UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

PEDRO HENRIQUE MARTINS MUSSI CORRÊA

MEIOS DE CULTIVO DE INTERESSE INDUSTRIAL

CURITIBA
2023
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 2
2. CLASSIFICAÇÕES DE MEIOS DE CULTIVO ....................................................... 3
2.1 CONSISTÊNCIA ............................................................................................... 3
2.1.1 Líquido ........................................................................................................... 3
2.1.2 Sólido ............................................................................................................. 5
2.1.3 Semi-sólido .................................................................................................... 7
2.2 ORIGEM DOS COMPONENTES ...................................................................... 8
2.2.1 Complexos ..................................................................................................... 8
2.2.2 Sintéticos ...................................................................................................... 11
2.3 FUNÇÃO ......................................................................................................... 12
2.3.1 Meio redutor ................................................................................................. 12
2.3.2 Meio seletivo ................................................................................................ 13
2.3.3 Diferenciais .................................................................................................. 13
2.3.4 Meio enriquecido .......................................................................................... 14
3. FATORES IMPORTANTES PARA O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS
.................................................................................................................................. 15
3.1 TEMPERATURA ............................................................................................. 15
3.2 pH.................................................................................................................... 16
3.3 PRESSÃO OSMÓTICA ................................................................................... 17
3.4 FATORES QUÍMICOS .................................................................................... 18
3.4.1 Carbono ....................................................................................................... 18
3.4.2 Nitrogênio, enxofre e fósforo ........................................................................ 18
3.4.3 Elementos-traço ........................................................................................... 19
3.4.4 Oxigênio ....................................................................................................... 19
4. TRABALHOS RECENTES RELACIONADOS A MEIO DE CULTIVO INTERESSE
INDUSTRIAL ............................................................................................................ 20
4.1 USO DE INTELIGÊNCIA ARTIFICIAL NA OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS
DO MEIO DE CULTIVO ........................................................................................ 20
4.2 PRODUÇÃO DE ETANOL PARTINDO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS 21
4.3 PRODUÇÃO DE EXO‑POLYGALACTURONASE USANDO CASCA DE UMBU
COMO SUBSTRATO ............................................................................................ 21
4.4 PRODUÇÃO DE NANOCELULOSE BACTERIAL USANDO RESÍDUOS
AGROINDUSTRIAIS ............................................................................................. 22
5. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 22
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1. INTRODUÇÃO

Meios de cultura são soluções que possuem os nutrientes adequados para o

crescimento de um microrganismo específico. Além de nutrientes, o meio deve ter o
volume necessário de água, o pH correto para a célula a ser cultivada e uma
concentração adequada de oxigênio, podendo ser zero. Em geral, os meios
possuem uma fonte de carbono e nitrogênio, fatores de crescimento e elementos
traço, porém outros componentes podem ser adicionados dependendo de cada
microrganismo (TORTORA, FUNKE, CASE, 2017; SINGH, 2022).
Os meios de cultura possuem diversas aplicações como no diagnóstico de
doenças infecciosas, obtenção de antígenos, desenvolvimento de vacinas, estudos
genéticos e identificação de espécies de microrganismos. Além disso, são de
extrema importância para o isolamento de culturas puras, no armazenamento de
estoque de células, para testes de contaminação, no desenvolvimento de agentes
antimicrobianos e conservantes, para a determinação de células viáveis e para o
teste da sensibilidade de antibióticos (SINGH, 2022).
Além do mais, os meios de cultura podem ser classificados pela consistência,
podendo ser sólidos, semi-sólidos ou líquidos. Também é possível dividi-los pela
origem dos componentes, podendo ser complexos ou sintéticos. Outra classificação
é feita com base na função do meio, podendo ser seletivo, diferencial, redutor,
enriquecido e entre outras (SINGH, 2022).
Muitas das características desejadas para microrganismos de interesse
industrial dependem do meio de cultura utilizado. Dessa forma, a escolha do meio
influência na capacidade das células de permitirem o acúmulo do produto no meio,
na produção de substâncias incompatíveis com o produto, na eficiente conversão do
substrato em produto, no comportamento fisiológico constante e na rápida liberação
do produto para o meio (SCHMIDELL, 2001).
Além disso, são características específicas de meios de cultura industriais
serem o mais barato possível, serem adequados às necessidades nutricionais do
microrganismo a ser cultivado, não resultarem em dificuldades na recuperação do
produto, não provocarem problemas no tratamento do efluente e terem composição
razoavelmente conhecida. Também é importante que os componentes presentes no
meio possibilitem tempo de armazenagem para que estejam disponíveis o tempo
todo. Outro atributo interessante é que os meios ajudem no controle do processo,
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por exemplo um meio tamponado, evitando grandes variações no pH e demasiada

formação de espuma (SCHMIDELL, 2001).
Normalmente, os meio usados para as pesquisas iniciais de isolamento
possuem substâncias caras. Dessa maneira, o uso desses componentes no
processo industrial é inviável, sendo necessário usar outros materiais porém que
mantenham a mesma produtividade. Em vários processos fermentativos industriais
são utilizadas matérias-primas, como caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas e
entre outros componentes. No entanto, esses materiais possuem variação na
composição química, tornando necessário que as industriais tenham meios de
padronizar a composição de cada lote, evitando problemas nos biorreatores
(SCHMIDELL, 2001).
A utilização de resíduos de indústrias na composição dos meios de cultivo é
um tópico de interesse de estudo. As indústria relacionadas com a agricultura geram
vários resíduos que são biodegradáveis e ricos em nutrientes. A utilização desses
compostos permite ao mesmo tempo resolver os problemas de descarte dos
resíduos e poluição. Além disso, em geral resíduos industriais são baratos,
diminuindo os custos do processo de produção (PANESAR, KAUR, PANESAR,
2015).

