Biotecnologia

Vegetal
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Resumos Prática _________________

Autor: Hugo Rocha

Licenciatura em Biotecnologia
Ano Letivo 2022/2023

Aveiro
 Biotecnologia Vegetal – Resumos Prática

Índice
1º Protocolo – Micropropagação de Plantas ............................................................................. 3
Micropropagação .................................................................................................................... 3
Laboratório de Micropropagação.......................................................................................... 3
Equipamento para Cultura de Tecidos ................................................................................. 3
Fatores Importantes ................................................................................................................ 3
Explante ................................................................................................................................... 4
Micropropagação de Segmentos Nodais ............................................................................... 5
Fases da Micropropagação ..................................................................................................... 5
2º Protocolo – Multiplicação e enraizamento de plantas ......................................................... 7
Fase de Multiplicação ............................................................................................................. 7
Fase de Enraizamento ............................................................................................................. 7
O Papel das Hormonas ........................................................................................................... 8
3º Protocolo – Hidrolases: Aplicações na indústria alimentar ................................................ 9
Enzimas .................................................................................................................................... 9
Aplicações enzimáticas............................................................................................................ 9
Indústria dos Vinhos e dos Sumos ....................................................................................... 10
Pectinase e Amilase ............................................................................................................... 11
Temperatura e pH ótimos..................................................................................................... 11
Clarificação do sumo de maçã.............................................................................................. 12
Fruit Peeling .......................................................................................................................... 13
4º Protocolo – Isolamento de Protoplastos .............................................................................. 13
O Protoplasto ......................................................................................................................... 13
Métodos de Isolamento de protoplastos .............................................................................. 14
Produção e Viabilidade ......................................................................................................... 15
Procedimento ......................................................................................................................... 15
5º Protocolo – Deteção de Milho Transgénico ........................................................................ 17
Organismos Geneticamente Modificados............................................................................ 17
Caso Estudo: Milho Bt .......................................................................................................... 17
Deteção de Marcadores Transgénicos ................................................................................. 19
Protocolo – Como realizar um teste QuickStix................................................................... 20
6º Protocolo – Aclimatização .................................................................................................... 21
O Processo da Aclimatização ............................................................................................... 21

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1º Protocolo – Micropropagação de Plantas

Micropropagação

A micropropagação é uma técnica que permite o crescimento de plantas sob certas

condições de assepsia num meio com nutrientes, hormonas e controlo de fatores abióticos, tais
como, luz, temperatura, oxigénio e dióxido de carbono.

Laboratório de Micropropagação

Um laboratório de micropropagação pode-se dividir em 5 “áreas físicas”:

1. Sala de preparação de meio
2. Sala de esterilização
3. Sala de manipulação em assepsia
4. Sala de crescimento das plantas in vitro
5. Estufa

Equipamento para Cultura de Tecidos

• Dionizador
• Balança
• Medidor de pH
• Filtro esterilizador
• Autoclave
• Câmara de Fluxo Laminar
• Incubadora
• Câmara de crescimento vegetal

Fatores Importantes

Meio de Crescimento – Minerais, fatores de crescimento, fonte de carbono, hormonas

Fatores ambientais – Luz, temperatura, fotoperíodo, esterilidade
Fonte do Explante – Espécie, genótipo, idade

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Explante

Quando se retira um explante como um botão axilar, nós removemo-lo de uma fonte de
vários químicos e temos de restabelecer estes para permitir que os explantes cresçam.

O que é um explante?
É um fragmento de tecido vegetal obtido de uma planta e que vai ser propagado para obter
uma nova planta.
Os explantes mais adequados para micropropagação contêm, naturalmente, células do
tecido meristemático. As folhas e raízes são também usadas.

Fonte do Explante
O explante deve ter propriedades desejáveis como ser facilmente desinfetado, ser jovem,
e responsivo à cultura.
A escolha do explante condiciona o grau de sucesso da micropropagação e a sua fonte
deve ser escolhida com cuidado. Os explantes devem ser partes jovens de uma planta adulta,
preferencialmente de área de crescimento ativo, incluindo meristemas.

