Conteúdo • I

Manual de
BIOQUÍMICA
com Correlações Clínicas
II • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
 Conteúdo • III

Manual de
BIOQUÍMICA
com Correlações Clínicas
Tradução da 7.ª edição americana
Coordenado por

Thomas M. Devlin
Professor Emérito – Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
College of Medicine – Drexel University

Tradução para o Português

Coordenação da Tradução e Revisão Geral

Profa. Dra. Yara M. Michelacci

Professora Associada Livre Docente
Disciplina de Biologia Molecular – Departamento de Bioquímica
Escola Paulista de Medicina – Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP

Trabalho de Tradução
Profa. Dra. Yara M. Michelacci
Professora Associada Livre Docente – Disciplina de Biologia Molecular – Departamento de Bioquímica
Escola Paulista de Medicina – Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP

Dra. Thaís Sodré de Lima Machado

Doutora em Medicina Veterinária
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade de São Paulo – USP

Biomédico Giovani Bravin Peres

Graduado em Ciências Biomédicas
Pós-graduando do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular
Disciplina de Biologia Molecular – Departamento de Bioquímica
Escola Paulista de Medicina – Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP
IV • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas

Manual de bioquímica com correlações clínicas

Título original: Textbook of Biochemistry with clinical correlations
Copyright © 2011
John Wiley & Sons, inc. All rights reserved

Tradução publicada sob licença de John Wiley & Sons, inc.

DIreitos reservados para a língua portuguesa pela

Editora Edgard Blücher Ltda. 2011.

IMAGEM DA CAPA
Modelo de um complexo parcial de elongação da telomerase. A
enzima telomerase é uma ribonucleoproteína transcriptase reversa, res
ponsável pela manutenção do comprimento e da integridade das extre
midades de cromossomos lineares, chamadas telômeros, presentes em
eucariotos. A figura mostra a estrutura parcial do complexo de elongação
da telomerase na extremidade de um cromossomo (esferas azuis). A su
bunidade catalítica da telomerase (cilindros vermelhos) usa um molde
de RNA integrado (esferas verdes) para adicionar múltiplas repetições
idênticas de desoxirribonucleotídeos à extremidade 3! da fita de DNA de
um cromossomo. Defeitos na telomerase e no telômero são considerados
fatores que contribuem para a senescência replicativa e envelhecimento
celular programado. Ativação da telomerase é associada com a prolife
ração descontrolada de células observada em cerca de 85% dos cânceres
humanos. Uma discussão sobre telomerase é apresentada no capítulo 4.
Gillis, A.J., Schuller, A.P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium cas
taneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature 455:633, 2008. Figura
generosamente fornecida pelo Dr. Emmanuel Skordalakes, The Wistar Ins
titute, Philadelphia, PA 19104, EUA.

FICHA CATALOGRÁFICA

Rua Pedroso Alvarenga, 1245, 4º andar Manual de bioquímica com correlações clínincas / coordenado
04531-012 - São Paulo - SP - Brasil por Thomaz M. Devlin; traduzido por Yara M. Michelacci. -- São
Tel.: 55 11 3078-5366 Paulo: Blucher, 2011.
editora@blucher.com.br
www.blucher.com.br Título original: Textbook of biochemistry; with clinical
correlations
7 ed. norte-americana.
Segundo Novo Acordo Ortográfico, conforme 5. ed. Bibliografia
do Vocabulário Ortográfico da Língua Portuguesa, ISBN 978-85-212-1581-3
Academia Brasileira de Letras, março de 2009.
1. Bioquímica 2. Bioquímica - Clínica I. Devlin, Thomaz M.
É proibida a reprodução total ou parcial por quaisquer meios sem
autorização escrita da editora. 11-01463 CDD-612.015

Todos os direitos reservados pela Editora Edgard Blücher Ltda. Índices para catálogo sistemático:
1. Bioquímica: Ciências médicas 612.015
 Conteúdo • V

À MINHA FAMÍLIA
Steve, Bonnie, Mark, Cathy, Kate, Matt, Ryan e Laura, que
foram fontes constantes de orgulho e amor

À MARJORIE
que tem estado comigo ao longo das sete edições, por seu
constante encorajamento, suporte e amor.
VI • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
 Conteúdo • VII

Conteúdo resumido

Parte I Parte IV
ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
1 Estrutura da Célula Eucariótica, 1 14 Bioenergética, Mitocôndria e Metabolismo Oxida
tivo, 561
2 DNA e RNA: Composição e Estrutura, 29
15 Metabolismo de Carboidratos I: Principais Vias
3 Proteínas I: Composição e Estrutura, 79
Metabólicas e Seu Controle, 611
16 Metabolismo de Carboidratos II: Vias Especiais e
Parte II
Glicoconjugados, 667
TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
17 Metabolismo de Lipídeos I: Síntese, Armaze
4 Replicação, Recombinação e Reparo do DNA,
namento e Utilização de Ácidos Graxos e Triacil
145
gliceróis, 693
5 RNA: Transcrição e Processamento do RNA, 187
18 Metabolismo de Lipídeos II: Vias do Metabolismo
6 Síntese de Proteínas: Tradução e Modificações de Lipídeos Especiais, 727
Pós-Tradução, 215
19 Metabolismo de Aminoácidos, 771
7 DNA Recombinante e Biotecnologia, 265
20 Metabolismo de Purina e Pirimidina Nucleo
8 Regulação da Expressão Gênica, 317 tídeos, 831
21 Inter-relações Metabólicas, 865
Parte III
22 Bioquímica dos Hormônios, 907
FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
9 Proteínas II: Relações Estrutura–função em
Parte V
Famílias de Proteínas, 347
PROCESSOS FISIOLÓGICOS
10 Enzimas: Classificação, Cinética e Controle, 391
23 Biologia Molecular da Célula, 961
11 Citocromos P450 e Óxido Nítrico Sintases, 441
24 Ciclo Celular, Morte Celular Programada e
12 Membranas Biológicas: Estrutura, Receptores e Câncer, 1027
Transporte de Solutos, 475
25 Digestão e Absorção de Constituintes Nutricio
13 Fundamentos da Transdução de Sinal, 525 nais Básicos, 1053
26 Vitaminas e Minerais: Necessidades e Função,
1089
27 Macronutrientes: Efeitos Metabólicos e Implica
ções para a Saúde, 1129

Apêndice, 1155
Glossário, 1167
Índice Remissivo, 1199
VIII • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas

Conteúdo
Parte I
ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS
1 Estrutura da Célula Eucariótica, 1
Thomas M. Devlin
CONCEITOS CHAVES
1.1 CÉLULAS SÃO A BASE DOS ORGANISMOS
VIVOS, 2
Classificação das Células Vivas, 2
1.2 O AMBIENTE DAS CÉLULAS: ÁGUA E SOLU
TOS, 3
Pontes de Hidrogênio Formam-se entre Moléculas
de Água, 3
Água tem Propriedades Singulares como Solven
te, 4
Eletrólitos: Dissociação de Moléculas na Água, 5
Água É um Eletrólito Fraco, 6
1.3 pH, ÁCIDOS FRACOS E SUAS BASES CONJU
TADAS, 6
A Equação de Henderson–Hasselbalch Define a
Relação entre pH e Concentrações de Ácido e Base
Conjugados, 8
O Tamponamento É Importante para Controlar o
pH, 10
1.4 EUCARIOTOS: CÉLULAS E TECIDOS DE MA
MÍFEROS, 11
Células de Mamíferos, 12
Composição Química de Células de Mamíferos, 13
1.5 FUNÇÕES DE ORGANELAS SUBCELULARES
E SISTEMAS DE MEMBRANAS EM CÉLULAS
EUCARIÓTICAS, 14
Membrana Plasmática É a Fronteira Que Delimita
uma Célula, 15
Núcleo é o Local de Síntese de DNA e de RNA, 16
O Retículo Endoplasmático Tem um Papel na Sín
tese Proteica e em Muitas Vias de Síntese, 17
Aparelho de Golgi Está Envolvido na Secreção de
Proteínas, 17
Mitocôndria Atende à Maior Parte da Necessidade
Celular de ATP, 18
Lisossomos São Necessários para Digestão Intrace
lular, 18
Os Peroxissomos Têm um Importante Papel no
Metabolismo de Lipídeos, 21
Citoesqueleto Organiza o Conteúdo Intracelular, 22
Citosol Contém Componentes Celulares Solúveis, 22
1.6 INTEGRAÇÃO E CONTROLE DAS FUNÇÕES
CELULARES, 23
Conteúdo • IX
2 DNA e RNA: Composição e Estrutura, 29
Stephen A. Woski e Francis J. Schmidt
CONCEITOS CHAVES
2.1 ÁCIDOS NUCLEICOS E INFORMAÇÃO BIOLÓ
GICA, 30
Dogma Central da Biologia Molecular, 30
DNA Pode Transformar Células, 30
Capacidade de Informação do DNA É Enorme, 30
2.2 COMPONENTES ESTRUTURAIS DOS ÁCI
DOS NUCLEICOS: NUCLEOBASES, NUCLEO
SÍDEOS E NUCLEOTÍDEOS, 31
Propriedades Físicas de Nucleosídeos e Nucleotí
deos, 32
Propriedades Estruturais de Nucleosídeos e Nucle
otídeos, 33
2.3 ESTRUTURA DO DNA, 34
Estrutura Polinucleotídica e Propriedades, 34
DNA de Dupla-Hélice, 36
Estruturas Não-Canônicas do DNA, 45
2.4 ESTRUTURA DE ORDEM SUPERIOR DO DNA,
51
O DNA Genômico Pode Ser Linear ou Circular, 51
O DNA É Super-Helicoidal, 53
Topoisomerases, 55
Empacotamento do DNA Procariótico, 57
Organização da Cromatina Eucariótica, 58
2.5 SEQUÊNCIA E FUNÇÃO DO DNA, 61
Endonucleases de Restrição e Palíndromes, 61
A Maior Parte do DNA Procariótico Codifica Prote
ínas Específicas, 63
Apenas uma Pequena Percentagem do DNA Euca
riótico Consiste de Genes Funcionais, 63
Sequências Repetidas, 64
2.6 ESTRUTURA DO RNA, 65
RNA é um Polímero de Ribonucleosídeos 5!-Mono
fosfato, 65
Estrutura Secundária do RNA Envolve Pareamento
Intramolecular de Bases, 66
Moléculas de RNA Têm Estruturas Terciárias, 67
2.7 TIPOS DE RNA, 67
RNA Transportador Tem Duas Funções: Ativar Ami
noácidos e Reconhecer Códons no mRNA, 67
RNA Ribossômico É Parte do Aparelho de Síntese
Proteica, 68
RNAs Mensageiros Carregam a Informação para a
Estrutura Primária de Proteínas, 70
X • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas

Mitocôndrias Contêm Espécies Peculiares de RNA, Forças Não-Covalentes Levam ao Dobramento

71 da Proteína e Contribuem para a Estabilidade da
RNA em Partículas Ribonucleoproteicas, 71 Proteína, 120
RNA Catalítico: Ribozimas, 71 Desnaturação Leva à Perda de Estrutura Nativa, 124
RNAs Podem Ligar Outras Moléculas, 73
3 Proteínas I: Composição
RNAs Controlam
Richard M. Schultz e Estrutura,
a Tradução, 73 79 ASPECTOS DINÂMICOS DA ESTRUTURA DE
PROTEÍNAS, 125
3.9 CARACTERIZAÇÃO, PURIFICAÇÃO E DETER
MINAÇÃO DA ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
DE PROTEÍNAS, 126
Separação de Proteínas com Base em Carga, 126
Separação de Proteínas com Base em Massa Mole
CONCEITOS CHAVES
cular ou Tamanho, 127
3.1 PAPÉIS FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS NO HO Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença
MEM, 80 de um Detergente, 128
Técnicas de HPLC Separam Aminoácidos, Peptídeos
3.2 COMPOSIÇÃO EM AMINOÁCIDOS DE PROTE e Proteínas, 129
ÍNAS, 81 Cromatografia de Afinidade, 129
Aminoácidos Comuns, 81 Abordagem Geral para Purificação de Proteínas, 129
Aminoácidos São Polimerizados em Peptídeos e As Técnicas de Proteômica Tentam Determinar
Proteínas, 84 Todas as Proteínas Expressas em uma Célula ou um
Tecido em um Único Ensaio, 130
3.3 PROPRIEDADES DE CARGAS E QUÍMICAS DE Determinação da Composição em Aminoácidos de
AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS, 86 uma Proteína, 131
Grupos Ionizáveis de Aminoácidos e Proteínas São Técnicas de Difração de Raios-X São Usadas para
Críticos para a Função Biológica, 86 Determinar a Estrutura Tridimensional de Proteí
Relação Geral entre as Propriedades de Carga de nas, 132
Aminoácidos e Proteínas e pH, 89 Métodos de Espectroscopia para Avaliar Estrutura
Aminoácidos e Proteínas Podem Ser Separados e Função de Proteínas, 134
com Base em Valores de pI, 90 Ressonância Magnética Nuclear, 137
Cadeias Laterais de Aminoácidos Têm Proprieda
des Polares e Apolares, 91
Aminoácidos Sofrem Várias Reações Químicas, 91
Parte II
TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
3.4 ESTRUTURA PRIMÁRIA DE PROTEÍNAS, 93
3.5 PROTEÍNAS,
NÍVEIS SUPERIORES
94 DE ORGANIZAÇÃO DE 4 Replicação, Recombinação e Reparo do DNA, 145

Estrutura Secundária, 95 Howard J. Edenberg

Estrutura Terciária, 98
Estrutura Quaternária, 100
CONCEITOS CHAVES
Proteínas Não-Estruturadas, 101
Bioinformática
Complexos de Proteínas,
RelacionaRedes
Estrutura
e Interactomas,
e Função de102 4.1 CARACTERÍSTICAS COMUNS DA REPLICA
CÃO, RECOMBINACÃO E REPARO, 146
Proteínas como Produtos Gênicos, 103
mente
Estruturas
Formadas
de Dobras
a Partir
Homólogas
de Sequências
São Frequente-
de Amino 4.2 REPLICAÇÃO DO DNA: MECANISMOS FUNDA
MENTAIS, 146
ácidos Não Homólogas, 105 A Base, 146
Química da Elongação da Cadeia, 147
3.6 PROTEÍNAS ESTRUTURADAS NÃO-GLOBU DNA Polimerases, 148
LARES, 106 Separando as Fitas Parentais: a Forquilha de Repli
Colágeno, 107 cação, 150
Elastina É uma Proteína Fibrosa com Ligações Cru Resolvendo o Problema da Polaridade: Síntese de
zadas Geradas por Alisina, 109 DNA Semidescontínua, 151
Queratina e Tropomiosina, 110 Movimento da Forquilha de Replicação, 151
Lipoproteínas Plasmáticas São Complexos de Lipí Coreografia em Três Dimensões: o Replissomo, 154
deos com Proteínas, 110 Término da Replicação em Genomas Circulares, 155
Glicoproteínas Contêm Carboidratos Ligados Cova Término da Replicação em Genomas Lineares:
lentemente, 115 Telômeros, 155
Epigenética, 156
3.7 DOBRAMENTO (FOLDING) DE PROTEÍNAS
DE ESTRUTURAS ALEATÓRIAS PARA ES- 3.8
4.3 REPLICAÇÃO DO DNA: ENZIMAS E REGULA
TRUTURAS SINGULARES: ESTABILIDADE DA ÇÃO, 156
PROTEÍNA, 116 Enzimas Procarióticas da Replicação, 156
O Problema de Dobramento de Proteínas, 116 Enzimas Eucarióticas da Replicação, 158
Proteínas Chaperones Ajudam o Processo de Do Ciclo Celular, 162
bramento de Proteínas, 120 Replicação de Genomas de RNA, 163
 Conteúdo • XI

4.4 RECOMBINAÇÃO,
Recombinação 164 164
Homóloga, 5.8 NUCLEASES E TURNOVER DO RNA, 207
O Turnover do RNA Mensageiro Citoplasmático É
Proteínas Chaves da Recombinação em E. coli, 167 Acoplado à Tradução, 207
Recombinação Não-Homóloga, 168
Pseudogenes, 168 6 Síntese de Proteínas: Tradução e Modificações
4.5 DANOS AO DNA E MUTAÇÕES, 169 Pós-Tradução, 215
Mutações, 170
Dohn Glitz
4.6 REPARO DO DNA, 172
Reparo por Excisão, 172 CONCEITOS CHAVES
Desmetilação Direta, 178
Fotorreativação,
Lesões Podem Bloquear
178 a Replicação, 178 6.1 INTRODUÇÃO, 216

Reparo
Regulação
de Quebra
do Reparo
na do
Dupla-Fita,180
DNA: o Regulon SOS, 181
6.2 CONCEITOS DO APARELHO DE TRADUÇÃO,
216
RNA Mensageiro Transmite a Informação Codifica
da no DNA, 216
5 RNA: Transcrição e Processamento do RNA, 187 RNA Transportador É uma Molécula Tradutora
Bilíngue, 217
Frank J. Schmidt e David R. Setzer O Código Genético Usa um Alfabeto de Quatro
Letras de Nucleotídeos, 217
Interações Códon-Anticódon Permitem Ler um
CONCEITOS CHAVES mRNA, 218
5.1 INTRODUÇÃO, 188 A Aminoacilação do RNA Transportador Ativa os
Aminoácidos para a Síntese Proteica, 222
5.2 MECANISMOS DE TRANSCRIÇÃO, 188 Ribossomos São Máquinas para a Síntese Protei
O Processo Inicial de Síntese de RNA É a Transcri ca, 224
ção, 188
A Informação na Sequência do DNA Sinaliza a 6.3 BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS, 225
Síntese de RNA, 188 A Tradução É Direcional e Colinear com o mRNA,
RNA Polimerase Catalisa o Processo de Transcrição, 225
A Iniciação da Síntese Proteica É um Processo Com
189
plexo, 226
Etapas da Transcrição em Procariotos, 190
A Elongação É a Formação Passo a Passo das Liga
5.3 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS, 193 ções Peptídicas, 228
Natureza da Cromatina Ativa, 194 Terminação da Síntese do Polipeptídeo Requer um
Ativação da Transcrição Opera por Recrutamento Códon de Parada (ou Stop Codon), 233
da RNA Polimerase, 194 Tradução Tem um Custo Energético Considerável,
Transcrição pela RNA Polimerase II, 195 234
Transcrição pela RNA Polimerase I, 196 Síntese de Proteínas em Mitocôndrias Difere Ligei
Transcrição pela RNA Polimerase III, 196 ramente, 234
As Bases Enzimáticas Comuns para a Ação das RNA Muitos Antibióticos e Toxinas Têm Como Alvo a
Polimerases, 198 Biossíntese de Proteínas, 235

5.4 RNA TransportadorDO

PROCESSAMENTO
O RNA, 199 por Clivagem,
É Modificado
Adição e Modificação de Bases, 199
O Processamento do RNA Ribossômico Libera Vá
rios RNAs de um Precursor Mais Longo, 200
O Processamento do RNA Mensageiro Garante a
Sequência Codificadora Correta, 200
RNA Polimerase II Recruta Enzimas de Processa
mento durante a Transcrição em Eucariotos, 201
Mutações
no Homem,em204
Sinais de Splicing Causam Doenças
Splicing Alternativo do Pré-mRNA Pode Levar
à Síntese de Múltiplas Isoformas da Proteína a
partir de uma Única Sequência Codificadora no
DNA, 204
5.5 EXPORTAÇÃO DO RNA E CONTROLE DE
QUALIDADE, 205
5.6 RNA DE INTERFERÊNCIA, 206
5.7 REPARO DE DNA ACOPLADO A TRANSCRI-
ÇÃO, 207
6.4 MATURAÇÃO DE PROTEÍNAS: DOBRAMEN
TO, MODIFICAÇÃO, SECREÇÃO E DIRECIONA
MENTO, 236
Chaperones Ajudam no Dobramento da Proteína,
237
Proteínas para Exportação Seguem a Via Secretó
ria, 237
Glicosilação de Proteínas Ocorre no Retículo Endo
plasmático e no Complexo de Golgi, 238
6.5 DIRECIONAMENTO PARA MEMBRANA E OR
GANELAS, 241
Seleção de Proteínas na Via Secretória, 241
Importação de Proteínas por Mitocôndrias É Com
plexa, 242
Sinais de Direcionamento Encaminham Proteínas
para Organelas Específicas, 245
6.6 MAIS MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO, 246
Proteólise Parcial Libera Insulina e Ativa Zimogê
nios, 246
Aminoácidos Podem Ser Modificados após Incor
poração a Proteínas, 246
XII • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas

Biossíntese
ções Pós-Tradução,
de Colágeno
247 Requer Muitas Modifica- DNA COMPLEMENTAR E BIBLIOTECAS DE
DNA COMPLEMENTAR, 285
6.7 REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO, 250 mRNA como Molde para Síntese de DNA Usando
Transcriptase Reversa, 286
6.8 253
DEGRADAÇÃO
Proteólise E TURNOVER
Dependente DE PROTEÍNAS,
de ATP Ocorre em Proteas
7.7 BACTERIÓFAGOS, COSMÍDEOS E VETORES
DE CLONAGEM EM LEVEDURA E ANÁLISE
somos, 254 DE LONGOS SEGMENTOS DE DNA, 288
Digestão Intracelular de Algumas Proteínas Ocorre Bacteriófagos como Vetores de Clonagem, 288
em Lisossomos, 255 Clonando Fragmentos de DNA em Cosmídeos e
Outros Sistemas Proteolíticos, 255 Vetores Cromossomos Artificiais, 289
Subclonagem Permite Definição de Grandes Seg
mentos de DNA, 290
7 DNA Recombinante e Biotecnologia, 265 Caminhar pelo Cromossomo (Chromosome
Walking) Define Arranjo de Genes em Segmentos
Gerald Soslau Longos do DNA, 290

7.1 CONCEITOS CHAVES

INTRODUÇÃO, 266 7.8 VETORES DE EXPRESSÃO E PROTEÍNAS DE
FUSÃO, 291
Genes Estrangeiros Expressos em Bactérias Permi
tem Síntese de suas Proteínas Codificadas, 292
7.2 REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA, 267 Vetores de Expressão em Células Eucarióticas, 293
PCRAninhado, 268
7.3 ENDONUCLEASE
PCR Quantitativo emDE RESTRIÇÃO,
Tempo Real, 269 MAPAS DE 7.9 MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA, 295
Papel de Regiões Flanqueadoras no DNA Avaliado
por Mutações de Deleção e Inserção, 295
RESTRIÇÃO E SEQUENCIAMENTO DE DNA, Mutagênese Sítio-Dirigida de um Único Nucleotí
269 deo, 296
Endonucleases de Restrição Hidrolisam Seletiva
mente DNA,
Mapas de Restrição
269 Permitem a Preparação Roti 7.10 APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RE
COMBINANTE, 299
neira de Segmentos Definidos de DNA, 270 Ácidos Nucleicos Complementares (Antisense) em
Método de Clivagem Enzimática Interrompida: Pesquisa e Terapêutica, 299
Procedimento de Sanger, 270 Técnicas Moleculares Aplicadas ao Animal Inteiro, 300
Sequenciamento por Corante-Terminador, 272 DNA Recombinante em Agricultura Tem Impacto
Comercial, 305
7.4 DNA RECOMBINANTE, CLONAGEM E SELE
ÇÃO
DNAsDE CLONES, 274
de Diferentes Fontes Podem Ser Ligados 7.11 GENÔMICA, PROTEÔMICA E ANÁLISE POR
MICROARRAY, 306
para Formar uma Nova Espécie de DNA: DNA Re Análise de Microarray, 306
combinante, 274 Genoma Humano, 308
Vetores de DNA Recombinante São Produzidos
Clonagem
por Clonagem,
Direcional:
274 DNA Inserido em DNA Vetor
8 Regulação da Expressão Gênica, 317
em uma Direção Específica, 275
Bactérias Transformadas com DNA Recombinante Daniel L. Weeks e John E. Donelson
e a Necessidade de um Processo de Seleção, 275
Moléculas de DNA Recombinante em uma Biblio CONCEITOS CHAVES
teca Gênica, 276
Carregam
Seleção dePlasmídeos
Resistência
α-Complementação
Bactéria
a Antibiótico,
Transformada
para
Recombinantes,
Selecionar
276 por
Bactérias
Perda
278 de que 8.1 INTRODUÇÃO,318
8.2 UNIDADE DE TRANSCRIÇÃO EM BACTÉRIAS:
O OPERON, 318
7.5 PCR ContornaEaIDENTIFICAÇÃO
DETECÇÃO DE ÁCIDOS
Necessidade de Clonar DNA, 279 8.3 OPERON LACTOSE DE E. COLI, 319
Repressor do Operon Lactose É uma Proteína Difu
sível, 320
NUCLEICOS E PROTEÍNAS QUE SE LIGAM AO
Sequência Operador do Operon Lactose É Contí
DNA, 280 gua a um Promotor e Três Genes Estruturais, 321
Ácidos Nucleicos como Sondas (Probes) para Se
RNA Polimerase e uma Proteína Reguladora
quências Específicas de DNA ou RNA, 280
Reconhecem a Sequência do Promotor do Operon
Técnica de Southern Blot para Identificar Frag
Lactose, 322
mentos de DNA, 281
Proteína Ativadora de Catabólito Liga Promotor
Polimorfismo de Conformação de Cadeia Única,
Lactose, 322
283
Detecção de mRNA, 283 7.6
8.4 OPERONTRIPTOFANO DE E. COLI, 323
Detecção de Proteínas que se Ligam a Sequências Operon Triptofano É Controlado por uma Proteína
Específicas no DNA, 285 Repressora, 323

Região Atenuadora do Operon Triptofano, 325
Atenuação da Transcrição Controla Outros Ope
rons de Biossíntese de Aminoácidos, 326
8.5 OUTROS OPERONS BACTERIANOS, 327
Síntese de Proteínas Ribossômicas É Regulada de
Modo Coordenado, 327
Resposta Estringente Controla Síntese de rRNAs e
tRNAs, 327
8.6 TRANSPOSONS BACTERIANOS, 328
Transposons São Segmentos Móveis do DNA, 328
O Transposon Tn3 Contém Três Genes Estruturais, 329
8.7 EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS, 330
DNA Eucariótico é Ligado a Histonas para Formar
Cromatina, 331
Metilação do DNA Correlaciona-se com Inativação
de Genes, 332
8.8 COMPLEXO DE PRÉ-INICIAÇÃO EM EUCA
RIOTOS: FATORES DE TRANSCRIÇÃO, RNA
POLIMERASE II E DNA, 333
Promotores Eucarióticos e Outras Sequências Que
Influenciam Transcrição, 335
Projeto Modular de Fatores de Transcrição Eucari
óticos, 335
Motivos Comuns em Proteínas Que Ligam DNA e
Regulam Transcrição, 335
8.9 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EUCA
RIÓTICA, 338
Regulando os Reguladores, 338
Ativação da Transcrição do Gene do Receptor de
LDL Ilustra Muitas Características Encontradas na
Regulação Gênica Eucariótica, 339
Controle Epigenético da Expressão Gênica, 341
Parte III
FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
9 Proteínas II: Relações Estrutura-Função em
Famílias de Proteínas, 347
Richard M. Schultz
CONCEITOS CHAVES
9.1 INTRODUÇÃO, 348
9.2 MOLÉCULAS DE ANTICORPOS: A SUPERFA
MÍLIA DE PROTEÍNAS IMUNOGLOBULINAS,
349
Moléculas de Anticorpos Contêm Quatro Cadeias
Polipeptídicas, 349
Imunoglobulinas de uma Classe Contêm Regiões
CH Homólogas, 350
Existem Dois Sítios de Ligação de Antígeno por
Molécula de Anticorpo, 354
Genética das Imunoglobulinas, 355
Dobra de Imunoglobulinas É Encontrada em uma
Grande Família de Proteínas com Diferentes Papeis
Funcionais, 357
9.3 PROTEÍNAS COM UM MECANISMO CATALÍTI
CO COMUM: SERINO PROTEASES, 357
Conteúdo • XIII
As Enzimas Proteolíticas São Classificadas por seu
Mecanismo Catalítico, 357
Serino Proteases São Sintetizadas como Zimogê
nios e em Proteínas com Múltiplos Domínios, 361
Estruturas Terciárias dos Domínios Catalíticos de
Serino Proteases São Semelhantes, 362
Serino Proteases Têm Relações Estrutura-Função
Semelhantes, 364
Homologia de Sequência em Serino Proteases, 365
Mecanismo de Catálise das Serino Proteases, 366
Inibidores Proteicos Específicos de Serino Protea
ses, 366
9.4 HEMOGLOBINA E MIOGLOBINA, 367
A Hemoglobina Humana Ocorre em Várias For
mas, 367
Mioglobina: Um Único Polipeptídeo com Um Sítio
de Ligação de O2,368
O Grupo Prostético Heme É o Sítio de Ligação de
O2, 369
Cristalografia por Raios-X Definiu as Estruturas da
Hemoglobina e da Mioglobina, 370
Um Equilíbrio Simples Define a Ligação de O2 à
Mioglobina, 372
A Ligação de O2 à Hemoglobina Envolve Coopera
tividade entre Subunidades, 373
Hemoglobina Facilita o Transporte de CO2 e NO, 374
Diminuição no pKa de Grupos Ácidos com Carga
da Conformação T para R Libera Prótons, 374
Hemoglobina Entrega Óxido Nítrico (NO) para a
Parede Capilar de Tecidos onde Promove Entrega
de O2, 378
9.5 O COMPLEXO PROTEICO DA LÂMINA BASAL,
381
Composição em Proteínas da Lâmina Basal, 381
A Estrutura Molecular da Lâmina Basal É Formada
a Partir de uma Rede de Laminina e Colágeno Tipo
IV, 382
Contato Focal em Membrana Celular Interconecta
a Matriz Extracelular com o Citoesqueleto, 386
10 Enzimas: Classificação, Cinética e Controle, 391
Henry Weiner
CONCEITOS CHAVES
10.1 INTRODUÇÃO, 392
10.2 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS, 392
Classe 1: Óxido-redutases, 393
Classe 2: Transferases, 393
Classe 3: Hidrolases, 394
Classe 4: Liases, 395
Classe 5: Isomerases, 395
Classe 6: Ligases, 396
10.3 CONCEITOS GERAIS DOS MECANISMOS DE
ENZIMAS, 396
Considerações Termodinâmicas, 396
Ligação do Substrato a uma Enzima,397
Estado de Transição, 397
Ligação Covalente do Substrato à Enzima, 400
O pH Afeta uma Reação por Afetar Ácidos e Bases
Gerais, 401
XIV • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
10.4 SÍTIO ATIVO DE UMA ENZIMA, 401
Estereoquímica do Sítio Ativo, 401
Influência de Grupos Sobre o Substrato Distal à
Ligação a Ser Modificada, 403
10.5 COENZIMAS, COSSUBSTRATOS E COFATO
RES, 404
Coenzimas, 404
Adenosina Trifosfato Pode Ser um Segundo Subs
trato ou um Modulador de Atividade, 407
Cofatores Íons Metálicos, 407
10.6 CINÉTICA DE REAÇÕES QUÍMICAS, 409
Velocidade de Formação de Produto, 409
Velocidade de Desaparecimento de Substrato, 410
Reações Reversíveis, 411
10.7 CINÉTICA ENZIMÁTICA DE REAÇÕES COM
UM SUBSTRATO, 411
Equação de Michaelis–Menten, 413
Significado de kcat na Equação de Michaelis–Men
ten, 416
Km Baixo versus kcat Alta, 417
Calculando as Constantes, 418
Efeito das Condições de Ensaio, 418
10.8 CINÉTICA DE REAÇÕES COM DOIS SUBSTRA
TOS, 419
Mecanismo Sequencial, 419
Mecanismo Pingue-Pongue, 419
Kmapp, 420
10.9 INIBIDORES, 420
Inibição Competitiva, 421
Inibição Acompetitiva, 423
Inibição Não-competitiva, 423
Gráficos de Lineweaver–Burk em Presença de Inibi
dores, 423
Outros Inibidores, 424
Inibidores de Enzimas como Drogas, 424
10.10 REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA,427
Modificação Covalente, 427
Controle Alostérico de Atividade Enzimática, 427
Enzimas Multi-subunidades: Cooperatividade, 429
Subunidades Regulatórias Modulam a Atividade
de Subunidades Catalíticas, 431
10.11 REGULAÇÃO DE VIAS METABÓLICAS, 431
10.12 APLICAÇÕES CLÍNICAS DE ENZIMAS, 432
Dosagem de Enzimas Plasmáticas, 432
Metabolômica e Proteômica, 434
11 Citocromos P450 e Óxido Nítrico Sintases, 441
Linda J. Roman e Bettie Sue Siler Masters
CONCEITOS CHAVES
11.1 INTRODUÇÃO, 442
11.2 CITOCROMOS P450: PROPRIEDADES E FUN
ÇÃO, 443
11.3 SISTEMAS DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS
CITOCROMOS P450, 444
NADPH-Citocromo P450 Redutase É a Flavoproteí
na Doadora de Elétrons no Retículo Endoplasmáti
co, 444
NADPH-Adrenodoxina Redutase É a Flavoproteína
Doadora de Elétrons em Mitocôndrias, 446
11.4 CITOCROMOS P450: NOMENCLATURA E ISO
FORMAS,446
11.5 CITOCROMOS P450: SUBSTRATOS E FUN
ÇÕES FISIOLÓGICAS, 447
Citocromos P450 Participam da Síntese de Hormô
nios Esteroides e da Oxigenação de Compostos
Endógenos, 448
Citocromos P450 Oxidam Substratos Lipofílicos
Exógenos, 451
11.6 CITOCROMO P450: INDUÇÃO E INIBIÇÃO, 456
Interações Droga–Droga, 457
Polimorfismos Genéticos de Citocromos P450, 459
Inibição Terapêutica de Citocromo P450, 460
11.7 ÓXIDO NÍTRICO SINTASES: PROPRIEDADES
E FUNÇÃO ENZIMÁTICA, 461
11.8 ISOFORMAS DA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE E
FUNÇÕES FISIOLÓGICAS, 463
NOSI, 464
NOSII, 465
NOSIII, 466
12 Membranas Biológicas: Estrutura, Receptores e
Transporte de Solutos, 475
Thomas M. Devlin
CONCEITOS CHAVES
12.1 INTRODUÇÃO, 476
12.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS MEMBRANAS,
476
Lipídeos São Importantes Componentes das Mem
branas, 476
Glicerofosfolipídeos São os Lipídeos Mais Abun
dantes das Membranas, 477
Esfingolipídeos Estão Presentes nas Membranas, 480
Colesterol É um Importante Componente das
Membranas Plasmáticas, 481
A Composição em Lipídeos Varia entre Membra
nas, 481
Proteínas de Membrana, 482
Carboidratos de Membranas São Parte de Glico
proteínas ou Glicolipídeos, 483
12.3 MICELAS, BICAMADAS LIPÍDICAS E LIPOSSO
MOS, 484
Lipídeos Formam Estruturas Vesiculares, 484
Propriedades Gerais de Bicamadas Lipídicas, 485
12.4 ESTRUTURA DAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS,
486
Modelo Mosaico das Membranas Biológicas, 486
Lipídeos São Distribuídos Assimetricamente nas
Membranas, 487
Proteínas Integrais de Membrana, 487
Proteínas Periféricas de Membrana: Âncoras Lipídi
cas, 489

Proteínas e Lipídeos Difundem nas Camadas da
Membrana, 491
Microdomínios de Complexos Lipídeo–Proteína
Estão Presentes nas Membranas, 492
Ambiente Dinâmico das Membranas, 493
12.5 RECEPTORES DE MEMBRANA, 493
12.6 DESLOCAMENTO DE MOLÉCULAS ATRAVÉS
DE MEMBRANAS, 495
Algumas Moléculas se Difundem Através das
Membranas Celulares, 495
Mecanismos Baseados em Proteínas para Desloca
mento, 496
12.7 CANAIS E POROS DE MEMBRANAS, 497
Estruturas dos Canais de Membrana, 497
Controle e Seletividade dos Canais de Membrana,
498
Canais de Membrana e Poros Representativos, 498
12.8 PROTEÍNAS DO TRANSPORTE DE MEMBRA
NAS, 504
Energética de Sistemas de Transporte de Membra
na, 506
Transportadores de Membrana de Mamíferos, 507
12.9 TRANSPORTADORES DIRIGIDOS POR PO
TENCIAL ELETROQUÍMICO, 507
Transportadores Dirigidos por Potencial Eletroquí
mico Representativos, 508
12.10 TRANSPORTADORES ATIVOS PRIMÁRIOS, 510
Transportadores Ativos Primários Representativos,
511
12.11 TOXINAS FORMADORAS DE POROS E IONÓ
FOROS, 516
13 Fundamentos da Transdução de Sinal, 525
George R. Dubyak
CONCEITOS CHAVES
13.1 TRANSDUÇÃO DE SINAL ENTRECÉLULAS, 526
13.2 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTERCELULAR,
526
Dois Modos Fundamentais de Transdução de Sinal
Intercelular, 526
Moléculas Sinalizadoras Secretadas, 528
13.3 RECEPTORES DE MOLÉCULAS SECRETA
DAS, 528
13.4 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTRACELULAR
POR RECEPTORES DE SUPERFÍCIE CELU
LAR, 529
Ligantes, Receptores e Interações Receptor–Ligan
te, 529
Relações entre Receptores, Efetores e Segundos
Mensageiros, 531
Fosforilação de Proteínas na Transdução de Sinal,
531
Proteínas Regulatórias Que Ligam GTP na Transdu
ção de Sinal, 532
Conteúdo • XV
Outros Componentes de Complexos de Sinalização
Mediada por Receptor e Cascatas, 532
Interação Ligante–Receptor e Eventos Subsequen
tes de Sinalização, 533
Término da Transdução de Sinal por Receptores de
Superfície Celular, 534
13.5 RECEPTORES CANAIS IÔNICOS LIGANTE
-DEPENDENTES, 535
Receptores Canais Iônicos, 535
Término da Sinalização por Receptores Canais
Iônicos, 536
Outros Ligantes de Receptores Canais Iônicos, 537
13.6 RECEPTORES LIGADOS A ENZIMAS, 537
Funções Fisiológicas de Ligantes Extracelulares,
537
Receptores Tirosina Quinases (RTK), 537
Receptores Serina/Treonina Quinases, 538
13.7 RECEPTORES DE CITOCINAS, 540
Receptores de Citocinas: Estrutura e Função, 540
13.8 RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G,
542
Funções Fisiológicas e Ligantes Extracelulares, 542
Estrutura dos Receptores Acoplados a Proteína G,
542
Proteínas G Heterotriméricas, 544
Ciclo da Proteína G, 544
13.9 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM AMP
CÍCLICO, 546
Regulação da Síntese e Degradação de AMP Cícli
co, 546
Mecanismos Intracelulares de Sinalização por AMP
Cíclico, 548
13.10 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM GMP
CÍCLICO, 549
Regulação da Síntese e Degradação de GMP Cícli
co, 549
Mecanismos Intracelulares de Sinalização por GMP
Cíclico, 550
13.11 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM CÁL
CIO, 551
Regulação da Concentração Citosólica de Ca2+,
551
Ativação por Cálcio de Proteína Quinases e Fosfa
tases Dependentes de Calmodulina, 552
13.12 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM FOS
FOLIPÍDEOS, 553
Metabolismo Regulado de Fosfolipídeos como um
Componente de Vias Intracelulares de Sinalização,
553
Regulação da Fosfolipase C e da Fosfolipase D,
553
Diacilglicerol e Proteína Quinase C, 554
PIP3, Fosfatidilinositol 3-Quinases e Proteína Qui
nase B, 554
Fosfolipase A2 e Geração de Metabólitos de Ácido
Araquidônico, 555
13.13 INTEGRAÇÃO DE VIAS DE TRANSDUÇÃO
DE SINAL EM REDES DE TRANSDUÇÃO DE
SINAL, 555
XVI • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
Parte IV
VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
14 Bioenergética, Mitocôndria e Metabolismo Oxi
dativo, 561
Diana S. Beattie
CONCEITOS CHAVES
14.1 SISTEMAS PRODUTORES E CONSUMIDORES
DE ENERGIA, 562
ATP Liga Sistemas de Produção e de Utilização de
Energia, 562
NAD+ e NADP+ em Catabolismo e Anabolismo, 563
14.2 RELAÇÕES TERMODINÂMICAS E COMPO
NENTES RICOS EM ENERGIA, 563
Energia Livre É a Energia Disponível para Trabalho
Útil, 564
Valor Calórico de Componentes da Dieta, 565
Compostos São Classificados com Base na Energia
Liberada na Hidrólise de Grupos Específicos, 566
Variações de Energia Livre Podem Ser Determi
nadas a partir de Reações Enzimáticas Acopladas,
566
Energias de Ligações de Alta Energia de Vários
Grupos Podem Ser Transferidas de um Composto
para Outro, 567
14.3 FONTES E DESTINOS DE ACETIL-COENZIMA
A, 568
Fontes e Destinos Metabólicos do Piruvato, 568
Piruvato Desidrogenase É um Complexo Multienzi
mático, 569
Acetil-CoA É Usado por Várias Vias Diferentes, 570
14.4 O CICLO DOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS, 570
Reações do Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos, 571
Conversão do Grupo Acetil de Acetil-CoA em CO2
e H2O Conserva Energia, 574
Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos Serve como uma
Fonte de Intermediários Biossintéticos, 574
Reações Anapleróticas Repõem Intermediários do
Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos, 575
Atividade do Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos é
Cuidadosamente Regulada, 576
14.5 ESTRUTURA E COMPARTIMENTALIZAÇÃO
POR MEMBRANAS MITOCONDRIAIS, 577
As Membranas Mitocondriais Interna e Externa
Têm Diferentes Composições e Funções, 578
14.6 CADEIA DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS, 579
Reações de Oxidação-Redução, 579
Transporte Mitocondrial de Elétrons É um Sistema
com Múltiplos Componentes, 581
Complexo I: NADH-Ubiquinona Óxido-redutase,
581
Complexo II: Succinato-Ubiquinona Óxido-Reduta
se, 583
Complexo III: Ubiquinol-Citocromo c Óxido-Redu
tase, 583
Complexo IV: Citocromo c Oxidase, 586
Inibidores da Cadeia de Transporte de Elétrons,
587
14.7 FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA, 589
Acoplamento de Síntese de ATP e Transporte de
Elétrons, 590
ATP Sintase, 591
14.8 MEMBRANA MITOCONDRIAL INTERNA CON
TÉM SISTEMAS DE TRANSPORTE DE SUBS
TRATO, 594
Transporte de Adenina-Nucleotídeos e Fosfato, 594
Lançadeiras de Substrato Transportam Equivalen
tes de Redução Através da Membrana Mitocon
drial Interna, 596
Unidades Acetil São Transportadas como Citrato,
596
Mitocôndrias Têm um Transportador de Cálcio
Específico, 597
Proteínas Desacopladoras, 598
14.9 GENES MITOCONDRIAIS E DOENÇAS, 599
14.10 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS,
REACTIVE OXYGEN SPECIES), 601
Produção de Espécies Reativas de Oxigênio, 602
Dano Causado por Espécies Reativas de Oxigênio,
603
Defesas Celulares Contra Espécies Reativas de Oxi
gênio, 604
15 Metabolismo de Carboidratos I: Principais Vias
Metabólicas e Seu Controle, 611
Robert A. Harris
CONCEITOS CHAVES
15.1 INTRODUÇÃO, 612
15.2 GLICÓLISE, 612
Glicólise Ocorre em Todas as Células Humanas, 612
Glicose É Metabolizada Diferentemente em Várias
Células, 615
15.3 VIA GLICOLÍTICA, 616
Glicólise Ocorre em Três Estágios, 616
Rendimento em ATP e Equação Balanceada da
Glicólise Anaeróbica, 619
NADH Gerado pela Glicólise Deve ser Oxidado de
Volta a NAD+: Papel da Lactato Desidrogenase e
das Lançadeiras de Substrato, 620
Lançadeiras São Importantes para Outras Vias de
Óxido-redução, 621
Reagentes Sulfidrila e Fluoreto Inibem a Glicólise,
621
Hiperglicemia Inibe Glicólise, 622
Arsenato Impede Síntese Líquida de ATP sem Inibir
a Glicólise, 622
15.4 REGULAÇÃO DA GLICÓLISE, 623
Hexoquinase e Glucoquinase Têm Propriedades
Diferentes, 624
6-Fosfofruto-1-quinase É uma Enzima Regulatória
da Glicólise, 627
Controle Hormonal da 6-Fosfofruto-1-quinase por
cAMP e Frutose 2,6-bisfosfato, 630
A Enzima Bifuncional 6-Fosfofruto-2-quinase/Fru
tose 2,6-bisfosfatase É Regulada Por Fosforilação,
633

Coração Contém uma Isoenzima Diferente da
6-Fosfofruto-2-quinase/Frutose 2,6-bisfosfatase, 635
A Piruvato Quinase É também uma Enzima Regu
latória da Glicólise, 636
15.5 GLUCONEOGÊNESE, 638
Síntese de Glicose É Necessária para Sobrevivência,
638
Síntese de Glicose a Partir de Lactato, 640
Glicose É Sintetizada a Partir da Maioria dos Ami
noácidos, 641
Glicose Pode Ser Sintetizada a partir de Ácidos
Graxos com Número Ímpar, mas Não com Número
Par de Carbonos, 643
Glicose É Também Sintetizada a Partir de Frutose,
644
Gluconeogênese Requer Gasto de ATP, 645
Gluconeogênese Tem Vários Pontos de Regulação,
646
Controle Hormonal da Gluconeogênese É Crítico
para a Homeostase, 646
Oxidação de Álcool Inibe Gluconeogênese, 647
15.6 GLICOGENÓLISE E GLICOGÊNESE, 648
Glicogênio É a Forma de Armazenamento de Gli
cose, 648
Glicogênio Fosforilase Inicia Glicogenólise, 650
Enzima Cortadora de Ramos É Necessária para
Glicogenólise, 651
Glicogênese Requer Enzimas Singulares, 652
Características Especiais da Glicogenólise e da
Glicogênese, 654
Síntese e Degradação de Glicogênio São Muito
Reguladas, 655
Controle Efetor do Metabolismo de Glicogênio, 658
Fosforilase a É um “Receptor de Glicose” no Fíga
do, 659
Controle Hormonal e Neural da Síntese e da De
gradação de Glicogênio, 659
16 Metabolismo de Carboidratos II: Vias Especiais
e Glicoconjugados, 667
Nancy B. Schwartz
CONCEITOS CHAVES
16.1 VIA DAS PENTOSES FOSFATO, 668
A Via das Pentoses Fosfato Tem Duas Fases, 668
Oxidação de Glicose 6-Fosfato Conserva Equiva
lentes Redox como NADPH e a Descarboxilação
Fornece Pentoses Fosfato, 668
Interconversões de Pentoses Fosfato Levam a
Intermediários da Glicólise, 668
Glicose 6-Fosfato Pode Ser Completamente Oxida
da a CO2, 670
Via das Pentoses Fosfato Serve como um Sistema
Regenerador de NADPH e Fornecedor de Pentoses
Fosfato, 671
16.2 INTERCONVERSÕES DE AÇÚCARES E FORMA
ÇÃO DE AÇÚCAR LIGADO A NUCLEOTÍDEO, 672
Isomerização e Fosforilação São Reações Comuns
para Interconverter Carboidratos, 672
Açúcares Ligados a Nucleotídeos São Intermediá
rios em Muitas Transformações de Açúcares, 672
Conteúdo • XVII
Epimerização Interconverte Glicose e Galactose
Ligadas a Nucleotídeo, 673
Ácido Glucurônico É Formado por Oxidação de
UDP-Glicose, 674
Descarboxilação, Óxido-Redução e Transaminação
de Açúcares Dão Produtos Necessários, 675
Ácidos Siálicos São Derivados de N-Acetilglucosa
mina, 676
16.3 BIOSSÍNTESE DE POLISSACARÍDEOS COM
PLEXOS, 676
16.4 GLICOPROTEÍNAS, 678
Glicoproteínas Contêm Quantidades Variáveis de
Carboidratos, 678
Síntese de Glicoproteínas N-Ligadas Envolve Doli
col Fosfato, 679
Função do Glicano, 681
16.5 PROTEOGLICANOS, 683
Existem Seis Classes de Proteoglicanos, 683
Biossíntese de Condroitim Sulfato É Típica da For
mação de Glicosaminoglicanos, 685
17 Metabolismo de Lipídeos I: Síntese, Armazena
mento e Utilização de Ácidos Graxos e Triacil
gliceróis, 693
Martin D. Snider, J. Denis McGarry (falecido) e Richard W.
Hanson
CONCEITOS CHAVES
17.1 INTRODUÇÃO, 694
17.2 NATUREZA QUÍMICA DOS ÁCIDOS GRAXOS E
ACILGLICERÓIS, 695
Ácidos Graxos São Cadeias Alquila Terminando em
um Grupo Carboxila, 695
A Maioria dos Ácidos Graxos no Homem Ocorre
como Triacilgliceróis, 695
Hidrofobicidade dos Triacilgliceróis É Importante
para Suas Funções, 696
17.3 TRANSPORTE INTERÓRGÃOS DE ÁCIDOS
GRAXOS E SEUS PRODUTOS PRIMÁRIOS, 696
Transporte de Lipídeos no Estado Alimentado, 699
Transporte de Lipídeos no Estado de Jejum, 699
17.4 SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS: LIPOGÊNESE,
700
Glicose É o Principal Precursor para Síntese de
Ácidos Graxos, 700
Via de Biossíntese de Ácidos Graxos, 700
Via de Clivagem do Citrato Fornece Acetil-CoA e
NADPH para Lipogênese no Citosol, 704
Modificação de Ácidos Graxos, 705
O Ácido Graxo Sintase Pode Produzir Outros Áci
dos Graxos além do Palmitato, 706
Acil Graxo-CoAs Podem Ser Reduzidos a Alcoóis
Graxos, 707
17.5 ARMAZENAMENTO DE ÁCIDOS GRAXOS
COMO TRIACILGLICERÓIS, 707
Triacilgliceróis São Sintetizados a partir de Acil
Graxo-CoAs e Glicerol 3-Fosfato, 707
Mobilização de Triacilgliceróis Requer Hidrólise, 709
XVIII • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
Síntese de Triacilgliceróis Ocorre durante o Jejum
como Parte de um Ciclo Triacilglicerol-Ácido Graxo
Via Gliceroneogênese, 709
17.6 UTILIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS PARA PRO
DUÇÃO DE ENERGIA, 709
b-Oxidação de Ácidos Graxos de Cadeia Linear É
um Importante Processo de Produção de Energia,
710
Rendimento Energético da b-Oxidação de Ácidos
Graxos, 713
Comparação entre Síntese e Oxidação de Ácidos
Graxos, 714
b-Oxidação de Alguns Ácidos Graxos Requer Eta
pas Adicionais, 714
Corpos Cetônicos São Formados a partir de Acetil
-CoA, 717
Utilização de Corpos Cetônicos por Tecidos Não
-Hepáticos Requer a Formação de Acetoacetil-CoA,
718
A Oxidação em Peroxissomos de Ácidos Graxos
Cumpre Muitas Funções, 720
17.7 REGULAÇÃO DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS,
721
Regulação no Estado Alimentado, 721
Regulação no Estado de Jejum, 721
Regulação da Oxidação de Ácidos Graxos, 721
Ácidos Graxos como Moléculas Regulatórias, 722
18 Metabolismo de Lipídeos II: Vias do Metabolis
mo de Lipídeos Especiais, 727
Robert H. Glew
CONCEITOS CHAVES
18.1 INTRODUÇÃO, 728
18.2 FOSFOLIPÍDEOS, 728
Fosfolipídeos Contêm Ácido Fosfatídico Ligado a
uma Base, 728
Fosfolipídeos de Membranas Desempenham uma
Variedade de Funções, 730
Biossíntese de Fosfolipídeos, 733
Distribuição Assimétrica de Ácidos Graxos em Fos
folipídeos Deve-se a Reações de Remodelamento,
735
Plasmalogênios São Sintetizados a Partir de Alcoóis
Graxos, 736
18.3 COLESTEROL, 738
Colesterol É Amplamente Distribuído nas Formas
Livre e Esterificada, 738
Colesterol É Sintetizado a Partir de Acetil-CoA, 739
Lipoproteínas Plasmáticas, 741
Síntese do Colesterol É Cuidadosamente Regulada,
745
Colesterol É Excretado Primariamente como Áci
dos Biliares, 747
18.4 ESFINGOLIPÍDEOS, 748
Síntese de Esfingosina, 748
Ceramidas São Amidas de Ácidos Graxos Derivadas
de Esfingosina, 749
Esfingomielina É um Esfingolipídeo que Contém
Fósforo, 749
Glicoesfingolipídeos Geralmente Contêm Galacto
se ou Glicose, 749
Esfingolipidoses São Doenças Lisossomais de Ar
mazenamento, 753
18.5 PROSTAGLANDINAS E TROMBOXANES, 756
Prostaglandinas e Tromboxanes São Derivados de
Ácidos Monocarboxílicos, 756
Síntese de Prostaglandinas Envolve uma Ciclooxi
genase, 757
Prostaglandinas Têm Muitos Efeitos Fisiológicos,
760
18.6 LIPOXIGENASE E ÁCIDOS OXIEICOSATETRA
ENOICOS, 761
Ácidos Mono-Hidroperoxieicosatetraenoicos São
Produtos da Ação da Lipoxigenase, 761
Leucotrienos e Ácidos Hidroxieicosatetraenoicos
São Hormônios Derivados de HPETEs, 762
Leucotrienos e HETEs Afetam Vários Processos
Fisiológicos, 762
19 Metabolismo de Aminoácidos, 771
Marguerite W. Coomes
CONCEITOS CHAVES
19.1 INCORPORAÇÃO DE NITROGÊNIO EM AMINO
ÁCIDOS, 772
A Maioria dos Aminoácidos É Obtida da Dieta, 772
Grupos Amino São Transferidos de Um Aminoáci
do para Formar Outro, 773
Piridoxal Fosfato É Cofator das Aminotransferases,
775
Glutamato Desidrogenase Incorpora e Produz
Amônia, 776
Amônia Livre É Incorporada em, e Produzida a
Partir de Glutamina, 777
Aminoácido Oxidases Removem Grupos Amino, 778
19.2 TRANSPORTE DE NITROGÊNIO PARA O FÍ
GADO E O RIM, 778
Proteína É Constantemente Degradada, 778
Amônia É Liberada no Fígado e no Rim, 779
19.3 CICLO DA UREIA, 779
Átomos de Nitrogênios da Ureia Vêm de Amônia e
Aspartato, 779
A Síntese de Ureia Requer Cinco Enzimas, 780
A Síntese da Ureia É Regulada por um Efetor Alos
térico e por Indução Enzimática, 781
Doenças Metabólicas da Síntese da Ureia Têm
Graves Consequências, 782
19.4 SÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO-ESSEN
CIAIS, 783
19.5 DEGRADAÇÃO DE AMINOÁCIDOS, 785
Aminoácidos Não-essenciais, 785
Aminoácidos Essenciais, 787
Aminoácidos de Cadeia Ramificada, 795
19.6 IMPORTANTES METABÓLITOS DERIVADOS
DE AMINOÁCIDOS, 802
Metabólitos Feitos de Mais de um Aminoácido, 809
Glutationa, 811

19.7 BIOSSÍNTESE DO HEME, 814
Enzimas Envolvidas na Biossíntese do Heme, 814
ALA Sintase Catalisa a Etapa Limitante da Veloci
dade da Biossíntese do Heme, 818
Porfirias, 819
19.8 CATABOLISMO DO HEME, 820
A Bilirrubina É Conjugada para Formar Bilirrubina
Diglucuronídeo no Fígado, 821
Hemólise Intravascular Requer a Remoção do
Ferro, 824
20 Metabolismo de Purina e Pirimidina Nucleotí
deos, 831
Joseph G. Cory e Ann H. Cory
CONCEITOS CHAVES
20.1 INTRODUÇÃO,832
20.2 FUNÇÕES METABÓLICAS DOS NUCLEOTÍDE
OS, 832
Distribuição de Nucleotídeos Varia com o Tipo de
Célula, 832
20.3 5!-FOSFORRIBOSIL-1-PIROFOSFATO E GLU
TAMINA NASÍNTESE DE NOVO DE NUCLEO
TÍDEOS, 833
5’-Fosforribosil-1-pirofosfato, 833
20.4 SÍNTESE DE PURINA NUCLEOTÍDEOS, 836
Formação de IMP, 836
Síntese de Purina Nucleotídeos É Muito Regulada,
836
Bases Púricas e Nucleotídeos São Recuperados
para Formar Novamente Nucleotídeos, 839
Purinas Nucleotídeos São Interconvertidos para
Equilibrar os Níveis Celulares de Nucleotídeos de
Adenina e Guanina, 840
20.5 GTP É O PRECURSOR DE TETRA-HIDROBIOP
TERINA, 842
20.6 ÁCIDO ÚRICO É O PRODUTO FINAL DA DE
GRADAÇÃO DE PURINAS NO HOMEM, 845
20.7 METABOLISMO DE PIRIMIDINA NUCLEOTÍ
DEOS, 846
Síntese de Pirimidina Nucleotídeos, 846
Síntese de Pirimidina Nucleotídeos É Regulada no
Nível da Carbamoil Fosfato Sintetase II, 848
Bases Pirimídicas São Recuperadas para Formar
Novamente Nucleotídeos, 849
20.8 FORMAÇÃO DE DESOXIRRIBONUCLEOTÍDEOS,
849
Desoxirribonucleotídeos São Formados por Redu
ção de Ribonucleosídeos 5’-Difosfatos, 849
Síntese de Desoxitimidilato Requer N5, N10-Metile
no H4Folato, 850
Interconversões de Pirimidinas: Desoxirribopirimi
dina Nucleosídeos e Nucleotídeos, 851
20.9 DEGRADAÇÃO DE PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOS,
851
Conteúdo • XIX
20.10 NUCLEOSÍDEO E NUCLEOTÍDEO QUINASES,
852
20.11 ENZIMAS QUE METABOLIZAM NUCLEOTÍDE
OS EM FUNÇÃO DO CICLO CELULAR, 853
20.12 SÍNTESE DE COENZIMAS NUCLEOTÍDEOS,
854
20.13 AGENTES QUIMITERÁPICOS QUE INTERFE
REM COM O METABOLISMO DE PURINA E
PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOS, 855
Inibidores do Metabolismo de Purina e Pirimidina
Nucleotídeos, 856
Base Bioquímica para a Resposta a Agentes Qui
mioterápicos, 860
21 Inter-relações Metabólicas, 865
Robert A. Harris e David W. Crabb
CONCEITOS CHAVES
21.1 INTRODUÇÃO, 866
21.2 CICLOJEJUM-ALIMENTAÇÃO,869
No Estado Bem Alimentado a Dieta Supre as Ne
cessidades Energéticas, 869
No Estado de Jejum Inicial a Glicogenólise Hepáti
ca Mantém a Glicose Sanguínea, 870
O Estado de Jejum Requer Gluconeogênese a par
tir de Aminoácidos e Glicerol, 871
No Estado de Realimentação Inicial, o Glicogênio É
Formado pela Via Indireta, 873
Importantes Interações Metabólicas Interórgãos, 874
Necessidades Energéticas, Reservas e Homeostase
Calórica, 874
Cinco Fases da Homeostase da Glicose, 876
21.3 MECANISMOS ENVOLVIDOS NA MUDANÇA
DO METABOLISMO HEPÁTICO ENTRE OS ES
TADOS BEM ALIMENTADO E DE JEJUM, 879
Disponibilidade de Substratos Controla Muitas
Vias Metabólicas, 879
Efetores Alostéricos Regulam Enzimas-Chaves, 879
Modificação Covalente Regula Enzimas-Chaves, 881
Mudanças nas Quantidades de Enzimas-Chaves
Fornecem Adaptações de Longo Prazo, 885
21.4 INTER-RELAÇÕES METABÓLICAS DE TECI
DOS EM VÁRIOS ESTADOS NUTRICIONAIS E
HORMONAIS, 888
Obesidade, 888
Fazendo Dieta, 889
Diabetes Mellitus Tipo 2, 889
Diabetes Mellitus Tipo 1,890
Câncer, 892
Exercício Aeróbico e Anaeróbico, 894
Gravidez, 895
Lactação, 896
Estresse e Trauma, 896
Doença Hepática, 897
Doença Renal, 897
Consumo de Álcool, 898
Equilíbrio Ácido-Base, 898
Cólon, 900
XX • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
22 Bioquímica dos Hormônios, 907
Thomas J. Schmidt
CONCEITOS CHAVES
22.1 INTRODUÇÃO, 908
22.2 HORMÔNIOS E O SISTEMA DE CASCATA HOR
MONAL, 909
Os Sistemas de Cascata Amplificam os Sinais Espe
cíficos, 909
Importantes Hormônios Polipeptídicos e Suas
Ações, 911
22.3 SÍNTESE DE HORMÔNIOS POLIPEPTÍDICOS E
DERIVADOS DE AMINOÁCIDOS 916
Hormônios Polipeptídicos: Codificação Gênica, 916
Hormônios Derivados de Aminoácidos, 918
Inativação e Degradação de Hormônios Derivados
de Aminoácidos, 920
22.4 PROTEÍNAS DE SINALIZAÇÃO HORMONAL,
921
Visão Geral da Sinalização, 921
Sistemas Hormonais Cíclicos, 923
Ciclo Ovariano É Controlado pela Secreção Pulsátil
e Cíclica de Hormônio Liberador de Gonadotropi
na, 924
22.5 RECEPTORES HORMONAIS DE MEMBRANA,
926
Algumas Interações Hormônio-Receptor Envolvem
Múltiplas Subunidades Hormonais, 926
Internalização de Receptores, 929
22.6 CASCATAS HORMONAIS INTRACELULARES:
PROTEÍNA QUINASES, 931
Receptor de Insulina: Transdução por Tirosina Qui
nase, 931
Atividade da Vasopressina: Proteína Quinase A,
933
Hormônio Liberador de Gonadotropina (GnRH):
Proteína Quinase C, 933
Atividade do Fator Natriurético Atrial (ANF): Pro
teína Quinase G, 936
22.7 HORMÔNIOS ESTEROIDES, 938
Estrutura e Funções dos Hormônios Esteroides, 938
Biossíntese de Hormônios Esteroides, 940
Metabolismo de Hormônios Esteroides, 942
Regulação da Síntese de Hormônios Esteroides,
943
Vitamina D3, 949
Transporte de Hormônios Esteroides: Proteínas
Plasmáticas de Ligação, 949
22.8 RECEPTORES DE HORMÔNIOS ESTEROIDES,
950
Hormônios Esteroides Ligam-se a Proteínas Recep
tores Intracelulares, 950
Receptores Órfãos, 955
Regulação Negativa (Down-regulation) do Recep
tor de Esteroide pelo Ligante, 955
Receptores Nucleares de Hormônios, Coativadores
e Correpressores, 956
Efeitos Não-Genômicos de Esteroides, 956
Parte V
PROCESSOS FISIOLÓGICOS
23 Biologia Molecular da Célula, 961
Thomas E. Smith
CONCEITOS CHAVES
23.1 TECIDO NERVOSO: METABOLISMO E FUN
ÇÃO, 963
Conceitos Essenciais, 963
ATP e Potencial Elétrico Transmembrânico em
Neurônios, 965
Interação Neurônio–Neurônio Ocorre por Meio de
Sinapses, 966
Síntese, Armazenamento e Liberação de Neuro
transmissores, 968
Terminação de Sinais em Junções Sinápticas, 970
Neuropeptídeos São Derivados de Proteínas Pre
cursoras, 975
23.2 O OLHO: METABOLISMO E VISÃO, 976
Córnea Deriva ATP do Metabolismo Aeróbico, 976
Cristalino Consiste Principalmente de Água e Pro
teína, 977
Retina Deriva ATP de Glicólise Anaeróbica, 978
Transdução Visual Envolve Eventos Fotoquímicos,
Bioquímicos e Elétricos, 978
Bastonetes e Cones São Células Fotorreceptoras, 980
Visão de Cores Origina-se nos Cones, 987
23.3 MOTORES MOLECULARES E PROTEÍNAS
ASSOCIADAS, 990
Contração Muscular, 990
Músculo Esquelético: Organização Estrutural de
Seus Componentes, 991
Contração do Músculo Esquelético, 997
Músculo Cardíaco: Estrutura e Contração, 1000
Contração do Músculo Liso: Regulação por Cálcio,
1001
Reservatórios de Energia para Contração Muscular,
1002
Outras Classes de Miosinas e Motores Moleculares,
1002
23.4 MECANISMO DE COAGULAÇÃO DO SANGUE,
1005
Processos Bioquímicos da Hemostasia, 1005
Fase Pró-Coagulante da Hemostasia (Fase 1), 1007
Algumas Propriedades das Proteínas Envolvidas na
Formação do Coágulo, 1009
Fase Anticoagulante da Hemostasia (Fase 2), 1012
Fase Fibrinolítica da Hemostasia (Fase 3), 1016
Papel dos Resíduos de Gla nos Fatores da Coagula
ção do Sangue, 1017
24 Ciclo Celular, Morte Celular Programada e Cân
cer, 1027
Richard M. Schultz
CONCEITOS CHAVES
24.1 INTRODUÇÃO, 1028

24.2 CICLO DE DIVISÃO CELULAR, 1028
Regulação do Ciclo Celular, 1029
Transdução de Sinal de Fator de Crescimento, 1031
24.3 APOPTOSE: MORTE CELULAR PROGRAMA
DA, 1034
Principais Vias da Apoptose, 1034
Indução de Apoptose por p53, 1037
Vias da MAPK Regulam a Morte Celular e a Sobre
vivência Celular, 1038
24.4 CÂNCER, 1039
Oncogenes e Genes Supressores de Tumor, 1039
Propriedades de Células de Câncer, 1040
Múltiplas Mutações São Necessárias para Formar
um Câncer, 1043
Heterogeneidade Genética e Bioquímica no Cân
cer, 1043
Agentes Mutagênicos e Promotores Causam Cân
cer, 1046
Análise Bioquímica de Cânceres Individuais, 1047
25 Digestão e Absorção de Constituintes Nutricio
nais Básicos, 1053
Ulrich Hopfer
CONCEITOS CHAVES
25.1 INTRODUÇÃO, 1054
Tipos de Nutrientes, 1054
Vários Órgãos Gastrointestinais Contribuem para a
Digestão de Alimentos, 1054
25.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS, 1056
Diferentes Locais de Digestão, 1056
Enzimas Digestivas São Secretadas como Pró-Enzi
mas, 1057
Secreção É Regulada por Muitos Secretagogos,
1057
25.3 TRANSPORTE EPITELIAL, 1061
Transporte de Solutos Pode Ser Transcelular ou
Paracelular, 1061
Absorção de NaCl Depende de ATPase Trocadora
de Na+/K+, Transportadores de Membrana e Ca
nais, 1061
Secreção de NaCl Depende da ATPase Trocadora
de Na+/K+, Transportadores de Membrana e Ca
nais, 1062
Gradientes de Concentração de Íons e Potenciais
Elétricos Energizam o Transporte de Nutrientes,
1066
Células Gástricas Parietais Secretam HCl, 1067
25.4 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE PROTEÍNAS, 1068
As Peptidases Garantem Digestão Eficiente de
Proteínas, 1068
Transportadores de Aminoácidos e de Di- e Tripep
tídeos, 1071
25.5 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE CARBOIDRATOS,
1073
Dissacarídeos e Polissacarídeos Requerem Hidróli
se, 1073
Transportadores de Monossacarídeos, 1076
25.6 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE LIPÍDEOS, 1076
Conteúdo • XXI
Digestão de Lipídeos Requer Vencer sua Limitada
Solubilidade em Água, 1076
Lipídeos São Digeridos pelas Lipases Gástrica e
Pancreática, 1076
Micelas de Ácidos Biliares Solubilizam Lipídeos
Durante a Digestão, 1078
A Maioria dos Lipídeos Absorvidos É Incorporada
em Quilomícrons, 1080
25.7 METABOLISMO DE ÁCIDOS BILIARES, 1083
Química e Síntese de Ácidos Biliares, 1083
Transporte de Ácidos Biliares, 1083
26 Vitaminas e Minerais: Necessidades e Função,
1089
Stephen G. Chaney
CONCEITOS CHAVES
26.1 INTRODUÇÃO, 1090
26.2 AVALIAÇÃO DA DESNUTRIÇÃO, 1090
26.3 INGESTÃO DIETÉTICA DE REFERÊNCIA, 1091
26.4 VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS, 1092
Vitamina A É Derivada de Carotenoides de Plan
tas, 1092
Síntese de Vitamina D Requer Luz do Sol, 1094
Vitamina E É uma Mistura de Tocoferóis e Toco
trienóis, 1098
Vitamina K É um Derivado de Quinona, 1099
26.5 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS, 1100
26.6 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS LIBERADO
RAS DE ENERGIA, 1102
Tiamina Forma a Coenzima Tiamina Pirofosfato,
1102
Riboflavina Forma as Coenzimas FAD e FMN, 1103
Niacina Forma as Coenzimas NAD e NADP, 1103
Piridoxina (Vitamina B6) Forma a Coenzima Pirido
xal Fosfato, 1105
Ácido Pantotênico e Biotina Formam Coenzimas
Envolvidas no Metabolismo Energético, 1105
Ácido α-Lipoico Desempenha Papéis Mútiplos no
Corpo, 1106
26.7 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS HEMATOPOI
ÉTICAS, 1106
Ácido Fólico Funciona como Tetra-hidrofolato no
Metabolismo de Um Carbono, 1106
Vitamina B12 (Cobalamina) Contém Cobalto num
Anel Tetrapirrólico, 1108
26.8 OUTRAS VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS, 1109
Ácido Ascórbico Funciona em Reações de Redução
e Hidroxilação, 1109
Colina e Carnitina Desempenham Várias Funções,
1111
26.9 MACROMINERAIS, 1112
Cálcio Tem Muitas Funções Fisiológicas, 1112
Magnésio É Requerido por Muitas Enzimas, 1112
26.10 MINERAIS TRAÇOS, 1112
Deficiência de Ferro Causa Anemia e Imunocom
petência Diminuída, 1112
XXII • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas

Iodo É Incorporado a Hormônios da Tireoide, 1118 Durante o Crescimento e em Doenças, 1133

Zinco É Requerido por Muitas Proteínas, 1118
Cobre É um Cofator de Enzimas Importantes, 1119 27.4 DESNUTRIÇÃO PROTEICO-ENERGÉTICA,
Cromo É um Componente da Cromodulina, 1120 1133
Selênio É Encontrado em Selenoproteínas, 1120 27.5 EXCESSO DE INGESTÃO PROTEICO-ENERGÉ
Manganês, Molibdênio, Fluoreto e Boro São Ele
TICA, 1135
mentos Traços Essenciais, 1121
Obesidade Tem Componentes Dietéticos e Genéti
26.11 A DIETA NORTE-AMERICANA: FATO E FALÁ cos, 1136
CIA, 1121 Obesidade, Resistência a Insulina, Síndrome Meta
bólica e Diabetes Tipo 2, 1137
26.12 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL NA A Obesidade Tem Implicações Significativas para a
PRÁTICA CLÍNICA, 1121 Saúde, 1139
26.13 NUTRIGENÔMICA – O FUTURO DA NUTRI 27.6 CARBOIDRATOS, 1139
ÇÃO, 1122
27.7 GORDURAS, 1139
27 Macronutrientes: Efeitos Metabólicos e Implica 27.8 FIBRAS, 1140
ções para a Saúde, 1129 27.9 COMPOSIÇÃO DOS MACRONUTRIENTES DA
DIETA, 1142
Stephen G. Chaney A Composição da Dieta Afeta o Colesterol Sérico,
1142
CONCEITOS CHAVES Carboidratos, Índice Glicêmico e Carga Glicêmica,
1144
27.1 INTRODUÇÃO, 1130
As Necessidades Nutricionais de Proteína São
27.2 METABOLISMO ENERGÉTICO, 1130 Atendidas Misturando-se Proteínas Vegetais e
O Conteúdo Energético dos Alimentos É Medido Animais, 1145
Primariamente em Quilocalorias, 1130 Fibras de Fontes Variadas São Desejáveis, 1145
O Gasto de Energia É Influenciado por Quatro Recomendações Dietéticas, 1145
Fatores, 1130
27.10 NUTRIGENÉTICA E COMPOSIÇÃO DIETÉTI
27.3 METABOLISMO DE PROTEÍNAS, 1131 CA, 1147
As Proteína da Dieta Desempenha Muitas Funções,
Incluindo a Produção de Energia, 1131 Apêndice: Revisão de Química Orgânica, 1155
O Balanço Nitrogenado Relaciona a Ingestão com
a Excreção de Nitrogênio, 1131 Carol N. Angstadt
Aminoácidos Essenciais Precisam Estar Presentes
na Dieta, 1131
A Economia de Proteínas Está Relacionada com o Glossário, 1167
Conteúdo na Dieta de Carboidratos e Gorduras,
1132 Francis Vella
Necessidades de Proteína do Adulto Normal, 1132
As Necessidades de Proteína São Aumentadas Índice Remissivo, 1199
 Correlações ClínInCas • XXIII

Correlações Clínicas
4.2 Análogos de Nucleosídeos e Resistência a Drogas
1 Estrutura da Célula Eucariótica na Terapia do HIV, 150
4.3 Topoisomerases Como Antibióticos, 158
1.1 Condições Médicas Anormais Refletidas no pH do 4.4 Câncer e o Ciclo Celular, 163
Sangue, 7
4.5 Recombinação e Câncer, 164
1.2 Importância do HCO3– do Sangue na Acidose
4.6 Recombinação e Terapia Gênica, 169
Metabólica, 11
1.3 Envelhecimento Acelerado e o Núcleo Celular, 16 4.7 Cisplatina e o Tour de France, 170
Doenças Mitocondriais, 19 4.8 Análogos da Base Tiopurina Como Drogas, 171
1.4
1.5 Enzimas Lisossomais e Gota, 20 4.9 Medicina Personalizada, 172
1.6 Deficiência de Lipase Ácida Lisossomal, 21 4.10 Xeroderma Pigmentoso, 175
1.7 Doenças da Biogênese de Peroxissomos (PBD), 22 4.11 Reparo de Pareamento Errado e Câncer, 177

2 DNA e RNA: Composição e Estrutura 5 RNA: Transcrição e Processamento do RNA

2.1 Vacinas de DNA, 32 5.1 Antibióticos e Toxinas que Têm RNA Polimerase
2.2 Uso Diagnóstico de Matrizes (Arrays) de DNA em Como Alvo, 191
Medicina e Genética, 43 5.2 Síndrome do XFrágil: Uma Doença da Cromatina?
2.3 Antibióticos Antitumorais que Mudam a Forma do 195
DNA, 46 5.3 Envolvimento de Fatores de Transcrição na Car
2.4 Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal, 50 cinogênese, 197
2.5 Telomerase Como Alvo para Agentes Anticâncer, 5.4 Talassemia Decorrente de Defeitos na Síntese de
50 RNA Mensageiro, 202
2.6 Expansão de Repetições de Tripletes de DNA e 5.5 Autoimunidade em Doenças do Tecido Conjuntivo,
Doença Humana, 52 203
2.7 Topoisomerases no Tratamento de Doenças, 56 5.6 Enzimas de Edição de Ácidos Nucleicos: Uma De
2.8 Tratamentos Epigenéticos para o Câncer, 61 fesa Antiviral, Bem Como um Modo de Alterar a
2.9 Resistência de Staphylococcus à Eritromicina, 69 Expressão Gênica, 206
5.7 Envolvimento de MicroRNAs na Oncogênese, 208
5.8 Síndrome de Cockayne, 209
3 Proteínas I: Composição e Estrutura

3.1 Proteínas Plasmáticas no Diagnóstico de Doenças, 6 Síntese de Proteínas: Tradução e Modificações

92 Pós-Tradução
3.2 Diferenças em Insulinas Usadas no Tratamento de
Diabetes Mellitus, 94 6.1 Mutações Silenciosas Podem Não Ser Silenciosas:
3.3 Hiperlipoproteinemias, 113 (1) Síndrome Progeria de Hutchinson–Gilford e (2)
3.4 Hipolipoproteinemias, 114 Gene de Resistência a Múltiplas Drogas 1, 220
3.5 Hemoglobina Glicosilada, HbA1c, 117 6.2 Mutações com Sentido Errado: Hemoglobinopa
3.6 DoençasDoenças dede PríonsPríons ee ProteínasProteínas ComoComo AgentesAgentes In-In tias, 220
fecciosos: Encefalopatias Espongiformes Transmis 6.3 Mutações Que Geram um Códon de Terminação,
síveis Humanas (TSEs), 118 221
3.7 Uso de Análise de Aminoácidos no Diagnóstico de 6.4 α-Talassemia, 221
Doenças, 131 6.5 Mudança na Fase de Leitura (Frameshifting) Pro
gramada na Biossíntese de Proteínas de HIV, 223
6.6 Mutações em rRNA e tRNA Mitocondriais Resul
4 Replicação, Recombinação e Reparo do DNA tam em Surdez Induzida por Antibiótico, 235
6.7 Deleção de um Códon, Enovelamento Incorreto e
4.1 A Quimioterapia Pode Ter Como Alvos Precursores Degradação Prematura: Fibrose Cística, 236
da Síntese de DNA, 148 6.8 Doenças de Direcionamento para Lisossomos:
XXIV • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
Doença da Célula I, 243 8.6 Tratamento de Câncer Usando Drogas Que Têm
6.9 Terapia por Reposição de Enzima para Doenças Como Alvo a Modificação de Histonas e de DNA:
Lisossomais de Acúmulo, 244 Terapia Epigenética, 341
6.10 Importação Mitocondrial de Proteína Defectiva e
Doença, 245
6.11 Hiperproinsulinemia Familiar, 247
6.12 AusênciaAusência dede ModificaçãoModificação Pós-Tradução:Pós-Tradução: Deficiên-Deficiên
9 Proteínas II: Relações Estrutura-Função em
Famílias de Proteínas
cia Múltipla de Sulfatases, 248
6.13 Defeitos na Síntese de Colágeno, 251
9.1 As Proteínas do Complemento, 351
6.14 Enovelamento Errado de Proteína e Agregação:
9.2 Funções de Diferentes Classes de Anticorpos, 352
Doença de Huntington e Doença de Alzheimer, 256
9.3 Imunização, 353
6.15 Defeitos no Sistema Ubiquitina-Proteassomo, 257
9.4 Formação de Fibrina em um Infarto do Miocár
dio e Uso de Ativador de Plasminogênio Tecidual
Recombinante (rt-PA), 358
7 DNA Recombinante e Biotecnologia 9.5 Envolvimento de Serino Proteases na Metástase de
Células Tumorais, 360
7.1 Reação de Polimerase em Cadeia (Polymerase 9.6 Hemoglobinopatias, 368
Chain Reaction), 268
7.2 PCR em Tempo Real Quantitativo (qRT-PCR) na
Análise de um Gene Associado com Câncer de
Próstata, 269 10 Enzimas: Classificação, Cinética e Controle
7.3 Mapas de Restrição e Evolução, 271
7.4 Sequenciamento Direto de DNA para Diagnóstico 10.1 Hidrólise de Asparaginase e Leucemia, 395
da Síndrome de Bloom: uma Doença Genética, 273 10.2 Mutação de um Sítio de Ligação de Coenzima
7.5 Análise por PCR Multiplex de Defeitos no Gene da Resulta em Doença Clínica, 404
HGPRTase na Síndrome de Lesch–Nyhan, 279 10.3 Um Caso de Gota Demonstra Duas Fases no Me
7.6 Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de canismo de Ação Enzimática, 415
Restrição Determina a Origem Clonal de Tumores, 10.4 Efeito Fisiológico de Mudanças nos Valores de Km
282 de Enzimas, 416
7.7 Polimorfismo de Conformação de Cadeia Única 10.5 Labilidade Térmica da Glicose-6-Fosfato Desidro-ro
para Detecção de Mutações Espontâneas que genase Resulta em Anemia Hemolítica, 419
Podem Levar a SIDS, 284 10.6 Isoenzimas da Álcool Desidrogenase com Diferen
7.8 O Uso de Camundongo Transgênico com Cromos tes pHs Ótimos, 420
somo Artificial de Levedura (YAC) para Estudar a 10.7 Inibidores de Xantina Oxidase Isolados de Plantas,
Doença de Huntington, 290 421
7.9 O Uso de Chromosome Walking e Jumping para 10.8 Planejamento de um Inibidor Seletivo, 422
Identificar o Gene da Fibrose Cística, 292
10.9 Um Caso de Envenenamento, 425
7.10 Mutagênese Sítio-Dirigida de Colágeno Tipo VII
10.10 Cogumelos e Metabolismo de Álcool, 426
(C7), 297
10.11 Testosterona e Câncer de Próstata, 426
7.11 Regulação da Expressão Gênica Mediada por
siRNA, 301 10.12 Produtos Naturais Como Inibidores de Enzimas,
427
7.12 Terapia Gênica: Genes Normais Podem Ser Intro
duzidos em Células com Genes Defectivos, 302 10.13 Um Caso de Gota Demonstra a Diferença entre um
Sítio Alostérico e um Sítio de Ligação de Substrato,
7.13 Modelos de Animais Transgênicos, 304
428
7.14 Camundongos Knockout para Definir um Papel
10.14 Ambiguidade no Ensaio de Enzimas Mutadas, 429
para o Purinoceptor P2Y1, 305
10.15 Identificação e Tratamento de uma Deficiência
7.15 Técnica de Micromatrizes (Microarray) para Detec
Enzimática, 433
tar e Tratar Doenças, 308

8 Regulação da Expressão Gênica 11 Os Citocromos P450 e Óxido Nítrico Sintase

8.1 Resistência Transmissível a Múltiplas Drogas, 329 11.1 Hiperplasia Adrenal Congênita: Deficiência de
8.2 O Patógeno Bacteriano do Estômago: Helicobacter CYP21A2, 452
pylori, 330 11.2 Produção de Hormônios Esteroides Durante a
8.3 Síndrome de Rubstein-Taybi, 332 Gestação, 452
8.4 O Tamoxifeno e o Receptor de Estrógeno Como 11.3 Inibição de Citocromo P450: Interações Droga–
Alvo, 339 Droga e Efeitos Adversos, 455
8.5 Fatores de Transcrição e Doença Cardiovascular, 11.4 Papel do Citocromo P450 2E1 na Toxicidade Hepá-Hepá
339 tica Induzida por Acetaminofen, 457
 Correlações ClínInCas • XXV
11.5 Indução de Citocromo P450: Interações Droga–
Droga e Efeitos Adversos, 458 15 Metabolismo de Carboidratos I: Principais Vias
11.6 Polimorfismos Genéticos de Enzimas P450, 460 Metabólicas e Seu Controle
11.7 Polimorfismos Genéticos de NADPH-Citocromo
P450 Redutase: Síndrome de Antley–Bixler, 461 15.1 Álcool e Barbituratos, 622
11.8 O Mecanismo de Ação de Sildenafil, 465 15.2 Envenenamento por Arsênico, 624
11.9 SuperproduçãoSuperprodução dede ÓxidoÓxido NítricoNítrico nono ChoqueChoque Sép-Sép 15.3 Intolerância a Frutose, 626
tico, 466 15.4 Diabetes Mellitus, 628
11.10 História e Efeitos Biológicos da Nitroglicerina, 467 15.5 Acidose Láctica, 630
11.11 Usos Terapêuticos de Óxido Nítrico Inalado, 468 15.6 “Picles” de Porco e Hipertermia Maligna, 631
11.12 O Papel de eNOS na Disfunção Endotelial, 469 15.7 Angina Pectoris e Infarto do Miocárdio, 632
15.8 Deficiência de Piruvato Quinase e Anemia Hemo
lítica, 638
12 Membranas Biológicas: Estrutura, Receptores e 15.9 Hipoglicemia e Bebês Prematuros, 639
15.10 Hipoglicemia e Intoxicação Alcoólica, 648
Transporte de Solutos
15.11 Doenças de Armazenamento de Glicogênio, 653
12.1 LipossomosLipossomos comocomo CarregadoresCarregadores dede Drogas,Drogas, Proteí-Proteí
nas e Ácidos Nucleicos, 486
12.2 Anomalias na Fluidez de Membranas Celulares em 16 Metabolismo de Carboidratos II: Vias Especiais
Doenças, 492 e Glicoconjugados
12.3 O Rim de Mamíferos e as Aquaporinas, 500
12.4 Doenças Que se Devem à Perda de Sistemas de 16.1 Deficiência de Glicose 6-Fosfato Desidrogenase,
Transporte de Membranas, 507 669
12.5 Fibrose Cística e o Canal de Cl–, 516 16.2 SíndromeSíndrome dede �ernicke–Korsakoff:�ernicke–Korsakoff: AnomaliasAnomalias As-As
12.6 DoençasDoenças QueQue EnvolvemEnvolvem aa SuperfamíliaSuperfamília dede Trans-Trans sociadas e Atividade de Transcetolase, 671
portadores ABC, 518 16.3 Frutosúria Essencial e Intolerância a Frutose:
Deficiência de Frutoquinase e de Frutose 1-Fosfato
Aldolase, 673
13 Fundamentos da Transdução de Sinal 16.4 Galactosemia:Galactosemia: IncapacidadeIncapacidade dede TransformarTransformar Galac-Galac
tose em Glicose, 674
13.1 Família de Receptores Tirosina Quinases ErbB/HER 16.5 Pentosúria: Deficiência de Xilitol Desidrogenase;
Como Alvos para Quimioterapia do Câncer, 539 L-Xilulose Redutase, 675
13.2 Antagonistas Endógenos de Receptores de In 16.6 O Ácido Ascórbico (Vitamina C) É Derivado de
terleucina-1 Como Terapia para Doenças Infla Ácido Glucurônico, 675
matórias, 541 16.7 ÁcidoÁcido Glucurônico:Glucurônico: SignificadoSignificado FisiológicoFisiológico dada For-For
13.3 Receptores de Quimiocinas Acoplados a Proteína mação de Glucuronídeos, 675
G como Alvos para o Vírus da Imunodeficiência 16.8 Substâncias dos Grupos Sanguíneos, 678
Humana (HIV), 543 16.9 Doenças Congênitas de Glicosilação (CDGs, con
13.4 Mutações em Proteína G em Tumores de Glândula genital disorders of glycosylation), 681
Pituitária e Doenças Endócrinas, 545 16.10 Defeitos no Catabolismo de Glicoproteínas, 682
13.5 Alterações na Sinalização do Receptor b-Adrenér 16.11 Doenças de Glicolipídeos, 683
gico na Insuficiência Cardíaca Congestiva, 547 16.12A Heparina É um Anticoagulante, 683
13.6 Sinalização por Óxido Nítrico/cGMP Como Alvos 16.13 CondrodistrofiasCondrodistrofias DecorrentesDecorrentes dede DefeitosDefeitos dede Sulfa-Sulfa
Terapêuticos em Doenças Cardíacas e Vasculares, tação, 686
550 16.14 Mucopolissacaridoses, 687

14 Bioenergética, Mitocôndria e Metabolismo Oxi 17 Metabolismo de Lipídeos I: Síntese, Armazena

dativo mento e Utilização de Ácidos Graxos e Triacil
gliceróis
14.1 Deficiência de Piruvato Desidrogenase, 571
14.2 Deficiência de Fumarase, 574 17.1 Obesidade, 697
14.3 Envenenamento por Cianeto, 589 17.2 Papel Chave do Metabolismo de Ácidos Graxos no
14.4 Neuropatia Óptica Hereditária de Leber, 600 Diabetes Tipo 2: Um Tributo a J. Denis McGarry,
14.5 Miopatias Mitocondriais Decorrentes de Mutações 698
em Genes de tRNA Mitocondrial, 600 17.3 Ciclo Triacilglicerol/Ácido Graxo, 710
14.6 Intolerância a Exercício em Pacientes com Muta 17.4 Deficiências Genéticas no Transporte por Carnitina
ções no Citocromo b, 601 ou na Carnitina Palmitoil Transferase, 713
14.7 NADPH Oxidase (NOX) na Saúde e na Doença, 603 17.5 DeficiênciasDeficiências GenéticasGenéticas dasdas Acil-CoAAcil-CoA Desidroge-Desidroge
14.8 Lesão por Reperfusão do Miocárdio, 604 nases, 714
XXVI • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
17.6 Doença de Refsum, 717
17.7 Corpos Cetônicos Como Combustíveis: A Dieta de
Atkins, 719
17.8 Ácidos Graxos como Moléculas Regulatórias, 722
18 Metabolismo de Lipídeos II: Vias do Metabolis
mo de Lipídeos Especiais
18.1 Remoção (clearance) de Eritrócitos: Papel da Fosfa
tidilserina, 731
18.2 Síndrome do Desconforto Respiratório, 732
18.3 Tratamento da Hipercolesterolomia, 747
18.4 Aterosclerose, 747
18.5 Diagnóstico da Doença de Gaucher em um Adulto,
756
20 Metabolismo de Purina e Pirimidina Nucleotí
deos
20.1 Mutações com Perda de Função da Fosforribosil
pirofosfato Sintetase 1 (PRPS1): Síndrome de Arts,
834
20.2 Gota, 835
20.3 Síndrome de Lesch–Nyhan, 841
20.4 Atividade Citosólica Aumentada de 5’-Nucleotida-a
se, 843
20.5 Doenças de Imunodeficiências Associadas a Defei
tos na Degradação de Purina Nucleosídeos, 844
20.6 Síndrome da Lise Tumoral (TSL), 845
20.7 Acidúria Orótica Hereditária, 847
20.8 Síndrome da Encefalopatia Neurogastrointestinal
Mitocondrial (MNGIE), 853

19 Metabolismo de Aminoácidos 21 Inter-relações Metabólicas

19.1 Deficiências de Carbamoil Fosfato Sintetase e de 21.1 Obesidade e a Síndrome Metabólica, 866
N-Acetilglutamato Sintetase, 783 21.2 Desnutrição Proteico-Calórica, 867
19.2 Deficiências de Enzimas do Ciclo da Ureia, 784 21.3 Jejum, 868
19.3 Selenoproteínas, 787 21.4 Coma Hiperglicêmico, Hiperosmolar, 877
19.4 Hiperglicinemia Não-Cetótica: Encefalopatia da 21.5 Hiperglicemia e Glicação de Proteínas, 877
Glicina, 788 21.6 Diabetes Mellitus Tipo 2, 891
19.5 Deficiência de Prolina Desidrogenase, 788 21.7 Hipoglicemia e Diabetes, 892
19.6 Deficiências na Via do Semialdeído Glutâmico, 788 21.8 Diabetes Mellitus Tipo 1,893
19.7 Fenilcetonúria, 790 21.9 Caquexia do Câncer, 893
19.8 Tirosinemias, 791
19.9 Alcaptonúria, 793
19.10 Homocisteinemia e Homocisteinúria, 794
19.11 Doenças Envolvendo Cistina, 795
22 Bioquímica dos Hormônios

19.12 Doenças do Metabolismo de Ácido Glutárico, 797 22.1 Hipopituitarismo, 914

19.13 Hiperlisinemia e Intolerância à Proteína Lisinúrica,
798
19.14 Histidinemia e Deficiência de Formiminotransfera-a
se, 799
19.15 Doença da Urina em Xarope de Bordo e Outras
Doenças das Vias Degradativas de Aminoácidos de
Cadeia Ramificada, 801
19.16 Acidemia Propiônica e Acidúria Metilmalônica,
803
19.17 Hiperoxalúria Primária, 804
19.18 Deficiência de Metionina Adenosiltransferase
(MAT), 805
19.19 Mal de Parkinson, 807
19.20Tetra-hidrobiopterina, 809
19.21 Albinismo, 810
19.22Deficiência de Triptofano Hidroxilase, 811
19.23 Porfiria Intermitente Aguda, 818
19.24Função Citoprotetora da Heme Oxigenase, 820
19.25 Hemólise Isoimune Neonatal, 821
19.26 Deficiência de Bilirrubina UDP-Glucuronosiltrans
ferase, 822
19.27 Elevação da Bilirrubina Conjugada Sérica, 823
22.2 Puberdade Precoce, 924
22.3 Atividade Reduzida do Receptor de Insulina
Quinase no Diabetes Mellitus Gestacional, 934
22.4 Contracepção Oral, 947
22.5 Síndrome do Excesso Aparente de Mineralocorti
coide, 952
22.6 Mutação no Receptor de Mineralocorticoide Resul
ta em Hipertensão e Toxemia na Gravidez, 954
23 Biologia Molecular da Célula
23.1 A Barreira Hemato-Encefálica e Defeitos no Trans
porte de Glicose, 964
23.2 Síndrome Miastênica de Lambert–Eaton, 971
23.3 Miastenia Gravis: Um Distúrbio Neuromuscular, 972
23.4 Degeneração da Mácula e Perda da Visão, 979
23.5 Doença de Niemann–Pick e Retinite Pigmentosa,
981
23.6 Retinite Pigmentosa por Mutação do Gene da
Periferina, 982
23.7 Amaurose Congênita de Leber: Distrofia da Retina
Que Leva à Cegueira, 988
23.8 Canelopatias de Íons Voltagem-Dependentes, 994

23.9 Cardiomiopatias Hipertróficas Familiares e Muta
ções em Proteínas Musculares, 994
23.10 Cardiomiopatia Dilatada e Mutações na Actina,
996
23.11 Subunidades da Troponina como Marcadores do
Infarto do Miocárdio, 999
23.12 Canais Iônicos e Doença do Músculo Cardíaco,
1001
23.13 Mutações Que Afetam Pigmentação: Existe uma
Conexão com Motor Molecular? 1003
23.14 Defeitos da Via Intrínseca: Deficiência de Pré-cali
creína, 1008
23.15 Hemofilia Clássica, 1013
23.16 Uso do Fator VIIa Recombinante para Controlar
Sangramento, 1013
23.17 Trombose: Defeitos na Via da Proteína C e Níveis
Aumentados de Fatores da Coagulação, 1016
24 Ciclo Celular, Morte Celular Programada e Cân
cer
24.1 Vírus Oncogênicos de DNA, 1041
24.2 Droga Anticâncer Molecularmente Dirigida, 1044
24.3 Causa Ambiental do Câncer Humano, 1045
25 Digestão e Absorção de Constituintes Nutricio
nais Básicos
25.1 A Cloridorreia Familiar Causa Alcalose Metabólica,
1064
25.2 Fibrose Cística no Pâncreas, 1065
25.3 Diarreias Bacterianas Toxigênicas e Terapia de
Reposição de Eletrólitos, 1066
25.4 Autodigestão Tríptica e Pancreática, 1070
25.5 Enteropatia por Glúten, 1071
25.6 Aminoacidúria Neutra: Doença de Hartnup, 1073
25.7 Deficiência de Dissacaridases, 1075
25.8 Intervenções Farmacológicas para Evitar Absorção
de Gordura e Obesidade, 1078
Correlações ClínInCas • XXVII
25.9 Cálculos de Colesterol, 1081
25.10 Absorção de Colesterol, 1082
25.11 A-b-Lipoproteinemia, 1083
26 Vitaminas e Minerais: Necessidades e Função
26.1 Considerações Nutricionais na Fibrose Cística, 1094
26.2 Osteodistrofia Renal, 1096
26.3 Considerações Nutricionais em Recém-Nascidos,
1101
26.4 DrogasDrogas AnticonvulsivantesAnticonvulsivantes ee NecessidadesNecessidades Vita-Vita
mínicas, 1101
26.5 Considerações Nutricionais em Alcoólatras, 1103
26.6 Polimorfirmos Genéticos e Necessidades de Ácido
Fólico, 1108
26.7 Necessidades Nutricionais de Pessoas Idosas, 1110
26.8 Dieta e Osteoporose, 1113
26.9 Ceruloplasmina e Metabolismo do Ferro, 1116
26.10 Hemocromatose, 1117
26.11Testes Clínicos para Anemia por Deficiência de
Ferro e Hemocromatose, 1118
26.12 Doenças do Metabolismo do Cobre, 1120
27 Macronutrientes: Efeitos Metabólicos e Implica
ções para a Saúde
27.1 DietasDietas VegetarianasVegetarianas ee NecessidadesNecessidades Proteico-Ener-Proteico-Ener
géticas de Crianças, 1133
27.2 Ingestão de Proteínas na Dieta e Doença Renal,
1134
27.3 Oferecendo Proteínas e Calorias Adequadas para
Pacientes Hospitalizados, 1135
27.4 Carga de Carboidratos e Resistência Atlética, 1140
27.5 Dietas Ricas em Carboidratos Versus Dietas Ricas
em Gorduras para Diabéticos, 1141
27.6 Ácidos Graxos Poli-insaturados e Fatores de Risco
para Doença Cardíaca, 1143
27.7 Adaptação Metabólica: Relação entre Ingestão de
Carboidratos e Triacilglicerol Sérico, 1147
XXVIII • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
 Correlações ClínInCas • XXIX

Um Olhar mais Atento

1 Estrutura da Célula Eucariótica 14 Bioenergética, Mitocôndria e Metabolismo Oxi
dativo
1.1 Ácido Carbônico (H2CO3) é um Ácido Fraco Impor
tante na Homeostase de Animais, 9 14.1 OO CicloCiclo QQ parapara TransferênciaTransferência dede ElétronsElétrons ee Bom-Bom
1.2 Problemas de pH e Tamponamento, 11 beamento de Prótons no Complexo III, 585
14.2 Vias de Transferência de Elétrons no Complexo IV,
588
3 Proteínas I: Composição e Estrutura 14.3 Síntese de ATP em F1, 593
14.4 EvidênciaEvidência ExperimentalExperimental dada RotaçãoRotação dasdas Subuni-Subuni
dades g e c pela ATP Sintase, 595
3.1 Clívagem Proteolítica da Proinsulina, 92
3.2 Absorbância de Luz Ultravioleta e Visível Mostra
uma Dependência Linear de Concentração e Com
primento do Caminho, 136 15 Metabolismo de Carboidratos I: Principais Vias
Metabólicas e Seu Controle

6 Síntese de Proteínas: Tradução e Modificações 15.1 2,3-Bisfosfoglicerato e Altitude Elevada, 620

Pós-Tradução 15.2 GliceraldeídoGliceraldeído 3-Fosfato3-Fosfato DesidrogenaseDesidrogenase ee aa Hiper-Hiper
glicemia, 623
6.1 Aminoacil-tRNA Sintetases, 218 15.3 Hexoquinase II e Câncer, 626
6.2 Estrutura e Função dos Ribossomos, 225 15.4 6-Fosfofruto-2-quinase/Frutose-2,6-bisfosfatase e o
Câncer, 637
6.3 Chaperones do Retículo Endoplasmático, 238
15.5 TIGAR e Câncer, 637
6.4 Ubiquitina e SUMO, 257
15.6 Piruvato Quinase M2 e o Câncer, 638
15.7 Glicogênio Fosforilado e Doença de Lafora, 655

10 Enzimas: Classificação, Cinética e Controle

10.1 Unidades de Energia, 397

19 Metabolismo de Aminoácidos
10.2 Estereoquímica Ajuda a Explicar o Mecanismo de
Reações Catalisadas por Enzimas, 403 19.1 OO NitrogênioNitrogênio UreicoUreico SanguíneoSanguíneo ee MedidaMedida dodo Bal-Bal
anço Nitrogenado, 774
10.3 Abreviações para NAD e NADP, 405
19.2 Mecanismo das Aminotransferases, 775
10.4 Reações Complexas, 412
19.3 Ciclo Intercelular de Glutamina, 780
10.5 Derivação da Equação de Michaelis-Menten, 414
19.4 Enzimas Piruvoil, 787
10.6 Varredura de Alto Desempenho para Encontrar
Inibidores e Ativadores de Enzimas, 427 19.5 Triptofano, Carboidratos e Sono, 796
10.7 Ensaiosnsaios dede LaboratórioLaboratório ClínicoClínico EmpregandoEmpregando Enzi-Enzi 19.6 Lisina e Pipecolato, 799
mas, 435 19.7 Urocromo, 823
10.8 ImunoensaiosImunoensaios LigadosLigados aa EnzimasEnzimas EmpregamEmpregam Enzi-Enzi
mas Como Indicadores, 435
23 Biologia Molecular da Célula

12 Membranas Biológicas: Estrutura, Receptores e 23.1 Estrutura da Acetilcolina Esterase, 973

Transporte de Solutos 23.2 Estrutura da LeuT-Desimpramina: Uma Pista para
o Mecanismo de Recaptação Neuronal de Dopa
12.1 Fosfatidilinositóis Têm Muitas Funções, 479 mina, Epinefrina e Serotonina, 973
12.2 Deslocamento de Grupo e o Ciclo g-Glutamil, 497 23.3 Mudanças Conformacionais durante a Formação
da “Rodopsina Ativa”, 987
23.4 Homologia de Sequência dos Pigmentos Visuais,
989
23.5 Diagnóstico da Cegueira a Cor de John Dalton,
990
XXX • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
23.6 OutrasOutras DiferençasDiferenças FísicasFísicas ee QuímicasQuímicas EntreEntre Bas-Bas
tonetes e Cones, 990 24 Ciclo Celular, Morte Celular Programada e Cân
23.7 EvidênciaEvidência ExperimentalExperimental dasdas RegiõesRegiões dede Articula-Articula cer
ção (hinge) e da Parte da Molécula que Promove
Agregaçãos, 993 24.1 A Família de Proteínas Bcl-2, 1036
23.8 Homologia entre Miosinas de Diferentes Fontes,
995
23.9 EvidênciaEvidência dede MudançasMudanças ConformacionaisConformacionais nana Lib-Lib
eração de Pi e ADP, 1000
25 Digestão e Absorção de Constituintes Nutricio
nais Básicos
23.10Trombomodulina, 1017
23.11 Arranjo Estrutural do Ativador de Plasminogênio 25.1 Amidação de Hormônios Peptídicos e Neuropep
Tecidual, 1018 tídeos, 1060
23.12Ativação de Zimogênios Envolvidos na Coagulação
do Sangue, 1018
23.13 Possível Mecanismo de Ação da Vitamina K na
Carboxilação de Proteínas, 1018

Prefácio
No início da década de 1980, fomos motivados a pre
parar a Primeira Edição do Manual de Bioquímica com
Correlações Clínicas porque, naquele momento, ne
nhum texto bioquímico enfatizava os espantosos avan
ços da segunda metade do século vinte em relação ao
nosso conhecimento sobre a bioquímica celular normal
e anormal de mamíferos, especificamente a humana.
Assim, decidiu-se que, neste texto, o foco da apresen
tação seria a bioquímica celular básica de eucariotos,
com ênfase em células e tecidos de mamíferos. A pro
fundidade e o escopo da apresentação ainda são de um
texto de bioquímica básica. Na preparação da Primeira
Edição, também queríamos que os estudantes tivessem
uma idéia de como a pesquisa bioquímica levou ao en
tendimento das causas de muitas doenças humanas.
Isto foi realizado pela apresentação de descrições da
bioquímica de doenças selecionadas em caixas separa
das de Correlações Clínicas. Estas correlações dão sig
nificado à bioquímica, facilitando assim o processo de
aprendizado. A popularidade entre os estudantes das
correlações clínicas encorajaram-nos a adicionar novas
nas edições subsequentes.
Por que uma Sétima Edição?
O crescimento constante da profundidade de nosso
conhecimento da bioquímica e dos mecanismos de con
trole das células e dos tecidos normais foram o incenti
vo primário para atualizar o conteúdo do livro.
Resultados de pesquisa recente levaram a um en
tendimento dos eventos moleculares de muitos proces
sos celulares e fisiológicos, que até agora eram muito
pouco entendidos, como proteínas da matriz extrace
lular, morte celular programada, motores moleculares
e sinalização celular. Portanto, é conveniente incluir
estes e outros tópicos neste livro. Além disso, muitos
desses tópicos são agora apresentados em cursos de
bioquímica.
Finalmente, também foi necessário reorganizar al
guns tópicos, uma vez que a pesquisa descobriu as com
plexas relações entre muitos processos celulares e tis
sulares. Ao lado dessas mudanças, o escopo e o número
de Correlações Clínicas aumentaram, cobrindo tópicos
tão diversos como infecções por HIV, hipercolesterole
mia, diabetes e doença de Parkinson.
PrefáCIo • XXXI
Objetivos e Escopo da Apresentação
da Sétima Edição
Os seguintes objetivos foram estabelecidos na Pri
meira Edição e foram mantidos em todas as edições
subsequentes. São eles:
Apresentar uma discussão clara e precisa da bioquí
mica de células eucarióticas, com ênfase na de tecidos
de mamíferos
O escopo e a profundidade da apresentação devem
atender às exigências de cursos de bioquímica em nível
de graduação superior, de pós-graduação e profissionais
Relacionar eventos bioquímicos em nível celular
com processos fisiológicos no animal inteiro
Citar exemplos de processos bioquímicos anormais
em doenças humanas
O livro é organizado e escrito de modo que qualquer
sequência de tópicos considerada mais adequada pelo
instrutor possa ser apresentada. Ao longo deste texto,
resultados de pesquisas com organismos não-mamífe
ros são apresentados se a informação for mais avançada
do que a de estudos semelhantes em células de mamífe
ros. Assim, o livro apresenta uma imagem atual de nos
so conhecimento da bioquímica de células eucarióticas.
Mudanças Significativas na Sétima
Edição
Todos os capítulos foram atualizados, com inclusão
de nova informação e condensação de algum material.
Algumas mudanças são:
• Uma discussão expandida sobre microRNAs
• Uma apresentação profunda do complexo de pro
teínas da lâmina basal, de motores moleculares,
morte celular programada e câncer
• Uma apresentação de mecanismos de transporte
de membrana, em conformidade com a nomencla
tura atual e orientações de pesquisa
• Uma discussão sobre proteínas não-estruturadas
XXXII • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
• Uma discussão reorganizada sobre o metabolismo
de aminoácidos que separa a síntese, a degradação
e as funções dos aminoácidos
• Uma discussão sobre o metabolismo do heme in
cluída em aminoácidos, o que é a localização mais
comum em programas de ensino
• Uma apresentação abrangente da absorção e do
transporte de ferro
• Uma discussão inclusiva da função de vitaminas,
concentrada em um capítulo
• Uma atualização das bibliografias dos capítulos,
com seleção de referências de fontes de fácil aces
so, muitas acessíveis na Rede. Referências são
geralmente de artigos de revisão e publicações
originais; páginas da rede cuidadosamente selecio
nadas são também apresentadas
• Aproximadamente metade das questões e respos
tas anotadas são novas nesta edição; são seme
lhantes às de exames de admissão em cursos de
pós-graduação e profissionais, algumas são basea
das em dados apresentados em uma vinheta clíni
ca, e cada grupo de questões tem várias perguntas
de solução de problemas
Além disso, em resposta a recomendações de revi
sores, seções de muitos capítulos foram reorganizadas
para um melhor fluxo de informação. Conteúdos rela
cionados, que em edições anteriores eram apresentados
em vários capítulos diferentes, foram consolidados em
uma única apresentação. Ilustrações foram atualizadas
e novas figuras adicionadas. O adágio “Uma imagem
vale por mil palavras” é apropriado, e o leitor é encora
jado a estudar as ilustrações porque elas estão lá para
esclarecer aspectos confusos de um tópico.
Como nas edições anteriores, há frequentes referên
cias cruzadas entre capítulos.
Novas Características da Sétima
Edição
Para facilitar o aprendizados dos estudantes, adicio
namos várias características novas ao texto.
• Conceitos Chaves: uma lista de Conceitos Chaves
aparece no início de cada capítulo para os estu
dantes usarem como guia à medida que estudam
o capítulo e como referência para autoavaliação no
final do estudo.
• Um Olhar mais Atento: estas caixas contêm infor
mação suplementar sobre o tópico em discussão.
• Termos Chaves: uma lista de Termos Chaves apa
rece no fim de cada capítulo.
• Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM):
números de acesso associados com uma doença
ou enzima no banco de dados Online Mendelian
Inheritance in Man (OMIM) são indicados nos lu
gares correspondentes no texto. O banco de dados
OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim) cataloga do
enças conhecidas com um componente genético.
Conteúdo e Organização da Sétima
Edição
O conteúdo da sétima edição é dividido em cinco
partes principais.
• Parte I, Estrutura de Macromoléculas, contém um
capítulo introdutório sobre a estrutura da célula
eucariótica (Capítulo 1), seguido de dois capítulos
sobre a química e a estrutura de ácidos nucleicos
(Capítulo 2) e proteínas (Capítulo 3).
• Parte II, Transmissão da Informação, começa com
capítulos separados sobre a síntese das principais
macromoléculas celulares, isto é, DNA (Capítulo
4), RNA (Capítulo 5), e proteínas (Capítulo 6). Um
capítulo sobre DNA recombinante e biotecnologia
é incluído porque o conhecimento e as técnicas
desta área tiveram e continuam a ter um profundo
impacto sobre a pesquisa em quase todas as face
tas da bioquímica (Capítulo 7). A Parte II termina
com um capítulo sobre a Regulação da Expressão
Gênica, na qual mecanismos tanto de procariotos
como de eucariotos são apresentados (Capítulo 8).
• Parte III, Funções de Proteínas, abre com uma
apresentação da relação estrutura-função de qua
tro importantes famílias de proteínas, isto é, mo
léculas de anticorpo, serino proteases, hemoglobi
na e proteínas da lâmina basal (Capítulo 9). Esta
é seguida por uma discussão detalhada da função
e da cinética enzimática (Capítulo 10) e um capí
tulo separado sobre os citocromos P450, uma sin
gular e importante família de enzimas (Capítulo
11). Um capítulo sobre a estrutura de membranas
e os mecanismos essenciais de transporte trans
membrânico (Capítulo 12), e um capítulo sobre os
mecanismos básicos da transdução de sinal celular
concluem a Parte III (Capítulo 14). Estes capítulos
apresentam os fundamentos destes tópicos, e ca
pítulos subsequentes apresentam suas funções em
processos celulares específicos.
• Parte IV, Vias Metabólicas e Seu Controle, abre
com um capítulo sobre bioenergética e metabolis
mo oxidativo (Capítulo 14). Capítulos separados
descrevem as principais vias metabólicas de car
boidratos (Capítulo 15) e vias especiais de carboi
dratos e glicoconjugados (Capítulo 16). Segue-se
um capítulo cobrindo a síntese, o armazenamen
to e a utilização de energia na forma de lipídeos
(Capítulo 17), depois um descrevendo o metabo
lismo de fosfolipídeos, esfingolipídeos, colesterol e
prostaglandinas (Capítulo 18). O metabolismo de

aminoácidos e do heme é coberto no Capítulo 19,
seguido pela síntese e degradação de nucleotídeos
de purina e pirimidina (Capítulo 20). Um capítulo
sobre a integração dessas vias metabólicas no ho
mem completa esta parte (Capítulo 21). Grande ên
fase, ao longo de toda a Parte IV, é dada ao controle
de cada via ou processo.
• Parte V, Processos Fisiológicos, cobre as áreas ex
clusivas de células e tecidos de mamíferos, come
çando com um capítulo sobre hormônios, que en
fatiza suas funções bioquímicas como mensageiros
(Capítulo 22) e um capítulo sobre biologia mole
cular da célula, contendo discussões sobre quatro
sistemas fisiológicos importantes de transdução de
sinal: o sistema nervoso, o olho, contração muscu
lar e motores moleculares, e coagulação do sangue
(Capítulo 23). Uma discussão sobre o ciclo celular,
morte celular programada e câncer, três tópicos es
treitamente relacionados, é apresentada (Capítulo
24). Um capítulo sobre a complexa e integrada bio
química da digestão e da absorção dos constituin
tes nutricionais básicos (Capítulo 25) é seguida por
um sobre as funções e as necessidades nutricionais
de vitaminas e minerais no metabolismo (Capítu
lo 26). O último capítulo cobre os princípios gerais
da nutrição humana com proteínas, carboidratos e
gorduras (Capítulo 27).
Um Glossário com definições precisas serve de refe
rência rápida para a maior parte das palavras comuns
na linguagem em contínua expansão das ciências bio
químicas. Novos termos foram adicionados para enri
quecer esta seção.
Uma Revisão de Química Orgânica, como um Apên
dice, é projetado como uma referência rápida para a
nomenclatura e as estruturas de moléculas orgânicas
importantes encontradas em bioquímica; não pretende
ser uma revisão abrangente. O leitor deve se familiari
zar com o conteúdo do Apêndice de modo que possa ser
usado quando necessário, enquanto lê o texto principal.
Caixas de Correlações Clínicas em todos os capítu
los descrevem exemplos de doenças humanas nas quais
as ramificações de processos bioquímicos alterados es
tão bem estabelecidas. Existem 260 Correlações Clíni
cas apresentando a bioquímica aberrante de condições
médicas, desde muito comuns até relativamente raras,
e em alguns casos seus tratamentos baseados no co
nhecimento bioquímico da condição. As apresentações
são discussões da bioquímica alterada, e não um estudo
de caso médico. Em alguns casos, a mesma condição
clínica é apresentada em capítulos diferentes, mas cada
vez está baseada na bioquímica que está sendo apre
sentada. No caso de várias doenças importantes, como,
por exemplo, diabetes, uma única Correlação Clínica foi
elaborada como discussão primária, e outras Correla
ções sobre a mesma doença citam a primeira como in
formação geral de base. O entendimento do material do
PrefáCIo • XXXIII
texto principal não requer a leitura das Correlações Clí
nicas. Referências são incluídas nas Correlações para
facilitar a exploração do tópico em maiores detalhes.
Em alguns poucos casos, as condições clínicas são dis
cutidas como parte do texto primário porque estudos
da condição médica levaram a um entendimento de um
processo bioquímico básico.
Suplementos em Inglês
O Manual de Bioquímica com Correlações Clíni
cas, 7.ª edição, oferece uma variedade de recursos ino
vadores para dar suporte a estudantes e instrutores no
site <www.wiley.com>.
Para estudantes
Explorações Guiadas. 50 apresentações completas,
muitas com narração, usando extensa animação com
putacional gráfica, para melhorar o entendimento de
tópicos chaves.
Exercícios Interativos. 22 estruturas moleculares que
foram construídas em Jmol, uma interface indepen
dente de browser para manipular estruturas em três
dimensões, e pareadas com questões para facilitar a
compreensão dos conceitos.
Figuras Animadas. 25 figuras ilustrando vários concei
tos, técnicas e processos; apresentadas em animações
curtas, que servem como ferramentas de aprendizado
muito úteis.
Em Conclusão
Como nas edições anteriores, este trabalho é um li
vro multiautores. Todos os coautores são de nível aca
dêmico sênior, e todos são membros das faculdades de
diferentes universidades. Todos os coautores estão en
volvidos ativamente no ensino de bioquímica de progra
mas de pós-graduação e/ou de medicina, e todos têm
um interesse de pesquisa ativo no assunto apresentado
no capítulo que ele ou ela escreveu. Eles preparam seus
capítulos a partir da perspectiva do instrutor de sala
de aula, com a experiência para selecionar os tópicos e
determinar a ênfase necessária aos estudantes em um
curso de bioquímica geral.
Cada autor traz ao livro uma abordagem individual,
levando a algumas diferenças na apresentação. Todos os
capítulos, entretanto, foram editados para apresentarem
um estilo de escrita consistente e para eliminar repeti
ções desnecessárias e redundâncias. Alguns poucos tó
picos são discutidos em dois lugares no livro, para tornar
as discussões individuais completas e autônomas. Esta
repetição deve facilitar o processo de aprendizado.
O livro não tem por objetivo ser um compêndio de fa
tos bioquímicos ou uma revisão da literatura atual, mas
cada capítulo contém detalhes suficientes sobre o as
XXXIV • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
sunto para torná-lo útil como recurso. Os autores foram
orientados a não citarem pesquisadores individuais e
não tratarem de aspectos históricos de seus tópicos;
nossas desculpas aos muitos cientistas, que merecem
reconhecimento por suas excepcionais contribuições à
pesquisa e que tornaram este livro possível.
Uma pessoa deve aceitar a responsabilidade pelo
produto final de qualquer projeto. As decisões relativas
à seleção de tópicos e ao formato e à revisão dos ras
cunhos, bem como a responsabilidade pela conferência
final do livro foram inteiramente minhas. Aceito total
responsabilidade por essas decisões. São bem-vindos
comentários, críticas e sugestões de estudantes, pro
fessores e profissionais. Nossa esperança é que este
trabalho seja útil àqueles que embarcam na excitante
experiência de aprender a química da vida pela primei
ra vez, bem como àqueles que retornam a um tópico no
qual a informação se expande tão rapidamente.
thoMas M. deVlIn
Verwyn, Pennsylvania
Setembro de 2009

Prefácio da edição
brasileira
Mais uma vez tive a honra, o privilégio e a responsa
bilidade de traduzir o Manual de Bioquímica com Cor
relações Clínicas, de Thomas M. Devlin, agora na sua
Sétima Edição.
Desta vez, também participaram do trabalho de tra
dução o Biomédico Giovani Bravin Peres, graduado no
Curso de Ciências Biomédicas da Escola Paulista de
Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNI
FESP) e estudante de pós-graduação do Programa de
Pós-Graduação em Biologia Molecular da mesma Insti
tuição, e a Dra. Thaís Sodré de Lima Machado, Doutora
em Medicina Veterinária pela Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
(USP).
Escrever textos científicos em português, especial
mente nas áreas de Bioquímica e Biologia Molecular, é
sempre um desafio, uma vez que muitos neologismos fo
ram criados em outros idiomas (principalmente inglês
e francês) para fazer referência a moléculas e proces
sos recentemente descobertos, para os quais inexistem
termos de mesmo significado em português. Pesquisa
dores brasileiros têm dado importantes contribuições à
ciência mundial nesse campo, mas seus trabalhos são
quase sempre publicados em periódicos de circulação
internacional, em inglês. Por isso, para muitos termos
não existe uma tradução adequada (ou existem várias,
nenhuma perfeita) e, nos meios especializados, o termo
em inglês é o mais usado.
A Editora Blücher optou por entregar a tradução
deste livro, não a especialistas em português e/ou in
glês, mas a pesquisadores e educadores em Bioquímica,
Biologia Molecular e Medicina. Se, de um lado, certas
dificuldades podem ter surgido pela nossa pouca fami
liaridade e experiência com a arte de compor livros,
foram evitados erros grosseiros, inaceitáveis para os
profissionais e estudantes que utilizarão esta obra para
aprender seu conteúdo, aprofundar seus conhecimentos
ou como texto básico para o ensino de suas disciplinas.
Não somos tradutores. Muitos dos termos usados
aqui foram traduzidos segundo seu uso corrente nos
meios acadêmicos, ou não foram traduzidos. Alguns
exemplos: upregulation e downregulation que, quan
do coube, foram traduzidos por “regulação positiva” e
“regulação negativa”, respectivamente; upstream e
PrefáCIo • XXXV
downstream, que foram traduzidos por “a montante”
e “a jusante”, respectivamente; feedback foi traduzi
do por “retroalimentação”; turnover foi traduzido por
“renovação” ou “reciclagem”, dependendo do contexto;
primer, “iniciador”; template, “molde”; gap junctions,
“junção em fenda” ou “junção tipo fenda”; tight junc
tion, “junção ocludente”; steady state, “estado estacio
nário”, entre outros. Para evitar dúvidas, em muitos ca
sos optamos por manter o termo em inglês, em itálico,
ao lado do termo traduzido. Em outros casos, o uso da
palavra inglesa está consagrado no Brasil, como spli
cing, que não foi traduzido e aparece sempre em itálico.
Quanto às siglas, de modo geral foram mantidas as
originais, de uso comum. Por exemplo, DNA, para ácido
desoxirribonucleico (desoxyribonucleic acid); PCR,
para reação de polimerase em cadeia (polymerase
chain reaction); PDGF, para fator de crescimento de
rivado de plaquetas (platelet derived growth factor).
Uma questão que merece destaque é a tradução dos
nomes dos açúcares e das vias do seu metabolismo.
Em inglês, a raíz gly é genérica e refere-se à família
dos açúcares e não a um composto específico (p. ex.,
glycan, glicano; glycoproteins ou glycolipids, para
glicoproteínas ou glicolipídeos que contêm diferentes
açúcares; glycosyltransferase, para glicosiltransfera
ses, enzimas que transferem açúcares para aceptores),
enquanto glu refere-se ao monossacarídeo glucose e
seus derivados. Entretanto, em português gly é tradu
zido por “gli”, e glucose é “glicose”, gerando confusão.
Neste livro, optamos por traduzir todas as palavras com
a raíz gly por “gli” (p. ex., glycosaminoglycan, glicosa
minoglicano; glycoprotein, glicoproteína; glycolipid,
glicolipídeo; glycolysis, glicólise; glycogen, glicogê
nio), e usamos “glu” para os derivados de glucose (p.
ex., glucosamine, glucosamina; D-glucuronic acid,
ácido D-glucurônico; gluconeogenesis, gluconeogêne
se; glucosyltransferase, glucosiltransferase, enzima
que transfere glicose para aceptor). A única exceção é o
próprio monossacarídeo “glicose”, mantido aqui devido
ao seu uso consagrado no Brasil.
Outro ponto que merece destaque é que, neste livro,
os capítulos são escritos por diferentes autores, especia
listas nos respectivos temas. Por um lado, isso assegura
a precisão e a atualidade do conteúdo, mas, por outro
lado, gera diferenças de estilo. Apesar dos esforços no
XXXVI • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
sentido buscar um estilo de escrita consistente, é fácil
perceber, na leitura dos capítulos, diferentes graus de
clareza e profundidade no texto. Isso, obviamente, foi
mantido na tradução. Além disso, é claro que diferenças
de estilo também existem em português, e fatalmente
apareceriam se o texto fosse traduzido por diferentes
bioquímicos. Para minimizar essas diferenças e dar ao
livro traduzido certo grau de uniformidade, fiz a revisão
de todos os capítulos. Procurei ser, tanto quanto possí
vel, fiel ao texto original e, muitas vezes, apoiei-me em
dicionários (Aurélio, Houaiss, Michaelis e outros) e em
outros textos já traduzidos para o português ou escritos
por autores brasileiros, como referências.
A presente edição foi bastante modificada e atua
lizada em relação às edições anteriores, incorporando
novos conteúdos e tópicos, que eram desconhecidos (ou
pouco conhecidos) há poucos anos. Em especial, foram
incorporadas novas Correlações Clínicas e referências
bibliográficas (outras foram removidas), e alguns tre
chos foram destacados em novas caixas chamadas “Um
Olhar mais Atento”, que permitem um acesso rápido a
informações relevantes. Além disso, foram criadas as
seções “Conceitos Chaves” e “Termos Chaves”, no iní
cio e no fim, respectivamente, de cada capítulo, o que
facilita muito o estudo e a avaliação da aprendizagem.
Novas Questões também foram introduzidas em todos
os capítulos.
Para o entendimento da Biologia e a prática da Medi
cina nos dias de hoje, é imprescindível que os processos
que ocorrem nos seres vivos, tanto os normais como os
alterados por doenças, sejam entendidos em nível mo
lecular. Todos os profissionais que utilizam conceitos
biológicos na sua atuação devem estar familiarizados
com a nomenclatura dos componentes moleculares e
dos processos que ocorrem nas células, nos tecidos e no
organismo como um todo, para que possam desempe
nhar adequadamente suas funções.
Além disso, o público em geral também se beneficia
dos novos conhecimentos e avanços da ciência moderna.
Com o advento de novas tecnologias como DNA recom
binante, clonagem gênica, produção de medicamentos
recombinantes e “sob medida” para o usuário, produ
ção de organismos transgênicos, além da possibilidade
de clonagem de organismos inteiros, cada vez mais as
pessoas deverão tomar decisões que poderão afetar sua
vida diária, bem como a vida em todo o planeta. Pou
quíssimos textos de Bioquímica, especialmente esta
belecendo relações com a Clínica Médica, são amplos,
completos e atualizados como este. Espero que esta
nova edição ajude tanto profissionais como “amantes da
ciência” a entenderem os novos conhecimentos sobre
sistemas bioquímicos e suas implicações na biologia e
na saúde humana, com base nos conhecimentos adqui
ridos em laboratórios de pesquisa de todo o mundo.
Yara M. Michelacci
Fevereiro de 2011

Coautores
Carol n. angstadt, Ph.d.
Professora Emérita
School of Nursing and Health Profes
sions
Drexel University
490 S. Old Middletown Road
Media, PA 19063
Email: cnang@verizon.net
dIana s. BeattIe, Ph.d.
Professora e Ex-Chefe
Departamento de Bioquímica
West Virginia University School of Me
dicine
POBox9142
Morgantown, WV 26506
E-mail: dbeattie@hsc.wvu.edu
stePhen g. Chaney, Ph.d.
Professor Titular
Departamentos de Bioquímica e Biofísi
ca e de Nutrição
Genetic Medicine Building
School of Medicine CB# 7260
University of North Carolina at Chapei
Hill
Chapei Hill, NC 27599-7260
Email: stephen_chaney@med.unc.
edu
MarguerIte W. CooMes, Ph.d.
Professora Associada
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
Howard University College of Medicine
3411 MurdockRoad,
Kensington, MD 20895-1630
Email: mcoomes@howard.edu
ann h. Cory, M.s.
Pesquisadora Associada
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
Brody School of Medicine
East Carolina University
Greenville, NC 27834-4354
Email: corya@ecu.edu
JosePh g. Cory, Ph.d.
Professor Titular e Ex-Chefe
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
Brody School of Medicine
East Carolina University
Greenville, NC 27858-4354
Email: coryjo@ecu.edu
daVId W. CraBB, M.d.
Professor John B. Hickam e Chefe
Departamentos de Medicine
Professor Titular, Departamento de Bio
química e Biologia Molecular
Biology Emerson Hall 317
Indiana University School of Medicine
545 Barnhill Drive
Indianapolis, IN 46202-5124
Email: dcrabb@iupui.edu
thoMas M. deVlIn, Ph.d.
Professor Emérito e Ex-Chefe
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
Drexel University College of Medicine
159 Greenville Court
Berwyn, PA 19312-2071
Email: tdevlin@drexelmed.edu
John e. donelson, Ph.d.
Professor Titular e Ex-Chefe
Departamento de Bioquímica
Carver College of Medicine
University oflowa
Bowen Science Building
lowa City, IA 52242-0001
Email: john-donelson @uiowa. edu
george r. duByak, Ph.d.
Professor Titular
Departamento de Fisiologia e Biofísica
Case School of Medicine
Case Western Reserve University
2109 Adelbert Road
Cleveland, OH 44106
Email: george.dubyak@case.edu
hoWard J. edenBerg, Ph.d.
Professor Chancellor, Professor de Bio
química e Biologia Molecular e de Gené
tica Médica e Molecular
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
Indiana University School of Medicine
635 Barnhill Drive, Med. Sei. 4063
Indianapolis, IN 46202-5122
Email: edenberg@iupui.edu
roBert h. gleW, Ph.d.
Professor Emérito
PrefáCIo • XXXVII
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
MSC08 4670
University of New México
Albuquerque, NM 87131
Email: rglew@salud.unm.edu
dohn g. glItz, Ph.d.
Professor Emérito
Departamento de Química Biológica
UCLA School of Medicine
11260 Barnett Valley Road
Sebastopol, CA 95472
E-mail: dglitz@mednet.ucla.edu
rIChard W. hanson, Ph.d.
Professor Leonard & Jean Skeggs de
Bioquímica
Departamento de Bioquímica
RoomW414
Case School of Medicine
Case Western Reserve University
Cleveland, OH 44106-4935
E-mail: rwh@cwru.edu
roBert a. harrIs, Ph.d.
Professor Emérito Distinto e Professor
Emérito Showalter de Bioquímica
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
Indiana University School of Medicine
Richard Roudebush VA Medical Center
Research 151; Room D-3034
1481 West Tenth Street
Indianapolis, IN 46202
Email: raharris@iupui.edu
ulrICh hoPfer, M.d., Ph.d.
Professor Titular de Fisiologia e Biofísi
ca e Medicina
Departamento de Fisiologia e Biofísica
Case School of Medicine
Case Western Reserve University
109000EuclidAve.
Cleveland, OH 44106-4970
Email: ulrich.hopfer@case.edu
BettIe sue sIler Masters, Ph.d., d.sC.,
M.d. (hon.)
Professora Distinta Robert A. Welch de
Química
Departamento de Bioquímica, MSC 7760
University of Texas Health Science Cen
ter at San Antonio
XXXVIII • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
7703 Floyd Curl Drive
San Antonio, TX78229-3900
Email: mitsters@uthscsa.edu
lInda J. roMan, Ph.d.
Professora Associada
Departamento de Bioquímica - MSC 7760
University of Texas Health Science Cen
ter at San Antonio
7703 Floyd Curl Dr.
San Antonio, TX78229-3900
Email: roman@uthscsa.edu
frangIs J. sChMIdt, Ph.d.
Professor Titular
Departamento de Bioquímica
117 Schweitzer Hall
University of Missouri
Columbia, MO65211
Email: schmidtf@missouri.edu
thoMas J. sChMIdt, Ph.d.
Professor Titular
Departamento de Fisiologia Molecular e
Biofísica
6-452 Bowen Science Building
Carver College of Medicine
University of lowa
lowa City, IA 52242-1109
Email: thomas-schmidt@uiowa. edu
rlChard M. sChultz, Ph.d.
Professor Titular
Programas de Bioquímica e Biologia Mo
lecular
Departamento de Microbiologia e Imu
nologia, Sala 102-6652
Stritch School of Medicine
Loyola University of Chicago
2160 South First Avenue,
Maywood, IL60153
Email: rschult@lumc.edu
nanCy .d.
B. sChWartz, Ph
Professora Titular
Departamentos de Pediatria e de Bio
química e Biologia Molecular
University of Chicago, MC 5058
5841 S. Maryland Ave.
Chicago, IL60637-1463
Email: n-schwartz@uchicago. edu
daVId r. setzer, Ph.d.
Professor Titular
Divisão de Ciências Biológicas
410Tucker Hall
University of Missouri
Columbia, MO65211
Email: setzerd@missouri.edu
thoMas e. sMIth, Ph.d.
Professor Titular e Ex-Chefe
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
College of Medicine
Howard University
520 W Street, N.W.
Washington, DC 20059
Email: tsmith@howard.edu
MartIn d. snIder, Ph.d.
Professor Associado
Departamento de Bioquímica, Sala
W433
Case School of Medicine
Case Western Reserve University
109000 Euclid Ave
Cleveland, Ohio 44106-4935
Email: manin.snider@case.edu
gerald soslau, Ph.d.
Professor Titular e Diretor Associado
Sênior
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
M.S. 344, Sala 4104 NCB
Drexel University College of Medicine
245North 15th Street Philadelphia, PA
19102-1192
Email: verald.soslau@drexelmed.edu
frangIs Vella, Ph.d.
Professor (Aposentado)
Departamento de Bioquímica
University of Saskatchewan
18 Leyden Crescent
Saskatoon, Saskatchewan
SKS7J2S4, Canada
Email: f.vella @sasktel. net
danIel l. Weeks, Ph.d.
Professor Titular
Departamento de Bioquímica
Bowen Science Building
Carver College of Medicine
University of lowa
lowa City, IA 52242
Email: daniel_weeks@uiowa.edu
henry WeIner, Ph.d.
Professor Titular
Departamento de Bioquímica
Purdue University
175 S. University Street
West Lafayette IN 47907-2063
Email: hweiner@purdue.edu
stePhena. WoskI, Ph.d.
Professor Associado
Departamento de Química
Box 870336
University of Alabama
Tuscaloosa, AL 35487-0336
Email: swoski@bama.ua.edu

Agradecimentos
A sétima edição do Manual de Bioquímica com
Correlações Clínicas foi possibilitada pelos esforços e
encorajamento de muitas pessoas, e eu estendo a todos
meus sinceros agradecimentos. Sou muito grato a cada
um dos coautores por aceitarem o desafio de preparar
os capítulos, compartilhar suas idéias para aprimorar
o livro, imediatamente aceitarem sugestões para modi
ficar suas contribuições, e cooperarem durante toda a
preparação. A cada um, apresento minha mais profun
da admiração por um trabalho bem feito. Os coautores
e eu apresentados um especial agradecimento a nossos
ex-professores, colegas e estudantes por seu suporte e
inspiração, que tornaram este texto possível.
Na preparação desta edição, capítulos da 6ª edição
foram criticamente revisados por: Dr. David J Edwards,
University of Pittsburg, Dr. Kevin Gaston, University of
Bristol, UK, Professor James J. A. Heffron, University
College Cork, Irlanda, Dr. Thomas E. Smith, Howard
University, Dr. Frank Vella, University of Saskatchewan,
e Dr. Edward J. Wood, University of Leeds, UK. Nós, os
coautores e eu, somos muito agradecidos a eles; seus
excelentes comentários e sugestões foram a base para
as principais mudanças na sétima edição. Com pesar,
menciono o falecimento do Dr. Edward J. Wood em de
zembro de 2008; perdemos um dedicado e inspirador
colega. Nossa gratidão é estendida ao Dr. Emmanuel
Skordalakes, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, por
fornecer um modelo de um complexo parcial de elonga
ção da telomerase para a capa.
Manifesto minha mais sincera admiração e agrade
cimentos aos membros do quadro da Higher Education
Division da John Wiley & Sons por sua participação na
produção desta edição. Tem sido um prazer trabalhar
com um grupo de indivíduos extremamente inteligen
tes, profissionais e encorajadores. Minha mais profunda
gratidão é estendida a Joan Kalkut, Editor de Bioquími
ca, que paciente e conscientemente me guiou durante a
produção desta edição, e coordenou minhas atividades.
Joan fez muitas sugestões valiosas e estava sempre dis
ponível para responder minhas perguntas. Estendo mi
nha apreciação a Kaye Pace, Vice-Presidente e Editora
Executiva para Ciências, por seu comprometimento com
o projeto. Sou grato a Petra Recter, Editora Associada
de Química e Física, Micheline Frederick, Gerente de
Produção, e Kerry Weinstein, Editor Sênior de Produ
ção, por seus esforços; todos demonstraram os mais
altos padrões de profissionalismo. Um agradecimento
especial a Hilary Newman, Gerente, Departamento de
Foto, e muito obrigado a Yelena Zolotorevskaya, Assis
tente do Programa Editorial, que lidou eficientemente
PrefáCIo • XXXIX
com detalhes administrativos. Estendo minha profun
da apreciação a Marc Wezdecki, Editor de Mídia, e Ke
vin Murphy, Designer Sênior, e Hope Miller, designer
que criou a capa. O design atraente das páginas foi cria
do por Laura Ireardi, a quem apresento agradecimentos
especiais. Marketing teve um papel importante no de
sign do livro e eu apresento minha mais profunda admi
ração a Kristine Ruff por sua inestimável colaboração.
A edição e composição desta edição foram respon
sabilidade de MPS Content Services, Macmillan Pu
blishing Solutions. Quero expressar meus agradecimen
tos especiais a John Sollami, Vice-Presidente, Onshore
Content Services, por seu suporte e aconselhamento.
John e eu trabalhamos juntos na quarta edição, e foi
um privilégio poder interagir com ele novamente. Nós
queremos agradecer a Pat O’Maley, Diretor de Opera
ções, que foi responsável por supervisionar essa fase do
projeto. A pessoa responsável pelas atividades do dia
a dia da produção foi Edward Dionne, Gerente de Pro
jeto, que paciente e meticulosamente supervisionou a
transformação de nossos manuscritos em páginas. Ed
me manteve bem informado, gerenciou os muitos de
talhes envolvidos, acionou prontamente minhas suges
tões e preocupações, e nos manteve no prazo. Foi um
prazer trabalhar com um profissional tão eficiente, res
ponsável e consciencioso, além de ser uma pessoa muito
agradável; apresento minha profunda gratidão a ele. O
excelente copy-editing do manuscrito foi completado
por Carol A. Loomis, e o Índice foi preparado por Diana
Witt; a ambas, meus sinceros agradecimentos.
Eu cometeria um erro se não agradecesse aos mem
bros da STM Division da John Wiley, que guiaram a
preparação dos manuscritos e me deram assistência
e suporte inestimáveis. Meu especial agradecimento a
Michael Forster, Vice-Presidente e Diretor de Edição
Associado, Ciências Físicas, Wiley-Blackwell, por seu
apoio contínuo, e Darla P. Henderson, Editor Sênior de
Aquisições, Anita Lekhwani, Editora Sênior de Aquisi
ções, e Revekah Amos, Assistente Editorial Sênior, que
foram um apoio constante e tiveram um papel impor
tante e valioso na realização da sétima edição.
Finalmente, uma nota muito especial de gratidão à
minha esposa, Marjorie, que teve a sabedoria muitos
anos atrás de me encorajar a iniciar a preparação de
um livro, que me apoiou durante os dias de intenso tra
balho, e que criou um ambiente no qual pude devotar
as muitas horas necessárias à preparação deste livro. À
Marjorie, meu mais profundo e sincero muito obrigado.
thoMas M. deVlIn
XL • Manual de BIoquíMICa CoM Correlações ClínICas
1
PARTE I
ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS
Estrutura da
Célula Eucariótica
Thomas M. Devlin
Professor Emérito, College of Medicine – Drexel University
CONTEÚDO
1.1 CÉLULAS SÃO A BASE DOS ORGANISMOS VI
VOS, 2
1.2 O AMBIENTE DAS CÉLULAS: ÁGUA E SOLU
TOS, 3
1.3 PH, ÁCIDOS FRACOS E SUAS BASES CONJUGA
DAS, 6
1.4 EUCARIOTOS: CÉLULAS E TECIDOS DE MAMÍ
FEROS, 11
1.5 FUNÇÕES DE ORGANELAS SUBCELULARES
E SISTEMAS DE MEMBRANAS EM CÉLULAS
EUCARIÓTICAS, 14
1.6 INTEGRAÇÃO E CONTROLE DAS FUNÇÕES
CELULARES, 23
Conceitos Chaves
• Todos os organismos vivos são compostos por célu
las individualizadas, delimitadas por uma membra
na externa lipídica. As células podem apresentar
uma variedade de estruturas internas.
• Células vivas incluem archea, eubactérias e euca
riotos. Organismos multicelulares podem ter uma
variedade de células especializadas.
• As células são capazes de se replicar e controlar
seu ambiente interno, utilizando materiais para a
produção de energia e para a síntese das moléculas
necessárias.
CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 1
δ–
δ+
H
104,5o
H
δ+
CORRELAÇÕES CLÍNICAS
1.1 Condições Médicas Anormais Refletidas no pH do
Sangue, 7
1.2 Importância do HCO–3 do Sangue na Acidose Meta
bólica, 11
1.3 Envelhecimento Acelerado e o Núcleo Celular, 16
1.4 Doenças Mitocondriais, 19
1.5 Enzimas Lisossomais e Gota, 20
1.6 Deficiência da Lipase Ácida Lisossomal, 21
1.7 Doenças da Biogênese de Peroxissomos (PBD), 22
• A água é um componente essencial das células. Mo
léculas de água formam pontes de hidrogênio entre
si e com outras moléculas.
• Ácidos fracos e grupamentos acídicos de macromo
léculas permitem que a célula controle sua concen
tração interna de íons hidrogênio (pH).
As células de mamíferos são compartimentaliza
•
das em diversas estruturas intracelulares, cada
qual com funções específicas.
As funções das células são integradas e podem ser
•
controladas tanto por mecanismos intracelulares
quanto por influências extracelulares.
2 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
1.1 CÉLULAS SÃO A BASE DOS
ORGANISMOS VIVOS
A base de todos os organismos vivos, do mais simples
ao mais complexo, é uma unidade de espaço delimitada
por membrana. Tal unidade é a definição de célula. O
espaço compreendido em seu interior pode apresentar
de 10 a 10.000 micrômetros de diâmetro, com graus va
riáveis de complexidade interna, dependendo do orga
nismo em questão. As células existem como organismos
unicelulares independentes, a exemplo das bactérias, e
como organismos multicelulares, como o homem, com
mais de 100 trilhões de células. Independentemente da
complexidade do organismo, todas as células apresen
tam as seguintes características em comum:
• Muitos dos mesmos íons inorgânicos e das molé
culas orgânicas, incluindo carboidratos, lipídeos e
macromoléculas, como proteínas e ácidos nuclei
cos.
• Uma membrana celular externa, denominada
membrana plasmática, composta por moléculas
anfipáticas (fosfolipídeos e proteínas). Essa mem
brana delimita o espaço ocupado pela célula, sepa
rando um ambiente externo variável e potencial
mente hostil de um meio intracelular relativamente
constante.
• Sistemas que permitem a comunicação entre os
meios interno e externo.
• A capacidade de transformar fontes externas de
energia em energia capaz de alimentar as reações
endergônicas que ocorrem em seu interior. Essas
fontes externas incluem a luz, as moléculas orgâni
cas e os gradientes de concentração de moléculas
existentes através da membrana.
• A capacidade de converter nutrientes ingeridos
em constituintes celulares e de eliminar materiais
degradados e potencialmente tóxicos. Todas essas
reações são catalisadas por enzimas, que são cata
lisadores proteicos.
• A capacidade de sintetizar macromoléculas, como
ácidos nucleicos e proteínas.
• Um genoma composto por ácido desoxirribonu
cleico (DNA), que contém as instruções para todo
o funcionamento celular.
• A capacidade de se replicar, transferindo à progê
nie as informações genéticas hereditárias.
Há mais de 3,7 bilhões de anos, sob condições não
inteiramente claras e numa faixa de tempo difícil de
compreender, os elementos hidrogênio, oxigênio, nitro
gênio, enxofre e fósforo formaram compostos químicos
simples. Estes se combinaram, dispersaram e recombi
naram, formando várias moléculas maiores, até surgi
rem estruturas capazes de replicação. Não há registros
conclusivos, entretanto, quanto às condições ambientais
que permitiram essa reações. Com a contínua formação
de moléculas ainda mais complexas, aquelas que tinham
capacidade de se autorreplicar tornaram-se envolvidas
por membranas para formar células. Com a passagem
do tempo, essas formas de vida simples evoluíram para
a célula que se tornaria o “último ancestral comum” de
todos os milhões de espécies e subespécies da Terra, in
cluindo o homem. O “último ancestral comum” de todos
os homens surgiu há cerca de 450 milhões de anos. A
evolução dos organismos ainda continua. A vasta diver
sidade de vida observada hoje, da mais simples bactéria
a organismos complexos multicelulares como plantas e
animais, é produto dessas mudanças evolutivas.
Classificação das Células Vivas
Todos os organismos são agrupados em um dos três
grandes domínios: Archea, Eubacteria e Eucaryota.
Há evidências de que todos os três tenham se deriva
do de um ancestral comum desconhecido. As arqueias,
que provavelmente são o domínio mais primitivo, e as
eubactérias, que incluem as bactérias comuns, são clas
sificadas como procariotos, uma vez que apresentam
muitas estruturas em comum, incluindo a ausência de
um núcleo definido ou de estruturas internas envoltas
por membranas. Geralmente, esses organismos são uni
celulares (Figura 1.1a), mas, em alguns casos, formam
colônias ou filamentos. Os procariotos apresentam uma
variedade de formas e tamanhos e podem viver sob
condições diversas, algumas extremas. A membrana
plasmática é frequentemente invaginada. O DNA dos
procariotos é uma fita circular única e comumente fica
segregada em uma discreta massa, a região nucleoide,
que não é envolta por membrana ou envelope. Ainda
que sem compartimentos definidos por membranas, o
meio intracelular dos procariotos é organizado em com
partimentos funcionais.
Nos eucariotos estão inclusos organismos unicelula
res, como leveduras e fungos, e multicelulares, a exem
plo das plantas e dos animais. O volume de suas células
é 1.000 a 10.000 vezes maior do que o da maioria dos
procariotos. Possuem uma membrana bem definida que
envolve o núcleo, contendo a maior parte do DNA celular,
e várias estruturas intracelulares e organelas envoltas
por membrana (Figura 1.1b). Os sistemas de membranas
intracelulares definem distintos compartimentos sub
celulares (p. 14), permitindo um grau singular de orga
nização subcelular. Por meio da compartimentalização,
diferentes reações químicas, que requerem diferentes
ambientes, podem ocorrer simultaneamente.
Os elementos químicos básicos e as reações quími
cas fundamentais de todas as células, procarióticas ou
eucarióticas, são muito semelhantes. Por outro lado, há
diferenças significativas na composição química e nas
atividades bioquímicas.

