Aula

Biofábricas e Criopreservação

Nadia Botini
Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas
Doutoranda em Genética e Melhoramento de Plantas
botininadia@gmail.com
Biofábrica
 Biofábrica

Modalidade mais difundida

para a produção, em escala
Micropropagação comercial, de diversa
espécies.

Condições
controladas

Por meio dessa

modalidade de cultivo,
Temperatura Umidade Luminosidade surgiu o conceito de
Biofábrica.
 DEFINIÇÃO DE BIOFÁBRICA

 Lei de Sementes e Mudas Nº. 10.711 de 5 de agosto de 2003:

Unidade física (laboratório de cultura de tecidos, casas de vegetação, telados

ou viveiros) onde são obtidas as mudas micropropagadas.

 IN 24/2005 : Unidade de propagação in vitro:

Local destinado a propagação vegetativa visando à produção de mudas a

partir da cultura de tecidos.
 DEFINIÇÃO DE BIOFÁBRICA

 Laboratório de cultura de tecidos que produz maciçamente in vitro

determinada planta e cujo processo de produção esteja bem definido

(Gerald, 2011).

 Empresas especializadas na multiplicação de plantas in vitro em larga

escala com fins lucrativos (Carvalho, 2009).

 Processo bem controlado: produz não apenas grande quantidade de

plantas, mas também mudas de qualidade uniforme.

 Biofábrica é uma fábrica que utiliza a biotecnologia para a produção

de mudas sadias em escala industrial.

 Biofábrica

Micropropagação

Técnicas da
Biotecnologia Produção em
Vegetal larga escala

Embriogênese
Somática
1974 • 150 espécies vegetais micropropagadas
• Murashige

1978 • Esse número dobrou

• 1º: Orquídeas (60% laboratórios)

1984 •
•
•
2º Folhagens e outras flores (33%)
3º Samambaias
4º Espécies lenhosas

1990
Aproximadamente 1000 espécies já eram
propagadas por cultura de tecidos em todo o
mundo
 Em 1998, as principais espécies micropropagadas eram:

Orquídeas Spathiphyllum Antúrio Violeta Samambaia

africana

 Atualmente:

- Ornamentais

- Fruteiras

- Grandes culturas

- Florestais (teca, eucalipto e pinus)

 Regiões importantes

 Europa Ocidental e Estados Unidos – tecnologia mais avançada.

 Ásia (China e Taiwan) – possivelmente já tenha a maior quantidade de

plantas biofabricadas do mundo.

 Tendência atual – transferência das biofábricas de países desenvolvidos

(EUA e Europa Ocidental) para países em desenvolvimento (China, México,

Índia, Brasil, países da África e Europa Oriental).
 Biofábricas no Brasil

Percentual de distribuição das biofábricas cadastradas no RENASEM, no

Registro Geral de Requerentes do MAPA, como unidades de propagação in
vitro .
 Mudas Micropropagadas por Região

Percentual de distribuição do número de mudas micropropagadas

produzidas por região, de acordo com os mapas de produção e
comercialização cadastrados do RENASEM.
Mudas Micropropagadas por Grupos de Espécies

Percentual de distribuição dos grupos de espécies

micropropagadas de acordo com os mapas de produção e
comercialização cadastrados no RENASEM.
 Fruteiras Micropropagadas no Brasil

Percentual de distribuição das fruteiras micropropagadas de acordo com

os mapas de produção e comercialização cadastrados no RENASEM.
 Ornamentais Micropropagadas no Brasil

Percentual de distribuição das plantas ornamentais micropropagadas de

acordo com os mapas de produção e comercialização cadastrados no
RENASEM.
 Grandes Culturas Micropropagadas no Brasil

Percentual de distribuição das grandes culturas micropropagadas de

acordo com os mapas de produção e comercialização cadastrados no
RENASEM.
 Florestais Micropropagadas no Brasil

Percentual de distribuição das florestais micropropagadas de acordo com

os mapas de cadastro do RENASEM.
 Biofábricas no Brasil

 Produção anual (2011): 35 milhões de mudas.