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Micropropagação de Segmentos Nodais

A produção de rebentos a partir de meristemas pré-existentes apenas. O tipo mais simples

de propagação de plantas in vitro é a estimulação do desenvolvimento de botões axilares (laterais).

Fases da Micropropagação
1. Seleção e Desinfeção do Explante
2. Iniciação
3. Multiplicação
4. Enraizamento
5. Aclimatização

Passo 1 – Seleção e Desinfeção do Explante

Seleciona-se o tecido vegetal (explante) de uma planta mãe vigorosa e saudável, este
tecido é, muitas vezes, o botão apical/terminal, mas podem ser outros tecidos.
Todos os estudos de cultura de tecidos que objetivam obter uma elevada regeneração de
rebentos devem ser executadas sob condições estéreis.
Este tecido deve ser desinfetado para remover contaminantes microbianos.

Desinfeção
Bactérias e fungos vão crescer em demasia no explante no meio, a não ser que sejam
removidos.
Existe uma série de pré-tratamentos para limpar o explante:
- Transferir as plantas para um estufa para reduzir os contaminantes endémicos;
- Forçar o crescimento dos segmentos nodais;
- Usar fungicidas.

O tratamento mais importante antes da iniciação da cultura é, talvez, a desinfeção da

superfície do explante.

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Na imagem, o protocolo 1 refere-se à desinfeção dos segmentos nodais e o 2 à desinfeção

das sementes.

Passo 2 – Iniciação
Estabelecimento do explante num meio de cultura. O meio sustenta as células vegetais e
encoraja a divisão celular.
O meio em si pode ser sólido ou liquido e cada espécie/genótipo de planta tem requisitos
médios específicos que devem ser estabelecidos por tentativa e erro.

O meio de iniciação já tinha um regulador de crescimento, uma citoquinina (BAP), que

serve para quebrar a dormência dos gomos e fazer com que eles cresçam.
Os segmentos nodais eram de roseira e as sementes eram de brócolo.

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2º Protocolo – Multiplicação e enraizamento de plantas

Fase de Multiplicação

O objetivo no passo 3 é aumentar o número de microrrebentos produzidos na cultura

através de subculturas.
Microrrebentos são os botões pequenos iniciados durante a fase de iniciação e de
multiplicação da micropropagação.
De acordo com os métodos de propagação empregados, estas estruturas podem ser
rebentos axilares ou adventícios ou embriões, etc.
A subcultura é o processo de divisão de rebentos ou tecidos em pedaços mais pequenos
e, depois, transferi-los para um meio fresco para começar o processo de multiplicação outra vez.
Dependendo da espécie da planta, a subcultura é feita a cada 4 a 8 semanas. Este processo permite
ao propagador ter milhares de microrrebentos de apenas um explante.

Nesta aula usámos Violeta Africana, pois é uma planta facilmente propagável. O meio
continha auxinas (IBA) e citoquininas (BAP) com maior concentração das últimas, porque o
objetivo continua a ser quebrar a dormência dos gomos para que estes possam crescer.

Fase de Enraizamento

O objetivo do 4º passo é iniciar raízes nas microestacas. Os brotos de semente da fase de

multiplicação são muito pequenos e incompletos e não é possível a sua transferência direta para
o solo ou para outro substrato.
Nesta fase, certos procedimentos são seguidos para que estas pequenas plantas
desenvolvam a sua capacidade fotossintética e sejam capazes de sobreviver sob condições
naturais sem adição de carboidratos artificiais.

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Em alguns casos, a elongação dos pecíolos é um pré-requisito para a fase de enraizamento

– Reguladores de crescimento vegetal: GA3
O crescimento de rebentos pode ser induzido para produzir raízes adventícias ao incluir
auxina no meio – Reguladores de Crescimento Vegetal: IBA, IAA.

