MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS

PFP507 – Bacteriologia Vegetal

Relatório de aulas práticas

Discente: Brunno Cassiano Lemos Araújo

Docente: Prof. Dr. Ricardo Magela

LAVRAS – MG

2022
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS – PRÁTICA 1

O isolamento dos microrganismos presentes no local infectado é o primeiro passo para

identificação e caracterização dos patógenos causadores de doença em determinada amostra
de planta. Para isso podemos realizar o isolamento em dois métodos: Isolamento direto, no
qual o órgão infectado é transferido diretamente para o meio de cultura e mantido em câmara
úmida para favorecer o crescimento dos microrganismos; O segundo método é definido como
isolamento indireto, que se baseia na técnica de transferência do tecido infectado para um
meio de cultura passando por processos de esterilização para retirada de possíveis organismos
contaminantes na superfície do tecido.

Método:

1. Retirar fragmentos de tecidos entre a região infectada e a área sadia, pois é onde se
encontra maior atividade metabólica do organismo fitopatogênicos. Áreas totalmente
necróticas normalmente contêm alta população de saprófitas (organismos
contaminantes).
2. Transferir os fragmentos, com a ajuda de uma pinça previamente flambada, para um
béquer com álcool 70% por aproximadamente 30 segundos; Posteriormente coloca-se
os fragmentos em béquer com hipoclorito de sódio a 2% por 2 minutos; Para lavagem
dos resíduos químicos do tecido, o fragmento é transferido para um béquer com água
destilada estéril por 2 minutos;
3. Macerar os fragmentos já esterilizados com a ajuda de um bastão de vidro, de forma à
homogeneizar todo o tecido.
4. Com a alça de repicagem flambada, transferir uma gota da suspensão do tecido
homogeneizado para placas de Petri com meio de cultura, realizando a técnica de
estrias paralelas;
5. Acondicionar as placas riscadas em estufas de germinação tipo B.O.D. com
temperatura de 28°C, fotoperíodo de 12 horas por 5 a 7 dias, até o crescimento das
populações bacterianas.
Figura 1: Planta de Brassica oleracea L. (couve) Figura 2: Realização da técnica de
infectada com Xanthomonas campestris pv. estrias paralelas
campestris

Figura 3: Placas riscadas transferidas para estufa de germinação B.O.D.

RESULTADOS:

Figura 4: Crescimento de colônias de Ralstonia

solanacearum em meio de cultura após isolamento
do tecido infectado de plantas de tomate.

Figura 5: Crescimento de colônias de Xanthomonas

campestris pv. campestris em meio de cultura após
isolamento do tecido infectado de plantas de couve.

Figura 6: Crescimento de colônias de Xanthomonas

axonopodis pv. phaseoli em meio de cultura após
isolamento do tecido infectado de plantas de feijão.
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS CAUSADORAS DE PODRIDÃO MOLE – PRÁTICA 2

A podridão mole é causada por bactérias pectinolíticas que tem como principal gênero
o grupo Pectobacterium sp. Sua rápida colonização dos tecidos e a produção de enzimas que
degradam a pectina da parede celular são suas principais características. Com a lesão no
tecido, bactérias saprofíticas se aproveitam e multiplicam no local, dificultando o isolamento
das bactérias causadoras da doença. Por isso, para o isolamento das colônias desse grupo de
bactérias, é recomendada a utilização de iscas biológicas, funcionando como um meio semi-
seletivo.

Método

Foi utilizado pimentão e batata como iscas biológicas para o isolamento de Pectobacterium
carotovorum pv. carotovorum causadora de podridão mole no tomate.

1. Desinfestar as iscas biológicas:

a. Detergente + água
b. Mergulhar as iscas em álcool 96% e flambar o material
2. No pimentão, com auxílio de um palito, tocar no material infectado e realizar furos ao
redor da isca (cerca de 3 furos). Já na batata, com o auxílio de uma faca previamente
flambada com álcool 96%, realizar um corte em torno da batata sem que o centro do
tubérculo seja tocado e posteriormente quebrar de forma a obter duas partes; Com
um palito, tocar no material infectado e realizar um furo no centro do tubérculo;
Fechar as duas partes e amarrar com um elástico.
3. Colocar as iscas em um saco plástico molhado previamente com um algodão
levemente encharcado por aproximadamente 24h para realizar uma espécie de
câmara úmida.

