Cultura de tecidos vegetais e

aplicações na produção vegetal

Prof. Dr. Marcos Siqueira

2022
 OBJETIVOS DA AULA

• Apresentar os principais conceitos associados à cultura de tecidos, de células

vegetais e micropropagação - suas finalidades, estratégias e limitações.

• Compreender o que são explantes, meios de cultura, condições de cultivo,

organogênese e embriogênese somática.

TÓPICOS DA AULA
• Introdução à cultura de células vegetais.
• Micropropagação - finalidades, estratégias e limitações.
• Organogênese e embriogênese.
CONTEXTUALIZAÇÃO
 CULTURA VEGETAL DE CÉLULAS VEGETAIS

• Consiste no cultivo de células, tecidos ou órgãos em

recipientes semi-herméticos, sob condições de assepsia, com
controle de luminosidade, temperatura, umidade e pH.

Meios de cultura

• Líquidos ou sólidos, contendo nutrientes (sais inorgânicos,

açúcares, vitaminas, hormônios de crescimento e aminoácidos)
necessários ao desenvolvimento do fragmento da planta que
está sendo cultivada.
 O QUE É A MICROPROPAGAÇÃO ?

Propagação de plantas em larga escala a partir de pequenos

tecidos (explantes) cultivados in vitro.

Objetivos:

• Grande número de mudas de uma planta

selecionada, em um curto período de tempo e em
espaço físico reduzido (empresas e bancos de
germoplasma).
• Limpeza clonal - plantas livres de patógenos a
partir da cultura de tecidos meristemáticos.
 EXPLANTES

Fragmentos retirados de plantas e cultivados em um meio nutritivo,

em condições assépticas, visando a obtenção de plantas
completas.

Segmento de folha Raíz Meristema / Ápice caulinar

O cultivo de explantes se baseia na

expressão da totipotência celular

Micropropagação de Ginko biloba a partir de discos foliares

 TOTIPOTENCIALIDADE

Habilidade de uma célula (mesmo diferenciada) dar origem a um

organismo inteiro.
 DIFERENCIAÇÃO CELULAR

Processo progressivo de
perda das características
citológicas e fisiológicas
das células embrionárias e
aquisição de
características de células
adultas e diferenciadas.

Quanto mais especializada a célula, mais difícil de expressar

totipotência.
 EXPLANTES COM MENOR NÍVEL DE DIFERENCIAÇÃO

Meristema
Gemas axilares

Embriões imaturos

Pendão imaturo
 MERISTEMA E ÁPICE CAULINAR

São os explantes mais utilizados para iniciar a micropropagação.

Porquê?
1) Alta capacidade morfogenética (indiferenciado).

2) Células geneticamente estáveis, permitindo regenerar plantas

idênticas a planta mãe.

3) Livre de vírus.
 PORQUÊ O MERISTEMA É LIVRE DE VÍRUS ?

Algumas hipóteses:
• Falta de conexão vascular.

• Multiplicação do vírus é menor que o

crescimento apical da planta.

• Existe um mecanismo de inativação viral nas

células meristemáticas em cultura.
 QUAIS OS ESTÁGIOS DA MICROPROPAGAÇÃO ?

- Estágio I:

Seleção de explantes, desinfestação e cultura em

meio nutritivo sob condições assépticas.

Viroses Explante
Filamento fungos

Meio de Assepsia autoclaves

cultura
 QUAIS OS ESTÁGIOS DA MICROPROPAGAÇÃO ?

- Estágio II:
Multiplicação dos propágulos mediante sucessivas
subculturas em meio próprio para multiplicação.
 ESTÁGIOS DA MICROPROPAGAÇÃO

- Estágio III:

Transferência das partes aéreas produzidas para

meios de enraizamento e subsequente transplante
para um substrato ou solo (aclimatização).
 Retirada do meristema

4000 var.

