, Mg, S e K) e micronutrientes (Mn,

Mo, Fe, Co, Cu, Zn, Se e B), além da adição ao meio de cultura
necessitam. Os nutrientes limitantes para as microalgas são:

nitrogênio e fósforo, embora o carbono seja considerado o
macronutriente mais importante (OSHE et al., 2007).
Por se tratar de um amplo espectro de espécies, as condi-
ções ótimas de desenvolvimento das microalgas variam muito.
microalgas (Tabela 3.3). Estes valores são válidos apenas como

estimativa inicial, visto que, trabalhos mais recentes apresen-
tam uma faixa mais ampla para temperatura, como Ras, Steyer,
Bernard (2013) que apresentaram a possibilidade de cultivo de
17 diferentes espécies de Chlorella em uma faixa de tempera-
tura de 26°C a 36°C.
Tabela 3.3.
de microalgas.
Faixa de alcance Faixa ótima
Temperatura (°C) 16-27 18-24
Salinidade (g L-1) 12-40 20-24
1.000-10.000
(lux)
16:8 (mínimo)
Fotoperíodo (claro: -
escuro, horas) -
24:0 (máximo)
pH 7-9 8,2-8,7
*depende do volume e da densidade Fonte: Cotteau (1996).
Ao analisar o conteúdo lipídico (ou teor lipídico) de muitas

espécies de microalgas, é possível comprovar sua verdadeira

aptidão como matéria par

-
rior a das culturas vegetais. Entretanto, Chen et al. (2011) des-
tacam que o teor de lipídios não é o único fator que determina
a capacidade de produção de óleo de microalgas. Segundo os
autores, o teor de lipídios e a produção de biomassa precisam
ser considerados simultaneamente. Assim, a produtividade
lipídica, que representa o efeito combinado destes dois fatores
mencionados é o índice de desempenho mais adequado para
indicar a capacidade produtiva de lipídios por uma microalga.
A alta produtividade lipídica das microalgas (Figura 3.3)
pode ser comprovada pelo tempo de duplicação, bem como pela
área necessária para a produção. O tempo médio de duplicação
inferior ao correspondente para os cultivos vegetais clássicos

(FERRERO, 2011), durante a fase exponencial de crescimento,
o tempo de duplicação da biomassa é de aproximadamente
colheita de microalga é de 9 a 18 dias (LEMOS, 2012) enquanto

que as culturas vegetais geralmente levam mais que 100 dias
para chegar ao ponto de colheita (FIOREZE, 2013).
rodut d de dc u tur s
70000
58700
no
60000
50000
0000
dc
0000
rodut d de
20000
10000 5 66
97 6 6 172
0
Fonte: Adaptado de Chisti (2007).
Figura 3.3. Produtividade lipídica de diferentes culturas vegetais.

A Tabela 3.4 apresenta a produtividade e teor lipídico de

diversas espécies de microalgas submetidas a diferentes condi-
ções de cultivo. Ao analisar a Tabela 3.4, pode-se constatar que
as espécies Chlorella sp., e
sp. são as que apresentam maiores produtividades lipídicas no
e 109,3 mg L-1 d-1, respectivamente. Contudo, a espécie que

mais se destaca é a Chlorella protothecoides, quando submetida
lipídica (entre 1840,0 e 1881,3 mg L-1 d-1).

Estes valores não são absolutos, sendo conhecido desde
1949 o fato de que a composição química de uma microalga
pode variar em virtude de alterações em suas condições de cul-
tivo, como a Chlorella que obteve a sua composição química
dióxido de carbono do meio, tipo de atmosfera presente (aeró-

bia e anaeróbia), concentrações dos nutrientes minerais, varia-
ção na temperatura e na iluminação (SPOEHR; MILNER, 1949).
Muitas microalgas aumentam sensivelmente sua produção
de lipídios quando submetidas às condições de stress (McGIN-
NIS, 1997; WHITE et al., 2011). Este estado de stress pode ser
-
-
mular a produção de lipídeos nas células (DENG et al., 2011).
Todavia, foi demonstrado que as mesmas condições de stress
-
ticamente o crescimento.
-
física dos lipídios e sua consequente nomenclatura são coman-

dadas pelo comprimento da cadeia, pelo grau de insaturação e
pela distribuição dos radicais (ARCEO, 2012).
Estudos também mostraram que o acúmulo de lipídios
acontece principalmente sob a forma de lipídios neutros, sendo
estes mais adequados para a produção de biodiesel.

108
Tabela 3.4. Produtividade e teor lipídico de diferentes espécies de microalgas sob diferentes condições de
5 Livro Microalgas V2.indb 108

cultivo.
Produtividade de Produtividade
Espécies de Condições de Conteúdo lipídico
biomassa (g L-1 lipídica (mg L-1 Referência
microalgas cultivo
d-1) d-1)
Chaetoceros
0,07 33,6 21,8
muelleri (2009)
Chlorella Illman, Scragg e

29,0-63,0 8,1-49,9
emersonii Shales (2000)
Microalgas de Águas Continentais | Volume 2
Chlorella Cheng et al.

4,0-4,4 43,0-46,0 1840,0-1881,3
protothecoides (2009)
Chlorella
0,23 19,3 44,7
sorokiniana (2009)
Chlorella sp. 32,0-34,0 121,3-178,8 Chiu et al. (2008)
Illman, Scragg e
Chlorella vulgaris 0,03-0,04 18,0-40,0
Shales (2000)
Liang, Sarkany e
Chlorella vulgaris 23,0-36,0
Cui (2009)
30/07/2014 09:47:04
Liang, Sarkany e
Chlorella vulgaris 21,0-34,0
Cui (2009)
Chlorococcum sp. 0,28 19,03

(2009)
Dunaliella Takagi, Karseno e

0,10 60,6-67,8 60,6-69,8
tetriolecta Yoshida (2006)
Elipsoidion sp. 0,17 27,4 47,3

(2009)
Isochrysis sp. 0,14 27,4 37,8

(2009)
Monodus
0,19 16,1 30,4
subterraneus (2009)
Takagi, Karseno e
Nannochloris sp. 29,9-40,3
Yoshida (2006)
Nannochloropsis
0,17 60,9
sp. (2009)
Neochloris
0,31-0,63 7,0-40,3 38,0-133,0 Li et al. (2008)
oleoabundans
109
30/07/2014 09:47:04
110
Pavlova lutheri 0,14

(2009)
Pavlova salina 0,16 30,9 49,4

(2009)
Phaedactylum
0,24 18,7 44,8
tricornutum (2009)
Porphyridium
0,37 34,8
cruentum (2009)
Scenedesmus Gouveia e
0,09 17,7
obliquus Oliveira (2009)
Scenedesmus Mandal e Mallick

6,6-11,8
obliquus (2009)
Scenedesmus
0,19 18,4
quadriculata (2009)
Scenedesmus sp. 0,26 21,1

(2009)
Skeletonema
0,08 21,1 17,4
costatum (2009)
30/07/2014 09:47:04
Skeletonema sp. 0,09 31,8 27,3
(2009)
Tetraselmis sp. 0,30 14,7 43,4

(2009)
Tetraselmis
0,28 12,9 36,4
suecica (2009)
Fonte: Adaptado de Chen et al. (2011).
111
30/07/2014 09:47:04
O óleo das microalgas é composto principalmente pela

mistura de ácidos graxos instaurados, embora também estejam
presentes os ácidos graxos saturados, porém em menor pro-
porção (BJERK, 2012), óleos estes com características físico-
-químicas similares aos de óleos vegetais (MIYAMOTO, 1997).
Segundo Arceo (2012), em algumas espécies, os ácidos
-
-
posição de ácidos graxos de algumas espécies de microalgas.
Esta considerável quantidade de ácidos graxos poli-insatura-
dos presente nas microalgas, facilita a oxidação do biodiesel
(BRENNAN; OWENDE, 2010). Desta forma, torna-se preferível

a escolha de uma espécie de microalga com uma proporção
produto de melhor qualidade (KNOTHE et al., 2006).
as espécies mais promissoras para a produção de biodiesel são:

Trichodesmium erythraeum,
totais presentes em cadeia saturada de 10 carbonos; Chlorella
de 16 carbonos
presentes em cadeia de 14 carbonos.
É importante ressaltar que são necessários mais estudos
sobre a composição lipídica das espécies de microalgas. A
composição de muitas espécies ainda não é conhecida, sendo
importantes, pesquisas em trabalhos de prospecção e caracte-

Tabela 3.5.
Ácidos graxos
B.a
Haptophyceae
Cyanophyceae
Cryptophyceae
Chlorophyceae
Pinguiophyceae
Bacillariophyceae
C.sp N.sp M.s C.s C.v P.i E.h I.g P.p G.c A.sp T.e H.b R.l
C10:0
C11:0
C14:0 32,0 23,6 6,9 2,3 23,1 18,7 22,0 29-34 7,21 2,0 18,0
C14:2 9-13
Saturados
2,2 1,1 1,2
C16:0 9,2 19,9 20,2 40,0 18,0 9,1 14,0 3,7 4,4 11-17 13,3 13,1
C17:0 2,0
C18:0 0,6 2,1 1,0 1,1 1-2 2-6 2,2

113
30/07/2014 09:47:04
114
C16:1

C16:1
27,0 27,4 26,9 4,0 0,7 2,0 4,0 4,7 13,0
C16:1
3,6 1,0 36-39
1,0 1,0
Monoinsaturados
3,0 1,7 9,2 9,2 14,3 13,0 1,3 6,6 1-2 3-7 2,0 10,1
C18:1
1-4
C20:1 18,0
30/07/2014 09:47:04
C16:2
6,0 0,6 3,0 6,1
C16:2
2,0 0,9 11,0 12,0 1,0
C16:3 8,0 2,6 17,0 2,1
C18:2
2,0 36,0 43,0 9,3 2,1 1,8 3,9 1-2 2,2
C18:3
0,7 23,0 10,0 1,0 7,0 6-19 11,0 16,0
C18:3
0,9 1,0 0,6 7,0 1,1
C18:4
0,6 4,2 1,2 8,0 10,0 30,0 23,0
Poli-insaturados
10,0
C20:4
4,1 2,9
26,0 8,0 34,9 37,1 39,2 11,0 13,0
1,0 13,3 1,0

C22:6
1,0 11,0 14,0
Fonte: Adaptado de Hu et al. (2008). Abreviação das espécies de microalgas: B.a., Biddulphia áurica (ORCUTT; PATTERSON, 1974); C.sp.
Chaetoceros sp. (RENAULD et al., 2002); N.sp., Nannochloropsis sp. (SUKENIK, 1999); M.s., Monodus subterraneus (COHEN, 1999); C.s.,
Chlorella sorokiniana (PATTERSON, 1970); C.v., Chlorella vulgaris (HARRIS et al., 1965); P.i., Parietochloris incise (KHOZIN-GOLDBERG;
COHEN, 2006); E.h., Emiliania huxleyi (VOLKMAN et al., 1981); I.g., Isochrysis galbana (VOLKMAN et al., 1981); P.p., Phaeonomonas parva
(KAWACHI et al., 2002); G.c., Glossomastrix chrysoplasta (KAWACHI et al., 2002); A.sp., Aphanocapsa sp. (KENYON, 1972); S.p., Spirulina
platensis (MUHLING et al., 2005); T.e., Trichodesmium erythraeum (PARKER et al., 1967); H.b., Hemiselmis brunescens (CHUECAS; RILEY,
1969); R. l., Rhodomonas lens (BEACH et al., 1970).
115
30/07/2014 09:47:04
3.3.1 Meios de cultivo

Segundo Oliveira (2009), há diversos meios de cultura que
fornecem quantidades apropriadas de nutrientes às microal-
al., 2011), enquanto que em cultivos de grande escala os meios

podem ser preparados de fontes residuais e/ou comerciais de
composição nutricional conhecida.
De modo geral, tem sido constatado por diversos auto-
res que a limitação de nitrogênio e enxofre, em determina-
lipídica em diversas espécies de microalgas, proporcionando

-
ciência de fósforo gera resultados controversos: aumento do
teor lipídico em algumas espécies e redução em outras (KHO-
ZIN-GOLDBERG et al., 2003; VERMA et al., 2010).
Lemos (2012) aponta que a proporção de nitrogênio:fósforo
ideal para Scenedesmus sp. é 16:1, o que permite que esta cul-
-
-
xos poli-insaturados. Outro fator relevante narrado por Lemos
(2012) é que o aumento na porcentagem de lipídios totais nas
células de Scenedesmus sp ocorre na fase estacionária de cres-
cimento. Para diferentes gêneros de microalgas os teores lipí-
dicos são menores na fase exponencial de crescimento, devido
à alta demanda de energia, mas tendem a aumentar na fase
estacionária, quando as células passam a acumular reservas
energéticas devido à limitação de nutrientes no meio.
Os dados presentes na Tabela 3.6 mostram a quantidade
e o volume de biomassa necessários para a obtenção de um
quilograma de óleo extraído. A biomassa requerida para obten-
ção de uma dada quantidade de lipídios é função do teor lipí-
dico presente na biomassa, ao passo que o volume requerido
de cultivo para obtenção desta mesma quantidade de lipídios

depende da produtividade da biomassa. Assim, para efeito de
quantidade de biomassa e o volume de cultivo requeridos para

a obtenção de um quilograma de lipídio por dia, considerando
-
gal:
Para tanto, foram levados em consideração os dados apre-

sentados na Tabela 3.4, sendo que, para os dados apresentados

118
Tabela 3.6. Biomassa e volume de cultivo requeridos para a produção diária de 1 quilograma de lipídios

Biomassa requerida (kg/d) Volume requerido de cultivo (m³)
Espécies de Condições de
microalgas cultivo máxima de de máxima de de
Centrifugação Centrifugação
recuperação Floculação recuperação Floculação
Botryococus
4,81 4,97 160,26 174,76
braunii
Chaetoceros
2,98 3,07 43,92 46,37
muelleri
Chlorella
2,17 2,37
emersonii
Chlorella
2,32
protothecoides
Chlorella
23,27
sorokiniana
Chlorella sp. 3,03 3,13 3,3 6,73 6,96 7,34
30/07/2014 09:47:04
Chlorella
3,76 101,78 107,44
vulgaris
Chlorella
3,39 3,7 29,48 32,14
vulgaris
Chlorella
3,64 3,76 3,97 21,39 22,1 23,33
vulgaris
Chlorococcum
18,77 19,39 20,47
sp.
Dunaliella
1,61 1,7 16,09 16,99
tetriolecta
Elipsoidion sp. 3,77 3,98 21,47 22,18 23,41
Isochrysis sp. 3,77 3,98 26,07 26,93 28,43
Monodus
6,21 6,42 6,77 32,69 33,77
subterraneus
Nannochloris sp. 2,94 3,11 8,63 8,92 9,41
Nannochloropsis
2,8 2,89 16,48 17,02 17,97
sp.
119
30/07/2014 09:47:04
120
Neochloris

4,23 4,37 4,61 4,91
oleoabundans
Pavlova lutheri 2,82 2,91 3,07 20,12 20,79 21,94
Pavlova salina 3,24 3,34 20,23 20,9 22,06
Phaedactylum
22,28 23,02 24,3
tricornutum
Porphyridium
10,87 11,48 29,39 31,02
cruentum
Scenedesmus
6,16 62,77 68,46
obliquus
Scenedesmus
11,24 11,61 36,84 38,06 40,17
obliquus
Scenedesmus
28,6 31,19
quadriculata
Scenedesmus sp. 4,74 4,9 18,23 18,83 19,88
Skeletonema
4,74 4,9 61,2 64,6
costatum
30/07/2014 09:47:04
Skeletonema sp. 3,14 3,43 34,94 36,1 38,1
Spirulina
24,39 26,6 116,14 119,98 126,66
maxima
Tetraselmis sp. 6,8 7,03 7,42 22,68 23,43 24,73
Tetraselmis
8,01 27,69 28,6 30,19
suecica
Thalassiosira
60,68 62,69 66,17
psedonana
121
30/07/2014 09:47:04
3.3.2 Colheita da biomassa microalgal

A colheita (Recuperação da Biomassa Microalgal) é a etapa
-
ção de biodiesel de microalgas. Pelo tamanho das células a
serem separadas e sua diluição, esta etapa pode corresponder
MARTINS; CAETANO, 2010).

A recuperação da biomassa, ou comumente conhecida
como colheita, consiste na remoção da biomassa microalgal
do meio de cultivo. De forma mais genérica consiste de opera-
ções de separação sólido-líquido, através de processos físicos,
químicos ou biológicos. Os métodos mais habituais de recu-
peração incluem os processos físicos, nos quais se destacam
Brennan e Owende (2010) dividem a colheita das microal-

gas em um processo de duas etapas:
1. colheita de grandes quantidades destinada à separa-

ção da biomassa a partir da suspensão, empregando
gravidade;
2. espessamento, cujo objetivo é concentrar a pasta de
agregação ultrassônica.
A escolha da técnica de colheita é dependente dos recur-

-
priedades das microalgas e do sistema de cultivo (densidade
celular, tamanho das partículas e qualidade dos produtos dese-
jados) (BRENNAN; OWENDE, 2010). Por exemplo, do ponto de
vista operacional, tanques ou lagoas de sedimentação são reco-

mendados em casos de recuperação da biomassa proveniente

de estações de tratamento de esgoto, ou seja, em larga escala,
quando o aproveitamento total da biomassa não se constitui
um dos principais objetivos do processo. Por outro lado, o uso
de centrífugas também pode recuperar grandes volumes de
biomassa se operado continuamente, apesar de seu custo mais
elevado (MATA; MARTINS; CAETANO, 2010).
Para Bjerk (2012), devido à variabilidade das caracterís-
ticas da biomassa microalgal, como tamanho, forma e mobili-
dade, é difícil selecionar uma única técnica de recuperação de
biomassa que possa vir a se tornar um método padrão para ser
(2012) e Schenk et al. (2008) apontam que não há um método

de recuperação de biomassa adequado a todos os sistemas
de produção e, portanto, são necessárias avaliações tanto do
ponto de vista econômico quanto do técnico-operacional para
a seleção da tecnologia mais apropriada a cada caso. Contudo,
Chen et al. (2011) salientam que um método de colheita ideal
deve requerer o mínimo de produtos químicos e de energia,
e, se possível, facilitar a liberação de materiais intracelulares
para a coleta.
Pela impossibilidade de uma análise única de etapa de
algumas das operações unitárias possíveis ao processo, como

um meio facilitador na escolha do método a ser empregado.
3.3.3 Sedimentação por gravidade

A sedimentação é um processo de separação física, na
qual as fases são separadas pela atuação da força gravitacional
ao meio. Assim sendo, praticamente não apresenta dispêndio
energético nem requer grande investimento operacional.
Equipamentos onde a sedimentação ocorre são conhecidos
como sedimentadores e consistem em tanques, normalmente

-
-
e espessadores, quando o interesse está na fase mais concen-

trada (MCCABE et al., 1998).
A sedimentação para processos diluídos pode ser descrita
-
ção é proporcional à diferença de densidade entre os objetos
do meio líquido (GEANKOPLIS, 1998) (Equação 4):
(Equação 4)
Onde:
= velocidade de sedimentação das partículas (m s-2);
-3
);
-3
);
= aceleração da gravidade (m s-2);

= viscosidade do líquido (Pa.s = 3 kg m-1s-1).
Diversos autores salientam que a sedimentação por si só

não é viável quando se visa à produção de biodiesel, conside-
rando a relação do tempo necessário de processamento versus
Chlorella
vulgaris em condições normais de cultura é de aproximada-
-
tiva, esta microalga pode formar pequenas colônias estáveis
a partir da agregação com mais sete células, adquirindo cerca
de sedimentação das partículas na forma unicelular ( u) e na

forma multicelular ( m
e a água em condições ambiente como meio líquido, sendo os
valores das variáveis descritos como:
°C (998 kg m-3);
= aceleração da gravidade (9,81 m s-2);
= viscosidade da água a 20°C (1,003.10-3Pa.s =
1,003.10-3 kg m-1s-1).
Chlorella vulgaris
(1070 kg m-3
(2013).
-6
m);
-
6
m).
As velocidades de sedimentação obtidas para os dois esta-

dos comportamentais das microalgas foram respectivamente:
O tempo de sedimentação para cada caso pode ser calcu-

-
e que estas sejam pouco profundas em virtude da incidência de

-
Onde:
= tempo de sedimentação das partículas (s);
= velocidade de sedimentação das partículas (m s-1).

-
tação quando as microalgas encontram-se na forma unicelular
(tu) e na forma multicelular (tm), obtiveram-se:
A partir dos resultados pode-se concluir que o comporta-

mento físico da matéria interfere substancialmente no processo
de sedimentação, de forma que, quando as microalgas se agru-
-
fatores importantes quando esta aglomeração celular ocorre

não foram levados em conta neste cálculo, como por exem-
plo, a perda de produtividade lipídica. São cálculos apenas de
do método de sedimentação por gravidade não é um processo
demanda muito tempo e espaço, além do risco de degradação

microalgal em virtude do tempo gasto.
previamente a agregação das partículas por outros mecanismos,

tornando a sedimentação uma operação secundária deste
processo de colheita, a fim de aumentar a eficiência global
do processo de recuperação de biomassa microalgal. Tais
exemplo, a floculação como etapa prévia à sedimentação.

Desta maneira, a adição de floculantes contribuirá ao aumento
o tempo necessário para o posterior processo de sedimentação.
-
pendente da espécie de microalga testada, a recuperação de
s).

Desta maneira, quando se visa à produção de biodiesel a

-
ção procedida de sedimentação) é recomendada. Ressalta-se
que, durante o cultivo é interessante que o meio esteja subme-
que proporciona um melhor desenvolvimento microalgal. Por-

tanto, somente quando a cultura tiver alcançada a fase estável
de crescimento ou os limites máximos de produtividade de bio-
-
cialmente da maneira mais rápida possível.
3.3.4 Floculação e coagulação
a equação 4) é possível observar que o processo de sedimenta-
das partículas e pela aglomeração das mesmas. A coagulação/
processo. As duas operações serão tratadas no mesmo item por

-
lhanças e por poderem ser provocadas pelos mesmos reagentes
(RUSHTON et al., 1996).
Em termos de tratamento de água, a coagulação descreve
De forma mais ampla, o termo coagulação é reservado
(dupla camada elétrica) de uma partícula suspensa num eletró-

-
tes. A existência da coagulação no meio depende do balanço
entre as forças atrativas de van der Waals e as forças repulsivas
da dupla camada. Pequenas partículas são submetidas cons-
tantemente a um bombardeamento aleatório pelas moléculas

do líquido, dando origem ao movimento irregular conhecido

como movimento Browniano. Tal comportamento pode pro-
propiciando a formação de pequenos aglomerados. Chama-se
(RUSHTON et al., 1996).

Algumas espécies de microalgas, segundo Benemann e
-
teúdo lipídico e, outras, em resposta a estímulos ambientais
como alterações no pH do meio de cultura e das concentra-
ao aumento do pH ocasionado pelo consumo de CO2 durante

-
-
ocorra é maior. É importante frisar que não é um processo

comum a todas as microalgas, para algumas espécies a coagu-
Se a coagulação não ocorrer espontaneamente, produtos

químicos são adicionados com a missão de alterar a carga da
superfície para permitir a aglomeração local. Segundo Boo-
naert et al. (2003), a coagulação pode ocorrer por ajustes de
pH ou pela adição de eletrólitos. São exemplos de coagulantes:
alguns polímeros catiônicos e ácidos, hidróxido de cálcio e sul-
fatos férricos, que coagulam e precipitam em pH neutro.
-
suas células possuem carga negativa e, portanto, a agregação é

inibida pelas forças repulsivas, havendo necessidade da adição

das células microalgais (CHEN et al., 2011)
como, por exemplo, o policloreto de alumínio, o sulfato de

alumínio, o sulfato férrico ou o cloreto férrico (GRIMA et al.,
quitosana e sementes de moringa, dentre outros. Silva (2013)

-
-
gradabilidade, baixa toxicidade e baixa produtividade de lodos
residuais.
-
-
culantes (GODOS et al., 2011).
-
a) -
-
-
d) Concentração da biomassa: quanto maior a concentra-

ção da biomassa, maior a frequência de colisão e, con-

forças excessivas de cisalhamento podem romper os
a conformação dos agregados e, portanto, o processo
-
missor para a colheita em grande escala, mas a sua aplicação
parece ser atualmente limitada a microalgas de água doce, pois
qual a biomassa será submetida. Por exemplo, para extração
-
REDO, 2012; CHEN et al., 2011; GRIMA et al., 2003).
-
ciência na recuperação da biomassa microalgal sem agredir as
células, dispensando o ajuste de pH do meio, isso porque este
Adicionalmente, o cloreto férrico também é um dos componen-

tes de alguns meios de cultivo, demandando menores adições
-
dante.
-
tado (FeCl3.6H2
nutos e sedimentação de 10 minutos.

Tabela 3.7.
-
Fonte
Cultivo:
Microalga selecionada: Scenedesmus sp. Lemos (2012)
Produtividade de
34,7 mg L-1 d-1 Lemos (2012)
biomassa1 (PB):
Tempo de cultivo até a

18 dias Lemos (2012)
colheita (t):
Teor lipídico em
relação à biomassa Lemos (2012)
seca2
Floculação:
Cloreto férrico
hexahidratado Lemos (2012)
(FeCl3.6H2O)
Concentração ideal do -1
Lemos (2012)
F
):
Lemos (2012)
de biomassa (ER):
Splabor (2013)
(CF):
Volume (V)*: 1000 L = 1 m3

1
Valor médio.
2Determinado após a floculação da biomassa. Volume de 1.000 L foi a base de cálculo para os parâmetros
descrito em Lemos (2012).

Para determinação da quantidade de biomassa removível

(BR), multiplicou-se a produtividade de biomassa da microalga
Scenedesmus sp. (PB) pelo volume de cultivo (V) e o tempo de
cultivo até a colheita (t) (Equação 6):
(Equação 6)
Onde:
= massa removível de biomassa (g);
= produtividade de biomassa (mg L-1 d-1);
= volume do meio de cultivo (L);
= tempo de cultivo até a colheita (d).
A massa removível de lipídios (LR) pode ser determinada

pelo produto da massa removível de biomassa (BR) pelo teor
lipídico (TL R
) obtida
-
tado (melhor resultado encontrado em literatura), determinado
(Equação 7)
Onde:
= massa removível de lipídios (g);
massa removível de lipídios (C) é determinado considerando o

F F
)
-
tivo (V) e a quantidade removível de lipídios (LR) para esse
processo (Equação 8):

(Equação 8)
Onde:
= custo total por unidade de massa removível de lipí-
dios (R$ por kg de lipídios removíveis);
);
-1
obtidos foram:
Vale ressaltar que não estão considerados valores adicio-
simplicidade operacional e ao mínimo gasto energético reque-
Esses resultados podem sofrer variação, provocadas pela
de microalga, da composição do meio de cultivo, do pH do

-
Silva (2013) salienta que, apesar de apresentar elevada
-
gens:
a) -
cessárias para promover a separação, o que acarreta
alta produção de lodo;
b) O processo é altamente sensível às variações de pH;
-
cia para todos os grupos de microalgas;
d) A biomassa microalgal pode ser contaminada pela pre-

alumínio e ferro, comprometendo, desta forma a sua
3.3.5 Centrifugação
A centrifugação é uma extensão da sedimentação por gra-
vidade na medida em que a aceleração gravitacional (g) é subs-
2
) (GEANKOPLIS, 1998).
sólido-líquido (PERRY; CHILTON, 1973). A equação da velo-
pela Equação 9:
(Equação 9)
Onde:
= velocidade de centrifugação das partículas (m s-1);
s-1);
r=
(m);
-3
);
-3
);
-1
s-1).
A centrifugação é um dos métodos mais rápidos (SILVA,

-
-
sentando características ideais de aplicação em larga escala.
-
massa presente no meio, resultando em um produto com baixo
grau de umidade. Nessa técnica, forças centrífugas promovem

a separação sólido-líquido com base na diferença entre as den-
características das células microalgais, do tempo de aplicação

da força e da profundidade do tubo da centrífuga.
São ideais para separação de partículas com tamanhos
consideração a aquisição e a operação do equipamento, este

método somente é recomendado como uma etapa secundária
para aumentar a concentração de uma biomassa já recuperada
-
tendo baixas concentrações de biomassa torna a recuperação
por centrifugação um método inviável para aplicação em larga
escala (AZEREDO, 2012), além do alto consumo energético
(UDUMAN et al., 2010).
Segundo Zardo (2011), apesar de alguns tipos de centrí-
-
tes, este método requer elevados custos (de aquisição e opera-
cionais), principalmente quando se deseja trabalhar em larga
escala.
De acordo com Grima et al. (2003), a recuperação da
biomassa em centrífugas depende de três fatores: da taxa de
deposição da biomassa, do tempo de residência da biomassa no
design do equipamento,
Shelef, Sukenink e Green (1984) dividiram os principais

equipamentos de centrifugação em: dispositivos com parede
-
fugas de sedimentação). Os principais tipos de centrífugas de
sedimentação são: centrífugas de discos ou pratos (com des-
carregamento de sólidos manual ou automático), centrífuga

tubulares e centrífugas com tela perfurada (AZEREDO, 2012).
piloto de produção de biocombustível via microalgas (GRIMA

et al., 2003). Uma centrífuga de discos consiste em uma super-
fície externa cilíndrica contendo cones de metal espaçados
-
ção alimentada ao centro, force a fase mais densa a viajar para
discos mais distantes, separando em camadas os materiais de
diferentes densidades.
o cálculo da massa removível de biomassa e da massa remo-
do custo total da operação de centrifugação por unidade de

massa removível de lipídios, foram considerados o custo com
energia elétrica, a energia requerida e a quantidade removível
de lipídios por esse processo (Equação 10):
(Equação 10)
Onde:
= custo total por unidade de massa removível de lipí-
dios (R$/kg de lipídios removíveis);
= custo de 1 KWh;
= energia requerida (KWh m-3);
= volume do meio de cultivo (m3);
= massa removível de lipídios (kg).

Tabela 3.8.
etapa de centrifugação.
Fonte
Cultivo:
Microalga selecionada: Scenedesmus sp. Lemos (2012)
Produtividade média
34,7 mg L-1 d-1 Lemos (2012)
de biomassa1 (PB):
Tempo de cultivo até a

18 dias Lemos (2012)
colheita (t):
Teor lipídico em
relação à biomassa Lemos (2012)
seca2
Centrifugação:
Centrífuga discos Milledge e Heaven

Tipo de equipamento:
Westfalia (2013)
Potencia da centrífuga Gea (2009)
Capacidade da 3
/h Gea (2009)
centrífuga
Energia consumida
1,4 KWh m-3
(E)1:
Lemos (2012)
de biomassa (ER):
Custo de 1 KWh (CE): R$ 0,39631 COPEL (2013)
Volume (V): 1 m3
1
Valor se todo for utilizado em sua totalidade.
2 (TAMBURIC et al., 2011).
*Volume em estudo foi de uma base de cálculo de 1000 L.

As condições de operação da centrífuga descritas foram
Scenedesmus sp.,
3
/h
3
para a colheita de algas (GEA, 2009) com o máximo de potên-
Quanto aos custos com energia elétrica, aplicou-se o valor

cobrado pela Companhia Paranaense de Energia (COPEL,
2013) entre junho de 2013 a junho de 2014. A tarifa aplicada
refere-se ao uso convencional, ou seja, sem diferenciação de
preço em função da hora e para consumidores de classe B1
(industrial com tensão inferior a 2 kV).
Os valores encontrados são:
O custo para um m3 é de:
É importante observar que a centrífuga, como qualquer

equipamento elétrico, mostra-se muito mais econômica se
-
-
ção e centrifugação encontrados no trabalho de Lemos (2012),
a produtividade de biomassa atingida neste trabalho é inferior
produtividade de 260 mg L-1 d-1 para este mesmo gênero de
Lemos (2012).

Nesse sentido, caso fosse considerada a produtividade rela-

-
Também foram desconsiderados os custos de manuten-

ção do equipamento. Sendo assim, os resultados encontrados
de massa de lipídios removíveis será ainda maior do que os

demonstrados.
Em uma análise restrita à centrifugação, levando em conta
que o tempo ideal para crescimento desta espécie de microalga
(Scenedesmus sp.) de 18 dias, é possível obter 20 ciclos por ano
de cada tanque de cultivo. Ao se considerar 18 tanques de 280
m3 cada, será possível centrifugar 1 tanque por dia (supondo 8
m3 ou 19.000 kg de óleo ao ano. Supondo o valor aproximado
biomassa, ter-se-á um valor adicional de R$ 13,00 por kg de
(tempo de vida útil do equipamento) resultando valor aproxi-

mado de R$ 0,13/kg de lipídios para pagamento do bem durá-
vel, que é o equipamento.
Entretanto, nestes cálculos não foram considerados os
gastos com a instalação do equipamento e com a execução de
obras (escavação dos tanques). Portanto, para uma tomada de
melhor nível de precisão a relação custo-benefício.

3.3.6 Flotação
qual o ar ou as bolhas de gás agem sobre as partículas sólidas e,

em seguida, carregam-nas para a superfície do líquido (CHEN
para a remoção de microalgas, visto ser uma tecnologia efetiva

-
uma operação relativamente rápida e de custos operacionais
tem o potencial para superar o gargalo da produção viável de

biocombustível de microalgas.
De acordo com o tamanho das bolhas de gás, as aplicações
mas com maior intensidade de agitação (CHISTI, 2007;

POONCHINDA et al., 2004; UDUMAN et al., 2010).
formação de bolhas de ar
mistura completamente com o líquido e, após passar por um

dispersor, forma múltiplas bolhas cujos tamanhos variam de
-
rença de potencial aplicada entre os eletrodos permite que
sejam geradas microbolhas de oxigênio e hidrogênio de dimen-
-

subir em direção à superfície arrastando os coloides formados

(SILVA, 2013).
-
corrente elétrica gerada pelos eletrodos de alumínio, se com-

parada com a originada pelos eletrodos de ferro.
-
rente e aumento da área de contato (BJERK, 2012). Sendo
energia e de custos com eletrólitos, além de proporcionar

ganho de tempo no processo.
-
-
centração de óleo extraído. Este procedimento deve ser utili-
-
nação.
-3
-
(COWARD et al., 2013).
3.3.7 Filtração
líquido-sólido, envolvendo a passagem da solução através de

uma barreira porosa que retém a maior parte das partículas
sólidas contidas na mistura.

Serve de barreira que permite a passagem do líquido, enquanto

retém a maior parte dos sólidos, podendo ser constituída por
uma tela, tecido, papel, ou a camada de sólidos. O líquido que
CHILTON, 1973).
-
litada pela ação da gravidade ou pela aplicação de pressão,
vácuo ou força centrífuga (AZEREDO, 2012; SHELEF et al.,
1984).
consideradas as mais adequadas à recuperação de biomassa
biomassa, mas para algumas aplicações a operação pode ser

-
voca queda de pressão do meio.
em processos de colheita de microalga para produção de bio-
Coelastrum proboscideum
e Spirulina platensis, mas não pode recuperar organismos de
Scenedesmus, Dunaliella, ou
Chlorella (GRIMA et al., 2003; BRENNAN; OWENDE, 2010).
a recuperação da biomassa microalgal, sendo mais adequadas
processos de produção em pequena escala, mas pelo baixo
biodiesel.
Grima et al. (2003) apresentaram uma análise compara-
C. probos-
cideum à pressão, tendo observado um
gasto energético de 0,1 e 0,88 kWh m-3

comparada aos dados da centrifugação (1,4 kW/m3) mostram

-
ência de processo.
3.4 Processamento da Biomassa

Após a separação sólido-líquido, a biomassa recuperada
ainda possui alta umidade e deve ser rapidamente processada
para que não perca sua qualidade. Para aumentar o tempo
de conservação do material coletado, bem como facilitar as
operações posteriores, a desidratação é comumente aplicada
(ARCEO, 2012), podendo constituir-se pelos seguintes méto-
-
A secagem ao sol é o método de desidratação de menor

custo, mas possui como principais desvantagens a necessidade
a falta de controle operacional (BRENNAN; OWENDE, 2010).
como a obtenção de partículas esféricas e de escoamento livre
formação de gotículas em uma corrente de ar quente, ou seja, é

-
gido em forma de spray
ar quente, transformando, desta forma, gotas líquidas em par-
tículas sólidas, que são recolhidas em um sistema de coleta de
-
nomicamente viável para produtos de baixo valor de mercado,

como o caso de biocombustíveis (MATA et al., 2010).
O método é baseado no ponto triplo da água, necessitando de

baixa temperatura e pressão. A Figura 3.4 apresenta o diagrama
de fases da água que auxilia na compreensão do processo. O
ponto 1 corresponde às condições normais de congelamento da
biomassa submetida à pressão ambiente (760 mm Hg) e tempe-
ratura inferior a 0,01°C. O ponto 2 corresponde à mesma con-
dição de temperatura e redução da pressão a valores inferiores
a 4,0 mm Hg, onde os cristais de gelo sublimam diretamente
pela exposição a condições inferiores a do ponto triplo da água
sendo necessários aproximadamente 2.800 KJ para cada quilo-

grama de gelo sublimado (CHISTI, 2007).
é um método
matéria-prima. Brennan e Owende (2009) afirmam que óleos

de difícil extração a partir da biomassa úmida por solventes sem
prévia ruptura celular, podem ser mais facilmente extraíveis se
microalgas de baixo valor agregado, como o biodiesel (GRIMA

et al., 2003).
O método de secagem a tambor consiste no aquecimento
a vapor de maneira uniforme sobre o interior um tambor cilín-
drico que gira continuamente. O produto a ser seco é aplicado
a secagem se inicia imediatamente. Após cada rotação, uma
no interior do cilindro.

