Construction and application of a “superplasmid” for enhanced

production of antibiotics
Qin Liu1 & Qin Lin1 & Xinying Li1 & Muhammad Ali2 & Jing He
https://doi.org/10.1007/s00253-019-10283-6
SLIDE 2
Qual o problema?

Mais de dois terços dos antibióticos conhecidos são produzidos por

actinomicetos do gênero Streptomyces. Infelizmente, a taxa de produção do
antibiótico natural Streptomyces é extremamente lenta e, portanto, não pode
satisfazer a demanda industrial. Neste estudo, a produção de antibióticos por
Streptomyces é aumentada por um “superplasmídeo” que inclui :
 Fator regulador global (afsR)
 Gene da proteína do receptor de adenosina ciclica (CRP)
 Mutação pontual da subunidade ÿ da polimerase de RNA (rpoB)
 Gene da polimerase de RNA (accA2BE)

Aplicados simultaneamente para gerar uma cepa com capacidade de

superprodução de antibióticos durante o processo de fermentação.

SLIDE 4
O que é um plasmídeo?
 Plasmídeos são cadeias circulares duplas de moléculas
de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA
cromossômico (que contém o material genético). O gene ou outro
fragmento de DNA de interesse, é primeiramente inserido no plasmideo.
A inserção é feita utilizando-se enzimas de restrições (enzima que
reconhece uma sequência alvo específica e corta o DNA em dois
pedaços neste sítio), e então é produzida uma molécula de DNA
recombinante, ou seja, um DNA montado a partir de fragmentos de
várias fontes.

 Em seguida o plasmídeo recombinante é introduzido em bactérias. As

bactérias contendo plasmídeo são selecionadas e cultivadas. Conforme
elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus
descendentes, produzindo cópias do DNA que ele contém (transdução).
 SLIDE 6
pLQ 001 –
 O Fator regulador global (afsR) e o PermE* foram digeridos e ligados
juntamente com o vetor pSET152 resultando no plasmídeo pLQ001.
 Xba I e Bam Hil, são enzimas de restrição que reconhecem a sequência
alvo específica e cortam o DNA em dois pedaços.
 Através do uso da eletroforese, verificou-se a presença dos genes afsR.

SLIDE 7

 Os plasmídeos pZAY6 e pZAY7 foram digeridos com Xba I e Hind II

(enzimas de restrição) formando o conjunto de genes e promotores de
interesse.
 O conjunto (Crp/PermE* e rpoB/ accA2/accBE) foi então clonados no
local especifico, Xba l do plasmídeo 001, produzindo o plasmídeo
recombinante 003.

A análise dos genes que influenciam na produção do metabolitos de interesse

foi feita por eletroforese. Podendo visualizar os fragmentos de genes para a
construção do plasmídeo.

SLIDE 8

 O plasmídeo 2 também foi criado a partir dos Genes – afsR e do

promotor permE*, porém utilizaram o vetor pWHM4S. E as enzimas de
restrição são EcoR I e EcoR V.
 O plasmídeo 4 foi obtido a partir do plasmídeo 2, mas com dois novos
fragmentos de genes como o accBE e accA2.

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Materiais e metodos
Os plasmídeos pLQ001, pLQ002, pLQ003, pLQ004 e o vetor vazio pSET152
utilizaram a E.coli DH5alfa como hospedeiro de clonagem. As cópias dos
plasmídeos foram recuperadas e purificadas para serem inseridas em duas
cepas de E.coli (E.coli ET12567 e E.coli S17-1) e então os plasmídeos foram
inseridos em
 Streptomyces coelicolor M145,
 S. mutabilis TRM 45540,
 S. hygroscopicus XM201
 Streptomyces hygroscopicus ATCC29253
por conjugação entre as E. colis que continham as copias dos plasmídeos e as
bactérias de interesse (ET12567 (pUZ8002) eUZ8002 E. coli S17–1).
(conjugação, transferência de DNA de uma bactéria para outra através de uma
estrutura chamada de pilus). Dessa forma, o material genético é transferido
para a célula alvo.

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Materiais e métodos
Condições de cultivo
 Todos os plasmídeos foram cultivados em meio liquído ou sólido a 37ºC
com o antibiótico apropriado selecionado
 As bactérias que conseguiram se desenvolver no meio que em havia o
antibiótico, são as que contém o plasmídeo recombinante
 A partir da seleção da bactérias com plasmídeos recombinantes foram
cultivadas em condições e meios específicos para cada antibiótico de
interesse:
 Actinorodina
 Undecilprodigiosina
 Rapamicina
 Higrocina A
 Actinomicina D
 Geldanamicina
Para produção de cada antibiótico as bactérias foram cultivadas em meio
especifico, que induzem a produção do antibiótico de interesse

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Resultados e discussão

LER SLIDE

Não ocorreu diferenças significativas entre as cepas selvagens e o pLQ002 e

pLQ004, eles não foram testados nos demais antibióticos