Tubérculos selecionados
Meio de cultura
Multiplicação
em telado

Fase de
Multiplicação
crescimento
“in vitro”
 ETAPAS DA MICROPROPAGAÇÃO

Introdução Indução
do explante de brotações

Alongamento, desenvolvimento
e enraizamento das plantas in vitro

Aclimatização
das plantas
 QUAIS OS FATORES QUE AFETAM A
MICROPROPAGAÇÃO ?

Material vegetal:
- Genótipo.
- Tipo de explante (seleção e coleta).
- Condições fisiológicas da planta e do explante (idade, época
do ano, nutrição, condições de crescimento, outros).

- Condições fitossanitárias da planta doadora e do explante.

 QUAIS OS FATORES QUE AFETAM A
MICROPROPAGAÇÃO ?
Meio de cultura:
- Constituição química (macro e micronutrientes inorgânicos,
vitaminas, fontes de N orgânico, açúcares, agente solidificante
e reguladores de crescimento – auxinas e citocininas).
- Consistência (líquido, sólido ou
semi-sólido).

Condições ambientais:
- Luz (intensidade, qualidade, fotoperíodo).
- Temperatura.
- Trocas gasosas.

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 QUAIS OS FATORES QUE AFETAM A
MICROPROPAGAÇÃO ?

Limpeza dos explantes

• Etanol
• Hipoclorito de sódio e de cálcio
• PPM
• NaDCC
• HgCl2
• Peróxido de hidrogênio
• Ácidos e Bases
• Mertiolate
• Fungicidas
• Antibióticos

Um dos principais fatores limitantes na micropropagação!!!

 LIMPEZA DE VÍRUS

Doenças de Plantas: fungos, bactérias, vírus transmitidas na propagação

vegetativa.
White (1934): vírus estão distribuídos de maneira desuniforme em raiz de
fumo e se observou:
(i) redução da concentração em direção à extremidade
(ii) ápice radicular livre de vírus
Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentração de vírus
na parte aérea.
Morel & Martin (1952): plantas de dália livres de vírus.
LIMPEZA DE VÍRUS

Principais culturas: Cana-de-açúcar, Mandioca,

Morango, Batata, Plantas ornamentais.
LIMPEZA DE VÍRUS
 LIMPEZA DE VÍRUS

• Termoterapia + cultura do ápice meristemático

ex: vírus do mosaico da cana-de açúcar

cultura de meristema: explante 0,3 mm
cultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) +
termoterapia (45oC / 8 horas)

•Quimioterapia + cultura do ápice meristemático

ex: incorporação de antivirais no meio de cultura

• Indexação - avaliação da presença do vírus, ex:

ensaios biológicos
microscopia eletrônica
serologia (ELISA)
hibridação com ácido nucleico
 SISTEMAS DE MICROPROPAGAÇÃO
1) Multiplicação por meio da proliferação de gemas axilares.

• Segmentos de parte aérea são formados - estes são divididos

em partes menores, ou cada parte é isolada das demais para
formação de novos explantes.

R. Árvore, Viçosa-MG, v.28, n.4, p.493- 498, 2004

Auxina BAP a 2 mgL-1 = maior taxa de multiplicação de gemas (3,5 brotos/explante).

 SISTEMAS DE MICROPROPAGAÇÃO
2) Multiplicação mediante indução de gemas adventícias

• Originadas em locais diferentes daqueles onde se formariam no

curso normal de desenvolvimento da planta.
• Ocorre de forma direta e indireta - organogênese.

Pesq. agropec. bras., Brasília, v.43, n.10, p.1331-1337, out. 2008

Adição da auxina BAP ao meio de cultura promoveu melhor resposta

organogênica.
 SISTEMAS DE MICROPROPAGAÇÃO - ORGANOGÊNESE

• Formação de gemas (e órgãos) diretamente a partir de tecidos

(folhas, pecíolos, segmentos de raízes, etc.) ou indiretamente
(calos).
• 2 fases: (i) a desdiferenciação, acontece logo após o isolamento
do tecido, que promove uma rápida divisão celular, formando um
aglomerado de células indiferenciadas; (ii) e a rediferenciação,
quando o primórdio do órgão origina meristemas.
 ORGANOGÊNESE NA PRÁTICA

Chapada Diamantina - BA

• Estabelecer um protocolo de regeneração via organogênese direta.

