1.

Coleta e Preparação de Sangue

 Coleta de Sangue: O sangue é coletado usando anticoagulante para prevenir a

coagulação. Heparina.
 Diluição: O sangue coletado geralmente é diluído em uma solução salina
balanceada, como PBS (Phosphate-Buffered Saline), numa proporção de 1:1.

2. Isolamento de PBMCs por Gradiente de Densidade

 Camada de Ficoll: Uma solução de Ficoll-Paque é usada para criar um

gradiente de densidade. O sangue diluído é cuidadosamente camada sobre
Ficoll em tubos de centrífuga.
 Centrifugação: Os tubos são centrifugados a uma força g específica
(geralmente em torno de 400-800 g) por 20-30 minutos a temperatura
ambiente. Este processo separa o sangue em camadas, com as PBMCs
formando uma camada distinta na interface entre o plasma e o Ficoll.
 Recolhimento das PBMCs: A camada contendo as PBMCs é cuidadosamente
coletada e transferida para um novo tubo.

3. Lavagem

 Lavagem das Células: As PBMCs coletadas são lavadas pelo menos duas vezes
com PBS ou outro meio de lavagem por centrifugação a aproximadamente 300
g por 10 minutos para remover o Ficoll e os plasmaresíduos.
 Resuspensão: Após a última lavagem, as células são ressuspendidas em meio
de cultura apropriado.

4. Cultura

 Meio de Cultura: O meio de cultura típico pode ser RPMI 1640 ou DMEM,
frequentemente suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), L-
glutamina e antibióticos (penicilina e estreptomicina).
 Semeadura: As células são contadas usando um contador de células ou
hemocitômetro e semeadas em placas de cultura ou frascos a uma densidade
apropriada, geralmente entre 1×10^6 a 2×10^6 células/mL.
 Condições de Cultura: As células são incubadas a 37°C em uma atmosfera
contendo 5% de CO2.
 Monitoramento e Manutenção: O meio de cultura deve ser trocado a cada
dois ou três dias, e as células devem ser monitoradas regularmente sob um
microscópio para avaliar a viabilidade e a contaminação.

5. Estimulação (Opcional)

 Para alguns experimentos, pode ser desejável estimular as PBMCs, por exemplo,
com fito-hemaglutinina (PHA), lipopolissacarídeo (LPS) ou anticorpos anti-
CD3/CD28, para ativar as células ou induzir uma resposta imune específica.
Notas Importantes

 Sempre trabalhe em condições assépticas para evitar contaminação.

 Ajuste as condições de cultura, como a densidade celular e o meio de cultura,
de acordo com as necessidades específicas do seu experimento.
 Monitoramento cuidadoso das células é crucial para garantir a saúde e a
viabilidade das células durante o cultivo.

Se as células PBMCs não são aderentes, a troca de meio pode ser um pouco diferente em
comparação com células aderentes. Aqui está uma maneira comum de realizar a troca de
meio em células não aderentes:

1. Aspiração do Meio Usado:

 Utilize uma pipeta ou uma seringa com uma agulha fina para aspirar
cuidadosamente o meio usado sem perturbar as células no fundo do frasco.
 Evite aspirar as células junto com o meio usado. Se necessário, incline
delicadamente o frasco para garantir que todo o meio seja removido, mas
as células permaneçam no fundo.
2. Lavagem das Células (Opcional):
 Se você estiver preocupado com a acumulação de resíduos ou produtos
metabólicos, pode lavar as células uma ou duas vezes com PBS estéril ou
outro meio de lavagem. Para isso, adicione uma pequena quantidade de
PBS estéril no frasco e, em seguida, aspira o PBS, tendo cuidado para não
remover as células.
3. Adição de Novo Meio:
 Adicione o novo meio de cultura cuidadosamente ao frasco. Deixe cair o
meio ao longo das paredes do frasco para evitar perturbar as células no
fundo.
 Certifique-se de adicionar a quantidade correta de meio fresco para manter
a concentração celular desejada e fornecer nutrientes adequados às células.
4. Incubação:
 Coloque o frasco de volta na incubadora e permita que as células
continuem a crescer e se proliferar sob as condições apropriadas de
temperatura, umidade e concentração de CO2.
5. Monitoramento:
 Após a troca de meio, monitore regularmente as células para garantir que
estejam saudáveis e em condições ideais de crescimento.

É importante realizar a troca de meio com cuidado para evitar danos às células. Além disso,
é recomendável manter as condições assépticas durante todo o processo para evitar
contaminação.