(a)
NUCLEO
(b)
FIGURA 1.1 Organização de células procariótica e
eucariótica.
(a) Micrografia eletrônica de Escherichia coli, um procarioto
representativo; aumento aproximado × 30.000. Há pouca orga
nização intracelular aparente e nenhuma organela delimitada
por membrana. A cromatina está condensada em um nucleoi
de, mas não envolto por uma membrana. Células procarióticas
são muito menores do que células eucarióticas. (b) Micrografia
eletrônica de um corte fino de uma célula do fígado (hepató
cito de rato), uma célula eucariótica representativa; aumento
aproximado × 7.500. Note a membrana nuclear distinta, dife
rentes organelas delimitadas por membranas ou vesículas e
extenso sistema de membranas.
Fotografia (a) gentilmente fornecida por Dr. M. E. Bayer, Fox
Chase Cancer Institute, Philadelphia, PA. Fotografia (b) reim
pressa com permissão de Dr. K. R. Porter, de: Porter, K. R. e
Bonneville, M. A. em: Fine Structure of Cells and Tissues.
Philadelphia: Lea & Febiger, 1972.
CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 3
Por exemplo, procariotos não possuem histonas, uma
classe de proteínas muito conservadas em todos os euca
riotos, que se complexam com o DNA (p. 54). Há também
diferenças no conteúdo enzimático e nos complexos ácido
ribonucleico-proteína chamados ribossomos, envolvidos
na biossíntese de proteínas. A universalidade de muitos
fenômenos bioquímicos permite muitas extrapolações de
procariotos para eucariotos, incluindo o homem.
A ênfase deste livro é dada à bioquímica de eucario
tos, particularmente mamíferos, mas grande parte do
nosso conhecimento da bioquímica de células vivas veio
de estudos de células procarióticas e de células eucarió
ticas de não mamíferos.
1.2 O AMBIENTE DAS CÉLULAS:
ÁGUA E SOLUTOS
A vida como conhecemos existe por causa da água,
um componente comum a todas as células e seu am
biente extracelular.
Pontes de Hidrogênio Formam-se
entre Moléculas de Água
A interação dinâmica de moléculas individuais de
água leva a uma “estrutura dinâmica da água” em sis
temas aquosos. Uma molécula de água se forma quando
dois átomos de hidrogênio compartilham seus elétrons
com um par de elétrons não-compartilhados de um áto
mo de oxigênio (Figura 1.2). A água é uma molécula
polar porque o núcleo do oxigênio exerce uma atração
mais forte sobre os elétrons compartilhados do que o
hidrogênio, e os núcleos de hidrogênio carregados posi
tivamente ficam com uma parte desigual dos elétrons.
Isso cria uma carga positiva parcial em cada hidrogê
nio e uma carga negativa parcial no oxigênio. O ângulo
da ligação entre os hidrogênios e o oxigênio é 104,5°,
tornando a molécula eletricamente assimétrica e pro
duzindo um dipolo elétrico.
As moléculas de água interagem entre si porque os
átomos de hidrogênio de uma molécula, carregados po
sitivamente, são atraídos por um átomo de oxigênio de
outra molécula, carregado negativamente, com a for
mação de uma ligação fraca entre as duas moléculas
(Figura 1.3a). Essa ligação, indicada por uma linha tra
cejada, é uma ponte de hidrogênio. Estudos recentes,
entretanto, sugerem que a ligação entre duas moléculas
de água é parcialmente covalente. As pontes de hidro
gênio são relativamente fracas, se comparadas com as
ligações covalentes, porém seu grande número é a ra
zão para a estabilidade da água líquida. Uma discussão
detalhada das interações não covalentes, incluindo ele
trostáticas, van der Waals e hidrofóbicas, entre molécu
las é apresentada na página 116.
4 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
δ–
O moléculas e sobre a superfície de membranas lipídicas,
H H
104,5o
δ+ δ+
FIGURA 1.2 Estrutura de uma molécula de água.
O ângulo da ligação H—O—H é 104,5°. Os dois átomos de hi
drogênio carregam uma carga positiva parcial, e o oxigênio,
uma carga negativa parcial, criando um dipolo.
Cinco moléculas de água formam uma estrutura te
traédrica por pontes de hidrogênio (Figura 1.3b), com
cada oxigênio compartilhando seus elétrons com quatro
átomos de hidrogênio, e cada hidrogênio compartilhan
do seus elétrons com outro oxigênio. Uma estrutura em
rede tetraédrica é responsável pela estrutura cristalina
do gelo. Na transição de gelo para água líquida, apenas
algumas pontes de hidrogênio são quebradas. A água
líquida tem uma estrutura que varia rapidamente, à me
dida que pontes de hidrogênio se quebram e novas se
formam; a meia-vida das pontes de hidrogênio na água
é menor do que 1 × 10–11 s. Assim, a água líquida está
em constante mudança, com uma variedade de estrutu
ras contendo muitas moléculas de água sendo continu
amente formadas e modificadas. Em nível molecular, a
água é heterogênea, com estruturas dinâmicas conten
do grupos (clusters) de tamanhos variáveis de molécu
las de água, envolvendo centenas de moléculas. Mesmo
a 100 °C, a água líquida contém um número significa
tivo de pontes de hidrogênio, que respondem por seu
alto calor de vaporização. Na transformação do estado
líquido para vapor, pontes de hidrogênio são rompidas.
Muitos modelos da estrutura da água líquida foram pro
postos, mas nenhum deles explica adequadamente to
das as suas propriedades.
A estrutura da água pura é alterada quando seus
átomos fazem pontes de hidrogênio com outras estru
turas químicas. A interação das moléculas de água
com outras moléculas leva a uma mudança considerá
vel na orientação da água. Por exemplo, moléculas de
água próximas à superfície de membranas estão mais
ordenadas por causa da natureza anfifílica dos fosfoli
pídeos de membrana (p. 484). A água presente sobre
ou dentro de moléculas de proteínas e ácidos nucleicos
estabiliza essas macromoléculas. A estrutura da água
pode ser diferente no meio aquoso extracelular da do
meio intracelular, em virtude da diferença de compo
sição iônica.
As substâncias necessárias à existência das células
estão dissolvidas ou suspensas em um meio aquoso e
suas atividades são influenciadas pela organização das
moléculas de água. Microambientes com diferentes es
truturas de água são formados dentro de e sobre macro
em virtude da interação entre a água e grupos dessas
moléculas. A presença desses microambientes pode
levar a variações na atividade de íons e moléculas em
diferentes regiões da célula.
(a) H H
O
H
O
H
(b) H1HO
H
2
O
H H H
H
3O 4O 5O
H H H
FIGURA 1.3 Ponte de hidrogênio na água.
(a) Pontes de hidrogênio, indicadas por linhas tracejadas, en
tre duas moléculas de água. (b) Pontes de hidrogênio tetraé
dricas ligando cinco moléculas de água. Moléculas de água 1,
2 e 3 estão no plano da página, 4 está abaixo, e 5 está acima.
Pontes de hidrogênio também ocorrem entre outras
moléculas, além da água, sempre que átomos de oxigê
nio ou nitrogênio eletronegativos ficarem muito próxi
mos de hidrogênio covalentemente ligado a outro átomo
eletronegativo. Pontes de hidrogênio representativas
são apresentadas na Figura 1.4. Formação de pontes de
hidrogênio intramoleculares ocorre muito em macro
moléculas grandes, tais como proteínas e ácidos nuclei
cos, e é parcialmente responsável por sua estabilidade
estrutural.
Água tem Propriedades Singulares
como Solvente
A natureza polar e a capacidade de formar pontes de
hidrogênio são a base para a capacidade de a água dis
solver uma variedade de moléculas inorgânicas e orgâ
nicas. Moléculas polares, como sais, dispersam-se facil
mente em água. A estrutura cristalina de sais é mantida
por atração entre átomos ou grupos carregados positiva
e negativamente. Eles dissolvem-se na água porque as
forças eletrostáticas do cristal podem ser superadas
pela atração dos componentes carregados pelo dipolo
da água. A atração entre os átomos carregados Na+ e
 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 5

Cl– no NaCl é superada pela interação do Na+ com a car moléculas. Moléculas muito hidrofóbicas, como lipídeos
ga negativa de átomos de oxigênio da água, e Cl– com a contendo longas cadeias hidrocarbônicas, entretanto,
carga positiva dos átomos de hidrogênio. Em solução, os não se dispersam facilmente em moléculas individuais
íons individuais são circundados por uma capa de água. em água. Elas interagem entre si para excluir as molé
O número de interações fracas carga-carga entre a água culas polares de água (p. 483).
e os íons Na+ e Cl– é suficiente para manter a separação
física dos íons carregados.
Eletrólitos: Dissociação de Moléculas
H Grupo hidroxila
na Água
R O
Moléculas que se dissociam na água formam cátions
H (íons carregados positivamente) e ânions (íons carre
gados negativamente). São classificadas como eletróli
H O Água tos porque os íons facilitam a condutância de uma cor
rente elétrica. Açúcares ou alcoóis são não eletrólitos
porque se dissolvem facilmente na água, mas não têm
R C R' carga nem se dissociam em espécies carregadas.
Carbonila
Sais de metais alcalinos (p. ex., Li, Na e K) e ácidos
O
como o clorídrico e o sulfúrico em baixas concentra
H ções dissociam-se completamente quando dissolvidos
R O em água, mas não necessariamente em altas concen
R' Água trações. Considera-se que, em sistemas biológicos, tais
H
compostos, bem como os sais de ácidos orgânicos, este
jam totalmente dissociados em virtude de suas baixas
N CH R' Cadeia peptídica
concentrações. Se uma solução contiver vários sais di
O
C R"
ferentes (por exemplo, NaCl e K2SO4), essas moléculas
não existem como tais em solução, apenas os íons dis
H
sociados (por exemplo, Na+, K+ e SO42–) estão presentes.
Sais que se dissociam completamente são chamados
R C N CH R'
Cadeia peptídica de eletrólitos fortes. Na água, os ânions dissociados de
sais orgânicos reagem, até certo ponto, com prótons li
O R" vres (H+) da dissociação da água para formar o ácido
não-dissociado (Figura 1.5).
H
R C CH3 Ao contrário dos sais, muitos ácidos, quando dis
O N
C N C Timina no DNA solvidos em água, não se dissociam totalmente, mas
estabelecem um equilíbrio entre os componentes não
O -dissociados e dissociados. Assim, o ácido láctico, um
H C H H importante intermediário metabólico, dissocia-se par
NH cialmente em ânion lactato e um próton da seguinte
NC
forma:
Adenina no DNA
N C C
N
CH3—CHOH—COOH  CH3—CHOH—COO– + H+
N C Um equilíbrio dinâmico se estabelece no qual os
H
produtos da reação formam novamente o reagente não
FIGURA 1.4 Pontes de hidrogênio representativas de dissociado, enquanto outras moléculas se dissociam. O
importância em sistemas biológicos. grau de dissociação de tais eletrólitos depende da afi
nidade do ânion por H+. Haverá mais dissociação se as
forças fracas de dipolo da água que interage com o ânion
e o cátion forem mais fortes do que as forças eletrostá
Moléculas orgânicas não iônicas contendo grupos ticas entre o ânion e H+. Em base molar tais compostos,
polares fracos são também solúveis em água graças à chamados eletrólitos fracos, têm menor capacidade de
atração dos grupos polares por moléculas de água. Açú conduzir carga elétrica quando comparados com aque
cares e álcoois são facilmente solúveis por essa razão. les que se dissociam totalmente.
Compostos que contêm tanto grupos polares como apo
lares, isto é, moléculas anfipáticas, dispersam em água Na dissociação parcial de um eletrólito fraco, re
se a atração do grupo polar pela água conseguir superar presentado por HA, a concentração das várias espécies
as interações hidrofóbicas das porções não polares das pode ser determinada pela equação do equilíbrio:
6 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

[H+][A−] em relação ao número de moléculas não-dissociadas.

Keq = [HA]
onde K!eq é uma constante física, A– representa o ânion
dissociado e os colchetes indicam a concentração
de cada componente em unidades como mol por litro
(mol/L ou M) ou milimoles por litro (milimol/L ou mM).
A atividade de cada espécie, em vez de na concentra
ção, deveria ser empregada na equação de equilíbrio,
mas como a maioria dos compostos de interesse em sis
temas biológicos está presente em baixa concentração,
o valor da atividade é próximo do da concentração. A
constante de equilíbrio, contudo, é indicada por K!eq
para indicar que é uma constante aparente, baseada em
concentrações. Uma vez que a dissociação de um ácido
aumenta com a elevação da temperatura, o valor de K!eq
também aumentará.
(1) CH3 CHOHCHOONa
Lactato de sódio
Na+ + CH3ÍonCHOHlactatoCOO–
(2) CH3 CHOH
Íon lactato
COO– + H+
(1.1) Portanto, a concentração de água, que é 55,5 M, pra
ticamente não é modificada pela dissociação e, assim,
é uma constante. A Equação 1.2 pode ser reescrita da
seguinte forma:
Keq× [H2O] = [H+][OH] (1.3)
K!eqda
iônico × [55,5]
água. éSeu
umavalor
constante
a 25 °Ceéé1chamada
× 10–14. Em
produto
água
pura, a concentração de H+ é igual à de OH–, e substi
tuindo-se [H+] por [OH–] na Eq. 1.3, [H+] é 1 × 10–7 M.
Do mesmo modo, [OH–] também é 1 × 10–7 M. A reação
de equilíbrio de H2O, H+ e OH– sempre existe em so
lução, independentemente da presença de substâncias
dissolvidas. Se [H+] estiver aumentado, como acontece
quando se adiciona um ácido, uma diminuição na [OH–]
deve ocorrer para satisfazer a relação de equilíbrio da
água. Da mesma forma, se a [OH–] aumentar, [H+] di
minuirá. Usando a equação do produto iônico, [H+] ou
[OH–] podem ser calculadas se a concentração de um
íon for conhecida. A importância dos íons hidrogênio
em sistemas biológicos ficará clara nas discussões sobre
atividade enzimática (p. 401) e metabolismo.

CH3 CHOHCOOH
Ácido lactico
1.3 pH, ÁCIDOS FRACOS E SUAS
FIGURA 1.5 Reações que ocorrem quando lactato de
sódio é dissolvido em água. BASES CONJUGADAS
A partir da equação da dissociação, fica evidente que Por conveniência, [H+] é geralmente expresso em
K!eq será um número pequeno se o grau de dissociação termos de pH, definido como:
de uma substância for pequeno (denominador grande
na Equação 1.1), mas grande se o grau de dissociação pH = log[H1 (1.4)
for grande (denominador pequeno). Uma K!eq não pode −]
ser determinada para eletrólitos fortes porque, no equi
líbrio, não há soluto não-dissociado. Em água pura, [H+] e [OH–] são ambos 1 × 10–7 M, e o
pH = 7,0 · [OH–] pode ser expressa como pOH e tem um
valor de 7. Pela equação que descreve a dissociação da
Água É um Eletrólito Fraco água, 1 × 10–14 = [H+][OH–]; passando para o logaritmo
negativo dos dois lados, a equação fica 14 = pH + pOH. A
Água dissocia da seguinte forma: Tabela 1.1 apresenta a relação entre pH e [H+].
HOH  H+ + OH– Valores de pH de diferentes fluidos biológicos são
apresentados na Tabela 1.2. No plasma sanguíneo, [H+]
Os prótons que se dissociam interagem com o oxi
é 0,00000004 M, ou um pH de 7,4. Outros cátions, como
gênio de outra molécula de água, formando grupos
Na+ e K+, estão entre 0,001 e 0,10 M, bem mais do que
(clusters)
determinou
quentementedeser
representada
moléculas
de 6 a 27.deEssa
como
água, H3O+, O)n
hidratação
H+(H2 o íon
, onde
hidrônio.
n se
10.000 vezes [H+]. A Correlação Clínica 1.1 descreve a
de H+ é fre
importância das mudanças do pH sanguíneo.
É uma prática geralmente aceita, e que será empregada As definições de um ácido como doador de prótons
neste livro, apresentar o próton como H+ ao invés de e de uma base como aceptor de prótons, propostas por
química
H3O+, embora
real. Ase25reconheça
°C, o valor
que
deH+(H2
K!eq para
O)n dissociação
é a espécie Lowry e Brønsted, são convenientes quando se conside
ram sistemas biológicos. HCl e H2SO4 são definidos como
da água é cerca de 1,8 × 10–16: ácidos fortes porque se dissociam totalmente, liberando
prótons. OH– é uma base forte porque se associa pronta
[H+][OH−]
Keq = 1,8 × 10−16 = [H O] (1.2) mente com prótons disponíveis, formando H2O. Adição
2 de um ácido ou de uma base à água leva ao estabeleci
mento de um novo equilíbrio de OH– + H+  H2O.
Com K!eq tão pequena, um número extremamente
pequeno de moléculas de água realmente se dissocia,
 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 7

CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.1

Condições Médicas Anormais Refletidas no pH do Sangue

Em mamíferos, os diferentes pHs dos meios intra e
extracelulares estão em estado estacionário dinâmico,
com as mudanças que ocorrem em um, alterando a com
posição do outro. O pH sanguíneo reflete a mudança de
pH nos tecidos, e valores acima ou abaixo da faixa de
normalidade (pH de 7,35 a 7,45) indicam uma condição
potencialmente patológica. Valores de pH sanguíneo
abaixo de 7,0 (H+ = 0,0000001 M) ou acima de 7,8 (H+
= 0,000000016 M) são prejudiciais à vida, sendo neces
sária uma intervenção clínica. Muitas são as condições
que podem causar variações consideráveis no pH do
sangue. Acidose é o termo utilizado quando o pH san
guíneo cai abaixo de 7,35, e alcalose, quando se eleva
acima de 7,45. As condições que podem levar à acidose
ou à alcalose serão definidas posteriormente, com base
na origem do aumento de ácido ou de base no corpo,
devido a alterações metabólicas ou respiratórias.
Uma acidose metabólica pode se dar em virtude de
aumento na produção de ácidos orgânicos (p. ex.: ácido
láctico ou corpos cetônicos [p. 717]) ou perda de HCO3 –
do corpo. Excesso na produção de ácidos pode ocorrem
em diabetes, hipoxemia (p. ex., excesso de produção de
ácido láctico ocorre em corredores de longa distância),
e no metabolismo de xenobióticos que produzem ácidos.
Perda de HCO3–, que muda o equilíbrio de base e ácido,
ocorre em diarrei severa, uremia e doenças renais crôni
cas. Uma acidose respiratória ocorre quando há retenção
de CO2, o anidrido do H2CO3, e é causada por condições
que restringem a exalação de CO2 dos pulmões, como
quando há acúmulo de fluidos nos pulmões em condições
como enfisema ou asma, restrição respiratória como em
traumas, poliomielite e obesidade severa.
As principais causas de alcalose metabólica são
retenção de HCO3– e ingestão de bases. Uma alcalose
respiratória ocorre por hiperventilação, em virtude de
histeria ou tensão, overdose de algumas drogas (p. ex.:
salicilatos) e febre.
A medição do pH do sangue para monitorar o estado
ácido-base é rotineira em muitas doenças porque, uma
diminuição ou um aumento descontrolado do pH san
guíneo pode levar a consequências rápidas e graves.
Preston, R. A. Acid-Base, Fluids, and Electrolytes Made Ri
diculously Simple. Miami, FL: Medmaster, 2002.

TABELA 1.1 Relações Entre [H+] e pH e [OH–] e pOH TABELA 1.2 pH de Alguns Fluidos Biológicos
[H+] (M) pH [OH–] (M) pOH Fluido pH
1,0 0 (1 × 10–14) 14 Plasma sanguíneo 7,4
0,1 (1 × 10–1) 1 (1 × 10–13) 13
Fluido Intersticial 7,4
(1 × 10–2) 2 (1 × 10–12) 12
Fluido intracelular
(1 × 10–3) 3 (1 × 10–11) 11 Citosol (fígado) 6,9
(1 × 10–4) 4 (1 × 10–10) 10 Matriz lisossomal abaixo de 5,0
(1 × 10–5) 5 (1 × 10–9) 9 Suco gástrico 1,5–3,0
(1 × 10–6) 6 (1 × 10–8) 8 Suco pancreático 7,8–8,0
(1 × 10–7) 7 (1 × 10–7) 7
Leite humano 7,4
(1 × 10–8) 8 (1 × 10–6) 6
Saliva 6,4–7,0
(1 × 10–9) 9 (1 × 10–5) 5
Urina 5,0–8,0
(1 × 10–10) 10 (1 × 10–4) 4
(1 × 10–11) 11 (1 × 10–3) 3
(1 × 10–12) 12 (1 × 10–2) 2 A maioria dos ácidos orgânicos encontrados nos
(1 × 10–13) 13 0,1 (1 × 10–1) 1 sistemas biológicos dissocia-se parcialmente, sendo
classificados como ácidos fracos. Eles estabelecem um
(1 × 10–14) 14 1,0 0 equilíbrio entre HA (doador de próton), um ânion (A–)
do ácido dissociado, e um H+, como se segue:
Quando um ácido forte e OH– se combinam, H+ do HA  A– + H+
ácido e OH– interagem quase totalmente e se neutra
lizam mutuamente. Ânions produzidos quando ácidos O ânion formado nessa dissociação é uma base por
fortes se dissociam, como Cl– do HCl, não são bases por que pode aceitar um próton e refazer o ácido. Um ácido
que não se reassociam com prótons em solução fraco e sua base (ânion) formados na dissociação são
8 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

designados como um par conjugado. Alguns pares con Um método conveniente de expressar a K!eq é na for
jugados de importância biológica são apresentados na ma de pK!, definido como:
Tabela 1.3. O íon amônio (NH4+) é um ácido fraco porque
se dissocia produzindo H+ e amônia (NH3) não-carre pK = log 1 (1.5)
um ácido
gada, umae base
o PO3–4 é uma base,
conjugada. masfosfórico
Ácido H2– e (H HPO 2–4 ) é
3PO
K eq

PO4 4são
Note a semelhança entre essa definição e a do pH;
ou base ou ácido, dependendo se o grupo fosfato estiver
como para pH e [H+], a relação entre pK! e K!eq é inver
aceitando ou doando um próton.
sa, e quanto menor K!eq, maior pK!. Valores representa
A tendência de um ácido conjugado liberar H+ pode tivos de K!eq e pK! para ácidos conjugados de importân
ser avaliada pela K!eq (Equação 1.1). Quanto menor o cia em sistemas biológicos são apresentados na Tabela
valor de K!eq, menor a tendência de doar um próton e 1.4. Detalhes do sistema ácido carbônico/bicarbonato
mais fraco é o ácido. Quanto maior o valor da K!eq, maior são apresentados em Um Olhar Mais Atento 1.1.
a tendência de dissociar e mais forte é o ácido. A água
é um ácido muito fraco, com K!eq de 1,8 × 10–16, a 25 °C.

TABELA 1.3 Alguns Pares Conjugados Ácido–Base de Importância em Sistemas Biológicos

Doador de Próton (Ácido) Aceptor de Próton (Base)
CH3—CHOH—COOH (ácido láctico)  H+ + CH3—CHOH—COO– (lactato)
CH3—CO—COOH (ácido pirúvico)  H+ + CH3—CO—COO– (piruvato)
HOOC—CH2—COOH
+H3 —COOH
—CH2(glicina) (ácido succínico)  H+
2H++++H3—COO– —CH2 (glicinato)
–OOC—CH2—COO– (succinato)
PO4
NCH2  H+ + H2PO4
N—CH2
–

H3 
H2PO–4  H+ + HPO42–
HPO2–4  H+ + PO3–4
Glicose 6-PO3H–  H+ + glicose 6—PO32–
H2CO3  H+ + HCO3–
NH4+  H+ + NH3
H2O  H+ +OH–

A Equação de Henderson– [ácidoconjugada]

[base conjugado] (1.7)
[H+]
1 = Keq
1 ·
Hasselbalch Define a Relação entre
pH e Concentrações de Ácido e Base Aplicando os logaritmos em ambos os lados teremos
= log1K
1eq + log[ácido
[base conjugada]
conjugado] (1.8)
Conjugados log[H1+]

Uma mudança na concentração de qualquer compo

nente de uma reação de equilíbrio requer uma mudança
concomitante de todos os componentes. Por exemplo,
um aumento em [H+] diminui a concentração de base
conjugada (p. ex., íon lactato) com um aumento equi
valente no ácido conjugado (p. ex., ácido láctico). Essa
relação é convenientemente expressa rearranjando-se
a equação de equilíbrio e resolvendo para H+, como
mostrado para a seguinte dissociação:
Ácido conjugado  base conjugada + H+
[H][base conjugada]
Keq =
[ácido conjugado]
A divisão da Equação 1.6 por [H+] e K!eq leva a
Como pH = log 1/[H+] e pK! = log 1/K!eq, a Equação
1.8 torna-se
pH = pK+log[ácido[baseconjugada]conjugado] (1.9)
A Equação 1.9, referida como a equação de Hender
son–Hasselbalch, é um modo conveniente de visualizar
a relação entre pH de uma solução e quantidades rela
tivas de base e ácido conjugados presentes. A Análise
da Equação 1.9 demonstra que, quando a razão entre
[base]/[ácido] é 1:1, o pH iguala-se ao pK! do ácido por
(1.6)
que log 1 = 0. Se o pH for uma unidade abaixo do pK!,
a razão [base]/[ácido] é 1:10, e se o pH for uma unidade
acima do pK!, a razão [base]/[ácido] é 10:1. A Figura 1.6
 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 9

TABELA 1.4 Constantes de Dissociação Aparentes e pK’ de Alguns Compostos de Importância em Bioquímica
Composto Estruturas K!eq (M) pK!
Ácido acético (CH3—COOH) 1,74 × 10–5 4,76
Alanina (CH3—CH—COOH) 4,57 × 10–3 2,34 (COOH)
|
NH3
2,04 × 10–10 9,69 (NH3+)

Ácido cítrico (HOOC—CH2—COH—CH2—COOH) 8,12 × 10–4 3,09

| 1,77 × 10–5 3,74
COOH 3,89 × 10–6 5,41
Ácido glutâmico (HOOC—CH2—CH2—CH—COOH) 5,62
6,45
2,14 × 10–5
10–3
10–10 2,19 (COOH)
|
NH3+
4,25 (COOH)
9,67 (NH3+)
Glicina (CH2—COOH) 4,57 × 10–3 2,34 (COOH)
|
NH
2,51 × 10–10 9,60 (NH3+)
3
+
Ácido láctico (CH3—CHOH—COOH) 1,38 × 10–5 3,86
Ácido pirúvico (CH3—CO—COOH) 3,16 × 10–3 2,50
Ácido succínico (HOOC—CH2—CH2—COOH) 6,46 × 10–5 4,19
3,31 × 10–6 5,48
Glicose 6-PO3H– C12H–
H11O5PO3 7,76 × 10–7 6,11
H2PO
H3 1,0 × 10–2 2,0
PO44– 2,0 × 10–7 6,7
2–
HPO4 3,4 × 10–13 12,5
H2CO3 1,7 × 10–4 3,77
NH4+ 5,62 × 10–10 9,25
H2O 1,8 × 10–16 15,74

UM OLHAR MAIS ATENTO 1.1

Ácido Carbônico (H2CO3) é um Ácido Fraco Importante na Homeostase de Animais

Ácido carbônico (H2CO3) é um ácido fraco impor
tante no controle do pH em mamíferos. O CO2 é cons
tantemente produzido em reações catabólicas nos teci
dos e é removido do corpo pelos pulmões, na expiração.
Medidas do CO2 sanguíneo são importantes para de
terminar o estado ácido/base dos pacientes. Condições
médicas que restringem a liberação de CO2 do corpo
levam a um acúmulo de H2CO3 e à condição de acidose
respiratória (Correlação Clínínica 1.1).
Dióxido de carbono, quando dissolvido em água,
está envolvido nas seguintes reações de equilíbrio:
CO2 + H2O K' H2CO3 K'
⇌2 ⇌1 H+ + HCO−3
Ácido carbônico tem um pK1 de 3,77, que é compará
vel ao de ácidos orgânicos como o ácido láctico. A equa
ção de equilíbrio para essa reação é
[H]+[HCO−3]
K2 = [H2
CO3]
H2CO3 está, entretanto, em equilíbrio com o CO2 dis
[H2CO3]
solvido, e a equação de equilíbrio para essa reação é
K2
= [CO2][H2
O]
Resolvendo a Equação 2 para H2CO3 e substituindo
por H2CO3 na Equação 1, as duas reações de equilíbrio
podem ser combinadas em uma equação:
[H+1][HCO−3]
K1 (3)
= K2[CO2][H2O]
Rearranjando para combinar constantes, incluindo
a concentração de H2O (55,5 M), simplifica a equação e
dá uma nova constante combinada, K!3, como se segue:
K1K2 = [H2O] = K3 = [H+[CO
][HCO
2 −3 ]
] (4)
É prática comum em medicina referir-se ao CO2 dis
solvido como o ácido conjugado; é o anidrido ácido do
H2CO3. O termo K!3 tem um valor de 7,95 × 10–7 e pK!3
= 6,1. Se o sistema aquoso estiver em contato com uma
fase aérea, CO2 dissolvido também estará em equilíbrio
com CO2 da fase
componente é, CO2Diminuição ou aumento de um
– istoaérea.
(1) H+
nentes.
ou HCOO sistema
–3 – causa COuma (ar), CO
alteração
2/HCO3– é 2 (dissolvido), H2CO3,
em todos os compo
extremamente impor
tante para manter pH e homeostase em animais. CO2 é
constantemente produzido em reações catabólicas em
tecidos e é removido pelos pulmões no ar expirado. Aci
(2) dose respiratória pode ser tanto uma condição aguda
(segurar a respiração) quanto crônica (pneumonia).
10 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

é um gráfico das razões de base conjugada para ácido das curvas de titulação individuais são semelhantes,
conjugado versus pH de vários ácidos fracos; observe mas deslocadas em virtude das diferenças nos valores
que as razões são apresentadas em escala logarítmica. de pK!. Há uma elevação íngreme no pH quando apenas
0,1 equiv de OH– é adicionado, mas entre 0,1 e 0,9 equiv
de OH– adicionado, a mudança de pH é de apenas ~2.
)
a
c
i Portanto, uma grande quantidade de OH– é adicionada,
m
t
m
HPO42– /H2PO4– com uma mudança relativamente pequena no pH. Isso é
ír
a
g100/1 Lactato/Láctico
chamado tamponamento, e é definido como a capacida
o NH3+
/NH4
l
a
l 10/1
de de uma solução resistir à mudança de pH quando se
a
c
s adiciona um ácido ou uma base. Se o ácido fraco não es
e
(]
o 1/1 tiver presente, uma pequena quantidade de OH– levaria
d
i
c
á
[/
a um pH muito alto, porque não haveria nenhuma fonte
] 1/10 de H+ para neutralizar o OH–.
e
s
a
b
[
r1/100
e
t A melhor faixa de tamponamento para um par con
n
e jugado é em pH próximo ao pK! do ácido fraco. Come
o
ã
z
a
0 2 4 6 8 10 12 14 çando com um pH uma unidade abaixo até uma unidade
R pH
acima do pK!, cerca de 82% de um ácido fraco em solu
ção se dissociará e, consequentemente, uma quantida
FIGURA 1.6 Razão de [base]/[ácido] conjugados em
função do pH. de de base equivalente a cerca de 82% do ácido original
Quando a razão [base]/[ácido] é 1, o pH iguala pK! do ácido pode ser neutralizada, com uma alteração no pH de 2.
fraco. As faixas máximas de tamponamento para pares con
jugados são consideradas entre 1 unidade de pH abaixo
s 1.0 e 1 unidade de pH acima do pK!. O par conjugado íon
o
d
a
n 0.8
o
lactato/ácido láctico, com pK! = 3,86, é um tampão efe
i
c
i tivo entre pHs 3 e 5, sem capacidade significativa de
d
a
E
e
s 0.6
tamponamento em pH = 7,0. O par HPO42–/H2PO4–, com
a pK′ = 3.86 pK′ = 9.25 pK! = 6,7, é um tampão efetivo em pH 7,0. Assim, no pH
b
e
d 0.4 do citosol celular (~7,0), o par íon lactato–ácido láctico
s
e
t não é um tampão efetivo, mas HPO42–/H2–
n
e
PO4 é.
l 0.2
a
v
i
u A capacidade de tamponamento também depende
q
0 2 4 6 8 10 12 14 da concentração de ácido e base conjugados. Quan
pH to maior a concentração de base conjugada, maior a
quantidade de H+ adicionado com o qual pode reagir.
FIGURA 1.7 Curvas de titulação ácido–base para ácido
Quanto mais ácido conjugado, mais OH– adicionado
láctico (pK! 3,86) e NH4+ (pK! 9,25).
Em pHs iguais aos respectivos valores de pK!, haverá quantida
pode ser neutralizado por dissociação do ácido. Um
de igual de ácido e base para cada par conjugado. caso assim é o plasma sanguíneo em pH 7,4. O pK! de
HPO42–/H2PO–4igual a 6,7 sugere que esse par conjugado
seria um tampão efetivo no plasma. A concentração do
par fosfato, entretanto, é baixa quando comparada à do
O Tamponamento É Importante para sistema
em concentração
HCO3–/CO2,20com pK! de 6,1, que está presente
Controlar o pH vezes maior. O sistema HCO–/CO32
contribui para a maior parte da capacidade de tampo
Quando NaOH é adicionado a uma solução de áci namento, apesar do seu valore de pK! ser 1,3 unida
do fraco, ele se dissocia totalmente e o OH– formado é des menor que o pH do plasma sanguíneo. Tanto pK!
neutralizado por H+ do ácido dissociado parcialmente quanto a concentração de um par conjugado devem ser
para formar H2O. A diminuição de [H+] causa maior dis considerados quando se avalia a capacidade de tampo
sociação do ácido fraco, para obedecer às exigências de namento. A maioria dos ácidos orgânicos é relativamen
sua reação de equilíbrio. A quantidade de ácido fraco te sem importância como tampão nos fluidos celulares
dissociado será tão próxima à quantidade de OH– adi porque seus valores de pK! são várias unidades de pH
cionado que é considerada igual. Assim, a diminuição menores que o pH da célula, e suas concentrações são
na concentração de ácido conjugado é igual à quantida
muito baixas em comparação com sistemas tampões
de de base conjugada formada, e a razão de [base con como HPO42–/H2PO–4 e HCO–/CO32.
jugada]/[ácido conjugado] do ácido fraco se altera. Os
eventos são representados em curvas de titulação de Um problema típico usando a equação de Hender
dois ácidos fracos, apresentadas na Figura 1.7. Quando son–Hasselbalch é apresentado em Um Olhar Mais
0,5 equivalentes (equiv) de OH– são adicionados, 50% Atento 1.2. Controle do pH e tamponamento no homem
do ácido fraco são dissociados, e a razão [ácido]/[base] é merecem muita ênfase; a Correlação Clínica 1.2 é um
1,0; o pH neste ponto é igual ao pK! do ácido. As formas problema representativo da prática médica.
 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 11

UM OLHAR MAIS ATENTO 1.2

Problemas de pH e Tamponamento
1. Calcule a razão HPO2–/H
4 2PO4– (pK = 6,7) nos pHs Solução: pH = pK + log[HCO−3]
5,7,6,7, e 8,7. [CO4]
[HPO2− 4 ] 8 mM
Solução: pH = pK + log 7,1 = 6,1 + log
[H2PO−4] [CO2]
5,7 = 6,7 + log da razão;
7,1 = 6,1 = 1 = log8 mM
Rearranjando, 5,7 – 6,7 = –1 = log da razão Rearranjando, [CO2]
2–
O antilog de –1 = 0,1 ou 1/10. Assim HPO4 /H2PO–4 O antilog de 1 = 10. Assim, 10 = 8 mM/[CO2]. Rear
ranjando,
razão
= 1/10no
nopHpH6,7
5,7.=Usando
1:1 e noopH
mesmo
8,7 =procedimento,
100:1. a
[CO2 8 mM
2. Se o pH do sangue é 7,1 e a concentração de HCO3– ]
= 10
(pK!
é 8 mM,
paraqual
HCO3–/CO2
é a concentração de CO2 no sangue = 0,8 mM
= 6,1)?

CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.2

Importância do HCO3– do Sangue na Acidose Metabólica

Tampões mantêm o pH do sangue em cerca de 7,40. 1. A equação de Henderson–Hasselbalch é

A produção celular de ácidos tende a acidificar o san pH = pK+log[HCO−3]
gue, sendo o H+ tamponado por várias bases, incluindo
[CO2]
HCO3–, hemoglobina e HPO42–. O pH sanguíneo diminui
rá à medida que as bases forem consumidas no processo pK! para [HCO3–]/[CO2] é 6,10.
de tamponamento. Se todas as bases forem consumi
das, não haverá mais capacidade de tamponamento e o 2. Substituindo os valores dados na equação
pH diminuirá progressivamente. As concentrações de [HCO−3]
7,03 = 6,10 + log 1,10 mM
HCO3– e de CO2, bem como o pH do sangue, são medi
das na prática médica, a fim de se determinar o estado
[HCO− 3]
ácido/base dos pacientes. Em uma acidose metabólica, ou 7,03 − 6,10 = 0,93 = log 1,10 mM
quando o pH sanguíneo é inferior a 7,35 (Correlação
Clínica 1.1), é importante monitorar o pH, bem como O antilog de 0,93 = 8,5; portanto,
verificar a quantidade de HCO3– capaz de ainda tampo [HCO−
nar a produção contínua de ácido. Utilizando-se a equa 3]
8,5= 1,10mM
ção de Henderson–Hasselbalch, com o conhecimento
de duas variáveis, a terceira pode ser calculada. ou [HCO3–] presente no sangue = 9,4 mM
Considere os valores sanguíneos de um paciente 3. Portanto, houve uma diminuição de 14,6 mmoles
com acidose metabólica de pH = 7,03 e [CO2] = 1,10 mM. de HCO3–/L de sangue. Se muito mais HCO–3 for
Os valores normais são pH = 7,40, [HCO3–] = 24,0 mM e perdido, esse importante tampão seria incapaz de
e quanto
[CO 2] = 1,20 mM. Qual
do [HCO –]3 é a [HCO–]3 no sangue do paciente tamponar mais ácido no sangue e o pH cairia ra
normal foi usado no tamponamento pidamente, provavelmente levando à morte do pa
do ácido que causou a condição? ciente

1.4 EUCARIOTOS: CÉLULAS E
TECIDOS DE MAMÍFEROS
Células eucarióticas contêm estruturas subcelulares
e organelas, como núcleo, mitocôndrias, lisossomos e
peroxissomos, todos formando compartimentos sub
celulares que são delimitados por uma membrana (Fi
gura 1.8). As membranas também formam uma rede
tubular por toda a célula, o retículo endoplasmático e
o complexo de Golgi, englobando um espaço interconec
tado ou cisternas, respectivamente. A natureza lipídica–
proteica de todas as membranas celulares (p. 482) impe
de o movimento rápido de muitas moléculas, incluindo
a água, de um compartimento para outro. Mecanismos
específicos de deslocamento em membranas controlam
12 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
FIGURA 1.8 A Célula de Mamífero.
(a) Micrografia eletrônica de uma célula de fígado de rato, marcada
para indicar os principais componentes estruturais de células eucarió
ticas e (b) desenho esquemático de uma célula animal. Note o número
e a variedade de organelas subcelulares e a rede de membranas inter
conectadas que delimitam canais ou cisternas. Nem todas as células
eucarióticas são tão complexas em sua aparência, mas a maioria con
tém as principais estruturas mostradas. ER, retículo endoplasmático;
G, Complexo de Golgi; Ly, lisossomo; P, peroxissomo; M, mitocôndria.
Fotografia (a) reproduzida com permissão de Dr. K. R. Porter de:
Porter, K. R., e Bonneville, M. A. em: Fine Structure of Cells and
Tissues. Philadelphia: Lea & Febiger, 1972; esquema (b) reproduzido
com permissão de: Voet, D., e Voet, J. G. Biochemistry, 2. ed., New
York, Wiley, 1995.
as concentrações de moléculas pequenas e grandes,
carregadas ou não-carregadas, nos vários comparti
mentos subcelulares. Portanto, a composição em íons
inorgânicos, moléculas orgânicas, proteínas e ácidos
nucléicos é diferente em diferentes organelas. O se
questro de substratos específicos, de cofatores e de
enzimas em espaços delimitados por membrana au
menta a eficiência metabólica e permite um maior
grau de controle dos processos biológicos.
A composição química, as atividades e as funções
dos diversos compartimentos celulares têm sido
estudadas por uma variedade de técnicas. Foram
empregados, com células intactas, métodos histo
químicos, imunológicos e de coloração fluorescente.
Foram usados métodos para observações contínuas
em tempo real de eventos intracelulares em células
viáveis. As mudanças de pH e de concentração de
íon cálcio são estudadas pelo uso de indicadores
íon-específicos. A localização celular de proteínas
específicas é determinada com anticorpos fluores
centes. Organelas individuais, membranas e com
ponentes do citosol podem ser isolados e analisados
após o rompimento da membrana plasmática. Técni
cas para romper a membrana plasmática incluem o
uso de choque osmótico, detergentes ou homogenei
zação dos tecidos. Na última técnica, forças de atri
to rompem a membrana plasmática. A centrifugação
diferencial permite a separação de componentes
celulares graças às diferenças em seus tamanhos e
densidades. Além disso, componentes de organelas,
como mitocôndrias e peroxissomos, podem ser iso
lados após o rompimento da membrana da organela.
A maioria das estruturas isoladas e frações ce
lulares parece reter as características químicas e
bioquímicas da estrutura in situ. Mas sistemas de
membranas biológicas estão sujeitos a danos, mesmo
em condições muito brandas, e mudanças na compo
sição ocorrem durante o isolamento. Danos a uma
membrana alteram suas propriedades de permea
bilidade e permitem a transferência de substâncias
que normalmente seriam excluídas pela barreira da
membrana. Além disso, muitas proteínas são fraca
mente associadas com as membranas e facilmente
se dissociam (p. 489).
Células de Mamíferos
Os mamíferos são um dos mais complexos orga
nismos multicelulares; há mais de 5.400 espécies
nessa classe de vertebrados. Eles não são apenas
multicelulares, mas as células de cada órgão dos sis
temas (fígado, rim, cérebro etc.) são especializadas
para desempenhar funções específicas. Muitos dos
órgãos individuais consistem de vários tipos celula
res diferentes, cada qual com um papel específico.
Existem mais de 200 tipos diferentes de células no
homem, determinados por seus atributos físicos e

químicos. Estes variam desde células individuais, como
leucócitos no sangue, até células agrupadas em órgãos,
como neurônios no sistema nervoso. Com exceção dos
eritrócitos maduros, que não contêm DNA, todas as
células em um indivíduo contêm informação genética
idêntica no seu DNA. Só a informação necessária para
as funções de uma célula individual é expressa. No perí
odo após a fertilização de um ovo, algumas células, cha
madas células-tronco embrionárias, têm o potencial de
se desenvolver em todas as células de todos os órgãos
no organismo adulto. Estas são células pluripotentes.
Tecidos diferenciados contêm células multipotentes,
que podem se diferenciar em um número limitado de
diferentes tipos celulares. Estudos recentes demons
traram que o genoma de células diferenciadas pode ser
reprogramado para formar células multipotentes ou
pluripotentes. Assim, a informação genética para o de
senvolvimento em células diferenciadas não é perdida
irreversivelmente, mas apenas suprimida.
Todas as células de mamíferos, independente do te
cido de origem e do grau de especialização, têm muitas
propriedades físicas, químicas e bioquímicas em comum.
Atividades e componentes de células de um órgão de
uma espécie de mamífero serão muito semelhantes, se
não idênticas, àquelas do mesmo órgão de alguma outra
espécie. Em um mamífero, incluindo o homem, a mesma
proteína ou enzima está presente em células de muitos
tipos celulares diferentes (p. ex., músculo e fígado), mas
frequentemente existem marcadas diferenças na quanti
dade (p. ex., concentração). Uma via metabólica em par
ticular pode ser muito importante em um tipo celular,
mas menos importante em outro. Essas diferenças são
devidas a variações nas necessidades das células espe
cializadas individuais; essas diferenças são controladas
pela expressão do genoma nos diversos tipos celulares.
Todos os componentes das células estão em equilí
brio dinâmico, sendo sintetizados e degradados, crian
do um estado estacionário de concentração celular des
sas substâncias. Esse estado dinâmico varia entre os
tipos de células de mamíferos. Essas vias catabólicas
(degradativas) e anabólicas (de síntese) são reguladas
para manter o balanço correto de intermediários e pro
dutos químicos. Em muitos casos, controle é exercido
por sinais químicos gerados intracelularmente. Mamí
feros também têm sistemas de sinalização complexos e
integrados para transmitir informações entre tipos ce
lulares (p. 526). Tais vias incluem síntese e liberação de
moléculas sinalizadoras de um tipo celular, transporte
para células em outro sistema do órgão, e reconheci
mento específico do sinal pelas células-alvo. Na maioria
dos casos, a molécula sinalizadora não afeta todos os ti
pos celulares. Um exemplo é o papel dos hormônios (p.
ex., insulina), sintetizados por células do sistema endó
crino e capazes de alterar o metabolismo da glicose no
sistema muscular.
Como indicado, a principal diferença entre procario
tos e eucariotos é a presença de sistemas de membrana
CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 13
intracelulares e organelas nos eucariotos. Isso permite
outro nível de facilitação e controle das reações quími
cas catalisadas por enzimas. Por exemplo, por manter
uma via metabólica contida no interior de uma organela
(p. ex., mitocôndria), a concentração de intermediários
químicos pode ser maximizada para facilitar o rendi
mento da via ou da reação. Se esse não fosse o caso,
a quantidade total de reagentes necessários na célula
deveria ser muito maior para se conseguir o mesmo ren
dimento.
Composição Química de Células de
Mamíferos
Os componentes químicos básicos das células bio
lógicas são apresentados na Tabela 1.5. Em tipos dife
rentes de células de mamíferos, as concentrações intra
celulares de íons inorgânicos são muito similares, mas
muito diferentes daquela encontrada no meio extrace
lular. Uma aproximação da composição iônica do fluido
intracelular, considerado como representante primário
do citosol, comparada ao plasma sanguíneo é apresen
tada na Figura 1.9. O volume e o grau de hidratação das
células são dinâmicos e, portanto, essas concentrações
são apenas estimativas das concentrações reais. Na+ é
o principal cátion extracelular, com uma concentração
de ~140 meq/L (mM); muito pouco Na+ está presente no
líquido intracelular. K+ é o principal cátion intracelular.
Mg2+ está presente em ambos os compartimentos, extra
e intracelular, em concentrações muito inferiores às de
Na+ e K+. Os principais ânions extracelulares são Cl– e
HCO3–, com menores quantidades de fosfato e sulfato.
A maioria das proteínas tem carga negativa em pH 7,4
(p. 90), sendo ânions no pH dos fluidos teciduais. Os
principais ânions intracelulares são fosfato inorgânico,
fosfatos orgânicos e proteínas. Outros ânions e cátions
inorgânicos e orgânicos estão presentes em concentra
ções bem abaixo do nível de meq/L. Exceto por dife
renças muito pequenas criadas por membranas e que
levam ao desenvolvimento de potenciais de membrana,
a concentração total de cátions iguala a concentração
total de ânions nos diferentes fluidos.
TABELA 1.5 Componentes Químicos das Células
Variação de Pesos
Componente Moleculares
H2O 18
Íons
Na+,
inorgânicos
K+, Cl–, SO4 23–100
2–, HPO2–4 HCO–,3
Ca2+, Mg2+ etc.
Moléculas orgânicas pequenas 100–1.200
Carboidratos, ácidos orgânicos,
lipídeos, nucleotídeos, peptídeos
Macromoléculas 6.000–1.000.000
Proteínas, polissacarídeos, ácidos
nucleicos
14 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

180
190
200 H•HCO3
As concentrações intracelulares da maioria das mo
HCO3 – léculas orgânicas de baixo peso molecular, como açú
Não eletrólitos Cl– ? cares, ácidos orgânicos, aminoácidos e intermediários
160
170
fosforilados, estão na faixa de 0,01–1,0 meq/L, mas al
H•HCO3 gumas são significativamente menores. Coenzimas,
o
c
i
– n
â
moléculas orgânicas necessárias à atividade de algu
150 HCO3 g
r
o
mas enzimas, estão na mesma faixa de concentração.
140 K+ e As concentrações celulares gerais de substratos para as
o
c
i
130 n enzimas são relativamente baixas em comparação com
â
g
ronisotafso
120
110 íons inorgânicos; a localização em organelas específicas
ou microambientes celulares, entretanto, pode aumen
tar significativamente suas concentrações.
100
1–Lqe
90 Na+ F
Não tem muito sentido determinar a concentração
m
80 Cl– molar de proteínas individuais nas células. Em muitos
70 SO42– casos, elas se localizam em estruturas específicas ou
40
50
60 ficam combinadas com outras proteínas, criando uni
dades funcionais. É num compartimento restrito que
? Na+
a
n
í
proteínas individuais desempenham suas funções, se
e
t
HPO4
2–
o
r
jam elas estruturais, catalíticas ou regulatórias. É inte
2–
SO 4 P ressante que o plasma sanguíneo contenha milhares de
20
30 K+ Org ACID proteínas distintas, cujas concentrações vão de cerca
n
i
e
10 Ca2+ t
o
r
de 10–3 M (albumina) a 10–13 M (hormônio da parati
Mg2+ P reoide), com algumas proteínas em concentrações ain
sanguíneo
Plasma Fluido da menores.
celular

FIGURA 1.9 Principais constituintes químicos do plasma

sanguíneo e do fluido celular.
Altura da metade esquerda de cada coluna indica concentração
total de cátions; a da metade direita, concentrações de ânions.
Ambos são expressos em miliequivalentes por litro (meq/L) do
fluido. Note que os valores de cloreto e sódio no fluido celular
são questionados. É provável que, pelo menos no músculo, o
citosol contenha algum sódio, mas não cloreto.
Adaptado de: Gregersen, M. I. Em: P. Bard (Ed.), Medical
Physiology, 11. ed., St. Louis, MO; Mosby, 1961, p 307.
1.5 FUNÇÕES DE ORGANELAS
SUBCELULARES E SISTEMAS
DE MEMBRANAS EM
CÉLULAS EUCARIÓTICAS
As organelas têm funções muito específicas, e suas
atividades enzimáticas servem como marcadores da
organela durante o isolamento. Algumas vias metabó
licas estão localizadas em um único compartimento
celular. Por exemplo, o ciclo dos ácidos tricarboxílico
(p. 570) ocorre inteiramente no interior das mitocôn
drias, a glicólise no citosol (p. 612) e a replicação do
DNA no núcleo e nas mitocôndrias. Algumas vias estão
divididas entre duas localizações, com os intermediá
rios da via difundindo ou sendo transportados de um
compartimento para outro. As enzimas para a síntese
do heme (p. 814) estão divididas entre as mitocôndrias
e o citosol.

Um resumo das funções das principais estruturas

FIGURA 1.10 Membrana plasmática de uma célula de
mamífero.
Micrografia eletrônica da membrana plasmática de um eritró
cito.
Cortesia de J. D. Robertson, Duke University, Durham, NC.
das células eucarióticas é apresentado na Tabela 1.6,
e as estruturas são identificadas na Figura 1.8. Com a
capacidade de inativar seletivamente ou deletar genes
específicos em animais (p. 303), condições patológicas
e doenças foram identificadas envolvendo a maioria das
organelas e estruturas celulares. Em muitos casos, en
tretanto, os detalhes bioquímicos que levam às conse
quências de um gene modificado ainda não foram de
terminados.
 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 15

Membrana Plasmática É a Fronteira sinalização bidirecional através da membrana. Por meio

Que Delimita uma Célula
A superfície externa da membrana plasmática (Fi
gura 1.10) está em contato com um ambiente externo
variável, e a superfície interna está em contato com um
ambiente relativamente constante, fornecido pelo cito
plasma da célula. A composição proteica da membrana
plasmática varia entre os tipos celulares, mas há uma
semelhança na composição lipídica. Proteínas e lipíde
os não estão distribuídos ao acaso na membrana. Os
dois lados das membranas plasmáticas de mamíferos
têm composições lipídicas diferentes (p. 487).
A superfície externa faz interações adesivas com a
matriz extracelular e com outras células por meio de
integrinas. Essas proteínas transmembrânicas ligam
-se ao citoesqueleto dentro das células e participam da
de elementos do citoesqueleto, a membrana plasmática
está envolvida na determinação de forma e movimen
to celulares. A natureza lipídica das membranas exclui
muitas substâncias, mas mecanismos de transporte
ou poros permitem o movimento transmembrânico de
íons, moléculas orgânicas e água. A comunicação in
tercelular ocorre graças à presença de receptores pro
teicos específicos na superfície externa da membrana
plasmática, para ligar sinais extracelulares, como hor
mônios e neurotransmissores. A membrana plasmática
interage com uma variedade de substâncias citoplasmá
ticas para fazer endo e exocitose. Além do seu papel
na internalização do líquido extracelular, a endocitose
tem um papel significativo na morte celular programa
da, chamada apoptose (p. 1034). Detalhes da estrutura
e da bioquímica da membrana são apresentados no Ca
pítulo 12.

TABELA 1.6 Resumo dos Compartimentos da Célula Eucariótica e Suas Principais Funções
Compartimento Principal funções
Membrana plasmática Transporte de íons e moléculas pequenas
Exo e Endocitose
Reconhecimento
Célula-Célula
Receptores para moléculas pequenas e grandes
Morfologia e movimento celular
Núcleo Síntese e reparo de DNA
Síntese de RNA
Nucléolo Processamento de RNA e síntese de ribossomos
Retículo endoplasmático Síntese de membranas
Síntese de proteínas e lipídeos para algumas organelas e para exportação
Síntese de lipídeos e esteroides
Reações de desintoxicação
Sinalização por Ca2+
Complexo de Golgi Modificação e seleção de proteínas para incorporação em membranas e or
ganelas, e para exportação
Exportação de proteínas
Mitocôndrias Produção de ATP
Respiração celular
Oxidação de piruvato, aminoácidos e ácidos graxos
Síntese de ureia e heme
Lisossomos Apoptose
Digestão celular: hidrólise de proteínas, carboidratos, lipídeos, e ácidos nu
cleicos
Peroxissomos Oxidação de lipídeos
Reações oxidativas envolvendo O2
Utilização de H2O2
Microtúbulos, filamentos intermediá Citoesqueleto celular
rios e microfilamentos Morfologia celular
Motilidade celular
Movimentos intracelulares
Citosol Metabolismo de carboidratos, aminoácidos e nucleotídeos; síntese de ácidos
graxos
Síntese de proteínas
16 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.3

Envelhecimento Acelerado e o Núcleo Celular

A síndrome progéria de Hutchinson–Gilford (HGPS,
Hutchinson–Gilford progeria syndrome) (OMIM 17660)
é uma condição muito rara na qual os pacientes pas
sam por uma velocidade rápida de envelhecimento, ini
ciando-se ao nascer. Estima-se que a síndrome ocorra
em cerca de 1 a cada 4 a 8 milhões de nascimentos.
É detectada cedo na vida, com crescimento limitado,
perda de cabelo, características faciais específicas, os
sos pequenos e frágeis, pele enrugada, aterosclerose e
problemas cardiovasculares, todos comuns em idosos.
Os pacientes, entretanto, não apresentam sintomas de
doenças neurodegenerativas. Raramente ultrapassam o
início da adolescência. O processo de envelhecimento
desses indivíduos é de 6 a 8 vezes mais acelerado do
que o normal.
Uma mudança genética em relação ao normal foi
identificada em pacientes com HGPS. O envelope
nuclear dos pacientes parece distorcido. Lamina A,
uma proteína estrutural do núcleo, está envolvida na
síntese de DNA e RNA. É formada de um precursor,
ligado à membrana nuclear, por uma reação catali
sada por enzima. Os pacientes com HGPS apresen
tam déficit nessa conversão, o que leva ao acúmulo
de uma lamina A anormal em células normais, com o
envelhecimento. A presença dessa proteína anormal
causa formação de “bolhas” no núcleo (blebbing),
alteração na expressão gênica, e interferência com
a mitose. No momento, não há terapia estabelecida
para essa condição, porém, definindo-se as alterações
que a causam, uma abordagem terapêutica pode ser
possível. Os resultados de estudos em HPGS deverão
revelar também maiores detalhes acerca do processo
de envelhecimento normal.
Mattout, A., Dechat, T., Adam, A. A., Goldman, R.D., e Gru
enbaum, Y. Nuclear lamins, disease and aging. Curr. Opinion
in Cell Biol. 18:335, 2006; Korf, B. Hutchinson-Gilford proge
ria syndrome, aging, and the nuclear lamina. N. Engl. J. Med.
358:552, 2008; e Merideth, M. A., Gordon, L. B., Clauss, S., Sa
chdev, V. et al., Phenotype and course of Hutchinson-Gilford
progeria syndrome. N. Engl. J. Med. 358:592, 2008

Núcleo é o Local de Síntese de DNA teínas e as enzimas envolvidas na replicação do DNA, e

no reparo do DNA que foi danificado (p. 169).
e de RNA
O núcleo (Figura 1.11) é envolvido por duas mem
branas, chamadas envelope nuclear, com a membrana
externa sendo contínua com as membranas do retículo NÚCLEO
endoplasmático. O espaço entre as membranas, o es
paço perinuclear, é contínuo com o lúmen do retícu
lo endoplasmático rugoso. O envelope nuclear contém
numerosos complexos multiproteicos, denominados
complexos do poro nuclear, que atravessam o envelo
pe e têm um poro com cerca de 90 Å de diâmetro. O
complexo permite movimento controlado de partículas
e de moléculas grandes entre a matriz nuclear e o cito
plasma. O transporte de macromoléculas requer gasto
de energia, e é facilitado por uma série diversificada de
proteínas transportadoras e fatores de transporte solú
veis, que ciclam entre os dois compartimentos. Consi FIGURA 1.11 Núcleo de uma célula de mamífero.
Micrografia eletrônica gentilmente cedida pelo Dr. John A. Mc
dera-se hoje que o envelope nuclear desempenha outros
Nulty, Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy,
papéis importantes, além de servir como barreira entre Stritch School of Medicine, Loyola University, Chicago.
a matriz nuclear e o citoplasma (Correlação Clínica 1.3).
Há também subcompartimentos intranucleares, sendo
o principal deles o nucléolo. Uma estrutura em rede de
lineando a membrana nuclear interna, a lâmina nuclear, A transcrição da informação genética do DNA em
uma forma que possa ser traduzida em proteínas celu
suporta a estrutura do núcleo.
lares (p. 193) envolve a síntese e o processamento de
O ácido desoxirribonucleico (DNA), o reservatório várias formas de ácido ribonucleico (RNA). O proces
da informação genética, localiza-se dentro do núcleo samento do RNA para construção dos ribossomos, ne
como um complexo DNA–proteína, a cromatina, que é cessários para a síntese proteica no citosol, ocorre no
organizada em cromossomos. O núcleo contém as pro nucléolo.
 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 17

O Retículo Endoplasmático Tem importantes na biossíntese de hormônios esteroides,

na remoção de substâncias tóxicas e no metabolismo
um Papel na Síntese Proteica e em de drogas. O retículo endoplasmático e o complexo de
Golgi estão envolvidos na formação de outras organe
Muitas Vias de Síntese las celulares, como lisossomos e peroxissomos, e na
O citoplasma de células eucarióticas contém uma sinalização do Ca2+ (p. 551).
extensa rede de membranas interconectadas que se es
tende do envelope nuclear até a membrana plasmática,
chamada retículo endoplasmático (ER). Consiste de
membranas com aparêncialisa (ER liso ou SER, smooth
endoplasmic reticulum) em algumas áreas, e rugosa
(ER rugoso ou RER, rough endoplasmic reticulum)
em outros lugares (Figuras 1.12 e 1.13). Essa organela
dinâmica muda de tamanho e forma, dependendo das
necessidades da célula. O ER delimita o lúmen do ER,
onde proteínas recém-sintetizadas são modificadas. A
aparência rugosa deve-se à presença de partículas de
ribonucleoproteína, chamadas ribossomos, ligadas ao
seu lado citosólico. Durante o fracionamento celular, a
rede do retículo endoplasmático é rompida e a membra
na fecha novamente, formando pequenas vesículas ou
microssomos. Essas vesículas não estão presentes nas
células.
FIGURA 1.13 Retículo endoplasmático rugoso de uma
célula de mamífero.
Três setas paralelas indicam três ribossomos entre os muitos
acoplados às membranas. A seta individual indica uma mito
côndria para comparação.
Cortesia do Dr. U. Jarlfors, University of Miami, Miami, FL.
SER

Aparelho de Golgi Está Envolvido na

Secreção de Proteínas
O aparelho de Golgi (também denominado comple
xo de Golgi) (Figura 1.14) é uma rede de bolsas acha
tadas e empilhadas de membranas lisas – cisternas – e
vesículas. Funciona em conjunto com o retículo endo
FIGURA 1.12 Retículo endoplasmático liso de uma célula
plasmático, onde proteínas para destinos específicos
de mamífero.
são sintetizadas.
SER, retículo endoplasmático liso. Micrografia eletrônica gen
tilmente fornecida pelo Dr. John A. McNulty, Department of
Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Stritch School of Me
dicine, Loyola University, Chicago.

GOLGI
Uma função importante dos ribossomos no retícu
lo endoplasmático rugoso é a biossíntese de proteínas
para incorporação em membranas e organelas celula
res, bem como para exportação para fora da célula. O
ER está envolvido no dobramento de proteínas; se o
sistema de dobramento estiver sobrecarregado e pro
teínas não dobradas se acumularem, uma série de pro
cessos é induzida para reduzir o estresse sobre o ER.
Existem algumas evidências de que o estresse do ER
esteja envolvido em várias doenças. O retículo endo FIGURA 1.14 Aparelho de Golgi de uma célula de
plasmático liso está envolvido na síntese de lipídeos e mamífero.
contém enzimas chamadas citocromos P450 (p. 442), Micrografia eletrônica gentilmente cedida pelo Dr. John A. Mc
que catalisam a hidroxilação de uma variedade de Nulty, Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy,
compostos endógenos e exógenos. Essas enzimas são Stritch School of Medicine, Loyola University, Chicago.
18 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Enzimas nas membranas do Golgi catalisam a trans

ferência de unidades de carboidratos para proteínas,
para formar glicoproteínas, um processo que é impor
tante na determinação do destino final de proteínas. O
Golgi é o principal local de síntese de novas membranas
e participa da formação de lisossomos e peroxissomos.
Vesículas de membranas transportam proteínas entre
as cisternas; elas brotam de uma cisterna e fundem
com outra, com a ajuda de uma família de proteínas
chamadas proteínas SNARE. Vesículas que se originam
do complexo de Golgi transportam proteínas, tais como
hormônios, proteínas do plasma sanguíneo e enzimas
digestivas para a membrana plasmática, para secreção.
O aparelho de Golgi também tem um papel no movi
mento dos lipídeos dentro da célula.

FIGURA 1.15 Mitocôndrias de uma célula de mamífero.

Mitocôndria Atende à Maior Parte
da Necessidade Celular de ATP
As mitocôndrias (Figura 1.15) são bem estabelecidas
como as usinas da célula, responsáveis pela síntese de
mais de 90% da adenosina trifosfato (ATP) que a célula
requer (p. 589). Também têm papéis importantes em di
versas funções celulares, incluindo apoptose (p. 1034),
formação de espécies reativas de oxigênio (p. 601), sina
lização celular, e vários processos metabólicos. Em mi
crografias eletrônicas, as mitocôndrias aparecem como
bastonetes, esferas, ou corpos filamentosos, geralmente,
com cerca de 0,5–1 μm de diâmetro e até 7 μm de com
primento; algumas dessas diferenças de forma podem
ser devidas à preparação do tecido ou célula para análise
microscópica. A matriz interna da organela, o mitosol, é
envolta por duas membranas, claramente diferentes em
aparência, composição e função bioquímica. A membra
na interna invagina-se para dentro da matriz formando
cristas, e contém inúmeras pequenas esferas ligadas por
hastes e se projetando para o mitosol, que são respon
sáveis pela síntese de ATP. A estrutura das cristas varia
de tubular a lamelar, dependendo do tecido e do esta
do funcional das mitocôndrias. As mitocôndrias podem
se dividir por fissão e se fundir; as proteínas requeridas
para esses processos já foram identificadas, porém mui
tos detalhes dos mecanismos reais ainda não foram des
cobertos. Exercício promove um aumento no número de
mitocôndrias do músculo esquelético. Componentes do
sistema de transporte de elétrons e da fosforilação oxi
dativa fazem parte da membrana interna (p. 577). Vias
metabólicas para oxidação de piruvato produzido na gli
cólise, ácidos graxos e aminoácidos, bem como algumas
reações de biossíntese de ureia e heme, localizam-se no
mitosol. Ambas as membranas, externa e interna, con
têm mecanismos para deslocamento de proteínas es
pecíficas. Há uma variedade de sistemas de transporte
transmembrânico na membrana interna, para desloca
mento de vários metabólitos. As mitocôndrias desempe
nham um papel chave no envelhecimento; o citocromo
c, um componente do sistema de transporte de elétrons
mitocondrial, é um iniciador de apoptose.
Micrografia eletrônica de mitocôndrias em fibras musculares
de coração de coelho (× 39.600).
Cortesia do Dr. W. B. Winborn, Department of Anatomy, Uni
versity of Texas Health Science Center at San Antônio, e do
Laboratório de Micrografia Eletrônica, Department of Patholo
gy, University of Texas Health Science Center at San Antonio.
Mitocôndrias desempenham um papel em sua pró
pria replicação. Contêm várias cópias de um DNA circu
lar (DNA mitocondrial [mtDNA]), com informação ge
nética para 13 proteínas mitocondriais e alguns RNAs.
O DNA é semelhante, em tamanho (16.569 pares de
bases), ao de cromossomos bacterianos. A presença de
um genoma independente e a similaridade com bacté
rias levaram à hipótese amplamente aceita de que essas
organelas foram bactérias que foram captadas por uma
célula mais avançada e, em lugar de serem destruídas,
estabeleceram um relacionamento endossimbiótico.
Estima-se que esse evento possa ter ocorrido há cer
ca de 3 bilhões de anos. A herança mitocondrial ocorre
por transmissão materna, e tem sido possível estudar o
movimento global humano por avaliação das variações
no mtDNA. Mitocôndrias também têm a maquinaria ne-
cessária (p. 599) para catalisar a síntese de proteínas.
A maioria das proteínas mitocondriais (mais de 90%)
é derivada de genes presentes no DNA nuclear e sin
tetizada no citosol, depois importada para a organela.
Existem várias centenas de doenças genéticas de fun
ção mitocondrial (Correlação Clínica 1.4).
Lisossomos São Necessários para
Digestão Intracelular
Os lisossomos (Figura 1.16) são responsáveis pela
digestão intracelular de substâncias, tanto extracelu
lares como intracelulares. Com uma única membrana
delimitante, mantêm um pH intralisossomal de cerca
de 5. Encapsulada nessas organelas está uma classe
de enzimas glicoproteicas, hidrolases, que catalisam a
clivagem hidrolítica de ligações carbono–oxigênio, car

CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.4
Doenças Mitocondriais
A primeira doença envolvendo especificamente trans
dução de energia mitocondrial (doença de Luft) (OMIM
238800) foi relatada em 1962. Uma paciente de 30 anos
de idade apresentava fraqueza generalizada, transpira
ção excessiva, alta ingesta calórica sem ganho de peso,
e taxa de metabolismo basal muito elevada (uma medida
da utilização de oxigênio). Ela tinha um defeito no me
canismo que controla a utilização de oxigênio pela mi
tocôndria (p. 590). Desde então, centenas de anomalias
genéticas foram identificadas que levam a alterações em
enzimas, ácidos ribonucleicos, componentes do trans
porte de elétrons e sistemas de transporte de membra
nas mitocondriais. Algumas condições resultam de mu
tações no DNA mitocondrial e outras, de mutações no
DNA nuclear que codifica proteínas mitocondriais.
A primeira doença identificada, devida a uma mu
tação no mtDNA, foi a Neuropatia Óptica Hereditária
de Leber (OMIM 535000), que leva a cegueira súbita no
início da idade adulta. Muitas doenças mitocondriais
envolvem músculo esquelético e sistema nervoso cen
tral. Danos no DNA mitocondrial podem ocorrer por
causa de radicais livres (superóxidos) formados nas mi
tocôndrias. Anomalias nas mitocôndrias têm sido im
bono–nitrogênio, carbono–enxofre e oxigênio–fósforo
em proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucleicos.
Uma lista parcial das enzimas lisossomais é apresen
tada na Tabela 1.7. O conteúdo enzimático dos lisosso
mos varia em diferentes tecidos e depende das funções
específicas do tecido. Hidrolases lisossomais são mais
ativas em pH ácido e quebram moléculas complexas em
compostos simples de baixo peso molecular, que podem
ser reutilizados. A relação entre pH e atividade enzimá
tica é discutida na p. 401. O rompimento da membrana
lisossomal dentro da célula leva à digestão celular. Vá
rias condições patológicas têm sido atribuídas à libera
ção de enzimas lisossomais, incluindo artrite, respostas
alérgicas, várias doenças musculares e destruição teci
dual induzida por drogas (Correlação Clínica 1.5).
As células internalizam partículas exógenas, como
microrganismos e vírus, por fagocitose, líquidos por
pinocitose, e proteínas específicas por endocitose, um
processo mediado por receptor. Em cada caso, o mate
rial do exterior da célula é encapsulado em vesículas
delimitadas pela membrana plasmática (Figura 1.17).
As vesículas contendo material externo fundem-se com
lisossomos primários para formar lisossomos secundá
rios ou vacúolos digestivos, que contêm o material a
ser digerido e as hidrolases lisossomais para fazerem a
digestão. São identificados microscopicamente pelo seu
tamanho e, frequentemente, pela presença de estrutu
ras parcialmente digeridas. Os lisossomos primários
CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 19
plicadas na patofisiologia da esquizofrenia, da doença
bipolar e de doenças degenerativas relacionadas com
idade, como as doenças de Parkinson, de Alzheimer e
cardiomiopatias. Recentemente, foi sugerido que uma
única mutação em um tRNA mitocondrial levaria a uma
constelação de sintomas, incluindo hipertensão, coles
terol elevado no sangue e níveis baixos de Mg2+ no plas
ma. As doenças causadas por mutações no mtDNA são
transmitidas da fêmea para seus descendentes, uma vez
que as mitocôndrias presentes na célula-ovo são deriva
das do oócito.
Ver Correlação Clínica 6.6, página 235; Seção 14.4,
página 570; Seção 14.5, página 577; Seção 14.6, página
579 e Seção 14.7, página 589, para detalhes de doenças
mitocondriais específicas.
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of disease. Exp. Mol. Path. 83:84, 2007.
são aqueles que não se fundiram com vesículas conten
do o material a ser degradado.
FIGURA 1.16 Lisossomos de uma célula mamária.
Micrografia eletrônica generosamente cedida por Dr. John A.
McNulty, Departamento de Biologia Celular, Neurobiologia e
Anatomia, Stritch School of Medicine, Loyola University, Chi
cago.
Proteínas celulares, ácidos nucleicos, lipídeos e or
ganelas, como mitocôndrias, estão em estado dinâmico
de síntese e degradação. Os lisossomos são responsáveis
pela hidrólise desses componentes celulares, por um
processo finamente regulado chamado autofagia. Subs
20 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.5

Enzimas Lisossomais e Gota

O catabolismo de purinas (p. 845), compostos hete
rocíclicos contendo nitrogênio, encontrados em ácidos
nucleicos, leva à formação de ácido úrico, que é excre
tado na urina. Gota é uma anormalidade na qual o ácido
úrico é produzido em excesso, levando a aumento no
ácido úrico sanguíneo e à deposição de cristais de ura
to nas articulações. As manifestações clínicas incluem
inflamação, dor, inchaço e aumento de temperatura de
algumas articulações, particularmente do grande arte
lho. O ácido úrico é bastante insolúvel, e alguns dos sin
tomas clínicos da gota podem ser atribuídos à lesão cau
sada por cristais de urato. Os cristais são fagocitados
por células da articulação, e se acumulam em vacúolos
digestivos intracelulares, que contêm enzimas lisosso
mais. Os cristais causam danos físicos aos vacúolos, li
berando hidrolases lisossomais no citosol. Embora o pH
ótimo das enzimas lisossomais seja inferior ao pH do
citosol, elas têm alguma atividade hidrolítica em pH
mais alto, causando digestão de componentes celulares
e autólise celular.
Weissmann, G. Crystals, lysosomes, and gout. Adv. Intern.
Med. 19:239, 1974; e Burt, H. M., Kalkman, P. H. e Mauldin, D.
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hydrate. J. Rheumatol. 10:440, 1983.

TABELA 1.7 Enzimas Lisossomais Representativas e Seus tâncias destinadas a serem degradadas são identificadas
Substratos e captadas por lisossomos ou são primeiramente encap
Tipo de Substrato e Substrato suladas dentro de vesículas de membranas que, então, se
Enzima Específico fundem com lisossomos primários (Figura 1.17). Autofa
gia é importante não somente em condições de estresse,
ENZIMAS QUE HIDROLIZAM POLISSACARÍDEOS mas também em células normais de mamíferos; jejum e
a-Glucosidase Glicogênio hormônios específicos induzem autofagia.
a-Fucosidase Fucose de membrana
Produtos da digestão lisossomal são liberados dos
b-Galactosidase Galactosídeos lisossomos e são reutilizados pela célula. Material não
a-Manosidase Manosídeos -digerido acumula-se em vesículas chamadas corpos
b-Glucuronidase Glucuronídeos residuais, cujos conteúdos são normalmente removidos
da célula por exocitose. Alguns corpos residuais con
Hialuronidase Ácido hialurônico e
condroitim sulfatos têm altas concentrações de substâncias pigmentadas,
que são quimicamente heterogêneas e contêm ácidos
Arilsulfatase Sulfatos orgânicos graxos poli-insaturados e proteínas. Esses materiais
Lisozima Parede celular de acumulam-se nas células e são chamados lipofuscina,
bactérias ou “pigmento da idade” ou “pigmento do uso e desgaste”
ENZIMAS QUE HIDROLIZAM PROTEÍNAS (wear and tear pigment). A lipofuscina foi observa
da principalmente em neurônios e células musculares
Catepsinas Proteínas
pós-mitóticos, e foi implicada no processo de envelhe
Colagenases Colágeno
cimento.
Elastase Elastina
Algumas enzimas lisossomais são normalmente se
Peptidases Peptídeos
cretadas da célula para digestão de material extracelu
ENZIMAS QUE HIDROLIZAM ÁCIDOS NUCLEICOS lar no tecido conjuntivo e na glândula prostática. Nas
Ribonuclease RNA doenças genéticas de acúmulo lisossomal (p. 242), en
Desoxirribonuclease DNA zimas lisossomais individuais estão ausentes, levando
ENZIMAS QUE HIDROLIZAM LIPÍDEOS ao acúmulo nos lisossomos do substrato da enzima que
Lipase Triacilglicerol e ésteres falta. Os lisossomos ficam aumentados com o material
de colesterol não-digerido, interferindo com os processos normais
da célula (Correlação Clínica 1.6). Um caso desses é a
Esterase Ésteres de ácidos graxos doença da célula I, na qual o mecanismo celular de dire
Fosfolipase Fosfolipídeos cionamento de enzimas lisossomais para os lisossomos
FOSFATASES durante sua síntese está defeituoso. Ao contrário, as en
zimas hidrolíticas lisossomais são exportadas para fora
Fosfatase Fosfomonoésteres
da célula e danificam a matriz extracelular. (Correlação
Fosfodiesterase Fosfodiésteres
Clínica 6.8, p. 243).
SULFATASES
Condroitim sulfatase Heparam sulfato
Arilsulfatase B Dermatam sulfato

CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.6
Deficiência de Lipase Ácida Lisossomal
Lipase ácida lisossomal humana (hLAL) hidrolisa
triacilglicerol a ácidos graxos livres e glicerol, e ésteres
de colesterol a colesterol e ácidos graxos. É uma enzi
ma crítica no metabolismo de colesterol, servindo para
tornar o colesterol disponível para as necessidades das
células. Doença de armazenamento de colesteril-ésteres
(CESD) e doença de Wolman (OMIM 27800) são duas
formas fenotípicas distintas de uma deficiência genética
de hLAL; ambas são doenças autossômicas recessivas
raras. CESD é geralmente diagnosticada em adultos e
é evidenciada por hipercolesterolemia, hepatomegalia e
início precoce de grave aterosclerose. Os indivíduos afe
tados têm atividade de hLAL, mas em níveis muito baixos
(<5% do normal). Aparentemente, esse nível é suficiente
para hidrolisar triacilglicerol, mas não colesteril-ésteres.
Os pacientes são homozigotos para uma mutação numa
Retículo endoplasmático
– Complexo de Golgi
Mitocôndria
Lisossomos Lisossomos
primários
digestivo
Vacúolo secundários Vacúolos
residuais
Descarga
FIGURA 1.17 Representação diagramática do papel de lisossomos na digestão
intracelular de substâncias internalizadas por fagocitose (heterofagia) e de
componentes celulares (autofagia).
Nos dois processos, substâncias a serem digeridas são envoltas em uma vesícula de
membrana, seguida de fusão com um lisossomo primário para formar um lisossomo
secundário, no qual a digestão ocorre.
CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 21
junção de splice em ambos os alelos, levando a uma en
zima cataliticamente defectiva e instável.
A doença de Wolman manifesta-se em bebês e é ge
ralmente fatal por volta de 1 ano de idade. Não há ati
vidade detectável de hLAL. Ambos, triacilglicerol e co
lesteril-estéres, acumulam-se nos tecidos. Os pacientes
são homozigotos para uma mutação que leva à ausência
de enzima ativa.
Hegele, R. A., Little, J. A., Vezina, C., et al., Hepatic lipase de
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acteristics. Atherosclerosis and Thrombosis 13:720, 1993;
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lysossomal acid lipase and other proteins in atherosclerosis. J.
Biochem. 140:23, 2006.
Os Peroxissomos Têm
um Importante Papel
no Metabolismo de
Lipídeos
A maioria das células de mamí
feros, protozoários e plantas tem
organelas, denominadas micro
corpúsculos ou peroxissomos, o
último devido à sua capacidade de
produzir ou utilizar peróxido de
hidrogênio (H2O2). Eles possuem
Vacúolo uma única membrana e são peque
autofágico
nos (0,3-1,5 μm de diâmetro, esféri
cos ou ovais, com uma fina rede de
túbulos em sua matriz. A alta con
Vacúolo centração de proteínas na matriz de
digestivo alguns peroxissomos leva a inclu
sões cristalinas. Variam entre célu
las em sua composição enzimática,
função e número. Mais de 50 enzi
mas, catalisando reações oxidativas
e biossintéticas, foram identificadas
em peroxissomos de diferentes te
cidos.
Os peroxissomos são essenciais
para a oxidação de ácidos graxos
de cadeia muito longa (p. 720) e
síntese de glicerolipídeos, lipídeos
glicerol éteres (plasmalogênios) e
isoprenoides (p. 740). Em camun
dongos, demonstrou-se que os pe
roxissomos têm um papel fisiológico
22 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.7
Doenças da Biogênese de Peroxissomos (PBD)
Os peroxissomos são responsáveis por várias re
ações metabólicas importantes, incluindo síntese de
glicerol éteres, encurtamento de ácidos graxos de
cadeia muito longa para que as mitocôndrias possam
oxidá-los completamente, e oxidação da cadeia late
ral do colesterol necessária à síntese de ácidos bilia
res. Doenças da biogênese de peroxissomos (PBDs)
(OMIM 601539) compreendem mais de 25 doenças
genéticas fenotipicamente relacionadas que envolvem
atividades enzimáticas de peroxissomos. São doen
ças autossômicas recessivas raras, que se caracteri
zam por níveis diminuídos de lipídeos glicerol–éteres
(plasmalogênios), níveis aumentados de ácidos graxos
de cadeias muito longas (C24 e C26) e de derivados do
ácido colestanoico (precursores de ácidos biliares).
A doença pode afetar fígado, rim, cérebro e sistema
esquelético. A mais grave é a síndrome de Zellweger,
que se deve à ausência de peroxissomos funcionais; a
morte frequentemente ocorre por volta dos 6 meses
significativo na síntese e na degradação de lipídeos. Eles
também contêm enzimas que oxidam D-aminoácidos,
ácido úrico e vários 2-hidroxiácidos, usando O2 mole
cular com formação de H2O2. A catalase, uma heme
-enzima (p. 605) presente nos peroxissomos, catalisa a
conversão de H2O2 em água e oxigênio e a oxidação de
vários compostos por H2O2 (Figura 1.18). As células se
protegem da toxicidade do H2O2 por possuírem tanto
enzimas que produzem peróxidos como enzimas que
utilizam peróxidos em um compartimento.
(1) 2H2O2 2H2O + O2
(2) RH2 + H2O2 R + 2H2O
FIGURA 1.18 Reações catalisadas pela catalase.
As proteínas responsáveis pela biogênese de pe
roxissomos foram identificadas. Várias classes de xeno
bióticos, isto é, substâncias estranhas, incluindo aspi
rina, levam à proliferação de peroxissomos no fígado.
Mais de 25 doenças genéticas envolvem peroxissomos;
são agrupadas como doenças da biogênese de peroxis
somos (Correlação Clínica 1.7).
Citoesqueleto Organiza o Conteúdo
Intracelular
As células eucarióticas contêm microtúbulos, fila
mentos intermediários e filamentos de actina (microfi
lamentos), como parte de uma rede de citoesqueleto, ou
de idade. Nessa condição, o defeito genético está no
mecanismo para importar enzimas para a matriz dos
peroxissomos. Algumas condições PBD são causadas
por mutações de splice doador ou de sentido errado
(missense) (p. 171); em algumas, há ausência de uma
única enzima metabólica ou defeito em um componen
te do transporte de membranas. Em alguns casos, a
doença pode ser diagnosticada antes do nascimento
por ensaio de enzimas de peroxissomos ou de ácidos
graxos em células do líquido amniótico.
FitzPatrick, D. R., Zellweger syndrome and associated phe
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Biochim. Biophys. Acta. 1763:1733, 2006.
arcabouço, no citoplasma (p. 1008). Essa estrutura di
nâmica desempenha um papel na manutenção da mor
fologia celular, no transporte intracelular de vesículas
e organelas, na motilidade celular e na divisão celular.
O citoesqueleto inclui os microtúbulos, consistindo de
multímeros de tubulina, uma proteína que rapidamente
se organiza em estruturas tubulares e se desorganiza,
dependendo das necessidades da célula. Actina e mio
sina formam filamentos celulares muito importantes no
músculo estriado, onde são responsáveis pela contra
ção muscular (p. 991). Três superfamílias separadas de
proteínas mecânico-químicas – miosina, dineína e cine
sina – convertem energia química em energia mecânica
para o movimento de componentes celulares (p. 1002).
Esses motores moleculares ficam associados com o ci
toesqueleto. Dineína está envolvida nos movimentos
ciliar e flagelar, enquanto cinesina é a força que dire
ciona o movimento de vesículas e organelas ao longo
de microtúbulos, especialmente em axônios neuronais.
Essas proteínas motores desempenham um papel signi
ficativo na patogênese de várias doenças.
Citosol Contém Componentes
Celulares Solúveis
A menos complexa em estrutura, mas não em quími
ca, é a seiva da célula sem organelas, ou citosol. É aqui
que muitas reações químicas e vias do metabolismo (p.
ex., glicólise, glicogênese, glicogenólise e síntese de áci
dos graxos) ocorrem. A síntese de proteínas tanto em
ribossomos livres, geralmente na forma de polissomos,
quanto naqueles ligados ao retículo endoplasmático,

ocorre no citosol, que contém todos os intermediários
necessários. Embora não exista estrutura aparente no
citosol, o alto conteúdo proteico impede que seja uma
mistura homogênea de componentes solúveis, e acredi
ta-se que existam compartimentos funcionais ao longo
do citosol. Muitas reações estão localizadas em áreas
selecionadas, onde a disponibilidade de substrato é
mais favorável. O estado físico-químico real do citosol é
pouco conhecido. Outra complicação para se analisar a
composição do citosol é que algumas enzimas e prote
ínas ocorrem como proteínas solúveis quando o citosol
é isolado, mas na célula intacta podem, na verdade, es
tar fracamente ligadas a estruturas de membranas ou a
componentes do citoesqueleto.
1.6 INTEGRAÇÃO E CONTROLE
DAS FUNÇÕES CELULARES
Uma célula eucariótica é uma estrutura complexa
que mantém um ambiente intracelular que permite
que muitas reações complexas e processos ocorram si
multaneamente. Isso requer um alto grau de controle
e integração. As células de organismos multicelulares
também participam da manutenção do bem-estar de
todo o organismo, exercendo influências mútuas para
manter o equilíbrio entre as atividades tissulares e ce
lulares. Pouquíssimas funções operam de modo total
mente independente; mudanças em uma função podem
exercer uma influência, positiva ou negativa, sobre ou
tras funções. Como será descrito ao longo deste livro, o
controle da função é mediado em muitos níveis, desde
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CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 23
a expressão de um gene para alterar a concentração de
uma enzima ou proteína efetora, até mudanças nos ní
veis de substrato ou coenzima para ajustar a velocida
de de uma reação enzimática específica. A integração
de muitos processos celulares é controlada por prote
ínas que funcionam como ativadores ou inibidores, as
quais mantêm a homeostase celular. Muitos processos
celulares são programados para ocorrer em condições
específicas; por exemplo, a divisão celular em células
normais só ocorre quando os processos necessários
para a divisão celular são ativados (p. 1028). Então, e
somente então, ocorre uma série de reações ordenadas
e integradas, culminando na divisão de uma célula em
duas células filhas.
A morte celular programada (p. 1034) é um processo
muito regulado, que ocorre em todas as células de ma
míferos, mas as etapas individuais do processo variam
de tecido para tecido. Muitas doenças devem-se a falhas
em mecanismos específicos de controle. À medida que
ampliamos nossa compreensão sobre a complexidade
das células biológicas, nós nos surpreendemos por não
ocorrerem muito mais erros e muito mais indivíduos
com condições anormais.
Assim, à medida que caminhamos para o estudo dos
componentes químicos separados e das atividades das
células, nos capítulos subsequentes, é importante lem
brar as atividades concomitantes e vizinhas, as limita
ções, e as influências do ambiente. Só conciliando todas
as partes e atividades separadas de uma célula, isto é,
montando o quebra-cabeça, é que apreciaremos a mara
vilha das células vivas.
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ácido carbônico capacidade tamponante
ácido de Brønsted catalase
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água citoesqueleto
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ânion composição iônica
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DNA hidrolase
eletrólitos fortes K!eq
eletrólitos fracos íon hidrônio
endocitose lisossomos
envelope nuclear membrana plasmática
equação de Henderson– microcorpos
Hasselbalch microtúbulos
eucariotos mitocôndria
 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 25

mitosol organelas pontes de hidrogênio sais

não-eletrólitos par conjugado procariotos tamponamento
nucléolo
nucleoide
núcleo peroxissomos produto iônico da água vacúolos digestivos
pH retículo endoplasmático xenobióticos
pK! ribossomos

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha C. sistemas específicos para transporte de molé
culas não-carregadas.
1. Tanto células procarióticas quanto células eucarió
ticas têm todas as seguintes, exceto: D. local para reações bioquímicas.
A. membrana plasmática. E. movimento livre de proteínas e ácidos nuclei
cos através da membrana.
B. genoma de DNA.
C. organelas subcelulares delimitadas por mem 6. Análise da composição do principal compartimen
brana. to líquido do corpo mostra que:
D. a capacidade de se replicar. A. o principal cátion do plasma sanguíneo é K+.
E. a capacidade de transformar fontes externas B. o principal cátion do fluido celular é Na+.
de energia em energia utilizável. C. um dos principais ânions intracelulares é Cl–.
2. Fatores responsáveis por uma molécula de água ser D. um dos principais ânions intracelulares é fos
um dipolo incluem a: fato.
A. similaridade em afinidade por elétrons de hi E. plasma e fluido celular são muito semelhantes
drogênio e oxigênio. em composição iônica.
B. estrutura tetraédrica da água líquida. Questões 7 e 8: Um paciente com doença de Luft apre
C. magnitude do ângulo da ligação H—O—H. sentava-se com fraqueza geral, transpiração excessiva,
D. capacidade de a água fazer pontes de hidrogê alta ingesta calórica sem ganho de peso corpóreo e taxa
nio com várias estruturas químicas. de metabolismo basal muito elevada. A doença de Luft
E. foi a primeira doença envolvendo defeito em mitocôn
diferença na força de ligação entre pontes de drias a ser descrita. É um defeito no mecanismo que
hidrogênio e ligações covalentes.
controla a utilização de oxigênio em mitocôndrias.
3. Pode-se esperar que pontes de hidrogênio se for
7. Componentes do sistema de transporte de elétrons
mem apenas entre átomos eletronegativos, como
e fosforilação oxidativa são encontrados associa
oxigênio ou nitrogênio, e um átomo de hidrogênio
dos com:
ligado a:
A. membrana mitocondrial externa.
A. carbono.
um átomo eletronegativo. B. membrana mitocondrial interna.
B.
C. mitosol.
C. hidrogênio.
D. peroxissomos.
D. iodo.
E. componentes da síntese proteica.
E. enxofre.
Qual dos seguintes é um ácido de Brønsted e uma 8. Qual(is) dos seguintes é (são) característica(s)
4.
das mitocôndrias?
base de Brønsted em água?
A. H2PO4– A. A membrana interna forma cristas e contém
pequenas esferas ligadas por hastes sobre a
B. H2CO3 superfície interna.
C. NH3 B. Apenas a membrana externa possui sistemas
D. NH4+ transmembranares para translocação de me
E. Cl– tabólitos.
5. Membranas biológicas estão associadas a todos os C. O mitosol é relativamente inerte quanto ao
seguintes, exceto: metabolismo.
A. impedimento de livre difusão de solutos iôni D. DNA mitocondrial é semelhante ao DNA nu
cos. clear em tamanho e forma.
E. Mitocôndrias não possuem papel na apoptose.
B. liberação de proteínas, quando danificada.
26 • PARTEI ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
Questões 9 e 10: Gota é uma condição na qual a produ
ção excessiva de ácido úrico leva a deposição de cris
tais de urato em articulações. Manifestações clínicas
incluem inflamação, dor e inchaço nas articulações, es
pecialmente do grande artelho. Cristais são fagocitados
por células na articulação e acumulam-se em vacúolos
digestivos que contêm enzimas lisossomais. Cristais
causam lesão física aos vacúolos, liberando enzimas li
sossomais no citosol.
9. Enzimas lisossomais:
A. são hidrolases.
B. geralmente funcionam em pH ácido.
C. normalmente ficam isoladas de seus substra
tos pela membrana lisossômica.
D. podem levar à digestão celular se a membrana
lisossomal se romper.
E. todas as anteriores estão corretas.
10. Enzimas lisossomais individuais estão deficientes
em várias doenças genéticas chamadas doenças
lisossomais de acúmulo. Nessas doenças:
A. defeito é uma incapacidade de direcionar en
zimas para o lisossomo após sua síntese.
B. lisossomos de células afetadas ficam aumenta
dos com materiais não-digeridos.
C. lipofuscina, ou “pigmento do desgaste”, acu
mula-se em células.
D. qualquer material captado por lisossomos acu
mular-se-á.
E. corpos residuais contêm os produtos de diges
tão.
Respostas
1. C O meio intracelular dos procariotos é organi
zado em compartimentos funcionais, mas não são
delimitados por membranas. A, B, D e E: Essas são
características que procariotos e eucariotos têm
em comum.
2. C Água é uma molécula polar porque os elétrons
da ligação são atraídos mais fortemente pelo oxigê
nio do que pelo hidrogênio. O ângulo da ligação dá
origem a assimetria na distribuição de carga; se a
água fosse linear, não seria um dipolo. A: hidrogê
nio e oxigênio têm afinidades muito diferentes por
elétrons. B e D são consequências da estrutura da
água, não fatores responsáveis por ela.
3. B Somente átomos de hidrogênio ligados a um
dos elementos eletronegativos (O, N ou F) podem
formar pontes de hidrogênio. Um átomo de hidro
gênio que participe da ponte de hidrogênio deve
ter um elemento eletronegativo de cada lado.
4. A H2PO4– pode doar um próton, tornando-se
Questões 11 e 12: Síndrome de Zellweger é uma de uma
classe chamada doenças de biogênese de peroxisso
mos (PBDs). PBDs caracterizam-se por anomalias no
fígado, no rim, no cérebro e no sistema esquelético. Sín
drome de Zellweger é particularmente grave, e a morte
geralmente ocorre por volta dos 6 meses de idade. Há
ausência de peroxissomos funcionais.
11. Peroxissomos desempenham um papel em todos os
seguintes, exceto:
A. oxidação de ácidos graxos de cadeia muito
longa.
B. síntese de glicerolipídeos.
C. hidrólise de colesteril ésteres.
D. oxidação de D-aminoácidos.
E. oxidação de ácido úrico.
12. Uma das funções dos peroxissomos é tornar H2O2
não-tóxica:
A. oxidando aminoácidos com O2.
B. por meio da ação da enzima catalase.
C. transportando H2O2 do sangue para os pero
xissomos.
D. por ação de catepsinas.
E. encurtanto a cadeia de um ácido graxo.
Problemas
13. Se um ácido fraco estiver neutralizado em 91% a
pH 5,7, qual é o pK! desse ácido?
14. Se o pH normal do plasma é 7,4 e a [CO2] normal é
1,2 mM, qual será a [HCO3 –]? O pK! para esse siste
ma é 6,1.
HPO2–.4 Também pode aceitar um próton e tornar
-se H3PO4.
base B e D são ácidos de Brønsted; C é uma
de Brønsted.
O íon Cl– na água não é nem um
nem outro.
5. E Essas moléculas são muito grandes para atra
vessar livremente a membrana, a menos que esta
esteja danificada (B). A: solutos iônicos não atra
vessam a membrana lipídica facilmente. C: a maio
ria das substâncias requer transporte através da
membrana. D: diferentes membranas têm diferen
tes reações.
6. D Fosfato e proteína são os principais ânions in
tracelulares. A, B, e E: plasma e fluido celular são
muito diferentes. O íon Na+ é o principal cátion do
plasma. C: A maior parte do Cl– é extracelular.
7. B As proteínas transportadoras de elétrons e da
fosforilação oxidativa fazem parte da membrana in
terna. D: Peroxissomos são organelas separadas e
não fazem parte das mitocôndrias. E: Mitocôndrias

produzem algumas de suas próprias proteínas, mas
esse é um processo separado e não faz parte do
transporte de elétrons ou da fosforilação oxidativa.
8. A As cristas são os sítios para a síntese de ATP. B:
A membrana externa é relativamente permeável; a
membrana interna não o é e tem múltiplos sistemas
de transporte. C: O mitosol tem numerosas vias
metabólicas – oxidação do piruvato, ácidos graxos
e aminoácidos, por exemplo. D: DNA mitocondrial
(mtDNA) é pequeno e circular. E: Citocromo c é
um iniciador de apoptose.
9. E A: Há hidrolases para todas as classes de ma
cromoléculas. B e D: pH lisossomal geralmente
está em torno de 5, mas as enzimas retêm certa ati
vidade em pHs mais altos. C: Substratos e enzimas
são aproximados por fagocitose ou pinocitose.
10. B Aumento no tamanho interfere com proces
sos celulares normais. A: Essa é a doença da cé
lula I e afeta todas as enzimas lisossomais, que
são exportadas para fora da célula. C: Esse é um
processo normal. Lipofuscina é uma substância
pigmentada, quimicamente heterogênea, não
causada por falta de enzima lisossomal. D: Cada
Doença de Acúmulo Lisossomal afeta uma única
enzima, de modo que apenas os substratos dessa
CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA • 27
enzima são afetados. E: Corpos residuais contêm
material que não pode ser digerido.
11. C Isso ocorre em lisossomos.
12. B H2O2 é convertido em O2 e H2O. A, E: estes pro
duzem H2O2. C: H2O2 é produzida e utilizada em
peroxissomos. D: essas são enzimas de lisossomos.
13. Se um ácido fraco está 91% neutralizado, 91 partes
estão presentes como base conjugada e 9 partes
permanecem como ácido fraco. Portanto, a razão
base conjugada/ácido conjugado é 10:1. Substituin
do essa relação na equação de Henderson–Hassel
balch dá 5,7 = pK! + log (10/1). Resolvendo a equa
ção para pK!, teremos uma resposta de 4,7. O ácido
poderia ser b-hidroxibutírico, um importante ácido
fisiológico que tem esse pK!.
14. Nesse sistema, CO2 é o ácido conjugado e HCO3–
é a base conjugada. Substituindo-se os valores na
equação de Henderson–Hasselbalch teríamos:
7,4 = 6,1 + log (x/1,2)
O antilog de 1,3 = 20. Portanto, [HCO3–] = 20 × 1,2 =
24 mM. A capacidade de se resolver a equação para
quaisquer três valores dados é muito importante
para verificar o estado ácido–base no sangue.
28 • PARTE I ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
PARTE I
ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS
2
DNA e RNA:
Composição e estrutura
Stephen A. Woski
Professor Associado, University ofAlabama
Francis J. Schmidt
Professor Titular, University of Missouri
CONTEÚDO
2.1 ÁCIDOS NUCLEICOS E INFORMAÇÃO BIOLÓGI
CA, 30
2.2 COMPONENTES ESTRUTURAIS DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS: NUCLEOBASES, NUCLEOSÍDEOS
E NUCLEOTÍDEOS, 31
2.3 ESTRUTURA DO DNA, 34
2.4 ESTRUTURA DE ORDEM SUPERIOR DO DNA, 51
2.5 SEQUÊNCIA E FUNÇÃO DO DNA, 61
2.6 ESTRUTURA DO RNA, 65
2.7 TIPOS DE RNA, 67
Conceitos Chaves
• O dogma central da biologia molecular afirma que
a informação biológica especificada por sequências
de ácidos nucleicos no DNA e no RNA determina
as sequências das proteínas e, consequentemente,
suas propriedades.
• A estrutura dos ácidos nucleicos é determinada
pelas propriedades químicas de suas partes consti
tuintes: fosfato, açúcar e nucleobase.
• O DNA celular é tipicamente um polímero de dupla
fita de 2!-desoxirribonucleosídeos 5! monofosfatos.
• A complementaridade entre as bases da dupla hé
lice permite ao DNA funcionar como o material ge
nético celular.
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 29
CORRELAÇÕES CLÍNICAS
2.1 Vacinas de DNA, 32
2.2 Uso
Medicina
Diagnóstico
e Genética, 43
de Matrizes (Arrays) de DNA em
2.3 DNA, 46
Antibióticos Antitumorais que Mudam a Forma do
2.4 Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal, 50
2.5 Telomerase Como Alvo para Agentes Anticâncer, 50
2.6 Expansão de Repetições de Tripletes de DNA e
Doença Humana, 52
2.7 Topoisomerases no Tratamento de Doenças, 56
2.8 Tratamentos Epigenéticos para o Câncer, 61
2.9 Resistência de Staphylococcus à Eritromicina, 69
• O comprimento da molécula de DNA é muito maior
do que a dimensão de uma célula; consequente
mente, o DNA adota estruturas de ordem superior
que compactam a molécula na cromatina.
• A sequência de nucleotídeos do DNA determina
sua função.
• RNAs celulares são polímeros de fita única de ribo
nucleosídeos 5! monofosfatos.
• A estrutura terciária do RNA é determinada por
pontes de hidrogênio intramoleculares.
Os RNAs celulares desempenham papéis na trans
•
ferência da informação, catalíticos e regulatórios.
30 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
2.1 ÁCIDOS NUCLEICOS E
INFORMAÇÃO BIOLÓGICA
Dogma Central da Biologia
Molecular
Uma das características mais notáveis dos organis
mos vivos é sua capacidade de reprodução. A informa
ção que torna cada forma de vida individual singular
deve ser preservada e passada aos descendentes. Toda
vida na Terra usa ácidos nucleicos para armazenar a
informação genética. Com exceção de alguns vírus, a
biomolécula utilizada para armazenar informação é o
ácido desoxirribonucleico (DNA). Essa molécula é
muito adequada ao seu papel graças à sua estabilida
de química e capacidade de codificar enormes quan
tidades de informações, usando um código simples de
quatro letras. Entretanto, o DNA é só uma parte da ar
quitetura central da vida. O ácido ribonucleico (RNA)
e as proteínas desempenham papéis igualmente impor
tantes. A interrelação entre essas três classes de molé
culas constitui o “dogma central da biologia molecular”
(Figura 2.1), que afirma que o DNA armazena a infor
mação que determina a sequência do RNA que, por sua
vez, determina a estrutura da proteína. Grande parte
da estrutura e da bioquímica das células deve-se às pro
priedades de seus constituintes proteicos. Tais proprie
dades são determinadas por pedaços da sequência do
DNA. A informação, entretanto, não pode fluir direta
mente do DNA para as proteínas, mas depende do RNA
para transportar a informação. A informação genética
é transmitida do DNA para o RNA por transcrição. A
sequência do RNA é, então, traduzida numa sequência
de proteína nos ribossomos. O DNA também desem
penha um papel essencial na hereditariedade, funcio
nando como molde para sua própria replicação. Várias
descobertas turvaram as funções distintas de cada uma
dessas biomoléculas no dogma central. Por exemplo, o
RNA pode funcionar como catalisador (ribozimas) em
reações bioquímicas e constituir o componente ativo
dos ribossomos, a maquinaria de síntese proteica da cé
lula. O RNA pode servir como molde para a síntese de
DNA, revertendo o fluxo normal da informação (trans
crição reversa). Algumas doenças podem ser transmi
tidas por proteínas na ausência de ácidos
nucleicos. Contudo, o papel central que os
ácidos nucleicos desempenham no arma
zenamento e na transmissão da informa
ção biológica é inegável.
Replicação
FIGURA 2.1 Dogma central da biologia molecular.
DNA Pode Transformar Células
Antes da década de 1950, a visão geral era que os
ácidos nucleicos eram substâncias de importância celu
lar limitada. A primeira evidência de que o DNA é o ma
terial genético foi encontrada durante a década de 1920,
mas a demonstração definitiva do papel do DNA não foi
conseguida até 1944. Os experimentos chaves envolve
ram duas cepas de pneumococo, uma bactéria que cau
sa uma forma de pneumonia. Quando cultivadas, uma
cepa formava colônias lisas (smooth), e a outra forma
va colônias rugosas (rough); elas foram denominadas
formas S e R, respectivamente. A forma S é virulenta,
enquanto a forma R é não-virulenta, e as duas formas
são geneticamente distintas e não se interconvertem
espontaneamente. Tratamento de bactérias da forma
R com DNA puro extraído da forma S resultou em sua
transformação na forma S. A transformação foi her
dada permanentemente pelas gerações subsequentes.
Isso demonstrou que o DNA era o agente transformante
e o material responsável por transmitir a informação
genética de uma geração para a seguinte. A Correlação
Clínica 2.1 descreve vacinas baseadas na transforma
ção de células de mamíferos por DNA.
Capacidade de Informação do DNA
É Enorme
Uma característica notável do DNA é sua capacida
de de codificar uma enorme quantidade de informação
biológica. Por exemplo, uma célula humana contém
informação para a síntese de cerca de 20.000 a 25.000
proteínas. Essa informação é armazenada no núcleo da
célula, uma estrutura de cerca de 0,00001 m de diâme
tro. Apesar dessa compactação, a informação do DNA
é facilmente acessada e duplicada, sob comando. A ca
pacidade de armazenar grandes quantidades de infor
mação em moléculas e acessá-la facilmente está muito
além da moderna tecnologia de informação. A capacida
de dos ácidos nucleicos para manter e transmitir a in
formação arquivada eficientemente advém diretamente
de sua estrutura química.
Transcrição Tradução
DNA RNA Proteína
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO
Purinas E ESTRUTURA • 31

2.2 COMPONENTES
NH2
ESTRUTURAIS DOS ÁCIDOS N
7
5
6
N1
NUCLEICOS: NUCLEOBASES, 8
2
N9 N
NUCLEOSÍDEOS E H
4
3

NUCLEOTÍDEOS adenina
O
Ácidos nucleicos são polímeros lineares de unida
N N N H
des nucleotídicas. Cada nucleotídeo consiste de um
éster de fosfato, um açúcar pentose e uma nucleobase
heterocíclica. No RNA, o açúcar é D-ribose; no DNA, é HN NH2
o açúcar estreitamente relacionado 2-desoxi-D-ribose.
Em ambos os casos, a base é ligada à posição 1 do açú guanina
car por uma ligação -N-glicosídica. Duas classes princi
pais de nucleobases são encontradas nos ácidos nuclei Piramidinas
cos: purinas e pirimidinas (Figura 2.2). As principais NH2
4
purinas são guanina e adenina, que ocorrem no DNA e
5 N3
no RNA e são ligadas ao açúcar em N-9. As três nucle
2
obases pirimídicas principais são a citosina, a uracil e 6
N1 O
a timina. A citosina está presente no DNA e no RNA.
Entretanto, a uracil é geralmente encontrada apenas H
no RNA, e a timina é geralmente encontrada apenas no citosina
DNA. Cada pirimidina é ligada ao açúcar pela posição
O
N-1. Uma nucleobase glicosilada com açúcar pentose é
um nucleosídeo. Nucleosídeos que contêm ribose são ri R H
N
bonucleosídeos (Figura 2.3), enquanto aqueles com de
soxirribose são desoxirribonucleosídeos (Figura 2.4). N O
Quatro ribonucleosídeos são comumente encontrados
H
no RNA – adenosina (A), guanosina (G), citidina (C) e
uridina (U) – e quatro desoxirribonucleosídeos no DNA uracil (R = H)
– desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG), deso timina (R = CH3)
xicitidina (dC) e desoxitimidina (dT). Além disso, mais
de 80 nucleosídeos minoritários foram encontrados em FIGURA 2.2 Principais bases púricas e pirimídicas
ácidos nucleicos de ocorrência natural. encontradas no DNA e no RNA.
Nucleotídeos são ésteres de fosfato dos nucleosí
deos (Figura 2.5). Qualquer grupo hidroxila de seus O NH2 NH2
açúcares pode ser fosforilado, mas as bases não são. N N N
Os nucleotídeos que contêm um fosfato monoéster são NN
OH5! OH O N O
nucleosídeos monofostato. Por exemplo, o 5!-nucleotí
4! 1!
deo da desoxicitidina é desoxicitidina 5!-monofostato 3! 2!
(5!-dCMP). Mais de um fosfato pode estar ligado por OH OH OH OH
uma ligação anidrido, resultando nos correspondentes
adenosina citidina
ésteres di-, tri- e tetrafosfato. O 5!-trifosfato de guano A C
sina é guanosina 5!-trifosfato (GTP). Fosfato diésteres
O O
são também possíveis, incluindo os importantes segun
N NH NH
dos mensageiros – adenosina-3!,5!-monofosfato cíclico
(cAMP) e guanosina-3!,5!-monofosfato cíclico (cGMP). OH NN NH2 OH O N O
O uridina

OH OH OH OH
guanosina
G U

FIGURA 2.3 Estruturas dos ribonucleosídeos.

São mostradas as abreviaturas de uma letra para cada com
posto. Essas abreviaturas são também usadas para bases e
nucleotídeos correspondentes e, em alguns casos, para os de
soxirribonucleosídeos.
32 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

O NH2 NH2 Propriedades Físicas de Nucleosídeos

N N N
e Nucleotídeos
HO N N HO O N O
Em graus variáveis, nucleobases, nucleosídeos e
nucleotídeos são todos solúveis em água numa ampla
HO HO faixa de pHs. Em pHs biologicamente relevantes (pH
6-8), nucleobases e nucleosídeos são espécies neutras.
desoxiadenosina desoxicitidina Os primeiros pKas de fosfato mono e diésteres são 1;
dA dC
portanto, os nucleotídeos carregam uma carga negativa
O O em pHs fisiológicos. O segundo pKa de um fosfato mo
NNH H3CNH noéster é 6,5, e há um equilíbrio entre o monoânion e o
diânion em pHs neutros. A presença de grupos fosfato
HO O N NNH2 HO O N O carregados em nucleotídeos fornece pontos para intera
ções eletrostáticas com pontos carregados positivamen
te em proteínas e íons metálicos.
HO HO
desoxiguanosina desoxitimidina Nucleosídeos e nucleotídeos são estáveis numa am
dG dT pla faixa de pH. Em condições fortemente básicas, a
hidrólise dos ésteres de fosfato ocorre lentamente. Li
FIGURA 2.4 Estruturas dos desoxirribonucleosídeos. gações N-glicosídicas de nucleosídeos e nucleotídeos são
A presença de 2-desoxirribose é abreviada por um “d” prece estáveis nessas condições, mas em condições ácidas
dendo a notação de uma letra. Note que timidina (T) é frequen são consideravelmente mais lábeis. Em temperaturas
temente usada alternativamente para desoxitimidina (dT).
elevadas, a protonação das bases púricas (G e A) re
sulta em rápida quebra da ligação entre o açúcar e a

CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.1

Vacinas de DNA
Procedimentos de vacinação tradicionais usam
componentes de um organismo infeccioso, organismos
mortos ou células intactas atenuadas para induzir a
produção de anticorpos específicos que possam forne
cer imunidade ativa aos indivíduos. Tais vacinas for
neceram proteção, com sucesso, contra doenças como
pólio, varíola, coqueluche (pertussis), febre tifoide e
difteria. Entretanto, o desenvolvimento de imuniza
ções contra patógenos infecciosos como HIV e malária
tem sido difícil. O enorme impacto em todo o mundo
desses patógenos, o uso em potencial de outros em
bioterrorismo, e o problema crescente de resistência
a antibióticos estimularam os esforços para produzir
novas vacinas.
Uma abordagem recente para imunização usou
DNA contendo uma sequência do genoma do patóge
no. Esse DNA é tipicamente um plasmídeo bacteriano,
engenheirado para incluir a sequência de uma proteí
na antigênica do patógeno. Esse DNA pode entrar em
vários tipos de células, e pode ser expresso lá usando
a maquinaria celular de transcrição e tradução. Nesse
sentido, vacinas de DNA atuam de modo semelhante
aos vírus. Não obstante, esses DNAs contêm apenas
uma quantidade muito limitada de informação genéti
ca e não podem se tornar infecciosos. Os mecanismos
de captação e indução de resposta imune ainda não
estão esclarecidos. Contudo, resultados promissores
foram observados contra vários vírus, bactérias e mi
crorganismos parasitas. Essa abordagem é muito pro
missora para o desenvolvimento de vacinas efetivas
contra doenças sem tratamento, incluindo HIV/AIDS,
tuberculose e malária.
Vacinas de DNA também podem ser úteis para a
vacinação contra o câncer. Enquanto antígenos apre
sentados por células tumorais são fracamente imuno
gênicos, estudos modelos usando DNA plasmidial de
monstraram resultados promissores. Camundongos
vacinados, por via oral, com plasmídeos cultivados em
bactérias Salmonella atenuadas foram capazes de re
tardar ou parar completamente o crescimento de uma
dose letal de células de carcinoma. A morte da bactéria
presumivelmente libera um grande número de plasmí
deos, que são captados por células apresentadoras de
antígenos do sistema imune. Extensão desse trabalho
ao homem está atualmente em investigação.
Kutzler, M. A. e Weiner, D. B. DNA vaccines: Ready for
prime time? Nature Rev. Genet. 9:776, 2008; Belakova, J.,
Horynova, M., Krupka, M., Weigl, E. e Raska, M. Arch. Immol.
Ther. Exp. 55:387, 2007; Cui, Z. DNA vaccine. Adv. Genet.
54:257, 2005; e Chiarella, P., Massi, E., Robertis, M., Fazio,
V. M. e Signori, E. Strategies for effective naked-DNA vacci
nation against infectious diseases. Recent Pat. Anti-Infect.
Drug Discovery 3:93, 2008.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 33

base. Os nucleosídeos e nucleotídeos de pirimidinas (C, Propriedades Estruturais de

T e U) são muito mais resistentes ao tratamento por
ácido. Condições que quebram a ligação glicosídica (p. Nucleosídeos e Nucleotídeos
ex., ácido perclórico 60% a 100 C) também levam à des
Uma característica marcante dos nucleosídeos e nu
truição do açúcar.
cleotídeos é o número considerável de conformações pos
Moléculas que contêm bases púricas e pirimídicas síveis que podem adotar. Ao contrário dos anéis de seis
absorvem fortemente luz UV. Purinas, bem como nu membros, anéis de cinco membros são muito flexíveis. Os
cleosídeos e nucleotídeos contendo purinas, têm coe átomos do anel de cinco membros de um açúcar pentose
ficientes de extinção molar mais altos (absorvem luz não são coplanares; tipicamente, um ou dois dos átomos
mais fortemente) do que os derivados de pirimidinas. do anel deslocam-se para fora do plano. Em anéis de ci
O comprimento de onda de UV no qual ocorre máxi clopentano, há várias conformações em envelope e meia
ma absorção varia, mas fica geralmente próximo de -cadeira que se interconvertem rapidamente. Por causa
260 nm. Em virtude do alto coeficiente de extinção das do padrão assimétrico de substituição do anel da pentose
nucleobases e sua alta concentração nos ácidos nuclei nos nucleosídeos, duas conformações são preferidas (Fi
cos, a absorbância a 260 nm pode ser usada para medir, gura 2.6). Esses modos de torcer os açúcares são defi
com precisão, a quantidade de ácidos nucleicos (DNA e nidos pelo deslocamento dos carbonos 2! e 3! acima do
RNA) presentes numa amostra. Análise mais profunda plano dos átomos C1! – O4! – C4!. Por convenção, acima é
e separação de nucleobases, nucleosídeos, nucleotídeos a direção na qual a base e C5! se projetam do anel, e é de
e ácidos nucleicos podem ser feitas por uma diversidade nominada face endo da pentose. Se C2! estiver deslocado
de técnicas, incluindo cromatografia líquida de alto de para cima do anel da pentose, a conformação é C2!-endo.
sempenho (HPLC), cromatografia de camada delgada Na segunda torção comum, C3! é deslocada em direção
(TLC), cromatografia em papel e eletroforese. à face endo, e é chamada C3!-endo. Note que os grupos
ligados ao açúcar ficam em orientações muito diferentes
em cada uma dessas conformações. Por exemplo, os gru
NH2 pos 5!- e 3!-fosfatos ficam muito mais afastados na torção
N
C2!-endo do que na C3!-endo. A orientação da ligação
glicosídica também muda significativamente nas duas
O
O
N O conformações. Conformações C2!-endo e C3!-endo estão
P O
O O em rápido equilíbrio. Um substituinte eletronegativo na
posição 2! da pentose favorece a conformação C3!-endo.
HO Portanto, ribonucleosídeos no RNA preferem essa torção
do açúcar, uma vez que possuem um grupo 2!-hidroxila.
desoxicitidina 5-monofosfato
dCMP
Os 2!-desoxinucleosídeos do DNA contêm um hidrogê
nio no lugar do grupo 2!-OH, e a conformação C2!-endo
O é preferida.
N
NH As bases nos nucleosídeos são planas. Embora a ro
O P O P O P O NN
NH2
tação livre em torno da ligação glicosídica seja possível,
O
duas orientações da base em relação ao açúcar predo
O O O O O O minam (Figura 2.7). Nas purinas, a conformação anti
HO OH coloca H8 sobre o açúcar, enquanto a conformação syn
posiciona esse átomo longe do açúcar e coloca a maior
guanosina 5-trifosfato
GTP parte da purina bicíclica sobre o açúcar. As purinas se
interconvertem rapidamente entre as duas conforma
NH2 ções, mas favorecem a orientação anti. Contudo, guani
O N
ON N na 5!-nucleotídeos são exceções. Nesses casos, intera
ções favoráveis entre o grupo 2-NH2 e o grupo 5!-fosfato
O O
N estabilizam a conformação syn. 2!-Desoxiguanosina
5!-monofosfato (dGMP), por exemplo, prefere a con
P formação glicosídica syn. Essa preferência também foi
O O OH observada no DNA fita-dupla, em sequências de Gs e Cs
adenosina 3,5-monofosfato cíclico alternados. A conformação syn dos resíduos G nesses
cAMP DNAs resulta na formação de uma hélice pouco usual,
que gira para a esquerda, chamada Z-DNA (p. 43). Nas
FIGURA 2.5 Estruturas de alguns nucleotídeos
pirimidinas, o átomo H6 fica acima do anel de pentose
representativos. na conformação anti, e o átomo O2, maior, fica acima
do anel na conformação glicosídica syn. As pirimidinas,
portanto, mostram uma grande preferência pela confor
mação com menos impedimento estérico anti.
34 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

OP a centenas de milhões de resíduos. Tipicamente, fitas

O base de ácidos nucleicos contendo 50 nucleotídeos ou me
nos são chamados oligonucleotídeos, enquanto os mais
7.0 Å C-2! endo
longos são polinucleotídeos. A ligação fosfodiéster liga
OP “Sul” o grupo 5!-hidroxila de um resíduo ao grupo 3!-hidro
xila do seguinte. Ligações entre dois 5!-OHs ou dois
3!-OHs não são vistas no DNA de ocorrência natural.
A direcionalidade dessa ligação significa que oligo- e
base
P O O polinucleotídeos lineares têm uma extremidade que
termina em 5!-OH, e outra que termina em 3!-OH. Essas
5.9 ÅOP extremidades são as extremidades 5! e 3!, respectiva
mente. Polinucleotídeos circulares não têm nenhuma
C-3! endo
“Norte”
extremidade livre, e são formados unindo-se a extre
midade 5! de um polinucleotídeo linear com sua própria
FIGURA 2.6 Conformações preferenciais de açúcares extremidade 3!, por uma ligação fosfodiéster. Tanto em
pentoses. polinucleotídeos lineares como circulares, o esqueleto
Duas conformações produzem variações na orientação relativa açúcar-fosfodiéster é muito uniforme, e a diversidade
da base (com relação ao açúcar) e na distância entre os grupos química surge primariamente das bases. A sequência
3!- e 5!-fosfato (P). Finalmente, essas diferenças afetam a con
de bases dá a cada molécula uma identidade química
formação geral do complexo dupla-hélice.
singular (Figura 2.9). Esse arranjo é análogo ao de poli
H NH2N HO
H2 NH2H peptídeos e proteínas (p. 85), nos quais as variações na
N estrutura química primária surgem da identidade das
H 6 N O 2 cadeias laterais dos aminoácidos.
HO O N O O N
H
Conformações dos Polinucleotídeos
OH OH As bases são, em grande parte, responsáveis pelas
anti syn conformações dos polinucleotídeos. As bordas das ba
H
O
ses contêm átomos de nitrogênio e oxigênio (grupos
O N —NH2, =N- e =O) que podem interagir com outros
HO8 N H HON OH grupos polares ou moléculas de água adjacentes. As
N
N N NH2 N H faces dos anéis, contudo, não podem participar de tais
HO HO OH
anti HOsyn
O N interações e tendem a evitar o contato com a água.
Ao contrário, interagem umas com as outras, produ
zindo uma conformação empilhada. O empilhamento
de bases reduz a área de superfície hidrofóbica que
deve ser solvatada por moléculas polares de água. Ali
beração dessas moléculas de água no solvente é entro
FIGURA 2.7 Conformações glicosídicas de purinas e picamente favorável. O arranjo empilhado das bases é
pirimidinas. mais estabilizado por interações eletrônicas favoráveis
Nas pirimidinas, fatores estéricos entre o açúcar e o O2 da base
(forças de van der Waals). Como outros sistemas aro
desfavorecem fortemente a conformação syn. Nas purinas, as
conformações anti e syn se interconvertem facilmente, sendo máticos, as bases possuem orbitais muito deslocados
anti mais estável na maioria dos casos. A conformação syn é acima e abaixo do plano de seus anéis. A densidade
estabilizada na guanosina 5!-fosfato em virtude das interações eletrônica nesses orbitais pode ser polarizada por di
favoráveis entre o grupo 2-NH2 e os oxigênios do fosfato. polos próximos.

O dipolo induzido resultante pode então interagir

favoravelmente com o grupo polarizador. Essas inte
rações fracas são aumentadas por forças de dispersão
London atrativas (dipolo induzido-dipolo induzido).
2.3 ESTRUTURA DO DNA Como a força dessas interações eletrônicas depende
muito da distância, nenhum espaço vazio fica entre as
Estrutura Polinucleotídica e bases empilhadas.

Propriedades Polinucleotídeos adotam conformações que maxi

mizam as interações de empilhamento favoráveis entre
Ácidos nucleicos são fitas de nucleotídeos ligados as bases vizinhas. As restrições impostas pela estrutura
por ligações fosfodiéster (Figura 2.8). O comprimento do esqueleto açúcar-fosfodiéster favorecem estruturas
dessas fitas varia consideravelmente, de dois resíduos helicoidais (Figura 2.10).
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 35

O A estabilidade geral dessas estruturas helicoidais

extremidade 5! N
N
H Desoxiguanosina depende de fatores que incluem empilhamento de ba
H
ses sequência-dependente, pH, concentração de sais
HO O N N N
e temperatura. Por exemplo, alguns polinucleotídeos
H sintéticos, incluindo poli(C) e poli(A), formam héli
H NH
OP ces que giram para a direita nas quais as bases ficam
JOO N N Desoxiadenosina muito empilhadas. Muitos outros polinucleotídeos
permanecem em uma hélice ao acaso (random coil)
O O N
N bastante desordenada. Grandes polinucleotídeos po
dem ter tanto regiões helicoidais como desordenadas,
O
dependendo da sequência local. As características da
H3C N H Desoxitimidina
O solução também determinam se os polinucleotídeos
OJOP O adotam conformações empilhadas. Por exemplo, altas
O
N O concentrações de cátions, especialmente íons poliva
HNH lentes como Mg2+, estabilizam a conformação helicoi
dal por protegerem as cargas dos grupos fosfodiéster
O Desoxicitidina do esqueleto. Sem essa proteção, as cargas negativas
N
OJOP dos grupos fosfato desestabilizariam a hélice por re
O O
O
N pulsão eletrostática.

HO

extremidade 3!

FIGURA 2.8 Estrutura de um DNA polinucleotídeo.

É apresentado um tetranucleotídeo. Geralmente, ácidos nu
cleicos com menos de 50 nucleotídeos de comprimento são
chamados oligonucleotídeos. Ácidos nucleicos mais longos são
chamados polinucleotídeos.

DNA
A C G T
5! 3!

3! 3! 3! 3! d(ACGT) Empilhadas Não-empilhadas

HO P P P OH
FIGURA 2.10 Conformações empilhada e espiral ao acaso
5! 5! 5! 5! de um polinucleotídeo fita-única.
A faixa helicoidal representa o esqueleto açúcar-fosfato do
RNA polinucleotídeo. As bases são representadas em visão lateral,
A C G U como linhas em contato com suas vizinhas. O desempilhamen
to das bases leva a uma estrutura mais flexível, com bases
2! OH 2! OH 2! OH 2! OH orientadas ao acaso.
3! 3! 3! 3!
pACGU
P P P P OH
Estabilidade do Esqueleto
5! 5! 5! 5!
Polinucleotídico
FIGURA 2.9 Notação resumida para estrutura de
oligonucleotídeos. Polinucleotídeos são relativamente estáveis em solu
A convenção usada para escrever a estrutura de um oligo ou ções aquosas próximas do pH neutro. Estima-se que a
polinucleotídeo é uma barra perpendicular representando o meia-vida de hidrólise das ligações fosfodiéster do DNA
resíduo de açúcar, com a posição 5!-OH do açúcar localizada seja cerca de 200 milhões de anos. Essa alta estabilida
na parte inferior da barra, e o 3!-OH (e 2!-OH, se houver) numa de torna o DNA adequado para o armazenamento em
posição intermediária. Barras unindo posições 3! e 5! represen longo prazo da informação genética. Diferentemente,
tam as ligações 3!→ 5!-fosfodiéster, e o P do lado esquerdo ou o RNA é muito mais susceptível à hidrólise. A presen
direito da barra perpendicular representa um éster 5!-fosfato ça do grupo 2!-OH confere um nucleófilo interno para
ou 3!-fosfato, respectivamente. A base é representada por sua
transesterificação da ligação 3!,5!-fosfodiéster (Figu
inicial colocada no topo da barra. Uma forma resumida alter ra 2.11). O resultado é a cisão do esqueleto polinucle
nativa é usar as iniciais de uma letra para as bases escritas na
direção 5!→3! da esquerda para a direita. Grupos fosfodiéster otídico, deixando um fosfato diéster 2!3!-cíclico em um
internos ficam subentendidos, e fosfatos terminais são deno fragmento e um grupo 5!-OH livre no outro. A maior
tados com um “p”. Sequências de oligonucleotídeos contendo labilidade hidrolítica do RNA torna-o menos adequado
desoxirribose como açúcares são precedidos por um “d”. como material genético do que o DNA.
36 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
Embora o esqueleto do DNA seja relativamente
estável à hidrólise, numerosas enzimas (nucleases)
catalisam a cisão do fosfodiéster. Essas nucleases são
caracterizadas pelos tipos de polinucleotídeos que
hidrolisam e pelas ligações específicas que quebram.
Exonucleases clivam o último resíduo de nucleotídeo
nas extremidades 5!- ou 3!- de um polinucleotídeo. A
remoção passo a passo de nucleotídeos individuais de
uma extremidade de um polinucleotídeo pode resultar
em sua completa degradação. Endonucleases clivam
ligações fosfodiéster localizadas no interior dos poli
nucleotídeos. Elas não requerem uma extremidade li
vre; portanto, também podem clivar polinucleotídeos
circulares. Endonucleases como DNase I e DNase II
hidrolisam DNA com pouca seletividade para sequên
cias. As endonucleases de restrição reconhecem e cli
vam sequências muito específicas. Nucleases também
apresentam especificidade com respeito à estrutura
geral dos polinucleotídeos. Por exemplo, algumas nu
cleases agem tanto sobre polinucleotídeos fita-única
como fita-dupla, enquanto outras discriminam entre
essas duas estruturas. Algumas agem sobre ambos,
DNA ou RNA, enquanto outras são ativas apenas sobre
um tipo de polinucleotídeo.
DNA de Dupla-Hélice
Com o reconhecimento, no início e no meio do sé
culo XX, que o DNA funcionava como repositório da
informação genética, intensificou-se o trabalho para
estabelecer a base estrutural do armazenamento de in
formação.
Experimentos de síntese e difração de raios-X le
varam à aceitação de uma estrutura polinucleotídica
linear para o DNA. Três peças chaves de informação
O O
O
P OH Base
O OH
O O
O P
O O
O O
Base
HO
O OH
FIGURA 2.11 A hidrólise do RNA é acelerada pela participação do grupo 2!-OH.
O ataque nucleofílico intramolecular pelo grupo 2!-OH da ribose aumenta muito a
velocidade de clivagem hidrolítica do esqueleto fosfodiéster, especialmente sob con
dições básicas. O fosfodiéster 2!,3!-cíclico resultante pode reagir subsequentemente
com água ou hidróxido, formando uma mistura de 2!- e 3!-fosfato monoésteres.
foram necessárias para a dedução da estrutura tridi
mensional do DNA. A primeira foi a descoberta que o
DNA não continha quantidades iguais de cada um dos
quatro nucleosídeos, mas sim quantidades variáveis em
diferentes organismos. Entretanto, verificou-se que a
abundância de desoxiadenosina era sempre igual à de
desoxitimidina, e a quantidade de desoxiguanosina, à
de desoxicitidina. Isso levou à proposição de estruturas
com nucleosídeos pareados especificamente, dois a dois
(dA com dT e dG com dC). A segunda foi que dados
de difração de raios-X sugeriam que o DNA contivesse
estruturas em dupla-hélice, e a simetria sugeria que as
duas fitas polinucleotídicas eram orientadas de modo
antiparalelo, uma em relação à outra. A terceira foi a
sugestão de que as nucleobases estavam nas formas
tautoméricas ceto e amino, em vez das formas enol e
imino. Tautômeros são isômeros de uma molécula que
diferem na posição de apenas um átomo de hidrogênio.
Cada uma das quatro nucleobases tem duas ou mais
formas tautoméricas possíveis, que estão em equilíbrio
(Figura 2.12). A identificação incorreta das estruturas
tautoméricas predominantes significou que os pesqui
sadores estavam tentando formar pares de base usan
do padrões incorretos de pontes de hidrogênio. Com o
tautômero certo, um modelo para o DNA rapidamente
se encaixou.
A estrutura que Watson e Crick propuseram em 1953
para o DNA dupla-hélice foi atraente por sua simplicida
de e simetria (Figura 2.13). Além disso, explicava todos
os dados estruturais disponíveis para o DNA e imedia
tamente levou às hipóteses quanto aos mecanismos de
armazenamento e replicação da informação genética.
A dupla-hélice de Watson–Crick pode ser visualizada
como o resultando do enrolamento de duas fitas polinu
cleotídicas que formam hélices girando para a direita,
em torno de um eixo comum. As fitas
fazem contato por pontes de hidrogênio
Base formadas nas bordas hidrofílicas das
O bases. Os grupos N—H das nucleoba
ses são bons doadores de pontes de hi
drogênio, e o par de elétrons dos oxigê
O nios sp2-hibridizados dos grupos C=O
e dos nitrogênios dos grupos =N- são
bons aceptores de hidrogênio. O parea
mento ocorre quando um aceptor e um
doador estão em posição para formar
O Base uma ponte de hidrogênio. Essas pontes
se formam entre resíduos de purina de
uma fita e resíduos de pirimidinas da
O OH
outra, e a combinação de doadores e
aceptores de pontes de hidrogênio re
sulta em dois tipos de pares de bases:
adenina–timina e guanina–citosina
(Figura 2.14). Uma consequência di
reta dessas especificidades de pontes
de hidrogênio é que o DNA dupla-fita
(dsDNA, double-stranded DNA) deve
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 37

conter razões de nucleosídeos que concordem com as A relação entre as bases de fitas opostas da dupla
observações experimentais (dA = dT e dG = dC). Final -hélice é descrita como complementaridade. As bases
mente, as geometrias dos pares de bases dA/dT e dG/dC são complementares porque cada nucleobase de uma
resultam em distâncias C1!–C1! (~10,6 Å) e orientações fita é pareada, por forma e pontes de hidrogênio, com
de ligações glicosídicas semelhantes. Esse isomorfismo uma base complementar da outra fita (Figura 2.15).
estrutural significa que qualquer dos quatro possíveis Por exemplo, para cada adenina que se projete em di
pares de bases (dA-dT, dT-dA, dG-dC e dC-dG) pode reção ao eixo comum da dupla-hélice, uma timina deve
ser colocado na dupla-hélice, sem mudar significativa ser projetada da fita oposta para estabelecer pontes de
mente a estrutura do esqueleto; note como isso leva à hidrogênio e preencher exatamente o espaço entre as
possível substituição de um par de base por outro, uma fitas. Nem citosina nem guanina se encaixam precisa
chave para o entendimento de como a informação con mente no espaço disponível oposto à adenina, de ma
tida no DNA pode mudar, ou mutar. neira a permitir a formação de pontes de hidrogênio en
tre as fitas. Essa especificidade de pontes de hidrogênio
assegura que toda a sequência de bases de uma fita seja
N H complementar à da outra fita.
NH D NH D/A
NH
O exterior da dupla hélice consiste dos esqueletos
N A D açúcar-fosfato de suas fitas componentes. As duas fitas
O A N são alinhadas em direções opostas; se duas nucleobases
O A
adjacentes de uma fita, por exemplo, timina e citosina,
estiverem conectadas na direção 5!→3!, suas nucleoba
amino-ceto imino-ceto
ses complementares da outra fita, adenina e guanina,
estarão ligadas na direção 3!→5!. Esse alinhamento an
tiparalelo produz uma associação estável entre as fitas,
excluindo o arranjo alternativo paralelo.
N O A N OH D/A
NH O enrolamento das duas fitas antiparalelas produz
N N HNH D N N A
uma estrutura que tem duas fendas helicoidais distin
N
NH tas entre os esqueletos açúcar–fosfato (Figuras 2.13 e
H D
2.14). A fenda maior é muito mais larga do que a fenda
menor. Essa disparidade resulta da geometria dos pa
ceto enol res de bases. As ligações glicosídicas entre as bases e as
pentoses do esqueleto não são dispostas diretamente
NH opostas umas às outras, mas estão deslocadas em di
N N HNH N NN NH reção à fenda menor. É significativo que a sequência de
D D/A
nucleotídeos do DNA possa ser discernida sem dissociar
H3CN N
O A H3C OH D a dupla hélice, examinando-se dentro das fendas. Cada
base sempre apresenta os mesmos átomos em cada uma
das fendas da dupla hélice. Esses átomos, então, cons
amino imino tituem um meio importante para o reconhecimento de
sequências específicas no DNA por proteínas e molécu
las pequenas. Por exemplo, N7 das purinas está sempre
disposto na fenda maior e pode servir como aceptor de
A D/A pontes de hidrogênio em interações com grupos doa
dores de proteínas (Figura 2.14). Da mesma forma, o
N NH D N A grupo exocíclico 2-NH2 da guanina sempre se projeta
N na fenda menor e pode formar um impedimento estéri
O A O A
co para a ligação de moléculas pequenas.
ceto enol

FIGURA 2.12 Formas tautoméricas das nucleobases.

O padrão dos grupos doadores (D) e aceptores (A) de pon
tes de hidrogênio varia dependendo do tautômero da base que
está presente. São apresentadas as formas tautoméricas pre
dominantes (esquerda) e uma das formas alternativas (direita)
para cada base. O padrão das pontes de hidrogênio para cada
base também é apresentado; a ambiguidade nas posições —
OH e =NH dos tautômeros minoritários se deve à rotação ou
isômeros desses grupos. As razões de equilíbrio entre a forma
predominante e as outras é superior a 99:1.v
Fatores que Estabilizam DNA de Dupla
Hélice
Interações de empilhamento que estabilizam as es
truturas em hélice de polinucleotídeos de fita-única são
também instrumentos de estabilização da dupla hélice.
A separação entre o interior hidrofóbico das nucleo
bases empilhadas e o exterior hidrofílico dos grupos
carregados açúcar-fosfato é ainda mais pronunciada
na dupla hélice do que nas hélices de fita única. A ten
38 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

dupla-fita é um arranjo mais favorável, que es

Fenda
sencialmente remove as nucleobases do am
maior biente aquoso, ao mesmo tempo que permite
que o esqueleto de fosfato seja muito solvata
do por água.
As interações de empilhamento, uma
Fenda combinação de forças hidrofóbicas e intera
Fenda
maior ções de van der Waals, têm 16-61 kiloJoules
(ou principal) menor
por mol (kJ/mol; 4-15 kilocalorias por mol
[kcal/mol]) de energia de estabilização para
cada par adjacente de bases (Tabela 2.1). A
estabilização adicional da dupla hélice re
sulta da extensa rede de pontes de hidrogê
Fenda nio cooperativas. Geralmente, essas pontes
menor são fracas 10-30 kJ/mol (3-7 kcal/mol), e são
ainda mais fracas no DNA 8-12 kJ/mol (2-3
kcal/mol) em virtude dos impedimentos geo
métricos no interior da dupla hélice. Poderia
parecer que as pontes de hidrogênio entre as
FIGURA 2.13 O modelo Watson–Crick para o DNA. nucleobases poderiam cumulativamente for
À esquerda está um modelo de espaço preenchido do DNA; à direita está um necer estabilização substancial para a dupla
modelo de fita, idealizado. Bases estão empilhadas no interior da hélice, en
hélice. Entretanto, as pontes de hidrogênio
quanto o esqueleto açúcar-fosfato hidrofílico localiza-se no exterior.
Redesenhado com base em: Rich, A. J. Biomol. Struct. Dyn. 1:1, 1983.
em uma dupla hélice simplesmente substi
tuem as energeticamente semelhantes entre
as nucleobases e a água em polinucleotídeos de fita úni
ca. Portanto, pontes de hidrogênio não são a cola que
fenda maior mantém as estruturas de dupla-hélice. Ainda assim,
ao contrário das forças de empilhamento, as pontes de
hidrogênio são muito direcionais e ajudam a discrimi
HN H HN NH O CH 3 nar entre os pares de bases corretos e incorretos. Em
virtude de sua direcionalidade, as pontes de hidrogênio
H
N N N tendem a orientar as nucleobases de modo a favorecer o
N empilhamento. Portanto, a contribuição das pontes de
O
H hidrogênio é indiretamente vital para a estabilidade da
adenina timina dupla hélice.

fenda menor
TABELA 2.1 Energias de Empilhamento de Pares de Bases
fenda maior
Dinucleotídeos
Bases
Pares de Energias de Empilhamento
por Para
H
H N H kJ mol–1 kcal mol–1
O
H N
N H (GC) × (GC) –61,0 –14,6
N N H N
N (AC) × (GT) –44,0 –10,5
O
N H
(TC) × (GA) –41,1 –9,81
guanina H citocina
(CG) × (CG) –40,5 –9,69
fenda menor (GG) × (CC) –34,6 –8,26
(AG) × (CT) –28,4 –6,78
FIGURA 2.14 Pares de bases Watson–Crick.
Pares de bases seletivos são formados entre adenina e timina (TG) × (CA) –27,5 –6,57
e entre guanina e citosina. Note a formação de duas pontes de (AT) × (AT) –27,5 –6,57
hidrogênio no par de bases A-T e de três no par de bases G-C.
(AA) × (TT) –22,5 –5,37
dência de empilhamento dos polinucleotídeos de fita (TA) × (TA) –16,0 –3,82
única pode ser vista como resultante de uma tendência aDados de: Ornstein, R. L., Reim, R., Breen, D. L. e McElroy,
das bases reduzirem seu contato com a água. A hélice R. D. Biopolymers 17:2341, 1978.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 39

5'
H
O
N O H N

O N
Desoxiguanosina N H N Desoxicitidina
N N 3'
O N H O O
O
P H O
O H
O O
O N HN
O
O N O
Desoxiadenosina N NH P Desoxitimidina
N O
N
O
O O
O
PO O N OHN
H O
H
N O O
Deoxicitidina
Desoxitimidina N NH N N 5' PO Desoxiadenosina
O N O
O O P
O
OP
O O H
HNO N O
Desoxiguanosina
O

O N N N O O
OH
N O

H O

3'

FIGURA 2.15 Formação de pontes de hidrogênio entre bases complementares do DNA

dupla-fita.
A interação entre as fitas polinucleotídicas é muito seletiva. A complementaridade depende não só
de fatores geométricos que permitem o encaixe adequado entre as bases complementares das duas
fitas, mas também da formação de pontes de hidrogênio específicas entre as bases complementares.
Note a orientação antiparalela das fitas do DNA dupla-fita. A geometria das hélices não impede um
alinhamento paralelo, mas tal arranjo não é encontrado no DNA.