Figura 3.4. Diagrama de fases da água.
drum-
-drying em microalgas da espécie Scenedesmus sp. e obtiveram
ótimos resultados do ponto de vista da qualidade de extração
-
, 2
com capacidade evaporativa de 20 L h m de biomassa com

-1 -2
KWh.
Tendo em vista os altos custos com energia, processos com
-
rem a fonte energética do processo.
3.5 Extração de Óleo (Ruptura Celular e

Extração dos Lipídios)
A ruptura das células das microalgas é um pré-tratamento
para a extração, tendo como objetivo a facilitação da extração
dos metabólitos de interesse (no caso da produção de biodiesel,

os lipídios). Não é uma etapa obrigatória e a decisão por sua
Vários métodos podem ser aplicados para a ruptura celular,

dependendo da característica da parede celular das microalgas
e Caetano (2010), a ruptura e a extração podem ocorrer de

duas maneiras:
a) Pela a
alta pressão, moinho de bolas, ultrassom, autoclaves
esta não é uma área que tem sido amplamente avaliada. Outro
fator relevante é que quando ocorre o rompimento celular, os
lipídios são liberados para o meio circundante, o que facilita a
sua separação (CHISTI; MOO-YOUNG, 1986; LEE et al., 2010).
A maioria dos pré-tratamentos de rompimento celular exi-
de secagem.
-
torial (CHISTI; MOO-YOUNG, 1986; HARRISON et al., 2003).

fechada na presença de esferas de vidro ou aço (geralmente
deste processo depende do tamanho das partículas, da agita-

ção aplicada, do tempo de residência do material no sistema,
bem como das dimensões do equipamento (GREENWELL et
al., 2010). Este método parece ser o mais indicado para escala
industrial devido ao seu baixo custo operacional (CHISTI;
MOO-YOUNG, 1986).
-
rápida mudança de pressão, bem como uma elevada tensão de

cisalhamento, o que causa a ruptura celular das microalgas. O
nível de ruptura depende da pressão aplicada, da resistência
da parede celular e do tamanho das células. Microrganismos
-
mente mais resistentes, possuindo parede celular mais espessa
(GREENWELL et al., 2010).
e extração em meio supercrítico.

De modo geral, a extração líquido-líquido (óleo-água na
biomassa) envolve a transferência de massa a partir de uma
fase líquida para uma segunda fase líquida imiscível, podendo
biomassa de microalgas é exposta a um solvente de eluição
-
rage com os lipídios neutros ligados ao citoplasma, por meio
de forças de van der Waals, formando um complexo de sol-
ao gradiente de concentração entre a fase intra e extracelular,

difunde-se através da membrana celular, havendo a extração
células. Alguns lipídios neutros são, no entanto, encontrados

no citoplasma estando ligados aos lipídios polares. Esta ligação
tem força superior à força dos lipídios neutros (estão unidos
entre lipídios e as proteínas, formando ligações de hidrogênio

com os lipídios polares do complexo (KATES, 1986; MEDINA
et al., 1998).
Segundo Mata, Martins e Caetano (2010), embora o etanol
contaminantes celulares, como açúcares, aminoácidos, sais,

proteínas e pigmentos, o que não é desejável quando o objetivo
da extração é apenas os lipídios. Em microalgas, a composição
da fração lipídica extraída pode sofrer alterações de acordo
os fosfolipídios e os glicolipídeos requerem solventes polares,

tais como o etanol ou metanol; lipídios apolares como triacil-
glicerídeos devem ser extraídos com solventes apolares, como
o hexano ou de média polaridade, como o clorofórmio.
n-hexano, o metanol, o etanol, uma mistura de hexano-etanol,

uma mistura de clorofórmio-metanol, etc. (MATA; MARTINS;
CAETANO, 2010).
tradicional na extração.
As primeiras observações experimentais de que o aumento
-

de fases, na prática, o estado supercrítico é obtido elevando-

-se a pressão e/ou a temperatura de um gás ou de um líquido
de forma que se altere o estado de agregação e, como conse-
pressão ou a temperatura estejam abaixo dos valores críticos,
Essas alterações promovem mudança na densidade, na vis-
supercrítico possui densidade próxima a dos líquidos (bom sol-

vente) e viscosidade e difusividade mássica mais próximas aos
-
supercríticos são a água (SCW) e o dióxido de carbono (SCCO2).

Apesar de a água possuir um maior potencial para sistemas
-
tura e pressão crítica (Tc=647,3 K e Pc=22,0 MPa).
O CO2 é relativamente barato e possui baixa temperatura e
pressão crítica (Tc=304,2 K e Pc=7,4 MPa). É ambientalmente
propriedades de transporte do CO2 sob diferentes pressões pró-

ximas da crítica ao longo de uma isoterma (acima de Tc).
podem ser drasticamente alteradas passando do comporta-

mento de gás para o de líquido pela simples variação da pres-
são. Para pressões acima de 1,2 Pc (pressão crítica), a densidade
possui valor próximo da densidade de líquidos e a os valores da
difusividade e a viscosidade são intermediários entre líquidos
e gases. Este comportamento pode ser esperado para qualquer

-
tura reacional estiver a uma temperatura acima da crítica e a
pressão próxima da Pc, uma combinação favorável de taxas de
transporte pode ser obtida.
Fonte: (SUBRAMANIAM et al., 2002).
Figura 3.5. Variações das propriedades físico químicas do CO2 em

pressões próximas a pressão e temperaturas críticas.
Um dos principais fatos medidos recentemente de forma

experimental foi a mudança na constante dielétrica de vários
solventes em função das condições de temperatura e pressão
(e. g. o dióxido de carbono, apolar em condições normais de
temperatura e pressão e em elevadas pressões, apresenta cons-
-
-
mais de temperatura e pressão apresenta constante dielétrica
-
GENTI; LANÇAS, 1994).
O poder solvente de extração do CO2 supercrítico é uma
função direta da pressão e da temperatura de extração (TAY-

aumento de densidade e, portanto, a um aumento no poder de

solvente. No entanto, o aumento da pressão, também aumenta
-
ção de componentes indesejáveis.
-
pressão.
Dentre os critérios para a seleção do(s) método(s) de extra-
-
a degradação dos lipídios e dos triacilglicerídeos. No caso de

se optar pela extração com solventes, estes devem ser baratos,
voláteis (para posterior remoção), de baixa toxicidade, puros,
imiscíveis em água e seletivos (ARCEO, 2012).
A extração de lipídios a partir de biomassa microalgal não
gargalo a produção em escala industrial de biodiesel microal-

gal. Futuras pesquisas em biodiesel de microalgas devem se
concentrar no desenvolvimento de um processo de extração de
extração de lipídios ideal para o biodiesel de microalgas deve
compostos contaminantes não lipídicos tais como proteínas e

carboidratos.
Do ponto de vista energético, outro item não abordado
-
de outros produtos energéticos (Figura 3.6).

A Figura 3.6 apresenta algumas opções para a conversão
de biomassa microalgal em outros produtos energéticos. No
caso do processo central ser a produção de biodiesel, após a

extração lipídica, os carboidratos existentes no bolo vegetal
processos como: fermentação para a produção de bioetanol

(ANTUNES; SILVA, 2010) reações a altas temperaturas na
mesmo (pirólise) favorecendo a quebra de ligações químicas e

formação de novos compostos desde os voláteis (metano) até
os produtos com alto peso molecular (carvão); a forma mais
elétrica (MATA; MARTINS; CAETANO, 2010). Estes processos
energética proveniente das microalgas, através do aproveita-

mento de seus coprodutos, assegurando a rentabilidade global
do processo (CHEN et al., 2011; FERRERO, 2011).
Fonte: Zardo (2011).
Figura 3.6. Formas de se obter energia a partir da biomassa microalgal.

após extração lipídica para obtenção de coprodutos, entre eles

outras formas de combustíveis, conforme já apresentado ante-
riormente.
3.6 Produção de Biodiesel
-
massa renovável para uso de motores a combustão interna com
ignição por compressão ou, conforme regulamentação, para
geração de outro tipo de energia, que possa substituir parcial
-
-
deos em ésteres pode ocorrer por diversas rotas químicas: via
-
Cada nação possui regulamentação própria de biodiesel e,

no Brasil, a regulamentação da ANP no -
-
posto de alquil ésteres de ácidos carboxílicos de cadeia longa,
matérias graxas de gorduras de origem vegetal ou animal e
no -
American Society of testing and materials (ASTM) e
pela União Europeia.
segundo normas da ABNT, ASTM ou EM/ISO. Dentre as análi-

ses para assegurar a qualidade do biodiesel destacam-se: aci-

viscosidade cinemática, mas os valores permitidos são especí-
Igualmente aos óleos e as gorduras, os lipídios das micro-

algas são constituídos por diferentes ácidos graxos saturados e
insaturados e mesmo poli-insaturados como ômega 3 ou ômega
6 (HU et al., 2008; HUANG et al., 2010). Além disso, o óleo
-
cação é uma reação química que inclui três passos reversíveis
em série, em que os triglicerídeos são convertidos em diglice-
Finalmente, estes monoglicerídeos são transformados em éste-

res (biodiesel) e glicerol (subproduto).
deve ocorrer catalíticamente, seja via catálise ácida, básica ou

(Figura
3.7).
R representa a cadeia carbônica de ácidos graxos e R1 a cadeia carbônica do álcool reagente.

Fonte: Zardo (2011).
Figura 3.7.

graxos livres presentes nas matérias-primas.

Segundo Bjerk (2012), a reação via catálise básica ocorre
-
ção de hidróxido de sódio ou de potássio. Outras desvanta-
temperaturas próximas à da ebulição do álcool. Além disso, a

cinética de reação é menos favorecida, sendo necessária, pelo
menos 3 horas de reação.
De acordo com Dias (2012), o teor de ácidos graxos livres
especialmente na presença de água em uma reação de catálise
conversão e rendimento reacional. Portanto, se o óleo possui
-
missoras para produção de biodiesel (SOUZA et al., 2010). A
-
na literatura para a obtenção de ésteres com altas conversões.
pelo seu alto custo aliado à sua rápida desativação na presença

de álcool, além de ser necessário longo tempo (18 horas) para
que estes atuem como catalisador.

-
nol e o etanol, não apenas por seu baixo custo, mas também
por suas vantagens físico-químicas: cadeias mais curtas e alta
polaridade (ARCEO, 2012). Segundo Dias (2012), o metanol
se sobressai por ser mais reativo, necessitando menor tempe-
ratura e menor tempo reacional. Entretanto, a rota etílica tem
sido bastante estudada, pela menor toxidade do etanol em rela-
ção ao metanol e por ser oriunda de energia renovável, o que
torna o ciclo produtivo do biodiesel ambientalmente menos
agressivo. É importante considerar que o metanol apesar de ser
costumeiramente obtido a partir de petróleo, também pode ser
obtido a partir da biomassa.
-
um grande excesso de álcool, usualmente 6:1 ou 12:1, deve ser
De modo geral, a relação entre a entrada de massa de

matéria-prima e produção em massa de biodiesel é de cerca de
1:1, ou seja, teoricamente, 1 quilograma de óleo resulta aproxi-
madamente em 1 quilograma de biodiesel (MATA; MARTINS;
-
rico é analisado levando em conta apenas a estequiometria da
reação, um estudo sobre o equilíbrio químico da reação pro-
porcionaria um resultado da máxima conversão que é possível
ser obtida no processo.
devem ser separados da glicerina, dos reagentes em excesso

-
meiro, separa-se a glicerina via decantação ou centrifugação;
em seguida, eliminam-se os sabões, restos de catalisador e de
metanol/etanol por um processo de lavagem com água e bor-
bulhação ou pelo uso de silicato de magnésio, requerendo este

al., 2008). Depois de separado destes componentes, o biodiesel
como misturado ao óleo diesel.
pode ser obtido para produção de biodiesel. As etapas reacio-

nais são a hidrólise ácida do ácido graxo seguido por uma este-
sabão quando submetidos à catálise básica (ARCEO, 2012).

Segundo Bueno (2007), a reação de hidrólise converte
triglicerídeos em ácidos graxos livres, mono e diglicerídeos, e
evitando qualquer interação com o álcool ou com o biodie-
metanol ou etanol, gerando então biodiesel (produto) e água

(subproduto). Essa água pode ser reaproveitada no processo de
-
cação gere taxas muito elevadas de conversão, podendo atingir
além de catalisadores mais caros, o que eleva consideravel-

mente os custos de investimento em equipamentos e insumos
para esta técnica, limitando sua aplicação a escalas menores.
Apesar da produção de biodiesel ser relativamente sim-
-
dade determinados pela ANP conforme acima citado (ou outras
deve se estender desde a escolha da matéria-prima até o arma-

A vantagem principal da produção de biodiesel de microal-
gas é que as microalgas não precisam competir com as oleagino-
sas alimentícias, que hoje são usadas na produção do biodiesel,
como é o caso do óleo de soja no Brasil e o óleo de canola na
Europa. Acredita-se que em futuro próximo a demanda de bio-
de microalgas de forma economicamente viável.
-
cia máxima teórica de conversão, se mostra como um indi-
para a produção de biodiesel.
-
rável aos valores alcançados em cultivos fechados (fotobiorrea-
tores). Assim, é recomendável o cultivo em fotobiorreatores em
grandes plantas instaladas em locais que forneçam condições
ambientais mais favoráveis ao desenvolvimento das microalgas
-
de cultivo de baixo custo, como uma fonte de CO2 resultante do

processo de fermentação da cana-de-açúcar, onde a demanda
nutricional pode ser suprida parcial ou totalmente por subpro-
dutos de outras atividades, como águas residuárias industriais,
o aproveitamento de outros componentes da biomassa microal-

gal.
Após a extração lipídica para a produção de biodiesel,
pode haver um aproveitamento da biomassa remanescente

como substrato de fermentação para a produção de bioetanol

(ANTUNES; SILVA, 2010), ou sua queima para produção de
-
mente queimada para cogeração de energia (eletricidade ou
calor) (MATA; MARTINS; CAETANO, 2010). Essas medidas
-
gética proveniente das microalgas, através do aproveitamento
de seus coprodutos, assegurando a rentabilidade global do pro-
cesso (CHEN et al., 2011; FERRERO, 2011).
As etapas entre o cultivo da biomassa e a extração lipídica
são o gargalo do processo produtivo do biodiesel a partir das
microalgas, pois como foi possível analisar através de cálculos
-
rosas, resultando em um alto custo operacional para obtenção
da matéria prima do biodiesel: os lipídios. Como o custo da
alto valor de obtenção de lipídios impacta drasticamente no
Para a obtenção de uma mesma quantidade de lipídios,

quanto maior for a produtividade de biomassa, menor será o
volume de cultivo requerido; e quanto maior for o teor lipídico
da microalga, menor será a quantidade de biomassa requerida
para o processo de colheita.
Cultura de microalgas é colhida como uma solução aquosa
diluída (de 0,1 a 2 g de biomassa de microalgas secas/L de cul-
tura) e é substancialmente concentrada. No entanto, a desidra-
tação da biomassa de microalgas para concentrações superiores
a 200 g de microalgas secas L-1 de cultura é energeticamente
proibitiva. É economicamente mais vantajosa a tecnologia
de extração de lipídios que puder ser aplicada diretamente à
matéria prima relativamente úmida, ou seja, processo prévios
de concentrações máximas entre 10 g e 200 g de biomassa de
microalgas secas L-1 de cultura (HALIM et al., 2011). Uma com-

carbono supercrítico (SCCO2), mostra que cada uma delas tem

seus méritos e suas limitações. Apesar de ter baixa reatividade
com lipídios e sendo diretamente aplicável à matéria prima
Por outro lado, a extração com SCCO2 é rápida, não tóxica, tem
principais desvantagens estão associadas com o elevado custo

de capital e de energia.
Em meio supercrítico, as propriedades do meio variam
às variações de temperatura e de pressão, provocando um

aumento na difusividade e na solubilidade do meio, atuando
como um excelente solvente para extração do óleo das micro-
-
nuindo as perdas de produtos voláteis.
Pode-se concluir que o processo de produção de biodiesel
a partir de microalgas tem sua viabilidade econômica pautada
em três pontos principais:
de investimento;
etapa de colheita;
Escolha da metodologia operacional de colheita e da
extração adequadas à microalga cultivada.
Ainda existem muitos questionamentos a esse respeito
processamento promissor do ponto de vista ecológico se torne

favorável economicamente.

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PARTE 2
DESAFIOS DE CULTIVO
DE MICROALGAS PARA
PRODUÇÃO DE BIOMASSA

CAPÍTULO 4
POTENCIAL CLIMÁTICO PARA

O CULTIVO DE MICROALGAS
EM SISTEMAS ABERTOS
NO ESTADO DO PARANÁ
João Henrique Caviglione
Diva Souza Andrade

Introdução
O planeta sofre o impacto das mudanças climáticas, o que
acaba por fomentar a busca por alternativas energéticas ao uso
objetivo de muitos, quer seja pela redução na emissão de gases

de efeito estufa e carbono de origem fóssil na atmosfera, pela
sustentabilidade, ou pelo custo elevado das fontes energéticas
tradicionais. Dentre os microrganismos, as microalgas se desta-
-
mento rápido e grande produção de biomassa, a qual apresenta
-
gas não compete com a produção de grãos pela agricultura,
pois independe de solos. Por isto, as microalgas tem sido foco
de estudos da pesquisa e da indústria, principalmente com o
objetivo energético. No entanto, em países como os USA, onde
o número de empresas ligadas a algacultura é grande, Trenta-
coste et al. (2014) questionam os potenciais de políticas e pro-
gramas que poderiam apoiar o cultivo de biomassa algal, bem
como as barreiras para a expansão destes programas.
De todas as fontes disponíveis para biocombustíveis, os
derivados de microalgas mostram potencial em termos ener-
géticos para se tornarem uma alternativa viável e sustentável
aos combustíveis fósseis. Essa premissa de sustentabilidade
a partir de microalgas. Explorando a possibilidade do uso de

combustível de microalgas na aviação comercial, Haddad e
derivado de microalgas em relação aos combustíveis fósseis,

quando se considera no processo a questão ambiental.
Como há pouco conhecimento disponível na literatura
sobre a modelagem da temperatura e radiação, relacionado
ao desenvolvimento e crescimento de microalgas, o objetivo
neste capítulo é apresentar um estudo de caso sobre este tema.

-
tico anual para o cultivo massal de microalgas em sistemas
abertos no Estado do Paraná, visando a obtenção de óleo e o
aproveitamento comercial de seus subprodutos.
4.1 Exigências Climáticas para a Produção

Massal de Microalgas
Os dados das exigências climáticas para o crescimento de
microalgas foram obtidos através de um levantamento biblio-
-
sidade, ou Radiação Fotossinteticamente Ativa (Photosyntheti-
cally active radiation, PAR), citadas nos artigos sobre microalgas.
De acordo com este levantamento, as temperaturas para o cul-
na maioria dos artigos cita a temperatura e luminosidade ou a
a máxima produtividade de biomassa da espécie ou da estirpe

de microalga estudada. Considerando se que a moda estatística
dos dados levantados nos artigos foi de 20°C e a média de 22°C,
Tabela 4.1. Espécies e temperatura (°C) de crescimento das microalgas.
Microalga
Temperatura Fonte
Gênero Espécie
gracilis 20 Almeida (2007)
Fioresi e
A. gracilis 24 Sipaúba-Tavares
(2008)

Nordi et al.
A. gracilis 23
(2006)
Sipaúba-Tavares
A. gracilis 22
et al. (2009)
Jacob-Lopes;
Revah et al.
Aphanothece microscopica
(2009)REVAH,
et al., 2009
Teixeira et al.
Arthospira platensis 30
(2008)
Borges et al.
Chaetoceros
(2007)
Moura-Junior et
C. gracilis 18
al. (2006)
Borges et al.
C. muelleri 20
(2007)
Borges et al.
C. muelleri 22
(2007)
Ding et al.
Chlamydomonas sp.
(2007)
Borges et al.
Isochrysis galbana 27
(2007)
Junior et al.
Isochrysis galbana 18
(2006)
Microcystis panniformis 20 Almeida (2007)
Rückert e Giani
M. viridis 20
(2004)
Borges et al.
oculata 20
(2007)

Borges et al.
Phaeodactylum tricornutum 20
(2007)
Borges et al.
costatum 20
(2007)
Spirulina maxima
(2006)
Macedo e Alegre
S. maxima
(2001)
Miranda et al.
S. maxima 20
(1998)
Santos et al.
S. maxima
(2003)
Muliterno et al.
S. platensis 30
Andrade et al.
Spirulina sp. 30
(2008)
Borges et al.
Tetraselmis chuii 20
(2007)
T. chuii 24
(1993)
Borges et al.
T. tetrathele 20
(2007)
Borges et al.
Thalassiosira 20
(2007)
Borges et al.
T. pseudonana 20
(2007)
Moura-Junior et
T. 18
al. (2006)
Os dados de luminosidade levantados nos artigos estão sintetizados na Tabela 4.2. Neste parâmetro
destaca-se a grande variação nas unidades de medida utilizadas. A unidade adotada da Radiação Fotossin-
teticamente Ativa se refere ao acúmulo de energia no dia e não ao fluxo de radiação, em razão do objetivo
buscar a maior produtividade de biomassa de microalgas. Todos os dados de luminosidade ou iluminação
foram convertidos para radiação acumulada no dia e expressa em MJ m-2 dia-1.

Tabela 4.2.
(PAR) por espécies de microalgas.
Microalga Fluxo de
PAR1
fótons Fonte
Gênero Espécie .s
-2 -1
gracilis 600 (12h) Almeida (2007)
gracilis
20,7
0,38 Sipaúba-
Tavares (2008)
Nordi et al.
gracilis 174 (12h) 1,61
(2006)
Sipaúba-
gracilis 24,12 Tavares et al.
(2009)
Jacob-lopes;
Aphanothece microscopica 2,78 Scoparo et al.
(24h)
(2009)
43 kLux Teixeira et al.

Arthospira platensis (12h)
2,72
(2008)
Borges et al.,
Chaetoceros 64 (12h)
(2007)
Moura-Junior
C. gracilis 40 w2
et al. (2006)
Borges et al.
C. muelleri 369 (12h) 3,42
2007)
Borges et al.
C. muelleri 40 w
2007)

Ding et al.
Chlamydomonas sp. 24-34 0,63 (2007)
Borges et al.
Isochrysis galbana
(2007)
Moura-Junior et
I. galbana 40 w al., (2006)
Microcystis panniformis 700 6,47 Almeida, 2007)
Rückert e Giani
viridis 60
(2004)
BorgeS et al.
oculata 399 3,69
(2007)
Borges et al.
Phaeodactylum tricornutum
(2007)
BorgeS et al.
Skeletonema costatum 279
2007)
3.2 kLux
Spirulina maxima 0,21
(12h) (2006)
6x40 w Macedo e
S. maxima 0,32
2.4 kLux Alegre (2001)
Miranda et al.
S. maxima 0,37
(14h) (1998)
6x40 w Santos et al.

S. maxima 2.4 kLux
0,32
(2003)
3 kLux Muliterno et al.

S. platensis 0,19
(12h)
Andrade et al.
Spirulina sp. 0,32
(2008)

Borges et al.
Tetraselmis chuii 209 1,93
(2007)
Klein e
T. chuii 40w
Borges et al.
T. tetrathele 261 2,41
(2007)
Borges et al.
Thalassiosiora 199 1,84
(2007)
Borges et al.
T. pseudonana 416 3,84
(2007)
Moura-Junior et
T. 2x40w 0,10 al. (2006)
1
Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR) acumulada no dia (MJ m-2 dia-1). Quando não definido, o
fotoperíodo considerado para os cálculos foi de 24 h; 1 lux = 1 lumen m-2; 1 watt = 683 lumens, 1 lumen =
6,792.10-3 µmol fótons s-1; 1 watt m-2 = 4,67 μmol fóton m-2 s-1 de PAR na luz solar. Fonte: (BOOTHE, 2002).2
Lâmpadas fluorescentes de 40 w
4.2 Caracterização Climática (Temperatura e

PAR) do Paraná
O Paraná situa-se na região Sul do Brasil, com o Trópico de
Capricórnio passando pelo estado. O estado apresenta transi-
ções entre climas Cfa e Cfb
conforme a Figura 4.1 (CAVIGLIONE et al., 2000). O clima Cfa
é subtropical, com temperatura média no mês mais frio infe-
rior a 18°C (mesotérmico) e temperatura média no mês mais
quente acima de 22°C, com verões quentes, geadas pouco fre-
quentes e tendência de concentração das chuvas nos meses de
Cfb é
temperado propriamente dito, com temperatura média no mês
mais frio abaixo de 18°C (mesotérmico), com verões frescos,
temperatura média no mês mais quente abaixo de 22°C e sem

Figura 4.1.
4.3 Temperatura do Ar no Paraná

Os mapas de temperatura média mensal para o Estado do
Paraná foram gerados a partir de uma série de dados meteo-
meteorológicas do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) e

do Sistema Meteorológico do Paraná (SIMEPAR), que estão dis-
tribuídas em todo o Estado do Paraná (Figura 4.2).
Foram obtidas regressões entre as coordenadas (latitude,
longitude) e altitude das estações. As interpolações, através das
regressões, foram obtidas com base no modelo digital de ele-
vação SRTM (RABUS et al., 2003), com resolução espacial de
900 metros.
As áreas com potencial de cultivo no estado para espécies
de diversos gêneros de microalgas em sistema aberto, sem con-
trole de temperatura, no Estado do Paraná, são apresentadas
segundo as médias mensais para os meses de janeiro a abril,
nas Figuras 4.3 a 4.6, respectivamente, de maio a agosto, na

respectivamente.
Figura 4.2.
meteorológicas do IAPAR.
Figura 4.3. Distribuição das áreas com potencial de cultivo de mi-

croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de ja-
neiro, considerando a temperatura base de 22ºC.


croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de fe-
vereiro, considerando a temperatura base de 22ºC.
Jorquera et al. (2010) apontam que o cultivo e a produção

de biomassa de microalgas ricas em lipídeos em lagoas e canais
adutores são economicamente viáveis. Para espécies da Classe
das Chlorophyceae, por exemplo, , foi rela-
tado que, usando uma coluna cilíndrica acrílica transparente
como fotobiorreator, a temperatura do meio de cultivo atin-
giu 41°C, no entanto, o controle da temperatura não é essen-
cial (BÉCHET et al., 2013). Em contraste, a temperatura ótima
taxa de crescimento ao longo de uma ampla gama de intensi-

s
-2 -1
taxas de crescimento máximas para algumas microalgas e as

-1
e 420s-1 para Selenastrum minu-
-2
tum, 1,64 d-1 s para Coelastrum microporum e

-2 -1
de 1,00 d-1
s para Cosmarium subprotumidum
-2 -1
(BOUTERFAS et al., 2002).

Para os diferentes gêneros de microalgas consultados na

literatura nesse estudo, as temperaturas médias no Paraná nos
o cultivo em sistemas abertos em grande parte do estado. No

período de maio a agosto (Figura 4.7), a temperatura média
-
ros citados na literatura e, portanto, sem condições de cultivos
produtivos com as espécies citadas nos artigos da Tabela 4.1.
Essa análise do potencial de áreas de cultivo em tanques
na produção devem ser detalhados. Uma alternativa é a sele-

ção de espécies adaptadas a temperaturas abaixo de 22°C. Por
exemplo as microalgas dos gêneros e Chae-
toceros adaptam se bem a temperaturas abaixo de 20°C. No
trabalho de coleta, no Estado do Paraná, para a formação da
Coleção de microalgas IPR foram encontradas espécies dos
gêneros e Chaetoceros. Há espécies de micro-
20ºC, como exemplo, °C

(ALMEIDA, 2007), Chaetoceros gracilis a 18°C (BORGES et al.,
2007; JUNIOR et al., 2006). Outra opção para o cultivo de
microalgas em regiões com temperaturas abaixo de 22ºC é o
uso de sistemas fechados ou parcialmente fechados, com con-
trole de temperatura, que tendem a resultar em maior produti-
vidade durante todo o ano.
Portanto, no período de maio a agosto (Figura 4.6), a tem-
peratura média para alguns dos gêneros descritos na literatura
está abaixo da considerada ótima e, dessa maneira, nessas
regiões é necessária a seleção de espécies adaptadas a tempe-
raturas inferiores a 22ºC ou, alternativamente, a produção de
microalgas deve ser feita em espaços fechados ou parcialmente
fechados, com controle de temperatura para aumentar a pro-
dutividade e permitir produção durante todo o ano.
A análi
no verão, primavera e parte do outono, há a possibilidade de

sem controle de temperatura. No entanto, no inverno, metade

da área do Estado do Paraná precisa de algum controle de tem-
peratura ou microalga adaptada a condições de baixas tempe-
raturas. No entanto, a validação desses modelos deve ser feita
por meio de cultivos em sistemas aberto ou fotobiorreatores ao
ar livre, bem como o cultivo de diferentes espécies de microal-
gas.
4.4 Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR)

Os cloroplastos convertem uma faixa da radiação solar em
energia química. Esta faixa da radiação solar é denominada de
Radiação Fotossinteticamente Ativa (Photosynthetically active
radiation - PAR), ela é semelhante ao espectro visível e com-
preende a radiação entre os comprimentos de onda de 400 a
700 nm (MCCREE, 1972). A PAR pode ser expressa de formas
representada por mol de fótons m-2 s-1 ou Einstein m-2 s-1. O

-2
e a energia acumu-
lada em J m .
-2
acúmulo e conversão em biomassa a forma energética (acumu-

lada) é apropriada. A conversão entre as formas depende da
constante de Planck em cada frequência do espectro.
A maioria das estações meteorológicas convencionais é
-
ção da PAR. No entanto, a PAR é um componente da radiação
global medida nas estações. A PAR corresponde, aproximada-
em função da posição no planeta, nebulosidade, dia do ano e

horas do dia. A Figura 4.12 mostra a distribuição da radiação
solar, nos diferentes comprimentos de onda que já foi determi-
ASTM, 2012).


croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de
março, considerando a temperatura base de 22ºC.

abril, considerando a temperatura base de 22ºC.


croalgas em sistemas de tanques abertos nos meses de
maio, junho, julho e agosto, considerando a tempera-
tura base de 22ºC.

croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de se-
tembro, considerando a temperatura base de 22ºC.


croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de ou-
tubro, considerando a temperatura base de 22ºC.

novembro, considerando a temperatura base de 22ºC.


ASTM G173-03 Reference Spectra
2,00
1,75
Topo da atmosfera Radiação global

Irradiância espectral (W m-2 nm -1)
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
100 400 700 1000 1300 1600 1900 2200
Comprimento de onda (nm)
Figura 4.12. Referência da distribuição do espectro de radiação so-

lar (ASTM, 2012).

Dentre os trabalhos que buscam a equivalência entre a

Radiação Global (RG) e a PAR, Galvani (2009) determinou
quatro equações para São Paulo, segundo as quatro estações
-
lhantes para o Paraná. Nas equações 1, 2, 3 e 4, PAR é a radia-
ção fotossinteticamente ativa e RG é a radiação global e R2 é o
Verão - PAR = 0,429.RG (R2 = 0,97)

(1)
2
= 0,98) (2)
Inverno - PAR = 0,448.RG (R2 = 0,98) (3)
2
= 0,97)
(4)
-
mativa de PAR a partir dos dados de registrados de radiação
global de 38 estações meteorológicas do SIMEPAR no período
para interpolação e construção dos mapas. A Figura 4.13 apre-
A partir dos dados de Radiação global horária das estações

meteorológicas do SIMEPAR e das equações de Galvani (2009),
estimou-se os dados da PAR para o Paraná. Foram determi-
-
da duração dia, as medias diárias são apresentadas em Mj m-2

dia-1. Os dados foram interpolados no software ArcGis, resul-
tando nos mapas de estimativa da PAR apresentados a seguir.
A Figura 4.14 refere-se à à PAR
de inverno, a Figura 4.16 à PAR de verão, a Figura 4.17 à PAR
de primavera e a Figura 4.18 à PAR anual.

Figura 4.13.
Figura 4.14. Mapa da radiação solar fotossinteticamente ativa

(PAR), média diária acumulada com base em dados
do período de outono.


do período de inverno.

do período de verão.


do período de primavera.
Figura 4.18. Mapa da Radiação solar fotossinteticamente ativa

(PAR), média diária acumulada PAR com base em
dados anuais.

Os dados da distribuição de radiação mostram claramente

que não há limitações de luminosidade ou PAR ao desenvol-
raceways
-
conversão da PAR em biomassa.
As áreas do noroeste, norte e oeste do estado do Paraná
apresentaram maior potencial para produção de biomassa de
microalgas em fotobiorreatores ao ar livre e tanques abertos
durante todo o ano. No entanto, quando se considera a possi-
bilidade de cultivo de espécies mais adaptadas a baixas tempe-
raturas (menores do que 22ºC), na maioria da área do estado
é possível o crescimento de microalgas, sem controle da tem-
peratura.
A análise preliminar das potenciais áreas de cultivo em
tanques abertos no estado do Paraná mostra que as alternativas
apresentadas devem ser detalhadas. Um exemplo é a seleção
de espécies de microalgas adaptadas a temperaturas inferio-
res a 22°C pode ser uma opção para aumentar o período de
recomendação para o cultivo durante o ano. Outra alternativa
são os cultivos fechados ou parcialmente fechados, com con-
trole de temperatura para aumentar a produtividade de micro-
algas ao longo do ano.
Com relação à luminosidade ou PAR, não existe limitação
para o cultivo massal de microalgas no Paraná em nenhuma
época do ano.
O estudo da viabilidade considerando as condições cli-
máticas mostrou o grande potencial para o cultivo massal de
microalgas no estado do Paraná.

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CAPÍTULO 5
POTENCIALIDADES E LIMITAÇÕES DO
USO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
NO CULTIVO DE MICROALGAS PARA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL
Antônio Costa
Graziela Moraes de Cesare Barbosa
Patrícia Cristina Gomes

Introdução
O uso de combustíveis fósseis tem aumentando considera-
velmente nas últimas décadas. Há preocupação com a capaci-
dade das reservas de petróleo conhecidas atender esse aumento
Além do eventual esgotamento das reservas de petróleo e
aspectos ambientais do uso dos combustíveis fósseis. Assim, a

produção sustentável de energia representa uma questão a ser
Os biocombustíveis podem ser uma contribuição promis-

sora para que essa equação seja resolvida, aliando economi-
cidade e baixo impacto ambiental. Dentre os combustíveis
renováveis mais promissores destaca-se o biodiesel, cujas limi-
tações estão relacionadas à disponibilidade de matéria-prima
que atenda, quantitativa e qualitativamente, à demanda por
óleos vegetais e processos de produção viáveis economica-
mente, com capacidade de competição com os combustíveis
fósseis e com sustentabilidade ambiental.
De um lado o biodiesel é um componente essencial para
garantir a sustentabilidade econômica e socioambiental de
nosso setor energético. De outro lado, o biodiesel oriundo de
plantas oleaginosas, bem como de óleos de fritura e de gor-
dura animal, não consegue atender sequer uma pequena parte
uma extensão elevada de áreas cultiváveis e uma complexa

rede de coleta de resíduos. Ainda, o histórico da produção bra-
sileira de biodiesel mostra o setor em crescente dependência de
uma única matéria-prima, a soja, contrapondo-se ao objetivo
do Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB)
de sustentar sua cadeia na diversidade de materiais graxos dis-
poníveis nas várias regiões do País (FRANCO et al., 2013).
A soja, como matéria-prima para o biodiesel, tem a limita-
ção de ser uma commodity, assim seu valor é cotado conforme
a variação do mercado internacional. Atualmente, com mer-

-
-prima para produção de biodiesel.
Nessa visão, a produção de biocombustíveis a partir de
microalgas apresenta como vantagens alta produtividade,
necessidade de menor área que os cultivos de plantas agríco-
las oleaginosas, capacidade para absorver nutrientes de meios
As microalgas necessitam basicamente de energia solar e

CO2
a obtida em plantações de oleaginosas. Enquanto a soja pro-
-1
ano-1), as
-
valentes de petróleo (ha ano ) (FRANCO et al., 2013).
-1 -1
Apesar dos aspectos positivos e das grandes perspectivas

que o cultivo de microalgas apresenta, a produção em escala
está ainda muito distante de alcançar viabilidade econômica e
-
tentes para esta tecnologia emergente, que podem ser resumi-
dos nos seguintes itens (RAMOS et al., 2011):
a) complexidade da logística de produção em larga esca-

la;
-
c) alto custo na formulação dos meios de cultivo;

d) complexidade no escalonamento de estratégias de pro-
dução em sistema fechado, a exemplo dos fotobiorrea-
tores;
f) alta demanda energética para secagem e extração de

lipídeos;
-
pende intrinsecamente da tecnologia empregada para
a extração.