2. CLASSIFICAÇÕES DE MEIOS DE CULTIVO

2.1 CONSISTÊNCIA

2.1.1 Líquido

Os meios de cultura líquidos não possuem agentes solidificantes, como agar

ou gelatina, e também são chamados de caldos. Esse tipo de meio permite o
crescimento uniforme de microrganismos, tornando o líquido turvo. A figura 1 mostra
o crescimento de bactérias nos três primeiros tubos da esquerda para direita, sendo
possível observar que esses três meios estão mais turvos que o quarto, onde não
houve crescimento de microrganismos. Os meios líquidos são usados para o
crescimento em abundâncias das células e para fermentações (SINGH, 2022).
No artigo de Poli et al (2014) os autores testam um meio de cultivo líquido
contendo resíduos industriais para cultivar a levedura Yarrowia lipolytica. Esse fungo
 4

é conhecido pela produção de lipídios, podendo ser potencialmente usado no

processo de produção do biodiesel. O resíduo industrial usado foi o glicerol bruto,
que é um subproduto do próprio processo de produção de biodiesel, chegando a
uma concentração de lipídeos 1,27 g/l, enquanto a célula cultivada com glicerol puro
chegou a concentração de 1,48 g/L. Dessa maneira, os autores concluíram que a
síntese de lipídeos usando a levedura cultivada em glicerol bruto tem potencial para
a produção de biodiesel.

FIGURA 1 - CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS NOS TRÊS PRIMEIROS MEIOS DA

ESQUERDA PARA DIREITA

FONTE: National Science Foundation (2007)

Outro trabalho que usa resíduos como substrato no meio de cultivo é o de

Streit et al (2008). Nessa pesquisa, os autores buscaram cultivar o fungo
Gongronella butleri para produção de quitosana, em um meio de cultivo líquido com
bagaço de maçã como substrato. O bagaço de maça tem alta composição de amido
e açúcares, podendo ser potencialmente usado para o cultivo de vários
microrganismos. Além disso, os autores adicionaram açúcares redutores e nitrato de
sódio ao meio. A concentração de quitosana obtida foi de 1,19 g/, assim, os autores
chegaram a conclusão que meios contendo bagaço de maçã, açúcares redutores e
nitrato de sódio pode ser usados para o crescimento de microrganismos. Quitosana
é um polímero que pode ser usado como um agente floculante e quelante, e também
é usado nos processos de encapsulação e imobilização.
No artigo de Henríquez et al (2013) os autores desenvolvem um meio líquido
para a bactéria Piscirickettsia salmonis, a qual causa a doença Piscirickettsiosis em
salmões resultando em perdas econômicas na indústria de aquicultura.
Normalmente, essa bactéria é cultivada para a fabricação de vacinas por meio da
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infecção de células eucarióticas. No entanto, esse processo possui altos custos e

demanda muito tempo. Assim, os autores criaram um meio líquido sem sangue e
soro, que conseguiu acumular oito vezes mais biomassa de Piscirickettsia salmonis
do que o meio comunmente usado.

2.1.2 Sólido

Nos meios de cultivo sólidos há normalmente agar na concentração de 1,5%-

2,0%, porém pode ser usado também outro agente solidificante. Esse tipo de meio é
usado para preparar culturas puras, crescer microrganismos na sua forma física
inteira e isolar para o estudo das características das colônias. O meio não é
hidrolisado pelas células e não deve possuir substâncias inibidoras de crescimento
(SINGH, 2022).
Na área industrial existe a fermentação em estado sólido, que pode ser usada
para produção de rações, combustíveis, comida, produtos químicos e produtos
farmacêuticos. Além do mais, pode ser aplicado na área de bioprocessos como na
realização de biolixiviação, biobeneficiação, biopolpação e entre outra aplicações.
Esse tipo de fermentação envolve sólidos na ausência da água, porém o substrato
precisa ter umidade suficiente para suportar o crescimento e o metabolismo do
microrganismos. A fermentação em estado sólido possibilita várias oportunidades no
processamento de resíduos agroindustriais, já que requer menor energia, gera
menor volume de águas residuais e são favoráveis ambientalmente (PANDEY,
2003).
Os biorreatores mais simples para a realização das fermentações em estado
sólidos são chamados de reatores de bandeja, mostrado na figura 2. Esse
equipamento é composto basicamente de fileiras de bandejas nas quais são
colocadas os substratos para a fermentação e depois inoculadas com os
microrganismos (WANG, YANG, 2007).
No trabalho de Costa et al (2017) os autores buscam produzir enzimas
lipolíticas por meio do fungo filamentoso Aspergillus niger cultivado em fermentação
em estado sólido usando resíduos agroindustriais como substrato. As lipases
possuem uma grande variedade de aplicações comerciais, como em detergentes,
fármacos, alimentos, cosméticos, tratamento de efluentes e entre outras aplicações.
Os autores testaram farelo de trigo, arroz e soja misturados com glicose, glicerol ou
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óleo de soja como substratos para a fermentação em estado sólido . Os melhores

resultados foram obtidos do meio contendo glicerol e farelo de arroz, sendo
alcançada uma atividade de lipase de 19,844 U.g-1. Outro meio que teve bons
resultados foi o contendo somente farelo de arroz, alcançando uma atividade de
13,267 U.g-1, mostrando que a lipase pode ser produzida como única fonte de
carbono sendo um resíduo industrial.