O Papel das Hormonas

Auxinas
As auxinas afetam o crescimento e a forma da planta e desempenha papeis em:

• Formação de raízes;
• Abcisão de folhas;
• Dominância Apical/Terminal;
• Desenvolvimento de fruta partenocárpica.
• Algumas auxinas sintéticas são utilizadas como herbicidas seletivos.
Citoquininas
As citoquininas estão ativas desde as sementes até à sua senescência:

• São derivados de adenina;

• Zeatina e Isopentenil Adenina são citoquininas que ocorrem naturalmente,
enquanto a quinetina é uma sintética;
• São promotoras da divisão celular em plantas;
• Promovem germinação de sementes em algumas espécies;
• Inibem a elongação dos pecíolos;
• Promovem o inchaço lateral dos caules e das raízes;
• Estimulam o crescimento de botões laterais;
• Promovem a expansão de tecidos das folhas e atrasam a senescência das folhas.

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3º Protocolo – Hidrolases: Aplicações na indústria alimentar

Enzimas

As enzimas são macromoléculas de natureza proteica que atuam nas células e são
catalisadores bastante eficientes em reações bioquímicas. Elas aceleram as reações ao fornecer
uma reação alternativa de menor energia de ativação. As enzimas são, normalmente, altamente
seletivas, catalisando reações específicas apenas. Esta especificidade deve-se às formas das
moléculas. A atividade enzimática depende da velocidade a que os produtos de reação se formam.
Existem, então, vários fatores que afetam a atividade catalítica das enzimas, tais como:
• Temperatura;
• pH;
• Concentração enzimática e do substrato;
• Inibidores.

As enzimas utilizadas nesta atividade prática eram hidrolases: enzimas que catalisam
reações de hidrólise onde a molécula é dividida em duas ou mais moléculas pequenas através da
adição de água. Alguns exemplos são as protéases. Estas proteínas separam moléculas proteicas
e são, posteriormente, classificadas pelo seu pH ótimo como ácidas, alcalinas ou neutras.

Aplicações enzimáticas

As enzimas são usadas, nos dias de hoje, em várias indústrias diferentes. O uso de enzimas
na comida e na indústria de rações é bem estabelecido e generalizado.
As enzimas são capazes de manipulas especificamente todas as macromoléculas
biológicas principais, assim como as mais pequenas, tais como aminoácidos ou vitaminas. Devido
à elevada especificidade, um nível reduzido de sub-produtos, altos rendimentos e composições
controladas dos produtos são obtidas.
Para além disso, as enzimas trabalham em condições ambientais suaves (temperatura e
pressão) que levam a um equipamento industrial mais económico.

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Indústria dos Vinhos e dos Sumos

No processamento da fruta é muito importante alcançar uma boa maceração do tecido da

fruta. Para tal, as enzimas mais usadas nesta indústria são as pectinases.
Pectinase é um termo geral para enzimas, tais como a pectoliase, pectina esteriase,
pectozima e poligalacturonase comummente referidas como enzimas pécticas que quebram a
pectina.
Estas pectinases oferecem diversas vantagens como:
• Maior rendimento de prensagem;
• Redução da viscosidade;
• Melhoramento na filtração e na clarificação.

Na produção de vinho tinto não convencional, de modo a aumentar a velocidade de

extração das antocianinas pigmentadas da pele das uvas, a maceração das uvas é aquecida e uma
grande quantidade de pectina é libertada no sumo que se torna viscoso. Neste processo de
produção de vinho é necessária a adição de pectinases.
Há enzimas que são usadas como auxiliares de processamento, tais como, hemicelulases,
amílases, glucanases e protéases.
Existem diferentes tipos de “cocktails” enzimáticos otimizados de acordo com:
• O tipo de fruta (maçã, laranja, pêssego e uva, etc)
• O processo de manufaturação;
• A qualidade desejada do produto final.
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Pectinase e Amilase

A pectina é um polissacarídeo ramificado constituído por cadeias de centenas de resíduos

de ácido galacturónico que existe em todos os tecidos vegetais. As maçãs e os citrinos são as
frutas mais ricas em pectina.
Pectinases:
• Enzimas hidrolíticas produzidas e comercializadas a partir de microrganismos;
• Alterações na fluidez e integridade da membrana.