A importância relativa das forças de empilhamento de aminoácidos em proteínas podem proteger os grupos
versus pontes de hidrogênio na estabilização da dupla fosfatos e diminuir as forças repulsivas.
hélice nem sempre foi apreciada. Experimentos com
reagentes que reduzem a estabilidade da dupla hélice
(desnaturantes) ilustram a maior importância relativa TABELA 2.2 Efeitos de Vários Reagentes sobre a
Estabilidade da Dupla Hélicea
das interações de empilhamento (Tabela 2.2). Esses re
sultados mostram que o efeito desestabilizante de um Solubilidade de Molaridade que
reagente não está relacionado com sua capacidade de Reagente Adenina × 10–3 Produz 50% de
quebrar pontes de hidrogênio, mas é determinada pela (em reagente 1 M) Desnaturação
solubilidade das bases livres nesse reagente. À medida
que o reagente se torna um solvente melhor para as ba Etilureia 22,5 0,60
ses, a força que determina o empilhamento diminui, e a Propionamida 22,5 0,62
dupla hélice é desestabilizada.
Etanol 17,7 1,2
Forças eletrostáticas também têm um efeito sobre a Ureia 17,7 1,0
estabilidade e a conformação da dupla hélice. Os grupos
Metanol 15,9 3,5
fosfodiéster estão ionizados no pH fisiológico; assim, o
exterior da dupla hélice carrega duas cargas negativas Formamida 15,4 1,9
por par de bases. A repulsão eletrostática entre os fosfa Fonte: Dados de: Levine, L., Gordon, J. e Jencks, W. P. Biochemistry
tos carregados negativamente é desestabilizadora entre 2:168, 1963.
aO efeito desestabilizador dos reagentes apresentados sobre a dupla
as fitas, e tende a separar as fitas complementares. Em
água destilada, as fitas do DNA se separam à tempera hélice é independente da capacidade desses reagentes para quebrar
pontes de hidrogênio. Ao contrário, o efeito desestabilizador é deter
tura ambiente. Entretanto, cátions como Mg2+, esper minado pela solubilidade de adenina. Resultados semelhantes seriam
mina4+ (uma tetramina) e as cadeias laterais básicas esperados se as solubilidades das outras bases fossem examinadas.
40 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Desnaturação e Renaturação tude da forte absorbância das bases púricas e pirimídi

A dupla hélice é desfeita em quase todos os pro
cessos biológicos dos quais DNA participa, incluindo
replicação, transcrição, reparo e recombinação. As
forças que mantêm as duas fitas unidas são adequa
das para fornecer estabilidade, mas suficientemente
fracas para permitirem a fácil separação das fitas. A
dupla hélice é estabilizada, em relação a fitas únicas,
por cerca de 4 kJ/mol (1 kcal/mol) por par de bases,
de modo que uma perturbação relativamente pequena
pode produzir uma separação local de um pedaço pe
queno da dupla-fita. Esses pares de bases podem fechar
de novo, liberando energia livre que pode, então, levar
pares de bases adjacentes a desenrolarem. Dessa ma
neira, pequenas separações da dupla fita podem migrar
ao longo do seu comprimento (Figura 2.16). Assim, em
qualquer momento em particular, a grande maioria das
bases permanece com pontes de hidrogênio, mas todas
as bases podem passar transitoriamente pelo estado de
fita-única. A capacidade do DNA dupla hélice “respirar”
é um pré-requisito essencial para sua função biológica.
cas, o DNA absorve fortemente na região UV, com um
máximo ao redor de 260 nm. Contudo, a absorbância
das bases individuais é reduzida pelas interações ele
trônicas entre as bases empilhadas. A absorbância total
pode ser reduzida em até 40%, quando comparada com
um estado não-empilhado. Essa redução no coeficiente
de extinção das bases agregadas é chamada hipocro
micidade. As interações de empilhamento diminuem
gradativamente à medida que a estrutura ordenada da
dupla hélice é desfeita por aumento na temperatura.
Portanto, um polinucleotídeo completamente desorde
nado tem uma absorbância comparável à soma das ab
sorbâncias de suas purinas e pirimidinas constituintes.
A medida da absorbância de um DNA complexo a
260 nm, enquanto se aumenta lentamente a tempera
tura, é um meio de observar a desnaturação. Em um
experimento de desnaturação térmica monitorada por

A separação das fitas de DNA pode ser estudada

elevando-se a temperatura de uma solução. Em tem
peraturas relativamente baixas, poucos pares de bases
são rompidos, criando uma ou mais bolhas de fitas aber Renaturação
tas (Figura 2.17). Estas bolhas formam-se, inicialmen (rápida)

te, em regiões contendo proporções maiores de pares

adenina-timina, em virtude da baixa energia de empi
lhamento de tais pares. À medida que a temperatura
sobe, o tamanho das bolhas aumenta e o movimento
térmico dos polinucleotídeos eventualmente supera as
forças que estabilizam a dupla hélice. Em temperaturas
ainda mais altas, as fitas se separam e adquirem uma
conformação em espiral aleatória. O processo é mais Renaturação
(lenta) Desnaturação
apropriadamente descrito como transição hélice-para
-espiral, mas é comumente chamado desnaturação ou
fusão.

A desnaturação é acompanhada por várias mudan

ças físicas na solução contendo DNA, incluindo um au
mento na densidade de flutuação, uma redução na vis
cosidade, uma alteração na capacidade de girar a luz
polarizada e mudanças na absorção de luz UV. A última
é frequentemente usada para seguir, experimentalmen
te, o processo de desnaturação (Figura 2.18). Em vir
Reassociação
Desnaturação
ao acaso

FIGURA 2.17 Desnaturação do DNA.

Em temperaturas altas, a estrutura em dupla-fita do DNA é
FIGURA 2.16 Migração de bolhas pelo DNA dupla-hélice. completamente perdida, com eventual separação das fitas e
O DNA contém pedaços curtos de fitas abertas que podem se formação de espirais abertas de fita-única. Desnaturação tam
mover ao longo da hélice. bém ocorre em faixas extremas de pH e de forças iônicas.

espectroscopia de absorção, a absorbância do polinu
cleotídeo muda muito lentamente no início, depois sobe
rapidamente até um valor máximo. Antes da subida, o
DNA é dupla-fita. Na parte ascendente da curva, um
número crescente de pares de bases é quebrado. A se
paração total das fitas ocorre em temperaturas corres
pondentes ao platô superior da curva. A temperatura
do ponto do meio dessa transição, a temperatura de
fusão (Tm), é característica do conteúdo de bases do
DNA em condições padrões de concentração e força iô
nica. Quanto mais alto o conteúdo de guanina-citosina,
mais alta a temperatura de transição entre hélice dupla
-fita e simples-fita. Essa diferença em valores de Tm é
atribuída à estabilidade aumentada dos pares guanina
-citosina, que resulta de interações de empilhamento
mais favoráveis.
O DNA é desnaturado em pH>11,3, quando os gru
pos N-H das bases ficam desprotonados, impedindo que
participem das pontes de hidrogênio. A desnaturação
alcalina é frequentemente usada para evitar danos ao
DNA que podem ocorrer em altas temperaturas ou pH
baixo. Desnaturação também pode ser induzida em bai
xas forças iônicas, em virtude da maior repulsão entre
os fosfatos carregados negativamente da fitas, e por
vários agentes desnaturantes (compostos que podem
efetivamente formar pontes de hidrogênio com as ba
ses, ao mesmo tempo em que quebram interações hi
drofóbicas de empilhamento). Uma curva de desnatu
ração completa semelhante à mostrada na Figura 2.18
é observada a uma temperatura relativamente baixa e
constante por variação na concentração de um desna
turante adicionado, como ureia.
Faixa de transição
1.4
)
m
n cionados para pareamento de bases. Após a formação
(tlar2i6ve0
ieópdact
i H
s 1.3
n 1.2
1.1 Tm
D de uma dupla hélice curta serve como ponto de nuclea
1.0
30 50 70
(°C)
FIGURA 2.18 Perfil de temperatura-densidade óptica
para DNA.
Quando DNA é aquecido, a absorância a 260 nm aumenta com
a elevação da temperatura. Um gráfico no qual absorbância
versus temperatura é plotado é chamado de curva de fusão.
Densidade óptica relativa é a razão da absorbância em qual
quer temperatura àquela em baixa temperatura. A tempera
tura na qual metade da densidade óptica máxima é obtida é a
temperatura do ponto do meio (Tm).
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 41
Fitas complementares de DNA, separadas por des
naturação, podem voltar a formar dupla-hélice, se tra
tadas apropriadamente. Isso é chamado renaturação
ou anelamento. Se a desnaturação não for completa e
poucas bases permanecem com pontes de hidrogênio
entre as duas fitas, a transição hélice-para-espiral é
rapidamente reversível. Anelamento é possível mesmo
depois de as fitas complementares terem sido comple
tamente separadas. Nessas condições, o processo de
renaturação depende do encontro de fitas de DNA com
plementares, de maneira que possa levar à formação da
estrutura original. Não é surpreendente que seja um
processo lento, dependente de concentração. Quando a
renaturação começa, algumas das pontes de hidrogê
nio formadas são formadas entre curtos segmentos do
polinucleotídeo, que podem ter estado distantes na es
trutura original nativa. Essas estruturas com bases pa
readas aleatoriamente têm vida curta porque as bases
em torno desses segmentos complementares curtos não
podem parear e, assim, não podem formar estruturas
estáveis totalmente unidas por pontes de hidrogênio.
Uma vez que as nucleobases corretas comecem a parear
por acaso, a dupla hélice é formada rapidamente ao lon
go de toda a molécula do DNA.
O início brusco da desnaturação ou da renaturação
revela a natureza tudo-ou-nada da transição hélice
-para-espiral ou espiral-para-hélice. O processo de re
naturação requer a formação de uma região curta com
dupla-hélice para iniciar a formação da dupla hélice
(Figura 2.19). Isso começa com a formação de um úni
co par de bases, que é bastante instável. Entretanto, a
formação de um segundo par de bases vizinho é aumen
tada porque o processo é agora menos entropicamente
desfavorável. À medida que novos pares de bases come
çam a formar uma estrutura empilhada, a formação dos
pares de bases subsequentes é ainda mais facilitada.
0 Os nucleotídeos não-pareados de cada fita começam a
empilhar na hélice em crescimento, otimamente posi
l
tua de uma dupla hélice com quatro a cinco pares de ba
cen ses, uma dupla hélice estável se forma, e o restante do
er complexo rápida e espontaneamente se fecha como um
p
ia “zipper”. Após a formação do par de bases inicial, o em
rom
rc pilhamento e o pareamento de bases não são eventos
e
ip independentes, mas são influenciados pelos pares vizi
nhos. Tal processo é chamado cooperativo. A presença
50
ção para o anelamento porque facilita a formação dos
100
90 pares de bases subsequentes. A desnaturação é o mes
mo processo, ao reverso: uma bolha serve como ponto
de início do desempilhamento de nucleobases e como
rápida “abertura do zipper” da hélice.
42 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

C G C G C G C G C G C G
GC
G C G C G C
G C G C
T A muito T A T A T A T A rá[pido TA
C G lento C G C
G C G C G CG

A T A T A T A T A T AT

T A T A T A T A T A T A

G C G C G C G C G C G C

formação do ponto de nucleação propagação da hélice

FIGURA 2.19 Cooperatividade de renaturação/desnaturação de duplas hélices de DNA.

Durante a renaturação, a formação do primeiro par de base correto é muito lenta. Anelamento de pares vizinhos é facilitado, especial
mente após formação de um sítio de nucleação com 3 a 5-pb. Desnaturação segue um processo semelhante, mas a ordem das etapas
é invertida. Redesenhado de Saenger, E. Principles of Nucleic Acid Structure. New York: Springer-Verlag, 1984, p. 141.

Hibridização
Uma técnica baseada na associação de fitas poli
nucleotídicas complementares, a hibridização foi de
senvolvida para a detecção e a quantificação de sequ-
ências específicas de ácidos nucleicos alvos. Estas são
importantes ferramentas básicas na biologia molecu
lar contemporânea e estão sendo usadas para deter
minar (a) se certa sequência ocorre no DNA de um
organismo em particular, (b) um parentesco genético
ou evolutivo entre diferentes organismos, (c) o núme
ro de genes transcritos em um mRNA específico, e (d)
a localização de uma dada sequência de DNA. Elas são
baseadas no anelamento de um polinucleotídeo com
plementar, chamado sonda (probe), que é marcado
apropriadamente para fácil detecção do híbrido dupla
-hélice.
Em um experimento típico, o DNA ou o RNA a ser
testado por hibridização é desnaturado e imobiliza
do por ligação com uma matriz insolúvel adequada.
Sondas de DNA marcadas são, então, postas para hi
bridizar com as sequências complementares ligadas
à matriz (Figura 2.20). Sondas são oligonucleotídeos
curtos, fita-única, de DNA ou RNA, que são comple
mentares às sequências específicas de interesse. Em
condições adequadas, as sondas interagem somente
com o segmento de interesse, indicando se está pre
sente em uma amostra de DNA em particular. As mo
léculas das sondas geralmente têm >20 nucleotídeos
de comprimento. Marcadores apropriados incluem ele
mentos radioativos, cromóforos fluorescentes e bioti
na. Como o complexo dupla-hélice contendo a sonda
hibridizada está geralmente ligado a uma matriz inso FIGURA 2.20 Representação geral de experimentos de
lúvel, as sondas não-hibridizadas podem ser lavadas. hibridização.
A detecção das marcas ligadas permite a quantifica Uma mistura de DNAs desnaturados é tratada com uma sonda
ção direta da sequência de interesse. A determinação de DNA carregando uma marca. A sonda pode hibridizar com
da quantidade máxima de DNA que pode hibridizar aqueles DNAs de sequências complementares. A detecção dos
complexos dupla-hélice permite a detecção e a quantificação
pode estabelecer o grau de homologia entre DNAs de do DNA que contém a sequência de interesse. Aplicações es
diferentes espécies, uma vez que as sequências de ba pecíficas frequentemente contêm etapas para separar e imobi
ses de cada organismo são singulares. As homologias lizar os diferentes DNAs da mistura a ser analisada.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.2
Uso Diagnóstico de Matrizes (Arrays) de DNA em Medicina e Genética
Com o término do Projeto Genoma Humano, uma
riqueza de informação genética está rapidamente se
tornando disponível. A aplicação desse conhecimento
à medicina requer o desenvolvimento de novas técni
cas para monitorar a expressão gênica e para analisar
rapidamente os genes, quanto a mutações. Matrizes
(arrays) de oligonucleotídeos consistem de várias son
das oligonucleotídicas gene-específicas imobilizadas
em pontos definidos de uma matriz sólida (chip). Elas
podem conter milhares de moléculas de sondas diferen
tes, cada uma com um endereço fixo. Chips genéticos
podem, então, ser tratados com os ácidos nucleicos al
vos marcados (DNA ou RNA) derivados de células de
um organismo. A hibridização dos alvos com as sondas
de sequências complementares permite a imobilização
da marca em pontos específicos do chip. A presença de
sequências específicas pode ser determinada, e a quan
tidade de alvo marcado hibridizado a um ponto pode ser
quantificada.
Tais técnicas podem levar ao diagnóstico por análi
se rápida (screening) do DNA genômico quanto a mu
tações associadas a doenças. Por exemplo, matrizes de
DNA de alta densidade, com milhares de sondas oligo
nucleotídicas, têm sido usadas para detectar mutações
que levam à ataxia telangiectasia, uma doença recessi
va caracterizada por alterações neurológicas, infecções
respiratórias recorrentes e vasos sanguíneos dilatados
na pele e nos olhos. Estudos semelhantes examina
ram mutações no gene BRCA do câncer hereditário de
mama e de ovário. Ensaios comparáveis podem ser usa
dos para identificar com precisão patógenos presentes
observadas servem de índices de parentesco evolutivo
e têm sido particularmente úteis na definição da filo
gênese de procariotos. Estudos de hibridização entre
DNA e RNA trouxeram informações muito úteis sobre
o papel biológico do DNA, particularmente o mecanis
mo de transcrição. Matrizes (arrays) de sondas são
úteis para o diagnóstico rápido e definitivo de doenças
genéticas, doenças infecciosas e câncer, como descrito
na Correlação Clínica 2.2.
Conformações do DNA Dupla-Hélice
Os primeiros estudos de difração de raios-X mos
traram que havia mais de uma conformação no DNA
(Figura 2.21). Uma delas, A-DNA, foi encontrada em
condições de baixa umidade e alta concentração de sal.
A adição de solventes orgânicos, como etanol, reduziu a
umidade dessas soluções aquosas. Uma segunda forma
distinta, B-DNA, apareceu sob condições de alta umi
dade e baixa concentração de sal e foi a base para a
estrutura Watson–Crick. Onze conformações distintas
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 43
em uma amostra clínica. A capacidade de medir a quan
tidade de mRNAs em várias células permite identificar
o perfil de expressão gênica. Isso pode levar a técnicas
para avaliar doenças, tal como o câncer, e selecionar
tratamentos individualizados.
Composição
Referência
GTCA
20 9
9 21 9
22 9
23 9
24 9 9
25 26
Teste
Freeman, W.M., Robertson, D.J. e Vrana, K.E. Fundamen
tals of DNA hybridization arrays for gene expression analy
sis. BioTechniques 29:1042, 2000; Stover, A. G., Jeffery, E.,
Xu, J., Persing, D. H. Hybridization array technology. In: D. H.
Persing (Ed), Molecular Microbiology. Herndon, VA: ASM,
2004, 619; e Hacia, J.G., Brody, L.C., Chee, M.S., Fodor, S.P. e
Collins, F.S. Detection of heterozygous mutations in BRCA1
using high density oligonucleotide arrays and two colour
fluorescence analysis. Nat. Genet. 14:441, 1996.
do DNA dupla-hélice foram descritas desde então. Elas
variam em orientação das bases em relação ao eixo e
uma em relação à outra e em outros parâmetros geo
métricos da dupla-hélice. Uma forma, Z-DNA, incorpora
uma hélice que gira para a esquerda em lugar da varie
dade usual que gira para a direita.
O polimorfismo estrutural do DNA dupla-hélice
depende da composição em bases e das condições fí
sicas. A estrutura local do DNA é suficientemente fle
xível para permitir mudanças de conformação que ma
ximizem o empilhamento, ao mesmo tempo em que
minimizem as interações estéricas desfavoráveis. As
preferências de empilhamento de bases podem favo
recer uma conformação sobre outras. Por exemplo,
guaninas consecutivas em uma fita favorecem confor
mações tipo A-DNA. As condições da solução também
desempenham um papel chave na determinação da
conformação favorecida. Moléculas de água interagem
diferentemente com duplas hélices em diferentes con
formações. Por exemplo, os grupos fosfatos no B-DNA
44 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

hélice, que passa através dos pares de bases. As

fendas maior e menor têm mais ou menos a mesma
profundidade, e a fenda menor é relativamente es
treita. A hélice é longa e fina, com aproximadamen
te 10 pares de bases por volta da hélice. O passo por
resíduo é de 3,4 Å, a espessura aproximada das ba
ses. Diferentemente, a estrutura do A-DNA é mais
curta e mais grossa. Há cerca de 11 pares de base
por volta da hélice, com um crescimento vertical de
2,56 Å por resíduo. Para acomodar a espessura das
bases, o par de bases é inclinado em 20 em relação
ao plano perpendicular ao eixo da hélice. O eixo da
hélice é deslocado para o lado da fenda maior dos
pares de bases. Isso resulta em uma fenda maior
muito profunda e uma fenda menor rasa, e forma
um buraco com 3 Å de diâmetro que corre pelo cen
tro da hélice. Baixa umidade favorece a estrutura
A-DNA, que expõe mais superfície hidrofílica ao
solvente que B-DNA.

FIGURA 2.21 As geometrias variadas do DNA dupla-hélice. Z-DNA é uma conformação dupla-hélice radical
Dependendo das condições e da sequência de bases, a dupla hélice mente diferente que gira para a esquerda, para DNA
pode adquirir várias geometrias distintas. Há três famílias principais dupla fita. Geralmente é observada em sequências de
de conformações do DNA: A, B e Z. As formas que giram para a direita, purinas e pirimidinas alternadas, particularmente
B-DNA e A-DNA, diferem na torção do açúcar; isso leva a diferentes d(GC)n. A designação “Z” foi escolhida porque o es
estruturas helicoidas. A forma A é menos torcida em comparação com queleto fosfodiéster assume um arranjo em zigue
a forma B, e a hélice resultante é mais curta e mais grossa. A estrutura -zague, comparado à conformação lisa que carac
Z-DNA é uma hélice que gira para a esquerda, com o esqueleto fazendo
teriza A-DNA e B-DNA. A estrutura Z-DNA é mais
um zigue-zague. A torção do açúcar e as conformações glicosídicas al
ternam de um resíduo para o seguinte, produzindo uma reversão local longa e mais fina que aquela do B-DNA e completa
uma volta a cada 12 pares de bases. A fenda me
da direção da cadeia.
nor é muito profunda e contém o eixo da hélice. Os
são mais acessíveis às moléculas de água do que aque pares de bases são dispostos tão longe na fenda maior
les no A-DNA. Também, grupos polares das bases es que um canal distinto não existe mais. Essas mudanças
tão mais hidratados na conformação B-DNA. De fato, colocam as nucleobases empilhadas na parte mais ex
em sequências ricas em AT, uma matriz ordenada de terna do Z-DNA em vez da sua posição convencional no
moléculas de água ocupa a estreita fenda menor do B interior da dupla hélice.
-DNA (Figura 2.22a). Com uma redução de umidade,
as moléculas de água disponíveis solvatam os grupos
fosfato muito polares, em preferência às bases. A fenda
maior se estreita, permitindo que moléculas de água
façam pontes entre os fosfatos (Figura 2.22b), estabi
lizando assim a conformação A-DNA.
As diferentes conformações do DNA podem ser
agrupadas in três famílias: A-DNA, B-DNA e Z-DNA.
Os parâmetros dessas conformações, apresentados na
Tabela 2.3, foram determinados por métodos de di
fração de raios-X. Deve ser enfatizado que se acredi
ta que a estrutura geral do DNA em organismos vivos
seja do tipo B-DNA. É notável que a conformação B, ao
contrário das formas A e Z, é muito flexível. No B-DNA
nativo, variação local considerável em conformação de (a) (b)
nucleotídeos individuais pode ocorrer. Tais variações FIGURA 2.22 Hidratação das fendas do DNA.
podem ser importantes na regulação da expressão (a) Uma espinha de hidratação organizada preenche a fenda me
gênica, uma vez que podem influenciar a extensão da nor da forma B-DNA. (b) Os fosfatos que delineiam a fenda
ligação do DNA com vários tipos de proteínas regula maior são espalhados por uma rede de águas na forma A-DNA.
tórias. Reproduzido com permissão de Saenger, W. Principles of
Nucleic Acid Structure. New York: Springer-Verlag, 1984, p.
Conformações do DNA na família B apresentam pa 379. Com a gentil permissão de Springer Science and Busi
res de bases que são quase perpendiculares ao eixo da ness Media.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 45

TABELA 2.3 Características Estruturais de A-, B- e Z-DNA.

Características A-DNA B-DNA Z-DNA
Rotação da hélice Direita Direita Esquerda
Pares de bases por volta (cristal) 10,7 9,7 12
Pares de bases por volta (fibra) 11 10 –
Pares de
Passo porbases da hélice
volta por volta (solução) 24,6
– Å 10,5 –
33,2 Å 45,6 Å
Proporções Curta e larga Mais longa e mais fina Alongada e fina
Diâmetro de empacotamento da hélice 25,5 Å 23,7 Å 18,4 Å
Distância entre pares de bases (cristal) 2,3 Å 3,3 Å 3,7 Å
Distância entre pares de bases (fibra) 2,6 Å 3,4 Å –
Eixo da hélice Fenda maior Através dos pares de bases Fenda menor
Conformação do anel do açúcar (cristal) C3! endo Variável Alternada
Conformação do anel do açúcar (fibra) C3! endo C2! endo –
Conformação da ligação glicosídica anti anti anti em C, syn em G

Existem algumas evidências que sugerem que o Z
-DNA influencie expressão e regulação gênicas. Aparen
temente, regiões curtas do DNA contendo purinas e pi
rimidinas alternadas são mais comumente encontradas
nas extremidades 5! de genes, regiões que regulam ati
vidades transcripcionais. Também, a metilação de resí
duos de guanina nas posições C8 e N7 ou de resíduos de
citosina na posição C5 (Figura 2.23) estabilizam a forma
Z. Sequências que não são estritamente purinas e pirimi
dinas alternadas também podem adquirir a conformação
Z por causa da metilação. A sugestão de que Z-DNA po
deria desempenhar um papel na regulação gênica é sus
tentada por modificações nos padrões de metilação que
acompanham o processo de expressão gênica. Entretan
to, o Z-DNA ainda não foi detectado em DNA in vivo.
Estruturas Não-Canônicas do DNA
A-, B- e Z-DNA estão associados principalmente com
variação na conformação dos nucleotídeos constituin
tes do DNA. Reconhece-se agora que mesmo o B-DNA
canônico não é uma estrutura reta, monótona e unifor
me. Ao contrário, o DNA dobra-se e forma estruturas
incomuns, como arranjos cruciformes ou fita-tripla,
quando interage com certas proteínas. Tais variações
na conformação do DNA parecem ser um importante
tema recorrente no processo de reconhecimento mole
humano é rico em sequências homopurina-homopirimi
dina e sequências alternadas de purina-pirimidina.
DNA Dobrado
Sequências de DNA com 4 a 6 adeninas separadas por
espaçadores de 10 pares de bases (pb) produzem con
formações dobradas. Estudos estruturais indicaram que
as fendas menores dessas sequências são comprimidas.
Entretanto, não está claro se a dobra surge dessa carac
terística ou do limite entre essa conformação pouco co
mum e o B-DNA normal. Dobramento do DNA parece ser
um elemento fundamental na interação entre sequências
de DNA e proteínas que catalisam processos centrais,
como replicação, transcrição e recombinação sítio-es
pecífica. O dobramento induzido por interações do DNA
com enzimas e outras proteínas, tais como histonas, não
requer as condições de sequências de nucleotídeos que
são necessárias para dobrar o DNA livre de proteínas. O
dobramento também ocorre em virtude de danos foto
químicos ou pareamento errado de bases, e serve como
sinal de reconhecimento para iniciar o reparo do DNA.
Antibióticos antitumorais que produzem estruturas do
bradas são discutidos na Correlação Clínica 2.3.
NH2

cular do DNA por proteínas e enzimas. Variações na es N

CH3
trutura ou na conformação do DNA são favorecidas por
motivos (motifs) de sequências específicas do DNA, tais O N
como repetições invertidas, palíndromes, repetições no
espelho e repetições diretas (Figura 2.24), bem como HO O
por sequências homopurina-homopirimidina, sequên
cias de fase A e regiões ricas em G. Sequências ricas em
AT, que são propensas a fácil separação de fitas, exis HO
tem perto das origens de replicação do DNA. O genoma
FIGURA 2.23 Estrutura de 5-metildesoxicitidina.
46 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Repetição 5! GGAATCGATCTTAAGATCGATTCC 3! DNA Cruciforme

invertida 3! CCTTAGCTAGAATTCTAGCTAAGG 5!
Repetição 5! GGAATCGATCTTTTCTAGCTAAGG 3!
no espelho 3! CCTTAGCTAGAAAAGATCGATTCC 5!
Repetição
direta 3!
5! CCTTAGCTAGAAGGAATCGATCTT
GGAATCGATCTT 3!
CCTTAGCTAGAA 5!
FIGURA 2.24 Elementos de simetria em sequências de
DNA.
Três tipos de elementos de simetria para sequências de DNA
de dupla fita são mostrados. As setas indicam a relação espe
cial entre esses elementos em cada uma das sequências. Em
repetições invertidas, ou palíndromes, cada fita de DNA é au
tocomplementar com a região invertida que contém os elemen
tos de simetria. Uma repetição no espelho caracteriza-se pela
presença de pares de bases idênticos, equidistantes do centro
de simetria no segmento de DNA. Repetições diretas são regiões
do DNA nas quais uma sequência em particular é repetida. As
repetições não precisam ser adjacentes umas às outras.
Rompimento de pontes de hidrogênio entre as fitas
complementares, e formação de pontes de hidrogênio
intrafitas na região de uma repetição invertida pro
duz uma estrutura cruciforme (Figura 2.25). As alças
(loops) geradas pela formação cruciforme requerem
o despareamento de 3 a 4 bases no fim do “grampo”
(hairpin). Dependendo da sequência, essas estruturas
podem ser só levemente desestabilizantes, porque re
síduos da alça podem permanecer empilhados no final
da hélice.
Especula-se que repetições invertidas podem fun
cionar como comutadores moleculares para a replicação
e a transcrição. Repetições invertidas estão espalhadas
no genoma humano, e geralmente ocorrem próximas a
regiões controles putativas de genes ou próximas à ori
gens de replicação do DNA. Demonstrou-se que estru

CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.3

Antibióticos Antitumorais que Mudam a Forma do DNA

A estrutura local tridimensional do DNA é impor com proteínas HMG também podem contribuir para sua
tante em interações com proteínas envolvidas no repa citotoxicidade. Ligação de proteínas HMG pode sina
ro, na transcrição, na recombinação e na condensação lizar incorretamente que a região danificada do DNA
da cromatina. Foi proposto que antibióticos possam é transcripcionalmente ativa e impedir a condensação
induzir a formação de estruturas de DNA que podem em estruturas de cromatina compactada. Esses com
recrutar essas proteínas com resultados citotóxicos. plexos também perpetuam a lesão porque bloqueiam o
O exemplo mais bem estudado é a droga antitumoral aducto DNA–cisplatina, impedindo o reparo.
cisplatina, um complexo tetracoordenado de platina
2Cl2].
[cis-Pt(NH2 com
combinação) outros
A cisplatina
agenteséantitumorais para
usada sozinha outra
em Zamble, D.B. e Lippard, S.J. The response of cellular proteinsto
cisplatin-damaged DNA. In Lippert, B (Ed.), Cisplatin: Chem
tar uma série de tumores, incluindo câncer testicular, istry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug. New
ovariano, ósseo e pulmonar. Ela forma ligações cruza York: Wiley-VCH, 1999, 73; Bhana, S., Hewer, A., Phillips, D. H.,
das inter e intrafitas em DNA dupla-fita com o último e Lloyd, D. R. Dependent global nucleotide excision repair of
aducto, compreendendo 90% das lesões do DNA. Essas cisplatin-induced intrastrand cross links in human cells. Mu
ligações surgem do deslocamento de cloretos ligados à tagenesis 23:131, 2008. Damsma, G. E., Alt, A., Brueckner, F.,
platina por átomos N7 de duas guaninas vizinhas. Es Carell, T, e Cramer, P. Mechanism of transcriptional stalling at
tudos estruturais de DNA com aducto fazendo ligação cisplatin-damaged DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 14:1127, 2007;
e Mukhopadhyay, R., Dubey, P. e Sarkar, S. Structural chang
cruzada intrafita mostram que a dupla hélice é forte
es of DNA induced by mono- and binuclear cancer drugs. J.
mente dobrada em direção à fenda maior. Na figura a
Struct. Biol. 150:277, 2005.
seguir, (a) DNA Normal e (b) DNA com aducto.
Estruturas dobradas de aductos DNA-cisplatina são
reconhecidas especificamente por várias proteínas que
se ligam ao DNA, tais como proteínas do reparo por ex
cisão de nucleotídeos (NER) e proteínas não-histonas
que se ligam ao DNA, como HMG-1. A citotoxicidade
da cisplatina é um processo complicado mediado por
interações específicas com essas proteínas. Processos Pt
celulares, como transcrição e apoptose, são também
afetados pela formação de aductos DNA-cisplatina. As
lesões propriamente ditas e os complexos aducto–pro
teína provavelmente interferem com a transcrição. Pro
teínas NER são recrutadas para reparar a lesão, mas
o reparo por excisão está sujeito a introduzir quebras
na fita do DNA. O acúmulo dessas quebras induzirá, no
final, apoptose, quando o DNA ficar danificado demais
para funcionar. Interações do aducto cisplatina-DNA (a) (b)
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 47

mente posicionadas na fenda maior podem formar

5! AAT C GG GT G CC A C AT CG A GT CGG AC TT ACC G 3!
tripletes de bases Hoogsteen específicos (Figura
3! TTA G C C C A C GG T G T A GC T C A GCC TG A A T G G C 5! 2.26). Por exemplo, uma timina pode seletivamen
te formar duas pontes de hidrogênio Hoogsteen
Sequência de DNA com repetições invertidas com a adenina de um par A-T. Da mesma forma,
uma citosina protonada pode formar duas pon
tes H Hoogsteen com a guanina de um par G-C,
resultando num triplete de bases isomorfo a T-A
G
T C
-T. O pK!a da citidina é aproximadamente 4,5, e
A A
triplas hélices contendo tripletes C-G-C mostram
C G
uma forte dependência do pH. Entretanto, o efei
A T to de molde do triplete eleva o pK!a aparente da
C G citosina, tornando possível formar triplas hélices,
C G
G C
mesmo em soluções que são moderadamente áci
T A das (pH 6). Os padrões singulares de formação
G C TT ACC de pontes de hidrogênio Hoogsteen de guanina e
5! AAT C GG G 3!
adenina fornecem especificidades semelhantes às
3! TT
A GCC A AT G G C 5! dos pares Watson–Crick. Mudando a orientação
C G das nucleobases da terceira fita na fenda maior, é
A T possível a formação de tripletes Hoogsteen-rever
C G
sos (Figura 2.26). Tripletes seletivos podem ser
G C
G C
formados entre uma adenina e um par A-T, bem
T A como entre uma guanina e um par G-C. Um tri
G C plete Hoogsteen-reverso também pode se formar
T T entre timina e A-T, mas o triplete resultante não
GA é isomorfo aos tripletes pu•pu•pi. Entretanto, o
C
esqueleto é capaz de acomodar as distorções que
Pareamento de bases entre segmentos
complementares na mesma fita de DNA resultam da incorporação desses tripletes.

FIGURA 2.25 Formação de estruturas cruciformes no DNA. Como nos complexos dupla-hélice, o empilha
A existência de repetições invertidas no DNA dupla-fita é uma condi mento de bases desempenha o papel chave na es
ção necessária, mas não suficiente para a formação de estruturas cru tabilização da estrutura triplex. Contudo, juntar
ciformes. Em DNA relaxado, não é provável a formação de cruciformes três fitas com esqueletos carregados negativa
porque o DNA linear acomoda mais pares de bases empilhados e ligados mente, aumenta a repulsão eletrostática. Assim,
por pontes de hidrogênio do que a estrutura cruciforme, tornando a for
o complexo tripla-hélice é menos estável do que a
mação do último termodinamicamente desfavorável. O desenrolamento
é seguido de formação de pontes de hidrogênio intrafita, entre as duas
dupla hélice Watson–Crick. A presença de Mg2+ e
partes simétricas da repetição, produzindo a estrutura cruciforme. A for de outros cátions multivalentes estabiliza a tripla
mação de estruturas cruciformes não é favorecida em regiões de DNA hélice por bloquear as cargas dos fosfatos.
que consistem de repetições no espelho, porque tais cruciformes seriam
construídos a partir de fitas paralelas de DNA, e não antiparalelas. Em Triplas hélices intramoleculares podem se
vez disso, certas repetições no espelho tendem a formar triplas hélices. formar por interrupção do DNA dupla-hélice
com sequências de polipurinas em repetições
turas cruciformes nas origens de replicação do DNA de no espelho. Uma repetição no espelho é uma região
células de mamíferos recrutam proteínas que se ligam como AGGGGA, que tem a mesma sequência de bases
aos cruciformes e funcionam durante a iniciação da sín quando lida em qualquer direção a partir de um ponto
tese de DNA. central. Redobramento gera uma região com tripla-fita
e uma alça de fita única, em uma estrutura chamada
H-DNA (Figura 2.27).
DNA Tripla-Fita
Embora a formação do H-DNA seja termodinamica
Alguns polinucleotídeos, como poli(dA) e poli(dT), mente desfavorável, por causa de uma redução nas inte
combinam-se para formar complexos de três fitas em rações de empilhamento, triplas hélices intramolecula
lugar das duplas hélices esperadas. A estequiometria res foram detectadas em DNA celular quando em tensão
desses complexos requer que uma fita contenha uma de super-hélice. O superenrolamento do DNA fornece a
sequência de homopurina, enquanto as outras duas te energia para direcionar o desenrolamento do DNA que é
nham sequências de homopirimidinas. Mesmo quando necessário para a formação da tripla hélice. A formação
participam de pares de bases Watson-Crick, purinas da tripla-fita produz um relaxamento do superenrola
possuem dois pontos potenciais para estabelecer pon mento negativo. Também, a ligação de proteínas ao DNA
tes de hidrogênio na fenda maior: N7 e O6 para guani fita-única pode estabilizar ainda mais a estrutura H-DNA
na, N7 e 6-NH2 para adenina. Nucleobases apropriada e impedir a degradação da alça por nucleases.
48 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

R
N
N N
H H
N
N
N H
O H
O
H N N
CH3 O CH3
O R
NRO O N N N R N
R N H O

H
N N N
N H H NH H
H
Triplete de bases C Triplete de bases GGC
N
R R

N
N
Triplete de bases TAT N H CH3
NH
N H O O
RN H N
H H
N+ N H H H
N N N N N
R

O H N O N H N O N R N

R H H R Triplete de bases AAT

N N N

+GC N
CH3
H3C O O
O N
H H H
N NR
N H
N O

N N
R
Triplete de bases TAT
(a) (b)

FIGURA 2.26 Triplas hélices.

(a) Tripla-hélice Hoogsteen. Pontes de hidrogênio Hoogsteen entre uma fita de homopurinas de uma dupla hélice e uma fita paralela
de homopirimidinas na fenda maior. Os tripletes de bases isomorfos resultantes TAT e C+GC fornecem ligação sequência-seletiva. (b)
Tripla-hélice Hoogsteen reverso. Triplas hélices podem se formar por ligação antiparalela de um oligonucleotídeo à fenda maior da
fita de homopurina de uma dupla-hélice Watson-Crick. Pontes de hidrogênio Hoogsteen reversa produzem três tripletes possíveis:
GGC, AAT e TAT. O último triplete não é isomorfo com os outros porque os açúcares (representados por R) estão posicionados dife
rentemente com relação aos pares de bases Watson–Crick

Muitas sequências dos genomas eucarióticos têm o
potencial de formar estruturas de DNA tripla-fita. Tais
regiões ocorrem com frequência muito maior do que o
esperado por considerações de probabilidade apenas.
Sequências de polipurinas com mais do que 25 nucleo
tídeos constituem até 0,5% de certos genomas eucarió
ticos. Essas regiões de tripla-hélice em potencial são es
pecialmente comuns próximo a sequências envolvidas
na regulação gênica. Por isso, tem sido proposto que
o H-DNA possa desempenhar um papel no controle da
síntese de RNA (Correlação Clínica 2.4). Outras tare
fas biológicas em potencial foram propostas para o DNA
tripla-hélice, incluindo possíveis papéis na iniciação e
na terminação da replicação e da recombinação. A ca
pacidade do DNA tripla-fita interferir na transcrição
também levou a esforços para utilizar as triplas hélices
intramoleculares para controlar artificialmente a sínte
se de RNA, e a subsequente síntese proteica.
DNA Quatro-Fitas
Nucleotídeos de guanina e polinucleotídeos muito
ricos em G formam novas estruturas tetraméricas cha
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 49

madas G-quartetos, que contêm uma matriz plana de 5! 3!

3! 3!
guaninas conectadas por pontes de hidrogênio Hoogs 3! 3!
teen (Figura 2.28). Polinucleotídeos podem interagir G G
GG
GG
G
T G
T G
T G
T G G
para formar tetraplexos, onde G-quartetos empilham
G G
-se para formar uma estrutura em multicamadas (Fi G G
gura 2.29). Essas estruturas são estabilizadas por Na+ G G
G G
e K+, que interagem com oxigênios da guanina (O6) no G
G
G
G
centro do plano do quarteto ou entre dois planos ad G T G
T
jacentes. Esses cátions estabilizam o complexo, tanto T T T T
eletrostaticamente, por equilibrar as cargas negativas G G G G TGTG
das quatro fitas polinucleotídicas, como por liberar en
tropicamente grande número de moléculas de água na G
GGG
T Paralelo
G
T G T G T
G G
Antiparalelo
G
G
solução. G G
G G
G G
GGG G

(3!) (5!)

5! 5!
5! 5! 5! 3!

FIGURA 2.29 DNA G-quadruplex.

Estruturas de quatro fitas podem surgir por empilhamento de
G-quartetos. Estruturas quadruplex podem ser paralelas ou
antiparalelas (um arranjo possível é mostrado). O último pode
ser formado pelas sequências ricas em G do DNA telomérico.
Redesenhado com base em figura de Siden, R. R. DNA Struc
ture and Function. New York: Academic, 1994.

Embora G-tetraplexos tenham sido observados por

difração de raios-X e espectroscopia NMR, sua exis
tência in vivo não foi provada. Entretanto, as extre
midades dos cromossomos eucarióticos (telômeros)
FIGURA 2.27 Triplas hélices intramoleculares: H-DNA. contêm sequências repetitivas ricas em G. Os telômeros
Regiões de polipurina-polipirimidina do DNA, com uma sime
humanos contêm 800-2.400 cópias da sequência repe
tria repetida no espelho podem formar uma tripla hélice intra
molecular, na qual a terceira fita fica na fenda maior, enquanto
titiva hexamérica d(TTAGGG)n e terminam em uma
sua fita complementar adquire uma conformação de fita única. extensão de fita-única com cerca de 150 nucleotídeos
Redesenhado com base em figura de Siden, R. R. DNA Struc de comprimento. In vitro, oligonucleotídeos com essa
ture and Function. New York: Academic, 1994. sequência podem formar estruturas tetraplex. O papel
que os tetrapetes desempenham na função dos telôme
ros é desconhecido.
N
H
N
H N Entretanto, telômeros estão atraindo atenção como
H N N alvos para novas quimioterapias anticâncer (Correlação
N O HN N
Clínica 2.5). Além disso, G-tetraplexos estão envolvidos
NN N M
na recombinação dos genes de imunoglobulinas e na
H H O N dimerização do RNA dupla-fita gênomico do vírus da
imunodeficiência humana (HIV).
O + NN
NH H
HN
O
N H
DNA Deslizado
N
H HN N
Regiões de DNA com simetria de repetição direta
podem formar DNA deslizado, com pareamento errado
(SMP-DNA). Sua formação envolve o desenrolamento
FIGURA 2.28Estrutura de um G-quarteto.
da dupla-hélice, realinhamento e subsequente parea
As quatro guaninas coplanares formam uma estrutura tetra
mérica por formação de pontes de hidrogênio Hoogsteen. A mento de uma cópia da repetição direta com uma cópia
cavidade no centro do quarteto pode acomodar um íon sódio adjacente da outra fita. Isso gera duas alças de DNA fita
ou potássio com coordenação pelos quatro oxigênios O6. única. Duas estruturas isoméricas de um SMP-DNA são
50 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.4
Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal
A persistência hereditária da hemoglobina fetal
(HPFH, hereditary persistence offetal hemoglobin)
(OMIM 141749) é um grupo de condições nas quais a
síntese de hemoglobina fetal não para ao nascer, mas
persiste até a vida adulta. A forma homozigota da doen
ça é extremamente rara, sendo caracterizada por mo
dificações nos glóbulos vermelhos semelhantes às en
contradas na doença genética do sangue b-talassemia.
HPFH, tanto no estado homozigoto como no heterozigo
to, está associada a anomalias clínicas e hematológicas
leves. Dores musculoesqueléticas leves podem ocorrer
com pouca frequência, mas os pacientes com HPFH são
frequentemente assintomáticos.
A condição resulta de falha na parada da transcri
ção dos genes humanos das Gg- e Ag-globinas, levando
a níveis elevados de hemoglobina fetal. A formação de
uma estrutura DNA tripla-hélice intramolecular, locali
zada cerca de 200 pb à montante (upstream) do ponto
de início da transcrição dos genes de g-globina (entre
as posições –194 e –215) atua como um freio para sua
expressão. Os genes da hemoglobina dos pacientes con
têm mutações em uma ou mais posições dessa região,
possíveis (Figura 2.30). Embora SMP-DNA não tenha
sido identificado ainda in vivo, evidências genéticas su
gerem que esteja envolvido em mutações espontâneas
com mudança na estrutura de leitura (frameshift), que
resulta em adição ou deleção de base em sequências
CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.5
Telomerase Como Alvo para Agentes Anticâncer
Os telômeros, as extremidades dos cromossomos
lineares eucarióticos, são críticos para manter a esta
bilidade do genoma. Eles são progressivamente encur
tados durante cada ciclo de divisão celular; ao alcançar
um comprimento crítico, desencadeiam a apoptose. A
telomerase atua mantendo ou encompridando os telô
meros, mas não é ativa em células somáticas normais.
A atividade da telomerase, na maioria das linhagens ce
lulares tumorais, pode ser responsável por sua imorta
lização; quando aumentada, correlaciona-se com prog
nóstico clínico pior.
Duas abordagens estão sendo investigadas para ini
bição seletiva da telomerase. A primeira envolve a parte
contendo o RNA da enzima. Esse RNA serve de mol
de para a extensão da sequência telomérica repetitiva.
Ácidos nucleicos com esqueletos açúcar–fosfato quimi
diminuindo a estabilidade da tripla-hélice e reduzindo
sua capacidade de inibir a síntese proteica.
–206
G G GG
GG
CC
C
T C +G C –202
T C G C
C
T A
G A
G T
T –198
C
C
T
A A
G G C –196
–195
–217 TA A TG AC
5! T
3! T A
5! 3!
Ulrich, M. J., Gray, W. J. e Ley, T. J. An intramolecular DNA
triplex is disrupted by point mutations associated with heredi
tary persistence offetalhemoglobin. J. Biol. Chem. 267:18649,
1992; e Bacolla, A., Ulrich, M. J., Larson, J. E., Ley, T. J. e Wells,
R. D. An intramolecular triplex in the human gamma-globin
5!-flanking region is altered by point mutations associated with
hereditary persistence of fetal hemoglobin. J. Biol. Chem.
270:24556, 1995.
de base única (Figura 2.31). Deleções e duplicações
de segmentos de DNA que são mais longos do que uma
base única podem ocorrer durante a replicação do DNA
entre repetições diretas, causando estruturas desliza
das com alças. A duplicação de certas repetições de tri
camente modificados ligam-se ao RNA da telomerase
em células humanas imortalizadas, inibindo a atividade
e, finalmente, causando a morte celular. Ácidos nuclei
cos modificados foram usados para resistir à degrada
ção por nuclease e fornecer alta afinidade para formar
complexos dupla-hélice com RNA. Uma segunda abor
dagem envolve drogas que se ligam ao DNA G-quadru
plex. Moléculas grandes aromáticas, como porfirinas e
antraquinonas, ligam-se seletivamente e estabilizam as
estruturas do DNA G-quadruplex.
Herbert, B.-S., Pitts, A.E., Baker, S.I., Hamilton, S.E., Wright,
W.E., Shay, J.W. e Corey, D.R. Inhibition of human telomerase in
immortal human cells leads to progressive telomere shortening
and cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14276, 1999; Par
kinson, E. K., e Minty, F. Anticancer therapy targeting telomeres
and telomerase. Biodrugs 21:375, 2007; e Cuesta, J., Read, M.
A. e Neidle, S. The design of G-quadruplex ligands astelomerase
inhibitors. Mini-Rev. Med. Chem. 3:11, 2003.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 51

1 11 21 3!
5! CTAGCCTTAAAAAGG
GATCGGAATTTTTCC 3!
5!
5! GGGATCCAAGGTCCATCGTTGGGATCCAAGGTCCATCGTT 3!
(a) 3! CCCTAGGTTCCAGGTAGCAACCCTAGGTTCCAGGTAGCAA
CCCTAGGTTCCAGGTAGCAA
GGGATCCAAGGTCCATCGTT 5! GATCGGAATTTT
CTAGCCTTAAAAAGG Replicação

3!
5! GATCGGAATTTT
CTAGCCTTAAAAAGG 3!
T
CCAAGGTCC
C 5!

G TT A
T A AAA A Deslizamento Deslizamento
da fita filha da fita molde
A
GG G
T
(b) 3!
5! 3! 5! 3! 5! GATCGGAATTTT 3!
5! 3! 5! 3! CTAGCCTTAAAACC
CCC CG A
TGCC G Replicação
continuada
CCCTAGGTTCCAGGTAGCAA
GGGATCCAAGGTCCATCGTT
G T T FIGURA
3!
5! 2.31
T Mutagênese
3!3! com3!5!mudança na
GATCGGAATTTTGG
CTAGCCTTAAAACC
G GATCGGAATTTTTCC
CTAGCCTTAAAAAGG A 3!
T 5! 5!
2º ciclo desuperior
da fita replicação

AAGG T
CTG TTCC 3!
5!
A AAA A C C
AT GATCGGAATTTTTTCC
AGCCTTAAAAAAGG
Adição de um T 5! 3!
5! GATCGGAATTTTCC
AGCCTTAAAAGG
Deleção de um T 3!
5!
(c) 5!
3! G
TCTT C C C
GCC GG
G
T A GG G 3!
5!

estrutura de leitura (frameshift) por deslizamento

do DNA.
A replicação do DNA numa sequência de uma única
base pode produzir uma mudança na estrutura de lei
tura de uma base. Neste exemplo, uma sequência de
cinco As é replicada e, dependendo de um deslizamen
to ter ocorrido na fita filha ou na fita molde, um T pode
FIGURA 2.30 DNA deslizado, com pareamento errado. ser adicionado ou removido do DNA.
(a) Presença de duas repetições adjacentes (tandem) pode dar origem a
dois isômeros de DNA deslizado, com pareamento errado. (b) A segunda
cópia da repetição direta na fita de cima pareia com a primeira cópia da
repetição na fita de baixo. (c) O pareamento da primeira cópia da repeti
ção direta na fita de cima com a segunda cópia da repetição direta na fita
de baixo. Duas alças de fita única são geradas em cada isômero.

pletes simples, que são a base de várias doenças genéti
cas humanas (Correlação Clínica 2.6), também podem
ocorrer por esse mecanismo.
2.4 ESTRUTURA DE ORDEM
SUPERIOR DO DNA
Com exceção dos vírus que contêm RNA, toda vida
na Terra usa DNA para armazenar informação genética.
O comprimento do DNA varia de espécie para espécie,
em faixas que vão de poucos milhares de pares de ba
ses para vírus pequenos, até milhões de pares de bases
em bactérias, e bilhões de pares de bases em plantas
e animais. Em todos os organismos, o comprimento
de contorno (comprimento do DNA considerando-se
uma dupla-hélice em forma-B) do DNA genômico é ge
ralmente muito maior do que o tamanho da célula que
o contém. Por exemplo, um vírus de tamanho médio,
como o fago λ, contém 4,8 × 104 pb no DNA, que tem
16,5 mm de comprimento. Entretanto, a partícula viral
tem apenas 0,19 mm de comprimento. A bactéria co
mum Escherichia coli tem aproximadamente 2 μm de
comprimento, e tem um único cromossomo com 4,6 ×
106 pb, com um comprimento de contorno de 1,5 mm.
Uma única célula diploide humana contém 6 × 109 pb
no DNA cromossômico organizado em 46 cromossomos.
O comprimento de contorno desse DNA aproxima-se de
2 m, empacotados em um núcleo de cerca de 10 μm de
diâmetro. É claro que o DNA de todos os organismos
deve ser extraordinariamente empacotado.
O DNA Genômico Pode Ser Linear
ou Circular
Com exceção de alguns pequenos bacteriófagos,
como ϕΧ174, que podem adquirir uma forma de fita-úni
ca, a maioria dos DNAs existe como complexos de du
pla-hélice. Dependendo da fonte, os complexos podem
ser lineares ou circulares. Por exemplo, os DNAs de vá
rios vírus pequenos são hélices lineares de dupla-fita.
Alguns desses DNAs contêm quebras internas simples
-fita, de ocorrência natural. A estrutura em dupla-hélice
52 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.6
Expansão de Repetições de Tripletes de DNA e Doença Humana
A presença de sequências reiteradas de três pares
de bases de DNA ocorre em várias doenças genéticas
humanas, incluindo a síndrome do X frágil (OMIM
300624), a distrofia miotônica (OMIM 160900), a atro
fia muscular espinal e bulbar ligada ao X (síndrome de
Kennedy), a ataxia de Friedrich e a doença de Hunting
ton (OMIM 143100). Essas doenças estão associadas à
expansão de repetições de tripletes de nucleotídeos que
aparecem em, ou próximos de, genes específicos. Verifi
cou-se que a doença de Kennedy contém uma repetição
CAG no primeiro éxon do gene do receptor de andróge
no. Tripletes repetidos também foram encontrados em
regiões não-traduzidas do gene: na ataxia de Friedrei
ch, GAA repetido é encontrado dentro de um íntron, e
na distrofia miotônica, uma repetição CTG é encontrada
na região 3!-não-traduzida de seu gene. A síndrome do
X frágil, uma das principais causas de retardo mental,
caracteriza-se por expansão do triplete GCC no lado 5!
do gene FMR-1. Essa repetição expande-se de 30 cópias
para milhares de cópias. A doença desenvolve-se quan
do a expressão normal do gene FMR-1 é desligada por
metilação de sítios CpG. Em todos os casos, a expan
Replicação
Tripletes repetidos
Grampo de deslizamento
é mantida porque as quebras em uma fita são geralmen
te em localizações diferentes das encontradas na fita
complementar. Os DNAs da maioria dos organismos su
periores também são lineares. Cada um dos 46 cromos
somos de uma célula humana diploide é um DNA linear
em dupla-hélice, complexado com proteínas.
O DNA circular resulta da formação de ligações
fosfodiéster entre as extremidades 3! e 5! de polinu
são do triplete interfere com o funcionamento normal
da proteína relacionada. Frequentemente há perda de
função da proteína, mas, ocasionalmente, um ganho ou
função deletéria ocorrem. Essas doenças são caracteri
zadas por um aumento na gravidade da doença em gera
ções sucessivas, o que é chamado antecipação.
Expansão de tripletes pode resultar de pareamento
deslizado errado durante a síntese do DNA. Em virtude
da enorme amplificação que caracteriza essas doenças,
deslocamentos repetidos ou múltiplos deveriam estar
envolvidos para explicar o alto grau de expansão. Um
possível mecanismo envolve o deslizamento do DNA
nascente durante a síntese da fita tardia. Esse processo
pode ser ajudado pela formação de uma estrutura em
grampo (hairpin) estável pela alça que deslizou. Repe
tição desse processo leva ao acúmulo de grande número
de tripletes repetidos.
Mirkin, S. Expandable DNA repeats and human disease. Na
ture 447:932, 2007; e Patel, P. I. e Isaya, G. Friedreich Ataxia:
From GAA triplet-repeat expansion to frataxin deficiency. Am.
J. Hum. Genetics. 69:15, 2001.
Fita descontínua
Fita lider
cleotídeos lineares. Suspeitou-se da natureza circular
do DNA fita única do fago ϕΧ174 por estudos que mos
traram que nenhuma extremidade estava disponível
para reagir com éxonucleases. Além disso, a clivagem
com endonuclease em um único ponto gerava só um
polinucleotídeo. Esses resultados foram mais tarde
confirmados por observação direta à microscopia ele
trônica.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 53

5! 3! 3! 5! de 200-1.500 × 103 pb, que codificam proteínas especí

ficas, usadas pelas organelas (p. 600). A presença de
um genoma independente e a grande similaridade com
DNA linear de dupla-fita
cianobactérias levaram à hipótese de que essas organe
las teriam surgido há bilhões de anos, de uma relação
5! 5!
3! simbiótica entre células protoeucarióticas e bactérias.
3!

DNA O DNA É Super-Helicoidal

ligase
DNA dupla-fita circular, formado pela ligação das
extremidades livres de um DNA linear é relaxado; isto
é, tem a estrutura termodinamicamente favorável do B
DNA em círculo aberto DNA em círculo fechado -DNA. Esse DNA relaxado tem atividade muito reduzi
da na replicação, na tradução e na recombinação. A for
FIGURA 2.32 Circularização do DNA l. ma biologicamente ativa do DNA é super-helicoidal, um
O DNA do bacteriófago existe em formas linear e circular, que são isômero topologicamente tensionado, criado por menor
interconversíveis. A circularização do DNA λ é possível porque ou maior enrolamento da dupla hélice. Antes da circu
as extensões 5! da forma linear são sequências complementares.
larização de um DNA linear na forma B, a dupla hélice
contém cerca de 10,5 pb por volta completa. Se o DNA
Alguns organismos têm DNAs que são lineares ou for desenrolado antes de fechar, a estrutura resultante
circulares em diferentes pontos de seus ciclos de vida. será tensionada (Figura 2.33). O desenrolamento reduz
Antes de entrar em E. coli, o DNA do fago λ é linear, com o número total de voltas helicoidais presentes na estru
extensões de fita única nas extremidades 5!. Essas ex tura circular. O desenrolamento da hélice pode ser aco
tensões têm cerca de 20 nucleotídeos de comprimento e modado por quebra no pareamento de bases em uma
têm sequências complementares. Na infecção, ocorre cir pequena região, para produzir um par de alças fita-sim
cularização por hibridização das extremidades entre si. ples numa estrutura circular relaxada. A perda de em
A formação de ligações fosfodiéster entre as extremida pilhamento de bases nessa estrutura é energeticamen
des 3! e 5! de cada fita pela DNA ligase produz um círculo te desfavorável. Entretanto, se todo o empilhamento de
fechado covalentemente (Figura
2.32). As fitas de um DNA circu
lar não podem ser separadas irre
versivelmente por desnaturação
porque elas existem como círculos Os pares de bases se reúnem
fechados entrelaçados. A ausência novamente e um superenrolamento
para a direita (negativo) é
de extremidades 3! e 5! confere ao
sistência a antibióticos. Os plas- Umavolta da formado para compensar
DNA
a
gevidade
exonucleases,
A circular
maioria
do DNA.
completa
dos
aumentando
DNAsresistência
bacteria
a lon- Ligação das o aumento
hélice é extremidades de tensão.
desenrolada livres

nos existe exclusivamente como

círculos fechados. Estes incluem
os cromossomos bacterianos e os DNA circular DNA circular com
DNAs extracromossômicos meno parcialmente um superenrolamento
desenrolado para a direita
res, plasmídeos. Os últimos têm
(negativo)
poucos milhares de pares de ba
ses de comprimento e codificam
genes acessórios, como os de re
DNA normal
linear parcialmente
DNA linear

mídeos são mantidos e replicados desenrolado

separadamente do DNA cromos
sômico, e podem estar às cente
nas em uma bactéria. DNA circu
lar também existe em organismos
superiores. Leveduras também
podem carregar plasmídeos cir
culares. Mitocôndrias e cloroplas
tos de células de organismos su
periores contêm DNAs circulares
FIGURA 2.33 Superenrolamento negativo do DNA.
Superenrolamentos para a direita (DNA com superenrolamento negativo) são formados se
DNA relaxado for parcialmente desenrolado. Desenrolamento pode levar a ruptura de pon
tes de hidrogênio ou pode produzir superenrolamentos negativos. Os superenrolamentos
negativos são formados para compensar o aumento de tensão que é gerado quando pares
de bases rompidos são formados.
Redesenhado de Darnell, J., Lodish, H. e Baltimore, D. Molecular Cell Biology, New York:
Freeman, 1986.
54 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

bases for mantido, o desenrolamento gera uma tensão

de torção no esqueleto da dupla hélice. Enrolar o DNA
circular inteiro na direção oposta à da rotação original,
alivia a tensão. Isso resulta na formação de uma mola (a)
torcida, mais conhecida por super-hélice. DNA menos
enrolado é chamado super-hélice negativa, e a super
-hélice resultante gira para a direita (Figura 2.34). Ao
contrário, DNA mais enrolado tem super-hélice positiva
e forma uma super-hélice que gira para a esquerda.

Embora a forma circular fechada do DNA seja ide

al para adquirir a estrutura em super-hélice, qualquer
segmento de DNA dupla-fita que seja imobilizado em
ambas as extremidades pode ser super-helicoidal. O
DNA de células eucarióticas, por exemplo, pode adqui
rir uma forma super-helicoidal porque sua ancoragem (b)
a proteínas nucleares cria vários domínios topológicos
fechados. Um domínio topológico é definido como um
segmento de DNA contido de tal maneira que restrinja
a rotação da dupla-hélice (Figura 2.35).

Em geral, seja o DNA circular ou linear, a existência

de super-hélice negativa parece ser uma característica
importante. O superenrolamento promove empacota
mento do DNA dentro do pequeno espaço da célula,
facilitando a formação de estruturas compactas. Super
-hélices também tendem a gerar regiões com pontes de
hidrogênio rompidas (bolhas), que podem ser úteis na
facilitação de processos de separação localizada de fitas
do DNA durante o reparo, a síntese e a recombinação
do DNA.
(c)
FIGURA 2.35 Modelo em super-hélice do DNA.
Uma fita de elástico pode demonstrar as propriedades topoló
gicas do DNA circular dupla-fita. (a) A forma relaxada da fita.
(b) A fita pode ser torcida para gerar dois domínios topológicos
distintos, separados pelo par de “âncoras polegar-indicador”.
Voltas para a esquerda (anti-horárias) são introduzidas na par
te superior da fita, com voltas para a direita (horárias) com
pensatórias na parte inferior. (c) Quando
as “âncoras” aproximam-se uma da outra, a
parte superior que continha as voltas para
a esquerda forma uma super-hélice que
gira para a direita. A parte inferior produz
uma super-hélice que gira para a esquerda.
A super-helicidade não é uma propriedade
da molécula de DNA como um todo, mas
uma propriedade de domínios específicos
do DNA.
Redesenhado de Sinden, R. R. e Wells, R. D.
DNA structure, mutations, and human ge
netic disease. Curr. Opin. Biotech. 3:612,
1992.

Super-hélice para a Hélice circular Super-hélice para a

direita (negativa) relaxada esquerda (positiva)

FIGURA 2.34 DNA relaxado e superenrolado.

O DNA relaxado pode ser convertido em DNA superenrolado para a direita ou para
a esquerda. O DNA que gira para a direita (DNA com superenrolamento negativo) é
a forma normalmente presente nas células. O DNA girando para a esquerda pode ser
gerado transitoriamente quando o DNA é submetido a transformações catalisadas
por enzimas (replicação, recombinação etc.) e está presente em certas espécies de
bactérias. Os padrões nitidamente diferentes de enrolamento de DNA que gira para a
direita ou para a esquerda são visíveis nessa representação.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 55

Topoisomerases Topoisomerases I fazem uma quebra transitória em

Topoisomerases regulam a formação de super-hé
lices. Essas enzimas catalisam a quebra e a religação
coordenada de fitas de DNA, produzindo um DNA que
é mais ou menos super-helicoidal do que o original (Ta
bela 2.4). A regulação precisa do nível celular de super
-helicidade do DNA é importante para facilitar as inte
rações de proteínas com o DNA. A razão celular entre
ATP e ADP pode desempenhar um papel nesse proces
so, porque influencia a atividade de algumas topoisome
rases. Compostos que inibem topoisomerases e girases
são eficientes agentes antibacterianos e antitumorais
(Correlação Clínica 2.7).
uma fita de um DNA dupla-hélice superenrolado; a pas
sagem da fita não-quebrada pela falha elimina um supe
renrolamento do DNA (Figura 2.36). Durante a reação,
a enzima permanece ligada ao DNA por uma ligação
covalente entre um resíduo tirosil e um grupo fosforil
no ponto da incisão. Isso conserva a energia da ligação
fosfodiéster interrompida para o reparo subsequente da
incisão. As duas subclasses de topoisomerase I diferem
na formação de ligação 5!-fosfotirosina (classe IA) ou
3!-fosfotirosina (classe IB).

TABELA 2.4 Propriedades das DNA Topoisomerases

Topoisomerase Tipoa Funções
Topoisomerase I de E. coli (top A)b IA Relaxa DNA com superenrolamento negativo
Topoisomerase III de E. coli (top B) IA Relaxa DNA com superenrolamento negativo, atividade de
decatenação (desligamento).
Topoisomerase III eucariótica (top 3) IA Possível papel na recombinação e/ou na decatenação de
cromossomos?
DNA girase reversa de Archae IA Introduz superenrolamento positivo no DNA
DNA
(top 1)
topoisomerase I eucariótica IB Relaxa DNA com superenrolamento positivo ou negativo

DNA topoisomerase de Vaccinia (vírus da

varíola) IB Relaxa DNA com superenrolamento positivo ou negativo;
liga-se especificamente a sequências superenroladas do
DNA.
DNA girase de E. coli (gyrA, gyrB) II Introduz superenrolamentos negativos no DNA, relaxa DNA
com superenrolamento positivo ou negativo.
Topoisomerase IV de E. coli (parC, parE) II Decatenação de cromossomos durante a replicação; relaxa
DNA com superenrolamento negativo.
DNA topoisomerase II eucariótica (top 2) II Decatenação de cromossomos ligados; relaxa DNA com
superenrolamento positivo ou negativo.
aTopoisomerases tipo I usam Mg2+ como cofator, mas não requerem ATP. Topoisomerases tipo II requerem Mg2+ e ATP.
bO nome do gene que codifica a topoisomerase é apresentado em itálico.

Quebra de uma A fita intacta passa As extremidades da

fita do DNA através da quebra fita quebrada são ligadas

(a) (b) (c) (d)

FIGURA 2.36 Mecanismo de ação da topoisomerases I.

Topoisomerases I relaxam DNA (a) ligando-se a ele e separando localmente as fitas complementares; então, (b) cortam uma das
fitas e ligam-se às extremidades recém-geradas; e (c) passam a fita intacta através da falha gerada pela quebra e fecham a fenda por
restauração da ligação fosfodiéster. Isso gera e origina uma estrutura relaxada (d).
Redesenhado de Dean, F. et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:773, 1982.
56 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.7
Topoisomerases no Tratamento de Doenças
Topoisomerases são importantes alvos para agentes
antimicrobianos e antineoplásicos. Essas drogas não
inibem a atividade total da enzima, como no caso da
maioria das drogas direcionadas a enzimas. Em vez dis
so, inibem o complexo imediato entre a topoisomerase
e o DNA. Isso pode resultar na degradação do DNA, na
introdução de mutações ou na inibição da tradução e da
replicação.
No tratamento do câncer, ambas as topoisomerases
I e II podem ser alvos. Camptotecina e seus derivados
agem sobre a topoisomerase I. Uma excelente correlação
foi observada entre a atividade antitumoral de vários de
rivados da camptotecina sobre a leucemia murina e sua
interferência com a atividade da topoisomerase. Podem
causar lesões potencialmente letais por formarem com
plexos covalentes de clivagem do DNA estabilizados pela
droga. Replicação subsequente do DNA pode ser um pré
-requisito para a toxicidade celular. A eficácia dos deri
vados de camptotecina pode ser aumentada por níveis
aumentados de topoisomerase I nas células tumorais,
como no câncer de cólon avançado. Dois outros potentes
agentes antineoplásicos, amsacrina e etoposídeo, agem
seletivamente sobre a topoisomerase II e indicam que es
sas drogas clinicamente úteis estabilizam os complexos
covalentes de clivagem topoisomerase II-DNA. Evidência
indireta sugere que essas drogas possam estimular a for
mação desses complexos. As quebras de DNA mediadas
pela topoisomerase II podem exercer seu efeito citotóxi
co na ausência de síntese de DNA, provavelmente pela
indução de recombinação e mutação no local de forma
ção dos complexos topoisomerase II-DNA induzidos pela
droga. Muitos agentes anticâncer, incluindo as antracicli
nas (incluindo adriamicina e doxorubicina), intercalado
res sintéticos, elipticinas e podofilotoxinas também têm
topoisomerase II como alvo. Neoplasias hematológicas,
tais como leucemias linfoide e não-linfoide, linfomas não
Hodgkins avançados e doença de Hodgkin são tratados
principalmente por combinações de inibidores de topoi
somerase II com ou sem agentes tóxicos adicionais.
Ciprofloxacin (Cipro®) obteve considerável atenção
da mídia por seu uso no tratamento da inalação de an
trax. É um representante das quinolonas, uma classe
de agentes antibacterianos de amplo espectro. Esses
Topoisomerases II são proteínas diméricas que se
ligam a DNA dupla-hélice e clivam ambas as fitas (Figu
ra 2.37). A passagem de outro segmento de DNA dupla
-hélice através da quebra remove ou adiciona dois supe
renrolamentos. Todas as topoisomerases II eucarióticas
e muitas procarióticas só relaxam DNA superenrolado.
A hidrólise de ATP é necessária para o ciclo (turnover)
da enzima, mas não realmente para a reação de rela
antibióticos inibem seletivamente a DNA girase e a to
poisomerase IV bacterianas. Quinolonas ligam-se aos
complexos formados por essas enzimas e inibem a re
plicação do DNA. No final, morte celular ocorre devi
da ao acúmulo de quebras de dupla fita letais no DNA
bacteriano. Como essas enzimas não encontradas em
células eucarióticas, as quinolonas são muito seletivas
em sua ação citotóxica. Fluoroquinolonas, como cipro
floxacin, apresentam boa atividade contra bactérias
Gram-negativas e Gram-positivas, enquanto drogas
mais novas apresentam atividades ainda mais amplas.
Por exemplo, gemifloxacin (Factive®) é especialmente
útil no tratamento de infecções respiratórias, incluindo
as de Staphylococcus pneumoniae, Mucoplasma e
Legionella resistentes a múltiplas drogas.
OH
H3CO OCH3
O H O
N O
N O
O O
H
O
OOH O
H 3C
H 3C O
OH
O
OH
captotecin etoposídeo
O O
F COOH F COOH
N N N N N
OH 3C
N N
H
NH2
ciprofloxacin gemifloxacin
Potmesil, M. e Kohn, K. W. (Eds.). DNA Topoisomerases in
Cancer. New York: Oxford University Press, 1991; Pommier,
Y. Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond. Na
ture Rev. Cancer 6:789, 2006; Hopper, D.C. Clinical applica
tions of quinolones. Biochem. Biophys. Acta 1400:45, 1998;
Mitscher, L. A. Bacterial topoisomerase inhibitors: Quinolone
and pyridine antibacterial agents. Chem. Rev. 105:559, 2005;
e Oliphant, C. M. e Green, G. M. Quinolones: A comprehensive
review. Am. Fam. Physician 65:455, 2002.
xamento. As girases, um subgrupo de topoisomerases
tipo II, são as únicas enzimas que adicionam superen
rolamento negativo no DNA. Elas ocorrem somente em
bactérias; eucariotos usam o enrolamento do DNA em
torno de proteínas cromossômicas para a introdução
de superenrolamentos negativos. A reação da girase
requer hidrólise de ATP como fonte de energia e pode
adicionar superenrolamento negativo a uma velocidade
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 57

e cadaverina), RNA e proteínas não-his

tonas (Figura 2.38). HU é um hetero
Sela
Estabiliza Quebra novamente dímero de 18 kDa de duas subunidades
o nó (+) o a quebra
(–)
quase idênticas (HU-1 e HU-2). Quando
positivo segmento pela frente
se liga, HU muda a forma e o superenro
lamento do DNA. In vitro, a ligação de
Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3
(–) (–) (–) HU compacta o DNA e restringe o supe
renrolamento de modo concentração
-dependente. Numa razão equimolar,
a interação do DNA com HU impede a
topoisomerase I de relaxar o DNA supe
FIGURA 2.37 Mecanismo de ação da topoisomerases II. renrolado negativamente no complexo
Topoisomerases II podem relaxar ou, no caso de girases, introduzir super-hélices DNA-HU. Concentrações mais altas de
negativas no DNA. O mecanismo de ação da girase é ilustrado usando a conversão de HU não resultam em superenrolamen
uma molécula de DNA relaxada em uma molécula que contém os primeiros dois su tos adicionais. Parece que HU dobra
perenrolamentos, um positivo e um negativo (etapa 1). A passagem de um segmento
acentuadamente o DNA num círculo
de DNA através do superenrolamento positivo mostrado na parte mais à direita da
figura (etapa 3) produz uma molécula que contém dois superenrolamentos negati apertado e é primariamente respon
vos. Esta reação requer hidrólise de ATP como fonte de energia. sável pela formação de uma estrutura
Redesenhado de Brown, P.O. e Cozzaelli, N.R. Science 206:1081, 1979. nucleoide em “bolinhas”. No nucleoide,
uma única molécula superenrolada de
de cerca de 100 por minuto. A girase liga-se ao DNA DNA é organizada em cerca de 40 alças, cada uma com
em uma conformação que introduz uma alça super-heli aproximadamente 105pb, que se funde em um arcabou
coidal positiva e negativa, deixando o estado topológico ço rico em proteínas e RNA. A participação do RNA no
do DNA inalterado. Quebra da dupla fita e passagem do empacotamento de cromossomos é exclusiva de proca
DNA através da incisão introduz dois superenrolamen riotos. Como resultado da formação de um nucleoide,
tos negativos. o genoma bacteriano pode facilmente caber dentro de
uma célula.
Topoisomerases também catalisam outras isomeri
zações topológicas. Topoisomerases tipo III bacterianas
têm propriedades de topoisomerases tipo I; isto é, rela
xam superenrolamento sem necessidade de uma fonte
de energia, como hidrólise de ATP. Essas topoisome
rases podem ter se especializado na separação de pro
dutos entrelaçados de DNA circular (catenatos), que
são gerados antes do término da replicação do DNA.
Girases reversas, membros de uma classe incomum de
topoisomerases, foram isoladas pela primeira vez de
archaebactérias. Essas girases introduzem superenro
lamentos positivos no DNA, que podem protegê-lo das
condições desnaturantes de altas temperaturas e aci RNase DNase
dez, nas quais essas bactérias existem.

Empacotamento do DNA
Procariótico
Em células procarióticas, o único cromossomo é um
DNA dupla-fita, circular e superenrolado. Cromossomos
bacterianos são estruturas dinâmicas, refletindo a ne
cessidade de rápida síntese de DNA, divisão celular e
transcrição. Entretanto, em uma bactéria comum como FIGURA 2.38 Cromossomos bacterianos são empacotados
E. coli, o comprimento de contorno do DNA é mais de em nucleoides.
750 vezes maior do que o comprimento da célula. Por O cromossomo circular de uma bactéria é compactado em
tanto, o DNA deve estar empacotado em uma forma cerca de 40-50 alças de DNA superenrolado organizadas por
um arcabouço de RNA-proteína. A DNase relaxa a estrutura
muito condensada para caber dentro da célula. Os cro
progressivamente, abrindo as alças individuais, uma de cada
mossomos bacterianos são organizados em estruturas vez. A RNase desdobra completamente o cromossomo em uma
compactas, chamadas nucleoides, por interação com única etapa, rompendo o centro do nucleoide.
proteínas HU e H-NS e participação de vários cátions, Redesenhado de Worcel, A. e Burgi, E. J. Mol. Biol. 71:127,
poliaminas (como espermina, espermidina, putrescina 1972.
58 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
Organização da Cromatina
Eucariótica
O enorme comprimento do genoma da maioria dos
eucariotos requer a divisão da informação genética em
vários cromossomos independentes. Células humanas
contêm 23 pares de cromossomos, com um compri
mento médio de 1,3 × 108 pb, ou aproximadamente 43
mm. Cada cromossomo humano consiste de uma mo
lécula de DNA, variando em tamanho de 263 × 106pb
para o cromossomo 1 até menos de 50 × 106 pb para o
cromossomo Y. Para que essa quantidade de DNA cai
ba dentro de um núcleo celular, com um diâmetro de
aproximadamente 10-20 μm, há necessidade de uma
razão de condensação superior a cinco ordens de gran
deza (Figura 2.39).
O DNA em células eucarióticas está associado a
várias proteínas para formar a cromatina. Em células
que não estão se dividindo (interfase), a cromatina é
amorfa e dispersa por todo o núcleo. Imediatamente
antes da divisão celular (metáfase), torna-se organi
zada em estruturas muito compactas chamadas cro
mossomos. Cada cromossomo caracteriza-se por um
centrômero, que é o local para adesão de proteínas
que ligam o cromossomo ao fuso mitótico. Os telô
meros definem as extremidades de cromossomos li
neares. Os cromossomos também contêm sequências
necessárias ao início da replicação do DNA (origens
de replicação).
Histonas são as proteínas mais numerosas da cro
matina. Existem cinco classes dessas proteínas: histo
Nucleofilamento
de 10 nm
H1
Fibra de 30 nm
Octâmero Cromatina depletada
de histonas de histona H1
(todas as histonas
DNA nuremovidas)
FIGURA 2.39 Organização do DNA em cromossomos.
Um desenho mostrando a condensação passo a passo do DNA em cromatina. O DNA
inicialmente se enrola em torno de histonas do cerne (core) do nucleossomo. A con
densação com histona H1 produz o nucleofilamento de 10 nm, que é subsequentemente
empacotado numa estrutura torcida, com alças, ligada a um arcabouço de proteínas no
cromossomo.
nas H1, H2A, H2B, H3 e H4. Por causa de seu conteúdo
extraordinariamente elevado dos aminoácidos básicos
lisina e arginina, as histonas são muito catiônicas e in
teragem com os fosfatos do esqueleto polianiônico do
DNA para produzir nucleoproteínas sem carga. As se
quências de aminoácidos das histonas são muito con
servadas entre as espécies. Histonas H4 de ervilhas e
de vacas diferem em apenas dois aminoácidos, embora
essas espécies tenham divergido há mais de um bilhão
de anos. Histonas H3 são também muito conservadas,
enquanto as regiões não-básicas das histonas H2A e
H2B são menos conservadas. H1 é maior, mais básica
e, de longe, a histona mais tecido-específica e espécie
-específica. Em alguns tipos celulares de vertebrados,
uma sexta histona, H5, funciona como substituta de
H1. Um grupo heterogêneo de proteínas com alta espe
cificidade para espécie e órgão também está presente
na cromatina. Essas proteínas não-histonas consistem
de centenas de membros, a maioria dos quais presente
em quantidades muito pequenas. Muitas delas estão
associadas com funções dos cromossomos como repli
cação, expressão gênica e organização cromossômica.
Nucleossomos e Polinucleossomos
As histonas interagem com o DNA para formar uma
estrutura periódica “contas num fio”, chamada polinu
cleossomo, no qual a unidade elementar é um nucleos
somo (Figura 2.40). Cada nucleossomo tem forma de
disco, cerca de 11 nm de diâmetro e 6 nm de altura, e
consiste de um segmento de DNA e um grupo de his
tonas composto de duas moléculas de cada uma das
histonas H2A, H2B, H3 e H4. Cada
grupo octamérico consiste do te
Arcabouço proteico trâmero (H3)2—(H4)2 com dois
dímeros H2A—H2B. Cada histo
na caracteriza-se por um domínio
central não-polar, que forma uma
1 µm
estrutura globular e é responsável
pelas interações histona-histona.
As regiões N-terminais vizinhas
contêm a maior parte dos resíduos
de aminoácidos carregados posi
tivamente, os quais permitem in
terações eletrostáticas favoráveis
com o DNA. Essas sequências de
cauda parecem se estender radial
mente para fora do cerne de histo
nas e podem estar envolvidas nas
interações entre nucleossomos. O
DNA é enrolado em torno do octâ
Cromossomo
metafísico mero com o cerne central (H3)2—
(H4)2 interagindo com os 70–80
pb centrais do DNA que o circunda
(Figura 2.41). Aproximadamen
te 146 pb do DNA enrolam-se em
torno do octâmero de histonas. As
histonas ficam em contato com a

fenda menor do DNA e deixam a fenda maior disponí
vel para interação com as proteínas que regulam a ex
pressão gênica e outras funções do DNA. A estrutura
do cerne dos nucleossomos explica porque as células
eucarióticas não têm girases, que podem desenrolar
DNA relaxado. Super-helicidade negativa é introduzi
da quando o DNA faz uma volta em torno do centro de
histonas (Figura 2.42).
DNA
Octâmero
de histonas
H1 65 Å
FIGURA 2.40 Modelo do complexo nucleossomo.
O nucleossomo consiste de aproximadamente 146 pb de DNA,
correspondendo a 1¾ voltas da super-hélice, enroladas em tor
no de um octâmero de histonas. O cromatossomo consiste de
cerca de 166 pb de DNA (duas voltas super-helicoidais). A his
tona H1 é associada com o DNA de ligação (linker).
Reproduzido com permissão de Voet, D. e Voet, J. G., 3. ed.,
New York, Wiley, 2004 (2004) Donald e Judith Voet.
FIGURA 2.41 Estrutura por raios-X do cerne (core) do
nucleossomo.
O disco do cerne do nucleossomo foi dividido ao meio para
mostrar uma volta do DNA enrolado em torno de quatro mo
léculas de histonas. As linhas tracejadas representam partes
não-estruturadas das caudas das histonas.
Reproduzido com permissão de Kornberg, R.D. e Lorch, Y. Cell
98:285, 1999.
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 59
Tal enrolamento remove aproximadamente uma
volta de hélice do DNA, gerando um superenrolamento
negativo na região enrolada em torno do cerne de histo
nas, e um superenrolamento positivo compensador em
outro lugar da molécula. O relaxamento subsequente do
superenrolamento positivo por topoisomerases eucari
óticas deixa um superenrolamento negativo na região
nucleossômica.
DNA
Cerne de
histonas
Superenrolamento
negativo ligado
Superenrolamento
positivo não-ligado
topoisomerase
Um superenrolamento
positivo (final)
FIGURA 2.42 Geração de superenrolamento negativo em
DNA eucariótico.
A ligação de um octâmero de histonas a um domínio fechado,
relaxado de DNA força o DNA a se enrolar em torno do octâ
mero, gerando um superenrolamento negativo. Na ausência
de qualquer quebra da fita, o domínio permanece intacto e
um superenrolamento positivo compensatório deve ser gera
do em outro local do domínio. A ação de uma topoisomerase
eucariótica subsequentemente relaxa o superenrolamento
positivo, deixando o domínio fechado com um superenrola
mento negativo.
Entre nucleossomos, existem 20 a 90 pb de DNA
de ligação (linker). Este fica associado com histona
H1, que trava o DNA enrolado no lugar; o complexo
resultante é um cromatossomo (Figura 2.40). A pe
riodicidade da distribuição de nucleossomos ao longo
da estrutura do polinucleossomo foi determinada por
digestão controlada com uma nuclease que ataca pre
ferencialmente DNA linker. A distribuição dos nucle
ossomos não é aleatória com relação à sequência de
bases do DNA. O DNA não se dobra uniformemente,
mas dobra-se um pouco e depois mais acentuadamen
te em torno do octâmero de histonas. Isso sugere que
a ligação ao DNA seja dependente da sequência e que
o posicionamento dos nucleossomos possa ser influen
60 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
ciado pela sequência do DNA. De fato, nucleossomos
tendem a se formar preferencialmente em certas regi
ões do DNA. DNA que contém longas sequências de A
ou repetições G-C geralmente não forma nucleossomos.
Ao contrário, certas regiões dobradas do DNA como,
por exemplo, trechos em fase A periódica, associam-se
fortemente com histonas. Octâmeros de histonas po
dem migrar ao longo da fita de DNA. Essa mobilidade
permite o acesso ao DNA pelas polimerases e outras
proteínas necessárias à transcrição e à replicação.
Empacotamento de Polinucleossomos em
Estruturas Superiores
O enrolamento do DNA em torno de histonas para
formar nucleossomos resulta em uma redução de dez
vezes no comprimento aparente do DNA e na forma
ção de um nucleofilamento de 10 nm. A condensação
de nucleofilamentos de 10 nm em um arranjo em so
lenoide, envolvendo seis ou sete cromatossomos por
volta, forma a fibra de 30 nm (Figura 2.43). Molécu
las de histona H1 ligam-se cooperativamente entre si,
aproximando mais os nucleossomos vizinhos na fibra
de 30 nm. Em concentrações salinas fisiológicas, as
fibras de 30 nm formam-se espontaneamente, mas,
em força iônica mais baixa, dissociam-se em nucleo
filamentos de 10 nm. A formação dos polinucleosso
mos e sua condensação em fibras de 30 nm dá uma
razão de compactação do DNA de até duas ordens de
grandeza. As fibras de 30 nm formam-se apenas em
regiões específicas do DNA, que se caracterizam pela
ausência de ligação com outras proteínas não-histo
nas sequência-específicas. A presença destas e seus
efeitos sobre a formação das fibras de 30 nm podem
depender do estado transcripcional das regiões de
DNA envolvidas.
1 mM aumentando a força iônica
Fibra de 30 nm
ou solenoide
Nucleofilamento de 10 nm
H1
DNA
FIGURA 2.43 Estrutura do nucleofilamento.
A histona H1 ligada às regiões de ligação (linker) entre os nucleossomos resulta
na condensação em fibras de 10 nm. Em forças iônicas mais altas, o nucleofila
mento forma uma estrutura helicoidal muito compacta ou um solenoide helicoi
dal. As histonas H1 interagem fortemente entre si nessa estrutura.
Adaptado de Kornberg, R.D. e Klug, A. The Nucleosome. San Diego, CA: Aca
demic, 1989.
Os modelos de níveis superiores de empacotamento
das fibras de 30 nm são baseados em evidências indi
retas obtidas com cromossomos plumulosos de oócitos
de vertebrados e cromossomos politênicos de células
secretoras gigantes de mosca de frutas. Esses cromos
somos são excepcionais porque mantêm estruturas de
ordem superior, precisamente definidas, na interfase,
isto é, quando células estão em estado de repouso (não
-divisão). Por extrapolação, as características estrutu
rais dos cromossomos interfásicos plumulosos levaram
a se propor que os cromossomos em geral são organiza
dos em uma série de domínios em alças, condensados,
de fibras de 30 nm de tamanhos variados para diferen
tes organismos. Essas alças podem conter de 5.000 a
120.000 pb, com uma média de 20.000. Assim, o genoma
humano haploide conteria cerca de 60.000 alças. Uma
alça pode conter alguns poucos genes ligados. As alças
firam ligadas a um arcabouço proteico consistindo de
histona H1 e diversas proteínas não-histonas, incluindo
duas proteínas principais de arcabouço (scaffold) Sc1
(uma topoisomerase II) e Sc2.
São fixadas em suas bases e podem, portanto, acu
mular superenrolamentos. Regiões específicas ricas em
AT, conhecidas como regiões de adesão ao arcabouço
(SARs, scaffold attachment regions) ficam preferen
cialmente associadas com o arcabouço. SARs também
contêm pontos para ligação de topoisomerase II. A pre
sença das topoisomerases sugere que alterações no su
perenrolamento dentro desses domínios sejam biologi
camente importantes. A formação de domínios em alça
pode ser responsável por uma condensação adicional de
200 vezes no comprimento do DNA, e uma razão de em
pacotamento geral de mais de quatro ordens de grande
za. Cada alça pode ser enrolada e, depois, superenrola
da em 0,4 mm de fibras de 30 nm. Como um cromossomo
tem cerca de 1 mm de diâmetro, o empacotamento da fi
bra de 30 nm em uma cromátide requereria apenas mais
uma ordem de dobramento. Mais compactação pode ser
conseguida dispondo-se as alças de fibras
100 mM de 30 nm em espirais helicoidais densa
mente empilhadas. As cromátides, os dois
braços ligados do DNA replicado nos cro
mossomos metafásicos muito condensa
dos, podem consistir de alças de fibras de
30 nm empacotadas de modo helicoidal.
Alterações no empacotamento em vá
rios estágios do ciclo celular parecem ser
controladas, em parte, por modificação
covalente das histonas do cerne (core)
(remodelamento de histonas). Acetilação
reversível do grupo e-amino de resíduos de
lisina e fosforilação de resíduos de serina
e treonina estão envolvidas na regulação
da atividade do DNA em nucleossomos.
Essas modificações reduzem o número
de cargas positivas nas histonas, fazendo
que se liguem menos fortemente ao DNA.
O desempacotamento resultante das fibras

CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.8
Tratamentos Epigenéticos para o Câncer
A progressão para o câncer pode envolver altera
ções epigenéticas que afetam processos que incluem
progressão no ciclo celular, reparo de danos no DNA e
morte celular programada (apoptose). Uma dessas al
terações, remodelamento cromossômico, chamou aten
ção como alvo para tratamento do câncer. As histona
deacetilases, enzimas responsáveis pela reversão da
acetilação de lisinas e argininas, são superexpressas
em vários tipos de câncer, incluindo de cólon, próstata,
mama, e colo uterino (cervical). Ácidos hidroxâmicos,
como tricostatina A e ácido suberoilanilida hidroxâmi
co (SAHA) ligam-se a um íon zinco do sítio ativo da en
zima e bloqueiam a desacetilação de lisinas e argininas.
Esses compostos inibem o crescimento de células tu
morais e bloqueiam a progressão no ciclo celular. É im
portante notar que o SAHA está hoje aprovado para tra
tamento de linfoma cutâneo de células T, com o nome
Zolinz®. Outras modificações no código de histonas, tal
como fosforilação de serina, desempenham papel no re
paro e na estabilidade de cromossomos, e também po
dem ser alvos para drogas antiproliferativas.
N O
H N
O N
OH
O
tricostatina A
de 30 nm e a descondensação da cromatina produz a
eucromatina frouxamente empacotada, a forma trans
cripcionalmente ativa do DNA. A metilação de cadeias
laterais de aminoácidos básicos (lisina e arginina) pro
move o efeito oposto e, quando acompanhada de aceti
lação diminuída, caracteriza uma forma de cromatina
muito condensada, inativa, chamada heterocromatina.
Ao longo do ciclo celular, genes reprimidos permanen
temente e outras regiões não-transcritas como centrô
meros, telômeros e DNA “lixo” ficam condensadas.
O padrão de modificações covalentes (o código de
histonas) permite meios para o ajuste fino da regulação
da expressão gênica (Correlação Clínica 2.8). Embora
esse código não implique mudanças na sequência do
DNA (ele é epigenético), é hereditário em virtude da
coordenação entre modificação de histonas e metilação
do DNA na posição 5 da desoxicitidina (Figura 2.23).
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 61
Existe também um componente dietético em po
tencial para o controle epigenético do câncer. Ácidos
graxos de cadeia curta, como butirato, são gerados pela
flora bacteriana do intestino grosso e apresentam uma
fraca capacidade de regular a mitose de células epite
liais, diferenciação e apoptose. Experimentos demons
traram que o butirato aumenta os níveis de acetilação
de histonas, presumivelmente por inibição da histona
desacetilase. Estes dados sugerem que o estado nutri
cional de um indivíduo pode afetar o código de histonas
e seu papel no câncer.
Inche, A. G., e LaThangue, N. B. Chromatin contron and can
cer-drug discovery: Realizing the promise. Drug Discov. To
day 11:97, 2006; Wang, G. G., Allis, C. D., e Chi, P. Chromatin
remodeling and cancer, part I: Covalent histone modifications.
Trends Mol. Med. 13:363, 2006; Marks, P. A., Richon, V. M.,
Breslow, R., e Rifkind, R. A. Histone deacetylase inhibitors as
new cancer drugs. Curr. Opin. Oncol. 13:477, 2001; e Gar
finkel, M. D., e Ruden, D. M. Chromatin effects in nutrition,
câncer, and obesity. Nutrition 20:56, 2004.
NH H
OH
O
Ácido suberoilanilida hidroxâmico
(SAHA, Zolinza®.)
2.5 SEQUÊNCIA E FUNÇÃO DO
DNA
O tamanho e a composição média em bases do DNA
variam enormemente entre as espécies. O que torna o
DNA de uma espécie singular é sua sequência de nu
cleotídeos. Até recentemente, a determinação direta
das sequências de nucleotídeos do DNA genômico era
uma tarefa intimidante. A tecnologia desenvolvida em
conexão com o Projeto Genoma Humano aumentou a
velocidade na qual sequências de DNA são determina
das. Sequências de DNA de mais de 1.000 espécies já
estão disponíveis para análise.
Endonucleases de Restrição e
Palíndromes
Um evento chave que permitiu desenvolvimento de
métodos para sequenciar o DNA genômico foi a desco
berta das endonucleases de restrição bacterianas. Estas
quebram DNA dupla-fita em uma sequência específica,
cortando ambas as fitas (Figura 2.44). Bactérias desen
62 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

conhecimento, enquanto as do
EcoRI 5! .... GAATTC .... 3! 5! ....
3! G5!
.... CC5!
CTTAA5!
GG3!
CTGCA3!
G3! + 5!G ....
5!AATTC
3!ACGTC
3!GG
5!CC
3!G ....
....5!
....5!
3! 5!-
3!- Extremidades
fita única
Prolongamento tipo II quebram o DNA especi
3! .... CTTAAG .... 5!
+
ficamente dentro da sequência
de reconhecimento.

Haelll
Pstl 5! .... CTGCAG
GGCC ........
3! 3! 5! .... Endonucleases de restrição
3! .... GACGTC .... 5! 3! .... reconhecem sequências espe
cíficas que podem ter frequ
ências relativamente baixas;
5! .... elas fragmentam o DNA muito
3! .... CCGG .... 5! 3! seletivamente. Por exemplo,
cegas (ou um DNA bacteriano típico com
niveladas)
3 × 106pbserá clivado em pou
FIGURA 2.44 Tipos de produtos gerados por endonucleases de restrição tipo II. cas centenas de fragmentos.
Enzimas exemplificadas por EcoR1 e PstI cortam em ambos os lados do centro de simetria do DNAs de plasmídeos podem
palíndrome, gerando prolongamentos fita única. Muitas enzimas comumente usadas geram ter poucos ou nenhum sítio de
prolongamentos-5!, embora algumas produzam extremidades com prolongamentos-3!, como clivagem para uma endonucle
mostrado para PstI. Outras endonucleases de restrição cortam através do centro de simetria ase de restrição em particular
da sequência de reconhecimento, produzindo extremidades niveladas ou cegas, como exem
(Figura 2.45). Assim, uma en
plificado por HaeIII.
donuclease de restrição espe
volveram endonucleases de restrição como defesa con cífica gera uma família singular de fragmentos, ou pro
tra infecção por fagos. A clivagem expõe o DNA viral à dutos de restrição, para uma dada molécula de DNA. A
eventual degradação por exonucleases bacterianas ines disponibilidade de enzimas de restrição e o desenvolvi
pecíficas. O DNA bacteriano pode ser protegido da cli mento de técnicas de eletroforese em gel para separar
vagem por metilação sequência-específica. Os sítios de os fragmentos de DNA tornaram a determinação de se
reconhecimento das metilases de restrição correspon quências um assunto simples (ver p. 269).
dem aos das endonucleases. A meti
lação de bases específicas nos sítios
de reconhecimento impede clivagem
pela nuclease cognata. Os sítios mais
comuns de metilação de bases são a
posição 5 da citosina e o grupo 6-NH2
da adenina. Note que a metilação de
bases também é crítica na regulação
gênica em organismos superiores.

Centenas de endonucleases de
restrição foram purificadas. Com
poucas exceções, elas reconhecem
sequências de quatro a seis nucleo
tídeos de comprimento. Endonucle
ases com sítios de reconhecimento
excepcionalmente longos promovem
poucos cortes e são valiosos em vir
tude da relativa baixa frequência
de clivagem em DNAs muito gran
des, como cromossomos eucarió
ticos. Not I, por exemplo, tem uma
sequência de reconhecimento de
oito nucleotídeos. As sequências
reconhecidas são, frequentemente,
repetições simétricas invertidas ou
palíndromes; a ordem das bases é FIGURA 2.45 Mapa de restrição do DNA de plasmídeo.
a mesma quando as duas fitas com O plasmídeo bacteriano pBR322 é um DNA circular de 4.363 pb, contendo uma origem
de replicação (ori) e genes de resistência aos antibióticos ampicilina (Apr) e tetraci
plementares do palíndrome são li
das 5!→3!. Para EcoRI de E. coli, clina (Tcr). As localizações das sequências específicas do DNA que são reconhecidas

a sequência é 5!-GAATTC-3!. Endo
nucleases de restrição tipos I e III
cortam na vizinhança do sítio de re
por várias endonucleases de restrição estão marcadas. Outras endonucleases podem
quebrar esse plasmídeo muitas vezes ou nenhuma. Por exemplo, a sequência reconhe
cida por Bgl I aparece em três localizações nesse plasmídeo, enquanto Bgl II não cliva
esse plasmídeo.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 63

A Maior Parte do DNA Procariótico revela que genes estruturais – sequências nucleotídicas
que codificam proteínas – nem sempre têm localizações
Codifica Proteínas Específicas físicas exclusivas. Ao contrário, com frequência elas
se sobrepõem umas às outras, como ilustrado pela se
Em procariotos, um grande percentual do DNA co quência parcial do bacteriófago ϕΧ174 (Figura 2.46). A
difica proteínas específicas. O genoma inteiro de E.
sobreposição permite utilização eficiente e econômica
coli consiste de cerca de 4,6 × 106 pb de DNA e contém
do limitado DNA presente e pode controlar a ordem da
~4.200 genes. Nem todos os genes codificam proteínas.
expressão dos genes.
Por exemplo, 80 genes codificam moléculas de tRNA,
e alguns não codificam nenhuma molécula funcional.
O DNA de E. coli é denso em informação de sequên Apenas uma Pequena Percentagem
cias, e há pouca repetição de informações nele. Cerca
de 1% do genoma de E. coli é composto de múltiplas do DNA Eucariótico Consiste de
cópias de sequências repetitivas curtas conhecidas Genes Funcionais
como elementos palindrômicos extragênicos repetiti
vos (REP, repeatead extragenic palindromic). Es Eucariotos têm genomas muito maiores do que pro
tes estão presentes em sítios de interação do DNA com cariotos, de cerca de 1,5 × 107 pb, para leveduras, até
proteínas funcionais, por exemplo, na região de inicia cerca de 1,15 × 1011 pb, para o genoma haploide do lírio
ção da replicação do DNA (chamada OriC). Em OriC, Fritillaria assyrinca. Os resultados do Projeto Geno
os elementos REP têm uma sequência consenso de 34 ma Humano, entretanto, indicaram que o genoma hu
nucleotídeos e ligam topoisomerase II. Elementos REP mano codifica apenas 20.000-25.000 genes. Como resul
com a sequência GCTGGTGG (sítios Chi) ligam a en tado, a informação genética não precisa ser tão densa
zima RecBCD, que inicia a recombinação do DNA. Os como em bactérias. Um DNA típico de mamíferos, com
sítios Chi ficam regularmente espaçados em intervalos apenas 7 vezes mais genes do que E. coli, contém 500
de cerca de 4.000 pb. A informação genética é ainda vezes mais DNA do que E. coli. De fato, apenas 2% a
mais densamente organizada em organismos menores, 4% do DNA de uma célula de mamífero poderia ser sufi
como bacteriófagos, onde a sequência primária do DNA ciente para todos os seus genes. Parte do DNA restante,

Proteína A.......................... Glu Ser Lys Asn Tyr Leu Asp Lys Ala Gly Ile Thr Thr
Origem da proteína K Met Ser Arg Lys Ile Ile Leu Ile Lys Gln Glu Leu Leu Leu

Sequência de nucleotídeos........................................ATG A G T C G A A A A A T T A T C T T G A T A A A G C A G G A A T T A C T A C T
51 61 71 81 91

Ala Cys Leu Arg Ile Lys Ser Lys Trp Thr Ala Gly Gly Lys Termino da proteína A
Leu Val Tyr Glu Leu Asn Arg Ser Gly Leu Leu Ala Glu Asn Glu Lys Ile Arg Pro Ile
Origem da proteína C Met Arg Lys Phe Asp Leu

G C TT G T T T A C G A A TT A A A T C G G A G T G G A C T G C T G G C G G A A A AT G A G A A A A TT C G A C C T A T
101 111 121 131 141 151

Leu Ala Gln Leu Glu Lys Leu Leu Leu Cys Asp Leu Ser Pro Ser Thr Asn Asp Ser Val
Ser Leu Arg Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Phe Ala Thr Phe Arg His Gln Leu Thr Ile Leu

C C T T G C G C A G C T C G A G A A G C T C T T A C TT T G C G A C C TT T C G C C A T C A A C T A A C G A TT C T G T
161 171 181 191 201 211

Lys Asn Termino da proteína K

Ser Lys Thr.......................Proteína C continua

C A A A A A CT ...................
219

FIGURA 2.46 Sequências parciais de nucleotídeos de genes contíguos e sobrepostos de fago ϕX174.
A sequência da proteína K, nucleotídeos 51-219, é apresentada nesta figura. Essa sequência codifica. Uma parte dessa sequência, os
nucleotídeos 51-133, codifica parte da proteína A. Outra parte da sequência, os nucleotídeos 133-219, codifica parte da proteína C.
Sobreposições semelhantes são observadas entre outros genes de ϕX174.
Adaptado de Smith, M.Am. Sci.67:61, 1979.
64 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
como o de centrômeros e telômeros, tem uma função
bem definida. Nenhuma função específica pode ser atri
buída à maior parte do DNA não-codificador, que tem
sido chamado “DNA lixo” ou junk DNA. Contudo, exis
tem evidências crescentes de que o “DNA lixo” possa
desempenhar um papel vital na regulação da expressão
gênica durante o desenvolvimento. Paradoxalmente, a
quantidade de “DNA lixo” correlaciona-se mais com a
complexidade do organismo do que o número de genes.
Os genes eucarióticos não se sobrepõem e são espa
çados, na média, por 40.000 pb. Entretanto, alguns po
dem estar mais próximos uns dos outros, em regiões que
contêm genes expressos de maneira fortemente coor
denada (grupos de genes). A maioria dos genes eucari
óticos é interrompida por sequências não-codificadoras
de nucleotídeos intervenientes chamadas íntrons (Fi
gura 2.47). As sequências do gene que são expressas,
seja como RNA produto final (RNA maduro) ou como
proteína, são chamadas éxons. Os íntrons são removi
dos durante o processamento do RNA transcrito, e os
éxons são unidos. Esse ajuste do transcrito original é
chamada splicing. As sequências e os tamanhos dos ín
trons variam enormemente entre as espécies. Somados,
podem ser 5 a 10 vezes mais longos do que os éxons
que separam. A maioria dos genes é interrompida por
íntrons pelo menos uma vez, embora alguns sejam in
terrompidos mais vezes. Alguns genes, como o do inter
feron-α humano, não contêm íntrons.
Íntrons são comuns em genes de vertebrados e de
plantas que dão flores, mas são pouco frequentes nos
de outras espécies. O papel biológico dos íntrons não
está esclarecido. Seu surgimento pode ter sido relativa
mente recente na evolução, em virtude da migração de
elementos móveis de DNA (transposons) de outras par
tes do genoma e sua inserção em genes que codificam
proteínas (p. 328). Por mutações, esses insertos podem
ter, depois, perdido sua mobilidade.
Íntron A
DNA
Éxon 1 Éxon 2
Cap A B
mRNA transcrito
1 2
mRNA maduro Cap
1 2
FIGURA 2.47 Apresentação esquemática de um gene eucariótico.
A linha superior representa uma parte do DNA genômico; a linha inferior representa o mRNA pro
duzido por ele. Nesse exemplo, o DNA consiste de dois íntrons e três éxons. As sequências dos
íntrons são transcritas, mas são removidas durante o splicing, que produz um mRNA maduro.
Redesenhado de Crick, F. Science 204:264, 1979.
Sequências Repetidas
Enquanto as repetições de sequências específicas
de DNA em procariotos são muito limitadas, o DNA de
eucariotos contém sequências que são repetidas desde
poucas vezes, para genes codificadores específicos, até
milhões de vezes por genoma, para certas sequências
simples e relativamente curtas. Dependendo da espé
cie, o DNA repetitivo pode constituir de 3% a 80% do
DNA total. Em genomas de mamíferos, incluindo o hu
mano, 25% a 35% do DNA é repetitivo. As sequências
podem ser classificadas em cópia única, moderadamen
te reiterada, altamente reiterada e repetição invertida.
O conteúdo de DNA cópia única varia entre os euca
riotos. Os limites exatos entre os vários tipos de DNAs
reiterados não são definidos com muito rigor.
Cerca de metade do genoma humano consiste de
sequências únicas, mas só uma pequena fração delas
codifica proteínas. Parte do DNA contém pseudogenes,
sequências de DNA que têm significativa homologia de
nucleotídeos com um gene funcional, mas contêm mu
tações que impedem expressão do gene. Os pseudoge
nes aumentam significativamente o tamanho dos ge
nomas eucarióticos, sem contribuir para seu conteúdo
genético que pode ser expresso. Sequências adicionais
de DNA cópia única funcionam como íntrons e regiões
de controle que flanqueiam os genes.
O DNA moderadamente reiterado consiste de cópias
de sequências idênticas ou estreitamente relacionadas
que são reiteradas de poucas a milhares de vezes. Es
sas sequências são relativamente longas, variando de
uma centena e muitos milhares de nucleotídeos. Cerca
de 20% do DNA de camundongo consiste de sequências
de algumas centenas de pares de bases de comprimento,
que são repetidas mais de mil vezes. Cerca de 15% do
genoma humano consiste de DNA moderadamente reite
rado. Algumas sequências envolvem genes de proteínas
muito abundantes e de RNAs ribossômicos (rRNAs). Por
exemplo, o ouriço do mar carrega centenas de cópias dos
genes de histonas. Eucariotos geralmente possuem cen
tenas de cópias do gene que codifica rRNA. A função de
outras sequências modera
Íntron B
damente repetidas não é
conhecida com clareza.
Éxon 3
Normalmente, sequên
-cias cópia única e mo
deradamente reiteradas
3 ocorrem em um cromos-
Cauda de poli(A)
somo em um padrão or
denado conhecido como
padrão de dispersão, que
3
Cauda de poli (A) consiste de blocos alterna
dos de DNA cópia única e
DNA moderadamente rei
terado. Elementos disper
sos longos (LINEs, long
interspersed elements)
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 65

consistem de sequências com milhares de nucleotídeos 2.6 ESTRUTURA DO RNA

de comprimento, com até 1.000 cópias por genoma. São
flanqueados em ambos os lados por sequências que
são repetições diretas. Um exemplo de um elemento RNA é um Polímero de
disperso curto (SINE, short interspersed element) é a
família Alu, uma sequência de função desconhecida que Ribonucleosídeos 5!-Monofosfato
constitui uma parte substancial (cerca de 5%) do geno
ma humano. As sequências Alu têm aproximadamente O RNA é um polímero linear de ribosídeo monofos
300 pb de comprimento e são repetidas mais de 500.000 fatos. As bases púricas do RNA são adenina e guanina;
as pirimídicas são citosina e uracil (Figura 2.2). Exceto
vezes. As estruturas das repetições dispersas curtas, in
cluindo a família Alu, são remanescentes de transposons. por uracil, que substitui a timina, são as mesmas bases
encontradas no DNA. Nucleotídeos de A, C, G e U (Figu
Aproximadamente 1% a 15% do DNA genômico ra 2.3) são incorporados ao RNA durante a transcrição.
eucariótico consiste de sequências tipicamente mais Muitos RNAs também contêm nucleotídeos modifica
curtas do que 20 nucleotídeos, reiteradas milhares ou dos, que são produzidos por processamento pós-trans
milhões de vezes. A maioria das sequências muito rei cripcional. Nucleotídeos modificados são especialmen
teradas tem uma composição em bases característica, te característicos de espécies estáveis de RNA (p. ex.,
e elas podem ser isoladas fragmentando-se o DNA em tRNA e rRNA); contudo, alguns nucleotídeos metilados
segmentos de algumas centenas de nucleotídeos e sepa estão também presentes no mRNA eucariótico. Na sua
rando-se os fragmentos por centrifugação em gradien maior parte, os nucleotídeos modificados do RNA têm
te de densidade. Esses fragmentos são chamados DNA um papel no ajuste fino, e no exercício de funções indis
satélite, porque aparecem como satélites das bandas pensáveis na célula.
que contêm a maior parte do DNA após centrifugação.
Outras sequências muito reiteradas, que não podem ser As ligações 3!,5!-fosfodiéster do RNA formam um
isoladas por centrifugação, podem ser identificadas por esqueleto a partir do qual as bases se estendem (Fi
sua propriedade de rápido reanelamento. Esses DNAs gura 2.48). Os RNAs eucarióticos variam de aproxima
muito reiterados são também chamados DNAs de se damente 20 nucleotídeos de comprimento até mais de
quência simples. Sequências simples estão tipicamente 200.000 nucleotídeos.
presentes no DNA da maioria dos eucariotos, se não de
todos. Em algumas espécies, uma sequência principal
está presente, enquanto em outras, várias sequências O
simples são repetidas até um milhão de vezes. Os DNAs Extremidade
OH 5! N N
H
Guanosina
de sequência simples podem, frequentemente, ser iso H
O N N N
lados como DNA satélite. O encontrado no centrômero H
de eucariotos superiores consiste de milhares de cópias H N H
em sequência de uma ou de algumas poucas sequên O OH
PO N N
cias curtas. Sequências satélites têm apenas 5-10 pb Adenosina
O O
de comprimento e são um constituinte dos telômeros, O
N N
onde têm um papel bem definido na replicação do DNA.
Alguns DNAs de sequência simples mais longos foram O
O OH
identificados. Por exemplo, no genoma do macaco verde H
PO N Uridina
africano, um segmento de 172 pb que contém algumas O O
N O
repetições de sequências é altamente reiterado. O

H N H
Repetições invertidas são motivos estruturais do O OH
DNA. Repetições invertidas curtas, consistindo de até PO N Citidina
seis nucleotídeos de comprimento, por exemplo, a sequên O O
N O
cia palindrômica GAATTC, ocorrem por acaso uma vez O

a cada 3.000 nucleotídeos. Tais repetições curtas não

podem formar uma estrutura cruciforme estável como
a formada por sequências palindrômicas mais longas. É
pouco provável que ocorram por acaso, sequências re
petitivas invertidas suficientemente longas para formar
cruciformes estáveis, e estas deveriam ser classificadas
como um tipo separado de sequências eucarióticas. No
DNA humano, cerca de dois milhões de repetições in
vertidas estão presentes, com um comprimento médio
de cerca de 200 pb; entretanto, sequências invertidas
com mais de 1.000 pb já foram detectadas. A maioria
das sequências repetidas invertidas é repetida 1.000 ou
mais vezes por célula.
OH OH
Extremidade 3!
FIGURA 2.48 Estrutura das ligações 3!,5!-fosfodiéster
entre os ribonucleotídeos que formam um RNA fita
única.
Fosfato une o grupo 3!-OH de uma ribose com o grupo 5!-OH
da ribose seguinte. Essa ligação produz um polirribonucleo
tídeo contendo um esqueleto açúcar–fosfato. Bases púricas
e pirimídicas estendem-se para longe do eixo do esqueleto e
podem parear com bases complementares para formar regiões
dupla-hélice com bases pareadas.
66 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Cada RNA é complementar à sequência de bases de tídeos. A hélice parcial causada por empilhamento de
porções específicas de apenas uma das fitas do DNA. bases nessa alça liga-se, por pareamento de bases, a um
Portanto, ao contrário da composição em bases do DNA, códon complementar no mRNA, de modo que tradução
as relações molares (A + U) e (G + C) no RNA não são possa ocorrer.
iguais. O RNA celular é linear e de fita-única. RNA fita
dupla estável não está presente na célula. Ao contrário,
a presença RNA dupla-fita sinaliza sua destruição. Isso
parece ser parte da resposta à infecção por vírus, uma
vez que os genomas de alguns vírus são compostos por
RNA dupla-fita, e RNA dupla-fita é um intermediário na
replicação de vírus de RNA fita-única.

Quimicamente, o RNA é semelhante ao DNA. Ambos

contêm ligações fosfodiéster carregadas negativamen
te, e as bases são quimicamente muito semelhantes. As
diferenças entre DNA e RNA devem-se principalmente
a dois fatores. Primeiro, o RNA contém ribose em lu
gar de 2!-desoxirribose como o componente açúcar do
nucleotídeo, e segundo, os RNAs geralmente são fita
-única, em lugar de dupla-fita.

O grupo 2!-hidroxila torna as ligações fosfodiéster (a) (b)

de uma molécula de RNA mais susceptível à hidrólise
FIGURA 2.49 Estrutura helicoidal do RNA.
química, especialmente em soluções alcalinas, do que Modelos indicando uma estrutura helicoidal devida a (a) empi
as do DNA (Figura 2.11). A instabilidade química do lhamento de bases na extremidade CCA do tRNA e (b) falta de
RNA reflete-se em sua instabilidade metabólica. Alguns uma hélice ordenada quando não ocorre empilhamento nessa
RNAs, como o mRNA bacteriano, são sintetizados, usa região sem pareamento de bases.
dos e degradados em minutos. Outros, o como rRNA hu Redesenhado de Sprinzl, M. e Cramer, F. Prog. Nucl. Res. Mol.
mano, são mais estáveis metabolicamente, com tempo Biol. 22:9, 1979.
de vida medido em dias. Entretanto, mesmo os RNAs
mais estáveis são muito menos estáveis do que o DNA. 3! A
75 Haste
C
aceptora
P A
Estrutura Secundária do RNA
5! G C
Envolve Pareamento Intramolecular C G
G C 70
de Bases G U
Alça D 5 A U
Como as moléculas de RNA têm fita-única, geralmen α D G 15 A 10 U A 65A Alça TCψ
te não formam extensas duplas-hélices. Em vez disso, a U
G 2 A U G mG C A C60C 55 mA
estrutura secundária de uma molécula de RNA resul
ta de regiões relativamente curtas com pareamento de D CUC mG G
C m22G mC
5C U50
U G GU TψC
bases intramolecular. Mesmo sequências não-pareadas G A GAG
de RNA fita-única podem conter considerável estrutura
G
20 25 C G AG7 Alça
helicoidal (Figura 2.49). As hélices do RNA geralmente
variável
são do tipo A, com 11 nucleotídeos por volta. β G
U 45
30 G
A m5C40
Regiões dupla-hélice haste-alça do RNA frequente
mente formam “grampos de cabelo” (hairpins). Existe CmA ψA
variação apreciável nos detalhes de estrutura fina das
estruturas em grampo, incluindo o comprimento das UGm 35 Y
Alça do
regiões de bases pareadas e o tamanho das alças não anticódon
A
-pareadas (Figura 2.50). Os RNAs transportadores são A
excelentes exemplos de empilhamento de bases e for
mação de pontes de hidrogênio em uma molécula de FIGURA 2.50 Estrutura em trevo do tRNA.
RNA fita única (Figura 2.51). Cerca de 60% das bases Diagrama em trevo da estrutura bidimensional e sequência de
nucleotídeos do tRNAPhe de levedura. As linhas vermelhas que
ficam pareadas em quatro hastes dupla-hélice, e duas
conectam os nucleotídeos em círculos indicam bases com pon
alças interagem entre si, resultando em uma molécula tes de hidrogênio. Inserção de nucleotídeos na alça D ocorre
em forma de L. A região do anticódon do tRNA é uma nas posições a e b para os diferentes tRNAs.
alça não-pareada, com bases empilhadas, de sete nucleo Redesenhado de Quigley, G.J. e Rich, A. Science 194:797, 1976.

Haste TCψ
Alça TCψ
64
54
56
Alça D
7 69
20
12
Alça
variável
Haste D
44
25
Haste do
anticódon 38
32
Alça do
anticódon
FIGURA 2.51 Estrutura terciária do tRNA.
Dobra terciária da estrutura em trevo do tRNAPhe. Pontes de hi
drogênio são indicadas por linhas cruzadas. Compare com a repre
sentação da Figura 2.50.
Redesenhado de Quigley, G.J. e Rich, A. Science 194:797, 1976.
Moléculas de RNA Têm Estruturas
Terciárias
As estruturas de moléculas funcionais de RNA são
mais complexas do que o sugerido pelas bases empilha
das e hélices com pontes de hidrogênio mencionadas
acima. Em particular, as bases das regiões não-parea
das podem formar pontes de hidrogênio ou interagir de
outro modo entre si ou com porções helicoidais da mo
lécula. Os RNAs, in vivo, são moléculas dinâmicas, que
podem mudar suas conformações durante a síntese, o
processamento e o funcionamento. Proteínas associa
das com moléculas de RNA frequentemente conferem
estabilidade à estrutura do RNA. De fato, o RNA celular
geralmente funciona como complexos RNA–proteínas,
e não moléculas livres de RNA.
A estrutura terciária das moléculas de RNA resulta
do empilhamento das bases e de pontes de hidrogênio
entre diferentes partes da molécula. O tRNA oferece
vários exemplos. Em solução, o tRNA é dobrado numa
conformação compacta em forma de L (Figura 2.51),
estabilizada por pareamento de bases Watson–Crick e
por interações de bases envolvendo mais de dois nu
cleotídeos. Isso é verdade para outros RNAs. A Figura
2.52a mostra um triplete de bases bem definido do RNA
ribossômico bacteriano. As bases podem doar átomos
de hidrogênio para ligar com o esqueleto fosfodiéster.
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 67
O 2!-OH da ribose é também um importante doador e
aceptor para a formação de pontes de hidrogênio. Todas
Haste aceptora
essas interações contribuem para a forma dobrada da
5′ molécula de RNA.
3′ Outras características terciárias foram deduzidas
72 da estrutura tridimensional de RNAs em solução ou
em forma cristalina. O termo tetraloop refere-se às se
quências específicas (p. ex., UUCG ou GAGA) que são
frequentemente encontradas na extremidade fechada
dos grampos de RNA (Figura 2.52b). Esses tetraloops
conferem estabilidade extra aos grampos de RNA por
formarem pontes de hidrogênio internas entre bases e
açúcares. Os tetraloops podem formar pontes de hidro
gênio com regiões da dupla-hélice ou com alças internas
de outras partes de um RNA, formando assim uma es
trutura terciária complexa.
2.7 TIPOS DE RNA
As moléculas de RNA são tradicionalmente classifi
cadas como RNAs transportador (ou de transferência),
ribossômico e mensageiro, de acordo com sua função
normal; entretanto, moléculas de RNA desempenham
várias outras funções numa célula.
RNA Transportador Tem Duas
Funções: Ativar Aminoácidos e
Reconhecer Códons no mRNA
Cerca de 15% do total de RNA celular é tRNA, um
intermediário essencial entre a informação do DNA e
da proteína no Dogma Central. A formação de amino
acil-tRNA, catalisada por enzimas, ativa os aminoáci
dos para a síntese proteica, de modo que a formação
das ligações peptídicas seja energeticamente favorável.
Aminoacil-tRNAs ligam-se aos ribossomos, onde os
aminoácidos são transferidos para cadeias peptídicas
em crescimento (daí o nome tRNA). O tRNA reconhece
a informação de sequência nucleotídica no mRNA para
garantir que o aminoácido correto seja incorporado à
cadeia peptídica em crescimento. A ativação do amino
ácido ocorre na sequência CCA 3!-OH terminal, à qual
aminoácidos específicos são ligados enzimaticamente.
O reconhecimento do códon ocorre por ligação do tri
plete do anticódon com um códon de três nucleotídeos
no mRNA. O pareamento de bases do códon do mRNA e
dos tripletes do anticódon no tRNA é o principal meca
nismo para garantir a precisão da formação da ligação
peptídica.
Cada tRNA pode transportar apenas um aminoáci
do. Embora apenas 20 aminoácidos sejam utilizados na
síntese proteica, organismos de vida livre sintetizam
um conjunto maior de tRNAs. Isso é uma consequên
cia do código genético ser redundante (tendo mais de
um códon para cada aminoácido). Por exemplo, a se
68 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

quência genômica da bactéria Haemophilus influen isoaceptores. Um tRNA que aceita fenilalanina seria de
zae contém genes para 54 espécies de tRNA. Mitocôn signado por tRNAPhe, enquanto um que aceita tirosina
drias sintetizam um número muito menor de tRNAs. Os seria tRNATyr.
tRNAs que aceitam o mesmo aminoácido são chamados
Os tRNAs têm 65 a 110 nucleotídeos de comprimen
to, correspondendo a uma faixa de pesos moleculares
(a)
de 22.000 a 37.000. As sequências de todas as molé
culas de tRNAs (milhares são conhecidas) podem ser
organizadas numa estrutura secundária comum em
trevo, por pareamento de bases complementares tipo
Watson–Crick, formando três estruturas em haste e
alça. A sequência triplete do anticódon está em uma
“folha” do trevo, enquanto a haste aceptora CCA está
no “caule”. Esse arranjo é preservado na estrutura
terciária do tRNAPhe (Figura 2.51), onde as hastes do
G1071
anticódon e aceptora estão cada uma em uma extre
midade da molécula em forma de L. Pontes de hidro
gênio adicionais, não-Watson–Crick, formam a estru
tura terciária da molécula em forma de L.
Os tRNAs contêm nucleotídeos modificados, por
C1100
exemplo, 7-metilguanina na posição 46 da Figu
G1091 ra 2.50. Nucleotídeos modificados afetam a estrutura
e a estabilidade, mas não são necessários para seu
funcionamento básico. Por exemplo, uma base modi
ficada vizinha ao anticódon torna o reconhecimen
to do códon mais eficiente, mas um tRNA sem essa
modificação ainda pode ser lido corretamente pelo
(b) ribossomo.
U6 U
Muitas características estruturais são comuns a
U
CU
G
... C C7 todos os tRNAs trevos. Sete pares de bases formam
C G o braço aceptor do aminoácido, que termina com o
U5 U ... G G8 triplete de nucleotídeos CCA. Esse triplete CCA não
5! 3!
tem pareamento de bases. A haste do di-hidrouracil
C4 C ... G G9 ou “haste D” tem três ou quatro pares de bases, en
C(UUCG)G tetraloop
quanto as hastes do anticódon e T têm cinco pares
de bases cada. A alça do anticódon e a alça T contêm
sete nucleotídeos. Diferenças no número de nucleotí
C deos em diferentes tRNAs ocorrem na alça variável. A
maioria dos tRNAs tem pequenas alças variáveis, de
C6
4-5 nucleotídeos, enquanto outros têm alças maiores
AC
G A com 13-21 nucleotídeos. As posições de alguns nu
C G A A7 cleotídeos são constantes em todos os tRNAs (ver as
5! 3! caixas laranjas escuras na Figura 2.50).
G5 G ... A A8

C4 C ... G G9 RNA Ribossômico É Parte do

FIGURA 2.52 Pontes de hidrogênio no tRNA.
(a) Um triplete de bases do RNA ribossômico 23S. Neste caso, a ter
ceira base (G1071) forma pontes de hidrogênio com a face de “cima”
ou “Hoogsteen” de ambas G1091 e C1100. (b) Diagrama esquemático
mostrando que dois tetraloops de RNA têm estruturas semelhantes.
Ambas as estruturas são estabilizadas por empilhamento das bases
das alças e por pontes de hidrogênio não-Watson–Crick entre bases,
e por pontes de hidrogênio entre resíduos de açúcar, fosfato e ribose.
Redesenhado com permissão de Westhof, E. e Fritsch V. RNA Fol
ding: Beyond Watson–Crick base pairs. Structure 8:R55-R65, 2000.
Redesenhado de Wyatt, J. e Tinoco, I. Jr. RNA structure, 471. Em:
Gesteland, R. F., e Atkins, J.F. (Eds.), The RNA World. 1. ed. Cold
Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor, 1993.
Aparelho de Síntese Proteica
A síntese de proteínas ocorre nos ribossomos.
Em eucariotos, essas estruturas complexas são com
postas por quatro moléculas de RNA, representando
cerca de dois terços da massa da partícula, e 82 pro
teínas. A subunidade menor, a partícula 40S, contém
um RNA 18S e 33 proteínas. A subunidade maior, a
partícula 60S, contém uma cópia de cada um dos três
rRNAs 28S, 5,8S e 5S, juntamente com 49 proteínas.
A estrutura inteira forma o ribossomo 80S. Ribosso
mos procarióticos são menores; a subunidade 30S
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 69

5! O rRNA corresponde a 80%

P
U do RNA celular e é metabolica
3! U
A
G mente estável. Essa estabilidade
C
C C L18
é necessária para o funciona
G U mento repetido dos ribossomos
(L5)
G G
A L18 e é aumentada pela associação
G (L25) L18
C G U
C
C C
A L5 com as proteínas ribossômicas.
G C
G G G Os rRNAs eucarióticos 28S (4.718
L18 C C CA C C C A
U C 18 U
(L5) C G C C nucleotídeos), 18S (1.874 nucleo
G C G G U G 24 C U G A U
GGG A
A
23
tídeos) e 5,8S (160 nucleotídeos)
A G
107 são sintetizados no nucléolo. O
U U G C C G C A A G A C U C C
G A G A G A A rRNA 5S (120 nucleotídeos) não
A AGUG A A G C
C G
44 é transcrito no nucléolo, mas a
C
G G partir de genes separados, no nu
U
A
G A 69 C cleoplasma (Figura 2.53). Os três
U U U L18 C L18 41
C
G G G (L25) rRNAs maiores são sintetizados
C GU A (L5)
C
C
G como parte de uma longa cadeia
G
U G
polinucleotídica que é, depois,
86
C U G processada para gerar as molécu
las individuais.
L18
(L5)
Modificações de nucleotídeos
FIGURA 2.53 Estrutura secundária proposta, com pareamento de bases, para o rRNA 5S. no rRNA são primariamente me
As setas indicam as regiões protegidas por proteínas na subunidade ribossômica grande. tilações para formar 2!-O-metil
Informações combinadas de Fox, G. E., e Woese, C. R. Nature (London) 256:505, 1975; e ribose. A metilação de rRNA foi
Gray, P. N., Bellemare, G., Monier, R., Garrett, R.A. e Stoffler, G. J. Mol.Biol. 73:133, 1973. diretamente relacionada com re
sistência bacteriana a antibióticos
contém um único rRNA 16S e 21 proteínas, enquanto a em espécies patogênicas (Correlação Clínica 2.9). Um
subunidade maior 50S contém uma cópia de rRNAs 5S e pequeno número de N6-dimetiladeninas está presente
23S e 34 proteínas (ver p. 222 para uma discussão sobre no rRNA 18S. O rRNA 28S tem cerca de 45 grupos metil,
a estrutura dos ribossomos). e o rRNA 18S tem 30 grupos metil.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 2.9

Resistência de Staphylococcus à Eritromicina

Bactérias expostas a antibióticos em situações clí
nicas ou agrícolas frequentemente desenvolvem resis
tência às drogas. Essa resistência pode surgir de uma
mutação no DNA da célula alvo, o que dá origem a des
cendentes resistentes. Um modo alternativo e clinica
mente mais sério de resistência surge quando plasmí
deos que codificam resistência a antibióticos proliferam
pela população bacteriana. Esses plasmídeos podem
carregar múltiplos determinantes de resistência e tor
nar vários antibióticos inúteis ao mesmo tempo.
A eritromicina inibe a síntese de proteínas por se
ligar à subunidade ribossômica grande. O Staphylococ
cus aureus pode ficar resistente à eritromicina e a an
tibióticos semelhantes como resultado de uma RNA me
tilase codificada em plasmídeo, que converte uma única
adenosina do rRNA 23S em N6-dimetiladenosina. Como
o mesmo sítio ribossômico liga lincomicina e clindami
cina, o plasmídeo causa resistência cruzada a esses an
tibióticos também. A síntese da metilase é induzida por
eritromicina.
Um microrganismo que produza um antibiótico tam
bém deve ser imune a ele, caso contrário seria morto por
seu próprio produto tóxico. O produtor de eritromicina,
Streptomyces erythreus, possui ele mesmo uma rRNA
metilase, que age no mesmo sítio ribossômico que a de
S. aureus. Qual veio primeiro? É provável que muitos
dos genes de resistência de organismos alvos tenham
evoluído dos de organismos produtores. Em vários ca
sos, as sequências de DNA dos genes de resistência de
mesma especificidade foram conservadas em organis
mos produtores e alvos. Podemos, portanto, ver resis
tência a antibióticos dependente de plasmídeos como
um caso de “engenharia genética natural”, onde o DNA
de um organismo (p. ex., o produtor Streptomyces) é
apropriado e expresso em outro organismo (p. ex., o
alvo Staphylococcus).
Cundliffe, E. How antibiotic-producing microorganisms avoid
suicide. Annu. Rev. Microbiol. 43:207, 1989.
70 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

O RNA ribossômico é o componente catalítico do No citoplasma, os mRNAs têm vida relativamente

ribossomo. A estrutura do cristal analisada por raios curta. Alguns são sintetizados e armazenados em um
-X da subunidade ribossômica maior de uma espécie estado inativo ou dormente no citoplasma, prontos para
bacteriana mostra que o sítio ativo da síntese da liga uma resposta rápida quando a síntese da proteína for
ção peptídica é composto exclusivamente de RNA 23S; necessária. Em vários animais imediatamente após a
qualquer cadeia lateral de aminoácido potencialmente fecundação, o ovo sofre rápida síntese de proteínas na
catalítica está muito longe para participar diretamente ausência de transcrição, indicando que mRNAs pré
da reação. As reações químicas necessárias à síntese da -formados e ribossomos estão presentes no citoplasma.
ligação peptídica são catalisadas pelo rRNA da subuni
dade grande (ver p. 71 para uma discussão sobre RNAs Os mRNAs eucarióticos têm características estru
turais singulares (Figura 2.54). Como a informação
catalíticos).
contida no mRNA reside na sequência linear de nucleo
tídeos, a integridade dessa sequência é extremamente
RNAs Mensageiros Carregam importante. Qualquer perda ou modificação de nucleo
tídeos poderia alterar a estrutura da proteína que está
a Informação para a Estrutura sendo traduzida. A tradução do mRNA nos ribossomos
também deve começar e terminar em sequências es
Primária de Proteínas pecíficas. Em eucariotos, uma estrutura “cap” na ex
Os mRNAs são os carregadores diretos da informa tremidade 5! de um mRNA especifica onde a tradução
ção genética do genoma para os ribossomos. Todos os deve começar. Os caps dos mRNAs eucarióticos contêm
mRNAs eucarióticos são monocistrônicos, isto é, con uma ligação fosfodiéster invertida, uma base metilada
têm informação para apenas uma cadeia polipeptídica. ligada ao mRNA via um 5!,5!-trifosfatodiéster em lugar
Em procariotos, as espécies de mRNA são frequente da ligação usual 3!,5!-fosfodiéster. O cap é ligado ao pri
mente policistrônicas, codificando mais de uma prote meiro nucleotídeo transcrito, geralmente uma purina
ína. Um fenótipo celular e seu estado funcional estão 2!-O-metilada (Figura 2.55). O cap é seguido por uma
diretamente relacionados com seu conteúdo de mRNA. sequência líder não-traduzida. A tradução começa no
códon de iniciação, sendo AUG o
mais frequente, e continua pela
m7Gppp AAAnAA OH
AUG UAG sequência codificadora. No final
Sequência codificadora
Sequência de cauda da sequência codificadora, uma
Sequência lider ou traduzida
não-traduzida sequência de terminação sinaliza
não-traduzida
o término da formação do poli
FIGURA 2.54 Estrutura geral de um mRNA eucariótico. peptídeo e a liberação do ribosso
Há uma extremidade 5! “bloqueada” (cap), seguida por uma sequência líder não-traduzida mo. Uma segunda sequência não
contendo o promotor. A região codificadora geralmente começa com o códon de iniciação -traduzida, ou “trailer”, segue-se,
AUG e continua até a sequência de terminação da tradução UAG, UAA ou UGA. Em se terminada por uma sequência de
guida, vem uma região “trailer” não-traduzida e uma cauda de poli(A) na extremidade 3’. 20-200 nucleotídeos de adeni
na, chamada cauda de poli(A),
7-Metilguanosina que constitui a extremidade 3! do
CH3
O– mRNA.
N+
N O cap 5! tem um efeito positivo
sobre o início da tradução da men
2!-O-Metilribonucleosídeo
H2N
N N 5! sagem. Durante a iniciação da tra
2! 3! O O O 5! Base (m6Ade, Ade, Gua, dução do mRNA, a estrutura cap é
Cyt, Ura)
CH2 O P O O–
P OPOCH2 O reconhecida por um fator de inicia
OH OH
O– O–
ção específico (p. 225). A sequên
O cia poli(A) afeta a estabilidade do
3! 2!
O OCH3 Base (Ade, Gua, mRNA; a degradação de um mRNA
OPOCH2 geralmente começa pelo encurta
O Cyt, Ura)
mento de sua cauda de poli(A).
O–

3! 2!
O(CH3 or H)
RNA

FIGURA 2.55 Diagrama da estrutura do “cap” ou da extremidade 5! bloqueada

em mRNA.
A 7-metilguanosina é invertida para formar uma ligação 5’-fosfato para 5’-fosfato com
o primeiro nucleotídeo do mRNA. Esse nucleotídeo é frequentemente uma purina
metilada.
 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 71

Mitocôndrias Contêm Espécies reação de múltiplas etapas (Figura 2.56). Um guanina

nucleosídeo ou nucleotídeo reage com a ligação fosfodiés
Peculiares de RNA ter íntron-éxon, deslocando o éxon doador do íntron.
Essa reação, uma transesterificação, é promovida pelo
Mitocôndrias (mt) têm seu próprio aparelho de sín
próprio íntron dobrado. O éxon doador livre, então, ataca
tese de proteínas, incluindo ribossomos, tRNAs e mR
NAs. Os rRNAs mitocondriais, 12S e 16S, são transcri
tos a partir do DNA mitocondrial (mtDNA), assim como
22 tRNAs específicos e 13 mRNAs, a maioria dos quais
codifica proteínas da cadeia de transporte de elétrons e
ATP sintase. Note que há menos tRNAs mitocondriais HO O G
do que espécies de tRNAs procarióticos ou citosólicos;
geralmente há apenas uma espécie de tRNA mitocon HO P
OH O
drial por aminoácido. Os mtRNAs correspondem a 4%
PO O–
do total de RNA celular. São transcritos por uma RNA O–
O
polimerase mitocondrial específica e são processados PO O

a partir de um par de RNAs precursores que contêm O

sequências de tRNA e mRNA. A expressão dos genomas
nuclear e mitocondrial é cuidadosamente coordenada.
A maioria das enzimas que fazem a aminoacilação dos
tRNAs mitocondriais e todas as proteínas ribossômicas
mitocondriais são codificadas por genes nucleares, tra Transesterificação

duzidas no citosol e transportadas para dentro das mi

tocôndrias. As bases modificadas em espécies de tRNA
mitocondrial são sintetizadas por enzimas codificadas
O
no DNA nuclear.
OH PO O–

RNA em Partículas
Ribonucleoproteicas
O
Outras espécies de RNAs, pequenas e estáveis, po
dem ser encontradas no núcleo, no citosol e nas mito O O–

côndrias. Essas espécies pequenas de RNA funcionam O

Transesterificação HO
como partículas de ribonucleoproteínas (RNPs), com OH
uma ou mais subunidades proteicas ligadas. Diferentes O
G
espécies de RNP foram implicadas no processamento
O–
de RNA, no transporte de RNA e no controle da tradu
PO O
ção, bem como no reconhecimento de proteínas desti
nadas à exportação. As funções reais dessas espécies, Éxons
O
ligados
quando conhecidas, são descritas em mais detalhes na +
discussão dos eventos metabólicos específicos. OH

RNA Catalítico: Ribozimas

O RNA pode ser uma enzima. Em muitos casos, o O Íntron removido

componente RNA de uma partícula ribonucleoproteica O P O–

é a subunidade cataliticamente ativa da enzima. Em O

outros casos, reações catalíticas podem ser realizadas HO
OH
in vitro por RNA, na ausência de qualquer proteína. O

Enzimas cujas subunidades RNA realizam reações ca G

talíticas são chamadas ribozimas. Existem cinco clas

ses de ribozimas. Três dessas espécies de RNA realizam
reações de autoprocessamento, enquanto as outras, ri
bonuclease P (RNase P) e rRNA, são catalisadores ver
dadeiros que agem sobre substratos separados.
No protozoário ciliado Tetrahymena thermophila,
um íntron do precursor de rRNA é removido por uma
FIGURA 2.56 Mecanismo de auto-splicing do precursor
de rRNA de Tetrahymena.
Dois éxons do rRNA são representados por cilindros azuis es
curo. As funções catalíticas residem no íntron, que é lilás. Esta
função de splicing requer a adição de um guanina nucleosídeo
ou nucleotídeo.
Reproduzido com permissão de Cech, T. R. J.Am. Med. Assoc.
260:308, 1988.
72 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

de modo semelhante a ligação fosfodiéster éxon–íntron como transportador da informação genética. Isso levan
da extremidade aceptora do íntron. Íntrons desse tipo tou a possibilidade de que os primeiros organismos vi
(íntrons do Grupo I) foram encontrados em vários ge vos possam ter sido baseados inteiramente em RNA, e
nes de mitocôndrias de fungos, em bactérias e no bac que o DNA e as proteínas tenham evoluído mais tarde.
teriófago T4. Embora esses íntrons não sejam enzimas Esse modelo é às vezes chamado o “mundo do RNA”.
verdadeiras in vivo porque só funcionam em um ciclo Segundo, sabemos que muitos vírus, incluindo pató
de reação, podem realizar reações catalíticas em condi genos humanos, usam informação genética em RNA;
ções especiais. demonstrou-se que alguns desses RNAs são catalíticos.
Portanto, o RNA catalítico oferece oportunidades para
Íntrons de auto-splicing do Grupo II estão presen a descoberta de fármacos baseados em RNA. Terceiro,
tes nos precursores de RNA mitocondrial de leveduras muitos dos eventos de processamento de informação no
e outros fungos. Embora esses RNAs façam auto-spli splicing do mRNA requerem RNA componentes. Esses
cing, existem muitos paralelos entre essa reação e a re RNAs também podem estar agindo como catalisadores.
moção de íntrons dos precursores de mRNA durante o
processamento.
Os RNAs que se autoclivam do Grupo III são encon 3! 5!
ppp
Haste III HO
trados nos RNAs genômicos de diversos vírus. Esses 15.5U dA16.5
15.4G dC16.4
RNAs clivam a si mesmos durante a geração de molé
15.3C dG 16.3
culas de RNA genômico únicas a partir de precursores 15.2C
15.1 dG16.2 Sítio de
clivagem
multiméricos grandes. A estrutura tridimensional da L2.4 4
. 1
.
1
A dTdC
. 3
. . 5. . 7
1 1 1 1 1 1
.
A 1 1 13 A
ribozima cabeça de martelo, um membro dessa tercei L2.3
A G1G CC G A
14 1. 2 dC4dG dCdC
dGdGdT
1716.1
1 6 OH 3!
12
ra classe, foi determinada (Figura 2.57). Embora o ci A GGCC C C GA C G G7ppp
C .1 2 5!
3
. . 5
4 . 6
. .
L2.2
G 4
. . 3 2 .2 2 2 2 2 2
clo catalítico não esteja completamente determinado, 0 0A U
L2.1 1 19 4
G G Haste I
o grupo amino de uma citosina desempenha um papel II
Haste 1
8 U 6
7
A 5

essencial nessa reação de clivagem. O fosfato da ligação (a)

quebrada fica na posição 3!-hidroxila do RNA produzido.
Um RNA que se autocliva encontrado em um pequeno dC1.7
3!
vírus satélite, o vírus da hepatite delta, está implicado AL2.2 AL2.3
AL2.4
em casos graves de hepatite infecciosa humana. Todos G2.1
5!
os RNAs que se autoprocessam citados podem ser le
Haste I
vados a funcionar como verdadeiros catalisadores (ou
seja, apresentando ciclos múltiplos) in vitro e in vivo. Haste II G10.1 Sítio
8 de
C11.1 A9 clivagem
G
.1
O quarto tipo de ribozima, a Ribonuclease P, con U7 G1
G12 dC17 d C3
tém um componente proteico e um componente RNA. A13 T16
.1
A6 U4
Age como uma enzima verdadeira em células, clivan A14
A15.1 G5
do precursores de tRNA para gerar a extremidade 5! Haste III
madura de moléculas de tRNA. A RNase P reconhece dA16.5
5!
estruturas constantes associadas com precursores de 3! U15.5

tRNA (p. ex., a haste aceptora e a sequência CCA), em (b)

lugar de usar um extenso pareamento de bases para li
gar o RNA substrato à ribozima. O produto da clivagem
contém um 5!-fosfato, em contraste com os produtos do
cabeça de martelo e de RNAs semelhantes. Em todos
esses eventos, a estrutura do RNA catalítico é essencial
para a catálise.
Finalmente, a estrutura obtida por cristalografia de
raios-X de um ribossomo bacteriano revela que também
ele é uma ribozima. O sítio ativo do ribossomo está na
subunidade 50S. Não há nenhum grupo funcional de
proteína suficientemente próximo para catalisar a for
mação da ligação peptídica. Ao contrário, resíduos do
RNA 23S ajudam a transferir um íon hidrogênio duran
te a síntese da ligação peptídica.
A descoberta da catálise por RNA mudou muito os
nossos conceitos sobre a evolução bioquímica e o al
cance das possibilidades da química celular. Hoje sa
bemos que o RNA pode funcionar como catalisador e
FIGURA 2.57 Estrutura em “cabeça de martelo” de RNA viral.
(a) Estrutura em “cabeça de martelo” de um RNA viral com
autoclivagem. Essa molécula artificial é formada pelo parea
mento de bases de dois RNAs separados. A clivagem da sequên
cia de RNA no sítio indicado pela seta na fita de cima requer
seu pareamento de bases com a sequência na parte inferior da
molécula. Os nucleotídeos destacados são uma sequência de
consenso encontrada em RNAs virais com autoclivagem. (b)
Dobramento tridimensional do RNA catalítico em cabeça de
martelo. As estrelas indicam a posição da ligação quebrada,
enquanto M indica um sítio de ligação de um íon metálico. As
hélices II e III empilham-se para formar uma hélice aparen
temente contínua, enquanto interação não-Watson–Crick po
sicionam as bases não-complementares da cabeça de martelo
numa estrutura em “volta de uridina”, idêntica à encontrada
nos tRNAs.
(a) é redesenhada de Sampson, J. R., Sullivan, F. X., Beh
len, L. S., DiRenzo, A. B. e Uhlenbeck, O.C. Cold Spring Har
bor Symp. Quant. Biol. 52:267, 1987. (b) é redesenhada de
Pley, H. W., Flaherty, K.M. e McKay, D. B. Nature 372:68, 1994.