 Entraves ao avanço:

 Falta de protocolos bem definidos;

 Falta de parcerias entre instituições de pesquisa e setor privado;

 Dificuldades na transferência da tecnologia entre estes setores;

 Alto custo da muda – principal causa:

Método convencional de propagação;

Alta demanda por mão-de-obra qualificada.

 A Gestão de uma Biofábrica

Planejamento Responsável, gerente - Deve ser extremamente cuidadoso,

operacional e prevendo todas as tarefas a serem executadas por cada
orçamento membro da equipe e dimensionando a utilização de todos os
equipamentos, para a produção esperada;

Aquisição de - Jornada de Trabalho: duração máxima de 8h diárias e 44h

semanais.
recursos - Perfil essencial: atenção concentrada, habilidades manuais,
materiais e tranquilidade e capacidade de execução de tarefas
humanos repetitivas.
- Empresas com mais de 100 empregados está obrigada a
preencher pelo menos 2% de seus cargos com portadores
de deficiência.
 A Gestão de uma Biofábrica
Cabe ao gerente liderar e orientar sua
Execução operacional, controle
equipe,
e análise de resultados cobrando eficiência e resultados.

1. Manutenção de
Preventiva ou Corretiva.
equipamentos

Normas para a produção, comercialização e utilização de

2. Ministério da Agricultura,
mudas. Todo e qualquer produtor de mudas deve estar
Pecuária e Abastecimento
escrito no RENASEN - Registro Nacional de Sementes e
(MAPA)
mudas.

3. Controle de produto químicos Nitrato de Amônio e Nitrato de Potássio utilizados na

pelo Exército fabricação explosivos.

4. Controle de produtos Aplicação menos comum em Biofábricas.

químicos pela Polícia Federal
 A Gestão de uma Biofábrica

Cabe ao treinamento a cargo de colegas

Designação de tarefas e mais experientes, sob supervisão do
treinamento gerente que avalia o desenvolvimento do
novo funcionário

ajuste de protocolos - responsabilidade do

Pesquisa e desenvolvimento gerente, que estabelece os objetivos da
pesquisa de acordo com os interesses da
empresa

Relações comerciais e vendas: devem ser realizadas por profissional

preparado (gerente).
 Antes de tudo: Planejamento

 Definir estratégias e possíveis alternativas caso o negócio passe por períodos de

instabilidade;

 Definir culturas "chave";

 Fazer o levantamento do melhor local, considerando fatores como:

 Clima (em função das culturas produzidas);

 Disponibilidade de insumos;

 Facilidade de escoamento da produção;

 Disponibilidade de viveiros para aclimatização;

 Distância até o cliente;

 Mão-de-obra especializada.
Etapas da micropropagação em biofábricas

Estágio 0 - Preparação
Estágio I - Estabelecimento
Estágio II - Multiplicação
Estágio III - Enraizamento
Estágio IV - Aclimatização
 Etapas da micropropagação em biofábricas

Seleção de matrizes

Seleção da planta matriz: preparo do material para extração do explante

 Etapas da micropropagação em biofábricas

Estágio 0 - Preparação

Preparação e desinfestação do explante

Seleção do material de introdução contido nos vasos germinados na

UTI (38,5 C / 06 horas luz /15 dias).

Tendo uma uniformidade na morfologia, inicia-se o material.

Descarte dos vasos com diagnose Positiva de doenças.

Sala de preparo de meio
Autoclavagem do meio de cultura
 Etapas da micropropagação em biofábricas

Estágio I - Estabelecimento

Desinfecção do explante

➢Contaminação da cultura “in vitro” é o principal problema na micropropagação.

➢Explantes retirados de gemas de cana de açúcar em rápido crescimento são facilmente

desinfectados.

➢São utilizados varias soluções desinfectantes para controle da contaminação.

Isolamento de gemas
Inoculação no meio de cultura
Sala de cultivo
 Estágio II - Multiplicação

➢Produção de uma alto numero de indivíduos

➢Multiplicação Geométrica

➢Proliferação de gemas axilares com

consistência genética.

➢Eliminação de plântulas anormais.