FIGURA 2 - REATOR DE BANDEJA PlaFractor™

FONTE: Wang e Yang (2007)

Na pesquisa de Boratyński et al (2018) os autores buscam otimizar a

biosíntese de hidrolases pela fermentação em estado sólido do fungo Penicillium
camemberti usando resíduos de canola como substrato. A síntese de lipase
aumentou em 11,2 vezes quando usado os resíduos de canola junto com lactose e
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cloreto de cálcio. Além disso, a produção de proteases aumentou em 8,4 vezes

quando usado resíduos de canola, lactose e sulfato de amônio.
No artigo de Alvarez (2009) o autor busca remover cobre, cromo e arsênico
de madeiras tratadas para preservação. As madeiras que passa por esse tipo de
tratamento causam preocupações ambientais devido ao seu descarte, já que possui
substâncias tóxicas inorgânicas na sua composição. O método usado pelo autor
para remover esses compostos consistiu em usar ácido cítrico seguido pela
fermentação em estado sólido usando fungos tolerantes ao cobre. Dessa maneira, o
autor conseguiu remover 87% do cobre, 80% do cromo e 100% do arsênico, assim,
o método mostrou potencial para remediação.

2.1.3 Semi-sólido

Os meios semi-sólidos possuem uma pequena concentração de ágar, entre

0,2%-0,5%, o que deixa a consistência semelhante de uma geleia. Esses meios são
usados para testes de motilidade, ou seja, para verificar se a bactéria consegue se
mover por mecanismos próprios. Esse teste é usado para a caracterização dos
microrganismos. A consistência do meio semi-sólido permite que as bactérias
móveis se movam pelo meio, resultando na turbidez do meio inteiro ou em somente
partes do meio. Já as bactérias não móveis só crescerão na área onde foram
inoculadas. A figura 3 apresenta o resultado de um teste de motilidade, o tubo da
esquerda não foi inoculado, o tubo do meio apresentou bactérias com capacidade de
se mover, já o tubo da direita possui bactérias não móveis. Outra aplicação de meios
semi-sólidos é no cultivo de bactérias microaerófilas (SINGH, 2022; ARYAL, 2022).

FIGURA 3 - TESTE DE MOTILIDADE

FONTE: UFRGS (s.d)

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Na área industrial existe a fermentação em estado semi-sólido, a qual é

semelhante à fermentação em estado sólido porém há a presença de maior volume
de líquido livre, o que facilita a disponibilidade de nutrientes e o controle da
fermentação (MACHADO, TEIXEIRA, COUTO, 2013). No trabalho de Machado,
Teixeira e Couto (2013), os autores buscam produzir neomicina pelo actinomiceto
Streptomyces fradiae através de fermentação em estado semi-sólido. Neomicina é
um importante antibiótico usado com frequência em fármacos e na área veterinária.
Ao invés de usar suportes naturais para a fermentação, como foi usado no artigo
citado anteriormente de Boratyński et al (2018), em que os autores usaram resíduos
canola, nesse caso foi usado esponja de nylon como suporte. A fermentação
alcançou a concentração de neomicina de 13,903 μg/ml, resultado que foi 55 vezes
maior do que alcançado por fermentação líquida.
Outro artigo que estuda o uso de meio semi-sólido é o de Niture e Pant
(2004). Nesse trabalho os autores cultivam o fungo Fusarium moniliforme em meio
semi-sólido contendo farelo de trigo e polpa de laranja com o objetivo de produzir as
enzimas poligalacturonase e pectina liase, as quais são economicamente
importantes para a clarificação de sucos. O cultivo em estado semi-sólido triplicou a
produção de poligalacturonase e dobrou a de pectina liase quando comparada com
a cultura em meio líquido.
No trabalho de Caron et al (2009) os autores desenvolveram um meio semi-
sólido para seleção de células mamíferas que secretam grande quantidade de
proteínas recombinantes. O método funciona de maneira que as células que
produzem as proteínas recombinantes ficam fluorescentes. Além disso, a
intensidade de fluorescência é proporcional à quantidade do peptídeo recombinante
secretado pela célula. Assim, essa técnica, a partir do uso de um meio semi-sólido,
permite um método rápido e simples para prospecção de células para a área de
pesquisa e industrial.