RNAs Podem Ligar Outras Moléculas
Considerações sobre o mundo do RNA levaram a
um novo tipo de “bioquímica combinatória”, baseada
no grande número de sequências em potencial (4N),
que poderiam ser feitas se A, C, G ou U fossem inseri
dos ao acaso em cada uma das N posições de um ácido
nucleico. Um conjunto de moléculas de ácido nucleico
com 25 nucleotídeos de comprimento, sintetizadas qui
micamente ao acaso, conteriam 425 = 1015 membros em
potencial. Esperar-se-ia que as moléculas individuais
dessa enorme coleção de RNAs se dobrassem numa co
leção igualmente grande de formas. O grande número
de formas moleculares implica que alguns membros
dessa coleção seriam capazes de se ligar fortemente e
especificamente a ligantes, como os íntrons do Grupo
I ligam especificamente guanosina nucleotídeos. Esses
RNAs que se ligam são chamados aptâmeros. Embora
uma única molécula fosse rara demais para se estudar
na população original, o RNA aptâmero poderia ser se
lecionado e replicado preferencialmente in vitro. Por
exemplo, um RNA capaz de distinguir teofilina de cafe
ína foi selecionado a partir de uma população comple
xa (Figura 2.58). A teofilina é usada no tratamento de
asma crônica, mas o nível deve ser cuidadosamente con
trolado para evitar efeitos colaterais. O monitoramento
das concentrações de teofilina por ensaios convencio
nais baseados em anticorpos é difícil porque cafeína
e teofilina diferem apenas em um único grupo metil.
Portanto, anticorpos antiteofilina apresentam conside
rável reação cruzada com cafeína. Foram encontrados
RNA aptâmeros que ligam teofilina 10.000 vezes mais
fortemente do que cafeína. Outras extensões da tecno
logia usaram procedimentos de seleção para identificar
novas ribozimas sintéticas e RNAs com potencial tera
pêutico.
O N O
N
CH3 CH3
N O H
H3C N H3C N N
O N N
CH3
Cafeína Teofilina
FIGURA 2.58 Estruturas da teofilina e da cafeína.
Embora esses compostos se diferenciem apenas em um único
grupo metil, um RNA sintético específico pode se ligar à teofili
na com força 10.000 vezes maior do que à cafeína.
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 73
RNAs Controlam a Tradução
A tradução de um mRNA requer que esteja liga
do e se mova em relação ao ribossomo. Controlando a
eficiência desses processos, é possível controlar a tra
dução. Uma forma de fazer isso é por sítios aptâmeros
contidos no mRNA. Alguns mRNAs bacterianos contêm
sítios aptâmeros de ocorrência natural na região 5!-não
-traduzida da molécula de mRNA. Esses sítios agregam
com ligantes específicos, como aminoácidos, bases pú
ricas, glucosamina 6-fosfato, ou cofatores de enzimas
que são produtos da via cujas enzimas são codificadas
por cada mRNA. A agregação do ligante impede a tra
dução do mRNA, controlando assim a síntese das pro
teínas que são responsáveis pela via de biossíntese do
ligante. Esta é uma forma de regulação em cis porque
o controle é exercido na mesma molécula que contém o
sítio aptâmero.
RNA dupla-fita é um regulador negativo da expressão
gênica eucariótica em trans, isto é, em outra molécula.
Por exemplo, RNA dupla-fita é um intermediário neces
sário na replicação de alguns vírus de RNA. Como me
canismo de defesa, o hospedeiro processa o RNA dupla
-fita para produzir RNAs curtos de fita única, com cerca
de 23 nucleotídeos. Esses RNAs, chamados microRNA
(miRNAs), estabelecem pares de bases com mRNAs es
pecíficos, e param sua tradução ou desencadeiam sua
degradação (p. 299). Mais estudos sobre miRNAs e os
estreitamente relacionados RNAs pequenos inibitórios
(siRNAs, small inhibitory RNAs) demonstraram que
essas espécies são importantes reguladores de muitos
produtos gênicos, incluindo os envolvidos na transfor
mação maligna (ver Correlação Clínica 5.8, p. 209).
74 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
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 CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 75

Termos Chaves
A-DNA dogma central mRNA RNA pequeno inibitório
adenina DNA nucleosídeo rRNA
aptâmero DNA repetitivo nucleossomo splicing
B-DNA dupla hélice nucleotídeo superenrolamento
cap do mRNA empilhamento de bases pares de bases Watson–Cri telômero
cauda de poli(A) éxon ck temperatura de fusão
centrômero fosfodiéster partícula de ribonucleopro timina
guanina replicação
renaturação
polinucleotídeopós-transcripcional
policistrônico
teína
citosina topoisomerase
complementaridade hibridização transcrição
cromatina histona tRNA
cromossomo íntron uracil
desnaturação micro RNA Z-DNA
desoxirribose monocistrônico
ribozima

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha
1. A melhor definição de uma endonuclease é uma en
zima que hidrolisa:
A. um nucleotídeo, só da extremidade 3! de um
oligonucleotídeo.
B. um nucleotídeo, de qualquer extremidade de
um oligonucleotídeo.
C. uma ligação fosfodiéster localizada no interior
de um polinucleotídeo.
D. uma ligação, apenas em uma sequência espe
cífica de nucleotídeos.
E. uma ligação, que é distal à base que ocupa a
posição 5! da ligação.
2. Na estrutura de um DNA de ocorrência natural,
A. DNA circular é formado pela ligação dos 3!
OHs de ambas as extremidades de um DNA
linear.
B. o empilhamento de bases reduz a área de su
perfície hidrofóbica que deve ser solvatada por
água e estabiliza a dupla hélice.
C. as duas fitas podem ser paralelas ou antipara
lelas.
D. qual a forma tautomérica assumida pelas fun
ções de nitrogênio e oxigênio, não é relevante
para sua capacidade de formar pontes de hi
drogênio.
E. o enrolamento das duas fitas produz duas fen
das helicoidais de tamanhos quase idênticos.
3. A hélice do Z-DNA:
A. é a forma primária em organismos vivos.
B. é favorecida por uma sequência de G-C alter
nadas.
C. tende a ser encontrada na extremidade 3! de
genes.
D. é inibida por metilação das bases.
E. é uma conformação permanente do DNA.
4. Um nucleossomo:
A. é uma estrutura regularmente repetida de
DNA e proteínas histonas.
B. tem um cerne (core) de DNA, com proteínas
enroladas em volta, pelo lado de fora.
C. usa só um tipo de histona por nucleossomo.
D. é separado de um segundo nucleossomo por
proteínas não-histonas.
E. tem histonas em contato com a fenda maior do
DNA.
5. O RNA
A. incorpora tanto bases modificadas como não
-modificadas durante a transcrição.
B. não apresenta nenhuma estrutura em dupla
-hélice.
C. tem estrutura com empilhamento de bases e
pareamento de bases por pontes de hidrogê
nio.
D. geralmente contém cerca de 65-100 nucleotí
deos.
E. não apresenta pareamento de bases Watson–
Crick.
6. Ribozimas
A. são quaisquer partículas de ribonucleoproteí
nas.
B. são enzimas cuja função catalítica reside nas
subunidades RNA.
C. desempenham reações de autoprocessamen
to, mas não podem ser consideradas catalisa
dores verdadeiros.
76 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
D. requerem um cofator proteico para formar
uma ligação peptídica.
E. funcionam apenas no processamento do
mRNA.
Questões 7 e 8: Quase todos os processos dos quais
o DNA participa requerem que o DNA interaja com
proteínas. As interação com proteínas depende da es
trutura tridimensional local do DNA. Uma droga anti
tumoral, a cisplatina, é um complexo tetracoordenado
de platina. Forma ligações cruzadas intracadeia com o
DNA, levando a dupla-hélice a se dobrar fortemente em
direção à fenda maior. Processos celulares, como trans
crição e morte celular programada, são afetados.
7. DNA dobrado
A. ocorre só em presença de agentes externos,
como drogas antitumorais.
B. pode ser um elemento fundamental na intera
ção entre sequências de DNA e proteínas.
C. ocorre primariamente na presença de DNA
tripla-fita.
D. requer a presença de repetições invertidas.
E. ocorre só em DNA que está na forma Z.
8. Outra forma incomum de DNA é um complexo tri
pla-fita. DNA tripla-fita
A. geralmente ocorre no DNA em regiões que não
desempenham nenhum papel na transcrição.
B. envolve pontes de hidrogênio Hoogsteen.
C. caracteriza-se pela presença de uma sequên
cia de bases púricas-pirimídicas alternadas.
D. forma-se só entre moléculas.
E. assume uma conformação cruciforme.
Questões 9 e 10: Como as topoisomerases desempe
nham funções importantes em muitas atividades do
metabolismo de ácidos nucleicos, são alvos de alguns
agentes antimicrobianos e antineoplásicos. Estes man
têm o complexo intermediário entre topoisomerase e
DNA, o que pode resultar em degradação do DNA, in
trodução de mutações, ou inibição da tradução e da re
plicação.
9. Topoisomerases
A. regulam o nível de super-helicidade do DNA
nas células.
B. sempre quebram apenas uma fita de DNA.
C. podem criar, mas não remover, superenrola
mentos.
D. devem hidrolisar ATP para sua ação.
E. da subclasse girases, introduzem super-héli
ces negativas no DNA eucariótico.
10. Além da super-helicidade, o DNA ainda precisa ser
mais empacotado para caber em uma bactéria ou
célula. Qual das seguintes está correta:
A. O DNA de ambos, procariotos e eucariotos,
forma cromatina.
B. Um cromossomo bacteriano contém uma úni
ca molécula de DNA, mas um cromossomo hu
mano contém mais de um DNA.
C. O empacotamento do DNA em nucleossomos
não envolve topoisomerases.
D. Polissomos são o nível mais alto de empacota
mento que o DNA tem.
E. Fibras de 30 nm (solenoides) podem se orga
nizar em uma série alças ou domínios conden
sados.
Questões 11 e 12: O DNA eucariótico contém muitas
sequências que podem ser repetidas de algumas vezes,
para alguns genes codificadores, a milhões de vezes,
para algumas sequências relativamente curtas. A ex
pansão anormal de sequências de DNA de três pares de
bases reiteradas pode levar a várias doenças. A síndro
me do X frágil, que causa retardo mental, é caracteri
zada pela expansão de um triplete GCC perto do gene
FMR-1, de 30 cópias (normal) para milhares de cópias.
Doenças desse tipo geralmente aumentam em gravida
de a cada geração sucessiva. Um possível mecanismo
de expansão envolve o deslizamento do DNA durante a
síntese da fita tardia.
11. DNA deslizado, com pareamento errado, ocorre
quando a região do DNA tem
A. repetições diretas.
B. sequências de homopurina-homopirimidina.
C. repetições invertidas.
D. repetições no espelho.
E. palíndromes.
12. Normalmente, certos tipos de sequências reitera
das ocorrem em um cromossomo como um padrão
disperso que é
A. o de sequências de DNA muito repetitivas.
B. a porção do DNA composta de DNA em cópia
única.
C. o de sequências Alu.
D. o de blocos alternados de DNA cópia única e
DNA moderadamente repetitivo.
E. o de blocos alternados de repetições curtas
dispersas e repetições longas dispersas.
Problemas
13. Qual conformação do DNA, totalmente dupla-héli
ce, minimamente desenrolada ou muito desenro
lada, teria a maior absorbância relativa a 260 nm?
Uma molécula de DNA com um conteúdo maior de
guanina e citosina teria do que de adenina e timina
Tm maisinversa?
composição
teria alta ou mais baixa do que uma com a
14. Uma abordagem para diminuir a atividade de telo
merase em células tumorais envolve drogas que se
ligam a DNA quadruplex-G, uma vez que os telôme
ros podem, potencialmente, formar tais estruturas.
O que é um quadruplex-G, e o que na estrutura te
lomérica pode levar a ele?

Respostas
1. C Ambos A e B descrevem exonucleases. D re
fere-se especificamente a uma endonuclease de
restrição, e não é uma definição do tipo geral. E:
ambas, endo e exonucleases, apresentam especifi
cidade quanto à ligação hidrolisada.
2. B Dá uma contribuição importante para a estabi
lidade da dupla-hélice. A: a ligação entre nucleotí
deos é sempre entre o 5!-OH de um com o 3!-OH do
outro. C: o arranjo antiparalelo permite que os nu
cleotídeos opostos fiquem na posição correta para
estabelecer pontes de hidrogênio. D: cada par, na
ponte de hidrogênio, deve estar na forma tauto
mérica correta, de modo que um seja o doador e o
outro, o aceptor. E: as fendas são diferentes, com a
fenda maior sendo mais larga do que a fenda menor.
3. B A sequência de purinas-pirimidinas alternadas
é importante. A: esta é a forma B, mais flexível. C: é
mais provável que seja encontrado na extremidade
5!, consistente com uma de suas funções propostas
na regulação da transcrição. D: a metilação favore
ce a forma Z, na qual o metil é protegido da água.
E: a transição B para Z é influenciada por eventos,
como metilação.
4. A A estrutura “bolinhas num fio” é chamada po
linucleossomo. B: histonas formam o cerne (core)
com o DNA do lado de fora. C: todos os cinco tipos
de histonas estão presentes, quatro no cerne e uma
do lado de fora. D: as regiões de ligação são DNA.
E: proteínas que regulam a expressão gênica e ou
tras atividades ligam-se à fenda maior. Histonas
ligam-se à fenda menor.
5. C O empilhamento estabiliza a hélice fita única.
As porções dobradas da estrutura têm pareamen
to de bases por pontes de hidrogênio. A: apenas as
quatro bases A, G, U e C são incorporadas durante
a transcrição. B: embora fita única, o RNA apresen
ta considerável estrutura secundária e terciária. D:
só o tRNA seria assim pequeno. E: isso ocorre nas
regiões helicoidais intracadeia.
6. B Ribozimas são um tipo muito específico de
partícula. A: ver comentário anterior. C: uma das
quatro classes, RNase P, catalisa uma reação de cli
vagem. D: cristalografia de raios-X demonstrou que
não há nenhuma cadeia de aminoácidos suficien
temente próxima para catalisar a formação da li
gação peptídica. E: ribozimas foram implicadas no
processamento do RNA ribossômico e de tRNAs.
7. B O DNA dobrado pode ser um sítio de reconhe
cimento para que proteínas específicas se liguem.
A e D: DNA dobrado ocorre naturalmente em se
quências de 4 a 6 adenosinas separadas por espa
çadores ou é induzida por interações do DNA com
CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 77
certas proteínas. C: o DNA dobrado é dupla-fita. E:
o Z-DNA não tem fenda maior proeminente, e a do
bra é na direção da fenda maior.
8. B Pontes Hoogsteen em tripletes TAT e GGC são
responsáveis por manter a terceira fita na fenda
maior. A: são encontrados frequentemente em re
giões envolvidas na regulação de genes. C: a sequ-
ência necessária é uma sequência de homopurinas.
D: também podem se formar intramolecularmente
por desdobramento e redobramento do DNA. E:
um cruciforme é uma conformação alternativa do
DNA, mas não envolve uma terceira fita.
9. A Atopoisomerase Irelaxa o DNA, e a topoisome
rase II gera superenrolamentos. B: a topoisomerase
I quebra uma fita, mas a topoisomerase II quebra
ambas as fitas. C: a topoisomerase I remove supe
renrolamento. D: a topoisomerase II usa ATP, mas
a topoisomerase I não. E: girases são encontradas
só em bactérias.
10. E Essas alças são ligadas a um arcabouço de pro
teínas. A: cromatina é encontrada em eucariotos,
nucleoide em procariotos. B: um cromossomo hu
mano contém um único DNA. C: ocorre adição e
quebra de superenrolamentos. D: polissomos orga
nizam-se em fibras de 10 nm e, depois, em fibras de
30 nm que, por sua vez, empacotam mais.
11. A Quando o DNA desenrola e realinha, uma cópia
de uma repetição direta em uma fita pareia com
uma cópia adjacente da outra fita. B, C, D, E: es
tas são outros tipos de estruturas importantes no
DNA.
12. D A, B: estes são dois de vários tipos de DNAs,
mas não constituem padrões. C e E: Alu é um tipo
de repetição dispersa curta. Repetições dispersas
curtas e longas são as duas classes de DNA mode
radamente repetitivo.
13. Bases púricas e pirimídicas não-empilhadas têm
densidade óptica relativa mais alta do que bases
empilhadas, de modo que a forma mais desenro
lada do DNA teria o valor mais alto. Tm é o ponto
do meio da transição entre DNA dupla-fita e DNA
separado. Conteúdo mais alto de G-C significa que
o DNA é mais estável, de modo que sua Tm seria
mais alta.
14. Quartetos-G contêm um arranjo planar de gua
ninas interconectadas por pontes de hidrogênio
Hoogsteen, que podem empilhar umas sobre as
outras para formar uma estrutura multicamadas.
São estabilizadas por Na+ e K+. Telômeros contêm
800-2.400 cópias da sequência necessária, rica em
G d(TTAGGG)n.
78 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
PARTE I CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 79
ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS

3
Proteínas I:
Composição e estrutura
Richard M. Schultz
Professor Titular, Stritch School of Medicine, Loyola University of Chicago

CONTEÚDO CORRELAÇÕES CLÍNICAS

3.1 PAPÉIS FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS NO HO 3.1 Proteínas Plasmáticas no Diagnóstico de Doenças,
MEM, 80 92
3.2 COMPOSIÇÃO EM AMINOÁCIDOS DE PROTEÍ 3.2 Diferenças em Insulinas Usadas em Tratamento
NAS, 81 de Diabetes Mellitus, 94
3.3 PROPRIEDADES DE CARGAS E QUÍMICAS DE 3.3 Hiperlipoproteinemias, 113
AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS, 86
3.4 Hipolipoproteinemias, 114
3.4 ESTRUTURA PRIMÁRIA DE PROTEÍNAS, 93
3.5 Hemoglobina Glicosilada, HbA1c, 117
3.5 NÍVEIS SUPERIORES DE ORGANIZAÇÃO DE
3.6 Doenças de Príons e Proteínas Como Agentes
PROTEÍNAS, 94
Infecciosos: Encefalopatias Espongiformes Trans
3.6 PROTEÍNAS ESTRUTURADAS NÃO GLOBULA missíveis Humanas (TSEs), 118
RES, 106
3.7 Uso de Análise de Aminoácidos em Diagnóstico de
3.7 DOBRAMENTO (FOLDING) DE PROTEÍNAS DE Doenças, 131
ESTRUTURAS ALEATÓRIAS PARA ESTRUTU
RAS SINGULARES: ESTABILIDADE DA PROTEÍ
NA, 116
3.8 ASPECTOS DINÂMICOS DA ESTRUTURA DE
PROTEÍNAS, 125
3.9 CARACTERIZAÇÃO, PURIFICAÇÃO E DETERMI
NAÇÃO DA ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO DE
PROTEÍNAS, 126

Conceitos Chaves
• Dois tipos de aminoácidos compõem polipeptíde
os: aminoácidos comuns e derivados. Aminoácidos
comuns têm um átomo de carbono central ao qual
é ligado um grupo amino, um grupo ácido carboxí
lico, um átomo de hidrogênio e um grupo de cadeia
lateral.
• Os aminoácidos nas cadeias polipeptídicas são uni
dos por uma ligação peptídica, que conecta o grupo
ácido α-carboxílico de um aminoácido com o grupo
α-amino de um segundo aminoácido.
• Aminoácidos e proteínas têm propriedades ácido
-base e de cargas correspondentes que determi
nam suas atividades biológicas e são usadas para
caracterização e purificação.
80 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
• Uma proteína é definida por sua estrutura secun
dária, terciária e quaternária. a-Hélices e b-estru
turas são estruturas secundárias estáveis comuns
encontradas em proteínas dobradas.
• Domínios de proteínas globulares são formados
por motivos estruturais e dobras características.
• Proteínas nas células estão presentes em comple
xos, que são organizados em redes e participam de
interactomas.
Algumas proteínas são intrinsecamente não-es
•
truturadas, o que é necessário para suas funções
biológicas.
• Proteínas não globulares incluem proteínas fibro
sas, como o colágeno, com sequência de aminoáci
dos repetitiva e hélice incomum, com geometria em
forma de bastão.
3.1 PAPÉIS FUNCIONAIS DE
PROTEÍNAS NO HOMEM
As proteínas desempenham uma surpreendente va
riedade de funções essenciais dinâmicas e estruturais
em organismos de mamíferos. Funções dinâmicas in
cluem catálise de transformações químicas, transpor
te, controle metabólico e contração. Em suas funções
estruturais, as proteínas compõem a matriz para osso
e tecido conjuntivo, dando estrutura e forma ao orga
nismo humano. Estima-se que os aproximadamente
25.000 genes humanos, por meio de splicing alterna
tivo de RNA e modificações pós-tradução de proteínas
traduzidas, produzam 1 milhão de proteínas individua
lizadas. O número de proteínas expressas simultanea
mente em uma única célula humana está na faixa de
20.000 a 50.000.
Enzimas são proteínas que catalisam reações quími
cas. Quase todas, dentre as milhares de reações quími
cas de organismos vivos, exigem uma enzima específica
catalisadora para garantir que essas reações ocorram
numa velocidade compatível com a vida. O caráter de
qualquer célula é baseado em sua química particular,
que é determinada por sua composição enzimática es
pecífica, que estabelece o fenótipo celular. Muitas doen
ças genéticas resultam de níveis alterados da produção
de enzimas, ou de alterações específicas em sua sequ-
ência de aminoácidos. Aproximadamente um terço dos
genes humanos codifica proteínas que são enzimas.
Transporte é outra função importante de proteínas.
São exemplos discutidos em detalhes neste texto a he
moglobina e a mioglobina, que transporta oxigênio no
sangue e o armazena no músculo, respectivamente. As
proteínas ligam e carregam lipídeos, metabólitos, hor
mônios esteróides, vitaminas, moléculas sinalizadoras
e minerais no sangue, do seu local de síntese ou entrada
até seu local de ação ou eliminação. Muitas drogas e
• Uma proteína dobra-se até atingir sua conformação
de menor energia livre de Gibbs, dentro dos limites
cinéticos, sob o controle de forças não covalentes.
As estruturas das proteínas dobradas são dinâmi
•
cas, com os átomos flutuando e girando em torno
de posições médias.
• Proteínas são purificadas e caracterizadas por téc
nicas que utilizam carga e peso molecular. A es
trutura de proteínas é caracterizada por técnicas
espectrais, ópticas e de difração de raios-x.
• Técnicas de proteômica determinam a expressão
de milhares de proteínas em uma célula ou um te
cido, em um único ensaio.
compostos tóxicos são transportados ligados a proteínas.
Outras proteínas agem intracelularmente, transpor
tando compostos, bem como outras proteínas, até seus
locais de ação. As proteínas agem na transmissão de
compostos e de sinais através da membrana plasmática
de células e da membrana de organelas. As proteínas
também participam dos mecanismos de contração. Mio
sina e Actina funcionam na contração muscular e são
responsáveis por mudanças na forma da célula.
Proteínas com um papel protetor incluem imuno
globulinas, proteínas do complemento e interferon, que
protegem contra infecções bacterianas ou virais. As
proteínas da coagulação interrompem a perda de san
gue quando há lesão no sistema vascular.
Muitos hormônios são proteínas ou peptídeos. Insu
lina, tirotropina, somatotropina (hormônio de cresci
mento), prolactina, hormônio luteinizante e hormônio
folículo-estimulante são proteínas. Muitos hormônios
polipeptídicos têm baixo peso molecular (<5 kDa) e são
chamados peptídeos. Em geral, o termo proteína é usa
do para moléculas que contêm mais de 50 aminoácidos,
e peptídeo é usado para aquelas que contêm menos do
que 50 aminoácidos. Os hormônios peptídicos impor
tantes incluem o hormônio adrenocorticotrópico, hor
mônio antidiurético, glucagon e calcitonina.
Proteínas controlam e regulam a transcrição e a tra
dução de genes. Estas incluem as proteínas histonas,
que ficam estreitamente associadas com o DNA, fatores
de transcrição repressores e amplificadores que con
trolam a transcrição gênica, proteínas que regulam a
estrutura do DNA para promover ou inibir a expressão
de genes, proteínas que transcrevem o DNA em RNA e
componentes de partículas heteronucleares com RNA
e ribossomos.
Proteínas estruturais desempenham funções de
“tijolo-e-argamassa”. Estão incluídos colágeno e elas
tina, que formam a matriz do osso e dos ligamentos e

dão força estrutural e elasticidade a órgãos e ao sistema
vascular. Tubulina e actina são proteínas que polimeri
zam em fibras de microtúbulos e filamentos que formam
o citoesqueleto de cada célula.
Um entendimento do funcionamento normal e pa
tológico do organismo de mamíferos requer um claro
entendimento das propriedades das proteínas.
3.2 COMPOSIÇÃO EM
AMINOÁCIDOS DE
PROTEÍNAS
Todos os diferentes tipos de proteínas são polímeros
de apenas 21 aminoácidos. Esses aminoácidos comuns
são definidos como os aminoácidos para os quais existe
pelo menos um códon no código genético. A transcrição
e a tradução do código do DNA resultam na ligação de
aminoácidos em uma sequência linear específica carac
terística de uma proteína (Figura 3.1). Muitas proteínas
também contêm aminoácidos derivados, que são ge
ralmente formados por modificação enzimática de um
dos aminoácidos comuns depois de sua incorporação a
uma proteína. Exemplos de aminoácidos derivados são
cistina (p. 84), desmosina e isodesmosina, encontrados
na elastina, hidroxiprolina e hidroxilisina do colágeno,
g-carboxiglutamato na protrombina, além de fosfoseri
na, alfosfotreonina e fosfotirosina.
Genes
contendo
códons para
Membrana
nuclear
aminoácidos
transcrição
mRNA contendo
a sequência de códon
de aminoácidos
tradução
Proteína
com sequência
específica de aminoácidos
FIGURA3.1 A informação genética é transcrita de uma
sequência de DNA para mRNA e então é traduzida para
a sequência de aminoácidos de uma proteína.
CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 81
Aminoácidos Comuns
Aminoácidos comuns têm a estrutura geral repre
sentada na Figura 3.2. Eles contêm em comum um áto
mo central de carbono-alfa (a) ao qual um grupo ácido
carboxílico, um grupo amino e um átomo de hidrogê
nio estão covalentemente ligados. Além disso, a quarta
valência do átomo de carbono-a é ligado a um grupo
químico específico, designado por R e chamado cadeia
lateral, que define especificamente cada um dos amino
ácidos comuns. A Figura 3.2 mostra a forma ionizada de
um aminoácido comum em solução a pH 7. Em condi
ções fisiológicas, o grupo a-amino está protonado e em
forma de íon amônio; o grupo carboxílico está despro
tonado ou em forma de íon carboxilato.
COO–
NH
+ 3 Cα H
R
FIGURA 3.2 Estrutura geral dos aminoácidos comuns.
Cadeias Laterais Definem a Natureza
Química e as Estruturas de a-Aminoácidos
As estruturas dos aminoácidos comuns são mos
tradas na Figura 3.3. Aminoácidos que contêm grupos
alquila como cadeias laterais incluem glicina, alanina,
valina, leucina e isoleucina. A Glicina tem a estrutura
mais simples, com R = H. A Alanina contém um gru
po metil (CH3—). A Valina tem um grupo R isopropil
(Figura 3.4). Os grupos R de leucina e isoleucina são
grupos isobutil que são isômeros estruturais um do ou
tro. Na leucina, a ramificação da cadeia lateral isobutil
ocorre no carbono-gama (g), e na isoleucina é ramifica
da no carbono-beta (b) (Figura 3.4).
Fenilalanina, tirosina e triptofano são aminoácidos
aromáticos. A Fenilalanina contém um anel benzêni
co, a tirosina um grupo fenol, e o triptofano a estru
tura heterocíclica indol. Em todos os casos, a porção
aromática é ligada ao carbono-a por um carbono meti
leno (—CH2—) (Figura 3.3).
Aminoácidos contendo enxofre são cisteína e metio
nina. O grupo de cadeia lateral da cisteína é um tiol
metil (HSCH2—), e na metionina, a cadeia lateral é um
metil etiltiol éter (CH3SCH2CH2—).
Os dois aminoácidos contendo hidroxila (álcool)
são serina e treonina. Na serina, a cadeia lateral é um
hidroximetil (HOCH2—). Na treonina, uma estrutura
etanol é conectada ao carbono-a para produzir um ál
cool secundário (CH3-CHOH-CHa—).
Prolina é singular porque incorpora o a-amino gru
po em sua cadeia lateral e é mais precisamente classifi
cada como um a-iminoácido, uma vez que sua a-amina
82 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Monoamino, monocarboxílico
Não substituído

COO– COO– COO– COO– COO–

H3NCH
+ H3NCH
+ H3NCH
+ H3NCH
+ H3N
+ C H
H3H
H CH3 H3 CH CH2 H3C CH2
CH
Glicina H3H
L-Alanina C CH3
L-Valina C
L-Leucina L-Isoleucina

H3 CH3 CH3

H3 Monoamino,
Heterocíclico
H dicarboxílico
Hidroxi Aromático Diamino, monocarboxílico Tioéter
H2CCH2
N H + COO– H3H
+ COO– + COO– COO–
NC
H2C + C H3NCH H3NCH +
H3NCH
H2 COO– CH2 CH2 CH2 CH2

CH2

S
HN CH3

OH
L-Prolina L-Fenilalanina L-Tirosina L-Triptofano L-Metionina

Mercapto Seleno Carboxamida

COO– COO– COO– COO– COO– COO–

N
+ C H3NCH
+ H3NCH
+ H3NCH
+ H3NCH
+ H3NCH
+

CH2OH HC OH CH2 CH2 CH2 CH2

CH3 SH SeH C NH2 CH2

O C NH2
O
L-Serina L-Treonina L-Cisteína L-Selenocisteína L-Asparagina L-Glutamina

COO– COO– COO– COO– COO–

NC NC NC
+ + H3N
+ CH H3H
+ H3N
+ CH

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

COO– CH2
COO– CH2 CH2 HN NH++

NH
CH2

+NH3 H2N
+ C
NH2

L-Aspartato L-Glutamato L-Lisina L-Arginina L-Histidina

FIGURA 3.3 Estruturas dos aminoácidos comuns. As formas carregadas são as presentes em pH 7,0.

é uma amina secundária, com seu nitrogênio-a tendo
duas ligações covalentes com carbono. A incorporação
do nitrogênio a-amino em um anel de cinco membros
limita a liberdade de rotação em torno da ligação —
Na—Ca— da prolina e, assim, limita a participação da
prolina em conformações específicas da cadeia polipep
tídica.
Os aminoácidos descritos até agora contêm cadeias
laterais que não são carregadas em pH fisiológico. Os
ácidos dicarboxílicos-monoamino contêm um grupo
carboxílico em sua cadeia lateral. No aspartato, esse
grupo é separado por um carbono metileno (—CH2—)
do carbono-a (Figura 3.5). No glutamato (Figura 3.5),
o grupo é separado por dois átomos de carbono meti
leno (—CH2—CH2—) do carbono-a (Figura 3.5). Em
pH fisiológico, esses grupos são desprotonados e car
regados negativamente. O ácidos dibásicos-monocar
boxílicos são a lisina, a arginina e a histidina (Figura
3.3). Nestes, o grupo R contém um ou dois átomos de
nitrogênio que agem como uma base ligando um pró
ton. Na lisina, a cadeia lateral é uma N-butilamina. Na
arginina, a cadeia lateral contém um grupo guanidino
(Figura 3.6) separado do carbono-a por três átomos
de carbono metileno. Tanto o grupo guanidino da ar
ginina como o grupo e-amino da lisina são protonados

em pH fisiológico (~7) e carregados positivamente. Na
histidina, a cadeia lateral contém uma estrutura hete
rocíclica de cinco elementos, o grupo imidazol (Figura
3.6). O pK!a do grupo imidazol é aproximadamente 6,0
em água; portanto, soluções fisiológicas contêm con
centrações relativamente altas de ambas as formas bá
sica (imidazol) e ácida (imidazólio) da cadeia lateral
da histidina.
CH3
H Cβ
CH3
Grupo R isopropil da valina
CH3 H teínas que incorporam selenocisteína. Além disso, en
HCγ Cβ
CH3 H todos os animais, o códon não é universal, uma vez
Grupo R isobutil da leucina
CH3
CH3CH2 Cβ
H proteínas têm um papel antioxidante na eliminação de
Grupo R isobutil da isoleucina
FIGURA 3.4 Cadeias laterais alquilas da valina, leucina e
isoleucina.
–O
CCH2
O
Grupo R do aspartato
–O
C CH2 CH2
O
Grupo R do glutamato
FIGURA 3.5 Cadeias laterais de aspartato e glutamato.
Glutamina e asparagina são análogos estruturais
de ácido glutâmico e ácido aspártico, com seus grupos
carboxílicos das cadeias laterais amidados. Existem có
dons de DNA específicos para glutamina e asparagina,
diferentes dos do ácido glutâmico e do ácido aspártico.
As cadeias laterais amida da glutamina e da asparagina
não podem ser protonadas e não são carregadas em pH
fisiológico.
Por volta de meados da década de 1960, acreditava
-se que os códons de três nucleotídeos do DNA, es
pecificando os aminoácidos comuns encontrados em
proteínas, tivessem sido determinados. O número
total de aminoácidos comuns era 20, derivados de 64
códons tripletes possíveis, com 3 códons destinados a
terminar a tradução de open readingframes (Tabela
6.1). Entretanto, em 1988, um 21º aminoácido comum,
CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 83
selenocisteína (Figura 3.3), com um códon especí
fico no mRNA e tRNA que coloca selenocisteína em
cadeias polipeptídicas durante a tradução do mRNA,
foi demonstrado. A selenocisteína é estruturalmente
semelhante à cisteína, mas com um átomo de selênio
substituindo o átomo de enxofre. Uma dificuldade com
o códon da selenocisteína é que ele é idêntico a um
dos códons de terminação, que se traduz num sinal de
parada da tradução. Portanto, esse códon, UGA, tem
dois significados. O códon codifica um sinal de parada
da tradução na grande maioria das vezes, mas em con
textos especiais de RNA, codifica a incorporação de
selenocisteína em uma sequência polipeptídica. Esses
casos são raros, uma vez que apenas 25 genes foram
identificados no genoma humano, que codificam pro
quanto selenocisteína-proteínas são encontradas em
que não está presente em plantas superiores, levedu
ras e na maioria das bactérias. Em estudos animais, o
nocaute (knockout) do gene do tRNA de selenocisteí
na é letal, inferindo-se que a selenocisteína é essencial
para a vida em espécies animais. Muitas das seleno
espécies reativas de oxigênio.
+
NH2
NH2 C NH
Grupo guanidina (forma carregada) da arginina
HC C
HN+ NH
C
H
Grupo imidazólio da histidina
FIGURA 3.6 Grupos guanidina e imidazólio de arginina e
histidina.
Para representar sequências de aminoácidos em
proteínas, abreviaturas de três letras e de uma letra
para os aminoácidos comuns são usadas (Tabela 3.1).
Essas abreviaturas são universalmente aceitas e serão
usadas em todo este livro. As abreviaturas de três letras
dos ácidos aspártico (Asp) e glutâmico (Glu) não devem
ser confundidas com as de asparagina (Asn) e glutami
na (Gln). Na determinação da composição em amino
ácidos de uma proteína por procedimentos químicos,
não se pode diferenciar facilmente entre Asn e Asp, ou
entre Gln e Glu, porque os grupos amida das cadeias
laterais de Asn e Gln são frequentemente hidrolisados
no processo e geram Asp e Glu (Seção 3.9). Os símbolos
Asx para Asp ou Asn, e Glx para Glu ou Gln, indicam
essa ambiguidade na análise. Um esquema semelhante
é usado com as abreviaturas de uma letra para Asp ou
Asn, e Glu ou Gln.
84 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

TABELA 3.1 Abreviaturas dos Aminoácidos COO–

CH2 COO–
Aminoácido Abreviatura NH3
H C H CNH3H

Letras
Três Uma CH2
Letra + SH
C
+H2 +
–2H S
S
Alanina Ala A
SH
CNH+3 CNH+3
Arginina Arg R CH2
Asparagina Asn N H
Aspartato Asp D COO– COO–

Asparagina ou aspartato Asx B Duas cisteínas Cistina

Cisteína Cys C
FIGURA3.7 Formação da ligação cistina.
Glicina Gly G
Glutamina Gln Q
te a um carbono-α. Um átomo de carbono com quatro
Glutamato Glu E substituintes diferentes numa configuração tetraédrica
Glutamina ou glutamato Glx Z é assimétrico e existe em duas formas enantiomorfas.
Portanto, todos os aminoácidos apresentam isomeria
Histidina His H
óptica, exceto glicina na qual R = H e, portanto, dois
Isoleucina Ile I dos quatro substituintes do átomo de carbono-α são hi
Leucina Leu L drogênio. A configuração absoluta de um aminoácido
é apresentada na Figura 3.8, usando a projeção de Fis
Lisina Lys K cher para mostrar a posição no espaço dos substituin
Metionina Met M tes do carbono-α arranjados num tetraedro. O grupo
α-COO– é direcionado para cima e para trás do plano da
Fenilalanina Phe F
página, e o grupo R está direcionado para baixo e para
Prolina Pro P trás do plano da página. Os grupos α-H e α-NH3+ estão
Selenocisteína Sec U na direção ao leitor. Um aminoácido assim posiciona
a direita
do projetadoseu
átomo
grupo
deα-NH 3+ paraPor
carbono-α. a esquerda ou para
convenção,
Serina Ser S
se o
Treonina Thr T α-NH3+ estiver projetado para a esquerda, o aminoáci
Triptofano Trp W do tem configuração absoluta L. Seu enantiômero, com
α-NH3+ projetado para a direita, tem uma configuração
Tirosina Tyr Y absoluta D. As proteínas de mamíferos contêm aminoá
Valina Val V cidos apenas com configuração L. As designações L e D
referem-se à capacidade de girar luz polarizada para a
esquerda (L, levo) ou direita (D, dextro) a partir de seu
Cistina É um Aminoácido Derivado plano de polarização. Como os aminoácidos das pro
teínas são assimétricos, as proteínas que os contêm
Produzido pela Oxidação de Dois Resíduos
também apresentam propriedades assimétricas.
de Cisteína
Um aminoácido derivado encontrado em muitas
proteínas é a cistina. É formado pela oxidação de duas COO– COO–
cadeias laterais tiol de duas cisteínas, formando uma
ligação covalente dissulfeto (Figura 3.7). Em proteí NH3
+ C H
HC
NH+3
nas, ligações dissulfeto de cistina formada a partir de
resíduos de cisteína, separadas uma da outra na cadeia R R

polipeptídica (intracadeia) ou entre duas cadeias poli Configuração L Configuração D

peptídicas (intercadeias) têm um papel importante na
estabilização da conformação dobrada de proteínas (es
trutura da insulina; ver Figura 3.23, p. 91).
a-Aminoácidos Têm um Centro
Assimétrico
Os aminoácidos comuns (ver Figura 3.2) têm quatro
substituintes (R, H, COO– e NH+)3 ligados covalentemen
FIGURA 3.8 Configuração absoluta de um aminoácido.
Aminoácidos São Polimerizados em
Peptídeos e Proteínas
A ligação de uma seleção de aminoácidos comuns
em cadeias polipeptídicas em células é catalisada en
zimaticamente (p. 225). Quimicamente, é uma reação

de desidratação (Figura 3.9). O grupo a-carboxílico de
um aminoácido forma uma ligação peptídica covalen
te com o grupo a-amino de outro aminoácido por eli
minação de uma molécula de água. O dipeptídeo (dois
resíduos de aminoácidos unidos por uma única ligação
peptídica) pode então formar uma segunda ligação pep
tídica por meio de seu grupo carboxílico terminal e o
a-amino de um terceiro aminoácido, gerando um tri
peptídeo (Figura 3.9). A repetição desse processo gera
um polipeptídeo ou proteína com sequência específica
de aminoácidos. Essa é a estrutura primária da proteí
na, e é predeterminada pela sequência de nucleotídeos
de seu gene. A estrutura primária singular permite que
uma cadeia polipeptídica se dobre em uma estrutura
tridimensional específica, que dá à proteína suas pro
priedades químicas e fisiológicas.
Uma ligação peptídica pode ser representada como
dois isômeros de ressonância (Figura 3.10). Na estru
tura I, uma dupla ligação localiza-se entre o carbono da
carbonila e o oxigênio da carbonila (C!=O), e a liga
ção do carbono da carbonila com o nitrogênio (C!—N)
é uma ligação simples. Na estrutura II, a ligação entre
o carbono e o oxigênio (C!—O–) é uma ligação simples,
e a ligação localizada entre o carbono e o nitrogênio é
uma dupla ligação (C!=N). Na estrutura II há uma car
ga negativa no oxigênio e uma carga positiva no nitro
gênio. Ligações peptídicas reais são híbridos de resso
nância dessas duas estruturas elétron isômeras, sendo
que a ligação entre carbono e nitrogênio tem caráter
de 50% dupla ligação. Estudos de difração de raios-X
confirmam isso e mostram que o comprimento da liga
ção entre o carbono da carbonila e o nitrogênio (1,33 Å)
está aproximadamente a meio caminho entre o de uma
ligação C!—N simples (~1,45 Å) e uma ligação C!=N
dupla (~1,25 Å).
NH3 H H
+ C COO– + NH C
+ 3COO–
R1 R2
– H2O
H O R2
NH
+ 3 CCNCCOO– + NH3CCOO–
+
R1 HH
Dipeptídeo
– H2O
H O R2 O H
CCNC
+
NH3CNCCOO–
R1 HH
TripeptídeoH
FIGURA 3.9 Formação da ligação peptídica.
CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 85
O O–
R C′ N R′ R C′ N R′
+
H H
I II
FIGURA 3.10 Estruturas de isômeros eletrônicos de uma
ligação peptídica.
Uma consequência do caráter parcial de dupla liga
ção é que não ocorre rotação do carbono da carbonila
em relação ao nitrogênio de uma ligação peptídica em
temperaturas fisiológicas. Uma segunda consequência
do caráter de dupla ligação é que todos os átomos liga
dos a C! e N ficam num plano comum.
+C
C C′N
O−
H
Assim, uma cadeia polipeptídica consiste de planos
de ligações peptídicas interconectados nos átomos de
carbono-a. O carbono-a interconecta as ligações peptí
dicas por meio de ligações simples que permitem rota
ção de planos peptídicos adjacentes, um em relação ao
outro. Cada resíduo de aminoácido contribui com um
carbono-a, duas ligações simples e uma ligação peptí
dica para a cadeia polipeptídica (Figura 3.11). O termo
resíduo refere-se aos átomos fornecidos por um amino
ácido a uma cadeia polipeptídica, incluindo os da cadeia
lateral.
Ligação peptídica para Ri
HRi–1δ+H Φi ψi Oδ–
C′ HRi+1
C N C
Cα Nδ+Φi+1
ψi –1C′
Oδ– Ri H H
FIGURA 3.11 Resíduo de aminoácido numa cadeia
polipeptídica.
Cada resíduo de um polipeptídeo contribui com duas ligações
simples e uma ligação peptídica para a cadeia. As ligações sim
ples são aquelas entre o Ca e os átomos C! carbonílicos e os
átomos Ca e N. Ver p. 96 para definição de f e y.
H
A ligação peptídica da Figura 3.12a mostra uma con
figuração trans de seus átomos de oxigênio (O) e hi
R3 drogênio (H). Essa é a configuração mais estável, com
as duas cadeias laterais de resíduos adjacentes (R e R!)
também em trans. A configuração cis (Figura 3.12b)
traz os dois grupos das cadeias laterais para o mesmo
lado da ligação C!=N, que é desfavorável em virtude do
impedimento estérico entre os grupos R. Consequente
mente, ligações peptídicas trans ocorrem em proteínas,
exceto quando há resíduos de prolina. Na prolina, a ca
R3 deia lateral inclui o grupo a-amino, e ambas as configu
rações da ligação peptídica, cis e trans, com o a-imino
grupo da prolina têm interações desfavoráveis com o
carbono-a do aminoácido adjacente que está formando
86 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
a ligação peptídica com o a-imino. Por conseguinte, a li
gação peptídica de prolina em uma cadeia polipeptídica
não-estruturada ou desnaturada terá quantidades sig
nificativas de sua ligação peptídica em configurações
trans e cis. A configuração da ligação peptídica da pro
lina em uma proteína dobrada depende das forças sobre
a ligação da prolina geradas pela estrutura tridimensio
nal da molécula de proteína específica na qual a prolina
está inserida.
H
R
α-Ci
H
C´ N
Ligação
peptídica
O α-Ci +1
R′
(a) configuração trans
H H
R R′
α-Ci α-Ci +1
C´ N a forma ácida carregada positivamente, tornado mais di
Ligação
peptídica
H na ausência de uma estabilização por uma carga negati
O va de estabilização próxima. Outros fatores que afetam
(b) configuração cis
FIGURA3.12 (a) Ligação trans-peptídica e (b) a rara
ligação cis-peptídica.
C!-N tem caráter parcial de dupla ligação.
Um dos maiores polipeptídeos humanos é a proteína
muscular titina, que contém cerca de 27.000 resíduos
de aminoácidos em uma única cadeia polipeptídica. O
comprimento da cadeia por si só, entretanto, não de
termina a função de um polipeptídeo. Muitos peptídeos
pequenos de menos de 10 aminoácidos desempenham
importantes funções bioquímicas e fisiológicas no ho
mem (Tabela 3.2). As estruturas primárias são escri
tas de uma forma padrão, convencional, e numeradas
sequencialmente da extremidade NH2-terminal para a
extremidade COOH-terminal, consistente com a ordem
de adição dos aminoácidos à cadeia durante a biossín
tese. Assim, para o hormônio liberador de tirotropina
(Tabela 3.2), o resíduo de ácido glutâmico da esquerda
é o aminoácido NH2-terminal do tripeptídeo e é o resí
duo de aminoácido 1 da sequência. A prolina é o amino
ácido COOH-terminal e é o resíduo 3. A direção definida
da cadeia polipeptídica é de Glu para Pro (aminoácido
NH2-terminal para aminoácido COOH-terminal).
3.3 PROPRIEDADES DE
CARGAS E QUÍMICAS
DE AMINOÁCIDOS E
PROTEÍNAS
Grupos Ionizáveis de Aminoácidos e
Proteínas São Críticos para a Função
Biológica
Os grupos ionizáveis comuns a proteínas e aminoáci
dos são mostrados na Tabela 3.3. As formas ácidas estão
à esquerda do sinal de equilíbrio, e as formas básicas do
H lado direito. Ao formar sua base conjugada, a forma áci
da libera um próton. Ao contrário, a forma básica asso
cia-se com um próton para formar o respectivo ácido. A
dissociação de um ácido é caracterizada por uma cons
tante
= log (1/K!a
de dissociação ácida (K!a) e seu valor de pK!a:pK!a
). A Tabela 3.3 mostra a faixa de valores de
pK!a para cada grupo ácido, porque o pK!a real depende
do meio no qual o grupo ácido está colocado. Por exem
plo, quando um grupo amônio carregado positivamente
(—NH3+) é colocado perto de um grupo carregado nega
tivamente em uma proteína, a carga negativa estabiliza
fícil
o pK!a
a dissociação
incluem a polaridade
do seu próton.
do ambiente,
O pK!a doa —NH3
ausência
+ terá
ou
um valor maior do que o normal para um grupo amônio
presença de água e o potencial para formação de pontes
de hidrogênio. Além disso, grupos ácidos (a-COOH ou
a-NH3+) nas extremidades dos polipeptídeos tipicamen
te têm um valor de pK!a mais baixo do que os mesmos
tipos de grupos ácidos nas cadeias laterais (Tabela 3.4).
Os aminoácidos cujos grupos R contêm átomos de nitro
gênio (Lys e Arg) são os aminoácidos básicos, uma vez
que sua cadeias laterais têm valores relativamente altos
de pK!a e funcionam como bases em pH fisiológico. Eles
estão geralmente em sua forma ácida e são carregados
positivamente em pH fisiológico. Aminoácidos cujas ca
deias laterais contém um grupo carboxílico têm valores
de pK!a relativamente baixos, que facilmente perdem
seus prótons e são aminoácidos acídicos. Estão predo
minantemente em sua forma desprotonada e carregada
negativamente em pH fisiológico. Proteínas nas quais a
razão (ΣLys + ΣArg)/(ΣGlu + ΣAsp) é maior do que 1
são proteínas básicas. Proteínas nas quais a razão é me
nor do que 1 são proteínas acídicas.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 87

TABELA 3.2 Peptídeos Biologicamente Ativos

Sequência de aminoácido Nome Função
Hormônio
de tirotropina
liberador Secretado pelo hipotálamo; induz a
1 3
)a glândula pituitária anterior a liberar
piroGlu-His-Pro(NH2
hormônio tireotrópico
1 9 antidiurético)
(hormônio
Vasopressina Secretado pela glândula pituitária
H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly(NH2)b,a posterior; faz o rim reter água da
| | urina
S—S
Metionina encefalina Peptídeo tipo-opiato encontrado no
1 5
cérebro e que inibe a sensação de
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH
dor
1 10 Gastrina pequena Hormônio secretado por células
piroGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu (humana) da mucosa do estômago; induz as
11 17 células parietais do estômago a
Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe(NH2)c,d secretarem ácido
|
SO3
1 10 Glucagon (bovino) Hormônio pancreático envolvido na
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr regulação do metabolismo da glicose
11 20
Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln
21 29
Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
Angiotensina II Peptídeo pressor ou hipertensivo;
1 8
(cavalo) também estimula liberação de
H-Asp-Arg-Val-Tyr-IleHis-Pro-Phe-OH
aldosterona do córtex adrenal
1 9 Bradicinina Peptídeo vasodilatador
H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH plasmática (bovina)
1 10 Substância P Neurotransmissor
)a
H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met(NH2
aO NH2-terminal do Glu está na forma piro na qual seu g-COOH é covalentemente ligado ao seu a-NH2 por ligação amida; o aminoácido COOH-terminal

está amidado e, assim, também não está livre.

bCisteína-1 e cisteína-6 estão ligadas formando uma ponte de dissulfeto interna no nonapeptídeo.
cA Tyr 12 é sulfatada na sua cadeia lateral fenólica OH.
dO aminoácido COOH-terminal é amidado.

A Forma Iônica de um Aminoácido ou uma Consequentemente, a enzima terá 50% de sua ativi
Proteína Pode Ser Determinada em Dado dade potencial. Em pH 7,0, a razão [imidazol]/[imida
zólio] é 10:1 (Tabela 3.5), e a enzima apresenta 10/(10
pH
+ 1) × 100 = 91% de sua atividade potencial máxima.
Do valor do pK!a de cada grupo ácido em um ami Portanto, uma mudança no pH tem um efeito drástico
sobre a atividade da enzima.
noácido ou proteína e pela equação de Henderson–
Hasselbalch (Figura 3.13), a forma iônica da molécula
pode ser calculada em um dado pH. Essa é uma equa
ção importante porque mostra a mudança no estado
pH = pKa + log [base conjugada]
de ionização e na carga da molécula com o pH. As ati
[ácido conjugado]
vidades fisiológicas de uma molécula diferem com mu
or
danças no pH e no estado de ionização. Por exemplo,
algumas enzimas requerem o imidazol de uma histidi [base conjugada]
pH – pKa = log [ácido conjugado]
na em sua forma básica para atividade catalítica. Se o
pK!a dessa histidina é 6,0, em pH 6,0 metade das mo
léculas da enzima estarão na forma básica ativa (imi FIGURA3.13 Equação de Handerson–Hasselbalch.
dazol) e metade na forma ácida inativa (imidazólio). (Para uma discussão mais detalhada dessa equação, ver p. 8).
88 º PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

TABELA 3.3 Valores de pKa característicos para os Grupos Ácidos Comuns em Proteínas
Faixa Aproximada
Onde o Grupo Ácido É Encontrado Forma Ácida Forma Básica de pKa
Para o Grupo

NH2-terminal ou cadeia lateral de R—NH3 R—NH2 + H" 7,6—10,6

lisina Amônia > Amina , U-1U,

COOH-terminal Ou Cadeias laterais R—COOH R—COO + H" 3,0–5,5

de glutamato e aspartato ácido CarboxílicO CarboxilatO > > >>

R-NH-C NH R—NH—C=NH + H"

Cadeia lateral de arginina : = | 11,5—12,5

NH2 NH2
GuanidíneO Guanidino

• • I Aº R—SH R—ST + H"

Cadeia lateral de Cisteína Ti = -- • 80-90
iOl TiOlatO

R— C CH R— C CH

Cadeia lateral de histidina "…" —+

= Esses -- H
+

H H 60-70
Imidazólio Imidazol

• • • R R O + HT
Cadeia lateral de tirosina = 9,5—10,5

Fenol FenolatO

TABELA 3.4 pKa da Cadeia Lateral e Grupos Ácidos COOH COO- COO
Terminais em Ribonuclease …-- # H NH3 *-* --OHT …-- H

--

—NH3 —COOH * #… #…
Cadeia lateral Lisina = 10,2 Glu e Asp = 4,6 cº-º-º cº-º-º cº-º-º
CH3 CH3 CH3

Final da cadeia N-terminal = 7,8 C-terminal = 3,8 | || ||

Carga --1 O —1
pH < 2,4 2,4 <pH < 9,6 9,6 < pH

FIGURA 3.14 Formas iônicas da leucina.

TABELA 3.5 Relação entre a Diferença de pH e pK, Ácido
e a Razão das Concentrações da Base para Seu Ácido
Conjugado
Titulação de um Ácido Monoamino
pH — pKa Razão de Concentrações Monocarboxílico: Determinação do pH
(Diferença entre pH e da Base para o Acido Isoelétrico
pKa) Conjugado
O 1 O entendimentO de uma proteína em Suas formas
ácida e básica e sua relação com carga é facilitado
1 10 quando se acompanha a titulação dos grupos ionizá
veis de um aminoácido simples. Na Figura 3.14, a leu
2 |100
cina tem um O-COOH com pK% = 2,4 e um O-NH3 com
3 1000 pK, = 9,6. Em pH 1,0, a forma iônica predominante
(forma I) tem uma carga de +1 e migra em direção
—1 0,1 ao cátodo num campo elétrico. Adição de 0,5 equiva
—2 0,01 lente de base titula metade dos grupos 0-COOH, isto
é, a razão [COO7]/[COOH] fica igual a 1. A equação de
—3 0,001 Henderson-Hasselbalch, com o segundo termo no lado
direito da equação logio [(base)/(ácido)] = log (1) = 0
numa razão entre a base e o ácido conjugado de 1:1,
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 89

mostra que o pH (quando o a-COOH está metade titula
do) é diretamente igual ao pKa(a-COOH) (Figura 3.15).
Adição de 1 equivalente de base em pH 6,0 titula
completamente o a-COOH, mas não tem nenhum efeito
sobre o grupo a-NH+.3 Na forma resultante (II), as car
gas negativa e positiva se anulam mutuamente e a carga
final é zero. A forma II é a forma zwitterion, a forma iô
nica na qual o total das cargas positivas é igual ao total
de cargas negativas. Como a carga final de uma molécu
la zwitteriônica é zero, ela não migrará em um campo
elétrico. Adição posterior de 0,5 equiv de base à forma
zwitteriônica (total de base adicionada é 1,5 equiv) ti
tularão
grupo
zão [NHaa-NH
metade(Figura
3+ 3+]
2]/[NH =dos
1, egrupos
o
3.15). igual+.3ao
pH éa-NH
Adição mais
Nesse
devalor 0,5pK!
ponto,
do
equiv
de base (total de dois equiv de base adicionados; Figura
3.15) titula completamente o grupo a-NH+3 para sua for
ma básica (a-NH2). O pH fica superior a 11, e a espécie
molecular predominante tem uma carga negativa de -1
(forma III).
É útil calcular o pH no qual um aminoácido está
em sua forma zwitteriônica. Esse pH é o pH isoelétrico
da molécula, representado por pI. O valor de pI é uma
constante para um composto em uma força iônica e
temperatura definidas. Para moléculas de aminoácidos
simples, como a leucina, o pI é calculado como a média
dos dois valores de pK!a que regulam os limites da forma
zwitteriônica. Para leucina:
pKaCOOH2+ pKaNH+3 = 2,4+
2 9,6
pI =
Em pH > 6,0, a leucina tem uma carga parcial nega
tiva que aumenta em pHs mais elevados, até uma car
ga negativa total de –1 (forma III) (Figura 3.14). Em
pH < 6, tem uma carga parcial positiva até que, em um
pH muito baixo, fique com carga +1 (forma I) (Figura
3.14). A carga parcial em qualquer pH pode ser calcu
lada a partir da equação de Henderson–Hasselbalch ou
pela extrapolação da curva de titulação da Figura 3.15.
2.0
Titulação de um Ácido Monoamino
Dicarboxílico
Um exemplo mais complicado é o ácido glutâmico.
Com mostram as Figuras 3.16 e 3.17, no ácido glutâmico
dopK!
o a-NH
a do 3a-COOH
+ é é 2,2, o pK!a do g-COOH é 4,3, e o pK!a
9,7. A forma zwitteriônica é gerada após
adição de 1,0 equiv de base à forma de pH baixo, e o
pH isoelétrico (pI) é calculado a partir da média dos
dois valores de pK!a que controlam os limites da forma
zwitteriônica:
= 2,4 + 4,3
pI = 3,25
aa ra
2
do
Consequentemente, em valores de pH acima de 3,25,
a molécula assume uma carga final negativa, até que,
em pH elevado, adquira carga final –2. Em pH < 3,25,
ácido glutâmico é carregado positivamente, e em pH ex
tremamente baixo, tem carga final positiva de +1.
Relação Geral entre as Propriedades
de Carga de Aminoácidos e
Proteínas e pH
A relação entre pH e carga para leucina e glutamato
é verdadeira para os outros aminoácidos. Em pH abai
xo do pI, a molécula é carregada positivamente. Em
pH acima do pI, é carregada negativamente. O grau de
carga positiva ou negativa é uma função da magnitude
da diferença entre pH e pI. Como proteínas são polie
= 6,0
letrólitos complexos que contêm muitos grupos ionizá
veis que regulam a forma zwitteriônica, cálculo do pH
isoelétrico de uma proteína a partir de seus múltiplos
valores de pK!a ácidos utilizando a relação Henderson–
Hasselbalch é difícil. Assim, valores de pI de proteínas
são medidos experimentalmente por determinação do
valor de pH no qual a proteína não migra em um campo
elétrico. Valores de pI de algumas proteínas são dados
na Tabela 3.6.
Como para aminoácidos, em um pH acima do seu
pI, uma proteína tem uma carga líquida (net charge)
negativa. Em um pH abaixo do seu pI, tem carga líqui
da positiva (Figura 3.18). A magnitude da carga líquida

HNaesdOtlEquivn 1.5
0.50
1.0 2.0pKCOOH
4.0 6.0
pl=6.00
8.0 10.0
pKNH3
12.0+ 14.0
COOH +OH– + C
COO–
H + COO– COO–
+H+ 0
NH3 CH2 +OH–
+H+ NH3CCH2 H +OH–
+H+ –2
NH3 C H 2,2 pH^ 4,3 pH^ NH2 C H

+ CH2 CH2

CH2 CH2 CH2

COOH COOH COO– COO–

Carga +1
pH ^2,2 ^4,3 –1 ^9,7 9,7 ^pH
pH

FIGURA3.15 Curva de titulação da leucina. FIGURA3.16 Formas iônicas do ácido glutâmico.

90 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

3.0
Aminoácidos e Proteínas Podem Ser
2.5 Separados com Base em Valores de pI
H As técnicas de eletroforese, focalização isoelétrica e
O2.0
a
N cromatografia de troca iônica separam e caracterizam
e
d1.5
s
e
moléculas biológicas com base em seus pIs (p. 89). Na
t pKα-COOH
n clínica médica, a separação eletroforética de proteínas
e
l 1.0
a
v
i
u
pI = 3.25 plasmáticas levou à sua classificação com base em sua
q
E0.5 mobilidade eletroforética relativa. A separação de pro
pKγ-COOH pKNH+3 teínas plasmáticas é comumente feita em pH 8,6, que
é mais alto do que os valores de pI das principais pro
0 2 4 6 8 10 12 14
pH teínas. Consequentemente, as proteínas estão carre
gadas negativamente e migram em direção ao ânodo
FIGURA3.17 Curva de titulação do ácido glutâmico. em uma velocidade dependente de sua carga líquida. A
A linha observada (vermelha) esconde as titulações do pK!g e Figura 3.20 mostra uma eletroforese de proteínas plas
pKa, que são muito próximos para serem observados indivi máticas em um gel de agarose em pH 8,6, que separa
dualmente. As titulações desses grupos são mostradas na linha as proteínas em cinco bandas clássicas, usadas para
azul sobreposta. classificar as proteínas plasmáticas. Por ordem de mi
b-
gração, as principais
e g-globulinas (Figura
frações Algumas
3.20).são albumina,
dessas
a1-,
bandas
a2- e
aumenta à medida que a diferença entre o pH e o pIau
menta. Um exemplo é a albumina plasmática humana, representam, na verdade, dezenas a centenas de pro
com 585 resíduos de aminoácidos incluindo 61 gluta teínas diferentes, com migrações semelhantes em pH
matos, 36 aspartatos, 57 lisinas, 24 argininas e 16 his 8,6. Entretanto, certas proteínas predominam em cada
tidinas. A curva de titulação é apresentada na Figura banda, e variações em suas quantidades relativas são
3.19. O pI da albumina é 5,9, pH no qual a carga líquida características de certas doenças (Figuras 3.20 e 3.21,
é zero. Em pH 7,5, os grupos imidazólio das histidinas e Correlação Clínica 3.1).
estão parcialmente titulados, e há uma carga negativa
de -10. Em pH 8,6 a carga líquida é aproximadamente
-20, e em pH 11, é aproximadamente -60. Em pH 3, a 0
carga líquida aproximada é +60.
+80

pH > pl, então proteína com carga negativa

pH < pl, então proteína com carga positiva o
r 40 +60
o
s
e
FIGURA3.18 Relação entre o pH da solução, o pI da d
o
a r
proteína e a carga da proteína. n
i o
m +40 s
u e
b
l d
a a
e n
i
d 80 m
TABELA 3.6 Valores de pI para Algumas Proteínas e
l +20 u
o b
l
m a
Proteína pI r e
o d
p a
l
o120
200
160 Zwitterion 0 u
Pepsina ~1 d c
a
ic é
l
o
o
s m
Soroalbumina humana 5,9 s
i r
H
d o
–20 p
+ a
g
r
a1-Lipoproteína 5,5 e
d a
s C
e
l
Fibrinogênio 5,8 o –40
M
Hemoglobina A 7,1
–60
Ribonuclease 7,8
Citocromo c 10,0
–80
Timo-histona 10,6
2 4 6 8 10 12
pH

FIGURA3.19 Curva de titulação de soroalbumina bovina

a 25 °C e a força iônica de 0,150.
Redesenhado de Tanford, C. J.Am. Chem. Soc. 72:441, 1950
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 91

Cadeias Laterais de Aminoácidos dobradas, a maioria dos aminoácidos hidrofóbicos fica

escondida, longe da água solvente que interage com a
Têm Propriedades Polares e superfície de uma proteína solúvel. Entretanto, a cor
relação geral não é perfeita em virtude da natureza
Apolares anfotérica de muitos aminoácidos hidrofóbicos que
colocam as porções mais polares da estrutura de sua
A hidrofobicidade das cadeias laterais dos amino cadeia lateral próxima da superfície para interagir
ácidos é crítica para o dobramento (folding) de uma com água. Além disso, algumas cadeias laterais não
proteína em sua estrutura nativa e para a estabilidade polares podem estar na superfície. Entretanto, quando
da proteína dobrada. A Figura 3.22 mostra um gráfi na superfície, os grupos hidrofóbicos ficam geralmen
co da hidrofobicidade relativa dos aminoácidos com te dispersos entre as cadeias laterais polares. Quando
base em sua tendência de partição em uma mistura de um grupo de cadeias laterais não polares ocorre na su
água e um solvente não polar. A escala é baseada em
perfície, geralmente está associado com uma função,
um valor de zero para glicina. Cadeias laterais que se
como fornecer um sítio para ligação de moléculas de
dissolvem preferencialmente no solvente não polar em substrato por meio de interações hidrofóbicas.
relação à glicina mostram um valor de hidrofobicidade
positivo (+), quanto mais positivo maior a preferência A maioria das cadeias laterais carregadas fica na
pelo solvente não polar. Em estruturas de proteínas superfície de proteínas globulares solúveis, onde são
estabilizadas por interações energéticas favoráveis com
água. O raro posicionamento de uma cadeia
AIb α1 α2 β12
β γ lateral carregada no interior geralmente im
plica num papel funcional importante para
+Ânodo −Cátodo essa carga “mergulhada” no interior não po
lar, na estabilização da conformação da pro
teína ou participação em catálise.
Gc AT3 PI CRP As proteínas transmembrânicas inver
Hpt
α-Lp C1q
tem o posicionamento da polaridade de suas
α1Ac cadeias laterais em relação à das proteí
nas globulares solúveis em água. Dentro da
αα1At α2M Tf C3 Fibr
C4 membrana, essas proteínas frequentemen
la TI
C5 te posicionam cadeias laterais hidrofóbicas
Pre A 1Ag
IgM
C1Inh Hpx
no lado de fora e grupos iônicos no lado de
C1s dentro para fornecer interações de ligação e
Cer
IgA IgD(E) para formar canais iônicos (p. 497).

AIb IgG
C1r FB Aminoácidos Sofrem Várias
Reações Químicas
FIGURA3.20Padrão eletroforético em gel de agarose de proteínas
plasmáticas em pH 8,6. Aminoácidos em proteínas reagem com
A migração ao longo do eixo horizontal da direita para a esquerda (cátodo para vários reagentes que podem ser usados para
ânodo), com proteínas de maior mobilidade próximas do ânodo. A intensidade investigar a função de cadeias laterais espe
das bandas ao longo do eixo vertical mostra a concentração das proteínas.
cíficas. Algumas reações químicas comuns
Diferentes proteínas principais são identificadas abaixo de seus picos de mo
são apresentadas na Tabela 3.7. Reagentes
bilidade eletroforética. f designa o pico do fibrinogênio, que está presente no
plasma, mas ausente no soro. Em alguns géis, a banda da g-globina é separada que modificam as cadeias laterais ácidas
em duas bandas g1 e g2 (não mostrado aqui). foram sintetizados para se ligarem a sítios
Os picos de proteínas importantes contidas nas bandas do gel de agarose são específicos na estrutura de uma proteína,
desenhados nesta figura. As áreas dos picos desenhados mostram sua concen como o sítio de ligação ao substrato. A es
a1
tração relativa e posição no gel. Abreviaturas: a1Ac = a1-antiquimotripsina; tratégia é modelar as características estru
Ag = glicoproteína ácida a1; a1At = a1-antitripsina; a2-M = a2-macroglo turais do substrato natural da enzima no re
bulina; a-Lp = a-lipoproteína; Alb = albumina; AT3 = antitrombina III, b-Lp agente que causa a modificação. O reagente
= b-lipoproteína; componentes do complemento C1q, C1r, C1s, C3, C4 e C5
liga-se ao sítio ativo como um substrato na
= como designado; C1Inh = inibidor de C1 esterase; Cer = ceruloplasmina;
tural e reage com uma cadeia lateral especí
CRP = proteína C-reativa; Gc = globulina Gc (proteína de ligação a vitamina
D); FB = fator B; Fibr = fibrinogênio; Hpt = haptoglobina; Hpx = hemopexina; fica. Isso identifica o aminoácido modificado
imunoglobulinas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM = como designado; IaTI = inibidor de como estando localizado no sítio de ligação
inter-a-tripsina; Pl= plasminogênio; PreA = pré-albumina; e Tf = transferrina. do substrato e ajuda a identificar seu papel
Redesenhado a partir de McPherson, R. A. Em: McPherson, R. A. e Pincus, na catálise.
M. R. (Eds.), Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods. 21. ed., Capítulo 19. Philadelphia: Saunders-Elsevier, 2007.
92 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

CORRELAÇÃO CLÍNICA 3.1 UM OLHAR MAIS ATENTO 3.1

Proteínas Plasmáticas no Diagnóstico de Doenças Clívagem Proteolítica da Proinsulina

A análise eletroforética das proteínas plasmáti
cas é comumente utilizada no diagnóstico de doen
ças. Eletroforese de plasma, tamponada em pH 8,6,
separa as principais proteínas plasmáticas, à medi
da que migram para o ânodo no campo elétrico em
bandas ou picos, com base em suas diferenças de
cargas (ver texto). Exemplos de padrões eletrofo
réticos anormais são apresentados na Figura 3.21.
Uma resposta imediata que ocorre ao estresse ou à
inflamação causada por infecção, agressão ou trau
ma cirúrgico é apresentada no padrão (b), no qual
haptoglobinas da banda de mobilidade a2 estão se
letivamente aumentadas. Uma resposta tardia apre
sentada no padrão (c) está associada com infecção
e mostra um aumento no pico de g-globulina devido
a um aumento de imunoglobulinas. Um exemplo de
uma hipo-g-globulinemia em virtude de uma doen
ça imunossupressora é apresentado no padrão (d).
Na cirrose hepática, há um grande aumento nas
g-globulinas com redução de albumina, como no
padrão (e). Gamopatias monoclonais são devidas à
síntese clonal de uma imunoglobulina específica, e
originam uma banda estreita de g-globulina, como
no padrão (f). A síndrome nefrótica mostra uma
perda seletiva de proteínas de baixo peso molecular
do plasma, como no padrão (g). O padrão mostra
uma diminuição na albumina (65 kDa), mas uma
A Proinsulina é produzida em células das ilhotas
pancreáticas como uma cadeia polipeptídica única
contendo 86 aminoácidos e três ligações dissulfeto
cistina intracadeias (Figura 3.23). É transformada
na insulina biologicamente ativa por clivagem proteo
lítica antes de sua secreção das células das ilhotas. A
proinsulina é clivada por proteases presentes nas cé
lulas das ilhotas, entre os resíduos 30 e 31 e 65 e 66.
Isso libera duas moléculas, um fragmento de 35 resí
duos (peptídeo C) e insulina, que consiste de duas
cadeias polipeptídicas (A e B) de 21 aminoácidos e
de 30 aminoácidos, respectivamente, covalentemen
te ligados pelas mesmas pontes dissulfeto presentes
na proinsulina. O peptídeo C é mais processado por
proteases que hidrolisam um dipeptídeo básico das
extremidades N- e C-terminais. O peptídeo C modifi
cado é secretado com a insulina.
Globulinas
a
in
m β γ
u
lb IgGIgA
A

retenção das bandas compostas de proteínas gran Padrão(a)

normal IgM Cirrose hepática
("Gamopatia policlonal")
(2.000 kDa) na
des a2-macroglobulina (725 kDa) e b-lipoproteínas
(e)
banda a2. O padrão (h) é de um pa
ciente com enteropatia com perda proteica, que está
perdendo plasma por exudação no trato intestinal.
O discreto aumento na banda a2 do padrão (h) de
ve-se a uma resposta imediata ou tardia a um es
tímulo de estresse, como observado anteriormente
nos padrões (b) e (c).

Ritzmann, S. E. e Daniels, J. C. Serum protein electrophore (b)

"Padrão de resposta imediata" Paraproteína
sis and total serum proteins. Em: Ritzmann, S. E. e Daniels, J. ("Gamopatia monoclonal")
C. (Eds.), Serum Protein Abnormalities Diagnostic and (f)
Clinical Aspects. Boston: Little, Brown and Co., 1975, 3;
McPherson, R. A. Specific proteins. Em: Henry, J. B. (Ed.),
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods, 17. ed. Philadelphia: Saunders, 1984, 204; Keren,
D. F. Protein Electrophoresis in Clinical Diagnosis, Lon
don: Arnold/Hodder Publishers, 2003.
"Padrão de resposta tardia" Sindrome nefrótica
(c) (g)

FIGURA 3.21 Padrões de mobilidade eletroforética

observados em um indivíduo normal e em pacientes com
concentrações anormais de proteínas séricas, analisadas por
eletroforese
Redesenhado em
de McPherson,
gel de agarose.
R.A.Specific proteins. Em: Henry, J.

B. (Ed.),
phia: Saunders,
Clinical
1984.
Diagnosis and Management, 17. ed. Philadel- (d)
Hipogamaglobulinemia Enteropatia com perda proteica
(h)
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 93

4
3.4 ESTRUTURA PRIMÁRIA DE
l
o 2
m
PROTEÍNAS
/l
a
c
k
, 0
A estrutura primária de uma proteína refere-se à
a
u
g
estrutura covalente, que inclui a sequência de amino
á
a
r –2
ácidos e a logalização de pontes dissulfeto (cistina). A
a
p estrutura primária de uma proteína é necessária para
a
ic
n entender a sua estrutura e mecanismo de ação, sua
r –4
ê
biossíntese incluindo as modificações pós-tradução de
e
fs
n sua estrutura, e sua relação com outras proteínas com
a
rt –6
e
d
papéis fisiológicos semelhantes. A estrutura primária
e
r de vários peptídeos biologicamente ativos foi apresen
v
il –8
a
i tada na Tabela 3.2 (p. 87). A insulina ilustra como o
g
r
e
n
conhecimento da estrutura primária leva ao entendi
E –10 mento da biossíntese e das formas fisiológicas desse
hormônio bioativo (Figura 3.23;Um Olhar Mais Aten
–12 to 3.1 e Correlação Clínica 21.8). A insulina é inicial
R E D K P C S Q N G T A H M V L Y I F W mente sintetizada como proinsulina, que é uma cadeia
Aminoácidos
polipeptídica única de 86 aminoácidos e três ligações
FIGURA 3.22 Hidrofobicidade relativa das cadeias laterais cistina intracadeias (Figura 3.23). A forma hormonal
dos aminoácidos. consiste de duas cadeias polipeptídicas (A e B) cova
Com base na partição dos aminoácidos entre um solvente or lentemente interconectadas por duas ligações cistina e
gânico e água. Valores negativos indicam preferência por água, a cadeia A contendo uma cistina intracadeia. Essa é a
e valores positivos, preferência por solvente não polar (etanol estrutura primária ou covalente da insulina ativa.
ou dioxana), em relação à glicina (ver texto).
Baseado em dados de Von Heyne, G., and Blomberg, C. Eur. J. Além de fornecer informação sobre sua biossíntese,
Biochem. 97:175, 1979; e de Nozaki, Y., e Tanford, C. J. Biol. a comparação das estruturas primárias de insulinas de
Chem. 246:2211, 1971. diferentes espécies animais mostra os resíduos essen

TABELA 3.7 Reações Químicas de Aminoácidos

Grupo Reativo Reagente ou Reação Produto
Grupos amina (—NH2) Ninhidrina Produto de cor azul que absorve em 540 nma

Fluorescamina Produto que fluoresce

Grupos ácidos Alcoóis Produtos éster
carboxílicos Aminas Produtos amida
Carbodiimida Ativa para reação com nucleófilos
—NH2 da Lys 2,3,6-Trinitrobenzeno sulfonato Produto que absorve em 367 nm
Anidridos Acetila aminas
Aldeídos Forma adutos base de Schiff
Grupo guanidino Reação de Sakaguchi Produto vermelho rosado que pode ser usado para
da Arg ensaiar a Arg
Fenol da Tyr I2 Iodinação de posições orto do grupo hidroxila no anel
Anidrido acético aromático
Acetilação de —OH
Átomo S da cadeia CH3I Produto metil sulfônio
lateral da Met [O–] ou H2O2 Metionina sulfóxido ou metionina sulfona
—SH da Cys Iodoacetato Produto carboximetiltiol éter
N-Etilmaleimide Adição de produto com S
Mercuriais orgânicos Adutos mercuriais
Ácido perfórmico Produto ácido cisteico (—SO3H)
Ácido ditionitrobenzóico Produto amarelo que pode ser usado para quantificar
grupos —SH
Imidazol da His e Reagente de Pauly Produto amarelo avermelhado
fenol da Tyr
aO grupo imino da prolina reage com ninhidrina formando produto que absorve luz em 440 nm (cor amarela).
94 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

ciais e não essenciais para sua função hormonal. As es

truturas primárias alinhadas têm resíduos idênticos na
maioria das posições dos aminoácidos, exceto para os
resíduos 8, 9 e 10 da cadeia A e o resíduo 30 da cadeia
B. Os aminoácidos dessas posições variam muito (Ta
bela 3.8) e aparentemente não afetam as propriedades
biológicas (Correlação Clínica 3.2). Outros resíduos são
raramente substituídos, sugerindo que tenham um pa
pel essencial na função.
Comparações de sequências são comumente usa
das para prever a similaridade de estrutura e função
entre proteínas. Essas comparações tipicamente re
querem alinhamento de sequências para maximizar o
número de resíduos idênticos e minimizar o número de
inserções ou deleções necessárias para conseguir esse
alinhamento. Duas sequências são homólogas quando
suas sequências são muito alinhadas. Note que, nesse
uso correto, homologia refere-se apenas a proteínas que
evoluíram a partir do mesmo gene. A analogia descreve
sequências de proteínas que são estruturalmente seme
lhantes, mas para as quais não se demonstrou nenhu
ma relação evolutiva. A substituição de um aminoácido
por outro de polaridade semelhante (ou seja, Val por
Ile na posição 10 da insulina) é uma substituição con
servativa e é comumente observada em sequências da
mesma proteína de espécies animais diferentes. Se um
aminoácido em particular é regularmente encontrado
na mesma posição, é um resíduo invariante. Pode-se
considerar que tais resíduos têm um papel essencial na
estrutura ou na função da proteína. Uma substituição
não conservativa envolve substituição de um aminoáci
do por outro de polaridade diferente. Isso pode mudar
drasticamente as propriedades da proteína ou ocorrer
em regiões que são aparentemente sem importância
funcional (Correlação Clínica 6.2; p. 220). A polaridade
é só uma das propriedades físicas dos aminoácidos que
determinam se uma substituição alterará significativa
mente a função da proteína. Outras propriedades im
portantes são o volume molecular e a área de superfície
do resíduo.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 3.2
Diferenças em Insulinas Usadas no Tratamento
de Diabetes Mellitus
Antes do desenvolvimento da insulin recombinante
humana, insulinas de porco (porcina) e de boi (bovi
na) eram usadas no tratamento da diabetes humana.
A insulina de fontes animais é ainda usada no tra
tamento de diabetes em países em desenvolvimento.
Em virtude das diferenças na sequência da insulina
humana, alguns indivíduos diabéticos terão uma res
posta alérgica inicial à insulina injetada, uma vez que
seu sistema imunológico reconhece a insulina como
estranha, ou desenvolvem resistência à insulina por
causa de um alto título de anticorpos anti-insulina,
em um estágio mais tardio do tratamento. Entretan
to, a frequência de uma resposta imunológica dele
téria às insulinas porcina e bovina é pequena, com a
grande maioria da população podendo utilizar essas
insulinas sem complicações. Isso se deve ao peque
no número e à natureza conservativa das mudanças
entre as sequências de aminoácidos e ao fato de elas
não modificarem significativamente a estrutura tri
dimensional da insulina em relação à da insulina hu
mana. A insulina de porco é geralmente mais aceita
do que a bovina em indivíduos reativos à insulina
porque é mais parecida, em sequência, com a insu
lina humana (ver Tabela 3.8). A insulina humana é
hoje a principal insulina usada em países desenvol
vidos, sendo feita por bactérias geneticamente enge
nheiradas ou por modificações da insulina de porco.
Brogdon, R. N., e Heel, R. C. Human insulin: a review
of its biological activity, pharmacokinetics, and thera
peutic use. Drugs 34: 350, 1987; Richter, B. e Neises, G.
Human insulin versus animal insulin in people with dia
betes mellitus. Cochrane Database Systematic Review
3:CD003816, 2002.

TABELA 3.8 Variação nas Posições A8, A9, A10 e B30 da

Insulina 3.5 NÍVEIS SUPERIORES
Espécies A8 A9 A10 B30 DE ORGANIZAÇÃO DE
Humana Thr Ser Ile Thr
PROTEÍNAS
Boi Ala Ser Val Ala
Níveis superiores de organização de proteínas refe
Porco Thr Ser Ile Ala
rem-se a conformações, geradas não covalentemente, da
Carneiro Ala Gly Val Ala cadeia polipeptídica. Esses níveis superiores de organi
Cavalo Thr Gly Ile Ala zação da proteína são chamados estruturas secundária,
terciária e quaternária. Estrutura secundária refere
Cachorro Thr Ser Ile Ala
-se ao dobramento local do esqueleto polipeptídico em
Galinhaa His Asn Thr Ala conformações em hélice, folha pregueada ou ao acaso.
Patoa Glu Asn Pro Thr O esqueleto polipeptídico é formado pelos átomos in
aNas posições 1 e 2 da cadeia B são Ala em galinha e pato, enquanto terconectados covalentemente das ligações peptídicas
em outras espécies da tabela, a posição 1 é Phe e a posição 2 é Val na e carbonos-α que ligam os resíduos de aminoácidos da
cadeia B. proteína. Cadeias laterais não são consideradas em nível
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 95

Peptídeo de estrutura secundária. Estrutura terciária

refere-se à estrutura tridimensional do poli
LEUPROGLNLEUSERGLYALA50GLYPROGLYGLYGLYLEU
peptídeo. Inclui as relações conformacionais
ALA GLU no espaço das cadeias laterais e a relação
VALGLN
LEU geométrica entre regiões distantes da cadeia
GLU GLY polipeptídica. Estrutura quaternária refere
40
GLY 60 VAL -se à associação não covalente de subunida
GLN des polipeptídicas discretas numa proteína
SER
LEU
LEUGLN
com múltiplas subunidades. Nem todas as
ASP
proteínas têm estrutura quaternária.
GLUALA

LYSARGGLY As proteínas geralmente assumem con

GLU formações secundária, terciária e quaterná
Cadeia A ARG ria singulares para produzir a conformação
ILE SS 30 ARG nativa da proteína. O dobramento da estru
THR
tura primária na conformação nativa ocorre
VAL
ASNCOO–
GLUGLNCYSCYSTHRSERILECYSSERLEUTYRGLNLEUASNTYRCYS
80 LYS
espontaneamente, na maioria dos casos, por
GLU70S interações não covalentes. Essa conforma
PRO
ção é uma das de mais baixa energia livre
S S THR
de Gibbs total cineticamente acessível ao(s)
S TYR
Cadeia B
PHE
polipeptídeo(s) para as condições específi
cas de força iônica, pH e temperatura em que
LEUCYSGLYSERHISGLUALALEUTYRLEUVALCYSHIS
LEUVAL10 PHEGLUARGGLY
GLY ocorre o dobramento. Na célula, proteínas
GLN 20 chaperones (p. 237) podem facilitar o dobra
Proinsulina mento de proteínas.
ASN

VAL
Hidrólise
1 PHE
catalisada por protease Estrutura Secundária
+
NH3
+
NH3 A conformação de um esqueleto polipep
SS tídico pode ser descrita pelos ângulos de ro
GLY 1 CadeiaA tação das ligações covalentes que participam
COO–
ILE
da cadeia. Essas são fornecidas por cada um
VAL
30 THR dos aminoácidos e se formam entre o nitro
10 ASN COO– gênio e o carbono-a e o carbono-a e o carbo
20GLUGLNCYSCYSTHRSERILECYSSERLEUTYRGLNLEUGLUASNTYRCYS LYS
no da carbonila. A primeira é designada por
PRO
70S
ligação phi (j) e a segunda por ligação psi
S THR
(y) (Figura 3.24). A terceira ligação com que
S Cadeia B S TYR
cada aminoácido contribui é a ligação peptí
PHE
LEUCYS GLY SER HIS LEU VAL GLU ALALEU TYR LEU VAL CYS
HIS PHE
dica. Como discutido anteriormente, em vir
10 GLYGLUARGGLY tude do caráter parcial de dupla ligação da
20 ligação C!—N, existe uma barreira para a ro
GLN
tação livre em torno dessa ligação peptídica.
ASN

VAL Insulina Estrutura secundária regular ocorre em

1 PHE segmentos de uma cadeia polipeptídica nos
+ quais todos os ângulos de ligações jsão iguais,
NH3
+ Peptídeo
e todos os ângulos de ligações y são iguais. Os
FIGURA3.23 Estruturas primárias da proinsulina, da insulina e do ângulos de rotação para ligações j e y para
peptídeo Chumanos. estruturas secundárias regulares comuns
Na sequência polipeptídica da proinsulina, o peptídeo da cadeia-B incipiente são dados na Tabela 3.9.
estende-se da Phe da posição 1 até a Thr da posição 30, o peptídeo C da Arg da
posição 31 até a Arg da posição 65, e o peptídeo-A da Gly da posição 66 até a
As conformações em a-hélice e b-fita de
Asn da posição 86. Ligações cistina nas posições 7 para 72, 19 para 85 e 71 para polipeptídeos são as mais estáveis termodi
76 são encontradas na proinsulina. namicamente das estruturas secundárias
Redesenhado de Bell, G.I., Swain, W. F., Pictet, R., Cordell, B., Goodman, H. M., regulares. Porém, uma sequência em par
e Rutter, W. J. Nature 282: 525, 1979. ticular pode ter uma estrutura secundária
desordenada ou ao acaso, na qual nem os
ângulos das ligações j nem das ligações y
são iguais. A prolina interrompe a conforma
96 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

ção em a-hélice porque sua cadeia lateral pirrolidina

interage estericamente com o resíduo que a precede e
impede a formação de uma estrutura em a-hélice.

Carbono-α

Ligação peptídica
H
p
N

C′ Ligação ψ

O
n=4

Ligação φ Carbono-α FIGURA3.25 Passo da hélice (p) para uma hélice com n = 4.
Cada círculo sobre uma linha representa um carbono-a de um
Cadeia
resíduo de aminoácido. O avanço por resíduo seria p/n (ver
H
lateral equação no texto). Reproduzido com permissão de Dickerson,
R R. E. e Geis, I. The Structural and Action of Proteins. Menlo
N
H
Park, CA: Benjamin, 1969, p.26.

O
C′
N
R ção em a-hélice girando para a direita é mostrada na
O
Plano peptídico
Carbono-α
α-C
C′
FIGURA3.24 Cadeia polipeptídica mostrando ligações
j, y e peptídicas para o resíduo Ri numa cadeia
polipeptídica.
Redesenhada com permissão de Dickerson, R.E. e Geis, I. The
Structural and Action of Proteins. Menlo Park, CA: Benja
min, 1969, 25.
Estruturas helicoidais são caracterizadas pelo nú
mero n de resíduos por volta da hélice e pela distância d
entre os átomos de carbono-a de aminoácidos adjacen
tes, medida paralelamente ao eixo da hélice. O passo da
hélice p, o produto de n × d, então, mede a distância en
tre voltas repetitivas da hélice em uma linha desenhada
paralelamente ao eixo da hélice (Figura 3.25).
Estrutura em a-Hélice
Uma sequência de aminoácidos em uma conforma
Figura 3.26. Característicos são 3,6 resíduos de amino
ácidos por volta de 360° (n = 3,6). Os planos das liga
ções peptídicas são paralelos ao eixo da hélice. Nessa
geometria, cada peptídeo forma duas pontes de hidro
gênio, uma com a ligação peptídica do quarto aminoá
cido acima e a outra com a ligação peptídica do quarto
aminoácido abaixo. Outros parâmetros, como o passo
p, são dados na Tabela 3.9. Nas pontes de hidrogênio
entre os grupos peptídicos, a distância entre o átomo
doador de hidrogênio e o aceptor de hidrogênio é 2,9 Å.
Além disso, o doador, o aceptor e os átomos de hidro
gênio estão aproximadamente em uma linha reta. Esta
é uma geometria e distância ótimas para força máxima
das pontes de hidrogênio (Seção 3.7).
As cadeias laterais ficam no lado externo da estru
tura em espiral. Em virtude dos característicos 3,6 resí
duos por volta, o primeiro e todos os terceiros e quartos

TABELA 3.9 Parâmetros da Hélice em Estruturas Secundárias Regulares

Ângulo aproximado Passo da hélicea
das ligações (!) Resíduos por volta,
Estrutura
a-hélice girando para direita [3,613-hélice] –57
f –47
y 3,6
n p5,4
(Å)

310-hélice +49 –26 3,0 6,0

Fita-b paralela –119 +113 2,0 6,4
Fita-b antiparalela –139 +135 2,0 6,8
Poliprolina tipo IIb –78 +149 3,0 9,4
aDistância entre voltas repetitivas em uma linha desenhada paralela ao eixo da hélice.
bTipo de hélice encontrada em cadeias polipeptídicas de colágeno.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 97

mam tiverem carga de mesmo sinal ou forem ramifica

das em seu carbono-b (valina e isoleucina), suas intera
ções iônicas desfavoráveis ou estéricas desestabilizam
a estrutura da hélice. A a-hélice pode, teoricamente,
girar para a esquerda ou direita, dando a ela proprie
dades assimétricas e atividade óptica correspondente.
Uma a-hélice girando para a direita é mais estável do
que uma que gire para a esquerda.

Estrutura-b
Uma cadeia polipeptídica em estrutura-b (Figu
ra 3.27) estabelece pontes de hidrogênio com outra re
gião polipeptídica semelhante alinhada em direção pa
ralela ou antiparalela (Figura 3.28). Fitas b ligadas por
pontes de hidrogênio parecem-se como uma folha pre
gueada (Figura 3.29). As cadeias laterais projetam-se
para cima e para baixo da estrutura em folha pregueada.

Motivos Estruturais e Dobras das

Proteínas
Arranjos simples de estrutura secundária que ocor
rem em mais de uma proteína são chamados motivos
estruturais. Incluem o motivo hélice-volta-hélice en
contrado em muitas proteínas que se ligam ao DNA, o
motivo fita-volta-fita encontrado em proteínas com es
trutura b antiparalela, e o motivo alternado fita-volta
-hélice-volta-fita encontrado em muitas proteínas-a/b.
Nesses motivos, uma volta (turn) é um segmento pe
queno do polipeptídeo (aproximadamente três ou
quatro resíduos) de estrutura secundária não regular
que conecta regiões de estrutura secundária regular,
enquanto uma alça (loop) é um segmento maior de
ligação¸com conformação não regular. Combinações de
Carbino
Cadeia
Carbono-α
Nitrogênio
Hidrogênio
carbonila
Oxigênio
lateral
motivos ou organizações mais complexas de estrutura
secundária podem formar uma dobra (fold). Uma do
bra é o arranjo de estruturas secundárias de um domí
nio. Um domínio estrutural é uma estrutural globular
compacta formada dentro do polipeptídeo com um nú
cleo hidrofóbico e superfície hidrofílica, e geralmente
se drobra independentemente de outras unidades es
truturais da cadeia polipeptídica.
Ponte de hidrogênio
O domínio calmodulina pode servir como um exem
FIGURA 3.26 Uma a-hélice. plo para definir os termos modelo estrutural, dobra e
Redesenhada com permissão, baseado na figura de Pauling, L. domínio (Figura 3.30). A calmodulina liga-se a proteí
The Nature of Chemical Bond, 3. ed. Ithanca, NY: Cornell nas alvos onde atua como sensor dos níveis de cálcio na
University Press, 1960. célula. Em níveis elevados de cálcio celular, o cálcio ati
va a calmodulina para transmitir um sinala sua proteína
alvo ligada. Proteínas alvos da calmodulina participam
grupos R da sequência de aminoácidos na hélice ficam da sinalização celular, contração muscular, fertilização,
próximos uns dos outros. As hélices frequentemente metabolismo, morte celular programada, memória de
apresentam faces polar e não polar se suas sequências curta e de longa duração, crescimento nervoso, respos
de aminoácidos colocarem grupos R polares ou não po ta imune e divisão celular. O átomo de cálcio se liga à
lares separados de três ou quatro resíduos. Isso gera ca calmodulina dentro de uma alça de um motivo hélice
racterísticas funcionais peculiares à hélice. Entretanto, -volta-hélice chamada braço-EF (Figura 3.30a e ver Fi
se as terceira ou quarta cadeias laterais que se aproxi gura 12.57, p. 514). O motivo obteve seu nome a partir
98 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

FIGURA 3.27 Duas

cadeias polipeptídicas em
conformação folha-ß.
Cadeias polipeptídicas podem
ser adicionadas aos dois lados
das duas fitas mostradas, para
gerar uma estrutura mais exten
Hydrogênio
Nitrogênio
Oxigênio Carbono carbonila Ponte de hidrogênio sa.
Redesenhada com permissão de
Cadeia
Carbono-α
lateral Fersht, A. Enzyme Structure
and Mechanism, San Francisco:
Freeman, 1977, 10.

FIGURA3.28Exemplo de
folha-ß antiparalela [resíduos
93-98 (superior), 28-33 (meio)
e 16-21 (inferior) da Cu, Zn
superóxido dismutase).
Linhas tracejadas mostram pon
tes de hidrogênio entre átomos
de oxigênio da carbonila (verme
lho) e átomos de nitrogênio da
ligação peptídica (cinza); setas
mostram a direção do polipeptí
deo da extremidade N-terminal
para a C-terminal. Na folha-b
característica antiparalela, pares
de pontes de hidrogênio inter
cadeias muito próximas se al
ternam com pares de pontes de
hidrogênio bem espaçadas.
Redesenhado com permissão de
Richardson, J. S. Adv. Protein
Chem. 34:168, 1981

das hélices E e F (hélices 5 e 6 a partir da extremidade Estrutura Terciária

N-terminal) da proteína de músculo parvalbumina, na
qual esse motivo de ligação a cálcio foi observado pela
primeira vez. O motivo braço-EF é amplamente distri
buído em proteínas que ligam cálcio e é encontrado em
mais de 70 proteínas diferentes, com estruturas deter
minadas no banco de dados de proteínas (Protein Data
Bank). A dobra do domínio de calmodulina contém dois
motivos braços-EF interconectados por um segmento
de a-hélice (Figura 3.30b). Adição dos grupos de ca
deia lateral à estrutura secundária delineada pela ca
deia polipeptídica gera a estrutura terciária completa
do domínio (Figura 3.30c).
A estrutura terciária de um polipeptídeo mostra a
localização de cada um de seus átomos no espaço. In
clui a relação geométrica entre segmentos distantes das
estruturas primária e secundária e a relação posicional
das cadeias laterais, uma em relação à outra. A estru
tura terciária da tripsina é mostrada na Figura 3.31. A
estrutura em fita (a) mostra a conformação da única
cadeia polipeptídica e o padrão geral de dobramento da
cadeia polipeptídica (fold structure). A Figura 3.31b
mostra a posição das cadeias laterais. Cadeias laterais
do sítio catalítico ativo são apresentadas em amarelo,
que inclui o grupo hidroximetil da serina (resíduo 177),
o imidazol da histidina (resíduo 40), e o carboxilato da
cadeia lateral do aspartato (resíduo 85). Embora este
jam bem separados na estrutura primária, a estrutura
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 99

R
R
R R
H R
O
H O R
N H C H
H C O
C N H C
C H C
N C N H
H C C
C
O N C
H C N C
O
H
O H
H H FIGURA 3.29 Estrutura em folha-ß
C O
R H H
O
entre duas cadeias polipeptídicas
N C
R H H mostrando os planos de ligações
C N C C O
N
CH C N C R peptídicas unidas.
O H N
C
C N C Cadeias polipeptídicas podem ser adi
H O cionadas acima e abaixo para gerar uma
H C
H O C
H estrutura mais extensa. Os grupos de
R cadeias laterais ao longo da cadeia poli
R peptídica alternam suas posições acima e
R abaixo do plano.

FIGURA 3.30 Estruturas do motivo e

da dobra no domínio da calmodulina.
(a) Motivo braço-EF hélice-volta-hélice
com Ca2+ ligado. (b) Dois motivos braço
-EF combinam-se na dobra do domínio
C-terminal da calmodulina. (c) Os grupos
de cadeia lateral são adicionados para ge
rar a estrutura terciária do motivo. Cada
α-hélice tem uma cor diferente, com a ca
deia polipeptídica desenhada como uma
fita preta para mostrar mais claramente
a estrutura secundária da cadeia polipep
tídica.
Baseado na estrutura PDB ID 1J7P, Chou,
J. J. et al., Nat. Struct. Biol. 8:990, 2001.
Imagens produzidas com Swiss PDV
viewer, Guex, N. e Peitsch, M. C. Electro
phoresis 18:2714, 1997.

terciária os aproxima para formar o sítio catalítico. Na
Figura 3.31c, um modelo de preenchimento de espaço
mostra átomos de C, N e O representados por bolas de
raios proporcionais a seus raios de van der Waals. A es
trutura está de acordo com as regras gerais para prote
ínas solúveis (Seção 3.3).
Cadeias laterais hidrofóbicas ficam geralmente no
interior, longe da interface com a água. Cadeias laterais
ionizadas ficam no lado de fora, onde são estabilizadas
por água de solvatação. Dentro da estrutura da proteína
(não mostrado) estão mergulhadas moléculas de água
frequentemente apresentando interações estabiliza
doras específicas. Um grande número de moléculas de
água forma uma capa de solvatação ao redor do lado
externo da proteína.
Uma longa cadeia polipeptídica dobra-se em múlti
plas regiões compactas semi-independentes ou domí
nios, cada um tendo uma geometria compacta carac
terística com um núcleo hidrofóbico e uma superfície
polar. Geralmente contêm 100-150 aminoácidos. Os
domínios em uma proteína multidomínios podem ser
conectados por um segmento que não tem estrutura
secundária regular. Alternativamente, as regiões esfé
ricas densamente dobradas podem ser separadas por
100 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
uma fenda ou região menos densa de estrutura terciá
ria (Figura 3.32). A tripsina contém dois domínios com
uma fenda no meio, que contém o sítio catalítico para li
gação do substrato. Um sítio ativo dentro de uma inter
face interdomínios é característico de muitas enzimas.
Diferentes domínios em uma proteína podem se mover
um em relação ao outro. A hexoquinase (Figura 3.33),
que catalisa fosforilação de glicose por adenosina tri
fosfato (ATP) (p. 616), tem um sítio de ligação para gli
cose numa região entre dois domínios. Quando a glicose
liga-se ao sítio ativo, os domínios circundantes se mo
vem (Seção 3.8) para envolver o substrato, prendendo-o
para a fosforilação (Figura 3.33). Em enzimas com mais
de um sítio para substrato ou sítio para efetoralostérico
(p. 427), os diferentes sítios podem estar localizados
em diferentes domínios. Em proteínas multifuncionais,
cada domínio pode realizar uma tarefa diferente.
FIGURA 3.31 Estrutura terciária da tripsina.
(a) Estrutura em fita delineia a conformação da cadeia poli
peptídica. (b) A estrutura mostra as cadeias laterais, incluindo
os resíduos do sítio ativo (em amarelo) com delineamento da
cadeia polipeptídica sobreposta (fita). (c) Estrutura de preen
chimento de espaço, na qual cada átomo é representado com o
tamanho de seu raio de van der Waals.
Em (c) os átomos de hidrogênio não são mostrados. Diferen
tes domínios são mostrados em branco e azul escuro. Resíduos
do sítio ativo estão em amarelo, e as pontes dissulfeto cistina
intracadeia, em vermelho. Esferas em azul claro representam
moléculas de água associadas com a proteína. Essa estrutura
mostra a densidade de empacotamento no interior da proteína.
Estrutura Quaternária
Estrutura quaternária refere-se ao arranjo de ca
deias polipeptídicas em uma proteína multicadeias. As
subunidades em uma estrutura quaternária ficam as
sociadas não covalentemente. a-Quimotripsina contém
três polipeptídeos ligados covalentemente por pontes
dissulfeto intercadeias em uma única unidade covalen
te e, portanto, não tem estrutura quaternária. A mioglo
bina consiste de um polipeptídeo e não tem estrutura
quaternária. Contudo, a hemoglobina A contém quatro
subunidades polipeptídicas (a2b2) unidas não cova
lentemente em uma conformação específica, necessá
ria para sua função (p. 375). Portanto, a hemoglobina
tem uma estrutura quaternária. Aspartato carbamoil
transferase bacteriana (p. 846) tem uma estrutura qua
ternária formada por 12 subunidades polipeptídicas. A
proteína da capa do poliovírus contém 60 subunidades
polipeptídicas, e a proteína do vírus do mosaico do ta
baco contém 2.120 subunidades polipeptídicas associa
das não covalentemente.

FIGURA3.32 Domínios globulares em proteínas.
(a) A fosfoglicerato quinase tem dois domínios com um pes
coço relativamente estreito entre eles. (b) A elastase tem dois
domínios fortemente associados separados por uma fenda es
treita. Cada esfera no desenho de espaço preenchido repre
senta a posição do carbono-α de um aminoácido na estrutura
da proteína.
Reproduzido com permissão de Richardson, J. S. Adv. Protein
Chem. 34:168, 1981.
Proteínas Não-Estruturadas
As proteínas descritas anteriormente têm dobras e
estruturas terciárias definidas, nas quais a localização
média no espaço dos átomos das estruturas dobradas
são conhecidas. Ao contrário, existem proteínas que não
têm uma estrutura dobrada estável. Isso pode não ser
surpreendente, uma vez que proteínas dobradas são, em
geral, apenas 21–45 kJ/mol (5–10 kcal/mol) mais está
veis do que suas conformações desnaturadas (Seção 3.7,
p. 116). Não seria, portanto, inesperado que existissem
proteínas que não têm uma conformação dobrada es
tável em temperaturas fisiológicas. Proteínas com uma
conformação não dobrada são chamadas proteínas in
trinsecamente não-estruturadas (IUPs, intrinsically
unstructured proteins). Outras proteínas podem con
ter regiões ou domínios não-estruturados, que contêm
conformações parcialmente não dobradas (PUFs, par
tially unfolded conformations). As IUPs e as proteínas
com PUFs incluem proteínas de arcabouço, hormônios,
domínios de ativação de fatores de transcrição, quinases
CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 101
FIGURA 3.33 Desenhos de (a) forma não ligada da
hexoquinase e glicose livre e (b) conformação da
hexoquinase com glicose ligada.
Nesse desenho de espaço preenchido, cada círculo representa
raio de van der Waals de um átomo da estrutura. A glicose é
preta, e cada domínio é sombreado diferentemente.
Reproduzido com permissão de Bennett, W. S. e Huber, R..
CRC Rev. Biochem. 15:291, 1984.
dependentes de ciclinas e seus inibidores, proteínas da
transdução de sinal celular, e os segmentos NH2-termi
nais das proteínas histonas nos nucleossomos.
As conformações não dobradas são muito dinâmi
cas, com os átomos apresentando mobilidade tanto em
deslocamento como em rotação (ver Seção 3.8 para uma
discussão sobre a mobilidade de proteínas dobradas).
Entretanto, as conformações não-estruturadas podem
conter regiões de estrutura secundária ordenada, não
completamente ao acaso. Esses domínios de proteínas
não-estruturadas lembram os intermediários em glóbu
lo fundido (molden globule) que está presente nas vias
de dobramento de proteínas (Seção 3.5).
IUPs e PUFs frequentemente funcionam na ligação
a outras proteínas ou a DNA e RNA. A interação da liga
ção induz uma estrutura no polipeptídeo não dobrado
(Figura 3.34). A indução da estrutura definida no IUP
ou PUF é um processo entropicamente negativo, que é
desfavorável quanto à energia livre. Portanto, a força de
ligação de proteínas não-estruturadas a seus parceiros
de ligação é geralmente mais fraca do que a de ligação
de uma molécula com uma estrutura pré-formada, que
não precisa utilizar parte da sua energia de ligação fa
102 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
Não-estruturada (conjunto
Glóbulo
conformacional)
fundido
(conjunto conformacional)
Por exemplo, ACTR (não NCBD) Por exemplo, NCBD (não ACTR)
Ligação
Complexo ACTR-NCBD
FIGURA 3.34 Estrutura induzida pela ligação em domínios não
-estruturados.
O domínio de interação do ativador dos receptores do hormônio da tireóide e
de ácido retinóico (ACTR) é um conjunto de conformações não-estruturadas
(marrom avermelhado, painel superior esquerdo) e o domínio coativador do re
ceptor nuclear (NCBD, nuclear-receptor coactivator domain) tem uma con
formação em glóbulo fundido com elementos de estrutura secundária regular e
uma estrutura terciária instável (verde, painel superior direito). A associação
induz uma estrutura secundária e terciária estável em ambas as proteínas (pai
nel inferior).
Reproduzido com permissão de Macmillan Publishers Ltd: de Dyson, H. J. e
Wright, P. E. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:197, 2005.
vorável para conseguir uma mudança de conformação
entropicamente desfavorável. Essa propriedade de li
gação fraca é frequentemente vantajosa, uma vez que
interações fracas e transitórias são necessárias para
muitos processos biológicos. Além disso, os domínios
não-estruturados mostram promiscuidade com seus
parceiros de ligação, porque sua falta de estrutura pré
-formada dá a eles uma plasticidade para formar super
fícies complementares de ligação com muitos parceiros
de ligação diferentes. Assim, o inibidor de quinases de
pendentes de ciclina p21 tem capacidade de se ligar a
diferente quinases dependentes de ciclina e regular as
quinases dependentes de ciclina presentes nas diferen
tes fases do ciclo celular. Proteínas de arcabouço agru
pam muitas proteínas em um complexo funcional. Sua
plasticidade permite a ligação de múltiplos parceiros no
complexo e permite mudanças nas proteínas membros,
de acordo com as necessidades fisiológicas.
Regiões não-estruturadas de proteínas podem ser re
conhecidas a partir da sequência de aminoácidos de seus
polipeptídeos. Regiões desordenadas são enri
quecidas em aminoácidos polares e carregados
(glutamato, lisina e glutamina) e no aminoáci
do prolina, e são depletadas em aminoácidos
aromáticos e alquila. Foram desenvolvidos al
goritmos para pesquisas sequências e identifi
carregiões potencialmente não-estruturadas
de cadeias polipeptídicas. A conservação das
proteínas não-estruturadas e de PUFs em
proteínas específicas ao longo da evolução
mostra a importância de tais regiões em pro
cessos biológicos críticos.
Complexos de Proteínas,
Redes e Interactomas
Moléculas de proteína no meio celular es
tão primariamente presentes em complexos
de proteínas contendo múltiplas subunida
des proteicas. Os complexos são funcional
mente essenciais para a maioria dos proces
sos celulares, incluindo sinalização celular,
transcrição gênica, splicing e tradução de
RNA, apoptose e metabolismo celular. Esses
complexos têm, tipicamente, 5-10 proteínas,
mas muitos contêm até 20-30 proteínas dife
rentes. Os complexos se comunicam entre si
por meio de proteínas presentes em dois ou
mais complexos diferentes, e que podem se
mover entre os complexos para conectá-los
em redes. Um complexo que se interconecta
com mais do que três outros complexos é um
nó (ou hub) da rede, e um alvo importante
para terapêutica de doenças. Uma rede fun
cional compreendendo complexos proteicos
interconectados é um interactoma.
Complexos proteicos celulares são caracterizados
utilizando-se purificação por afinidade em sequência
(TAP, tandem affinity purification), que envolve in
serção de um gene reporter em seguida ao gene de uma
proteína de interesse, para produzir uma proteína qui
mérica na qual a proteína alvo produzida está ligada a
uma proteína marcada. A proteína marcada é isolada
por eluição do lisado celular de uma coluna de afinida
de contendo anticorpo contra a marca (Figura 3.35). A
resina de afinidade liga a proteína marcada e suas pro
teínas associadas, que são eluídas da coluna, separadas
por eletroforese e identificadas por espectroscopia de
massa (p. 131 para uma discussão das técnicas). Outros
métodos de identificação dos parceiros no complexo de
uma proteína alvo incluem coimunoprecipitação com
um anticorpo dirigido contra a proteína alvo, e o ensaio
de dois-híbridos em levedura, no qual as interações bi
nárias proteína-proteína de mamífero são avaliadas em
um sistema reporter célula de levedura (Figura 3.35).
Nenhuma dessas técnicas de ensaio, por si só, é sufi
ciente para provar uma interação proteína-proteína in

vivo, uma vez que artefatos são comuns. Resultados
positivos em mais de uma dessas técnicas demonstra
interação, com grande confiabilidade. Essas técnicas
não permitem isolar complexos transitórios, complexos
de membrana ou complexos de estados fisiológicos ou
fenótipos não presentes nas células analisadas.
Y Função de Proteínas como Produtos
AD
X
DBD
Gene reporter
(a) Dois híbridos em levedura
e sequências polipeptídicas no UniProt Knowledge Base,
X d
a
Z d
i
n
if
a 75.000 são humanas. O Protein Data Bank contém 47.000
Isca e
Y d
a
n
u
l das por difração de raios-X, ressonância nuclear mag
W o
C
(b)
Purificação por afinidade
FIGURA 3.35 Dois métodos para determinar interações
proteína-proteína.
(a) A técnica de dois-híbridos em levedura determina intera
ções binárias proteína-proteína em um sistema de expressão
em levedura. Uma proteína fator de transcrição que se liga a
uma sequência regulatória à montante de um gene repórter
de levedura, como Gal4, consiste de um domínio de ligação ao
DNA (DBD, DNA binding domain) e um domínio de ativação
(AD, activation domain), necessários para ativar a expressão
do gene repórter. As regiões codificadoras dos domínios DBD e
AD são separadas e ligadas a dois genes de mamíferos de inte
resse (X e Y) e expressos em células de levedura para produzir
proteínas quiméricas DBD-X e Y-AD. Se a proteína Y se ligar à
proteína X, os domínios DBD e AD se aproximam e estimulam
a expressão do gene repórter. O gene popular Gal4 produz a
enzima b-galactosidase, que dá uma cor azul a células em pla
cas de cultura impregnadas com o substrato correto.
(b) A técnica de purificação por afinidade em sequência (TAP)
liga uma proteína marcada (quadrado púrpura) com uma pro
teína de interesse (proteína isca, laranja) e a proteína quimé
rica é expressa em uma célula de interesse. O lisado celular
é passado em uma resina de afinidade contendo anticorpo
contra a proteína marcada com o complexo da proteína isca
(proteínas W-Z). As proteínas ligadas são eluídas da coluna de
afinidade e identificadas por espectroscopia de massa.
Redesenhado com base na figura de Aloy, P. e Russell, R. B.
Nature Reviews Mol. Cell Biol. 7:188, 2006.
Estimativas teóricas indicam que uma célula huma
na tem aproximadamente 3.000 complexos proteicos,
cada um com múltiplas isoformas (membros de proteí
nas que não são do núcleo do complexo e que são inter
cambiáveis, gerando diferentes isoformas), e aproxima
damente 650.000 interações binárias proteína-proteína
gerando esses complexos de proteínas. A determinação
CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 103
das características de complexos e redes nos quais pro
teínas associadas a doenças estão presentes mostra as
interdependências de múltiplos produtos gênicos que
afetam uma doença e suas relações nas vias relaciona
das com a doença (Figura 3.36).
Bioinformática Relaciona Estrutura e
Gênicos
Ao longo das últimas décadas, as sequências de nu
cleotídeos dos genomas de múltiplas espécies animais
foram obtidas, bem como as sequências dos RNAs trans
critos e as sequências polipeptídicas produzidas a partir
do DNA genômico. A quantidade de dados é enorme, e
são armazenados em bancos de dados computacionais,
que são acessados livremente na Internet. O número de
em 2008, era superior a 6,4 milhões, dentre as quais
estruturas tridimensionais de proteínas dobradas obti
nética e microscopia eletrônica. Bioinformática é uma
área de pesquisa baseada em computação que focaliza
a integração e a análise de dados biológicos complexos
com algoritmos computacionais. Uma grande ênfase da
bioinformática foi identificar padrões em sequências de
ácidos nucleicos ou de aminoácidos que são assinaturas
de características estruturais ou motivos e de famílias
ou classes de proteínas às quais o produto gênico per
tence. Esses algoritmos de busca de homologia são usa
dos para identificar e classificar produtos de genes com
base em similaridade de sequência quando a estrutura
é conhecida, a busca de homologia pode ser baseada em
similaridade estrutural. O grau de similaridade de sequ-
ência usa critérios que vão desde a identidade absoluta
de resíduos em posições equivalentes até a similaridade
baseada em polaridade, hidrofobicidade e tamanho. Os
algoritmos permitem inserção ou deleção de segmentos
da cadeia polipeptídica ou da estrutura para dar a sobre
posição máxima entre duas proteínas.
Os domínios das proteínas são classificados por
classe, dobra e família. A classe é determinada pelo
tipo predominante de estrutura secundária presente na
proteína. Alguns exemplos são principalmente a-hélice
(toda a), principalmente b-fita (toda b), e quantidades
aproximadamente iguais de a-hélice e b-fita ([a/b] al
ternadas ou [a + b] não alternadas). A dobra é deter
minada pelo arranjo específico dos elementos de estru
tura secundária no domínio. A família é determinada
pelo grau de identidade de sequência entre as proteí
nas. Proteínas que são membros da mesma família têm
uma relação evolutiva comum e são derivadas do mes
mo gene primordial. Proteínas da mesma família têm
o mesmo dobramento e frequentemente desempenham
funções similares.
104 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
FIGURA3.36 Mapa preliminar do interactoma relacionado
a doenças para um subconjunto de 7.200 proteínas
humanas.
As interações binárias no ensaio de dois-híbridos em levedura
foram determinadas em um subconjunto de 7.200 produtos gê
nicos. O interactoma mostrado refere-se a interações de ligações
de proteínas relacionadas com doenças conhecidas, que estão
designadas no banco de dados OMIM. Nós verdes são produtos
De interesse para a clínica médica é a descoberta
de mutações na sequência de aminoácidos, que podem
dar origem a significativas alterações de função. Em
nível molecular, mudanças em apenas um aminoácido
podem ser significativas. Uma mutação de um amino
ácido pode perturbar a conformação nativa; a flexibi
lidade conformacional; a energética ou movimento da
molécula; e a seletividade de enzimas por substratos e
inibidores. Exemplos disso são as hemoglobinas, para
as quais existe um extenso catálogo de mutações. Algu
gênicos do banco de dados OMIM, e nós amarelos representam
produtos gênicos sem designação atual no OMIM. Linhas verme
lhas mostram interações binárias identificadas por Rual et al., e
linhas sólidas azuis mostram interações identificadas pelos auto
res na literatura. Linhas tracejadas mostram interações através
de uma terceira proteína.
Reproduzido com permissão de Rual, J.-F., Venkatesan, K., Hao,
T., Hirozane-Kishikawa, T., et al. Nature 437:1183, 2005.
mas mutações da hemoglobina produzem significativos
sintomas clínicos, como anemia falciforme (Correlação
Clínica 6.2; p. 220). Certas posições na sequência de
aminoácidos são variantes entre populações. Essas
posições na sequência, quando envolvem alterações
únicas no códon de bases para aquele aminoácido, são
chamadas polimorfismos de um nucleotídeo único
(SNPs, single nucleotide polymorphisms) e podem
levar a um entendimento das diferenças em respostas a
uma doença ou terapêutica entre populações humanas.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 105

Estruturas de Dobras Homólogas -sheet). Novamente, os segmentos de fita-b são ligados

São Frequentemente Formadas
a Partir de Sequências de
Aminoácidos Não Homólogas
Embora cada estrutura nativa seja singular, a com
paração de estruturas terciárias de diferentes proteí
nas mostra que arranjos semelhantes de motivos de es
trutura secundária são frequentemente observados nas
estruturas de dobras de domínios. Dobras de estrutura
semelhante de proteínas não relacionadas por função,
sequência ou evolução são chamadas superdobras (su
perfolds). Elas se formam graças à estabilidade termo
dinâmica de seus arranjos de estrutura secundária ou à
sua acessibilidade cinética.
por regiões de a-hélices posicionadas no lado externo,
dando o padrão característico de dobra. Uma superdo
bra domínio-todo-b está presente na Cu, Zn superóxido
dismutase, na qual a folha-b antiparalela forma um bar
ril-b “chave grega” (Figura 3.40). Um padrão de dobra
semelhante ocorre em cada um dos domínios de imu
noglobulinas. A concavalina A (Figura 3.40) apresen
ta uma superdobra domínio-todo-b, no qual as fitas-b
antiparalelas formam uma dobra em barril-b chamada
“jelly roll”. Proteínas que não são solúveis em água po
dem conter diferentes padrões de dobras (Seção 3.6).

Uma dobra comum toda-a ou domínio é encontrada

na lisozima e é chamada dobra de globina (Figura 3.37),
uma vez que foi descrita pela primeira vez na mioglobi
na e nas subunidades da hemoglobina (p. 369). Essas
estruturas toda-a têm sete ou oito seções de a-hélices
ligadas por segmentos menores que permitem que as
hélices se dobrem sobre si mesmas, formando uma for
ma globular característica. Como essa dobra é gerada
por proteínas de diferentes famílias com homologias de
sequências, a dobra de globina é uma superdobra. Outra
superdobra comum é a estrutura domínio-a/b da triose Triose fosfato isomerase
fosfato isomerase (Figura 3.38), na qual as fitas (desig
nadas por setas) formam um barril-b central com cada
fita-b do interior conectada por uma região de a-hélice
do lado externo da dobra. Uma dobra semelhante forma
um domínio da piruvato quinase (Figura 3.38), que não
tem homologia de sequência ou funcional. Um tipo di
ferente de superdobra-a/b está presente no domínio 1
não homólogos da lactato desidrogenase e no domínio 2
da fosfoglicerato quinase (Figura 3.39). Nestas, seções
centrais participam de uma folha-b torcida (twisted b-

Domínio 1 da piruvato quinase

FIGURA 3.38 Exemplo de uma dobra domínio-a/b na

triose phosphato isomerase e no domínio 1 da piruvato
quinase.
Ver legenda da Figura 3.37. Nesta superdobra comumente
formada, as fitas-b formam um barril-b no centro do domínio
enquanto os segmentos de a-hélice ficam no lado de fora do
FIGURA 3.37 Exemplo de um domínio dobra de globina domínio. As fitas-b ficam em direções paralelas. Regiões de
todo-a na lisozima. a-hélice alternam-se com fitas-b na cadeia polipeptídica.
Nesse desenho e nas Figuras 3.38, 3.39 e 3.40, apenas o deline
Redesenhado com permissão de Richardson, J. S. Adv. Pro
amento da cadeia polipeptídica é mostrado. Fitas-b são repre
tein Chem. 34:168, 1981.
sentadas por setas indicando a direção N—>C-terminal; raios
representam pontes de dissulfeto e círculos representam íons
metálicos cofatores (quando presentes). Domínio todo-a é a
dobra de globina.
Redesenhado com permissão de Richardson, J. S. Adv. Pro
tein Chem. 34:168, 1981.
106 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
Domínio 1 da lactato desidrogenase
Domínio 2 da fosfoglicerato quinase
FIGURA 3.39 Exemplo de uma dobra domínio-a/b no
qual fitas-b formam uma folha-b torcida clássica na
lactato desidrogenase e na fosfoglicerato quinase.
Ver legenda da Figura 3.37. Como na dobra domínio-a/b an
terior, regiões de a-hélice alternam-se com regiões de fita-b
na cadeia polipeptídica. A estrutura em folha-b fica no lado de
dentro, enquanto os segmentos de a-hélice ficam no lado de
fora. As fitas-b ficam em paralelo na estrutura-b.
Redesenhado com permissão de Richardson, J. S. Adv. Pro
tein Chem. 34:168, 1981.
3.6 PROTEÍNAS ESTRUTURADAS
NÃO-GLOBULARES
As características estruturais de proteínas já discu
tidas são baseadas em observações de proteínas globu
lares e solúveis em água. As proteínas globulares têm
uma forma esférica, variam em tamanho, têm solubili
dade em água relativamente elevada e funcionam como
catalisadores, transportadores e reguladores de vias
metabólicas e da expressão gênica. As proteínas que
não se encaixam no modelo de proteína globular solúvel
Cu, Zn superóxido dismutase
Concanavalina A
FIGURA 3.40 Exemplos de superdobras domínio-todo-b:
o barril chave grega e as dobras jelly roll apresentadas
na superóxido dismutase e na concanavalina A.
Ver legenda da Figura 3.37. As fitas-b são principalmente anti
paralelas em dobras domínio-todo-b.
Redesenhado com permissão de Richardson, J. S. Adv. Pro
tein Chem. 34:168, 1981.
são as proteínas fibrosas e as proteínas de membranas.
Estas são não-globulares e têm baixa solubilidade em
água. Além disso, lipoproteínas e glicoproteínas contêm
componentes não-proteicos lipídicos e carboidratos e
podem ter ou não-estruturas globulares.
Proteínas fibrosas caracteristicamente têm quan
tidades maiores de estrutura secundária regular, uma
forma cilíndrica longa (tipo bastão), baixa solubilida
de em água, e uma função estrutural em lugar de um
papel dinâmico. Colágeno, queratina e tropomiosina
são importantes proteínas fibrosas. Suas estruturas
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 107

com múltiplas cadeias têm cadeias polipeptídicas com H H

N N
uma grande quantidade de estrutura secundária regu H2C
OH CHCOOH H2C CHCOOH
lar (hélice poliprolina tipo II ou a-hélice), que se asso
ciam para formar conformações superenroladas mul HC CH2 H2C CH

ticadeias em forma de bastão. Em todos os casos, as OH

sequências de aminoácidos das cadeias geram bordas 4-Hidroxiprolina 3-Hidroxiprolina
nas superfícies cilíndricas que estabilizam interações
hidrofóbicas entre as cadeias nas conformações supe
renroladas. Por sua vez, essas estruturas moleculares OH NH2
são alinhadas em fibrilas multimoleculares que são es
NH2 CH2CHCH2CH2CH
tabilizadas, em alguns casos, por ligações covalentes
COOH
cruzadas.
5-Hidroxilisina

NH2
Colágeno
COCH2CH2CH2CH
Colágeno é uma família de proteínas extracelulares H COOH
presentes em todos os tecidos e órgãos, que fornece o Alisina
arcabouço que dá aos tecidos sua forma e resistência.
É a proteína mais abundante no homem (Tabela 3.10 e FIGURA 3.41 Aminoácidos derivados no colágeno.
Correlação Clínica 6.13, p. 251). Carboidrato é ligado à 5-OH de hidroxilisina por uma ligação
glicosídica tipo III (ver Figura 3.49).

TABELA 3.10 Percentagem de Colágeno em Tecidos e

Órgãos Representativos Humanos Sequência de Aminoácidos do Colágeno
Percentagem de A família do colágeno é composta por polipeptídeos
Tecido ou Órgão Colágeno em peso derivados de 40 genes conhecidos de cadeias de co
lágeno, que produzem cerca de 20 tipos de colágeno.
fígado 4 Cada molécula de colágeno maduro ou tropocoláge
no contém três cadeias polipeptídicas. Alguns tipos
pulmão 10
de colágeno contêm três cadeias polipeptídicas idên
aorta 10-24 ticas. No tipo I (Tabela 3.12), há duas cadeias a1(I)
e uma a2(I). O colágeno tipo V contém três cadeias
cartilagem 50 diferentes, chamadas a1(V), a2(V) e a3(V). Os colá
osso cortical inteiro
córnea 64 genos diferem em sequência de aminoácidos, mas há
grandes regiões de sequências homólogas entre todos
23 os diferentes tipos de colágeno. Em todos os tipos de
colágeno há regiões com os tripeptídeos Gly-Pro-Y e
pele 74
Gly-X-Hyp (onde X e Y são quaisquer aminoácidos),
repetidos, em seguida, centenas de vezes. Nos poli
peptídeos do colágeno tipo I, as sequências de triple
Composição em Aminoácidos do tes repetidos correspondem a mais de 600 dos apro
Colágeno ximadamente 1.000 aminoácidos por polipeptídeo. Os
colágenos diferem em seu componente carboidrato.
A composição do colágeno tipo I de pele e das pro Algumas características dos colágenos tipos I-VI são
teínas globulares ribonuclease e hemoglobina são da
das na Tabela 3.11. O colágeno de pele é rico em glicina resumidas na Tabela 3.12.
(33% de seus aminoácidos), prolina (13%) e os amino
ácidos derivados 4-hidroxiprolina (9%) e 5-hidroxili Estrutura do Colágeno
sina (0,6%) (Figura 3.41). Hidroxiprolina é exclusiva
de colágenos, sendo formada enzimaticamente a partir Cadeias polipeptídicas sintéticas contendo apenas
de prolina. A maior parte das hidroxiprolinas tem o prolina (poli-Pro) podem ser preparadas em laborató
grupo hidroxila na posição 4 (carbono g), embora uma rio e assumem, em solução aquosa, uma estrutura se
pequena quantidade de 3-hidroxiprolina também seja cundária regular diferente da a-hélice. A pol-Pro forma
formada (Tabela 3.11). Os colágenos são glicoproteí uma hélice estendida muito torcida com três resíduos
nas com carboidratos ligados a 5-hidroxilisina por por volta (n = 3). Essa hélice, com todas as ligações
uma ligação O-glicosídica por meio do grupo hidroxila trans-peptídicas, é a hélice poliprolina tipo II (Figu
do carbono-d. ra 3.12, para diferenças entre ligações peptídicas cis e
trans). A hélice poli-Pro lembra muito a encontrada em
cadeias de colágeno em regiões que contêm uma proli
108 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

na ou uma hidroxiprolina a aproximadamente cada ter
ceira posição nas sequências de tripeptídeo repetitivo,
indicando que as forças termodinâmicas que levam à
formação da estrutura da hélice do colágeno devem-se
às propriedades da prolina.
Na hélice de poliprolina tipo II, o plano de cada liga
ção peptídica é perpendicular ao eixo da hélice. Assim,
os átomos de oxigênio e nitrogênio da ligação peptídica
em uma hélice poliprolina tipo II apontam na direção
das cadeias polipeptídicas vizinhas e formam fortes
pontes de hidrogênio intercadeias. Isso contrasta com a
α-hélice, na qual o plano da ligação peptídica é paralelo
ao eixo, onde o NH e o oxigênio da carbonila dos peptí
deos formam apenas pontes de hidrogênio intracadeia.

TABELA 3.11 Comparação do Conteúdo de Aminoácido do Colágeno da Pele Humana (Tipo I) e Elastina Madura com a de
Duas Proteínas Globulares Típicasa

Colágeno Elastina Ribonuclease

(Bovina) Hemoglobina
Aminoácido (Pele humana)
(Mamíferos) (Humana)
aminoácidos comuns porcentagem do total
Ala 11 22 8 9
Arg 5 0,9 5 3
Asn 8 3
Asp 5 1 15 10
Cys 0 0 0 1
Glu 7 2 12 6
Gln 6 1
Gly 31 2 4
His 0,5
30 0,1 4 9
Ile 1 2 3 0
Leu 2 6 2 14
Lys 3 0,8 11 10
Met 0,6 0,2 4 1
Phe 1 3 4 7
Pro 13 11 4 5
Ser 4 1 11 4
Thr 2 1 9 5
Trp 2 1 9 2
Tyr 0,3 2 8 3
Val 2 12 8 10
aminoácidos derivados
Cistina 0 0 7 0
3-Hidroxiprolina 0,1 0 0
4-Hidroxiprolina 9 1 0 0
5-Hidroxilisina 0,6 0 0 0
Desmosina e isodesmosina 0 1 0 0
aNúmeros em quadrados enfatizam importantes diferenças na composição de aminoácidos entre proteínas fibrosas (colágeno e elastina) e proteínas
globulares típicas.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 109

As três cadeias de uma molécula de colágeno, onde Formação de Ligações Covalentes

cada cadeia está na conformação de hélice poliprolina
tipo II, enrolam-se umas em torno das outras, para for
mar uma estrutura conhecida como super-hélice (Fi
gura 3.42, p. 106). A super-hélice de três cadeias tem
tamanho (d) e passo (p) característicos, diferentes dos
encontrados em cada uma das cadeias polipeptídicas
em hélice de poliprolina. A super-hélice é estabiliza
da por pontes de hidrogênio intercadeias entre as três
cadeias, porque glicina ocorre a cada terceira posição.
Com a conformação em hélice poliprolina tipo II de
cada cadeia polipeptídica, com três resíduos por volta
(n = 3), as glicinas formam uma borda apolar ao longo
do comprimento de cada uma das hélices. A borda de
glicina então estabelece interações não polares entre as
cadeias, que são críticas para estabilizar a super-hélice
de três cadeias. Qualquer cadeia lateral diferente da gli
cina ao longo da borda apolar impediria que as cadeias
adjacentes se aproximassem na estrutura da super-hé
lice (Figura 3.42, Osteogênese Imperfecta, e Correlação
Clínica 6.13; p. 251).
No colágeno tipo I, a tripla hélice estende-se pela
maior parte da sequência, e só os segmentos carboxi
-terminal e amino-terminal (conhecidos como telopep
tídeos) não têm conformação em tripla-hélice. A molé
cula de colágeno tipo I tem 3.000 Å de comprimento e
apenas 15 Å de largura, uma estrutura cilíndrica muito
longa. Em outros tipos de colágeno, as regiões de super
-hélice podem ser interrompidas periodicamente por
regiões globulares.
Cruzadas no Colágeno
Uma enzima extracelular age sobre moléculas de
colágeno (p. 111) para converter o e-amino grupo de
algumas cadeias laterais de lisina em um d-aldeído (Fi
gura 3.43). O aminoácido derivado é alisina. A cadeia
lateral aldeído recém-formada sofre reações de adição
nucleofílica espontânea com e-amino grupos de lisina
não modificada e com átomos de carbono-d de outros
grupos aldeídicos de alisinas. Essas ligações covalentes
podem ser entre cadeias dentro da estrutura super-héli
ce ou entre super-hélices de colágeno adjacentes numa
fibrila de colágeno (p. 247 para uma discussão sobre a
biossíntese do colágeno).
Elastina É uma Proteína Fibrosa
com Ligações Cruzadas Geradas por
Alisina
Elastina confere a tecidos e órgãos a capacidade de
se esticarem sem romper. É classificada como proteína
fibrosa por sua função estrutural e relativa insolubili
dade em água; é abundante em ligamentos, pulmões,
paredes de artérias e pele. A elastina não tem estrutu
ra secundária regular. Como no colágeno, alisinas fa
zem ligações cruzadas na elastina. Uma lisina amino
oxidase extracelular converte cadeias laterais de li
sina nas sequências -Lys-Ala-Ala-Lys- e -Lys-Ala-Ala

TABELA 3.12 Classificação dos Tipos de Colágeno

Designações das
Tipo cadeias Tecido em que é encontrado Características

I [a1(I)]2a2(I) Osso, pele, tendão, tecido de Pouco carboidrato;

cicatrização, válvula do coração, <10 hidroxilisinas por cadeia
paredes intestinal e uterina
II [a1(II)]3 Cartilagem, vítreo 10% carboidrato;
>20 hidrolisinas por cadeia
III [a1(III)]3 Vasos sanguíneos, pele de recém Pouco carboidrato; muita hidroxiprolina e
-nascido, tecido de cicatrização, Gly; contém Cys
paredes intestinal e uterina
IV [a2(IV)]33
[a1(IV)] Membrana basal, cápsula do Muita 3-hidroxiprolina;
cristalino >40 hidroxilisinas por cadeia; pouca Ala e
Arg; contém Cys; muito carboidrato (15%)
V a1(V)a2(V)a3(V)
[a1(V)]3
[a1(V)]3a2(V) Superfícies celulares ou Muito carboidrato, relativamente muita
exocitoesqueleto; amplamente glicina e hidroxilisina
distribuído em quantidades baixas
VI a3(VI)
a1(VI)a2(VI) Íntima da aorta, placenta, rim e Domínios globulares relativamente grandes
pele em quantidades baixas nas regiões de telopeptídeos; muita Cys e
Tyr; peso molecular relativamente baixo
(~160 kDa); quantidades equimolares de
hidroxilisina e hidroxilisina
110 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Queratina e Tropomiosina
Queratina e tropomiosina são proteínas fibrosas
12 nas quais cada polipeptídeo é uma α-hélice. A quera
tina é encontrada na camada epidérmica da pele, nas
unhas e no cabelo. A tropomiosina é um componente
11
dos filamentos finos do tecido muscular. As sequências
de ambas as proteínas mostram repetições em seguida
(tandem) de segmentos de sete resíduos (hepteto), nos
10 quais o primeiro e o quarto aminoácidos têm cadeias
Gly
laterais hidrofóbicas, e o quinto e o sétimo, cadeias la
terais polares. A reiteração de cadeias laterais hidrofó
bicas e polares no segmento hepteto é simbolicamente
9
representada pela formulação (a-b-c-d-e-f-g)i, onde a e
d são aminoácidos hidrofóbicos, e e g são grupos de ca
deias laterais polares ou ionizados. Como um segmento
8 de sete aminoácidos representa duas voltas completas
de uma α-hélice (n = 3,6), os resíduos apolares em a e
7
Gly d alinham-se para formar uma borda apolar ao longo de
um lado da α-hélice (Figura 3.45). Essa borda apolar
interage com bordas polipeptídicas apolares de outras
cadeias de α-queratina formando uma estrutura super
6 -helicoidal em mola-enrolada (coiled-coil) contendo
duas ou quatro cadeias polipeptídicas. Cada polipeptí
deo também contém uma borda polar, devido aos resí
5
duos e e g, que interagem com água no lado externo da
Gly super-hélice e a estabilizam.
4

Lipoproteínas Plasmáticas São

3
2 teínas e lipídeos que formam agregados distintos com
Gly
(a) (b)
FIGURA 3.42 Diagrama do colágeno demonstrando a
necessidade de glicina a cada três resíduos para permitir
que diferentes cadeias fiquem muito próximas na
estrutura.
(a) Modelo em fita para a estrutura superenrolada do coláge
no, com cada cadeia individual em uma hélice poliprolina tipo
II. (b) Modelo mais detalhado da conformação superenrolada.
Todos os átomos de carbono-α são numerados, e as pontes de
hidrogênio propostas são mostradas por linhas tracejadas.
Redesenhada com permissão de Dickerson, R.E. e Geis, I. The
Structural and Action of Proteins. Menlo Park, CA: Benja
min, 1969, pp. 41,42.
-Ala-Lys- em alisinas. Três alisinas e uma lisina não
modificada em diferentes regiões das cadeias polipep
tídicas reagem para formar a estrutura heterocíclica
desmosina ou isodesmosina, que estabelecem liga
ções cruzadas entre cadeias polipeptídicas na rede de
elastina (Figura 3.44).
Complexos de Lipídeos com
Proteínas
Lipoproteínas plasmáticas são complexos de pro
uma estequiometria aproximada entre os componentes
proteicos e lipídicos. Ligações covalentes não existem
entre as moléculas de lipídeos e de proteínas, mas as
moléculas do complexo são mantidas juntas na estrutu
ra da partícula por meio de interações não-covalentes
(p. 741). As partículas de lipoproteínas funcionam no
transporte de lipídeos de tecido para tecido e partici
pam do metabolismo de lipídeos (p. 743).
Existem quatro classes no plasma de seres huma
nos normais em jejum (Tabela 3.13), e no período pós
-absortivo uma quinta classe, quilomícrons, também
está presente. São diferenciadas por sua densidade, de
terminada por ultracentrifugação e por eletroforese (Fi
gura 3.46). Mudanças nas suas concentrações relativas
são preditivas de aterosclerose, uma importante doen
ça humana (Correlação Clínica 3.3). Seus componentes
proteicos são chamados apolipoproteínas, e cada classe
de lipoproteína tem uma composição característica em
apolipoproteína. As apolipoproteínas mais proeminentes
(Tabela 3.14) são apolipoproteína ApoA-I em lipoproteí
nas de alta densidae (HDLs); ApoB em lipoproteínas de
baixa densidade (LDLs), em lipoproteínas de densidade
intermediária (IDLs) e em lipoproteínas de muito bai
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 111

O H H O H H
O H H CCN
O
C (CH2)2
HC
CH2HN O
C (CH2)2
H
C
CH2HN C (CH2)2
CCH2 N amino
Lisil C (CH2
C N (CH2 O
C (CH2
H
C
CH2 N
CH2 oxidase NH+3 H

)2 )2 N
CH2 CH2
C
+3 oxidase
amino
lisil H O condensação
aldólica CH2

NH+3 NH CH
CH2 CH2
CH CH2 CH2 CH H
O
NH H C O H O CC

CH2 C (CH2)2
CN
2 C
(CH2)2 (CH2)2 (CH2)2 (CH2)2 (CH2)2 )2
O H H
C C N CC N C C N C C N CC N

O H H O H H O H H O H H O H H

Lisinonorleucina Base de Schiff Derivativo aldeídico Residuos de lisil Derivativos aldeídicos Ligação cruzada aldol
(uma ligação cruzada no (alisil) no colágeno (alisil) no colágeno
colágeno ou elastina)

FIGURA 3.43 Ligações covalentes cruzadas formadas em colágeno por intermediários alisina.
A formação de alisinas é catalisada por lisilamino oxidase.

Cadeia
(CH2)3 (CH2)3 polipeptídica (CH2
)3 (CH2)3
CH CH2 (CH2)3
(CH2
NH2
CH2 CH2
NH2 (CH2 NH2
CH2
CH2 CH2
O
N
3 lisinas +
convertidas a alisinas Condensações aldólicas
O CH2
NH2 Lisina amino oxidase H C O
(CH2)3 CH2
)3 (CH
CH2 H CH2
C
)3
2)3 (CH2)3

Ligação cruzada desmosina

FIGURA 3.44 Formação da ligação covalente cruzada desmosina na elastina a partir de lisina e alisinas.
A cadeia polipeptídica foi desenhada esquematicamente com interseções de linhas representando a localização dos carbonos-a.

c
g e′ xa densidade (VLDLs); e ApoC em IDLs e VLDLs. Cada
b′
d a′
classe de apolipoproteína é genética e estruturalmente
distinta (ver Correlação Clínica 3.6). As apolipoproteínas
f′ variam de 6 kDa (ApoC-I) até 550 kDa para ApoB-100.
f
A última é um longo polipeptídeo (4.536 aminoácidos) e
b a d′ ocorre em forma truncada (apenas os 2.512 resíduos N
c′ -terminais) como ApoB-48 em quilomícrons.
e g′

FIGURA3.45 Interação de bordas apolares de duas
cadeias em conformação em a-hélice na queratina e na
tropomiosina.
É apresentada a interação de resíduos apolares d-a e a!-d de
duas a-hélices alinhadas paralelas na direção NH2-terminal
(superior) para COOH-terminal.
Redesenhado de McLachlan, A. D., e Stewart, M. J. Mol. Biol.
98:293, 1975.
Um modelo para a estrutura de uma partícula de
VLDL é mostrado na Figura 3.47. No lado de dentro estão
lipídeos neutros como ésteres de colesterol e triacilglice
róis. Em torno desse núcleo interno de lipídeos neutros,
há uma capa de ~20 Å de espessura, na qual residem as
proteínas e os lipídeos anfotéricos carregados como co
lesterol não esterificado e fosfatidilcolinas (p. 479). Li
pídeos anfotéricos e proteínas na capa externa colocam
suas regiões apolares hidrofóbicas em direção ao lado in
terno da partícula, e seus grupos carregados em direção
ao lado externo, onde interagem entre si e com a água.
112 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

TABELA 3.13 Classes de Densidade Hidratada de Lipoproteínas Plasmáticas

Fração de Densidade Taxa de Flutuação, Sf Peso Molecular Diâmetro da

Lipoproteína (gmL–1) (unidades Svedberg) (daltons) Partícula (Å)
HDL 1,063–1,210 HDL2, 4 × 105 70–130
HDL3, 2 × 105 50–100
LDL (ou LDL2) 1,019–1,063 0–12 2 × 106 200–280
IDL (ou LDL1) 1,006–1,019 12–20 4,5 × 106 250
VLDL 0,95–1,006 20–400 5 × 106–107 250–750
Quilomícrons < 0,95 > 400 109–1010 103–104
Fonte: Dados de Soutar, A. K. e Myant, N. B. Em: Offord, R.E. (Ed.), Chemistry ofMacromolecules, IIB. Baltimore, MD: University Park Press, 1979.