As pectinases ocorrem naturalmente em todas as frutas e são parcialmente responsáveis

pelo processo de amadurecimento. Porém, as pectinases da uva estão inativas sob o pH e às
condições de SO2 associadas à produção de vinho. As pectinases fúngicas são mais resistentes a
estas condições.
Deste modo, foi estabelecido que apenas Aspergillus niger e Trichoderma podem ser
utilizadas para a produção de enzimas.
O amido é uma estrutura ramificada composta por imenso monómeros de glucose e é uma
amilase que catalisa a hidrólise do amido em produtos de baixo peso molecular.
A conversão enzimática do amido inclui vários passos:
1. Gelatinização – envolve a dissolução dos grânulos de amido, formando, assim, uma
suspensão viscosa;
2. Liquefação – envolve a hidrólise parcial e perda de viscosidade;
3. Sacarificação – envolve a produção de glucose e maltose através da hidrólise.

Temperatura e pH ótimos

A pectinase exerce a sua atividade máxima quando a temperatura se encontra perto dos
45ºC e o pH perto de 4,0.
Já a amilase tem um pH ótimo perto de 6 e uma temperatura ideal aos 55ºC.

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Clarificação do sumo de maçã

O sumo de maçã bruto obtido após a trituração das maçãs é turvo, de cor castanha,
bastante viscoso e tende a pousar durante o armazenamento, para isso deve ser clarificado antes
da sua comercialização.
Polissacarídeos (como a pectina, celulose, hemicelulose e amido), proteínas, taninas,
metais e microrganismos são os principais responsáveis pela turbidez do sumo de maçã.
Os processos de clarificação convencional objetivam eliminar os sólidos insolúveis e
destruir substâncias peptídicas ao degradar a pectina e o amido com enzimas específicas,
floculando a turbidez com agentes de clarificação (bentonite, gelatina e silicasol).
Tanto a despectinisação como desamidação são essenciais para a maioria dos processos
de clarificação dos sumos. O amido pode ser degradado pela amilase junto com as pectinases
durante as despectinização do sumo.
A amilase elimina a possível ação das moléculas de amido se agregarem com proteínas,
pectinas e, assim, elimina a formação de turvação.
O amido é, também, responsável pela lenta filtração e elevada viscosidade do sumo. A α-
amilase atua sinergeticamente com a pectinase para reduzir a viscosidade.
O conteúdo total de açúcares redutores é aumentado na clarificação do sumo de maçã
após o tratamento com pectinase e amilase. Isto deve-se às enzimas libertarem ácido galacturónico,
glucose, dextrina, maltose e outros açúcares redutores da pectina e do amido durante a hidrólise.
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Fruit Peeling

As pectinases também podem ser utilizadas para efetuar o peeling enzimático de citrinos
e para remover a pele fina de frutos com caroço, como pêssegos, damascos e nectarinas.
É necessário raspar a casca da tangerina para retirar as cutículas cerosas, permitindo que
as enzimas entrem na casca.

4º Protocolo – Isolamento de Protoplastos

O Protoplasto

Os protoplastos são conteúdos plasmolizados esféricos de uma célula vegetal, rodeados

pela membrana plasmática e desprovidos de parede celular por um processo experimental
adequado. Basicamente são células de plantas, fungos ou bactérias, cuja parede celular foi
removida, mantendo a membrana plasmática intacta.
O interesse na sua utilização vem do facto de estes não terem parede celular e de
exercerem a sua função como unidades individuais.
Os protoplastos isolados são capazes de:
• Regeneração da parede celular;
• Divisão celular;
• Crescimento celular;
• Regeneração da planta sob cultura.

Também os protoplastos têm diversas aplicações principais, tais como:

• Fusão de células – hibridização somática;
• Transformação;
• Uso de clonagem a partir de uma única célula para a seleção de linhagens de células
mutantes ou células transformadas;
• Uso para estudos da ultraestrutura, membrana (processos de transporte e captação) e
regeneração da parede celular;
• Isolamento de organelos e cromossomas da células.
Os protoplastos podem ser usados para o estudo da biologia da membrana citoplasmática,
incluindo o “uptake” de macromoléculas e vírus. São também amplamente utilizados para a
transformação de DNA (para a produção de organismos geneticamente modificados), uma vez
que, de outro modo, a parede celular bloqueia a passagem de DNA para a célula.