A OD refere-se ao surgimento direto de gemas a partir de tecidos (câmbio vascular, base do pecíolo em
dicotiledôneas, base de folhas e escamas em bulbos de monocotiledôneas, segmentos de raízes, entre
outros) que apresentam potencial morfogenético na planta in vivo, mas que em geral não se expressam. A
fase da OI ocorre quando o processo de regeneração de gemas é precedido pela formação de calo.

• A > taxa de brotação foi obtida com o explante de caule com 20 e 40 dias de
idade em meio com a auxina ANA.
• Na fase de enraizamento, a presença de carvão ativado interferiu
positivamente no comprimento da parte aérea e sistema radicular.
• As plantas foram aclimatizadas com 100% de sobrevivência.
 SISTEMAS DE MICROPROPAGAÇÃO - EMBRIOGÊNESE
SOMÁTICA
3) Multiplicação via embriogênese somática.

• Produção de embriões a partir de tecidos

somáticos que a) regeneram uma
b) planta inteira,
geralmente com constituição genética idêntica à da
planta-mãe.
• É considerada um pré-requisito na produção de
plantas transgênicas, uma vez que é uma rota
morfogenética eficiente
c) e há pouca chance de
anormalidades genéticas nas plantas regeneradas.

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SIST. DE MICROPROPAGAÇÃO - EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA

a) b)

Explante inicial – tecido foliar; Processo de calogênese

c)

Desenvolvimento de embriões somáticos Desenvolvimento de plântulas de café.

 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA NA PRÁTICA
• Espécie de alto valor agregado, falta de
informação de cultivo in vitro - deficiência nos
programas de melhoramento, crescimento
lento, etc.
• Tanto os explantes provenientes de
inflorescências como de folhas imaturas
podem ser utilizados como fontes de
explantes para a embriogênese somática
direta em meio MS.
• Modelo embriogênese somática alta/
dependente do tipo e estado fisiológico do
explante.
 ORNAMENTAIS

Violeta Lili Rose Spathiphyllum Antúrio Limonium

Orquídea Begônia

FRUTÍFERAS E OLERÍCOLAS

Maracujá Café
Abacaxi Banana

2009 FLORESTAIS

• 125 lab.
• 20 mil empregos
• 300 milhões de mudas/ano
 CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

As células haploides possuem em seu

6 FASES núcleo celular somente um cromossomo de
cada tipo. Uma das células haploides são
os gametas (espermatozoides e ovócitos).
Os espermatozoides, assim como os
óvulos, também possuem 23 tipos
1. ASSEPSIA diferentes de cromossomos. Por isso, nos
humanos, os gametas são 23n.
2. EXPLANTES
(anteras (micrósporo), pólen, óvulos, ovários vegetais)

3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO (pré-tratamento)

4. INDUÇÃO DE ORGANOGÊNESE OU ÊMBRIOGÊNESE

- direta (sem passar pela fase de calos)

- indireta (com passagem pela fase de calos)

Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo.

 CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro

- alongamento das plantas

- enraizamento
- aclimatização

6. OBTENÇÃO DE PLANTAS HAPLÓIDES OU DUPLO-HAPLÓIDES

- duplicação cromossômica natural ou com utilização de drogas

antimitóticas.

- drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )

 CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

Flor Anteras Micrósporo

germinando

Aclimatização Embriogênese
Multiplicação
somática
 CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

Calos
Flor - Ovário Óvulos

Multiplicação Organogênese
Obtenção de plantas
somática
 CULTURA DE PROTOPLASTOS

- Células vegetais isoladas e sem parede celular

(removidas por enzimas)

Enzimas: Hemicelulases - digerem hemicelulose

Celulases - digerem celulose
Pectinases - digerem pectinas

- sensíveis a modificação na osmolaridade do meio e a luz

- meio mais concentrado: protoplastos perdem água para o meio

- meio mais diluído: protoplastos absorvem água do meio

(meios geralmente entre 0,4 e 0,8M)

 CULTURA DE PROTOPLASTOS

- Usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio.

- A ausência de parede celular possibilita a fusão de protoplastos.

- Isolamento, purificação e cultivo de protoplastos utilizando meios

contendo a mesma osmolaridade.

MEIOS

• Meios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X)

• Solução de enzimas 0,4M

• Solução de Polietileno glicol a 50%

• Agarose tipoVII (baixo ponto de fusão) - 1,2%

 CULTURA DE PROTOPLASTOS

MEIO CPW (para protoplastos vegetais (Gilmour et al., 1989)).

Composição mg/L

1. CaCl2*2H2O 1.480
2. MgSO4*7H2O 246
3. KNO3 101
4. KH2PO4 27,2
5. KI 0,16

- acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M)

- ajustar o pH 6,0
- esterilizar

SOLUÇÕES ESTOQUE CONC. VOLUME USADO / L

A. CaCl2*2H2O 50x 20 mL/L

B. OUTROS SAIS 100x 10 mL/L

 CULTURA DE PROTOPLASTOS

Material esterilizado

- placas de Petri

- peneiras com poros de 50 m

- tubos 8 ml com tampa

- pipetas Pasteur
 CULTURA DE PROTOPLASTOS

FASES

1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspensão celular, pétalas, anteras)

2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitação 50 rpm, escuro, 27o

C, durante 8 a 16 h.

3. PURIFICAÇÃO - peneiramento, centrifugação, retirada da solução,

lavagem com CPW

4. FUSÃO - adição de PEG ou eletrofusão

5. RETIRADA DO PEG

6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSÃO - meio MS 0,4M(2X) e

agarose
 CULTURA DE PROTOPLASTOS

Explante Protoplastos Viabilidade de

protoplastos

Fusão múltipla Fusão

Fusão
 CULTURA DE PROTOPLASTOS

Primeira divisão Microcalo

Microcolônia

Embrião
Embrião somático Calos e embriões
germinando
somáticos
 CULTURA DE PROTOPLASTOS

Desenvolvimento das plantas

e enraizamento

Placa com embriões Plantas

germinando in vitro

Aclimatização ao meio ambiente

 VANTAGENS DA MICROPROPAGAÇÃO

• Multiplicação rápida de plantas de propagação vegetativa ou

de difícil propagação.
• Pode ser realizada a qualquer época do ano.
• Possibilidade de multiplicar grandes quantidades de plantas
em uma área reduzida a baixos custos.
• Auxilia no melhoramento vegetal - manutenção e
multiplicação de plantas híbridas (mantém a combinação
genética) e conservação recursos genéticos.
 DESVANTAGENS DA MICROPROPAGAÇÃO

• Possiblidade de se produzirem clones infectados, se a

planta-mãe estiver infectada.

• Custos elevados.

• Mão de obra especializada.

 NOTAS FINAIS

• A micropropagação permite o crescimento e a multiplicação

de células, tecidos, órgãos ou partes de órgãos de uma
planta, em meio artificial, sob condições de luminosidade,
temperatura e fotoperíodo controlados.

• Identificamos algumas vantagens e desvantagens da

micropropagação em relação aos métodos convencionais.

• Verificamos que existe um esquema padrão para sistemas

de micropropagação composto por 3 estágios.

• Observamos 2 importantes métodos de propagação: a

organogênese e a embriogênese somática – exemplos.
 SUGESTÃO DE LEITURA

Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.14, n.1, p.110-121, 2012.

 Muito obrigado!
Prof. Dr. Marcos Siqueira
marcos.siqueira@uemg.br