FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

Curso: Engenharia Agrícola e Ambiental

Disciplina: Bioquímica
Professor: Leonardo Cavalcanti

Aluna: Isadora Benevides Miranda

ESTUDO DIRIGIDO
CATÁLISE ENZIMÁTICA

1. Tipos de inibição enzimática:

1.1. Inibição Reversível Competitiva

Neste caso de inibição, os inibidores são compostos que possuem forma

estrutural suficientemente semelhante à forma do substrato, de modo que este
consegue ocupar um sítio ativo da enzima, sendo, assim, reconhecido pela
mesma. A Figura 1 explica de forma simplificada o processo:

Figura 1: Processo de inibição competitiva

 Pode-se perceber claramente que existe uma competição entre as
moléculas de substrato e as moléculas inibidoras pela ligação com o sítio ativo
da enzima, ressaltando que geralmente faltam determinados grupos químicos
capazes de dar procedimento à reação, nos inibidores. Assim, o complexo EI
(enzima-inibidor) não gera produto algum.

O processo de inibição competitiva depende basicamente de dois

fatores:

 concentrações relativas de substrato e inibidor;

 afinidade da enzima pelo substrato e pelo inibidor.

Em um experimento realizado com uma enzima + substrato sem a

presença de uma substância inibidora, percebe-se que existe um determinado
valor de VMAX e um valor para KM. Relembrando para o modelo uni-uni,

𝑘−1 𝑘1 𝑘2
𝐸+𝑆 𝐸𝑆 𝐸+𝑃

𝑘2 + 𝑘−1
𝐾𝑀 =
𝑘1

Entretanto, na presença de um inibidor, o valor de K M aumentará devido

ao fato da diminuição da constante cinética k1 (relativa à formação do complexo
ES), pois se estará formando o complexo enzima-inibidor, com uma outra
constante cinética KI. Contudo, a velocidade de formação VMAX não se altera,
pois o inibidor se liga reversivelmente à enzima e uma simples adição de
substrato ao meio torna menor a probabilidade da formação do complexo EI.
Ou seja, em uma determinada reação enzimática sempre haverá uma
concentração de substrato alta o suficiente que fará o inibidor se deslocar do
sítio ativo da enzima, formando assim o complexo ES e atingindo uma mesmo
VMAX, porém de forma mais lenta (diminuição de k1).

Equação de Michaelis-Menten com a presença de um inibidor

competitivo:
 Aplicando-se o método de Lineweaver-Burk na equação anterior:

1.2. Inibição Reversível Incompetitiva

Neste tipo de exibição existe um bloqueio do complexo ES via

introdução da molécula inibidora no mesmo. Para a análise deste tipo de
inibição, supõe-se que existem dois sítios ativos na enzima: um destinado ao
substrato e outro destinado ao inibidor, este último se fixando de modo
reversível sobre o complexo ES. A Figura 2 resume o processo:

Figura 2: Processo de inibição incompetitiva

Percebe-se que o inibidor só se liga ao complexo ES, formando um

complexo ESI (enzima-substrato-inibidor) inativo, sem dar origem a nenhum
produto. É importante ressaltar que, neste caso, tanto o valor de K M aparente
quanto o de VMAX aparente são menores que os valores sem presença de
inibidor. O valor de KM aparente decai devido à diminuição da constante de
formação de produto k2, já o VMAX aparente decai com a presença do inibidor
devido justamente à formação dos complexos inativos ESI, que irão influenciar
diretamente no equilíbrio da reação quando [S] 0 tende a infinito. Isso pode ser
observado através do balanço de sítios ativos da enzima:
[𝑆í𝑡𝑖𝑜𝑠]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 = [𝑆í𝑡𝑖𝑜𝑠]𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 + [𝑆í𝑡𝑖𝑜𝑠]𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖𝑑𝑜𝑟

No caso onde [I] é igual a zero, temos que [Sítios] inibidor também será
igual a zero, obtendo um determinado valor para V MAX. Contudo, quando
[Sítios]inibidor≠ 0, haverá uma mudança no equilíbrio da reação quando se
assume uma alta concentração de substrato, atingindo um valor diferente para
VMAX.