2.2 ORIGEM DOS COMPONENTES

2.2.1 Complexos

As substâncias presentes em meios complexos são de origem de produtos

microbianos, animais ou vegetais. Exemplos desses componentes são a caseína,
 9

que pode ser retirada do leite, extrato de carne, caldo tríptico de soja e extrato de
levedura. É possível comprar esse compostos na forma desidratada, sendo
necessária a hidratação para a preparação do meio de cultivo. A principal vantagem
do uso de meios complexos é uso de componentes altamente nutritivos, porém a
desvantagem é que não é conhecida a composição nutricional exata do meio
(MADIGAN et al, 2016).
Resíduos agroindustriais são derivados do processamento de produtos de
origem animal ou vegetal e podem ser usados como substrato na indústria de
bioprocessos. Exemplos desse tipo de material são melaço, bagaço, resíduos do
processamento de sementes oleaginosas e de milho. Produtos de interesse que
podem ser obtidos pelo uso de resíduos agroindustriais são etanol, bioetanol,
pectina, proteínas, minerais, vitaminas e biogás (NIGAM, GUPTA, ANTHWAL,
2009).
Os resíduos agroindustriais possuem glicose em grande quantidade, porém
na forma de celulose. Já que glicose pode ser fermentada facilmente pela maior
parte dos microrganismos é uma substância muito demandada nas indústrias de
fermentação. A celulose é um polissacarídeo, em qual as unidades monoméricas
são moléculas de glicose, como apresentado na figura 4. Nos resíduos
agroindustriais, junto com a celulose está presente outras duas substâncias: a
lignina e a hemicelulose. A primeira é um composto fenólico, enquanto a segunda,
assim como a celulose, é um polissacarídeo. Dessa maneira, para tornar possível o
consumo dos monômeros desses polissacarídeos pelos microrganismos é
necessária a separação da celulose e hemicelulose da lignina, processo o qual
ocorre através de pré-tratamentos, podendo ser separados como físico, químicos e
biológicos (NIGAM, GUPTA, ANTHWAL, 2009).

FIGURA 4 - ESTRUTURA DA CELULOSE

FONTE: Nigam, Gupta e Anthwal (2009)

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Os pré-tratamentos físicos ocorrem por meio de processos mecânicos e

térmicos, porém a alta demanda de energia para realizar os métodos pode aumentar
o custo do processo consideravelmente. A técnica de explosão de vapor é um pré-
tratamento físico que ocorre entre as temperaturas de 180 a 240°C e a alta pressão,
resultando na degradação da lignina. Outra técnicas de pré-tratamento físico são a
de processamento hidrotérmico e irradiação (NIGAM, GUPTA, ANTHWAL, 2009).
Os pré-tratamentos químicos são normalmente usados para a remoção da
lignina presente nos resíduos agroindustriais. As desvantagens desse tipo de
método é a necessidade de aparatos resistentes à corrosão, estratégia eficaz de
lavagem e capacidade de descartar corretamente os produtos químicos usados. Os
compostos químicos usados no pré-tratamento podem ser o peróxido de hidrogênio,
solventes orgânicos, como etanol, butanol e fenol, ozônio e ácido perfórmico
(NIGAM, GUPTA, ANTHWAL, 2009).
Os pré-tratamentos biológicos consistem no uso de microrganismos que
sintetizam enzimas que degradam a lignina. Um exemplo é o fungo lignolítico, que
além de degradar a lignina, também quebram a celulose e hemicelulose. Dessa
maneira, além de realizaram o pré-tratamento são capazes de sintetizar produtos de
interesse. Em geral, o pré-tratamento biológico demanda mais tempo que os
métodos físicos e químicos, podendo durar de 2 a 5 semanas. Alternativamente, é
possível o uso direto de enzimas que degradam a lignina porém essa técnica é cara
(NIGAM, GUPTA, ANTHWAL, 2009).
Um modo de minimizar as desvantagens de cada método é combinar
diferentes técnicas de pré-tratamento. Uma das técnicas é usar em conjunto a
irradiação gama com hidróxido de sódio. Outro método é o de hidróxido de sódio e
fermentação em estado sólido, em que antes do resíduo industrial ir para o processo
de fermentação ele é tratado com hidróxido de sódio (NIGAM, GUPTA, ANTHWAL,
2009).
No artigo de El-Tayeb et al (2012) os autores testam diferentes métodos de
pré-tratamento de alguns resíduos agroindustriais (palha de arroz, talo de milho,
serragem, resíduos de beterraba e bagaço de cana-de-açúcar) com o objetivo de
obter açúcares livres para produção de bioetanol. Uma das técnicas testadas pelos
autores foi a hidrólise ácida em uma etapa, aumentando a concentração de ácido de
1% até 5% (v/v). O aumento da concentração de ácido resultou para a maior parte
dos resíduos em uma menor conversão para etanol. Também foi testada uma
 11

hidrólise ácida em duas etapas usando primeiramente ácido fosfórico e depois ácido
sulfúrico, os dois em uma concentração de 1% (v/v). Após isso, a solução é
neutralizada e foi usada levedura de padeiro para a conversão em etanol. Essa
técnica foi a ótima para os resíduos de beterraba, chegando em uma conversão de
41,3% (m/m). Outro método testado foi o tratamento com o fungo Trichoderma viride,
o qual é degrada a celulose. Após o tratamento, é usado levedura de padeiro, o que
resultou em uma bioconversão de 37,8% (m/m) quando usado resíduos de
beterraba.