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Métodos de Isolamento de protoplastos

O isolamento de protoplastos pode ser afeito através de dois métodos ou, então, através
da conjugação de ambos.
O primeiro método, o mais antigo, é o método mecânico que consiste em:
1. Um pequeno pedaço de tecido vegetal;
2. Plasmólise das células;
3. Corte da parede celular com um microbisturi ao microscópio;
4. Fases seguintes de libertação dos protoplastos;
5. Obtenção dos protoplastos isolados e da célula vazia.
Este método demonstra desvantagens como a sua dificuldade ou a baixa produção de
protoplastos, no entanto, tem como vantagem não haver efeitos metabólicos negativos
provenientes da contaminantes de soluções enzimáticas.
Já o segundo método, o enzimático, também se divide em vários passos:
1. Esterilização da superfície;
2. Remoção da epiderme/Cortar em tiras finas;
3. Plasmólise e digestão enzimática da parede celular;
4. Separação e purificação de protoplastos;
5. Cultura sob uma densidade adequada.

As enzimas que são usadas neste processo são aquelas que conseguem digerir os
constituintes principais da parede celular – celulase, pectinase e hemicelulase.
A solução enzimática contém, porém, outros componentes como substâncias osmóticas
(manitol e sorbitol) e sais (maioritariamente cloreto de cálcio).
Dois métodos podem ser utilizados:
• Em dois passo, isto é, sequencialmente: Primeiro a pectinase para separar as células, ao
degradar a lamela do meio/central e, depois, a celulase que remove a parede celular.
• Num único passo, ou seja, simultaneamente: Uso de ambas as enzimas ao mesmo tempo.
 Para a separação e purificação primeiro é necessário fazer uma filtração, seguida de uma
sedimentação ou flutuação.

Produção e Viabilidade

Existe a necessidade de determinar o número de protoplastos viáveis produzidos para

estabelecer a cultura sob densidade adequada. Estes podem ser determinados por:
• Observação dos movimentos de ciclose – a ciclose é o movimento do citoplasma dentro
de células vivas vegetais;
• Consumo de oxigénio;
• Atividade fotossintética;
• Corantes vitais – como, por exemplo, fenosafranina que torna os protoplastos mortos
vermelhos, enquanto os vivos permanecem incolores.

Vantagens:
• Elevado rendimento de protoplastos;
• Pode ser utilizado para vários tecidos ou órgãos diferentes (embora alguns ajustes sejam
necessários) como folhas, caules, hipocótios, raízes, frutos, etc.
• Fácil de realizar;
• A contração osmótica é mínima e os efeitos prejudiciais são minimizados;
• Os protoplastos podem ser obtidos de células meristemáticas não vacuoladas, onde a
plasmólise celular não ocorre imediatamente.

Procedimento

O procedimento experimental divide-se em duas partes: uma primeira onde se realiza o

isolamento de protoplastos e, uma segunda, onde se observa e avalia a viabilidade dos
protoplastos.
1. Pesar o tecido e cortar em tiras finas;
2. Incubar numa solução enzimática de celulase e pectinase;
3. Filtrar através de uma gase, para separar a suspensão que contém os protoplastos
dos resíduos das tiras.
4. Centrifugar 5 minutos a 200xg;
5. Coletar a banda de protoplastos com uma pipeta de Pasteur de vidro;
6. Medir o volume de protoplastos obtido com uma pipeta graduada
7. Adicionar solução de fenosafranina (corante vital);
8. Colocar uma gota da mistura no hematocitómetro e efetuar a contagem dos
protoplastos viáveis – aqueles que sejam redondos e não estejam corados de rosa-
claro).
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5º Protocolo – Deteção de Milho Transgénico

Organismos Geneticamente Modificados

Como é que é possível saber que comidas contêm ou não contêm GMOs?
Alguns países exigem a rotulagem, enquanto outros baniram todos os organismos
geneticamente modificados até os seus efeitos serem mais bem compreendidos. No entanto,
alguns níveis limiares estão a ser estabelecidos em alguns países para organismos geneticamente
modificados em certos alimentos ou culturas.
De modo a serem comercializados, os GMOs devem ser, inicialmente, sujeitos a um
processo de avaliação rigoroso e depois, rotulados, respeitando as regras de rotulagem e
rastreabilidade dos produtos.
Todos os produtos que contenham mais de 0.9% de GMOs na sua composição, devem
incluir a seguinte informação na sua rotulagem.