Classe HDL LDL IDL VLDL Quilomícrons

1.21 1.063 1.019
Densidade 1.006 0.95

a
n
i
é
t
o
r
p
o
p
il
e
d
o
ã
ç
a
rt
n
e
c
n
o
C

Origem

Pre-β

FIGURA 3.46 Correspondência entre densidade das classes de lipoproteínas

plasmáticas e mobilidade eletroforética em uma eletroforese de plasma.
No diagrama superior, é apresentado um padrão de ultracentrifugação de Schlieren. No
inferior, eletroforese em um suporte de papel mostra as mobilidades das principais clas
ses de lipoproteínas plasmáticas com relação às bandas de a- e b-globulinas.
Reproduzido com permissão de Soutar, A. K. e Myant, N. B. Em: Offord, R.E. (Ed.), Che
mistry of Macromolecules, IIB, Baltimore, MD: University Park Press, 1979.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 113

CORRELAÇÃO CLÍNICA 3.3

Hiperlipoproteinemias

Hiperlipoproteinemias (OMIM 608083) são erros
nas taxas de síntese ou depuração de lipoproteínas da
corrente sanguínea. Geralmente são detectadas por do
sagem de triacilglicerol e colesterol plasmáticos, e são
classificadas com base na classe de lipoproteína elevada.
A hiperlipoproteinemia tipo I deve-se ao acúmulo
de quilomícrons. Duas formas genéticas são conheci
das: deficiência de lipoproteína lipase e deficiência de
ApoCII. ApoCII é necessária para completa atividade da
lipoproteína lipase. Pacientes com hiperlipoproteine
mia tipo I têm concentrações extremamente elevadas
de triacilglicerol plasmático (acima de 1.000 mg/dL) e
sofrem de xantomas eruptivos (depósitos amarelados
de triacilglicerol na pele) e pancreatite.
A hiperlipoproteinemia tipo II caracteriza-se por
níveis elevados de LDL. A maioria dos casos deve-se a
defeitos genéticos na síntese, no processamento ou na
função do receptor de LDL. Heterozigotos têm níveis
elevados de LDL; portanto, essa característica é ex
pressa de forma dominante. Pacientes homozigotos têm
níveis muito elevados de LDL e podem sofrer infarto do
miocárdio antes dos 20 anos de idade.
A hiperlipoproteinemia tipo III deve-se a anomalias
em ApoE, que interferem com a captação de quilomí
crons e remanescentes de VLDL. O hipotireoidismo
pode produzir uma hiperlipoproteinemia muito seme
lhante. Esses pacientes têm risco aumentado de ateros
clerose.
A hiperlipoproteinemia tipo IV é a anomalia mais
comum. Os níveis de VLDL são aumentados, frequente
mente devido à obesidade, ao abuso de álcool ou diabe
tes. Formas familiares são também conhecidas.
A hiperlipoproteinemia tipo V é, como a tipo I, as
sociada com altos níveis de triacilglicerol de quilomí
crons, pancreatite e xantomas eruptivos.
A hipercolesterolemia também ocorre em certos ti
pos de doenças do fígado, nas quais a excreção biliar
de colesterol está reduzida. Uma lipoproteína anormal
chamada lipoproteína X acumula-se. Essa doença não
está associada com aumento de doença cardiovascular
resultante de aterosclerose.
Havel, R. J. e Kane, J. P. Introduction: Structure and meta
bolism of plasma lipoproteins. Em Scriver, C. R., Beaudet, A.
L., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.), The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8. ed. New York: McGraw-Hill,
2001, Cap. 114; e Goldstein, J. L., Hobbs, H. H. e Brown, M. S.
Familial hypercholesterolemia. Em: Scriver, C. R., Beaudet,
A. L., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.), The Metabolic and Mole
cular Bases of Inherited Disease, 8. ed. New York: McGraw
-Hill, 2001, Cap. 120.

TABELA 3.14 Apoliproteínas de Lipoproteínas Plasmáticas Humanas (Valores em Porcentagem do Total de Proteínas
Presentes)a

Apolipoproteína HDL2 HDL3 LDL IDL VLDL Quilomícrons

ApoA-I 85 70–75 Traços 0 0–3 0–3
ApoA-II 5 20 Traços 0 0–0,5 0–1,5
ApoD 0 1–2 0 1
ApoB 0–2 0 95–100 50–60 40–50 20–22b

ApoC-I 1–2 1–2 0–5 <1 5 5–10

ApoC-II 1 1 0,5 2,5 10 15
ApoC-III 2–3 2–3 0–5 17 20–25 40
ApoE Traços 0–5 0 15–20 5–10 5
ApoF Traços Traços
ApoG Traços Traços
Fonte: Dados de Soutar, A. K. e Myant, N. B. Em: Offord, R.E. (Ed.), Chemistry ofMacromolecules, IIB, Baltimore, MD: University Park Press, 1979;
Kostner, G. M. Adv. Lipid. Res. 20:1, 1983.
aValores mostram variabilidade entre diferentes laboratórios.
bPrimariamente ApoB-48.
114 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

CORRELAÇÃO CLÍNICA 3.4

Hipolipoproteinemias

A abetalipoproteinemia é uma doença genética ca A deficiência da enzima lecitina:colesterolaciltrans

racterizada por ausência de quilomícrons, VLDLs e ferase é uma doença rara que resulta na produção de
LDLs devido a uma incapacidade de sintetizar apolipo lipoproteína X. Também característica é a diminuição
proteínas apoB-100 e apoB-48. Ocorre acúmulo de go nas bandas de a-lipoproteína e pré-b-lipoproteína e o
tículas de lipídeo em células do intestino delgado, má aumento na b-lipoproteína em virtude da presença de
absorção de gordura, acantocitose (glóbulos vermelhos lipoproteína X na eletroforese.
com “espinhos”) e doença neurológica (retinite pigmen
Kane, J. P. e Havel, R. J. Disorders of the biogenesis and
tosa, ataxia e retardo).
secretion of lipoproteins containing the b apoliproteins. Em:
A Doença de Tangier, uma deficiência de a-lipopro Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.),
The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,
teína, é uma doença autossômica recessiva rara na qual
8. ed. New York: McGraw-Hill, 2001, Cap. 115; Assmann, G.,
o nível de HDL é 1–5% do seu valor normal. As caracte von Eckardstein, A. e Brewer, H. B. Jr. Familial high densi
rísticas clínicas devem-se ao acúmulo de colesterol no ty lipoprotein deficiency: Tangier disease. Em: Scriver, C.
sistema linforreticular, o que pode levar a hepatome R., Beaudet, A.L., Sly, W.S. e Valle, D. (Eds.), The Metabolic
galia e esplenomegalia. O colesterol e os fosfolipídeos and Molecular Bases of Inherited Disease, 8. ed. New York:
plasmáticos ficam muito reduzidos. McGraw-Hill, 2001, Cap. 122.

C Esse modelo de lipoproteína

E
como partícula aplica-se a todas
C–II
as lipoproteínas plasmáticas. À
E E E EE E EE
E E
E E
E E E E
EEE
B
E E EE E medida que o diâmetro da partí
E E E EEE EE EE C–I E E EE
E
E E E EE E
E E EE
EE EE E E E E E EE cula diminui, a camada externa
EE EE E E E E E EE
E E E E E E E EE EE E E E E E E EE E E E E corresponde a uma porcentagem
E EE E E E E
E EE E E E EE E E E
E E E E E E E EE E E E maior do total da partícula. Assim,
E E E E E E EE E EE EE EE E EE E E E E EE E EE
E E
E E E
E EE E E
E E E EE E EE E EE E E EE EE E EE EE EE C–III as partículas menores têm uma
E E
E EE EEEEEEEEE E E E E E E E EE
EE E E E porcentagem maior de moléculas de
E EE E EE
EE E E EEEE
EEEE
EEE E E EE E EE E EEE E
E
EE E
E
E E E E
EE EEE EEEEEE E E EEEEEE
E
E E
proteínas de superfície e de lipídeos
E A–I
anfotéricos do que as partículas
B
E maiores. As partículas de HDL, que
VLDL são muito menores do que as de
VLDL, portanto consistem de 45%
QUILOMÍCRON
proteína e 55% lipídeo, enquanto
as partículas de VLDL consistem
A–II A–I
E
de 10 % proteína e 90% lipídeo
B (Tabela 3.15).
E E
As apolipoproteínas têm alto
E
E
conteúdo de a-hélice quando em
(a) HDL E
E associação com lipídeos. Suas re
giões helicoidais são anfipáticas,
LDL
t

R FIGURA 3.47 Estrutura geral de lipoproteínas plasmáticas.

E (a) Modelo de partícula esférica consistindo de um núcleo de triacilagliceróis
(“Es” em amarelo) e ésteres de colesterol (gotinhas laranja) com uma capa
E de ~20 Å de apoliproteínas (letras), fosfolipídeos e colesterol não esterifica
E E
r
E do. Apoliproteínas ficam embebidas com suas bordas hidrofóbicas orientadas
em direção ao núcleo e suas bordas hidrofílicas, em direção ao lado externo.
(b) Partícula de LDL mostrando ApoB-100 mergulhada na capa externa da
partícula.
Parte (a) redesenhada a partir de Segrest, J. P., et al. Adv. Protein. Chem.
ApoB 45:303, 1994; e parte (b) redesenhada de Schumaker, V. N., et al., Protein
(b) LDL
Chem. 45:205, 1994.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 115

TABELA 3.15 Composição Química das Classes de Lipoproteínas Plasmáticas

Lipoproteína
Classe de Proteína
Total
(%) Lipídeo(%) Composição em Porcentagem da Fração Lipídica
Fosfolipídeos Esterificado
Colesterol NãoColesterol
esterificado Triacilgliceróis

HDL2a 40–45 55 35 12 4 5
HDL3a 50–55 50 20–25 12 3–4 3

LDL 20–25 75–80 15–20 35–40 7–10 7–10

IDL 15–20 80–85 22 22 8 30
VLDL 5–10 90–95 15–20 10–15 5–10 50–65
Quilomícrons 1,5–2,5 97–99 7–9 3–5 1–3 84–89
Fonte: dados de Soutar, A. K. e Myant, N. B. Em: Offord, R.E. (Ed.), Chemistry ofMacromolecules, IIB, Baltimore, MD: University Park Press, 1979.
aSubclasses de HDL.

uma vez que cada terceiro ou quarto aminoácido é
carregado. Esses resíduos formam uma borda polar
que se associa com as cabeças polares dos fosfolipíde
os e o ambiente aquoso. Os lados opostos das hélices
têm cadeias laterais hidrofóbicas que são orientadas
em direção ao centro não polar da partícula lipopro
teica. A estrutura a-helicoidal de parte da ApoC-I é
mostrada na Figura 3.48. ApoB contém segmentos
de a-hélice e de fita-b. Um único po
lipeptídeo longo de ApoB-100 contorna
a circunferência da partícula de LDL,
como um cinto que se entrelaça para
Glu
dentro e para fora da capa fosfolipídica
hormônios, neurotransmissores e vírus. Tumorigênese
e transformação maligna estão associadas com mudan
ças na composição em glicoproteínas das membranas
plasmáticas. Na matriz extracelular, muitas proteínas
(p. ex., colágeno e laminina) contêm carboidratos liga
dos, assim como proteínas de secreções mucosas que
lubrificam e protegem superfícies. As principais proteí
nas plamáticas (mas não albumina) são glicoproteínas,
–
Leu
Ser Lys

externa (Figura 3.47). Ser

Met

+ Ala
Arg
Lys
+
Glicoproteínas Contêm
Arg Trp
Glu Phe
Carboidratos Ligados –

Covalentemente Trp
Thr

glicoproteínas contêm um ou múlti Ser Phe

Lys
plos aminoácidos covalentemente liga –
Val
dos a moléculas de carboidratos (açú Glu Gln
cares). As glicoproteínas participam de
+
muitas funções normais e relacionadas Lys Lys
a doenças de relevância clínica. As gli Lys +
coproteínas mais bem caracterizadas Lys Leu
são as da superfície externa da membra
na plasmática, da matriz extracelular e – Glu
do plasma sanguíneo. As da membrana +
plasmática fornecem informação para Lys
identificação de células por outras célu
las e para regulação do crescimento ce Face polar Face não polar
lular por inibição por contato. Também
FIGURA3.48 Cadeias laterais de um segmento anfipático helicoidal da
fornecem determinantes antigênicos
apoproteína C1 entre os resíduos 32 e 53.
dos vários sistemas de grupos sanguí A face polar mostra resíduos ácidos no centro e resíduos básicos na borda. No outro
neos (p. ex., ABO e Rh) em eritrócitos, lado da hélice, resíduos hidrofóbicos formam uma face longitudinal não polar.
histocompatibilidade em transplantes Reproduzido com permissão de Sparrow, J. T. e Gotto, A. M. Jr. CRC Crit. Rev.
de tecidos, e receptores celulares de Biochem. 13:87, 1983. Direitos autorais (1983) da CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.
116 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

incluindo proteínas da coagulação do sangue, imuno comum para a mesma proteína, mesmo em um único or
globulinas, proteínas do complemento e hormônio fo ganismo. Por exemplo, as formas A e B da ribonuclease
lículo estimulante, hormônio luteinizante e hormônio pancreática têm sequências de aminoácidos idênticas,
tiróide estimulante. mas diferem em sua composição em carboidratos.

A quantidade de carboidratos em glicoproteínas é A incorporação de carboidratos ocorre em uma sé

variável. IgG contém 4% em peso, glicoforina da mem rie de reações catalisadas por enzimas, à medida que a
brana do eritrócito humano 60%, e glicoproteína gás cadeia polipeptídica é transportada pelo retículo endo
trica humana 82%. O carboidrato pode ser distribuído plasmático e complexo de Golgi (p. 17).
uniformemente ao longo da cadeia polipeptídica ou con
centrado em regiões definidas. Em proteínas da mem
brana plasmática, os carboidratos ficam ligados apenas Ligações Covalentes Carboidrato
na porção extracelular. Os carboidratos ligados geral
mente contêm menos de 15 resíduos de açúcares e, em
Proteína
alguns casos, apenas um. Glicoproteínas com a mesma As duas ligações de carboidratos mais comuns são
função de diferentes espécies animais frequentemente a ligação N-glicosídica (ligação tipo I) entre o grupo
têm sequências homólogas, mas variam em seus carboi amida de uma asparagina e um açúcar, e a ligação O
dratos. Heterogeneidade no conteúdo de carboidratos é -glicosídica (ligação tipo II), entre um grupo hidroxila
de uma serina ou treonina e um açúcar (Figura 3.49).
HO
H CH2OH
H O NH2
No tipo I, a ligação é com asparagina na sequência Asn
O H -X-Thr(Ser). As glicoproteínas de mamíferos também
HO
H H COOH
NH CCH2C contêm ligações O-glicosídicas em 5-hidroxilisina (li
OH NH H
H gação tipo III). Esta ocorre em colágenos e na proteína
sérica do complemento C1q. Menos comuns são as li
gações ao grupo hidroxila de 4-hidroxiprolina (ligação
tipo IV), ao tiol de uma cisteína (ligação tipo V) e a
C O um α-amino grupo de uma cadeia polipeptídica (liga
CH3 ção tipo VI). Altas concentrações de ligações tipo VI
são formadas não enzimaticamente entre a hemoglobi
Tipo I Ligação N-Glicosídica à asparagina
na e a glicose sanguínea no diabetes não controlado.
O ensaio de hemoglobina glicosilada é utilizado para
OHCH2 NH2 acompanhar as alterações na concentração de glicose
O no sangue (Correlação Clínica 3.5).
OCH2C COOH
H
OH
H HH
NH H

3.7 DOBRAMENTO (FOLDING)

CO
DE PROTEÍNAS DE
CH3 ESTRUTURAS ALEATÓRIAS
Tipo II Ligação O-Glicosídica à serina
PARA ESTRUTURAS
NH2 SINGULARES: ESTABILIDADE
CH2OH

O
CH2 DA PROTEÍNA
H
O CH
H
OH H
HO H
CH2 O Problema de Dobramento de
CH2
H OH Proteínas
H2N CH
A capacidade de a estrutura primária de uma pro
COOH
teína dobrar espontaneamente em sua conformação
Tipo III Ligação O-Glicosídica à 5-hidroxilisina secundária ou terciária nativa, sem qualquer informa
ção além da sequência de aminoácidos e das forças
FIGURA3.49Exemplos de ligações glicosídicas com não-covalentes que agem sobre essas sequências, tem
aminoácidos em proteínas. sido demonstrada para muitas proteínas. Assim, a ri
Tipo I é uma ligação N-glicosídica com o nitrogênio amida de
bonuclease pancreática espontaneamente assume sua
Asn; tipo II é uma ligação O-glicosídica com o OH de Ser ou
Thr; e tipo III é uma ligação O-glicosídica com o 5-OH de 5-hi conformação nativa depois de ter sido desnaturada, e
droxilisina. suas pontes dissulfeto são reduzidas sem a hidrólise de

CORRELAÇÃO CLÍNICA 3.5
Hemoglobina Glicosilada, HbA1c
Uma hemoglobina glicosilada, designada por HbA1c,
é formada não enzimaticamente em glóbulos vermelhos
por combinação do grupo amino do NH2-terminal da
cadeia b da hemoglobina com a glicose. A forma aldeí
do da glicose primeiro forma uma base de Schiff com o
grupo amino NH2-terminal,
H OH
N C C cientes diabéticos podem ser usadas para acompanhar
H
que depois se rearranja para uma ligação amino cetona
mais estável,
H H O
C
N C
ligações peptídicas. Tais observações levaram à hipó
tese de que uma sequência polipeptídica promova do
bramento espontâneo a sua conformação ativa peculiar
sob condições corretas de solvente e em presença de
grupos prostéticos que podem ser parte de sua estru
tura. Como descrito a seguir, proteínas chaperones po
dem facilitar a velocidade de dobramento da proteína.
Estruturas quaternárias também se organizam espon
taneamente, depois que a estrutura terciária das subu
nidades se formou.
Pode parecer surpreendente que uma cadeia poli
peptídica se dobre em uma única conformação pecu
liar, dadas todas as possíveis conformações rotacionais
disponíveis em torno de ligações simples em sua estru
tura primária. Por exemplo, a cadeia a da hemoglobina
contém 141 aminoácidos, e existem pelo menos quatro
ligações simples por resíduo de aminoácido, em torno
das quais pode ocorrer livre rotação. Se cada ligação,
em torno da qual livre rotação ocorre, tiver dois ou mais
rotâmeros estáveis acessíveis a ela, haveria um mínimo
de 4141 ou 5 × 1086 conformações possíveis para o poli
peptídeo da cadeia a.
A conformação de uma proteína é a de menor ener
gia livre de Gibbs acessível à sua sequência, dentro de
um espaço de tempo fisiológico. Assim, o dobramento
está sob controle termodinâmico e cinético. Embora o
conhecimento detalhado do dobramento de novo de
um polipeptídeo tenha sido proposto apenas para al
guns poucos exemplos, até o momento, o envolvimento
de certos processos parece razoável para a maioria das
CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 117
por uma reação espontânea conhecida como rearranjo
de Amadori. A concentração de HbA1c depende da con
centração de glicose no sangue e da duração da hiper
glicemia. Na hiperglicemia prolongada, a concentração
pode chegar a 12% ou mais da hemoglobina total. Pa
cientes com diabetes mellitus têm altas concentrações
de glicose no sangue e, portanto, grande quantidade de
HbA1c. As mudanças na concentração de HbA1c em pa
a eficácia do tratamento do diabetes.
Bunn, H. F. Evaluation of glycosilated hemoglobin in dia
betic patients. Diabetes 30:613, 1980; e Brown, S. B. e Bowes,
M. A. Glycosilated haemoglobins and their role in manage
ment of diabetes mellitus. Biochem. Educ. 13:2, 1985.
reações de dobramento. Existem evidências de que o
dobramento se inicie por interações não covalentes de
curto alcance entre uma cadeia lateral e seus vizinhos
mais próximos, que formam estruturas secundárias
em pequenas regiões do polipeptídeo. Cadeias laterais
específicas têm uma propensão de promoverem a for
mação de a-hélices, fitas-b e voltas ou dobras agudas
(b-turns) no polipeptídeo. Tais regiões do polipeptí
deo, chamadas sítios de iniciação, assumem espon
taneamente uma estrutura secundária. As estruturas
parcialmente dobradas, então, interagem entre si para
formar um estado de glóbulo fundido. Este é um inter
mediário condensado da via de dobramento, que con
tém muitos dos elementos de estrutura secundária da
conformação nativa, mas muitas interações incorretas
de estrutura terciária. As regiões de estrutura secun
dária no estado de glóbulo fundido são muito móveis
um em relação ao outro, e o glóbulo fundido está em
rápido equilíbrio com o estado completamente desdo
brado. As interações corretas de alcance médio e longo
entre diferentes sítios de iniciação são encontradas por
rearranjos dentro do glóbulo-fundido, e a conformação
nativa de baixa energia livre da cadeia polipeptídica
é formada. Segue-se a formação de pontes dissulfeto
(cistinas). A etapa determinante da velocidade de do
bramento e desdobramento da conformação nativa fica
entre o glóbulo-fundido e a estrutura nativa. Para algu
mas proteínas podem existir duas ou mais conforma
ções dobradas termodinamicamente estáveis, de baixa
energia livre de Gibbs. A Correlação Clínica 3.6 contém
uma discussão sobre o dobramento de proteínas e agen
tes infecciosos príons.
118 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

CORRELAÇÃO CLÍNICA 3.6

Doenças de Príons e Proteínas Como Agentes Infecciosos: Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis

Humanas (TSEs)

As proteínas príons são capazes de atuar como agen
tes infecciosos em ausência de DNA ou RNA. A doença
do príon no homem também pode aparecer espontane
amente (doença esporádica) ou em virtude de heran
ça de um gene mutado da proteína príon. A doença
caracteriza-se por ataxia, demência e paralisia, e é qua
se sempre fatal. O exame patológico do cérebro mostra
placas amilóides e degeneração espongiformes (vacuo
lar).
Na doença do príon, PrPc refere-se à conformação
celular muito solúvel da proteína príon, e PrPSc à con
formação insolúvel tóxica isolada originalmente de ovi
nos com a paraplexia enzoótica (Sc, scrapie). A prote
ína PrPc solúvel contém três segmentos em a-hélices e
dois em folha-b (Figura 1 Correlação Clínica).
A conversão para a forma PrPSc tóxica caracteriza
-se pela conversão de um segmento a-hélice em uma
fita-b, com a provável indução de fitas-b adicionais na
extremidade N-terminal da cadeia polipeptídica, an
teriormente indefinida (Figura 1 Correlação Clínica).
A conformação PrPSc inicia outras moléculas de príon
PrPc a se converterem na conformação PrPSc e, por in
teração de fitas-b entre moléculas de PrPSc, polimeriza
em fibras amilóides. A formação do polímero amilóide é
irreversível e, no cérebro, leva à morte das células neu
ronais. Em várias outras doenças neurodegenerativas
semelhantes, ocorre equilíbrio conformacional entre
uma conformação solúvel, preferencialmente em a-hé
lice, e uma conformação menos solúvel, contendo fita-b,
da proteína, com as proteínas contendo fita-b polimeri
zando em fibrilas amilóides insolúveis (Figura 2 Cor
relação Clínica). A unidade proteica difere com o tipo
de doença, mas as placas formadas têm todas estrutu
ra semelhante da fibrila amilóide (Figura 2 Correlação
Clínica). Doenças neuronais importantes induzidas por
amilóide incluem Alzheimer, Parkinson, Huntington e
esclerose lateral amiotrófica (ELA, Lou Gehrig).

FIGURA 1 Correlação Clínica. Estrutura das Formas do Príon.

(a) Estrutura de dobra de PrP (PrPc). Aproximadamente 120 resíduos de amino
ácidos da extremidade N-terminal não são observados. (b) Modelo da estrutura
de dobra da PrP tóxica (PrPSc), na qual um segmento em a-hélice da conforma
ção PrPc forma uma fita-b, bem como fitas-b agora formadas, a partir da região
de alça na estrutura PrPSc e do segmento N-terminal da cadeia polipeptídica.
Figura do Website do Dr. Fred Cohen, University of California, San Francisco.

FIGURA 2 Correlação Clínica. Micrografia eletrônica da estrutura de

fibrila amilóide em virtude da polimerização de fitas-ß de um domínio
SH3 da PI3 quinase.
As fibrilas são semelhantes às observadas em doenças neuronais que produzem
amilóide. A barra de escala é 100 nm.
Reproduzido com permissão de Guijarro, J. I., Sunde, M., Jones, J. A., Campbell,
I. D. e Dobson, C. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4224, 1998.

FIGURA 3 Correlação Clínica. Mecanismo de formação da fibra amilóide iniciada por PrPSc.
A proteína príon é uma glicoproteína contendo mo
léculas de carboidratos ligadas covalentemente em um
lipídeo fosfatidilinositol. O lipídeo ancora a proteína
príon no lado extracelular da membrana plasmática.
A proteína PrPc na membrana plasmática funciona em
conjugação com proteínas receptores de membrana na
transmissão de sinais extracelulares para a célula.
A doença do príon no homem é pleiotrópica, com o
fenótipo dependendo da causa da doença (esporádica,
hereditária ou infecciosa) e o tipo de polimorfismos
presentes nos genes do príon de um indivíduo. Existem
múltiplos polimorfismos do gene do príon na população
humana, com mais de 50 mutações reportadas. A ini
ciação da formação do amilóide por uma molécula de
PrPSc “semente” (iniciadora) pode acontecer por três
vias diferentes: (a) doença esporádica iniciada pela
mudança de conformação espontânea de uma molécu
la normal de PrPc para a conformação PrPSc, (b) pro
teínas PrPScinfectantes introduzidas por ingestão de
carne contaminada com PrPSc ou introdução de PrPSc
exógeno por outras vias, e (c) herança de um gene de
príon mutado, cujo produto gênico tem capacidade
de se dobrar espontaneamente e mais facilmente na
conformação PrPSc. Os fenótipos hereditários incluem
a síndrome de Gerstmann–Sträussler–Scheinker e a
insônia familiar fatal. A doença esporádica resulta na
Doença de Creutzfeldt–Jakob (CJD) e é geralmente fa
tal em um ano após o início da doença. A incidência da
CJD é 1 caso por 1 milhão por ano em todo o mundo,
ou aproximadamente 300 casos por ano nos Estados
Unidos. A doença esporádica corresponde a aproxima
CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 119
damente 85%, formas hereditárias a 15%, e a doença
infecciosa a menos de 1% das doenças de príons.
A doença do príon causada por proteína PrPSc in
fecciosa exógena é a mais interessante, porque mostra
a capacidade de uma proteína atuar como um agente
infeccioso em ausência de DNA ou RNA. Seres huma
nos podem adquirir a doença do príon por ingestão de
príons bovinos com a conformação PrPSc em carne con
taminada de gado com encefalite espongiforme trans
missível bovina (BSE; doença da vaca louca). A doença,
variante da Doença de Creutzfeldt–Jakob (vCJD), tem
um fenótipo diferente da CJD esporádica. A idade me
diana de início da vCJD é 28 anos, e 68 anos para a CJD
esporádica. A duração da doença é aproximadamente
14 meses para vCJD e 5 meses para a CJD esporádi
ca. Os Centros de Controle de Doenças (CDC) identi
ficaram um total de 195 casos de vCJD até agosto de
2006, dos quais 162 no Reino Unido, 20 na França e 2
nos Estados Unidos. O período de incubação do tempo
da infecção até o início de manifestação da doença é de,
aproximadamente, 10 anos. A infecção por BSE parece
ser seletiva para idade. Como o pico de diagnóstico nos
Estados Unidos aconteceu entre 1994 e 1996 em pacien
tes com uma idade mediana de 28 anos, a infecção deve
ter ocorrido em torno de 1984-1986, com uma idade me
diana para os indivíduos infectados de 18 anos.
Uma segunda via infecciosa significativa é iatrogêni
ca. Entre 1985 e 1996, foram registrados 136 casos de
vCJD em todo o mundo em pacientes tratados com hor
mônio de crescimento derivado de pituitária humana,
120 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
e 136 casos de pacientes que receberam transplante de
dura mater de cadáver. Um pequeno número de CJDs
iatrogênicas foram causadas por outros procedimentos,
como transplante de córnea, transfusão de sangue e
tratamento com gonadotropina humana.
Dois mecanismos foram sugeridos para a formação
da placa amilóide iniciada por um príon infeccioso
(Figura 3 Correlação Clínica). No mecanismo de Nu
cleação-Polimerização (a), PrPc (verde) está em rápido
equilíbrio com a conformação PrPSc (marrom) (etapa
1), mas a polimerização em uma fibra amilóide é len
ta (etapa 2) na ausência de uma molécula iniciadora. A
introdução de príon infectante PrPSc (laranja) nucleia
o processo de polimerização (etapa 3). O processo é
Proteínas Chaperones Ajudam
o Processo de Dobramento de
Proteínas
As células contêm proteínas que facilitam o pro
cesso de dobramento. Estas incluem cis-trans-prolil
isomerases, proteína dissulfeto isomerases e proteínas
chaperones. As cis-trans-prolil isomerases intercon
vertem ligações peptídicas cis- e trans- de resíduos de
prolina. Isso permite que se forme a conformação cor
reta da ligação peptídica prolil para cada prolina, como
exigido pela conformação nativa. Proteína dissulfeto
isomerases catalisam a quebra e a formação de pontes
dissulfeto cistina, de modo que as ligações incorretas
não sejam estabilizadas e o arranjo correto de ligações
para conformação nativa seja rapidamente atingido.
As Proteínas chaperones foram descobertas como
proteínas de choque térmico (hsps, heat shock pro
teins), uma família de proteínas cuja síntese aumenta
em temperaturas elevadas. As chaperones não alteram
o resultado final do processo de dobramento, mas impe
dem a agregação de proteínas antes que o dobramento
se complete e impedem a formação de produtos finais
metastávéis ou de intermediários não produtivos. As
chaperones da família de hsp70-kDa ligam-se a poli
peptídeos à medida que são sintetizadas nos ribosso
mos, bloqueando as superfícies hidrofóbicas que esta
riam normalmente expostas ao solvente. Isso protege
a proteína de agregação até que a cadeia inteira tenha
sido sintetizada e o dobramento possa ocorrer. Algu
mas proteínas, entretanto, não podem completar seu
processo de dobramento enquanto estão em presença
de chaperones hsp70 e são entregues à família hsp60
(GroEL em Escherichia coli) de proteínas chaperones,
também chamadas chaperoninas. As chaperoninas são
estruturas longas, cilíndricas, com múltiplas subunida
des, que ligam polipeptídeos não dobrados em seu es
tado de glóbulo-fundido dentro de sua cavidade central
propagado por fragmentos do polímero recém-gerado
(etapa 5).
No mecanismo Dirigido por Molde (b), o príon PrPSc
serve como um molde para promover a mudança de
conformação do PrPc em PrPSc (etapas 1 e 2). Uma vez
convertido em PrPSc, o PrPSc rapidamente polimeriza
em fibrilas insolúveis.
Aguzzi, A. e Polymenidou, M. Mammalian prion biology:
One century of evolving concepts. Cell 116:313, 2004; Collin
ge, J. e Clarke, A. R. A general model of prion strains and their
pathogenicity. Science 318:930, 2007; e Soto, S., Estrada, L.
e Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious na
ture of misfolded protein aggregates. Trends Biochem. Sci.
31:150, 2006.
hidrofóbica. As chaperoninas têm atividade de ATPase
e hidrolisam ATP enquanto facilitam o dobramento. O
dobramento assistido por chaperonina hsp60 em E. coli
é apresentado na Figura 3.50. As proteínas chaperones
são também necessárias para o redobramento de pro
teínas após atravessarem membranas celulares. Um sis
tema de chaperones facilita o transporte de proteínas
para dentro das mitocôndrias, bem como para dentro e
através do retículo endoplasmático. Proteínas atraves
sam a bicamada lipídica das membranas mitocondriais
e do retículo endoplasmático em uma conformação não
dobrada, e chaperones locais são geralmente necessá
rias para facilitar seu dobramento dentro da organela
intracelular.
Forças Não-Covalentes Levam
ao Dobramento da Proteína e
Contribuem para a Estabilidade da
Proteína
As forças não-covalentes levam um polipeptídeo a
se dobrar numa conformação singular e, então, estabi
lizam a estrutura nativa contra desnaturação. As forças
não covalentes são forças de ligação fracas com forças
de 4-29 kJ/mol (1-7 kcal/mol). Isso pode ser comparado
com as ligações covalentes, que têm força de ligação de,
no mínimo, 210 kJ/mol (50 kcal/mol) (Tabela 3.16). Em
bora individualmente fracos, o grande número de con
tatos não covalentes dentro de uma proteína confere
um grande fator energético que promove o dobramento
da proteína.
Forças de Interação Hidrofóbica
Importantes forças não-covalentes que levam um
polipeptídeo a se dobrar em sua estrutura nativa são
as forças de interação hidrofóbica. Sua força não se
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 121

(iv)

(a) (b) (d) ADP ADP ATP +

140 Å 33 Å (e)
80 Å ATPase
10 Å GroES

GroES (i) não-nativos

Estados (ii)
ATP (iii)
não-nativos
Estados Estados (v)
ATP ATP ATPATP ADP ADP
80 Å
184 Å DP ATP ATP

GroEL

71 Å

180
ATPATP +ADP

(c)
(vi)

não-nativos

cis
GroES
a
igrenE

trans Intermediário Intermediário Intermediário

GroES cineticamente retido cineticamente retido cineticamente retido

Proteína nativa Proteína nativa Proteína nativa

Espontâneo Espontâneo Confinamento

FIGURA 3.50 O sistema chaperonina GroEL-GroES para
dobramento de proteínas.
(a) Modelo de preenchimento de espaço do complexo cha
peronina inteiro, em uma vista de cima olhando para baixo, a
partir da proteína da “tampa” ou cap GroES. GroES liga-se ao
lado cis de GroEL. GroES tem 7 subunidades polipeptídicas de
peso molecular 10 kDa, e as estruturas cilíndricas cis e trans
GroEL são compostas cada uma por 7 subunidades polipeptídi
cas (total 14), cada uma com 60 kDa. (b) mesmo que (a), mas
em vista lateral, com o anel trans GroEL em vermelho, o anel
cis GroEL em verde, e o cap GroES em dourado. (c) Desenho
de fitas de um corte passando pelo centro do complexo chape
ronina mostrando cavidades internas das secções cilíndricas
cis e trans, onde proteínas desnaturadas entram e ocorre seu
dobramento. (d) Esquema simplificado do dobramento de pro
teína facilitado por GroEL. (i) A proteína desnaturada (linha
curva preta) entra em GroEL e liga-se na cavidade com alta
afinidade, (ii) ATP liga-se a um anel produzindo uma confor
mação alterada, (iii) o anel ligado a ATP liga GroES para se
questrar a proteína desnaturada na câmara de dobramento e
uma grande mudança conformacional no anel ligado a GroES
abre a proteína desnaturada para desfazer sua conformação
não produtiva e depois libera a proteína na cavidade expandida
para dobrar espontaneamente, (iv) a proteína dobra-se dentro
da câmara e ATP é hidrolisado, (v) o ATP liga-se ao anel trans,
o que libera GroES e a proteína dobrada, e (vi) uma nova pro
teína é encapsulada. (e) Diagramas de energia livre para o do
bramento de proteínas. Esquerda: dobramento da proteína em
ausência de chaperonina resulta em um intermediário retido
cineticamente. Meio: no dobramento em chaperonina, empur
rar e liberar (annealing) dissocia intermediários retidos e dá à
proteína chances adicionais de se dobrar sem ser retida. Direi
ta: além disso, a cavidade GroEL alisa o panorama energético
para evitar a formação de certos intermediários retidos.
(a), (b) e (c) reproduzidas com permissão de Xu, Z. H., Horwi
cz, A. L. e Sigler, P. B. Nature 388:741, 1997; (d) reproduzida
com permissão de Saibil, H. R. e Ranson, N. A. Trends Bio
chem. Sci. 27:627, 2002, e Ranson, N.A. et al., Cell 107:869,
2001; (e) redesenhado de Ulrich, F., Hartl, F. e Hayer-Hartl, M.
Science 295:1852, 2002. Direitos autorais (2002) AAAS.

TABELA 3.16 Força de Ligações Encontradas em Estruturas de Proteínas

Força da Ligação
Tipo de Ligação
(kJmol –1) (kcal mol –1)
Covalente >210 >50
Não-covalente 2,5–29 0,6–7
Hidrofóbica (i.e. dois grupos de cadeia lateral benzil de Phe) 8–13 2–3
Hidrogênio 4–290 1–7
Iônica (ambiente dielétrico baixo) 4–25 1–6
van der Waals <4 <1
122 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

deve a nenhuma atração intrínseca entre grupos não Doador Aceptor

polares, mas sim às propriedades da água que circunda OC

os grupos não polares. Uma cadeia lateral não polar ou N H O C
uma região de uma molécula de proteína dissolvida em Peptídeo Peptídeo
NH
água induz uma capa de solvatação de água, na qual
as moléculas de água ficam muito ordenadas. Quando
duas cadeias laterais não polares se aproximam, a área
de superfície exposta ao solvente é reduzida e algumas Ser H HO
C CH2O H N NH
das moléculas de água da capa de solvatação, muito or
denadas, são liberadas no solvente geral. A entropia do His
sistema (ou seja, desordem das moléculas de água no H
sistema) aumenta. O aumento de entropia é termo CH2S
dinamicamente favorável e é a força motriz que leva H
grupos não polares a se aproximarem no solvente Cys H2O
aquoso. Uma mudança favorável de energia livre de
8 kJ/mol (2 kcal/mol) para associação de duas cadeias O
laterais de fenilalanina em água deve-se a esse ganho
N+HO–C
CH2CH2
de entropia (Figura 3.51).
H
Na transição de conformação aleatória para secun Lys Glu
dária regular, como a-hélice ou estrutura-b, aproxima
FIGURA3.52 Algumas pontes de hidrogênio comumente
damente um terço da água de solvatação em torno do encontradas em proteínas.
polipeptídeo desdobrado é perdida para o solvente geral.

H Isso é perto de 2–4 kJ/mol (0,5–0,9

OH
H H kcal/mol) para cada resíduo de pep
H O H O H tídeo. Um terço adicional da capa de
H OH
O H H solvatação original é perdido quando
um polipeptídeo chega à sua confor
H O H
H H + moleculas H2 H H
mação nativa. Isso coloca diferentes
H O H O O
O segmentos da cadeia polipeptídica
H H
H
H H dobrada em íntima proximidade, com
O O
H
O O
H liberação de água de solvatação entre
HO HO esses segmentos.
H O H H O H
H
H H H
H
Pontes de Hidrogênio
Interação hidrofóbica
Pontes de hidrogênio se formam
quando um átomo de hidrogênio co
valentemente ligado a um átomo
eletronegativo é compartilhado com
um segundo átomo eletronegativo. O
átomo ao qual o átomo de hidrogênio
H OH
H O H no solvente geral
O liberadas H H está ligado é chamado átomo doador
O
H
de hidrogênio. O átomo com o qual o
O hidrogênio é compartilhado é o áto
H H mo aceptor de hidrogênio. Pontes de
O O H
hidrogênio típicas encontradas em
H H
H OH O proteínas são apresentadas na Figura
3.52. Conformações em a-hélice e fi
H ta-b têm muitas pontes de hidrogênio.
H H HHO
O OH H
A força de uma ponte de hidro
H HO H H
H O H O
OH gênio depende da distância entre os
átomos doador e aceptor. Energias
H
de ligação altas ocorrem quando essa
distância estiver entre 2,7 e 3,1 Å.
FIGURA3.51 Formação de interações hidrofóbicas entre dois grupos de cadeia De menor importância, mas não des
lateral de fenilalanina.
prezível, é a dependência da força da
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 123

ponte de hidrogênio quanto à geometria. Ligações de
energia mais alta são geometricamente colineares, com
os átomos doador, hidrogênio e aceptor dispostos em
uma linha reta. A constante dielétrica do meio em tor
no da ponte de hidrogênio também pode se refletir na
força da ligação. Forças típicas de pontes de hidrogênio
em proteínas são 4–29 kJ/mol (1–7 kcal/mol). Embora
contribuam para a estabilidade termodinâmica da con
formação de uma proteína, sua formação pode não ser
uma força motriz importante para o dobramento. Isso
porque ligações peptídicas e outros grupos que formam
pontes de hidrogênio estabelecem pontes de hidrogê
nio com a água solvente no estado desnaturado, e essas
ligações devem ser quebradas antes do polipeptídeo do
brar. No cálculo da contribuição das forças das pontes
de hidrogênio para o dobramento, a energia necessária
para quebrar as pontes de hidrogênio com a água deve
ser subtraída da ganha na formação de novas pontes de
hidrogênio entre átomos da proteína dobrada.
vo (B) inversamente dependente à 12ª potência dessa
distância (Figura 3.54). O termo A contribui, na sua
distância ótima, com uma força atrativa de menos que
4 kJ/mol (1 kcal/mol) por interação atômica devido à
indução de cargas parciais complementares ou dipolos
na densidade eletrônica de átomos adjacentes, quando
os orbitais eletrônicos de dois átomos se aproximam
até uma pequena distância. À medida que os átomos
se aproximam, porém, o componente repulsivo (termo
B) da força de van der Waals predomina, visto que os
orbitais dos elétrons de átomos adjacentes começam a
se sobrepor. A força repulsiva é comumente chamada
impedimento estérico.
EVDW= – rA
ab +
6 B
r12
ab
FIGURA3.54 Força de interações de van der Waals.

A distância de máxima interação favorável entre dois

átomos é a distância de contato de van der Waals, que
Interações Eletrostáticas é a soma dos raios de van der Waals para os dois áto
mos (Figura 3.55). Os raios de van der Waals de átomos
Interações eletrostáticas (ligações iônicas ou sali encontrados em proteínas são apresentados na Tabe
nas) entre grupos carregados são importantes na es la 3.17.
tabilização da estrutura de proteínas e na ligação de
ligantes carregados e substratos a proteínas. Forças
eletrostáticas são repulsivas ou atrativas dependendo
de as cargas que estão interagindo serem de mesmo si 0.1
0.2
0.3
0.4
1.5
nal ou de sinais opostos. A intensidade de uma força
) H H C C )
eletrostática (Eel) é diretamente dependente da carga l–
1
o
1l–
o
(Z) de cada íon e inversamente dependente da cons m
l
m
J
a k
(
tante dielétrica (D) do solvente e da distância entre as c
k
( lai
l c
cargas (rab) (Figura 3.53). a
i n
c 1.0 e
t
n o
e
t p
a
op a
i
i 0.5 g
r
g
re e
n
.B . ε2
Eel ZAD. Z n E
rab E
0.0 Distância 0.0
de contato
van der Waals
FIGURA3.53 Força de interações eletrostáticas.
0.1
2 4 6 0.5
A água tem uma alta constante dielétrica (D = 80), e
interações de cargas na água são relativamente fracas, Å

em comparação com as do interior de uma proteína, em

que a constante dielétrica é baixa. Porém, a maioria dos
grupos carregados permanece na superfície, onde não
interagem com outros grupos carregados da proteína
devido à alta constante dielétrica da água, mas são es
tabilizadas por pontes de hidrogênio e interações pola
res com água. Essas interações geram as forças domi
nantes que colocam a maioria dos grupos carregados de
uma proteína no lado de fora das estruturas dobradas.
Forças de van der Waals
Forças de van der Waals são as mais fracas das for
ças não covalentes. Têm um termo atrativo (A) inversa
mente dependente da sexta potência da distância entre
dois átomos que interagem (rab), e um termo repulsi
FIGURA 3.55 Energias de interação de dispersão de van
der Waals–London entre dois átomos de hidrogênio e
dois átomos de carbono (tetraédricos).
Energias negativas são favoráveis e energias positivas, desfa
voráveis.
Redesenhado de Fersht, A. Enzyme Structure and Mecha
nism. San Francisco: Freeman, 1977, p. 228.
As forças de van der Waals repulsivas entre átomos
de uma ligação peptídica são as mais fracas nos ângulos
específicos j e y compatíveis com as conformações em
a-hélice e fita-b. Portanto, a ausência de uma força re
pulsiva de van der Walls é crítica para a formação da es
trutura secundária de proteínas. Para chegar à confor
mação nativa, o número de interações de van der Waals
fracas envolvidas chega aos milhares. Sua contribuição
124 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

total para a estabilidade de uma estrutura dobrada é
substancial.
Um tipo especial de interação (elétron-π-elétron-π)
ocorre quando dois anéis aromáticos aproximam-se
um do outro, com elétrons de seus anéis aromáticos
interagindo favoravelmente (Figura 3.56). Essa inte
ração pode resultar em forças atrativas de até 25 kJ/
mol (6 kcal/mol).
está sempre correlacionado com perda de função de
uma proteína. Perda de função não é necessariamente
sinônimo de desnaturação, uma vez que pequenas mu
danças de conformação podem levar à perda de função
sem perda da estrutura nativa dobrada. Por exemplo,
uma mudança na posição de uma única cadeia lateral
do sítio ativo de uma enzima ou na protonação de uma
cadeia lateral pode resultar em perda de atividade enzi
mática, mas não em perda da conformação nativa.

Embora as diferenças conformacionais entre as

C estruturas desnaturadas e nativas possam ser subs
C tanciais, a diferença de energia livre entre tais estru
turas é tipicamente tão baixa quanto 20–40 kJ/mol
FIGURA 3.56 Interações elétron-p-elétron-p entre dois (5–10 kcal/mol) (a energia de três ou quatro ligações
anéis aromáticos. não covalentes). Portanto, a perda de uma única ponte
de hidrogênio ou interação eletrostática ou hidrofóbica
Aminoácidos
pode levar à desestabilização de uma estrutura enove
lada. Tal mudança na estabilidade de uma ligação não
velocidade de síntese
covalente pode, por sua vez, ser causada por mudança
[proteína] no pH, na força iônica ou na temperatura. A presença
velocidade dedesnaturação
de grupos prostéticos, cofatores e substratos, também
afeta a estabilidade de sua conformação nativa.
Digestão da proteína
A afirmativa de que a quebra de uma única ligação
FIGURA3.57 A concentração de estado estacionário não-covalente pode causar desnaturação aparentemen
(steadystate) de uma proteína deve-se às suas te conflita com a observação de que uma sequência de
velocidades de síntese e desnaturação. aminoácidos pode frequentemente ser bastante variada
sem perda da estrutura da proteína. A chave para a re
solução deste aparente conflito é a palavra “essencial”.
Desnaturação Leva à Perda de Muitas interações não covalentes não são essenciais
para a estabilidade estrutural da conformação nativa de
Estrutura Nativa uma proteína. Entretanto, substituição ou modificação
A desnaturação ocorre quando uma proteína perde de um aminoácido essencial que estabelece uma intera
sua estrutura nativa secundária, terciária e/ou quater ção não covalente crítica sem uma interação compensa
nária. As ligações peptídicas não são quebradas por tória estabilizadora afeta dramaticamente a estabilida
desnaturação conformacional. O estado desnaturado de da conformação nativa da proteína.

TABELA 3.17 Raios de Ligações Covalentes e de van der Waals de Átomos Selecionados
Átomo Raio covalente
(Å) Raio de van der Waals
(Å)a

Carbono (tetraédrico) 0,77 2,0

Carbono (aromático) 0,69 ao
0,73 ao longo da ligação
dupla ligação
simples 1,70

Carbono (amida) 0,72 para o Namida

0,67 oxigênio 1,50

0,75 para o C da cadeia

Hidrogênio 0,33 1,0
Oxigênio (—O—) 0,66 1,35
Oxigênio (=O) 0,57 1,35
Nitrogênio (amida) 0,60 para o H
0,70 da ponte de hidrogênio
Camida 1,45

0,70 para o C da cadeia

Enxofre, diagonal 1,04 1,70
Fonte: Fasman, G.D. (Ed.), CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3. ed., Sect. D, Vol. II, Boca Raton, FL: CRC Press, 1976, p. 221.
aA distância de contato de van der Waals é a soma de dois raios de van der Waals para dois átomos em proximidade.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 125

A concentração celular de uma proteína é contro gias de ligações covalentes e não covalentes em virtude
lada por sua velocidade de síntese e degradação (Fi de forças eletrostáticas, pontes de hidrogênio e forças
gura 3.57). Em muitas circunstâncias, a desnaturação de van der Waals. Aos átomos individuais são atribuí
de uma proteína é a etapa que controla a velocidade das velocidades aleatórias a partir de uma distribuição
de sua degradação. Enzimas celulares e organelas que teórica, e as equações de Newton são usadas para re
digerem proteínas “reconhecem” proteínas desnatura laxar o sistema em uma dada temperatura. O cálculo é
das e as eliminam rapidamente. Em situações experi uma intensa atividade computacional, mesmo quando
mentais, a desnaturação de proteínas ocorre após adi limitado a menos de algumas centenas de picosegundos
ção de ureia hidrocloreto de guanidina ou detergentes (1ps = 10–12 s) do tempo dinâmico da proteína. Tais
(p. ex., dodecil sulfato de sódio), que enfraquecem as cálculos indicam que um átomo médio de uma proteína
interações hidrofóbicas de proteínas e estabilizam o oscila numa distância de 0,7 Å na escala de picosegun
estado desnaturado. Adição de base forte, ácido ou dos. Alguns átomos ou grupos de átomos movem-se a
solvente orgânico ou aquecimento a temperaturas aci distâncias menores ou maiores que essa média calcula
ma de 60 °C são também métodos comuns para desna da (Figura 3.58).
turar uma proteína.
O movimento final de qualquer segmento de um po
lipeptídeo ao longo do tempo representa a somatória
3.8 ASPECTOS DINÂMICOS DA das forças que se devem a rápidas oscilações atômicas,
e ao balanço local e movimentos elásticos de grupos
ESTRUTURA DE PROTEÍNAS de átomos ligados covalentemente. Esses movimentos
Embora difração de raios-X de alta resolução dê as no interior densamente empacotado de uma proteína
coordenadas atômicas de cada átomo em uma proteína, frequentemente permitem que anéis aromáticos planos
evidências experimentais de NMR, espectroscopia de de tirosinas, que ficam mergulhados, se virem. As flu
fluorescência e dependência da temperatura na difra tuações de pequena amplitude fornecem o “lubrificante”
ção de raios-X revelam que os átomos em uma molécula para movimentos grandes em proteínas, tais como mo
de proteína têm movimento dinâmico tipo-fluido, e não vimentos de domínios e mudanças de estrutura quater
existem em uma posição estática. Em vez de uma lo nária, como os observados na hemoglobina após ligação
calização exata, as coordenadas atômicas obtidas por de O2 (p. 372). O comportamento dinâmico de proteí
difração de raios-X representam a posi
ção
duração
de
tempo para
dahoras.
várias
média, coleta
encontrar
no tempo,
Assim,
de dados,
ade
posição
acada
conformação
quemédia
átomo.
pode ser
éOa 1,5 (a)

1,0
ativa
Uma
pequenos
estrutura
estrutura de da
podedefeitos
dobrada,
diferir raios-X
no
indicando
conformação
empacotamento
também da
a existên
mostra
média.

) 0,5
Å
(
cia de buracos na estrutura, que permi o
ã
ç
tem à proteína espaço para flexibilidade. a
u
t
c 0,0
O conceito de que cada átomo de uma u
l
F
proteína está em movimento constante, (b)
1,0
como as moléculas em um fluido, embo
ra limitado por suas ligações covalentes
e estruturas secundárias e terciárias, é 0,5
um aspecto importante da estrutura de
proteínas.

Cálculos da dinâmica molecular te- 0,0 0 20 40 60 80 100

órica descrevem as mudanças nas co
ordenadas dos átomos na estrutura de
uma proteína e na posição de regiões da
estrutura, em virtude da somatória dos
movimentos dos átomos nessa região. A
computação é baseada na solução das
equações do movimento de Newton si
multaneamente para todos os átomos da
proteína e do solvente que interage com
ela. As funções energéticas usadas na
equação incluem representações de ener-
Número do aminoácido
FIGURA 3.58 Flutuação de estrutura do citocromo c.
(a) Flutuação calculada em uma escala de tempo de picosegundos dos carbonos-a
de cada resíduo de aminoácido na estrutura dobrada do citocromo c. (b) Flutuação
observada experimentalmente de cada carbono-a dos resíduos de aminoácidos
determinados a partir da dependência de temperatura do padrão de difração de
raios-X para a proteína. O citocromo c tem 103 resíduos de aminoácidos. O eixo x
dispõe os resíduos de aminoácidos do citocromo c de 1 a 103, e o eixo y mostra as
distâncias de flutuação em angstroms.
Redesenhado de Karplus, M., e McCammon, J. A. Annu. Rev. Biochem. 53:263,
1983.
126 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

nas é a base para mudanças conformacionais induzidas
por substrato, inibidor ou droga, quando se liga a uma
enzima ou receptor, geração de efeitos alostéricos em
hemoglobinas, transferência de elétrons em citocromos,
e formação de estruturas supramoleculares, como ví
rus. Os movimentos também podem ter um papel fun
cional na ação catalítica de enzimas.
3.9 CARACTERIZAÇÃO,
PURIFICAÇÃO
E DETERMINAÇÃO
DA ESTRUTURA
E ORGANIZAÇÃO
DE PROTEÍNAS
Moléculas de mesma carga da resina são eluídas primei
ro, em uma única banda, seguidas pelas de carga opos
ta à da resina, em uma ordem baseada na densidade
de cargas da proteína (Figura 3.61). Quando é difícil
remover uma molécula da resina em virtude da força
da interação atrativa entre a molécula ligada e a resi
na, mudanças sistemáticas no pH ou na força iônica são
usadas para enfraquecer a interação. Por exemplo, um
gradiente crescente de pH em uma resina de troca ca
tiônica reduz a diferença entre o pH da solução e o pI da
proteína ligada. Essa diminuição entre pH e pI reduz a
magnitude da carga final da proteína e diminui a força
da interação de cargas entre a proteína e a resina. Um
gradiente crescente de força iônica também diminui as
interações de cargas, porque os íons competem com as
proteínas pela ligação, e eluem da resina eletrólitos for
temente ligados.

Separação de Proteínas com Base 0.05 S F A A1c

em Carga A1c A
A2 F
)
m
Na eletroforese, a proteína dissolvida em uma so n
5
lução tampão em um determinado pH é colocada num 1
4
(
S
campo elétrico. Dependendo da relação entre o pH do a
i
c
n
tampão e o pI da proteína, a proteína move-se em direção â
b
r
ao cátodo (–) ou ao ânodo (+) ou permanece estacionária o
s
b
A2

(pH = pI). Suportes como géis poliméricos (p. ex., polia A

crilamida, agarose ou acetato de celulose) são usados. 0 14 15 16 17

Os suportes inertes são saturados com a solução tampão,
uma amostra da proteína é colocada sobre o suporte em
forma de linha ou ponto, um campo elétrico é aplicado ao
suporte, e as proteínas carregadas migram como bandas Tempo (min)

no suporte, em direção ao polo de carga oposta. (a) (b)

Uma técnica de resolução extremamente alta é a
focalização isoelétrica, na qual misturas de anfolitos
poliamino-ácidos policarboxílicos, com uma faixa defini
da de valores de pI, são usadas para estabelecer um gra
diente de pH ao longo do campo elétrico aplicado. Uma
proteína carregada migra pelo gradiente de pH no campo
elétrico até alcançar uma região de pH no gradiente igual
ao seu valor de pI. Nesse ponto, a proteína torna-se es
tacionária e pode ser vista (Figura 3.59). Proteínas que
diferem por tão pouco quanto 0,0025 em seus valores de
pI são separadas no gradiente apropriado de pH.
A cromatografia de troca-iônica em coluna é usa
da para separação preparativa de proteínas, por car
ga. As resinas de troca-iônica consistem de materiais
insolúveis (agarose, poliacrilamida, celulose e vidro)
que contêm grupos carregados (Figura 3.60). Resinas
carregadas negativamente ligam cátions fortemente e
são resinas de troca catiônica. Resinas carregadas po
sitivamente ligam ânions fortemente e são resinas de
troca aniônica. O grau de retardo de uma proteína (ou
um aminoácido) em uma resina depende da magnitude
da carga da proteína no pH específico do experimento.
FIGURA 3.59 Focalização isoelétrica de hemoglobinas de
um paciente heterozigoto para HbS e ß-talassemia.
Figura mostra separação por focalização isoelétrica de HbA1c
(HbA glicosilada na extremidade NH2, ver Correlação Clínica
3.5), HbA de adulto normal, HbF fetal, HbS de anemia falcifor
me (ver Correlação Clínica 6.2, p. 220) e HbA2 minoritária de
adulto. (a) Focalização isoelétrica realizada por eletroforese
capilar com anfólito na faixa de pH entre 6,7 e 7,7 e detecção
de bandas a 415 nm. (b) Focalização isoelétrica realizada em
gel com Pharmacia Phast System; anfólito na faixa de pH en
tre 6,7 e 7,7.
Redesenhado de Molteni, S., Frischknecht, H. e Thormann, W.
Electrophoresis 15:22, 1994.
RCH2 COO–
Ligante carregado negativamente: carboximetil
+ C2H5
R N
C2H5
H
Ligante carregado positivamente: dietilamino
FIGURA 3.60 Dois exemplos de ligantes carregados
usados em cromatografia de troca-iônica.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 127

7.8 direção ao cátodo supera qualquer migração negativa,

A
C
e os ânions também migram em direção ao cátodo, mas
7.4 com velocidade menor do que a de moléculas catiônicas
o ou neutras.
ãçartnecno F pH
S
A2 Na eletroforese de zona, as separações são feitas em
7.0
presença de um único tampão. A eletroforese capilar
C
pode ser realizada em presença de anfólitos para sepa
6.6 rar proteínas por focalização isoelétrica, em presença
500 1000 1500 2000 de um gel poroso para separar proteínas por peso mole
Volume de eluição (mL) cular, ou em presença de um componente micelar para
separar por hidrofobicidade. Detectores que utilizam
FIGURA 3.61 Exemplo de cromatografia de troca-iônica. luz UV, fluorescência, espectroscopia Raman, detecção
Diagrama de eluição de uma mistura artificial de hemoglobinas eletroquímica ou espectroscopia de massa tornam o
F, A1, A2, S e C em carboximetil-Sephadex C-50.
método capilar sensível e versátil.
Redesenhado de Dozy, A. M. e Huisman, T. H. J. J. Chromatog.
40:62, 1969.

Separação de Proteínas com Base

Eletroforese Capilar em Massa Molecular ou Tamanho
Eletroforese dentro de um tubo capilar de sílica fun Ultracentrifugação: Definição de
dida tem uma alta eficiência de separação, utiliza amos Coeficiente de Svedberg
tras muito pequenas e requer apenas alguns minutos
para um ensaio. Um longo tubo capilar é preenchido Uma proteína submetida à força centrífuga move-se
com o meio da eletroforese, uma amostra é injetada em na direção da força a uma velocidade dependente de
uma banda estreita próxima à extremidade do ânodo sua massa. A velocidade do movimento é medida com
do tubo, e as moléculas da amostra são separadas por um sistema de detecção óptico apropriado, e a partir
sua mobilidade em direção ao polo carregado negativa da velocidade, o coeficiente de sedimentação é calcu
mente. A parede de sílica fundida do capilar tem uma lado em unidades Svedberg (unidades de 10–13 s). Na
carga negativa, e uma camada catiônica imóvel é fixada equação (Figura 3.63), v é a velocidade medida do mo
a ela. Uma camada adjacente difusa de cátions move vimento da proteína, w a velocidade angular do rotor
-se em direção ao cátodo no campo elétrico aplicado e da centrífuga, e r a distância entre o centro do tubo no
causa um fluxo de solvente em direção ao cátodo. Esse qual a proteína foi colocada e o centro de rotação.
fluxo eletro-osmótico cria uma “corrente” que carrega
as moléculas a serem analisadas em direção ao cátodo,
independentemente da carga da amostra (Figura 3.62). v
s = ω2r
Moléculas com uma alta relação carga positiva-massa
movem-se com a corrente e têm a maior mobilidade, se
FIGURA3.63 Equação para cálculo do coeficiente de
guidas por moléculas neutras. Moléculas aniônicas são Svedberg.
repelidas pelo cátodo e movem-se contra o fluxo eletro
-osmótico. Entretanto, a corrente eletro-osmótica em Coeficientes de sedimentação en
tre 1 e 200 unidades Svedberg (S) fo
ram encontrados para proteínas (Ta
bela 3.18). Equações foram derivadas
para relacionar o coeficiente de sedi
mentação com a massa molecular de
+ + + + + + +
amostra uma proteína. Uma das equações mais
amostra
+ + + + + ++ simples é apresentada na Figura 3.64,
Ânodo
+ + fluxo + +
eletro-osmótico + + + + + + Cátodo
– na qual R é a constante dos gases, T
+ a temperatura, s o coeficiente de sedi
mentação, D o coeficiente de difusão
+ + + + amostra + + da proteína, v o volume parcial espe
amostra
+ + + + + + + + cífico da proteína, e p a densidade do
solvente. Os valores D e v devem ser
medidos em experimentos indepen
dentes. A equação assume uma geo
Surperfície capilar
metria esferoide para a proteína. Como
FIGURA3.62 Geração de fluxo eletro-osmótico em direção ao cátodo em essa hipótese pode não ser verdadeira
eletroforese capilar. e medidas independentes de D e v são
128 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

TABELA 3.18 Coeficiente de Svedberg para Algumas Proteínas Plasmáticas na carga. Um detergente comum é
Lisozima
a2 -Macroglobulina Proteína (cm
s20s–1
,2,19
Xdyn–1)a
10–13
19,6 Molecular
Peso o dodecil sulfato de sódio (SDS),
e um suporte poroso comum é a
poliacrilamida com ligações cru
15.000–16.000 zadas. Os dodecil sulfatos são C12
Albumina 4,6 69.000 alquila sulfatos anfifílicos, que es
Imunoglobulina G
Fibrinogênio 6,6-7,2 153.000 tabilizam uma proteína desnatura
341.000 da por formarem uma capa de sol
7,63 vatação de SDS carregado micelar
C1q (fator do complemento) 11,1 410.000 ao redor da cadeia polipeptídica. A
820.000 carga inerente da cadeia polipep
tídica é obliterada pelas moléculas
Imunoglobulina M 18–20 1.000.000 de SDS carregadas negativamen
Fator VIII da coagulação sanguínea 23,7 1.120.000 te, e cada agregado proteína-SDS
Fonte: Fasman, G.D. (Ed.), CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3. ed., Sect. solubilizado tem carga idêntica,
D, Vol. II, Boca Raton, FL: CRC Press, 1976, p. 242. por unidade de volume. Partículas
as20’ × 10–13 é o coeficiente de sedimentação em unidades de Svedberg, com referência à água a
carregadas negativamente movem
20 °C, e extrapolado para a concentração zero de proteína. -se pelo gel de poliacrilamida em
direção ao ânodo. A poliacrilami
difíceis, geralmente só o coeficiente de sedimentação da funciona como uma peneira molecular, e os com
de uma molécula é reportado. O coeficiente de sedi plexos proteínas-micelas são separados por tamanho;
mentação de uma proteína é uma medida qualitativa de proteínas de maior massa são retardadas. Uma única
sua massa molecular. banda em uma eletroforese em SDS-poliacrilamida é
frequentemente usada para demonstrar uma proteína
pura. A conformação da estrutura nativa não é um fator
Peso molecular = D (1RTs no cálculo da massa molecular, que é determinada por
–
– νρ) comparação com padrões conhecidos, desnaturados da
mesma forma. O detergente dissocia a estrutura qua
FIGURA3.64 Uma equação relacionando o coeficiente de ternária de uma proteína multimérica e libera as subu
Svedberg com o peso molecular.
nidades constituintes. Somente as massas moleculares
das subunidades de tal proteína são determinadas por
Cromatografia de Exclusão Molecular esse método.
Um gel poroso na forma de pequenas esferas inso
lúveis é comumente usado para separar proteínas por
tamanho, em colunas de cromatografia. Proteínas pe
quenas penetram nos poros do gel e têm maior volume
de solvente para percorrerem na coluna do que prote
ínas maiores, que são estericamente excluídas dos po
ros. Consequentemente, uma mistura de proteínas é se
parada por tamanho. As proteínas maiores são eluídas
primeiro, seguidas pelas proteínas menores, que são re
tardadas por seu acesso a um volume maior de solvente
(Figura 3.65). Como para a ultracentrifugação, assu
me-se uma geometria para uma proteína desconhecida
na determinação da massa molecular. Proteínas não
esféricas alongadas dão massas moleculares anômalas
quando analisadas usando-se uma curva padrão deter
minada com proteínas de geometria esferoide.

Eletroforese em Gel de Esfera pequena

Proteína Proteína
porosa grande
Poliacrilamida na Presença de um
FIGURA 3.65 Cromatografia de exclusão molecular.
Detergente Uma proteína pequena pode entrar nas partículas porosas
do gel e será retardada na coluna em relação a uma proteína
Se um detergente carregado for adicionado a um en
maior, que não pode entrar nas partículas porosas do gel.
saio de eletroforese de proteínas e a eletroforese ocorrer
através de um suporte poroso filtrante, a separação de
proteínas será baseada no tamanho das proteínas, e não
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 129

Técnicas de HPLC Separam bem como lipídeos, polissacarídeos e polinucleotíde

os, a purificação de uma proteína específica de outros
Aminoácidos, Peptídeos e Proteínas constituintes celulares pode ser difícil. A primeira ta
refa é o desenvolvimento de um ensaio simples para a
Na cromatografia líquida de alto desempenho
proteína. Seja utilizando a velocidade de transformação
(HPLC, high-performance liquid chromatography),
de substrato em produto, reação antígeno-anticorpo,
um solvente líquido contendo uma mistura de molé
ou uma resposta fisiológica em um sistema de ensaio
culas a serem identificadas é passado por uma coluna
em animal, o ensaio de uma proteína deve dar uma me
densamente empacotada com uma resina insolúvel em
dida quantitativa da atividade por unidade da concen
esferas de pequeno diâmetro. Na cromatografia em co
tração da proteína. Essa quantidade é conhecida como
luna, quanto menor e mais firmemente empacotadas as
a atividade específica da amostra. O propósito de um
esferas da resina, maior a resolução da técnica de sepa
procedimento de purificação é aumentar a atividade
ração. Em HPLC, a resina é tão densamente empacota
específica de uma amostra até o valor esperado para
da que o líquido deve ser bombeado pela coluna com
a proteína pura. Um protocolo típico para purificação
alta pressão. Portanto, HPLC usa bombas precisas de alta
de uma proteína celular solúvel envolve o rompimen
pressão com tubos e colunas de metal, e não de plástico
to das membranas celulares, seguido de centrifugação
e vidro usados em cromatografia por gravidade. As es
diferencial em um gradiente de densidade para isolar
feras de resinas são recobertas por grupos carregados
a proteína das partículas subcelulares e dos agregados
para separar compostos por troca-iônica, ou por grupos
de alto peso molecular. Maior purificação pode utilizar
hidrofóbicos para retardar moléculas hidrofóbicas não
precipitação seletiva por sais inorgânicos como sulfa
polares. Na cromatografia hidrofóbica, os compostos
to de amônio (salting out) ou por solventes orgânicos.
não polares firmemente associados são eluídos das esfe
A purificação final inclui uma combinação de técnicas
ras hidrofóbicas por solventes aquosos contendo várias
que separam com base em carga molecular, tamanho
porcentagens de um reagente orgânico. Quanto maior
molecular e/ou afinidade.
a porcentagem de solvente orgânico no eluente, mais
rapidamente o componente não polar é eluído da resi
na hidrofóbica. Este último tipo de cromatografia sobre
esferas de resina não polares é chamado HPLC de fase
reversa (Figura 3.66). Separações por
HPLC têm resolução e reprodutibili
dade extremamente altas. S
Y
L
-
S
N
D
i
d
Cromatografia de –

Afinidade
)
Proteínas têm uma alta afinidade A
µ
2
,
por seus substratos, grupos prostéti 0
(
cos, receptores de membrana ou inibi a
v
it
a
l
dores específicos não covalentes, bem e
r R
como por anticorpos feitos contra elas. a
i Y
c T
-
n
Esses compostos de alta afinidade po ê
c
S
N
s D
dem ser ligados covalentemente a uma e
r
o
i
d
-
u
l O
resina insolúvel, e a resina modificada F ,
N
pode ser usada para purificar sua pro
teína conjugada em cromatografia em
coluna. Em uma mistura de proteínas
eluídas através da resina, a de interes
se é seletivamente retardada.

Abordagem Geral para 4 8 12 16 20

Purificação de Proteínas
Uma proteína deve ser purificada
antes da determinação de sua com
posição química, estrutura e função.
Como células vivas contêm milhares
de proteínas geneticamente distintas,
Tempo (min)
FIGURA 3.66 Separação de aminoácidos utilizando HPLC de fase reversa. O
eixo x é o tempo de eluição da coluna.
Aminoácidos são derivados por reação com cloreto de dansila (DNS) para que possam
emitir fluorescência, que é usada para ensaiá-los à medida que são eluídos da coluna.
Reproduzido com permissão de Hunkapiller, M. W., Strickler, J. E. e Wilson, K. J.
Science 226:304, 1984. Reproduzido com permissão de AAAS.
130 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

As Técnicas de Proteômica Tentam manchas no padrão 2-D de um tipo celular específi

Determinar Todas as Proteínas
Expressas em uma Célula ou um
Tecido em um Único Ensaio
O número de genes individuais do genoma humano
é estimado em cerca de 25.000. Visto que múltiplos pro
dutos proteicos podem ser produzidos a partir de um
único gene por splicing alternativo e modificações pós
-tradução geram formas adicionais, o número de pro
teínas diferentes presentes no homem provavelmente
chega perto de 1 milhão. Proteômica é a
ciência de determinar exatamente quais
proteínas são produzidas em uma célula 100
ou tecido, em um conjunto específico de
condições.
co. Esses padrões 2-D de referência estão disponíveis
na Internet. Para definir melhor, uma mancha pode
ser extraída do gel e a proteína pode ser parcialmen
te hidrolisada em fragmentos peptídicos menores por
digestão proteolítica com enzimas (p. ex., tripsina ou
quimotripsina), e os fragmentos peptídicos submetidos
a espectroscopia de massa. A espectroscopia de massa
determina rapidamente a sequência de aminoácidos de
muitos dos fragmentos pequenos. Essa técnica é cha
mada impressão digital de massa (mass fingerprint)
de peptídeos. Usando essas sequências para pesquisar
sequências de proteínas ou bancos de dados de genes,
5.5 5.2 4.9

Qualquer célula ou tecido pode ex

pressar milhares de diferentes proteínas 60
a
simultaneamente. Para entender as pro D
k
priedades de uma célula ou tecido, são ,r
a
l
u 45
determinados os tipos de proteínas ex c
e
l
pressas e como o padrão de proteínas ex o
m
a
pressas muda com o desenvolvimento, a s
s
a
diferenciação e doenças. Técnicas foram M 30
desenvolvidas para ensaiar os mRNAs ex
pressos em células e tecidos em um único
ensaio por hibridização com micromatri
zes de DNA (microarrays). Mais recente
mente, técnicas foram desenvolvidas para 15
analisar os produtos dos genes ativos, as
proteínas expressas por células e tecidos (a) p/
5.4 5.3
usando eletroforese 2-D. Nesta, as proteí
nas são, primeiro, extraídas de células ou
tecidos e depois aplicadas a um gel de po 50
liacrilamida em um aparelho de eletrofore
se. As proteínas são separadas na primeira a
D
k
direção com base em suas diferenças de ,r
a
l
pI. O gel é, então, virado em 90° e dode u
c
e
l 45
cil sulfato de sódio (SDS) é adicionado ao o
m
tampão. As proteínas são separadas na se a
s
s
a
gunda direção com base em suas diferen M
tes massas moleculares (ver Eletroforese
em Gel de Poliacrilamida em Presença de
um Detergente). O gel resultante é cora 40
do para proteínas, e a intensidade de cada
um dos milhares de pontos de proteínas é (b)
medida para determinar se uma proteína
específica é expressa e sua concentração FIGURA3.67 Apresentação bidimensional (2-D) de proteínas expressas
(Figura 3.67). por células em cultura.
(a) Proteínas solúveis de extrato celular (500 μg) aplicados ao gel e separados
A determinação da identidade de cada por focalização isoelétrica (pH 4,9–5,5) na direção horizontal e por massa mole
uma das manchas proteicas em um gel 2-D cular na direção vertical (eletroforese em presença de detergente SDS). Mais de
não é uma tarefa trivial. O padrão 2-D, 1.500 proteínas são observadas no gel por coloração com prata. (b) Uma região
do gel expandida para mostrar detalhes. Proteínas numeradas foram analisadas
se realizado em condições padronizadas, por hidrólise com protease e espectroscopia de massa para determinar sua sequ-
pode ser comparado com padrões obtidos ência parcial de aminoácidos, levando a sua identificação.
por laboratórios de referência, que de Reproduzido com premissão de Gygi, S. P., Corthals, G. L., Zhang, Y., Rochon, Y.
terminaram a identidade da maioria das e Aebersold, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9390, 2000.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 3.7
Uso de Análise de Aminoácidos no Diagnóstico de Doenças
Concentrações elevadas de aminoácidos são encontradas no plasma ou na urina em várias doenças clínicas.
Uma concentração anormalmente elevada de aminoácidos na urina é chamada aminoacidúria.
Aminoacidúrias no homem
Aminoácido(s) Elevado(s)
Phe
Cys, Lys, Arg, ornitina
Lys, Arg, ornitina
Aminoácidos neutros (monocarboxílicos monoamino)
Deficiência de Trp
Pro, hidroxiprolina, Gly
Asp, Glu
Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiology Rev. 88:239, 2008; e Camargo, S. M.,
Bockenhauer, D. e Kleta, R. Aminoacidurias: Clinical and molecular aspects. Kidney International 73:918, 2008.
pode-se chegar à identificação da proteína extraída do
gel 2-D. Instrumentos robóticos hoje executam cada
etapa da extração e identificação da proteína da man
cha. Dessa maneira, as milhares de proteínas expressas
podem ser identificadas.
A técnica atualmente é incapaz de identificar pro
teínas pouco abundantes em células ou tecidos. Além
disso, certos tipos de proteínas são difíceis de analisar
em virtude de baixa solubilidade, baixa carga molecular
ou massa molecular muito pequena. Por exemplo, pro
teínas integrais de membrana são muito hidrofóbicas e
não são solúveis nos solventes padrões de focalização
isoelétrica.
Determinação da Composição em
Aminoácidos de uma Proteína
A determinação da composição em aminoácidos é
um componente essencial no estudo da estrutura de
uma proteína e de suas propriedades fisiológicas. Uma
proteína é hidrolisada a seus aminoácidos constituin
tes por aquecimento a 110 °C em HCl 6 N, por 18–36 h,
em tubo selado a vácuo para impedir degradação de
cadeias laterais sensíveis à oxidação no ar. O triptofa
no é destruído nesse método, e procedimentos alter
nativos são usados para sua análise. Cadeias laterais
amida de asparagina e glutamina são hidrolisadas a
aspartato e glutamato e amônia livre; estes são inclu
ídos no conteúdo de ácido glutâmico e ácido aspártico
na análise.
CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 131
Aminoacidúria CorrelaçãoClínica
Fenilcetonúria 19.7, p. 790
Cistinúria 19.11, p. 795
Intolerância lisinúrica a proteínas 19.15, p. 801
Doença de Hartnup 25.5, p. 1071
Iminoglicinúria 19.5, p. 788
Aminoacidúria dicarboxílica
Procedimentos comuns para identificação de amino
ácidos usam cromatografia de troca catiônica ou HPLC
de fase reversa para separá-los e, então, reagir com ni
nhidrina, fluorescamina, cloreto de dansila ou reagen
tes cromóforos ou fluoróforos semelhantes para quanti
ficação. Com alguns tipos de derivação, os aminoácidos
são identificados em concentrações de 0,5 × 10–12 mol
(pmol). A análise da composição em aminoácidos de lí
quidos fisiológicos (p. ex., sangue e urina) é usada no
diagnóstico de doenças (Correlação Clínica 3.7).
Determinação da Sequência de
Aminoácidos
A capacidade de clonar genes levou à capacidade de
determinar a sequência de aminoácidos de uma proteí
na a partir de suas sequências de DNA ou mRNA. Esse
é um método muito mais rápido para obtenção de uma
sequência de aminoácidos. O sequenciamento de uma
proteína, entretanto, é necessário para a determinação
de modificações na estrutura da proteína que ocorrem
após sua biossíntese, para identificar uma parte da se
quência da proteína para que seu gene possa ser clona
do, e para identificar uma proteína como o produto de
um gene específico. A determinação da estrutura pri
mária de uma proteína requer uma proteína purificada
e a determinação do seu número de cadeias. As cadeias
individuais são purificadas pelas mesmas técnicas usa
das na purificação da proteína inteira. Se pontes dissul
feto unirem covalentemente as cadeias, essas ligações
devem ser quebradas (Figura 3.68).
Polipeptídeos são comumente sequenciadas pela
reação de Edman ou por espectroscopia de massa.
132 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Na reação de Edman, a cadeia polipeptídica

reage com fenilisotiocianato,
aminoácido NH2-terminal. Condições
que reageacídicas
com o RN O R3 O R2 O R1 O R1′ O R2′ O RN′

NH
+ 3CC NCCNCCNCCNCCNCCNCCOO–

H H H H H H H H H H H H H
catalisam ciclização intramolecular que cliva
o aminoácido NH2-terminal como um derivado Ligação
feniltio-hidantoína (Figura 3.69). Esse ami polipeptídica
hidrolizada
noácido derivado pode ser separado cromato
graficamente e identificado contra padrões. O R1 Reagente

polipeptídeo restante é isolado, e a reação de Phe, Tyr, or Trp Quimotripsina

Edman é repetida para identificar o aminoáci Arg, Lys Tripsina
do NH2-terminal seguinte. Teoricamente, isso Met Brometo de cianogênio
Trp Ácido o-lodosobenzóico
pode ser repetido até que a sequência do poli Glu Endoprotease V8 Staphylococcus aureus
peptídeo inteiro seja determinada, mas em con
dições favoráveis só pode ser feita para 30 ou
40 aminoácidos da cadeia polipeptídica, quando FIGURA3.70 Especificidade de alguns reagentes que clivam
polipeptídeos.
impurezas geradas em reações incompletas nas
séries de reações tornam mais ciclos de Edman
inviáveis. Polipeptídeos com mais de 30 ou 40 aminoáci a ligação peptídica no lado COOH-terminal de lisina e
dos são hidrolisados em fragmentos menores e sequen arginina na cadeia polipeptídica. Quimotripsina cliva
ciados em partes. Para sequenciamento por espectros a ligação peptídica no lado COOH-terminal de cadeias
copia de massa, também é necessário quebrar longas laterais apolares grandes. Outras enzimas clivam as ca
cadeias polipeptídicas em fragmentos menores. deias polipeptídicas no lado COOH-terminal de ácidos
glutâmico e aspártico. Brometo de cianogênio cliva li
gações peptídicas no lado COOH-terminal de resíduos
de metionina (Figura 3.70). Após hidrólise parcial, os
CH2 CH2 CH2
SS segmentos são separados, e a sequência de cada um é
HO3S + SO3H
determinada pela reação de Edman ou por espectros
CH2 copia de massa. Para ordenar corretamente os peptíde
os sequenciados na sequência completa, outra amostra
Ligação cistina Dois ácidos cisteicos
do polipeptídeo original é submetida à hidrólise parcial
FIGURA3.68 Quebra de pontes dissulfeto por oxidação por um reagente hidrolítico diferente do usado inicial
de ácidos cisteicos. mente, e os fragmentos são separados e sequenciados.
Isso gera sequências sobrepostas, que permitem a de
Métodos enzimáticos e químicos são usados para terminação da sequência completa (Figura 3.71).
quebrar as cadeias polipeptídicas em fragmentos me
nores (Figura 3.70). Tripsina cliva preferencialmente
Técnicas de Difração de Raios-X
NCS
R1 O
CCCCNCC
H O R3 O H São Usadas para Determinar
S +R
H1H3N+
O HR2 OH
N HR2R3
H O H H NCCOO–
H H H H RN
a Estrutura Tridimensional de
Fenilisotiocianato Cadeia polipeptídica
Proteínas
A difração de raios-X permite a determinação
da estrutura de proteínas com resolução quase atô
NCN CC CCNCC
mica. A abordagem requer a formação de um cristal
H
N NCCOO– da proteína, que contém solvente e é, portanto, uma
H H RN solução concentrada, para uso como alvo. Nosso en
tendimento dos componentes detalhados da estru
Peptídeo (ou proteína) feniltiocarbamoil (PTC) tura de proteínas derivados desse estado cristalino
H+
correlaciona-se bem com outras medidas físicas da
O R1 estrutura da proteína em solução (p. ex., com espec
CCH + R2 O H O RN troscopia de NMR; p. 137).
N NH H3N+ CCNCCNCCOO– A geração de cristais de proteínas pode ser o
C H H R3 H H aspecto mais demorado do processo. As proteínas
S têm dimensões moleculares pelo menos uma ordem
Feniltio-hidantoína Cadeia polipeptídica (menos aminoácido do NH2–terminal
de grandeza acima de uma molécula pequena, e o
empacotamento de moléculas grandes de proteínas
FIGURA 3.69 Reação de Edman. na rede cristalina gera um cristal com grandes “bu

1 2 3 4 5 6 7 8
Ala - Leu - Tyr - Met-Gly - Arg - Phe - Ala-Lys - Ser - Glu - Asn
+ um reator nuclear ou acelerador de partícu
NH3-R1R2R3R4R5R6R7R8R9R10R11R12-COO–
Tripsina 1 paraCom
6 7
Quimotripsina 1
3 4 7 8
Brometo de cianogênio 1
4 5
FIGURA 3.71 Ordenação de fragmentos peptídicos de sequências
sobrepostas produzidas por proteólise específica de um peptídeo.
racos” ou canais de solvente. Um cristal de proteína
tipicamente contém 40 a 60% de solvente, e pode ser
considerado como uma solução concentrada, ao invés
do sólido cristalino duro que é obtido para a maioria
das moléculas pequenas. A presença de solvente e de
um volume não ocupado no cristal permitem a infusão
de inibidores e substratos nas moléculas de proteína no
estado cristalino.
Uma flexibilidade dinâmica em regiões da estrutura
da proteína pode ser vista como desordem no padrão de
difração de raios-X. Desordem descreve a situação na
qual a densidade de elétrons observada pode ser ajusta
da a mais de uma conformação local. Duas explicações
devem ser diferenciadas. A primeira envolve a presença
de duas ou mais conformações moleculares estáticas,
que estão presentes em uma relação estequiométrica.
A segunda envolve a faixa dinâmica real de movimento
apresentado por átomos ou grupos de átomos em regi
ões localizadas da molécula. Essas explicações podem
ser diferenciadas baixando-se a temperatura do cris
tal até que a desordem dinâmica seja “congelada”; em
contraste, as conformações estáticas múltiplas não são
dependentes de temperatura e persistem. A análise da
desordem dinâmica por sua dependência de temperatu
ra usando difração de raios-X é um método importante
para estudar a dinâmica das proteínas (Seção 3.8).
As técnicas de cristalização têm avançado tanto
que cristais são obtidos mesmo das proteínas menos
abundantes. Estruturas interessantes foram reporta
das para proteínas nas quais resíduos específicos foram
substituídos, complexos antígeno-anticorpo, e produ
tos virais como a protease necessária à infecção pelo
vírus da imunodeficiência humana (HIV) que causa a
síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Apro
ximadamente 50.000 estruturas foram resolvidas por
difração de raios-X, e os detalhes estão armazenados
no Protein Data Bank, que está acessível na Internet.
A difração de raios-X por um cristal ocorre com ra
diação incidente de um comprimento de onda caracte
rístico (p. ex. cobre, Kα = 1,54 Å). O feixe de raios-X é
difratado pelos elétrons que circundam os núcleos atô
micos do cristal, com uma intensidade proporcional ao
número de elétrons ao redor do núcleo. Assim, a técnica
estabelece a distribuição de elétrons da molécula e in
fere a distribuição de núcleos. Posições reais de núcleos
atômicos podem ser determinadas diretamente por di
fração com radiação de feixe de nêutrons, uma técnica
CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 133
9 10 11 12 interessante, mas muito cara, porque requer
las. a maior resolução
determinação agora
de estrutura dedisponível
proteínas
9 10 12
12
por difração de raios-X, a difração de átomos
de C, N, O e S pode ser observada. A de átomos
12
de hidrogênio não é observada em virtude da
baixa densidade de elétrons, isto é, um único
elétron ao redor de um núcleo de hidrogênio.
O raio difratado é tipicamente detectado em
filme fotográfico ou em detectores eletrônicos de área.
Isso permite o registro da amplitude (intensidade) de
radiação difratada em uma orientação definida. A de
terminação dos ângulos de fase exigiu, historicamente,
a colocação de átomos pesados (como iodo, mercúrio ou
chumbo) na molécula de proteína. Procedimentos mo
dernos podem frequentemente resolver o problema de
fase sem uso de átomos pesados.
É conveniente comparar a cristalografia de raios-X
com a microscopia óptica, para entender os processos
envolvidos. Na microscopia óptica, a radiação incidente
é refletida por um objeto em estudo, e o raio refletido é
recondensado pelas lentes objetivas para produzir uma
imagem do objeto. A analogia é apropriada para raios-X
incidentes, mas não existe nenhum material que possa
servir como lente objetiva para a radiação de raios-X.
Em lugar das lentes objetivas, medidas de amplitude e
de ângulos de fase da radiação difratada são reconstru
ídas matematicamente por síntese de Fourier para ge
rar um mapa de densidade eletrônica tridimensional do
objeto difratado. Algumas centenas de reflexões são ne
cessárias para um mapa de densidade eletrônica de bai
xa resolução. Por exemplo, 400 reflexões foram usadas
para obter um mapa de 6 Å da mioglobina. Nessa reso
lução, é possível localizar claramente a molécula dentro
de uma unidade cela do cristal e estudar o empacota
mento geral das subunidades em uma proteína multi
mérica. Contudo, um traçado da conformação da cadeia
polipeptídica é feito com dificuldade. Muito mais refle
xões são necessárias para se obter mapas de resolução
maior. Para a mioglobina, na qual 400 reflexões foram
utilizadas para obter o mapa de 6 Å, 10.000 reflexões
foram necessárias para um mapa de 2Å, e 17.000 refle
xões para um mapa de 1,4 Å. Grande parte do trabalho
hoje é parcialmente automatizado usando computado
res. Uma fatia através de um mapa de densidade eletrô
nica tridimensional do tripsinogênio é apresentada na
Figura 3.72. A estrutura primária conhecida é ajustada
ao padrão de densidade eletrônica por refinamento, o
processo de computação intensiva de alinhamento de
uma sequência ao mapa de densidade eletrônica, até
que o melhor ajuste seja obtido.
A difração de raios-X fornece evidências incomple
tas do mecanismo de ação de uma proteína. Ao contrá
rio, fornece uma estrutura média de uma molécula cujos
átomos estão normalmente sofrendo rápida flutuação
em solução (Seção 3.8). Na verdade, a estrutura média
pode não ser a estrutura ativa de uma proteína em solu
134 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

inferidas a partir das figuras estáticas de uma forma

inativa da proteína ou de complexos com análogos ina
tivos de seus substratos (Figura 3.73).
S

Métodos mais novos de difração de raios-X usam ra

diação síncroton para gerar um feixe de raios-X, no mí
ONN nimo 10.000 vezes mais intenso do que os de geradores
Ser195 de raios-X padrão, o que permite a coleta de dados de
His 57
Asp10299 difração em escala de milissegundos. A aplicação des
191
sas técnicas permitirá a determinação de estruturas de
vida curta e a solução de questões mecanísticas e de
Trp 215
N
estruturas dinâmicas, não acessíveis pela tecnologia
S
O padrão.
220

Thr 98
Absorção da ligação peptídica Absorção da
cadeira lateral
da Tyr e Trp
o Absorção de SS
FIGURA 3.72 Mapa de densidade eletrônica em resolução ãçrosbA

de 1,9-Å na região do sítio ativo da forma pró-enzima da

tripsina.
Os resíduos de aminoácidos do sítio ativo são ajustados em um
mapa de densidade eletrônica.
Reproduzido com permissão de Kossiakoff, A. A., Chambers, J. L., 200 250 300
Kay, L. M., e Stroud, R. M. Biochemistry 16:654, 1977. Direitos Comprimento de onda (nm)
autorais (1977) da American Chemical Society.
FIGURA 3.74 Espectro de absorção ultravioleta da
proteína globular a-quimotripsina.
ção. Na escala de tempo da coleta de dados para difra
ção, as estruturas de complexos reativos enzima-subs
trato, intermediários e estados de transição de reações Métodos de Espectroscopia para
não podem ser observados. Essas estruturas devem ser
Avaliar Estrutura e Função de
Proteínas
Espectroscopia de Luz
Ultravioleta
As cadeias laterais da tirosina,
da fenilalanina e do triptofano, e
as ligações peptídicas absorvem luz
ultravioleta (UV). A eficiência de
absorção de cada cromóforo está
relacionada com seu coeficiente
de extinção molar (e) (Um Olhar
Mais Atento 3.2). Um espectro tí
pico é apresentado na Figura 3.74.
Absorbâncias entre 260 e 300 nm
devem-se primariamente a cadeias
laterais aromáticas (Figura 3.75).
Quando a cadeia lateral da tirosina
é ionizada em pH alto (esse grupo
R tem pK!a ≈10), a absorbância é
deslocada para um comprimento
de onda maior (desvio para o ver
FIGURA3.73 Tracejado estérico da estrutura do esqueleto de carbono a da melho) e sua absorbância molar é
protease do HIV com inibidor (linhas grossas) e da protease sem inibidor (linhas aumentada (Figura 3.75). Ligações
finas).
peptídicas absorvem no UV dis
Redesenhado com permissão de Miller, M., Schneider, J., Sathyanarayana, B. K., Toth, M.
V., Marshall, G. R., Clawson, L., Selk, L., Kent, S. B. H., e Wlodawer, A. Science 246:1149, tante (180-230 nm). Uma ligação
1989. Direitos autorais (1989) AAAS. peptídica na conformação a-hélice
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 135

× 10–3 UM OLHAR MAIS ATENTO 3.2

2.0 Tirosinato Absorbância de Luz Ultravioleta e

6 Visível Mostra uma Dependência
Linear de Concentração e Compri
e0.3
h
1.5
ry p 4
5 mento do Caminho
r
P T T
0.2 1.0 3 A lei de Beer–Lambert é uma equação
empírica que mostra a relação linear
0.1 0.5 2 Tirosina Triptofano entre a concentração de um cromóforo
e a absorbância em um comprimento de
1 Fenilalanina onda específico de luz UV ou visível. A
0 250 260 270 280 290 300 310 equação é:
Comprimento de onda (nm)
A = el * l * c
FIGURA 3.75 Absorção ultravioleta para os cromóforos de Phe, Tyr, Trp e onde A é a abosrbância de luz no com
tirosinato.
primento de onda l, el é a absortividade
Note as diferenças nos coeficientes de extinção no eixo esquerdo para os dife
rentes cromóforos. molar ou o coeficiente de extinção de
Redesenhado
mas, J. O. e Tipton,
de d’Albis,
K. F. (Eds.),
A. e Gratzer,
Companion
W. B. to
Em:Biochemistry.
Bull, A. T., Lagmado,
London: Longmans,
J. R., Tho- um cromóforo no comprimento de onda
l, l é o comprimento do caminho da luz
1974, p. 170. através da solução, e c é a concentração
do cromóforo. O coeficiente de extinção
molar é uma constante da molécula de
interage com os elétrons de outras ligações peptídicas cromóforo em um conjunto de tempera
acima e abaixo dela, criando um sistema éxciton, no tiver eem
tura unidadesdadesolução.
condições M–1cm–1,Seentão
el es
qual elétrons são deslocados. O resultado é um des l
locamento na absorção máxima de uma ligação pep estará em cm, c em M, e A estará em
tídica isolada para um comprimento de onda menor unidades de absorbância.
ou maior (Figura 3.76). A espectroscopia de UV pode
fornecer informações sobre a estrutura secundária e
terciária de uma proteína. À medida que uma prote
ína é desnaturada, diferenças nas características de A absorbância molar de um substrato cromóforo
absorção das ligações peptídicas aparecem em virtude frequentemente muda na ligação com uma proteína e
da ruptura do sistema exciton. Além disso, a absor pode ser usada para medir sua constante de ligação.
ção máxima para um cromóforo aromático ocorre em Mudanças nos coeficientes de extinção do cromóforo
um comprimento de onda mais baixo em um ambiente durante catálise a enzimática são usadas para fornecer
aquoso do que em um ambiente não-polar. os parâmetros cinéticos da reação.

Espectroscopia de Fluorescência
A energia de um elétron excitado produzido por ab
r
a
l 6 sorção de luz é perdida mais comumente como energia
o
m Estrutura térmica, em um processo de colisão. Em alguns cromó
o aleatória
u
d
í
foros, a energia de excitação é dissipada por fluores
s4
e
r
Folha β cência. A emissão fluorescente ocorre sempre em um
e
d comprimento de onda maior de luz (menor energia) do
e
d α-hélice que o comprimento de onda de absorção do fluoróforo,
a2
d
iv
it
r
porque os níveis energéticos de vibração, formados du
o
s
b0
rante a absorção de luz (excitação), são perdidos antes
A 180 190 200 210 220 230 240 250 da fluorescência (Figura 3.77). Se outra molécula esti
Comprimento de onda (nm) ver presente para absorver a energia da luz emitida pelo
fluoróforo, a fluorescência emitida não é observada,
FIGURA 3.76 Absorção ultravioleta das ligações mas transferida para a molécula que a absorve. A molé
peptídicas de uma cadeia polipeptídica em conformações
em a-hélice, estrutura aleatória e folha-b antiparalela. cula aceptora, por sua vez, ou emite sua própria fluores
Redesenhado de d’Albis, A. e Gratzer, W. B. Em: Bull, A. T., cência característica, ou perde sua energia de excitação
Lagmado, J. R., Thomas J. O. e Tipton, K. F. (Eds.), Compa por um processo alternativo. Se a molécula aceptora
nion to Biochemistry. London: Longmans, 1970, p. 175. perder sua energia de excitação por um processo não
fluorescente, é um apagador ou quencher da molécula
doadora de fluorescência. A eficiência da transferência
136 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

Desativação nios globulares. Na desnaturação, as distâncias

vibratória
ν' = 43
1
2 entre grupos doadores e aceptores aumentam
a eletrônico
excitado
Estado e a eficiência de transferência de energia para
0
o triptofano diminui. Consequentemente, um
aumento na fluorescência de tirosina e/ou feni
lalanina e uma diminuição na do triptofano são
observados na desnaturação de uma proteína.
i
g
r Como os processos de transferência de excita
e
n
E ção em proteínas são dependentes da distância
e da orientação, a fluorescência final depende
da conformação da proteína. Esse tipo de análi
se detecta mudanças que se devem a mudanças
de conformação e interações de ligação.
ν= 4
3
Estado 2
basal 1
0 [θ] × 10–3
α-hélice
Absorção Fluorescência
60
70
FIGURA 3.77 Transições eletrônicas de absorção e fluorescência.
A excitação após absorção da luz é do nível vibratório zero, no estado basal,
para vários níveis
fluorescência é dovibratórios
nível vibratório
superiores,
zero, donoestado
estadoeletrônico
excitado.excitado,
A emissãopara
de 50

vários
de
em
Redesenhado
Thomas,
onda O.
comprimentos
níveis
de
J. absorção.
vibratórios,
de
e Tipton,
d’Albis,
de ondano
K.
A.maiores
estado
F.
e Gratzer,
(Eds.),
basal.
(menos
Companion
W.AB.emissão
energia)
Em: Bull,
de
to
doA.
fluorescência
Biochemistry.
que
T., oLagmado,
comprimento
ocorre
Lon-
J. R. 30
40 Folha β

10
20

Estrutura aleatória
don: Longmans, 1970, p. 166.
0
de excitação depende da distância e da orientação das 10
moléculas doadoras e aceptoras.
20 Folha β
Os espectros de emissão de fluorescência de ca
30
deias laterais de fenilalanina, tirosina e triptofano são α-hélice

apresentados na Figura 3.78. Os comprimentos de onda 40 Estrutura aleatória

de emissão da fenilalanina se sobrepõem aos compri 190 200 210 220 230 240 250
mentos de onda de absorção da tirosina. Por sua vez, Comprimento de onda (nm)
os comprimentos de onda de emissão da tirosina se
sobrepõem aos comprimentos de onda de absorção do FIGURA3.79 Espectro de dicroísmo circular de cadeias
polipeptídicas em conformações a-hélice, folha-b e
triptofano. Por causa dessas sobreposições nos compri
aleatórias.
mentos de onda de emissão e absorção, primariamen Redesenhado de d’Albis, A. e Gratzer, W. B. Em: Bull,A.T., Lag
te, apenas a fluorescência do triptofano é observada. mado, J. R., Thomas, J. O. e Tipton, K. F. (Eds.), Companion
A transferência de excitação ocorre em distâncias de to Biochemistry. London: Longmans, 1970, p. 190.
até 80 Å, que são tipicamente os diâmetros de domí
Espectroscopia de Dicroísmo Circular
t 1.5
a Tyr O dicroísmo circular (CD) é causado por diferenças
n na absorção de luz entre os componentes vetores em
a
u
q
e 1.0
d
sentido horário e anti-horário de um feixe de luz polari
o
v
it zada viajando através de uma solução de uma molécula
l 0.5
a Trp
opticamente ativa, como um L-aminoácido. Um espec
e
r
o
r tro é gerado quando o dicroísmo circular é determinado
e
m
ú
Phe em uma faixa de comprimentos de onda. Aminoácidos
N
aromáticos em uma proteína e a cadeia polipeptídica
0
280 320 360 400 440 geram uma rotação óptica e um espectro de CD (Figu
Comprimento de onda (nm) ra 3.79). Em virtude das diferenças entre os espectros
de a-hélice, folha-b e estruturas aleatórias, o dicroís
FIGURA3.78 Fluorescência característica de grupos
mo circular tem sido um ensaio bastante sensível para
aromáticos em proteínas.
Redesenhado de d’Albis, A. e Gratzer, W. B. Em: Bull, A. T., a quantidade e o tipo de estrutura secundária, e é co
Lagmado, J. R., Thomas, J. O. e Tipton, K. F. (Eds.), Compa mumente utilizado para acompanhar o dobramento e a
nion to Biochemistry. London: Longmans, 1970, p. 478. desnaturação de proteínas.
 CAPÍTULO 3 PROTEÍNASI: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 137

Ressonância Magnética Nuclear
Com NMR bidimensional (2-D) e espectrômetros
NMR potentes, a conformação em solução de proteí
nas pequenas, de cerca de 150 aminoácidos ou menos,
pode ser determinada. NMR multidimensional e res
sonância tripla podem estender a sensibilidade a mais
de 250 resíduos.
Técnicas convencionais de NMR usam radiação de
radiofrequência (rf) para estudar o ambiente dos núcle
os atômicos que são magnéticos. A exigência de núcleos
magnéticos é absoluta e baseia-se em um estado de spin
não pareado no núcleo. Assim, os núcleos de carbono
(12C), nitrogênio (14N) e oxigênio (16O) naturalmente
abundantes não absorvem, enquanto 13C, 15N e 17O ab
sorvem. A informação derivada das bandas de absorção
permite a determinação da identidade e do número de
grupos vizinhos mais próximos, que podem afetar a res
posta de espécies que absorvem por interações de liga
ções, mas não dá informações quanto às interações es
paciais (não ligadas) em virtude da conformação nativa
da proteína. Para determinar as interações no espaço e
das ligações. O método gera uma família de estruturas,
a variabilidade mostrando ou a imprecisão da técnica
ou a “desordem” dinâmica da estrutura dobrada (Figu
ra 3.80). Tais computações forneceram estruturas que
não diferem significativamente da estrutura média no
tempo, observada pelos métodos de difração de raios-X.
Outros avanços do NMR, para determinação da es
trutura de proteínas, incluem a capacidade de sintetizar
proteínas que contêm aminoácidos enriquecidos isoto
picamente (p. ex., contendo 13C ou 15N) e o desenvolvi
mento de reagentes com deslocamento paramagnético
para estudar ambientes localizados em ressonâncias
paramagnéticas, como os grupos sinalizadores com íon
lantanídeo.
34
10
64
66
86
59 84

a estrutura terciária de proteínas, é necessário o uso de 4

efeitos nucleares de Overhauser (NOEs) e a aplicação
da técnica bidimensional. 70
94 16
A principal diferença entre NMR bidimensional e 41
81
unidimensional (1-D) é a adição de um segundo pulso 55 27
rfretardado. A técnica requer identificação no espectro
de absorção de prótons de uma posição específica na 1
estrutura da proteína. Interações espaciais podem ser
observadas a uma distância máxima de aproximada 50
47 21
mente 5 Å. Na geração da informação de distância para
77
pares interresíduos na estrutura da proteína, as con
99
formações da proteína consistentes com os espectros
são geradas. Nesse cálculo, uma matriz de distâncias
é construída contendo faixas de distâncias (mínima e FIGURA 3.80 Estrutura de NMR da plastocianina de feijão
francês.
máxima) para tantas interações interresíduos quantas
A estrutura mostra a sobreposição de oito estruturas do esque
possam ser medidas. Estruturas possíveis são geradas a leto polipeptídeo da proteína, calculadas a partir das restrições
partir dos dados consistentes com as restrições impos do espectro de NMR.
tas pelos espectros de NMR. Refinamentos computacio De Moore, J. M., Lepre, C.A., Gippert, G. P., Chazin, W. J. et al.
nais das estruturas calculadas inicialmente podem oti J. Mol. Biol. 221:533, 1991. Figura generosamente fornecida
mizar as distâncias das ligações covalentes e os ângulos por P. E Wright.

Bibliografia
Bioinformática e Portais de Software de Proteômica

O periódico Nucleic Acids Research compila anual
mente e resume os bancos de dados biológicos dispo
níveis na Rede (Nucleic Acids Research 36: janeiro,
2008) e páginas da internet com ferramentas para aná
lise de dados biológicos (Nucleic Acids Research 26:
July 1, 2008).
O site de entrada do The National Institutes of Health
dá acesso a bancos de dados de sequências, genômica
e expressão de proteínas e ferramentas de análises
(http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez).
O site do Expert Protein Analysis System (ExPASy) do
Swiss Institute of Bioinformatics contém ferramentas
para o estudo de proteínas e links para outras páginas e
bancos de dados para o estudo e a análise de proteínas
(http://ca.expasy.org).
O website do European Bioinformatics Institute tam
bém oferece referências a bancos de dados e um pacote
abrangente de ferramentas de análise (http://www.ebi.
ac.uk).
138 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
O Swiss PDB viewer (Deep View) pode ser baixado e
permite a visão de estruturas tridimensionais. O sof
tware e o manual estão disponíveis no site do Deep
View (http://spdbv.vital-it.ch).
Um excelente tutorial da Gale Rhodes pode ser aces
sado no http:// spdbv.vital-it.ch/TheMolecularLevel/
SPVTut/index.html.
O Protein Explorer está disponível em http://www.
umass.edu/microbio/chime/pe_beta/pe/protexpl.
Cn3D está disponível no National Center for Biotechno
logy Info: (NCBI) no web site do NIH http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml.
O Molecular Viewers permite fazer download de estru
turas de proteínas armazenadas no Banco de Dados
(Data Bank) (PDB) de RCSB (http://www.rcsb.org/
pdb/home/home.do).
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140 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

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Termos Chaves
a-hélice Hasselbalch interação hidrofóbica ponte de hidrogênio
aminoácidos acídicos estrutura-b interação iônica proteína fibrosa
aminoácidos básicos estrutura primária interactome proteína intrinsecamen
aminoácidos comuns estrutura quaternária ligação N-glicosídica te não-estruturada
aminoácidos derivados estrutura secundária ligação O-glicosídica proteína globular
apoproteína estrutura terciária ligação phi(j) resíduo invariável
chaperone família de proteínas ligação psi (y) selenocisteína
chaperonina glicoproteína lipoproteína substituição conserva
tiva
conformação nativa glóbulo fundido (molten motive estrutural
globule) substituição não-conser
desnaturação peptídeo
vativa
dinâmica de proteínas hélice de poliprolina tipo II pH isoelétrico (pI)
superdobra (superfold)
dobra de proteína homologia pK!a
zwitterions
equação de Henderson– interação de van der Waals polipeptídeo

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha 3. Proteínas chaperones:
1. Todas as seguintes são corretas sobre uma ligação A. todas requerem ATP para exercer seu efeito.
peptídica, exceto: B. quebram pontes dissulfeto incorretas, permi
A. apresenta caráter parcial de dupla ligação. tindo que as corretas se formem subsequente
mente.
B. é mais estável na configuração cis do que na
configuração trans. C. guiam o dobramento de cadeias polipeptídicas
em padrões que seriam termodinamicamente
C. tem restrição de rotação em torno da ligação
instáveis sem a presença de chaperones.
entre o carbono da carbonila e o nitrogênio.
D. da classe Hsp70 estão envolvidas no transpor
D. é planar.
te de proteínas através das membranas mito
E. na prolina, o nitrogênio é ligado à cadeia late condriais e do retículo endoplasmático.
ral.
E. atuam apenas sobre cadeias polipeptídicas
2. Em uma a-hélice: completamente sintetizadas.
A. grupos de cadeias laterais podem se alinhar 4. Proteínas podem ser separadas de acordo com ta
para formar uma face polar. manho por:
B. cada ligação peptídica forma duas pontes de A. focalização isoelétrica.
hidrogênio.
B. eletroforese em gel de poliacrilamida.
C. existem 3,6 aminoácidos por volta.
C. cromatografia de troca iônica.
D. todas as anteriores estão corretas.
D. cromatografia de exclusão molecular.
E. nenhuma das anteriores.
E. HPLC de fase reversa.

5. Arranjos semelhantes de motivos de estrutura se
cundária são frequentemente observados na estru
tura de dobras de domínios de proteínas. Qual das
seguintes está correta?
A. Superdobras são estruturas semelhantes de
proteínas relacionadas por função ou evolução
a partir do mesmo gene primordial.
As
B. dobras devem ser ou toda a ou toda b.
C. Existe só um tipo de domínio b.
D. Se uma proteína tiver mais de um domínio, to
dos os domínios serão idênticos.
E. Uma dobra comum tem um b-barril central
com as fitas conectadas por a-hélices em tor
no do lado externo.
6. Proteínas não-estruturadas
A. são as proteínas que foram desnaturadas por
calor.
B. não têm nenhuma função biológica.
C. podem ser induzidas a assumirem uma estru
tura definida por ligação com outras proteínas
ou com DNA ou RNA.
D. não têm nenhuma estrutura secundária ou
terciária.
E. têm regiões que são muito ricas em aminoáci
dos aromáticos.
Questões 7 e 8: Anomalias na síntese ou na estrutu
ra do colágeno causam disfunções em órgãos cardíaco,
osso, pele, articulações e olhos. Os problemas podem
resultar de genes de colágeno anormais, de modifica
ções pós-tradução anormais do colágeno ou de deficiên
cia de cofatores necessários por enzimas responsáveis
pelas modificações pós-tradução. Escorbuto, uma falta
de vitamina C, é um exemplo deste último tipo.
7. No colágeno:
A. pontes de hidrogênio intracadeias estabilizam
a estrutura nativa.
B. três cadeias com conformação em hélice tipo
poliprolina podem enrolar uma em torno da
outra para formar uma super-hélice devido à
estrutura da glicina.
C. os ângulos j fornecidos pela prolina são livres
para rodar.
D. regiões de super-helicidade compreendem a
estrutura inteira, exceto as extremidades N- e
C-terminais.
E. ligações cruzadas entre triplas hélices for
mam-se depois da lisina ter sido convertida em
alisina.
8. A formação de ligações covalentes cruzadas no co
lágeno:
A. ocorre durante a síntese da cadeia peptídica.
B. usa hidroxiprolina.
C. envolve resíduos de glicina.
CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 141
D. requer a conversão de alguns e-amino grupos
de lisina em d-aldeídos.
E. todos os anteriores.
Questões 9 e 10: Glicoproteínas, com moléculas de
carboidratos ligadas covalentemente a um ou mais ami
noácidos, participam de muitas funções normais e rela
cionadas com doenças, por exemplo, como determinan
tes antigênicos de grupos sanguíneos, reconhecimento
célula-célula e funcionamento do colágeno. Geralmente
o carboidrato é adicionado à proteína por reações en
zimáticas. Uma hemoglobina glicosilada, HbA1c, entre
tanto, é formada não-enzimaticamente em eritrócitos.
Na hiperglicemia prolongada, como em pacientes com
diabetes mellitus, a concentração de HbA1c sobe e pode
ser usada para seguir a eficácia do tratamento.
9. Glicoproteínas
A. são encontradas em células, mas não no plas
ma.
B. em uma membrana plasmática, tipicamente a
porção carboidrato fica no lado citosólico.
C. podem ter a porção carboidrato covalente
mente ligada à proteína em uma asparagina.
D. que têm carboidrato ligado a um hidroxila
sempre têm ligação com hidroxilisina.
E. de um dado tipo sempre têm cadeias de car
boidratos idênticas.
10. Em glicoproteínas,
A. o carboidrato é adicionado à medida que a ca
deia polipeptídica é transportada pelo retículo
endoplasmático e rede do Golgi.
B. a quantidade de carboidrato presente é sem
pre uma pequena porcentagem (<5%) do peso
da proteína.
C. a porção carboidrato consiste de um único
açúcar em cada aminoácido.
D. o tipo mais comum de ligação é com um grupo
a-amino de uma cadeia polipeptídica.
E. mudanças na composição não teriam qualquer
efeito sobre a função biológica.
Questões 11 e 12: Muitas hiperlipoproteinemias pa
tológicas resultam de anomalias nas velocidades de
síntese ou de depuração de lipoproteínas do sangue.
Estas são geralmente caracterizadas por níveis eleva
dos de colesterol e/ou triacilgliceróis no sangue. O tipo
I tem níveis plasmáticos muito altos de triacilgliceróis
(>1.000 g/dL), devido a um acúmulo de quilomícrons. O
tipo II (hipercolesterolemia familiar) tem colesterol ele
vado, especialmente na forma de LDL. Outra anomalia
de lipoproteínas é hipolipoproteinemia, na qual lipopro
teínas não se formam em virtude da incapacidade de
fazer uma apoproteína específica.
142 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
11. Todas as partículas de lipoproteínas do sangue têm
a mesma arquitetura geral, que inclui:
A. um núcleo (core) neutro de triacilgliceróis e
ésteres de colesterol.
B. lipídeos anfipáticos orientados com seus gru
pos de cabeça polar para a superfície e suas
cadeias hidrofóbicas orientadas para o centro.
C. a maior parte das apoproteínas de superfície
contendo hélices anfipáticas.
D. colesterol não-esterificado associado com a
capa externa.
E. todos os anteriores.
12. Na abetalipoproteinemia, quilomícrons, VLDL e
LDL estão ausentes no sangue. Qual dos seguintes
está correto?
A. Nessa doença, nenhuma apolipoproteína é sin
tetizada.
B. Se o sangue desses indivíduos for centrifuga
do, a banda de lipídeos seria encontrada pri
mariamente na metade superior do tubo.
Respostas
1. B Isso colocaria ambas as cadeias laterais no
mesmo lado da ligação, o que é menos favorável. C:
essa é uma consequência de A. D: todos os átomos
ligados a carbono e nitrogênio da ligação estão em
um plano comum. E: a prolina tem um imino gru
po.
2. D A: também poderiam se alinhar para formar
uma face não-polar. B: uma é com o quarto resíduo
acima da ligação, e a outra é com o quarto resíduo
abaixo. C: esta é uma das características de uma
a-hélice girando para a direita.
3. D Proteínas cruzam a membrana em um estado
desdobrado e dobram novamente depois de terem
atravessado a membrana. A: a família de chapero
nes hsp60 é ligada a ATP, mas a família hsp70 não
é. B: dissulfeto isomerases catalisam essa reação.
C: o produto final é termodinamicamente estável;
chaperones impedem interações intermediárias
desfavoráveis. E: chaperones hsp70 reagem com
cadeias polipeptídicas nascentes à medida que são
sintetizadas pelo ribossomo. A proteína pode, en
tão, ser entregue para um chaperone hsp60 para
facilitar o dobramento final.
4. D Outro método que separa com base em tama
nho é SDS-PAGE. A-C separam moléculas com
base em carga. E: HPLC de fase reversa efetua se
parações com base na polaridade.
5. E Esta estrutura a/b é encontrada na piruvato
quinase, por exemplo. A: isso é chamado uma fa
mília; superdobras são encontradas em proteínas
não relacionadas por função ou origem. B: ver E.
C. A incapacidade de sintetizar apolipoproteína
ApoB-100 e ApoB-48 seria responsável pelo
padrão apresentado nessa doença.
D. Apolipoproteínas são compostas principal
mente de estrutura b.
E. Todos os anteriores.
Problemas
13. Em um gráfico de equivalentes de OH– versus pH,
o pH é ~2 quando 0,5 equiv foram usados, o pH é
~6 para 1,5 equiv, e o pH é ~9,5 para 2,5 equiv. Que
aminoácido foi titulado? Em cada caso, o ponto in
dicado é o ponto do meio de uma parte íngreme da
curva.
14. Após purificação, a reação de Edman foi usada
para sequenciar um dodecapeptídeo, gerando os
seguintes dados: o aminoácido C-terminal é iso
leucina; o aminoácido N-terminal é metionina; e
os fragmentos peptídicos são Ala-Ala-Ile, Leu-Arg
-Lys-Lys-Glu-Lys-Glu-Ala, Met-Gly-Leu e Met-Phe
-Por-Met. Qual é a sequência desse peptídeo?
C: existem vários tipos diferentes. D: uma proteína
pode ter múltiplos domínios diferentes, e os dife
rentes domínios podem, em alguns casos, ter dife
rentes funções.
6. C Seus domínios não-estruturados permitem que
se liguem a uma variedade de parceiros. A: essas
proteínas são naturalmente desprovidas de uma
conformação dobrada estável. B: elas desempe
nham várias funções como, por exemplo, proteínas
de arcabouço, quinases dependentes de ciclinas e
muitas outras. D: elas podem ter regiões com es
trutura secundária. E: elas tendem a ser ricas em
aminoácidos polares e carregados e pobres em aro
máticos.
7. B Contatos íntimos no interior de uma tripla hélice
são possíveis só quando o grupo R dessa posição
for muito pequeno, isto é, hidrogênio. A: pontes de
hidrogênio no colágeno são intercadeias. C: o ân
gulo j é parte do anel da prolina e não está livre
para rodar. D: embora a afirmativa esteja correta
para o colágeno tipo I, as regiões de super-hélice
em outros tipos de colágeno podem ser quebradas
por regiões de domínios globulares. E: a conversão
e as ligações cruzadas são extracelulares.
8. D Estas então reagem umas com as outras ou com
grupos e-amino de lisinas não modificadas. A: é
pós-tradução. B, D: esta não é a função da hidroxi
prolina ou da glicina.
9. C No tipo N-ligado, a asparagina está na sequên
cia Asn-X-Thr(Ser). A: a maioria das proteínas
plasmáticas, exceto albumina, é glicoproteína. B:

carboidrato fica no lado de fora da célula para fun
ções como reconhecimento célula-célula. D: essa
ligação ocorre só no colágeno. Outros carboidratos
O-ligados fazem a ligação com serina ou treonina.
E: a estrutura dos carboidratos não é determinada
por genes e é variável.
10. A O conteúdo de carboidratos não é controlado
por genes, mas é um evento co- ou pós-tradução.
B: o conteúdo é muito variável, por exemplo, a gli
coforina da membrana de eritrócitos tem 60% de
carboidratos. C: o carboidrato ligado pode ser um
único carboidrato ou até 15 resíduos de carboidra
tos. D: esta é uma ligação tipo IV encontrada na
HbA1c, mas não é o tipo mais comum. E: poderia
haver uma profunda mudança na função.
11. E Todas as lipoproteínas compartilham essas ca
racterísticas. C: a face polar interage com água, e a
face hidrofóbica é orientada em direção ao centro.
D: o grupo hidroxila do colesterol é suficientemen
te polar para que se oriente em direção à capa ex
terna.
12. C Apo B-100 é uma apolipoproteína primária de
CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA • 143
LDLs e VLDLs. Apo B-48, uma forma truncada de
B-100, é encontrada em quilomícrons. A: como as
várias apolipoproteínas vêm de genes diferentes,
não seria de se esperar que todos os genes fossem
afetados. B: as lipoproteínas que faltam são as
encontradas na parte superior do tubo após cen
trifugação. D: apolipoproteínas associadas com
lipídeos têm um alto conteúdo de α-hélices anfi
páticas.
13. Esta é uma curva de titulação de um aminoácido
com três grupos dissociáveis. Os pontos indicados
representam a meia-titulação de cada um desses
grupos, e os pHs são os valores de pK de cada gru
po. Com esses valores de pK, o aminoácido deve ser
histidina.
14. Você deve ter os aminoácidos N- e C-terminais
corretos, e o número total de aminoácidos (12)
no peptídeo também correto. Usando esses valo
res e sobrepondo os fragmentos, você deve obter a
sequência Met-Phe-Pro-Met-Gly-Leu-Arg-Lys-Glu
-Ala-Ala-Ile. Observe que o fragmento Lys-Glu não
dá nenhuma informação adicional para o sequen
ciamento.
144 • PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS
PARTE II
CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA
TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
4
Replicação,
Recombinação
e Reparo do DNA
Howard J. Edenberg
Professor Chancellor, Indiana University School of Medicine
CONTEÚDO
4.1 CARACTERÍSTICAS COMUNS DA REPLICAÇÃO,
RECOMBINAÇÃO E REPARO, 146
4.2 REPLICAÇÃO DO DNA: MECANISMOS FUNDA
MENTAIS, 146
4.3 REPLICAÇÃO DO DNA: ENZIMAS E REGULA
ÇÃO, 156
4.4 RECOMBINAÇÃO, 164
4.5 DANOS AO DNA E MUTAÇÕES, 169
4.6 REPARO DO DNA, 172
Conceitos Chaves
• Replicação, reparo e recombinação do DNA envol
vem transesterificação, a troca de parceiros numa
ligação fosfodiéster. Todos os três processos ba
seiam-se no pareamento complementar de bases.
• A replicação do DNA requer um molde, um conjun
to de enzimas e os precursores adequados. É semi
conservativa, com as fitas parentais separando-se,
de modo que cada uma possa ser um molde para a
síntese de uma fita complementar. A dupla-hélice
se abre na forquilha de replicação e seguem-se uma
etapa de iniciação, a adição sequencial de nucleo
tídeos complementares e a ligação de fragmentos
adjacentes. O processo é extremamente preciso.
• 145
CORRELAÇÕES CLÍNICAS
4.1 A Quimioterapia Pode Ter Como Alvos Precurso
res da Síntese de DNA, 148
4.2 Análogos de Nucleosídeos e Resistência a Drogas
na Terapia do HIV, 150
4.3 Topoisomerases Como Antibióticos, 158
4.4 Câncer e o Ciclo Celular, 163
4.5 Recombinação e Câncer, 164
4.6 Recombinação e Terapia Gênica, 169
4.7 Cisplatina e o Tour de France, 170
4.8 Análogos da Base Tiopurina Como Drogas, 171
4.9 Medicina Personalizada, 172
4.10 Xeroderma Pigmentoso, 175
4.11 Reparo de Pareamento Errado e Câncer, 177
• A replicação é muito semelhante em células bac
terianas e de mamíferos, mas as diferenças permi
tem que antibióticos inibam seletivamente o cres
cimento bacteriano.
• A replicação é muito regulada, como parte do ci
clo celular. A telomerase preserva as extremidades
dos cromossomos.
• A recombinação é essencial para a segregação cor
reta de cromossomos entre células filhas. Um inter
mediário chave é uma estrutura de DNA chamada
Junção Holliday. Erros de recombinação podem le
var ao câncer.
146 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
• Mudanças em um único par de bases dos 6 bilhões
de pares de bases do genoma humano pode levar
a doença. Estima-se que ocorram 10.000–50.000
eventos danosos, como radiações e reações quí
micas, no DNA por célula por dia. Existem várias
reações diferentes para reparar DNA danificado.
Reparo por excisão de base e reparo por excisão
4.1 CARACTERÍSTICAS
COMUNS DA REPLICAÇÃO,
RECOMBINAÇÃO E REPARO
Analisando-se “os três Rs” do DNA – replicação, re
combinação e reparo – é útil considerar algumas simi
laridades comuns a eles. Os mecanismos fundamentais
da replicação, recombinação e reparo foram conserva
dos ao longo da evolução. Pelo fato de esses processos
agirem sobre o mesmo substrato, cadeias de DNA, eles
compartilham mecanismos químicos fundamentais
para estabelecer e quebrar ligações fosfodiéster. A quí
mica do DNA é, em grande parte, a de suas ligações
fosfodiéster. O tema de um ataque nucleofílico a uma
ligação fosfodiéster, levando a uma troca entre os par
ceiros envolvidos na ligação, é comum a todos os três
processos. A natureza em dupla fita do DNA celular e
a complementaridade das duas fitas também desempe
nha um papel importante em todos os três processos.
Como a informação genética está presente em duas có
pias, cada fita pode servir de molde para a síntese ou o
reparo da fita oposta. A natureza antiparalela das duas
fitas é crítica em todos os processos que agem sobre o
DNA. Os três processos compartilham muitas enzimas.
A necessidade de precisão e regulação, contudo, leva à
especialização de um grupo de enzimas para uma tare
fa em particular. O reconhecimento de semelhanças e
diferenças tornará mais fácil o entendimento da repli
cação, da recombinação e do reparo.
Como carregador da informação genética, o DNA
de uma célula deve ser duplicado, mantido e passado
às células filhas com extraordinária exatidão. A escala
do problema é grande. A bactéria comum Escherichia
coli (E. coli) possui um genoma contendo 4,6 milhões
de pares de bases (pb). O genoma humano consiste de
duas cópias de 23 cromossomos, totalizando aproxima
damente 6 × 109pb. Cromossomos humanos individuais
contêm, cada um, uma única molécula de DNA, cujo ta
manho varia de 34 milhões pb para o menor cromosso
mo, a 263 milhões pb para o maior.
A precisão geral da replicação é extremamente alta:
Durante um único ciclo de replicação, em média ape
nas um erro é introduzido por bilhão pb. Entretanto,
mesmo com essa extraordinária precisão, um punhado
de erros é introduzido numa célula humana comum a
cada divisão celular. Esses erros são mutações, altera
ções hereditárias na sequência do DNA. Mutações são
de nucleotídeo são processos muito precisos que
removem base(s) danificada(s). Defeitos nos me
canismos de reparo do DNA podem causar câncer.
Alguns mecanismos de reparo introduzem erros no
•
DNA como um custo de deixar células lidarem com
danos que bloqueiam a replicação.
frequentemente prejudiciais; podem afetar a viabilida
de celular ou desencadear o crescimento descontrola
do característico do câncer. Algumas doenças graves
podem resultar de troca de um único par de bases no
genoma humano de 6 × 109 pb. Eucariotos têm a tarefa
adicional de assegurar que todas as partes do genoma
sejam replicadas apenas uma vez durante cada ciclo ce
lular, para evitar anomalias cromossômicas ou desequi
líbrio na expressão gênica.
Replicação precisa, crítica como é, não é suficiente.
O DNA está sujeito ao contínuo ataque tanto de agen
tes químicos como físicos às células, incluindo a água,
espécies ativas de oxigênio que surgem como subpro
dutos do metabolismo celular normal, agentes quími
cos de alimentos e do meio ambiente, e radiação. Há
sistemas que reconhecem e reparam danos ao DNA e,
consequentemente, ajudam a manter a integridade do
genoma. Apesar de todo esse cuidado, o acúmulo de
mutações pode levar a morte celular, envelhecimento
e câncer.
4.2 REPLICAÇÃO DO
DNA: MECANISMOS
FUNDAMENTAIS
A Base
Replicação leva à duplicação do DNA, preservando
assim a informação genética carregada na sequência
de bases. Replicação requer um molde para fornecer a
informação de sequência. O mecanismo básico da repli
cação do DNA ficou óbvio assim que a estrutura com
plementar em dupla fita do DNA foi descoberta. Como
cada fita é complementar à outra, com um A em uma
fita sempre pareando com um T na outra e, do mesmo
modo, para C e G, as duas fitas podem ser separadas e
cada uma pode ser usada como molde para a síntese de
um novo complemento. Isso é chamado replicação se
miconservativa, visto que metade da molécula de DNA
parental (uma fita) é conservada em cada nova dupla
-hélice, pareada com uma fita complementar recém-sin
tetizada (Figura 4.1).
Um molde sozinho não é suficiente para a síntese
de DNA. As DNA polimerases catalisam a adição de
mononucleotídeos a uma cadeia nascente. As DNA po
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 147

DNA, a própria cadeia em crescimento, pareada pelas

bases com o molde, serve de primer para a adição do
nucleotídeo seguinte.

TABELA 4.1 Exigências para replicação do DNA

Molde Fornece a informação de sequência
Iniciador Fornece 3!-OH livre ao qual os
(primer) nucleotídeos são adicionados
Precursores 5!-Desoxinucleosídeos trifosfatos
(5!-dNTPs)
Enzimas DNA polimerases, braçadeiras
corrediças, helicases, primases,
proteínas de ligação à fita simples de
DNA, nucleases, ligases

Química da Elongação da Cadeia

A química da replicação do DNA, reparo e recombi
nação é essencialmente a da formação das ligações fos
fodiéster que unem os nucleotídeos vizinhos em uma
cadeia de DNA. A Figura 4.3 mostra a formação da li
gação fosfodiéster entre uma cadeia curta de DNA (um
primer) e o nucleotídeo que está sendo incorporado.
Esse processo se repete para cada nucleotídeo adicio
nado à cadeia em crescimento.

Adição de um nucleotídeo a uma cadeia em cres

FIGURA 4.1 Síntese semiconservativa do DNA.
As duas fitas parentais se separam, e cada uma é molde para a
síntese de uma fita filha complementar. Portanto, os dois dú
plices filhos têm, cada um, uma fita parental e uma fita recém
-sintetizada.
limerases não iniciam uma fita ligando os dois primei
ros nucleotídeos; elas ligam nucleotídeos a um iniciador
(primer) existente, que fornece o grupo 3!-hidroxila
(Figura 4.2, Tabela 4.1). A necessidade de um primer
não se deve à química da formação da ligação fosfodi
éster, como demonstrado pela capacidade de as RNA
polimerases iniciarem cadeias polinucleotídicas de
novo (sem primers). Ao contrário, provavelmente evo
luiu porque aumenta a precisão geral da replicação. A
revisão (ver p. 149) durante a polimerização dos pri
meiros nucleotídeos não é efetiva porque há poucos pa
res de bases para estabilizar a dupla-hélice e permitir
o reconhecimento do pareamento de bases correto. Na
maioria dos organismos, o primer inicial é feito de ribo
nucleotídeos por uma enzima chamada primase. Os pri
meiros poucos nucleotídeos são mar
cados para eventual remoção porque iniciador 5!
cimento não é um processo espontâneo, porque a di
minuição da entropia é grande. Por essa razão, os
nucleotídeos precursores do DNA são 5!-desoxirribonu
cleotídeos trifosfato (5!-dNTPs; Correlação Clínica 4.1).
A ligação fosfodiéster que conecta o primeiro fosfato
(a) (ligado ao carbono 5! do açúcar) e os dois fosfatos
de fora (β e γ) sofrem ataque nucleofílico pelo 3!-OH da
cadeia de DNA em crescimento (Figura 4.3). A ligação
não é hidrolisada, mas transesterificada; a ligação fos
fodiéster que ligava o a-fosfato ao β-fosfato, agora liga
o a-fosfato à extremidade 3! da cadeia em crescimento.
Os dois fosfatos terminais são liberados como pirofos
fato inorgânico, que é hidrolisado por fosfodiesterases
presentes nas células. A quebra do pirofosfato torna a
reação essencialmente irreversível. Muito da química
da replicação, do reparo e da recombinação envolve
reações de esterificação como esta.
3! OH

são ribonucleotídeos; sua subsequen molde 5!

te remoção deixa uma falha que pode

FIGURA 4.2 Molde e iniciador (primer).
ser preenchida com maior precisão, O substrato para a adição de um nucleotídeo é um primer (marrom claro) ligado por
porque a ressíntese é feita por elon pontes de hidrogênio a um molde (marrom escuro). O molde fornece informação sobre
gação de uma fita mais longa de DNA. qual nucleotídeo adicionar. O primer fornece um grupo 3!-hidroxila livre ao qual nu
Durante o crescimento da cadeia de cleotídeos podem ser adicionados. As duas fitas são antiparalelas.
148 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.1

A Quimioterapia Pode Ter Como Alvos Precursores da Síntese de DNA

Como células tumorais replicam a velocidades maio rios à síntese de DNA. Hidroxiureia é um antimeta
res do que a maioria dos tecidos normais, grande parte bólito que inibe a ribonucleotídeo redutase, a enzima
da quimioterapia é direcionada para a inibição da repli chave necessária para fazer desoxirribonucleotídeos a
cação do DNA. Células que se dividem ativamente são partir de ribonucleotídeos. Isso diminui as concentra
mais sensíveis a essas drogas do que células quiescen ções dos dNTPs, inibindo assim síntese de DNA, sem
tes; isso fornece uma janela terapêutica. Além das célu alterar dramaticamente as reservas de rNTPs necessá
las de divisão rápida do câncer, os alvos da quimiotera rios à transcrição. Hidroxiureia é usada primariamente
pia, há células normais que se dividem rapidamente no contra melanoma e doenças mieloproliferativas como
trato intestinal, na medula óssea e nos folículos dos ca leucemia mielógena crônica; pode ser usada em com
belos; a sensibilidade dessas células normais de divisão binação com radioterapia que danifica o DNA porque,
rápida explica muitos dos efeitos colaterais limitantes diminuindo as reservas de dNTPs, também é capaz de
da quimioterapia. inibir o reparo do DNA. O principal efeito colateral é a
mielossupressão, decorrente da inibição da síntese de
Uma maneira de inibir a replicação é interferir com DNA na medula óssea, o que leva à queda de eritrócitos,
os reservatórios de desoxirribonucleotídeos necessá leucócitos e plaquetas.

DNA Polimerases primers (iniciadores) e utilizam precursores 5!-dNTP

(Figura 4.3). As poderosas técnicas de laboratório para
DNA polimerases catalisam a adição de nucleotíde sequenciamento do DNA e reação da polimerase em
os durante a elongação da cadeia. Requerem molde e cadeia (polymerase chain reaction, p. 267) baseiam

A T A G T T C A
T A T C A A G

2! 2!
3! 3! A
O O O O O O OH O
O O O O O OH
–O
P P P P P P –O P G
O O O O O O O 2!
–O 5!–O –O –O –O –O O 5!
–O
3!
P OH
O 3!
O O 2! OH
O
–O P –O Pα
O O
–O O 5!
–O P
β O
O
–O P
γ O
–O
A T A G T T C A
T A T C A A G

2! 2!
3!
O 3!O O O O O O O O O O O OH
–O 5! P P P O P P P
P
O O O O –O O O –O O
–O –O –O –O –O 5!

O
+ –O
P
O
O
PPi
–O PO
–O =
pirofosfato

FIGURA 4.3 Formação de uma ligação fosfodiéster.

Um nucleotídeo trifosfato que forma pontes de hidrogênio corretas com o molde no sítio ativo de uma DNA polimerase que está
representada em púrpura. O 3!-OH do primer ataca o fosfato mais interno (α) do nucleotídeo que está chegando, deslocando assim
os dois fosfatos terminais como pirofosfato (inserto). Isso resulta na elongação do primer por um nucleotídeo. O ciclo é repetido
enquanto o molde estiver disponível.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 149

-se na necessidade de molde e primers para permitir a Essa combinação resulta na remoção de praticamente
polimerização do DNA. As células contêm várias DNA todos os nucleotídeos pareados incorretamente antes
polimerases que desempenham funções especializadas, da adição do nucleotídeo seguinte. Também leva à re
incluindo vários aspectos da replicação e da cópia de moção de alguns nucleotídeos adicionados corretamen
molde danificado (Tabela 4.2). DNA polimerases que te, mas esse é um preço a ser pago pela maior precisão
participam da replicação ajudam a garantir a precisão graças à revisão. A capacidade de discriminar entre os
de dois modos: pela seleção inicial do nucleotídeo apro nucleotídeos incorporados correta e incorretamente
priado a ser adicionado e pela revisão enzimática. fica comprometida quando a cadeia em crescimento é
muito pequena, porque a força do pareamento de ba
A seleção inicial baseia-se no encaixe do nucleotídeo
ses entre uma cadeia curta e o molde é fraca. Essa é a
que está chegando ao sítio ativo da polimerase. Um nu
explicação mais provável para a evolução das DNA poli
cleotídeo que chega e faz pontes de hidrogênio corretas
merases incapazes de iniciar cadeias de novo, e para o
com o nucleotídeo da fita molde pode ser adicionado à
uso de ribonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA.
cadeia em crescimento. Um nucleotídeo que chega, mas
não faz as pontes de hidrogênio corretas, não se alinha Algumas DNA polimerases mutadas são, na verda
apropriadamente para a catálise. Mudanças conforma de, mais precisas do que a polimerase normal. Isso é
cionais na própria DNA polimerase são críticas para um paradoxo se considerar-se que há uma vantagem
garantir essa precisão, levando a uma taxa de erros na evolutiva para precisão cada vez maior. Entretanto,
faixa de 10–4 a 10–6. Embora bom para muitos proces há razões para se esperar que, acima de certo nível,
sos, não está nem perto da precisão necessária para a maior precisão não seja vantajosa e possa, de fato, ser
replicação. desvantajosa. Primeiro, uma revisão extremamente
A segunda maneira de as DNA polimerases aumenta precisa é energeticamente custosa. Para garantir que
rem a precisão é por revisão. Isso é fei
para
to por5!,uma
queatividade
remove nucleotídeos pare
exonucleolítica 3! (a) Nucleotídeo correto na extremidade 3!.
5! 3! OH
ados incorretamente a partir da extre 5!
midade 3! da cadeia nascente. A revisão
é parte integrante de muitas DNA poli (b)
Nucleotídeo pareado incorretamente na extremidade 3!.
merases replicativas, mas também pode 3! OH
ser feita por uma proteína associada ao 5!
complexo de replicação. Um primer 5!
com um nucleotídeo terminal pareado
corretamente é um bom substrato para FIGURA 4.4 Revisão.
a adição do próximo nucleotídeo, mas (a) Quando o nucleotídeo correto é adicionado à extremidade 3! de um primer, o
um mau substrato para a exonuclease resultado é um bom substrato para a adição de um nucleotídeo, mas um mau subs
trato para a exonuclease 3! para 5!. (b) Nas raras ocasiões em que um nucleotídeo
3! para 5!(Figura 4.4). Um primer com
incorreto é adicionado ao primer, o primer resultante contendo um erro de parea
um nucleotídeo terminal pareado erro
mento na extremidade 3! é um mau substrato para adição de um nucleotídeo, mas
neamente é um mau substrato para a um bom substrato para a exonuclease de revisão 3! para 5!, que remove o nucleotí
adição de um nucleotídeo, mas um bom deo pareado incorretamente. Isso deixa o primer mais curto, mas pronto para que o
substrato para a exonuclease 3! para 5!. nucleotídeo correto seja incorporado.

TABELA 4.2 DNA polimerases

Função Enzima de E. coli Enzima eucariótica
Iniciação DnaG primasea Pola/primaseb

Síntese da fita contínua (líder) Pol III Pold

Síntese da parte inicial do fragmento de Okazaki Pol a/primase
Síntese da maior parte do fragmento de Okazaki Pol III Pold
Preenchimento da falha após a remoção do primer Pol I Pold
Bypass da lesão Pol IV, Pol V Pole, Pol x, Polh, Poli
Bypass da lesão, reparo do DNA Pol II Pol e?
Reparo por excisão de base Pol I Pol β
Replicação do DNA mitocondrial Polγ
aDnaG não é considerada uma DNA polimerase; ela faz um RNA iniciador.
bEm eucariotos, o componente primase do complexo pola/primase faz o RNA iniciador do começo, que é estendido 20–30 ntpelo componente DNA

polimerase a usando dNTPs.