2.2.2 Sintéticos

Os meios sintéticos, também chamados de meios definidos, são feitos a partir

da adição de quantidades conhecidas de compostos orgânicos e/ou inorgânicos à
um certo volume de água destilada. Dessa maneira, as concentrações exatas de
cada componente do meio são conhecidas. Quando o meio possui somente uma
fonte de carbono ele é designado como simples. Um exemplo de meio sintético
simples é o apresentado na tabela 1. Esse meio visa o cultivo de Escherichia coli e o
microrganismo produz todas suas moléculas orgânicas a partir da glicose, já que
essa é a única fonte de carbono presente (MADIGAN et al, 2016).

TABELA 1 - EXEMPLO DE MEIO SINTÉTICO

FONTE: Madigan et al (2016)

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No trabalho de Lino et al (2018) os autores buscam desenvolver um meio

sintético que simule melaço de caldo de cana. O motivo de fazer isso é conseguir
testar microrganismos de interesse industrial em condições industrialmente
relevantes já no início do desenvolvimento da linhagem. Assim, os autores acreditam
que isso pode melhorar a escolha de células de interesse industrial. Foi escolhido
tentar replicar as condições do melaço, já que esse composto é um importante
substrato para a produção de biocombustíveis. Os resultados obtidos pelos autores
mostraram grande semelhança entre a produção de etanol e biomassa, viabilidade
das leveduras, rendimento de ácido acético e glicerol entre o melaço e o meio
sintético.
No artigo de Chen et al (2017) os autores buscam produzir pullulan a partir do
cultivo do fungo Aureobasidium pullulans em um meio sintético. Pullulan é um
polissacarídeo que possui diversas aplicações na área de cosméticos, alimentícia,
farmacêutica e entre outras. A determinação do meio ideal para o cultivo foi feita por
estudos de otimização. Os resultados obtido pelos autores da produção de pullulan
foi que a maior produção chegou a 109 g/L e a biomassa seca alcançou 125 g/L
após 114 horas. Além disso, a produtividade ficou aproximadamente 1 g/ L.h,
resultados maiores do que já foi previamente documentado.

2.3 FUNÇÃO

2.3.1 Meio redutor

Bactérias anaeróbicas têm dificuldades de crescer em ambientes com

oxigênio, dessa maneira existem meios que possuem um agente redutor o qual
reage com o oxigênio, eliminando-o do meio. Esses meios podem ser utilizados em
tubos de ensaio firmemente tampados. Antes de realizar a inoculação eles são
rapidamente aquecidos para retirar o oxigênio absorvido. Além disso, esses meios
também podem ser usados em placas de Petri, de forma que as placas são
colocadas em jarras ou caixas, o oxigênio é removido quimicamente e o recipiente é
selado. Outra modo seria usar uma câmara anaeróbica (TORTORA, FUNKE, CASE,
2016). Um exemplo de meio redutor é o caldo tioglicolato, podendo ser utilizado para
verificação de esterilidade em produtos biológicos e farmacêuticos (NEWPROV,
2005).
 13

No trabalho de Georgieva, Mikkelsen e Ahring (2008) os autores cultivam a

bactéria termofílica anaeróbica Thermoanaerobacter em um meio redutor para a
produção de etanol. As vantagens de usar um microrganismo com essas
características é a maior taxa de conversão relacionadas a maiores temperaturas e
baixo risco de contaminação, porém há problemas quanto a produção de
subprodutos. O substrato usado pelos autores foi palha de trigo pré-tratada com
explosão à vapor. O rendimento de etanol obtido pelos autores foi na faixa de 0,39-
0,42 g/g.

2.3.2 Meio seletivo

Meios de cultura seletivos são feitos de modo que possuem componentes que
não permitem o crescimento de alguns microrganismos, crescendo seletivamente
outros microrganismos. Um exemplo de um meio seletivo é o ágar eosina-azul de
metileno (EAM), pois somente ocorre o crescimento de organismos gram-negativos
(MADIGAN et al, 2016).
No artigo de Yoon et al (2023) os autores buscam desenvolver um meio
seletivo para enumerar bactérias do ácido lático e bifidobactéria. Microrganismos
desses grupos são importantes para indústria alimentícia, tendo potenciais
benefícios à saúde. Dessa maneira, é necessário numerar as células viáveis
presentes nos alimentos. O meio com o melhor resultado foi o BPL (Brilliant green-
Phenol red-Lactose Agar) sem sangue com pH ajustado para 5,8.

2.3.3 Diferenciais

Meios de cultura diferenciais mostram através de uma mudança de cor se

uma reação metabólica específica ocorreu. O meio EAM citado no tópico anterior,
além de ser seletivo, também é diferencial já que discerne fermentadores de lactose
de não fermentadores de lactose. A figura 5 mostra o meio EAM, em que à esquerda
está a Escherichia coli, bactéria fermentadora de lactose, e à direita está a
Pseudomonas aeruginosa, não fermentadora de lactose. As duas bactérias são
gram-negativas (MADIGAN et al, 2016).
Os meios diferenciais podem ser usados para a bioprospecção de bactérias
com características de interesse, como foi feito no trabalho de Chatterjee et al
 14

(2018). Nesse estudo, os autores desenvolvem um meio para a identificação de

produção de ácido gama-poliglutâmico por diferentes cepas da bactéria Bacillus
methylotrophicus, composto que possui várias aplicações na área da agricultura,
cosméticos, medicinal e entre outros. Dessa maneira, foi possível escolher a
linhagem melhor produtora dessa substância. O meio para realizar essa pesquisa
era líquido, contendo azul metileno e com o auxílio de espectrofotômetro UV-vis foi
possível distinguir a forma monomérica e polimérica do ácido glutâmico.