A equação de velocidade é dada por:

Aplicando o método de Lineweaver-Burk na equação anterior:

1.3. Inibição Reversível Não-Competitiva

Neste caso, a molécula inibidora não compete com o substrato pela

ligação com o sítio ativo da enzima, ocupando outro sítio da enzima (sítio de
inibição), formando, além dos complexos ES e EI, um complexo ternário ESI,
como mostra a Figura 3:
 Figura 3: Processo de inibição não-competitiva

A enzima se torna inativa uma vez que o inibidor se liga a ela, estando
presente o substrato ou não. Ao contrário da inibição incompetitiva, uma
concentração infinitamente alta de substrato não consegue fazer com que toda
a enzima presente se converta no complexo ES. Ou seja, para uma
concentração qualquer de inibidor, uma parte da enzima permanecerá sob a
forma do complexo ternário ESI, supondo-se, assim, que VMAX aparente será
menor do que VMAX. Como o inibidor pode agir tanto no sentido de formação de
ES como no sentindo de degradação do mesmo, formando ESI, então é
previsível que o valor de KM aparente pouco irá diferir do valor de KM.

A equação da velocidade é:

Aplicando o método de Lineweaver-Burk na equação anterior:

1.4. Inibição Irreversível

Inibidores irreversíveis são aqueles que se combinam com um grupo

funcional na molécula da enzima e que é essencial para sua atividade, estes
inibidores podem, também, promover a destruição de tal grupo. É comum a
formação de uma união covalente entre um inibidor irreversível e uma enzima.

Um substrato que se combina irreversivelmente com uma enzima pode

assemelhar-se a um inibidor não competitivo porque Vmax diminui, ao passo
que Km permanece a mesma. A Vmax diminui porque parte de enzima é
completamente removida do sistema.

Equação de Michaelis-Menten na presença de um inibidor irreversível:

Aplicando-se o método de Lineweaver-Burk na equação anterior:

2. Metodologia

1o) Caso

160
140
V0(mol.L-1.min-1

120
100
80 Série1
60
40 Polinômio
20 (Série1)
0
0 100 200 300
[S] (µM)

Gráfico 1: Vo x [S]
 0,050
0,045 y = 0,196x + 0,006

1/V0(mol.L-1.min-1)
0,040 R² = 0,999
0,035
0,030
0,025
0,020 Série1
0,015
Linear (Série1)
0,010
0,005
0,000
0 0,1 0,2 0,3
1/[S] (µM)

Gráfico 2: 1/Vo x 1/[S]

Essa enzima apresenta o comportamento de Michaelis-Menen, pois o

gráfico 2 (1/Vo x 1/[S]) fornece uma reta. A equação da reta é y = 0,196x +
0,006. O valor de R, que significa que quanto mais próximo de 1, menor a
dispersão dos pontos, ou seja, revela com que precisão os valores estimados
para a linha de tendência correspondem aos seus dados reais, foi R= 0,999.

Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de

Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b. Logo,
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

1/Vmax=0,006

Vmax = 166,67

Km/Vmax=0,196

Km = 32,67
 2o) Caso

 Sem inibidor

4,5
4
3,5
V0(mol.L-1.min-1) 3
2,5
Série1
2
1,5
1 Polinômio
(Série1)
0,5
0
0 5 10 15
[S] (µM)

Gráfico 3: Vo x [S]

0,700
y = 0,484x + 0,195
1/V0(mol.L-1.min-1)

0,600
R² = 0,997
0,500
0,400
0,300
0,200 Série1
0,100 Linear (Série1)
0,000
0 0,5 1
1/[S] (µM)

Gráfico 4: 1/Vo x 1/[S]

Essa enzima apresenta o comportamento de Michaelis-Menen, pois o

gráfico 4 (1/Vo x 1/[S]) fornece uma reta. A equação da reta é y = 0,484x +
0,195. O valor de R, que significa que quanto mais próximo de 1, menor a
dispersão dos pontos, ou seja, revela com que precisão os valores estimados
para a linha de tendência correspondem aos seus dados reais, foi R= 0,998.
 Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de
Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
Logo, encontra-se: Vmax = 5,13 e Km = 2,48.