A produção de microalgas em meios formulados torna o

processo de cultivo economicamente limitante devido ao alto
custo de produtos químicos comerciais. Os meios de cultivo
devem proporcionar todos os elementos essenciais ao desen-
volvimento de uma microalga. Mais do que isso, há elementos
essenciais para certas espécies que podem ser desnecessárias
para outras. Não há, portanto, nenhum meio de cultura viável
para o cultivo de todas as espécies de microalgas. Os exem-
plos mais bem sucedidos de meios de cultura contemplam, de
forma abrangente, as necessidades nutricionais de centenas de
espécies testadas, que passam a ser naturalmente a primeira
opção de meio de cultura a ser testado no caso de espécies
cujas necessidades nutricionais básicas são desconhecidas
(LOURENÇO, 2006).
Uma solução para os elevados custos dos meios de cultivo
sintéticos é o uso de meios alternativos para o cultivo desses
microrganismos, onde se procura estabelecer um substrato
2007). Nesse sentido, vários resíduos agroindustriais têm sido
capítulo é discutir o uso de alguns desses resíduos no cultivo

de microalgas.
5.1 Caracterização Físico-Química dos

Resíduos como Meio de Cultura para
Microalgas
sólido, líquido ou gasoso, que é descartado. Resulta de um pro-

-
mação, de fabricação ou de consumo. É material considerado
de baixo ou nenhum valor econômico. É o que sobra de alguma
atividade.

Atividades agropecuárias e de processamento de seus pro-

dutos têm proporcionado grandes volumes de resíduos, alguns
com alto impacto poluente. Esses resíduos podem apresentar
in
natura em corpos hídricos pode ocasionar grande decréscimo
na concentração de oxigênio dissolvido, provocando a morte
de animais, a exalação de odores fétidos e gases agressivos,
As microalgas vivem essencialmente em meio líquido. Por
agroindustriais podem ser constituintes dos meios de cultivo
Ainda, promove a reciclagem e a disposição adequada des-

ses dejetos, contribuindo para mitigar problemas ambientais
decorrentes do seu lançamento em mananciais, como elevação
corpos hídricos e proliferação de doenças. Em muitos casos, é

possível observar, a olho nu, a presença de algas nesses resí-
duos.
Por outro lado, o uso de resíduos pressupõe riscos, pois
da viabilidade do resíduo a ser usado no cultivo da microalga.

A origem do material deve ser conhecida, a amostragem e a
análise do resíduo devem ser criteriosas. Depois de caracteri-
desse material para o cultivo de microalgas.

No Projeto Microalgas para Produção de Biodiesel, convê-
nio IAPAR, Copel, Fapeagro, a busca por fontes alternativas de
estado do Paraná apresenta várias cadeias produtivas que geram

elevada quantidade de resíduos, entre as quais podemos citar
aqueles originados: da suinocultura, da indústria sucroalcoo-
leira, dos aterros sanitários e da indústria de sucos de frutas.
A suinocultura gera grande volume de dejeto, com cerca

de 1,3 milhões de m3 mensais (IBGE, 2010). É composto pelas
grande impacto no meio ambiente como, por exemplo, a eutro-
ecossistemas.
-
tiva para cultivo de microalgas no projeto, foi coletado em uma
granja de suínos de ciclo completo, situada no município de
por processo de biodigestão. O uso desse resíduo no cultivo de

microalgas tem se mostrado promissor, ainda que limitações
existam, como será discutido ao longo desse capítulo.
Figura 5.1. Coleta de resíduo, após passagem por biodigestor, em

-
cípio de Arapongas, PR.
A produção de cana-de-açúcar gerou no Paraná, em 2010,

22 milhões de m3 de resíduo (ALCOPAR, 2011). A vinhaça
-

mente em fontes minerais. O resíduo da indústria sucroalcoo-
Figura 5.2. Coleta de vinhaça em usina de processamento de cana

O cultivo de microalgas em meio à base de vinhaça tem

apresentado resultados satisfatórios, mas há necessidade de se
equilibrar o balanceamento de nutrientes desse resíduo, bem
A fruticultura, particularmente o cultivo de laranja no

Norte do Paraná, gera resíduo no processamento de extração
-
É uma fonte muito diluída e que necessita

da complementação de nutrientes para seu uso no cultivo de
microalgas.
O resíduo da extração do suco de laranja foi proveniente
de lagoa de decantação que continha resto de suco e água
de lavagem das máquinas de extração do suco de laranja, no
sanitários que são abundantes no estado do Paraná e um dos

principais causadores de impactos ambientais. O lixiviado
(chorume) formado nos aterros pode ser aproveitado como
meio no cultivo de microalgas para a produção de biodiesel. A
formação do chorume em aterros sanitários ocorre principal-
mente pela percolação de água advinda da precipitação atmos-
aterro; da umidade inicial contida nos resíduos depositados e

da decomposição dos resíduos devido à atividade microbioló-
gica. Em decorrência de seu processo de formação, a compo-
para o cultivo de microalgas.

Figura 5.3. Coleta de resíduo da indústria de suco de laranja em
O chorume foi coletado no aterro do município de Lon-

Figura 5.4. Coleta de resíduo em lagoa de tratamento de aterro sa-

nitário de Londrina, PR.
de microalgas é a grande variabilidade dos teores de nutrientes

e o desequilíbrio da composição dos resíduos em relação à
demanda por nutrientes das microalgas. Portanto, ao contrário

de cultivo das microalgas, os resíduo apresentam, simultanea-

mente, vários nutrientes que se encontram em quantidades
desproporcionais em relação às exigências das microalgas. Na
no cultivo de microalgas, originados dos resíduos, no projeto

de cooperação IAPAR, Copel, Fapeagro.
Há grande variabilidade na composição química dos resí-
duos e as quantidades que os constituem não são proporcionais
à demanda de nutrientes exigida pelas microalgas. Na compo-
sição elementar média das algas a relação de nitrogênio (N),
fósforo (P) e potássio (K), nutrientes mais abundantes em sua
de massa seca de alga. Essa relação não é contemplada por

nenhum dos resíduos avaliados, fato que constituí uma limita-
As amostras do resíduo de suco de laranja foram as que

apresentaram as menores concentrações em nutrientes e, parti-
cularmente, com concentração muito baixa em nitrogênio, ele-
mento exigido em grande quantidade pelas microalgas (Tabela
quantidade de elementos a ser fornecida no meio de cultivo

para complementar sua composição seria elevada, não contri-
-
dução de microalgas.
No resíduo proveniente do aterro sanitário, mostra que
necessidade de adição de fontes de fósforo e nitrogênio para

balancear sua composição para o cultivo de microalgas, de

Tabela 5.1. Nutrientes nos resíduos de suinocultura, aterro sanitá-

rio, indústria sucroalcooleira e de extração de suco de
laranja.
N P K Ca Mg B Cu Mn Zn
avaliados
Resíduos
g kg-1 mg kg-1
Resíduo de
laranja
0,020 0,276 0,139 0,018 0,223 0,118 0,721 0,264

suinocultura
Resíduo da
1,38 0,376 2,084 3,969 194,407

de aterro
sanitário
Resíduo
1,04 0,036 2,203 0,263 3,188 2,638 2,904

(vinhaça)
Resíduo
da cana
0,36 0,049 2,40 0,368 0,220 11,2 4,8 13,2
A vinhaça é um resíduo abundante na região Norte do

Paraná. Os resultados médios das amostras analisadas de
vinhaça indicaram teores elevados de potássio e bons níveis
uso de vinhaça pressupõe sua diluição e complementação com

nitrogênio e fósforo, condição que onera o custo do seu uso no
cultivo de microalgas, porém, dependendo das condições não

O resíduo da suinocultura, também denominado dejeto

líquido de suíno (DLS) foi o que apresentou, na média, maior
concentração de nutrientes dos resíduos avaliados. Os teores
de cálcio, fósforo, cobre e manganês são relativamente altos,
quando comparados aos demais resíduos. A relação de N:P:K
nesse resíduo é de 3,67:6,69:1, respectivamente, portanto,
diferente da relação média da composição das microalgas de
-
rido (RSB) com meio sintético no cultivo das microalgas, culti-
vou-se Chlorella vulgaris, por 21 dias, em condições de tempera-
correspondia à dose de nitrogênio no meio BG-11. O objetivo

do experimento foi observar o crescimento da microalga no
RSB e avaliar a possibilidade do resíduo substituir o meio sin-
tético de cultivo, BG-11.
A maior produção de biomassa para a microalga Chlorella
vulgaris foi observada em meio sintético BG-11 e no RSBN100,
ou seja, com a quantidade de nitrogênio foi a mesma, tanto no
RSB como no BG-11. O uso de RSB fornecendo menores quanti-
dades de N comprometeu a produção de biomassa de Chlorella
vulgaris, indicando que a menor quantidade de nitrogênio foi
outro lado, a menor produção de biomassa nos cultivos com
N, quando comparado ao meio BG-11, que recebeu todos os

nutrientes para o adequado desenvolvimento das microalgas.

Figura 5.5. Massa seca de Chlorella vulgaris (g L-1) cultivada em meio

sintético BG-11 e em resíduo suíno biodigerido (RSB)
rada ao meio BG-11. Médias seguidas de mesma letra
O resultado obtido indica, portanto, que o uso de RSB, na

dose RSBN100, pode substituir o uso do meio sintético BG-11.
5.2 Ocorrência de Microalgas em Resíduos

Agroindustriais
As microalgas estão entre os microrganismos mais abun-
Chlorella sp., que são microrganis-
Dessa forma, ao isolar espécies de microalgas que ocorrem

em resíduos pode-se aproveitar a adaptação desses organismos
a esses meios e avaliar seu potencial de produtividade de lipí-

deos para a produção de biodiesel (CERTIK; SHIMIZU, 1999).

-
-
ção dos atributos relevantes de cada espécie ou estirpe (TAVA-
RES, 2009).
Para os estudos com microalgas as estirpes podem ser
isoladas de ambientes naturais ou adquiridas em Coleções de
microrganismos que prestam este tipo de serviço. Esses centros
de cepas podem fornecer microrganismos de características
já conhecidas, mas nem sempre estão presentes os melhores
caracteres desejados, enquanto no ambiente encontra-se uma
1988).
Dessa forma, o isolamento inicia-se com o estabelecimento
dos resíduos a serem trabalhados e da constatação da ocorrên-
resíduos são de ocorrência expressiva no estado do Paraná.

Há dois métodos básicos para o isolamento das microalgas
em cultura: plaqueamento e seleção por capilar (pescaria). No
isolamento de microalgas dos resíduos optou-se pelo método
de plaqueamento. Usando-se essa técnica foram isoladas oito

Figura 5.6.
7121, isolada de resíduo suíno biodigerido.
Figura 5.7. Estirpe de cianobactéria nominada IPR-7122, isolada de

resíduo suíno biodigerido.

Figura 5.8. Estirpe de cianobactéria nominada IPR-7124, isolada de

resíduo suíno biodigerido.
Figura 5.9.
in natura

Figura 5.10.
IPR-7126, isolada de vinhaça.
Figura 5.11.
IPR-7127, isolada de vinhaça.

Figura 5.12.
IPR-7128, isolada de resíduo de aterro sanitário.
Figura 5.13.
IPR-7129, isolada de resíduo de aterro sanitário.

Após o isolamento, nos diferentes resíduos, foi estabele-
com fotoperíodo de 12 h/12 h (claro/escuro), com iluminação
células (cel)
mL -1
cel mL-1. O
inóculo inicial da IPR-7126 foi de 2,28 x 10 cel mL-1 e da IPR-
6
6
cel mL-1. O inóculo inicial da IPR-7128
6
cel mL-1 6
cel
mL .
-1
A microalga IPR-7121 teve um crescimento inicial lento

atingindo sua densidade celular máxima no 17°
x 10 cel mL-1).
-
mento inicial lento nos primeiros dias de cultivo, porém atin-
-
mento expressivo no 21° cel mL-1
10 cel mL-1, respectivamente).
dia (819,38 x10 células mL-1) e da IPR-7127 ocorreu no 20º

células mL-1). A IPR-7128 e IPR-7129 alcança-
células
mL -1 6
células mL , respectivamente).
-1
As estirpes foram incorporadas à Coleção IPR de Microal-

gas.

10
o 10
N n s
o 10
10
9 N n s
1
m
1
m
8
N de c u s
N de c u s
7
7
6
6
5 5
0 5 10 15 20 25 0 0 10 20 0
s
s
o 10
10 N n s
o 10
10
N n s
1
9
m
9
1
m
N de c u s
8 8
N de c u s
7 7
6 6
5 5
0 10 20 0 0 10 20 0
s
s
10 10
N n s
o 10
N n s
o 10
9 9
1
m
1
N de c u s
8 8
N de c u s
7 7
6 6
5 5
0 10 20 0 0 10 20 0
s s
Figura 5.14. Curvas de crescimento das microalgas IPR-7121, IPR-

-
liadas pelo número de células em função do tempo,
em dias.

5.3 Cultivos de Microalgas em Resíduos

Agroindustriais
As microalgas necessitam de uma fonte de energia para
o seu crescimento. A energia luminosa é a fonte usada no
extremos existem rotas metabólicas intermediárias.
CO2 ou HCO3- dissolvido na água. Essa modalidade de cultivo

requer outros nutrientes, especialmente os macronutrientes
nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e enxofre, bem
crescimento, como temperatura, luminosidade, pH e agitação

do meio de cultivo. Estes fatores devem estar na faixa de tole-
entre gêneros e até entre espécies de microalgas (COSTA et al.,

2014).
As microalgas apresentam alta diversidade, são organismos
adaptados a diferentes meios, sendo encontrados em ambien-
tes aquáticos de água doce, salobra e salgada. Como observado
anteriormente, estes microrganismos são encontrados também
em resíduos de atividades agroindustriais e águas de aterro de
lixo urbano e do tratamento de lodo de esgoto, dentre outras.
Essa diversidade proporciona vantagens relevantes em compa-
os impactos ambientais adversos nos recursos naturais solo e

água (FRANCO et al., 2013).
de fonte de nutrientes, pode ser uma forma de mitigação da

poluição ambiental, pelo não descarte desses resíduos nas
águas dos mananciais. A produção de resíduos das atividades
agropecuária e agroindustriais, bem como aquelas originadas

de resíduos urbanos, é concentrada em determinadas regiões

em grandes
centros populacionais. A estratégia de aliar os cultivos de
microalgas ao uso de resíduos pode ser uma alternativa viável
para tratar biologicamente esses resíduos e contribuir para a
Particularmente, o custo com reagentes químicos que com-

põem o meio de cultivo é um fator limitante à produção de
menos dispendiosos (MOREIRA, 2007). Dentre os meios de cul-

tura alternativos avaliados para a produção de biomassa de
e resíduo da suinocultura (RODRIGUES; BELLI FILHO, 2004;

TRAVIESO et al., 2006).
-
mento de suínos, e que passaram por processamento, foram os
que apresentaram resultados mais promissores.
Apresenta-se a seguir um estudo de caso sobre o cultivo
de microalgas em meio de cultivo à base de resíduo suíno bio-
-
Bold Basal Medium).
As microalgas cultivadas foram Chlorella vulgaris (C. vulgaris),
Chlorella minutissima (C. minutissima) e IPR-7121, esta isolada
em resíduo suíno biodigerido, proveniente de uma granja de
ciclo completo, situada no município de Arapongas, PR. O cul-
Foram testados quatro concentrações de RSB, equivalentes
de nitrogênio no meio BBM, que contém 41 mg de N L-1. No

RSB, os demais nutrientes que constituíam o resíduo, variaram

em função da dose de nitrogênio usada.

O inóculo inicial das microalgas C. vulgaris, C. minutis-
sima células mL-1,
microalgas foi avaliado pelas alterações nos valores do pH, da

densidade óptica, da contagem de células e pela produção de
Os valores de pH, em amostras dos meios avaliadas aos
função do tempo de amostragem, das espécies cultivadas e dos

meios em que as microalgas se desenvolveram. Valores mais
elevados de pH foram observados nos meios de cultivo que
que o RSB era originalmente mais alcalino, o que sugere o uso
suínos. O pH do meio foi mais elevado quanto maior a concen-

tração de resíduo no meio, atingindo o valor máximo médio,
durante o período de cultivo, de 9,44, no tratamento N100.
de cultivo de microalgas e determina a solubilidade do dió-
ou indiretamente o metabolismo das microalgas. As alterações

no valor de pH dependem de vários fatores, como composição
e capacidade tamponante do meio, quantidade de dióxido de
carbono dissolvido, temperatura (que determina a solubilidade
do CO2
Por outro lado, cada espécie de microalgas possui uma faixa
de pH adequada para seu crescimento, além disso, sua exigên-
Segundo Richmond (1990), a faixa ótima de pH para o cresci-

mento da microalga Spirulina
Noike (1994) indicam que Chlorella vulgaris tem intervalo ideal
O valor do pH aumentou no cultivo em meio BBM para as
a 9,10, apresentando variação de quase duas unidades (Tabela

-
3
) e amoniacal
(N-NH 4) na solução interfere no valor do pH durante o desen-
+
volvimento da microalga. Quando somente o N-NO-3 é usado

como fonte de nitrogênio, o pH da solução aumenta. Contra-
riamente, quando a fonte de nitrogênio tem exclusivamente
N-NH+4 o pH da solução decresce.
Esse fato ocorre, pois as microalgas, ao absorverem íons do
meio de cultivo (cátions) liberam outros íons, como H+ e, desse
microalgas liberam HCO-3, elevando o pH da solução (CLARK,

1982). O meio BBM é constituído exclusivamente de N-NO-3,
o cultivo das microalgas. As variações nos valores de pH nas

soluções que continham RSB foram menos acentuadas e tanto
menores quanto maior a concentração de resíduos no meio
de cultivo. No meio de cultivo RSBN100, a média do cultivo
das três microalgas testadas, o pH variou de 9,08 a 9,80, no
fato sugere a presença de nitrogênio amoniacal e nítrico na

solução com RSB.
A foi a microalga que apresentou menor
variação no valor do pH dos meios de cultivo, seguida da IPR-
7121. A C. vulgaris apresentou a maior elevação do valor pH no
de pH pode representar maior quantidade de nutrientes absor-

vidos pela C. vulgaris -
massa em relação às outras duas microalgas avaliadas, como é
da microalga cultivada, os maiores valores de pH ocorreram
indica que para serem cultivados em RSB as microalgas devem

tolerar meios medianamente alcalinos, com valores de pH em
-
riais que ocorrem nesse meio de cultivo.

Tabela 5.2. Variação dos valores de pH, em meio BBM (Bold’s Basal Medium) e em 4 diferentes concentra-
ções de RSB (Resíduo Suíno Biodigerido), cultivados com as estirpes de microalgas C. vulgaris
(Cv), C. minutissima (Cm) e IPR-7121 (IPR).
Época de Amostragem (dias) Média

Meios de
Inicial 4 8 12
cultivo2
Cv Cm IPR Média Cv Cm IPR Média Cv Cm IPR Média Cv Cm IPR Média
BBM 7,4 7,2 7,12 7,1 9,7 8,38 7,6 9,1 7,94 c
7,8 7,93 9,6 9,9 9,32 9,8 9,63 9,11 b
8,7 9 9,87 10,2 9,6 9,28 a
8,9 8,9 8,9 10,2 9,8 9,82 9,36 a
RSBN100 9 9,1 9,08 9 9,1 9,17 10,1 9,3 9,7 9,7 10,1 9,7 9,6 9,8 9,44 a
8,36 8,31 8,27 8,67 9,74 8,92 9,11

Média1 8,31 8,31 C 8,71 9,77 A 9,47 10,1A 9,61 9,03 a
A A A A B A B C B
Épocas (Ep)
Espécies (Sp)
Meios (Me) DMS = 0,1092 F = 261,32**

229
30/07/2014 09:47:27
230
Ep*Sp DMS = 0,1314 F = 38,47** ---

Ep*Me DMS = 0,2184 F = 20,36** ---
Sp*Me DMS = 0,1780 ---
Ep*Sp*Me DMS = 0,3783 F = 10,67** ---

1
As médias seguidas pela mesma letra, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linha, não diferem estatisticamente entre si. São apresentados os valores da diferença
mínima significativa (DMS) e o valor de F (F) para cada variável e para as interações e o valor do coeficiente de variação (CV), em percentagem, para cada variável. Foi
aplicado o teste de t no nível de 5% de probabilidade.
2
Concentração de resíduo suíno biodigerido (RSB) equivalentes a 25% (N25), 50% (N50), 75% (N75) e 100% (N100) do teor de nitrogênio no meio BBM.
30/07/2014 09:47:27
Os valores médios de densidade ótica (DO) variaram em

função dos meios de cultivo usados e das microalgas cultiva-
um método rápido, embora indireto, de estimar a concentra-

ção celular nesse meio. Valores mais elevados de DO foram
observados nos meios de cultivo que continham RSB quando
comparados ao meio BBM. Os valores de DO foram tanto mais
elevados quanto maior a concentração de resíduo no meio,
indicando que partículas sólidas contidas no RSB podem ter
contribuído para os aumentos nesses valores, além do aumento
da concentração do número de células das microalgas cultiva-
Em todos os meios de cultivo, a estirpe de microalga IPR-

-7121foi a que apresentou maiores valores de DO, seguida da
C. minutissima. Os menores valores determinados ocorreram
nos meios de cultivo para a C. vulgaris
com menor tamanho de células apresentam densidade ótica
mais elevada do que aquelas de maior tamanho. A IPR-7121
C.
. A C. vulgaris tem células de maior tamanho (OHSE
Independentemente da microalga cultivada os maiores valo-

res de DO ocorreram nas maiores concentrações de resíduo,
alguns meios de cultivo com C. vulgaris, para todas as microal-

gas, indicando que o RSB é um meio com alta possibilidade de
aproveitamento para o cultivo de microalgas.
Avaliou-se o número de células (NC) das três espécies de
microalgas cultivadas nos diferentes meios de cultivo ava-
liados. O NC variou em função dos meios usados e das espé-
cies cultivadas. Valores mais elevados foram observados nos
meios de cultivo que continham RSB quando comparados ao

um meio cultivo que pode viabi
de variação (CV), em porcentagem, para cada variável.
Tabela 5.3. Variação da densidade ótica (DO), em meio BBM e em

quatro diferentes concentrações de RSB, cultivados com
as microalgas C. vulgaris, C. minutissima e IPR-7121.
Meios1,2 C. vulgaris1 C. minutissima IPR-7121 Média
BBM 0,111 B 0,081 B 0,374 A 0,189 b
0,161 B 0,200 B 0,313 A
0,149 B 0,261 A 0,268 a
0,119 C 0,311 B 0,278 a
RSBN100 0,281 B 0,283 a
Média2 0,139 C 0,227 B 0,380 A 0,249
Espécies ---
Meios DMS = 0,061 F = 10,72** ---
DMS
Espécies* F=
espécies = DMS meios = 0,061
Meios
1
As médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatistica-
mente entre si. Foi aplicado o teste de t no nível de 5% de probabilidade. São apresentados os valores da
diferença mínima significativa (DMS) e o valor de F (F) para cada variável e para as interações.
2
Concentração de resíduo suíno biodigerido (RSB) equivalentes a 25% (N25), 50% (N50), 75% (N75) e 100%
(N100) do teor de nitrogênio no meio BBM.
A microalga C. vulgaris ,apresentou o menor número de

células em todos os meios de cultivo testados. Não houve dife-

e a IPR-7121. Esses
resultados apresentam relação com aqueles observados para DO
das microalgas cultivadas. Ou seja, os menores valores deter-
minados para DO e NC ocorreram nos meios de cultivo de C.
vulgaris
diferença existente nos tamanhos celulares dessas microalgas.
C. vulgaris tem maior tamanho do que as duas outras microal-
densidade ótica e de número de células (OHSE et al., 2008).
Tabela 5.4. Número de células (NC x10 mL-1), em meio BBM e em

quatro diferentes concentrações de RSB, cultivados com
C. vulgaris, C. minutissima e IPR-7121.
Meios1,2 C. vulgaris1 C. minutissima IPR-7121 Média2
BBM 16,33 C 42,09 B 81,80 A 46,74 d
18,70 C 124,81 A 81,38 B 74,96 c
18,79 B 134,68 A 136,84 A 96,77 ab
13,31 C 107,49 a
RSBN100 14,74 C 102,08 B 137,08 A 84,63 bc
Média 16,22 B 114,32 A 82,12
Espécies DMS = 8,60 F = 468,28**
Meios DMS = 13,64

20,27
DMS
Espécies* F=
espécies= DMS meios = 23,63
Meios 11,97**
22,34
As médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatistica-
1
mente entre si pelo teste de t no nível de 5% de probabilidade.

2

As maiores ocorrências de NC foram observadas nos trata-
cultivada, os maiores números de células foram observados nos
foi mais adequado para a C. vulgaris, para a o
para a IPRM7121, selecionada no resíduo de suíno biodige-

rido o maior número de células foi observado no tratamento
RSBN100.
A produção de biomassa não variou em função dos meios
de cultivo usad
Tabela 5.5. Produção de biomassa, em g L-1, de Chlorella vulgaris,

e IPR-7121 em função de cinco
meios de cultivo.
Meios1,2 C. vulgaris1 C. minutissima IPR-7121 Média2
BBM 0,22 bA 0,09 aA 0,24 aA 0,18 a
0,27 abA 0,16 aA 0,21 aA 0,21 a
0,27 abA 0,14 aA 0,21 aA 0,20 a
0,44 aA 0,17 aB 0,21 aB 0,27 a
DS100 0,32 abA 0,23 aA 0,32 aA 0,29 a
Média2 0,30 A 0,16 C 0,23 B 0,23 a
Espécies F = 33,42**
17,29
Meios DMS = 0,116
DMS
Espécies*
espécies = DMS meios = 0,200 F = 0,681
Meios
0,181
1
As médias seguidas pela mesma letra, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem esta-
tisticamente entre si. Foi aplicado o teste t no nível de 5% de probabilidade. São apresentados os valores
da diferença mínima significativa (DMS) e o valor do teste F (F) para cada variável e para as interações e o
valor do coeficiente de variação (CV), em porcentagem, para cada variável.
2

Entretanto, observou-se diferença entre as espécies culti-

vadas. A microalga mais produtiva foi C. vulgaris, seguida da
C. minutissima. Esse fato sugere que microalgas mais robustas

são mais produtivas e adaptadas ao cultivo em RSB. C. vulga-
ris teve sua maior produtividade quando cultivada no RSB, no
potencial para cultivo de microalgas adaptadas a esse resíduo,

podendo assim ser uma alternativa econômica para essa ativi-
dade e com sustentabilidade ambiental.
Um segundo estudo de caso é apresentado, com objetivo
de avaliar a produção de biomassa e de lipídeos pela C. minutis-
sima cultivada em resíduo suíno biodigerido (RSB) e em meio
massa seca e a quantidade de lipídio acumulado pela C. minu-

tissima
300 ml de cultivo a 10.000 rpm, por 10 minutos, seguido de
constante. No meio BBM, composto de sais e água, a massa

determinada foi constituída exclusivamente de
(CM). No RSB, a massa representava as microalgas mais as par-
tículas sólidas dispersas no resíduo. A quantidade de partículas
sólidas dispersas era tanto maior quanto maior a quantidade de
resíduo adicionada à solução de cultivo. A maior produção de
-1
, foi obtida no
g L-1
0,19 g L-1
BBM. A maior produção de biomassa de CM foi determinada
Os lipídeos foram extraídos da biomassa com solução de

clorofórmio:metanol e determinados gravimetricamente. Os

valores obtidos variaram em função dos diferentes tratamen-
por Lemoes et al. (2009) e por Soares et al. (2010). No estudo

dos primeiros autores, os lipídios foram extraídos da biomassa
de Chlorella pyrenoidosa -
-
res et al. (2010) concluíram, entre os métodos testados, que o
-
minação de lipídeo.
Associando-se a produção de biomassa e o teor de lipídeo
-1
,
C. minutissima , após 30 dias
eo determinada
Não se observou diferença na produção de massa seca nos

-
tanto o número de células de C. minutissima no meio BBM,
dados não apresentados, foi superior a esses dois tratamentos
que usaram RSB como meio de cultivo. Esses resultados suge-
rem que os sólidos dispersos no RSB contribuíram para a com-
posição da massa seca, onde o resíduo foi usado como meio
de cultivo. Ainda observou-se queda nos teores e acúmulo de
lipídios com o aumento das doses de RSB indicando que esse
aumento de dose incorporou à produção de massa, centrifu-
gada após 30 dias de cultivo, material menos rico em lipídios
do que aquele contido na .

Figura 5.15. Quantidades de massa seca (g L-1) e de lipídio (mg L-1)

Chlorella minutissima, cultivada em re-
síduo suíno biodigerido (RSB) e meio BBM.
Outro aspecto a considerar é que entre os diversos compo-

nentes do meio de cultura, a fonte ou a composição de nitrogê-
nio pode afetar o crescimento e a composição das microalgas em
cultivo, atingindo diretamente a produtividade e a composição
bioquímica da biomassa obtida (MOLINA et al., 1994). Estu-
algumas variações bioquímicas relacionando o aumento do teor

de lipídeo com baixas concentrações de nitrogênio. Fioresi e
Sipaúba-Tavares (2008) cultivaram , em
esterco suíno biodigerido, encontraram níveis mais elevados
Segundo Illman et al. (2000), baixas concentrações de

nitrogênio são consideradas condições ótimas para o aumento
da produção de lipídeos nas estirpes de Chlorella, conforme
evidenciado, neste relato, para a Chlorella minutissima culti-
(1981) com 30 espécies de microalgas, onde algas verdes, com

-
dico após 4 a 9 dias de ausência de nitrogênio. Torres (1994)
-
-1
e de 3,7
Spirulina maxima.
Portanto, a concentração de nitrogênio no resíduo suíno
biodigerido afetou o crescimento e composição lipídica da
microalga C. minutissima
menor que a do meio sintético BBM, a densidade populacional,
biomassa e produção de lipídio dessa microalga foram supe-
riores aos obtidos no meio padrão de cultivo. Assim, o resíduo
a produção da microalga C. minutissima.
A produção de biocombustíveis a partir de microalgas
apresenta como vantagens alta produtividade de biomassa e
óleo, ocupando menor área de cultivo quando comparada a
plantas oleaginosas. Há iniciativas no sentido de alcançar a
viabilidade econômica e ambiental para a implementação, em
larga escala, da produção de biocombustíveis a partir de bio-
massa de microalgas. No entanto, há inúmeras limitações para
se alcançar esse objetivo.
resíduos do criatório de animais e das atividades agroindus-

triais podem ser constituintes dos meios de cultivo desses orga-
ocorrem naturalmente nas lagoas de decantação que contém

esses dejetos e por serem fontes de nutrientes e carbono para as
microalgas. Ainda, o uso como constituinte do meio de cultivo
promove a reciclagem e a disposição adequada desses dejetos,
contribuindo para mitigar problemas ambientais decorrentes

do seu lançamento em mananciais.

O uso de resíduos, no entanto, pressupõe riscos e limita-
-
-
pela avaliação da viabilidade do resíduo a ser usado no cultivo

da microalga, sendo recomendável que os dejetos sejam sub-
metidos a tratamentos como fermentação.
No Projeto Microalgas para a Produção de Biodiesel, con-
vênio IAPAR, Copel, Fapeagro, a busca por fontes alternativas
pois o estado do Paraná apresenta várias cadeias produtivas que

geram elevada quantidade de resíduos. Foram estudados aque-
les originados: da suinocultura, da indústria sucroalcooleira,
dos resíduos de aterros sanitários e da indústria do processa-
mento da laranja. Nesses materiais isolaram-se 08 microalgas
de ocorrência natural e avaliou-se o potencial de cada resí-
duo como constituinte de meios de cultivo. O dejeto líquido de
suíno biodigerido foi o resíduo que apresentou maior potencial
para compor meios de cultivo para as microalgas. As microal-
gas selecionadas nesse resíduo, IPR-7121 e IPR-7122, foram as
o dejeto foi um constituinte do meio de cultivo.

A produtividade máxima de massa seca de microalgas pro-
no projeto, foi 280 mg L-1 dia-1. A produção média de lipídeo
-1
dia-1.
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CAPÍTULO 6
CULTIVO DE MICROALGAS EM
FOTOBIORREATORES DE BANCADA:
FATORES ABIÓTICOS

Cássio Egidio Cavenaghi Prete
Diva Souza Andrade

Introdução
-
-
tadores nos quais uma fonte de carbono, por exemplo, glicose
raceway,
em sistemas fechados ou parcialmente fechados, chamados de
fotobiorreatores (FBR). Nos fotobiorreatores, a luminosidade
-
tamente sobre a superfície do cultivo e não ocorre a troca direta
de gases e contaminantes entre o cultivo e a atmosfera (BAR-
ao formato, as principais categorias de fotobiorreatores são:
inclinados e espirais. Estes sistemas podem ser confeccionados

em vidro ou material plástico, acrílico, polietileno (TREDICI,
2007). O custo da construção, no teto de um laboratório, de
um FBR de vidro foi de 8.700 euros, incluindo as placas para
-
ção de O2
(MASOJÍDEK et al., 2003).
no crescimento de microalgas, em fotobiorreatores fechados

de bancada, inicialmente, são apresentados os resultados do
experimento, avaliando os efeitos do fotoperíodo na produção
de biomassa e lipídeos da microalga .
Posteriormente, pela análise de superfície de resposta, os resul-
tados da densidade ótica (DO), teores de proteína e produção
de biomassa da são discutidos em função do
pH e concentração de nitrato de sódio no meio de cultivo.

6.1 Efeito do Fotoperíodo no Cultivo de

Microalgas
O cultivo da microalga
-
-
cidade para 90 litros foram testados para o cultivo de microal-
gas em Meio Basal de Bold (BBM) pH 6,8 (Figuras 6.1A, B e C).
Figura 6.1. Preparo do Meio Basal de Bold nos fotobiorreatores tipo

aquário (A, B) e inoculação com a microalga
oleoabundans
O inóculo contendo a microalga

-
rio, foi transferido para o fotobiorreator, conforme ilustrado na
iluminação: de 18 h e 24 h, com radiação fotossinteticamente

-2
-
cente tubular (24W) e aeração constante fornecida por bomba.
Os FBRs foram separados um do outro por meio de anteparo de

tos e três repetições.
longo do período por meio da coleta de alíquotas dos cultivos

nos FBR e plaqueamento em placas de Petri contendo meio
-
mento das células no meio conforme Figura 6.2.
Na avaliação da contagem de células viáveis da -
bundans, foi observado também crescimento de contaminantes
bacterianos nos meios de cultivo, possivelmente devido às con-
dições dos fotobiorreatores que são semiabertos.
Figura 6.2. Colônias de microalgas mostrando a viabilidade das cé-

lulas ao longo do desenvolvimento do cultivo em fo-
tobiorreator tipo aquário após 10 dias de cultivo. A)
viabilidade de células da microalga -
bundans “drop-plate”
pela diluição seriada para contagem de células de mi-
croalga.
A biomassa algal dos cultivos foi determinada 10 dias após

a inoculação da microalga por meio de secagem em estufa a

aproximadamente 40ºC até a obtenção de peso constante. Para

coleta da biomassa total os cultivos foram retirados dos FBR e
acondicionados em sacos plásticos para facilitar a decantação
de decantação natural das células após a eliminação do meio

de cultivo (Figura 6.3).
Figura 6.3. Coleta da biomassa de cultiva-

da durante 10 dias em fotobiorreator tipo aquário. (A-
D) Transferência dos cultivos para recipientes gradativa-
mente menores para facilitar a decantação do meio de
cultivo da biomassa; (E) biomassa úmida e (F) biomassa
seca.

O teor de lipídeo total dos cultivos foi determinado em

amostras do cultivo que foram retiradas 10 dias após a ino-
culação da microalga. O lipídeo da biomassa da microalga foi
-
cência do corante Vermelho do Nilo.
A fase de coleta da biomassa pode ser considerada o gar-
galo da produção neste tipo de fotobiorreator. A decantação
alternativas de coleta da biomassa precisam ser ainda testadas.