FIGURA 5 - MEIO EAM, Escherichia coli Á DIREITA Pseudomonas aeruginosa Á

ESQUERDA

FONTE: Madigan et al (2016)

2.3.4 Meio enriquecido

Meios de cultivo de enriquecimento são semelhantes aos meios seletivos pois

tentam favorecer o crescimento de um microrganismo, porém não necessariamente
inibem o crescimento de outros. Além do mais, o meio de cultivo de enriquecimento
tem o objetivo de aumentar o número de uma célula específica a qual está presente
em uma quantidade muito pequena inicialmente. Normalmente, microrganismos
cultivados nesse tipo de meio são fastidiosos, ou seja, possuem uma alta demanda
nutricional (MADIGAN et al, 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2016).
No trabalho de Renoulf e Lonvaud-Funel (2006) os autores desenvolvem um
meio enriquecido para a detecção da levedura Brettanomyces bruxellensis na
superfície de uvas. Esse fungo é um problema para indústria do vinho pois produz
os compostos 4-etilfenol e 4-etilguaicol os quais conferem odores para o vinho e
mudam a qualidade do aroma. A presença dessa levedura na superfície da uva não
 15

tinha sido previamente demonstrada, somente especulada. Além disso, esses

microrganismos podem estar presentes em quantidades muito pequenas, não sendo
possível usar técnicas moleculares. Após dez dias de cultura foi possível detectar
Brettanomyces bruxellensis, demonstrando a presença delas pela primeira vez na
superfície de frutos de uva.

3. FATORES IMPORTANTES PARA O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS

3.1 TEMPERATURA

Os microrganismos podem ser divididos em três grupos de acordo a

temperatura ideal para o crescimento: psicrófilos crescem preferencialmente em
temperaturas mais baixas, mesófilos em temperaturas moderadas e termófilos em
temperaturas mais altas. Cada microrganismo cresce em faixas de temperaturas,
sendo que esse intervalo contém a temperatura mínima de crescimento (menor
temperatura que o microrganismo pode crescer), temperatura ótima de crescimento
(temperatura em que ele melhor cresce) e temperatura máxima de crescimento
(maior temperatura em que ele cresce) (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).
Alguns microrganismos psicrófilos, apesar de conseguirem crescer a 0°C,
possuem uma temperatura ótima de crescimento entre 20°C e 30°C. Esses
microrganismos são chamados de psicicrotróficos e são deterioradores de alimentos.
Já os microrganismos termófilos que têm uma temperatura ótima de crescimento de
80°C são chamados de hipertermófilos. A figura 6 mostra um gráfico de
temperatura x velocidade de crescimento para cada uma dessas classes de
microrganismos (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).
Os microrganismos termófilos são de especial interesse para a indústria de
biotecnologia, devido a capacidade de produzir enzimas extracelulares
termoestáveis. A vantagem de usar enzimas com essas características é a redução
da possibilidade de contaminação por microrganismos mesófilos, diminuição da
viscosidade do meio, aumento da disponibilidade e solubilidade de compostos
orgânicos, aumento do coeficiente de difusão do substratos o que resulta em
maiores taxas de conversão. As enzimas termoestáveis podem ser produzidas
diretamente do microrganismo nativo, porém na maioria dos processos industriais há
a expressão heteróloga (GOMES et al, 2016).
 16

Os microrganismos psicrófilos e suas enzimas também possuem várias

aplicações, podendo ser usados para a biorremediação em temperaturas baixas,
também foi descoberto que várias linhagens de bactérias e fungos são capazes de
produzir agentes anti-fungo, anti-cancerígeno e anti-tumor. Além disso, enzimas
produzidas por esses microrganismos podem ser usadas de limpeza domésticos, já
que a lavagem de roupas a baixas temperaturas protege as cores dos tecidos e
demanda menor energia. Outra aplicação da enzimas de microrganismos psicrófilos
é na indústria têxtil, como amilases e celulases (BANERJEE, HALDER, NATTA,
2016).

FIGURA 6 - GRÁFICO DE TEMPERATURA X VELOCIDADE DE CRESCIMENTO PARA

DIFERENTES GRUPOS DE MICRORGANISMOS

FONTE: Tortora, Funke e Case (2016)

3.2 pH

A maior parte das bactérias crescem em um pH em torno de 7, porém existem

algumas espécies que podem crescer em pH mais baixo, chamadas de bactérias
acidófilas. O intervalo de pH para o crescimento de fungos é maior do que para as
bactérias, porém o pH ótimo para o crescimento deles é menor, entre 5 e 6
(TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).
É comum durante o cultivo em laboratório as bactérias produzirem ácidos
orgânicos, o que tende diminuir o pH do meio e consequentemente afetar o
 17

crescimento. Por esse motivo é comum o uso de tampões no meio de cultura para o
cultivo de bactérias (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).
As bactérias acidófilas ocorrem em meios ácido naturais, como lagos de
ácido, e em ambientes feitos pelos homem, como minas. Esses microrganismos
possuem mecanismos próprios para regular o pH intracelular, porém mesmo assim
as enzimas dessas bactérias são conhecidas por funcionar em pH muito menor do
que o intracelular, o que as torna de interesse para indústria. As aplicações ocorrem
na área de panificação, de processamento de sucos, de alimentação animal e
farmacêutica (SHARMA, PARASHAR, SATYANARAYANA, 2016).