 Inibidor A
3

2,5
V0(mol.L-1.min-1)

1,5
Série1
1
Polinômio
0,5
(Série1)
0
0 5 10 15
[S] (µM)

Gráfico 5: Vo x [S]

1,200
y = 0,858x + 0,336
1,000
1/V0(mol.L-1.min-1)

R² = 0,999
0,800
0,600
0,400 Série1

0,200 Linear (Série1)

0,000
0 0,5 1
1/[S] (µM)

Gráfico 6: 1/Vo x 1/[S]

 Essa enzima apresenta o comportamento de Michaelis-Menen, pois o
gráfico 6 (1/Vo x 1/[S]) fornece uma reta. A equação da reta é y = 0,858x +
0,336. O valor de R, que significa que quanto mais próximo de 1, menor a
dispersão dos pontos, ou seja, revela com que precisão os valores estimados
para a linha de tendência correspondem aos seus dados reais, foi R= 0,999.

Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de

Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
Logo, encontra-se: Vmax = 2,98 e Km = 2,55.

 Inibidor B
4
3,5
V0(mol.L-1.min-1)

3
2,5
2
Série1
1,5
1
Polinômio
0,5 (Série1)
0
0 5 10 15
[S] (µM)

Gráfico 7: Vo x [S]
 1,200
y = 1,006x + 0,186
1,000

1/V0(mol.L-1.min-1)
R² = 0,999
0,800
0,600
0,400 Série1

0,200 Linear (Série1)

0,000
0 0,5 1
1/[S] (µM)

Gráfico 8: 1/ Vo x 1/[S]

Essa enzima apresenta o comportamento de Michaelis-Menen, pois o

gráfico 8 (1/Vo x 1/[S]) fornece uma reta. A equação da reta é y = 1,006x +
0,186. O valor de R, que significa que quanto mais próximo de 1, menor a
dispersão dos pontos, ou seja, revela com que precisão os valores estimados
para a linha de tendência correspondem aos seus dados reais, foi R= 0,999.

Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de

Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
Logo, encontra-se: Vmax = 5,38 e Km = 5,41.

Classificação dos inibidores A e B: O inibidor A é do tipo não-

competitivo, pois apresentou uma diminuição na velocidade máxima quando o
inibidor foi adicionado e o Km pouco se alterou. Já o inibidor B é do tipo
competitivo, onde Km na presença do inibidor é maior que o Km na reação sem
inibidor e Vmax foi pouco alterado.

3. Atividades
1)
 10
y = 0,765x + 1,438
8 R² = 0,999

1/V (x 109 )
6

4
Série1
2 Linear (Série1)
0
0 5 10 15
1/[S] (x 105 M-1 )

Gráfico 9: 1/Vo x 1/[S]

Essa enzima apresenta o comportamento de Michaelis-Menen, pois o

gráfico 9 (1/Vo x 1/[S]) fornece uma reta. Para encontrar os valores de Km e
Vmax foi usado o método de Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
Logo, encontra-se: Vmax = 0,68 x 10-9 mol.min-1 e Km = 0,52 x 10-5 M.

Quando a concentração de penicilina for 0,2 x 10-5, substitui-se o valor

[S] na fórmula de Lineweaver-Burk encontrando a velocidade V = 0,189x10-9
mol.min-1 . E quando [S] for 1,0 x 10-3, V = 0,676 x 10-9 mol.min-1.

Quando a concentração de penicilina [S] for 0,4 x 10-5, a quantidade de

produto formado será 0,2958 mol.min-1. Então, em 5 minutos será formado
1,479 x 10-9 mol.10mL-1 de produto.