Após o cultivo, o meio de cultura BBM separado da bio-
massa foi analisado quanto aos teores de macro e micronu-
trientes de acordo com metodologia descrita para tecido vege-
tal (MIYAZAWA et al., 2009). O objetivo desta análise foi
relatos de reciclagem de nutrientes pelo reuso do meio de cul-

tivo para sp. (RODOLFI et al., 2003) este tipo
de reaproveitamento também foi avaliado em Scenedesmus sp.
(KIM et al., 2011) e em tratamento e reciclagem para biodiesel
(LEMOS, 2012).
-
produção de lipídeo total entre os FBRs que permaneceram

com fotoperíodo de 18 horas de luminosidade e aqueles em
que a luminosidade foi constante (Tabela 6.1).
Na comparação da microalga entre os tra-
tamentos com 24 h e com 18 h de luminosidade foi observado
o aumento do fotoperíodo. Todavia, possivelmente devido as
e ao aumento da temperatura nos fotobiorreatores com 24 h de

entre os dois tratamentos. Estes resultados não eram esperados
importante para o desenvolvimento de microalgas em cultivos
Tabela 6.1. -
dans
tipo aquário em Meio Basal de Bold.
Luminosidade Biomassa seca Lipídeo total

T (°C)1 pH1
(h) (mg L-1)
24 4,4a 7,6
18 30a 8,4a 34,0
1,7 70
1=Temperatura e pH do meio de cultivo no décimo dia no final do experimento. Valores seguidos da
mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste t a 5% de probabilidade.
-
rior do fotobiorreator é a profundidade e continua sendo um
gargalho em cultivo massal de microalgas (BARBOSA et al.,
2003).
Shimidt (2007) relata que o fotoperíodo é importante
luminosidade contínua. A combinação do aumento de lumi-

nosidade de temperatura, que permaneceu em torno de 30°C
dentro dos FBR, deveria ter aumentado a taxa de crescimento
provável que tenha ocorrido fotoinibição nos cultivos. Ao tra-

balhar com
que temperaturas acima de 30ºC nos cultivos resultou em redu-

ções na taxa de desenvolvimento dessa microalga.

A análise do meio de cultivo residual após 10 dias de cul-
tivo apontou esgotamento dos nutrientes nitrogênio e magné-
função dos cultivos em diferentes fotoperíodos, pelo teste t a
Tabela 6.2. Concentrações de macro e micronutrientes no Meio

Basal de Bold de
após 10 dias de cultivo em fotobiorreator tipo aquário.
Concentração Fotoperíodo
inicial dos
Nutrientes nutrientes 18 h 24 h
(g L-1)
Ca 6,9 6,3 6,0 11,10
Mg 0,01 0,01 0,01
S 3,0 3,2 3,3
mg L-1
N ** 41,2 0,1 0,1 18,70
Cu (0,4)
Zn (2,3) 2,6 2,6 2,60
B (2,3) 2,4 2,4 4,10
Mn (0,6) 0,3
Fe (0,4) 0,9 0,8 11,90

Lemos (2012) trabalhando com a microalga Scenedes-

mus sp. em meio de cultivo fresco e reciclado observou que
não houve decréscimo na densidade celular e lipídeos totais
-
mas sugere que não existe a necessidade deste ser aplicado no

sistema de reciclagem do meio de cultivo.
mg L-1 no fotobiorreator, com 24 h de luminosidade; e foi de

20 mg L-1, no cultivo com fotoperíodo de 18 h. A porcenta-
-
res com luminosidade direta (24 h), a temperatura e pH do
meio de cultivo foram maiores em 0,1 unidades. Os resultados
evidenciaram que o crescimento de não foi
afetado pelo fotoperíodo.
O cultivo da microalga sp. em meio reci-
clado não mostrou produtividade de biomassa, possivelmente
o crescimento da microalga no cultivo anterior (RODOLFI et al.

2003) e comportamento similar foi observado em cultivos de
Scenesdesmus sp.
6.2 Cultivo de Microalgas em Fotobiorreator

de Polietileno
A produção das microalgas pode ser em sistemas simples e
fechados (fotobiorreator) para evitar contaminação e aumen-
tar a biomassa algal em tempo menor. Silva e colaboradores
(2012) relataram o crescimento da microalga -
bundans em fotobiorreator vertical construído em saco plástico
transparente, composto de polietileno de baixa densidade, com
baixo custo de instalação, em torno de R$ 70,00 por unidade
com capacidade de 100 L de meio de cultivo.

tivo, com aeração constante durante 10 dias de crescimento.
foi o Bold’s Basal Medium (BBM). O preparo do inóculo inicial

da microalga foi feito em três frascos com capacidade de 2 L,
constando 1,7 L de cultivo em sala de fotoperíodo de 12 h, com
°C °C na fase
s obtida
-2 -1
-
das análises diárias de pH, densidade ótica (DO) a 670 nm,
interna da casa de vegetação aferida a cada 2 h.

A estirpe microalga
foi cultivada durante 10 dias em meio de cultivo BBM, em um
fotobiorreator vertical confeccionado em polietileno de baixa
densidade, com capacidade para 80 L, instalado sobre bancada
em casa de vegetação de vidro (Figura 6.4). O inóculo inicial
6
células mL-1 (Log10= 6,7 UFC mL-1), que corres-
ponde a 0,13 de densidade óptica (DO670nm).
A temperatura média do ar na casa de vegetação durante
e 23,23°C (fase escura das 20:00 as 6:00h). Desta forma, foram

obtidos os seguintes resultados: o inóculo inicial apresentou
6
cel mL-1. O pH ini-
cial do meio de cultivo no fotobiorreator foi de 6,8 e durante
o crescimento da microalga o pH do cultivo foi se aumentando
até alcançar o pH 9,0 no 10° dia. A D.O670nm do cultivo inocu-
4
(cél mL-1) e no
10° dia a D.O foi de 0,226 e concentração celular de 6,8 106
(cel mL-1), mas o maior índice de crescimento foi observado no
9° dia de cultivo com D.O de 0,29 e concentração celular de
1,07 107 (cel mL-1).

Figura 6.4. Cultivo de em fotobiorreator

vertical, em bancada em casa de vegetação.
Este tipo de FBR, em ambiente de casa de vegetação, mos-

trou-se uma alternativa viável para produção de inóculo de
produção em grande escala. A produtividade de biomassa de

microalga aumentou pois foi observado incremento em cerca
de 3 unidades logarítmicas no número de células no meio de
cultivo.
6.3 Meios de Cultivo: pH e Concentração de

Nitrato de Sódio
As microalgas são microrganismos que se destacam como
fonte de proteína de qualidade para a alimentação humana e

animal, principalmente pela alta taxa de crescimento, capaci-
descrevem que concentração de nitrogênio (N) assim como a
das microalgas e, consequentemente, no teor de lipídeos e pro-

teínas da biomassa (GRIFFITHS et al., 2009; LIN et al., 2011;
nitrato de sódio (NaNO3) como fonte de nitrogênio para cres-

cimento de microalgas, com doses variando com a composição
e características do meio preparado. De acordo com Richmond
-
L-1 -1 -1
. -1
Em relação ao pH, o controle dessa variável química é

essencial no cultivo de microalgas, pois afeta diretamente a
efetivamente na absorção dos nutrientes do meio de cultivo
podem ser tóxicos para algumas espécies de microalgas (LOU-

RENÇO, 2006).
O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da concen-
tração de nitrogênio (NaNO3) e da alteração do pH no meio de
cultivo da microalga
6.3.1 Preparo do inóculo de ambiente de cultivo
microalga foi o (BBM) (BOLD, 1949), auto-
temperatura e fotoperíodo controlados. Os cultivos da estirpe

de -
parentes com capacidade de 2 L em condições controladas de
aeração em , com fotoperíodo de 12 h,

°C
2°C na fase escura. A luminosidade para os cultivos foi provida
-
postas paralelamente na parte superior do recipiente e foi de
s (porômetro Licor INC
-2 -1
Figura 6.5. Cultivo de em meio BBM sem

aeração, em frascos de 2 L colocados sobre a bancada,
-
perior. Fotoperíodo e temperaturas controladas.
O delineamento fatorial completo foi aplicado para estu-
pH para as variáveis dependentes, na densidade ótica, no teor

de proteína e na biomassa, conforme a metodologia de super-
fície de resposta.

O planejamento experimental dos dois fatores, nitrato de

sódio (NaNO3
do programa STATISTICA versão 7.0. A Tabela 6.3 apresenta
as combinações das concentrações de nitrato de sódio (NaNO3)
em g L-1
três repetições. Como com o crescimento da microalga ocorre

alteração do pH, esse foi ajustado diariamente com KOH (4M)
ou HCL (4M).
Tabela 6.3. Níveis dos fatores concentração de nitrato de sódio

(NaNO3) em g L-1 e pH e os correspondentes níveis
Níveis
Fatores
-1 0 1
NaNO3 1,12
pH 7,0 9,0
Para o delineamento experimental em esquema fatorial

completo para dois fatores em três níveis os 9 tratamentos são
-
neamento foi feito visando à análise dos resultados pela meto-
dologia de superfície de resposta.

Tabela 6.4. Delineamento experimental em esquema fatorial com-

pleto para duas variáveis e três níveis.
Tratamentos NaNO3 pH
1 -1 -1
2 -1 0
3 -1 1
4 0 -1
0 0
6 0 1
7 1 -1
8 1 0
9 1 1
6.4 Densidade Ótica e Teor de Proteína na

Biomassa de Microalgas
do experimento no 14º dia de cultivo, em cubeta de vidro em

espectrofotômetro UV-visível (Genesys 10UV). A determina-
-
FORD, 1976) adaptado e soroalbumina bovina como padrão.
No experimento avaliando o efeito do pH e do NaNO3 no 14°
dia de cultivo de acordo com a densidade ótica, a análise esta-
=0,96),
2

Tabela 6.5. -
-Behnken para a variável resposta densidade ótica
(D.O.) do cultivo da estirpe de
3
.
Soma Média
Fatores GL Teste F p
quadrática quadrática
NaNO3 (L+Q) 0,00280 2 0,001403 0,001*
pH (L+Q) 2 0,037972 261,428 0,000*
Interação (L+Q) 2 0,002478 0,000*
Falta de ajuste 0,00021 2 0,723 0,499
Erro puro 0,00261 18
Total 0,09008 26
R2= 0,96; R2adj= 0,95; *p<0,05; L= efeito linear; Q= efeito quadrático; GL= Graus de liberdade.
3
e do pH sobre os resultados da densidade ótica, expressos em
14º dia de cultivo foi de 0,36 no tratamento com pH 9,0 e à

concentração de 1,12 g L-1 de NaNO3, e a menor média experi-
mental obtida de densidade óptica foi de 0,18 na qual o pH foi
3
.

Figura 6.6. Superfície de resposta para densidade ótica dos trata-

mentos experimentais com variação do pH e NaNO3
no 14° dia de cultivo da microalga -
bundans.
0,009y 2
resposta para densidade ótica.
pH e do NaNO3 no crescimento da microalga

-
plicação celular da microalga nos tratamentos em que o pH foi
ajustado para 9,0.
Em relação ao teor de proteína, a análise estatística do
-
veis pH e concentração de NaNO3
de regressão obtido foi de 0,92 (Tabela 6.6), indicando que
melhor previsão de resposta.

Tabela 6.6. -
-Behnken para a variável resposta teor de proteína
na biomassa da estirpe de
3
.
Soma Média
NaNO3 (L+Q) 2 0,0000*
pH (L+Q) 2 20,03227 0,0002*
Interação (L+Q) 71,7168 2 26,921 0,0000*
Falta de ajuste 2,3697 2 1,18487 0,889 0,4302
Erro puro 21,3118 16 1,33199
Total 338,1077 24
A equação que descreve a modelagem de superfície de res-
2 2
- 0,224xy2 + 1,180x2y
produtividade de proteína pela microalga .

A maior quantidade média de proteína foi obtida na bio-
massa microalgal cultivada nos na concentração de NaNO3 de
1,12 g L-1 e nessa concentração foram obtidos maiores valores
experimentais de 32,9 mg L-1
mg L-1 de proteína em pH 7,0 e de 30,6 mg L-1 para pH 9,0. A
menor média experimental obtida foi de 23,1 mg L-1 de pro-
-1
de NaNO3.
-
dução de proteína pela microalga . Tem-se que,
a quantidade de proteína obtida foi maior para os tratamentos
em que a concentração de NaNO3 foi de 1,12 L-1.

A redução de nitrato de sódio alterou o teor de lipídeo

e proteína da microalga marinha ,
desse nutriente visando o aumento da produção de biomassa

microalgal (WAN et al., 2013).
Figura 6.7. Superfície de resposta para proteína dos tratamentos

experimentais com variação do pH e NaNO3 no 14º dia
de cultivo da microalga .
A variação da concentração de proteínas em mg L-1 na bio-

massa das células da microalga , no 14º dia
sódio, visando aumentar a quantidade de proteína, a concen-

tração de NaNO3 para a maior produtividade foi de 1,37 g L-1 e
pH = 9,0 do meio de cultivo BBM ajustado diariamente.

6.5 Biomassa de Microalga em Função do pH e

Nitrato de Sódio
Para determinação da biomassa nos cultivos, foi coletada
com o planejamento experimental. Esta amostra foi centrifu-
°C.
O pellet formado durante a centrifugação foi ressuspen-
centrifugado, secos e pesados. O sobrenadante foi retirado e

seco em estufa a 60ºC, para posterior determinação da massa
concentração de NaNO3
modelo com melhor previsão de resposta.
Tabela 6.7.
Box-Behnken para a variável resposta biomassa de
células secas da estirpe de
3
.
Soma Média
NaNO3 (L+Q) 0,000376 2 0,000188 8,1621 0,0030*
pH (L+Q) 0,010146 2 220,3612 0,0000*
Interação (L+Q) 2 0,000284 12,3318 0,0004*
Falta de ajuste 0,000007 2 0,000003 0,1499 0,8618
Erro puro 0,000414 18 0,000023

Total 26
Na Figura 6.8 o gráfico da modelagem da superfície de

resposta para a biomassa seca verifica-se que houve maior
crescimento da microalga nos tratamentos em
que o pH foi ajustado para 9.
Figura 6.8. Superfície de resposta para biomassa seca da microalga

em função dos tratamentos ex-
perimentais com variação do pH e NaNO3. Cultivo sem
aeração durante 14° dia com ajuste diário do pH.
Os resultados do 14º dia, de acordo com a analise estatís-

-
veis concentração de NaNO3 e do pH, mostrando que há maior
produção de biomassa da em pH 9,0 e que os
valores de densidade ótica decresceram com a redução do pH.

Para a biomassa microalgal, os maiores valores variando entre

-1
mg L-1 de nitrato de sódio o meio de cultivo.

No geral, os resultados encontrados demonstraram aumento da
biomassa e da densidade ótica em pH 9,0 e, para a proteína a
mg L-1 de NaNO3.
O fotoperíodo altera a produção de biomassa e teor de lipí-
deo nas células d N. oleoabundans, mas com a alta variabili-
-
cativas para cultivos em fotobiorreatores de bancada.
O fotobiorreator vertical em saco plástico transparente
composto de polietileno de baixa densidade apresenta bai-
xos custos de instalação e potencial para cultivo da microalga
, buscando a produção de biomassa
-
-
microalga . A densidade ótica (DO) do cultivo

da microalga apresentou maior média para
concentração de 1,12 mol L de NaNO3 e em pH 9,0. A maior
-1
quantidade de proteína, foi obtida com 1,12 mol L-1 de NaNO3

e em pH 7,0 com valor médio de 32,98 mg L-1. O maior valor
para produtividade de biomassa microalgal foi encontrado na
concentração de NaNO3 -1
de NaNO3 e pH 9,0 com
-1
.

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marine microalga DUT01. Biochemical
Engineering Journal


CAPÍTULO 7
CULTIVO DE MICROALGAS
EM FOTOBIORREATORES FECHADOS
E EM SISTEMAS ABERTOS
Adriano Rausch Souto


Introdução
-
Nacional de Energia dos Estados Unidos (DOE) (SHEEHAN et

al., 1998). Em um extenso relatório deste departamento, estão
descritas varias metodologias, resultados e conclusões de um
programa internacional de pesquisa composto por Estados
Unidos da América, Israel e Japão, visando à produção de gás
metano e óleo combustível a partir da biomassa de algas. Diver-
sos projetos se iniciaram na década de 1980 e os resultados
apontaram para um uso potencial, com viabilidade econômica
em larga escala e uma produtividade média de 70 t ha-1 ano-1.
Os principais fatores limitantes relacionados ao controle
da produção de biomassa de microalgas em grandes tanques
abertos são descritos por Sheehan et al. (1998). Estes fatores
-
ratura. Além disso, fatores químicos presentes no meio de cul-
tivo, tais como teor de dióxido de carbono e potencial hidroge-
acordo com as necessidades de crescimento das microalgas.

-
gas, o baixo custo no processo está diretamente relacionado ao
planejamento da planta piloto, pois, envolve desde o tamanho
e forma dos tanques, tipos de cobertura, até os mecanismos de
iluminação e controle de temperatura. Outro ponto importante
a ser considerado é a água. De acordo com o relatório do DOE,
a água é o componente majoritário do cultivo de microalgas,
-
sar por um controle rigoroso, além disso, não pode possuir cloro.
Diversos sistemas de cultivos de microalgas têm sido rea-
elaboração de alimentos, quanto para a obtenção de produtos

naturais com alto valor no mercado mundial. O potencial bio-
tecnológico das microalgas, principalmente a sua capacidade

fotossintética, alta taxa de crescimento, além da produção de

-
-prima de biocombustíveis, ração na alimentação animal, pig-
mentos pode ser observado em diversos trabalhos (DERNER et
al., 2006; DEL CAMPO et al., 2007; LI et al., 2008).
As microalgas, quando comparadas com as plantas oleagi-
nosas tradicionais, apresentam uma elevada produção, como
observado por Chisti (2007) e apresentado na Tabela 7.1, onde
é possível observar uma produtividade em óleo muito supe-
rior às demais culturas. No Brasil, a soja é a principal matéria-
-prima para a produção do biodiesel, sendo que sua produtivi-
dade é relativamente baixa, variando de 400 a 600 kg de óleo
por hectare e tem apenas um ciclo anual. Já o girassol pode
Tabela 7.1. Comparação entre algumas fontes de biodiesel. Fonte:

Chisti (2007).
Área de cultivo
Produção de óleo Área necessária
Cultura nos EUA
(L ha-1) (M ha)
Milho 172 846
Soja 446 326
Canola 1190 223 122
Pinhão manso 1.892 140 77
Coco 2.689 99
Palma 24
Microalga a 136.900 2 1,1
Microalga b
a
70% em óleo em biomassa; b 30% em óleo em biomassa.

Lourenço (2006) indica que microalgas encontradas no
por hectare. Em uma área equivalente a um hectare, por exem-
óleo que a soja. Além disso, as formas de óleos encontradas

nas microalgas possuem características físico-químicas simila-
res aos demais óleos vegetais, sendo uma matéria-prima com
potencial para a produção de biodiesel.
-
ção biológica de dióxido de carbono (CO2), processo de grande
à
a elevação da concentração desse gás na atmosfera terrestre
é considerada uma das principais causas do agravamento do
aquecimento global. Segundo Chisti (2007) a sinergia entre os
sistemas biológicos de captação de CO2 de algumas espécies de
microalgas encontradas no meio marinho, em água doce e no
apontaram como vantajoso o uso de microalgas para produção

de biomassa, devido a apresentarem alta produtividade, o que
2006). Além disso, a região de cultivo de microalgas pode ser

árida e o solo pode estar degradado, pois o mesmo é somente
que a produção da biomassa é contínua, não seguindo o regime

de safras. Em geral, o meio de cultivo para microalgas é aquoso
e pode ser reaproveitado como fonte de nutrientes para culti-
2
residual de
-
tes para o cultivo de microalgas (VICHEZ et al., 1997; BENE-
MANN, 2009).
Tanto no ambiente natural quanto nos cultivos feitos pelo
ser humano, o crescimento de uma população de microalgas é
resultado da interação entre diversos fatores biológicos, quími-

cos e físicos (RAVEN et al., 2001). Os biológicos estão relacio-

nados às próprias taxas metabólicas da espécie cultivada, bem
No que se refere aos fatores físicos e químicos que afetam o

-
tura, a salinidade e a disponibilidade de nutrientes (GUILLARD
Com o objetivo de facilitar a entrada e saída de meio

líquido no sistema de Fotobiorreatores hexaédricos fechados
dos volumes de descarga dos meios o modelo desenvolvido no

projeto microalgas é apresentado. Tendo em vista o potencial
-
tivo neste capítulo é descrever a construção dos sistemas de
produção de biomassa, composta por uma plataforma de foto-
biorreatores abertos, no município de Londrina, Paraná.
7.1 Classificação e Componentes para

Produção Massal de Microalgas em
Sistemas Fechados e Abertos
As tecnologias de produção de biomassa de microalgas
-
fonte de energia e o gás carbônico; como fonte de carbono. Na
(REDAELLI et al., 2010).

A energia capturada pelas microalgas através da fotossín-
recurso natural, no entanto, varia com o ciclo diário. Para con-
possibilita a produção diária e contínua, mas, requer investi-
êm menor gasto
-
tema, pode-se até controlar períodos de claro e escuro, ligando-
A temperatura é outro fator importante ao crescimento

-
bólicas e, consequentemente, sobre a taxa de crescimento
(PEQUENO, 2010). Ao analisarem o efeito da temperatura e
pH no cultivo de Spirulina major, Karam e Soccol (2007) con-
cluíram que a temperatura ótima foi de 30ºC e o pH de 8,0,
-1
.
Quanto à nutrição, as microalgas necessitam de uma série
de nutrientes para seu crescimento, em destaque o nitrogênio,
o fósforo, o ferro e, em alguns casos, o silício (CHISTI, 2007).
O nitrogênio é o componente básico na formação de proteínas,
pode ser encontrado em concentrações variáveis no interior

das células algáceas. Os compostos de nitrogênio são assimila-
dos, preferencialmente, na forma amoniacal (NH3 e NH4+), mas
ou molecular de nitrato (NO3-) e de nitrito (NO2-). As principais

fontes de nitrogênio são os sais de nitrato, sais de amônio e
2
atmosférico em
NOx
O fósforo é um elemento importante na regulação do
metabolismo celular, na síntese de lipídeos e carboidratos, no

fornecimento de fosfatos para a geração de energia e consti-

tuição de moléculas estruturais (PEQUENO, 2010). O silício
é um componente da estrutura de revestimento externa das
microalgas diatomáceas, sendo que em cultivos dessas espé-
cies a baixa demanda desse elemento provoca diminuição da
espessura da parede celular destas microalgas (BRANCO, 1978;
LOURENÇO, 2006).
-
vido por outros tipos de cultura, como as oleaginosas, sendo
1,83 t de dióxido de carbono, o que torna bastante interessante

testar o efeito deste gás na produtividade. Borghetti (2009)
adição de CO2
A injeção de CO2 pode ser feita por um sistema semelhante
ao de injeção de ar por bombeamento, porém, recomenda-se
que não seja feita em conjunto. A ideia de separar a injeção
de CO2 da aeração é porque necessitaria de muito dióxido de
carbono para ser injetado junto com o ar, visto que é necessá-
ria uma agitação considerável do meio de cultivo. Além disso,
em sistemas separados. Bjerk (2012) descreve que o cilindro

de CO2 deve ser equipado com uma bomba solenoide, a qual
-1
,
durante o período de maior intensidade luminosa natural, cor-
respondendo ao período das 07:00 às 19:00 horas.
2
no sistema, deve se
estudar as seguintes possibilidades:
Injeção de CO2 em função do tempo de cultivo, com

base na curva de crescimento da microalga.
2,
o que seria
elevado custo de implantação.

7.2 Tipos e os Métodos de Cultivo Massal

de Microalgas
O desenvolvimento do cultivo de microalgas depende da
de biomassa devem apresentar baixo custo em larga escala ou,

resultar em produtos com alto valor agregado, nos casos de
pequena produtividade.
Entre as diferentes formas de cultivo, estas podem ser:
monoalgáceo ou misto. O monoalgáceo refere-se a uma única
-
ção comercial e manutenção de cepas, pois proporciona um
maior controle do processo de crescimento e de produção da
biomassa. Os cultivos mistos envolvem, na mesma unidade de
cultivo, duas ou mais espécies de microalgas, no entanto, pode
(LOURENÇO, 2006). Nestas condições mistas, as aplicações da

biomassa são mais restritas e, geralmente, envolvem mais pes-
-
cies por determinado recurso ambiental.
Os métodos de cultivo estão relacionados quanto à forma
semicontínuo ou contínuo. No sistema de cultivo estanque, as

células são inoculadas no meio de cultivo e nenhum outro com-
ponente é adicionado ao longo de seu desenvolvimento. Este
processo resulta em mudanças expressivas na densidade das
células, que tende a aumentar assim como os nutrientes dis-
solvidos tendem a diminuir ao longo do tempo, podendo che-
também sofre variações, quer de intensidade ou de qualidade,

característico de cada profundidade e que varia também com
-
pensão ou solução na água (BRANCO, 1978).
O regime contínuo é um processo permanente de saída de

cultura com células de microalgas e entrada de meio esteri-

-
1999). O sistema semicontínuo proporciona grande produção

de células por intervalo de tempo. Neste processo, uma parcela
do meio de cultivo com algas é retirada e substituída por meio
-
quer momento durante o desenvolvimento do cultivo, porém,
geralmente é feito quando já se formou uma biomassa relati-
vamente grande (fase log do crescimento). Este procedimento
acarreta curvas de crescimento como variações bruscas de den-
sidade de células, devido ao efeito da diluição da cultura.
7.3 Fotobiorreatores Fechados e

Sistemas Abertos
A produção de microalgas pode ocorrer em sistemas fecha-
dos, denominados fotobiorreatores, e abertos, sendo os mais
raceways
Os sistemas abertos de cultivo geralmente são de grande

porte e permitem a produção de elevada quantidade de bio-
massa. Estes sistemas devem ter pequena profundidade,
CHISTI, 2007). O revestimento pode ser de qualquer material

impermeável e liso para evitar aderência, incluindo plástico,
-
em muitos países, porém apresentam alguns gargalos técnicos

para o perfeito funcionamento (PUSHPARAJ et al., 1997).
Dentre outras desvantagens, aos sistemas abertos rela-
cionam-se as seguintes (PULZ, 2001; REDAELLI; MARCILIO;
RECH, 2010):

susceptibilidade à contaminação por microrganismos
baixa produtividade de biomassa;

alta taxa de evaporação da água;
temperatura e oxigênio.
Durante o inverno, em regiões temperadas e subtropi-

cais, pode ser necessário cobrir os tanques para evitar varia-
ções bruscas de temperatura, bem como impedir que a camada
a temperatura deve permanecer na faixa entre 20°C a 30°C.

Diante das limitações do cultivo aberto, foram desenvol-
vidos os sistemas fechados, conhecidos como fotobiorreatores
recipientes fechados de plástico, vidro ou policarbonato, sendo

necessária a introdução nas unidades, dos nutrientes que as
microalgas precisam para crescer (PÉREZ, 2007). As unida-
-
ção e da evaporação, favorecendo o crescimento das células,
sendo possível maior controle da temperatura e da intensidade
luminosa (FRANCISCO, 2010; REDAELLI; MARCILIO; RECH,
2010). No entanto, ainda existem problemas que incluem: o
superaquecimento, o entupimento, a acumulação de oxigênio,
o alto preço de instalação, de funcionamento e de manutenção
do cultivo (JACOME-PILCO et al., 2009; PEQUENO, 2010).
Estes sistemas fechados podem ser instalados ao ar livre ou
em ambiente coberto. No caso de cultivos em locais abertos, a
caso de ambientes fechados, há duas possibilidades: através do

uso de casas de vegetação, cujo teto e as paredes laterais são
transparentes, permitindo o aproveitamento da energia solar,
-

Nos cultivos em sistemas fechados, os custos de ajuste e

operação são mais elevados do que as lagoas abertas, mas a
maiores, ou seja, esta desvantagem inicial no custo é dissipada
comercial (PÉREZ, 2007).

Os sistemas de produção híbrida combinam o cultivo
fechado com o aberto, em dois estágios distintos. No primeiro,
as algas crescem num ambiente controlado em fotobiorreato-
res, evitando assim a contaminação e favorecendo a divisão
celular. O segundo estágio, refere-se à transferência das células
para os sistemas abertos.
7.4 Fotobiorreatores em Bancada

em Casa de Vegetação
No projeto Microalgas, uma grande variedade de mode-
em bancada e casa de vegetação, para atender a necessidade

da produção de microalgas em pequena e em média escala.
Para isto, ao longo do período de desenvolvimento do projeto,
confecção dos modelos dos fotobiorreatores fechados foi reali-
de biomassa que se pretendia obter, a quantidade de fotobior-

reatores que seria necessária com base nos tratamentos e repe-
tições. Estes FBRs são demonstrados na Figura 7.1.

Figura 7.1. Fotobiorreatores adaptados para cultivo de microalgas

durante o Projeto Microalgas, conforme objetivo do cul-
(b) tubos de ensaio, (c) vidros DURAN; (d) erlenmeyers
fas PET; (g) garrafas de vidro.

7.5. Fotobiorreatores hexaédricos fechados

A concepção do sistema de Fotobiorreatores hexaédricos
fechados (FHF) para o cultivo de microalgas iniciou-se através
alimentação do sistema fechado de produção de microalgas,

-
dades, possibilitando assim seu balanço volumétrico. Para isso
e Figura 7.2a).
7.5.1. Alimentação e dispositivo de coleta

Para o fornecimento do meio de cultivo dos fotobiorrea-
-
sibilitam a inserção de líquidos em unidades fechadas. Para a
-
nados pluviógrafos, que registram continuamente os volumes
descartados (Figura 7.2b). As cubas sifonadas responsáveis
-
ram por um tratamento com pintura eletrostática, as quais a
unidades, construiu-se uma estrutura metálica para servir

de suporte dos diferentes componentes dos fotobiorreato-
res hexaédricos fechados (FHF), o que permite sua repetição.
Para isto, as unidades foram dispostas lado a lado, a qual era
compota por três níveis: o superior, que comportam recipien-
tes contendo os meios de cultura para alimentação dos FHF;
hexaédricos fechados e, o inferior equipado com pluviógrafos
Neste fotobiorreator, adotou-se o cultivo semicontínuo, no

qual uma parcela do meio com microalgas é removida e subs-

tituída por um novo meio de cultura. Desta maneira, o cultivo

que permanece no fotobiorreator serve como inóculo para o
cultivo seguinte, o que tende a diminuir o tempo de produ-
ção de biomassa, sendo que a porcentagem retirada, em geral,
disso, estudou-se a remoção de diferentes percentuais, bem
A alimentação dos fotobiorreatores fechados foi através

de reservatórios, posicionados acima das unidades, onde os
nutrientes foram encaminhados por bombas de infusão volu-
que controlam os líquidos que são infundidos nos FHF, como

apresentado na Figura 7.2a.
Figura 7.2. (a) Fotobiorreatores hexaédricos fechados compostos

de três níveis: o superior, que comportam recipientes
contendo os meios de cultura para alimentação dos
FHF; o intermediário que suporta os fotobiorreatores
e, o inferior equipado com pluviógrafos para coleta e
coleta da descarga com registro do sistema fechado de

produção de microalgas

7.5.2 Produção de biomassa de Chlorella vulgaris

em fotobiorreatores fechados
Foram avaliadas três diferentes condições de cultivo nos
fotobiorreatores hexaédricos fechados (FHF), no regime semi-
do sistema de entrada dos nutrientes, através de um registro

esfera e um coletor, para descarga do material extraído. Para
-
tram continuamente os volumes coletados da biomassa, sendo
que estes foram direcionados para uma cisterna, onde se pro-
pode ser observado na Figura 7.2b.

Diante disto, este trabalho teve como objetivo cultivar a
microalga Chlorella vulgaris em fotobiorreatores hexaédricos
fechados (FHF), em regime hidráulico semicontínuo, com per-
centuais distintos de coleta da biomassa. Para isso, foram uti-
-
temas de alimentação para reposição de nutrientes e descarte
a) FHF-1: meio de cultura BBM, cuja composição foi de
do volume útil e, posterior reposição de meio novo,

não sendo controladas as condições de temperatura e
luminosidade;
com temperatura de 27°C e fotoperíodo de 12h/12h
seguido da reposição;
sem controle de temperatura e luminosidade, com re-

condições testadas. Para monitoramento do sistema, foram

avaliados o pH, a densidade óptica e contagem de células, uti-
nas unidades 1, 2 e 3 foram: 2, 4 e 3 mg L-1 dia-1, respectiva-
que o meio Oligo em FHF-3, tal fato pode estar associado à
7.6 Construção de Sistema Aberto de Cultivo

de Microalgas no Norte do Paraná
Um dos sistemas de cultivo aberto mais comuns de microal-
Este sistema é um canal de recirculação composto por uma
cultivo. A quantidade de pás que compõem o sistema depende
por minuto (LOURENÇO, 2006; BLANCO et al., 2007; CHISTI,

2007).
Para um bom cultivo, a agitação é um fator muito impor-
-
um elemento rotatório, normalmente montado em eixo hori-
A agitação também pode ser feita por meio do bombea-

mento de ar para o interior do meio de cultivo. A aplicação de
ar aos cultivos proporciona uma difusão efetiva dos nutrientes,
um aporte parcial de CO2
a manutenção das microalgas em suspensão e o cultivo uni-

formemente distribuído (COLLA et al., 2002). Para análise do

-
deração algumas variáveis como, por exemplo: tipo, forma e
quantidade de pás rotativas, relações geométricas, formação
de vórtices, velocidade de rotação do agitador, concentração e
densidade da mistura, granulometria da partícula, velocidade
de sedimentação.
Tendo em vista que um dos objetivos do Projeto Microal-
gas era a construção de sistemas abertos, apresenta-se neste
e construído, servindo como base para os ensaios de cultivo
7.6.1 Infraestrutura de apoio

O cultivo massal de microalgas necessita além dos sistemas
de produção de uma infraestrutura de apoio laboratorial, com-
alíquotas do cultivo em incubadoras, além de outras análises

do processo de produção. A planta do laboratório construído
local são apresentadas na Figura 7.3.

Figura 7.3. a, b) Laboratório de Microalgas do Instituto Agronômico

-
7.6.2 Escolha da área, preparo do terreno e

fundações
A área para instalação do sistema aberto foi escolhida em
função da proximidade com o Laboratório de Microalgas, além
de estar posicionada no sentido leste e oeste, corroborando com
a posição do sol ao longo do dia, visando possibilitar melhor
-
-
é apresentada na Tabela 7.2.

Tabela 7.2.
Atividade Volume (m3)
Corte 211,20
Aterro 64,80
Total 276,00
Após o término da movimentação de terra, corte e aterro,

iniciaram-se as atividades com a execução das fundações, utili-
uma viga baldrame, com as dimensões de 20 x 20 cm, em todo
20 cm, com profundidade de 1,0 metros. Após isto, foi reali-
das fundações e vigas baldrame armadas, para posterior assen-

tamento de tijolos de seis (6) furos e disposição de brita nas
laterais da viga, visando promover a drenagem das águas plu-
viais. Todo o material escavado manualmente foi depositado
no canteiro de obras, para posterior remoção e disposição para
readequação do canal de águas pluviais entre a plataforma do
as fundações e a estrutura de suporte foram executadas trinta

-
baldrame armada, com as dimensões de 20 x 20 cm, em todo o

perímetro das unidades.
e colocação das armaduras, para posterior preparo e instalação

das vigas baldrames. Após a retirada das formas de madeira,

iniciou-se o assentamento de tijolos para execução das pare-
des e as estruturas armadas dos pilares e lajes para suporte
das unidades. As imagens referentes às bases das unidades são
apresentadas na Figura 7.4.
Figura 7.4. a) Fundações; b) Caixaria e armaduras para as vigas

baldrame; c, d) Alvenaria de tijolos, para composição
Paraná, Londrina- PR.
7.6.3 Execução do sistema de produção aberto

-
foram devidamente pintadas, com acabamento interno das uni-

esta etapa, iniciaram-se os trabalhos de instalação da rede elé-

trica e hidráulica, bem como, dos equipamentos, composto
pelas pás rotativas, tanques de recirculação, reservatórios de
água potável, de meio de cultivo e de água clorada para assep-
sia, bem como, cilindros de CO2. Os motores e bombas são
independentes, possuindo acionamento elétrico com partida
automática, a partir do quadro de comando elétrico.
uma tubulação resulta sempre em certa perda de energia do

-
mente é dissipada sob a forma de calor. Diante disto, foram cal-
culadas as perdas de carga nas tubulações e acessórios, tanto na
como por bombeamento. No caso dos reservatórios apoiados e

enterrados, foram instalados válvulas de retenção e registros.
Visando eliminar o efeito da precipitação direta nas uni-
estrutura metálica e uma manta transparente. Além disso,

foram criadas condições básicas para recirculação do ar, com a
saída do ar aquecido pela cumeeira, promovendo a renovação
Salienta-se ainda que, em toda área ao redor das unidades

foi disposta uma camada de Brita no. 02, com 30 de espes-
sura, visando à drenagem das águas pluviais. Para as áreas do
entorno da plataforma foram plantadas gramas, para evitar os
efeitos da erosão no solo.
-
-
dados, sendo composto por quatro (4) unidades, sendo duas de

Tabela 7.3. Dimensões dos sistemas abertos de produção de microalgas.
Sistema aberto No. 01 No. 02
Quantidade (unidade) 02 02
Comprimento reto útil (m) 2,20
Raio cilindro circular (m) 0,60 0,80
Comprimento total (m) 3,40
Largura útil (m) 0,60 0,80
Nível de água (m) 0,40 0,40
Altura (m) 0,70 0,70
Volume curva (m3) 0,80
Volume central (m3) 0,90 1,61
Volume de uma unidade (m3) 3,00
Volume de duas unidades (m3) 3,00 6,00
7.6.4 Layout da plataforma de “raceways”

O detalhamento do sistema aberto para produção de micro-
algas é apresentado
são
apresentadas na Figura 7.8.