Resultados

Figura 1: Inoculação em Iscas biológicas de

pimentão e batata
 Figura 2: Crescimento de Pectobacterium
carotovorum pv. carotovorum em meio de cultura

REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE – PRÁTICA 3

A reação de hipersensibilidade é um evento de resposta de defesa das plantas contra o

ataque de fitopatógenos, sendo uma resposta localizada e rápida para evitar a disseminação
do patógeno e o acesso à nutrientes dos vegetais. A principal característica dessa reação de
defesa das plantas é a morte induzida de células ao redor do sitio de infecção, tendo como
objetivo isolar o patógeno naquele local e, consequentemente, restringir seu acesso à outras
células do tecido vegetal.

Método

Foram utilizadas plantas de tomate, tabaco, couve e pimentão para observar se a bactéria
Pseudomonas Syringae pv. Garcea provocava reações de defesa (HR) nas plantas.

1. Preparar uma solução bacteriana com colônias jovens;

2. Com a ajuda de uma seringa, introduzir levemente a agulha nos espaços intercelulares
do tecido vegetal (de forma à agulha não atravessar totalmente o tecido) e injetar a
suspensão bacteriana em alguns pontos;
3. Identificar as plantas que receberam a suspensão bacteriana;
4. Após 24h-48h da inoculação, observar os resultados.
Resultados

Figura 3: Pseudomonas Syringae pv. Garcea utilizada para

inoculação.

Figura 4: Reação de
Hipersensibilidade (HR)
em folhas de tabaco.
Figura 5: Reação de
Hipersensibilidade (HR) em
folhas de couve.

Figura 6: Reação de
Hipersensibilidade (HR) em
folhas de pimentão.
 Figura 7: Reação de
Hipersensibilidade (HR) em folhas de
tomate.

INOCULAÇÃO ARTIFICIAL – PRÁTICA 4

A prática de inoculação artificial permite observar a patogenicidade de um

determinado organismo em suas plantas hospedeiras, sendo este um procedimento que faz
parte dos Postulados de Koch.

Os patógenos bacterianos precisam de condições ambientais ideias para penetrarem e

realizarem suas atividades patogênicas dentro das células vegetais. A penetração da população
bacteriana nos tecidos das plantas ocorre através de entradas naturais (hidatódios, estômatos
e lenticelas) e por ferimentos ocasionados nos órgãos vegetais. Por isso, para que a inoculação
seja bem sucedida, é importante manter as condições de umidade ideias para a entrada e o
desenvolvimento bacteriano dentro das células vegetais.

MÉTODOS

 Os métodos de inoculação de bactérias fitopatogênicas utilizados foram:

- Inoculação por raízes

- Pulverização

- Inoculação de folhas por cortes

- Inoculação de folhas por furos

- Inoculação via hidatódios

 Inoculação por raízes

O procedimento foi realizado com Ralstonia solanacearum em plantas de

tomate.

Pode ocorrer de duas formas:

1. No momento em que as plântulas apresentarem o primeiro par de folhas

definitivas, remover a planta e lavar seu sistema radicular; Com uma
tesoura estéril, realizar cortes nas extremidades de algumas raízes, imergir
o sistema radicular na suspensão de inóculo e realizar o replantio.
2. Nesse método a planta não precisa ser arrancada; Com a ajuda de uma
tesoura realizar cortes nas raízes dentro do substrato e irrigar o vaso com o
inóculo da suspensão bacteriana.

Pulverização

Nesse caso a penetração ocorre, principalmente, através dos estômatos, por

isso é importante manter a umidade relativa alta. Realizado com Xanthomonas vesicatoria e X.
axonopodis pv. phaseoli em plantas de tomate e feijão.

Procedimento:

Realizar a pulverização com a ajuda de um

borrifador da suspensão bacteriana de maneira
uniforme, aplicando nas duas faces da folha; Manter
as plantas em câmara úmida por 24h.

Inoculação por cortes nas folhas

Esse método foi realizado com X. axonopodis pv. phaseoli em plantas de feijão.
O procedimento consistiu na imersão de uma tesousa esterilizada na suspensão de inóculo
bacteriano e realização de cortes no limbo foliar. Após o processo, colocar as plantas em
câmara úmida por 24h.
 Inoculação por picada

Procedimento realizado com Pectobacterium

(Erwinia) carotovorum subs. carotovorum em
plantas de tomate e couve. Realizar a perfuração
da haste, pecíolo e limbo foliar, com palito que
foi imerso na suspensão bacteriana; Transferir as
plantas para uma câmara úmida depois da
inoculação.