Multiplicação dos explantes
 Autoclavagem do meio de cultura

Re-inoculação das micro-estacas

Explantes em fase de multiplicação
Incubação em sala de cultivo
 Seleção dos lotes a serem aclimatizados
Estágio II (classificação)
Brotações prontas para serem aclimatizadas
Retirada da planta
 Estágio III - Enraizamento
Umidade relativa (UR)
alta, intensidade de luz
Enraizamento (1 a 2 g L-1 AIB ex vitro) baixa e temperatura
média alta.
Enraizamento em substrato apropriado
 Estágio IV - Aclimatização

➢ A eficiência deste estágio é vital para o sucesso da

propagação comercial.

➢As plântulas neste estágio devem permanecer sob alta

umidade relativa e baixa intensidade luminosa.

➢A duração deste estágio é de 12 dias.

Vista geral do telado de aclimatização
Viveiro e telados de aclimatização
Muda pronta para ser plantada no campo
Plantio comercial
Custo de Produção das Mudas Micropropagadas

• Mão-de-obra: 50-60%

• Energia: 10-15%

• Meio de cultura: 10-15%

• Manutenção predial e equipamentos: 5-10%

• Outros: 10-15%
 Mão-de-obra

“Norma”: número de explantes resultantes da manipulação de um

laboratorista a cada hora trabalhada.

Espécie N° de explantes / hora

Banana 175
Batata 325
Teca 250
Eucalipto 200
Mirtilo 300
Phalaenopsis 175
Cana-de-açúcar 250
A “Norma” depende da:

• Aptidão

• Capacidade do laboratorista (não adianta ter boa vontade e

não ter jeito para repicar).

A “Norma” é influenciada pela:
•Qualidade do material;

Assistência: tempo gasto com uma pessoa que presta assistência ao repicador,
aumentando o foco do repicador na repicagem - só funciona para acima de 10 repicadores;

“Pegada-pronta”: posição certa de colocar o explante no frasco.

Organização treinada: posição dos materiais na câmara;

Estratégia de gestão das pessoas: sistema de capacitação e reciclagens, sistema de

bônus, times especialistas, feedback de performance, “top 10” publicado, “top 10” restrito,
“coelhos de produção”, etc.

Equipamentos de suporte: manual ou automatizado.

 Consumo de Energia Elétrica

Influenciado pelo sistema adotado (lavagem manual ou automatizada, luzes,

etc).

Quando possível empilhar os frascos na sala de cultivo, cultivar no escuro, uso

de luz natural ou uso de LED.
 Meio de Cultura

Sempre relacionar:
MEIO DE CULTURA
X
DENSIDADE DE EXPLANTES
X
TEMPO DE CULTIVO

Quando possível utilizar componentes alternativos no meio de cultura e fazer o

enriquecimento temporal no meio de cultura.
Dosagem semi-automática do meio de cultura:
Esterilização:

FÍSICA

QUÍMICA
 Sistema de Biorreatores

Considerando os problemas enfrentados na produção de mudas in vitro pelo processo

tradicional, ou seja, aquele em que se utiliza meio gelificado, frascos pequenos e selados
e custo elevado.

A pesquisa tem procurado alternativas que possam eliminar ou minimizar esses

problemas, além de resultar em uma redução considerável no custo final da muda
micropropagada.
 Biorreatores

 São equipamentos para cultivo em meio líquido sob regime de

imersão permanente ou temporária de células, gemas, embriões

ou de qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado em

cultura de tecidos de plantas.

 De forma resumida: equipamentos específicos que visam a

aceleração do crescimento e multiplicação de organismos vivos,

reduzindo os custos de produção.

 Modelos de Biorreatores

Imersão permanente

É mais utilizado para o cultivo de células vegetais.

Principal desvantagem:
Hiperhidratação dos tecidos, causando sérios distúrbios
fisiológicos que irão afetar o crescimento e o
desenvolvimento do material em cultivo
 Modelos de Biorreatores
Imersão temporária

Apresentam um sistema de vasos O material vegetal fica temporariamente

comunicantes como tecnologia de imerso no meio de cultura. Os frascos
imersão. podem ser dispostos lado a lado ou
sobrepostos.
 Modelos de Biorreatores
RITA (Recipiente Automático de Imersão Temporária)

É bastante utilizado na embriogênese somática.