150 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
praticamente todas as bases incorporadas incorreta
mente sejam removidas, uma polimerase também teria
de remover um grande número de bases incorporadas
corretamente que se moveram levemente em relação ao
molde, em virtude de flutuações térmicas normais. Isso
retardaria muito a replicação e utilizaria muita energia
adicional na forma de dNTPs. Segundo, a capacidade
dos sistemas de reparo do DNA para lidar com erros
residuais reduz as vantagens de polimerases mais pre
cisas. Também se argumenta que um baixo nível de
mutações fornece a matéria-prima para evolução, pro
duzindo uma população com alguma variação genética,
mais capaz de sobreviver a condições variáveis.
Apesar de sua alta precisão, as polimerases podem
incorporar análogos de nucleotídeos. Análogos de nu
cleosídeos são frequentemente usados em quimiotera
pia para matar células de rápido crescimento no câncer
ou vírus responsáveis por doenças graves. Análogos que
são fosforilados a nucleotídeos podem ser incorporados
ao DNA, onde podem inibir o prosseguimento da sín
tese ou levar a um alto índice de mutações. Diferenças
entre polimerases bacterianas ou virais e do hospedei
ro em sua capacidade de incorporarem análogos de nu
cleotídeos podem fornecer uma janela terapêutica pela
qual os médicos podem atingir preferencialmente célu
las infectadas (Correlação Clínica 4.2).
CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.2
Análogos de Nucleosídeos e Resistência a Drogas na Terapia do HIV
A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)
é causada por infecção pelo retrovírus Vírus da Imuno
deficiência Humana (HIV). Uma etapa chave no ciclo
de vida do HIV é a síntese de uma cópia em DNA do
RNA do genoma viral, catalisada por uma transcriptase
reversa. A transcriptase reversa é um importante alvo
da quimioterapia porque não é essencial para células
normais.
Zidovudine (AZT; 3!-azido-2!,3!-didesoxitimidina) foi
a primeira droga aprovada para o tratamento de infecção
por HIV. É um análogo de nucleosídeo com um grupo azi
da no açúcar. Pode ser fosforilado para a forma trifosfato,
que compete com dTTP para incorporação no transcrito
reverso. Uma vez incorporado, termina a cadeia nascen
te do transcrito porque o grupo azida no carbono 3! do
açúcar não é substrato para adição de nucleotídeo. AZT
é muito menos eficiente na competição com as DNA poli
merases celulares, mais precisas, fornecendo uma janela
terapêutica na qual o efeito ocorre, primariamente, sobre
a replicação viral. Entretanto, efeitos colaterais incluem
toxicidade para a medula óssea, que contém células de
divisão rápida, e miopatia, que pode estar relacionada à
toxicidade mitocondrial, que contém sua própria DNA
polimerase, pol d. Outros análogos de nucleosídeos têm
Separando as Fitas Parentais: a
Forquilha de Replicação
Procariotos e eucariotos resolveram os problemas da
replicação de maneiras fundamentalmente semelhan
tes. A separação das duas fitas parentais de DNA per
mite que cada uma sirva de molde para uma fita nova
complementar. A separação das fitas parentais cria uma
estrutura chamada forquilha de replicação (Figura 4.5).
Essa separação requer considerável investimento ener
gético. A fusão do DNA de dupla-fita em duas fitas únicas
normalmente só ocorre em temperaturas elevadas (aci
ma de 90 °C). Para separar as fitas parentais em tem
peratura fisiológica, as células usam enzimas chamadas
helicases. As helicases ligam-se ao DNA de fita única e
deslizam sobre ela em uma direção fixa, com cada etapa
exigindo hidrólise de ATP. Isso “separa” o DNA parental,
formando uma forquilha de replicação (Figura 4.5).
Na ausência de proteínas adicionais, as fitas pa
rentais rapidamente se associariam atrás da helicase,
porque as fitas complementares estão próximas e ali
nhadas em registro correto. A reassociação, ou “reane
lamento” (reannealing), é impedida por proteínas que
se ligam a DNA de fita simples (SSBs, single-stranded
DNA-binding proteins) (Figura 4.5). SSBs mantêm
as fitas separadas, reduzem estruturas secundárias em
sido usados para tratar infecção por HIV. A didanosina
(DDI; 2!,3!-didesoxiinosina) e a zalcitabina (didesoxiciti
dina) também funcionam como terminadores de cadeia
após incorporação de seus derivados fosforilados pela
transcriptase reversa do HIV.
As transcriptases reversas não fazem revisão, por
tanto sua taxa de erro é muito maior do que a das DNA
polimerases celulares. Essa alta taxa de erro complica o
tratamento da AIDS porque a população viral presente
em um paciente contém muitos mutantes, e as mutações
continuam a crescer ao longo do tempo. É provável que
alguns desses mutantes sejam resistentes a um dado
agente terapêutico. Por isso, muitas drogas, inicialmen
te, reduzem a carga viral, mas, mais tarde, tornam-se
ineficientes em virtude do crescimento seletivo de vírus
nos quais o alvo da droga está mutado para uma forma
insensível. Terapia combinada, com múltiplas drogas
que têm como alvos diferentes proteínas virais, é uma
tentativa de contornar esse problema.
Há interessantes animações sobre o ciclo de vida
do HIV em http://www.galazygoo.org/biochem/hiv_li
fecycle.html e http://www.roche-hiv.com/portal/eipf.
pb/hiv/Roce-HIV/hivlifecycle#.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 151

potencial (grampos que poderiam impedir a polimeri
zação) e alinham as fitas moldes para rápida síntese de
DNA. As SSBs são importantes não só na replicação,
mas também na recombinação e no reparo.
Resolvendo o Problema da
Polaridade: Síntese de DNA
Semidescontínua
Fitas antiparalelas em uma forquilha representam
um problema imediato para o processo de replicação:
uma fita filha está orientada com a extremidade 3! vol
tada para a forquilha, e a outra tem sua extremidade 5!
voltada para a forquilha. (Figura 4.5). A
3!
fita com seu 3!-OH orientado em direção
à forquilha pode ser elongada simples- 5!
mente pela adição sequencial de novos
nucleotídeos a essa extremidade (ver
Figura 4.3); essa fita é chamada fita con DNA novo
tínua, líder ou anterógrada. A outra fita
de RNA sintetizadas por uma enzima especial chamada
primase. Em células eucarióticas, os primers de RNA
têm 8-10 nucleotídeos de comprimento. Esses nucleolí
deos fornecem um 3!-OH livre ao qual o primeiro deso
xirribonucleotídeo pode ser covalentemente adicionado
(Figura 4.7). Portanto, cada fragmento de Okazaki con
tém um segmento curto de RNA em sua extremidade 5!,
covalentemente ligado ao DNA.
Elongação da Fita
Cadeias de DNA crescem por adição repetida de
nucleotídeos às extremidades 3!-OH das cadeias, pelo
mecanismo apresentado na Figura 4.3. Essa reação é
catalisada por uma DNA polimerase.
SSB
3!
Helicase
3!
5!

apresenta o problema: nenhuma DNA

polimerase catalisa a adição de nucleo Fitas
tídeos
em crescimento.
à extremidade
Mesmo 5! de umaquando
assim, cadeia parentais
5!
SSB
5!
3!
vista em larga escala, a replicação pa
rece ocorrer ao longo de ambas as fitas
na direção do movimento da forquilha. Abertura da forquilha

Esse problema é resolvido pela síntese

de uma fita como uma série de peque FIGURA 4.5 Separação das fitas parentais em uma forquilha de replicação.
nos pedaços, cada um feito na direção A síntese de DNA ocorre em uma estrutura chamada forquilha de replicação, na
normal 5! para 3! e, depois, sua ligação qual as fitas parentais são separadas. Uma helicase é necessária para separar fitas
(Figura 4.6). A fita feita em pedaços é parentais e permitir que a forquilha progrida. As proteínas que se ligam ao DNA de
fita simples (SSBs) são necessárias para manter as fitas separadas. As fitas parentais
chamada de fita descontínua, tardia
enrolam-se uma em torno da outra, mais ou menos, uma vez a cada 10,5 pares de
ou retrógrada (movimento de trás para bases, e devem se desenrolar para se separar; isso gera problemas topológicos. Note
frente); os pequenos pedaços dos quais que uma das fitas em crescimento está orientada com sua extremidade 3! voltada para
a fita descontínua é feita são chamados a forquilha, enquanto a outra está orientada com sua extremidade 5! voltada para a
fragmentos de Okazaki, em homenagem forquilha.
a Reiji Okazaki, que demonstrou esse
processo pela primeira vez. Fragmentos de Okazaki
em células humanas têm em média 130-200 nucleo 3!
5!
tídeos de comprimento. Em E. coli, são cerca de 10 Fita contínua, líder
vezes maiores. O processo geral é chamado síntese
semidescontínua, porque uma fita é sintetizada con 3! 5!
Fragmentos de Okazaki 5! 3!
tinuamente, e a outra descontinuamente.
Fitas parentais

tardia, retrógrada
5!
3!
Movimento da Forquilha de Fita descontínua,

Replicação
Início
DNA polimerases requerem iniciadores (pri
mers). A fita contínua (líder) requer apenas um
evento iniciador, que ocorre no início da replicação
(p. 160). Porém, cada fragmento de Okazaki da fita
descontínua (retrógrada, tardia) requer um primer
separado. Esses primers são pequenas extensões
FIGURA 4.6 Resolvendo o problema de polaridade: síntese
semidescontína de DNA.
Ambas as fitas em crescimento são elongadas em suas extremidades
3!. A que tem sua extremidade 3! voltada para a forquilha pode cres
cer continuamente; é chamada fita contínua ou líder. Como nenhuma
DNA polimerase pode adicionar nucleotídeos à extremidade 5! de uma
cadeia em crescimento, a fita com sua extremidade 5! voltada para a
forquilha é feita como uma série de pequenos pedaços chamados frag
mentos de Okazaki, cada um sintetizado na direção de 5! para 3! e,
depois, unidos. Esta é chamada fita descontínua, retrógrada ou tardia.
152 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

(a) 3!
Remoção do Primer 5!
Fita
Os primers de RNA são removidos da contín
uoa
Fitas parentais
extremidade 5! dos fragmentos de Okazaki 5!
por enzimas com atividade de RNA hibri 3!
3!
dase (RNaseH). RNaseH catalisa a hidróli tínua
scon 5!
de
se de uma cadeia de RNA ligada por pontes Fita
de hidrogênio a uma cadeia de DNA (isto é, 3!
um híbrido RNA-DNA). Em eucariotos, uma 5!

endonuclease de flap (FEN1) também parti (b) 3!

cipa do processo; FEN1 corta em uma dobra 5!
quando a porção RNA foi destacada do mol
de. Todos os ribonucleotídeos são removidos,
5!
deixando apenas DNA. 3!
3!
5!

Preenchimento da Falha 5! 5!
3!
Remoção do RNA primer deixa uma fa
lha (gap) (Figura 4.7). A síntese deve preen
cher essa falha com desoxirribonucleotídeos, (c) 3!
5!
deixando apenas uma incisão (nick). Note a
terminologia: uma falha (gap) significa que
pelo menos um nucleotídeo está faltando. 5!
3!
Uma incisão (nick) é uma interrupção no 5! 5! 5! 3!
esqueleto fosfodiéster, sem falta de nucleotí
deo. A falha é preenchida com desoxirribonu
3!
cleotídeos por uma DNA polimerase, usando
o fragmento de Okazaki mais recentemente
sintetizado como primer. O fragmento de (d) 3!
5!
Okazaki fornece uma combinação primer
-molde segura, que permite revisão precisa.
5!
Ligação 3!

A incisão remanescente é selada por

uma DNA ligase. O selo da incisão requer a
formação de uma nova ligação fosfodiéster.
Portanto, requer energia, fornecida pelo aco
plamento da reação com a quebra de ATP
em eucariotos ou NAD+, em procariotos. Na
primeira etapa, um resíduo de AMP é ligado
à enzima (Figura 4.8). Esse AMP é transferi
do para a extremidade 5! da incisão. O AMP
serve como um bom grupo que sai, deslocado
pelo 3!-OH do outro lado da incisão; essa últi
ma etapa é comparável à reação que adiciona
um nucleotídeo a uma cadeia em crescimen
to, mas com um AMP como grupo de sai, em
lugar de um pirofosfato.
Desenrolando Fitas Parentais
A discussão, apresentada aqui, e os dia
gramas foram simplificados, desenhando-se
as fitas de DNA como linhas retas (Figura
4.7). Mas as fitas parentais enrolam-se uma em
torno da outra, aproximadamente uma vez
a cada 10,5 pb (Figura 4.5). Células não po
dem ignorar esse enrolamento. Na bactéria
E. coli, por exemplo, o genoma pode replicar
(e) 3!
5! 3!
5!
5!
3! 3!
3!
5!
FIGURA 4.7 Síntese de DNA em uma forquilha de replicação.
(a) A fita contínua é elongada em sua extremidade 3! por adições repetidas
de nucleotídeos, como mostra a Figura 4.2. Um fragmento de Okazaki fei
to previamente, com um pequeno RNA iniciador é mostrado do outro lado.
(b) Usando a fita parental como molde, primase sintetiza um RNA iniciador
(roxo). (c) DNA polimerase estende covalentemente a extremidade 3! do
RNA iniciador, incorporando desoxirribonucleotídeos (marrom), como mos
tra a Figura 4.2. (d) Quando o fragmento de Okazaki aproxima-se do frag
mento sintetizado anteriormente, o RNA iniciador do fragmento mais antigo
é removido e a falha é preenchida por uma DNA polimerase que elonga o
fragmento de Okazaki mais novo. Enquanto isso, a forquilha abre mais e pri
mase sintetiza um novo iniciador. (e) Quando a falha foi preenchida e apenas
uma incisão permanece, uma DNA ligase sela os dois fragmentos (dentro do
círculo). Esse processo será repetido com o novo iniciador elongado, o inicia
dor antigo removido, a falha preenchida e a incisão, selada.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA º 153

A A

2" 2"
OH OH =O
O / O / -

/* 3 /* 3 ºs#/
on 4 º "sofº"
O —> º "so_>" +
O TOs. / 6^o
tyr TOs. /
/ >o
t /
yr -o.Ps
>O

"Os P/
=O/ s O

(a)

=O #
>
O O
/
tyr

(b)

OH
/
tyr

(c)

A A T A G A T C A
+ [ A T C T A G T

2" (d)
2" 2
O •

-o-K K o S o O O O O o S o
=O
/ >O os/
/ >O ºs?
/ >O ºs?
/ >O ºs/
/>
os#
/ >O os/
/ >O ºs?
/ >O os/
/ >O
=O 5"O =O =O —O =O O 5. O
)

FIGURA 48 Mecanismos da DNA ligase.

(a) DNA ligase primeiro catalisa a adição de um resíduo de AMP a uma tirosina da enzima. Em eucariotos, o doa
dor de AMP é ATP (quebrado a AMP + pirofosfato, como mostrado aqui); em procariotos, é NAD" (quebrado a
AMP + NMN). (b) O complexo ligase-AMP liga-se a um duplex de DNA quebrado (esqueleto quebrado mostrado
em vermelho). (c) Ligase transfere o AMP para o nucleotídeo 5' na incisão. (d) Em destaque: o 3'-OH do outro
lado da incisão ataca o fosfato do nucleotídeo da incisão formando uma nova ligação fosfodiéster, selando o es
queleto do DNA e liberando AMP Esse ataque é semelhante ao que ocorre durante a síntese de DNA (compare
com Figura 4.2), mas com um AMP como O grupo que sai, em vez de pirofosfato. (e) O resultado é um esqueleto
fosfodiéster selado novamente, ao “custo” final de um ATP quebrado em AMP + PP (ou um NAD quebrado em
AMP + NMN).
154 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
em aproximadamente 40 minutos. Desenrolar os 4,6
milhões de pb do DNA completamente em 40 minutos
requer uma rotação de aproximadamente 11.000 revo
luções por minuto (rpm)! É claro, o cromossomo intei
ro, enovelado de modo compacto e carregando grandes
complexos de replicação e transcrição, não pode sim
plesmente girar a essas velocidades, sem “bater” o con
teúdo da célula transformando-a em uma espuma.
Outro problema causado pela natureza em dupla-fita
do DNA é topológico. Em DNA circular (como cromos
somo de E. coli, DNA mitocondrial, muitos vírus e plas
mídeos) ou DNA linear longo cujas extremidades não
estão livres para girar uma ao redor da outra (como em
nossos cromossomos, ligados em intervalos à matriz nu
clear), o número de vezes que uma fita gira ao redor da
outra, chamado número de ligação, é fixo. O número de
ligação não pode ser alterado sem quebrar, pelo menos,
uma das duas fitas. Em moléculas de DNA, o enrola
mento é de dois tipos, com o enrolamento de Watson
-Crick de uma fita ao redor da outra a cada 10,5 pb e
a torção da dupla hélice sobre o seu eixo (torção ou
superenrolamento). Topologicamente, enrolamento e
torção são equivalentes e podem ser interconvertidos;
é só o número total de vezes que uma fita gira em torno
da outra, o número de ligação, que deve permanecer
constante enquanto ambas as fitas estiverem intactas.
Uma maneira de permitir desenrolamento e redução
no número de ligação seria quebrar uma fita parental à
frente da forquilha de replicação. Isso relaxa a tensão
topológica e permite que as fitas parentais girem uma
em torno da outra. Uma incisão (nick) representa um
sério perigo, entretanto, pois se a forquilha de replicação
atingir a quebra, a separação das fitas a transformaria
em uma quebra na dupla-fita do DNA. Uma quebra na
dupla-fita do DNA representa uma séria ameaça à estabi
lidade do genoma; se não for corrigida, é letal. Enzimas
chamadas topoisomerases resolvem esse problema de
desligamento de maneira segura, catalisando mudanças
no número de ligação que permitem desenrolamento e
eventual separação das fitas parentais. Topoisomerases
agem por meio da formação de uma interrupção transi
tória no esqueleto do DNA e, depois, selam novamente.
Essa interrupção não é formada por hidrólise da ligação
açúcar-fosfato, mas por uma reação de transesterifica
ção que cria uma ligação fosfato-enzima como interme
diário transitório (Figura 4.9). A religação da ligação fos
fodiéster do esqueleto desloca a enzima. Portanto, não
há perda ou criação de ligações fosfodiéster, apenas uma
troca nos parceiros da ligação. Isso significa que “que
bra” e “ligação” podem ocorrer sem a necessidade de
acoplamento com um intermediário de alta energia (por
exemplo, hidrólise de ATP ou NAD+). A topoisomerase
também evita a presença de quebras livres no DNA.
Há duas classes principais de topoisomerases: topoi
somerases tipo I fazem uma quebra transitória em uma
fita (formando uma ligação proteína-DNA) e permitem
que a outra fita passe através da incisão. Isso muda o
número de ligação em passos de um. As topoisomerases
tipo II fazem quebras transitórias em ambas as fitas (li
geiramente desencontradas) e permite que uma dupla
hélice passe através da incisão, mudando o número de
ligação em passos de dois. Ambas desempenham papéis
importantes na replicação do DNA e são importantes
alvos para quimioterapia.
Braçadeiras Corrediças (Sliding Clamps) e
Processividade
Quando uma enzima se liga a um polímero, execu
ta uma única etapa de uma reação (por exemplo, uma
polimerase, adicionando um único nucleotídeo, ou uma
exonuclease, removendo um único nucleotídeo), e de
pois se dissocia do substrato, esse processo é chamado
distributivo. Diferentemente, quando uma enzima liga
-se e efetua muitas adições (ou excisões) antes de se dis
sociar, o processo é processivo. Como se consome um
tempo finito para uma enzima dissociar de um molde
e depois se reassociar, enzimas distributivas tendem a
trabalhar mais lentamente do que enzimas processivas.
Para síntese rápida de DNA novo, polimerases pro
cessivas são vantajosas. Para aumentar a processivida
de, as DNA polimerases que participam da replicação
ficam associadas com proteínas acessórias chamadas
braçadeiras corrediças (sliding clamps), que as man
têm em contato com a cadeia de DNA em crescimento.
Em células de mamíferos, as braçadeiras corrediças são
compostas por uma proteína chamada antígeno nuclear
de células em proliferação (PCNA, proliferating cell
nuclear antigen), com três moléculas de PCNA circun
dando a dupla-hélice de DNA (Figura 4.10). A montagem
desse anel em torno do DNA requer enzimas acessórias
chamadas fatores de instalação da braçadeira (clamp
loading factors). A ligação com uma braçadeira corre
diça torna uma DNA polimerase mais processiva, o que
aumenta a velocidade da síntese e sua precisão.
Coreografia em Três Dimensões: o
Replissomo
A complexa coreografia descrita acima ocorre no vo
lume muito confinado de uma célula bacteriana ou do
núcleo de uma célula eucariótica, um volume que tam
bém contém muitas outras moléculas executando suas
funções. A ideia de dois imensos complexos de repli
cação girando rapidamente em torno do DNA em cada
forquilha de replicação é insustentável. É muito mais
fácil para o DNA, muito fino e cilíndrico, girar em torno
do seu próprio eixo e se mover através de um grande
complexo de replicação. As polimerases que trabalham
nas fitas líder e tardia são organizadas em um grande
complexo chamado replissomo (Figura 4.11). À medida
que o DNA passa pelo replissomo, ambas as fitas são
sintetizadas. A fita contínua passa diretamente através
do replissomo enquanto é elongada em sua extremida
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA
A
T –O
O POO A
T OPOO
+ G
C –O
O POO
OH G
C A
T
tir
FIGURA 4.9 Mecanismo da topoisomerase.
Topoisomerase I (a enzima de quebra-fechamento de mamífero
é representada aqui) catalisa uma reação de transesterificação
que resulta em uma ligação fosfodiéster entre o carbono 3! de
um resíduo na cadeia de DNA e um resíduo de tirosina da topoi
somerase (painel direito). (Outras topoisomerases formam uma
ligação fosfodiéster com o carbono 5!). Isso quebra a continui
dade do esqueleto açúcar-fosfato e libera a outra parte da cadeia
(a)
(b)
(c)
(d)
FIGURA 4.10 Braçadeiras corrediças.
(a) Uma proteína de instalação da braçadeira (clamp-loa
ding) liga-se ao DNA. (b) O instalador de braçadeira organiza
a braçadeira corrediça a partir de suas subunidades. (c) A DNA
polimerase associa-se com a braçadeira organizada e torna-se
processiva. (d) A estrutura da braçadeira corrediça em células
de mamíferos, um trímero de subunidades PCNA. O DNA passa
livremente pelo grande buraco no centro do complexo.
• 155
–O
T G C A A
A C G T T
–OOHPOOO
tir
de DNA para girar ao redor (ou passar através) de seu par; isso
permite alterações no número de ligação. Então, o 5!-OH que foi
deixado do outro lado da interrupção ataca a ligação fosfodiéster
entre o nucleotídeo e a proteína, refazendo o esqueleto de DNA
e liberando a proteína (painel esquerdo). Note que, como esta é
uma série de reações de transesterificação, nenhum cofator de
alta energia é necessário.
de 3!. A fita descontínua liga-se para permitir a síntese
de um fragmento de Okazaki e é depois liberada, para
permitir as etapas finais (remoção do primer, preen
chimento da falha e ligação), enquanto o molde, mais
adiante na molécula, se liga ao replissomo para permitir
a síntese do fragmento de Okazaki seguinte.
Término da Replicação em Genomas
Circulares
O término da replicação de um genoma circular ge
ralmente ocorre a 180° da origem. Duas forquilhas de
replicação convergentes se encontram, e a última par
te do genoma é sintetizada. É necessário que ocorra o
desligamento topológico dos dois novos cromossomos.
Essa é uma função chave das topoisomerases tipo II.
Em alguns vírus pequenos como SV40, o término ocor
re onde as forquilhas de replicação se encontram; não
há nenhuma sequência especial envolvida. O genoma de
E. coli contém sequências de terminação especiais, que
determinam que a terminação ocorra em uma região
definida e impedem que as forquilhas ultrapassem essa
região.
Término da Replicação em Genomas
Lineares: Telômeros
Células humanas, e células eucarióticas em geral,
têm cromossomos lineares. Há dificuldades especiais
para replicar as extremidades dos cromossomos line
ares. Qual é exatamente o problema para replicar as
extremidades de cromossomos lineares? Embora a fita
contínua possa, teoricamente, ser sintetizada até o fi
156 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

5! desencadear recombinação. Para evitar

3!
ambos os problemas, as extremidades
dos cromossomos lineares eucarióticos
são estruturas especiais chamadas te
lômeros, que contêm muitas repetições
de uma sequência de seis nucleotídeos,
rica em G. Telômeros humanos contêm
milhares de repetições TTAGGG. A ex
3! tremidade 3! do cromossomo estende
5! -se cerca de 18 nucleotídeos além da
extremidade 5! (Figura 4.12b), deixan
do três repetições sobrando. A extre
Helicase
midade 3! que sobra dobra-se sobre si
mesma, formando pontes de hidrogênio
Polimerase
G-G não Watson-Crick, e liga proteínas
Braçadeira que definem seu comprimento e prote
corrediça
gem as extremidades dos cromossomos
5! de recombinação.
3!

FIGURA 4.11 Replicação de ambas as fitas num replissomo.

Pela ligação de duas DNA polimerases juntas com a fita descontínua, criando uma Epigenética
alça para que possa passar através do complexo, ambas as fitas podem ser feitas em
um só lugar. O DNA passa pelo complexo, girando à medida que passa; o grande Uma importante marca epigenética
complexo proteico não precisa girar ao redor do DNA. no DNA de mamíferos e a metilação de
resíduos C em ambas as fitas de muitas
sequências CpG. Isso pode alterar a re
(a) 3! gulação e silenciar alguns genes (Ca
5! pítulo 8). Padrões de metilação podem
ser herdados por células filhas, mas
????? como? Durante a replicação, a fita nova
é feita na forma não metilada, sendo
(b) [TTAGGG]nTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3!
incorporados resíduos C não modifica
[AATCCC]nAATCCC 5!
dos. A metilação é restaurada por DNA
metiltransferases, que reconhecem o
FIGURA 4.12 Telômeros humanos.
DNA hemimetilado resultante da repli
(a)O problema de replicação do telômero. A extremidade 3! de uma fita paren
cação semiconservativa (o C da fita an
tal, molde para a fita filha descontínua (retrógrada), é apresentada em marrom
escuro, a fita filha é apresentada em marrom claro, e um RNA primer está em
tiga continua metilado; o da fita nova,
roxo. O problema é que não há espaço para sintetizar um primer que permitiria não) e metila o C recém-incorporado.
que a fita filha fosse finalizada (região indicada por ?????), de modo que a fita
filha será mais curta do que a fita parental. A remoção do último RNA primer a
torna ainda menor. (b) Um telômero consiste de muitas repetições, em seguida,
de uma sequência de 6 nt, TTAGGG no homem, com a fita rica em G estendendo
-se além da fita rica em C por cerca de 12-18 nt.

nal de seu molde, a fita descontínua não pode. Não há
espaço para sintetizar um primer ao qual nucleotídeos
opostos ao final do molde possam ser adicionados (Fi
gura 4.12a). Mesmo se houvesse uma primase que pu
desse iniciar na extremidade do molde, a remoção do
RNA deixaria uma falha curta. Embora a impossibili
dade de completar a fita tardia na extremidade do cro
mossomo não seja um problema em uma única geração,
ao longo de muitos ciclos de replicação as extremidades
dos cromossomos seriam encurtadas, até que genes es
senciais fossem perdidos, levando à morte celular. Por
tanto, é essencial impedir perda contínua de DNA nas
extremidades dos cromossomos.
Um segundo problema que eucariotos enfrentam é
que as extremidades das moléculas de DNA tendem a
4.3 REPLICAÇÃO DO DNA:
ENZIMAS E REGULAÇÃO
Enzimas Procarióticas da Replicação
Enzimas que executam o movimento de uma forqui
lha de replicação em E. coli são apresentadas na Figura
4.13. A principal DNA polimerase replicativa em E. coli
é a DNA polimerase III (pol III). Pol III é um comple
xo multi-subunidades que sintetiza a fita contínua e a
maior parte da fita tardia. O centro (core) da polime
rase contém uma subunidade q, que catalisa a forma
ção da ligação fosfodiéster, uma subunidade β que é a
exonuclease de revisão 3! para 5!, e uma subunidade β.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 157

A braçadeira corrediça em E. coli consiste 3!

de duas subunidades β – que se organizam e 5! fita
pare
são mantidas sobre o DNA pelo complexo γ – nta
l
(o instalador da braçadeira), numa etapa que
fita
requer hidrólise de ATP. As subunidades β con
tínu
a
formam um anel ao redor da dupla hélice que complexo pol III
desliza ao longo dela (Figura 4.10), levando o
SSB
complexo pol III, para tornar a síntese de DNA 3!
um processo altamente processivo. Esse com 3!
plexo é capaz de sintetizar DNA até que se aca complexo pol III
5!
be o molde ou encontre certos tipos de lesões DnaB helicase
5!
no DNA. DnaG primase
SSB
Na fita tardia, o complexo libera o DNA pol I

quando encontra o fragmento de Okazaki an SSB

terior. Duas moléculas de pol III são mantidas

3!
juntas pela subunidade t, permitindo a síntese
5!
de ambas as fitas, líder e tardia, em um grande ligase
replissomo.
FIGURA 4.13 Enzimas da replicação em E. coli.
Na fita tardia, a DNA primase (chamada A fita contínua (superior) é elongada por pol III associada com uma braça
DnaG) forma um complexo com a DnaB heli deira corrediça. O complexo DNA helicase/primase (DnaB/DnaG) move-se
case (DnaB). DnaB faz com que o complexo se ao longo do molde para a fita tardia (inferior); faz uma pausa para permitir
mova ao longo do molde para a fita descontí que a DnaG sintetize um RNA primer a cada 1.000 a 2.000 nt. Pol III elonga
nua, separando as fitas parentais em um mo o primer até que ele alcance o primer do fragmento de Okazaki sintetizado
vimento que requer hidrólise de ATP. O DNA anteriormente. Nesse momento, pol III libera o DNA e pol I se liga à extre
midade do fragmento de Okazaki. Pol I remove o RNA primer, um nucleotí
fita simples que resulta da ação da helicase é
deo de cada vez, usando sua atividade 5!-endonuclease e, simultaneamente,
recoberto com proteína de ligação a DNA fita preenche a falha em um processo chamado nick translation. Quando resta
simples (SSB), que impede o reanelamento apenas uma incisão remanescente com desoxirribonucleotídeos em ambos
das fitas parentais e impede a formação de os lados, a DNA ligase pode selar a quebra.
grampos e outras estruturas secundárias no
DNA fita simples. O complexo helicase/primase para tituindo-os, uma atividade chamada nick translation.
aproximadamente uma vez a cada 1.000-2.000 pb, e a Esse seria um processo de desperdício, mas é limitado
DnaG primase sintetiza um RNA primer curto. O RNA pelo fato da pol I agir de maneira distributiva, deixan
primer é elongado em um fragmento de Okazaki de do o substrato frequentemente. Enquanto houver pelo
cerca de 1.000-2.000 pb pela DNA polimerase III com menos um ribonucleotídeo, a DNA ligase não pode agir
sua braçadeira corrediça associada. Elongação para sobre o substrato, mas pol I pode se ligar novamente e
quando o complexo da polimerase encontra o RNA pri substituir o ribonucleotídeo. Quando a falha foi preen
mer do fragmento de Okazaki sintetizado previamente, chida e só uma incisão (nick) permanece, dissociação
e o DNA dissocia-se do complexo pol III. da pol I permite que a DNA ligase se ligue à incisão e
catalise a formação de uma ligação fosfodiéster, selan
Em E. coli, a remoção do RNA primer e o preen do o fragmento de Okazaki da cadeia em crescimento.
chimento da falha são ambos catalisados por uma úni
ca enzima, a DNA polimerase I (pol I). Pol I contém Como observado aqui, o cromossomo circular de E.
uma atividade exonucleásica 5! para 3! que remove o coli está sujeito a limites topológicos. Ainda assim, a
RNA primer da extremidade 5! do fragmento de Oka dupla hélice parental deve ser completamente desen
zaki sintetizado previamente, funcionando assim como rolada para que ocorra replicação e os cromossomos
uma RNaseH. Também contém uma atividade de DNA completos se separem nas células filhas. A replicação
polimerase, que catalisa a adição de desoxirribonucle requer a remoção de superenrolamentos positivos, por
otídeos à extremidade 3! do fragmento de Okazaki sin que o número de ligação das fitas parentais deve ser re
tetizado mais recentemente, até que a falha criada pela duzido de um número positivo alto (aproximadamente
remoção do primer esteja preenchida (Figura 4.13). 440.000, porque elas são enroladas uma ao redor da ou
Uma atividade intrínseca de revisão exonucleásica 3! tra uma vez a cada 10,5 pb) até zero, para permitir que
para 5! aumenta a precisão do preenchimento da falha. os cromossomos filhos se separem. As Topoisomerases
Pol I coordena a remoção do primer e o preenchimento são, portanto, cruciais para a replicação do DNA.
da falha removendo um ribonucleotídeo do primer e
elongando o fragmento de Okazaki mais novo com um E. coli tem ambas as topoisomerases, tipo I e tipo II.
desoxirribonucleotídeo. Repete essas etapas até que o A topoisomerase tipo I de E. coli é chamada de proteína
primer seja removido. Pol I é capaz de continuar ao lon ômega (ω). Ômega age unidirecionalmente, removen
go do DNA, removendo desoxirribonucleotídeos e subs do apenas superenrolamentos negativos. Portanto, ω
158 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
não é suficiente para permitir que a replicação ocor
ra. DNA girase, uma topoisomerase tipo II, é essencial
para a replicação do DNA. A DNA girase age como um
“interruptor giratório” (swivel) para remover superen
rolamentos positivos ou introduzir superenrolamentos
negativos; a direção é idêntica. A girase é um heterotet
râmero com duas subunidades “swivelase” codificadas
por gyrA, e duas subunidades ATPase codificadas por
gyrB. As subunidades swivelase catalisam reações de
transesterificação que quebram e refazem o esqueleto
fosfodiéster, criando e selando novamente uma quebra
transitória em ambas as fitas (uma quebra transitória
de dupla fita). A hidrólise de ATP está acoplada à ação
da girase, não para formar novas ligações fosfodiéster,
mas para desencadear as alterações conformacionais
que permitem que uma dupla hélice passe através da
quebra transitória da fita-dupla, resultando em redução
unidirecional no número de ligação. Antibióticos que
têm como alvos uma ou a outra subunidade da DNA gi
rase, param rapidamente a replicação de E. coli (Cor
relação Clínica 4.3). E. coli tem uma segunda atividade
de topoisomerase tipo II, topo IV, que é importante na
segregação cromossômica entre as células filhas.
Enzimas Eucarióticas da Replicação
Eucariotos requerem os mesmos tipos de atividades
enzimáticas que os procariotos, porque a replicação se
CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.3
Topoisomerases Como Antibióticos
Antibióticos que têm como alvo qualquer subu
nidade da DNA girase rapidamente param a replica
ção de E. coli, porque o impedimento da redução do
número de ligação das fitas parentais impede que as
fitas se desenrolem. Existem duas maneiras de atin
gir as topoisomerases. Inibidores de topoisomerases,
como coumermicina A1 e novobiocina, impedem a
atividade catalítica; têm como alvo as subunidades
ATPases, codificadas por gyrB.
Venenos de topoisomerases, como ácido nalidíxi
co, congelam as ligações covalentes DNA-proteína;
esses complexos são letais se convertidos em quebras
de dupla-fita, o que aconteceria durante a replicação.
O ácido nalidíxico é usado em infecções do trato
urinário; tem como alvo as subunidades swivelase,
codificadas por gyrA. A ciprofloxacina, outro veneno
de topoisomerase, é um dos antibióticos orais mais
efetivos em uso clínico hoje; é usado para evitar e
tratar antrax e muitas outras infecções bacterianas.
Froelich-Ammon, S. J., e Osheroff, N. Topoisomerase
poisons: Harnessing the dark side of enzyme mechanism.
J. Biol. Chem. 270:21429, 1995.
gue essencialmente a mesma via. Mas diferenças entre
enzimas bacterianas e humanas nos detalhes de suas
especificidades e mecanismos são usadas em terapia
antibacteriana, para atingir a replicação do patógeno e
poupar as células hospedeiras.
A fita contínua, na forquilha de replicação, é sinteti
zada pela DNA polimerase d (pold), associada à braça
deira corrediça chamada antígeno nuclear de célula em
proliferação (PCNA – proliferating cell nuclear anti
gen). O PCNA foi detectado pela primeira vez como um
antígeno nos núcleos de células em replicação, daí seu
nome. Três subunidades de PCNA são organizadas para
formar um anel ao redor do DNA (Figura 4.10), ao qual
pol d se liga. A montagem desse anel requer um fator de
instalação da braçadeira chamado Fator de Replicação
C (RFC).
A situação na fita tardia é um pouco mais complica
da em eucariotos do que em E. coli (Figura 4.14). Uma
atividade de helicase em eucariotos separa as fitas pa
rentais, e uma proteína de ligação ao DNA fita simples
chamada proteína de replicação A (RPA) liga-se às fitas
simples expostas. Em eucariotos, a primase forma um
complexo com DNA polimerase a (pol a), que inicia a
síntese dos fragmentos de Okazaki. Esse complexo pol
a/primase sintetiza um primer de aproximadamen
te 10 ribonucleotídeos e, depois, muda a atividade de
primase para DNA polimerase e elonga o primer com
aproximadamente 15-30 desoxirribonucleotídeos. O
produto dessa reação dual é uma curta extensão de
DNA ligado covalentemente ao RNA primer. Uma vez
que o fragmento de Okazaki tenha atingido esse com
primento, o complexo pol a/primase se dissocia do
DNA. RFC liga-se a esse primer elongado e serve como
instalador de braçadeira para montar a braçadeira cor
rediça de PCNA. Então, pol βliga-se à PCNA e completa
os fragmentos de Okazaki até um comprimento final de
cerca de 130-200 pb.
A remoção do primer é efetuada em duas etapas
por RNaseH e FEN1. RNaseH degrada o RNA primer,
deixando um único ribonucleotídeo ligado à extremi
dade do fragmento de Okazaki. A flap endonuclease 1
(FEN1) remove o último ribonucleotídeo (e possivel
mente alguns desoxirribonucleotídeos), “descascando”
um ou alguns poucos nucleotídeos, formando uma pe
quena lingueta (flap) e depois clivando a ligação fos
fodiéster no ângulo, para liberar o flap. Se houver um
erro de pareamento entre os primeiros nucleotídeos do
fragmento de Okazaki, como resultado de incorporação
incorreta pela pol a, o erro desestabilizaria a extremi
dade 5! e criaria um flap maior, que seria removido por
FEN1. Isso aumenta a precisão do processo de replica
ção por remover erros introduzidos por pola.
A falha que fica é preenchida pela pol d estendendo
a extremidade 3! do fragmento de Okazaki sintetizado
por último (Figura 4.14). O complexo pol d/PCNA libe
ra o DNA quando encontra dNTPs na extremidade 5!
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 159

do fragmento de Okazaki sintetizado anteriormente. A parcialmente para repetir esse processo. Como em E.
incisão remanescente é selada pela DNA ligase. O com coli, duas moléculas da principal polimerase replicati
plexo pol d/PCNA do replissomo deve ser ligado nova va, pol d nesse caso, são mantidas juntas em um replis
mente ao próximo fragmento de Okazaki sintetizado somo, ou “fábrica de replicação”, no qual ambas as fitas
são sintetizadas (Figura 4.11).
Fragmento de Okazaki anterior
3! O DNA eucariótico é organizado em
5! nucleossomos que contêm aproxima
5! Molde para a fita tardia
RPA
damente 200 pb de DNA. A dissociação
(a)
dos nucleossomos é necessária para a
replicação e provavelmente limita a
Polα/primase velocidade de síntese do DNA. Quan
Primer de RNA
do um único nucleossomo é dissocia
3! do, cerca de 200 pb do DNA parental
5! ficam disponíveis para serem separa
dos; a síntese do primers pode ocorrer
(b)
em qualquer lugar do DNA fita simples
exposto. Isso explicaria o tamanho li
Polα/primase mitado dos fragmentos de Okazaki em
células humanas.
3!
5!
Os seres humanos têm topoisome
rases tipo I e tipo II. A topoisomerase
tipo I humana, chamada enzima de
(c) quebra-fechamento (Figura 4.9), é ca
PCNA paz de remover tanto superenrolamen
RFC to positivo como negativo; funciona
durante a replicação e a transcrição do
3!
DNA. A topoisomerase tipo II é crítica
5! na etapa de terminação e para segre
gação dos cromossomos, que ficariam
emaranhados à medida que as muitas
(d)

Polδ

3! FIGURA 4.14 Enzimas replicando a fita

5! tardia em eucariotos (a fita líder não é
mostrada).
(a) RPA, uma SSB, liga-se ao molde de fita
(e) simples que foi aberto pela progressão da
forquilha de replicação. Um fragmento de
RNaseH Okazaki anterior é mostrado à direita, com o
FEN1 primer de RNA em roxo. (b) A atividade da
primase no complexo pol a/primase inicia a
3!
síntese de um primer de RNA. (c) Depois
do primer de RNA atingir 10 nucleotíde
os, a atividade polimerase do complexo pol
(f) a/primase assume e elonga o primer com
cerca de 15-30 desoxinucleotídeos. Então,
pol a/primase dissocia-se. (d) RFC se liga
à extremidade deste fragmento de Okazaki
parcialmente completo e catalisa a monta
3! gem de uma braçadeira corrediça a partir de
5! três moléculas de PCNA. (e) Pol d se liga à
braçadeira corrediça e elonga o fragmento
de Okazaki. (f) À medida que o complexo de
(g)
replicação aproxima-se do primer de RNA
anterior, esse primer é degradado pela ação
3! combinada de RNaseH e FEN1. (g) A falha
5! é preenchida pela continuação da elongação
DNA ligase do fragmento de Okazaki. (h) A incisão re
(h) 5! manescente é selada pela DNA ligase.
160 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
ori
(a) ori ori
ori
ori ori
(b)
(c)
(d)
(e)
+
bolhas de replicação se completam. Topo II é uma pro
teína abundante que também desempenha um papel na
ligação do DNA a pontos específicos da matriz nuclear
durante a intérfase. A topoisomerase II humana não é
uma girase, uma vez que não introduz superenrolamen
to negativo. A quimioterapia do câncer frequentemente
tem topoisomerases como alvos, usando venenos que
levam a quebras de dupla-fita durante a replicação. As
células em rápida replicação são mais sensíveis a tais
drogas do que as células quiescentes.
Iniciação da Replicação
Na discussão anterior, vimos a progressão de uma
forquilha de replicação. Mas como uma forquilha de re
plicação começa? E como a iniciação é controlada de
modo que todo o genoma seja copiado uma vez, e ape
nas uma vez? A replicação começa em locais específicos
chamados origens de replicação. As origens conheci
das contêm múltiplas sequências repetitivas curtas,
que ligam proteínas iniciadoras específicas, e regiões
ricas em AT, nas quais ocorre a separação inicial das
fitas parentais. O cromossomo de E. coli tem uma única
origem de replicação, origem de replicação do cromos
somo (oriC), uma região de aproximadamente 245 pb.
Existem milhares de origens em células eucarióticas
(Figura 4.15), que permitem que essas células repli
quem a grande quantidade de DNA no tempo limitado
de um ciclo celular. Em levedura, as origens são deno
minadas sequências de replicação autônoma (ARS,
automonously replicationg sequences). No homem,
sequências específicas que servem como origens não
foram identificadas.
Em E. coli, oriC é ligada a uma proteína iniciadora
chamada DnaA. DnaC então se associa e funciona como
um “formador de pares” para permitir que DnaB, a heli
case, ligue-se e comece a separar as fitas parentais para
FIGURA 4.15 Replicons em sequência e
replicação bidirecional em eucariotos.
(a) Há múltiplas origens de replicação (ori)
organizadas em sequência ao longo de cada
cromossomo eucariótico. No homem, estão
espaçadas em intervalos de aproximada
mente 50.000-100.000 pb. (b) A iniciação
ocorre em todas as ori. Grupos adjacentes
de oris tendem a funcionar juntos. (c) Duas
forquilhas de replicação divergentes são
estabelecidas em cada ori, de modo que a
replicação é bidirecional. As estruturas for
madas são chamadas bolhas de replicação.
(d) As bolhas de replicação aumentam à
medida que a replicação continua, até que
fiquem bem próximas. Nesse estágio, o tér
mino da replicação une bolhas adjacentes e
separa o DNA parental. A topoisomerase II
é essencial para o término e a segregação
dos cromossomos. (e) Os cromossomos du
plicados resultantes podem, então, segre
gar em duas células filhas.
criar uma forquilha de replicação. Uma bolha de repli
cação é formada em cada origem e um par de forquilhas
é estabelecido e estas se movem para longe da origem,
cada uma em uma direção (Figura 4.15). Portanto, a
replicação é bidirecional.
O Complexo de Reconhecimento da Origem (ORC,
Origin Recognition Complex), em eucariotos, orga
niza-se em múltiplas origens (Figura 4.16). Para que
ocorra a iniciação, a organização de um ORC em uma
origem é necessária, mas não suficiente. Um segundo
complexo, chamado proteínas de manutenção de mini
cromossomos (MCM), que tem uma fraca atividade de
helicase, também deve se ligar, formando um complexo
pré-replicativo; Cdc6 (a proteína codificada por Cdc6)
é necessária para essa ligação. Uma vez que o complexo
ORC/MCM ligado a uma origem seja ativado, ele cata
lisa a separação inicial das fitas parentais para formar
uma pequena bolha de replicação (Figura 4.16). SSBs
(a SSB humana é RPA) ligam-se e mantêm as fitas se
paradas. O complexo MCM pode, então, funcionar como
helicase para permitir que a forquilha de replicação
desenrole. Ativação do complexo ORC/MCM é regula
da por ciclinas e quinases dependentes de ciclinas (ver
p. 1029). A fosforilação de Cdc6 por uma quinase de
pendente de ciclina causa sua inativação e impede sua
ligação ao complexo; esse é um dos mecanismos pelo
qual o reinício da replicação, que seria desastroso para
a célula, é impedido.
A iniciação da síntese de DNA usa a maioria dos
mesmos mecanismos e enzimas do movimento de uma
forquilha de replicação (Figura 4.14 e Figura 4.16). Em
eucariotos, o complexo pol a/primase inicia a síntese
de um RNA primer e depois muda para elongação com
dNTPs. Esse polinucleotídeo curto é elongado por uma
DNA polimerase d da mesma forma que na fita descon
tínua (retrógrada) em uma forquilha de replicação. O
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 161

replissomo que está elongando essa primeira fita pode
continuar a síntese e formar a fita líder da forquilha de
um lado da bolha de replicação (Figura 4.16). Nessa
metade da bolha, a síntese do primeiro fragmento de
Okazaki na fita retrógrada é iniciada pelo mesmo meca
nismo usado no movimento da forquilha de replicação
(compare com Figura 4.13). Entretanto, à medida que
este primeiro fragmento de Okazaki é elongado, não en
contrará um fragmento anterior, de modo que continua
a crescer na direção 5! para 3!; depois que passa a ori
gem, torna-se a fita líder da forquilha de replicação que
(a)
ORC
(b) MCM
(c)
RPA helicase
está crescendo na direção oposta (Figura 4.16). Ambas
as fitas líderes continuam a ser elongadas de maneira
muito processiva, e os fragmentos de Okazaki são sin
tetizados nos lados opostos. O resultado é um par de
forquilhas de replicação divergindo da origem.
Telomerase
Telômeros, as estruturas especializadas nas extre
midades de cromossomos lineares em eucariotos (Fi
gura 4.12), são mantidos por telomerases, enzimas que
adicionam novas repetições de seis nucleotídeos às ex
tremidades 3! dos telômeros. As telomerases são com
plexos ribonucleoproteicos contendo um pequeno RNA
que serve de molde para adição de uma nova repetição
de seis nucleotídeos (Figura 4.17). Uma telomerase li
ga-se à extremidade da fita 3!, com parte do RNA da
telomerase ligado por pontes de hidrogênio aos últimos
nucleotídeos do cromossomo. Uma repetição de seis
nucleotídeos é sintetizada, usando o RNA como molde.
Então, a telomerase pode se dissociar e reassociar para
adicionar outro hexâmero.

(d)

RNAprimer
FIGURA 4.16 Iniciação da replicação em uma origem de
replicação eucariótica.
(a) O complexo de reconhecimento da origem (ORC) liga-se
a uma origem. (b) Um complexo MCM liga-se a ele; a prote
(e) ína 6 do ciclo de divisão celular (cdc6, cell division cycle 6
protein) é importante nessa montagem. (c) O complexo ini
ciador é ativado e a atividade de helicase abre as fitas paren
DNA tais, formando uma bolha muito pequena. SSB liga-se às fitas
simples expostas, helicases são associadas ao DNA e a bolha
cresce. (d) Pol a/primase sintetiza o primeiro RNA primer e,
após cerca de 10 nt, muda para elongação com desoxirribonu
cleotídeos. (Neste painel e nos subsequentes, o foco está no
processo que está ocorrendo com o DNA, e as proteínas não
(f) são mostradas). (e) Depois que cerca de 15-30 desoxirribo
nucleotídeos foram adicionados, pol a/primase sai e a cadeia
é elongada pela DNA polimerase d, que incorpora desoxirribo
nucleotídeos. Até esse estágio, o processo é semelhante ao que
ocorre na fita descontínua (retrógrada) (compare com Figura
4.14). Entretanto, a fita em crescimento não encontrará um
RNA primer
fragmento de Okazaki anterior; ela pode continuar elongando,
tornando-se a fita contínua (líder) na forquilha de replicação
que se move para a esquerda. (f) Um RNA primer é sinteti
zado no lado descontínuo da forquilha de replicação, como na
(g) progressão normal da forquilha. (g) Esse primer é elongado
como descrito anteriormente. Entretanto, esta fita em cres
cimento não encontrará um fragmento de Okazaki anterior;
RNA primer pode continuar elongando, tornando-se a fita contínua (líder)
na forquilha de replicação que se move para a direita. Um RNA
primer pode ser sintetizado nessa forquilha pelo mecanismo
normal (compare com Figura 4.14). Resultam duas forquilhas
DNA
de replicação divergindo da origem. O processo é simétrico ao
redor do eixo indicado pela linha tracejada, com forquilhas em
imagem especular divergindo da origem.
162 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
[TTAGGG]nTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3!
nnnn
CCCAATCCC
[AATCCC]nAATCCC 5! !nn n
n
3 n
n a maior parte do tempo total de um ciclo celular. Uma
–
5!
FIGURA 4.17 Telomerase.
A telomerase é um complexo ribonucleoproteico com uma fita
curta de RNA, como parte integral; catalisa a adição de novas
repetições teloméricas de 6-nt à extremidade 3! de uma cadeia
de DNA. O RNA da telomerase pareia parcialmente pelas bases
com a repetição telomérica e serve de molde para a reação,
enquanto o componente proteico funciona como uma trans
criptase reversa, sintetizando DNA usando o RNA como molde.
Depois da adição de uma repetição de seis nucleotídeos, a en
zima pode se dissociar e se ligar novamente e adicionar novas
repetições de 6-nt.
Os telômeros não precisam permanecer exatamente
do mesmo tamanho; algum encurtamento não é proble
ma porque essas repetições não codificam proteínas. Os
telômeros passam por ciclos de encurtamento das fitas
tardias em virtude da incapacidade de síntese comple
ta (Figura 4.12a) e alongamento por adição de novas
repetições de seis nucleotídeos à extremidade 3! pela
telomerase (Figura 4.17). Embora o comprimento dos
telômeros não permaneça constante, encurtamento
progressivo é evitado por adição de repetições. Telome
rases também restabelecem os excessos 3!, caracterís
ticos dos telômeros.
As células que diferenciaram e se dividirão apenas
um número limitado de vezes, não expressam telome
rase. Assim, os telômeros encurtam a cada divisão sub
sequente; isso limita o número de vezes que tais célu
las podem se dividir antes que a perda dos telômeros
desencadeie apoptose, morte celular programada (ver
p. 1034). Expressão de telomerase é geralmente reati
vada em células tumorais; isso lhes permite continuar
a dividir indefinidamente, sem encurtamento cromos
sômico, e torna a telomerase um alvo atraente para
quimioterapia do câncer. Deve-se notar que inativação
da telomerase em um tumor não levaria a uma parada
rápida no crescimento do tumor; o efeito seria retarda
do por muitos ciclos celulares, até que as extremidades
dos cromossomos fossem significativamente encurta
das. Portanto, é provável que inibidores da telomerase
sejam úteis apenas em combinação com outras terapias.
Ciclo Celular
Em eucariotos, há um padrão distinto e regulado
de atividades que constituem um ciclo celular (Figu
ra 4.18). A característica morfológica mais notável do
ciclo celular é a mitose, a condensação, o alinhamento e
a separação dos cromossomos seguida da divisão da cé
lula em duas. A fase do ciclo celular na qual ocorre a mi
tose é chamada fase M (de fase mitótica). A replicação
do DNA ocorre durante a fase S (de fase de Síntese). A
fase G1 (Gap 1) ocorre entre a mitose e a fase S, e a fase
G2 (Gap 2) ocorre entre a fase S e a mitose. As fases
G1, S e G2 juntas são chamadas intérfase, e constituem
fração de células em mitose acima do normal é um in
dicador histológico de câncer (Correlação Clínica 4.4).
Em eucariotos, a replicação é regulada pela deter
minação de iniciar ou não a replicação do DNA. Uma
vez iniciada, as células geralmente prosseguem pelo
processo de replicação inteiro. A iniciação da replica
ção nas origens deve ser coordenada para garantir que
todas as regiões de todos os cromossomos sejam repli
cadas em cada ciclo celular, e que nenhuma região seja
replicada mais do que uma vez. Isto é, obviamente, um
desafio difícil em uma célula com milhares de origens.
A não replicação do genoma inteiro levaria a instabili
dade cromossômica e perda de informação genética. Se
um pedaço do DNA cromossômico não for replicado, os
dois cromossomos descendentes não podem se separar
adequadamente, ou o cromossomo poderia ser quebra
do na tentativa. Cromossomos quebrados são instáveis
e desencadeiam recombinação, que causa mais proble
mas. Tanto a falta de genes chaves em uma célula com
falta de um cromossomo, em virtude da segregação er
rada, quanto a expressão excessiva de outros genes, em
uma célula com uma cópia extra de um cromossomo,
podem ser desastrosos. A trissomia do 21, a presença de
uma cópia extra do menor cromossomo humano, causa
a síndrome de Down, e a maioria das outras trissomias
é letal.
Diferentes regiões do genoma são replicadas em
tempos diferentes durante a fase S do ciclo celular. Ti
picamente, regiões que são ativamente transcritas são
replicadas mais cedo durante a fase S. Diferentemente,
regiões heterocromáticas (onde a cromatina está con
densada e não é transcrita ativamente) são tipicamente
replicadas mais tarde na fase S.
mitose
M
G2
gap2
G1
gap1
S
síntese
INTERFASE
FIGURA 4.18 Ciclo celular.
Em células eucarióticas, a replicação do DNA (fase S) e a mito
se (fase M) são separadas por dois intervalos (gaps), G1 e G2.
O tamanho dos segmentos representa a fração típica do tempo
ciclo de divisão celular.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA
CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.4
Câncer e o Ciclo Celular
O câncer é definido como a divisão desregulada,
excessiva de células. É reconhecido patologicamente
por uma fração maior de células ativamente percor
rendo o ciclo celular do que esperada para o tecido
normal do qual se originou. Inclui uma fração maior
de células em mitose, reconhecidas por microscopia,
e uma fração maior de células na fase S.
Muitos tipos de drogas são usadas para impedir
replicação. Antimetabólitos interferem com síntese
de precursores de 5!-dNTPs. Metotrexate inibe a di
-hidrofolato redutase, necessária para manter o te
tra-hidrofolato reduzido, necessário à síntese de nu
cleotídeos. 5-Fluorouracil inibe a timidilato sintase;
quando metabolizado em sua forma trifosfato, pode
ser incorporado ao DNA e levar a quebras na fita. Al
caloides da Vinca inibem a montagem dos microtúbu
los e, assim, interferem com a mitose e a segregação
dos cromossomos. Inibidores de topoisomerases re
tardam ou param o processo de replicação por impe
direm o desenrolamento das fitas parentais. Venenos
de topoisomerases inibem o fechamento da ligação
fosfodiéster, deixando junções covalentes proteína
-DNA, que são convertidas em quebras de fitas; essa
classe de agentes antineoplásicos inclui etoposídeo e
doxorrubicina.
Embora os detalhes do processo não estejam ainda
claros, alguns princípios gerais podem ser afirmados.
O modelo atual é chamado de “licenciamento”. Um fa
tor de licenciamento deve estar ligado às origens para
permitir a iniciação da replicação nessa origem. Isso
ocorre antes do início da fase S, e envolve a ligação
do complexo MCM ao ORC nas muitas origens. Essa
ligação é facilitada por proteínas “formadoras de pa
res”, incluindo proteína 6 do ciclo de divisão celular
(Cdc6) e licenciamento da cromatina e fator 1 de re
plicação do DNA (Cdt1). A montagem desse complexo
de pré-replicação só ocorre durante a fase G1, antes
que a síntese de DNA ocorra. Uma vez que a iniciação
da replicação tenha ocorrido, o fator de licenciamento
é inativado por fosforilação e dissociação de Cdc6 e
do complexo MCM. A quinase dependente de ciclina
(CDK) e a quinase dependente de Dbf4 (DDK) estão
envolvidas na iniciação da replicação, catalisando o
recrutamento do replissomo para a origem, ativando
a atividade helicase que desenrola as fitas parentais, e
inativa os fatores de licenciamento. Para essa origem
ser usada de novo, um novo fator de licenciamento
deve se ligar, mas a montagem do complexo não pode
ocorrer até a fase G1 seguinte, quando nova proteína
Cdc6 estiver disponível. Outro bloqueio da re-replica
• 163
ção é a proteína geminina, que se liga e inibe Cdt1.
Isso impede reinício prematuro durante um único ci
clo celular.
Para a viabilidade da célula, é importante que o DNA
esteja completamente replicado antes da mitose. As cé
lulas têm mecanismos regulatórios que garantem a co
ordenação dos eventos do ciclo celular em vários pontos
de verificação. As células são mais sensíveis a danos no
DNA durante o processo de replicação, porque forqui
lhas de replicação podem encontrar a lesão antes que
ela tenha sido reparada (ver Correlação Clínica 4.4). As
células desenvolveram sensores que reconhecem danos
no DNA e param o ciclo celular ou no limite G1/S ou
no limite G2/M. Se a célula já estiver na fase S, o blo
queio das forquilhas de replicação impede novos even
tos de iniciação durante a fase S. Os sensores de danos
também induzem a síntese de proteínas que ajudam no
reparo do DNA. PCNA, RFC, RPA e pol e parecem de
sempenhar importantes papeis no reconhecimento de
danos que bloqueiam replicação e coordenação das fun
ções de replicação e reparo. A interação de PCNA com
p21cip1, um inibidor de quinase dependente de ciclina,
parece inibir a replicação, mas não o reparo; assim,
pode permitir que o reparo prossiga antes que a repli
cação continue. Defeitos em vários genes importantes
na resposta desse ponto de bloqueio, incluindo ATM,
TP53 e CHK2, aumentam a instabilidade genômica e o
risco de câncer.
Replicação de Genomas de RNA
Alguns vírus têm um genoma de RNA. Tais genomas
são replicados com muito menor precisão e podem acu
mular variações em período relativamente curto. Um
exemplo particularmente importante disso é o Vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV), que causa Síndrome
da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). O RNA viral
do HIV é transcrito reversamente em DNA e, depois, o
DNA integra-se ao cromossomo. A transcriptase rever
sa do HIV é um alvo para quimioterapia antiviral (ver
Correlação Clínica 4.2).
Transcrição reversa do RNA genômico do HIV é
muito menos precisa do que a síntese de DNA, e a pre
cisão reduzida leva à rápida geração de uma coleção de
vírus variantes em um indivíduo. Uma pequena fração
desses variantes pode ser resistente a qualquer droga
única que esteja sendo usada para tratar a infecção.
Essa fração pode continuar a replicar na presença do
agente terapêutico até se tornar a variante dominan
te; isso leva à perda de eficácia da droga. As terapias
combinadas atuais são projetadas para reduzir a pro
babilidade de um vírus ser resistente simultaneamente
a todas as drogas da combinação. Terapias combinadas
atuais têm como alvos tanto a transcriptase reversa do
HIV como a protease do HIV.
164 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
4.4 RECOMBINAÇÃO
Recombinação é a troca de informação genética. Há
dois tipos básicos: recombinação homóloga e recombi
nação não homóloga. A recombinação homóloga (tam
bém chamada recombinação geral) ocorre entre sequ-
ências idênticas ou quase idênticas, por exemplo, entre
os cromossomos paterno e materno de um par. Cromos
somos não são passados intactos de geração para gera
ção (Figura 4.19); ao contrário, cada cromossomo que
você herda de seu pai contém porções de ambos os pais
e, da mesma forma para os cromossomos herdados de
sua mãe. Ocasionalmente e frequentemente desencade
ada por danos a um cromossomo, como quebra da dupla
-fita, a recombinação ocorre entre cromossomos dife
rentes. Isso pode levar a câncer (Correlação Clínica 4.5).
ABCDEFGHIJKLMNOPQR+abcdefghijklmnopqrABCDEFGHIJklmnopqr+abcdefghijKLMNOPQR
FIGURA4.19 Recombinação homóloga.
(a) O cromossomo paterno é mostrado em azul, com os ale
los mostrados por letras maiúsculas. O cromossomo homólogo
materno é mostrado em vermelho, com os alelos mostrados
por letras minúsculas. (b) Depois da recombinação homóloga
entre os genes j e k, ambos os cromossomos contêm DNA de
ambos os pais. Houve uma troca igual, recíproca entre eles.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.5
Recombinação e Câncer
Erros de recombinação podem levar a duplica
ções ou deleções de genes, expansão de tripletes,
fusões de genes e rearranjos cromossômicos. A fre
quência de eventos de recombinação aumenta com
danos ao DNA, em parte e decorrência da ruptura de
forquilhas de replicação e, em parte, em decorrên
cia de quebras no DNA. Recombinação pode ocorrer
entre sequências relacionadas, mas não idênticas,
dentro de um cromossomo ou entre cromossomos.
Também pode ocorrer por ligação de extremidades
não homólogas após quebra da dupla-fita do DNA.
Algumas formas de câncer são desencadeadas por
rearranjos cromossômicos específicos que resultam
em fusões de genes que formam oncogenes. A leuce
mia mieloide crônica (CML) e a leucemia linfocítica
aguda (ALL) podem resultar de translocações entre
os cromossomos 9 e 22 que criam proteínas de fusão
entre os genes BCR e ABL. A proteína de fusão BSR
-ABL é uma tirosina quinase ativa que funciona como
um oncogene.
A recombinação homóloga é recíproca, transferin
do parte de um cromossomo para o outro, e vice-ver
sa. Ela “embaralha” a combinação de genes antes que
eles sejam passados para a geração seguinte, gerando
diversidade genética. Essa é uma parte normal do pro
cesso de alinhamento e segregação dos cromossomos,
necessários para garantir que cada célula germinativa
receba um único conjunto haploide de cromossomos
durante a meiose. A probabilidade de que um evento
de recombinação ocorra entre quaisquer dois pontos de
um cromossomo é grosseiramente proporcional à dis
tância física entre eles. Essa é a base do mapeamento
genético. Uma frequência de 1% de recombinação entre
dois genes ou marcadores é definida como uma distân
cia genética de 1 centimorgan (cM). No homem, 1 cM
é aproximadamente 1.000.000 pb ao longo do cromos
somo.
Recombinação Homóloga
Existem três modelos principais para recombinação
homóloga (Tabela 4.3). Eles estão relacionados de vá
rias formas, e têm um intermediário comum chamado
junção Holliday. O mais simples é o modelo Holliday; o
entendimento de seus pontos chaves tornará fácil ver as
diferenças dos outros.
Modelo Holliday
As características chaves do modelo Holliday são:
(a) homologia, (b) simetria de ambas as quebras e in
vasão da fita; e (c) presença de uma “junção Holliday”
de quatro fitas como intermediário chave (Tabela 4.3).
Nesse modelo, a recombinação é iniciada por um par de
quebras de fita única em posições homólogas nos dois
dúplices de DNA alinhados (Figura 4.20). As fitas de
cada duplex desenrolam parcialmente, e cada uma “in
vade” o duplex oposto. Isto é, uma parte da fita de cada
duplex estabelece pares de bases com o duplex oposto
de modo recíproco e simétrico. Essas fitas podem ser
unidas covalentemente ao duplex oposto, criando uma
molécula de junção na qual duas fitas cruzam entre as
moléculas de DNA.
Então ocorre a migração da ramificação (Figura
4.20c); migração da ramificação é o desenrolamento
e enrolamento simultâneo dos dois dúplices, de modo
que o número total de pontes de hidrogênio permanece
constante, mas a posição do cruzamento muda. Como o
número de pontes de hidrogênio permanece constante
e a molécula de DNA fina e cilíndrica gira com facili
dade em torno do seu eixo, a migração da ramificação
requer pouca energia. A migração da ramificação cria
uma região de heteroduplex, uma região em que uma
fita vem de um duplex original e a outra vem do outro
duplex. No homem, dois indivíduos diferem em apro
ximadamente um par de bases por mil; portanto, uma
região de heteroduplex frequentemente contém pelo
menos um par de bases errado.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 165

TABELA 4.3 Recombinação Homóloga

Modelo Modelo Modelo de
Holliday Meselson-Radding Quebra da Dupla-Fita
Homologia Sim Sim Sim
Iniciação Duas quebras em uma Uma quebra em fita única Uma quebra na dupla-fita,
única fita, em posições extremidades ressecadas
homólogas
Invasão por fita Uma fita de cada duplex A quebra única elongada Uma ou duas fitas invadem
invade a outra recíproca invade o outro duplex outro duplex
Migração da ramificação Sim Sim Sim
Intermediário chave Junção Holliday Junção Holliday Duas junções Holliday
Heteroduplex formado Sim – simétrico Sim – assimétrico Sim – assimétrico e longo

FIGURA 4.20 Modelo Holliday de

recombinação homóloga.
(a) Sinapses (pareamento): duas molé
culas homólogas de DNA são alinhadas
corretamente. (X,x e Y,y representam
gene Y
x (a)
(e) gene X gene Y
diferentes alelos dos genes X e Y, um de
cada lado do crossover). Quebras de fita
+
única são feitas em posições homólogas
em fitas de mesma polaridade em cada
+ gene x gene y
duplex. (b) As fitas desenrolam par
cialmente e reciprocamente “invadem”
(fazem pares de bases com) a molécu (b) gene X gene Y
la oposta, formando uma estrutura na
qual duas fitas intactas são unidas por
duas fitas cruzadas. Esse é um evento
simétrico e recíproco. Regiões nas quais gene x gene y
uma das fitas era de um duplex e a ou
tra, do duplex homólogo são chamadas
(c) gene X gene Y
heteroduplex. (c) Migração da rami
ficação ocorre. (d) DNA ligase sela as
quebras. Mais migração de ramificação
pode ocorrer. Todas as quatro fitas são
gene x gene y
mantidas juntas em um ponto de cruza
mento. (e) Rotação dessa estrutura for
ma um “intermediário Holliday”, mos (d) gene X gene Y
trado no inserto (h). (f, g) Resolução:
moléculas são separadas por um par
de cortes simétricos em uma de duas
direções (flechas laranja ou verde). As genex geney gene Y gene X
horizontal (h)
extremidades são seladas pela ligase. A
direção dos cortes determina se as regi (f) (g) Corte 2
ões flanqueadoras são trocadas. (f) Se Corte 2 gene
CorteY1

as fitas cruzadas forem cortadas (corte

1, horizontal), os genes ou marcadores geney = Corte 1
flanqueadores permanecem como esta
gene
Corte
x 1 gene x geney
vam (XY/xy). Não se poderia detectar
recombinação entre esses loci. (g) Se
Corte 2
vertical
as fitas parentais não cruzadas forem
cortadas (corte 2, vertical), os genes ou
marcadores flanqueadoras são trocados
(Xy/xY). Isso seria detectado como um gene
gene X
y genex
geney + gene X
evento de recombinação. Note que há
uma região de heteroduplex em ambos
os casos (retângulo); reparo de parea
mento errado nessa região pode levar à
conversão gênica. gene Y
166 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

As fitas cruzadas são ligadas covalentemente ao
outro duplex (Figura 4.20c). Os dois dúplices de DNA,
unidos por um único ponto de cruzamento, podem gi
rar como mostram as Figuras 4.20e e 4.20h para criar
a junção Holliday de quatro fitas. Sua resolução em
dois dúplices pode ocorrer por duas maneiras, repre
sentadas por cortes verticais ou horizontais na Figura
4.20e. Se as fitas cruzadas forem cortadas (corte 1), os
marcadores que flanqueiam a região do heteroduplex
permanecem ligados da mesma fase original (X com Y
e x com y; painelf); num nível grosseiro, os cromos
somos permanecem inalterados. Se as fitas intactas
forem cortadas (corte 2), as regiões flanqueadoras são
trocadas entre os dois cromossomos, criando um novo
cromossomo contendo parte de um dos pais e parte do
outro (X com y e x com Y; Figura 4.20g). O heterodu
plex pode sofrer reparo de pareamento errado (p. 175),
convertendo um alelo em outro, um processo chamado
conversão gênica.
Modelo de Meselson e Radding
Uma vez que você tenha entendido o modelo Holli
day, é fácil entender a variante proposta por Meselson e
Radding (Tabela 4.3). Esse modelo é iniciado por uma
única quebra e uma única fita invasora, em lugar de um
par de quebras e invasão recíproca (Figura 4.21a). A
fita quebrada serve como uma combinação molde-pri
mer que uma DNA polimerase elonga, e essa elonga
ção desloca parte do duplex invadido (Figura 4.21b).
A fita deslocada invade o duplex oposto, alinhado, for
mando uma estrutura chamada alça-D (D-loop) (Figu
ra 4.21c). A parte fita-única da alça-D é degradada, e
síntese do reparo e fechamento resultam em crossing
over de uma fita. Ocorre a migração da ramificação. A
quebra remanescente é selada, e as fitas podem girar
para formar uma junção Holliday idêntica à descrita
para o modelo Holliday precedente (Figura 4.21e), que
é resolvida exatamente da mesma maneira, resultando
numa troca de marcadores flanqueadores (corte 2: X
com y e x com Y; Figura 4.21g) ou na configuração origi
nal dos marcadores (corte 1: X com Y e x com y; Figura
4.21f). A diferença chave no modelo Meselson-Radding
é o heteroduplex assimétrico que resulta da invasão por
uma fita de um dos dois dúplices. O reparo de parea
mento errado pode levar a conversão gênica, como no
modelo Holliday.
(a) gene X gene Y
+
gene x gene y

(b) gene X gene Y

genexgeney

(c) gene X gene Y

FIGURA 4.21 Modelo Meselson-Radding de gene x gene y

recombinação homóloga.
Esse modelo é semelhante ao modelo Holliday, mas o (d) gene X gene Y
início é feito por uma única quebra e invasão de uma
única fita. (a) Sinapse (pareamento): duas moléculas
homólogas de DNA são alinhadas corretamente. Uma
quebra de fita única é feita em uma ds fitas. (b) A ex gene x gene y
tremidade 3!-OH é elongada por uma DNA polimerase,
(e) gene X
deslocando a extremidade 5!. (c) A extremidade 5! livre
invade o duplex homólogo, formando uma “alça-D”. (d) Corte 2
A alça-D é degradada e síntese do reparo e fechamen gene Y
to pela DNA ligase levam a uma molécula na qual uma
fita cruza entre dois dúplices. Migração da ramificação Corte 1
ocorre à medida que uma fita é ainda mais elongada. A
fita em elongação cruza e é ligada ao duplex oposto, dei geney
xando todas as quatro fitas unidas em um único ponto
de crossover, como na Figura 4.20. (e) As fitas giram
para formar uma junção Holliday, exatamente como na + gene x Corte (g)
1 Corte 2
Figura 4.20e e h. A resolução da junção Holliday pode
ocorrer
mina se de
as duas
regiões
maneiras,
flanqueadoras
e a direção
serão do
trocadas.
corte deter-
Note (f) gene Y gene X geney gene X

que há uma região de heteroduplex em ambos os casos +

(retângulos), mas não é recíproco; é apenas em um du
plex. Reparo de pareamento errado nessa região pode
levar à conversão gênica. gene x geney gene x gene Y
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 167

Modelo de Quebra da Dupla Fita
O terceiro modelo é o de quebra da dupla fita (Ta
bela 4.3). Nesse modelo, a recombinação é iniciada por
uma quebra da dupla fita em um duplex (Figura 4.22a).
As extremidades são ressecadas (Figura 4.22b), resul
tando em perda de informação genética de um dos dois
dúplices. Há formas alternativas desse modelo. Em uma
delas, os dois segmentos de fita única do duplex quebra
do invadem o duplex intacto, formando uma molécula
com duas junções Holliday. As extremidades quebradas
podem ser reparadas por uma polimerase, usando a ca
deia intacta como molde, e uma DNA ligase. A migração
da ramificação ocorre como nos modelos anteriores.
Em um modelo alternativo, a extremidade 3! de um
dos dois lados da quebra invade a outra fita e estabe
lece uma alça-D que permite copiar o duplex intacto.
Isso pode resultar em uma pequena bolha de replicação
com síntese em ambas as fitas por uma distância curta,
e resolução quando a bolha encontra o outro lado da
quebra. Isso responderia por extensa conversão gênica.
A resolução das duas junções Holliday é feita por um
par de cortes (Figura 4.22f). Como há duas direções
possíveis para resolver cada junção, há quatro resulta
dos possíveis. Duas deixam os marcadores flanqueado
res juntos em sua configuração original (X com Y e x
com y), e duas levam a troca dos marcadores flanquea
dores (X com y e x com Y). A resolução por uma topoi
somerase tipo II também pode ocorrer. Como um du
plex perdeu DNA na região da quebra, o preenchimento
da falha requer que a informação genética para ambos
os cromossomos resultantes venha do duplex intacto;
portanto, se existiam diferenças de sequência entre os
cromossomos na falha, terá ocorrido conversão gênica.
Proteínas Chaves da Recombinação
em E. coli
Em E. coli, a proteína chave do processo de recom
binação é RecA, que se liga de maneira cooperativa a
um DNA de fita simples e forma um enovelamento heli
coidal. Isso facilita o pareamento da fita única com um
DNA homólogo duplex para formar a tripla fita da alça
-D. Troca de fitas pode ocorrer, levando a DNA hetero
duplex. Eucariotos têm proteínas homólogas, sendo que
sua versão humana é chamada RAD51.
RecBCD é um complexo de E. coli com múltiplas ati
vidades; liga-se a uma quebra de dupla fita e a processa
em um substrato para a recombinação degradando o
DNA para trás, até encontrar uma sequência especial
chamada sítio χ, deixando uma projeção de fita simples
com 3!-OH. RecA pode se ligar a essa fita única para
iniciar o pareamento com o duplex homólogo. RuvA e
RuvB formam um complexo com atividade de DNA he
licase que catalisa extensa migração da ramificação,
uma etapa chave na recombinação. RuvC é uma endo
nuclease que se liga a esse complexo e catalisa a resolu
ção das junções Holliday.

(a) gene X A gene Y

C
T

G
gene x geney

(b)
C
T

G FIGURA4.22 Modelo de quebra da dupla fita em recombinação

homóloga.
Esse modelo é semelhante de muitos aspectos aos dois modelos discutidos an
(c)
teriormente, mas a iniciação se dá por uma quebra na dupla fita em um dos dois
CT
G DNAs. (a) A iniciação se dá por uma quebra da dupla fita em uma molécula de
DNA. Dois dúplices alinhados são mostrados; genes flanqueadores têm diferentes
alelos (X,x;Y,y). Também é mostrada uma posição na qual um duplex tem um
par de bases AT e o outro, um par de bases GC. (b) DNA é recortado a partir da
(d) quebra por uma exonuclease que deixa extremidades com excesso em 3!-OH.
C Esse recorte pode remover um dos nucleotídeos do ponto que difere entre os
dúplices. (c) Uma ou ambas as extremidades em excesso podem invadir o du
G
plex homólogo intacto. (d) Onde houver um erro de pareamento, a extremidade
livre pode ser mais recortada por enzimas do reparo de pareamento errado. (e)
(e) gene X gene Y A extremidade livre pode ser elongada por uma DNA polimerase, usando a fita
G
C
não degradada como molde e resultando em conversão gênica. As quebras rema
C nescentes são reparadas, formando duas junções Holliday. (f) Ambas as junções
G Holliday são então resolvidas. Como existem duas junções e duas maneiras de
gene x G
C geney
resolver cada uma (como na Figura 4.20h), há quatro resultados possíveis. Duas
(f) gene X gene Y das quatro maneiras possíveis de resolver as junções Holliday (cortes vertical/
vertical ou horizontal/horizontal) deixam os marcadores flanqueadores como es
tavam (XY/xy). As outras duas maneiras de resolver as junções Holliday levam à
troca dos marcadores flanqueadores (Xy/xY). Resolução também pode ser feita
genex geney
por topoisomerase.
168 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
Recombinação Não-Homóloga
Recombinação Sítio-Específica
Na recombinação sítio-específica, enzimas especia
lizadas catalisam a integração de uma sequência em
pontos específicos do DNA. Integração do bacteriófago
λ no cromossomo de E. coli é o exemplo mais bem estu
dado. A integrase λ catalisa quebra específica do DNA
λ e de uma sequência especial do cromossomo de E.
coli, além de catalisar a religação envolvida. Esse é um
processo reversível; a sequência λ integrada pode ser
removida do cromossomo. Existem importantes exem
plos de recombinação sítio-específica que controlam
processos como conjugação tipo conversão em levedura
e mudança de fase (alterações na principal proteína de
superfície) de tripanossomos. Mudança de fase de tripa
nossomos ajuda o parasita a evadir da resposta imune.
Transposição
Transposição é o movimento de pedaços específi
cos de DNA no genoma. Existem dois tipos de eventos
de transposição: transposição simples, na qual uma se
quência é removida de um local no genoma e inserida
em outro local, e transposição replicativa, na qual uma
cópia da sequência é inserida em outro local do geno
ma, sem que a original seja perdida. As transposases
são as enzimas que catalisam a transposição. Elas reco
nhecem e agem sobre sequências de inserção. Alguns
pedaços de DNA, chamados transposons, codificam
transposases flanqueadas por sequências de inserção
e podem se mover para quase qualquer lugar no cro
mossomo alvo. Transposons, às vezes, carregam outros
genes com eles, quando transpõem. Outros pedaços de
DNA contêm sequências de inserção, mas não codifi
cam sua própria transposase; esses pedaços podem se
mover quando uma transposase codificada em outro lo
cal é expressa.
Transposons podem se mover para novos lugares
dentro de um cromossomo ou se integrar a outros cro
mossomos. Uma fração significativa do genoma huma
no resultou do acúmulo de transposons e sequências de
inserção. Elementos Dispersos Longos (LINEs, long
interspersed elements, do qual o elemento L1 é o mais
comum) são transposons presentes em cerca de 50.000
cópias no genoma humano. As sequências Alu são ele
mentos dispersos pequenos (SINEs, short intersper
sed elements), presentes em cerca de 500.000 cópias
por genoma humano haploide; não codificam transcrip
tase reversa. Algumas mutações que causam doenças
se devem a inserção de um transposon dentro de um
gene, alterando sua codificação ou regulação.
Retrotransposons são sequências que foram trans
critas em RNA e depois transcritas reversamente e
integradas de volta num local qualquer do genoma.
Os retrovírus fazem cópias em DNA do seu RNA genô
mico (usando transcriptase reversa, uma enzima que
faz uma cópia em DNA de um RNA) e inserem-nas no
cromossomo hospedeiro por um evento de transposição
catalisado por uma integrase codificada pelo vírus.
Ligação de Extremidades Não-Homólogas
Na ligação de extremidades não-homólogas (NHEJ;
às vezes chamada recombinação ilegítima), nenhuma
homologia é necessária, nem existem sequências espe
ciais no DNA. Ao contrário, extremidades quebradas de
um DNA duplex podem recombinar com outro duplex
na ausência de homologia. Isso pode levar ao reparo de
uma quebra de dupla-fita de DNA e, assim, é de con
siderável valor para sobrevivência. Também pode le
var a translocação cromossômica ou a inserção de um
fragmento de DNA em qualquer lugar do genoma. Em
células de mamíferos, um heterodímero chamado Ku
liga-se avidamente às extremidades do DNA e pode
se mover ao longo do DNA. Ku associa-se com uma su
bunidade catalítica grande para formar DNA-PK, uma
serina/treonina proteína quinase dependente de DNA.
Acredita-se que isso desempenhe um papel na ligação
de extremidades não homólogas (NHEJ) por se ligar e
aproximar as duas extremidades livres de uma quebra
de dupla-fita e protegê-las de ação excessiva de nuclea
ses. Pode desenrolar as extremidades até que regiões
muito curtas de “micro-homologia” (2 – 6 pb) possam
parear. As “sobras” (flaps) não pareadas poderiam ser
removidas por FEN1, as falhas preenchidas por DNA
polimerase, e as quebras ligadas por DNA ligase. Defei
tos em Kulevam a sensibilidade aos raios-X, em virtude
da capacidade reduzida de reparar as quebras de du
pla-fita causadas por raios-X. Defeitos em Ku também
podem levar à doença de imunodeficiência combinada
grave (SCID), porque outra função de Ku é na recom
binação V(D)J, a clivagem sítio-específica e a religação
necessária à montagem dos genes funcionais de imuno
globulinas.
Quando genes são introduzidos em células de ma
míferos, eles geralmente se integram aleatoriamente no
cromossomo por ligação de extremidades não homólo
gas. Essa integração aleatória de um fragmento de DNA
pode destruir genes e causar mutações ou desregula
ção. Portanto, é possível que a tentativa de corrigir um
problema genético pela inserção de um gene possa cau
sar outro problema; esta é uma importante limitação
da terapia gênica no momento (Correlação Clínica 4.6).
Pseudogenes
O genoma humano contém muitos pseudogenes,
cópias não funcionais de genes. Essas cópias podem
resultar de retrotransposição de mRNAs, e, nesse
caso, elas não têm íntrons, ou de transcritos parcial
mente processados, e neste caso podem conter alguns,
mas não todos os íntrons. Em outros casos, parecem
surgir de recombinação, como crossing over desigual,
e contêm íntrons. Frequentemente, esses pseudogenes
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA
CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.6
Recombinação e Terapia Gênica
A terapia gênica é a introdução de genes novos ou
alterados em células para corrigir um defeito genéti
co ou tratar uma doença. À medida que aprendemos
mais sobre doenças específicas, as possibilidades de
intervenção genética aumentam. O tipo mais fácil de
doença a ser curada por terapia gênica é aquele em
que o suprimento de uma proteína circulante pode
ser fornecido por células engenheiradas para produ
zi-la, sem necessidade de essas células ficarem em
uma localização específica. Um pouco mais difícil se
ria a produção regulada de uma proteína, por exem
plo, insulina, que pode ser fornecida por células loca
lizadas em qualquer lugar no corpo. Será muito mais
difícil substituir um gene defeituoso por uma cópia
normal em células específicas nas quais é expresso.
Várias limitações importantes impedem o pro
gresso. Uma é a dificuldade de introduzir genes em
células relevantes; isso está sendo abordado por mais
trabalhos sobre vetores para a introdução de genes e
sobre a biologia de células-tronco. Outra é a tendên
cia dos genes introduzidos serem incorporados alea
toriamente no genoma. O DNA introduzido em célu
las de mamíferos integra-se mais frequentemente ao
genoma por ligação de extremidades não homólogas
(NHEJ). Essa inserção aleatória pode resultar na
criação de uma nova mutação se o transgene se in
serir numa sequência codificadora ou regulatória de
um gene. Também pode criar dificuldades na susten
tação da expressão gênica ao longo do tempo, porque
o gene inserido não estará em seu local normal no
cromossomo e, portanto, pode ser regulado incorre
tamente por mecanismos epigenéticos.
são não funcionais em virtude de mutações de senti
do errado (missense) ou sem sentido (nonsense) (ver
p. 170) ou porque as sequências necessárias à inicia
ção da transcrição foram alteradas. Em outros casos,
retrotransposição ou crossing over desigual foram a
matéria-prima para evolução, quando o acúmulo de
mudanças genéticas leva a cópia do gene a assumir ou
tras funções.
4.5 DANOS AO DNA E
MUTAÇÕES
O DNA em células está continuamente sendo dani
ficado por constituintes celulares, incluindo espécies
ativas de oxigênio que são subprodutos do metabolis
mo. Muitos agentes ambientais e compostos químicos
nos alimentos atacam e modificam o DNA. Danos no
• 169
DNA podem bloquear processos essenciais, incluindo
a replicação e a transcrição do DNA, e podem levar a
mutações.
Em solução aquosa a 37°C, ocorre deaminação es
pontânea de bases C, A e G no DNA. C deamina forma
U (Figura 4.23a), A forma hipoxantina, e G, xantina.
A despurinação espontânea em virtude da clivagem da
ligação glicosídica que liga purinas ao esqueleto, dei
xando o esqueleto do DNA intacto (Figura 4.23b), ocor
re a uma taxa substancial. Estima-se que entre 2.000 e
10.000 purinas sejam perdidas por célula de mamífero
em 24 horas. Esses sítios despurinados são chamados
abásicos (em que falta uma base) ou sítios AP (original
mente significando apurínico, em que falta uma purina,
mas depois generalizado para falta de qualquer base).
As bases são oxidadas a uma velocidade substancial
por espécies reativas de oxigênio, que são subprodutos
do metabolismo oxidativo; isso cria bases alteradas, por
exemplo, 8-hidroxiguanina (8-oxo G; Figura 4.23c).
Danos oxidativos tendem a aumentar com a idade. Pro
dutos da peroxidação de lipídeos podem formar aductos
com bases, particularmente resíduos G.
Agentes alquilantes, incluindo alguns usados em
quimioterapia, adicionam metil ou outro grupo alquila
às bases. S-adenosil metionina, um carregador de gru
pos metil do metabolismo normal, ocasionalmente me
tila uma base no DNA.
A radiação ultravioleta (da luz do sol ou de lâmpa
das de bronzeamento) liga covalentemente pirimidi
nas adjacentes ao longo de uma fita do DNA, formando
cis-syn-ciclobutano dímeros de pirimidina (Figura
4.23d e e) e outros fotoprodutos, incluindo pirimidina
6-4 pirimidonas. A radiação ionizante, incluindo raios
-X e decaimento radioativo, criam quebras nas fitas e
produzem espécies reativas de oxigênio que danificam
o DNA.
Agentes carcinogênicos e mutagênicos atacam o
DNA. Alguns agem diretamente e outros são pró-carci
nogênicos. Pró-carcinogênicos em sua forma nativa não
danificam o DNA, mas podem ser ativados por proces
sos metabólicos (por exemplo, oxidados por citocromos
P450) em carcinogênicos que danificam o DNA. Esse
processo é chamado ativação metabólica. Benzo(a)pi
reno, um constituinte do alcatrão, é um agente pró-car
cinogênico extremamente potente que requer oxidação
para que o epóxido ataque o DNA.
Muitos agentes quimioterápicos atacam o DNA; al
guns promovem alquilação das bases, outros, incluindo
a cisplatina, fazem ligações cruzadas entre as duas fi
tas (Correlação Clínica 4.7). A maior sensibilidade de
células em replicação a lesões no DNA significa que as
células tumorais de divisão rápida são mais sensíveis
a esses agentes lesivos do que as células normais, mas
sua ação deletéria sobre células normais limita sua do
sagem e seu uso.
170 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

H
CH
H NC
C NH
N H O CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.7
C CC
CH NH Cisplatina e o Tour de France
NC
Muitas drogas comumente usadas em quimiote
H O H O
rapia são agentes alquilantes, frequentemente com
(a) dois grupos funcionais que podem criar ligações cru
zadas tanto intracadeia como intercadeias no DNA.
Ciclofosfamida, busulfan e nitrosoureia são agentes
A A G C T T G T A alquilantes. Agentes alquilantes não são apenas tóxi
T T C A A C A T cos, mas também mutagênicos, às vezes, resultando
em câncer secundário como leucemias.
(b) Cisplatina (cis-diaminodicloroplatina),

CH3
NH3
O6Me-G O N ClPt NH3
HN CC
N C H Cl
COHC
N
N usada para tratar câncer metastático testicular, ova
H riano e uma grande variedade de outros tipos, faz
(c) ligação cruzada no DNA. Entre os graves efeitos co
laterais da cisplatina estão depleção de medula ós
sea, insuficiência renal grave e perda de audição e
AçúcarN CH N de equilíbrio. O câncer testicular disseminado cos
Açúcar CO
O C C CH3
tumava ser quase sempre fatal (5% de taxa de cura
Fosfato
em 1973), até que uma combinação quimioterápica,
C N H na qual a cisplatina foi adicionada a vinblastina e ble
N C C CO
omicina, foi desenvolvida pelos Drs. Larry Einhorn e
H CH3Anel
John Donohue Indiana University School of Medici
ciclobutano ne. A nova combinação aumentou muito a sobrevida.
(d) (e) Esse protocolo foi posteriormente modificado para
uma combinação de cisplatina, etoposídeo e bleo
FIGURA 4.23 Danos ao DNA.
micina. Hoje, aproximadamente 80% dos pacientes
(a) Deaminação oxidativa converte C em U. (b) Sítio AP. Despuri
nação (ou, menos frequentemente, despirimidinação) é a clivagem
sobrevivem. Após tratamento de câncer testicular
de uma ligação glicosídica entre a posição 1! do açúcar e a base. Isso avançado, o ciclista campeão mundial Lance Arms
deixa um sítio abásico ou AP, mas não quebra o esqueleto açúcar trong competiu e ganhou o Tour de France sete ve
-fosfato. (c) O6-metil guanosina é uma lesão altamente mutagênica. zes consecutivas.
(d) Luz ultravioleta leva à ligação cruzada entre piridinas adjacen
tes ao longo de uma das fitas do DNA. Um dímero timina cis-syn Einhorn, L. H. Curing metastatic testicular cancer.
ciclobutano é mostrado no esquema. (e) Um dímero ciclobutano é Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:4592, 2002
mostrado no DNA dupla-fita; o esqueleto é mostrado como um bas
tão para revelar a distorção das bases em ligação cruzada (amarelo)
e bases complementares na outra fita.

Mutações a uma transição. A frequência de transições é aumen

Mutações são alterações hereditárias na sequência
do DNA. Podem resultar de erros na replicação, de da
nos ao DNA ou de erros introduzidos durante o reparo
dos danos. Mutações que são trocas de um único par de
bases são chamadas mutações puntuais.
Mutações puntuais podem ser classificadas pela na
tureza das bases alteradas. Transições são mutações
puntuais nas quais uma purina é substituída por outra
(por exemplo, A por G ou G por A) ou uma pirimidina
é substituída por outra (por exemplo, T por C ou C por
T). A deaminação de C para U, se não reparada, levaria
tada por análogos de bases, incluindo 2-amino purina
(Correlação Clínica 4.8). Transversões são mutações
puntuais nas quais uma purina é substituída por uma
pirimidina ou vice-versa (por exemplo, A por C ou C
por A).
Mutações puntuais também podem ser caracteriza
das por seu efeito sobre uma sequência codificadora.
Mutações de sentido errado (missense) são mutações
puntuais que trocam um único par de bases em um
códon, de modo que o códon agora codifica um ami
noácido diferente (Figura 4.24a). Mutações sem sen
tido (nonsense) são mutações puntuais que trocam
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 171

CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.8

Análogos da Base Tiopurina Como Drogas

6-Mercapto purina (6-MP) é um análogo de purina
administrado oralmente que é útil na quimioterapia de
leucemias agudas e para imunossupressão após trans
plante de órgãos. Age por vários mecanismos, inclusive
inibindo a biossíntese de purinas e causando toxicidade
após incorporação ao DNA. É metabolizada a 6-MP ribo
sina 5!-fosfato, que tem meia-vida curta porque é degra
dada por xantina oxidase. A velocidade de degradação é
muito reduzida em pacientes que estão sendo tratados
com alopurinol (um inibidor da xantina oxidase) para
hiperuricemia relacionada à gota, de modo que a dose
deve ser drasticamente reduzida em tais pacientes.
Outra enzima que metaboliza 6-MP (e o antimetabó
lito relacionado 6-tioguanina) é tiopurina metil trans
ferase (TPMT). Alguns pacientes (cerca de 10% da po
pulação) são heterozigotos para um polimorfismo que
inativa a enzima e, portanto, têm aproximadamente 50%
da atividade, e 1/300 das pessoas não têm atividade de
TPMT e correm risco extremamente elevado de imunos
supressão grave e morte, se forem tratados com 6-MP.
Por outro lado, pessoas que metabolizam as drogas mais
rapidamente podem não atingir dose terapêutica sufi
ciente. Essa diferença farmacogenética, portanto, tem
sérias implicações para o tratamento com tiopurinas.
Sanderson, J., Ansari, A., Marinaki, T. e Duley, J. Thiopu
rine methyltransferase: Should it be measured before com
mencing thiopurine drug therapy? Ann. Clin. Biochem.
41:294, 2004.

um único par de bases em um códon para um Mutações pontuais

códon de terminação (stop codon) que termi ------

---CLU
eGu ACGUAU
Thr Tyr U
PUhU
e AA
sUnG
VUaC
l MT
AeGt --- ---L U
---C eGuA
TChG
rUSC
eUrU
PUhU
e AA
sUnG
VUaC
l MT
A Gt
na a tradução (Figura 4.24b). Mutações sem e ---
---
sentido geralmente têm efeitos mais graves do (a) Mutação de sentido errado (missense) (A para C)
que mutações de sentido errado, porque levam
à síntese de polipeptídeos truncados (e geral ---CUGACGUAUUUUAAUGUC--- M
ATeG
t ---CUGACGUAAUUUAAUGUCATG---
---Leu Thr Tyr Ph e As nVa l --- ---Leu Thr *** para da
mente instáveis). Mutações silenciosas ou si
(b) Mutação sem sentido (nonsense) (U para A)
nônimos não alteram o aminoácido codificado;
essas mutações incluem muitas mudanças no
Inserções e deleções
terceiro nucleotídeo de um códon. Algumas
---CUGACGUAUUUUAAUGUCATG---
------ ---CUGAACGUCUUUUAAUGUCAT---G
mutações silenciosas podem, entretanto, ter Leu Thr Tyr Ph e As nVa l Me t ---Leu As nVa l Ph e *** para da
sérias consequências se mudarem o padrão de
(c) Insertção (de A), muda a estrutura de leitura e causa uma mutação Frameshift
splicing do gene.
---CUGACGUAUUUUAAUGUCATG--- ---UGACGUCUUUUAAUGUCATG---
---Leu Thr Tyr Ph e As nVa l Me t --- --- *** para da
Inserções ou remoções de um ou mais pares
de bases (se o número de pares de bases não (d) Deleção (do primeiro C), muda a estrutura de leitura e causa uma mutação Frameshift

for um múltiplo de 3) podem levar a mudanças

na estrutura de leitura (frameshifts) que des ---CGGCGG [ CGG ]45CGG--- ---CGGCGG [CGG ]102CGG---

troem a codificação de uma proteína (Figura (e) Expansão de tripletes, pode causar doença

4.24c e d). A tradução de um mRNA não tem

pontuação; ao contrário, uma vez que o código
de iniciação tenha sido determinado, tripletes
sucessivos são lidos como códons. Portanto, en
quanto adição (ou deleção) de um múltiplo de
três pares de bases em uma região codificadora
adicionaria (ou subtrairia) aminoácidos a (ou
de) uma proteína, a adição de outros números
de pares de bases desloca a estrutura de leitura
daquele ponto em diante. Mudanças na estru
tura de leitura (frameshifts) geralmente levam
a terminação prematura (ou, mais raramente, à
elongação) da cadeia polipeptídica codificada,
quando códons de terminação (stop codons)
são gerados ou removidos pela mudança na es
trutura de leitura. Alguns agentes químicos,
incluindo acridinas e proflavina, intercalam
FIGURA4.24 Mutações.
Mutações puntuais. (a) Uma mutação de sentido errado (missense) muda
um único aminoácido no polipeptídeo codificado. (b) Uma mutação sem
sentido (nonsense) altera um códon de um aminoácido para um códon de
terminação (stop), terminando a síntese do polipeptídeo codificado. Muta
ções por inserção/deleção. (c) Inserção de um único nucleotídeo altera a
estrutura de leitura de todos os códons depois do ponto da inserção; isso
geralmente leva à formação de um novo códon de terminação que finaliza a
síntese. (d) Deleção de um único nucleotídeo muda a estrutura de leitura de
todos os códons após o ponto da deleção; isso geralmente leva à formação de
um novo códon de terminação que finaliza a síntese. (e) Expansão de triple
tes é um grande aumento no número de repetições de tripletes. A expansão
de tripletes causa muitas doenças, incluindo a doença de Huntington e a
doença do XFrágil, por adicionar longas extensões de um único aminoácido
ao polipeptídeo codificado ou por destruir a regulação de um gene.
172 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
-se no DNA; isto é, inserem-se entre pares de bases
adjacentes. Isso geralmente leva a inserções ou dele
ções de um único par de bases e, assim, uma mudan
ça na estrutura de leitura. Mutações também podem
resultar de alterações em larga escala, incluindo in
serção de transposons. Embora raras em uma geração
qualquer, mutações acumularam-se em populações ao
longo de milhões de anos, de modo que duas pessoas
diferem em cerca de 1 pb por 1.000 ao longo de seus
genomas. Muitas dessas diferenças genéticas não têm
efeito, mas outras afetam nossa fisiologia, susceptibili
dade a doenças e resposta a tratamentos (Correlação
Clínica 4.9).
O genoma contém muitas sequências de 2, 3, 4 ou 5
nucleotídeos repetidos. Essas repetições simples têm
uma taxa de mutação maior do que a média porque
podem, ocasionalmente, se alinhar erroneamente du
rante a replicação e a recombinação, levando a inser
ção ou deleção de certo número de repetições. Assim,
ao longo de muitas gerações, diferentes comprimentos
dessas sequências acumularam-se na população hu
mana; são chamados polimorfirmos de comprimento
de sequências simples (também chamados microssa
télites ou polimorfismos de repetição de sequências
simples). Há um tipo especial de mutação que resulta
de um grande aumento no número de tripletes repe
titivos (por exemplo, CGGCGG[CGG]nCGG), chama
do expansão de tripletes (Figura 4.24e). Quando o
comprimento de uma repetição de tripletes fica muito
mais longo do que o normal, pode causar doença por
codificar uma sequência do mesmo aminoácido muito
mais longa do que o normal no polipeptídeo codifica
CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.9
Medicina Personalizada
Indivíduos diferem na sequência do DNA do seu ge
noma de formas sutis, como resultado de um acúmulo
muito gradual de mutações na população ao longo de
muitas gerações. As diferenças mais comuns envolvem
um único par de bases; isso é chamado polimorfismo de
um único nucleotídeo (SNP) (embora polimorfismo de
um único par de bases fosse mais correto). Existem qua
se 7 milhões de SNPs validados no genoma humano, e
muitos mais reportados; isso dá uma média de 1 por 500
pb. A maioria dos polimorfismos não afeta as funções ce
lulares, mas outros contribuem para as muitas diferenças
que vemos. Alguns afetam susceptibilidade a doenças es
pecíficas, alguns afetam o metabolismo de drogas e ou
tros compostos (farmacocinética), e outros ainda afetam
a resposta a essas drogas (farmacodinâmica).
Como parte do projeto genoma humano, há um gran
de esforço para descobrir e catalogar polimorfismos.
do, como na doença de Huntington (Correlação Clíni
ca 2.6). Expansão de tripletes também pode afetar a
regulação de um gene, como na síndrome do X Frágil
(Correlação Clíninica 2.6), na qual a sequência de tri
pletes muito aumentada no promotor altera a expres
são gênica. Nessas doenças de expansão de tripletes
há um fenômeno pouco comum: a doença geralmente
fica mais grave em gerações sucessivas, como resul
tado de aumento ainda maior no comprimento dos
tripletes, porque quanto mais longa for a sequência
repetitiva, maior a probabilidade de alinhamento er
rado durante a replicação ou crossing over desigual,
levando a repetições drasticamente mais longas.
4.6 REPARO DO DNA
A manutenção da informação genética requer repa
ro constante dos danos ao DNA. Todos os organismos
de vida livre possuem mecanismos de reparo aos danos
no DNA. Algumas lesões são reparadas diretamente,
mas a maioria é removida do DNA como parte do pro
cesso de reparo. Uma característica chave da maioria
dos processos de reparo é a natureza em dupla-fita do
DNA, que permite a restauração da sequência correta
em uma fita danificada, com o uso da informação gené
tica complementar da outra fita.
Reparo por Excisão
Reparo por excisão é um mecanismo geral que pode
reparar com grande precisão muitos tipos diferentes
Quanto mais se aprende sobre os efeitos dessas diferen
ças de sequências sobre doenças e tratamentos, mais
a medicina se tornará adaptada ao indivíduo. Já existe
tecnologia para determinar rapidamente que polimor
fismo está presente em pontos específicos do genoma
de um indivíduo. Quando essas tecnologias ficarem
mais baratas e rotineiras, a determinação dos alelos
presentes em genes chaves tornar-se-á parte rotineira
do diagnóstico e do planejamento do tratamento. Por
exemplo, há diferenças significativas entre indivíduos
na velocidade com que metabolizam drogas (compare
Correlação Clínica 4.8). Uma dose padrão baseada no
peso corporal pode ser muito baixa para ser efetiva na
queles que metabolizam a droga rapidamente, mas tóxi
ca para aqueles que a metabolizam muito lentamente.
Determinação de polimorfismos relevantes e testes ro
tineiros poderiam levar a terapias mais eficientes, com
menos efeitos colaterais.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA
de danos. A característica que define o reparo por ex
cisão é a remoção do(s) nucleotídeo(s) danificado(s),
deixando uma falha no DNA, seguida por ressíntese,
usando a informação genética da fita oposta e, depois,
ligação para restabelecer a continuidade do DNA. Exis
tem dois modos principais de reparo por excisão: repa
ro por excisão de base (BER) e reparo por excisão de
nucleotídeos (NER) (Tabela 4.4).
Reparo por Excisão de Base
Reparo por excisão de base é um processo essen
cial que repara muitos tipos diferentes de bases dani
ficadas, incluindo bases metiladas, bases deaminadas
(por exemplo, U resultante da deaminação de C), ba
ses oxidadas e sítios abásicos (AP). A etapa inicial é a
remoção de uma única base danificada do esqueleto
do DNA por uma DNA glicosilase, uma enzima que
corta a ligação N-glicosil entre o açúcar e a base (Fi
gura 4.25). Essa etapa não quebra o esqueleto açúcar
-fosfato do DNA; ao contrário, deixa uma desoxirribo
se abásica no esqueleto, um sítio AP que precisa ser
removido. Duas atividades diferentes são necessárias
para remover esse açúcar: uma AP endonuclease, que
quebra a ligação fosfodiéster no lado 5!, mas deixa o
açúcar ainda ligado ao nucleotídeo seguinte, e uma
AP liase, que corta o lado 3! do sítio AP para remo
ver o açúcar. A falha resultante de um único nucleo
tídeo tem um 3!-hidroxila livre. A falha é preenchida
por uma DNA polimerase e ligada por uma DNA ligase
(Figura 4.25).
Existem, pelo menos, oito glicosilases diferentes
no homem, e cada uma reconhece certos tipos de
bases danificadas. Uma delas, uracil DNA glicosila
se (UNG), é especializada em remover U do DNA. U
não é um constituinte normal do DNA, mas é formado
quando C é deaminada, e pode ocasionalmente ser in
corporado ao DNA durante a replicação. A frequente
deaminação de C para U vista anteriormente (Figura
4.23a) levaria a uma alta taxa de mutação; portanto,
não é surpreendente que um mecanismo de reparo es
pecial tenha evoluído para remover U. Porém, muitos
TABELA 4.4 Reparo por excisão
Passos Básicos
Reconhecimento da lesão
Remoção da lesão por excisão de parte de uma das fitas
Ressíntese para preencher a falha; a informação genética da outra fita é usada
Ligação para restabelecer a continuidade do esqueleto do DNA
Reparo por excisão de base
Glicosilase remove a base, deixa o esqueleto intacto
AP endonuclease corta o esqueleto, AP liase remove o
açúcar
DNA polimerase preenche a falha
DNA ligase sela a incisão
• 173
resíduos C no DNA de mamíferos, na sequência CG,
são metilados na posição 5; isso é importante na regu
lação da expressão gênica. Deaminação de um 5-metil
C deixa um T, em vez de um U, no DNA. Esses resíduos
T não são reconhecidos pela uracil DNA glicosilase,
mas existem outras glicosilases que reconhecem o par
errado T:G resultante e removem preferencialmente
T, deixando um sítio AP (Figura 4.23b). Às vezes, en
tretanto, o sistema de reparo de pareamento errado
remove G em vez de T, criando uma mutação. Ao longo
de milhões de anos, isso levou a uma frequência mui
to menor do que o esperado de dinucleotídeos CG no
DNA de mamíferos.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
FIGURA4.25 Reparo por excisão de base.
(a)O ponto danificado (bolinha azul) é reconhecido por uma
DNA glicosilase. (b) A base é removida por clivagem da ligação
glicosídica que a conecta com o açúcar desoxirribose; o esque
leto açúcar-fosfato não é quebrado. Isso deixa um sítio AP. (c)
O esqueleto açúcar-fosfato é clivado no lado 5! do sítio abásico
por uma AP endonuclease. Há também uma clivagem no lado
3! desse sítio para remover o resíduo de açúcar; isso pode ser
feito por algumas AP endonucleases ou por uma atividade de
AP liase. (d) A falha de um único nucleotídeo é preenchida
por uma DNA polimerase. (e) A incisão remanescente é sela
da por uma DNA ligase.
Reparo por excisão do nucleotídeos
Excisão dupla remove a lesão como parte de um
} oligonucleotídeo (12-13 nt in E. coli, 27-29 nt no
homem)
DNA polimerase preenche a falha
DNA ligase sela a incisão
174 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Outra lesão comum é 8-oxo-G (Figura 4.23c), for com um corte em cada lado da lesão. Uma DNA polime
mada por dano oxidativo, o que leva a uma transver rase preenche a falha, seguida por ligação da incisão.
são. Existe uma via de reparo especial, projetada para
reparar 8-oxo-G; OGG1 remove a lesão do DNA. Se a
replicação já ocorreu, MUTYH remove o A que poderia
ter sido incorporado erroneamente em complemento a
8-oxo-G e permite que a polimerase de reparo coloque
o Ccorreto.

A AP endonuclease mais importante no homem é

APE1. Depois de quebrar o esqueleto no lado 5! de um
sítio AP deixando um 3!-OH livre, APE1 recruta DNA
polimerase β (pol β) para o local. Pol β tem atividade
de AP liase, que remove o açúcar-fosfato abásico rema
nescente no ponto da quebra da fita, deixando uma fa
lha de um único nucleotídeo com um 3!-OH livre. Pol β
também tem atividade de DNA polimerase, que pode
preencher a falha. Para muitos tipos de danos, a falha
é preenchida com apenas um ou dois nucleotídeos; isso
é chamado reparo de segmento curto (short patch re
pair). Em casos nos quais AP liase não pode remover
facilmente o açúcar-fosfato, deslocamento da fita pode
criar uma projeção de vários nucleotídeos e a endonu
clease FEN1 (que também serve para ajudar a remover
o RNA dos fragmentos de Okazaki, como mencionado
anteriormente) pode clivá-la. A falha um pouco maior
é preenchida por uma polimerase como pol β ou pos
sivelmente pol d (ou pole), estimulada por PCNA. Em
qualquer caso, a incisão remanescente é selada por uma
DNA ligase. Interações proteína-proteína coordenam
esse processo, mantendo a quebra e os intermediários
protegidos até que a próxima enzima tenha sido recru
tada para o local.
Reparo por Excisão de Nucleotídeos
Reparo por excisão de nucleotídeos age sobre uma
enorme variedade de danos, envolvendo tipicamente
grandes aductos ou distorção na estrutura em dupla
-hélice do DNA. Os melhor estudados são os dímeros
de pirimidina, os principais produtos de danos por ul
travioleta (Figura 4.23d e e). Aductos químicos com
carcinógenos, como benzo[a]pireno e aflatoxina, e com
agentes quimioterápicos, como cisplatina, são removi
dos por essa via, assim como bases pareadas incorre
tamente e pequenas alças (loops) no DNA. A lesão é
removida por um complexo enzimático que corta vários
nucleotídeos de distância dos dois lados da(s) base(s)
danificada(s), para que a lesão seja liberada como parte
de um oligonucleotídeo (Figura 4.26).
Em E. coli, um complexo de excisão de danos con
tendo UvrA, UvrB e UvrC reconhece a lesão e faz dois
cortes endonucleolíticos, um 3 a 5 nucleotídeos 3! da
lesão, e o outro 8 nucleotídeos 5! da lesão. Isso remove
a lesão como parte de um oligonucleotídeo de 12-13 nu
cleotídeos de comprimento. O reconhecimento da lesão
por UvrA parece iniciar o processo, e a abertura das fi
tas por UvrB (uma helicase) requer energia na forma de
hidrólise de ATP. UvrC liga e catalisa a clivagem dual,
FIGURA 4.26 Reparo por excisão de nucleotídeos.
(a) A base danificada (bolinha azul) é reconhecida por um
complexo de reparo do DNA. (b) O segmento ao redor da base
lesada é removido por um complexo enzimático que faz duas
quebras na fita danificada, uma de cada lado da lesão. (c) Um
oligonucleotídeo (27-29 nt no homem, 12-13 nt em E. coli)
é liberado. (d) Ressíntese: uma DNA polimerase preenche a
falha, usando a fita oposta como molde. (e) A DNA ligase sela
a incisão remanescente.
No homem, vários grandes complexos enzimáticos
estão envolvidos no reconhecimento da lesão, na aber
tura do DNA e nas duas clivagens. A doença rara au
tossômica recessiva Xeroderma pigmentoso (XP), que
torna os pacientes fotossensíveis e suscetíveis a câncer
de pele, resulta de mutação em um dos sete genes en
volvidos no reparo por excisão ou em um gene envolvido
na síntese de DNA translesão (ver Correlação Clínica
4.10). XPC é parte de um complexo que se liga forte
mente a lesões que distorcem a estrutura do DNA. XPA
é um fator chave envolvido no reconhecimento da lesão
e na montagem do complexo de excisão; mutações no
gene XPA tornam os indivíduos essencialmente incapa
zes de remover os dímeros de pirimidina induzidos por
UV. XPA recruta um grande complexo chamado TFII
-H, um fator de transcrição geral envolvido no início da
transcrição. TFII-H contém subunidades XPB e XPD,
ambas ATPases com atividade de helicase limitada. O
DNA é parcialmente desenrolado pela atividade helica
se de TFII-H, criando uma bolha de aproximadamente
25 pares de bases. Então, um heterodímero comple
mento cruzado 1 do reparo por excisão (XPF/ERCC1,
excision repair cross-complementing 1) faz um cor
te endonucleolítico na fita danificada a aproximada
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA
CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.10
Xeroderma Pigmentoso
Xeroderma pigmentoso (XP) (OMIM 194400) foi a
primeira doença que se demonstrou ser causada por de
feito no reparo do DNA. Os pacientes são fotossensíveis
e muito suscetíveis a câncer de pele nas áreas do corpo
expostas ao sol; as taxas de câncer de pele são 2.000
5.000 vezes maiores do que a média. Muitos pacientes
também têm problemas neurológicos.
XP é uma doença rara, autossômica recessiva, que
pode ser causada por defeitos em um dentre oito genes
diferentes, refletindo a complexidade do reparo do DNA
para dímeros de pirimidinas, a lesão mais comum intro
duzida por exposição à luz ultravioleta. Mutações em
sete dos genes XP levam a defeitos na etapa inicial de
incisão do reparo por excisão de nucleotídeos para dí
meros de pirimidina. Isso explica a extrema fotossensi
bilidade que é característica dessa doença. Uma classe
adicional, chamada XP-V (para variante), não apresenta
deficiência detectável no reparo por excisão, mas tem um
defeito na síntese translesão após danos causados por ul
travioleta. Células de pacientes XP podem também ter
hipersensibilidade a carcinógenos da fumaça de cigarro.
XP-C está envolvida na ligação inicial à lesão em re
giões que não estão sendo transcritas, e recruta TFII-H,
um fator de transcrição geral. Em regiões transcritas,
mente 22-24 nucleotídeos 5! da lesão, e XPG faz uma
clivagem endonucleolítica a aproximadamente 5 nucle
otídeos 3! da lesão. Esses dois cortes liberam um oligo
nucleotídeo que contém a lesão, de 27 a 29 nucleotídeos
de comprimento. A proteína de ligação ao DNA de fita
simples RPA é necessária para o reparo por excisão. A
falha no DNA é ligada a RPA e preenchida por pol dou
pole), estimulada por PCNA. A incisão remanescente é
selada por uma DNA ligase, provavelmente LIG1. Essas
últimas etapas lembram a complementação de um frag
mento de Okazaki.
Reparo Acoplado à Transcrição
Muitas lesões bloqueiam a transcrição do mesmo
modo como bloqueiam a replicação. Portanto, as célu
las enfrentam um problema imediato, mesmo quando
não estão sintetizando DNA: elas devem ser capazes de
fazer proteínas chaves para que sobrevivam. O reparo
acoplado à transcrição direciona a resposta de repa
ro imediata para a fita molde de regiões transcritas, de
modo que lesões aí sejam reparadas mais rapidamente
do que lesões em outras regiões, para que a transcri
ção possa recomeçar; o valor disso para sobrevivência é
óbvio. O reparo acoplado à transcrição é uma forma de
reparo de excisão desencadeado por um complexo RNA
• 175
a RNA polimerase parada reconhece a lesão e recruta
TFII-H. XPB e XPD codificam proteínas que funcionam
como subunidades de TFII-H. TFII-H pode funcionar
como helicase, abrindo uma região em torno do dímero.
XPA é crítica para o reconhecimento dos dímeros de
pirimidina e interage com outras proteínas do reparo.
ERCC1-XPF é um complexo que se liga a TFII-H e que
bra no lado 5! do dímero. XPG quebra no lado 3!.
É notável que defeitos em XP-B, XP-D ou XP-G pos
sam também levar à síndrome de Cockayne, com fo
tossensibilidade, defeitos de crescimento e deficiência
mental, entre os sintomas. Defeitos em XP-B ou XP-D
também podem levar a tricotiodistrofia, com sintomas
incluindo fotossensibilidade, baixa estatura e deficiên
cia intelectual. Portanto, diferentes alterações nos mes
mos genes podem levar a síndromes diferentes, talvez
por afetarem diferencialmente as funções de reparo e
de transcrição dessas proteínas.
van Brabant, A. J., Stan, R., e Ellis, N. A. DNA helicases,
genomic instability and human genetic disease. Annu. Rev.
of Gen. and Human Genet. 1:409, 2000; a good reference
for genetic diseases in the Online Mendelian Inheritance in
Man, OMIM, em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.
fcgi?db=OMIM.
polimerase parado em uma lesão. Em células eucarióti
cas, um complexo contendo CSA e CSB (mutações nos
quais causam a síndrome Cockayne, outra doença de
deficiência no reparo do DNA) reconhece a RNA poli
merase paralisada, que ela recue para longe da lesão, e
recruta proteínas de reparo, incluindo o complexo TFII
-H. Então, muitos tipos de danos que bloqueiam a trans
crição são reparados pela via do reparo por excisão de
nucleotídeos envolvendo XPA, TFII-H e outros fatores
de reparo por excisão. Evidências recentes sugerem
que o reparo acoplado à transcrição também atue em
lesões oxidativas, que são reparadas por reparo por ex
cisão de base depois do complexo de transcrição terre
cuado da lesão. Uma vez que o reparo esteja completo, a
transcrição pode continuar.
Reparo de Pareamento Errado
Reparo de pareamento errado é uma forma espe
cializada de reparo por excisão de nucleotídeos que
remove erros de replicação. Pareamentos errados não
são como danos no DNA: não há lesão ou base modi
ficada, só a errada dentre as quatro bases. Portanto, o
reconhecimento do pareamento errado depende da dis
torção na estrutura em dupla-hélice. Uma diferença im
portante entre o reparo do DNA danificado e o reparo
176 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
de pareamento errado é a escolha de qual base remover.
Enzimas podem reconhecer especificamente bases da
nificadas e removê-las, individualmente no reparo por
excisão de base, ou como parte de um oligonucleotí
deo no reparo por excisão de nucleotídeo. Mas quando
um pareamento errado é reconhecido, ambas as bases
são normais; qual deve ser removida? No DNA recém
-replicado, excisão da base recém-sintetizada preserva
ria a informação genética, enquanto a excisão da base
da fita parental modificaria permanentemente o DNA,
produzindo uma mutação. A escolha aleatória de uma
levaria a mutações na metade das vezes, uma taxa ina
ceitavelmente alta. Portanto, o desafio é reconhecer a
fita recém-sintetizada e remover a base pareada incor
retamente nessa fita.
O reparo de pareamento errado é mais bem conheci
do em E. coli. O DNA de muitos organismos (mas não de
todos) é metilado em posições específicas. Em E. coli,
a metilação mais frequente ocorre em A numa sequên
cia GATC (Figura 4.27a), uma sequência palindrômica
(significando que a fita oposta tem a mesma sequência
quando lida de 5! para 3!); ambas as fitas são metiladas.
Essa metilação específica não afeta o pareamento de
bases. Os resíduos A são incorporados ao DNA de for
ma não modificada, e mais tarde são metilados por uma
metilase de manutenção, que reconhece sequências he
mimetiladas no DNA (sequências metiladas em apenas
uma fita, a fita parental; Figura 4.27b) e metila a base
apropriada. Durante o breve período de tempo no qual
a fita filha ainda não foi metilada, o sistema de reparo
de pareamento errado e E. coli é capaz de reconhecer a
fita recém-sintetizada na região de um pareamento er
rado e remover o nucleotídeo errado da fita nova. Pare
amentos errados são reconhecidos por um homodímero
MutS, que cria uma alça (loop) contendo o pareamento
errado (Figura 4.28). Um homodímero MutL liga-se e
coordena a clivagem e a excisão subsequentes. MutH
faz um corte na fita não metilada, recém-sintetizada,
em ambos os lados do par errado. Uma helicase (UvrD)
desenrola a fita do ponto da quebra até o local do pare
amento errado, e a fita única cortada é degradada por
uma exonuclease 5! para 3! ou por uma exonuclease 3!
para 5!, dependendo da extremidade livre. A longa falha
(centenas de nucleotídeos) que é criada é preenchida
pela ação de DNA polimerase, adicionando nucleotídeos
à extremidade 3! da fita quebrada. Quando a falha foi
preenchida, a incisão remanescente é selada pela DNA
ligase.
O homem tem um sistema similar de reparo de pa
reamento errado com proteínas homólogas, embora o
sistema seja mais complexo, e o mecanismo pelo qual
reconhece a fita nova não esteja claro. O DNA humano
é metilado na posição 5 de C em sequências CG (Fi
gura 4.27c), mas não está claro se as sequências CG
hemimetiladas, quebras transitórias de fita única dos
fragmentos de Okazaki ainda não ligados, ou ligação
de PCNA participam do reconhecimento da fita recém
-sintetizada
m
5! ---GATC---3!
3!---CTAG---m5!
(a) DNA metilado em E. coli
m
5! ---GATC---3!
3! ---CTAG---5!
(b) DNA hemimetilado em E. coli
m
5! --- CG ---5!
3!---G---m
C3!
(c) DNA metilado em células humanas
m
5! --- CG --- 3!
3! ---GC--- 5!
(d) DNA hemimetilado em células humanas
FIGURA 4.27 DNA metilado.
(a) Metilação do DNA em E. coli é em A numa sequência
GATC. (b) DNA hemimetilado de E. coli. Fita parental me
tilada, fita filha não metilada ainda. (c) Metilação em células
humanas é em C em uma sequência CG. (d) DNA humano he
mimetilado, fita filha não metilada ainda. Note que em ambos
os casos a sequência é um palíndrome que se lê igual (5! para
3!) ao longo de ambas as fitas, e os resíduos em ambas as fitas
são eventualmente metilados.
Existem vários homólogos de MutS (proteínas MSH)
e homólogos de MutL (proteínas MLH e proteínas PMS),
que funcionam como heterodímeros. MutSa, um hete
rodímero de MSH2 e MSH6, reconhece pares base-base
errados e inserções/deleções curtas; MutSβ, um hete
rodímero de MSH2 e MSH3, reconhece inserções/dele
ções curtas. MutLa, dímeros contendo MLH1 e PMS2,
são os principais complexos necessários para a etapa
de incisão. As enzimas responsáveis pela excisão da fita
quebrada até o ponto além do pareamento errado ainda
não foram identificadas. Como em E. coli, a região re
movida tem centenas de nucleotídeos de comprimento.
PCNA, a braçadeira corrediça, é requerida no reparo de
pareamento errado. Além de seu papel como fator de
processividade para a DNA polimerase, parece funcio
nar durante a etapa de excisão. A ressíntese da grande
falha requer DNA poldou pole) e PCNA. A incisão re
manescente é selada pela DNA ligase.
Reparo de pareamento errado pode levar a conver
são gênica durante recombinação por meio da remoção
de uma fita de um heteroduplex e ressíntese, usando a
outra fita como molde; também pode atuar reduzindo a
frequência de recombinação.
Defeitos no reparo de pareamento errado causam
câncer de cólon não poliposo hereditário (HNPCC)
(ver Correlação Clínica 4.11). Entre 60% e 70% dos
casos de HNPCC são devidos a mutações em MLH1 ou
MSH2, com outros casos devidos a mutações em outros
genes do reparo de pareamento errado. Alguns tipos
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 177

CORRELAÇÃO CLÍNICA 4.11

Reparo de Pareamento Errado e Câncer

Defeitos no reparo de pareamento errado causam
câncer de cólon não poliposo hereditário (HNPCC), e
provavelmente são importantes em vários outros tipos
de câncer. Isso foi inicialmente sugerido pela descoberta
de que alguns tumores de cólon apresentavam mutações
frequentes em microssatélites (polimorfismos de com
primento de sequências simples, sequências repetitivas
curtas, particularmente mono- e dinucleotídeos), um fe
nótipo chamado instabilidade de microssatélites.
HNPCC é uma doença autossômica dominante. Um
gene que contribui para o risco de HNPCC foi mapeado
numa região que contém um gene de reparo de parea
mento errado. Isso conduziu a estudos que demonstra
ram que o defeito primário é uma mutação em um dos
genes do reparo de pareamento errado. Demonstrou-se
que defeitos em outros genes do reparo de pareamento
errado também causam HNPCC; os mais comuns são
MLH1 e MSH2.
Por que a herança de um único alelo defectivo em um
gene do reparo de pareamento errado leva a HNPCC?
As células que revestem o trato intestinal dividem-se
ativamente durante toda a vida de uma pessoa. Há uma
alta probabilidade de que, em algum momento da vida,
uma mutação somática ocorra em um dos alelos de um
gene do reparo de pareamento errado, em pelo menos
uma célula do cólon. Células nas quais um dos alelos em
qualquer desses loci está inativo, ainda pode executar
reparo de pareamento errado, de modo que isso geral
mente não levaria a tumor. Contudo, em um indivíduo
que herda um alelo inativo, uma mutação somática que
inative a única cópia ativa leva a reparo de pareamento
errado defectivo. As taxas de mutação podem ser ele
vadas em 100 a 1.000 vezes em células com reparo de
pareamento errado inativado. O resultado é o acúmulo
de mutações que eventualmente levam à formação de
tumor por meio de mutações em genes de regulação do
crescimento.

(a) CH3 CH3

(b) CH CH3
3 S
L

(c) (f)
CH3 CH3 CH3 CH3
H CH H

FIGURA4.28 Reparo de pareamento

errado em E. coli.
(d) (g)
3 CH3 CH3 CH3 (a) Um par errado no DNA recém-replica
do. A fita parental está metilada, mas nos
primeiros minutos após sua síntese, a fita
nova ainda não foi metilada; tal sítio, com
apenas uma das fitas metiladas é chamado
(e) (h)
hemimetilado. (b) MutS e MutL ligam-se ao
CH3 CH3 CH3 CH3 par errado. ATP é hidrolisado enquanto elas
deslocam uma pequena alça do DNA. (c e f)
MutH liga-se a um sítio hemimetilado (que
poderia estar no lado esquerdo ou direito do
par errado). (d e g) A fita não metilada é
(i) CH3 CH3 quebrada e depois removida, estendendo-se
para além do ponto do par errado. Isso pode
ocorrer em qualquer direção (d ou g). (e e
h) A longa falha resultante é preenchida por
(j) CH3 CH3 uma DNA polimerase, adicionando nucleo
tídeos à extremidade 3! da fita (vermelha).
(i) A incisão remanescente é selada por
uma DNA ligase. (j) Os sítios hemimetilados
CH3 CH3
são metilados.
178 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

esporádicos
relacionados
funcional
mento
alguns
e endometriais,
Reparo
errado.
carcinomas
do
decom
de
sistema
pareamento
câncer,
também
supressão
cólon-retais,
de reparo
particularmente
parecem
errado
ou inativação
de
gástricos
desem-
parea-
estar C H HH H H
CC H Me-GO66Me-G
O
H NH G C CH3
O O H C H O
N H
C C N NNN NC
N T CH NC
O6Me-G C C NH OC
H C N C
CH N
NC H C N C

H N N H NC N

penha um papel paradoxal na resposta de (a) Par de base C:G (b) Par de base T:O6-metil G
células a agentes citotóxicos como agentes
metilantes (N-nitrosoureia) e cisplatina,
que são usados na quimioterapia do cân MGMT MGMT
cer. O reconhecimento do dano da alquila
ção por proteínas do reparo de pareamen
to errado pode desencadear morte celular
por apoptose; células deficientes no repa SH S
CH3
ro de pareamento errado podem escapar CH3
O N H O N H
desse processo e, assim, podem ser resis C C
C C C C
tentes a agentes quimioterápicos. Células G
N N N C N
deficientes no reparo de pareamento er
rado têm taxas aumentadas de mutações, C N C N
H N H N
e podem assim evoluir para tumores que
H H
são mais agressivos. (c) (d)

FIGURA 4.29 Desmetilação direta.

Desmetilação Direta (a) Par de bases normal G:C. (b) Par de bases T:O6-metil G. Esse par de bases
poderia permitir incorporação de um Toposto ao O6-metil G durante replicação
Além das bases normalmente metila do DNA e levar a uma mutação na geração seguinte. (c) Metilguanina metil trans
das no DNA, algumas bases são alquiladas ferase (MGMT) pode se ligar a O6-metil G. (d) MGMT transfere o grupo metil do
erroneamente, por carcinógenos ou por O6 da guanina para um grupo sulfidrila da própria proteína MGMT, deixando um
interação com os carregadores normais Gintacto no DNA. A proteína MGMT metilada é inativa, é ubiquitinada e, depois,
degradada.
de metil nas células (por exemplo, S-ade
nosilmetionina). Alquilação em posições
que afetam o pareamento de bases é muito mutagênica. 23d e e), as principais lesões produzidas por radiação
Por exemplo, O6-metilguanina pareia com T, em vez de ultravioleta. É uma reversão direta dos danos. Uma en
C (Figura 4.29a), de modo que a replicação levaria a zima especializada chamada fotoliase liga-se à lesão
uma mutação. As células têm glicosilases que reconhe (Figura 4.30). Quando absorve luz, a fotoliase catalisa a
cem bases erroneamente metiladas e desencadeiam o reversão das ligações entre pirimidinas adjacentes, dei
reparo por excisão de base, mas também têm proteínas xando o DNA exatamente como era antes da formação
especiais que reconhecem O6-metilguanina no DNA e do dímero. Essa é uma reversão direta dos danos. A fo
removem diretamente o grupo metil, deixando o DNA torreativação, embora de grande importância na maio
intacto. O6-metilguanina metiltransferase (MGMT) re ria dos organismos, não é significativa em mamíferos.
conhece O6-metilguanina e transfere o grupo metil da
guanina para uma cisteína da própria proteína (Figura
4.29b). Uma única molécula de MGMT pode remover Lesões Podem Bloquear a Replicação
apenas um grupo metil, porque metilação da cisteína
inativa a proteína e a direciona para degradação na via A precisão e a capacidade de revisão das DNA po
proteolítica da ubiquitina. O custo para a célula de re limerases geralmente impedem que elas introduzam
mover um único grupo metil por essa via é alto, porque nucleotídeos opostos a bases danificadas; requerem pa
as células devem replicar e transcrever o gene desta reamento de bases muito preciso antes de inserirem um
enzima, depois processar e traduzir o mRNA, e todas nucleotídeo e continuarem. Portanto, quando um com
essas etapas requerem considerável energia e material. plexo de replicação chega a uma lesão na fita molde, ele
Isso enfatiza quão importante é manter a integridade para. Existem três mecanismos gerais para a replicação
do genoma, mesmo a elevado custo metabólico. prosseguir: o complexo pode (a) se desmontar ou voltar
atrás para permitir o reparo da lesão e depois reassu
mir a síntese, (b) ultrapassar diretamente (bypass) a
Fotorreativação lesão, ou (c) pular a lesão e reassumir a síntese além
dela (deixando uma falha na fita filha). Todos os três
Fotorreativação é um mecanismo específico para mecanismos são usados, e todos apresentam algumas
reparo de ciclobutano dímeros de pirimidinas (Figura vantagens e alguns problemas.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 179

de de mutagênese nessas lesões é reduzida (mas não

TTAA
eliminada). Polimerase h não tem capacidade intrín
seca de revisão e incorpora um erro a cada 20 a 400
(a)
nucleotídeos sintetizados, sugerindo que sua atividade
deva ser fortemente controlada. DNA polimerase i in
corpora nucleotídeos no lado oposto de lesões que pro
T T vocam fortes distorções ou lesões como sítios abásicos,
AA que não podem funcionar normalmente como moldes.
Essas polimerases parecem funcionar juntamente com
(b) a DNA polimerase x, que não adiciona nucleotídeos no
TT lado oposto de lesões, mas pode estender as estrutu
AA ras formadas pelas outras polimerases bypass até que
a polimerase replicativa normal possa assumir. Essas
(c) polimerases bypass são enzimas distributivas, de modo
FIGURA4.30 Fotorreativação. que a região na qual pares errados podem ser introdu
(a) Fotoliase liga-se a um ciclobutano dímero de pirimidinas; zidos é tipicamente pequena, limitando a introdução de
luz não é necessária para essa etapa. (b) O complexo absorve mutações.
luz; isso resulta em clivagem das ligações que unem pirimidi
nas adjacentes. (c) A enzima então se dissocia do DNA.

(a) lesão
Síntese Bypass (Translesão)
Uma polimerase muito precisa, com revisão, não é
capaz inserir nucleotídeos opostos a bases danificadas
e, por isso, parariam a síntese (ou deixariam uma falha,
como descrito a seguir). Um processo chamado síntese
bypass ou síntese translesão pode, entretanto, permitir
que a replicação prossiga além da lesão (Figura 4.31).
Existe uma família de DNA polimerases “sujeitas a
erro” ou de “exigência reduzida” que não têm capacida (b)
de de revisão (Tabela 4.2). em virtude de sua exigência
relaxada, essas polimerases podem inserir nucleotídeos
em oposição a bases danificadas e, assim, permitir que
a replicação continue. Sua precisão reduzida aumenta a
probabilidade de um nucleotídeo errado ser incorpora
do em oposição à lesão, e em qualquer outro DNA feito
por essas polimerases. As consequências prejudiciais
disso são, evidentemente, menores do que um bloqueio FIGURA4.31 Síntese bypass (translesão).
longo (ou permanente) da replicação. (a) Danos no molde geralmente fazem parar as DNA polimera
ses replicativas, uma vez que não podem adicionar nucleotídeo
Em E. coli, DNA polimerases IV (DinB) e V (com oposto a uma lesão não codificadora ou com distorção na fita.
plexo UmuD!2C) são muito menos precisas do que as (b) DNA polimerases especializadas, com especificidade rela
DNA polimerases replicativas normais III e I. Elas têm xada (ver Tabela 4.2) podem inserir nucleotídeos opostos a le
baixa processividade, geralmente sintetizando me sões no molde, permitindo assim ultrapassar (bypass) a lesão
nos do que 10 nucleotídeos antes de se dissociarem do e sintetizar fitas filhas sem falhas. A especificidade relaxada e
DNA; isso serve para limitar a extensão de mutações a falta de revisão dessas polimerases significam que erros (mu
introduzidas. Elas são induzidas como parte da respos tações em potencial) são frequentemente introduzidos. Essas
ta SOS descrita a seguir. Isso garante que o mecanismo polimerases se dissociam facilmente do DNA, de modo que o
comprimento do DNA que sintetizam é geralmente pequeno.
de síntese sujeita a erro bypass (translesão) funcione
apenas quando houver danos suficientes no DNA para
desencadear a resposta SOS, limitando o risco de mu Reparo de Falha na Fita Filha
tações a situações nas quais a viabilidade celular esteja
seriamente ameaçada. Se a síntese de DNA for bloqueada por uma lesão,
mas recomeçar depois da lesão, fica uma falha no DNA
Eucariotos também têm polimerases sujeitas a erros (Figura 4.32). Essa situação é mais fácil de ser vista na
que podem realizar síntese bypass (translesão) (Tabe fita descontínua, onde pode ocorrer simplesmente por
la 4.2). A DNA polimerase h incorpora predominante dissociação da polimerase do sítio bloqueado e inicia
mente A em oposição a dímeros de timina introduzidos ção do fragmento de Okazaki seguinte pelo mecanismo
por radiação UV; como A e o nucleotídeo correto a ser normal de replicação. Falhas no DNA são potencial
incorporado em oposição a T do dímero, a probabilida mente letais. Uma lesão oposta a uma falha não é subs
180 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

trato para reparo por excisão, porque não há fita intacta

(a) lesão
oposta à lesão para fornecer a informação codificadora
necessária ao reparo. O reparo de falha na fita filha (an falha
teriormente chamado recombinação pós-replicação)
não remove a lesão que causou a falha, mas repara a
falha. Isso protege a célula dos danos em potencial que
falhas podem causar, e também fornece um substrato
para o reparo por excisão agir sobre a própria lesão.

Reparo de falha na fita filha ocorre por recombi

nação. DNA de fita simples, como o oposto à falha, é (b)
recombinagênico; isto é, estimula recombinação. Re
combinação entre os dois dúplices recém-formados
permite transferir um pedaço da fita parental normal
para a falha (Figura 4.32a; a fita parental de um lado
da forquilha tem a mesma polaridade da fita filha do
outro lado). Isso deixa uma falha na fita parental que
doou o pedaço (Figura 4.32b), mas, como essa fita tem
uma fita de DNA normal oposta, a falha pode ser perfei
tamente preenchida pela DNA polimerase e selada pela
(c)
DNA ligase (Figura 4.32c). O resultado é que a falha
é reparada, embora a lesão permaneça. Como mencio
nado anteriormente, nessa configuração, a lesão é um
substrato para o reparo por excisão.

Enrolamento e Reparo de Forquilhas de

Replicação
É fácil para um complexo de replicação que parou a
síntese da fita descontínua em uma lesão, reassumir a
síntese para formar o fragmento de Okazaki seguinte,
usando os mecanismos normais de síntese de DNA (ver
p. 151). O reinício da fita contínua depois de um bloqueio
é mais difícil, porque iniciações são normalmente mui
to controladas nas origens de replicação. Parece que,
nesse caso, forquilhas bloqueadas podem regressar por
pareamento (annealing) das fitas filhas, o que permite
reparo das lesões e reinício da replicação. Em E. coli,
RecA liga-se às regiões de fita única da forquilha de re
plicação bloqueada e mantém a integridade do DNA. A
forquilha de replicação pode regressar por migração de
ramificação, enquanto é protegida por RecA, permitin
do que os mecanismos de reparo NER ou BER removam
a lesão. Então, uma reversão da migração da ramifica
ção ou degradação da fita deslocada pode permitir que
a síntese recomece. Os detalhes ainda não estão claros,
incluindo se o aparelho de replicação poderia permane
cer com a fita deslocada ou se o complexo de replicação
precisaria ser reorganizado de maneira independente
da origem.
Reparo de Quebra na Dupla-Fita
Quebras na dupla-fita (DSBs) do DNA são eventos
potencialmente letais. Estimulam recombinação gené
tica, que pode levar a translocações cromossômicas, e
DSBs não reparadas levam a cromossomos quebrados
e morte celular. Quebras de dupla-fita são causadas por
muitos agentes, particularmente radiação ionizante,
FIGURA 4.32 Reparo de falha na fita filha.
(a) Falhas ficam no DNA recém-replicado onde forquilhas de
replicação param em decorrência de lesões. Como a lesão não
tem DNA intacto oposto, não é substrato para o reparo por
excisão. (b) Recombinação permite que a fita parental isopolar
(marrom escuro) preencha a falha na fita filha (marrom claro).
Isso deixa uma falha na fita parental. (c) A falha na fita paren
tal pode ser preenchida (púrpura) por uma DNA polimerase,
porque existe um molde intacto oposto. O resultado é o reparo
da falha na fita filha, mas a lesão permanece. Note que a lesão
agora pode ser reparada por reparo de excisão, porque agora
está oposta a uma fita intacta.
espécies reativas de oxigênio e agentes quimioterápi
cos que geram radicais livres oxidativos (por exemplo,
bleomicina), ou são venenos de topoisomerases. Quando
uma forquilha de replicação encontra uma quebra de fita
única, essa quebra é convertida em quebra de dupla-fita.
Células têm mecanismos, incluindo controles em pontos
de verificação, que retardam ou param a replicação em
presença de danos, para dar tempo de reparar e para mi
nimizar a probabilidade de que uma quebra de fita única
seja encontrada. Entretanto, estima-se que cerca de 10
quebras de dupla-fita sejam formadas durante um único
ciclo de replicação de células de mamíferos.
A principal via para sobrevivência celular envolve re
paro de quebra de dupla-fita por recombinação homóloga
(descrita anteriormente; Figura 4.24) ou por ligação de
extremidades não-homólogas. Em levedura, predomina
a recombinação homóloga; em células de mamíferos,
predomina a ligação de extremidades não-homólogas.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 181

Regulação do Reparo do DNA: o aumenta significativamente. Contudo, enquanto danos

no DNA estiverem presentes e a proteína RecA estiver
Regulon SOS ativada, essa proteína LexA é clivada e não pode repri
mir os muitos genes do regulon SOS. À medida que os
Em E. coli, lesão no DNA desencadeia a resposta
danos são reparados, a quantidade de RecA ativada cai
SOS, uma mudança coordenada da expressão gênica
e, consequentemente, a clivagem de LexA diminui. Os
que ajuda na recuperação dos danos. A resposta SOS é
uma indução coordenada de muitos genes cuja transcri níveis crescentes de LexA ligam-se aos operadores dos
ção é, pelo menos em parte, regulada por um repressor genes din e gradualmente desligam a resposta SOS.
comum, LexA. Um grupo de operons que são controla
dos por um repressor comum é chamado um regulon.
Entre os genes do regulon SOS estão uvrA, uvrB, uvrC,
recA e o próprio lexA. Existe um
nível baixo, constitutivo, de mui Estado normal da célula
tos desses genes do regulon SOS,
porque a repressão por LexA não
é completa e alguns desses genes
têm promotores alternativos não
reprimidos por LexA.