Inoculação por hidatódios

Relizado em plantas de couve com X. campestris pv. campestris. Após as

plantas serem colocadas em câmara úmida durante 24h, realizar o pincelamento da suspensão
bacteriana nas bordas das folhas. Após o procedimento, retornar as plantas para a câmara
úmida e em local ventilado.

DETECÇÃO DE GÊNEROS – PRÁTICA 5

Teste Gram: É chamado de coloração de Gram o método de coloração utilizado para

diferenciar espécies bacterianas em dois grupos, bactérias gram-positivas e gram-negativas. As
bactérias são caracterizadas como gram-positivas ou gram-negativas realizando esfregaços que
podem ser fluidos ou formar um pus. Outra detecção é a quantidade de peptídeoglicano nas
paredes das bactérias. As bactérias gram-positivas serão azul violeta, enquanto as gram-
negativas serão vermelhas.

Teste de anaerobiose: Esse teste consiste avaliar diferentes disponibilidades de oxigênio para a
bactéria no meio de cultura, verificando seu crescimento em meio anaeróbio e aeróbio.

MÉTODOS

Teste de solubilidade em KOH: Foi depositado uma gota de KOH em uma lâmina,
transferindo a colônia bacteriana crescida em meio de cultura sólido. Homogeneizar por 5 a 10
segundos, com a própria alça de repicagem. Se a preparação ficar viscosa considera-se a
bactéria como gram-negativa. Se a solução tornar-se aquosa e não aderir a alça, considera-se
gram-positiva.

Teste de anaerobiose: Utilizando placas de Petri com meio de cultura, é realizado a

repicagem da bactéria e colocado uma lamínula sobre a cultura, para representar o ambiente
anaeróbio.

RESULTADO

1. Pectobacterium carotovorum subs. carotovorum crecendo tanto na presença

quanto na ausência de oxigênio.
2. Xanthomonas campestris pv. campestris só cresce na presença de oxigênio, não
crescendo sob a lamínula.

1 2

3. Teste de gram realizado com X. campestris pv. campestris. Resultado do teste foi
de uma bactéria gram-negativa, apresentando viscosidade.

3
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS POR DIFERENTES MEIOS DE CULTURA –
PRÁTICA 6

MÉTODOS

Meio EPGA (Hidrólise de amido): Utilizado para identificar bactérias que são capazes de
hidrolisar o amido. É realizado estrias em zigue-zague no centro da placa de Petri e
manutenção das placas em BOD;

Meio YDC (Yeast Dextrose Carbonate): Xanthomonas é o único gênero de bactérias capazes de
crescer nesse meio.

Meio LEVAN (Crescimento mucoide): Utilizado para preservação de bactérias; Além disso,
separa o gênero Pseudomonas sp. e Ralstonia solanacearum dos outros gêneros, pois esses
apresentam crescimento mucoide de forma convexa. Realizar estrias no centro da placa em
zigue-zague e observar se há o crsciemento de colônias convexas e mucosas.

Meio GYCA (Crescimento mucoide): Utilizado para separa o gênero Xanthomonas sp., que
nesse meio apresentam crescimento convexo e aspecto cremoso. Também é utilizado para
preservação de bactérias.

Meio King B (Teste de fluorescência): Utilizado para separar as bactérias fluorescentes das não-
fluorescentes dentro do gênero Pseudomonas sp. Realizar estrias paralelas e levar para BOD
por aproximadamente 7 dias.

Meio Kelman: Utilizado para observar colônias virulentas ou não-virulêntas de Ralstonia

solanacearum através da utilização de Tetrazólio. Realizar estrias paralelas e levar para BOD
por aproximadamente 7 dias.

RESULTADOS

YDC: Colônias grandes, convexas, mucoides e amareladas de

Xanthomonas sp.
LEVAN: Como a bactéria utilizada foi Xanthomonas sp., as
colônias não se apresentaram convexas e mucoides.

GYCA: Colônias de Xanthomonas sp. apresentaram aspecto de

crescimento mucoide, cremoso e forma convexa

Kelman: As colônias virulentas estão vermelhas com o centro

branco, enquanto as colônias avirulentas estão totalmente
vermelhas.