Modelos de Biorreatores

RITA
(Recipiente Automático de Imersão
Temporária)
 Modelos de Biorreatores

BIT (Biorreator de Imersão Temporária)

Utilizado para a maioria das espécies produzidas em larga escala.
Mudas de cana-de-açúcar em BIT
Mudas de cana-de-açúcar em BIT e em viveiro
Mudas de abacaxi (cv. Vitória) em BIT, no viveiro e no campo
Mudas de banana (Tetraploide Pacovan Ken) produzidas em BIT e no viveiro
BIT com 50 L de volume com cerca de 8 mil brotações de bananeira (cultivar Willians)

SBW do Brasil, Holambra - SP

 Vantagens dos Biorreatores

Redução na demanda de mão-de-obra;

Redução no uso de aparelhos (fluxo laminar, ferramentas para operação, entre outros) e
frascos;

Redução do espaço necessário para a biofabricação de plantas;

Redução nos gastos com eletricidade para o cultivo das plantas;

Redução na asfixia;

Redução da hiperhidricidade;

Redução da ocorrência de variações somaclonais;

 Vantagens dos Biorreatores

Uso de meio de cultura líquido (redução total ou parcial de agentes gelificantes);

Melhora na nutrição - maior contato do meio de cultura com os explantes;

Promoção do controle de agitação, aeração, temperatura, oxigênio dissolvido, pH;

Aumento significativo na taxa de multiplicação do material em cultivo;

Aumento da qualidade das plantas produzidas;

Facilidade de aclimatização dos materiais cultivados.

 Desvantagens dos Biorreatores

Grande perda de plantas, caso haja contaminação;

Alto custo inicial dos equipamentos;

Controle inicial rigoroso (fase de adaptação);

Indexação de bactérias latentes em alguns casos;

Hiperhidricidade (facilmente controlado pelo tempo de imersão dos materiais);

Problemas de esterilização (facilmente resolvido por esterilização química e preparo do

meio de cultura líquido em fogão industrial).
Uso intensivo de mão-de-obra Cana-de-açúcar
Biorreator X Método Convencional
 Biofábricas no Brasil

Recife - Pernambuco Cana-de-açúcar

 Atua no mercado de produção de mudas clonadas de alto valor genético,
destacando-se por ser a única empresa cearense habilitada em
produção de mudas clonadas, com a capacidade de produzir mudas
frutíferas clonadas de:
Abacaxizeiro (Ananas spp.),
Bananeira (Musa spp.),
Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum),
Flores tropicais; em quantidade e com qualidade certificada.
A empresa conta com excelentes condições de infraestrutura
laboratorial, produção e de PD&I.
Eusébio - Ceará
 Desde a propagação clonal até o estabelecimento e a gestão de
florestas, a PROTECA combina know-how e tecnologia de ponta em
cada aspecto do cultivo da teca. Nossos negócios incluem:

•Produção e comercialização de mudas clonais de teca de alta qualidade

Cuiabá - Mato Grosso
•Licenciamento de tecnologia de propagação clonal e material genético

•Investimento e gestão de plantações de teca de alta performance no

Estado de Mato Grosso, Brasil

•Pesquisa e desenvolvimento
 A SBW do Brasil é líder de mercado, a nível mundial, em
técnicas de cultura de tecido vegetal e é especializada em
oferecer serviços de micropropagação para as mais renomadas
empresas de melhoramento vegetal do mundo, garantindo
produção em larga escala, com alta qualidade de plântulas,
Holambra – São Paulo livres de doenças e pelo menor custo possível para os
produtores, através do uso das mais avançadas técnicas
disponíveis.
 A Multiplanta é uma empresa nacional, de capital privado, que utiliza técnicas
modernas de biotecnologia vegetal (clonagem asséptica de plantas em
laboratório e aclimatação controlada em estufas) para ofertar ao mercado
produtos diferenciados, certificados, de alta qualidade genética e fitossanitária,
Andradas - Minas Gerais que proporcionam ganhos em diferentes formas, tais como: produtividade,
lucratividade, facilidade de transporte, redução no uso de agro-químicos.
www.biocellclonagem.com.br
- Frutíferas (bananeiras)
- Florestais (eucalipto)
- Ornamentais (bromélias)
Araras - SP