A resposta SOS é desenca

deada por longas extensões de
DNA simples-fita, como as de
falhas deixadas por bloqueio da RecA
LexA
replicação (Figura 4.33). Quan
do tal extensão se forma, o nível
baixo, constitutivo, da proteína
RecA pode polimerizar coopera
tivamente ao longo do DNA fita (a)
-simples, formando um filamento Lesão reparada Lesão no DNA induz
Forquilhas restabelecidas regulon SOS:
de nucleoproteína. Nesse estado, Menos DNA simples-fita DNA simples-fita acumula-se
é ativada e liga LexA, aumentan RecA dissocia RecA polimeriza sobre ele
SOS INDUZIDO
do a velocidade na qual LexA é LexA acumula-se e é ativada
e reprime operons LexA é clivada
clivada em fragmentos inativos.
Isso diminui a repressão e permi
te rápida síntese dos genes nor
malmente reprimidos por LexA.
RecA participa do reparo de falha
na fita filha e da proteção da for
quilha de replicação, como men Proteína
induzida RecA
cionado anteriormente. Os outros por danos LexA
genes induzidos por danos (genes
din) produzem proteínas que aju Proteína
dam no reparo do DNA e na re induzida
cuperação da célula, e inibem a por danos
iniciação de novas forquilhas de
replicação e divisão celular, até (b)
que o reparo tenha se completado
(Figura 4.33). FIGURA 4.33 Regulação do reparo do DNA e recuperação em E. coli: a resposta SOS.
(a) Em células não danificadas, um grupo de operons que constituem o regulon SOS é
A autorregulação de lexA regulado por um repressor comum, LexA. Esse regulon inclui o próprio gene lexA (autor
baseia-se em uma única alça de regulação) e o gene recA, juntamente com muitos genes que codificam enzimas que agem
retroalimentação que efetivamen reparando lesões. Há uma transcrição baixa, constitutiva de muitos desses genes, incluindo
te permite uma resposta rápida, lexA e recA, mesmo quando a proteína LexA está presente. (b) Lesões bloqueiam forqui
mas transitória, aos danos no lhas de replicação e, assim, deixam DNA fita-simples. RecA se liga a DNA fita-simples e é
“ativada”. Nessa forma, ajuda na clivagem de LexA. Os fragmentos clivados de LexA não
DNA. Quando a proteína LexA é
podem se ligar aos operadores, de modo que todo o conjunto de operons é induzido. Muito
clivada, entre os muitos genes do mais RecA é feita, juntamente com outras proteínas, incluindo LexA. Enquanto existirem
regulon SOS que são induzidos lesões, RecA permanecerá ativada, LexA continuará a ser clivada para que os operons per
está o próprio LexA, de modo que maneçam ligados. Quando as lesões são reparadas, RecA é “desativada” e não mais ajuda a
a quantidade de LexA produzida clivar LexA, de modo que LexA ativa se acumula e desliga os genes desse regulon.
182 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
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 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA • 183

Termos Chaves
atividade exonucleolítica
complexo de reconheci
mento da origem (ORC)
conversão gênica
DNA girase
DNA ligase
DNA polimerases
fita contínua
fita descontínua
fitas antiparalelas
forquilha de replicação
fotorreativação
fragmento de Okazaki
helicase
heteroduplex
junção Holliday recombinação homóloga replicação bidirecional
migração da ramificação recombinação não-homóloga replicação semiconservati
molde RNA hibridase (RNaseH) va
mutação com mudança na RNA polimerase resposta SOS
estrutura de leitura (fra reparo acoplado à transcri revisão (ou edição)
meshift) ção sequência de inserção
mutação de sentido errado reparo de falha na fita-filha síntese semidescontínua
(missense)
reparo de pareamento erra síntese translesão (bypass)
mutação puntual do (mismatch)
superenrolamento
mutação sem sentido (non reparo de segmento curto
telomerase
sense)
reparo do DNA topoisomerase
origem de replicação
reparo por excisão transcriptase reversa
primase
reparo por excisão de base transesterificação
quebra de dupla-fita
reparo por excisão de nu transposição
reação processiva cleotídeo

Questões CARON N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha
1. Replicação:
A. requer que uma ligação fosfodiéster do dNTP
que está entrando seja hidrolisada para que
seja adicionado à cadeia em crescimento.
B. usa atividade de polimerase 5! para 3! para
sintetizar uma fita, e atividade de polimerase
3! para 5! para sintetizar a fita complementar.
C. deve sua precisão, em parte, à atividade exo
nucleolítica 3! para 5! da DNA polimerase ou
de proteínas associadas.
D. começa com dois dNTPs sendo unidos.
E. reque apenas proteínas com atividade de DNA
polimerase.
2. Na replicação eucariótica do DNA:
A. só um replissomo se forma porque há uma úni
ca origem de replicação.
B. a separação das fitas do DNA parental para
formar a forquilha de replicação é um proces
so energeticamente neutro.
C. fragmentos de Okazaki formam-se na fita líder
em uma forquilha de replicação (bolha).
D. topoisomerases catalisam mudanças no nú
mero de ligação, facilitando o desenrolamento
das fitas parentais de DNA.
E. o papel da ligase é substituir o nucleotídeo na
falha deixada pela remoção do RNA primer.
3. Todas as afirmativas seguintes sobre a telomerase
são corretas, exceto:
A. o componente RNA age como molde para a sín
tese de um segmento de DNA.
B. adiciona telômeros às extremidades 5! das fi
tas de DNA.
C. fornece um mecanismo para replicar as extre
midades de cromossomos lineares.
D. reconhece uma fita única do DNA rica em G.
E. é uma transcriptase reversa.
4. Uma mutação por transição:
A. ocorre quando uma purina é substituída por
uma pirimidina ou vice-versa.
B. resulta da inserção de uma ou duas bases na
cadeia de DNA.
C. é frequentemente causada por compostos quí
micos (como acridina) que se intercalam no
DNA.
D. resulta da substituição de uma purina por ou
tra, ou de uma pirimidina por outra.
E. é sempre uma mutação de sentido errado
(missense).
5. Recombinação homóloga:
A. ocorre só entre dois segmentos da mesma mo
lécula de DNA.
B. exige que uma sequência específica de DNA
esteja presente.
C. exige que um dos dúplices que estão sofrendo
recombinação seja cortado em ambas as fitas.
D. envolve um intermediário quatro-fitas (junção
Holliday), que pode ser cortado de duas for
mas diferentes.
E. é catalisada por transposases.
6. Todos os seguintes são verdadeiros com relação a
transposons, exceto:
A. transposons se movem de uma localização
para outra diferente dentro de um cromos
somo.
184 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
B. contêm, mas não codificam, transposases.
C. transposons têm sequências de inserção que
são reconhecidas por transposases.
D. o transposon tanto pode ser removido e des
locado, ou pode ser replicado com o pedaço
replicado sendo deslocado.
E. podem ativar ou inativar um gene.
Questões 7 e 8: Retrovírus, como HIV que causa
AIDS, têm sua informação genética na forma de RNA.
Transcriptase reversa sintetiza uma cópia em DNA do
genoma viral. Uma droga usada no tratamento da AIDS
é AZT, um análogo da desoxitimidina que tem um gru
po azido na posição 3! do açúcar. Pode ser fosforilado
e compete com dTTP pela incorporação no transcrito
reverso. Uma vez incorporado, sua presença termina a
elongação da cadeia.
7. A cadeia em crescimento é terminada porque:
A. o análogo não pode fazer pontes de hidrogênio
com o RNA.
B. a presença do análogo AZT inibe a capacidade
de revisão da transcriptase reversa.
C. AZT não tem 3!-OH livre.
D. o análogo causa distorção da cadeia em cresci
mento, inibindo a transcriptase reversa.
E. dTTP não pode mais ser adicionado à cadeia
em crescimento.
8. Há uma janela na qual o efeito é primariamente so
bre a replicação do vírus, uma vez que AZT é muito
menos efetivo na competição com dTTP para in
corporação pelas DNA polimerases celulares, em
virtude da capacidade de revisão das DNA polime
rases. Atividade de revisão para manter a fidelida
de de síntese do DNA:
A. ocorre depois que termina a síntese.
B. é uma função da atividade exonucleásica in
trínseca 3! para 5! ou associada às DNA poli
merases.
C. requer a presença de uma enzima separada
das DNA polimerases.
D. remove bases pareadas erradas no interior da
cadeia.
E. não ocorre em procariotos.
Questões 9 e 10: Pacientes com a rara doença genética
xeroderma pigmentoso (XP) são muito sensíveis à luz e
muito susceptíveis a câncer de pele. O estudo de tais
pacientes tem ampliado nosso conhecimento sobre o re
paro do DNA porque XP é causado por reparo do DNA
defectivo – reparo por excisão de nucleotídeos. (Uma
variante, XP-V, é deficiente no reparo pós-replicação).
9. No reparo por excisão de nucleotídeo
A. remoção das bases danificadas ocorre em ape
nas uma fita do DNA.
B. só dímeros de timina gerados por luz UV po
dem ser removidos.
C. a nuclease de excisão é uma exonuclease.
D. uma única enzima multifuncional realiza o
processo de reparo.
E. só os nucleotídeos danificados são removidos.
10. Outro tipo de reparo de DNA é o reparo por excisão
de base. Reparo por excisão de base
A. é usado só para bases que foram deaminadas.
B. usa enzimas chamadas DNA glicosilases para
gerar um sítio de açúcar abásico.
C. remove cerca de 10 a 15 nucleotídeos.
D. não requer uma endonuclease.
E. reconhece uma lesão volumosa.
Questões 11 e 12: Interferir com topoisomerases é
uma forma de inibir a replicação do DNA. Certos anti
bióticos têm DNA girase como alvo (topoisomerase tipo
II) de E. coli, inibindo sua atividade catalítica. Venenos
de topoisomerases impedem a religação da ligação fos
fodiéster, deixando junções covalentes proteína-DNA.
Esses compostos são usados para tratar infecções e
como agentes quimioterápicos.
11. DNA girase:
A. subunidades ATP hidrolisam ATP para formar
novas ligações fosfodiéster.
B. remove superenrolamento negativo.
C. subunidades swivelase criam e selam incisões
transitórias em ambas as fitas.
D. aumenta o número de ligação (linking num
ber).
E. ocorre em eucariotos, bem como em procario
tos.
12. Todos os seguintes estão corretos quanto a que
bras de dupla-fita do DNA, exceto que elas:
A. podem levar a perda de informação genética.
B. estão sempre envolvidas em recombinação ho
móloga.
C. estão envolvidas em recombinação não homó
loga.
D. estão associadas com um heterodímero (Ku)
em mamíferos.
E. podem levar a mutações ou regulação inade
quada da expressão gênica.
Problemas
13. Reparo de pareamento errado remove erros de re
plicação removendo as bases incorretas. Não há
danos no DNA ou bases modificadas presentes.
Como a célula distingue a fita recém-sintetizada e
preserva a fita de DNA parental correta?
14. Na fita codificadora de DNA do gene alfa da hemo
globina normal (HbA), as três bases que corres
pondem ao códon 142 do mRNA são TAA, e a ca
deia alfa tem 141 aminoácidos. Na fita codificadora
do gene da cadeia alfa da Hemoglobina Constant
Spring, as três bases são CAA e a cadeia contém
172 aminoácidos. Explique a mutação que ocorreu.
 CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA
Respostas
1. C Pode remover um nucleotídeo terminal pareado
errado, isto é, verificação (ou edição). A: a reação é
um ataque nucleofílico do 3!-OH da cadeia de DNA
sobre a ligação fosfato a-β do dNTP – uma tran
sesterificação. B: a replicação envolve fragmentos
de Okazaki porque a síntese só ocorre na direção
5! para 3!. D: a replicação começa com a formação
de um RNA iniciador (primer). E: a replicação
requer proteínas como primase, ligase, helicase e
outras.
2. D Como mudar o número de ligação é uma tran
sesterificação, ela protege a integridade do DNA e
ocorre sem a necessidade de energia adicional. A:
existem múltiplos sítios de iniciação. B: helicases
abrindo a forquilha de replicação requerem a hi
drólise de ATP. C: a fita contínua tem a orientação
correta; é a fita retardada ou descontínua que re
quer a formação dos fragmentos de Okazaki porque
tem a extremidade 5! orientada para a forquilha. E:
a ligase simplesmente forma a ligação fosfodiéster
entre nucleotídeos adjacentes depois que a falha foi
preenchida.
3. B Telômeros ficam na extremidade 3! de cada fita,
para que as extremidades 5! possam ser replicadas.
A e C: a telomerase se posiciona na extremidade 3!
do DNA e fornece o molde para estender essa ex
tremidade. D: esta é uma característica da extre
midade 3!. E: usa um molde de RNA para sintetizar
DNA.
4. D Esta é a definição. A: isso é uma transversão. B:
isso é uma mudança na estrutura de leitura (fra
meshift); transições são mutações puntuais. C:
isso causaria uma mudança na estrutura de leitu
ra. E: poderia ser uma mutação de sentido errado
(missense) se a alteração codificasse um aminoá
cido diferente, ou uma mutação sem sentido (non
sense) se o código fosse alterado para um sinal de
término (stop).
5. D Um desses cortes é responsável pela formação
de um novo cromossomo no qual parte vem de um
dos pais, e parte do outro. A e B: pode ocorrer en
tre duas moléculas distintas de DNA, se as duas se
quências forem homólogas. C: o corte pode ser em
uma fita só. E: estas são enzimas da recombinação
sítio-específica transposicional.
6. B Transposons são DNA, não proteínas: podem co
dificar uma transposase. A: esta é a definição. C:
esta é uma das características chaves. D: ambos os
tipos de eventos são catalisados por transposases.
E: inserção no meio de um gene poderia inativá-lo;
inserção de um promotor próximo a um gene pode
ria ativá-lo.
7. C A química da formação de nucleotídeos requer
um 3!-OH livre na extremidade da cadeia para li
• 185
gação do nucleotídeo seguinte. A: a presença do
grupo azida não afeta a formação de pontes de hi
drogênio. B: a transcriptase reversa não tem pro
priedades de revisão. D: isso não acontece. E: o
análogo AZT compete com dTPP; não o elimina.
8. B Essa atividade remove uma base recém-adiciona
da se houver um pareamento errado com o molde.
A: isso é chamado reparo. C: a maioria das polime
rases é multifuncional e tem capacidade de revi
são.D: só a base errada terminal é removida. E: pol
I de E. coli tem atividade intrínseca de exonuclea
se 3! para 5!.
9. A A fita não-cortada serve de molde para o reparo.
B: isso repara vários danos envolvendo, tipicamen
te, grandes aductos ou perturbações na estrutura
do DNA. C e E: cortes são feitos a vários nucleotí
deos de distância da base danificada, em ambos os
lados, de modo que é uma endonuclease. D: vários
complexos enzimáticos estão envolvidos, incluindo
uma polimerase, ligase e helicase.
10. B Essas catalisam a primeira etapa do processo. A:
bases metiladas e quimicamente modificadas tam
bém podem ser removidas. C e E: estas são carac
terísticas de um sistema de reparo diferente. D: o
açúcar fosfato abásico deve ser removido.
11. C Isso permite o desenrolamento do DNA. A: hi
drólise de ATP desencadeia mudanças conforma
cionais. B: remove superenrolamento positivo e
introduz negativo. D: número de ligação (linking
number) é reduzido. E: DNA girase é especifica
mente de procariotos; eucariotos têm topoisome
rases diferentes que desempenham a mesma ativi
dade.
12. B Isso também pode ocorrer com cortes de fita
-única. A: isso pode ser reparado, mas junções co
valentes proteína-DNA causadas por venenos de
topoisomerases podem ser letais. C: extremidades
quebradas de um DNA duplex pode recombinar
com outro duplex. D: isso desempenha um papel
na ligação de extremidades não homólogas. E: in
tegração aleatória de um fragmento de DNA por
ligação não homóloga pode destruir genes ou des
truir promotores.
13. Em E. coli, o DNA é metilado no A de uma sequên
cia GATC. Ambas as fitas são metiladas. Metilação
ocorre depois de as bases não-metiladas terem sido
incorporadas ao DNA. Durante a síntese, o DNA fi
cará hemimetilado por um curto período de tempo.
O sistema de reparo de pareamento errado reco
nhece o estado hemimetilado e pode remover o par
errado da fita não-metilada (nova). Eucariotos têm
um sistema de reparo similar, embora os detalhes
do reconhecimento da fita nova não sejam ainda
conhecidos.
186 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
14. A fita codificadora do gene tem a mesma sequência
do mRNA (exceto que U substitui T no RNA). Na
HbA, o códon da posição 142 do mRNA é um códon
de terminação (stop), de modo que o último ami
noácido adicionado é 141. Na Hb Constant Spring,
uma mutação puntual alterou o DNA de modo que
o códon 142 do mRNA agora codifica um aminoáci
do em vez de uma parada. A tradução continua até
que um códon de terminação apareça na posição
173 (portanto, 172 aminoácidos).
PARTE II CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 187
TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

5
RNA: Transcrição IIF
IID
e Processamento PA
IIB IIA
TATA INR DPE
Pol II

IIE
IIH

do RNA
Frank J. Schmidt
Professor Titular University of Missouri

David R. Setzer
Professor Titular University of Missouri

CONTEÚDO CORRELAÇÕES CLÍNICAS

5.1 INTRODUÇÃO, 188
5.2 MECANISMOS DE TRANSCRIÇÃO, 188
5.3 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS, 193
5.4 PROCESSAMENTO DO RNA, 199
5.5 EXPORTAÇÃO DO RNA E CONTROLE DE QUA
LIDADE, 205
5.6 RNA DE INTERFERÊNCIA, 206
5.7 REPARO DO DNA ACOPLADO ATRANSCRIÇÃO,
207
5.8 NUCLEASES E TURNOVER DO RNA, 207
5.1 Antibióticos e Toxinas que Têm RNA Polimerase
Como Alvo, 191
5.2 Síndrome do XFrágil: Uma Doença da Cromatina?
195
5.3 Envolvimento de Fatores de Transcrição na Carci
nogênese, 197
5.4 Talassemia Decorrente de Defeitos na Síntese de
RNA Mensageiro, 202
5.5 Autoimunidade em Doenças do Tecido Conjuntivo,
203
5.6 Enzimas de Edição de Ácidos Nucleicos: uma
Defesa Antiviral, Bem Como um Modo de Alterar
a Expressão Gênica, 206
5.7 Envolvimento de MicroRNAs na Oncogênese, 208
5.8 Síndrome de Cockayne, 209

Conceitos Chaves
• Transcrição é a síntese de RNA cuja sequência é
complementar à de um DNA molde. A transcri
ção começa numa sequência chamada promotor e
acontece na direção de 5! para 3!.
• RNA polimerases, que iniciam a transcrição de to
dos os tipos, são relacionadas entre si por uma an
cestralidade comum.
• RNA polimerases bacterianas contêm uma subuni
dade (sigma): diferentes subunidades sigma reco
nhecem diferentes classes de promotores.
• A iniciação eucariótica opera por meio do recruta
mento da RNA polimerase e de fatores proteicos
acessórios a promotores localizados em regiões
acessíveis da cromatina.
188 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
• Os RNAs transcritos são modificados por cliva
gem, adições e modificação de bases. A maioria
dos mRNAs transcritos eucarióticos é processada
com a síntese de um cap-5! e de uma sequência
3!-poli(A), e com a remoção dos íntrons. Partículas
ribonucleoproteicas participam do processamento.
• RNAs pequenos podem inibir a expressão gênica,
permitindo regulação gênica pós-transcripcional.
5.1 INTRODUÇÃO
A síntese de uma molécula de RNA envolve copiar
uma fita de uma sequência molde usando pareamento
de bases Watson-Crick entre os nucleotídeos do molde
(geralmente DNA) e os nucleotídeos que estão sendo
incorporados ao transcrito. A iniciação da transcrição
pela RNA polimerase é talvez o evento mais importante
no controle da expressão gênica. A iniciação da trans
crição requer sequências especializadas de DNA, cha
madas promotores, que sinalizam o local onde a síntese
de RNA deve começar. O reconhecimento das sequên
cias dos promotores envolve contatos moleculares en
tre o DNA e fatores proteicos. Esses fatores ligam-se à
enzima RNA polimerase e aos nucleotídeos do DNA por
meio de pontes de hidrogênio e outros contatos. Duran
te ou depois da elongação do transcrito, reações de pro
cessamento do RNA removem, adicionam ou modificam
nucleotídeos no transcrito primário. Essas reações de
processamento podem ocorrer cotranscripcionalmente.
Em outras palavras, ocorrem em partes do transcrito,
ao mesmo tempo em que as sequências a jusante ainda
estão sendo transcritas.
5.2 MECANISMOS DE
TRANSCRIÇÃO
O Processo Inicial de Síntese de RNA
É a Transcrição
A transcrição é o processo pelo qual cadeias de RNA
são feitas a partir de moldes de DNA. As reações de
transcrição assumem a seguinte fórmula:
DNA molde + n(NTP) →
→ pppN(pN)n-1 + (n - 1)PPi + DNA molde
As enzimas que catalisam essa reação são as RNA
polimerases; é importante reconhecer que, como as
DNA polimerases, elas são absolutamente dependen
tes de molde. Ao contrário das DNA polimerases, po
rém, as RNA polimerases não requerem uma molécula
iniciadora ou primer. A reação da RNA polimerase é
deslocada para a direita por dois fatores: primeiro, o
5! a-nucleotídeo fosfato do ribonucleosídeo trifosfato
é convertido, de um anidrido fosfato em uma ligação
• Não existem mecanismos de reparo de RNA, de
modo que todas as classes de moléculas de RNA
são recicladas. Exo e endonucleases hidrolisam o
RNA até nucleotídeos, para reutilização.
Os diferentes RNAs são reciclados (turnover) em
•
diferentes velocidades e por diferentes mecanis
mos.
fosfodiéster, com uma variação de energia livre (DG!)
de aproximadamente 12,5 kJ/mol (3 kcal/mol) em con
dições padrão. Segundo, o pirofosfato liberado, PPi, é
quebrado em dois fosfatos pela pirofosfatase, de modo
que sua concentração é baixa e a formação da ligação
fosfodiéster é mais favorecida, em relação às condições
padrão (ver p. 652).
Como um DNA molde é necessário para a síntese de
RNA, a transcrição eucariótica ocorre no núcleo ou na
matriz das mitocôndrias e dos cloroplastos. Mudanças
estruturais ocorrem no DNA durante a sua transcrição.
Em cromossomos politênicos de Drosophila, os genes
transcripcionalmente ativos são vistos ao microscópio
de luz como puffs distintos da cromatina condensada,
inativa. De fato, os genes ativos existem em estruturas
de cromatina modificada que são menos compactas,
conforme revelado pela acessibilidade desses genes a
reagentes químicos e a enzimas. Em procariotos e euca
riotos, a dupla hélice do DNA é transitoriamente aberta
(desenrolada), à medida que o complexo de transcrição
caminha ao longo do DNA.
Essas aberturas e desenrolamentos são necessários
porque o DNA é uma dupla hélice, e as duas fitas do
DNA devem ser separadas uma da outra para permitir
o pareamento de bases Watson–Crick entre a fita molde
do DNA e os nucleotídeos do RNA recém-sintetizado. A
abertura local e o desenrolamento do DNA permitem
que a transcrição prossiga sem o enrolamento do RNA
produzido em torno do DNA molde. As topoisomerases
tipo I e tipo II (p. 157) estão envolvidas nessas mudan
ças de helicidade do DNA.
O processo de transcrição é geralmente dividido em
três partes: iniciação refere-se ao reconhecimento de
uma sequência específica no DNA pela RNA polimerase
e o começo do processo de formação de ligações. Elon
gação é o processo real de síntese da cadeia de RNA,
que é seguida pela terminação e liberação da cadeia.
A Informação na Sequência do DNA
Sinaliza a Síntese de RNA
Grande parte do genoma humano não é transcrita
em RNA. Mesmo em bactérias, onde quase todo o DNA
especifica produtos gênicos, nem todos os genes são ex
pressos ao mesmo tempo. As moléculas de RNA poli
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 189

merase devem, portanto, distinguir entre os genes e os interação do ativador com outros fatores ou com a RNA
não-genes no DNA, bem como entre genes que devem polimerase. Essa interação facilita a transcrição porque
ser expressos, e os que não devem. “recruta” a RNA polimerase e outros fatores para for
mar um complexo de iniciação.
A iniciação da transcrição começa com reconheci
mento de uma sequência de promotor no DNA molde.
Geralmente, os promotores localizam-se a uma peque RNA Polimerase Catalisa o Processo
na distância à montante (upstream) do nucleotídeo
onde a transcrição começa. Diferentes promotores fre
de Transcrição
quentemente contêm sequências semelhantes, permi As RNA polimerases sintetizam RNA na direção
tindo a identificação de uma sequência “consenso” do 5! → 3! usando um DNA molde. Nesse sentido, são se
promotor (Figura 5.1), a partir da qual os promotores melhante às DNA polimerases dependentes de molde
reais variam em diferentes graus. Embora promotores discutidas no Capítulo 4. Ao contrário das DNA polime
procarióticos e eucarióticos sejam diferentes entre si, rases, entretanto, as RNA polimerases iniciam a poli
sequências conservadas são encontradas em ambas as merização em sequências de promotor, sem a necessi
categorias de promotores. Algumas sequências de DNA dade de um DNA ou RNA iniciador (primer).
estimulam a transcrição, mas se localizam mais longe
do sítio de iniciação, e algumas delas podem estimular As RNA polimerases procarióticas e eucarióticas
a transcrição independentemente da distância, da loca são enzimas grandes, com múltiplas subunidades. A
lização ou da orientação, em relação ao sítio de início da RNA polimerase de Escherichia coli consiste de cin
transcrição. Tais sequências regulatórias são chamadas co subunidades, com um peso molecular do agregado
enhancers (amplificadores). Enhancers estimulam a de mais de 500.000 (Tabela 5.1). Duas subunidades a,
síntese de alguns RNAs procarióticos e da maioria, se uma subunidade b e uma subunidade b! constituem a
não de todos, os mRNAs eucarióticos. Enhancers fun enzima core, que é capaz de fazer transcrição fiel, mas
cionam por meio da ligação de fatores proteicos especí não de síntese específica de RNA (ou seja, iniciada no
ficos, chamados ativadores. Quando um ativador se liga promotor). A adição de uma quinta subunidade pro
a um enhancer, uma mudança estrutural (frequente teica, chamada s, forma a holoenzima, que é capaz de
mente uma alça ou uma dobra) no DNA molde permite a síntese específica de RNA in vitro e in vivo. Embora

s a t cTT G A C a t t t tg TAtAaT cat

100

a 80
i
c
n
ê
rr
o
c
o 60
e
d
o
re
m
ú
N 40

20

0
−50 −40 −30 −20 −10 +1 10
Posição
A 2838303735 56 42423742 39 1825 26 2 6 2 722650 2634252631 203933 33392329 16 23 19 210629 6657 1 35 23 31 20 9 45 162425 26 24 243235 26
T 41 33322534 2235354227 324247 1492 94 11 1915 37 46 36384834 352828 273951 3443 263189 3 69 15191083129 21 1622 2 4227 2320 25 2715 1629
G 16 11 291921 181321 9 19 24 26 292911 6 88 3 1117 15 21 262127 23 2427 25 22232928 433511 1 18 1714 0 3324 30 21 8 37
4 252513
5 122722
18 172024 21 16
C 2227 182920 14 20 122223 1625 1043 7 6 111860 8 25 2323 1720 34 21 24 27 222520 25 202710 2 16 1422 3 1336 30 29 49 2217 17 16 17

FIGURA5.1 Uma sequência de consenso para promotores procarióticos.

As sequências de um grande número de promotores de E. coli foram compiladas, e o número de vezes que cada
base ocorre em posições individuais no promotor foi tabulado. O histograma mostra o número de ocorrências
da base mais frequente em cada posição. Essa análise permite a definição de uma sequência consenso para
promotores de E. coli reconhecidas pela forma da RNA polimerase holoenzima contendo s70. Essa sequência
consenso é apresentada na parte superior, com as bases mais conservadas em letras maiúsculas e as bases menos
conservadas, em letras minúsculas.
Redesenhado de Hawley, D. K.e McClure, W. R. Nucleic Acids Res. 11:2237, 1983.
190 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

TABELA 5.1 Composição em Subunidades de Algumas RNA Polimerasesa

Core da RNA
Pol I de Levedura Pol II de Levedura Pol III de Levedura
Polimerase de E. coli
A190 B220 (Rpb1) C160 b
A135 B150 (Rpb2) C128 b!
AC40 B45 (Rpb3) AC40 a
AC19 B12,5 (Rpb11) AC19 w
ABC23 ABC23 (Rpb6) ABC23
ABC27 ABC27 (Rpb5) ABC27
ABC14,5 ABC14,5 (Rpb8) ABC14,5
ABC10a ABC10a (Rpb12) ABC10a
ABC10b ABC10b (Rpb10) ABC10b
A12,2 B12,6 (Rpb9) C11
A14 B32 (Rpb4) C17
A43 B16 (Rpb7) C25
A49 C37
A34,5 C53
C82
C34
C31
aAs subunidades homólogas são apresentadas na mesma linha. Note que cinco subunidades são compartilhadas entre as RNA po
limerases I, II e III de levedura, e que duas subunidades adicionais são compartilhadas entre as RNA polimerases I e III. Além disso,
a RNA polimerase I contém mais duas, e RNA polimerase III mais cinco subunidades que não têm homólogos óbvios nas outras po
limerases. É possível que A49/C37 e A34,5/C53 sejam homólogas às subunidades do TFIIF, um fator de iniciação e elongação que se
associa com a RNA polimerase II durante a tradução, mas que não é considerado parte da própria polimerase. Quatro subunidades
de cada uma das polimerases eucarióticas são homólogas às quatro diferentes subunidades do core da RNA polimerase de E. coli. As
letras A, B e C nos nomes das subunidades referem-se à ocorrência dessa subunidade nas RNA polimerase I, II e III, respectivamente,
e o número no nome da subunidade refere-se ao peso molecular da subunidade em kilodaltons. Para a RNA polimerase II, o gene que
codifica cada uma das subunidades é dado entre parêntesis.

um fator s majoritário esteja envolvido na maioria das
transcrições, fatores s específicos são expressos em
resposta a eventos em larga escala, tanto ambientais
como de desenvolvimento. Esses fatores s reconhecem
diferentes classes de genes. Assim, um fator s especí
fico reconhece promotores de genes que são induzidos
como um resultado do choque térmico. Em bactérias
que esporulam, fatores s específicos reconhecem genes
induzidos durante a esporulação. Alguns bacteriófagos
(vírus que infectam bactérias) sintetizam fatores s que
permitem a apropriação da RNA polimerase da célula
para a transcrição do DNA viral.
As RNA polimerases procarióticas comuns são inibi
das pelo antibiótico rifampicina (usado no tratamento
da tuberculose), que se liga à subunidade b (Correla
ção Clínica 5.1). As RNA polimerases eucarióticas nu
cleares podem ser diferenciadas porque são inibidas
diferencialmente por a-amanitina, que é sintetizada
pelo cogumelo venenoso Amanita phalloides. Três
classes de RNA polimerases nucleares podem ser di
ferenciadas, uma vez que concentrações muito baixas
de a-amanitina inibem a síntese de mRNA e de alguns
RNAs nucleares pequenos (snRNAs); concentrações
mais altas inibem a síntese de tRNA, 5S rRNA e outros
snRNAs. A síntese de rRNA (exceto a síntese de rRNA
5S) não é inibida, mesmo por concentrações muito al
tas da toxina. As enzimas purificadas são inibidas dife
rencialmente pela a-amanitina, de modo que é possível
concluir que a síntese de mRNA é função da RNA po
limerase II, a mais sensível das formas purificadas de
RNA polimerase. A síntese de tRNA, rRNA 5S, snRNA
U6 e outros RNAs pequenos celulares e virais é reali
zada pela RNA polimerase III. Os genes de rRNA são
transcritos pela RNA polimerase I, que fica concentrada
no nucléolo. (Os números referem-se à ordem de eluição
das enzimas de uma coluna de cromatografia). Cada en
zima tem uma estrutura muito complexa (Tabela 5.1).
Uma RNA polimerase de mitocôndrias é responsável
pela síntese das espécies mitocondriais de mRNA, tRNA
e rRNA. Essa enzima, como a RNA polimerase bacteria
na, é inibida por rifampicina (Correlação Clínica 5.1).
Etapas da Transcrição em
Procariotos
O DNA cromossômico é geralmente transcrito em
apenas uma direção. A fita de DNA que serve de molde

CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.1
Antibióticos e Toxinas que Têm RNA Polimerase Como Alvo
A RNA polimerase é uma enzima essencial para a
vida, uma vez que a transcrição é a primeira etapa da
expressão gênica. Falta de atividade de RNA polimera
se significa que nenhuma outra proteína é feita. Dois
produtos naturais ilustram esse princípio; em ambos os
casos, a inibição de RNA polimerase leva à morte do
organismo.
O cogumelo “chapéu da morte” ou “anjo destruidor”
Amanita phalloides é muito venenoso e ainda causa
várias mortes por ano, apesar dos avisos amplamente
divulgados entre coletores amadores de cogumelos (in
cidentalmente, tem reputação de ser delicioso). A toxi
na mais letal, α-amanitina, inibe a RNA polimerase II
eucariótica, inibindo assim a síntese de mRNA. O en
venenamento começa com sintomas gastrointestinais
relativamente leves, seguidos, cerca de 48 horas depois,
por insuficiência hepática grave, à medida que os mR
NAs essenciais e suas proteínas são degradados, mas
não são substituídos por novas moléculas sintetizadas.
A única terapia possível é paliativa, incluindo trans
plante de fígado.
Mais benigna (pelo menos do ponto de vista de
nossa espécie) é a ação do antibiótico rifampicina, que
inibe as RNA polimerases de várias bactérias, princi
para a síntese de RNA é complementar ao RNA trans
crito. Por convenção, a fita molde é geralmente escrita
como a fita “de baixo” de um DNA dupla-fita. A outra
fita, a fita não-molde ou “de cima”, tem a mesma direção
do transcrito quando lida na direção 5! para 3!; essa fita,
às vezes, é chamada de fita codificadora. Quando ape
nas uma sequência de DNA for dada neste livro, a fita
codificadora é representada. Sua sequência pode ser
convertida no RNA transcrito de um gene pela simples
substituição das bases U (uracil) por T (timina).
Reconhecimento do Promotor
A transcrição procariótica começa com a ligação
da RNA polimerase ao promotor de um gene (Figura
5.2). A RNA polimerase holoenzima liga-se a uma face
do DNA, estendendo-se aproximadamente 45 pb à mon
tante (upstream) e 10 pb à jusante (downstream) do
sítio de iniciação do RNA. Duas sequências curtas dessa
região são muito conservadas (Figura 5.1). Uma sequên
cia, que é localizada cerca de 10 pb à montante do ponto
de início da transcrição, é a sequência consenso (às ve
zes chamada caixa -10 ou Pribnow):
T*A*TAAT*
As posições marcadas por asteriscos são as mais
conservadas.
CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 191
palmente no tratamento de tuberculose. Mycobacte
rium tuberculosis, o agente causador, é resistente a
muitos antibióticos comumente usados, mas é sensível
à rifampicina, o produto de um estreptomiceto de solo.
Como as RNA polimerases de mamíferos diferem da
variedade procariótica, a inibição da última enzima é
possível sem grande toxicidade para o hospedeiro. Isso
implica em bom índice terapêutico para a droga, isto é,
a capacidade de tratar uma doença sem causar efeitos
indesejáveis ao paciente. Juntamente com o aprimo
ramento de medidas de saúde pública, a terapia com
rifampicina e isoniazida (um antimetabólito) diminuiu
muito a morbidade da tuberculose em países indus
trializados. Infelizmente a doença ainda é endêmica
em populações pobres dos Estados Unidos e de outros
países. Em número crescente, indivíduos imunocom
prometidos, especialmente pacientes com AIDS, têm
tuberculose ativa.
Mitchel, D. H. Amanita mushroom poisoning. Annu.
Rev. Med. 31:51, 1980; A. G. Gilman, T. W. Rall, A. S. Nies e
P. Taylor (Eds.). The Pharmacological Basis of Therapeu
tics, 8. ed., New York: Pergamon Press, 1990, p. 129; e K. M.
DeCock, B. Soro, I. M. Colibaly, S. B. Lucas. Tuberculosis and
HIV infection in sub-Saharan Africa. JAMA 268:1581, 1992.
Uma segunda sequência consenso localiza-se à mon
tante da caixa –10 ou Pribnow. Essa sequência –35
T*T*G*ACA
é centralizada cerca de 35 pb à montante do ponto de
início da transcrição; os nucleotídeos marcados com
asteriscos são os mais conservados. O espaçamento en
tre as sequências –35 e –10 é crucial, com 17 pb sendo
não têm a TTGACA
Asé,sequências
são
muito
assimétricas;
conservado.isto mesma sequência
e TATAATse
a fita complementar for lida. Portanto, a sequência do
promotor, por si só, determina que a transcrição deve
acontecer em apenas uma direção.
Que diferença essas sequências de consenso fazem
para um gene? Medidas de afinidade de ligação da RNA
polimerase e da eficiência de iniciação em várias se
quências de promotores mostram que os promotores
mais ativos são os que mais se assemelham às sequên
cias consenso. O grau de similaridade de uma sequên
cia de promotor em particular com o consenso corre
laciona-se bem com a “força” medida de um promotor,
isto é, sua capacidade de iniciar transcrição com RNA
polimerase purificada.
As bases que flanqueiam as sequências –35 e –10,
as bases próximas ao início da transcrição, e as bases
192 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
1. Formando o complexo
com promotor fechado
2. Formando
com promotor
o complexo
aberto
3. Incorporando os
poucos nucleotídeos
4. Saindo do promotor
FIGURA 5.2 Eventos precoces na transcrição procariótica.
DNA contendo o promotor é apresentado em forma de dupla
-hélice, e a RNA polimerase holoenzima de E. coli é represen
tada por dois ovais, o menor dos quais representa o fator sigma
e o maior representa o core. O RNA nascente é apresentado
dentro da bolha de transcrição, anelado com a fita molde de
DNA, e os produtos de iniciação abortiva são mostrados como
produtos liberados do complexo de iniciação. Embora esta fi
gura mostre a liberação da subunidade sigma quando a RNA
polimerase entra no modo de elongação produtiva, o destino
do fator sigma nesse estágio do processo de transcrição ainda é
um tanto controverso.
localizadas próximo da posição –16 são pouco conser
vadas. Em algumas dessas regiões pouco conservadas,
a RNA polimerase pode requerer que um nucleotídeo
específico não esteja presente ou que variações locais
na estrutura helicoidal do DNA estejam presentes. Os
promotores dos genes de choque térmico de E. coli têm
diferentes sequências consenso nas regiões –35 e –10.
Isto é consistente com o fato de serem reconhecidos por
um fator s diferente.
Um RNA transcrito geralmente começa com uma pu
rina ribosídeo trifosfato; isto é, pppG××× ou pppA×××,
mas inícios com pirimidinas também são conhecidos
(Figura 5.1). A posição de iniciação da transcrição dife
religeiramente entre vários promotores, mas geralmen
te fica cinco a oito bases à jusante do T final da caixa
Pribnow.
Iniciação da Síntese
Para que a RNA polimerase inicie a síntese de um
transcrito RNA, são necessárias duas etapas cinetica
mente diferentes (ver Figura 5.2). Na primeira etapa,
descrita aqui, a RNA polimerase holoenzima liga-se de
modo relativamente fraco ao DNA promotor, formando
um complexo fechado. Na segunda etapa, a holoenzi
ma forma um complexo aberto, ligado mais fortemen
te, caracterizado por uma abertura local de cerca de
10 pb do DNA dupla-hélice. Como a caixa Pribnow de
consenso é rica em A-T, ela pode facilitar esse desenro
lamento local; seus pares de bases são rompidos mais
facilmente durante a abertura. A abertura de 10 pb do
DNA é topologicamente equivalente ao relaxamento de
um único superenrolamento negativo. Como poderia
ser previsto a partir dessa observação, a atividade de
alguns promotores depende do estado super-helicoidal
do DNA molde. Alguns promotores são mais ativos em
DNA superenrolado, enquanto outros são mais ativos
quando a densidade de super-hélice do molde é menor.
A fita molde do DNA desenrolado faz pares de bases
com o nucleosídeo trifosfato iniciador, bem como com
o segundo nucleotídeo da cadeia de RNA; a RNA poli
merase então catalisa a formação da primeira ligação
fosfodiéster. A enzima se desloca para a posição seguin
te (essa é a etapa inibida pela rifampicina) e continua
a síntese. Depois que vários nucleotídeos tiverem sido
adicionados à cadeia nascente de RNA, a enzima entra
no modo de elongação, caracterizado por uma associa
ção muito estável com o DNA molde e não se separa até
que sejam encontrados sinais específicos, na sequência,
para término da transcrição. Alteração da associação
da subunidade sigma com a polimerase core pode es
tar associada com esse estado de elongação, muito pro
cessivo. Uma vez que a RNA polimerase tenha saído da
região do promotor, outras moléculas de RNA polime
rase podem se ligar e iniciar no promotor, de modo que
o gene possa ser transcrito por muitas polimerases ao
mesmo tempo (Figura 5.3).
Novos RNA com proteínas
Moléculas de
RNA polimerase
Extremidade terminal
do gene
Extremidade inicial
do gene Direção de síntese
FIGURA5.3 Transcrição simultânea de um gene por
muitas RNA polimerases, mostrando o comprimento
crescente das moléculas nascentes de RNA.
Cortesia de O. L. Miller, University of Virginia. Reproduzido
com permissão de O. L. Miller e B. R. Beatty, Cell Physiol.
74:225, 1969.
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA
Elongação
A RNA polimerase continua o ciclo de ligação do
nucleotídeo – formação da ligação – deslocamento, a
uma velocidade média de cerca de 40 nucleotídeos por
segundo. Entretanto, são conhecidos muitos exemplos
nos quais a RNA polimerase faz uma pausa ou desace
lera em determinadas sequências. Como discutido mais
adiante, essas pausas podem estar ligadas à terminação
da transcrição.
À medida que a RNA polimerase se move ao longo
da dupla hélice, continua a separar as duas fitas do DNA
molde. Esse processo permite que a fita molde do DNA
estabeleça pares de bases com a cadeia nascente de
RNA. Portanto, um único mecanismo de transferência
de informação (pareamento de bases Watson-Crick)
serve a vários processos: replicação do DNA, reparo do
DNA e transcrição da informação genética em RNA. O
pareamento de bases é também essencial para a tra
dução (p. 21). O processo de desenrolamento e res
tauração da dupla-hélice do DNA leva a mudanças na
densidade de super-helicidade do DNA, e o estado de
super-helicidade do DNA é controlado pela ativade das
DNA topoisomerases I e II.
Mudanças no complexo de transcrição durante a
fase de elongação podem afetar os eventos subsequen
tes de terminação. Essas mudanças dependem da liga
ção de outras proteínas celulares (proteína NusA, por
exemplo) à RNA polimerase core. A não-ligação desses
fatores proteicos pode resultar em uma frequência au
mentada de terminação e, consequentemente, em um
nível reduzido de expressão gênica.
Terminação
O complexo RNA polimerase também reconhece as
extremidades dos genes (Figura 5.4). A terminação da
transcrição pode ocorrer de dois modos, de acordo com
a característica de ser dependente ou não da proteína
fator P (rho). Terminadores são, portanto, classifica
dos em P-independentes e P-dependentes; terminadores
P-independentes são bem caracterizados (Figura 5.4).
Uma sequência tipo-consenso está envolvida: um palín
drome rico em G-C (repetição invertida) que precede
uma sequência de 6–7 resíduos U na cadeia de RNA.
Como resultado, a cadeia de RNA forma uma estrutu
ra em haste e alça imediatamente antes dos resíduos
de oligoU. Essa estrutura secundária da haste e alça é
crucial para a terminação, como demonstrado por ex
perimentos que mostram que mutações com troca de
bases que impedem o pareamento no RNA também re
duzem a terminação. As haste e alça que ficam depois
da terminação estabilizam o mRNA procariótico contra
degradação nucleolítica.
Os terminadores P-dependentes são menos defini
dos. O fator P é uma proteína hexamérica que tem uma
atividade essencial de ATPase dependente de RNA. As
• 193
sequências dos sítios de terminação P-dependentes
apresentam sequências ricas em C localizadas a algu
ma distância a montante do sítio de terminação, que
é frequentemente uma região ampla na qual a termi
nação ocorre, e não um ponto específico. Acredita-se
que o fator P se desloque ao longo da cadeia nascente
de RNA, de forma dependente de ATP, até que alcance
a RNA polimerase elongadora. Quando isso acontece, P
desestabiliza, de alguma forma, o complexo de elonga
ção, levando à separação entre o DNA molde, a cadeia
completa de RNA e a polimerase.
Ribossomos procarióticos geralmente ligam-se ao
mRNA nascente enquanto está sendo transcrito. Esse
acoplamento entre transcrição e tradução é importante
no controle gênico por atenuação (p. 326).
8
8
8
8
& *
& *
8
& $
* KDVWHULFDHP*&
* &
* &
$ 8
H[WUHPLGDGH!GRP51$
$ 8
$88 888882+
6HTXrQFLDGH8 V
QmRSDUHDGRV
FIGURA 5.4 Estrutura em haste-alça do RNA transcrito
que determina a terminação da transcrição rho
independente.
Note os dois componentes da estrutura: haste e alça ricas em G
+ C, seguida por uma sequência de resíduos U.
5.3 TRANSCRIÇÃO EM
EUCARIOTOS
A iniciação da transcrição eucariótica difere subs
tancialmente de sua contrapartida procariótica. Em
bora a definição de um promotor seja a mesma – in
formação em sequência de DNA que especifica o início
da transcrição – os eventos moleculares necessários
para a iniciação da transcrição são mais complexos.
Primeiro, a cromatina contendo a sequência do pro
motor deve se tornar acessível para a maquinaria de
transcrição. Segundo, fatores de transcrição distintos
da RNA polimerase devem se ligar a sequências do
DNA na região do promotor, para que um gene fique
ativo. Terceiro, amplificadores ou enhancers e outros
elementos de controle da transcrição que agem em cis
ligam outros fatores proteicos (ativadores) para esti
mular transcrição.
194 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
Fatores de transcrição eucarióticos ligam-se ao DNA
e recrutam a RNA polimerase para o promotor. Isso
contrasta com a ação dos fatores σ bacterianos, que não
se ligam ao DNA sem se ligar primeiro à enzima RNA
polimerase core. A RNA polimerase eucariótica consis
te de três formas enzimáticas distintas, cada uma capaz
de transcrever diferentes classes de RNAs celulares.
Diferentemente, todos os genes procarióticos são trans
critos por uma única forma de RNA polimerase core,
embora diferentes fatores σ possam estar envolvidos na
iniciação de diferentes genes.
Natureza da Cromatina Ativa
A organização estrutural dos cromossomos eucarióti
cos é discutida nos Capítulos 4 e 8. Embora a cromatina
esteja organizada em nucleossomos, independentemen
te de poder ser transcrita ou não, um gene ativo tem
geralmente uma conformação “mais frouxa” do que cro
matina transcripcionalmente inativa. Essa diferença é
mais notável em sequências de promotores, partes das
quais não estão organizadas em nucleossomos (Figura
5.5). A falta de nucleossomos é manifestada experimen
talmente pela sensibilidade aumentada das sequências
de promotores a reagentes externos que quebram o
DNA, como a enzima DNase I. Essa acessibilidade au
mentada das sequências de promotores (chamada hi
persensibilidade a DNase I) garante que fatores de
transcrição possam se ligar às sequências regulatórias
corretas.
Sítios HSS
(setas) 5!transcrito
Oviduto,maduro
Oviduto,imaturo
Eritrócitos
5 0
Distância no DNA do início da transcrição em quilobases
FIGURA 5.5 Sítios hipersensíveis à DNase (HSS) antes do
promotor do gene de lisozima de galinha, uma unidade
transcripcional eucariótica típica.
Sítios hipersensíveis, isto é, sequências próximas ao gene da
lisozima que são particularmente susceptíveis à digestão por
nucleases mesmo quando empacotadas em cromatina, são in
dicados por setas. Note que alguns sítios hipersensíveis são
encontrados no promotor da lisozima tanto em oviduto madu
ro como imaturo. Indução da síntese de lisozima em oviduto
maduro é acompanhada pelo aparecimento de um novo sítio
hipersensível. Diferentemente, nenhum sítio hipersensível
está presente em eritrócitos nucleados que nunca sintetizam
lisozima.
Adaptado de Elgin, S. C. R. J. Biol. Chem. 263:1925, 1988.
Embora as sequências transcritas de um gene pos
sam estar organizadas em nucleossomos, os nucleosso
mos são menos fortemente ligados do que em um gene
inativo. Várias modificações covalentes das histonas es
tão associadas com mudanças no estado transcripcio
nal de genes organizados em nucleossomos. Uma dessas
modificações, que está geralmente associada com ativa
ção da transcrição, é a acetilação de histonas pelas his
tona acetiltransferases, uma reação que transfere gru
pos acetil do Acetil-CoA para histonas, especialmente
nas regiões N-terminais das histonas H4 e H3. Outras
modificações de histonas que influenciam a atividade
gênica incluem metilação, fosforilação e ubiquitinação.
A metilação de histonas está frequentemente associada
com cromatina inativa, enquanto as histonas de genes
transcritos ativamente estão sujeitas a outras modifica
ções. Combinações dessas modificações, ao ocorrerem
em diferentes posições específicas em histonas, podem
constituir um “código de histonas” que acopla as modi
ficações de histonas com a compactação de cromatina,
modificação do DNA e atividade gênica (Correlação Clí
nica 5.2). Uma ideia geral é que a cromatina parcial
mente desdobrada é necessária, mas não suficiente,
para a transcrição.
Ativação da Transcrição Opera por
Recrutamento da RNA Polimerase
Fatores proteicos eucarióticos, independentemente
da sequência à qual se liguem, operam de modo fun
damentalmente diferente do fator σ de E.coli. Em vez
de primeiro fazer parte de um complexo proteico para
depois procurar a sequência relevante no DNA, os fato
res se ligam a um sítio específico (sequência) no DNA e
depois se ligam à RNA polimerase (com ou sem envol
vimento de fatores intermediários). Esse mecanismo é
chamado “recrutamento”, que é um meio pouco impor
tante na ativação de genes em procariotos, e o principal
mecanismo em eucariotos.
Enhancers
Enhancers ou amplificadores aumentam muitas
vezes a expressão de um gene. Fatores de transcrição
que se ligam a enhancers são chamados ativadores. As
proteínas ativadoras têm, pelo menos, dois domínios,
um dos quais se liga à sequência enhancer, enquanto
o outro se liga a outros fatores proteicos ou à RNA po
limerase.
O modelo mais aceito para esses efeitos é que cro
matina forma uma alça que permite que o enhancer e
o promotor fiquem próximos no espaço, embora sepa
rados por uma sequência relativamente longa de DNA.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.2
Síndrome do X Frágil: Uma Doença da Cromatina?
A síndrome do X frágil (OMIM 300624) é a forma
individual mais comum de retardo mental hereditário,
afetando 1 a cada 1.250 homens e 1 a cada 2.000 mulhe
res. Uma variedade de sintomas anatômicos e neuroló-
gicos resulta de inativação do gene FMR1, localizado no
cromossomo X, que codifica a proteína FMRP. A gené
tica da síndrome é complexa em virtude do mecanismo
molecular da mutação do X frágil.
A condição do X frágil resulta da expansão da uma se
quência trinucleotídica repetitiva CGG, encontrada na re
gião 5! não-traduzida do gene FRM1. Normalmente, essa
repetição está presente em 30 cópias, embora indivíduos
normais possam ter até 200 cópias da repetição. Em indi
víduos com a síndrome do X frágil, o gene FRM1 contém
muito mais cópias, de 200 a milhares, da repetição CGG. A
genética complexa da doença resulta do potencial da repe
tição CGG se expandir de geração em geração.
A presença de um número anormalmente elevado
de repetições CGG induz extensa metilação do DNA em
Transcrição pela RNA Polimerase II
A RNA polimerase II é responsável pela síntese de
mRNA no núcleo. Vários temas comuns emergiram de
pesquisa em um grande número de genes (Figura 5.6).
(1) As sequências do DNA que controlam a transcrição
são complexas; um único gene pode ser controlado por
dúzias de elementos de sequências de DNA, além do
promotor, que inclui o sítio no qual um complexo multi
proteico contendo a RNA polimerase se organiza. Este
complexo de pré-iniciação é composto por vários fa
tores de transcrição de nível basal, ou gerais (p. 333),
cuja função é posicionar a RNA polimerase II no sítio
correto para iniciar transcrição, ajudar a separação
das fitas de DNA no ponto de início e controlar a tran
sição da polimerase do modo iniciação para elongação.
Entretanto, sem proteínas adicionais para o controle
da transcrição interagindo com enhancers e outros
elementos de sequência de ação cis, esse processo é
geralmente pouco eficiente. Elementos de sequência
controladores funcionam em combinação para dar
um padrão de controle estreitamente ajustado. (2) O
efeito de sequências de controle sobre a transcrição é
mediado pela ligação de proteínas a cada elemento de
sequência. Esses fatores de transcrição reconhecem
a sequência de nucleotídeos do elemento de controle
apropriado. (3) Fatores de transcrição ligados intera
gem entre si e finalmente atuam para recrutar a RNA
polimerase, frequentemente agindo por meio de fato
res do complexo de pré-iniciação ou outros intermedi
ários. A ligação ao DNA e as atividades de ativação dos
CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 195
toda a região do promotor de FMR1. A produção de DNA
metilado pode estar mecanisticamente ligada às modifi
cações de histonas que estão associadas com a cromati
na transcripcionalmente inativa, e o mRNA de FMR1 não
é sintetizado quando um grande número de repetições
CGG levam a metilação do promotor de FMR1. A ausên
cia da proteína FMR1 leva à patologia da doença.
A FMR1 é uma proteína que se liga ao RNA, que
pode se ligar aos mRNAs polirribossômicos celulares.
A associação com FMRP regula negativamente a tradu
ção dos mRNAs alvos, controlando assim a expressão
gênica em dendritos. A ação de FMRP é um dos mui
tos exemplos recentes que mostram como mecanismos
pós-transcripcionais controlam a expressão gênica e o
fenótipo molecular.
Penagarikano, O., Mulle, J. G., e Warren, S. T. The patho
physiology of Fragile X syndrome. Annu. Rev. Gen. Hum.
Genet. 8:109, 2007.
fatores residem em domínios separados das proteínas.
(4) A RNA polimerase II é modificada durante a rea
ção de transcrição. A polimerase modificada recruta
outros componentes nucleares, incluindo enzimas do
processamento de RNA, durante a fase de elongação
da transcrição.
Promotores para Síntese de mRNA
Diferentemente da RNA polimerase procariótica,
que reconhece apenas uma única sequência de pro
motor, os fatores de transcrição que agem em conjun
to com a RNA polimerase II podem reconhecer várias
classes de sequências consenso à montante do ponto de
início do mRNA. A primeira e mais proeminente delas,
às vezes chamada TATA box, tem a sequência
TATA(A/T)(A/T) A
em que os nucleotídeos entre parêntesis podem ser A
ou T.
O TATA box é centralizado cerca de 25 pb à montan
te da unidade de transcrição. Experimentos nos quais
foi removido sugerem que seja necessário para a trans
crição eficiente de muitos genes, mas pode só especifi
car o ponto de início da transcrição correto, em outros.
Alguns promotores são totalmente desprovidos dele.
Outros elementos de controle promotor-proximal
são frequentemente encontrados em genes transcritos
por RNA polimerase II, mas não são universais. Uma
dessas sequências é CAAT box, com a sequência
196 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

GG(T/C) CAATCT e 18S, nessa ordem. Várias centenas de cópias de cada

Outras sequências, ilustradas na Figura 5.6, também
podem promover transcrição.
Os boxes CAAT e TATA, bem como outras sequên
cias apresentadas na Figura 5.6, não fazem contato
direto com a RNA polimerase II. Em vez disso, reque
rem a ligação de fatores de transcrição específicos para
funcionarem. Note como fatores proteicos ligam-se não
apenas às suas sequências de reconhecimento, mas
também entre si e à RNA polimerase, ela própria uma
enzima muito grande e complexa. Formas mutadas de
alguns desses fatores de transcrição são produtos de
oncogenes (Correlação Clínica 5.3).
Transcrição pela RNA Polimerase I
RNAs ribossômicos são sintetizados em um cor
po nuclear específico, o nucléolo, e os genes de rRNA
localizam-se em uma região cromossômica específica
chamada organizador nucleolar. Cada unidade trans
cripcional contém sequências para os rRNAs 28S, 5,8S
Modificação de histone/DNA
DA Remodelamento da cromatina
unidade transcripcional ocorrem uma atrás da outra
(tandemly) no cromossomo. As unidades transcrip
cionais são separadas por sequências espaçadoras. As
sequências espaçadoras incluem sequências que espe
cificam a ligação da RNA polimerase I e de fatores de
transcrição da Classe I, que promovem a atividade da
RNA polimerase I. A Figura 5.7 é um diagrama dessa
estrutura. Cada unidade repetitiva é transcrita como
uma unidade, gerando um transcrito primário que con
tém uma cópia de cada uma das sequências 28S, 5,8S
e 18S, o que garante a síntese de quantidades equimo
lares desses três RNAs. O transcrito primário é, então,
processado por ribonucleases e enzimas modificadoras
para as três espécies maduras de rRNA. A terminação
da transcrição ocorre na região do espaçador não
-transcrito antes da RNA polimerase I atingir o promo
tor da unidade repetitiva seguinte. O mecanismo de ter
minação difere dos discutidos previamente para RNA
polimerase de E. coli.
O promotor reconhecido pela RNA polimerase I
localiza-se dentro do espaçador não-transcrito, aproxi
madamente da posição –40 até +10 e
de –150 até –110. Um fator de trans
crição liga-se ao promotor e, assim,
dirige o reconhecimento da sequência
do promotor pela RNA polimerase I.
Além disso, um elemento enhancer
localiza-se cerca de 250 pb à montan
te do promotor no DNA ribossômico
humano. O tamanho do espaçador
não-transcrito varia consideravel
mente entre organismos, bem como a
posição do elemento enhancer.

A transcrição dos rRNA pode ser

muito rápida; isso reflete o fato de a
Correguladores síntese dos ribossomos ser limitante
IIF da velocidade de crescimento celular,
IID
e a demanda de rRNA pode, portanto,
Pol II
IIB IIA ser muito alta. Em outras situações,
PA IIH
TATA INR DPE IIE quando o crescimento não é tão rápi
do, apenas algumas das repetições de
Cerne do promotor (core) rDNA são transcripcionalmente ativas.
FIGURA5.6 Interação de fatores de transcrição e fatores que modificam a
cromatina com promotores eucarióticos.
Elementos de controle transcripcional que agem em cis localizados próximo do sítio Transcrição pela RNA
de início da transcrição podem incluir uma caixa TATA (TATA box), um elemento
iniciador (INR), ou um elemento promotor a jusante (DPE, downstream promoter Polimerase III
element), e são apresentados aqui interagindo com os fatores do cerne (core) reque
ridos pela RNA polimerase II para transcrição específica. Promotores tipicamente con Muitos dos temas elaborados an
têm apenas um subconjunto desses elementos, e não todos os três. Os fatores centrais teriormente para a transcrição dos
incluem TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH, além da RNA polimerase II. Pro promotores Classe I e Classe II são vá
teínas ativadoras da transcrição podem se ligar a sequências de promotor-proximais lidos para a síntese de 5S RNA, tRNAs
(PA) ou de promotor-distais (DA) e ativar a transcrição por interações com os fatores
e outros RNAs pequenos celulares e
centrais, com correguladores ou com complexos modificadores da cromatina, como virais pela RNA polimerase III. Fato
mostrado. Ligação de fatores centrais ou ativadores transcripcionais pode requerer
ou ser acompanhada de modificações na estrutura da cromatina, incluindo perda de res de transcrição ligam-se ao DNA e
nucleossomos. dirigem a ação da RNA polimerase.
Reproduzido com permissão de Hochleimer, A. e Tjian, R. Genes Dev. 17:1309, 2003. Uma característica incomum da ação

CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.3
Envolvimento de Fatores de Transcrição na Carcinogênese
A conversão de uma célula normalmente bem regu
lada em uma cancerosa requer várias etapas indepen
dentes, cujo resultado final é uma célula transformada,
capaz de crescimento descontrolado e metástase. Des
cobertas sobre esse processo vieram de estudos sobre
DNA recombinante dos genes, chamados oncogenes,
cujos produtos mutados ou superexpressos contribuem
para a carcinogênese. Os oncogenes foram identificados
pela primeira vez como constituintes dos genomas de
DNA ou RNA de vírus tumorais, mas os encontrados em
vírus tumorais de RNA são derivados dos genes presen
tes em células normais. Os análogos celulares normais,
não-mutados, dos oncogenes são chamados proto-onco
genes. Seus produtos são componentes de muitas vias
que regulam o crescimento e a diferenciação de uma
célula normal; mutação para uma forma oncogênica en
volve uma modificação que torna o produto regulatório
menos sensível ao controle normal.
Alguns produtos de proto-oncogenes estão envolvi
dos na transdução de sinais hormonais ou no reconheci
mento de fatores de crescimento, e agem no citoplasma.
Outros proto-oncogenes têm local de ação nuclear; seus
produtos gênicos estão frequentemente associados com
o aparelho de transcrição, e são sintetizados em respos
ta a estímulos de crescimento. É fácil entender como a
superprodução ou a ativação permanente de um fator de
transcrição positivo poderia ajudar a transformação de
uma célula em maligna. Os genes normalmente trans
critos em níveis baixos ou controlados seriam superex
pressos por tal mecanismo de controle perturbado.
Um efeito genético mais sutil que predispõem ao cân
cer é exemplificado pela proteína humana supressora
de tumor p53. Essa proteína é o produto de um membro
de outra classe de genes implicados na tumorigênese,
os genes supressores de tumor. Diferentemente dos on
cogenes, cujos produtos regulam positivamente o cres
cimento e a proliferação celular, o produto de um gene
supressor de tumor como p53, regula negativamente a
DNA
PrerRNA
28S rRNA 5.8S
CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 197
divisão celular. Uma única cópia do gene mutado causa
a síndrome de Li-Fraumeni, uma condição hereditária
que predispõe a carcinomas de mama e córtex adrenal,
sarcomas, leucemia e tumores de cérebro.
Mutações somáticas em p53 podem ser identificadas
em cerca de metade de todos os cânceres humanos. Mu
tações representam uma perda de função, afetando ou
a estabilidade ou a capacidade de ligar DNA da p53. A
proteína selvagem ajuda a controlar o ponto de verifica
ção (checkpoint) entre as fases G1 e S do ciclo celular,
ativa o reparo do DNA e, em outras circunstâncias, leva
à morte celular programada (apoptose). Portanto, as
ações bioquímicas da p53 servem para manter o cres
cimento celular regulado e, finalmente, eliminar as cé
lulas danificadas. Todas essas funções se contrapõem à
transformação neoplásica de uma célula.
Esses papéis variados são uma função da ação da
p53 como fator de transcrição, inibindo alguns genes
e ativando outros. Por exemplo, p53 é uma proteína
que se liga ao DNA em um sítio específico e promove a
transcrição de alguns genes, incluindo os envolvidos no
reparo do DNA.
A estrutura tridimensional da p53 foi determinada.
Mutações encontradas na p53 de tumores afetam o do
mínio de ligação ao DNA da proteína. Por exemplo, qua
se 20% de todos os resíduos mutados envolvem muta
ções em duas posições da p53. A estrutura cristalina do
complexo proteína-DNA mostra que esses dois amino
ácidos, ambos argininas, formam pontes de hidrogênio
com DNA. A arginina 248 forma pontes de hidrogênio
na fenda menor da hélice do DNA com um oxigênio de
uma timina e com um nitrogênio do anel de uma adeni
na. Mutações destroem essa rede mantida por pontes-H
e, portanto, a capacidade da p53 regular a transcrição.
Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. New York: Gar
land Science, 2007.
FIGURA 5.7 Estrutura de uma
unidade transcripcional de rRNA.
Os genes do RNA ribossômico estão dis
postos com muitas cópias, uma atrás da
outra. Cada cópia é transcrita separada
5! mente, e cada transcrito é processado
em três espécies separadas de RNA. As
18S rRNA sequências dos promotores e enhan
cers estão localizadas nas regiões não
-transcritas das sequências repetidas
uma atrás da outra.
198 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

da RNA polimerase III é a localização das sequências polimerase core bacteriana, de uma RNA holoenzima,
de ligação de fatores de transcrição; estas podem es de uma RNA polimerase II eucariótica e até de uma
tar localizadas dentro da sequência de DNA que codi RNA polimerase II engajada na elongação da transcri
fica o RNA e são frequentemente chamadas regiões de ção foram determinadas por cristalografia de raios-X.
controle internas. Em alguns casos, o DNA na região A despeito de todas as diferenças na composição em
imediatamente 5! à região transcrita do gene pode ser subunidades, no tamanho e no mecanismo, as RNA po
substituído por outras sequências com efeitos relativa limerases parecem interagir com seus DNAs moldes,
mente pequenos sobre a transcrição. Em outros casos, nucleotídeos substratos e cadeias nascentes de RNA de
entretanto, sequências à montante do ponto de início modo semelhante.
da transcrição podem desempenhar um papel impor
Chama a atenção o fato de as formas das enzimas
tante no estabelecimento de uma transcrição eficiente.
As diferenças parecem resultar da importância relativa procarióticas e eucarióticas serem muito semelhantes,
dos vários contatos DNA–proteína na estabilização do particularmente no core catalítico das enzimas. Tanto a
RNA polimerase core bacteriana como a RNA polimera
complexo de transcrição inteiro, composto por múlti
plas proteínas, além da RNA polimerase III. As relações se II de levedura tem a forma de uma pinça de carangue
dessas várias proteínas com a sequência de DNA cor jo (Figura 5.9). O DNA entra por uma extremidade da
respondente é mostrada, para um gene de rRNA 5S e molécula, e se move por uma fenda profunda da polime
para um gene de tRNA, na Figura 5.8. rase antes de fazer uma dobra de 90-graus e sair da po
limerase. O sítio catalítico, isto é, o local onde um novo
nucleotídeo é adicionado à extremidade 3! da cadeia de
RNA nascente, localiza-se na extremidade do canal. As
As Bases Enzimáticas Comuns para a duas fitas da molécula de DNA dupla-hélice são separa
das pela enzima, formando uma “bolha de transcrição”,
Ação das RNA Polimerases
e um híbrido transitório RNA-DNA, com nove pares de
Nosso entendimento sobre a base molecular de ação bases, se forma dentro da bolha. Nucleotídeos entram e
da RNA polimerases cresceu recentemente, quando as RNA sai por dois outros canais separados na molécula.
estruturas tridimensionais de um fator σ, de uma RNA A despeito das diferenças de sequências e composição
em subunidades, as RNA polimerases proca
5S rRNA rióticas e eucarióticas mantiveram estruturas
TFIIIC
TFIIIB 55K 62K semelhantes para desempenhar as mesmas
90K B 135K 95K 145K 90K tarefas, levando à síntese de uma nova ca
70K B deia de RNA. Estas incluem: (1) a passagem
TFIIIA 51K do DNA molde por um canal da enzima, (2) a
separação das fitas de DNA para formar uma
bolha na qual um híbrido RNA-DNA existe
10 20 30 40 (box
50
60
A)
70 80 90 100 110 120 130
com a extremidade 3! da cadeia de RNA posi
−50 −40 −30 Início
−20 −10 Tx −1
box C cionada no sítio ativo, (3) a colocação de nu
SUP4 tRNATyr cleotídeos no sítio ativo por um poro da enzi
TFIIIC
ma, (4) o uso de um íon metálico para ajudar
TFIIIB 62K na catálise da formação de uma nova ligação
90K B 135K 95K 90K éster fosfato entre o fosfato α do nucleosídeo
145K
70K B
55K trifosfato que está chegando e a extremidade
3! da cadeia nascente do RNA, (5) a exclusão
do RNA produzido por outro poro, e (6) o en
caminhamento para reanelamento das duas
−50 −40 −30 −20 −10 −1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Início Tx boxA box B fitas de DNA, à medida que saem da enzima.

Lembre-se que a subunidade σ da holoen

FIGURA 5.8 As sequências das fitas não-moldes de genes de levedura
zima procariótica é responsável pela ligação
que codificam o rRNA 5S e um tRNA são apresentadas, juntamente
com representações esquemáticas das várias subunidades de TFIIIA,
às caixas –10 e –35 dos promotores. Estudos
TFIIIB e TFIIIC. estruturais demonstraram que sigma é uma
As localizações aproximadas dessas subunidades em relação às sequências molécula oblonga, composta por um feixe
do DNA dos dois genes são indicadas por setas. Note que TFIIIA é necessário de resíduos em α-hélice, empacotados em
para formar um complexo de transcrição em genes de 5SrRNA, mas não em uma forma de “V” aberto. Um braço do “V”
genes de tRNA. TFIIIA é responsável por grande parte do reconhecimento contém resíduos críticos para o reconheci
sequência-específico da região de controle interna do gene de 5S rRNA, en mento do promotor e a ligação com a poli
quanto TFIIIC executa essa função para um gene de tRNA. Por outro lado, merase core. Um lado desse braço contém
TFIIIC e TFIIIB são necessários para transcrição de ambos genes de 5SrRNA uma α-hélice que se liga à sequência -10, e a
e tRNA.
Redesenhado de Braun, B. R., Bartholomew, B., Kassavetis, G. A. e Geidus outra face liga a polimerase core por intera
chek E. P. J. Mol. Biol. 228:1063, 1992. ções hidrofóbicas.
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA
(a)
(b)
FIGURA 5.9 Comparação das estruturas de RNA
polimerases eucariótica e procariótica.
As mesmas cores são usadas para representar subunidades
homólogas nas duas enzimas. Note a semelhança das formas
gerais. (a) A estrutura tridimensional de RNA polimerase II
de levedura engajada na fase de elongação da transcrição. As
várias subunidades são apresentadas em diferentes cores,
com a maior subunidade em azul, e a segunda maior subu
nidade em verde. A fita de DNA molde é amarela e o RNA
nascente é azul escuro. Nessa estrutura estão faltando duas
subunidades da RNA polimerase (produtos dos genes Rpb4
e Rpb7) e a fita não-molde do DNA não foi resolvida na de
terminação da estrutura. (b) A estrutura da RNA polimerase
core de Thermus aquaticus é apresentada abaixo. A subu
nidade b! é apresentada em verde, a subunidade b em azul,
as duas subunidades a em vermelho e a subunidade w em
violeta.
Figuras desenhadas com as coordenadas fornecidas no ban
co de dados de estrutura de proteínas (pdb), com base nas
seguintes citações: (a) Gnatt, A. L., Cramer, P., Fu, J., Bush
nell, D. A., e Kornberg, R. D. Structural basis of transcription:
An RNA polymerase II elongation complex at 3.3Å resolution.
Science 292:1876, 2001; e (b) Minakhin, L., Bhagat, S., Brun
ning, A., Campbell, E. A., et al. Bacterial RNA polymerase su
bunit omega and eukaryotic RNA polymerase subunit RPB6
are sequence, structural, and functional homologs and pro
mote RNA polymerase assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
98:892, 2001.
• 199
5.4 PROCESSAMENTO DO RNA
Cópias em RNA de sequências de DNA devem ser
modificadas para produzir moléculas maduras, funcio
nais, tanto em procariotos como eucariotos. As reações
de processamento de RNA podem incluir: remoção
de nucleotídeos extras, modificação de bases, adição
de nucleotídeos e separação de diferentes sequências
de RNA pela ação de nucleases específicas. Reações de
processamento podem ocorrer cotranscripcionalmente
(enquanto o RNA ainda está sendo transcrito) ou pós
-transcripcionalmente (depois do transcrito ter sido
liberado pela RNA polimerase). Finalmente, em euca
riotos, os RNAs são exportados do núcleo.
O RNA Transportador É Modificado
por Clivagem, Adição e Modificação
de Bases
Clivagem
O transcrito primário de um gene de tRNA contém
sequências extras de nucleotídeos, tanto na direção 5!
como na 3! da sequência do tRNA. Esses transcritos
primários também podem conter íntrons na região do
anticódon. As reações de processamento pós-transcrip
cional ocorrem em uma ordem temporal bem definida,
mas não necessariamente rígida. Primeiro, o transcrito
primário é cortado de modo relativamente inespecífico
para gerar uma molécula precursora com extensões 5!
e 3! mais curtas. Então a ribonuclease P, uma ribozima
(p. 71), remove a extensão 5! por clivagem endonucleo
lítica. A extremidade 3! é cortada exonucleoliticamen
te, seguida pela síntese da terminação CCA. A sínte
se dos nucleotídeos modificados ocorre em qualquer
ordem em relação à clivagem nucleolítica. A remoção
de íntrons é determinada pela estrutura secundária do
precursor (Figura 5.10), e é executada por um sistema
enzimático solúvel, com dois componentes; uma enzi
ma remove o íntron e a outra sela novamente a cadeia
nucleotídica.
Adição na Extremidade 3!
Todo tRNA funcional tem a sequência CCA em sua
extremidade 3!. Essa sequência é essencial para que
o tRNA aceite aminoácidos. Na maioria dos casos, é
adicionada sequencialmente pela enzima tRNA nucle
otidiltransferase. Nucleotidiltransferases usam ATP
e CTP como substratos e sempre incorporam-nos em
tRNA numa razão de 2C/1A. As extremidades CCA são
encontradas tanto em tRNAs citoplasmáticos como mi
tocondriais.
Nucleosídeos Modificados
Os nucleotídeos de RNAs transportadores são os
mais modificados de todos os ácidos nucleicos. Mais de
200 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Ìntron mais de uma espécie de tRNA; entretanto,

DNA Transcrição
as enzimas modificadoras são localização
-específicas. A maioria das modificações se
completa antes dos precursores de tRNA
Endonuclease Exonuclease terem sido clivados até o tamanho do tRNA
Transcrito
primário 5! P P P OH 3! maduro.
RNase P

O Processamento do RNA
Ribossômico Libera Vários
RNAs de um Precursor Mais
Longo
Ìntron
O produto primário da transcrição do
gene de rRNA é um RNA longo, chamado
Adição da modificação 45S RNA, que contém as sequências dos
tRNA maduro CCAOH à extremidade 3!
rRNAs 28S, 5,8S e 18S. O processamento
H do 45S RNA ocorre no nucléolo, e é feito
O por grandes estruturas de ribonucleopro
A 3! teínas, com múltiplas subunidades. O pro
C
P C cessamento dos rRNAs segue uma ordem
5! sequencial (Figura 5.11). O processamento
dos pré-rRNAs em procariotos também en
volve clivagem de precursores de alto peso
molecular em moléculas menores. Em um
estágio inicial do processamento em eu
cariotos, algumas bases do 35S rRNA são
modificadas por metilação nos nitrogênios
do anel das bases e por formação de pseu
douridina. Essas reações são especificadas
por partículas de ribonucleoproteínas nu
Remoção do íntron cleolares pequenas (snoRNPs) no nuclé
(endonuclease e ligase) olo. Cada snoRNP contém um RNA guia,
H que estabelece pares de bases com o rRNA
O
transcrito no local da modificação, especifi
A 3!
C
cando onde uma metilação ou formação de
P C pseudouridina deve acontecer. Um meca
5! nismo semelhante opera para modificação
de alguns outros RNAs pequenos.

O Processamento do RNA
Mensageiro Garante a
FIGURA5.10 Esquema de processamento de um tRNA eucariótico.
Sequência Codificadora
O transcrito primário é clivado pela RNase P e por uma 3!-exonuclease, e a ter Correta
minação CCA é sintetizada por tRNA nucleotidiltransferase antes do íntron ser
removido, se necessário. A maioria dos mRNAs eucarióticos tem
características estruturais específicas, adi
60 modificações diferentes nas bases e na ribose, exi cionadas no núcleo por sistemas enzimáticos diferen
gindo bem mais de 100 diferentes reações enzimáticas, tes da RNA polimerase. Essas características incluem
foram encontradas em tRNA. Muitas são simples, meti a cauda de poli(A) da extremidade 3!, nucleotídeos in
lações de uma etapa, mas outras envolvem síntese com ternos metilados e o cap da extremidade 5!. Os mRNAs
múltiplas etapas. A formação de algumas bases modi maduros são mais curtos do que seus transcritos pri
ficadas, na realidade, requer a quebra da ligação b-gli mários. Sequências não-codificadoras presentes nos
cosídica entre a ribose e a base. Enzimas modificado pré-mRNAs, mas ausentes nos mRNAs maduros, são
ras produzem as mesmas modificações específicas em chamadas sequências intervenientes ou íntrons. As se
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 201

Eucariotos DNA do gene ribossômico

RNA Polimerase II Recruta
t i Enzimas de Processamento
Transcrição e metilação
PréRNA 35S
durante a Transcrição em
3! 5! Eucariotos
28S 5.8S 18S
Clivagem A subunidade maior da RNA polimerase II con
PrérRNA 41S tém um domínio C-terminal (CTD) que funciona
no acoplamento entre a transcrição e o processa
Clivagem PrérRNA 20S mento. Quando a RNA polimerase II está no modo
PrérRNA 32S de iniciação, o CTD não está modificado. Quan
do o transcrito tem cerca de 25 nucleotídeos de
comprimento, o CTD é extensamente fosforilado.
28SrRNA Clivagem 18S rRNA CTD fosforilado recruta aenzima de capping e os
Capping de splicing e depoliadenilação.
complexos

5.8S rRNA
À medida que o complexo de transcrição se
Procariotos DNA do gene ribossômico move ao longo do DNA, o complexo enzimático
de capping modifica a extremidade 5! do mRNA
t Clivagem com transcrição i nascente. Capping envolve a síntese de uma liga
ção 5!–5! trifosfato com adição de um resíduo G.
PrérRNA 23S 3! PrérRNA 16S Essa estrutura é ainda modificada por metilação.
Clivagem
Remoção de Íntrons de mRNA
23S rRNA 16S rRNA Precursores
FIGURA5.11 Esquemas para transcrição e processamento de À medida que o pré-mRNA sai do complexo
rRNAs. RNA polimerase, ligam-se rapidamente ribo
Redesenhado de Perry, R. Annu. Rev. Biochem. 45:611, 1976. nucleoproteínas nucleares pequenas, snRNPs

quências mantidas são chamadas éxons. O padrão geral Pausa inicial Elongação Terminação
de processamento de mRNA é apresentado na Figura
5.12. Os mRNAs processados de modo incompleto cons Adição do cap 5! Splicing do mRNA Processamento 3!
tituem uma parte importante do RNA heterogêneo nu
clear (HnRNA).

O processamento do pré-mRNA eucariótico envol

ve várias reações moleculares, sendo que todas devem
RNAPII
ser executadas com fidelidade exata. Isso fica mais cla 5!
ro na remoção de íntrons de um mRNA transcrito. Um
Enzimas
capping de Complexo de
nucleotídeo extra na sequência codificadora do mRNA CTD 5!
Spliceossomo
Poliadenilação 3!
maduro causaria um deslocamento na estrutura da lei exo (A)n
5!
tura da mensagem, e a proteína resultante seria, quase RNA Nascente

que com certeza, não-funcional. Na realidade, muta mRNA

ções que interferem com a remoção de íntrons são uma
causa importante de doenças genéticas humanas, por
exemplo, em alguns casos de b-talassemia (Correlação
Clínica 5.4). O desafio para as células fica ainda maior
pelo fato de alguns importantes genes humanos serem
compostos, em mais de 90% de suas sequências, por ín
trons. As complexas reações para remover os íntrons
são realizadas por sistemas enzimáticos de ribonucleo
proteínas multicomponentes no núcleo; depois que es
sas reações se completaram, o mRNA é exportado para
o citoplasma onde interage com os ribossomos para
iniciar a tradução. A maior parte do processamento é
cotranscripcional.
Exportação
FIGURA5.12 O processamento do RNA ocorre durante a
elongação na transcrição.
A fosforilação do domínio C-terminal da RNA polimerase II (RNAP
II) leva a transcrição para a fase de elongação e resulta no recru
tamento de fatores de processamento. À medida que o precursor
de mRNA parcialmente completo (nascente) emerge do comple
xo de transcrição, o spliceossomo remove os íntrons. Quando o
sinal de poliadenilação é encontrado, o complexo de poliadenila
ção cliva o mRNA nascente e adiciona a cauda de poli(A), (A)n.
O RNA nascente remanescente é degradado por 5! exonucleases,
enquanto o mRNA processado é exportado para tradução.
Adaptado com permissão de Pandit, S., Wang, D., and Fu, X.-D.
Curr. Opinion Cell Biol. 20:260, 2008.
202 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.4
Talassemia Decorrente de Defeitos na Síntese de RNA Mensageiro
As talassemias são defeitos genéticos na síntese co
ordenada das cadeias peptídicas a- e b-globinas; uma
deficiência de cadeias de b-globina é chamada b-talas
semia, enquanto uma deficiência de cadeias de a-globi
na é chamada a-talassemia. Pacientes acometidos de
b-talassemia apresenta-se com anemia por volta dos 6
meses de idade, quando cessa a síntese de HbF e a sín
tese de HbA predomina. A gravidade dos sintomas leva
à classificação da doença em talassemia maior, onde
ocorre uma deficiência severa na síntese de globina, e
talassemia menor, que representa um desequilíbrio me
nos grave. Ocasionalmente, uma forma intermediária é
identificada. A terapia da talassemia maior envolve fre
quentes transfusões de sangue, levando a um risco de
complicações advindas de sobrecarga de ferro. A menos
que terapia de quelação seja bem-sucedida, a deposi
ção de ferro em tecidos periféricos, chamada hemos
siderose, pode levar à morte antes da idade adulta. Os
portadores da doença são , em geral, assintomáticos ou
quase. Etnograficamente, a doença é comum em pessoas
descendentes da região do Mediterrâneo, de árabes e
do leste asiático. Como na anemia falciforme (HbS) e na
deficiência de glicose 6-fosfato desidrogenase, a anoma
lia dos eritrócitos dos portadores confere alguma pro
teção contra malária. Os mapas das regiões onde uma
ou outra dessas doenças são frequentes na população
nativa coincidem com as áreas do mundo onde a malá
ria é endêmica.
(“snurps”), que executam o splicing do RNA em duas
etapas: quebra do íntron no sítio doador 5! e união das
sequências de éxons a montante e a jusante (upstre
am e downstream). Quase todos os íntrons começam
com uma sequência GU e terminam com AG; essas se
quências são chamadas junções íntron-éxon doadora e
aceptora, respectivamente. Entretanto, nem todas as
sequências GU ou AG são removidas do RNA. Como a
célula sabe quais sequências GU estão em íntrons (e
portanto devem ser
removidas) e quais es
no mRNA
tão destinadas
manecerem a per- U1
maduro? Essa discri
minação é feita por
formação
bases entre
deU1
pares
RNAde
e RNA UCC AU A CAUA
a sequência do mRNA 5! A GGUAUGU
precursor próxima à Éxon 1 Doador 5! para junção
sequência doadora GU
(Figura 5.13; Correla
ção Clínica 5.5). Outra FIGURA5.13 Mecanismo de reconhecimento da junção de splice.
O reconhecimento da junção de splice 5! envolve o pareamento de bases entre a junção íntron-éxon e
snRNP, contendo U2
o U1 RNA snRNP. Esse pareamento de bases tem como alvo o íntron a ser removido.
RNA, reconhece sequ- Adaptado de Sharp, P. A. J.Am. Med. Assoc. 260:3035, 1988.
A forma mais comum de a-talassemia deve-se a
uma deleção genética, que presumivelmente resulta
de crossing over desigual entre alelos adjacentes, du
plicados, de a-globina. Diferentemente, a b-talassemia
pode resultar de uma grande variedade de mutações.
Eventos conhecidos incluem mutações que levam a
mudança na estrutura de leitura (frameshift) na se
quência codificadora da b-globina, bem como muta
ções que levam a terminação prematura na síntese do
polipeptídeo. Muitas b-talassemias resultam de muta
ções que afetam a biossíntese do mRNA de b-globina.
São conhecidos defeitos genéticos que afetam o pro
motor do gene, levando a transcrição ineficiente. Ou
tras mutações resultam em processamento aberrante
do transcrito nascente, ou durante a remoção de seus
dois íntrons do pré-mRNA, ou durante a poliadenila
ção do mRNA precursor. Exemplos em que o defeito
molecular ilustra um princípio geral da síntese de
mRNA são discutidos no texto.
Orkin, S. H. Disorders of hemoglobin synthesis: The
thalassemias. Em: G. Stamatoyannopoulis, A. W. Nienhuis,
P. Leder e P. W. Majerus (Eds.). The Molecular Basis of
Blood Diseases. Philadelphia: Saunders, 1987; e Weathe
rall, D. J., Clegg, J. B., Higgs, D. R. e Wood, W. G. The hemo
globinopathies. Em: Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W.
S. e Valle, D. (Eds.). The Metabolic and Molecular Bases
of Inherited Disease, 7. ed., New York: McGraw-Hill, 1995.
ências importantes na extremidade 3! aceptora do ín
tron. Também outras espécies de snRNP, entre elas U5
e U6, ligam-se então ao RNA precursor, formando um
grande complexo chamado spliceossomo (por analogia
com a grande construção ribonucleoproteica envolvida
na síntese de proteínas, o ribossomo). O spliceossomo
usa ATP para fazer a remoção precisa do íntron. Primei
ro, a ligação fosfodiéster entre o éxon e a sequência GU
doadora é quebrada, deixando um grupo 3!-OH livre na
Spliceossomo
U2
P PP G3m PPP G3m
AUGAUGU
U ACU AUA AG 3!
A
Íntron Éxon 2
Formação do laço Aceptor 3! para junção
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 203

CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.5

Autoimunidade em Doenças do Tecido Conjuntivo

Anticorpos humorais em soros de pacientes com
várias doenças do tecido conjuntivo reconhecem uma
variedade de complexos ribonucleoproteicos. Pacientes
com lupus eritematoso sistêmico apresentam uma ativi
dade de anticorpos no soro denominada Sm, e pacien
tes com doença mista do tecido conjuntivo exibem um
anticorpo denominado RNP. Cada anticorpo reconhece
um sítio distinto no mesmo complexo de RNA-proteína
(U1-RNP), que está envolvido no processamento de
mRNAs em células de mamíferos. O complexo U1-RNP
contém U1 RNA, uma sequência de 165 nucleotídeos
muito conservada em eucariotos, que em sua extremi
dade 5! inclui uma sequência complementar a junções
íntron–éxon. Adição desse anticorpo a ensaios de spli
cing in vitro inibe o splicing, presumivelmente pela
remoção do U1 RNP da reação. Soros de pacientes com
outras doenças do tecido conjuntivo reconhecem dife
rentes antígenos nucleares, proteínas nucleolares e/ou
centrômero de cromossomos. Demonstrou-se que soros
de pacientes com miosite reconhecem antígenos cito
plasmáticos como aminoacil-tRNA sintetases. Embora
tenha sido relatada a entrada de anticorpos humorais
na célula via receptores de Fc, não há evidência de que
isso seja parte do mecanismo de doenças autoimunes.

extremidade do primeiro éxon e um 5! 3!

5!-fosfato no G doador do íntron. Esse L1 L2
pG é, então, usado para formar uma C
G
ligação incomum com o grupo 2!-OH P
P
de uma adenosina dentro do íntron, G
G
gerando uma estrutura ramificada,
ou laço, no RNA, como mostra a Figu Etapa A OH 2!
ra 5.14. Depois que o laço é formado,
ApU
a segunda etapa do splicing ocorre.
A ligação fosfodiéster imediatamente 1
seguinte a AG é clivada, e as duas se
5! L1 L2 3!
quências éxons são unidas.

Poliadenilação GOH C
P
A RNA polimerase continua trans
G
crevendo o gene até que uma sequên Etapa B
cia sinal de poliadenilação seja atingi
G
da (Figura 5.15). Essa sequência, que ,5!
2! P
tem o consenso AAUAAA, aparece no IVS(A)
3!,5!
ApU G ApU P
mRNA maduro, mas não faz parte de 3!,5!
sua região codificadora. Em vez dis 2
so, sinaliza clivagem do precursor de
mRNA nascente, cerca de 20 nucleotí Etapa C
deos mais adiante. A sequência poli(A) ,5! G
2! P
é, então, adicionada por uma polimera OH 3! 5! G C 3!
se especializada à extremidade 3! pro
L12
duzida por essa clivagem. O domínio C
-terminal da RNA polimerase II recruta
FIGURA5.14 Esquema proposto para splicing de mRNA incluindo a estrutura
o complexo de clivagem e poliadenila
em laço.
ção para o transcrito. A terminação da
Um RNA mensageiro é representado com dois éxons (em azul) e um íntron interve
transcrição pela RNA polimerase que niente (em laranja). Um grupo 2!-OH da sequência do íntron reage com o 5!-fosfato
está elongando ocorre mais a jusante do nucleotídeo 5!-terminal do íntron, produzindo uma ligação 2!–5! e a estrutura em
e é acoplada à clivagem e reação de laço. Simultaneamente, a ligação fosfodiéster éxon 1-íntron é quebrada, deixando uma
poliadenilação, embora o mecanismo extremidade 3!-OH nesse éxon livre para reagir com 5!-fosfato do éxon 2, deslocando
detalhado não esteja claro. O resulta o íntron e criando o mRNA spliced. O laço do íntron liberado é subsequentemente
do final do processamento é um mRNA digerido por nucleases celulares.
codificador completamente funcional,
com todos os íntrons removidos e pron
to para dirigir a síntese proteica.
204 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
P PP Sequência sinal
de poliadenilação
AA
5! UA
AA
G
U
G
U Mutante
G
3!
Clivagem e poliadenilação
P
P AAUAAA
P
5!
mRNA precursor que inclui íntrons
FIGURA5.15 Clivagem e poliadenilação de precursores de mRNA
eucarióticos.
A extremidade 3! de espécies de mRNA eucariótico é derivada por pro
cessamento. A sequência AAUAAA em mRNA especifica clivagem do
precursor de mRNA. A extremidade 3!-OH livre do mRNA é um primer
para síntese de poli(A).
Adaptado de Proudfoot, N. J. Trends Biochem. Sci. 14:105, 1989.
Mutações em Sinais de Splicing
Causam Doenças no Homem
O splicing do RNA mensageiro é um processo in
trincado, dependente de muitos eventos moleculares.
Se esses eventos não forem realizados com precisão,
o mRNA funcional não é produzido. Isso é ilustrado
pelas talassemias humanas, que afetam a síntese equi
librada de cadeias de a- e b-globinas (ver Correlação
Clínica 5.4, p. 202). Algumas mutações que levam à
b-talassemia interferem com o splicing dos mRNAs
precursores da b-globina. Por exemplo, sabemos que
todas as sequências de íntrons começam com o dinu
cleotídeo GU. Uma mutação no G dessa sequência para
um A significa que a maquinaria de splicing não mais
reconhecerá esse dinucleotídeo como um sítio doador.
O splicing vai “pular” a junção correta éxon–íntron.
Isso poderia levar ao aparecimento de sequências ex
tras no mRNA da b-globina, que seriam normalmente
removidas ou, alternativamente, sequências poderiam
ser deletadas do mRNA produzido (Figura 5.16). Em
qualquer caso, a b-globina funcional será sintetizada
em quantidades reduzidas, resultando na anemia ca
racterística da doença.
Padrão de splicing
Normal
FIGURA5.16Troca de nucleotídeo na junção íntron
éxon do gene de ß-globina humana, que leva a
splicing aberrante e ß-talassemia.
Essa figura mostra o padrão de splicing de um transcri
to mutado contendo uma mudança de G-U para A-U nos
primeiros dois nucleotídeos do primeiro íntron. A perda
poly(A) dessa sequência invariável significa que a junção de splice
correta não pode ser usada; portanto, sequências trans
critas que fazem pares de bases com U1 snRNA menos
perfeitas do que a sequência da junção correta são usados
como doadores de splice. As linhas diagonais indicam as
porções unidas no transcrito mutante. Note que algumas
moléculas precursoras do mRNA mutante são spliced de
modo que porções do primeiro íntron (denotado como
caixas brancas) aparecem no produto processado. Em
outros casos, o doador da junção fica dentro do primeiro
éxon e porções do primeiro éxon são deletadas. Em ne
nhum caso o mRNA da globina tipo-selvagem é produzido.
Adaptado de Orkin, S. H. Em Stamatoyannopoulis, G., et
al. (Eds.), The Molecular Basis of Blood Diseases. Phila
delphia: Saunders, 1987.
Splicing Alternativo do Pré-mRNA
Pode Levar à Síntese de Múltiplas
Isoformas da Proteína a partir de
uma Única Sequência Codificadora
no DNA
A existência de sequências de íntrons é paradoxal.
Íntrons devem ser removidos com precisão, de modo
que o mRNA possa codificar uma proteína, com exati
dão. Como descrito na Correlação Clínica 5.4, a muta
ção de uma única base pode interferir drasticamente
com o splicing e causar uma doença grave. Além dis
so, a presença de íntrons em um gene significa que sua
sequência completa é muito maior do que a necessária
para codificar seu produto proteico. Um gene grande
é alvo para mais eventos mutagênicos do que um gene
pequeno. Na realidade, doenças genéticas humanas co
muns, como a distrofia muscular de Duchenne, ocorrem
em genes compostos por milhões de pares de bases de
informação no DNA. Por que a natureza não removeu
completamente os íntrons durante a longa escala de
tempo da evolução eucariótica? A resposta parece estar
na capacidade de processamento diferencial para gerar
múltiplas proteínas a partir de um único transcrito.
As proteínas tropomiosinas são componentes essen
ciais do aparelho contrátil nos três tipos de músculos
(p. 993), e cada um contém uma tropomiosina especí
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 205

fica. Essa diversidade surge a partir de um único gene,
que é transcrito em um transcrito primário. O transcri
to é, então, processado como esquematizado na Figura
5.17. Cada tipo de célula processa o transcrito primário
de tropomiosina de modo característico. As espécies de
mRNA resultantes são traduzidas, gerando as tropo
miosinas características de cada tipo celular. Esse é um
tema recorrente na expressão gênica eucariótica. Exis
tem apenas 20.000-25.000 genes que codificam proteína
no genoma humano; entretanto, aproximadamente dois
terços deles dão origem a transcritos spliced diferen
cialmente. Transcritos spliced diferencialmente são
traduzidos em produtos proteicos que têm diferentes
localizações, interações moleculares ou propriedades
enzimáticas. Portanto, a existência de íntrons fornece
ao organismo um método poderoso para gerar diversi
dade de proteínas. A escolha de um padrão de splicing
específico é frequentemente regulada por fatores pro
teicos que se ligam a sequências dentro de um éxon. Es
sas proteínas podem aumentar ou reprimir o splicing
de junções íntron–éxon adjacentes.
ORGANIZAÇÃO DOS ÉXONS DO GENE DA αTM
!87 
DT 60 675 
  
   
5.5 EXPORTAÇÃO DO RNA E
CONTROLE DE QUALIDADE
Os RNAs mensageiro, transportador e ribossômico
funcionam no citoplasma. O movimento para fora do
núcleo ocorre através do poro nuclear. O complexo do
poro nuclear é um cilindro que atravessa a membrana.
Dentro do cilindro ficam dois anéis empilhados e uma
rolha central (“plug”). Íons pequenos podem passar
através do poro entre o plug e os anéis, mas RNAs são
grandes demais para passarem por esse espaço. A ex
portação de RNA ocorre por um canal dentro do plug;
esse é um processo que requer que os RNAs estejam li
gados a proteínas para formar partículas de ribonucleo
proteínas. O movimento dos RNAs ribossômicos ocorre
após a montagem dos ribossomos no nucléolo. Os RNAs
transportadores podem ser ligados a aminoacil-tRNAs
sintetases, uma vez que podem ser aminoacilados no
núcleo antes da exportação. Os RNAs mensageiros são
exportados em complexos que contêm uma proteína
de ligação ao cap na extremidade
5! e proteínas de ligação ao RNA
ao longo do resto da sequência. O
675 processo requer energia metabólica
   675  na forma de GTP, sequências sinais
    !87  ! 87
específicas na proteína e uma pro
teína-G GTPase.

αTM mRNA Transcritos O splicing e a exportação do

RNA garantem o controle de qua
lidade da integridade do mRNA.
P~VFXOR O códon de terminação da cadeia
HVWULDGR
(um dos três códons sem sentido ou
nonsense, UAA, UAG ou UGA) de
um mRNA está geralmente locali
P~VFXOR
OLVR zado no último éxon. Se um mRNA
contiver um códon sem sentido a
montante, a proteína codificada
P~VFXOR seria mais curta do que a proteína
HVWULDGR normal (Correlação Clínica 5.6).
Essa proteína mais curta seria, mui
to provavelmente, não-funcional e
0LREOiVWR poderia interferir com a função ce
lular. A via de decaimento mediado
por nonsense evita a exportação e
1mRPXVFXODU a tradução de um mRNA cujo códon
ILEUREODVWR de terminação da cadeia esteja à
montante do último éxon. Algumas
poucas proteínas do spliceossomo
+HSDWRPD permanecem no mRNA spliced, na
junção de dois éxons. Um códon
nonsense em um éxon a montan
te é seguido por essas proteínas
&pUHEUR
de junção; esses mRNAs são alvos
FIGURA5.17 O splicing alternativo de transcritos do gene de tropomiosina para o decaimento mediado por
resulta em uma família de proteínas tropomiosinas tecido-específicas. nonsense. O reconhecimento do
Redesenhado de Breitbart, R.cE., Andreadis, A. e Nadal-Ginard, B. Annu. Rev. Bio códon nonsense a montante deve
chem. 56:467, 1986. envolver a tradução. Aparentemen
206 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.6
Enzimas de Edição de Ácidos Nucleicos: Uma Defesa Antiviral, Bem Como um Modo de Alterar a Expres
são Gênica
A apolipoproteína B, um ator chave no metabo
lismo de colesterol, existe em duas formas: uma de
Mr = 48.000, que é produzida no intestino, e uma segun
da com Mr = 100.000, que é sintetizada no fígado. Os
dois RNAs são transcritos de um único gene, e a forma
intestinal resulta de um evento de edição. Uma enzima
intestinal citidina deaminase, chamada enzima de edi
ção do mRNA da Apolipoproteína B, polipeptideo cata
lítico 1 (APOBEC1) converte um C específico do mRNA
da ApoB em U, transformando um códon CAA (Glc) em
um códon UAA (stop). As enzimas APOBEC formam
uma família, e diferentes isoformas são expressas em
tipos celulares diferentes.
Por que um mecanismo tão incomum, quando um
resultado semelhante poderia ser obtido por splicing
diferencial de um transcrito único ou de um gene du
plicado? Uma resposta pode estar nas propriedades da
família de enzimas APOBEC. Células T primária e ma
crófagos são relativamente resistentes à infecção por
HIV. Lembre-se que o HIV tem um genoma de RNA, que
deve ser transcrito reversamente em cDNA (p. 267).
Uma isoforma da família APOBEC codificada pelo hos
pedeiro, APOBEC3G, é carregada pela partícula viram
te, o primeiro ribossomo que vai traduzir remove as
proteínas da junção de éxons. Se o ribossomo parar em
um códon de terminação de cadeia antes que todas as
proteínas de junção de éxons tenham sido removidas,
um conjunto específico de nucleases degrada o mRNA,
impedindo sua tradução. Da mesma forma, um mRNA
que não tenha um códon nonsense normal de termina
ção da cadeia é alvo da degradação, porque é muito pro
vável que esse mRNA tenha sido sintetizado com baixa
precisão ou tenha sido clivado por engano. A tradução
desse mRNA provavelmente resultaria em síntese de
uma proteína mais curta.
5.6 RNA DE INTERFERÊNCIA
Regiões de dupla-fita em mRNA celular são geral
mente muito curtas, com menos de 10 pares de bases.
Sequências dupla-fita mais longas podem resultar de re
plicação de vírus de RNA, de transcrição de sequências
repetitivas ou de regiões mais longas de alguns mRNAs
naturais. Esses RNAs de fita-dupla são processados em
RNAs inibitórios (RNAi) de fita-única que atuam silen
ciando a expressão de seus próprios mRNAs alvos.
A via de processamento desses RNAs é apresentada
na Figura 5.18. Uma RNase específica para RNA dupla
quando ela brota de uma célula infectada. APOBEC3G
converte múltiplos resíduos C no cDNA inicial em deso
xi-U. Os dUs, então, especificam dAs durante a síntese
da segunda fita do cDNA, que tem a mesma sequência
do RNA viral. Os vírus mutados são defectivos nas fases
mais tardias do ciclo de vida.
Entretanto, a APOBEC3G não confere resistência
absoluta. Em outro exemplo de como organismos pato
gênicos evoluem para evadir das defesas do hospedeiro,
HIV codifica uma proteína chamada Vif, que direciona
especificamente APOBEC3G para degradação nos pro
teassomos. Vif é relacionada com enzimas ubiquitina
-E3 ligase, embora o mecanismo exato pelo qual atinge
APOBEC3G não esteja claro.
Goila-Gaur, R., e Strebel, K. HIV-1, Vif, APOBEC, and
intrinsic immunity. Retrovirol. 5:51, 2008; Harris, R., e Li
ddament, M. T. Retroviral restriction by APOBEC proteins.
Nature Rev. Immunol. 4:868, 2004; and Wahl, S. M., Gre
enwill- Wild, T., e Vazquez, N. HIV accomplices and adver
saries in macrophage infection. J. Leukocyte Biol. 80:973,
2006.
-fita (um membro da família RNase III) primeiro proces
sa o RNA dupla-fita em espécies dupla-fita mais curtas,
que são exportadas do núcleo. Uma vez no citoplasma,
o RNA dupla-fita é mais processado por outra RNase III
chamada Dicer, formando um RNA dupla-fita pequeno
com cerca de 21 pares de bases de comprimento. Então,
o RNA dupla-fita é desenrolado por um complexo pro
teico chamado complexo de silenciamento induzido por
RNA (RISC, RNA-induced silencing complex) ou mi
cro-RNA-proteína (miRNP). Em ambos os casos, uma
fita do RNA duplex é selecionada, quase sempre a que é
complementar ao mRNA alvo. Então, o RNA pequeno li
gado a proteína estabelece pares de bases com o mRNA,
causando um de dois eventos. Se houver complementa
ridade perfeita (o RNA é chamado RNA inibitório pe
queno [siRNA]), as enzimas do complexo RISC clivam
a fita do mRNA. Se a complementaridade for imperfeita
(o RNA é chamado micro-RNA [miRNA]), o mi-RNP re
prime a tradução do mRNA por pareamento de bases
do miRNA com o mRNA. RNA de interferência é eficien
te porque um único complexo RISC-siRNA pode clivar
muitas moléculas de mRNA, e a repressão da tradução
pode levar à degradação do mRNA. Pesquisas recentes
sugerem que miRNA pode regular a expressão de até
um terço dos genes de mamíferos, e o envolvimento de
RNAs não-codificadores na formação da heterocroma
tina implica que podem regular a transcrição, assim
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA
C. Elegans/mamíferos
Dicer
P O repositório de informação genética de uma célula
P
P
P
P está replicando. As moléculas de RNA, por outro lado,
miRNA/siRNA miRNA
RISC miRNP
AAAA7mG PAAAA
7mG P dação a nucleotídeos, que depois são reutilizados em
Clivagem do RNA Represão
da tradução
FIGURA5.18 Efeitos de RNAs inibitórios pequenos sobre
o metabolismo de mRNA eucariótico.
RNA de fita-dupla, por exemplo, da replicação de vírus de RNA
(superior esquerda) ou de grampos de transcritos longos de
RNA (superior direita), é processado pela enzima Dicer em
RNAs de fita-dupla curtos. Uma fita é complementar ao mRNA
e estabelece pares de bases com ele, ajudada ou por RISC (via
da esquerda) ou pelo complexo miRNP (via da direita). RISC
quebra o mRNA na região de fita-dupla, enquanto o pareamen
to de bases com miRNP para a tradução do mRNA.
Redesenhado de Meister, G. e Tuschl, T. Nature 431:343, 2004.
como a tradução. A Correlação Clínica 5.7 discute o en
volvimento de microRNAs na oncogênese.
5.7 REPARO DO DNA
ACOPLADO A
TRANSCRIÇÃO
Uma lesão química no DNA afeta a expressão gêni
ca só se a sequência alterada for transcrita. Sequências
que não são expressas não levarão a uma mutação ob
servável. Faz sentido, portanto, que o reparo do DNA
tenha como alvos sequências que estão sendo ativa
mente transcritas. Esse acoplamento entre transcrição
e reparo ocorre porque lesões no DNA (como dímeros
ciclobutano; p. 170) que ocorrem na fita molde fazem a
RNA polimerase II parar. A RNA polimerase parada é
um sinal para os sistemas de reparo por excisão remo
verem as sequências alteradas e sintetizarem a corre
ta. Obviamente, isso não pode ocorrer com a volumosa
RNA polimerase ligada ao DNA, de modo que o trans
crito interrompido é sacrificado. Uma deficiência no re
paro acoplado à transcrição é a marca da síndrome de
Cockayne (Correlação Clínica 5.8).
• 207
5.8 NUCLEASES E TURNOVER
DO RNA
As diferentes funções do RNA e do DNA na expres
são gênica refletem-se em seus destinos metabólicos.
(DNA) deve ser preservado, explicando assim a exis
tência dos múltiplos sistemas de reparo e edição do
DNA no núcleo. Embora sequências individuais de nu
cleotídeos no DNA possam ser recicladas, a molécula
como um todo é metabolicamente inerte, quando não
são individualmente dispensáveis e podem ser substi
tuídas por espécies recém-sintetizadas com a mesma
especificidade. Não é surpreendente que sistemas de
reparo de RNA não sejam conhecidos. Em vez disso,
RNAs defeituosos são removidos das células por degra
novas espécies de RNA.
Isso é mais claro para espécies de mRNA, que são
relativamente instáveis. Entretanto, mesmo os RNAs
ditos estáveis são reciclados; por exemplo, a meia-vida
de espécies de tRNA no fígado é de cerca de 5 dias. Uma
meia-vida bastante longa para um mRNA de mamíferos
é de 30 h.
A degradação de RNAs ocorre tanto no núcleo
como no citoplasma. No núcleo, a degradação realiza
duas funções que se sobrepõem. Primeiro, serve como
controle de qualidade para que RNAs que resultam de
transcrição ou processamento incorretos sejam impedi
dos de sair do núcleo. Segundo, os RNAs de partículas
ribonucleoproteicas são reciclados, especialmente du
rante o ciclo celular. Os RNAs perdem o cap por uma
enzima nuclear e são degradados na direção 3! para 5!
pelo exossomo, um complexo multienzimático.
O Turnover do RNA Mensageiro
Citoplasmático É Acoplado à
Tradução
A remoção de RNAs do citoplasma é realizada por
ribonucleases celulares. Os RNAs mensageiros são ini
cialmente degradados no citoplasma. As velocidades
variam para diferentes espécies de mRNA, levantando
a possibilidade de controle por degradação diferencial.
Dois exemplos da função da estabilidade do RNA no
controle gênico ilustram como a estabilidade do mRNA
influencia a expressão gênica. Tubulina é o principal
componente dos microtúbulos do citoesqueleto de mui
tos tipos de células. Quando há um excesso de tubuli
na na célula, a proteína monomérica liga-se e promove
degradação do mRNA de tubulina, reduzindo assim a
síntese de tubulina. Um segundo exemplo é oferecido
pelo vírus do Herpes simplex (HSV), o agente causador
208 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.7
Envolvimento de MicroRNAs na Oncogênese
MicroRNAs (miRNAs) reduzem a expressão de
seus genes alvos por se ligarem aos mRNAs e, assim,
inibirem sua tradução ou desencadearem sua destrui
ção (Figura 5.18). Aproximadamente 30% de todos os
mRNAs humanos são potencialmente regulados por
miRNAs. Como o câncer é causado por erros na expres
são gênica, parece lógico que a via dos miRNAs esteja
envolvida na oncogênese. Essa hipótese foi apoiada
por uma série de observações. (1) Genes de famílias
de miRNAs estão frequentemente deletados em li
nhagens celulares de cânceres humanos. (2) Ao con
trário, alguns linfomas de células B caracterizam-se
por sequências de DNA amplificadas, que especificam
miRNAs. (3) O miRNA let-7 interage com vários onco
genes. A redução do miRNA let-7 correlaciona-se com
mau prognóstico em câncer de pulmão de não-peque
nas células (NSCLC). Por outro lado, em um modelo
em camundongo de NSCLC, transgenes funcionais let
A progressão de um fenótipo de célula normal para
um de câncer metastático é regulada, em parte, por
espécies específicas de microRNAs. Uma seta signifi
ca que um microRNA regula positivamente a transição
para um estágio diferente, enquanto uma linha termi
de lesões típicas do herpes na boca (cold sores) e algu
mas infecções genitais. Um evento precoce no estabele
cimento da infecção por HSV é a capacidade que o vírus
tem de desestabilizar todas as moléculas de mRNA ce
lular, reduzindo assim a competição por ribossomos li
vres. Dessa maneira, as proteínas virais são traduzidas
mais eficientemente.
Nucleases são de vários tipos e especificidades. A
distinção mais útil é a que existe entre exonucleases,
que degradam RNA a partir da extremidade 5! ou 3!,
e endonucleases, que clivam ligações fosfodiéster den
7 reduzem o fenótipo oncogênico. (4) Vários miRNAs
inativam a via da p53, que desencadeia a apoptose, em
resposta a danos genéticos.
Esses dados e outros semelhantes levaram à pro
posição de um modelo para as funções dos miRNAs
no desenvolvimento de câncer (ver figura). Embora o
modelo esteja incompleto, ele aponta a possibilidade
de terapias que teriam como alvo esse novo mecanis
mo regulatório.
Garzon, R., e Croce, C. M. MicroRNAs in normal and malig
nant hematopoeisis. Curr. Opin. Hematol. 15:352, 2008; Ku
mar, M. S., Erkeland, S. J., Pester, R. E., Chen, D. Y., et al. Sup
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nando numa barra significa que o miRNA regula nega
tivamente a transição.
Figura generosamente fornecida pelo Dr. Phillip Sharp,
Koch Institute for Integrative Cancer Research, M.I.T.
tro de uma molécula. Os produtos da ação de RNases
contêm fosfatos 3!- ou 5!-terminais, e tanto endo- como
exonucleases podem ser mais bem caracterizadas pela
posição (5! ou 3!) na qual o monofosfato criado pela cli
vagem fica localizado.
Outra atividade de exonuclease 3!-5! envolvida na
degradação de RNA é a polinucleotídeo fosforilase. Seu
mecanismo de degradação de RNA usa fosfato inorgâni
co para deslocar a ligação fosfodiéster na extremidade
3! do RNA, gerando um RNA mais curto e um nucleotí
deo difosfato.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 5.8
Síndrome de Cockayne
A síndrome de Cockayne (CS) (OMIM 216400) é
uma doença complexa autossômica recessiva, mais
comumente causada por uma mutação em um de dois
genes. Pacientes com CS apresentam alterações de de
senvolvimento e neurológicas, anomalias esqueléticas
e de retina, e uma deformidade facial “tipo pássaro”.
A morte geralmente ocorre por volta dos 20 anos de
idade e é causada por degeneração neural. A maioria
dos pacientes com síndrome de Cockayne é também
fotossensível e predisposta a câncer de pele. Essa fo
tossensibilidade aponta para um defeito no reparo do
DNA. Por exemplo, xeroderma pigmentoso (XP) re
sulta de mutações em vários dos componentes da via
de reparo do DNA. CS também é uma deficiência em
reparo do DNA.
Existem dois genes cujas mutações causam a maio
ria dos casos de síndrome de Cockayne; sabe-se que
ambas estão envolvidas no reparo de danos no DNA.
CSB codifica uma ATP helicase dependente de DNA
relacionada com proteínas envolvidas no remodela
mento da cromatina. CSA é uma E3 ubiquitina ligase,
aparentemente envolvida na reciclagem (turnover) de
proteínas. As proteínas CSA e CSB cooperam com ou
tras proteínas do reparo do DNA para remover a RNA
polimerase parada e os transcritos, e reparar o molde
danificado. Após o reparo, nova iniciação da transcri
ção pode ocorrer no promotor, ou outras moléculas de
RNA polimerase II que estão paradas atrás da lesão
podem continuar com a transcrição correta.
A estrutura do RNA pode afetar a ação da nuclease.
A maioria das nucleases é menos eficiente em regiões de
RNA com estrutura muito ordenada. Assim, tRNAs são
preferencialmente clivados em regiões não-pareadas da
sequência, e o exossomo prefere como substratos RNAs
não-estruturados ou dobrados erroneamente. Por ou
tro lado, muitas RNases envolvidas no processamento
de RNA requerem que o substrato tenha uma estrutura
tridimensional definida para reconhecimento.
mRNAs citoplasmáticos podem ser degradados por
várias vias sobrepostas (Figura 5.19). A maquinária
de degradação de mRNA é comumente encontrada em
corpos-P, que são grânulos subcelulares que contêm
um conjunto de enzimas que metabolizam mRNA, in
cluindo as da degradação. Mais comumente, a cauda
de poli(A) 3! do mRNA é encurtada primariamente por
digestão por exonuclease. Essa desadenilação é inibi
da por proteína(s) de ligação a poli(A). Depois, o cap é
removido por uma enzima especializada para remoção
do cap, que é também inibida pela proteína de ligação
CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA • 209
O reparo acoplado à transcrição ocorre quando a
RNA polimerase está parada por encontrar uma base
alterada (por exemplo, um fotodímero de timina). A
transcrição para, o transcrito parcial é degradado, e a
fita molde do DNA é reparada. Aparentemente, aumen
to da transcrição pela proteína CSB também estimula o
reparo do DNA acoplado à transcrição.
Se essa fosse toda a história, a síndrome de Cockay
ne seria uma variante do xeroderma pigmentoso; entre
tanto, pacientes com XP são neurologicamente normais
quanto ao desenvolvimento, embora sejam fotossensí
veis. O que causa as outras características de CS? Pa
rece que esses outros sintomas são devidos a uma defi
ciência primária na elongação da transcrição, causada
pelo fator de elongação CSB alterado pela mutação.
Essa ideia expande nosso entendimento da relação en
tre mutação e doença. Geralmente, doenças genéticas
são causadas por uma mutação em processos bioquími
cos que ficam fora das vias centrais de informação da
célula. Isso faz sentido porque inibição geral da síntese
de DNA, RNA ou proteína seria letal num estágio preco
ce do desenvolvimento. Os defeitos generalizados da CS
devem ser devidos à mutação que afeta a transcrição de
alguns genes mais do que a de outros.
Citterio, E., Vermeulen, W. e Hoeijmakers, J. H. J. Trans
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Trends Genet. 22:430, 2006.
a poli(A). O RNA sem capping é o substrato para uma
exonuclease 5!-3! que degrada o RNA a nucleotídeos.
Uma via alternativa envolve desadenilação e degrada
ção exonucleolítica 3!-5! por exossomos citoplasmáticos
de mRNAs que ainda retêm seu cap (Figura 5.19).
O decaimento mediado por nonsense elimina mRNAs
que são incapazes de fazer uma proteína completa. Nada
é perfeito. Embora a transcrição e o processamento
usem energia celular para manter baixa a frequência de
erros, eles ainda ocorrem. Como cada mRNA é traduzido
em múltiplas proteínas, um mRNA processado incorreta
mente gastaria a energia necessária à tradução e levaria
a proteínas dobradas incorretamente, o que desencadea
ria inflamação ou outras doenças graves, como formação
da placa amiloide na doença de Alzheimer.
Um RNA mal processado ou mal transcrito teria
uma alta probabilidade de conter códons de termina
ção (nonsense). Códons nonsense prematuros de
sencadeiam a destruição do mRNA, um processo cha
210 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

m7G AAAAA mado decaimento mediado por nonsense

CCR4 (NMD). Durante o primeiro ciclo de tradu
Desadenilação ção (pioneiro), qualquer códon de termina
AAAAA Proteínas
NOT ção prematuro é reconhecido por fatores
m7G
de terminação. Esse complexo recruta ou
tros fatores que sinalizam a destruição do
CAF1
mRNA e enviam o mRNA defeituoso para o
Remoção do cap Decaimento 3!
corpo P. O mecanismo de vigilância é capaz
de distinguir entre códons nonsense pre
m7G m7G 5!
DCP2 Complexo maturos e corretos porque o primeiro ocor
SKI re à montante (5!) de junções íntron-éxon
DCP1 Decaimento5!3! Exossomo
do mRNA.

XRN1

FIGURA 5.19 Duas vias para decaimento de mRNA.

Ambas as vias começam com o encurtamento da cauda de poli(A) do mRNA. O
mRNA desadenilado é, então, degradado ou por remoção do capi, seguida por
decaimento 5!-3! (esquerda) ou pela via 3!-5! pelo complexo exossomo e SKI
(direita).
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Termos Chaves
acetilação de histonas éxon poliadenilação zima
capping exossomo processamento do RNA RNA polimerase I
códon de terminação da fator de transcrição promotor RNA polimerase II
cadeia fator sigma recrutamento RNA polimerase III
de ação cis iniciação remoção do cap snRNP
RNA
domínio C-terminal da
polimerase íntron RNA inibitório pequeno spliceossomo
laço (siRNA) splicing alternativo
elongação molde RNA polimerase terminação
enhancer microRNA (miRNA) RNA polimerase holoen transcrito

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha 2. A subunidade sigma (σ) da RNA polimerase proca
riótica:
1. Na transcrição eucariótica:
A. é parte da enzima core.
A. a RNA polimerase não requer um molde.
B. liga-se ao antibiótico rifampicina.
B. todo RNA é sintetizado no nucléolo.
C. é inibida por α-amanitina.
C. sequências consenso são os únicos elementos
de promotores conhecidos. D. deve estar presente para que a transcrição
ocorra.
D. a formação da ligação fosfodiéster é favorecida
porque há hidrólise do pirofosfato. E. reconhece especificamente sítios promotores.
E. a RNA polimerase exige um iniciador (primer).
212 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
3. A terminação de um transcrito procariótico:
A. é um processo aleatório.
B. requer a presença da subunidade rho da holo
enzima.
C. não requer fator rho se a extremidade do gene
contiver um palíndrome rico em G-C.
D. é mais eficiente se houver um segmento rico
em A-T na extremidade do gene.
E. requer uma ATPase além do fator rho.
4.
A transcrição eucariótica:
A. é independente da presença de sequências
consenso a montante (upstream).
B. pode envolver um promotor localizado dentro
da região transcrita, e não a montante (ups
tream).
C. requer uma região promotora separada para
cada um dos três RNAs ribossômicos transcri
tos.
D. requer que o gene inteiro esteja na forma de
nucleossomos na cromatina.
E. é afetada por sequências amplificadoras
(enhancers) apenas se elas forem adjacentes
ao promotor.
5. O processamento do RNA transportador (tRNA):
A. envolve a clivagem de vários tRNAs diferentes,
a partir de um transcrito primário.
B. envolve apenas exonucleases.
C. cliva o excesso de bases da extremidade 3! de
pois da sequência CCA.
D. cliva o excesso de bases de ambas as extre
midades do transcrito primário, mas não no
interior da molécula.
E. requer a modificação de algumas bases por
metilação.
6. Na reciclagem (turnover) celular do RNA:
A. o reparo é mais ativo do que a degradação.
B. regiões de extenso pareamento de bases são
mais susceptíveis à clivagem.
C. uma pequena região dupla-fita do mRNA po
deria levar à clivagem do mRNA se uma fita
tiver complementaridade perfeita com uma re
gião do mRNA.
D. os produtos são sempre nucleotídeos com um
fosfato no grupo 5!-OH.
E. todas as espécies, exceto rRNA, são clivadas.
Questões 7 e 8: A síndrome do X frágil é uma forma
comum de retardo mental hereditário. A mutação nessa
doença permite o aumento de uma repetição CGC em
um gene em particular de um normal de 30 repetições
para 200-1.000 repetições. Essa repetição é normalmen
te encontrada na região 5! não-traduzida de um gene
da proteína FMR1. A FMR1 poderia estar envolvida na
tradução de mRNAs cérebro-específicos durante o de
senvolvimento do cérebro. A consequência do número
muito grande de repetições CGC no DNA é extensa me
tilação de toda a região do promotor do gene FMR1.
7. Metilação de bases no DNA geralmente
A. facilita a ligação de fatores de transcrição ao
DNA.
B. faz diferença em atividade só se ocorrer em
uma região de enhancer.
C. evita que a cromatina se desenrole.
D. inativa o DNA para transcrição.
E. resulta em produção aumentada do produto
de qualquer gene que esteja metilado.
8. A transcrição de genes eucarióticos requer a pre
sença de um promotor e geralmente a presença de
enhancers. Um enhancer
A. é uma sequência consenso no DNA localizada
onde a RNA polimerase se liga primeiro.
B. pode estar localizado em vários lugares em ge
nes diferentes.
C. pode estar em qualquer fita de DNA na região
do gene.
D. funciona pela ligação da RNA polimerase.
E. estimula a transcrição tanto em procariotos
como em eucariotos.
Questões 9 e 10: A síntese da hemoglobina adulta nor
mal (HbA) requer a síntese coordenada de a-globina e
b-globina. A b-talassemia é uma doença genética que
leva a uma deficiência de cadeias de b-globina e uma
incapacidade do sangue em conduzir oxigênio adequa
damente. A b-talassemia pode resultar de uma grande
variedade de mutações.
9. Todos os seguintes poderiam levar à falta de
b-globina ou b-globina não-funcional, exceto:
A. uma mutação com mudança na estrutura de
leitura (frameshift) levando à terminação
prematura da síntese da proteína.
B. mutação na região do promotor do gene da
b-globina.
C. mutação próximo à extremidade 3! do gene da
b-globina que codifica o sítio de poliadenila
ção.
D. mutação no meio de um íntron, não em uma
base A.
E. todos os anteriores poderiam levar a esse re
sultado.
10. Uma mutação levando a b-talassemia ocorre em
uma junção de splice. Qual(is) das seguintes
afirmativas sobre remoção de íntrons está(ão)
correta(s)?
A. Ribonucleoproteínas nucleares pequenas
(snRNP) são necessárias para a remoção de
íntrons.
 CAPÍTULO 5 TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA
B. A sequência consenso das extremidades 5! e
3! dos íntrons são idênticas.
E. A remoção de um íntron não requer energia
metabólica.
D. O éxon de uma das extremidades de um íntron
deve sempre ser ligado ao éxon em sua outra
extremidade.
A.
O nucleotídeo da extremidade do íntron que é
liberado primeiro forma uma ligação com um
grupo 3!-OH de um dos nucleotídeos de dentro
do íntron.
Questões 11 e 12: Protooncogenes geram produtos
que têm papéis específicos na regulação do crescimento
e da diferenciação de células normais. Mutações podem
transformar esses genes em oncogenes, cujos produ
tos respondem menos ao controle normal. A proteína
p53 não-mutada, um supressor de tumor, é um fator de
transcrição, inibindo alguns genes e ativando outros.
p53 inibe genes com sequências TATA e ativa genes de
reparo do DNA.
11. A sequência TATA
A. ocorre cerca de 25 pb à jusante (downstream)
do início de transcrição.
B. liga-se diretamente à RNA polimerase.
C. liga fatores de transcrição que ligam RNA po
limerase.
Respostas
1. D Esse é um importante mecanismo para dire
cionar reações. A e B: a transcrição é dirigida por
DNA, gerando precursores de rRNA no nucléolo e
precursores de mRNA e de tRNA, no nucleoplas
ma. C: a transcrição eucariótica pode ter regiões
de promotores internas, bem como enhancers. E:
essa é uma diferença da DNA polimerase.
2. E A, D e E: o fator sigma é necessário para a ini
ciação correta e se dissocia da enzima core depois
que as primeiras ligações se formaram. A enzi
ma core pode transcrever, mas não pode iniciar a
transcrição corretamente. B e C: rifampicina liga
-se à subunidade b, e a-amanitina é um inibidor de
polimerases eucarióticas.
3. C A terminação rho-independente envolve a es
trutura secundária, que é estabilizada por um alto
conteúdo de G-C. A, B e E: existe um processo
rho-dependente, bem como um rho-independente.
Rho é uma proteína separada da RNA polimerase e
parece possuir atividade de ATPase. D: é necessá
ria uma região rica em G-C.
4. B A RNA polimerase III usa um promotor interno.
A: a atividade da RNA polimerase II envolve as cai
xas TATA e CAAT. C: a RNA polimerase I produz
um transcrito, que é, mais tarde, processado para
gerar três rRNAs. D: partes do promotor não estão
• 213
D. liga p53.
E. é uma sequência enhancer.
12. O reparo do DNA acoplado à transcrição
A. ocorre porque uma lesão no DNA faz a RNA
polimerase parar durante a transcrição.
B. ocorre quando uma lesão no DNA forma uma
região no DNA que é muito compactada.
C. leva a um transcrito normal porque a transcri
ção continua depois do reparo ter sido feito.
D. ocorre porque tanto a fita molde como a codifi
cadora do DNA têm lesões.
E. todas as anteriores estão corretas.
Problemas
13. Como o decaimento mediado por nonsense ajuda
a evitar a exportação e a tradução de mRNA que
levaria a uma proteína mais curta, não-funcional?
14. a. Como você poderia determinar experimental
mente se uma preparação purificada de uma RNA
polimerase é de fonte procariótica ou eucariótica?
b. Uma preparação purificada de RNA polimerase é
sensível à inibição por a-amanitina a uma concen
tração de 10–8 M. A síntese de que tipo ou tipos de
RNA é inibida?
em um nucleossomo. E: enhancers podem estar a
1.000 ou mais pb de distância.
5. E RNAs transportadores são os ácidos nucleicos
mais modificados. A: isso ocorre com o precursor
de rRNAs. B: tanto endo- como exonucleases são
necessárias. C: CCA são adicionados sequencial
mente por nucleotidiltransferases e não fazem par
te do transcrito primário. D: podem existir íntrons,
por exemplo, na região do anticódon do transcrito
primário.
6. C Essa fita é chamada siRNA. Se a complementari
dade for imperfeita (miRNA), a tradução é reprimi
da. A: não existem processos de reparo de RNA. B: a
maioria das enzimas degradativas é menos eficiente
sobre uma estrutura ordenada. D: poderia ser 3! ou
5!, dependendo do lado no qual a ligação fosfodiéster
é clivada. E: todos os RNAs são reciclados.
7. D Metilação-desmetilação do DNA é uma forma
de controle, com o DNA metilado sendo inativo
para transcrição. A e E: esses indicariam que a
metilação ativa o DNA. B: alteração na região do
enhancer poderia fazer uma diferença, mas alte
ração na região do promotor certamente faria. C: o
desdobramento da cromatina nessa região é neces
sário para a transcrição, mas a metilação do DNA
não está diretamente envolvida no processo.
214 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
8. B B e C: sequências enhancer parecem funcionar,
estejam no começo ou no fim de um gene, mas pre
cisam estar na mesma molécula de DNA que o gene
transcrito. A: a RNA polimerase liga-se primeiro ao
promotor. D: parecem funcionar ligando-se a prote
ínas que, por sua vez, ligam a RNA polimerase.
9. D Mutações em qualquer extremidade do íntron
levariam a um erro de splicing, mas uma mutação
no meio do íntron, não. A exceção seria se o ponto
específico da mutação fosse a adenosina que forma o
ponto de ramificação. A, B e C: todas estão corretas.
10. A snRNPs são responsáveis tanto pela clivagem
do íntron na extremidade 5! como pela junção dos
éxons. B: as sequências das duas extremidades de
um íntron são diferentes: GU na extremidade 5! e
AG na extremidade 3!. C: o spliceossomo requer
ATP para remover o íntron. D: éxons não-consecu
tivos podem ser ligados, levando a múltiplas pro
teínas a partir de um gene. E: o laço se forma em
2!-OH.
11. C B e C: a RNA polimerase não se liga diretamen
te ao TATA, mas a fatores de transcrição que li
gam TATA. A e E: TATA é parte do promotor e,
portanto, fica à montante (upstream) do início da
transcrição. D: p53 provavelmente liga-se ao com
plexo formado entre fatores de transcrição e TATA,
interferindo com a transcrição.
12. A Isso sinaliza ao sistema de reparo por excisão,
para reparar a lesão. B: o reparo é dirigido a ge
nes transcritos ativamente, onde a cromatina é
mais frouxamente organizada. C: para que ocorra
o reparo, a RNA polimerase deve se dissociar, e o
transcrito é sacrificado. D: uma lesão típica é dí
mero de timina na fita molde. A fita codificadora é
normal e funciona como molde para o reparo.
13. Um códon de terminação da cadeia a montante do
último éxon é anormal. Quando a tradução para em
tal códon, algumas proteínas da junção dos éxons
ainda permanecem. Isso leva um conjunto específi
co de nucleases a degradarem o mRNA, impedindo
sua tradução.
14. a. Teste a preparação quanto à inibição por α-ama
nitina em uma concentraçãoalta, na qualas RNA po
limerases eucarióticas são inibidas, exceto a I, mas
a enzima eucariótica não é. Se a preparação não for
inibida pela amanitina, confirme se é inibida por ri
fampicina. Não será possível distinguir a RNA poli
merase eucariótica mitocondrial da enzima proca
riótica, porque ambas têm a mesma sensibilidade.
b. A RNA polimerase II é sensível à α-amanitina
em uma concentração muito baixa, de modo que a
síntese de mRNA seria inibida.
PARTE II CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 215
TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

6
Síntese de Proteínas:
Tradução e Modificações
Pós-Tradução
Dohn Glitz
Professor Emérito, University of California, Los Angeles School of Medicine

CONTEÚDO 6.4 α-Talassemia, 221

6.1 INTRODUÇÃO, 216 6.5 Mudança na Fase de Leitura (Frameshifting)
Programada na Biossíntese de Proteínas de HIV,
6.2 COMPONENTES DO APARELHO DE TRADU
223
ÇÃO, 216
6.6 Mutações em rRNA e tRNA Mitocondriais Resul
6.3 BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS, 225
tam em Surdez Induzida por Antibiótico, 235
6.4 MATURAÇÃO DE PROTEÍNAS: DOBRAMENTO,
6.7 Deleção de um Códon, Enovelamento Incorreto e
MODIFICAÇÃO, SECREÇÃO E DIRECIONAMEN
Degradação Prematura: Fibrose Cística, 236
TO, 236
6.8 Doenças de Direcionamento para Lisossomos:
6.5 DIRECIONAMENTO PARA MEMBRANA E ORGA
Doença da Célula I, 243
NELAS, 241
6.9 Terapia por Reposição de Enzima para Doenças
6.6 MAIS MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO, 246
Lisossomais de Acúmulo, 244
6.7 REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO, 250
6.10 Importação Mitocondrial de Proteína Defectiva e
6.8 DEGRADAÇÃO E TURNOVER DE PROTEÍNAS, Doença, 245
253
6.11 Hiperproinsulinemia Familiar, 247
6.12Ausência de Modificação Pós-Tradução: Deficiên
CORRELAÇÕES CLÍNICAS cia Múltipla de Sulfatases, 248
6.1 Mutações Silenciosas Podem Não Ser Silenciosas: 6.13 Defeitos na Síntese de Colágeno, 251
(1) Síndrome Progeria de Hutchinson–Gilford e
6.14 Enovelamento Errado de Proteína e Agregação:
(2) Gene 1 de Resistência a Múltiplas Drogas, 220
Doença de Huntington e Doença de Alzheimer,
6.2 Mutações com Sentido Errado: Hemoglobinopa 256
tias, 220
6.15 Defeitos no Sistema Ubiquitina-Proteassomo, 257
6.3 Mutações Que Geram um Códon de Terminação,
221
216 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
Conceitos Chaves
• A biossíntese de proteínas envolve a tradução da
linguagem de polinucleotídeo dos genes para a lin
guagem de proteínas.
• Três nucleotídeos em sequência (códons) no mRNA
especificam um aminoácido específico, o ponto ini
cial da tradução e o término da cadeia peptídica.
Existem 64 códons possíveis, e a maioria dos ami
noácidos é especificada por mais de um códon. O
código genético é chamado degenerado e é quase
universal.
• A tradução é centralizada no RNA: o mRNA trans
mite a informação genética, o tRNA transporta os
aminoácidos, e o RNA ribossômico ajuda a dar for
ma aos ribossomos e catalisa a geração da ligação
peptídica. Muitas proteínas, enzimas e fatores es
tão envolvidos na síntese proteica.
• A síntese ocorre no sentido amino para carboxiter
minal. Em cada passo, (1) o aminoácido apropriado
é ativado pela ligação a um tRNA, (2) o aa-tRNA
6.1 INTRODUÇÃO
A biossíntese de proteínas é chamada tradução por
que envolve a tradução bioquímica da informação ge
nética, armazenada e transmitida em um alfabeto de
quatro letras e na linguagem estrutural do DNA, no
alfabeto de 20 letras e na linguagem estrutural de pro
teínas. A tradução é centralizada em múltiplas funções
do RNA: o RNA mensageiro transmite a informação
genética, o RNA transportor carrega os aminoácidos e
decodifica a mensagem, o RNA ribossômico catalisa a
formação da ligação peptídica e se constitui no cerne da
linha de montagem, e RNAs bem pequenos são impor
tantes reguladores do processo.
As células variam em suas necessidades e capacida
des de sintetizar proteínas. Glóbulos vermelhos comple
tamente diferenciados não têm aparelho para tradução
e têm um tempo de vida de apenas 120 dias. Outras cé
lulas sintetizam as proteínas que necessitam para man
ter as concentrações de enzimas e de outras proteínas.
As células em crescimento e divisão devem sintetizar
quantidades muito maiores de proteínas, e algumas cé
lulas também produzem proteínas para exportação. Por
exemplo, as células hepáticas são fábricas de proteínas
que sintetizam as enzimas utilizadas em suas múltiplas
vias metabólicas e mais proteínas para exportação, in
cluindo soroalbumina, a principal proteína do plasma
sanguíneo.
é posicionado no sítio aceptor do ribossomo, (3)
a cadeia peptídica nascente é ligada ao novo ami
noácido pela peptidil transferase, e (4) o peptidil
-tRNA elongado é deslocado para o local doador do
ribossomo.
• A tradução é muito regulada, tanto no nível de
cada proteína individual como global. Modificação
pós-tradução e cotradução das proteínas é comum
e pode influenciar a forma, a função, a localização
celular, a exportação da célula e o tempo de vida da
proteína.
• O dobramento de uma proteína em sua conforma
ção final é espontâneo ou assistido por proteínas
chaperones.
• Existem mecanismos para a degradação das proteí
nas que não são mais necessárias, com dobramento
errado, danificadas ou incompletas. O proteassomo
é um centro de degradação importante, mas não
exclusivo.
6.2 COMPONENTES DO
APARELHO DE TRADUÇÃO
RNA Mensageiro Transmite a
Informação Codificada no DNA
A informação genética é herdada e armazenada nas
sequências de nucleotídeos do DNA. A expressão seleti
va dessa informação requer sua transcrição em mRNA,
que carrega mensagens específicas e precisas do “ban
co de dados” nuclear para o local citoplasmático de sín
tese proteica.
Em eucariotos, os mRNAs são geralmente sintetiza
dos como moléculas precursoras maiores, que são pro
cessadas antes de serem exportadas do núcleo (p. 201).
O mRNA eucariótico é quase sempre monocistrônico;
isto é, codifica um único polipeptídeo. A extremidade
5! tem um cap de 7-metilguanosina ligado por uma
ponte 5!-trifosfato à extremidade 5! do mRNA (p. 201).
Uma região 5! não-traduzida precede o sinal de inicia
ção da tradução. Geralmente, mas nem sempre, essa é
a primeira sequência AUG encontrada quando a men
sagem é lida 5! → 3!. Sequências não-interrompidas de
códons de 3 nucleotídeos de comprimento, que espe
cificam uma sequência polipeptídica singular, seguem
o códon de iniciação até que um códon de tradução e
de terminação seja alcançado. Este é seguido por uma
sequência 3! não-traduzida (ou UTR), geralmente com
cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, antes que
o mRNA termine em uma cauda de poliadenilato com
100-200 nucleotídeos de comprimento.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 217

O mRNA procariótico difere significativamente. A extremidade amino-terminal para a carboxi-terminal.

extremidade 5! do mRNA não tem cap, mas retém um Essas direções correspondem a seus sentidos de leitura
trifosfato terminal de sua síntese pela RNA polimerase. e biossíntese.
A maioria dos mRNAs é policistrônica; eles codificam
vários polipeptídeos e incluem mais de um códon AUG Códons em mRNA São Palavras de Três
de iniciação. Uma sequência de posicionamento do ri Letras
bossomo localiza-se cerca de 10 nucleotídeos à montan
te do códon de iniciação AUG. Uma UTR segue o sinal Uma correspondência 1:1 entre bases e aminoáci
de terminação, mas não há cauda de poliadenilato. dos permitiria que o mRNA codificasse apenas quatro
aminoácidos diferentes, enquanto uma correspondên
cia 2:1 codificaria 42= 16 aminoácidos. Nenhuma delas
RNA Transportador É uma Molécula é suficiente, uma vez que 20 aminoácidos diferentes
ocorrem na maioria das proteínas. O código genético de
Tradutora Bilíngue três letras tem 43 = 64 permutações ou palavras; isso
Todas as moléculas de tRNA têm várias característi também é suficiente para codificar sinais de início e de
cas estruturais em comum, incluindo a sequência CCA parada, equivalentes a pontuação. Os tripletes são cha
3!-terminal à qual um aminoácido é ligado, uma estru mados códons e geralmente são apresentadas na forma
da Tabela 6.1. Dois aminoácidos são designados por có
tura secundária conservada em “trevo”, e uma estrutura
terciária em forma de L (p. 67). Entretanto, cada uma dons únicos: metionina por AUG e triptofano por UGG.
das muitas espécies de tRNA tem uma sequência nucle Os restantes são designados por dois, três, quatro ou
otídica própria que permite grande especificidade nas seis códons. Múltiplos códons para um único aminoá
interações com mRNA e com a aminoacil-tRNA sinteta cido representam a degeneração no código. O código
se que acopla um aminoácido específico a ele. genético é quase universal, uma vez que as mesmas pa
lavras códigos são usadas em todos os organismos. Uma
exceção à universalidade ocorre em mitocôndrias, nas
O Código Genético Usa um Alfabeto quais alguns poucos códons têm significado diferente
do citosol do mesmo organismo (Tabela 6.2).
de Quatro Letras de Nucleotídeos
Pontuação
A informação genética existe na forma de sequências
lineares de nucleotídeos no DNA, análogas à sequência Quatro códons funcionam parcial ou totalmente
linear de letras nestas palavras. A linguagem do DNA como pontuação. O sinal de início, AUG, também es
usa um alfabeto de quatro letras composto de duas pu pecifica metionina. Um AUG em um ponto adequado
rinas, A e G (adenina e gua
nina), e duas pirimidinas, C e TABELA 6.1 O Código Genéticoa
T (citosina e timina). A infor
um alfabeto
substitui
mação
quatro
seletivamente
letras,
noT.DNA
Asemelhante
mas
no
linguagem
é mRNA
U
transcrita
(uracil)
em
do
de U UUC U
UUU C A G
Phe
] UCU
UCC
UAUUAC]Tyr UGU
UGC
Cys U
C
]
UCA Ser UAA UGA Stop A
UUA
RNA é, portanto, um diale
UUG Leu ] UCG UAG Stop UGG Trp] G
to da
DNA.
é expressa
linguagem
A informação
predominante-
genética
genética
do C CUU CCU CAU His CGU U
CUA
CUC
Leu
CCC
CCAPro
CAC
CAA
CGC
CGA Arg
] C
A
que
dades na
mentederivam
de forma
sua suas
sequência
de proteínas
proprie-
de CUG CCG CAG
]Gln CGG G
Base 5! Base 3!
nados na
das lin-
Im-
4
aminoácidos.
de
é
20
plícita
dade
guagem
traduzida
letras
proteínas
letras
dessas
está
analogia
ácidos
sequências.
aNa
proteínas.
alinguagem
direcionali-
biossíntese
com
nucleicos
a Por
de A AUU
]
AUA Ile
AUC
ACU
ACCACAThr
AAU

AAA
]
AAC Asn
AGU
]
AGC Ser
U
C

AUG Met ACG ]

AAG Lys AGG ]
AGA Arg A
G
G GUU GCU GAU GGU U
GUC
GUA Val
GCC
GCA
Ala
GAA
]
GAC Asp GGC
GGAGly
C
A

convenção, sequências de aO
GUG GCG GAG ]Glu GGG G
código genético compreende 64 códons, que são permutações de quatro bases três a três. Note a im
ácidos nucleicos são escritas
portância da sequência: três bases, cada uma usada uma vez por códon triplete, resultam em seis permu
em uma direção 5! → 3!, e tações: ACG, AGC, GAC, GCA, CAG e CGA, para treonina, serina, aspartato, alanina, glutamina e arginina,
sequências de proteínas da respectivamente.
218 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
do mRNA significa metionina como o resíduo inicial,
amino-terminal. Códons AUG posteriores no mRNA es
pecificam resíduos de metionina no meio da proteína.
Três códons, UAG, UAA e UGA, são sinais de parada
(ou stop) que não especificam nenhum aminoácido e
são códons de terminação ou, menos apropriadamente,
códons sem sentido (nonsense).
O códon UGA tem uma função adicional, codificar
selenocisteína (sec) em pelo menos 25 proteínas hu
manas. Selenocisteinil-tRNA é sintetizado a partir de
um seril-tRNA(sec)ser específico (Um Olhar Mais Atento
6.1) e a selenocisteína somente é incorporada se o có
don UGA ocorrer em uma sequência de inserção de sec,
uma estrutura haste-alça específica no mRNA. Um fa
tor de elongamento específico (eEFSec) e uma proteína
de ligação a inserção de selenocisteína (SBP2) também
são necessários.
TABELA 6.2 Uso Não-Universal de Códons em
Mitocôndrias de Mamíferos
Códon Código Usual Código Mitocondrial
UGA Terminação Triptofano
AUA Isoleucina Metionina
AGA Arginina Terminação
AGG Arginina Terminação
Interações Códon-Anticódon
Permitem Ler um mRNA
A tradução dos códons do mRNA envolve sua inte
ração com as sequências do anticódon complementares
no tRNA. Cada espécie de tRNA carrega um aminoá
cido específico e tem um triplete anticódon específico.
Como no pareamento de bases do DNA, o pareamento
de bases códon-anticódon é antiparalelo, como mostra
a Figura 6.1. Os códons são lidos em uma estrutura de
leitura sequencial, sem sobreposição. Os sítios do anti
códon e aceptor do aminoácido ficam em extremidades
opostas da molécula de tRNA em forma de L (p. 67).
O tRNA, conceitualmente e fisicamente, faz uma pon
te entre a sequência de nucleotídeos do mRNA ligado
ao ribossomo e o local de montagem de proteínas no
ribossomo.
Como 61 códons designam 20 aminoácidos, parece
que seria necessário existirem exatamente 61 espécies
diferentes de tRNA. Esse não é o caso. Muitos ami
noácidos são carregados por mais de uma espécie de
tRNA, mas variação no pareamento de bases padrão é
comum também nas interações códon-anticódon. Mui
tos códons degenerados podem ser lidos por mais de
um tRNA (mas sempre um carregando o aminoácido
correto). Um nucleotídeo frequente no anticódon é áci
do inosínico (I), o nucleotídeo da hipoxantina, que pa
reia com U, C ou A. Nucleotídeos modificados no ou ao
UM OLHAR MAIS ATENTO 6.1
Aminoacil-tRNA Sintetases
Os eucariotos e algumas bactérias têm as espe
radas 20 aminoacil-tRNA sintetases, mas muitos
procariotos e arqueias não têm sintetases para a for
mação de glutaminil-, asparaginil-, e ocasionalmente
cistenil-tRNA. Assim, esses tRNAs são formados in
diretamente. Os tRNAs são primeiramente aminoa
cilados com glutamato, aspartato, ou O-fosfoserina
por aminoacil-tRNA sintetases com especificidade
relaxada para o reconhecimento de suas espécies
cognatas de tRNA. Os aminoácidos ligados são, en
tão, convertidos por enzimas modificadoras amino
acil-tRNA-dependentes que reconhecem apenas o
aminoacil-tRNA apropriado.
A selenocisteína é formada a partir de seril-tR
NASec em um processo de duas etapas; a serina é
fosforilada por uma quinase e depois convertida em
selenocisteína por uma sintase que usa selenofosfa
to. Muitas proteínas que incluem selenocisteína têm
um papel antioxidante na eliminação de espécies
reativas de oxigênio, e a eliminação do gene da seril
-tRNASec é letal.
Sheppard, K., Yuan, J., Hohn, M. J., Jester, B. et al.
From one amino acid to other: tRNA-dependent amino
acid biosynthesis. Nucl. Acids Res. 36:1813, 2008.
lado do primeiro nucleotídeo do anticódon em muitas
espécies de tRNA também modulam interações códon
-anticódon. A hipótese da oscilação (wobble) permite
o pareamento de bases menos rigoroso entre a primeira
posição do anticódon e a posição degenerada (terceira)
do códon. As regras de pareamento oscilante de bases
são apresentadas na Tabela 6.3. Se as regras de oscilação
forem seguidas, os 61 códons que não são de pontuação
poderiam ser lidos por apenas 31 moléculas de tRNA,
mas a maioria das células tem 50 ou mais espécies de
tRNA. Alguns códons são lidos mais eficientemente por
um anticódon do que outros. Nem todos os códons ou
pares de códons são usados igualmente; alguns são
usados muito raramente. O exame de muitas sequên
cias de mRNA mostra que diferentes organismos usam
preferencialmente diferentes códons para gerar sequ-
ências polipeptídicas semelhantes.
“Decifrando” o Código Genético
O código genético (ver Tabela 6.1) foi determinado
antes que o sequenciamento de DNA ou RNA fosse pos
sível. Os experimentos para decifrar o código usaram
mRNAs sintéticos simples para se obter informações
sobre como as proteínas são codificadas.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 219

Polinucleotídeo fosforilase catalisa a reação inde TABELA 6.3 Regras de Pareamento de Bases com
pendente de molde. Oscilação (wobble)

xNDP ↔ polinucleotídeo (pN)x + xPi Bases 5! Possíveis no

Base 3! do Códon
Anticódon
onde NDP é qualquer nucleosídeo 5!-difosfato. Com
UDP, um polímero de U, poli (U), é formado. A sínte A U ou I
se in vitro de proteínas com poli(U) como mRNA gera C G ou I
polifenilalanina. Do mesmo modo, poli(A) codifica po U
G C ou U
lilisina e poli(C), poliprolina. Um mRNA com uma se
quência aleatória de apenas U e C produz polipeptíde A ou G ou I
os que contêm não apenas prolina e fenilalanina como
A degeneração do código e a complexidade dos pro
previsto, mas também serina (de UCU e UCC) e leucina
dutos tornaram experimentos com mRNAs de sequên
(de CUU e CUC).
cias aleatórias difíceis de interpretar, mas mRNAs de
mRNA sequências definidas podem ser transcritos a partir de
5' DNAs sintéticos de repetições simples. Assim, poli(AU),
3'
transcrito a partir de um poli(dAT) repetitivo, produz
apenas um copolímero repetitivo de Ile-Tyr-Ile-Tyr, lido
A U a partir de tripletes sucessivos AUAUAU AUAUAU, e
assim por diante. Poli(CUG) contém códons possíveis
U C
A tRNAmet CUG para Leu, UGC para Cys, e GCU para Ala, cada
um se repetindo uma vez que a fase de leitura (reading
G frame) tenha sido estabelecida. A iniciação é aleatória
nesses experimentos, de modo que três homopolipeptí
deos são produzidos: polileucina, policisteína e poliala
nima. Um poli(CUGG) perfeito produz um polipeptídeo
5'
3' com a sequência (-Leu-Ala-Arg-Ser-), seja qual for o
(a)
ponto de iniciação. Essas relações, resumidas na Tabe
la 6.4, mostram códons a serem lidos em tripletes em
mRNA
5' sequência exata, sem sobreposição ou omissão.
3'
Outros experimentos usaram códons de trinucleo
tídeos sintéticos como mensagens mínimas. Nenhuma
C G proteína é feita, mas a ligação do ribossomo a apenas um
aminoácido (como tRNA conjugado) foi estimulada por
A U tRNAgln
um dado códon. O significado de cada códon possível foi
mais tarde verificado por determinação de sequências de
G C
mRNA.