Os alimentos que costumam ser mais sujeitos a serem geneticamente modificados são a
soja, as batatas, o tomate, o arroz, o milho e a abobora. E, normalmente, alteram-se as
propriedades genéticas destes organismos para que estes apresentem outras características que os
favoreçam como ação inseticida, resistência a herbicidas, alterações nos pigmentos, melhoria da
qualidade das proteínas, aumento da produtividade.

Caso Estudo: Milho Bt

Bacillus thuringiensis (ou Bt) é uma bactéria comum do solo gram-positiva, formadora
de esporos que é patogénica para um grande número de insetos. O seu efeito letal é mediado
pela proteína tóxica – Proteína Cristalina – que mata as larvas Lepidoptera.
O desenvolvimento e comercialização de culturas Bt transgénicas resistentes a insetos
que expressam as toxinas Cry revolucionou a história da agricultura.

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 Quando o gene da toxina foi introduzido em plantas economicamente importantes, estas
desenvolveram uma maior resistência às pragas de insetos principais, prevenindo a necessidade
de utilizar inseticidas.
Milho Bt: é uma variante do milho, geneticamente alterada, que expressa a toxina
bacteriana Bt.
Tem havido inúmeras variedades desenvolvidas que sejam resistentes a insetos utilizando
segmentos de genes Bt únicos e, assim, expressam diferentes proteínas específicas, tais como
Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1C, Cry1F, Cry2A, Cry3B, Cry34 e Cry9C.
Todas permitem que a planta produza a sua própria proteção interna contra pragas.
O gene pioneiro foi aquele que expressa a proteína Cry1Ab, mas como é que uma planta
geneticamente modificada é feita?
1. O gene de interesse é identificado (de uma bactéria, planta, etc.);
2. Esse gene é isolado;
3. O gene é integrado numa construção genética;
4. A construção genética é multiplicada;
5. A construção genética é transferida para a planta que se deseja modificar;
6. As células modificadas são selecionadas;
7. Plantas inteiras são regeneradas;
8. A expressão do fenótipo é analisada.
 As proteínas cristalinas que são formados nos esporos Bt são responsáveis pela toxicidade
Bt. A proteína Cry chega ao estômago, é parcialmente degrada, libertando uma pequena e
potencial tóxica parte da proteína.
Mas, estas proteína só será ativa se encontrar o recetor proteico correspondente certo que
cola as células que revestem o intestino de um inseto larval.
O que torna Bt uma grande candidata a aplicações pesticidas e de modificações genéticas
é que, enquanto estas toxinas Cry são bastante efetivas contra insetos, elas mostram-se ser seguras
para o consumo de mamíferos.

Deteção de Marcadores Transgénicos

Os ensaios EnviroLogix’ são igualmente adequados para confirmar a presença de certas

características ou para detetar a presença de modificações genéticas indesejadas, o que inclui
diferentes expressões do inseticida Bacillus thuringiensis (Bt), Herculex, YieldGard, Roundup
Ready e tolerância ao herbicida LibertyLink no milho, algodão, soja, alfalfa, canola e outros grãos,
sementes, brotos ou tecidos maduros.
Os testes mais aplicados são os Lateral Flow Devices – Dispositivos de fluxo lateral.
 O Kit EnviroLogix QuickStix para o gene Cry1Ab da folha ou semente do milho é
designado para extrair e detetar a presença de endotoxinas Cry1Ab Bt aos níveis tipicamente
expressos no tecido vegetal geneticamente modificado do milho.
Para detetar estas proteínas Cry1Ab com este kit, amostras de tecidos devem ser extraídas
e as endotoxinas devem ser solubilizadas no Buffer de Extração disponibilizado.
Os ensaios imunológicos utilizam anticorpos para identificar proteínas específicas
(imunodeteção), ou seja, os anticorpos ligam-se à membrana e os conjugados (indicadores de cor)
fornecem o sinal.
Lateral Flow Device: os anticorpors e outros reagentes são coatead numa membrana de
nitrocelulose. A amostra é adicionada numa extremidade e viaja pela ação capilar até à outra
extremidade. Ao passar ao longo da membrana, a amostra é exposta a zonas reativas do anticorpo
ao analito alvo. O ensaio foi concebido para desenvolver uma linha de controlo perto da
extremidade do dispositivo.