www.agrolabplants.com

- Orquídeas Phalaenopsis

- Cana-de-açúcar
 A Pró Mudas, instalada em Lavras, sul de Minas Gerais, é uma empresa
fundada por pesquisadores da área da biotecnologia vegetal
especializados na propagação clonal in vitro. Isso diferencia a empresa
quanto ao acesso constante a novas tecnologias florestais e a novos
genótipos, cada vez mais produtivos e/ou resistentes à estresses
bióticos e abióticos. Consequentemente, diferencia nossas mudas, que
são clones provenientes de matrizes com genótipos superiores e livres
www.promudas.com.br de pragas e de doenças.
www.bioteca.com.br
- Café arábica
 Sergipe

Micropropagação de
frutíferas
Icapui-CE
 Biofábricas Internacionais

Instituto de Investigaciones de la Cana de Azúcar - INICA

Modelo cubano de BIT

Flórida - EUA

www.altriaplants.com

- Orquídeas Phalaenopsis

- Bromélias
Sleidinge - Bélgica

www.derooseplants.com

- Orquídeas

- Bromélias

- Spathiphyllum (Lírio da Paz)

 Problemas enfrentados pelas Biofábricas

Contaminação

Devido ao grande volume de frascos, um surto de contaminação pode causar grande

perda em pouco tempo e, quando são utilizados biorreatores, a contaminação de um
frasco pode representar grande número de plantas perdidas.
 Problemas enfrentados pelas Biofábricas

Envelhecimento das plantas

- Normalmente ocorre na fase de multiplicação das culturas com ciclo curto de

repicagem (ex.: cana-de-açúcar).

- É causado pela falta de planejamento da produção.

- Aumenta a possibilidade de contaminação e diminui bastante o rendimento das

novas repicagens.
 Problemas enfrentados pelas Biofábricas

Desordens fisiológicas

Na fase de multiplicação pode ocorrer má formação das plantas, causada pelas próprias
condições do ambiente (alta umidade, poucas trocas gasosas, altas concentrações de
fitorreguladores, entre outros). A vitrificação (ou hiperhidricidade), é a anomalia de maior
ocorrência.
Desordens fisiológicas em cana-de-açúcar:

Estrangulamento internódio

Entrenó curto e formação de joelho

Ramificação em “Y” no colmo
 Problemas enfrentados pelas Biofábricas

Variações de plantas

Geralmente está ligado ao genótipo e à falhas na metodologia do processo. Principais causas:

BAP (6-Benzylaminopurina) em altas concentrações, trocas gasosas deficientes e grande
número de repicagens. Esses fatores também são responsáveis pela incidência de
hiperhidricidade e formação de massas verdes que aumentarão os índices de ocorrência de
variações somaclonais.
 O segredo do sucesso
Dedicação total dos sócios administradores;

Elaboração e rigoroso acompanhamento de planos anuais de trabalho;

Valorização dos recursos humanos;

Permanente foco nos projetos comerciais;

Atenção no relacionamento com os clientes, buscando sua fidelização;

Adequação constante à legislação vigente e em especial às normas oficiais de produção de sementes e mudas;

Estimular a criatividade e implementar ações inovadoras;

Agir preventivamente e ter atenção aos detalhes.

É difícil avaliar a relevância ou contribuição desses fatores se analisados isoladamente, mas de forma
conjunta certamente eles serão úteis para a consolidação de uma empresa no mercado.
Perspectivas para uso em Biofábricas

Estabelecimento de protocolos responsivos via embriogênese somática para diversas

culturas de interesse comercial!
Visão Atual do Cenário Nacional das Biofábricas de Plantas

Área em construção por falta de:

Gestores;
Técnicos e laboratoristas;
Reagentes;
Utensílios laboratoriais;
Logística;
Organização de classe (ABB Plantas);
Políticas públicas (para o favorecimento de biofábricas).
Criopreservação
 Criopreservação

Aumento da população Mundial;

Expansão das fronteiras agrícolas e urbanas; Consequência: Erosão genética
 Criopreservação
Alternativa pra evitar a erosão genética e a Conservação de
Bancos de germoplasma!
Base física que reúne o conjunto de materiais hereditários de uma espécie, representando
a variabilidade genética da mesma.