Figura 7.5. Implantação do sistema aberto de produção de microal-

gas e laboratório.

Figura 7.6. Layout da plataforma do sistema aberto de produção de

microalgas.
Figura 7.7. Cortes da rede de abastecimento de água, CO2 e nutrien-

tes.

Figura 7.8.
c) Rede hidráulica e CO2; d) Quadro de comando elétri-
co; e, f) Pás rotativas g) Reservatório de água; h) Tanque
de recirculação. Instituto Agronômico do Paraná, Lon-
drina- PR.

7.6.5 Validação do sistema de produção
sistema de
Para validação do sistema de produção massal de microal-
seguintes procedimentos:
Os inóculos iniciais foram preparados em sacos plás-
-
-se de que o inóculo proveria elevada densidade de
células;
Para aclimatação dos inóculos, estes permaneceram
por um período de 10 dias de crescimento em local
aberto;
O inóculo foi transferido para os raceways com volu-
Após 7 dias, parte do cultivo dos raceways com volu-
com volume de 3.000 L.
7.6.6 Coleta da biomassa algal, lavagem e

desinfecção do sistema de cultivo
A coleta da biomassa microalgal é outro ponto crítico

no que tange o contato direto entre os componentes
do mecanismo de coleta e o cultivo, evitando assim
sua contaminação. Para isto, as partes internas das
tubulações de descarga do sistema de cultivo devem
encontrar-se desinfectadas, sendo que, para isto, toda
rede coletora deve ser submersa em solução de cloro
-1
;
enxágue da tubulação e de toda a rede hidráulica,

através da aplicação de jatos de água, proveniente de

um reservatório de água potá -
gue com água pura das tubulações, são iniciados os
a ajuda de polímeros que promovem a sedimentação

da biomassa, após o desligamento das pás rotativas.
Nesta fase, o meio de cultivo pode ser retirado dos
sistemas de cultivo e ser encaminhado para os tanques
de recirculação, com posterior reaproveitamento;
-
temente do tipo de sistema de cultivo, são necessá-
-
to do registro na linha de descarga, visando eliminar
todos os resíduos de biomassa, através de sua lavagem
e desinfecção, para dar início a uma nova linha de
produção de biomassa microalgal;
Toda a rede hidráulica dos sistemas de produção
massal de microalgas, seja ela para abastecimento de
água e/ou meio de cultivo, alimentação, derivação,
o seu correto ordenamento de abertura e fechamen-

to dos registros, evitando assim qualquer problema
operacional.
7.6.7 Cultivo de Chlorella sorokiniana e Neochloris

oleoabundans em “raceways”
O cultivo das estirpes de microalgas niana
(IPRChs7107) e
-
-
-se como fonte de nitrogênio a ureia ((NH2)2CO), como fonte
de fósforo o superfosfato simples Ca(H2PO4) e como fonte de
ferro o cloreto de ferro (FeCl3
(C10H14N2Na2O8.2H2

foi feito com água não estéril, com pH inicial de 6,8. O inóculo
inicial foi preparado em sacos plásticos transparentes, manti-
dos em ambiente externo ao laboratório, sem controle de tem-
inóculo foi de 9,68 10 cél mL-1 de e de 4,96

10 cél mL de
-1
. Após 7 dias de cultivo, foram
-
tura ambiente, sendo mantida a agitação por bomba de água
Neubauer, determinação da densidade óptica por espectrofo-

o
C em
estufa com ventilação forçada e o teor de lipídeos por extração
com clorofórmio e metanol.
O número de células inicial das microalgas
e foi comparada com o número de células no
18º dia de cultivo (Tabela 7.4), bem como, os resultados do
pH, densidade óptica, biomassa.
Tabela 7.4. Determinação de pH, densidade óptica, biomassa e teor

de lipídeos.
Análises
9,82 10,87
DO670 nm 0,12 0,13

-1
) 0,10 0,09
Número de células
9,68 4,96
inicial (x 10 m L-1)
Número de células
16,00
final x (x 10 m L-1)

Neste trabalho constatou-se que é de fundamental impor-
produção massal.
7.6.2 Composição da biomassa da Chlorella

sorokiniana após extração de lipídeos totais
Após a extração de lipídeos, a biomassa residual, rica em
(2013) reportaram os resultados de um trabalho que foi con-

-
Chlorella
(IPR-Chls7107) para o cultivo em sistema aberto
Bold’s Basal Medium
(BBM), por aproximadamente 60 dias. Após este período, a
biomassa foi separada do meio de cultivo pela adição de poli-
cloreto de alumínio. Os lipídeos foram extraídos da biomassa
por 8 horas. A biomassa foi levada novamente à estufa por 2 h

a 60oC. Os teores de nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, mag-
nésio, carbono, cobre, manganês e ferro foram determinados
antes e após a extração dos lipídeos. A proteína e os pigmen-
pela técnica de extração com acetona, seguida de leitura em

espectrofotômetro em diferentes comprimentos de onda, obe-
decendo à mesma sequencia de análise.
a extração de lipídeos, bem como a proteína que apresentou

Tabela 7.5. Concentração (mg L-1 -

-a a e carotenoides totais na biomassa da
microalga IPR-Chls7107 ( ), antes
e depois da extração de lipídeo.
Antes Depois
Características
)
-1
a 147,02
a 187,11 298,48
Carotenoides totais 209,46
Portanto, a composição da biomassa de

após extração de lipídeos totais ainda possui nutrientes.
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PARTE 3
DESAFIOS PARA O
ISOLAMENTO, MANUTENÇÃO
E CARACTERIZAÇÃO
DE MICROALGAS

CAPÍTULO 8
COLETA, ISOLAMENTO,
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA
E MANUTENÇÃO IN VIVO DE
MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR
Diva Souza Andrade
Alexandra Scherer

Introdução
Microalgas são organismos microscópicos que primaria-
série de compostos de grande interesse comercial e para a pes-

quisa. Na área comercial, os compostos da biomassa microal-
gal possuem uma variedade de aplicações, seja na alimenta-
ção humana e de animais, na extração de compostos químicos
No campo da pesquisa destacam-se estudos sobre a ocorrên-

cia, distribuição e descrição de novas espécies. Além disso, as
-
cial de uso biotecnológico (AMARO et al., 2011).
Diversas espécies de microalgas como Botryococcus brau-
nii, , Chlorella spp. Chaetoceros mulleri,
Chaetoceros calcitrans, Chlorococcum spp., entre outras, produ-
para a produção de biodiesel, apresentando grande poten-
MATA et al., 2010; CHEN et al., 2013). Devido ao interesse por

fontes renováveis de energia, pesquisas têm sido voltadas para
a produção simultanêa de biodiesel, bioetanol e metano a par-
tir de matéria-prima de microalgas. A partir de um diagnóstico
tecnológico, sobre o potencial das microalgas para produção
de biocombustível, Antunes e Silva (2010) concluíram que por
se tratar de área tecnológica com empresas diretamente envol-
vidas com combustíveis, a proteção de patentes tecnológicas,
nesta área no Brasil, tende a crescer.
Afora os biocombustíveis, ainda existe uma demanda alta
de matéria-prima de microalgas, por exemplo, espécies de Hae-
matococcus pluvialis, Muriellopsis sphaerica, Arthrospira platen-
sis e Chlorella sp. para produção biotecnológica de compostos
como os pigmentos, suplementos proteicos, compostos com
atividade antioxidante e promotores de crescimento (MARGA-

LITH, 1999; DEL CAMPO et al., 2007; AMIN et al., 2009; FUJII
et al., 2010; FASSETT et al., 2011; ABURAI et al., 2013).
As microalgas são encontradas em diversos ambientes
aquáticos, tanto marítimos como em águas continentais ou de
interiores, e também em ambiente terrestre, diretamente no
solo ou em associação com plantas e animais. Para estudos ex
situ, existem diversos métodos de coleta (BICUDO et al., 2006),
bem como de isolamento de microalgas do ambiente, como o
uso de meio de cultivo enriquecido, isolamento de células utili-
diluição, separação por gravidade e fototaxia (ANDERSEN et

-
lamento depende do objetivo da coleta e de fatores como a
disponibilidade de equipamentos do laboratório.
A Coleção IPR de Microalgas foi formada para atender a
demanda do projeto de pesquisa intitulado Microalgas, resul-
tado de um Convênio entre o Instituto Agronômico do Paraná
(IAPAR), a Companhia Paranaense de Energia (COPEL) e a
Fundação de Apoio à Pesquisa e ao Desenvolvimento do Agro-
negócio (FAPEAGRO). O principal objetivo das coletas foi esta-
belecer uma coleção de trabalho composta por espécimes nati-
vos de ambientes aquáticos continentais do Estado do Paraná,
visando a seleção de microalgas com potencial para aplicação
prévia. Neste capítulo são abordadas de maneira sucinta as

-
ção morfológica (celular e colonial) e preservação das estirpes
para manutenção da Coleção de microalgas IPR. Esta coleção
encontra-se alocada no IAPAR, sendo composta de espécimes
-

8.1 Coleta e Preparo de Amostras para

Isolamento de Microalgas ex situ
8.1.1 Coleta de material biológico

A escolha do local e dos métodos está relacionada aos
objetivos da coleta, ou seja, o tipo de microalga a ser isolada
-
ção IPR, no projeto Microalgas foi obter diversidade quanto às
características de teores de lipídeos, pigmentos e adaptabili-
dade às diferentes condições climáticas. A coleta de amostras
-
téticas (sedimentação de resíduos), reservatórios de água doce,
lagoas naturais e tanques de piscicultura, em diferentes regiões
do estado do Paraná (Figura 8.1A e B).
As coletas de amostras foram em lagoas fotossintéticas e
de criação de peixes, em regiões representativas de diferentes
condições climáticas do Estado do Paraná. A descrição dos 10
locais de coleta nos diversos municípios, ambientes, climas e
-
-
agentes químicos ou radiação ultravioleta, conforme descrito

por Lourenço (2006). Os dados de coleta de cada local devem
ser registrados na caderneta de campo, incluindo coletor, data,
estirpes de microalgas isoladas (BICUDO; MENEZES, 2006).

-
dade de amostragem, potencial hidrogeniônico (pH), tempe-
ratura, condutividade e teor de oxigênio dissolvido, podem
ser incluídos, caso existam aparelhos de campos devidamente

-
ção inicial da espécie e posterior depósito em uma Coleção de
microrganismos. Essas informações também ajudam na esco-
pois os espécimes podem apresentar diferentes requerimentos

nutricionais, bem como a necessidade de enriquecimento adi-
cional (carboidratos, vitaminas, etc.) do meio para que ocorra
um bom desenvolvimento celular, mesmo fora do seu ambiente
natural (BARSANTI et al., 2006).
Para a Coleção IPR, as amostragens foram feitas em dupli-
cata, a uma profundidade aproximada de 20 a 30 cm e coloca-
caixas de isopor e encaminhados ao laboratório para as análi-

-
tras foram registradas no caderno da Coleção de Microalgas,
conforme padrão segundo a Federação das Coleções de Cultu-
ras Mundial (2010). O pH das amostras foi determinado, ano-
tado e as mesmas mantidas em temperatura entre 4°C e 8°C por
24-72 h, até o seu processamento.

Figura 8.1. Tipo de lagoa e locais de coleta de amostras para for-

mação da Coleção IPR de microalgas no projeto Convê-
nio Copel/Fapeagro/IAPAR. (A) Lagoa fotossintética; (B)
coletas das amostras de água. Fonte: Mapa elaborado por

João Henrique Caviglione.

312
Tabela 8.1. Localidades e características dos pontos de coleta de amostras de água no estado do Paraná para

o estabelecimento da Coleção IPR de Microalgas.
Clima Altitude
Município Ambiente Latitude Longitude
(Köppen) (m)
Lagoa
*Guarapuava Cfb 963
natural
Lagoa
*Pato Branco Cfa 704
natural
Lagoa
*Palotina Cfa 269
natural
São Mateus Lagoa

Cfb 761 °
do Sul natural
Fernandes Lagoa
Cfb °
Pinheiro natural
Pesqueiro-
Tapejara Cfa 494
lagoa
Umuarama* Represa Cfa 447
30/07/2014 09:47:36
Resíduo
Arapongas Cfa 804
suíno
Porecatu Vinhaça Cfa 364 °
Lagoa
industrial
Londrina e Chorume Cfa
de lixo
urbano
*Estação experimental do IAPAR.
313
30/07/2014 09:47:36
8.1.2 Preparo de amostras para isolamento

Nesta etapa do isolamento é possível selecionar grupos
de microalgas quanto a n -
de centrifugação (gravimétrica) permite separar as microalgas
Microalgas estes procedimentos foram testados.

-
-
nais (GRAVERHOLT et al., 2007; LI et al., 2007; ANDRADE et
al., 2008; LIANG et al., 2009; AZMA et al., 2011; CHEN et al.,
2011; FENG et al., 2011; MORALES-SÁNCHEZ et al., 2013)
-
em microalgas de determinadas espécies. Assim, a estratégia
isolamento em duas etapas. Na primeira etapa alíquotas das

amostras originais foram inoculadas simultaneamente em dois
meios líquidos de cultivo contendo sais minerais: o meio de
RIPPKA, 1988) e o meio BBM (Bold Basal Medium) no qual se
BISCHOFF et al., 1963).

Na segunda etapa do processo de isolamento, alíquotas das
amostras originais foram inoculadas em meio de cultura mine-
ral líquido BG-11 e BBM enriquecido com glicose como fonte
Para o desenvolvimento de microalgas, todas as amostras em

meios de cultura (BG-11 e BBM) e subamostras desses meios
-
s-1 -2
desses cultivos líquidos ex situ foram testadas duas formas de

isolamento simultaneamente: em tubos/frascos de 10 mL con-

tendo os meios de cultura líquidos (BG -11 e BBM) e em placas
de petri contendo os mesmos meios de cultura acrescidos de
Para obter microalgas com tamanho maior de células o

preparo das amostras para isolamento por gravimetria foi de
acordo com procedimento descrito por Lourenço (2006). Neste
terceiro procedimento, alíquotas de 100 mL de cada amostra
de água foram transferidas para frascos contendo 100 mL de
°
período alíquota de 1 mL dos cultivos foi transferida para
microtubos, centrifugadas a 2.000 g por 1 min e descartado
o sobrenadante. O pellet foi ressuspendido em meio BBM e
novamente inoculado em 100 mL dos meios BBM e BG-11, em
duplicata para cada meio. Os frascos foram então incubados
°C e fotoperíodo de 12 h
-
-
nadante da amostra por 2 a 24 h para separar células de baixa
densidade e tamanho menor de células grandes, não móveis e
de alta densidade.
8.2 Métodos de Isolamento para Obtenção de

Culturas Axênicas
A escolha do procedimento metodológico para o isola-
mento de microalgas depende da infraestrutura e disponibili-
dade de equipamentos, vidrarias e reagentes consumíveis do
laboratório.
8.2.1 Isolamento em meio de cultivo sólido

As variações dos procedimentos de isolamento em meios
de cultura sólidos são diversas, por exemplo, o da difusão em

ágar (BANERJEE et al., 2012), o espalhamento na superfície
riscos de contaminações.
Para evitar o crescimento de contaminantes, entre os agen-
tes antifúngicos recomenda-se a Ciclohexamida, a Nistatina e a
Anfotericina B. Existe relato de sucesso do uso de combinação
(coquetel) de antibióticos para descontaminação de culturas de
Pyrodinum (SANTOS et al., 2011). Na formação da Coleção IPR
-
dimentos de isolamento.
Além dos meios de cultura BG-11 e BBM sem antimicro-
)
-1
). -1
Alíquotas de cada amostra foram inoculadas por espalha-
de crescimento sob condições controladas. Um sumário das

etapas de isolamento em meio de cultivo sólido pode ser visua-

Figura 8.2. Representação das etapas do isolamento de microalgas

em meio mineral sólido: (A) amostra coletada cultivada;
-
tenção de colônia isolada da microalga; (E, F e G) foto-
microalgas em BOD da Coleção IPR de Microalgas in vivo.

procedeu-se a repicagem para outra placa de petri contendo

os respectivos meios de cultura, Destaca-se que estas colônias
apresentavam características típicas de microalgas, por exem-
(Figura 8.3A). A repicagem, ou seja, a transferência das colô-

nias isoladas para novas placas contendo meio sólido, com ou
cultivo do qual a microalga foi isolada.

De maneira geral, as microalgas cresceram melhor em
meios sem adição de glicose, possivelmente porque nestes
como fungos e bactérias (Figura 8.3A). A adição de estrepto-

micina retardou o crescimento das microalgas, mas não impe-
Contudo, a ciclohexamida além de inibir o crescimento de fun-

gos, também inibiu o crescimento de algumas das estirpes de
microalgas, nos meios nos quais foi adicionada este fungicida
-1
. Este resultado leva a conside-
rar o uso da ciclohexamida com cautela, no caso de isolamen-
tos ou mesmo de manutenção de microalgas clonais (Figura
8.3A, B, C e D).
de crescimento dos isolados em meio de cultura sólido. Os iso-

lados microbianos apresentaram aspectos de colônias com dife-
rentes colorações, além da formação de bolhas no meio solidi-
ágar, característico da produção de gases (Figura
8.4).
O isolamento de microalgas em meio sólido apresenta
-
-
nantes microbianos e, portanto, facilita a obtenção de colô-

nias isoladas. Porém, nem todas as espécies de microalgas são
assim, o procedimento de isolamento em meio líquido foi rea-
a seguir no item 8.2.2.
Figura 8.3. Placas de petri contendo meio de cultura para o isola-

mento de microalgas: (A) meio de cultura sem adição
de fonte de carbono. (B) Meio de cultura com adição
de glicose; (C) meio de cultura com glicose e acrescido
de ciclohexamida; (D) meio de cultura com glicose e
acrescido de estreptomicina, setas indicando o cresci-
mento de microalgas.

Figura 8.4. Aspectos visuais do crescimento dos isolados de microal-

gas em meio de cultura sólido em placa de petri.
8.2.2 Isolamento em meio de cultivo líquido

Para o isolamento em meio de cultura líquido, foi reali-
a cada transferência de alíquota para o próximo tubo, a densi-
de Neubauer sob microscópio óptico, o que permitiu calcular a

quantidade de diluições decimais necessárias para a obtenção
de um tubo de ensaio com uma célula.
Os tubos com as estirpes isoladas foram mantidos em
estufas nas mesmas condições das placas e, após cerca de três
dias, foi observado o crescimento das culturas. Foram obser-
vados diferentes hábitos dos isolados no crescimento em meio

Figura 8.5. Frascos de cultivos mostrando os aspectos do crescimento

de isolados de microalgas em meio líquido: (A) crescimen-
-
lado e (C) cultivo em que ocorre a formação de bolhas de
gases.

Porém, nos cultivos em meio de cultura líquido, diferente

do que ocorre nos cultivos em meio sólido, os contaminan-
observadas sob microscópio óptico.
que visualmente aparentavam sem contaminantes, um novo

-
estimular o crescimento de bactéria foi o de glicose-peptona,

K2HPO4, MgSO4, Fe2(SO4)3.9H2O, água destilada, ciclohexamida
meio Martim, contendo glicose, peptona, MgSO4, K2PO4, rosa

bengala, água destilada, estreptomicina e ágar. As placas de
petri com isolamentos que não apresentaram crescimento de
-
dos isolados puros de microalgas e foram incluídos na Coleção
IPR.
8.3 Caracterização Morfológica

-
-
cada estirpe de uma coleção de microalgas é etapa essencial e
das células, as estirpes de microalgas foram inoculadas em

meio de cultura líquido (BBM ou BG11) e mantidas em cresci-

As estirpes IPR de microalgas foram observadas em relação à

morfologia celular, tipo de talo, tamanho, cor e as informações
estão apresentados no Volume III desta coleção. As característi-
-
las das estirpes de microalgas da Coleção IPR são apresentadas
no Volume III desta coleção.
Figura 8.6.
colônias em meio de cultura sólido das microalgas da
Coleção IPR.

8.3.1 Morfologia de colônias de microalgas em

meio sólido
A morfologia das colônias das estirpes de microalgas, cia-
-
ção de colônias bacterianas, sendo estas características obser-
foi descrito para microalgas, contudo esta análise pode contri-

buir como mais um fator para a diferenciação entre estirpes.
2 mm; em formato puntiforme, irregular e circular; com eleva-

ção convexa ou plana; com borda inteira ou denteada, ondu-
lada e irregular; superfície lisa e rugosa, de consistência úmida
e seca; mucosa e não-mucosa, translúcida e opaca e de colora-
ção verde e amarela.
8.3.2 Caracterização morfológica celular
microalgas em meio BG-11 líquido (pH 7,0), cultivadas entre
°C.
fotografadas ao microsc
-
-
crever microalgas (BICUDO; MENEZES, 2006; GUIMARÃES;
AMARAL; SANTOS; SANTOS, 2009). As características celu-
lares avaliadas foram: presença ou ausência de núcleo organi-
forma da célula (circular, oval, cilíndrica, elipse, fusiforme,
Os formatos predominantes de células das estirpes IPR

foram esféricas, elipsoides, falcadas e algumas fusiformes com

-
gura de 0,2 a 6 . A estrutura de talo predominante foi unice-
lular com ocorrência de talos coloniais e cenobial. Os isolados
com ausência de núcleo, Divisão Cyanophyta, foram aproxima-
ao grupo Chlorophyta, com presença de núcleo. A diversidade

de talos e formatos celulares observada nos dois grupos é des-
crita na Figura 8.7. Mais detalhes das estirpes da coleção são
apresentados no Volume III desta coleção.
Figura 8.7. Diversidade fenotípica de microalgas isoladas de águas

continentais no estado do Paraná.
-
malina- álcool- ácido acético (FAA). A escolha do método foi
devido às vantagens deste agente químico, o qual é um bom
compostos químicos não é recomendada para espécimes de

Acetabularia. A Coleção IPR de
microalgas não contempla este gênero.

8.3.3 Análise de diversidade morfológica de

colônias e celulares
No início da formação da Coleção IPR, sessenta isolados
de microalgas provenientes de lagoas e pesqueiros foram obti-
Cyanophyta) e eucariotos (Divisão Chlorophyta). Com base nas

-
sentavam uma elevada diversidade. Quarenta e uma amostras
Chlorophytas, 26 isolados Chlorella

sp., sete isolados como Scenedesmus sp. e quatro isolados como
Chlamydomonas sp. Dois isolados de Cyanophyta foram identi-
Synechocystis. A diversi-
dade da coleção pode ser observada no dendrograma da Figura
8.8, o qual apresenta o agrupamento das microalgas Chloro-
phytas, de acordo com as análises morfológicas coloniais e
celulares.
-
de acordo com o número de estirpes presentes em cada grupo
et al., 2001). Com base nas características fenotípicas foi possí-

-
gas da distancia Euclidiana (Figura 8.9). Os índices de diver-

Figura 8.8. Dendrograma representando a diversidade fenotípica

de estirpes de microalgas da Coleção IPR (Cyanophyta
e Chlorophyta), isoladas de águas continentais no esta-
a localidade de origem do isolamento. U=Umuarama,

T=Tapejara, L=Londrina.
8.4 Preservação dos Cultivos Unialgais ex situ

A preservação de cultivos unialgais é condição essencial
para a continuidade dos estudos com espécies de microal-

gas. Com base

com os isolados da Coleção IPR. Day e Stacey (2008) desta-
de material biológico de valor nas Coleções, ou como atual-
e manutenção de material puro; autenticidade do material, isso
dos dados diretamente relacionados a cada material estocado.

Estes requisitos facilitam a manutenção da qualidade e a acre-
ditação de uma C
8.4.1 Cultivos de microalgas in vivo

Após o isolamento e sucessivas repicagens para obter estir-
pes unimicroalgais, essas são mantidas em duplicata em tubos
triplicata em tubos contendo meio líquido (Figura 8.9).
Figura 8.9.
os tubos da Coleção IPR de microalgas. Iluminação de
°C.

à Divisão Cyanophyta são mantidas em meio de cultivo BG -11

e as estirpes pertencentes à Divisão Chlorophyta são mantidas
em meio de cultivo BBM.
Conforme a revisão apresentada no capítulo 2 do Volume I
desta obra, a conservação de espécies de microalgas ex situ em
coleção em condições de cultivo requer tempo e pessoal trei-
nado para observação constante. Na manutenção das estirpes
da coleção IPR foram adaptados muitos dos protocolos des-
Para evitar o rápido crescimento das microalgas isoladas, os

tubos são mantidos em condições subótimas, em incubadora
°C. Estes
de contaminantes e ou necessidade de repicagem em função

da idade do cultivo. Aqueles com contaminação e/ou com
idades superior a seis meses são submetidos ao processo de
descontaminação por repicagem sucessiva e ou lavagem de
células.
-
ção de contaminantes nos cultivos implica na repicagem em
recuperação da célula algal original. Em casos de grande con-

taminação do isolado, quando não é possível a recuperação do
cultivo pela obtenção de uma colônia isolada na placa, outras
metodologias envolvendo antimicrobianos/lavagem de células
precisam ser empregadas. Os procedimentos metodológicos
são descritos a seguir:
1. Alíquotas do tubo original são acondicionadas em

microtubos e centrifugadas para a concentração das
-
tivo meio de cultivo para eliminação de metabólitos
celulares e parte dos microrganismos contaminantes.

Em seguida, as células são ressuspendidas em meio

contendo fungicidas e/ou bactericidas, de acordo com
o contaminante encontrado. Depois de incubadas por
48 h sob condições ótimas de cultivo, as células são
novamente lavadas com meio de cultivo e inoculadas
BBM), em triplicata.
2. Nos casos em que o uso de um único antimicrobiano
-
tenção de colônias isoladas de microalgas, são neces-
sárias incubações em série, com diferentes antimicro-
bianos e, consequentemente, sucessivas repicagens em
é em média de seis dias, a descontaminação de um

único isolado pode durar semanas. Em função disso,
metodologias adicionais de preservação foram testa-
das para uma manutenção menos trabalhosa e mais
-
peraturas menores do que 20°C e luminosidade menores do
-2
multiplicação celular tanto quanto o desejado. Considerando

as replicatas e necessários, o número de isolados da
semanal de cada um dos tubos e transferências para novos

meios de cultivos, o trabalho para manutenção da coleção é
considerável.
Para aumentar o intervalo de tempo entre as repicagens
de microalgas da Coleção, adicionou-se uma nova variável que
foi diminuir a disponibilidade de nutrientes no meio de cul-

objetivo, quatro estirpes morfologicamente diferentes: Pseu-

dochlorella pyrenoidosa (IPR-Psep7036), Desmodesmos opolien-
sis (IPR-Deso
do meio BBM. Ao longo de 90 dias foram determinados o pH,
-
rimento.
Para a estirpe IPR 7007, a fase de declínio no desenvolvi-
após a inoculação, mas predominantemente no 60° dia para as

demais estirpes, independente da concentração de nutrientes
no meio de cultivo (Figura 8.10). Maior número de células foi
dias.
Figura 8.10. Curvas de desenvolvimento de microalgas estirpes,
concentrações de Meio Basal de Bold.

De maneira geral, o pH dos cultivos variou de 6,8 a 9,1,
após a inoculação. Em relação à biomassa obtida nos diferentes
nutrientes apenas a estirpe IPR-Psep7036 apresentou biomassa
Figura 8.11. Biomassa de células de microalgas (g L-1) de estirpes

IPR em Meio Basal de Bold com diferentes concentra-
ções de nutrientes após 90 dias de cultivo.
-
tivo BBM diluído para manutenção de estirpes de microalgas
células. Embora a menor concentração de nutrientes no meio

de cultura não tenha possibilitado a redução do intervalo de
tempo entre as repicagens, possibilita a economia de reagentes
A reciclagem de meios de cultura pode ajudar a diminuir

os custos de cultivo, uso de nutrientes valiosos que podem
ainda permanecem no meio após o uso e torná-lo um sistema
de produção sustentável. Todavia, em trabalho recente, Rocha

e colaboradores (ROCHA et al., 2014) relataram os efeitos do

Scene-
com suplementação ou não de nitrogênio
e fósforo ou com todos os nutrientes da composição do meio.
Os resultados mostraram que todos os nutrientes devem ser
adicionados ao meio, em cada nova inoculação. De acordo com
os resultados apresentados, pelo menos três usos do meio de
-
para produção de determinados compostos devido alterações

da composição bioquímicas das células de -
cauda.
8.4.2 Cultivos in vivo por congelamento a

ultrabaixas temperaturas
O processo de manutenção contínua de estirpes unialgais
crescendo ativamente durante longos períodos de tempo é mui-
-
ganismos, nas suas diferentes variações, é uma alternativa, pois
permite mantê-los em um estado estacionário de desenvolvi-
mento, possibilitando maiores intervalos entre as replicações
das culturas.
O método de congelamento mais citado na literatura para
preservar microalgas viáveis é o de criopreservação com nitrogê-
nio liquído a ultra-baixas temperaturas (HUBÁLEK, 2003; PONCET
et al., 2003; DAY et al., 2007; ZHANG et al., 2009). Porém este é
também o método mais oneroso, desta maneira, optou-se por testar
métodos de congelamento mais simples com temperaturas de -80°C.
-
gelamento de microrganismos, destacando-se o congelamento das
estruturas celulares, o que pode levar à lise celular e consequente

celulares foram extensivamente estudados (HUBÁLEK, 2003; PON-

CET; VÉRON, 2003; DAY; LORENZ; WILDING; FRIEDL; HARDING;
PRASCHOLD; BRENNAN; MÜLLER; SANTOS; SANTOS; OSÓRIO;
AMARAL; LUKEÄOVÃ¡; HROUZEK; LUKEÅ¡; ELSTER; LUKAVSKY;
PROBERT; RYAN; BENSON, 2007; ZHANG; ZHANG; WANG; YANB;
WANG, 2009). Para a criopreservação das estirpes na Coleção IPR
foram adotadas algumas considerações práticas apresentadas para
eucariotos (REED, 2008).
Assim, para facilitar a manutenção da Coleção IPR estabelecida
ao longo do projeto, foram testados o congelamento, com criopro-
representantivos das estirpes de microalgas isoladas. Foram testados

crioprotetores em diferentes concentrações, bem como a preservação
de cultura em diferentes estágios celulares.
Para os testes de preservação, as estirpes de microalgas
fases do desenvolvimento, entre 10 e 18 dias. Para os testes

de congelamento das estirpes da Coleção IPR, a escolha dos
crioprotetores foi com base em diversos resultados para micro-
algas, incluindo cianobactérias e eucariotos (DAY et al., 1999;
TAYLOR et al., 1999; PONCET; VÉRON, 2003; DAY; JOHN et
al., 2007; CHETVERIKOVA, 2012; RASTOLL et al., 2013). Nos
Metanol (MeOH) e Dimetilsulfóxido (DMSO), nas concentra-
pós-congelamento foram adaptadas da metodologia publicada
protocols.aspx) e estão descritas na Tabela 8.2.

Tabela 8.2. Protocolos de preservação de células por congelamento
Etapas da Forma de preservação das células algais

preservação e
recuperação
Cultivo em Suspensão Cultivo em meio
das células
meio líquido de colônia sólido inclinado
microalgais
Meio de
cultivo/
período
BBM líquido BBM sólido BBM sólido BBM líquido

30 dias 10 dias 10 dias
Concentração
de células
Coleta de
células
Centrifugação e lavagem por

-
com meio centrifugação
e lavagem
com meio.
Leite
Preservante
MeOH e DMSO MeOH e DMSO desnatado
Repouso 30 min Repouso 30 min Repouso 30

min.
Congelamento
-20°C/ 18 h e -20°C/ 18 h e -20°C/ 18 h e

-80°C -80°C
Descongelamento
Gradual até o
Banho-maria a 37°C/ 2
descongelamento
min. e sob leve agitação. -
em banho de gelo
após 70 dias

1. Descarte
de meio com
preservantes e
1. Centrifugação e lavagem adição
com meio fresco; de meio fresco;
2. Repouso por cerca de 3 2. Repouso por 1. Adição
Preparo para h sob penumbra; cerca de 3 h sob de meio nas
Cultivo. 3. Centrifugação e lavagem penumbra; ampolas
com meio fresco; 3. Incubação e contato
4. Adição de meio às durante 2 h.
células lavadas. fotoperíodo
de 12 h para
recuperação do
tapete de células.
1.
Transferência
plugs
de algodão
para placas
1. Inoculação em
1. Inoculação em BBM de petri
BBM sólido;
sólido líquido fresco em contendo
Forma de 2. Incubação
maiores volumes; meio de
cultivo.
cultura BBM
fotoperíodo de
fotoperíodo de 12 h. sólido;
12 h.
2. Incubação
fotoperíodo
de 12 h por
A percentagem de estirpes IPR recuperadas, após preser-

°C é apresentada
na Tabela 8.3.
As células viáveis das quatro estirpes testadas, IPRPse
p-7036; IPR Des o e, IPR 7007 foram recu-
peradas tanto das culturas descongeladas como dos subcultivos
-
ção (Tabela 8.3). As fotos de cada etapa dos procedimentos

de preservação e recuperação de células algais, submetidas a

congelamento a ultrabaixas temperaturas, são apresentadas na
Figura 8.12.
Tabela 8.3. Porcentagem de recuperação de estirpes de microalgas
preservação.
IPR Pse p IPR Des o IPR M IPR M

Condição
70361 2
70603 70073
0 0 100 100
MeOH
10 0 0 100
Cultivo em
meio líquido
0 0 100 100
DMSO
10 0 0 100 100
0 100 100 100

MeOH
10 0 100 100 100
Suspensão
de colônia
100 100 100 100
DMSO
10 100 100 100 100
0 0 100
MeOH
10 0 0 100 100
Cultivo em
meio sólido
0 33,3 * 100
DMSO
10 0 100 * *
Leite
10 0 66,3 33,3 33,3
desnatado
1
Pseudochlorella pyrenoidosa, 2Desmodesmos opoliensis, 3Não determinado. *Ausência de crescimento
completo do tapete de células antes do congelamento.