Protocolo – Como realizar um teste QuickStix

1. Ensanduichar uma porção de tecido de folha entre a tampa e o corpo de um tubo de

Eppendorf vazio e fechar a tampa. Empurrar os pedaços de folha para o fundo do tubo
com o pilão. Identificar a amostra.
2. Inserir o pilão no tubo e triturar o tecido ao rodar o pilão contra os lados do tubo.
Continuar o processo durante 20 a 30 segundos ou até o tecido da folha estar bem moído.
3. Abrir o outro tubo e transferir 400 µL de Extraction Buffer diretamente sobre o tecido.
4. Repetir o processo de maceração.
5. Colocar a tira (à temperatura ambiente) no tubo de extração e a amostra irá subir ao longo
da tira.
6. Esperar 5 minutos pelos resultados.
 Biotecnologia Vegetal – Resumos Prática

6º Protocolo – Aclimatização

O Processo da Aclimatização

A aclimatização é a adaptação da planta a um novo ambiente e é bastante importante para

o crescimento e para a saúde das plantas.
O verdadeiro sucesso da micropropagação à escala comercial depende da habilidade de
transferir plantas para fora da cultura, em larga escala, com custos reduzidos e taxas de
sobrevivência elevadas.
As plântulas ou rebentos que tenham crescido in vitro foram continuamente expostas a
um microambiente único que foi selecionado para provocar o mínimo stress possível e ótimos
condições para a multiplicação das plantas.
As plântulas foram desenvolvidas:
• Em vasos de cultura;
• A níveis baixos de luz;
• Em condições assépticas;
• Com um meio que continha açúcares e nutrientes, permitindo um crescimento
heterotrófico para as plantas.
• Com um atmosfera de elevados níveis de humidade.

As culturas in vitro contribuem para induzir um fenótipo que não consegue sobreviver
sob as condições ambientais quando diretamente colocada numa estufa ou campo.
Durante a transferência para o campo, as plântulas que cresceram in vitro são incapazes
de competir com os micróbios do solo e de enfrente as condições ambientais.
As características fisiológicas e anatómicas das plântulas micropropagadas necessitam
que sejam aclimatizadas gradualmente ao ambiente da estufa ou do campo.
As anomalias na morfologia, anatomia e fisiologia das plântulas cultivadas in vitro podem
ser reparadas depois da sua transferência para condições ex vitro.
São necessárias, então, mudanças graduais nas condições ambientais para evitar perdas
por seca e fotoinibição.
Durante a aclimatização às condições ex vitro:
• A grossura das folhas, normalmente, aumenta;
• O mesófilo das folhas progride, em diferenciação, para folhas em paliçada e parênquima
esponjoso;
• Densidade de estomas diminui;

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 • Os estomas mudam a sua forma de circular para elíptica.

Mudanças importante incluem:

• Desenvolvimento da cutícula, o que vai prevenir perdas de água;
• Ceras epicuticulares;
• Regulação estomatal efetiva da transpiração, levando à estabilização do estado da água.

Contudo, as plântulas mudam de um crescimento heterotrófico para um crescimento

autotrófico e como?
1. As plantas são retiradas do meio;
2. São lavadas com água para remover o agar;
3. As plântulas são transferidas para vasos que contêm uma mistura de relva e perlite
esterilizada em autoclave;
4. É mantida a elevada humidade, embora esta vá diminuindo ao longo do tempo;
5. Ocorre fertilização;
6. Usam-se fungicidas.

A aclimatização pode ser acelerada através do endurecimento de plântulas in vitro:

• Diminuindo a humidade do ar, utilizando, por exemplo, tampas permeáveis para vapor
de água ou por arrefecimento do fundo;
• Aumentando a irradiância;
• Aumentando a concentração de CO2 por ventilação forçada.

Ou, após a transplantação, ao diminuir a taxa de transpiração por antitranspirantes,

incluindo ABA, ou aumentando a taxa fotossintética ao aumentar a concentração de CO2.