Material genético de uma espécie disponível para melhoramento, podendo incluir

espécies e gêneros relacionados.

A conservação de germoplasma de raças locais, cultivares domésticas e

parentes silvestres de espécies agronômicas tem sido uma das mais importantes áreas
de pesquisa na Botânica desde então.

Seu principal objetivo é o desenvolvimento de técnicas para a conservação a longo

prazo da variabilidade genética de espécies vegetais com a máxima integridade
genética e biológica possível.
 Criopreservação
CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA
Refere-se a conservação dos
ecossistemas e habitats naturais, a
manutenção e recuperação de
populações de espécies em sua áreas
vizinhas e em caso de espécies
cultivadas ou domesticadas.

1. Insitu Habitat natural

É a manutenção 2. Exsitu Fora do habitat natural Invivo
das espécies fora
de seu habitat
natural. - coleção a campo
Espécies propagadas vegetativamente
Bancos a campo
Requer amplo espaço físico
Alto custo de manutenção
Alto risco com doenças e pragas
Invitro
-banco de sementes
Espécies propagadas por sementes: Armazenamento de
sementes
Espécies com sementes recalcitrantes (não
ortodoxas)
(Theobroma cacao, Araucaria angustifolia, etc)
 Criopreservação
CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA

Ex situ: é a manutenção das espécies fora de seu habitat natural.

–in vivo
-coleção a campo
Espécies propagadas vegetativamente:
Bancos a campo
Requer amplo espaço físico Alto custo de manutenção
Alto risco com doenças e pragas

-banco de sementes
Espécies propagadas por sementes:
Armazenamento de sementes
Espécies com sementes recalcitrantes (não ortodoxas)
(Theobroma cacao, Araucaria angustifolia, etc)
 Criopreservação
CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA

– in vitro
- Coleções mantidas em ambiente estéril, livre de contaminantes.

Cultura in vitro de germoplasma de banana Banco in vitro de germoplasma de batata

 Criopreservação

Criopreservação (Nitrogênio Líquido, -196°C): é definida como a

conservação de material biológico em nitrogênio líquido a -196ºC, ou em
sua fase de vapor a -150°C.
 Criopreservação
Vantagens:
Conservação a longo prazo
Conservação de espécies de propagação vegetativa
Conservação de sementes recalcitrantes
Temperaturas ultra-baixa
Redução da divisão celular e processos metabólicos

Materiais vegetais:

 Gemas vegetativas
 Meristemas
 Sementes
 Embriões zigóticos e somáticos
 Protoplastos
 Calos e suspensões celulares
 Linhagens celulares genéticamente modificada e produtoras de
metabólitos secundários
 Criopreservação

•Os processos metabólicos (respiração e atividade enzimática) são inativados (Benson et al.,
1998)

•Estados físicos da água abaixo de –130ºC:

•cristalino
•vítreo

Viscosidade elevada e difusão insignificante

Baixa energia cinética molecular e as reações metabólicas são muito lentas ou paralisadas.

 Portanto: Viabilidade longa de armazenamento, com alta estabilidade genética.

 Criopreservação

Congelar sem formar cristais de gelo

Grande Desafio • Pode ocasionar na ruptura de membranas celulares;
do criobiologista.
• Água intracelular expande-se ao congelar e forma
cristais de gelo.
 Criopreservação
A injúria mecânica advém de dois fenômenos:

-expansão da água ao congelar-se

- conformação dos cristais de gelo

Ruptura da membrana plasmática celular:

-perda da semipermeabilidade e da compartimentalização celular – morte!

Alta quantidade de água nos tecidos x desidratação

- importante solvente, meio de transporte, resfriador (através da evaporação), e um constituinte essencial e

estabilizador da estrutura das macromoléculas e organelas.
 Criopreservação
• A capacidade de sobrevivência à criopreservação depende:

Tolerância à desidratação
Tolerância à temperatura do nitrogênio líquido (-196 C)

O congelamento pode ser realizado por dois métodos:

Lento: Material vegetal é congelado de Rápido: Material vegetal é colocado

forma gradual diretamente no nitrogênio líquido
Redução da temperatura de 0,1 a 3 ºC/min A velocidade de diminuição da
até – 40 ºC e vai para nitrogênio líquido temperatura é da ordem de 1000
ºC/min.
Criopreservação
Etapa do congelamento lento (metodologia clássica)
 Criopreservação
CONGELAMENTO LENTO
Célula atinge estado de super-resfriamento
•cristais de gelo extracelular entre protoplasto e parede

Ocorre desidratação induzida por congelamento:

•diferença de pressão de vapor da água – maior dentro da célula que nos espaços intracelulares congelados

 Dependente de freezer com temperatura escalonada

Criopreservação
Etapa do congelamento rápido (metodologia atual)
 Criopreservação
CONGELAMENTO RÁPIDO

Baseado na vitrificação ou formação do estado vítreo

Processo pelo qual a água sofre transição da fase líquida para estado
sólido-amorfo (vítreo)

Sólido - solução supersaturada e de alta viscosidade.

Criopreservação TÉCNICAS DE CRIOPROTEÇÃO

Vitrificação

Leva a um estado de quiescência metabólica:

restringe a difusão de substratos e produtos

dentro da célula e
previne as reações químicas dependentes de
difusão.

Vantagens:

-Limitação da cristalização de sais e proteínas;

-Tamponamento de pH;
-Prevenção de colapso celular.
Vitrificação do citoplasma é obtida pela desidratação dos explantes
para um teor de umidade em que não exista água livre para a
cristalização antes de colocar em Nitrogênio líquido.

A solução celular é concentrada e pode ser vitrificada

Não há tempo para a formação de cristais de gelo nos espaços

intracelulares:
- passagem rápida pela zona de temperatura onde ocorre o
aparecimento letal de cristais de gelo

DESIDRATAÇÃO

Evaporação da água - sílica-gel ou fluxo laminar

Tratamento com soluções de vitrificação

1)crioprotetores químicos - (DMSO, etileno glicol, glicerol)

2)Açúcares (sacarose, trealose e glicose)

-espécies de clima temperado – congelamento x acúmulo de açúcares
-espécies tolerantes à desidratação – maior teor de açúcares acumulados
Criopreservação TÉCNICAS DE CRIOPROTEÇÃO

Encapsulamento-desidratação
DESIDRATAÇÃO

1)Crioprotetores químicos

-Função:
-modificar a permeabilidade da membrana
-proteção de macromoléculas
-inativação de radicais livres

-Desvantagens:
-citotoxicidade
-estresse osmótico
-variação somaclonal

2) Açúcares
- Função:

redutor osmótico - estabilização de membranas celulares durante o congelamento

- remoção de água através de gradiente osmótico

 Agente vitrificante - vitrificação das membranas

-substituição de água removida mantendo as estruturas hidrofílicas hidratadas - vítreo

- Vantagens:
- ausência de citotoxicidade
- eficiência na estabilização de membranas celulares durante o congelamento
Criopreservação TÉCNICAS DE CRIOPROTEÇÃO

Encapsulamento-desidratação

VANTAGENS

Facilidade de manuseio de explantes de dimensões

reduzidas;
Simplificação do meio crioprotetor;
Não há necessidade de congelamento escalonado;
Encapsulamento protege o explante.
 Criopreservação
O êxito de um bom protocolo de criopreservação, está baseado em
seis pontos críticos (Withers, 1985).

1 - Pré-congelamento:
Manipular as condições de cultivo in vitro para aumentar a tolerância ao congelamento, adicionando-
se ao meio de cultura, compostos com atividade osmorreguladora (sacarose).

2.Crioproteção:
Permitir às células suportar o congelamento com uso de crioprotetores (DMSO, etileno glicol,
sacarose, etc) .

3. Resfriamento:
Congelamento: diminuição da temperatura preparando o explante para o congelamento (lento ou
rápido).

4. Conservação:
Nitrogênio líquido (–196 ºC na fase líquida ou –150 ºC na fase de vapor).

5. Descongelamento:
Fase de recuperação do material estocado.

6. Crescimento de recuperação:
Avaliar a viabilidade do material após o período de criopreservação.
 Criopreservação
FATORES QUE AFETAM A SOBREVIVÊNCIA NA
CRIOPRESERVAÇÃO

1. Tamanho e estágio de desenvolvimento do tecido

Diferentes níveis de tolerância à desidratação e ao congelamento

Estruturas menores são preferidas:

Uniformidade e rapidez na desidratação e congelamento

Tecido meristemático é mais apropriado

2.Desidratação
Remoção de água para evitar injúria causada pela formação de gelo;
Quando a água é removida das células os solutos tornam-se mais
concentrados.