Figura 8.12. Representação com fotos das etapas da recuperação de

células microalgais criopreservadas: a) placas de petri
com colônias de microalgas recuperadas de congela-
mento com criopreservantes a partir do tubo descon-
c) microtubos com BBM sólido contendo microalgas na

superfície do meio e cobertos com meio líquido adicio-
nado de criopreservantes; d) ampolas com microalgas
contendo BBM sólido após recuperação das microalgas

A recuperação de células viáveis de cada estirpe de microal-

gas preservada por congelamento a partir de tapete de células
coberto com BBM líquido adicionado de criopreservantes foi
possível para três das estirpes testadas (Tabela 8.3).
foi possível somente para a estirpe IPRPsc7036. Contudo, foi

-
Deso
-
servação.
Foi observado regeneração das células microalgais nos
quatro tratamentos de preservação testados. Maior quantidade
de tubos contendo culturas regeneradas foi constatada para o
isolado IPR M7007. Porém, para a estirpe IPR Pse7036 não
houve regeneração de células em nenhum tratamento. Todos
manter a viabilidade das estirpes representativas de gêneros

como Desmodesmus e Pseudochlorella, após diferentes tempos
de congelamento. Até o momento, a preservação usando o
congelamento a -80°C em meio líquido, acrescido de criopre-
servantes na suspensão de células a partir de colônia isolada
Os criopreservantes DMSO e MeOH não causaram efeitos

deletérios nas estirpes dos gêneros Desmodesmus e Pseudochlo-
rella, após diferentes tempos de congelamento. Contudo visando
diminuir os riscos de perda dos isolados pelo congelamento, os
métodos devem ser escolhidos de acordo com as características
biológicas de cada isolado ou estirpe de microalga. Dado que
o método de preservação deve ser escolhido de acordo com
características biológicas de cada estirpe, este estudo deve ser
uma rotina em uma coleção de microalgas.
Para aumentar a estabilidade de microalgas, outros trata-
mentos nos cultivos de células podem ser administrados. Nas
estirpes da Coleção IPR não foi testado o tratamento com emul-

sões de água e óleo. Todavia, é um procedimento útil e de

baixo custo (FERNÁNDEZ et al., 2014). Esses autores relataram
também que que a viabilidade das células de ,
que receberam um tratamento de aclimatação de 24 h, entre
sobreviveram em média acima de 100 dias a mais do que as

células que não receberam a aclimatação. As emulsões prepa-
radas com cresceram em meio contendo 29,7
mM de KNO3, 1,66 mM de MgSO4 4
e
2H2O, com densidades de células viáveis mais elevados depois
cultivadas em meio contendo 9,90 mM de KNO3 e 0,20 mM

MgSO4 7H2O sem FeSO4 2H2O.
8.6 Viabilidade Celular, Uso de Corantes Vitais

e Contagem nas Células Viáveis
viabilidade das células é uma atividade que facilita o estabele-

cimento da época de repicagem dos cultivos. Para determinar
o número de células viáveis/inviáveis nos cultivos de microal-
gas, as contagens de células de microalgas, coradas ou não,
8.6.1 Contagem de células viáveis de microalgas

Para medidas de crescimento microalgal, Lourenço (2006)
descreve em detalhes os diversos métodos de contagem direta
por microscopia, com auxilio de equipamentos contadores
automaticos de particulas entre outros procedimentos alterna-
tivos.
No geral, o método da gota na placa (Drop plate) pode ser
usado para determinar o número de células viáveis de micror-
ganismos em suspensão em um volume conhecido. Com a dis-

tribuição da amostra em gotas, a contagem de colônia pode ser

feito de forma mais rápido e com mais precisão. Algumas téc-
-
terior espalhamento da amostra diluída em um volume total
de 0,1 mL ou 0,2 mL por placa. Assim para essa metodologia,
Herigstad e colaboradores (2001) determinaram:
i) o desvio padrão da estimativa da densidade bacteria-

na;
iii) o delineamento ótimo da placa de gota;

iv) as vantagens do método da gota em comparação com
o método padrão de espalhamento em placa.
Os autores concluiram que a metologia foi adequada. Nos
viaveis no projeto Microalgas, optou se pela metodologia de

contagem de células (UFC) e o procedimento de placa de gota
(Drop plate
8.6.2 Testes de viabilidade celular de microalgas

com corantes azul metileno
Nos estudos com microrganismos procariontes e eucarion-
métodos desenvolvidos até agora para diferenciar células viá-

veis e não viáveis apresentam limitações importantes, como:
longo tempo de execução, resultados imprecisos e ainda alto
custo.
Determinados corantes agem apenas sobre as células vivas
-
culturas de células têm sido voltados para microrganismos pro-

mais ampla ainda não tem sido relatada.

-
que adquirem uma coloração amarelada, podendo ser absor-
-
vas/desnaturadas (BONORA et al., 1982; SMART et al., 1999).
Estes autores relataram a aplicação de uma metodologia sim-
quantitativas de células lesadas em populações de microrganis-

mos tais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutinis e
-
minada através da medição, a 664 nm, da densidade óptica
metileno, durante 6 min, uma condição que não afeta a inte-

gridade das células, conforme determinado pelo consumo de
oxigênio e de liberação de íons de potássio. Esta técnica é mais
rápida e mais simples do que os métodos clássicos de tintura-
-exclusão e de contagem em placa.
A técnica de observar a viabilidade celular mais ampla-
sob microscópio. Para avaliar a viabilidade celular de euca-
Tripan, comparando-se com a marcação com aneura v e iodeto

de propídeo, bem como por meio da análise com citometria
-
quer forma, o cálculo do percentual de células viáveis no tubo

da coleção auxilia na tomada de decisão de qual é a época

apropriada para a repicagem do cultivo para que não ocorra a
in vivo, no
procedimento de contagem foi adotado a metodologia com o
8.13).
Figura 8.13.
apresentam coloração amarela enquanto as mortas
8.6.3 Medidas de viabilidade e observações

microscópicas
Quando se trabalha com microrganismos, na maioria das
-
pensão preparada. Uma das formas mais comuns de se obter

esta estimativa é através da contagem ao microscópio, utili-
-
-Hausser. No caso das microalgas do projeto a opção foi pela
espécimes da Coleção IPR.
um indicador de viabilidade de culturas após criopreservação.

Com base neste conceito, no procedimento metodológico uti-
corante são combinados e deixados em repouso em um tubo

-
-
bauer melhorada), para facilitar a contagem sistemática. A
percentagem de células observadas que retiveram a sua cor
verde original foi calculada e relatado como a porcentagem da
viabilidade da cultura (CRUTCHFIELD et al., 1999). Estes auto-
res relataram ainda a técnica do espalhamento em placas de
Chlamydomonas sp. com con-

centração de 4x10 células mL foram espalhadas no meio de
3 -1
nu dentro de 2 semanas após a inoculação. Esse procedimento

metodológico simples é de baixo custo e pode ser aplicado roti-
neiramente na maioria dos laboratórios para a manutenção de
uma Coleção de Microalgas.

8.7 Registro/Depósito das Estirpes para

o Estabelecimento da Coleção IPR
de Microalgas
O processamento das amostras coletadas em águas con-
tinentais do estado do Paraná resultou na obtenção de mais
de Microalgas do Laboratório de Microbiologia de Solos do
a viabilidade, percentual aceitável para coleções de microrga-

nismos, desta maneira, a coleção atualmente conta com apro-
ximadamente 136 estirpes IPR.
-
Coleção de Algas da Universidade do Texas, EUA. As estirpes

adquiridas foram: Botryococcus braunii Chlorella
protothecoides Chlorella minutissima
e -
cidade de produção de lipídeos, e Haematococcus pluvialis
Muriellopsis sphaerica -
dade de produção de pigmentos.
pela sigla (acronomin) IPR- seguido da letra M de microalga,

porque a Coleção foi incluída no Biobanco de microrganismos
de interesse do Agronegócio Biotecnológico do Instituto Agro-
nômico do Paraná, seguido do numeral arábico sequencial ini-
foram incluídas as duas letras ou três iniciais do gênero, uma

-
mente, as informações referentes a cada estirpe da Coleção IPR
de microalgas foram apresentadas em um catálogo impresso
online em www.
.

obter estirpes unialgais e manter nestas condições sem conta-

minantes por longos períodos.
menos separar estirpes de microalgas pertencentes aos grupos

Cyanophyta e Chlorophyta.
Testes com diferentes antibióticos e concentrações deverão
é uma característica de cada estirpe e não apenas do gênero e/

ou espécie.
Exame sistemático dos espécimes de uma Coleção in vivo
trabalho rotineiro e não perder material genético importante.
A meta no Projeto Microalgas de estabelecer uma coleção

de espécies adaptadas às condições paranaenses foi alcançada.
Algumas dessas estirpes podem ser novas espécies e após des-
coleções internacionais.
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CAPÍTULO 9
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
DE MICROALGAS
Diva Souza Andrade

Juscélio Donizete Cardoso
Rafael Bruno Guayato Nomura
Krisle da Silva

Introdução
O nome Microalgas genericamente designa membros de
um grupo diverso de microrganismos (eucariotos e procario-
terrestre. O recente aumento no interesse pela exploração bio-

tecnológica das microalgas como fonte de matéria prima para
produção de bioenergia decorre de uma série de vantagens,
tais como: o crescimento rápido desses microrganismos, a alta
produtividade de biomassa com acúmulo de lipídeos e a produ-
ção de pigmentos e proteínas de qualidade. Os avanços atuais
-
potencial para produção de biocombustíveis, como também na

busca de novos produtos biotecnológicos.
IPR, a abordagem polifásica foi adotada. Nessa abordagem são

usados não apenas métodos citológicos, mas também técnicas
moleculares, como ferramentas auxiliares na análise genética
dos espécimes. Entre as técnicas moleculares empregadas na
reação da polimerase em cadeia (PCR) com iniciadores uni-

versais para os genes ribossomais 16S e 18S rRNA, para regi-
sequenciamento parcial dos genes ribossomais. Essas técnicas
de espécies de microalgas isoladas de águas continentais no

estado do Paraná. Assim, a ênfase neste capítulo é discutir os
resultados obtidos com a aplicação de algumas destas meto-
-
Índices de diversidade,
calculados com base da análise do perfil de polimorfismo do
material bio
de microalgas IPR.

9.1 Caracterização das Estirpes da Coleção

IPR de Microalgas
dos isolados unialgais e
análises de morfologia celular da Coleção IPR, procederam-se
-
-
pes entre procariotos e eucariotos da Coleção de Microalgas,
nove municípios do estado do Paraná.

Em relação aos estudos genéticos, as estirpes da Coleção
destas microalgas. Este capítulo tem por objetivo apresentar os

principais resultados destes estudos básicos sobre as caracterís-
ticas genéticas das estirpes da Coleção de Microalgas IPR.
9.1.1 Análise BOX-PCR para caracterizar estirpes

de microalgas
Os métodos moleculares permitem gerar uma grande
quantidade de informações sobre a identidade genética, diver-
uma Coleção. Com o advento de técnicas de Biologia Molecu-

-
-
um grande avanço nos estudos sobre genética e taxonomia dos

microrganismos, incrementando a velocidade de obtenção dos
resultados e o nível de precisão dos dados (VARGAS et al.,
1997; ABOU-SHANAB et al., 2011). Dentre esses métodos, é
-
No cromossomo bacteriano, são encontradas regiões inter-

ser REP ( ) ou ERIC ( -

terial Repetitive Intergenic Consensus
padrões com maior quantidade de fragmentos, que pode ser

-
-A1R (LOUWS et al., 1994; VERSALOVIC et al., 1994). Essa
característica representa um importante marcador molecular.
-
Este polimo
Figura 9.1.
IPR, isoladas de águas continentais de diversas regiões
-
-7020; -7021; -7178 (22); -7179 (23); -7033; -7048;
-7067, -7068, -7188 (69), -7070, Marcador Molecular 1

Kb Plus DNA Ladder e a microalga -
dans

O dendrograma resulta de uma análise estatística de deter-

minados dados, em que se emprega um método quantitativo
que leva ao agrupamento das estirpes. Os resultados dos per-
e variáveis, facilitando as interpretações. Para o agrupamento

das estirpes de microalgas pertencentes à coleção IPR, foram
-
-
grama BioNumerics (Applied Mathematics, Kortrijk, Belgium, v.
uma estirpe de
como referência. Neste grupo de 98 estirpes IPR, isoladas de
águas continentais de nove localidades do Paraná, observa se
grande diversidade genética (Figura 9.2).
No dendrograma foi possível observar a tendência de agru-
pamento das estirpes de acordo com a origem de isolamento,
destaque para as estirpes isoladas de lagoas de Palotina, Tape-
jara, Fernandes Pinheiro, Londrina, Umuarama e Pato Branco,
observadas nos clusters.

Figura 9.2.
isoladas de águas continentais no Paraná.

A análise de agrupamento das estirpes de microalgas com

-
-
-
grupos, todos compostos por menos de duas estirpes (Figura
similaridade dentro dos grupos, o que representaria isolados

idênticos, mas apenas agrupamentos de estirpes em diferentes
níveis de similaridade, de acordo com a localidade de origem
das amostras (Palotina, Tapejara e Pato Branco, PR).
genéticos das estirpes de cianobactérias, que podem ser utili-
e monitorar possíveis contaminações na Coleção. Entretanto,
considerar abordagens complementares, por exemplo, análise

com marcadores quimiotaxonômicos (lipídeos, pigmentos e
de estirpes/isolados que apresentam elevada diversidade mor-

fológica e genotípica.
O resultado do agrupamento das estirpes eucariontes
resultou na formação de quatro agrupamentos, sendo que um
deles se destacou pela elevada quantidade de estirpes (Figura
foi observada a formação de quarenta e nove grupos, todos

contendo poucas estirpes. Não foi observado agrupamento
-
mas estirpes foram agrupadas em diferentes níveis de simila-
ridade, de acordo com a localidade de origem do isolamento,
com destaque para as microalgas provenientes de Umuarama
e Tapejara, que apresentaram uma maior similaridade e, por-
fenotípica essas estirpes IPR, também se agruparam com base
SCHERER et al., 2013).

Figura 9.3. Dendrograma genético do agrupamento das estirpes IPR
IPR da coleção e o local de origem da amostra.
-
bactérias com material depositado na American Type Culture
Collection -
-
culares Bittencourt-Oliveira e Piccin-Santos (2012) propuse-
ser apenas com o uso de caracteres morfológicos. Isso reforça

a necessidade do uso de análises moleculares como uma fer-

Figura 9.4. -
rético do DNA das estirpes de microalgas (eucariotos)
acordo com o local de origem da amostra.

-
-
algas eucariontes, apresentando a mesma característica de ser
-
ção polifásica. Técnica similar com iniciadores ERIC e REP foi
em estudos genéticos
e isolados
simbiontes da angiosperma Gunnera sp. Os autores concluíram
que o método é adequado como para agrupar estir-
pes entre e intraespécies; todavia, devido à presença comum
dessas sequências em muitas bactérias, culturas axênicas são
temperatura de anelamento do termociclador, o tempo e volta-

gem de corrida eletroforética e a concentração da agarose no
gel. Para o rastreamento da possível contaminação microbiana
com em fontes de água, Yang e colaboradores
concentrações de DNA e a adição de albumina de soro bovino

(BSA). Essas são alternativas que podem ser aplicadas na otimi-
morfológicos de vinte estirpes de . O RAPD (Random

-
cação do DNA com iniciadores com poucas bases e que ampli-
-
-
ção de estirpes. Os autores relataram grande heterogeneidade
entre as estirpes de , porém, em geral não foram obser-
-

os dados morfológicos não correspondem necessariamente aos

dados genéticos na maioria dos casos e a análise de agrupa-
mento com base em RAPD multiplex, isto é, com mais de um
iniciador, mostrou um bom ajuste, revelando o poder discrimi-
natório desta técnica.
Valério e colaboradores (2009) observaram uma associa-
ção altamente congruente entre os agrupamentos em STTR e
LTRR ( )
três ordens de cianobactérias: Chroococcales, Oscillatoriales
-
dade destes microrganismos dentro de um reservatório de água,
indicando o seu potencial para uso como um controle de gestão
Normativa 13 do Ministério da Agricultura e Pecuária.
9.1.2 Diversidade genética de estirpes

de microalgas
-
de acordo com o número de estirpes presentes em cada grupo
al., 2001). Os valores médios dos índices são apresentados na

Tabela 9.1.
Tabela 9.1.

de Microalgas IPR.
Índices
N*
Grupos
Margalef
Menhinick
Localidades
Tapejara B 4 27 0,4636 0,8744 0,7698 0,9102 0,6308 1,298
Menor 2 27 0,3937 0,2606 0,4792 0,3849 0,3034 0,4988
Maior 4 27 0,7394 0,6063 1,106 0,7698 0,9102 1,298
Pato
A 3 11 0,686 0,314 0,6002 0,8341
Branco
Menor 1 11 0 0 0 0 0,2673
Maior 3 11 1 0,9949 0,8341
Palotina A 4 10 0,3 0,7 1,28 1,303 0,9232 2,471
Menor 2 10 0,26 0,46 0,673 0,4343 0,7298

365
30/07/2014 09:47:40
366
Maior 4 10 0,74 1,366 1,303 0,9912 2,471

Umuarama A 17 0,308 0,692 1,213 1,412 0,8484 2,387
Menor 3 17 0,2318 0,4637 0,8083 0,7276 0,6608
Maior 17 0,7682 1,213 1,412 0,9664 2,387
Nova
A 4 12 0,3472 1,199 1,207 0,8648 2,101
América
Menor 2 12 0,2639 0,4024

Maior 4 12 0,7361 1,207 0,9808 2,101

N*= número de estirpes de microalgas formado em cada grupo.
30/07/2014 09:47:40
observados nas localidades de amostragem Palotina, Umua-

rama e Nova América, respectivamente. A equitabilidade
Palotina (Tabela 9.1). A relação entre a diversidade genética
Pela análise de morfologia celular foram observadas gran-

des diferenças com alta diversidade fenotípica em um grupo
(SILVA, 2010; SCHERER et al., 2013). Valério e colaborado-

res (VALÉRIO; CHAMBEL; PAULINO; FARIA; PEREIRA; TEN-
REIRO, 2009) aplicaram técnicas moleculares em 118 ciano-
bactérias, provenientes na maior parte de reservatórios de
-
rpoC1. Baseado
em número de isolados por agrupamento hierárquico de M13
mostraram uma elevada diversidade dentro de todas as espé-

cies, sendo com índices de diversidade
os mais elevados (D = J ‘= 0,99).
9.2 Agrupamento de Estirpes de Microalgas

pela Técnica PCR-RFLP
Outra possibilidade de agrupamento dos isolados de
microalgas é o emprego da técnica de PCR-RFLP (Restriction
) que é baseada na restrição de
um fragmento de DNA por endonucleases. Essa metodologia
tem sido associada a PCR, conhecida como PCR-RFLP, que é

-
térias (LU et al., 1997; BOLCH et al., 1999; LYRA et al., 2001;
ITEMAN et al., 2002; BITTENCOURT-OLIVEIRA et al., 2009).
microalgas, um grupo de 16 estirpes de microalgas com pre-

sença de núcleo, da Coleção IPR, foi selecionado com base nas
-
-
et al., 2002). Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com

a endonuclease de restrição MspI (= Hpa
Figura 9.5.
Msp
=marcador -1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen™). Li-
nha 1 = IPR-7002; 2=-7002; 4=-7004; 6=-7006; 7=
-7007.

Com base na técnica de PCR-RFLP do gene 18S rRNA, essas

16 estirpes de microalgas da Coleção IPR foram agrupadas
em três grupos principais e cinco subgrupos (Figura 9.6). Seis
pares em três grupos distintos. A estirpe IPRM 7002 separou-se

das demais. Cabe salientar que tanto o 16S, quanto o 18S rDNA
permite o agrupamento das microalgas em nível de gênero ou,
Figura 9.6.
-
MspI. Dendrograma

LYRA et al. (1997) estudaram estirpes tóxicas e não tóxicas
proteínas SDS-PAGE de células inteiras e de PCR/RFLP do gene

16S rRNA. O RFLP do gene 16S rRNA com estirpes de referên-
cia mostrou ser um bom método para a taxonomia de ciano-
bactérias, separando estirpes sem heterocistos das estirpes com
Em busca de marcadores moleculares universais, pesqui-

sadores demonstraram a utilidade do RNA ribossomal, especi-
e eucariotos. Os principais motivos dessa escolha se devem ao

fato de que estes genes são encontrados em todos os organismos
-
cial. Além disso, estes genes expressam estruturas secundárias
altamente conservadas, que são consideradas para o alinha-
mento correto das sequências destes genes. São componentes
principais da estrutura dos ribossomos e, portanto, abundantes
-
tes das sequências nesses genes evoluíram em taxas diferen-
vários níveis de resolução taxonômica (WOESE et al., 1977;

WOESE et al., 1990).
-
,
sequenciamento de 16S rRNA, Southern blotting do DNA total,

REP- e ERIC-PCR, ribotipagem e testes fenotípicos. Os grupos
genéticos foram apoiados por uma propriedade fenotípica, a
de célula das estirpes não foram diferentes nos dois grupos

genéticos. Sequências do gene 16S rRNA indicaram que todas
as estirpes de estavam fortemente relacionadas, ape-
sar de suas diferentes origens.

9.3 Análise de Genes Específicos

e ) foram
barcoding.
-
blemas, incluindo a não homologia ( ) e heterogeneidade
que impede a criação de um de ferramentas universal de
PCR ( ). Alguns autores têm defendido o uso do espaçador
interno transcrito dois (ITS2) como uma alternativa para os
marcadores de cloroplasto tradicionais. No entanto, o ITS2 é
ou por ser confundido com introgressão ou com padrões de

herança biparentais, impossibilitando o seu amplo uso na
DNA (BUCHHEIM et al., 2012).

Um crescente corpo de evidências tem mostrado que a
-
ções da estrutura secundária pode superar pelo menos algumas
das limitações do ITS2 (BUCHHEIM et al., 2011). Os resultados
das análises dos dados ITS2 foram robustos em vários nós e
mostraram uma congruência considerável com os resultados
-
Além disso, os resultados indicam que as objeções ao uso de

ITS2 como DNA barcoding devem ser pesadas contra a utilidade
o poder demonstrado para reconstruir padrões evolutivos de

linhagens altamente divergentes.
Para complementar o exame morfológico da Thalassiosira
, uma diatomácea, Snapin e colaboradores (2011)
-

abrangendo dois espaçadores internos transcritos. O resultado

do nested-PCR obtido com iniciadores 18SF/28SR1 revelou
de T.
pseudonana, Cyclotella meneghiniana e Chaetoceros sp.
Buchheim e colaboradores (2012) relataram que existe
diversidade molecular nas cinco ordens (Chlamydomonada-
les, Sphaeropleales, Chaetephorales, Chaetopeltidales e Oedo-
goniates) e observaram ainda que há evidências de que pelo
menos duas linhagens adicionais devem existir dentro da classe
Chlorophyceae.
Synechococcus, presente no reservatório da
loci diferentes:
o gene rpoC1, o 16S-23S rRNA espaçador transcrito interno
(ITS) e o operon cpcBA-IGS, comparando-os com o gene de 16S
rRNA. Os autores observaram seis grupos de Synechococcus no
reservatório e concluíram que as sequências ITS são análises
complementares e úteis em estudos de diversidade desse grupo
de cianobactérias. Os genes do operon cpcBA têm um bom sinal
filogenético e resolução ao longo de vários níveis taxonômicos,
permitindo a correlação entre a sequência e a pigmentação
fisiológica.
-
Estudos dos genes ITS2 e 18S rRNA de estirpes de microalgas

resultou na descrição de um novo gênero, Jenufa, representado
por duas espécies distintas em uma nova linhagem da classe
Chlorophyceae. Pelas análises de sequências ambientais publi-
cadas anteriormente, uma provável terceira espécie do gênero
Jenufa existe em comunidades endolíticas nos Alpes, com
isso os autores sugeriram que Jenufa não é restrito às regiões
tropicais (NEMCOVA et al., 2011).

9.4 Sequenciamento dos Genes 16S e 18S RNA

das Microalgas
foram agrupados nos domínios Bacteria, Archaea e Eukarya.

Houve, então, a criação de um banco público onde se pode
depositar e consultar sequências de DNA. Com isso, pode-se
seu gene ribossomal 16S ou 18S. Quando a similaridade entre
indica que são pertencentes à mesma espécie (GEVERS et al.,
Tendo em vista as aplicações do sequenciamento parcial
-
-
-
-
-
de microalgas pertencentes à cianobactérias (procariotos) ou

-
os iniciadores universais fD1 e rD1 apresentou um fragmento

de aproximadamente 1.600 pares de bases para cada isolado.
com os iniciadores universais 18S-18N1 e 18NR11 apresentou

fragmentos com tamanho aproximado que variou de 1.800 a

2.000 pares de bases (Figura 9.7). Como os ribossomos pro-

carióticos e eucarióticos possuem números de pares de bases
distintos, foi possível separar esse dois grupos de microalgas
Figura 9.7. -
sais fD1 e rD1; 18-18N1 e 18NR11, em gel de agarose
M =marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen™),

N-controle negativo.
No IAPAR, o sequenciamento parcial de genes ribossomais

-
térias em nível de gênero (Figura 9.8).
Neste pequeno grupo de três cianobactérias, foi observado
que existe diversidade genotípica entre as estirpes da Coleção
IPR de águas continentais, águas residuais industriais e lagoas
estirpes IPRM (7061 e 7062) com Synechocystis e a estirpe

IPRM (7070) com (Figura 9.8).

Figura 9.8. Árvore filogenética baseada nas sequências parciais do

16S rDNA, de estirpes de cianobactérias isoladas de
águas continentais no Paraná. A árvore foi obtida pelo
-
nhamento de 809 bases. Out-group sequência do gene
18S rRNA de Chlorella vulgaris
Galhano et al. (2011) obtiveram informações moleculares

sobre o gene 16S rRNA e os genes hetR e nifH de cianobactérias
-
similaridade,
Já os fragmentos dos gene hetR
pb apresentaram similaridade com sp. TR183
PCC
de cianobactérias Calothrix e Tolypothrix foi congruente com
heterocistos e foram isoladas de amostras ambientais. Observa-

-se que os morfotipos Tolypothrix e Calothrix foram claramente
separados.
Estud -

como membros de cianobactérias. Com base na recuperação

de genomas de populações de intestino humano, de amostras
Melaina-
bacteria -
dos ancestrais e compartilhamento robusto com representantes

fotossintéticos. Os dados estão de acordo com a teoria que a
fotossíntese nas Cianobactérias envolveu extensa transferên-
cia lateral de genes e estende a funcionalidade reconhecida a
9.4 Ocorrência de Gêneros de Microalgas em

Águas Continentais do Paraná
A ocorrência dos diversos gêneros de microalgas no grupo
de estirpes isoladas em diversas localidades do Paraná foi ana-
lisada por sequenciamento parcial do gene 18S rRNA. Neste
à Coleção de Microrganismos do Laboratório de Microbiologia

do Solo do IAPAR, Londrina, PR.
Após a extração do DNA genômico de cada estirpe, foram
iniciador 18N1. As sequências foram avaliadas no programa
sequências obtidas apresentaram tamanho variável entre 471
foram comparadas com sequências depositadas no banco de

dados público NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os resul-
tados mostraram a ocorrência das espécies
bibraianus, Chlamydomonas moewusii, ,
Chlorococcum sp., Monoraphidium sp., Gonium multicoccum,

, sp., -
sis e Characium saccatum -
das como e seis como Monoraphidium sp.,
9.5 Sequenciamento de Microalgas

A análise de sequenciamento das microalgas do grupo dos
eucariotos mostrou que pelo menos nove gêneros de microal-
gas ocorrem nas amostras coletadas de águas em diferentes
localidades no Paraná (Figura 9.9).
Figura 9.9. Proporção de gêneros de microalgas do grupo dos euca-

riotos e prováveis espécies encontradas entre as amos-
tras coletadas de águas em diferentes localidades no
Paraná.
IPR. A árvore foi construída baseada nos resultados obtidos

pela submissão das sequências do gene 18S rRNA no banco de
dados de sequências, ( ), com auxilio do Software

Figura 9.10.
com as sequências parciais do gene 18S rRNA (610 bp)
de estirpes da Coleção IPR de microalgas (sequências
com número acesso/GenBank).
Glycine max
externo (outgroup). Percentagens de 1.000 repetições (boots-
traps) são indicadas próximas aos nós (apenas valores superiores
-
-Joining (NJ) e máxima-parsimônia/posterior probabilidade. A
-
dos por sítio.
A análise do agrupamento possibilitou a proposta de clas-

indicações de espécie. As 16 estirpes foram agrupadas em
-7040, -7042, -7049, -7071, -7179, -7181, -7182, -7186, -7187,

-7188, -7192) com o gênero Chlorella com bootstraps variando
-7176 com com bootstrap de
e -7191 com o gênero Monoraphidium sp. com bootstrap

No grupo quatro, duas estirpes (IPRM-7043, -7044) agruparam
com os gêneros Chlamydomonas e a -7183 com Gonium sp., com
suporte bootstrap
estirpe 7068 com Characium saccatum, as estirpes 7180 e 7184
com Chlorococcum sp., 7177 com o gênero danuali-
bis .
têm ganho destaque. Um exemplo foi o trabalho de Zhang e

colaboradores (2014), que selecionaram estirpes de microalgas
pela elevada produção de biomassa e teor de lipídeos. Estas
Tetranephris brasiliensis DL12, -
trodesmus sp. CJ02, A. gracilis A. gracilis CJ09, Desmodes-
mus subspicatus WC01, Chlorella vulgaris Desmodesmus sp.
WC08,
análise das sequências do 18S rDNA.
9.6 Sequenciamento do Genoma

de Microalgas
-
análises genéticas, o que permitiu a determinação de milhares

de sequências de DNA em um único processo, com custo rela-

foram lançadas e se baseiam em métodos diferentes de sequen-

ciamento:
);
Illumina Genome Analyser;
HiSeq e MiSeq (http://www.illumina.com);
SOLiDTM Genome Sequencer (http://www.lifetechno-
logies.com);
Ion Personal Genome Machine (PGM);
Ion Proton (http://www.lifetechnologies.com/us/en/
home/brands/ion-torrent.html).
pares de bases), mas geram uma quantidade expressiva de

dados. Esses avanços em equipamentos têm levado ao cresci-
mento acelerado das publicações de microalgas nesta área de
pesquisa.
Chlamydomonas reinhardtii
foi escolhida como modelo entre os organismos fotossintéti-
cos (CADORET et al., 2012). O sequenciamento do genoma
nuclear de C. reinhardtii foi concluído em 2007 (MERCHANT et
al., 2007; CADORET; GARNIER; SAINT-JEAN, 2012).
ferramentas genéticas tem resultado nos avanços de diversas

linhas, incluindo os estudos de proteômica que têm uma contri-
buição importante em pesquisas nas áreas da fotossíntese, bio-
logia molecular e evolução das algas (ROLLAND et al., 2009).
microalgas às alterações ambientais, de temperaturas (MÜH-
a estratégia de análises proteômicas - MALDI-TOF com uma

Chlamydomonas sp., isolada do rio Tinto
na Espanha (CID et al., 2010), bem como em um estudo para

entender o envolvimento no metabolismo de lipídeo da Chla-

mydomonas reinhardtii (NGUYEN et al., 2011).
Estudos de proteômica visando determinar a rota biossin-
tética do triacilglicerol na microalga oleaginosa Chlorella vul-
garis, ainda não sequenciada, indicaram regulação positiva dos
ácidos graxos e triglicerídeos, demonstrando a utilidade de um
transcriptoma montado como um modelo de pesquisa para a
análise proteômica de uma microalga, sem sequenciamento do
genoma (GUARNIERI et al., 2011).
O conteúdo genético de microalgas está começando a ser
explorado. Genomas de microalgas podem ser estruturalmente
a 168 Mbp para até uma

estimativa de 10.000 Mbp para . Considerando
grande tamanho dos genomas, o uso de sequenciamento do

transcriptoma para construção de catálogos de genes tem sido
recomendado (CADORET; GARNIER; SAINT-JEAN, 2012).
A microalga Botryococcus braunii (Chlorophyta, Botryococ-
a estirpe da linhagem A, enquanto o da linhagem L apresen-
2010). Os autores ainda sugerem que, de acordo com a aná-
de B. braunii correlaciona se com os tipos de hidrocarbonetos
Assim, as tecnologias de sequenciamento de nova geração

de genomas, possibilitam grandes avanços sobre a taxonomia,
(KIM et al., 2014).

-

cada como (IPR-Chls7107), isolada em

água doce no Paraná teve seu DNA total extraído e submetido
ao sequenciamento no Ion Torrent. Com base no sequencia-
mento do genoma da estirpe IPR-Chls7107, nas Figuras 9.11 a
9.13 são apresentadas os resultados das análises preliminares.
Na Figura 9.11 pode se observar que os fragmentos sequen-
ciados apresentam sua maior concentração em torno de 200
pb. O genoma com os contigs montados e anotados será subme-
tido ao GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Figura 9.11. Distribuição dos tamanhos dos fragmentos do genoma

da estirpe de microalga IPR-Chls7107.
É interessante verificar que o obtido com o

sequenciamento do genoma completo da estirpe de micro-
alga foi adequado, mostrando a qualidade excelente das bases
mesmo nos fragmentos mais longos (Figura 9.11).
O conteúdo de guanina (G) e citosina (C) que compõem
o genoma da microalga IPR Chls7107 está representado na
Figura 9.12.

Figura 9.12. Distribuição em porcentagem das bases guanina e ci-

tosina (GC) na sequência do genoma da estirpe de
microalga IPR-Chls7107.
Figura 9.13. Qualidade das sequências da estirpe IPR Chls7107 no

Phred Score

A porcentagem de GC está dentro do teórico (distribuição

esperada), porém, observa-se um pico com uma quantidade em
(Figura 9.12). Outra possibilidade é a grande quantidade de

genoma do Chloroplasto. Entretanto, no caso de eucarioto
o genoma possui sequências repetitivas que serão objeto de
estudo.
O dos reads
que representa a qualidade dos reads e mede a qualidade das
sequências em torno de 30 (Figura 9.13). Valores acima de
20 são considerados bons. As próximas atividades, depois dos
contigs
Artemis.
O processo de anotação consistirá em quatro passos:
1. Predição das ORFs (
2. Comparar as sequências contra bancos biológicos;

3. Comparar os resultado de cada ORF contra os ban-
-
tão depositadas ou publicadas e atribuir a função que
cada ORF que está sendo anotada;
4. Submeter todas as ORFs anotadas e a sequência do
genoma completo para o NCBI.
IPR-Chls7107, e com os dados da literatura, procederá

à publicação dos dados.
O sequenciamento completo de um genoma fornece exten-

sas informações sobre a evolução das espécies, ajuda a iden-
processos envolvidos nos ciclos de ferro, cálcio, sílica, ureia

e nitrogênio. Além disso, dados das sequências fornecem refe-
rências essenciais para combinar com as investigações pós-
-genômica, incluindo análises de transcriptoma e proteoma

(CADORET; GARNIER; SAINT-JEAN, 2012).

Chlorella (ArM0029B)
revelou uma estreita relação entre Chlorella, Parachlorella e
-
condriais, no entanto, indicaram que ArM0029B mostra uma
grupo Helicosporidium-Prototheca -
ticas detalhadas entre os três taxa ainda precisem ser escla-
recidas. Os autores concluiram que o genoma dos plastos de
ArM0029B é semelhante ao de C. variabilis
genoma de Chloroplasto
investigados de Chlorellales. A presença do intron cox1 a 721
em todos os quatro taxa Chlorellales investigados indica que o
intron cox1 -
les como uma forma cis-splicing e que o cis-splicing do intron
foi herdado em Chlorellale
trans-splicing em Helicosporidium (JEONG et al., 2014).
Para melhor entendimento dos processos metabólicos de
, a análise pangenômica comparativa do
cloroplasto e genomas mitocondriais de
de
na , respectivamente Comparação da
pangenoma de para outras algas dentro e fora
-
conservação de energia (ATP sintetase), a síntese de proteínas

e homeostase (CLP protease, ribossomo). Os autores concluí-
-
chloropsis são únicas. A semelhança excepcional dos genomas
organelares da e sugere que
(STA-
RKENBURG et al., 2014).

É de conhecimento geral que, nos ambientes aquáticos e
terrestres, existe grande diversidade de microrganismos, muitos
desses de interesse biotecnológico, como por exemplo, as
microalgas. No entanto o potencial biotecnológico só pode ser
explorado com o conhecimento da máxima capacidade destes
e estabelecer uma Coleção ex situ e manter in vivo esses espé-

cimes para ter acesso a essa diversidade. Nesse contexto, o uso
taxonômica de microalgas de uma Coleção e, consequente-

mente, para a elucidação da diversidade.
-
-
algas e, por meio de dendrogramas genéticos, foi possível rea-
mostrou que existe grande diversidade genética de estirpes de

microalgas em lagoas no estado do Paraná. Já com o sequen-
-
tecnologias de sequenciamento e os avanços da bioinformática,

permitiram a geração e montagens de novos genomas. Com as
-
capacidade biotecnológica desses microrganismos.
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PARTE 4
MICROALGAS: COPRODUTOS
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USO COMO BIOFERTILIZANTES

CAPÍTULO 10
PRODUÇÃO DE LIPÍDEOS PELAS

MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR
Diva Souza Andrade

Fernanda de Almeida Fin de Lima

Introdução
O elevado consumo mundial de energia oriunda principal-
mente da queima de combustíveis fósseis representa grandes
riscos à sobrevivência humana, devido não apenas ao esgo-
tamento das reservas mundiais de petróleo, mas, também aos
Aliado a estes problemas surge o risco das mudanças climáti-

cas em todo o globo com o aumento da concentração de CO2 na
atmosfera devido à queima de combustíveis fósseis. Segundo
Ritmann (2008), a necessidade de redução da dependência de
uso de combustíveis derivados do petróleo bem como o inte-
resse em desenvolver ferramentas que apoiem a redução do
biocombustíveis obtidos a partir de microalgas.

A determinação da biomassa, com os resultados expres-
sos em massa seca ou úmida, é um dos métodos de avaliar o
desenvolvimento de microalgas. Essa abordagem consiste em
recolher alíquotas dos cultivos, concentrar células por centri-
método mais adequado para secagem, no caso de determina-

-
para avaliar o crescimento das células, a biomassa é importante
durante o cultivo das microalgas.