Aumentando a quantidade hidrolisada em 4 vezes e mantendo a mesma

concentração do substrato obtém-se o seguinte gráfico:
 3
y = 0,237x + 0,308
2,5 R² = 0,995
1/V (x 109 ) 2

1,5
Série1
1
Linear (Série1)

0,5

0
0 5 10 15
1/[S] (x 105 M-1
Gráfico 10: 1/Vo x 1/[S]

1 𝐾𝑚 1 1
A partir da equação da reta e utilizando a fórmula = . + , foi
𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

encontrado Km = 0,77 x 10-5 M e Vmax = 3,25 x 10-9 mol.min-1.

Com os novos valores de Km e Vmax, se a concentração de penicilina fosse

0,2 x 10-5, a velocidade da reação seria V = 0,670 x 10-9 mol.min-1.

2)

0,9
0,8 y = 0,260x + 0,340
0,7 R² = 0,994
1/Vo (µmol/L/min)

0,6
0,5
0,4
Série1
0,3
Linear (Série1)
0,2
0,1
0
0 0,5 1 1,5 2
1/[ATP] (µmol/L)

Gráfico 10: 1/Vo x 1/[ATP]

Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de

Lineweaver-Burk que diz que:
 1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
Logo, encontra-se: Vmax = 2,94 µmol.min-1 e Km = 0,765.

3)
 pH 7,6
0,016
y = 9E-08x + 0,008
0,014
R² = 0,997
0,012
0,01
0,008 Série1
0,006 Linear (Série1)
0,004
0,002
0
0,00 20000,00 40000,00

Gráfico 11: 1/Vo x 1/[S]

Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de

Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
Logo, encontra-se: Vmax = 125µmol.min-1 e Km = 0,00001125 M.
  pH 9,0
0,035
y = 4E-07x + 0,005
0,03
R² = 0,999
0,025
0,02
Série1
0,015
Linear (Série1)
0,01
0,005
0
0 20000 40000

Gráfico 12: 1/Vo x 1/[S]

Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de

Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
Logo, encontra-se: Vmax = 200µmol.min-1 e Km = 0,00008 M.

O valor de pH em que a enzima apresenta uma maior afinidade para o

substrato é o que apresenta o menor valor de Km, nesse caso é o pH 7,6.

4) As velocidades caíram quase que pela metade e a reação, na presença

do composto, se trata de catálise. Portanto, o composto é um catalisador,
que vai acelerar a formação de produtos.
 5)
 Sem inibidor
0,12
y = 2E-07x + 0,022
0,1 R² = 0,998
1/Vo (µmol/min)

0,08

0,06
Série1
0,04
Linear (Série1)
0,02

0
0 200000 400000
1/[S] M

Gráfico 13: 1/Vo x 1/[S]

Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de

Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

Logo, encontra-se: Vmax = 45,45µmol.min-1 e Km =𝟗, 𝟎𝟗𝒙𝟏𝟎−𝟔 M.

 Com inibidor

0,3
y = 7E-07x + 0,021
0,25 R² = 0,999
0,2

0,15 Série1
0,1 Linear (Série1)

0,05

0
0 100000 200000 300000 400000

Gráfico 14: 1/Vo x 1/[S]

 Para encontrar os valores de Km e Vmax foi usado o método de
Lineweaver-Burk que diz que:

1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚 1
Onde = ao valor de a, na equação da reta e = ao valor de b.
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

Logo, encontra-se: Vmax = 47,62µmol.min-1 e Km =3,33𝒙𝟏𝟎−𝟓 M.

Como após a adição de um inibidor houve um aumento no valor de Km e

a velocidade máxima foi pouco alterada, classifica-se esse tipo de inibição
como inibição reversível competitiva.

Referências bibliográficas

NELSON, D. L. & COX, M.M. 2002. Lehninger: Princípios de Bioquímica. 3ª

edição. Editora Sarvier, São Paulo, SP, Brasil.

MARIOTTO, Juliana Ribeiro. Estágio de docência – Cinética enzimática. Julho,

2006.