3.Congelamento
Congelamento lento:
Desidratação excessiva ou formação de gelo na célula.
Lise da membrana plasmática.
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FATORES QUE AFETAM A SOBREVIVÊNCIA NA
CRIOPRESERVAÇÃO

4.Descongelamento
Evitar a formação de cristais de gelo

a)congelamento da água liberada pela de-vitrificação - o da temperatura libera água na forma líquida que pode
congelar antes de atingir a temperatura ambiente

b) cristais de gelo pequenos

Melhores resultados:

imersão em água ou meio de cultura líquido a 35-40oC;

descongelamento rápido (1 min) para evitar a formação de micro-cristais ou re-cristalização de gelo.

5.Regeneração
Retomada do crescimento – maior número de células vivas e regeneração de plantas

Crescimento na fase de recuperação é o indicador de sucesso mais confiável na criopreservação.

Problemas: decorrentes da complexidade técnica e biológica do processo de congelamento e

descongelamento.
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Espécies criopreservadas

Santos, 2000. Rev. Bras. Fisiol. Veg. 12:70-84.

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Criopreservação
Fig. 4 . Aspectos morfológicos das protocormas dos híbridos C.
harrisoniana × C. walkeriana , C. tigrina e C. guttata 90 dias após a
criopreservação das sementes. (A) Controle 1 - Germinação direta de
sementes in vitro ; (B) Controle 2 - Imersão de sementes em PVS2 por
1 h em banho de gelo; (C) imersão direta no LN; (D) imersão em PVS2
por 30 min em banho de gelo antes da imersão em LN; e (E) imersão
em PVS2 por 1 h em banho de gelo antes da imersão em LN. Barras =
1,0 cm.

Fig. 5 . Protocormos de C. guttata 90 dias após a criopreservação

das sementes; tratamento com imersão direta em sementes no LN.
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Fig. 6 . Aspectos gerais de plantas do híbrido C. harrisoniana × C. walkeriana , C. tigrina e C. guttata de sementes
criopreservadas após um ano de cultura in vitro . (A) germinação direta (controle 1); (B) 1 h em PVS2 sem LN (controle
2); (C) 30 min em PVS2 + LN; (D) 1 h em PVS2 + LN e (E) imersão direta em LN sem PVS2. Barras = 4,0 cm.
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Fig. 9 . Aspectos gerais de plantas do híbrido C. harrisoniana × C. walkeriana , C. tigrina e C.

guttata de sementes criopreservadas após seis meses de aclimatação em casa de
vegetação. (A) germinação direta (controle 1); (B) 1 h em PVS2 sem LN (controle 2); (C) 30 min
em PVS2 + LN; (D) 1 h em PVS2 + LN e (E) imersão direta em LN sem PVS2. Barras = 4,0 cm.
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Criopreservação de germoplasma de abacaxi pela técnica de vitrificação em gotas

Figura 1. Sequência metodológica para criopreservação de germoplasma de abacaxi pelo método de vitrificação em gotas.
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Figura 2. Regeneração e desenvolvimento de ápices caulinares oriundos de tratamento controle e criopreservados nos
diferentes tempos de exposição ao PVS2. Placa controle com plantas oriundas do pré-cultivo (PC) e dos três tempos de
exposição ao PVS2 do abacaxi ‘Imperial’ (a); plantas regeneradas dos três tempos de imersão em PVS2 após congelamento
(NL) do abacaxi ‘Imperial’ aos 150 dias após imersão em NL (b); Controles do A. comosus var. microstachys BGA-471 (c) e 45
dias após descongelamento (d); Controles do A. comosus var. bracteatus BGA-128 (e) e 45 dias após imersão em NL (f); Plantas
da cultivar ‘Imperial’ (g) e ‘Pérola’ (h) oriundas da criopreservação em meio de multiplicação.
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