Existe um grande número de espécies de microalgas pro-
missoras como fonte de lipídeos para a produção de biocombus-
tíveis devido à sua rápida multiplicação, alto conteúdo lipídico
tipos de lipídeos. Embora comumente quase toda microalga

possua lipídeo em sua célula, nem todo lipídeo de fonte algal
pode ser convertido a biodiesel (CHISTI, 2007). Diversos fato-

intensidade luminosa, o aumento de temperatura e os nutrien-

tes adicionados ao cultivo. Dentre os nutrientes estão o nitro-
gênio e o enxofre os quais são usados pelas microalgas na sín-
tese de aminoácidos e ácidos graxos (RADMANN et al., 2008).
Sabe-se que para constituir fonte de matéria prima de bio-
diesel, esta deve ser rica em ácido graxo. Uma microalga com
um teor de proteína muito alto e baixo teor de lipídeos não
seria útil como matéria prima dos biocombustíveis. Segundo
por microalgas está na forma de triacilgliceróis o que favorece

a produção de biodiesel, que é constituído de ésteres de alquila,
de um triacilglicerol com álcool, geralmente metanol ou etanol

anidro, na presença de catalisador homogêneo ou heterogêneo.
As microalgas conservadas in vivo em Coleção devem ser
-
mada no projeto Microalgas, em função de seus objetivos o teor
de lipídeos foi uma das características avaliadas. Para a seleção
de estirpes de microalgas com altas produtividades de lipídeos,
uma etapa fundamental é a determinação do teor deste com-
posto na biomassa. Nessa análise, o grupo de isolados deve ser
-
cies para aumentar a probabilidade de encontrar microalgas
com potencial produtivo em termos de lipídeos.
Dessa forma, neste capítulo, a proposta é mostrar os resul-
da Coleção IPR, visando a seleção de microalgas estirpes com

destaque nessas características .
10.1 Cultivo das Microalgas

As determinações da produção de biomassa e de lipídeos

autoclave e com pH 7,0, em frascos de vidro transparente con-

-
nobactérias foram inoculadas em meio de cultura (BG-11)
(ALLEN, 1968; ALLEN et al., 1968; RIPPKA, 1988) e as cloró-
Bold Basal Medium (BBM)
(BOLD, 1949; BISCHOFF et al., 1963). Cada estirpe de micro-
alga da Coleção IPR foi inoculada em BG11 ou BBM com inó-
aproximadamente 1 10 UFC mL-1. Os frascos de cultivos foram
°C com fotoperíodo de 12 h e luminosidade em torno

s , durante 12 dias. Após esse perí-
-2 -1
odo, foram retiradas alíquotas de 30 mL de cada cultivo para

as determinações da biomassa.
10.2 Produção de Biomassa pelas Microalgas

A biomassa microalgal é composta de grande parte de
de cultivo. Os tubos contendo os pellets foram mantidos em

estufa a 70°C por 24 h e posteriormente pesados até a obtenção
do peso constante da massa. A biomassa foi calculada pela dife-
Os valores da biomassa foram expressos em mg L-1 e trans-

formados em produtividade diária (mg L-1 dia-1). Os dados de
-
cado o teste de médias Scott-Knott para agrupamento das estir-
pes, devido o alto número de tratamentos (Figura 10.1a e b).
A produção diária de biomassa das cianobactérias apresentou
-1
dia-1. Quatro grupos foram for-

-1
dia-1. O grupo A repre-
64,23 mg L-1 dia-1 -

vamente superior aos das demais grupos de estirpes. O grupo
-1
dia e agrupa seis estirpes (IPR7138, 7006, 7070, 7162, 7146

-1
e 7174) (Figura 10.1a).

-
cedimentos de análises foram os mesmos adotados para as cia-
nobactérias. Os resultados da produtividade de biomassa das
109 estirpes de cada grupo são apresentados na Figura 10.1b.
valor médio de 14,76 mg L-1 dia-1, sendo esse resultado seme-

lhante aos das cianofíceas. A produtividade de biomassa das
-
pos conforme semelhança estatística pelo teste Scott-Knott
(Figura 10.1b). O grupo A é composto pela estirpe IPR7002,
que apresentou maior produtividade de biomassa com valor
médio de 86,18 mg L-1 dia-1, diferindo-se estatisticamente dos
demais grupos. O grupo B é composto pela estirpe IPR7171,
-1
dia-1 de biomassa.
7161, cujo valor médio foi de 40,89 mg L-1 dia-1 de produção de
e apresentaram valor médio de biomassa inferior a 28,92 mg

L-1 dia-1 (Figura 10.1b).

100
90
1
1d 80
70 n 1
60
m
0
sec
40 n 6
om ss
20 n 17
10 n 2
0
A
ru os de est r es de c no ct r s d oe o
12
n 6
10 n 9
n 1
n 1
8 n
0
A
Figura 10.1. Biomassa de células de 49 estirpes IPR de cianobac-

-
pes em cada grupo pelo teste de médias Scott-Knott (p
10.3 Alteração do pH e a relação entre

biomassa e densidade ótica do cultivo
Para determinar alterações nos cultivos das microalgas da
Coleção IPR, no décimo segundo dia após a inoculação foram

Os dados de pH dos cultivos foram submetidos à análise de

-
mento das estirpes (Figura 10.2a e b).
9,3 e foi uma das que apresentou maior produção de biomassa,

cerca de 60 mg L-1 dia-1
para produção de biomassa.
12
n 6
10 n 9
n 1
n 1
8 n
0
A
12
n 6
n
n 12
10 n 1
n 20
n 22
8 n 24
0
A
ru os de est r es de c or t s
Figura 10.2. Medida de pH do cultivo de 46 estirpes IPR de ciano-
estirpes em cada grupo pelo teste de médias Scott-

-Knott (p -

A densidade ótica dos cultivos de microalgas em meio de

-
trofotômetro Genesis e no comprimento de onda de 670 nm.
O valor médio de DO670 de cada estirpe de microalga em cada
com os dados de biomassa microalgal (Figuras 10.3a e 10.3b).
Figura 10.3. Relação entre densidade ótica (DO670) e biomassa de
Coleção IPR.

2
= 0,182 (p
< 0,001) e R 2
é o ajuste da curva para cada estirpe de microalga.

Os cultivos das microalgas apresentaram densidade ótica
(DO670) com menor valor no grupo da cianobactérias, a estirpe
log10
mostrou maior valor com DO de 1,644 e o valor médio do
número de células em log10 de 7,16 no cultivo de 12 dias.
10.4 Lipídeos em Microalgas

As estirpes de microalgas que compõem a Coleção IPR de
Microalgas isoladas de águas continentais no Paraná são alvo
de pesquisas do projeto Copel/IAPAR/Fapeagro. Um dos obje-
tivos do projeto foi o de avaliar a produção de lipídeos. Diante
da necessidade do laboratório em adotar um método para ava-
liar a produção de lipídios pelas microalgas, previamente foram
-
tados os métodos de Folch, Bligh e Dyer e de espectroscopia de
já são conhecidos.
-
por diversos pesquisadores para determinar os teores de lipí-

deos totais na biomassa de microalgas.
-
-

clorofórmio/metanol (2:1 v/v) e lavagem por adição de clo-
mistura de solventes clorofórmio:metanol:água (2:1:0,8; v/v).

Além de ser um processo a frio e não causar alteração para
quantidades mínimas de solventes e de amostra.

No projeto foi adotado um método para microdetermi-
nação de lipídeos em amostras de microalgas cultivadas em
laboratório. Os lipídeos foram extraídos de amostras secas de
biomassa de Chlorella vulgaris
uma mistura de clorofórmio e metanol 2:1 (v/v) e a quanti-
dade de lipídeos extraídos foi determinada por gravimetria. Os
resultados obtidos por esse método foram comparados com os
resultados obtidos na extração contínua em aparelho Soxhlet
(OHARA et al., 2014).
ácido sulfúrico, incubação a 90°C, resfriamento em banho de
al., 2011). Outro método quantitativo colorimétrico que usa

sulfo-fosofo-vanilina em microplacas de 96 poços e leitura da
ZHENG; VANDERGHEYNST, 2011). A escolha do método

depende também da disponibilidade de infraestrutura no labo-
ratório, como equipamentos e reagentes.
-
-se o corante vermelho do Nilo (
(COOKSEY et al., 1987; LEE et al., 1998; BERTOZZINI et al.,

2011). A mistura do corante com as células de microalgas des-

taca as partes da célula que contém os lipídeos. Este método
tem sido usado para contagem de bactérias que acumulam
compostos tais como lipídeos (SPIEKERMANN et al., 1999). O
9-dietilamino- -
-
-
vente e tem sido proposto para determinar o teor de lipídeos
neutros de células de microalgas. Essa metodologia é descrita
em diversos trabalhos com microalgas (LEE; YOON; OH, 1998;
LEE et al., 2010) e também por outros pesquisadores (COOK-
SEY; GUCKERT; WILLIAMS; CALLIS, 1987; ELSEY et al., 2007;
WEI et al., 2009; CHEN et al., 2011).
No caso das microalgas, em algumas espécies o conteúdo
de lipídeos é determinado com sucesso, mas em outras os teo-
em penetrar as paredes das células. Para eliminar este pro-
sulfuroso, em temperaturas elevadas para favorecer a passa-

gem do corante ( ) pela parede celular da microalga e
-
cerol ou dimetil sulfóxido DMSO em culturas de microalgas
de
a extração, mas o uso de corante ( ) e de outros não

-
bém, que o corante possa atingir inteiramente todas as partes
internas da célula (CHEN; SOMMERFELD; HU, 2011). A meto-
) foi

-
deo não polar de microalgas (SMITH-BADORF et al., 2013).
-
tica Eletrônica (LAFLURPE) do Departamento de Química da
Universidade Estadual de Londrina - UEL, Londrina, PR. Em
face da grande quantidade de estirpes da coleção de microal-
pouca quantidade de biomassa e de solvente. Sendo assim, a
necessidade.
Nessa técnica, após a coleta das amostras de microalgas
óptica (D.O.) em espectrofotômetro a 670 nm para efetuar as
de 0,06 (fator limite para esta análise). As amostras que apre-

sentaram D.O. superior a 0,06 foram diluídas com água desti-
foram considerados no cálculo do fator de diluição.
diluída foram transferidas para microtubos e centrifugadas
mínimo 24 h para rompimento das células. Posteriormente,
foi preparada com trioleína (padrão de lipídeo neutro) a partir

-1
da qual foram
preparadas diluições com 4 mL de acetona para se obter uma
-1
. A solu-
ção do corante
mg mL-1 (nesta concentração a coloração é rosa). Para cada um

. Todas as solu-
Para a reação, foram tomadas alíquotas de 1,0 mL das

amostras contidas nos microtubos, transferidas para tubos de
ensaio e adicionadas de 3 mL de acetona. O foi adicio-
em 620 nm. O tempo entre a adição do corante e a respectiva

leitura tanto para as amostras quanto para a curva foi rigorosa-
mente o mesmo (30 minutos). Todas as avaliações foram feitas
em triplicata.
Para garantia quanto às respostas obtidas pelo método de
-
gando-se amostras com teores conhecidos de lipídeos. Estes
resultados são apresentados na Tabela 10.1.
Tabela 10.1. -
rentes marcas de margarinas e determinados por três
diferentes métodos.
Folch Bligh e Dyer Fluorescência

Amostras
Milho 3,7 + 0,3 3,4 + 0,1 3,6 + 0,2
Farelo de soja 2,6 + 0,2 2,3 + 0,1 2,3 + 0,1
Caroço de algodão 23,2 + 0,9 23,1 + 0,2 23,9 + 0,1
Margarina A 38,9 + 0,6 41,4 + 0,9 39,9 + 0,2
Margarina B 68,6 + 0,6 + 0,8 64,6 + 0,4
Margarina C 18,9 + 22,2 + 0,9 20,8 + 0,7

Fonte: Adaptado de Lima et al. (2012).
A biomassa em cultivos de estirpes de microalgas de Chlo-

rella vulgaris (IPR-7123)

foi avaliada em meio de cultura BBM
por 14 dias em frascos de vidro transparente contendo 1000
°C
°C (fase escura). A intensidade de
s
-2 -1
na Tabela 10.2.
Tabela 10.2. Biomassa e lipídeos (em base seca) determinados pelo
cultivos das microalgas C. vulgaris (IPR-7123) e

oleoabundans .
Espécie Biomassa (g L-1)
C. vulgaris
-
las de microalgas Chlorella vulgaris (IPR-70123) pelo método
em microscópio
al., 2013). As células da microalga da espécie Chlorella vulgaris

foram cultivadas até a fase estacionária, para se obter maiores
acúmulos de lipídeos neutros. Alíquotas de 10 mL de suspen-
são de células foram centrifugadas a 10.000 g durante 10 min,
seguida por três lavagens com água destilada. Posteriormente,
da suspensão de células. Após o tratamento em micro-ondas

durante 1 min, uma alíquota da solução de vermelho do Nilo
( -1
) foi adicionada.

Após 10 min de incubação no escuro as células coradas foram
emitida pelas células de microalgas coradas indica a presença

de conteúdo lipídico intracelular.
Figura 10.4. Imagens de Chlorella vulgaris

de campo claro) e (b) céluas coradas com vermelho de
Nilo ( -
ca a presença de células lipídicas em microscopia de

10.5 Produção de lipídeos pelas microalgas

da Coleção IPR
objetivo de selecionar as estirpes consideradas elite com poten-

-
-
com base nos dados de lipídeo não polar da biomassa microal-
Os resultados dos teores de lipídeos em mg L-1 dia-1 para
foram analisadas quanto ao teor de lipídeos pela técnica da

-
Os cinco grupos que se destacaram foram compostos por

microalgas isoladas de água de lagoas da região centro sul e
sudoeste do Paraná. As três estirpes dos dois primeiros grupos
(A e B) que se destacaram com valores de lipídeos em mg L-1
dia-1 foram isoladas em São Mateus do Sul (IPR-Chls7104) com
de lixiviado de aterro sanitário, do município de Londrina,

apresentaram teores de lipídeos na biomassa de 186,84 e
204,87 mg L-1 dia-1
Botryococcus
braunii
apresentou teor médio de lipídeos similar a IPR-Chls7104 do

grupo A. A produção de lipídeos das microalgas dos grupos
apresentou baixa produção mostrou valor semelhante ao valor

relatado por Chen e colaboradores (2011) para cultivo hetero-
Chlorella protothecoides, usando glicerol, relataram
produção de biomassa de 23,9 g L-1.
800
700
1
600
d
1
00
deo m
400
00 n 1
200
n 1
n 4 n 1
100 n 1
n 4
n 6
n 0
0
A
800
700 n 1
n 2
600
d1
1
00
deo m
n 1
400
n 1
00
n 1
200 n 4
n
100
n 11
n 67
0
ru os de est r es de c or t d oe o
Figura 10.5. Produtividade de lipídeo neutro em mg L-1 dia-1 por

48 estirpes IPR de cianobactérias (a) e 93 estirpes de

h-1, o que equi-

-1
vale a 60 mg L-1 dia-1, e por Francisco (2010), que encontrou

para Chlorella equivalente a 127,2 mg L-1 dia-1, valores bem
menores aos encontrados neste grupo de microalgas da Cole-
ção IPR.
Amaro e colaboradores (2011) citam diversos trabalhos
sobre microalgas com valores de produtividade de lipídeos
(mg L-1 dia-1) variando de 10,3 para Chlorella emersonii a 134
para . Em geral, a produtividade em
biomassa e conteúdo de lipídeos é inversamente proporcio-
nal, porque a biossíntese de lipídeos é um processo de custo
metabólico alto (FRANCISCO, 2010). Esse comportamento foi
observado com as estirpes IPR, pois as microalgas com maior
produtividade de lipídios apresentaram menor produção de
biomassa.
Geralmente a intensidade de amostras de microalgas cora-
-
o corante vermelho do Nilo ( ) a linearidade da curva
mililitro (mL) de amostra de biomassa microalgal.
No estudo da relação entre biomassa em g por litro e densi-
-
tou um R2 mais elevado do que o das cianobactérias. No ajuste
de uma equação entre a biomassa de microalgas e densidade
ótica dos cultivos medida em comprimento de onda de 670 é
necessário que o mesmo seja feito para grupos de estirpes com
-

mentosas, ou mesmo, ajustar equações para uma única estirpe.

As metodologias para determinação de lipídeos de micro-
algas são diversas. A escolha do método deve ter como critério
o objetivo do trabalho e levar em conta as limitações de cada
método. No presente caso, devido ao grande número de estir-
pes a ser avaliado em curto espaço de tempo e considerando-se
-
orescência, que exige pequenas quantidades de amostra. Essa
metodologia permitiu selecionar um grupo menor de estirpes
com potencial quanto à produção de lipídeos a partir de um
grande conjunto de microalgas coletadas de águas de interiores
no estado do Paraná.
Algumas estirpes da Coleção IPR formada no projeto Micro-
algas se destacaram na produção de biomassa e na concentra-
ção de lipídeos. Os resultados apresentaram grande variação,
indicando uma ampla diversidade entre as estirpes.
Para um grande número de estirpes de microalgas, existe
a necessidade de condições e de procedimentos metodológi-
cos rápidos que permitam a dosagem de lipídeos na biomassa.
Para expressar o potencial máximo de produção de biomassa,
espécies de microalgas.
Esses dados obtidos neste estudo indicam que, essas estir-
pes de microalgas são promissoras para estudos aplicados.
Além disso, esse banco de germoplasma microalgal é impor-
tante para indicar a biodiversidade existente no estado e deve
ser conservado, porque, ao serem mantidas essas microalgas
projetos futuros envolvendo pesquisadores e estudantes em

todos os níveis. Essa Coleção IPR poderá, ainda, contribuir
para formar e treinar pessoal na área biotecnológica, e ampliar
os conhecimentos de Microalgas no estado ao incluir estudos
-
resse biotecnológico.

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CAPÍTULO 11
PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS E
PIGMENTOS PELAS MICROALGAS
DA COLEÇÃO IPR

Diva Souza Andrade
Alexandra Scherer

Introdução
-
tam diversos papéis ecológicos e participam de processos bio-
aproximadamente 140 anos e o estudo de suas aplicações bio-

tecnológicas foi revisado principalmente por Richmond (2004).
A biomassa de microalgas contém três componentes principais:
carboidratos, proteínas e lipídeos. As proteínas contidas na
biomassa microalgal têm potencial de aplicação na indústria
alimentícia, farmacológica e outras (PULZ et al., 2004; ZHU et
al., 2007). Esse alto conteúdo proteico na biomassa microalgal
tem potencial de aplicação na alimentação humana e como
suplemento alimentar animal. Estas proteínas apresentam um
bom balanço de aminoácidos e níveis baixos de ácidos nucléi-
cos em comparação com outras fontes de proteína unicelular
(ABURAI et al., 2013). Além disso, o potencial biotecnológico
das microalgas inclui o aproveitamento dos lipídeos de sua bio-
massa para produção de bioenergia, além da potencialidade do
-
cionantes do solo.
produtos de reserva, além da constituição da parede celular

(TOMASELLI, 2004). Estes estudos básicos podem contribuir
para ampliar as possibilidades de exploração biotecnológica
deste grupo diverso de microalgas.
Neste capítulo são relatados os resultados de pesquisa,
incluindo a produção de proteína e pigmentos como a cloro-
a a e carotenoides totais na biomassa de microal-
gas da Coleção IPR isoladas de águas continentais no Estado
do Paraná.

11.1 Cultivo das Microalgas

-
cias dos mais variados interesses. Detalhes sobre a produção
de coprodutos de microalgas são apresentados no capítulo 6 do
a a, caro-
tenoides totais) de cada estirpe estão apresentados no Volume
III desta coleção.
A determinação da concentração proteica na biomassa de
microalgas serve como um indicador para selecionar estirpes
com alta produção, visando aplicações biotecnologias especial-
mente na área de alimentos. Lourenço (2006) cita os métodos
-
1976) e o de microKjeldhal. O autor destaca que o método de
e não proteico) e fornece uma estimativa do teor de proteínas

ao ser multiplicado por um fator, que deve ser escolhido de
acordo com a espécie de microalga analisada. As estirpes de
quanto ao teor de proteína hidrossolúvel, pelo método descrito

por Bradford (1976). Esse método foi escolhido por ser sensí-
vel, rápido e exigir pequenas quantidades de volume do cultivo
celular.
a,
a
alíquotas de cultivos de microalgas. Os cultivos foram condu-
meio de cultura estéril, pH 7,0. Para obter esses cultivos, as

estirpes de cianobactérias foram inoculadas em meio de cul-
tura (BlueGreen Medium) nominado de BG-11 (ALLEN, 1968;
de cultivo Bold Basal Medium (BBM) (BOLD, 1949; BISCHOFF

células viáveis
mL-1 para cada estirpe de microalga da Coleção IPR (Figura
11.1a). Os frascos de cultivos foram mantidos estáticos durante
2°C, fotoperíodo de 12 h e luminosidade em torno de 80 a 100

s (Figura 11.1b). Após este período, foram reti-
-2 -1
radas alíquotas de 10 mL de cada cultivo para as determina-

a a e carotenoides totais.
Para selecionar as estirpes de microalgas com maior poten-
a a e carotenoi-
(CANTERI et al., 2001). O delineamento experimental foi intei-
Figura 11.1. Imagem ilustrativa: (a) o processo de inoculação dos

cultivos de microalgas em condições assépticas e (b)
-
mento.

11.2 Produção de Proteína pelas Microalgas
metodológico descrito por Bradford (1976). Após 10 dias de

crescimento das microalgas, uma alíquota de 1 mL foi retirada
desses cultivos e adicionada em 1 mL de solução de hidróxido
de sódio (NaOH a 0,1 mol L-1). Essas amostras de cultivos de
para promover a lise celular. A concentração de proteínas foi

determinada, nessa suspensão, empregando-se o reativo de
Bradford e a curva padrão de soro albumina bovina (BSA). O
Coo-
massie Brilhant - Blue
o volume foi completado para 100 mL com água destilada.

Para determinar a quantidade de proteína uma curva padrão
mL-1, a partir de uma solução estoque de 1,0 mg mL-1 de soro

albumina bovina (BSA). O BSA foi diluído em solução de PBS
-1
(0,2 g), Na2HPO4 2

PO4 (0,2 g). A leitura da absor-
-
tados de proteína foram expressos em mg L e transformados
-1
em produtividade diária em mg L-1 dia-1.

Os dados de proteína na biomassa das 48 cianobactérias
estão representados na Figura 11.2a. As estirpes foram distri-
buídas em sete grupos, sendo que o grupo A, composto pela
estirpe IPR-7146, destacou-se dos demais por apresentar maior
produção de proteína solúvel (18 mg L-1 dia-1). Os outros seis
apresentaram valor médio de proteína que variou de 1,64 a

-1
dia-1.

20
n 1
18
16
14
1
12
d
n 2
1
10
n 4
m
8
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n 6
6
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n
n
6 n 16
n 2
4 n 18
n 17
2 n 8
n 7
0
A
ru os de est r es c or t sd oe o
Figura 11.2. Teores de proteína hidrossolúvel na biomassa de mi-

croalgas da Coleção IPR: (a) 48 estirpes de cianobac-
estirpes em cada grupo pelo teste Scott-Knott (p <
mg L-1 dia1). Uma ampla diferença foi observada nos demais

grupos (B a J), cujos resultados variaram de 1,69 mg L-1 dia1 a

14,04 mg L-1 dia1. O grupo K, composto por sete estirpes, foi o
que exibiu os menores valores apresentando um valor médio
abaixo de 1,07 mg L-1 dia1 (Figura 11.2b).
No geral, os teores de proteínas entre o grupo de microal-
gas, procarioto e eucarioto, não diferiram pela análise do teste
t ( 0,622). As determinações do teor de proteínas em célu-
las de microalgas têm amplas aplicações que incluem desde as
2004; LOURENÇO, 2006; BOROWITZKA, 2013).
11.3 Produção de Pigmentos pelas Microalgas

Em escala mundial, as vantagens nutricionais dos corantes
-
ção de pigmentos de origem sintética na indústria alimentar.
Os estudos relacionados com a extração de pigmentos na bio-
massa microalgal são diversos. Na comparação de dados dispo-
níveis na literatura, um fator importante a ser considerado são
as condições de cultivos das microalgas, além dos procedimen-
tos metodológicos de extração (PASQUET et al., 2011a). Com-
parando os métodos de extração de pigmentos das microalgas
Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis e da levedura Pha-
Passos e colaboradores (2007) relataram que a
microalga Haematococcus pluvialis tem em média 20,79 mg de
carotenoides totais por g de célula seca (PASSOS et al., 2007).
Os processos de extração de pigmentos aplicados a micro-
desenvolvidas para plantas superiores e macroalgas. Algu-
incluindo maceração, percolação e extração de líquido pres-

de produ
de grandes quantidades de solventes e o risco de desnaturação
térmica ou transformação das moléculas de interesse. Portanto
para evitar a oxidação e a desnaturação térmica das amostras
de biomassa estas podem ser congeladas (-80°C, nitrogênio
atmosferas de vapor de água saturado (ESTEBAN et al., 2009).

Wiltshire e colaboradores (2000) relataram um método
de pigmentos e ácidos graxos, a partir de microalgas resisten-

tes, usando . Os autores concluíram que a
-
90 min a -4ºC resultou em excelente extração desses compos-

tos, podendo ser aplicável a um amplo espectro de microalgas
(WILTSHIRE; BOERSMA; MÖLLER; BUHTZ, 2000). Cardoso e
extratos de cianobactérias (Synechococcus sp.), obtidos com a

extração supercrítica com CO2 puro e CO2
etanol como cossolvente, em diferentes pressões e temperatu-
2
puro e seu conteúdo no extrato
não passou de 0,48 mg por g de célula de microalga seca. No
entanto, o uso de CO2 -
vente levou a uma melhora da extração, chegando a concentra-
ções maiores do que 0,70 mg/g de biomassa algal seca.
A maceração em nitrogênio líquido, seguida por extração
com tampão, que consiste na precipitação do pigmento com
-
O desempenho de irradiação por micro-ondas para extrair

pigmentos de duas microalgas marinhas Dunaliella tertiolecta

e Cylindrotheca closterium foi comparado com os processos

convencionais (imersão fria e quente e extração assistida por
-
-HPLC e o desempenho da extração foi avaliado em relação
-
-
ção para avaliar o impacto do processo sobre a integridade
Dunaliella tertiolecta (clorofícea) levaram à rápida extração de

pigmentos e rendimentos equivalentes à extração de pigmen-
tos convencionais e a irradiação por micro-ondas permitiu a
penetração do solvente nas células. A irradiação por micro-
pigmentos de C. closterium -
bilidade, aquecimento homogêneo e altos rendimentos (PAS-
QUET; CHÉROUVRIER; FARHAT; THIÉRY; PIOT; BÉRARD;
KAAS; SERIVE; PATRICE; CADORET; PICOT, 2011a).
°C
(VAN LEEUWE et al., 2006).

Roldán et al. (2004) descreveram uma técnica de aná-
com formação de imagens baseada em microscopia confocal

-
maneira não invasiva permite (i) a análise direta áreas globais

in
vivo
amostra pequena e (ii) a discriminação de células com deter-

e a correlação entre os dados morfológicos e os pigmentos de

cada célula.
Além das técnicas citadas, Pasquet e colaboradores (2011b),
pectinases e celulases como alternativas para melhorar as taxas

de extração de pigmentos em microalgas. Existem várias técni-
cas disponíveis em escala laboratorial e industrial para extra-
seleção de uma tecnologia de extração são as características
limitação do uso de solvente, reprodutibilidade, rendimento de

extração, seletividade, proteção de moléculas extraídas contra
transformação química, custo e facilidade.
Fatores abióticos como temperatura, luminosidade, con-
centração de sais no meio, pH, entre outros, podem alterar as
a produção destes coprodutos, de forma positiva ou negativa.

-
portamento das microalgas frente às condições estressantes de
presença de sais e variações e luminosidade.
A adição de sais no meio de cultivo é também umas das
estratégias estudadas e testadas por vários autores para aumen-
tar a produtividade de pigmentos em microalgas. White e cola-
boradores (2012) observaram que a adição de bicarbonato
de sódio (NaHCO3) na dose de 2 g L-1 no meio de cultivo das
microalgas Tetraselmis suecica e resultou
-
a b). No entanto, para a concentração de pig-
mentos totais de T. suecica não houve diferença significativa
entre as doses de 0,1 e 2 g L-1 -
dores (2010) observaram efeitos negativos no crescimento e na

produção de pigmentos pelas microalgas devido aos estresses
A taxa de crescimento das microalgas foi inibida pelo aumento

da concentração deste sal e pela redução de nitrato. Quanto
à a b
que a diminuição do conteúdo de pigmentos em meios de cul-
estresses salino.
As condições de cultivo da microalga Haematococcus plu-
vialis
de astaxantina e de carotenoides totais por Cifuentes et al.
-
autores concluíram que a produção de carotenoides foi indu-

-
s ). Dentre
-2 -1
produção de carotenoides (4,9 mg L-1) obtida em culturas pré-

-cultivadas em solução de nitrato.
Outro fator abiótico que altera a concentração de pigmen-
tos nas células microalgas é a temperatura e pode degradar os
pigmentos como a astaxantina. Raposo e colaboradores relata-
ram que a melhor conservação de astaxantina de Haematococ-
cus pluvialis foi conseguida com a secagem das amostras pelo
em nitrogênio (sem oxigênio). Nas condições propostas pelos

autores a proporção de degradação da astaxantina foi igual ou
dos fatores temperatura e intensidade luminosa na produção

máxima de células em Spirulina platensis (Arthrospira platensis),
intensidade luminosa, enquanto, para os carotenoides totais

o teor máximo foi encontrado em condições de cultivo com

conteúdo de carotenoides totais com o aumento da intensidade

S. pla-
tensis para a fotoproteção e essa poderia ser uma base para a
exploração de microalgas como fonte de pigmentos.
11.4 Produção de Clorofila-a e Formação de

Feofitina-a em Pigmentos Produzidos
pelas Microalgas
a a na bio-
massa de microalgas pode ser obtida por métodos colorimé-
ae
a das 110 estirpes de microalgas da Coleção IPR
Para ajustar a densidade ótica (D.O) dos cultivos de micro-

algas, uma alíquota foi analisada no comprimento de onda
1967). As alíquotas de 3 mL dos cultivos foram centrifugadas,

o sobrenadante foi descartado e as amostras precipitadas (pel-
let °C
de facilitar o rompimento da parede celular. Na etapa seguinte,
as amostras foram descongeladas, maceradas com bastão de
-
suspendido com auxílio do vórtex, em ambiente protegido de
°C
(geladeira). As amostras foram centrifugadas durante 10 min a
°C e os sobre-
-
tômetro (modelo Genesys 10-UV/Thermo) nos comprimentos
-
a, após as leituras da

a, nos mesmos extratos de microalgas foram adicionadas duas

gotas de ácido clorídrico (HCl 1 mol L-1) em cada amostra e
-
a a foram
determinadas de acordo com as equações (1) e (2), respectiva-
para expressar os resultados em mg L-1 dia-1.
a = F x (A -A
(1)
a= -A ) - (A
(2)
Onde:
a a = mg L-1
F= 26,73 representa o fator resultante das informa-
v = volume de acetona usado na extração (mL);

V = volume de amostra centrifugada (3 mL);
c = caminho óptico (1 cm);
A
A
A
clorídrico
A
clorídrico
a de 38 estirpes

a das estirpes de cianobac-

-1
dia-1. As estirpes do
-
a 173,27 mg L-1. dia-1. O grupo F (composto por 19 estirpes)

exibiu os menores valores (Figura 11.3a).
a
de 12,32 a 300,30 mg L dia-1. O grupo A representado pela
-1
estirpe IPR-7131 e o grupo B pela IPR-7136 se destacaram por

apresentar os maiores valores de 246 e 300 mg L-1 dia-1, respec-
tivamente. Os demais grupos (C a I) apresentaram ampla varia-
ção com teores entre 32,91 a 210 mg L-1 dia-1. O grupo J, con-
do que 12,32 mg L-1 dia-1 a (Figura 11.3b).

Os três principais grupos de pigmentos encontrados na
-
a
-
bec
prevenindo danos celulares em condições de altas irradiações
característica de cada espécie que apresenta sua própria combi-

nação de pigmentos e, consequentemente, colorações distintas.
a
para avaliar microalgas. Para as espécies de cianobactéria,
Synechococcus elongates e Anabaena variabilis, foram relatados
valores de 640 -1
a 680 -1
, respectivamente (TIWARI
et al., 2013). Para a microalga marinha, Chaetoceros gracilis,
a -1
foram apresentados

por Moura Junior et al. (2006), em cultivos com meio de cul-

tura de F/2 de Guillard durante 10 dias. Quando comparados
com os valores encontrados para as estirpes de microalgas da
coleção IPR, nota-se que os presentes resultados foram simila-
res aos apresentados pelos autores.
00
2 0
1
d
n 2
1
200
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1 0 n 2
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n 7
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1
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oro
n 8
100
n 14
n 10
0 n 12
n 21
0
A
ru os de est r es de c or t sd oe o
Figura 11.3. a na biomassa de 37 estirpes de
Coleção IPR. n= número de estirpes em cada grupo

pelo teste de médias Scott-Knott (p

s atuam como fotorreceptores no ato primário

-
a a mostra alta absorção

na região entre 660 a 670 nm. Geralmente, em certas espécies
-
mesmo sendo o pigmento com coloração verde em maior abun-
pesquisas requerem cuidados especiais no manuseio das amos-

tras de microalgas e extração e doseamento devido à instabili-
A composição química das células microalgais varia de

acordo com as condições de cultivo. Assim, dependendo do
objetivo é necessário direcionar o cultivo para o composto que
se tem interesse. Em um estudo com microalgas da classe Chlo-
rophyceae de áreas montanhosas no Japão, Aburai e colabo-
radores (2013) relataram que, com a variação da intensidade
s também ocorreram
2 -1
a a,
quando a mesma é desmetilada e o íon metálico Mg é subs-
2+
tituído por dois átomos de hidrogênio. A obtenção desse deri-

vado se dá através da reação de hidrólise ácida (DUJARDIN
é o uso na saúde humana e animal. Soares (2010) sugeriu que

a
grande potencial para agregar valor a uma nova geração de
fármacos, podendo vir a constituir um princípio ativo de medi-
camentos.