3.3 PRESSÃO OSMÓTICA

Microrganismos em meios em que a concentração de solutos é mais elevada

fora da célula, também chamados de meios hipertônicos, tendem a perder água por
osmose resultando na encolhimento do citoplasma da célula, processo chamado de
plasmólise. Dessa maneira, é importante que os meio de cultura preparados não
sejam hipertônicos. No entanto, existem microrganismos que necessitam de
concentrações altas para seu crescimento, chamados de halófilos obrigatórios.
Também existem outros que toleram concentrações mais altas de sal, chamados de
halófilos facultativos. No entanto, a maioria dos microrganismos devem ser
cultivados em meios com quase apenas água. Se a pressão osmótica for
demasiadamente baixa, ou seja, o meio é hipotônico, a água tende a entrar na
célula. Em microrganismos com parede celular frágil esse processo pode resultar na
lise da célula. A figura 7 apresenta primeiramente uma célula em uma solução
isotônica, ou seja, concentração de solutos intra e extracelulares são iguais, depois
a célula passa para um meio hipertônico, sendo plasmolisada (TORTORA, FUNKE,
CASE, 2016).
Microrganismos halófilos possuem aplicações usadas já a muito tempo, como
a manufatura de sal solar e a preparação de comidas fermentadas tradicionais. Além
disso, a produção de beta-carotenos (composto antioxidante) pela alga verde
Dunaliella e de ectoína (estabilizador de enzimas) por bactérias halófilas são
processos realizados com muito sucesso. Além do mais, microrganismos halófilos
têm o potencial de serem usados para o tratamento de água salina, produção de
 18

exopolissacarídeos, bioplásticos e biocombustíveis, porém esse processos ainda

precisam ser mais estudados (OREN, 2009).

FIGURA 7 - CÉLULA SOFRENDO PLASMÓLISE

FONTE: Tortora, Funke e Case (2016)

3.4 FATORES QUÍMICOS

3.4.1 Carbono

O carbono é um dos componentes mais essenciais para o desenvolvimento

dos microrganismos, sendo necessário para todos os componentes orgânicos
presentes em uma célula viva. Dessa maneira, o carbono é considerado o esqueleto
estrutural da matéria viva, sendo que metade do peso seco de uma célula bacteriana
comum é constituída de carbono. Quanto à obtenção desse componente os
microrganismos podem ser classificados como quimio-heterotróficos, os quais obtêm
carbono de matérias orgânicas, como proteínas, carboidratos e lipídeos. Além disso,
eles podem ser quimioautotróficos e fotoautotróficos, obtendo o carbono do dióxido
de carbono (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).

3.4.2 Nitrogênio, enxofre e fósforo

A síntese do material celular necessita de outros elementos além do carbono.

Exemplos disso são a síntese de proteínas, que necessita de nitrogênio e enxofre, a
síntese de DNA e RNA que precisa de nitrogênio e fósforo e a síntese de ATP, que
também precisa de nitrogênio e fósforo. Considerando o peso seco de uma bactéria,
 19

o enxofre e fósforo representam juntos 4%, já o nitrogênio 14% (TORTORA, FUNKE,

CASE, 2016).
O nitrogênio é principalmente utilizado para formação do grupo amino nos
aminoácidos. As fontes desse elemento podem ser proteínas, íons amônio e nitrato.
Além disso, existem microrganismos fixadores de nitrogênio, que utilizam nitrogênio
gasoso da própria atmosfera. Eles podem estar presentes no solo ou ainda viver
simbioticamente em raízes de leguminosas (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).
O enxofre é necessário para a composição dos aminoácidos que contém
enxofre e vitaminas, como a biotina e a tiamina. Esse elemento pode ser obtido dos
íons sulfato, do sulfeto de hidrogênio e dos próprios aminoácidos que contém
enxofre (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).
O fósforo é muito importante para a produção de ácidos nucleicos e
fosfolipídeos das membranas celulares, podendo também ser encontrado na
molécula de ATP. O fósforo pode ser obtido através de íons fosfato. Além desses
três elementos citados nesse tópico, os microrganismos também necessitam de
potássio, magnésio e cálcio, que são usados pelas células como cofatores nas
reações enzimáticas (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).

3.4.3 Elementos-traço

Os elementos-traço são substâncias que as células precisam em quantidades

muito pequenas como ferro, cobre, molibdênio e zinco. Geralmente, esses
elementos são essenciais para o funcionamento de enzimas, possuindo a função de
cofatores. Os meios de cultivos laboratoriais podem utilizar a própria água destilada
como fonte desse componentes, porém eventualmente é recomendado o uso da
água da torneira, onde há mais certeza da presença em concentrações adequadas
dos elementos-traço (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).