EPGA: Colocou-se lugol na placa de Petri com as colônias já

crescidas. A coloração no local das colônias comprova a hidrólise
do amido.
TESTES BIOQUÍMICOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE FITOBACTÉRIAS – PRÁTICA 7

Meio de Urease: Indica se a bactéria é capaz de produzir a enzima uréase;

Para realizar o teste, é preciso inocular a bactéria com a ajuda de uma alça
de repicagem. Basta tocar na colônia bacteriana já crescida em meio
líquido e tocar no meio.

RESULTADO:

As bactérias capazes de produzir urease, provocam aumento no pH,

colorindo o meio de rosa; ao contrário daqueles que não produzem a
enzima, que apresentarão coloração avermelhada no meio.

Meio da produção de H2S a partir de cisteína ou poptona: Indica se a

bactéria é capaz de utilizar cisteína ou peptona como fonte de nitrogênio.
Realizar a repicagem da bactéria com ajuda da alça e colocar uma tira de
papel tratada com solução de acetato de chumbo dentro do tubo de forma
que fique presa à tampa de algodão.

RESULTADO:

O enxofre, liberado pela bactéria capaz de utilizar a cisteína ou peptona

como fonte nitrogênio, reage com o acetato de chumbo do papel de filtro
provocando o seu escurecimento na extremidade perto do meio.
 Meio de Arginina: Indica se a bactéria é capaz de utilizar a
arginina, para se desenvolver na ausência de oxigênio
(anaerobiose). Para realização do teste, é necessário
inocular o meio com a bactéria com a ajuda de uma alça de
repicagem, bastando apenas fazer uma perfuração do meio
pela alça. Para cada bactéria serão inoculados dois tubos,
onde em um deles se adicionará uma camada de 0,5 cm de
óleo mineral esterilizado em autoclave, para que seja
satisfeita a condições de anaerobiose, sendo
posteriormente levado a BOD.

RESULTADO:

Haverá a quebra da arginina liberando NH³ nos testes

positivos, reduzindo o pH e fazendo com que o indicador
mude da coloração vermelha para rosa. Esta alteração deve
ser verificada nos dois tubos onde a mesma bactéria foi
inoculada. Se o meio contendo óleo mineral não sofreu
alteração de coloração, o resultado será negativo e a
bactéria não consegue crescer sob anaerobiose

Meio de gelatina: indica se a bactéria é capaz de digerir a gelatina.

Inoculação feita através da alça de repicagem, realizando apenas um
furo no meio. Posteriormente, transferir os tubos para a BOD.

RESULTADO:

Os resultados são observados com 3, 7 e 21 dias após a inoculação.

As bactérias capazes de hidrolisar gelatina apresentarão o meio
liquefeito após este período em refrigeração.
Meio de esculina: Indica se a bactéria é capaz de hidrolisar esculina.
Para realizar o teste, inocular o meio com a bactéria, bastando fazer
uma perfuração do meio com a alça de repicagem e posteriormente
levar a BOD por 3 a 4 dias.

RESULTADO:

As bactérias capazes de realizar a hidrólise da esculina, mudarão a

coloração do meio de marrom escuro fluorescente para preto.

Crescimento de bactérias em diferentes níveis

de NaCl: Visa determinar qual a máxima
concentração de NaCl que a bactéria consegue
se desenvolver. Para realizar o teste, inocular
os meios com 2%, 5% e 10% de NaCl e
posteriormente levar a BOD.

RESULTADO:

Os tubos em que se observar uma coloração

meio turva e leitosa, significa que a bactéria foi
capaz de se desenvolver, diferente dos tubos
que se mantiverem em coloração neutra.
OXIDASE E DETERMINAÇÃO DE BIOVARES – PRÁTICA 8

A espécie Ralstonia solanacearum são bactérias que possuem uma ampla gama
de hospedeiros, podendo ser caracterizados em raças e biovares, sendo descritas 5 raças e 5
biovares. As definições de raças são baseadas na sua especificidade por hospedeiros, enquanto
os biovares são divididos de acordo com sua utilização de substratos (açúcares).