Nas Figuras 11.4a e b são apresentados os valores

de feofitinas das estirpes componentes dos grupos de
cianobactérias e de clorófitas da coleção, formados pela
análise a partir das médias de produção das estirpes. No grupo
de 34 estirpes de cianobactérias as produções de feofitinas
-1
dia1. O grupo A (IPR7006)
-1
dia1 de
menores teores deste composto.
00
2 0
1
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1
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A
ru os de est r es de c or t sd oe o
Figura 11.4.
(b). n= número de estirpes em cada grupo pelo tes-

te de médias Scott-Knott (p

a -1
dia-1. O grupo A
dia1 -1
-
nas e o grupo J (14 estirpes) exibiu os menores teores (Figura
microalgas da Coleção IPR observa-se que a produção das cia-
11.5 Produção de Carotenoides Totais

pelas Microalgas
O teor dos carotenoides totais de cada estirpe de microalga
depositada na Coleção IPR foi determinado em amostras de
adição de ácido clorídrico.
carotenoides totais, de acordo com Strickland e Parson (1968),
-1
conforme descrito a seguir.
Carotenoides = [7,6 x A480

xA
Onde:
Carotenoides totais = mg L-1
v = volume de acetona usado na extração (mL);
V = volume de amostra centrifugada (mL);

c = caminho ótico (1 cm);
pelas microalgas da Coleção IPR estão apresentados na Figura
No grupo de 48 estirpes de cianobactérias a produção de

-1
dia1
L-1 dia1, os demais grupos (B a H) apresentaram valores entre

-1
dia1 de carotenoides e o grupo I (11 estir-
-1
dia1.
-
dia . A estirpe
-1 -1
IPR7024 do grupo B e a IPR7002 do grupo A apresentaram os
-1
dia-1 de carotenoides e o grupo H (28 estirpes)
Batista e colaboradores (2013) examinaram a composição quí-

mica e propriedades termo gravimétricas de cinco espécies de
microalgas com potencial aplicação na indústria de alimen-
tos: Chlorella vulgaris (carotenogênica), Haematococcus pluvia-
lis (carotenogênica), Spirulina maxima, e
Isochrysis galbana. As microalgas C. vulgaris e H. pluvialis apre-
sentaram alto conteúdo de carotenoides, porém, alto teor de
ácidos graxos, baixo teor de proteína e maior resistência ao tra-
tamento térmico, enquanto as espécies e I. galbana

00
1
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1
2 0
roten des u
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1 0 n 1
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0
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n 28
0
A
ru os de est r es de c or t d oe o
Figura 11.5. Teores de carotenoides totais em 48 estirpes IPR de

cianobactérias (a) e em 97 estirpes IPR de microalgas
-
po pelo teste de médias Scott-Knott (p
-
tas.
fundamental quando se pensa em isolamentos, manutenção em

coleção e multiplicação massal, visando à produção de bio-
massa microalgal para extração de coprodutos. Entre as estir-
pes isoladas de águas continentais no Estado do Paraná e atual-

mente mantidas em coleção (Coleção IPR de Microalgas do
grande diversidade em termos de características e de produção

de pigmentos e de proteínas. Essa diversidade é fundamental
e essas informações servem de base para nortear a seleção das
-
cação massal. As informações até aqui obtidas também indi-
Ainda são necessários estudos complementares para conhe-

cer melhor a diversidade e potencial biotecnológico de todas
as estirpes coletadas durante a execução do Projeto Microalgas,
microalgal e dos coprodutos de interesse, ainda são necessários
fatores abióticos nos cultivos.
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CAPÍTULO 12
INOCULAÇÃO DE CIANOBACTÉRIAS
EM LEGUMINOSAS E GRAMÍNEAS
Diva Souza Andrade

Gabriela da Silva Machineski
Gisele Milani Lovato
Kelly Campos Guerra Pinheiro de Goes

Introdução
procariot
-
ração simultaneamente em um mesmo compartimento, exer-
cendo um papel crucial nos ciclos biogeoquímicos do carbono
e oxigênio (VERMAAS, 2001). As cianobactérias ocupam uma
variedade de habitats do planeta, que incluem vastas áreas
com características extremas como desertos áridos, lagoas gla-

ciais e águas termais (HERRERO et al., 2001).
Dentro do grupo das cianobactérias, algumas espécies
-
gênio (FBN), processo de redução do nitrogênio atmosférico
(N2) a amônio, participando de forma efetiva no ciclo bio-
geoquímico deste elemento (MEEKS et al., 2002). Além de
microrganismos desperta interesse em diversas áreas, princi-
pelas mesmas. Na agricultura existe potencial do uso da sua
disso, existe o efeito ainda pouco estudado das microalgas em

geral sobre o crescimento das plantas, que pode ser decor-
-
mento ou até mesmo a FBN.
Explorar esses potenciais abre possibilidades de estudos
relacionados à inoculação de cianobactérias com capacidade
de fornecer nitrogênio para culturas de interesse econômico,
como plantas da : Poaceae (gramíneas) tais como, trigo
e milho, e Fabaceae (Leguminosa) como amendoim, feijão e
soja e, ainda, a coinoculação das mesmas com outras bactérias
as necessidades da planta. Milho (Zea mays L.) e trigo (Triti-

cum sativum
plantas respondem muito à adubação nitrogenada e por isso

nutriente. Leguminosas tais como a soja e o amendoim não

respondem à aplicação de N mineral, porque conseguem reali-
2
atmosférico quando em simbiose
ou mesmo com a associação destes com incrementos na produ-

ção de grãos.
O objetivo neste capítulo é discutir o potencial da inocu-
lação de cianobactérias, isoladas de águas continentais e salo-
bras no estado do Paraná, em sementes de culturas produtoras
de grão de interesse comercial, tais como o milho, trigo, feijão,
amendoim e soja. Neste contexto, o enfoque foi sobre os efei-
tos na promoção de crescimento. No organograma apresentado
na Figura 12.1 são destacados os principais procedimentos
metodológicos visando à seleção de estirpes de cianobactérias
promotoras de crescimento de plantas.
Figura 12.1. Organograma metodológico de bioensaios para seleção

de cianobactérias da Coleção IPR promotoras de cres-
cimento de plantas.

12.1 Potencial da Inoculação de

Cianobactérias
Existe uma variedade de fatores bióticos e abióticos que
podemos citar as interações destas com os microrganismos.

Para explorar o uso de microrganismos promotores de cresci-
mento de plantas na agricultura, devemos conhecer os poten-
ciais biotecnológicos dos mesmos. Nesta parte são apresenta-
As microalgas representam excelentes arquétipos para a

biotecnologia, podendo fornecer novos genes e biomoléculas
e ter diversos usos na agricultura e na indústria. Entretanto,
esforços concentrados são necessários para relacionar o com-
portamento ecológico in situ desses microrganismos com pro-
-
lação usando técnicas de análises moleculares, por exemplo,
interesse biotecnológico (PRASANNA et al., 2008).

Além de causarem efeitos nas plantas, alguns microrganis-
mos, incluindo as cianobactérias, podem ter efeito sobre algu-
mas propriedades do solo, sendo que algumas características
-
-
-
rico, auxiliar na agregação das partículas do solo (produção de
metabólitos) e com isso permitir a manutenção da umidade,
-
MADARI et al., 2013). A inoculação de cianobactérias pode
textura silte argilosa e, ainda, provocar mudanças microbioló-
desidrogenase, urease e fosfatase, e no teor de polissacarídeos

do solo (RAO et al., 1990). A inoculação de cianobactérias é
conhecida como melhoradora da estabilidade de agregados do

solo devido à excreção de polissacarídeos e lipídeos os quais

contribuem para o aumento da agregação do solo (FALCHINI
et al., 1996; OIKARINEN, 1996).
Em relação à exploração dos benefícios das cianobactérias
em culturas de interesse econômico, a prática mais conhecida
-
dos mantendo grande produtividade. A fertilidade dos solos
-
císticas, que ocorrem abundantemente nesses campos. Além
visíveis em campos alagados que apresentam a , uma

-
ria Anabaena, que se encarrega da FBN.
-
cialmente com espécies dos gêneros -
baena, e a maior difusão dessa prática foi relatada na Índia
-
térias vêm sendo investigados e alguns produtos comerciais
-
Soil Technologies -
Cyanotech Corporation (DAY et
al., 1999). Pinotti e Segato (1991) publicaram uma revisão
o uso como inoculantes do solo. Os benefícios da inoculação

de cianobactérias têm sido amplamente avaliados não apenas
(ROGER et al., 1987), mas para outras culturas
como ervilha (OSMAN et al., 2010), trigo (Triticum aestivum L.)
(KARTHIKEYAN et al., 2007; MAZHAR et al., 2011), soja (Gly-
cine max L. Merr.), aveia (Avena sativa L algodão (Gossypium
hirsutum L.), cana-de-açúcar (Saccharum sp.), milho (Zea mays

L.), pimenta (Capsicum annuum L.), feijão (Phaseolus vulgaris

L.), melão (Cucumis melo L.), alface ( L.), tomate
(Solanum lycopersicum L.) e rabanete (Raphanus sativus L.), de
acordo com (RODGERS et al., 1979).
12.2 Interação entre Cianobactérias e Outros

Microrganismos
Além da interação com plantas, as cianobactérias tam-
solo. O efeito promotor de crescimento microbiano exercido

pelas cianobactérias, parece também ocorrer com microrganis-
-
tos aquosos de microalgas estimulam o crescimento de outros
microrganismos de interesse do agronegócio.
Em um trabalho de controle biológico de Colletotrichum
sublineolum, agente causal da antracnose em sorgo (Sorghum
bicolor -
trado de cultura de Synechococcus leopoliensis e sp. esti-
mulou a germinação de conídios e o crescimento micelial do
fungo -
trados das cianobactérias foi atribuído aos nutrientes em con-
-
toras de crescimento.
Já foi observado que extratos aquosos de microalgas esti-
mulam o crescimento de outros microrganismos de interesse
do agronegócio. Fingerhut e colaboradores (1984) relataram
os efeitos da microalga e de extrato de
-
bium japonicum, uma estirpe isolada de plantas de soja. Em
crescimento da bactéria. Em contraste, o aumento das concen-

trações do extrato aquoso das microalgas em meio de cultura

aumentou a produção bacteriana. A interação positiva entre
-
radores (2010) observaram que culturas de sp. agem
como um probiótico e estimulam o crescimento da microalga
Botryococcus braunii
de crescimento lento. Os autores sugerem uma aplicação prá-
em larga escala dessas microalgas.
mutualística entre microalgas e algumas bactérias promotoras

de crescimento podem estimular o crescimento de espécies de
microalgas. A bactéria Bacillus pumilus -
plano de cactos proveniente de uma região árida, conhecida
como promotora de crescimento de plantas pôde promover
o crescimento da microalga Chlorella vulgaris em um experi-
-
NANDEZ et al., 2009).
12.3 Metabólitos de Cianobactérias

de Interesse Agronômico
A inoculação de cianobactérias e o uso de seus metabólitos
são de interesse agronômico tais como: produção de compos-
tos estimulantes para o crescimento de plantas, aumento na
concentração de microelementos essenciais no solo, tanto na
nutrição das plantas como na absorção de íons, aumento do
-
como aminoácidos, açúcares e vitaminas (SHARIATMADARI et

-
cias promotoras de crescimento de vegetais, que desempenham
-

nobactérias dos gêneros Anabaena e mostraram efeitos
e plantas herbáceas, pela produção de auxina (HASHTROUDI

et al., 2013).
Em um trabalho de revisão, Palacios e colaboradores
(2014), discutiram o papel das vitaminas e cofatores nas inte-
-
-
nham papel central na regulação do crescimento também das
próprias microalgas, conforme descrito para espécies dos gêne-
ros Chlorella e Scenedesmus, que obtiveram respostas no con-
de auxinas (BAGWELL et al., 2014) e, para a espécie de C. vul-

garis, com aumentos nas concentrações de pigmentos fotossin-
téticos, monossacarídeos e proteínas solúveis (PIOTROWSKA-
-NICZYPORUK et al., 2014).
12.4 Caracterização de Cianobactérias

da Coleção IPR
No processo de seleção de estirpes de cianobactéria com
potencial para uso em inoculantes comerciais, a escolha
-
importante. Em seguida, são necessários bioensaios para deter-

minar a produção de compostos de interesse, por exemplo, em
meio de cultura sem fonte de N para selecionar aquelas com
maior capacidade de FBN e também como produtoras de subs-
Coleção IPR de Microalgas do Instituto Agronômico do Paraná

-

cionadas cinco estirpes de cianobactérias da Coleção IPR de

Microalgas alocada no Laboratório de Microbiologia do Solo do
Arthrospira platensis foi cedida
pela Dr. Iracema de Oliveira Moraes, (Fundação André Tosello,
FTAT, Coleção de Culturas Tropical, Campinas, Brasil).
As estirpes de cianobactérias da Coleção IPR foram culti-
vadas em frascos contendo 200 mL de meio de cultura líquido
BG-11 (ALLEN, 1968; ALLEN et al., 1968; RIPPKA, 1988) e
°C
-
culo. As informações morfológicas celulares das cianobactérias
da Coleção IPR foram obtidas pela observação em microscópio
-
-
ção de espécimes do grupo Cyanophytas (BICUDO et al., 2006;
GUIMARÃES et al., 2009). Na Figura 12.2 são apresentadas
imagens das células das cianobactérias.
As estirpes de cianobactérias IPR-7029, Arth p
Syn-7061 e Syn-7062
(Figura 12.2).
das sequências geradas pelo sequenciamento parcial do gene

ribossomal 16S rRNA mostraram que as estirpes de cianobacté-
rias, IPR7061 e IPR7062, apresentaram identidade de sequên-
ynechocystis sp. e a estirpe
IPR7070 com a sp.

Figura 12.2. -
-
lho, em casa de vegetação no IAPAR, Londrina, PR. Au-
mento de 100x.
12.5 Produção de Hormônios

por Cianobactérias
Os indutores de crescimento são relatados na literatura
Anabaena e de ocorrên-
cia em solos Iranianos e com muitos destes isolados com efeitos
no crescimento de vegetais (HASHTROUDI et al., 2012). Na
literatura existem trabalhos sobre os efeitos dos extratos de
microalgas em plantas de interesse econômico na agricultura.
Em cultivos axênicos de duas espécies de microalgas, Scenedes-
mus armatus e Chlorella pyrenoidosa, foi observada a presença
de compostos indutores de crescimento ou com outras funções,
tais como; ácido indol acético (MAZUR et al., 2001).
e auxina em bioensaios de pepino, soja e feijão, em que se veri-

(STIRK et al., 2002).

Arthospira platensis estirpe
ácido 3-indol acético (AIA) em meio de cul-

tura com e sem triptofano. A bioatividade do AIA excretado
pela
laterais de Pisum sativum e efeito negativo no comprimento de
Rao e colaboradores (2001) relataram o efeito promo-

tor de crescimento de extratos aquosos das microalgas Hae-
matococcus pluvialis e Spirulina platensis (Arthrospira platensis)
avaliados pela acumulação de betalaínas (corante alimentar)
e tiofenos (inseticida útil contra a deterioração de grãos) em
pelos radiculares das culturas de Beta vulgaris e Tagetes patula,
das plantas com extratos (100 de células secas mL-1 de meio

de cultura de cada uma das espécies) houve aumento na bio-
Beta vulgaris
quando inoculadas com H. pluvialis e S. platensis em relação ao
controle sem extrato. Os autores observaram também que, o
extrato de H. pluvialis
pelos radiculares em T. patula e as plantas tratadas comesse
extrato aumentaram o acúmulo de tiofeno. Nesse experimento,
o extrato de S. platensis não alterou nem o crescimento e nem a
acumulação de tiofeno.
12.6 Quantificação in vitro da FBN em

Cianobactérias da Coleção IPR
Estudos prévios com testes in vitro que visam avaliar a

-
-
lisa a conversão do N2 em amônia, tornando o N disponível
para reações biológicas (RAVEN et al., 2001). Assim, as cia-
do solo, e constituem alternativa promissora que incrementa a

biodiversidade do solo (MARCHESAN et al., 2007).
Mesmo conhecendo a contribuição das cianobactérias para
a manutenção da fertilidade de áreas cultivadas de ecossiste-
mas (RICHMOND, 2004). Esse potencial ainda não tem uma
aplicação ampla na agricultura brasileira. A divulgação de
resultados de pesquisas pode contribuir para a implantação da
prática de inocular ou coinocular em outras culturas de impor-
Em um esforço para elucidar diferenças e semelhanças

subjacentes que governam a capacidade de FBN por cianobac-
-
bros do gênero Cyanothece. Cyanothece
membro deste gênero, tem mostrado capacidade para reali-
de Cyanothece spp. cultivadas sob condições idênticas, suge-

rindo que esses processos são controlados pelo ciclo diurno e,
cada estirpe. Apesar destas diferenças inerentes, a capacidade
e produção de hidrogênio parece ser uma característica deste

gênero (BANDYOPADHYAY et al., 2013).
Para a seleção de cianobactérias com potencial de inocu-
in vitro em
meio de cultura BG11 (ALLEN, 1968; ALLEN; STANIER, 1968;

RIPPKA, 1988), sem adição de N. Após o cultivo das cianobac-

térias em condições de temperatura (28 2°C) e luminosidade
(fotoperíodo de 12 h) controladas, o nitrogênio existente no
cultivo de cada estirpe foi extraído pelo processo de digestão
do método clássico de microKjeldhal, descrito em Vogel (1992)
-
dos na Figura 12.3.
Figura 12.3. in vitro por cianobac-

térias (IPR7029, Arth p Syn7061, Syn7062, 7069
e 7070), em meio de cultura sem N.
in vitro
-1
para a IPR7061. As estirpes IPR7061 e 7069 se destacaram
do que as demais.

(SROGA, 1997) e a produção de compostos, tais como citoci-

ninas e auxinas (STIRK; ÖRDÖG; VAN STADEN; JÄGER, 2002)
que promovem o crescimento de plantas, representando uma
12.7 Inoculação de Cianobactérias em Milho,

em Casa de Vegetação
estirpes de cianobactérias da Coleção IPR no desenvolvimento

de plantas de milho (Zea mays -
mento, em vasos de 300 mL, em casa de vegetação. As semen-
tes de milho da variedade IPR164 foram embebidas em sus-
7062, 7069 e 7070), crescidas em meio BG11. Como controle,
as cianobactérias. Os tratamentos foram as seis estirpes semea-

das em vasos contendo solo autoclavado e natural. O delinea-
repetições, sendo cada uma delas composta de duas plantas
aérea.
A Figura 12.4 ilustra o efeito da inoculação com a estirpe
de cianobactéria IPR-7069 em sementes de milho: a) solo auto-
clavado e solo natural, b) solo autoclavado e c) solo natural
comparados com os controles sem inoculação.


Figura 12.4.
em autoclave e solo natural, sementes inoculadas com
IPR7069, em casa de vegetação. B) plantas de milho
cultivadas em solo autoclavado, controle sem inocu-
lação e inoculado com a IPR7069. C) plantas de milho
cultivadas em solo natural, controle sem inoculação e
inoculado com a IPR7069.
As plantas cultivadas em solo autoclavado não apresen-

-
em que a inoculação da cianobactéria IPR7029 apresentou-se
inoculadas com a IPR7062 (Tabela 12.1).

As estirpes de cianobactérias mostraram capacidade de
in vitro, porém não foi observado o efeito sig-

Tabela 12.1. Efeito da inoculação de células de estirpes IPR de cia-

nobactérias no crescimento de plantas de milho.
Massa seca
Altura das Tamanho Massa seca
da parte
plantas do colmo
aérea
Tratamentos (cm) mm (g)
Solo autoclavado
IPR 7029 42,33 a 31,42 a 1,2 a
27 a 0,82 a 1,34 a
IPR7061 39,67 a 33,67 a 2,93 a 0,93 a 1,19 a
IPR7062 39,83 a 32,83 a 3,18 a 1,21 a 1,6 a
IPR7069 38 a 3,12 a 1,2 a
IPR7070 37,67 a 2,92 a 1,07 a 1,49 a
Controle 39,42 a 33 a 2,82 a 0,96 a 1,38 a
10,84 17,66 12,08
Solo natural
IPR7029 37,08 a 34,92 a 3,12 a 1,86 a
34,00 a 32,33 a 0,91 a 1,44 ab
IPR7061 36,33 a 2,73 a 1,27 ab
IPR7062 34,33 a 36 a 0,96 a 1,09 b
IPR7069 2,88 a 0,96 a 1,22 ab
IPR7070 34,92 a 37,67 a 3,4 a 1,02 a 1,23 ab
Controle 34,17 a 2,82 a 0,79 a 1,08 b
8,31 13,99 13,97 17,46

* Médias seguidas de mesma letra na coluna e dentro de cada variável não diferem entre si pelo teste
Tukey a 5% de probabilidade.

o o utoc do o o N tru
18
16
1
1
12
10
8
6
2
0
Figura 12.5. Teores de nitrogênio foliar das plantas de milho ino-

culadas com estirpes de cianobactérias em solo au-
toclavado e solo natural. Médias seguidas de mesma
Nas demais avaliações, com exceção da massa seca de
os tratamentos, tanto no solo natural como no autoclavado.

Contudo, estudos testando outros gêneros de cianobactérias
obtiveram resultados positivos para essa cultura. Maqubela
e colaboradores (2009) obtiveram aumento no crescimento e
absorção de nitrogênio de plantas de milho cultivadas em solo
com inoculação da cianobactérias do gênero
12.8 Inoculação do Trigo com Cianobactérias

-
mento de culturas de grãos enriquecidas com micronutrientes.
Existe uma crescente necessidade de inclusão de inoculação
com microrganismos promotores de crescimento para comple-
-

ção da desnutrição nos países em desenvolvimento. A qualidade

nutricional de grãos de trigo, em termos de teor de proteína e
micronutrientes, foi avaliada em função da inoculação de uma
bactéria promotora de crescimento de plantas (Providencia sp.
Anabaena sp. (CW1 e Cw3)
e Calothrix sp. (CW2). Análises comparativas com o controle
P K ) revelaram que a inoculação de Pro-
60 60 60
videncia P K resultou em aumentos nos grãos
60 60 60
Os efeitos da inoculação de cianobactérias IPR na promo-

ção de crescimento na cultura do trigo, produção de grãos e
absorção de nutrientes foram avaliados em campo. Os experi-
em Guarapuava, PR. As sementes de trigo foram inoculadas

antes do plantio com os cultivos das cianobactérias previa-
após o ciclo da cultura o efeito dessa inoculação na absorção

de N e na produtividade do grão de trigo (Figura 12.6).
A inoculação das diferentes estirpes de cianobactérias em
-
mulo com aumentos na produção de grão de trigo e na quan-
tidade de nitrogênio total nos grãos de trigo do que as demais.

Figura 12.6. Efeito da inoculação de cianobactérias em sementes

de trigo. (a) Teor de nitrogênio nos grãos de trigo e
(b) produtividade em kg ha-1. Médias de cinco repeti-
probabilidade.

A inoculação de microrganismos têm mostrado incremen-

tos na produtividade do trigo. Efeitos da inoculação de -
rillum brasilense
relatados em condições normais de cultivo de sequeiro em 297
locais experimentais na região de Pampas da Argentina. As res-
de trigo colhidos e o rendimento de grãos de 260 kg ha-1 em

-
cia de grandes limitações ao crescimento da cultura, sugerindo
a contribuição complementar da inoculação com
brasilense (DÍAZ-ZORITA et al., 2009). No Brasil, trabalhos
desenvolvidos por Hungria e colaboradores (2010), também
mostram a resposta na produção de grãos de trigo e milho a
inoculação de estirpes selecionadas de e
A. lipoferum.
12.9 Dupla Inoculação: Rizóbios

e Cianobactérias
considerada uma alternativa para o cultivo de baixo-nitrogê-

nio-intensivo de microalgas para a produção sustentável de
biocombustíveis de próxima geração e outros bioprodutos. A
-
ponta como matéria-prima promissora para os biocombus-
tíveis de próxima geração. O amônio excretado pelas células
mutantes de
mais amônio foi biodisponível para promover o crescimento de
. Em adição, esta simbiose sintética também

óleo usando tanto de carbono e nitrogênio do ar.

A maioria dos trabalhos sobre inoculantes com cianobac-
atenção. Na agricultura, a estratégia que tem ganhado desta-

que nos ultimos anos é a de combinar os inoculantes microbia-
-
lha ( ), duas espécies de cianobactérias ( -
phytum e ) foram testadas como biofer-
A inoculação no solo com essas cianobactérias isoladas ou em

combinação resultou em aumentos na taxa de germinação da
que
e citocinina do que , que apresentou mais gibe-
sobre o crescimento e produção de ervilha (OSMAN; EL-SHE-

EKH; EL-NAGGAR; GHEDA, 2010).
No início da década de setenta alguns trabalhos de uso
variedades de tomate (Pusa Ruby e Seleção 120) responderam

positivamente à inoculação com microalgas em termos de pro-
sobre o teor de vitamina C dos frutos. A aplicação combinada
adubo apenas (KAUSHIK et al., 1979).
depende das espécies de microalgas bem como dos métodos

pelo qual os solos são tratados. Compostos biologicamente ati-
vos podem ser liberados a partir de cianobactérias que crescem
na superfície de solos úmidos. Tais compostos também podem

ser libertados como exsudados de cianobactérias cultivadas em

meio de cultivo líquido. Rodgers e colaboradores (1979) des-
crevem a inoculação do solo em vasos, contendo rabanete ou
tomateiro, com suspensões de cianobactérias ou exsudados, o
que resultou em aumentos das taxas de crescimento de ambas
as plantas e aumentou seu rendimento global. No geral, não
-
dos autoclavados e os exsudados frescos sem nenhum procedi-
também estão bem documentados (GUPTA et al., 1973). Além

2
-
dade variável de auxina, na presença de diferentes concentra-
em laboratório devido as diferentes características, tais como, a
e de auxina. As duas estirpes de cianobactérias selecionadas

Phormidium
ácido cianídrico. Os autores concluíram que, as estirpes de cia-
enorme potencial para aumentar o crescimento do trigo.
em leguminosas, foram instalados experimentos em campo em

estações experimentais do IAPAR. As estirpes de
tropici, SEMIA4077 (CIAT899) recomendada pelo MAPA para
a cultura do feijoeiro, SEMIA6144 (FEPAGRO) recomendada

Como testemunha foi incluído um tratamento com adubação

de N (ureia). Na pesquisa foram avaliados o número e a massa
de 1.000 células g-1 de solo. Resultados da nodulação das plan-

tas inoculadas com cianobactérias são apresentados para o fei-
joeiro no município de Ponta Grossa, PR (Figura 12.7), para o
e para a soja no município de Ponta Grossa, PR (Figura 12.9).

A coinoculação da estirpe de
(SEMIA4077=CIAT899) recomendada para o feijoeiro com a
de cianobactéria IPR-Arth -
joeiro (Figura 12.7a). Os resultados na massa de nódulos secos
(Figura 12.7b) do feijoeiro demonstraram que houve diferença
estatística entre os tratamentos inoculados com a estirpe padrão
de coinoculação da SEMIA-4077 e IPR-7061 (T6) e (T7) para

com os demais.
Os resultados do número de nódulos por planta (Figura
12.8a) diferiram estatisticamente, o tratamento coinoculado
com a estirpe padrão e IPRArth p
apenas com a estirpe SEMIA6144. O incremento no número de
-
Arth p
demais tratamentos não diferiram entre si (Figura 12.8b).

(a) a
50
40
.planta-1
ab b
30 b b
b
20
10
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamentos
(b) a
30 a a
a a
25
mg.planta-1
20
15
b
10
b
5
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamentos
Figura 12.7. a) Número de nódulos (no planta-1); b) massa de nó-
dulos secos (mg planta-1) em feijoeiro, cv. IAPAR81,
inoculado com -SEMIA4077 (T1), inoculado com
IPRArth p
-
noculado com SEMIA4077 e IPR7061 (T6) e coinocu-
lado com SEMIA4077 e IPRArth p
não diferem estatisticamente pelo teste “t” (5%).

(a)
160 b
140
120 ab ab
.planta-1
ab ab
100 ab
0 b
60
40
20
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
(b)
00 a Tratamentos
700
600 ab ab
mg.planta-1
b b b
500 b
400
300
200
100
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamentos
Figura 12.8. (a) Número de nódulos (no planta-1) e (b) massa de
nódulos secos (mg planta-1) em amendoim, cv. IAC-
-Tatu, inoculado com SEMIA6144 (T1), inoculado
com IPRArth p
coinoculado com SEMIA6144 e IPR7061 (T6) e coino-

culado com SEMIA6144 e IPRArth p
de seis repetições e se seguidas pela mesma letra não

(a)
100 a
ab ab ab ab
0 ab
.planta-1
b
60
40
20
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamentos
(b)
500 a a
a a
a
400
a
mg.planta-1
300
b
200
100
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tratamentos
Figura 12.9. (a) Número de nódulos (no planta-1) e (b) massa de
nódulos secos (mg planta-1) em soja, inoculada com
Arth p
adubada com nitrogênio (T3), testemunha (T4), inocu-
IPRArth p -
guidas pela mesma letra não diferem estatisticamente

Os resultados do número de nódulos por planta de soja no

tratamento com a coinoculação da estirpe de
japonicum Arth
p -
bada (T3) (Figura 12.9a). Houve acréscimo no número de nódu-
los em todos os tratamentos que correspondem à inoculação e
coinoculação quando comparados com a testemunha adubada.
Para massa de nódulos secos todos os tratamentos diferiram
estatisticamente da testemunha adubada (Figura 12.9b).
Os resultados de produção em função da inoculação com
estação experimental do IAPAR em Umuarama, PR, com o

mesmo delineamento dos experimentos de campo já mencio-
nados, são apresentados na Tabela 12.2.
Na produtividade de feijão, em Umuarama, os tratamentos
com as sementes inoculadas com IPRArth p -
noculado com a bactéria e IPR7061 (T6) apresentaram dados
estatísticos similares ao tratamento adubado com nitrogênio
(T3), diferindo esses três tratamentos da testemunha (T4).
O extrato da microalga Phormidium foveolarum inoculado
como pré-tratamento de sementes de
incluindo comprimento, número e peso de vagens e de semen-

tes por planta (GUPTA; GUPTA, 1973).

Tabela 12.2. Produção de grãos, matéria seca da parte aérea (MSPA),

número de nódulos, matéria seca de nódulos (MSN),
nitrogênio total na parte aérea (PA) e nos grãos de
feijão em função da inoculação com -
pici (SEMIA4077) e cianobactérias IPRArtp
IPRSyn7061. Umuarama, PR.
N total N total
Grãos MSPA Nódulos MSN
PA grão
Tratamentos
No
kg ha-1 g pl-1 mg pl-1 kg ha-1
planta-1
SEMIA4077 32,0 bc 129,2 b

bc ab
IPRArth p 1.670 a 4,89 b 44,2 ab 144,3 b

ab ab
N mineral 1.684 a 8,43 a 24,0 c 18,33 c 223,3 a
49,98
Testemunha 3,09 c 48,2 a 79,8 c 43,81 b
ab
123,6
IPR7061 4,83 b 33,0 bc
ab bc ab
SEMIA4077 + 122,7
1.664 a 4,64 bc 38,8 ab
IPR7061 bc ab
SEMIA4077 + 1.326 49,26

33,2 bc
IPRArth p ab ab
Valor F 1,19* 2,01* 2,72** 1,26*
22,64 31,42
*, ** e *** significativo a 10, 5 e 1% de probabilidade, respectivamente. Médias seguidas pela mesma letra,
na coluna, não diferem entre si, pelo Teste t.

Palaniappan e colaboradores (2010) relataram o efeito de

uma formulação de cianobactéria Phormidium sp. e seu extrato
aquoso na germinação e crescimento de caupi ( -
lata
aumentou a germinação in vitro. Também a aplicação dupla, na
no solo na semeadura e na área foliar, promoveu aumentos na
-
culares e biomassa quando comparados com o controle.
Os efeitos das cianobactérias nos ensaios de campo com
feijão, amendoim e soja, no Paraná podem ser atribuídos, pos-
A. platensis -
nase apareceu predominantemente na região citoplasmática e
estresses a cianobactéria (PRIHANTO et al., 2014). A adição da

biomassa Chlorella pyrenoidosa
(YADAVALLI; HEGGERS , 2013).
A busca por aumentos na produtividade da agricultura
sustentável tem levado a diversos estudos com a inoculação
N2 -
mento vegetal representam uso potencial na agricultura como
fonte de nitrogênio, visando incrementar a produtividade de
As respostas da inoculação de cianobactérias são depen-

dentes das condições ambientais de clima, solo e espécie da
cultura inoculada. Para o sucesso da inoculação dois aspectos
tecnologia de aplicação adequada de inoculantes. Entretanto,

os inoculantes à base de cianobactérias ainda no mercado bra-
sileiro são desconhecidos.

São necessários mais estudos onde as cianobactérias sejam

aplicadas individualmente ou em consórcio com outras bac-
esses organismos, uma melhor seleção poderá ser alcançada

podendo resultar em benefícios diretos em práticas agrícolas.
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Health Science and Engineering, v.11, n.1, 2013/12/19, p.1-6. 2013.

CARLOS ALBERTO RICHA
Governador do Estado do Paraná
NORBERTO ANACLETO ORTIGARA

Secretário de Estado da Agricultura
e do Abastecimento
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ - IAPAR
FLORINDO DALBERTO
Diretor-Presidente
ARMANDO ANDROCIOLI FILHO

Diretor de Pesquisa
ALTAIR SEBASTIÃO DORIGO

Diretor de Administração e Finanças
ADELAR ANTONIO MOTTER

Diretor de Gestão de Pessoas
MARCOS VALENTIN FERREIRA MARTINS

Diretor de Inovação e Transferência de Tecnologia

Esta publicação, Microalgas de Águas Continentais: Potencialidades e Desafios do
Cultivo, é o segundo volume de um conjunto de três, que foram escritos como parte
das atividades do Projeto Microalgas, desenvolvido com o objetivo de estudar as
2 MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS
VOLUME 2
microalgas como fonte alternativa de energia e de coprodutos de valor agregado

com possibilidades de aplicações biotecnológicas.
Nos capítulos deste volume são apresentadas informações quantitativas sobre
PRODUÇÃO DE
trabalhos científicos, revisões de literatura e publicações que tratam do tema
microalgas. Além disso, é apresentado um roteiro para a realização de buscas
nas principais bases de dados mundiais. Na sequência, é discutido o biodiesel
produzido a partir das microalgas, as técnicas de cultivo destes microrganismos
BIOMASSA E
para essa finalidade e as exigências climáticas para o cultivo massal em diferentes
regiões do Estado do Paraná. Também é considerado o aproveitamento de resíduos
agroindustriais paro o cultivo de microalgas, como forma de destinação desses
resíduos. Fotobiorreatores abertos e fechados para o cultivo massal são abordados
COPRODUTOS
e os principais fatores bióticos e abióticos que podem influir na eficiência do
cultivo são descritos. Também é apresentado um estudo de caso com dados reais
PRODUÇÃO DE BIOMASSA E COPRODUTOS

de um fotobiorreator aberto. Uma coleção de microalgas foi montada durante o
Diva Souza Andrade e Arnaldo Colozzi Filho | Editores

desenvolvimento do projeto e detalhes sobre a amostragem, o isolamento das
microalgas para obtenção de culturas puras, a caracterização morfológica dos
isolados obtidos, a preservação dos cultivos ex situ e a determinação da viabilidade
celular dos isolados obtidos e depositados na coleção são apresentados. Técnicas
de biologia molecular foram utilizadas para a caracterização das microalgas
e os resultados do sequenciamento completo de microalgas e dados sobre o
levantamento dos gêneros de microalgas que ocorrem nas águas continentais do
Estado do Paraná são discutidos. Também são abordados, a partir de dados de
pesquisa, temas relacionados à composição lipídica das microalgas, a produção e
concentração de proteínas, pigmentos, clorofila e outras moléculas de importância
bioquímica, com relações entre as condições de cultivo e a produção dessas
DIVA SOUZA ANDRADE
moléculas. Por fim, são fornecidas informações sobre a possibilidade de utilização
das cianobactérias, microalgas fixadoras de nitrogênio atmosférico, para a
ARNALDO COLOZZI FILHO
inoculação de leguminosas e gramíneas. EDITORES
Essas informações abrem novas possibilidades de utilização de inoculantes
microbianos nas culturas agrícolas no Brasil.
ISBN 858818449-4
9 788588 184497
Diva Souza Andrade
Editores

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Esta publicação, Microalgas de Águas Continentais: Potencialidades e Desafios do

microalgas como fonte alternativa de energia e de coprodutos de valor agregado

PRODUÇÃO DE BIOMASSA E COPRODUTOS

Diva Souza Andrade e Arnaldo Colozzi Filho | Editores

Capa 2 - Alisson.indd 1 15/08/2014 16:46:08

NORBERTO ANACLETO ORTIGARA

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ - IAPAR

ARMANDO ANDROCIOLI FILHO

ALTAIR SEBASTIÃO DORIGO

ADELAR ANTONIO MOTTER

MARCOS VALENTIN FERREIRA MARTINS

Capa 2 - Alisson.indd 2 15/08/2014 16:46:09

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ

5 Livro Microalgas V2.indb 1 30/07/2014 09:46:55

Esta publicação, MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS: PRODUÇÃO DE BIO-

Paranaense de Energia Elétrica – COPEL /Geração de Energia e a Fundação de Apoio a

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

M626 Microalgas de águas continentais / editores: Diva Souza

Produção de biomassa e coprodutos - v.3. Coleção IPR de

1. Microalga – Cultivo. 2. Microalga – Biotecnologia. I.

Impresso no Brasil / Printed in Brazil

5 Livro Microalgas V2.indb 2 30/07/2014 09:46:56

Arnaldo Colozzi Filho

5 Livro Microalgas V2.indb 1 30/07/2014 09:46:56

Admilson Lopes Vieira

Arnaldo Colozzi Filho

5 Livro Microalgas V2.indb 3 30/07/2014 09:46:56

Diva Souza Andrade

Elisângela Andrade Angelo

Fernanda de Almeida Fin de Lima

Freddy Zambrano Gavilanes

Gabriela da Silva Machineski

5 Livro Microalgas V2.indb 4 30/07/2014 09:46:56

Graziela Moraes de Cesare Barbosa

Helder Rodrigues da Silva

Iara Cintra de Arruda Gatti

João Henrique Caviglione

Juscélio Donizete Cardoso

5 Livro Microalgas V2.indb 5 30/07/2014 09:46:56

Lisandra Ferreira de Lima

Lucas Alves Maroubo

Maria Aparecida de Matos

Maria Elisabeth da Costa Vasconcellos

5 Livro Microalgas V2.indb 6 30/07/2014 09:46:56

Patrícia Cristina Gomes

Rafael Bruno Guayato Nomura

5 Livro Microalgas V2.indb 7 30/07/2014 09:46:56

quantidade e qualidade do material graxo e dos co-

5 Livro Microalgas V2.indb 9 30/07/2014 09:46:56

5 Livro Microalgas V2.indb 10 30/07/2014 09:46:56

CO2, contribuindo não apenas para a disponibilidade de

de biomassa que pode ser utilizada como fertilizantes,

5 Livro Microalgas V2.indb 11 30/07/2014 09:46:56

contribuição inestimável a pesquisadores, professores

óleo e produção do biodiesel de microalgas são apre-

de microalgas com potencial de utilização para a pro-

5 Livro Microalgas V2.indb 12 30/07/2014 09:46:56

ocorrência e cultivo de microalgas nesses materiais são

cultivo de microalgas em biorreatores de bancada. São

5 Livro Microalgas V2.indb 13 30/07/2014 09:46:56

de registro e depósito dos espécimes para o estabeleci-

5 Livro Microalgas V2.indb 14 30/07/2014 09:46:56

O décimo capítulo aborda assuntos relacionados