3.4.4 Oxigênio

O oxigênio é outro fator químico importante para vários microrganismos na

geração de ATP, porém existem microrganismos que não conseguem crescer na
presença desse elemento. Quanto ao uso do oxigênio, as bactérias podem ser
classificadas em cinco grupos: aeróbios obrigatórios (necessitam do oxigênio),
 20

anaeróbicos facultativos (usam oxigênio na presença dele mas na ausência fazem

fermentação ou respiração anaeróbica), anaeróbicos obrigatórios (não crescem na
presença de oxigênio), aerotolerantes (não utilizam oxigênio mas crescem na sua
presença) e microaerófilos (necessitam de oxigênio em pequenas concentrações
para o crescimento). A tabela 2 ilustra o crescimento bacteriano em um meio de
cultura sólido para esses diferentes grupos de microrganismos. Os aeróbios
obrigatórios somente crescem onde há bastante oxigênio difundido, ou seja, na parte
do meio que está em contato com o ar. Já os anaeróbios facultativos crescem
preferencialmente onde há mais oxigênio, porém também estão presentes nas
outras partes dos meio. Os anaeróbicos obrigatórios somente estão onde há pouco
oxigênio difundido, ou seja, no fundo do meio. Os anaeróbicos aerotolerantes
crescem homogeamente ao longo do tubo, já que são indiferentes à presença do
oxigênio. Por fim, os microaerófilos crescem somente onde há pouco oxigênio
difundido no meio (TORTORA, FUNKE, CASE, 2016).

TABELA 2 - INFLUÊNCIA DO OXIGÊNIO NO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS

FONTE: Tortora, Funke e Case (2016)

4. TRABALHOS RECENTES RELACIONADOS A MEIO DE CULTIVO INTERESSE

INDUSTRIAL

4.1 USO DE INTELIGÊNCIA ARTIFICIAL NA OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS

DO MEIO DE CULTIVO

Na pesquisa de Bezerra et al (2021) os autores utilizam resíduos do fruto

pupunha, também chamado chontaduro, para a produção de carboximetilcelulases
peo fungo Trichoderma stromaticum através de fermentação em estado sólido. As
 21

enzimas celulases possuem grande importância nos setores industriais de

alimentação e no tratamento de efluentes de industrias de alimentação animal, têxtil,
de lavagem de roupas e entre outras. Os autores usaram a inteligência artificial para
determinar a concentração ótima da fonte de nitrogênio, o tempo de fermentação e a
temperatura. Os resultados obtidos mostraram um aumento de 31,58 vezes da
atividade da celulose quando comparado com a fermentação de inicial.
Outros artigos que usam inteligência artificial para determinar os melhores
parâmetros do meio de cultura é o de Ousaadi et al (2021) e o de Dhagat e
Jujjavarapu (2021). No primeiro artigo os autores determinaram a concentração
ótima do substrato, o tamanho do inóculo, cloreto de sódio e pH para a produção de
alfa-amilases por uma bactéria do gênero Streptomyces usando casca de laranja
como substrato, obtendo um rendimento 4 vezes maior de alfa-amilases. Já no
segundo trabalho os autores buscam determinar a concentração ideal de glicose,
glutamato monossódico, extrato de levedura e sulfato de magnésio para a produção
de bioemulsificadores e exopolissacarídeos pela bactéria Brevibacillus borstelensis.

4.2 PRODUÇÃO DE ETANOL PARTINDO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

No trabalho de Tsolcha et al (2021) os autores usam efluentes agroindustriais

suplementados com resíduos de extrato de uva como substrato para a cianobactéria
do gênero Leptolynbgya para a produção de açúcares fermentáveis. A biomassa
obtida por essa bactéria passou por um pré-tratamento de hidrólise ácida para a
liberação de carboidratos. Os açúcares liberados foram usados como substrato para
a levedura Saccharomyces cerevisiae, ocorrendo fermentação alcoólica para a
produção de etanol. O rendimento alcançou 85,9% do rendimento teórico, indicando
o potencial do uso de biomassa de cianobactérias para a produção de etanol.

4.3 PRODUÇÃO DE EXO‑POLYGALACTURONASE USANDO CASCA DE UMBU

COMO SUBSTRATO

No artigo de Santiago et al (2022) os autores realizam a fermentação em

estado sólido da casca de umbu usando Aspergillus niger para a produção da
enzima exo‑polygalacturonase, a qual é muito usada na indústria de bebidas para a
 22

despolimerização de pectinas, facilitando a clarificação e extração de vinhos e

sucos. O resultado obtido pelos autores foi uma atividade da enzima de 32,59 U/g.

4.4 PRODUÇÃO DE NANOCELULOSE BACTERIAL USANDO RESÍDUOS

AGROINDUSTRIAIS

No trabalho de Aboul-Fotouh et al (2020) os autores buscam produzir

nanocelulose, composto com ótimas propriedades mecânicas, hidrofilicidade,
excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade. Utilizando a bactéria
Komagataeibacter saccharivorans e usando resíduos de tamareira, figo e bagaço de
cana-de-açúcar. O melhor rendimento após 168h foi o utilizando bagaço de cana-de-
açúcar, alcançando 3,9 g/L.

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