MÉTODOS

Coletar uma porção da colônia já crescida em meio de cultura, com o auxilio de

uma alça de repicagem e depositar nos tubos contendo os substratos (Maltose, Lactose,
Celobiose, Manitol, Sorbitos e Dulcitol). Os tubos inoculados foram colocados em BOD e
realizado observações com 3, 7 e 14 dias.
RESULTADO:

Isolado
Biovar
Carboidrato testado
I II III IV V -
Maltose - + + - + -
Lactose - + + - + -
Celobiose - + + - + -
Manitol - - + + + -
Sorbitol - - + + - -
Dulcitol - - + + - -

ANTIBIOGRAMA, SENSIBILIDADE E ANTIBIÓTICOS – PRÁTICA 9

Antibióticos são compostos que contituem-se em ferramentas úteis para trabalhos de

pesquisa, como a idealização de meios seletivos para fitobactérias, marcadores biológicos para
trabalhos com genética bacteriana, estudos sobre sobrevivência de fitobactérias, patologia de
sementes e dentre outros. Um dos possíveis ensaios realizados com antibióticos é o uso de
antibiogramas, que são ensaios conduzidos “in vitro” para testar a sensibilidade das bactérias
aos antibióticos.

MÉTODOS

Para esse ensaio é utilizado discos de papel-filtro já estéreis, contendo quantidades

conhecidas de cada antibiótico. Nesse caso foram utilizados os antibióticos Tetraciclina,
Cefalexina, Cloranfenicol e Ampicilina.

Placas de Petri contendo meio de cultura com ágar a 2% ou meio MB1 com 7g de ágar
foi vertido e deixado solidificar. Em seguida, a bactéria cultivada (Xanthomonas axonopodis pv.
phaseoli e Ralstonia solanacearum) em meio líquido em fase exponencial de crescimento é
depositada como uma sobrecamada nas placas de Petri. Após esse procedimento, os discos
contendo os antibióticos são separadamente colocados sobre a cultura.

RESULTADOS

Figura 1: Crescimento de Ralstonia solanacearum em cima dos

discos de Cefalexina e Tetracilina e inibição quando em
contato com Cloranfenicol e Ampicilina.
 Figura 2: Crescimento de Xanthomonas axonopodis pv. phseoli
em cima dos discos de Cefalexina e Tetracilina e inibição
quando em contato com Cloranfenicol e Ampicilina.

DETECÇÃO DE BACTÉRIAS PROMOTORAS DE BACTERIOCINAS – PRÁTICA 10

Bacteriocinas são substâncias produzidas por bactérias capazes de, em baixas

concentrações, inibir o crescimento e multiplicação de outras bactérias. São geralmente de
natureza protéica grandes e particuladas(Stanier et al., 1986), que podem ser produzidas por
patovares como em Pseudomonas syringae (Klement et al., 1990).

MATERIAL E MÉTODOS

1. Foi repicado, com ajuda da alça de repicagem, uma gota da cultura (Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli) já crescida em meio líquido. As placas foram incubadas em
BOD por 48h;
2. As placas foram invertidas e adicionado, com uma pipeta estéril, 1 ml de clorofórmio
na superfície interna da tampa;
3. Após a eliminação de resíduos do clorofórmio, foi adicionado 5ml de meio semi-sólido
fundente junto com 1ml da cultura indicadora já crescida em meio líquido, de forma a
realizar uma sobre-camada homogênia em toda a placa;
4. Incubar as placas em BOD e observar os resultados após 2 a 5 dias.

RESULTADOS

Figura 1: Adição de clorofórmio

Figura 2: Presença de halos provocados pela inibição da
bactéria X. axonopodis pv. phaseoli
 DETECÇÃO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS EM SEMENTES – PRÁTICA 11

Bactérias fitopatogênicas, principalmente aquelas relacionadas à doenças de parte aérea em

plantas, podem estar associadas às sementes de suas hospedeiras, causando danos desde o
início da cultura e sendo um dos meios mais importantes de disseminação de bactérias em
longas distâncias.

Em alguns casos, a fitobactéria está associada às sementes sem que causar sintomas externos
visualmente reconhecíveis. Nesses casos, para identificação e caracterização da bactéria, é
necessário a realização de testes com os extratos das sementes.

MATERIAL E MÉTODOS

Realiza-se a extração do lote de sementes e adiciona-se uma solução para obter o extrato do
lote. O sobrenadante é diluído em tubos (10-1, 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5) e posteriormente vertidos
em placas de Petri, com meio EPGA, identificadas com cada diluição em série.

Figura 1: Sementes diluídas para obtenção do extrato Figura 2: Placas identificadas contendo meio EPGA,
e realização do teste. após as diluições serem vertidas