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31/07/2013

VETORES DE
CLONAGEM PARA E. coli

Disciplina: Biotecnologia Farmacutica

Tipos de vetores
Vetores de clonagem baseados em plasmdeos;
Vetores de clonagem baseados no bacterifago
M13;
Vetores de clonagem baseados no bacterifago
lambda ().

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Vetores de clonagem baseados


em plasmdeos

Nomenclatura de vetores plasmidiais


pBR322:
P = plasmdeo
BR = laboratrio onde foi construdo (Bolvar e
Rodrigues)
322 = identifica este de outros plasmdeos do
mesmo laboratrio.

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pBR322
pequeno (4363 bp) permite clonagem de fragmentos
com 6Kbp e clonado facilmente.
Tem duas marcas de seleo (resistncia ampicilina e
tetraciclina) cada uma com um local de restrio nico.
Tem vrios locais de restrio nicos que permitem
clonar genes com vrios tipos de extremidades coesivas.
Tem um nmero de cpias razoavelmente elevado e
que pode ser aumentado na presena de um inibidor da
sntese proteica, o cloranfenicol (at 1000-3000 cpias).

No entanto, este plasmdeo conjugativo, o que pode no


ser muito benfico devido transferncia indesejada de
genes entre espcies.
O plasmdeo pBR322 foi construdo a partir de 3 plasmdeos
naturais de E. coli que forneceram:
R1: ampR
R6.5: tetR
pMB1: ori
A seleo de transformantes utilizando-se pBR322 pode ser
feita atravs da resistncia ampicilina ou tetraciclina.

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Se digerirmos o vetor com BamHI e introduzimos o gene de


interesse na regio que codifica o gene tetR. As clulas
transformantes vo possuir apenas resistncia ampicilina,
mas este antibitico no pode ser usado unicamente para a
seleo porque tambm o vetor tem ampR.
Para transpor este problema fazem-se dois riscados de
colnias transformantes em placas contendo meio nutritivo e
amp ou tet. As colnias que no crescerem em meio com
tetraciclina so as que desejamos e podemos isol-las a partir
do meio apenas com ampicilina.

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pBR327
Construdo pela remoo de 1.089 pb de
pBR322;
Manteve os genes de resistncia antibiticos;
Difere de pBR322 nos seguintes aspectos:
- Apresenta mais cpias por clula (30 a 40
cpias)
- A deleo eliminou a capacidade conjugativa de
pBR322, transformando-o em no-conjugativo.

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pUC8
Elevado nmero de cpias (500-700 por clula);
Identificao de recombinantes num nico passo uso
do gene LacZ;
Locais de restrio aglomerados numa nica regio e
que permitem que as duas extremidades dos
fragmentos sejam cortadas por enzimas diferentes;
Resistncia ampicilina.

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A seleo de recombinantes em pUC8 envolve o gene LacZ.


Este gene codifica a sntese da protena -galactosidase,
envolvida na degradao da lactose em glucose e galactose.

pGEM3Z
Semelhante a pUC: contm genes ampR e
lacZ, alm de ser do mesmo tamanho;
Possui 2 pedaos de DNA extras: regies
promotoras para RNA-polimerase atuar;
Transcrio in vitro do DNA clonado

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pGEM3Z

Vetores de clonagem baseados no


bacterifago M13

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relembrando...

BACTERIFAGOS

Dois tipos principais de estrutura de fagos:


(a) Cabea e cauda (por ex., lambda)
(b) Filamentoso (por ex., M13)

M13mp7
Caractersticas:
Genoma do fago.
Gene LacZ que permite a seleo de
recombinantes.
Polylinker local mltiplo de clonagem, no
interior do LacZ. Tem locais de restrio para
EcoRI, BamHI, SalI e PstI

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M13mp7

O mtodo de seleo utilizado para o M13mp7 semelhante


ao do pUC8, embora no se tenha resistncia a ampicilina
para selecionar os transformantes.

Fagomdeos vetores hbridos


um vetor hbrido entre um plasmdeo e um fago M13
criado de modo a permitir a clonagem de genes de
dimenso superior s 1,5Kbp permitidas pelo M13pm7
(ex. pEMBL8);

Como um fagomdeo no contm a informao relativa


sntese das protenas da cpsula, quando se quer
obter um fago tem que se infectar as clulas com um
fago auxiliar. mais fcil extrair o DNA utilizando as
caractersticas do fago.

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Com o fagomdeo pEMBL8 podem clonar-se fragmentos de DNA


de cadeia simples com 6Kbp.

Vetores de clonagem baseados no


bacterifago lambda (
().

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Antes de se desenvolverem vetores baseados no fago


foi necessrio resolver dois problemas:
problemas
S se podiam adicionar fragmentos com 3Kbp
fragmentos maiores tornam o fago demasiado grande
para ser encapsulado.
No existiam locais de restrio nicos.

A eliminao de uma regio no-essencial do genoma


do fago, responsvel pela integrao do fago no DNA
cromossmico e sua posterior exciso, permitiu que
fossem disponibilizados mais 15Kbp para a clonagem
de fragmentos, perfazendo um total de 18Kbp.
A remoo da regio referida implica que o fago deixa
de ser capaz de realizar o ciclo lisognico (realiza
apenas o ciclo ltico), o que at uma caracterstica
desejvel para os vetores.
Para eliminar os locais mltiplos de clonagem utilizouse seleo natural (mutantes).

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Vetores de insero e substituio


Vetores de insero: possuem um nico local de
clonagem, adicionando-se o fragmento de DNA desejado
ao vetor local (ex. gt10 e ZAPII).

Vetores de insero e substituio


Vetores de substituio: possuem dois locais de restrio
que flanqueiam uma regio do DNA que substituda
pelo fragmento pretendido (ex. EMBL4, GEM11 e 12)

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MTODOS DE MODIFICAO
DE EXTREMIDADES DO DNA

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