Mutações
5'
3'
O entendimento do código genético e de como ele é
(b) lido fornece uma base para o entendimento da natureza
das mutações. Uma mutação é simplesmente uma mu
FIGURA6.1 Interações códon-anticódon.
dança hereditária em um gene. Mutações puntuais en
Interações entre (a) o códon AUG (metionina) e seu anticó
don CAU e (b) o códon CAG (glutamina) e um anticódon CUG
volvem uma mudança em um único par de bases no DNA
mostram que o pareamento de bases do mRNA com tRNA é e, assim uma única base no mRNA correspondente. Se
antiparalelo. essa mudança ocorrer na terceira posição de um códon
degenerado, pode não haver mudança no aminoácido
TABELA 6.4 Produtos Polipeptídicos de mRNAs Sintéticosa especificado (por exemplo,
UCC para UCA ainda codi
mRNA Sequência do Códon Produtos fica serina). Tais mutações
silenciosas são comumente
—(AU)n—
—(CUG)n— —CUG
—AUA CUG
UAU AUA
CUG UAU—
CUG— —(Leu)n—
—(Ile-Tyr)n/3— observadas na compara
ção de genes de proteínas
semelhantes, por exemplo,
—GCU
—UGC GCU
UGC UGC
GCU UGC—
GCU— —(Ala)n—
—(Cys)n— hemoglobinas de diferentes
espécies, de modo que são
geralmente sem efeito. (Para
—(CUCG)n— —CUC GCU CGC UCG— —(Leu-Ala-Arg-Ser)n/3— uma exceção, ver Correla
aOs colchetes horizontais demarcam a estrutura de leitura. ção Clínica 6.1).
220 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.1
Mutações Silenciosas Podem Não Ser Silenciosas: (1) Síndrome Progeria de Hutchinson–Gilford e (2) Gene
de Resistência a Múltiplas Drogas 1
Os polimorfismos de nucleotídeo único, nos
quais um nucleotídeo é alterado em relação ao gene
normal, podem ser detectados por análise de DNA.
Quando um polimorfismo em uma região codificado
ra do gene não altera o aminoácido codificado pelo
códon afetado, esse polimorfismo é considerado uma
mutação silenciosa. Contudo, pode haver consequên
cias significativas.
Síndrome Progeria de Hutchinson–Gilford é uma
doença muito rara caracterizada pelo envelhecimento
extremamente prematuro; as crianças permanecem
pequenas e sofrem de perda de cabelos e audição, os
teoporose, doença cardiovascular e outras enfermi
dades da velhice. A maioria morre de infarto do mio
cárdio no início da adolescência. Em 90% dos casos
uma troca de GGC para GGT no códon 608 do gene
da lamina A deveria ser silenciosa, uma vez que a gli
cina é especificada em ambos os casos. Entretanto,
um sítio de splicing críptico é ativado, resultando em
uma proteína Lamina A com uma deleção interna de
50 aminoácidos e que não é corretamente processada.
A Lanina A é um componente da membrana nuclear;
a proteína mutante rompe a membrana e de alguma
maneira resulta na doença. Uma vez que as crianças
afetadas não chegam à idade reprodutiva, todos os ca
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.2
Mutações com Sentido Errado: Hemoglobinopatias
As mutações de sentido errado mais importantes
que afetam a estrutura da hemoglobina ocorrem na
anemia falciforme (ver Correlação Clínica 2.4 e 9.6).
Uma mudança de A para U no códon GAA ou GAG de
glutamato dá um códon GUA ou GUG da valina na sexta
posição da cadeia b. A hemoglobina S (HbS) desoxige
nada forma polímeros lineares que levam o eritrócito
a adotar formato de foice quando a tensão de oxigênio
está baixa. O tratamento com hidroxiureia estimula a
síntese de cadeias g e, assim, aumenta os níveis de he
Mutações de sentido errado (missense) surgem
de uma troca de base que causa incorporação de um
aminoácido diferente em uma proteína (Correlação Clí
nica 6.2). Mutações puntuais também podem formar
ou destruir um códon de terminação e, assim, mudar
o comprimento de uma proteína. A formação de um
códon de terminação a partir de um que codifica um
aminoácido é uma mutação sem sentido ou nonsense;
sos representam uma nova mutação nesse ponto exato
em um alelo do gene.
Combinações de duas ou três mutações silenciosas
no gene de resistência a múltiplas drogas 1 (MDR1) re
sulta em proteínas com a sequência normal, mas uma
conformação diferente e interações alteradas com
droga e inibidores. A mudança de códons frequente
mente usados para códons raramente usados desace
lera ou pausa a tradução na região afetada e resulta em
mudança no dobramento cotradução da proteína. A
preferência do uso de códons se estende à frequência
de uso de códons adjacentes que especificam a mesma
sequência. Genes sintéticos que usam pares de códons
desfavoráveis para codificar proteína de cápsula poli
vírus foram traduzidos em velocidades menores, mes
mo quando os códons individuais foram favorecidos
em geral.
Korf, B. Hutchinson–Gilford progeria syndrome, aging,
and the nuclear lamina. N. Engl. J. Med. 358:552, 2008;
Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I., Sauna, Z. E. et al. A
“silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate
specificity. Science 315:525, 2007; e Coleman, J. R., Papa
michail, D., Skiena, S., Futcher et al. Virus attenuation by
genome-scale changes in codon pair bias. Science 320:1784,
2008.
moglobina fetal; a HbF interfere na polimerização de
HbS. Uma segunda hemoglobinopatia comum é a doen
ça da hemoglobina C, na qual uma troca de G por A em
um códon GAA ou GAG de glutamato resulta em um
códon AAA ou AAG de lisina na sexta posição da b-glo
bina. Centenas de outras mutações de sentido errado na
hemoglobina são conhecidas.
Platt, O. S. Hydroxyurea for the treatment of sickle cell
anemia. N. Engl. J. Med. 358:1362, 2008.
resulta na terminação prematura e numa proteína trun
cada (Correlação Clínica 6.3). Mutação de um códon de
terminação para outro de um aminoácido permite que a
mensagem continue a ser lida até que outro códon stop
seja encontrado. O resultado é uma proteína maior do
que o normal. Esse fenômeno é a base de várias doenças
(Tabela 6.5 e Correlação Clínica 6.4).
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.3
Mutações Que Geram um Códon de Terminação
Na Hemoglobina McKees Rocks (OMIM 141900) o
códon UAU ou UAC, normalmente designando tirosina
na posição 145 da b-globina, é mutado para o códon de
terminação UAA ou UAG. Isso encurta a b-globina de
seus 146 resíduos normais para 144 resíduos. A ligação
de 2,3-bisfosfoglicerato é impedida e a hemoglobina
mutante tem uma afinidade excepcionalmente eleva
da por oxigênio e oferta diminuída de oxigênio. Em
resposta, eritropoietina é secretada pelo rim e a pro
dução aumentada de eritrócitos produz um fenótipo
de policitemia.
Outra mutação de terminação causa um tipo de b-ta
lassemia. As talassemias são caracterizadas por um de
sequilíbrio na estequiometria de síntese de a- e b-glo
binas. A b-globina não é sintetizada na b0-talassemia.
Como resultado, a a-globina, incapaz de se associar
com a b-globina para formar hemoglobina, acumula
-se e precipita-se nas células eritroides. Isso danifica
TABELA 6.5 Mutações com Continuação da Leitura em Códons de Terminação Produzem Cadeias
Anormais Longas de a-Globina
Hemoglobina a-Códon 142
A UAA
Constant Spring CAA
Icaria AAA
Seal Rock GAA
Koya Dora UCA
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.4
a-Talassemia (OMIM 604131)
Existem dois genes expressos de a-globina em cada
cromossomo 16. Muitos exemplos de a-talassemia sur
gem da deleção de dois, três ou todos os quatro genes
de a-globina; a gravidade clínica aumenta com o nú
mero de genes deletados. Diferentemente, as doenças
resumidas na Tabela 6.5 são formas de a-talassemia
que surgem de moléculas de a-globina excepcional
mente longas. Estas substituem a a-globina normal e
estão presentes apenas em pequenas quantidades em
decorrência de uma taxa diminuída de síntese ou, mais
provavelmente, de uma taxa aumentada de quebra da
a-globina anormal. O códon de terminação normal,
UAA, é mutado para um dos quatro códons com sen
• 221
as membranas celulares, causando anemia hemolítica
e estímulo da eritropoiese. Uma variedade de b0-talas
semia, comum no sudeste asiático, resulta de uma mu
tação de terminação no códon 17 da b-globina; o códon
normal AAG, que designa um resíduo lisil, torna-se um
códon de terminação UAG; nenhuma sequência útil de
b-globina é sintetizada, e b-globina está ausente. Os ní
veis de mRNA de b-globina também ficam deprimidos,
provavelmente pelo processo chamado de decaimento
mediado por nonsense.
Winslow, R. M., Swenberg, M. L., Gross, E., Chervenick,
P. A. et al. Hemoglobin McKees Rocks (a2145 b2 tyràterm). A
human nonsense mutation leading to a shortened b-chain.
J. Clin. Invest. 57:772, 1976; Chang, J. C., e Kan, Y. W. b-
-Thalassemia: A nonsense mutation in man. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76:2886, 1979; e Rehwinkel, J., Raes, J.,
e Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay: target
genes and functional diversification of efforts. Trends Bio
chem. Sci. 131:639, 2006.
Comprimento da
Aminoácido 142 a-Globina (Resíduos)
141
Glutamina 172
Lisina 172
Glutamato 172
Serina 172
tido, resultando na colocação de quatro aminoácidos
diferentes na posição 142. A a-globina normal tem 141
resíduos de comprimento, mas as quatro a-globinas
anormais têm 172 de resíduos porque um triplete de
nucleotídeos na região normalmente não-traduzida do
mRNA torna-se um códon de terminação na posição
173. Cadeias de globina mais longas também podem
resultar de mutações com mudança estrutura de leitu
ra (frameshift) ou inserções.
Weatherall, D. J. e Clegg, J. B. The a-chain termination
mutants and their relationship to the a-thalassemias. Philos.
Trans. R. Soc. B [London] 271:411, 1975.
222 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
TABELA 6.6 Uma Mutação com Mudança na Estrutura de Leitura (Frameshift) Produz Hemoglobina Waynea
Posição 137 138
Sequência da α-globina
normal
-Thr -Ser
Sequênciadecódonsdaα-globinanormal -ACP -UCU -AAA -UAC -CGU -UAA -GCU -GGA -GCC -UCG -GUA
Sequênciadecódonsdaα-globinaWayne -ACP -UCA -AAU -ACC -GUU -AAG -CUG -GAG -CCU -CGG -UAG
Sequência de aminoácido -Thr -Ser
da α-globina Wayne
aA base deletada, que causa a mudança na fase de leitura, está marcada por um círculo. Os códons de terminação estão dentro de retângulos.
P = A, G, U ou C.
Inserção ou deleção de um único nucleotídeo dentro
da região codificadora de um gene resulta em uma muta
ção com mudança na estrutura de leitura (frameshift).
A estrutura de leitura é alterada nesse ponto, e códons
subsequentes são lidos em um novo contexto até que um
códon de terminação seja alcançado. A Tabela 6.6 ilustra
esse fenômeno. O significado da seleção da estrutura de
leitura é enfatizado por um fenômeno observado em al
guns vírus muito pequenos nos quais o tamanho do vírus
limita a quantidade de DNA que ele contém. Como com
pensação, um único segmento de DNA codifica diferen
tes polipeptídeos que são traduzidos usando diferentes
estruturas de leitura. Um exemplo é o vírus símio SV40
que causa tumor (Figura 6.2). O HIV e alguns outros
vírus dependem do frameshift durante a tradução para
gerar diferentes proteínas a partir de uma única mensa
gem (Correlação Clínica 6.5).
A Aminoacilação do RNA
Transportador Ativa os Aminoácidos
para a Síntese Proteica
Os aminoácidos devem ser ativados para ligação
a seus tRNAs carregadores apropriados antes de po
derem ser incorporados a proteínas. Esse processo de
duas etapas é catalisado por uma família de aminoacil
-tRNA sintetases, cada uma específica para um único
aminoácido e suas espécies apropriadas de tRNA. As
reações são normalmente escritas como se segue:
139 140 141 142 143 144 145 146 147
-Lys -Tyr -Arg
-Asn -Thr -Val -Lys -Leu -Glu -Pro -Arg
t Antigen VP2
VP3
ori
TAntigen
VP1
FIGURA 6.2 Genoma do vírus símio 40 (SV40).
O DNA de SV40, apresentado em vermelho, é um círculo de
fita dupla de pouco mais que 5.000 pares de base que codifica
toda a informação necessária à sobrevivência e replicação do
vírus dentro de uma célula hospedeira. Ela demonstra uso ex
tremamente eficiente do potencial de codificação de proteína
de um genoma. VP1, VP2 e VP3 são proteínas estruturais do
vírus; VP2 e VP3 são traduzidas a partir de diferentes pontos
de iniciação até a mesma extremidade carboxi-terminal. VP1
é traduzida em uma fase de leitura diferente: sua porção N
-terminal se sobrepõe aos genes VP2/VP3, mas sua sequência
de aminoácidos no segmento sobreposto é diferente de VP2 e
VP3. Duas proteínas, os antígenos tumorais large T (T gran
de) e small t (t pequeno), promovem transformação de células
infectadas. Elas são codificadas por um precursor de mRNA
comum e possuem sequências N-terminais idênticas, mas o
segmento C-terminal da proteína small t é codificado por um
segmento de mRNA que é removido da mensagem de large T,
e a sequência carboxi-terminal de large T é codificada no RNA
que se segue à terminação de small t. A origem da replicação
do DNA (ori) fica fora das regiões codificadoras.
Os colchetes em torno do complexo
aminoacil-AMP-enzima indicam que é um
intermediário transitório, ligado à enzi
ma. O aminoacil-adenilato, um anidrido
ácido misto com componentes carboxi
la e fosforila, é um intermediário de alta
energia. A ligação aminoacil éster com
o tRNA é de energia mais baixa do que o
aminoacil-adenilato, mas ainda maior que
a do grupo carboxila do aminoácido livre.
Pirofosfatases quebram o pirofosfato que é
produzido, e o equilíbrio é fortemente des
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.5
Mudança na Fase de Leitura (Frameshifting) Programada na Biossíntese de Proteínas de HIV
A manutenção da fase de leitura durante tradução
é central para a fidelidade da tradução. No entanto,
muitos retrovírus, incluindo o vírus HIV da AIDS, usa o
deslizamento do mRNA e uma mudança na fase de lei
tura para gerar proteínas diferentes a partir do mesmo
mensageiro. Um único mRNA, designado gag-pol, codi
fica duas poliproteínas que se sobrepõem em cerca de
200 nucleotídeos e estão em diferentes fases de leitura.
A poliproteína gag é traduzida do códon de iniciação
até um códon de terminação em fase perto da junção
gag-pol; a poliproteína gag é clivada para gerar várias
proteínas estruturais do vírus. Entretanto, em cerca de
locado na direção de formação do aminoacil-tRNA. Do
ponto de vista de precisão da tradução, o aminoácido,
que só tinha a sua cadeia lateral (grupo R) para distin
gui-lo, fica ligado a um carregador grande, complexo e
fácil de reconhecer.
Especificidade e Fidelidade de Reações de
Aminoacilação
Quase todas as células contêm 20 aminoacil-tRNA
sintetases diferentes, cada uma específica para um
aminoácido, e pelo menos uma família pequena de tRNAs
carregadores para cada aminoácido (ver Um Olhar Mais
Atento 6.1 para exceções). Como as interações códon–
anticódon definem o aminoácido a ser incorporado, um
tRNA erroneamente acilado causará um erro na proteí
na. A seleção correta de ambos tRNA e aminoácido pela
sintetase é, portanto, central para a fidelidade da tra
dução. As aminoacil-tRNA sintetases têm um mecanis
mo comum e muitas ocorrem nas células em complexos
multiproteicos. Entretanto, são um grupo diversificado
de proteínas que podem conter uma, duas ou quatro
subunidades idênticas ou pares de subunidades dife
rentes. Domínios estruturais separados podem estar
envolvidos na formação do aminoacil-adenilato, no re
conhecimento do tRNA e, se ocorrer, nas interações en
tre as subunidades. Cada enzima é capaz da formação,
quase sem erro, das combinações corretas aminoacil
-tRNA. Alguns aminoácidos são facilmente reconheci
dos pelas suas cadeias laterais volumosas (por exemplo,
triptofano), ou falta de volume (glicina), ou por cargas
positiva ou negativa nas cadeias laterais (por exemplo,
lisina e glutamato). Outros são de discriminação muito
mais difícil. Por exemplo, o reconhecimento da valina e
não da treonina ou isoleucina pela valil-tRNA sinteta
se é difícil, uma vez que as cadeias laterais diferem ou
por uma hidroxila adicionado, ou por um único grupo
metileno.
Os sítios de reconhecimento e ativação de amino
ácido de cada enzima têm grande especificidade, mas
• 223
5% das vezes ocorre uma mudança de fase de leitura de
um nucleotídeo no segmento de mRNA sobreposto, e o
códon de terminação é ultrapassado porque não está
mais na fase de leitura. É produzida uma poliproteína
de fusão gag-pol; a clivagem proteolítica da poliproteína
pol produz a transcriptase reversa viral e outras prote
ínas necessárias à reprodução do vírus. (Ver Correla
ções Clínicas 4.2 e 13.3).
Jacks, T., Power, M. D., Masiarz, F. R., Luciw, P. A. et al.
Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol
expression. Nature 331:280, 1988.
às vezes ocorre reconhecimento errado. Uma etapa
adicional de verificação aumenta a discriminação por
muitas (mas não todas) as aminoacil-tRNA sinteta
ses. Isso mais frequentemente ocorre por hidrólise do
intermediário aminoacil-adenilato, com a liberação de
aminoácido e AMP. A valil-tRNA sintetase hidrolisa
eficientemente o treonil-adenilato, e hidrolisa isoleu
cil-adenilato em presença de tRNAVal ligado (mas não
aminoacilado). Alternativamente, tRNA acilado erro
neamente é reconhecido e desacilado. Valil-, fenilalanil
e isoleucil-tRNA sintetases desacilam tRNAs que foram
carregados erroneamente com treonina, tirosina e vali
na, respectivamente. O resultado final é um nível médio
de acilação errada de um a cada 104 a 105.
Cada sintetase deve também reconhecer correta
mente de uma a várias espécies de tRNA que podem
carregar o mesmo aminoácido, ao mesmo tempo que
rejeitam espécies de tRNA incorretas. Isso pode ser
mais simples que a seleção de um único aminoácido.
Entretanto, lembre-se da semelhança conformacional e
dos elementos de sequência comuns a todos os tRNAs.
Sintetases diferentes reconhecem diferentes elementos
da estrutura do tRNA. Geralmente, múltiplos elemen
tos estruturais contribuem para o reconhecimento, mas
muitos desses elementos não são determinantes abso
lutos. Um elemento esperado para o reconhecimento do
tRNA é o anticódon. No caso do tRNAmet, a mudança do
anticódon altera o reconhecimento pela sintetase. Em
outros casos, isso é só parcialmente verdade, e às vezes
o anticódon não é um determinante de reconhecimen
to. Isso é demonstrado por mutações supressoras que
impedem a expressão de classes de mutações nonsen
se. Uma mutação puntual em um códon de glutamina
(CAG) produz um códon de terminação (UAG), que
causa terminação prematura da proteína codificada.
Uma segunda mutação supressora no anticódon de um
tRNAtyr, na qual o anticódon normal GUA é modificado
para CUA, permite a continuação da leitura do códon
de terminação. A mutação inicial é suprimida e uma
proteína quase normal é feita, com a glutamina afetada
224 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
substituída por tirosina. Aminoacilação tRNAtyrmutan
te com tirosina permite que nesse caso o anticódon não
determine especificidade da sintetase.
Outras características de identificação do tRNA po
dem incluir elementos do braço aceptor e partes da alça
variável ou da haste-alça D. A característica de reco
nhecimento primária do tRNAala de E. coli é um par de
bases G3-U70 no braço aceptor; mesmo que nenhuma
outra alteração no tRNAala ocorra, qualquer variação
nessa posição destrói sua capacidade de aceptor com
alanina-tRNAala sintetase. A estrutura de raios-X do
complexo glutaminil sintetase -tRNA apresentada na
Figura 6.3 mostra a ligação na superfície côncava do
tRNA, que é típica e compatível com as observações bio
químicas.
Extremidade 5'
Extremidade
aceptora
ATP
Anticódon
FIGURA 6.3 Interação de um tRNA com sua aminoacil-tRNA
sintetase.
O esqueleto açúcar-fosfato da glutamil tRNA de E. coli é apre
sentado em verde, e o esqueleto peptídico da glutaminil-tRNA
sintetase é apresentado em múltiplas cores. A sintetase interage
com o braço aceptor parcialmente desenrolado e a alça do anti
códon do tRNA. ATP, apresentado em vermelho, está a poucos
Angstroms da extremidade 3! do tRNA. Modelos do preenchi
mento de espaço do complexo mostram ambas as moléculas
como objetos sólidos, com vários sítios de contato direto.
Adaptado de Perona, J., Rould, M. e Steitz, T. Biochemistry
32:8758, 1993.
Ribossomos São Máquinas para a
Síntese Proteica
Ribossomos são partículas complexas de ribonu
cleoproteínas que fornecem uma bancada de trabalho e
base catalítica para a síntese de proteínas. São compos
tos por duas subunidades diferentes, ambas contendo
RNA e muitas proteínas. Com uma exceção, cada pro
teína está presente em uma cópia por ribossomo, assim
como cada espécie de RNA. A composição de importan
tes tipos de ribossomos é mostrada na Tabela 6.7.
A arquitetura e a função dos ribossomos foram
conservadas na evolução, e semelhanças entre ribos
somos e subunidades de diferentes fontes são mais
importantes do que as diferenças. As estruturas dos
ribossomos e suas subunidades foram determinadas
por cristalografia de raios-X de partículas de micror
ganismos. Ribossomos e subunidades de muitas fontes
foram também visualizados por microscopia eletrônica;
sua estrutura é muito conservada. Os ribossomos pro
carióticos podem se auto-organizar; estruturas nativas
podem ser reconstituídas a partir de misturas de pro
teínas individuais purificadas e RNAs. A reconstituição
de subunidades a partir de misturas nas quais um único
componente é omitido ou modificado pode mostrar se
é importante para organização da subunidade ou para
alguma função específica. Embora a reconstituição de
subunidades eucarióticas não tenha sido bem-sucedida,
muitos estudos mostram que ribossomos procarióticos
e eucarióticos não apenas têm morfologia semelhante,
mas também funcionam da mesma maneira. (Um Olhar
Mais Atento 6.2).
Estudos estruturais e funcionais levaram aos mode
los de ribossomos, cujas características são descritas
na Figura 6.4, e a Figura 6.5 mostra as estruturas de
raios-X de ribossomos e seus complexos com mRNA e
tRNA. Os ribossomos são organizados em dois modos
adicionais. Vários ribossomos frequentemente tradu
zem uma única molécula de mRNA simultaneamente.
Na Figura 6.6 são mostradas micrografias eletrônicas
de polissomos ligados por mRNA. Em células eucarióti
cas, os ribossomos ocorrem livres no citosol e ligados às
membranas do retículo endoplasmático rugoso. Em ge
ral, ribossomos livres sintetizam proteínas que perma
necem no citosol ou dirigem-se ao núcleo, às mitocôn
drias ou a alguma outra organela. Ribossomos ligados
à membrana sintetizam proteínas que serão secretadas
da célula ou sequestradas e funcionam na membrana
plasmática, no retículo endoplasmático, no complexo
de Golgi, ou nos lisossomos. Em homogenatos celula
res, fragmentos de membranas com ribossomos ligados
constituem a fração microssomal; detergentes podem
romper as membranas e liberar esses ribossomos.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 225

TABELA 6.7 Classificação e Composição de Ribossomos

Pequena Subunidades
Fonte de Ribossomo Tamanho do Monômero
Grande
Eucariotos
Citosol 80S RNA
40S:
34 proteínas
18S 60S:
50 proteínas
RNAs 28S, 5,8S e 5S
Mitocôndrias
Animais 55S–60S RNA 12S
30S–35S: 40–45S:
RNA 16S
70–100 proteínas
Plantas superiores 77S–80S RNA 19S
40S: 60S:
RNAs 25S, 5S
70–75 proteínas
Cloroplastos 70S RNA
30S:
20–2416S
proteínas 50S:
34–38 proteínas
RNAs 23S, 5S, 4,5S
Procariotos 70S RNA
30S:
21 proteínas
16S 50S:
Escherichia coli 34 proteínas
RNAs 23S, 5S

UM OLHAR MAIS ATENTO 6.2

Estrutura e Função dos Ribossomos

A complexidade dos ribossomos requer aplicação
de muitas técnicas para decifrar sua arquitetura e ele
mentos funcionais, particularmente se as estruturas de
raios-X não estiverem disponíveis. As técnicas impor
tantes incluem
1. Espalhamento de nêutrons de subunidades recons
tituídas nas quais duas proteínas são deuteradas:
isso permite a determinação da separação entre
duas proteínas nas subunidades.
2. Microscopia eletrônica de complexos de partículas
com anticorpos contra um componente proteico
único, um elemento RNA, ou uma sonda funcional:
o anticorpo em forma de Y serve como um indica
dor da localização do componente.
3. Ligação química cruzada: a determinação de com
ponentes ligados permite a identificação de proteí
nas vizinhas, de proteínas com segmentos de RNA,
e de elementos de RNA que podem estar distantes
na sequência, mas próximos na estrutura dobrada.
4. Sondas químicas e enzimáticas: elementos expos
tos podem ser identificados, enquanto componen
tes internos ou escondidos são resistentes.
5. Comparação de sequência: sequências podem ser
identificadas como sendo conservadas na evolução
e, portanto, são provávelmente importantes em es
trutura e função. Essa abordagem foi especialmen
te importante para estabelecer estruturas secun
dárias do rRNA.

6.3 BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS
A Tradução É Direcional e Colinear
com o mRNA
Sequências do RNA mensageiro são transcritas e
escritas 5! → 3!, e durante a tradução são lidas na mes
ma direção. Sequências de aminoácidos são escritas e
sintetizadas do resíduo amino-terminal para o carboxi
-terminal. Um ribossomo permanece ligado a uma mo
lécula de mRNA: o mensageiro é movido ao longo de
seu comprimento até que um códon de terminação seja
alcançado. A comparação da sequências de mRNA com
as sequências das proteínas que codificam mostra uma
correspondência perfeita, colinear, sem sobreposição
e sem falha da sequência de mRNA codificadora e do
polipeptídeo sintetizado. De fato, é comum deduzir a
sequência de uma proteína exclusivamente pela sequ-
ência de nucleotídeo de seu mRNA ou do DNA de seu
gene, embora a sequência final da proteína possa diferir
em virtude de modificações pós-tradução.
226 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

tRNA FIGURA 6.4 Modelo da estrutura de

mRNA ribossomo e sítios funcionais.
Peptidil- Domínio de 5! Linha superior: A face de cada subunidade
transferase translocação que interage no ribossomo funcional. Em (a)
os sítios da subunidade grande de formação
da ligação peptídica (peptidil transferase) e
de ligação do fator de elongação (domínio
de translocação) são vistos em lados opos
3! tos da protuberância central. A haste proje
ta-se para a direita. Em (b) a plataforma da
subunidade pequena se projeta em direção
ao leitor. O mRNA e os tRNAs interagem no
sítio decodificador, em uma fenda entre a
plataforma e o corpo da subunidade. Em (c)
a subunidade grande está rotacionada 90°, a
(a) (b)
haste projeta-se para dentro da página e o
tRNA
sítio de saída do peptídeo nascente é visto
mRNA próximo à base da subunidade. Esse sítio
5!
faz contato com a membrana em ribossomos
ligados ao retículo endoplasmático rugoso.
O sítio de formação da ligação peptídica fica
distante do sítio de saída; o peptídeo nas
cente passa através de uma fenda ou túnel
3! no ribossomo para chegar ao sítio de saída.
Em (d) a subunidade pequena sofreu uma
Sítio de rotação de 90°; a plataforma projeta-se para
decodificação dentro da página. Em (e) as subunidades fo
Ponto de ram unidas para mostrar sua orientação no
saída da cadeia ribossomo. O aminoacil-tRNA ligado à subu
peptídica nascente
nidade pequena é orientado com a extremi
(c) (d)
dade aceptora próximo à peptidiltransfera
se, enquanto o domínio de translocação fica
próximo do sítio decodificador.

3!

mRNA
5!

(e)

pode substituir o Met-tRNAiiniciação-específico

A Iniciação da Síntese Proteica É um
Processo Complexo
A iniciação requer aproximação de uma subunidade
ribossômica pequena (40S), um mRNA e um complexo
tRNA do aminoácido amino-terminal, tudo em orien
tação correta. Segue-se a associação da subunidade
grande (60S) para formar um complexo de iniciação
completo em um ribossomo 80S. Esse processo requer
várias proteínas fatores de iniciação, relacionadas na
Tabela 6.8, que agem transitoriamente e só na iniciação.
A Figura 6.7 apresenta o processo de iniciação. Primei
ro, o fator de iniciação eucariótico 2 (eIF2) liga-se a
GTP e ao tRNA iniciador, Met-tRNAimet, para formar
um complexo ternário. Nenhum outro aminoacil-tRNA
met nes
sa etapa. (Os procariotos utilizam um tRNA iniciador
específico cuja metionina é modificada por formilação
de seu amino grupo. Apenas fMet-tRNAimet é reconhe
cido pelo IF2 procariótico.)
A segunda etapa requer subunidades ribossômicas
40S associadas com uma proteína muito complexa,
eIF3. A eIF-3 de mamíferos contém 13 polipeptídeos
diferentes; liga-se à superfície da subunidade 40S que
fará contato com a subunidade 60S e bloqueia fisica
mente a associação das subunidades. Portanto, eIF3
é um fator antiassociação ribossômica, assim como
eIF6 que se liga a subunidades 60S. Um complexo que
inclui eIF2-GTP, Met-tRNAMet,i eIF3-40S e fatores pro
teicos adicionais, agora se forma. Na terceira etapa é
CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 227

FIGURA 6.5 Estrutura cristalo

gráfica de um ribossomo 70S.
A estrutura do ribossomo de Ther
mus thermophilus é mostrada
a uma resolução de 5,5 Å. Vistas
sucessivas são rotações de 90o
em torno do eixo vertical. (a) A
subunidade pequena está sobre a
subunidade grande, como no mo
delo da Figura 6.4e. Características
da subunidade pequena incluem
a plataforma (P), a cabeça (H), o
corpo (B) e um pescoço (N) que
faz a conexão. O 16S RNA está co
lorido em turquesa, e proteínas da
subunidade pequena estão em azul
escuro. (b) A subunidade grande
está à direita; 23S RNA é cinza, 5S
RNA é azul claro, e proteínas da
subunidade grande são púrpuras.
Uma molécula de tRNA (dourado)
atravessa as subunidades. (c) A
subunidade grande está em cima,
com sua haste se projetando à es
querda. (d) A subunidade grande
está à esquerda e elementos de
tRNA são visíveis na interface das
subunidades.
Reproduzido com permissão de Yu
supov, M. M., Yusupova, G.A., Bau
com, A., Lieberman, K., Earnest,
T.N., Cate, J. H. D. e Noller, H. F.
Science 292:883, 2001. Reproduzi
do com permissão de AAAS. Figu
ra gentilmente cedida por Drs. A.
Baucom e H. Noller.

Figura 6.6 Micrografias

eletrônicas de polissomos.
(a) Polirribossomos de reticuló
citos sombreados com platina são
vistos em grupos de três a seis ri
bossomos, um número consistente
com o tamanho do mRNA de uma
cadeia de globina. (b) Coloração
com uranil acetato e visualização
em maior aumento mostram po
lissomos; partes do mRNA são vi
síveis.
Cortesia de Dr. Alex Rich, M.I.T.
228 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

TABELA 6.8 Principais Fatores de Iniciação de Mamíferos

Fator Subunidade Função
eIF1 1 Ajuda a formação do complexo de pré-iniciação
eIF1A 1 Ajuda a formação do complexo de pré-iniciação, liga-se ao sítio A
eIF2 3 (a, b, g) Entrega o complexo ternário
eIF2B Recicla eIF2-GPD
eIF3 13 (a-m) Organizador de outros fatores na subunidade 40S, regulador de ligação, fator antias
sociação, outros funções desconhecidas
eIF4A 1 RNA helicase
eIF4B 1 Ajuda eIF4A
eIF4E 1 Ligação ao cap do mRNA
eIF4F 3 Complexo de eIF4A, eIF4E, eIF4G
eIF4G 1 Recrutamento do mRNA, varredura, ligação de eIF3
eIF5 GTPase para eIF2, ajuda a associação de 60S
eIF5B Formação do ribossomo 80S
eIF6 Liga 60S (fator antiassociação)
PAB Liga polyA do mRNA
Fonte: Thornton, S., Anand, N., Purcell, D. e Lee, J. Not Just for housekeeping: protein initiation and elongation factors in cell growth and tumori
genesis. J. Mol. Med. 81:536,2003. Noble, C. G. e Song, H. Structural studies of elongation and release factors. Cell. Mol. Life Sci. 65: 1335, 2008.

formado o complexo de pré-iniciação; mRNA, eIF4F,
também chamado complexo de ligação ao cap, eIF4A e
RNA helicase que desenrola a estrutura secundária da
sequência líder não-traduzida do mRNA, PAB, uma pro
teína de ligação ao poliA que faz uma alça aproximando
a extremidade 3! do mRNA e o 5!-cap, e várias outras
proteínas são necessárias. O mRNA é então percorrido
5! → 3! até que o primeiro triplete AUG seja encontrado.
O GTP do complexo ternário é hidrolisado com a ajuda
de eIF5, e eIF2-GDP e outros fatores são liberados. O
eIF2-GDP interage com o fator trocador de nucleotídeo
de guanina eIF2B e GTP para regenerar eIF2-GTP para
outro ciclo de iniciação. A etapa final requer a ligação
do complexo de pré-iniciação a uma subunidade 60S e
um fator adicional, eIF5B-GTP. GTP é hidrolisado, e
eIF5B-GDP e outros fatores são liberados. O comple
xo de iniciação completo é um ribossomo 80S com o
mRNA e o tRNA iniciador corretamente posicionados
para começar tradução.
Às vezes, o primeiro AUG não é utilizado e um AUG
posterior, caracterizado por sua estrutura secundá
ria no mRNA, é selecionado para iniciação. Tais sítios
internos de entrada no ribossomo (IRES) foram pri
meiro encontrados em mRNAs virais, mas também são
comuns em mensageiros que codificam proteínas que
protegem as células de estresse, quando a tradução da
maioria dos mRNAs está reprimida.
Procariotos usam menos fatores de iniciação para
formar um complexo de iniciação. Suas subunidades
30S, complexadas com um IF3 mais simples, podem se
ligar primeiro ou a um mRNA ou a um complexo terná
rio de IF2, fMet-tRNAimet e GTP. A orientação do mRNA
depende, em parte, do pareamento de bases entre uma
sequência rica em pirimidinas de oito nucleotídeos no
rRNA 16S e uma seqência rica em purinas, com cerca
de 10 nucleotídeos à montante do códon AUG iniciador.
A complementaridade entre o rRNA e o mRNA pode
incluir vários pares errados, mas complementaridade
maior geralmente leva a iniciação mais eficiente. O fator
de iniciação IF1 também age na formação do complexo
de pré-iniciação. Finalmente, uma subunidade 50S é li
gada, o GTP é hidrolisado, e os fatores de iniciação são
liberados. É interessante o fato de que os procariotos
dependem mais das interações RNA-RNA para posicio
nar o mRNA, enquanto os eucariotos usam muitas pro
teínas para obter o mesmo resultado.
A Elongação É a Formação Passo a
Passo das Ligações Peptídicas
Elongação da proteína, como mostra a Figura 6.8,
ocorre por prolongamento passo a passo da cadeia poli
peptídica. Em cada etapa, a peptidil transferase ribos
sômica transfere o peptídeo nascente (ou, na primeira
etapa, o resíduo de metionina iniciador) de seu tRNA
carregador para o a-amino grupo do resíduo de ami
noácido do aminoacil-tRNA especificado pelo códon
seguinte:
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 229

H Rn O Rn + 1 O H Rn O H Rn + 1 O

•••NCHC + H2N CH C •••NCHC

CNCH

(n resíduos de
peptidil-tRNA
tRNAn
comprimento) tRNAn + 1 tRNAn + 1
aminoacil-tRNA peptidil-tRNA
(n + 1 resíduos de comprimento)

tores
A de
eficiência
elongação
e a não-ribossômicos
fidelidade são aumentadas
que usam energia
por fa- das espécies corretas de aminoacil-tRNA e para mover
o mRNA e os tRNAs associados por meio do ribossomo.
liberada por hidrólise de GTP para garantir a colocação

GTP eIF2 +

GTP
eIF3
eIF2B + GDP Met-tRNAiMet
Complexo ternário
(Etapa 1)
eIF2B + GTP

40S
GDP eIF2

elF1
elF1A

3!

elF1
elF1A
elF5
5!
eIF3

60S 40S

(Etapa 4) 5!
Complexo de iniciação 60S

40S
eIF5B • GTP (Etapa 2)

3!
FIGURA 6.7 Iniciação da tradução em eucariotos.
Detalhes no texto. Um complexo ternário que inclui eIF4A
eIF4B
o tRNA iniciador (etapa 1) combina-se com uma su eIF4F
bunidade ribossômica pequena (etapa 2). A intera PAB
ção com mRNA forma um complexo de pré-iniciação eIF5
(etapa 3). A ligação da subunidade grande comple 40S 5! 3!
ta a formação do complexo de iniciação (etapa 4). mRNA
(Etapa 3)
A forma diferente de eIF2 complexado com GTP ou
na
GDPhidrólise
indica que
do trifosfato.
mudanças Depois
conformacionais
do início ocorrem
da elon Complexo de pré-iniciação

gação, subunidades pequenas adicionais se comple

xarão com o mesmo mRNA para formar polissomos.
230 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

aa

GTP EF1α

E P A
(Etapa 1) Met

60S
3!
5!

40S

GDP EF1α

E P A

(Etapa 2) Met aa

60S
3!
5!

40S

E Met P A
(Etapa 3)
aa

60S EF2 GTP

3!
5!

40S

EF2 GDP + Pi

E Met A
aa P

(Etapa 4)

60S
3!
5!

40S

FIGURA 6.8 Etapas de elongação na síntese proteica.
(a)O primeiro ciclo de elongação é mostrado. Etapa 1: um com
plexo de iniciação com metionil tRNAimet no sítio P80S. Etapa 2:
EF1α colocou um aminoacil-tRNA no sítio A. A hidrólise de GTP
resulta em uma mudança conformacional de EF1α. Etapa 3:
uma ligação peptídica se formou; o novo peptidil-tRNA ocupa
um sítio híbrido (A/P) no ribossomo e o braço aceptor do
tRNAimet desacilado está no sítio E da subunidade grande. Etapa
4: o complexo mRNA-peptidil-tRNA foi translocado para o sítio
P, enquanto o tRNA iniciador desacilado move-se para o sítio E.
(a)
(b) Ciclos subsequentes de elongação. Etapa 5: ligação do ami
noacil-tRNA no sítio A causa liberação do tRNA desacilado do
sítio E. Etapa 6: a formação da ligação peptídica resulta no novo
peptidil-tRNA ocupando um sítio híbrido A/P. Etapa 7: translo
cação move mRNA e novo peptidil-tRNA em registro para sítio P.
Aminoácidos adicionais são colocados por repetições sucessivas
do ciclo. Reciclagem de EF1α (superior à esquerda) é detalhada
na Figura 6.9. Para mais detalhes, ver texto.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO º 231

GDP

GTP GDP EF10 - +

º%

(Etapa 5)

(Etapa 7)

EF2 GDP +
(Etapa 6)

(b)

FIGURA 6.8
(continuação)
232 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
Durante a elongação até três moléculas de tRNA são
ligadas em sítios específicos que atravessam ambas as
subunidades ribossômicas. O met-tRNA iniciador é po
sicionado de modo que seu resíduo metionil possa ser
transferido (ou doado) para o a-amino grupo livre do
aminoacil-tRNA que está entrando; ele, portanto, ocu
pa o sítio doador, também chamado sítio peptidil ou sí
tio P do ribossomo. O aminoacil-tRNA especificado pelo
códon seguinte do mRNA é ligado ao sítio aceptor, tam
bém chamado sítio aminoacil ou sítio A do ribossomo.
A seleção do aminoacil-tRNA correto é aumentada pelo
fator de elongação EF1. Um componente de EF1, EF1a,
primeiro forma um complexo ternário com aminoacil
-tRNA e GTP. O complexo EF1a-aminoacil-tRNA-GTP
liga-se ao ribossomo e se as interações códon-anticó
don estiverem corretas, o aminoacil-tRNA é colocado
no sítio A, GTP é hidrolisado, e o complexo EF1a-GDP
se dissocia. O metionil-tRNA iniciador e o aminoacil
-tRNA que está entrando estão, agora, justapostos no
ribossomo. Seus anticódons estão pareados com códons
sucessivos do mRNA e os sítios P e A da subunidade pe
quena, e seus aminoácidos estão um ao lado do outro no
sítio peptidil transferase da subunidade grande. A pep
tidil transferase catalisa o ataque do grupo a-amino do
aminoacil-tRNA sobre o carbono carbonila do metionil
-tRNA. O resultado é a transferência da metionina para
o amino grupo do aminoacil-tRNA, que então ocupa
uma posição “híbrida” do ribossomo com o anticódon no
sítio A 40S, enquanto a extremidade aceptora e o pep
tídeo ligado estão no sítio P60S. O anticódon do tRNA
desacilado permanece no sítio P 40S; sua extremidade
aceptora localiza-se no sítio de saída ou E 60S.
O mRNA e o dipeptidil-tRNA no sítio A 40S devem
ser reposicionados para permitir que outro ciclo de
elongação comece. Isso é feito pelo fator de elongação
2 (EF2), também chamado translocase. EF2 move o
mRNA e o dipeptidil-tRNA, em registro códon–anti
códon, do sítio A 40S para o sítio P. No processo, GTP
é hidrolisado, fornecendo energia para o movimento,
e o sítio A fica vago. À medida que o dipeptidil-tRNA
move-se para o sítio P, o tRNA doador desacilado (me
tionina) também se move para o sítio E na subunidade
60S. O ribossomo pode agora entrar em um novo ciclo.
O aminoacil-tRNA seguinte, especificado pelo mRNA,
é entregue pelo EF1a-GTP para o sítio A, e o tRNA de
sacilado do sítio E é liberado. A transferência de pep
tídeo ocorre novamente. Ciclos sucessivos de ligação
de aminoacil-tRNA, formação da ligação peptídica, e
translocação resultam em elongação passo a passo do
polipeptídeo até a sua extremidade carboxila eventual.
Seja qual for o comprimento da cadeia nascente, a for
mação da ligação peptídica sempre ocorre por ataque
do grupo a-amino do aminoacil-tRNA recém-chegado
sobre a ligação peptídica carboxil-tRNA, de modo que
o arranjo geométrico das moléculas reagentes no sítio
peptidil transferase permanece constante.
A formação da ligação peptídica não requer uma
fonte de energia, como ATP ou GTP. A energia da liga
ção metionil (ou peptidil) éster com o tRNA direciona
a reação em direção à formação da ligação peptídica.
A elongação passo a passo continua até que um códon
de terminação (UGA, UUA, ou UAG) ocorra no mRNA.
Note que o códon UGA tem uma função adicional, co
dificando selenocisteína (sec) em um pequeno número
de proteínas (p. 83). O RNA ribossômico é a parte im
portante dos sítios de ligação de tRNA do ribossomo, e
subunidades 60S isoladas podem catalisar a atividade
de peptidil transferase sem o envolvimento de qualquer
fator não-ribossômico. Evidências de muitas fontes in
dicam que a subunidade grande é uma ribozima com
plexa na qual a formação da ligação peptídica é uma
reação catalisada por RNA. Cristalografia de raios-X de
subunidades grandes mostra que a região da transfera
se é composta só por RNA, com a cadeia de aminoácido
mais próxima a pelo menos 20 Å de distância. Elementos
de RNAs ribossômico e transportador estão envolvidos
na ação da transferase. Os nucleotídeos importantes no
sítio transferase foram universalmente conservados na
evolução, de modo que acredita-se que o mesmo me
canismo ocorra em ribossomos de mamíferos, embora
evidências cristalográficas ainda não estejam disponí
veis. Especula-se que o ribossomo primordial seria uma
molécula nua de RNA e que a atividade transferase foi
conservada no RNA.
Como determinado a partir de modelos procarióti
cos, o papel do GTP na ação de EF1a e EF2 está relacio
nado com mudanças conformacionais nessas proteínas.
Estudos cristalográficos mostram um grande rearranjo
de domínios com movimentos de vários angstroms na
hidrólise de GTP em EF-Tu, o equivalente procariótico
de EF1a. Tanto EF1a como EF2 ligam-se fortemente
aos ribossomos como complexos com GTP, enquanto
complexos com GDP dissociam-se do ribossomo mais
facilmente. Visto de outra forma, GTP estabiliza a con
formação da proteína que confere ao EF1a alta afini
dade pelo aminoacil-tRNA e o ribossomo, enquanto
GDP estabiliza a conformação com menor afinidade por
ambos, permitindo assim a entrega de tRNA e a disso
ciação de EF. Restauração da conformação de maior
afinidade associada a GTP de EF1a requer participa
ção de EF1bg, que causa liberação de GDP de EF-1a e
forma um complexo EF1a-EF1bg(Figura 6.9). GTP en
tão causa liberação de EF1bg, formando um complexo
EF1a-GTP que pode ligar um aminoacil-tRNA e depois
um ribossomo. Procariotos usam um mecanismo se
melhante, no qual EF-Tu liga GTP e aminoacil-tRNA e
EF-Ts substitui GDP. Procariotos também utilizam uma
translocase dependente de GTP, cmo EF-2, mas chama
da EF-G ou fator G.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 233

Met Met

E A E A
P P aa
aa

60S 60S

3! 5! 3!
5!

GTP EF1α
40S 40S

(Etapa 2) (Etapa 2a)

aa

GTP EF1α

GDP EF1α + Pi (Etapa 3)

(Etapa 1)

aa

aa GDP EF1βγ

GTP
EF1α
GTP EF1α EF1βγ
(Etapa 5) (Etapa 4)

FIGURA6.9 EF1 no ciclo de elongação.

EF1βγ
Terminação da Síntese do
Polipeptídeo Requer um Códon de
Parada (ou Stop Codon)
Um códon de terminação de cadeia UAG, UAA ou
UGA no sítio A promove a ligação do fator de liberação
(eRF1) (Figura 6.10). A ligação éster peptídeo-tRNA é
clivada pela peptidil transferase, agindo aqui como uma
hidrolase, e o polipeptídeo completo é liberado de seu
tRNA e do ribossomo. A liberação de eRF1 do ribosso
mo segue a hidrólise do GTP ligado e libera o ribossomo
para se dissociar em subunidades e, depois, reentrar no
ciclo de síntese proteica. Uma segunda proteína eRF3
participa desse processo. Embora eRF1 humano seja
Etapa 1: complexo EF1a-GTP-aminoacil-tRNA liga-se ao ri
bossomo. Etapa 2: aminoacil-tRNA é colocado no ribossomo
(etapa 2a) com hidrólise de GTP, uma mudança de conforma
ção de EF1a, e sua liberação do tRNA e do ribossomo (Etapa
3). Etapa 4: GDP é deslocado de EF1a por EF1bg. A ligação de
GTP, então, desloca EF1bg (etapa 5) e permite ligação de um
aminoacil-tRNA a EF1a em sua conformação de maior afinida
de (etapa 1).
uma proteína, é semelhante em tamanho e forma ao
tRNA, e aminoácidos na extremidade de um domínio
da proteína reconhecem e interagem com o códon de
terminação. Esse “mimetismo molecular” também apa
rece na estrutura da EF-G bacteriano, na qual um do
mínio proteico mimetiza o braço do anticódon do tRNA
e funciona na elongação, deslocando o tRNA do subsítio
A para o P na subunidade pequena.
234 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Met
NH3+ Tradução Tem um Custo
Energético Considerável
E P A Há um considerável uso de energia
COO– na síntese de um polipeptídeo. A ativa
A eRF1
GTP ção de aminoácido converte um ATP
60S
em AMP e pirofosfato, que é hidrolisa
do a Pi; o custo final é de dois fosfatos
5!
UAG 3! de alta energia. Mais duas ligações de
40S alta energia são hidrolisadas nas ações
de EF1α e EF2, dando um total de
quatro por ligação peptídica formada.
(Etapa 1) Iniciação, terminação e modificações
pós-tradução podem aumentar o custo
energético. Mais energia é necessária
Met
NH3+ para biossíntese de mRNA multiuso,
tRNAs, ribossomos e fatores proteicos,
mas esses custos são distribuídos de
E P A forma geral entre as proteínas forma
das durante seus tempos de vida.

60S eRF1 GTP

Síntese de Proteínas
5!
UAG 3! em Mitocôndrias Difere
40S Ligeiramente
Muitas características da mitocôn
H2O
E P (Etapa 2) eRF3 dria sugerem que ela seja descendente
Pi de um procarioto aeróbico que esta
Met beleceu uma relação simbiótica com
NH3+
uma célula eucariótica. Parte de sua
independência e seu caráter procari
ótico são mantidos. Embora a maioria
das proteínas mitocondriais seja co
dificada no DNA nuclear, sintetizada
no citosol, e importada em organelas,
60S eRF1 GDP a síntese proteica mitocondrial é im
portante (Correlação Clínica 6.6). Mi
5!
UAG
tocôndrias humanas têm um genoma
3!
de DNA circular com 16.569 pares de
40S bases que codificam 13 proteínas, 22
espécies de tRNA e espécies de rRNA
12S e 16S mitocôndria-específicos.
tRNA Seu aparelho para síntese proteica in
clui RNA polimerase, aminoacil-tRNA
eRF1 sintetases, tRNAs e ribossomos que
GDP
são característicos das mitocôndrias.

FIGURA6.10 Terminação da tradução.

Quando um códon de terminação no mRNA ocupa o sítio A,
ligação de um complexo RF1-GTP ocorre (etapa 1) e tRNA
desacilado é liberado. Etapa 2: a peptidil transferase age
60S 40S
como hidrolase; hidrólise da ligação éster que liga a proteína
ao tRNA libera a proteína. A extremidade aceptora do tRNA
desacilado é provavelmente deslocada, o GTP é hidrolisado,
e fator de liberação-GDP se dissocia. eRF3 promove esses
eventos. Os componentes dissociados podem, agora, entrar
em ciclos adicionais de síntese proteica.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
Alguns detalhes da tradução diferem: Ribossomos mi
tocondriais são menores e os rRNAs são mais curtos do
que os eucariótico citosólicos ou os procarióticos (ver
Tabela 6.7). O código genético é também um pouco di
ferente (ver Tabela 6.2), e assim como os procariotos,
o Met-tRNAimet iniciador é modificado por uma trans
fMet-tRNAimet. usa N10-formil H4-folato para produzir
formilase que Células
devem coordenar síntese protei
ca dentro de mitocôndrias com a síntese citosólica de
proteínas destinadas a importação pelas mitocôndrias.
Muitos Antibióticos e Toxinas
Têm Como Alvo a Biossíntese de
Proteínas
A biossíntese de proteínas é central para a vida e a
reprodução de células. Como um organismo pode ga
nhar uma vantagem biológica interferindo com a capa
cidade de seus competidores sintetizarem proteínas,
muitos antibióticos e toxinas funcionam dessa forma.
Alguns são seletivos para a síntese proteica procarióti
ca e, assim, são extremamente úteis na prática clínica.
Exemplos, mostrando vários mecanismos de ações de
antibióticos, são apresentados na Tabela 6.9.
Muitos antibióticos ligam-se ao ribossomo para ini
bir um aspecto da tradução. Estreptomicina liga-se à
subunidade pequena de ribossomos procarióticos e
causa leitura errada do mRNA (Correlação Clínica 6.6).
Mutações em uma proteína ribossômica ou no rRNA da
subunidade pequena pode conferir resistência a estrep
tomicina ou dependência a ela. Outros antibióticos ami
noglicosídicos, tais como neomicinas e gentamicinas,
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.6
Mutações em rRNA e tRNA Mitocondriais Resultam em Surdez Induzida por Antibiótico
Exemplos de surdez permanente foram ligados ao
uso de antibióticos aminoglicosídeos como estrep
tomicina, paromicina e gentamicina, normalmente
seguros nas quantidades efetivas. A sensibilidade in
comum a aminoglicosídeos é de transmissão mater
na, sugerindo um locus mitocondrial (o espermato
zoide não contribui com mitocôndrias para o zigoto).
Os aminoglicosídeos têm como alvos os ribossomos
bacterianos, de modo que o ribossomo mitocondrial
semelhante ao procariótico é um local lógico para se
procurar um sítio de mutação. Uma única mutação
puntual A→G no DNA mitocondrial, no nucleotídeo
1555 do gene do rRNA 12S foi identificada em famí
lias com essa susceptibilidade a aminoglicosídeos. A
mutação ocorre em uma região muito conservada da
sequência do rRNA que está envolvida na ligação do
aminoglicosídeo; algumas mutações na mesma re
gião conferem resistência aos antibióticos, e a região
• 235
interagem com a subunidade ribossômica pequena em
locais levemente diferentes, mas também causam tra
dução errada. Eritromicina, um antibiótico macrolídeo,
interfere com a translocação de ribossomos procarióti
cos. Os macrolídeos bloqueiam a passagem do peptídeo
nascente pelo ribossomo. Kasugamicina inibe a inicia
ção da tradução; a sensibilidade à kasugamicina depen
de da metilação de bases que normalmente ocorrem
em duas adeninas adjacentes no rRNA da subunidade
pequena. Tetraciclinas ligam-se a ribossomos e interfe
rem na ligação dos aminoacil-tRNAs. Puromicina (Fi
gura 6.11) é parecida com um aminoacil-tRNA; liga-se
ao sítio A da subunidade grande e age como um aceptor
do peptídeo nascente na reação da peptidil transfera
se. Peptidil-puromicina não é translocada e não pode
servir como doador de peptídeo. A tradução é prematu
ramente terminada, e a peptidil-puromicina é liberada.
Cloranfenicol inibe a peptidil transferase ligando-se
ao centro da transferase; não ocorre transferência e o
peptidil-tRNA permanece associado ao ribossomo.
Alguns agentes atuam diretamente no RNA ribossô
mico. Ricina (de mamona) e toxinas relacionadas são
N-glicosidases que clivam uma única adenina do es
queleto de rRNA da subunidade grande. Uma toxina de
fungo, a a-sarcina, quebra o rRNA da subunidade gran
de em um único ponto; em ambos os casos, o ribossomo
é inativado. Algumas cepas de E. coli produzem toxi
nas extracelulares que afetam outras bactérias. Uma
delas, a colicina E3, é uma ribonuclease que quebra o
RNA 16S perto da sequência de ligação ao mRNA e do
sítio decodificador; inativa a subunidade pequena e in
terrompe a síntese proteica em competidores da célula
produtora de colicina. Outros agentes afetam os fatores
de tradução: por exemplo, a translocação eucariótica é
do RNA é parte do sítio decodificador do ribossomo.
É provável que a mutação aumente a afinidade por
aminoglicosídeos e sua capacidade de inibir a síntese
proteica. A síntese proteica reduzida na mitocôndria
diminui os níveis de enzimas do sistema de fosforila
ção oxidativa e as células afetadas ficam deficientes
em ATP. Muitas outras mutações no rRNA e no tRNA
mitocondriais e tRNA estão associadas com perda de
audição e outros problemas.
Fischel-Ghodsian, N., Prezant, T., Bu, X. e Öztas, S. Mi
tochondrial ribosomal RNA gene mutation in a patient with
sporadic aminoglycoside ototoxicity. Am. J. Otolaryngol.
14:399, 1993; Xing, G., Chen, Z., e Cao, X. Mitochondrial rRNA
and tRNA and hearing function. Cell Res. 17:227, 2007; and
Wilson, F. H., Hariri, A., Farhi, A., Zhao, H. et al. A cluster
of metabolic defects caused by mutation in a mitochondrial
tRNA. Science 306:1190, 2004.
236 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
TABELA 6.9 Alguns Antibióticos Inibidores da Tradução
Tipo de Inibidor Exemplo
Aminoglicosídeos Estreptomicina
Neomicinas
Gentamicinas
Paromomicina
Macrolídeos Eritromicina
Telitromicina
Tilocina
Oxazolidinonas Linezolide
Tetraciclinas Tetraciclinas
Glicilciclina
Tiopeptídeos Tiostrepton
Aminonucleosídeos Puromicina
Fonte: Hermann, T. Drugs targeting the ribosome. Curt. Opinion Struct. Biol. 15:355, 2005. Tenson, T. e Mankin, A. Antibiotics and the Ribosome.
Molec. Microbial. 59: 1664, 2006.
inibida pela toxina diftérica, uma proteína produzida
por Corynebacterium diphteriae. A toxina liga-se à
membrana celular e uma subunidade entra no citoplas
ma e catalisa a ADP-ribosilação e inativação de EF2,
como representado na reação
EF-2 + NAD  ADP-ribosil EF-2 + nicotinamida + H+
(ativo) (inativo)
ADP-ribose é ligado a EF2 num resíduo de diftami
na, que é uma forma modificada pós-tradução da his
tidina (ver Figura 6.20). Pseudomonas aeruginosa
produz uma exotoxina similar.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.7
Deleção de um Códon, Enovelamento Incorreto e Degradação Prematura: Fibrose Cística (OMIM 219700)
Fibrose cística (CF) é a doença autossômica recessi
va mais comum em caucasianos, com uma frequência
de cerca de 1 em 2.000. O gene CF tem 230 kb de com
primento e inclui 27 exons que codificam uma proteí
na de 1.480 aminoácidos. A proteína conhecida como
regulador de condutância transmembrânica da fibrose
cística ou CFTR (p. 515) é um canal de cloreto regu
lado por AMP cíclico. Ela contém dois domínios que
atravessam a membrana, cada um com seis regiões
transmembrânicas, dois domínios de ligação a ATP, e
um domínio regulatório que inclui vários sítios de fos
forilação. Sua complexa via de dobramento é influen
ciada por vários chaperones.
Os epitélios na CF caracterizam-se pelo transporte
defeituoso de eletrólitos. Os órgãos mais fortemente
afetados incluem os pulmões, o pâncreas e o fígado,
e os efeitos que mais ameaçam a vida envolvem se
creções mucosas muito viscosas, que levam à doença
pulmonar obstrutiva crônica e a infecções persisten
tes nos pulmões. Em cerca de 70% dos pacientes, há
uma deleção dos três nucleotídeos que codificam a
fenilalanina 508, normalmente localizada no domínio
Processo Afetado Local de Ação
Códon-anticódon Subunidade pequena
Fidelidade de interação Centro decodificador
Translocação Subunidade grande
peptidil transferase
Formação ligação peptídica Sítio A Subunidade grande
Ligação do aminoacil-tRNA Sítio A Subunidade pequena
Elongação Centro GTPase Subunidade grande
Sítio A Subunidade grande
6.4 MATURAÇÃO DE
PROTEÍNAS: DOBRAMENTO,
MODIFICAÇÃO, SECREÇÃO
E DIRECIONAMENTO
Algumas proteínas emergem do ribossomo prontas
para funcionar, enquanto outras sofrem várias modifi
cações pós-tradução. O resultado pode ser conversão
em uma forma funcional, direcionamento para um com
partimento subcelular específico, secreção da célula,
1 de ligação ao ATP, no lado citoplasmático da mem
brana plasmática. Como em várias outras mutações
CF, a proteína com deleção da Phe 508 não se dobra
corretamente no ER e não é corretamente glicosilada
ou transportada para a superfície celular. Em vez dis
so, é degradada no citoplasma. No entanto, em células
cultivadas em baixas temperaturas ou com adição de
chaperones químicos como glicerol, a proteína mutan
te dobra-se, é transportada e funciona adequadamen
te. Drogas que simulam a interação de chaperone com
a CFTR mutante, e/ou auxiliam em seu dobramento
e transporte para a membrana, são uma abordagem
terapêutica em potencial para essa forma de fibrose
cística.
Cheung, J. C., e Deber, C. M. Misfolding of the cystic fibro
sis transmembrane conductance regulator and disease. Bio
chem. 47:1465, 2008; Plemper, R. K. e Wolf, D. H. Retrograde
protein translocation: Eradication of secretory proteins in
health and disease. Trends Biochem. Sci. 24:266, 1999; e
Egan, M. E., Pearson, M., Weiner, S. A., Rajendran, V. et al.
Curcumin, a major constituent of turmeric, corrects cystic
fibrosis defects. Science 304:600, 2004.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 237

ou uma alteração em atividade ou estabilidade. A infor se pancreática completamente desnaturada pode, em

mação que determina o destino pós-tradução de uma condições laboratoriais adequadas, dobrar novamente
proteína reside, em última análise, em sua estrutura; a e gerar as pontes dissulfeto corretas e a atividade to
sequência e a conformação da proteína determinam se tal. Muitas proteínas recém-sintetizadas dobram cor
ela será um substrato para uma enzima modificadora retamente à medida que emergem do ribossomo. En
e/ou a identificam para direcionamento a uma localiza tretanto, outras proteínas requerem a assistência de
ção subcelular ou extracelular. chaperones (p. 120), que se ligam reversivelmente às
regiões hidrofóbicas de proteínas nascentes e de pro
teínas em um estágio intermediário de dobramento.
NH2 Suas ações podem ajudar uma proteína a chegar à sua
N conformação funcional. Chaperones podem estabilizar
N intermediários e promover o dobramento correto, man
ter proteínas em um estado desdobrado para permitir
N N
a passagem através de membranas, ajudar a desdobrar
tRNAOCH2 O segmentos dobrados erroneamente, impedir a formação
de intermediários dobrados incorretamente, e impedir
a agregação ou outras interações incorretas com outras
O OH proteínas. Eles também podem auxiliar no desdobra
H2N CHC mento de proteínas destinadas à degradação. Alguns
O utilizam energia da hidrólise de ATP para executar
CH2
suas funções. A incapacidade de dobrar corretamente
geralmente leva à rápida degradação da proteína (Cor
relação Clínica 6.7). O acúmulo de proteínas dobradas
erroneamente pode resultar na agregação da proteína e
em doença grave (ver Correlação Clínica 6.14).
OH
Extremidade 3' tirosil-tRNA

CH3 CH3
Proteínas para Exportação Seguem a
N Via Secretória
N As proteínas destinadas à exportação e aquelas
N
destinadas à membrana plasmática, lisossomos, endos
N N somos ou sistema de Golgi são sintetizadas em ribosso
mos ligados às membranas do retículo endoplasmático
HOCH2 O rugoso (ER) (Figura 6.12).

NH OH

H2N CH
CH C
O
2

OCH3
Puromicina

FIGURA6.11 Puromicina (inferior) termina tradução por

ligar-se à subunidade grande do sítio A e atuar como um
análogo do aminoacil-tRNA [aqui tirosil-tRNA (superior)].
O α-amino grupo é um aceptor da peptidil transferase, e pepti
dil-puromicina dissocia-se do ribossomo.

Chaperones Ajudam no Dobramento

da Proteína
Muitas proteínas podem espontaneamente gerar
suas conformações nativas. Por exemplo, a ribonuclea
FIGURA6.12 Retículo endoplasmático rugoso.
Três setas paralelas indicam três ribossomos dentre os mui
tos ligados às membranas. Seta única indica uma mitocôndria,
para comparação.
Cortesia de Dr. U. Jarlfors, University of Miami.
238 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Essas proteínas têm um peptídeo

sinal hidrofóbico, geralmente na, ou
perto da, extremidade amino-termi
Membrana do ER
nal. Peptídeos sinal possuem uma re
Proteína de gião N-terminal com carga positiva e
aportamento Receptor
do ribossomo um cerne (core) de 8-12 aminoácidos
(docking)
hidrofóbicos em uma α-hélice segui
NCitoplasma ETAPA D dos de um segmento C-terminal mais
polar, que eventualmente serve como
ETAPA C ponto de clivagem para a excisão do
N peptídeo sinal. A tradução começa em
ETAPA B Lúmen ribossomos citosólicos livres. Quando
do ER o peptídeo sinal de 15-30 aminoácidos
emerge do ribossomo, ele se liga a uma
N partícula de reconhecimento do sinal
Peptidase
(SRP) (Figura 6.13). A SRP é com
sinal posta por seis proteínas diferentes e
uma molécula pequena de RNA (7S).
O peptídeo sinal liga-se em um bolsão
hidrofóbico da SRP, com o segmento
ETAPA A
N-terminal carregado positivamente
Ribossomo
SRP em contato com RNA da SRP.
Peptidase sinal
A tradução para; o complexo liga
mRNA
-se ao GTP e se move para o ER, onde
SRP se liga ao complexo GTP de um
FIGURA6.13 Via secretória: Reconhecimento do peptídeo sinal. receptor de SRP ou proteína de apor
Etapa A: Um peptídeo sinal hidrofóbico emerge de um ribossomo livre para o citosol. tamento (docking), na superfície cito
Etapa B: Uma partícula de reconhecimento de sinal (SRP) liga-se ao peptídeo sinal e a
sólica da membrana do ER. O ribosso
elongação é temporariamente paralisada. Etapa C: O ribossomo move-se para a mem
brana do ER, onde uma proteína de aportamento (docking) liga-se a SRP. Etapa D: O
mo é transferido para um translocon,
um receptor do ribossomo que cruza
ribossomo é transferido para um receptor (ou translocon), a elongação é retomada e a
proteína recém-sintetizada passa através da membrana para o lúmen do ER. a membrana e funciona como uma
passagem através da membrana. GTP
é hidrolizado e a SRP é liberada, relaxando o bloqueio
UM OLHAR MAIS ATENTO 6.3 da tradução. A passagem do translocon abre-se para
permitir o trânsito da proteína nascente, a sequência
Chaperones do Retículo Endoplasmático sinal hidrofóbica é inserida, e a tradução e a extrusão
Família Chaperone Função para dentro, ou através, do translocon está agora acopla
da. Mesmo segmentos muito hidrofílicos ou carregados
Hsp40 Auxilia Hsp70
são direcionados através da membrana para o lúmen do
Hsp70 Dobramento de proteínas ER. Os chaperones auxiliam o drobamento da proteína
geral do ER co- ou pós-tradução (Um Olhar Mais Atento 6.3). Pon
Hsp90 Dobramento de proteínas tes dissulfeto podem ser formadas com a participação
geral do ER de tiol óxido-redutases, e os componentes de proteínas
Hsp100 Incerta multi-subunidades podem se organizar. O peptídeo sinal
tipo GrpE Auxilia Hsp70 é excisado pela peptidase sinal, uma proteína integral de
Lectinas Dobramento de glicoproteínas membrana da face luminal do ER. Outras etapas podem
Ligada a ribossomos Auxilia Hsp70 incluir o processamento proteolítico e a glicosilação, que
ocorre no lúmen do ER e durante o trânsito da proteína
PDI Formação de pontes
pelo complexo de Golgi e em vesículas secretórias.
dissulfeto
PPI Peptidil-prolina cis-trans
isomerização Glicosilação de Proteínas Ocorre
Outros Dobramento de proteínas
específicas
no Retículo Endoplasmático e no
Herbert, D. N. e Molinari, M. In and out of the ER: Pro
Complexo de Golgi
tein folding, quality control, degradation, and related hu A glicosilação de proteínas para formar glicoproteí
man diseases. Physiol. Rev. 87:1377, 2007. nas (p. 115) é importante por muitas razões. A glicosi
lação altera as propriedades das proteínas, modificando
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
TABELA 6.10 Glicosiltransferases em Células Eucarióticas
Açúcar Transferido Abreviatura
Manose Man
Galactose Gal
Glicose Glc
Fucose Fuc
N-Acetilgalactosamina GalNAc
N-Acetilglucosamina GlcNAc
Ácido N-acetilneuramínico NANA ou NeuNAc
(ou ácido siálico) SA
sua estabilidade, solubilidade e volume físico. Os resí
duos de carboidratos podem ser sinais de reconheci
mento que direcionam interações e direcionamento das
proteínas. Os sítios de glicosilação são especificados
pelo aminoácido e sua sequência vizinha na proteína.
Glicosiltransferases, cujas classes estão resumidas na
Tabela 6.10, desempenham todas uma reação básica
semelhante: um açúcar é transferido de um substrato
doador ativado para um aceptor apropriado, geralmente
outro resíduo de açúcar que é parte de um oligossacarí
deo em construção. As enzimas apresentam especifici
dade para o monossacarídeo que é transferido, a estru
tura e a sequência do aceptor, e o sítio e configuração
da ligação anomérica formada.
Na glicosilação N-ligada, um oligossacarídeo é liga
do pelo nitrogênio da amida da asparagina. A formação
de oligossacarídeos N-ligados começa no lúmen do ER
e continua no complexo de Golgi. Uma sequência espe
cífica, Asn-X-Thr (ou Ser), na qual X pode ser qualquer
aminoácido exceto prolina, é necessária. Nem todas as
sequências Asn-X-Thr/Ser são glicosiladas porque al
gumas podem não estar acessíveis para modificação. O
antibiótico tunicamicina impede a N-glicosilação.
A glicosilação N-ligada é iniciada com um inter
mediário ligado a lipídeo (Figura 6.14). O dolicol fos
fato na superfície citoplasmática da membrana do ER
serve como glicosil-aceptor para N-acetilglucosami
na. A glicosilação passo a passo e a formação de um
(Man)5(GlcNAc)2-pirofosforil-dolicol ramificado no
lado citosólico da membrana ocorre. Esse intermediá
rio é, então, reorientado para a superfície luminal da
membrana do ER, e quatro manoses adicionais e três
glicoses são adicionadas. Um oligossacariltransfera
se complexo ligado à membrana então transfere o oli
gossacarídeo completo de seu dolicol carregador para
um resíduo de asparagina do polipeptídeo, quando ele
emerge no lúmen do ER. Note que a N-glicosilação é
cotradução; ocorre enquanto a proteína está sendo sin
• 239
Doador Glicosiltransferase
GDP-Man Manosiltransferase
Dolicol-Man
UDP-Gal Galactosiltransferase
UDP-Glc Glucosiltransferase
Dolicol-Glc
GDP-Fuc Fucosiltransferase
UDP-GalNAc N-Acetilgalactosaminiltransferase
UDP-GlcNAc N-Acetilglucosaminiltransferase
CMP-SA
CMP-NANA N-Acetilneuraminiltransferase
(sialiltransferase)
tetizada e pode afetar o dobramento (folding) da pro
teína.
Glicosidases e glicosiltransferases agora modifi
cam o oligossacarídeo recém-transferido. Resíduos de
glicose, que foram necessários para transferir o oligos
sacarídeo do carregador dolicol, são removidos. A gli
coproteína dobrada é transportada para um comparti
mento intermediário ER-Golgi, onde a seleção ocorre
e, depois, para o complexo de Golgi. Cortes adicionais
podem ocorrer agora, ou açúcares adicionais podem
ser adicionados. Os oligossacarídeos N-ligados resul
tantes são diversificados, mas duas classes são diferen
ciadas. Ambas têm uma região central (core) comum
(GlcNAc2Man3) ligada a asparagina e que se origina
do intermediário ligado ao dolicol. O tipo alta-manose
(high-mannose) inclui resíduos de manose em várias
ligações e apresenta menos processamento a partir do
intermediário ligado a dolicol. O tipo complexo é mais
processado e diversificado, com uma maior variedade
de açúcares e ligações (Figura 6.15).
Na glicosilação O-ligada, oligossacarídeos são liga
dos por meio de grupos hidroxila de serina ou treonina
das proteínas (p. 115). A glicosilação O-ligada ocorre só
depois de a proteína ter chegado ao complexo de Gol
gi; portanto, a O-glicosilação é pós-tradução e ocorre
somente em proteínas dobradas. Não há sequência de
aminoácidos definida na qual a serina ou a treonina deva
ocorrer, mas apenas resíduos na superfície da proteína
servem como aceptores para a GalNAc-transferase que
liga a N-acetilgalactosamina. Segue-se a adição passo
a passo de açúcares ao GalNAc aceptor. Os oligossaca
rídeos formados dependem dos tipos e das quantida
des de glicosiltransferases em uma dada célula. Se um
aceptor for um substrato para mais de uma transferase,
a quantidade de cada transferase influencia a compe
tição entre elas. O crescimento dos oligossacarídeos
encerra-se quando são formadas estruturas que não
são mais aceptoras para qualquer outra glicosiltransfe
240 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

rase presente. Isso pode resultar em diferentes estrutu

ras de oligossacarídeos em polipeptídeos idênticos, de
modo que heterogeneidade em glicoproteínas é comum
(Figura 6.16).

Lado Lado citoplasmático

do
lúmendpER P Dolicol fosfato

ETAPA A UDP GlcNAc

UMP

ETAPA B PP UDP

PP
GDP (5)

ETAPA C GDP (5)

PP

Reorientação

ETAPA D
(4) P

PP
FIGURA 6.14 Biossíntese de
(3)
oligossacarídeos N-ligados no retículo
endoplasmático.
P
Etapa A: a síntese começa sobre a face cito
plasmática da membrana do ER, com a trans (3) P ETAPA E
ferência de uma N-acetilglucosamina fosfato
para um dolicol aceptor. Etapa B: a formação
da primeira ligação glicosídica açúcar-açúcar
PP
ocorre após a transferência de um resíduo
de N-acetilglucosamina. Etapa C: cinco re
síduos de manose (de GDP-manose) são Ribossomo
adicionados sequencialmente, e o oligossa
os ETAPA F
face
são
dolicol.
carídeo
adicionais
transferidos
luminal
Dolicol-açúcares
ligadoda
de
a membrana.
lipídeo
manose
de intermediários
ésão
ereorientado
(Etapa
Etapa
gerados
E)
D:
ligados
aresídu-
glicose
para
partira N

de nucleosídeo difosfato-açúcares citoplas

máticos. Etapa F: o oligossacarídeo completo
é transferido para um polipeptídeos nascen
te na superfície da membrana; peptídeo sinal
pode já ter sido clivado nesse ponto. N-Acetilglucosamina (GlcNAc) PDolicol fosfato Manose Glicose
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 241

α 1,6 Região do core comum

α 1,2

α1,6
α 1,3
α 1,2
β1,4 β1,4 β Asparagina

α 1,3

α 1,2 α 1,2

TIPO ALTA MANOSE

Região do core comum

α 2,3 β 1,4 β 1,2 α 1,6

Asparagina
β 1,4 β 1,4 β
α 1,3
α2,6 β1,4 β1,2
FIGURA 6.15 Estrutura de
oligossacarídeos N-ligados.
TIPO COMPLEXO
Tipos básicos de oligossacarídeos N-liga
dos são mostrados. Cada estrutura é de
rivada do oligossacarídeo inicial ligado ao
Ácido siálico (N-Acetylneuraminic acid) Manose dolicol por ação de glicosidases e glicosil
transferases. Note a variedade de ligações
N-Acetilglucosamina Galactose
glicosídicas envolvidas.

6.5 DIRECIONAMENTO PARA o GlcNAc, formando um oligossacarídeo que contém ma

MEMBRANA E ORGANELAS
O transporte de proteínas do ER para e pelo com
plexo de Golgi, e além, usa vesículas carregadoras
multi-proteínas. Só proteínas corretamente dobradas
são reconhecidas como carga para transporte, e tanto
chaperones gerais como proteína-específicos do ER aju
dam o dobramento e favorecem a formação de pontes
dissulfeto corretas. A rede de chaperones também atua
em pontos de verificação (checkpoints) no transpor
te ER-Golgi para reconhecer proteínas mal dobradas
ou danificadas, que são devolvidas para o citosol para
degradação no processo de degradação ER-associada
(ERAD). A seleção de proteínas para seus destinos fi
nais ocorre em conjunção com sua glicosilação e que
bra proteolítica, à medida que passam pelos elementos
cis, medial e trans do complexo de Golgi. Famílias de
vesículas e proteínas receptoras dão especificidade ao
direcionamento e à fusão de membranas.
Seleção de Proteínas na Via
Secretória
O direcionamento de glicoproteínas específicas para
os lisossomos é bem conhecido. No cis Golgi, um aspecto
da estrutura terciária permite que proteínas lisossomais
sejam reconhecidas por uma glicosiltransferase que liga
N-acetilglucosamina fosfato (GlcNAc-P) a oligossacarí
deos do tipo alta manose. Uma glicosidase então remove
nose 6-fosfato (Figura 6.17), que determina a comparti
mentalização e o transporte vesicular dessas proteínas
para os lisossomos. Outras cadeias oligossacarídicas da
proteína podem ser mais processadas, para formar estru
turas tipo-complexas, mas a manose 6-fosfato determina
seu destino lisossomal. Pacientes com doença da célula
I não têm a GlcNAc-P glicosiltransferase, são incapazes
de marcar as enzimas lisossomais para seu destino e,
em vez disso, as secretam da célula (Correlação Clínica
6.8). Deficiências genéticas de muitas enzimas lisosso
mais conduzem a doenças, algumas das quais podem ser
moduladas pela usando o mecanismo de direcionamento
(Correlações Clínicas 6.9 e 18.5).
A via secretória direciona proteínas para os lisos
somos, para a membrana plasmática ou para secreção
para fora da célula. Proteínas do ER e do complexo
de Golgi são direcionadas por uso parcial da via. Por
exemplo, a localização de proteínas em qualquer lado
de ou atravessando a membrana do ER pode utilizar a
partícula de reconhecimento de sinal de modos diferen
tes (Figura 6.18). Às vezes, a sequência sinal não está
próxima da extremidade amino terminal da proteína,
mas em algum lugar a jusante, onde SRP se liga. Um
domínio amino terminal permanece na superfície cito
plasmática, e a sequência sinal e o segmento C-terminal
passam pelo translocon. Sequências de ancoragem hi
drofóbicas em uma proteína podem mergulhar na mem
brana e, ainda assim, permitir que boa parte da sequ-
ência permaneça na superfície citosólica ou seja retida
na superfície luminal da membrana do ER. Múltiplas
242 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Manα1,2Manα1,2Manα1,3
Manβ1,4GlcNAcβ1,4GlcNAcβAsn 1

Manα1,2Manα1,6
Manα1,6
Manα1,2Manα1,3

GalNANAα2,6β1,4GlcNAcβ1,2
Manα1,6
NANAα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,4

Manβ1,4GlcNAcβ1,4GlcNAcβAsn 2
NANAα2,6Galβ1,4GlcNAcβ1,6

NANAα2,6Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcNAcβ1,2Manα1,3
AsnManβ1,4
GlcNAcβ1,4GlcNAcβ 3
Fucα1,2(Galβ1,GlcNAcβ1,3) Galβ1,4GlcNAcβ1,2Manα1,6
5

NANAα2,6GalNAcαSer/Thr 4
FIGURA6.16 Exemplos de estrutura
de oligossacarídeo.
Fucα1,2Galβ1,3GlcNAcβ1,3GalNAcαSer/Thr 5
As estruturas 1-3 são oligossacarídeos
N-ligados típicos dos tipos alta-manose
NANAα2,3Galβ1,3
(1) e complexo (2, 3); note a estrutura
NANAα2,6 GalNAcαSer/Thr 6
do core comum do resíduo de aspara
gina da proteína até o primeiro ponto
de ramificação. As estruturas 4-8 são NANAα2,3Galβ1,4
oligossacarídeos O-ligados comuns, que Fucα1,3 GalNAcβ1,3GalNAcαSer/Thr 7
podem ser bastante simples ou muito
complexos. Note que embora a estrutu
ra do core (GalNAc-Ser/Thr) seja dife
rente dos oligossacarídeos N-ligados, a GlcNAcα1,4Galβ1,4GlcNAcβ1,3
extremidade pode ser muito semelhan Galβ1,3
te (por exemplo, as estruturas 2 e 6, 3 Fucα1,2Galβ1,4GlcNAcβ1,6 GalNAcα
e 7). Abreviaturas: Man = manose; Gal Fucα1,2GaIβ1,4GlcNAcβ1,6 Ser/Thr 8
= galactose; Fuc = fucose; GlcNAc =
N-acetilglucosamina; NANA = ácido N
-acetilneuramínico (ácido siálico).
Manose Ácido N-Acetilneuramínico Fucose N-Acetilglucosamina
Adaptado de Paulson, J. Trends Bio
N-Acetilgalactosamina Galactose Serina/Treonina/Asparagina
chem. Sci. 14:272, 1989.

sequências de ancoragem em um único polipeptídeo
podem fazê-lo atravessar a membrana várias vezes e,
assim, reter grande parte mergulhada na membrana.
Tais sequências hidrofóbicas são separadas por alças
polares, cuja orientação é determinada por resíduos
flanqueadores carregados positivamente que predomi
nam no lado citoplasmático da membrana.
Outros sinais de seleção determinam como proteí
nas são direcionadas (como carga) para subcomparti
mentos do Golgi, vários grânulos de armazenamento
e secreção e elementos específicos da membrana plas
mática. Por exemplo, proteínas solúveis são retidas no
lúmen do ER em resposta a uma sequência KDEL (Lys
-Asp-Glu-Leu) C-terminal. Uma sequência diferente em
um C-terminal exposto sinaliza retenção na membrana
do ER. Alguns domínios transmembrânicos resultam
em retenção no Golgi. Glicosilação e sulfatação polipep
tídeo-específica de alguns hormônios glicoproteicos da
pituitária anterior são mediadores de sua seleção para
grânulos de armazenamento.
Modificação por ácido polisiálico de uma proteína de
adesão de célula neural é específica para a proteína e
regulada durante desenvolvimento.
Importação de Proteínas por
Mitocôndrias É Complexa
Mitocôndrias fornecem um problema de direciona
mento especial, e defeitos no sistema podem levar a
doenças (Correlação Clínica 6.10). A maioria das prote
ínas mitocondriais é sintetizada no citosol por ribosso
mos livres como pré-proteínas maiores. Pré-sequências
N-terminais marcam a proteína para a mitocôndria; o
sinal de direcionamento não é uma sequência específi
ca, mas uma α-hélice anfifílica carregada positivamen
te que é reconhecida por um receptor mitocondrial. As
pré-proteínas são transportadas com a ajuda de chape
rones para as mitocôndrias e são translocadas (desdo
bradas) primeiro através da membrana externa por um
complexo translocase da membrana externa (TOM) e
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
Proteína
ETAPA 1
P UDP
ETAPA 2
Manose
UMP
ETAPA 3
P -natal das duas doenças é possível, mas ainda não
N-Acetilglucosamina Glucose
FIGURA6.17 Direcionamento de enzimas para lisossomos.
Glicoproteína N-ligada completa dobrada é liberada da membrana
do ER e, antes do transporte para o complexo de Golgi, glicosidases
removem resíduos de glicose (etapa 1). Um resíduo de manose pode
também ser removido. Etapa 2: No complexo de Golgi, uma glicosil
transferase liga um ou, às vezes, dois resíduos de N-acetilglucosa
mina fosfato ao oligossacarídeo. Etapa 3: Uma glicosidase remove
N-acetilglucosamina, deixando um ou dois resíduos de manose
6-fosfato no oligossacarídeo. A proteína é, então, reconhecida por
um receptor de manose 6-fosfato e direcionada para vesículas que
se destinam aos lisossomos.
Adaptado de Kornfeld, R. e Kornfeld, S. Annu. Rev. Biochem.
54:631, 1985.
depois para a matriz mitocondrial (ou a membrana interna)
por um complexo translocase da membrana interna (TIM)
em reações dependentes de energia. A passagem ocorre em
pontos de adesão, onde as membranas interna e externa
• 243
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.8
Doenças de Direcionamento para Lisossomos:
Doença da Célula I
A doença da célula I (mucolipidose II) surge
de defeitos no direcionamento de enzimas lisos
somais, em decorrência da deficiência da Glc
Nac-1-fosfotransferase, a enzima que transfere
N-acetilglucosamina fosfato para oligossacaríde
os do tipo alta manose de proteínas destinadas
aos lisossomos. A enzima hexamérica inclui três
tipos de subunidades codificadas em dois genes,
GNPTAB e GNPTG. Os fibroblastos dos indivíduos
afetados apresentam corpos de inclusão densos
(daí células I) e não têm atividade da fosfotrans
ferase; múltiplas enzimas lisossomais são secre
tadas para o meio, e níveis elevados de enzimas
lisossomais estão presentes no plasma e em ou
tros líquidos corporais dos pacientes. A doença é
caracterizada por severo retardo psicomotor, mui
tas anomalias esqueléticas, características faciais
grosseiras e movimento articular restrito. Os sin
tomas são geralmente observados ao nascimento
e progridem até a morte, geralmente por volta de
8 anos de idade. Quase todos os pacientes apre
sentam mutações com mudança na fase de leitura
(frameshift) ou na terminação da cadeia no gene
GNPTAB.
Polidistrofia pseudo-Hurler (mucolipidose III)
é uma doença relacionada, porém menos grave, na
qual a atividade da fosfotransferase está reduzida,
mas não completamente ausente. O início é geral
mente retardado até a idade de 2-4 anos, a doença
progride mais lentamente, e os pacientes podem
sobreviver até a idade adulta. O diagnóstico pré
existe tratamento definitivo.
Kornfeld, S. Trafficking of lysosomal enzymes in
normal and disease states. J. Clin. Invest. 77:1, 1986;
e Braulke, T., Pohl, S. e Storch, S. Molecular analysis
of the GlcNac-1-phosphotransferase. J. Inherit. Metab.
Dis. 31:253, 2008.
ficam unidas, e várias proteínas intermembranas es
tão envolvidas. Proteases removem o sinal de dire
cionamento para a matriz, mas podem deixar outras
sequências que ainda selecionam a proteína dentro
da mitocôndria, de volta para a a membrana interna,
via um complexo TIM diferente, ou para o espaço in
termembranas.
Por exemplo, em resposta a uma sequência hidro
fóbica, um precursor dobrado do citocromo b2 é leva
do da matriz, de volta através da membrana interna;
244 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.9

Terapia por Reposição de Enzima para Doenças Lisossomais de Acúmulo

Várias doenças surgem de uma deficiência genética
de uma única enzima hidrolítica em lisossomos (ver
Correlação Clínica 18.5), levando ao acúmulo de ma
terial não-degradado. Muitas dessas doenças são alvos
de terapia por reposição enzimática (ERT), na qual
a administração endovenosa da enzima humana pu
rificada, que é competente para captação lisossomal,
pode melhorar os sintomas (mas não curar o defeito
subjacente).
A mucopolissacaridose tipo I é causada por defeitos
na α-L-iduronidase, uma enzima lisossomal que age na
degradação de glicosaminoglicanos. Mais de 70 muta
ções foram identificadas, e os sintomas variam de se
vero retardo mental e morte precoce na infância (sín
drome de Hurler), até efeitos mais brandos, incluindo
perda de audição e opacidade de córnea, mas inteligên
cia e tempo de vida normais. Terapia de reposição en
zimática usando enzima humana normal recombinante
foi aprovada em 2003 e resulta em redução significativa
dos sintomas. A mucopolissacaridose tipo II (deficiência
de iduronato-2-sulfatase) e a mucopolissacaridose tipo
VI (síndrome de Maroteaux-Lamy, deficiência de N-ace
tilgalactosamina) também foram aprovadas para ERT.
A doença de Gaucher resulta da deficiência de uma
glucocerebrosidase, e no acúmulo de glucocerebrosí
deo. Os sintomas na doença de Gaucher tipo I incluem
hepatoesplenomegalia e muitos problemas ósseos; ERT,
especialmente em crianças pequenas, tem sido bem-su
cedido na redução da gravidade da doença. A doença
de Pompe infantil resulta da deficiência de α-1,4-glu
cosidase ácida; ela leva ao acúmulo de glicogênio em
lisossomos e miopatia cardioesquelética. A doença de
Fabry, causada por uma α-galactosidase-A defectiva,
resulta no acúmulo de esfingolipídeo e dano aos órgãos,
que surgem aos 6-8 anos de idade eleva à morte na meia
idade. ERT nessas doenças tem mostrado algum suces
so, mas o custo das enzimas purificadas para todas es
sas terapias é muito elevado.
Yogalingam, G., Guo, X.-L., Muller, V. J., Brooks, D. A. et
al. Identification and molecular characterization of α-L-idu
ronidase mutations present in mucopolysaccharidosis type I
patients undergoing enzyme replacement therapy. Hum. Mu
tat. 24:199, 2004; e Burrow, T. A., Hopkin, R. J., Leslie, N. D.,
Tinkle, B.T. e Grabowski, G. A. Enzyme reconstitution/repla
cement therapy for lysosomal storage diseases. Curr. Opin.
Pediatr. 19:628, 2007.

proteólise adicional o libera no espa

NNCNC ço intermembranas. Diferentemente,
N citocromo c apoproteína (sem heme)
LúmendoER
Citoplasma
liga-se à membrana externa e passa
para o espaço intermembranas. Lá
adquire seu heme e sofre uma mu
dança conformacional que assegura
sua retenção. Proteínas da membra
na externa também são direcionadas
para o complexo TOM, mas sequên
C cias de ancoragem as orientam e re
C têm, tanto embebidas na membrana
(a) (b) (c) (d)
como com domínios globulares sobre
a superfície da membrana externa da
FIGURA6.18Topologia de proteínas em membranas do retículo mitocôndria.
endoplasmático.
Proteínas são mostradas em várias orientações com relação à membrana. Em (a) a
proteína é ancorada à superfície luminal da membrana por um peptídeo sinal não
-clivado. Em (b) a sequência sinal não está na extremidade N-terminal; um domínio da
proteína foi sintetizado antes da emergência do peptídeo sinal. Inserção da sequência
sinal interna, seguida por complementação da tradução, resultou em uma proteína
com um domínio N-terminal citoplasmático, um segmento central que atravessa a
membrana, e um domínio C-terminal no lúmen do ER. (c) Uma proteína com a orien
tação oposta: uma sequência sinal N-terminal, que também poderia ter sido clivada
pela peptidase sinal, resultou em extrusão de um segmento da proteína no lúmen do
ER. Uma sequência hidrofóbica de ancoragem permaneceu associada à membrana e
impediu a continuação da passagem da proteína através da membrana, formando as
sim um domínio C-terminal citoplasmático. Em (d) vários sinais internos e sequências
de ancoragem permitem que vários segmentos da proteína fiquem orientados em cada
lado da membrana.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.10
Importação Mitocondrial de Proteína Defectiva e Doença
Direcionamento ineficiente para mitocôndrias
pode ter importantes consequências. Acidemia lática
resultante de deficiências no complexo piruvato desi
drogenase (PDH) tem sido associada a mutações em
vários genes, mais comumente a subunidade X-ligada
E1a. Uma mutação puntual resultando em uma subs
tituição Arg→Pro no sinal de direcionamento mito
condrial resulta na importação reduzida de E1a, baixa
atividade de PDH, e múltiplos sintomas, neurológicos
e outros. Direcionamento errado para mitocôndrias
ocorre em alguns casos de hiperoxaluria primária tipo
1. Alanina/glioxilato aminotransferase normalmente
catalisa a conversão de glioxilato em glicina nos pe
roxissomos. Mutações puntuais separadas, que criam
um sinal de direcionamento mitocondrial e alteram o
dobramento e a dimerização da enzima, resultam na
localização da enzima na mitocôndria; função pero
xissomal reduzida; deposição de oxalato no rim, trato
urinário e em outros locais; e eventual insuficiência
renal. Seleção e localização errada nas mitocôndrias,
em alguns casos, é um fator de doença hepática seve
ra em alcoólatras. A manganês superóxido dismutase
(MnSOD) está normalmente localizada na matriz mi
Sinais de Direcionamento
Encaminham Proteínas para
Organelas Específicas
O núcleo deve importar proteínas que são sinteti
zadas no citosol. Proteínas nucleares são direcionadas
por sinais de localização que incluem dois grupos sepa
rados de aminoácidos básicos ou, às vezes, uma única
sequência básica. Eles interagem com proteínas carre
gadoras (por exemplo, importinas), que os transportam
através dos complexos poros nucleares cilíndricos que
atravessam a membrana nuclear. O transporte requer a
GTPase Ran. Uma classe diferente de proteínas regu
latórias faz o transporte entre o citoplasma e o núcleo
para transmitir sinais para ativar a transcrição.
Fosforilação de uma sequência SPS (Ser-Pro-Ser) ou
TPT (Thr-Pro-Thr) induz a captação nuclear.
Os peroxissomos importam suas proteínas da matriz
a partir do citosol, e podem precisar ajustar seu conteúdo
enzimático para atender às necessidades celulares. Um
sinal de direcionamento é o tripeptídeo carboxi-terminal
Ser-Lys-Leu (SKL), que interage com um transportador
de ligação à carga para levar à membrana do peroxisso
mo para encaixe, translocação, e liberação na matriz.
Um nonapeptídeo N-terminal também funciona como
• 245
tocondrial. Valina (em lugar de alanina) na posição 16
na sequência de direcionamento resulta na retenção
parcial da enzima na membrana mitocondrial interna,
atividade de MnSOD reduzida, e capacidade reduzida
de detoxicar as espécies reativas de oxigênio que são
geradas pelo consumo de álcool.
Defeitos em proteínas dos mecanismos de impor
tação e seleção também podem resultar em doenças.
A síndrome da surdez distonia foi ligada a defeitos no
componente TIM Tim 8 (ver Correlação Clínica 6.6 para
uma causa diferente de surdez relacionada a mitocôn
drias). Defeitos no Tim 14 foram ligados a uma rara
cardiomiopatia com ataxia. Níveis diminuídos do cha
perone Hsp60 da matriz mitocondrial estão ligados a
número reduzido e morfologia atípica de mitocôndrias
e a casos de paraplegia espástica e insuficiência multi
sistêmica.
Robinson, B. H. Lactic acidemia and mitochondrial dise
ase. Mol. Genet. Metab. 89:3, 2006; e Mackenzie, J. A., and
Payne, R. M. Mitochondrial protein import and human health
and disease. Biochim. Biophys. Acta 1772:509, 2007.
sinal de direcionamento, utilizando um complexo trans
portador diferente. Algumas proteínas da membrana do
peroxissomo são sintetizadas no citoplasma, e são dire
cionadas para a membrana por sinais internos de dire
cionamento. Uma segunda classe de proteínas é sinteti
zada no ER e exportada para a membrana peroxissomal.
Algumas proteínas residem em mais de um compar
timento subcelular. Um sinal de localização sub-ótima
pode levar a direcionamento ineficiente e a uma locali
zação dual, como na secreção parcial de um inibidor do
ativador de plasminogênio. Uma proteína pode conter
dois sinais de direcionamento, resultando em localiza
ção dual. Duplicação gênica e divergência podem resul
tar em diferentes sinais de direcionamento em polipep
tídeos maduros muito relacionados. Sítios alternativos
de iniciação da transcrição ou splicing alternativo de
pré-mRNA podem gerar diferentes mensagens a partir
de um único gene. mRNAs com splicing alternativo da
proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina di
ferem com respeito à presença de um segmento interno
que codifica um sinal de localização nuclear. Sem esse
segmento, a proteína permanece no citosol.
Finalmente, o primeiro códon de iniciação em um
mRNA, às vezes, é ignorado. A iniciação alternativa de
tradução leva a duas formas de fumarase no fígado de
rato; uma inclui uma sequência de direcionamento mito
condrial, enquanto a outra não, e permanece no citosol.
246 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

6.6 MAIS MODIFICAÇÕES PÓS Aminoácidos Podem Ser Modificados

TRADUÇÃO após Incorporação a Proteínas
Embora 20 aminoácidos sejam codificados genetica
Eventos adicionais de maturação podem modificar
mente, a modificação pós-tradução permite a formação
proteínas para gerar suas formas finais, funcionais.
Alguns são muito comuns, enquanto outros são muito de muitos aminoácidos derivados em proteínas. A mo
dificação pode ser permanente ou facilmente reversí
restritos. Muitas modificações reversíveis regulam a ati
vel. Embora o número de aminoácidos modificados em
vidade da proteína. uma proteína possa ser pequeno, eles frequentemente
desempenham um importante papel em sua função.
Proteólise Parcial Libera Insulina e Aminoácidos modificados em proteínas são apresenta
dos na Tabela 6.11. Exemplos importantes incluem:
Ativa Zimogênios
• Modificação amino-terminal: a síntese proteica
Proteólise parcial é uma etapa de maturação co é iniciada usando metionina, mas proteólise fre
mum. Sequências podem ser removidas de qualquer quentemente remove um ou vários resíduos ami
extremidade ou do meio de uma proteína. Proteólise no no-terminais. O novo amino-terminal é, então, fre
ER e no complexo de Golgi ajuda a maturar o hormônio quentemente alterado, por acetilação, por exemplo.
proteico insulina (Figura 6.19). A pré-pró-insulina co As subunidades a de proteínas G de transdução de
dificada pelo mRNA é inserida no lúmen do ER. A pepti sinal (p. 540) são derivatizadas com ácido mirís
dase sinal cliva o peptídeo sinal para gerar pró-insulina, tico ou palmítico. A glutamina amino-terminal
que se dobra para formar as ligações
Peptídeo C
dissulfeto corretas. A pró-insulina é
transportada para o complexo de Gol
LEUPROGLNLEUSERGLYALA50GLYPROGLYGLYGLYLEUALAGLU
gi, onde é acondicionada em grânu
los secretórios. Um peptídeo interno
de conexão (peptídeo C) é removido LEU VAL
por proteólise, e a insulina madura é GLN
GLU GLY
secretada. Na hiperpró-insulinemia 40
GLY VAL
familiar, o processamento é incomple 60
GLN
to (Correlação Clínica 6.11). A via da SER
LEU
biossíntese de insulina garante a pro LEU
ASP
dução de quantidades iguais das ca
GLN GLU
deias A e B. Além disso, a pró-insulina
se dobra em uma conformação na qual LYS ALA
os resíduos de cisteína são posiciona ARG GLU
dos para a formação correta das pon 1 Cadeia A
2 ARG
GLY
tes dissulfeto. Pró-insulina reduzida S S
ILE ARG
e desnaturada pode dobrar outra vez
corretamente, enquanto a renaturação VAL 30 THR
80 ASN COO–
da insulina reduzida e desnaturada é GLUGLNCYSCYSTHRSERILECYSSERLEUTYRGLNLEUGLUASNTYRCYS LYS
ineficiente e leva a ligações dissulfeto PRO
incorretas. 70S S THR

soras
de A é um meio
clivagem
enzimas. decomum
proteínas
Proteases de ativação
precur-
digestivas são S
Cadeia B
S TYR
PHE
LEUCYSGLYSERHIS
10 LEUVAL GLUALALEUTYRLEUVAL CYS PHE
mento
a
sores
cionados
exemplos
secreção.
zimogênios
e ativados
em
clássicos
Assim,
grânulos
inativos
por
(p.
o tripsinogênio
proteólise
1058).
de são
armazena-
Precur-
acondi-
após
é GLY GLY
HIS
GLUARG
ASN
GLN 20

VAL

clivado
xapeptídeo dar tripsina maise um
paraamino-terminal, o qui
he- 1 PHE

motripsinogênio é clivado para formar
quimotripsina e dois peptídeos (p.
1069).
NH+3
FIGURA6.19 Maturação da pró-insulina humana.
Após clivagem nos dois pontos indicados por setas, resíduos de arginina 31, 32 e 65 e
resíduo de lisina 64 são removidos para produzir insulina e peptídeo C.
Redesenhado de Bell, G. I., Swain, W. F., Pictet, R., Cordell, B., Goodman, H. M. e
Rutter, W. J. Nature 282:525, 1979.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.11
Hiperproinsulinemia Familiar (OMIM 176730)
Hiperpró-insulinemia familiar, uma condição au
tossômica dominante, resulta em quantidades aproxi
madamente iguais de insulina e de uma pró-insulina
processada de modo anormal, sendo liberadas na cir
culação. Embora os indivíduos afetados tenham altas
concentrações de pró-insulina em seu sangue, eles são
aparentemente normais em termos do metabolismo de
glicose, não sendo nem diabéticos nem hipoglicêmi
cos. Pensou-se originalmente que o defeito resultasse
de uma deficiência de uma das três proteases que pro
cessam a pró-insulina: endopeptidases, que quebram
as ligações peptídicas Arg31-Arg32 e Lys64-Arg65, e
cicliza-se espontaneamente com frequência, for
mando um resíduo de piroglutamil. O amino-ter
minal também pode ser elongado pela adição de
um aminoácido (ver Seção 6.8 sobre degradação
de proteínas).
• Formação de pontes dissulfeto intercadeias ou in
tracadeia: catalisada pela dissulfeto isomerase, a
formação de dissulfeto pode evitar o desdobramen
to de proteínas e sua passagem através de mem
branas, de modo que também se torna um meio de
localização. Como no caso da insulina, pontes dis
sulfeto podem ligar covalentemente polipeptídeos
separados e podem ser necessárias para função.
• Modificação de cisteína: a S-palmitoilação ajuda
interações com a membrana e o tráfego de algumas
proteínas. As subunidades g das proteínas Ghete
rotriméricas (p. 544) são modificadas por ligação
tioéster de um isoprenoide a uma cisteína na, ou
próxima da, extremidade carboxi-terminal. A defi
ciência múltipla de sulfatases surge de capacidade
reduzida de executar uma modificação pós-tradu
ção de cisteína (Correlação Clínica 6.12).
• Modificação de lisina: acetilação e metilação de
e-amino grupos de lisinas nas histonas modulam
suas interações com o DNA. Uma fração da histona
H2A é também modificada por ligação isopeptídi
ca do e-amino grupo de uma lisina com a glicina
C-terminal da ubiquitina, uma proteína pequena
com muitas funções regulatórias. Biotina também
é ligada a algumas carboxilases por ligações amida
a lisina (p. 799).
• Grupos hidroxila de serina e treonina: além da
glicosilação, fosforilação reversível por proteína
quinases e proteína fosfatases é muito comum e
funcionalmente importante. Um exemplo clássico
é a fosforilação de um resíduo de serina da glico
gênio fosforilase pela fosforilase quinase (p. 655).
Resíduos de tirosina são fosforilados por tirosina
• 247
uma carboxipeptidase. Em várias famílias, o defeito
é a substituição da Arg65 por His ou Leu, o que im
pede a clivagem entre o peptídeo C e a cadeia A da
insulina, resultando na secreção de uma pró-insulina
parcialmente processada. Em uma família, uma muta
ção puntual (His10→Asp10) causa a hiperpró-insuli
nemia, mas não se sabe como essa mutação interfere
com o processamento.
Zhou, A., Webb, G., Zhu, X. e Steiner, D. F. Proteolytic pro
cessing in the secretory pathway. J. Biol. Chem. 274:20745,
1999.
quinases muito específicas. Atividade de quinase
é uma propriedade de muitos receptores de fato
res de crescimento nos quais a ligação do fator de
crescimento estimula a divisão celular. Oncogenes,
responsáveis em parte pela transformação celular
e proliferação de células tumorais, frequentemente
têm atividade de tirosina quinase e mostram forte
homologia com receptores de fatores de crescimen
to normais. Existem dúzias de outros exemplos;
em conjunto, as proteína quinases e as proteína
fosfatases controlam a atividade de muitas proteí
nas que são centrais para o desenvolvimento celu
lar normal e anormal.
• ADP-ribosilação: a toxina diftérica modifica mais
a diftamida, um resíduo de histidina modifica
da (Figura 6.20) do EF2, por ADP-ribosilação. A
atividade do EF2 e, portanto, a síntese proteica,
são ambas inibidas. ADP-ribosilação fisiológica,
não mediada por toxinas bacterianas, geralmente
envolve modificação reversível de resíduos de ar
ginina e cisteína e é importante na sinalização da
célula e de proteínas regulatórias e de superfície.
• Formação de g-carboxiglutamato: resíduos de áci
do glutâmico em várias proteínas da coagulação do
sangue, incluindo protrombina e fatores VII, IX e X,
são modificados. O g-carboxiglutamato quela íons
cálcio, que são necessários à coagulação do san
gue (p. 1010). Essa modificação requer vitamina K.
Ela pode ser bloqueada por derivados da cumarina
(p. 1018), que antagonizam a vitamina K. Os deriva
dos cumarínicos são anticoagulantes terapêuticos.
Biossíntese de Colágeno Requer
Muitas Modificações Pós-Tradução
Os colágenos são as proteínas mais abundantes no
homem. A família do colágeno inclui pelo menos 28
espécies diferentes da proteína predominantemente
248 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

TABELA 6.11 Aminoácidos Modificados em Proteínasa

Aminoácido Modificação Encontrada
Amino-terminal Formilação, acetilação, aminoacilação, miristoilação, glicosilação
Carboxi-terminal Metilação, ADP-ribosilação, formação de âncora de glicosil-fosfatidilinositol
Arginina N-Metilação, ADP-ribosilação
Asparagina N-glicosilação, N-metilação, desamidação
Ácido aspártico Metilação, fosforilação, hidroxilação, isomerização (iso Asp)
Cisteína Formação de cistina, palmitoilação, ligação ao heme, S-glicosilação, prenilação, ADP-ribosila
ção, S-hidroxilação
Ácido glutâmico Metilação, g-carboxilação, ADP-ribosilação, poliglicinação, poliglutamilação
Glutamina Formação de piroglutamato, desamidação, ligação cruzada
Histidina Metilação, fosforilação, formação de diftamida, ADP-ribosilação
Lisina N-Acetilação, N-metilação, hidroxilação, oxidação, ubiquitinação, biotinilação, formação de ali
sina, ligação cruzada
Metionina Formação de sulfóxido
Fenilalanina b-Hidroxilação, glicosilação
Prolina Hidroxilação, glicosilação
Serina Fosforilação, glicosilação, acetilação, formação de a-formilglicina, fosfopanteteinilação
Treonina Fosforilação, glicosilação, metilação
Triptofano b-Hidroxilação, formação de diona, C-manosilação
Tirosina Fosforilação, iodinação, adenilação, sulfonilação, hidroxilação, nitração
Fonte: Krishna, R. G. e Wold, F. Post-translational modification of proteins. Em: A. Meister (Ed.), Advances in Enzymology, Vol. 67, New York: Wiley
Interscience, 1993, pp. 265-298. Walsh, C. T., Gameau-Tsodikova, S. e Gatto, G. J. Protein posttranslational modifications: the chemistry of proteome
diversifications. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 44: 7342, 2005.
aA lista não está completa e algumas das modificações são raras. Note que nenhuma modificação de glicina alanina, leucina, isoleucina e valina foi

relatada em proteínas.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.12

Ausência de Modificação Pós-Tradução: Deficiência Múltipla de Sulfatases (OMIM 272200)

A deficiência múltipla de sulfatases é uma rara doença
lisossômica de acúmulo. Os indivíduos afetados desen
volvem-se lentamente e, a partir do segundo ano de
vida, perdem a capacidade de ficar em pé, sentar ou
falar; deformidades físicas e deficiências neurológicas
se desenvolvem, e é comum a morte antes dos 10 anos
de idade. Há uma severa ausência de todos os tipos de
sulfatases. A degradação de moléculas sulfatadas de
pende da atividade de várias sulfatases relacionadas,
a maioria das quais são lisossomais. Deficiências de
sulfatases individuais são também conhecidas, e vá
rias doenças distintas estão ligadas a defeitos de uma
única enzima.
A deficiência múltipla de sulfatases surge de um de
feito em uma modificação pós-tradução que é comum
a todas as enzimas sulfatases. Em todos os casos, um
resíduo de cisteína da enzima é normalmente conver
tido em Ca-formilglicina. Fibroblastos de indivíduos
com deficiência múltipla de sulfatases catalisam essa
modificação com eficiência significativamente dimi
nuída, e as sulfatases não-modificadas são catalitica
mente inativas.
Muitas moléculas biológicas são sulfatadas, por
exemplo, glicosaminoglicanos, esteroides e glicolipíde
os. Sulfatação insuficiente é também responsável por
doenças. Por exemplo, sulfatação insuficiente dos glico
saminoglicanos condroitim sulfato e queratam sulfato
(p. 685) de cartilagem resulta em importantes deformi
dades esqueléticas.
Schmidt, B., Selmer, T., Ingendoh, A. e von Figura, K. A
novel amino acid modification in sulfatases that is deficient
in multiple sulfatase deficiency. Cell 82:271, 1995; e Dierks,
T., Schmidt, B., Borissenko, L. V., Peng, J. et al. Multiple sul
fatase deficiency is caused by mutations in the gene encoding
the human C-formylglycine generating enzyme. Cell 113:435,
2003.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 249

O O uma molécula de colágeno tem três cadeias-α enrola

das em uma tripla hélice, na qual resíduos de glicina
CO– CO–
CH
+
ocupam o centro da estrutura (p. 109).
H3N
+ H3N CH

CH2 CH2 Formação de Pró-Colágeno no Retículo

Endoplasmático e no Complexo de Golgi
HN N HN N
A síntese das cadeias-α do colágeno começa no ci
tosol. Sequências sinal amino-terminais ligam partícu
CH2 las de reconhecimento de sinal e formas precursoras,
designadas, por exemplo, por pré-pró-α1(I), são trans
CH
+ CH3 feridas para o lúmen do ER. Hidroxilação de resíduos
HC 2 NCH3 de prolina e lisina tecido-específica ocorre concomitan
CO CH3 O temente com a tradução, antes da montagem da tripla
CO
hélice. A prolil 4-hidroxilase requer uma sequência -X
NH2 H3 -Pro-Gly- (portanto, 4-hidroxiprolina só é encontrada
N+CH em posições Y da sequência -Gly-X-Y-). A prolil 3-hidro
O− CH2 xilase modifica um número menor de resíduos de proli
na, e a lisil hidroxilase modifica alguns dos resíduos de
O
POCH2O N lisina da posição Y. Essas hidroxilases requerem Fe2+ e
ácido ascórbico (vitamina C). A hidroxilação da prolina
N
estabiliza o colágeno, enquanto a hidroxilação da lisi
CH2 na fornece sítios para ligações cruzadas intercadeias e
O OH OH CH2 CH3 para glicosilação por glicosiltransferases específicas do
CH3
ER. A extensão das modificações depende do tipo espe
NH2 N HCN
CO +
cífico de cadeia-α e de célula na qual ela ocorre.
CH3
N N –
A organização da tripla hélice mediada por chape
O− N NH2 rones ocorre depois de as cadeias polipeptídicas terem
sido completadas, e os peptídeos sinal são clivados. Os
P O CH2
domínios carboxi-terminais globulares dobram e pontes
O
O dissulfeto são formadas entre elas. Isso inicia o enrola
mento da tripla hélice a partir da extremidade carboxi-,
OH OH em direção à amino-terminal. A tripla hélice completa,
ADP-ribose com domínios globulares da pró-proteína nas duas extre
midades, vai para o complexo de Golgi onde oligossaca
FIGURA6.20 Diftamida (esquerda superior) é uma
modificação pós-tradução de um resíduo específico de
rídeos são processados e maturados. Às vezes, resíduos
histidina (direita superior) em EF2. ADP-ribosil-diftamida de tirosina são modificados por sulfatação e algumas se
é mostrada na parte inferior. rinas são fosforiladas. O pró-colágeno completo é, então,
liberado pela célula via vesículas secretórias.

fibrosa que fornece o arcabouço estrutural para teci Maturação de Colágeno

dos e órgãos, e proteínas adicionais tipo-colágeno com
partilham características estruturais. Os colágenos
sofrem muitas modificações pós-tradução que ilustram
a complexidade desses processos, seus efeitos sobre
estrutura e função, e defeitos nessas modificações que
resultam em doenças graves. Diferentes colágenos, de
signados por Tipos I, II, III, IV, e assim por diante (ver
p. 109 para detalhes de estrutura) são codificados em
vários cromossomos e expressos em diferentes tecidos.
Suas sequências de aminoácidos diferem, mas uma se
quência repetitiva Gly-X-Y, com cerca de 1.000 resíduos,
predomina. Todo terceiro resíduo é uma glicina, cerca
de um terço das posições X é ocupado por prolina, e um
número semelhante de posições Y é 4-hidroxiprolina,
uma forma modificada pós-tradução de prolina. Resídu
os de prolina e hidroxiprolina conferem rigidez à estru
tura em hélice tipo II de poliprolina (Figura 6.21). Cada
polipeptídeo do colágeno é chamado uma cadeia-α;
A conversão do pró-colágeno em colágeno ocorre no
meio extracelular. Nos colágenos em forma de fibrila
(por exemplo, tipo I) os pró-peptídeos amino- e carbo
xi-terminais são clivados por proteases separadas, en
quanto os pró-peptídeos carboxi-terminais são retidos
em colágenos que formam redes (por exemplo, tipo IV).
Ao mesmo tempo, as triplas hélices organizam-se em
fibrilas por agregação extremidade-com-extremidade
e lado-a-lado, e o colágeno é estabilizado por muitas
ligações cruzadas. Lisil oxidase converte algumas li
sinas ou hidroxilisinas nos aldeídos reativos alisina ou
hidroxialisina. Esses resíduos condensam-se uns com
os outros ou com resíduos de lisina ou hidroxilisina de
cadeias adjacentes para formar bases de Schiff e liga
ções cruzadas aldol. Reações menos caracterizadas
podem envolver outros resíduos, incluindo histidina, e
podem ligar três cadeias-α. Defeitos em muitas dessas
250 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

trientes, choque térmico e infecção

Fibrila viral, eIF2 é fosforilado. Ele perma
nece funcional, mas eIF2-GDP fos
forilado liga-se muito fortemente a
eIF2B, o fator de troca de nucleotí
deo de guanina. O eIF2B está pre
Zona de sobreposição Zona de falha
sente em quantidades limitantes e
fica não-disponível para troca de
Microfibrila, nucleotídeo; assim, não há eIF2
organização -GTP disponível para iniciação.
de molúculas
Paradoxalmente, eIF2 fosforilado
estimula a tradução de um fator de
transcrição que autoregula a res
posta de genes ao estresse.
Molécula com
300 nm de A fosforilação de eIF2 pode ser
comprimento catalisada por uma quinase regula
da por heme que é ativa na ausência
de heme. Essa quinase está presen
α-2
te em muitas células, mas foi mais
Tripla hélice bem estudada em reticulócitos
a direitapara
girando
α-1 que sintetizam hemoglobina. Uma
α-1 deficiência no suprimento energé
tico ou de qualquer precursor do
heme ativa a quinase. Uma quina
se dependente de RNA dupla-fita
Hidroxiprolina relacionada é ativada por ligação
Gly de ds-RNA que resulta de infecção
Sequência típica de viral. A produção dessa quinase é
hélice do colágeno X Y
também induzida por interferon.
Y X
girando para a esquerda
(α -1 e α -2) Pro Pro
Diferentemente, o fator de ini
ciação eIF4E é ativado por fosfori
FIGURA6.21 Estrutura do colágeno, ilustrando (de baixo para cima) a
regularidade da sequência primária em uma hélice tipo II de poliprolina que gira
lação de um resíduo de serina em
para a esquerda; a tripla hélice que gira para a direita; a molécula de 300 nm; e resposta a, por exemplo, a fatores
a organização das moléculas em uma fibrila típica, dentro da qual moléculas de de crescimento. A fosforilação in
colágeno são unidas por ligações cruzadas. terfere com a ligação de proteínas
inibitórias que se ligam a eIF4E.
Segue-se a reversão por uma proteína fosfatase, por
etapas são conhecidos e alguns dos mais bem carac
exemplo, infecção viral. Esses efeitos são mediados por
terizados são apresentados na Tabela 6.12 e descritos
na Correlação Clínica 6.13. eIF4G, que também é ativado por fosforilação.

A regulação da tradução de mRNAs específicos é im

6.7 REGULAÇÃO DA
TRADUÇÃO
A quantidade de proteínas em células é regulada em
níveis de transcrição, tradução e degradação. A regula
ção da tradução pode ser global, influenciando a síntese
de proteínas em geral, ou pode ser muito mais específi
ca para proteínas individuais ou grupo de proteínas. Os
mecanismos mais eficientes e comuns para regulação
da tradução estão no estágio de iniciação, e a fosforila
ção de fatores de iniciação pode servir, dependendo das
circunstâncias, para suprimir ou estimular a tradução.
O mecanismo mais conhecido de regulação geral da
tradução envolve a fosforilação reversível da serina 51 da
subunidade α de eIF2. Em condições como falta de nu
portante na regulação da quantidade e do equilíbrio de
proteínas em uma célula. A localização e o acondiciona
mento de mRNAs permite que mensagens específicasse
jam traduzidas onde são necessárias ou o armazemanto
do mRNA para utilização futura. A localização no inte
rior da célula depende de sequências no RNA denomi
nadas elementos de direcionamento (ou zip codes ou
elementos de localização), que interagem com proteínas
de ligação ao RNA que concentram os mRNAs em um
local subcelular. Às vezes as mensagens são acondicio
nadas em grânulos de armazenamento durante o desen
volvimento ou dentro de corpos P: agregados de mRNAs
cuja tradução foi reprimida, proteínas reguladoras e en
zimas do decaimento de mRNA. Esses mRNAs podem
ser degradados, mas também podem ser armazenados e
retornar ao citoplasma para tradução. Corpos Pajudam a
reprogramar a tradução em momentos de estresse.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
TABELA 6.12 Doenças Selecionadas na Biossíntese e na Estrutura do Colágeno
Doença Defeito no Colágeno
Osteogênese Síntese diminuída do tipo I
imperfecta 1
Osteogênese Mutação puntual e rearranjo de exons em
imperfecta 2 regiões de tripla hélice
Ehlers-Danlos IV Secreção diminuída, degradação prematura Pele translúcida, susceptibilidade a ferimentos,
do tipo III
Ehlers-Danlos VI Hidroxilisina diminuída nos tipos I e III Pele hiperextensível, articulações hipermóveis
Ehlers-Danlos VII Acúmulo de pró-colágeno tipo I: o pró
peptídeo N-terminal não é clivado
Cutis laxa Hidroxilisina diminuída em decorrência da
(síndrome do má distribuição de Cu
chifre occipital)
Escorbuto Hidroxiprolina diminuída por causa da
deficiência de ácido ascórbico
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.13
Defeitos na Síntese de Colágeno
Osteogenesis Imperfecta (OMIM 166210)
Osteogenesis imperfecta é um grupo de pelo
menos sete doenças clínica, genética, ou bioquimi
camente distintas, caracterizadas por fragilidade
óssea, deformidades e diminuição de massa óssea.
Diversas variantes resultam de mutações que pro
duzem cadeias α(I) modificadas, e o efeito sobre a
gravidade dos sintomas varia muito. No exemplo mais
claro, uma mutação por deleção causa ausência de 84
aminoácidos na cadeia α1(I). As cadeias α1(I) mais
curtas associam-se com cadeias α1(I) e α2(I) nor
mais e impedem a formação da tripla-hélice normal
de colágeno, resultando na degradação de todas as
cadeias. Três-quartos de todas as moléculas de co
lágeno formadas têm pelo menos uma cadeia α1(I)
defectiva. Outras formas de osteogênese imperfecta
resultam de mutações puntuais que substituem uma
glicina por outro aminoácido. Como a glicina tem de
se encaixar no interior da tripla hélice do colágeno,
essas substituições desestabilizam a hélice.
Cheung, M. S., e Glorieux, F. H. Osteogenesis imperfect:
update on presentation and manegment. Rev. Endocr. Me
tab. Disord. 9:153, 2008; e Barsh, G. S., Roush, C. L., Bonadio,
J., Byers, P. H. e Gelinas, R. E. Intron mediated recombination
causes an α(I) collagen deletion in a lethal form of osteoge
nesis imperfecta. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2870, 1985.
• 251
Manifestação Clínica
Fraturas de ossos longos antes da puberdade
Letalidade perinatal; ossos malformados, moles
e frágeis
ruptura arterial e do cólon
Articulações hipermóveis e deslocamentos
Pele flácida, mole; formação de chifre occipital
em adolescentes
Crescimento ósseo diminuído, deficiência em
cicatrização, machuca com gravidade
Síndrome de Ehlers-Danlos, Tipo IV (OMIM 130050)
A síndrome de Ehlers-Danlos é um grupo de, pelo
menos, 10 doenças que são clínica, genética e bioqui
micamente distintas, mas que compartilham manifes
tações de fragilidade estrutural no tecido conjuntivo.
Os problemas comuns são fragilidade e hiper-extensi
bilidade da pele e hipermotilidade das articulações. A
síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV é causada por defei
tos no colágeno tipo III (p. 109), que é particularmen
te importante na pele, nas artérias e nos órgãos ocos.
As características incluem pele fina, translúcida, pela
qual as veias podem ser vistas facilmente, ferimentos
marcantes e, às vezes, aparência de envelhecimento
nas mãos e na pele. Os problemas clínicos surgem de
ruptura arterial, perfuração intestinal e ruptura do
útero durante a gravidez ou o parto. O reparo cirúr
gico é difícil, em virtude da fragilidade do tecido. Os
defeitos no Ehlers-Danlos tipo IV surgem de modifi
cações na estrutura das cadeias tipo III, em decorrên
cia de mutações puntuais que substituem resíduos de
glicina e interrompem a tripla hélice do colágeno, e
da remoção de éxons, o que encurta o polipeptídeo e
pode resultar em secreção ineficiente, estabilidade di
minuída do colágeno, e formação anormal de fibrilas
de colágeno tipo III. Em alguns casos, colágeno tipo
III acumula-se no ER rugoso e é degradado muito len
tamente.
Germain, D. P., Ehlers-Danlos syndrome type IV. Orpha
net. J. Rare Dis. 2:32, 2007; e Superti-Furga, A., Gugler, E.,
Gitzelmann, R. e Steinmann, B. Ehlers-Danlos syndrome
type IV: a multi-exon delection in one of the two COL3A1 al
leles affecting structure, stability, and processing of type III
procollagen. J. Biol. Chem. 263:6226, 1988.
252 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
Correlação Clínica 6.13 (continuação)
Deficiência de Lisil Hidroxilase (OMIM 225400)
Na síndrome de Ehlers-Danlos tipo VI, a lisil hi
droxilase está deficiente. Pelo menos 20 mutações
diferentes são conhecidas, resultando em colágenos
tipos I e III (p. 109) com conteúdo diminuído de hi
droxilisina e, consequentemente, ligações cruzadas
menos estável entre as fibrilas de colágeno. Algumas
ligações cruzadas entre lisina e alisina ocorrem, mas
não são tão estáveis e não amadurecem tão bem como
ligações cruzadas contendo hidroxilisina. Hidroxilisi
na é também sítio de glicosilação, mas a função dessa
modificação não está clara. As características clínicas
incluem acentuada hiper-extensibilidade da pele e das
articulações, cicatrização deficiente de feridas e defor
midades músculo-esqueléticas. Alguns pacientes têm
uma forma mutante de lisil hidroxilase com uma cons
tande de Michaelis para ácido ascórbico mais alta do
que a enzima normal. Consequentemente, respondem
a altas doses de ácido ascórbico.
Pinnell, S. R., Krane, S. M., Kenzora, J. E. e Glimcher, M.
J. A heritable disorder of connective tissue: hydrozylysine
-deficient colagen disease. N. Engl. J. Med. 286:1013, 1972;
e Yeowell, H. N., e Walker, L. C. Mutations in the lysyl hydro
xylase 1 gene that result in enzymatic deficiency and the
clinical phenotype of Ehlers-Danlos syndrome type VI. Mol.
Gen. Metab. 71:212, 2000.
Síndrome de Ehlers-Danlos, Tipo VII (OMIM 225410)
Nessa condição a pele sofre lesões facilmente e é
hiper-extensível, mas as principais manifestações são
deslocamentos de articulações importantes, como
quadris e joelhos. A flacidez dos ligamentos pode ser
causada pela remoção incompleta de pró-peptídeos
amino-terminais das cadeias de pró-colágeno. Uma
variante resulta de deficiência da pró-colágeno N
-protease conhecida como ADAMTS2. Uma deficiência
semelhante ocorre na doença autossômica recessi
va chamada dermatoparaxis de gado bovino, ovino e
de gatos, na qual a fragilidade da pele é tão extrema
que chega a ser letal. Em outras variantes, as cadeias
proα1(I) e proα2(I) não têm os aminoácidos do ponto
de clivagem por causa da remoção de um éxon dos ge
nes. Isso impede a clivagem normal pela procolágeno
N-protease.
Cole, W. G., Chan, W., Chambers, G.W., Walker, I. D. e Bate
man, J. F. Deletion of 24 amino acids from the proα1(I) chain
of type I procollagen in a patient with the Ehlers-Danlos syn
drome type VII. J. Biol. Chem. 261:5496, 1986; e Tang, B. L.
ADAMTS: A novel family of extracellular matrix proteases.
Int. J. Biochem. Cell Biol. 33:33, 2001.
Síndrome do Chifre Ocipital (OMIM 304150)
A síndrome do chifre occipital é também conheci
da como síndrome de Ehlers-Danlos tipo IX ou cutis
laxa (elastose cutânea), e está associada com a sín
drome de Menkes do cabelo encarapinhado. Defeitos
em um gene que codifica uma ATPase do trans-Golgi
transportadora de cobre está por trás dessas doenças,
que aparecem como uma deficiência na atividade da
lisil oxidase cobre-dependente e, consequentemente,
em defeitos nas ligações cruzadas do colágeno. As ca
racterísticas da síndrome do chifre occipital incluem
pele flácida e mole e o aparecimento, durante a ado
lescência, de chifres ósseos occipitais. Na síndrome
de Menkes do cabelo encarapinhado, uma doença va
riável, mas frequentemente mais grave, os pacientes
apresentam problemas neurológicos como convulsões
e retardo no desenvolvimento, incapacidade de se de
senvolverem, cabelo característico e, às vezes, morte
na infância ou quando ainda bebês. Uma mulher que
estava tomando altas doses de uma droga quelante de
cobre, penicilamina, deu à luz uma criança com uma
síndrome tipo-Ehlers-Danlos adquirida que, subse
quentemente, melhorou. Os efeitos colaterais da tera
pia com penicilamina incluem cicatrização deficiente
e pele hiper-extensível. Animais deficientes em cobre
também apresentam ligações cruzadas deficientes na
elastina e no colágeno, novamente em virtude da ne
cessidade de íons cuproso para a lisil oxidase.
Kaler, S. G. Metabolic and molecular bases of Menkes di
sease and occipital horn syndrome. Pedriatr. Dev. Pathol.
1:85, 1998; e Peltonen, L., Kuivaniemi, H., Palotie, H., Horn,
N. et al. Alterations of copper and collagen metabolism in the
Menke’s syndrome and a new subtype of Ehlers-Danlos syn
drome. Biochemistry 22:6156, 1983.
Escorbuto e Síntese de Hidroxiprolina
A maioria dos animais, mas não o homem, pode
sintetizar ácido ascórbico (vitamina C). O escorbuto
é historicamente relacionado com longas viagens ma
rítimas e deficiência de vitamina C em decorrência da
ausência de frutas e vegetais frescos. As manifesta
ções clínicas incluem cicatrização deficiente de feri
das, fragilidade capilar aumentada e esfolados graves,
sangramento gengival, e supressão do processo orde
nado de crescimento ósseo em crianças. Entre outros
problemas, a deficiência de ácido ascórbico causa sín
tese diminuída de hidroxiprolina porque a prolil hi
droxilase requer ácido ascórbico. A hidroxiprolina for
nece átomos para pontes de hidrogênio adicionais, que
estabilizam a tripla hélice do colágeno. Colágeno con
tendo hidroxiprolina insuficiente é significativamente
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
Correlação Clínica 6.13 (continuação)
menos estável do que o colágeno normal à temperatu
ra corporal. Deficiência grave de ácido ascórbico leva,
secundariamente, a uma taxa reduzida de síntese de
procolágeno.
Um exemplo claro de regulação mensagem-especí
fica é a síntese da proteína que se liga a ferro ferritina.
Em ausência de ferro, uma proteína repressora liga-se
ao elemento de resposta ao ferro (IRE), uma estrutura
em haste-alça da sequência líder 5! do mRNA da ferriti
na (p. 1116). Esse mRNA é sequestrado para uso futuro.
A ácido d-aminolevulínico sintase, uma enzima da bios
síntese do heme, também é regulada por um 5!-IRE no
seu mRNA. Diferentemente, mais receptor de ferritina
é necessário se o ferro estiver limitado; seu mRNA tem
IREs em sua região 3! não traduzida. A ligação da pro
teína repressora estabiliza o mRNA e prolonga seu tem
po de vida. Muitos mRNAs regulados por crescimento,
incluindo os de proteínas ribossômicas, têm uma sequ-
ência de polipirimidinas em sua sequência líder. Uma
proteína que se liga a polipirimidinas ajuda a regular
sua tradução.
Além de seu papel na transferência de informa
ção (mRNA) e tradução (tRNA, rRNA), o RNA é mui
to importante na regulação da expressão gênica em
múltiplas funções biológicas, geralmente de maneira
tecido específica. Várias classes de pequenos RNAs se
ligam a grupos específicos de proteínas e interagem
com o mRNA para regular a transcrição e a tradução
em processos denominados silenciamento do RNA e
interferência com RNA. No homem, existem quase
500 genes diferentes de micro-RNAs (miRNA). RNAs
maiores em “grampo” são processados no núcleo por
uma nuclease Drosha e, em seguida, por uma endonu
clease citoplasmática chamada Dicer, para gerar RNAs
dupla-fita com 21-23 nucleotídeos de comprimento.
Uma RNA helicase separa as fitas, uma das quais é li
gada por um complexo silenciador induzido por RNA
(RISC), cujo componente central é uma proteína Ar
gonauta. O RISC guia o miRNA para sequências com
plementares no mRNA, geralmente na região 3!-não
traduzida. A formação de um duplex mRNA-miRNA
imperfeito reprime a tradução, mas não afeta imedia
tamente a estabilidade do mRNA. A interação coope
rativa de múltiplos miRNAs com um mRNA aumenta
a eficiência de inibição. Os complexos miRNAmRNA
podem ser direcionados para os corpos P citoplas
máticos para armazenamento ou degradação. Dicer e
RISC também geram duplexes perfeitamente comple
mentares de moléculas pequenas de RNA com mRNA.
Esses complexos resultam na clivagem e inativação do
• 253
Peterofsky, B. Ascorbate requirement for hydroxylation
and secretion of pro-collagen: relationship to inhibition of
collagen synthesis in scurvy. Am. J. Clin. Med. 54:1135S,
1991; e Olmedo, J. M., Yiannias, J. A., Windgassen, E. B., e
Gornet, M. K. Scurvy: A disease almost forgotten. Int. J. Der
matol. 45:909, 2006.
mRNA alvo por uma endonuclease RISC chamada sli
cer e outras nucleases que degradam o mRNA.
Várias outras classes de RNA pequeno foram identi
ficadas. Os RNAs pequenos de interferência (siRNAs)
são gerados a partir do RNA dupla-fita; eles podem ser
endógenos ou derivados de vírus e funcionam como o
miRNA. Outras classes são transcritas a partir de se
quências repetitivas do DNA, derivadas de transcritos
fita-simples, e podem ser maiores do que os miRNAs. O
RNAi de interferência sintetizado quimicamente mime
tiza o miRNA e é uma ferramenta laboratorial valiosa e
um potente agente terapêutico.
6.8 DEGRADAÇÃO E TURNOVER
DE PROTEÍNAS
Os tempos de vida das proteínas variam muito. As
células do cristalino não são substituídas e suas proteí
nas não são recicladas. A hemoglobina dura os 120 dias
de vida do eritrócito. Algumas proteínas da coagulação
do sangue sobrevivem apenas alguns dias, de modo que
os hemofílicos só estão protegidos por um curto período
após transfusão ou injeção de fatores necessários. Os dia
béticos requerem injeções frequentes de insulina, uma
vez que o hormônio precisa variar (ver Correlação Clínica
21.8, p. 893). As enzimas metabólicas variam quantita
tivamente, dependendo da necessidade ou de mudança
na situação; por exemplo, a concentração de enzimas do
ciclo da ureia muda em resposta à dieta. As proteínas
também são danificadas por oxidação, proteólise, des
naturação ou outras modificações irreversíveis. Erros de
tradução e dobramento levam a proteínas não-funcionais,
e o processamento proteolítico gera peptídeos não-fun
cionais, como o peptídeo-C da pró-insulina. Mecanismos
de descarte são necessários; a proteólise reduz as pro
teínas indesejadas a peptídeos e, eventualmente, a ami
noácidos. A maioria desses aminoácidos é reciclada para
sintetizar novas proteínas, mas alguns são metabolizados
e seus produtos de degradação são excretados. Proteases
digestivas, como pepsina, tripsina, quimotripsina e elas
tase, hidrolisam proteínas da dieta e não participam da
reciclagem intracelular de proteínas, mas os aminoácidos
que geram contribuem para a reserva metabólica usada
na tradução. Isso é particularmente necessário para ami
noácidos essenciais (ver Tabela 19.1, p. 774).
254 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Proteólise Dependente de ATP celular. A destruição dependente de ubiquitina de uma

ciclina permite que células passem da fase M para a G1,
Ocorre em Proteassomos enquanto a degradação de receptores impede a transdu
ção de sinal e para a proliferação celular. Outras proteí
Uma via proteolítica mais bem descrita usa pro
nas degradadas por proteólise dependente de ubiquitina
teassomos, estruturas em forma de halteres que con
incluem fatores de transcrição, o supressor de tumor p53
têm cerca de 28 polipeptídeos (Figura 6.22). Um cerne
e outras oncoproteínas, proteína quinases, e receptores
cilíndrico é tampado em ambas as extremidades por
do sistema imune e outros de superfície celular.
complexos em forma de V que ajudam a reconhecer e
desdobrar polipeptídeos e transportá-los para o cerne
proteolítico, em um mecanismo que depende de ATP.
O direcionamento para proteassomos normalmente
requer ubiquitina, uma proteína muito conservada de
76 aminoácidos. As proteínas são marcadas para de
gradação por poliubiquitinação, como mostrado na Fi
gura 6.23. A ubiquitina é ativada pela enzima E1 para
formar um tioéster; ATP é necessário e um comple
xo transitório AMP-ubiquitina se forma. A ubiquitina
é, então, passada para enzima E2 e, finalmente, via
um grupo de complexos multiproteicos E3, para uma
proteína alvo. A ligação da ubiquitina ocorre por liga
ções isopeptídicas entre e-amino grupos de resíduos
de lisina da proteína e o resíduo de glicina carboxi
-terminal da ubiquitina. Várias moléculas de ubiquiti
na são ligadas à proteína e uma à outra, e a proteína
poliubiquitinilada é levada aos proteassomos e degra
dada; uma isopeptidase libera ubiquitina intacta para
ser reutilizada. Proteínas danificadas, defeituosas,
dobradas incorretamente e mutadas são rapidamente
degradadas pela via da ubiquitina, e o acúmulo de pro
teínas não degradadas pode levar a doenças (Correla FIGURA6.22 Modelo de proteassomo.
ção Clínica 6.14). Por exemplo, a deleção de um ami Um segmento central 20S que inclui 12-15 polipeptídeos dife
noácido altera a estabilidade da proteína CFTR (ver rentes é composto por quatro anéis heptaméricos empilhados,
Correlação Clínica 6.7) na fibrose cística. A seleção de com um cerne oco que inclui várias proteases com especifici
proteínas nativas para degradação depende da espe dades diferentes. Segmentos em forma de V em ambas as ex
cificidade da enzima E3; tanto a conformação como tremidades fecham o cilindro e agem no reconhecimento de
substrato ATP-dependente, no desdobramento e na translo
a sequência de aminoácidos são importantes. Sequên
cias desestabilizadoras PEST (ricas em Pro, Glu, Ser cação para dentro do cerne. A estrutura da tampa superior é
mostrada deslocada do segmento central para ilustrar o cerne
e Thr) ocorrem em várias proteínas de vida curta, e oco do cilindro.
um motivo de interação com ubiquitina, que liga ubi Adaptado de Rubin, D., e Finley, D. Cur. Biol. 5:854, 1995; e
quitina e às vezes também promove poliubiquitinação, Peters, J.-M. Trends Biochem. Sci. 19:377, 1994.
foi identificado. Outro determinante é a identidade do
aminoácido amino-terminal. De acordo com a regra do
N-terminal, proteínas com resíduos amino-terminais
diferentes são degradadas a velocidades muito dife A poliubiquitinação é necessária para sinalizar pro
rentes, e o tempo de vida de uma proteína pode ser teólise; por exemplo, a poliubiquitinil-p53 é degradada,
modificado pela incorporação de um resíduo N-termi enquanto a monoubiquitinil-p53 é direcionada para ex
nal desestabilizante, a partir de um aminoacil-tRNA portação do núcleo. Defeitos na proteólise dependente
doador. Proteínas dobradas erroneamente no ER são de ubiquitina levam a doença (Correlação Clínica 6.15).
geralmente degradadas pela via da ubiquitina. Chape Outros papéis da ubiquitina estão descritos em Um
rones e lectinas do ER impedem a agregação de glico Olhar Mais Atento 6.4.
proteínas N-ligadas dobradas erroneamente e as dire
cionam para retrotranslocação, de volta para o citosol, Como proteassomos, as proteases procarióticas
em um processo denominado ERAD (ER-associated complexas Lon e Clp e FtsH requerem hidrólise de ATP
para sua ação, mas ubiquitina está ausente em proca
degradation, degradação associada ao ER).
riotos. Essas proteases também estão organizadas em
A proteólise dependente de ubiquitina desempenha estruturas em forma de barril e a ATPase energiza o
um papel importante na regulação de eventos celulares. desdobramento da proteína substrato. Uma regra do N
Ciclinas (p. 1039) e receptores proteínas tirosina qui -terminal aplica-se a um número reduzido de aminoáci
nases (p. 529) estão envolvidos no controle da divisão dos N-terminais desestabilizantes.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO • 255

O
Digestão Intracelular de Algumas
Etapa 1a PPi UB C OH
Proteínas Ocorre em Lisossomos
ATP
A digestão intracelular de proteínas provenientes
do ambiente extracelular ocorre dentro de lisosso E1SH

mos, ricos em proteases. O material que não permeia a

membrana plasmática é importado por endocitose. Na O
pinocitose, partículas grandes, agregados moleculares
UB C
E2SH
AMP • E1
ou outros materiais no fluido extracelular são engolfa
dos. Macrófagos ingerem bactérias e células mortas por Etapa 1b
esse mecanismo. A endocitose mediada por receptor
usa receptores de superfície celular para ligar molécu
las específicas em depressões da superfície celular que O
são encapados pela proteína multi-subunidades clatri
na. Invaginação da membrana plasmática e dos recep UBC SE1
Etapa 2
tores ligados a ligante forma vesículas intracelulares
encapadas com clatrina, sendo que um destino delas é E1
a fusão com um lisossomo e degradação do conteúdo.
A reciclagem de proteínas intracelulares pode também
ocorrer dentro de lisossomos, e, em certas condições, O
quantidades significativas de material celular podem UBC S E2
ser degradadas por lisossomos. Por exemplo, a carência Etapa 3
de soro para fibroblastos ou o jejum de ratos leva à de E3• PROTEÍNA
gradação lisossomal de uma subpopulação de proteínas E2

celulares. O reconhecimento de uma sequência peptídi

ca específica está envolvido, novamente indicando que
O
o tempo de vida de uma proteína é, em última instância,
codificado em sua sequência. UBC OH UB CN PROTEÍNA
COMPLEXO
Etapa 4
O ATP

Outros Sistemas Proteolíticos PROTEASE

AMP
A apoptose (p. 1034), também chamada morte ce
lular programada, acontece por ativação proteolítica de
proteases conhecidas como caspases (cisteína aspartil PEPTÍDEOS
proteases). Estresses como inflamação, dano celular ou
FIGURA6.23 Degradação de proteínas dependente de
deficiência de fatores de crescimento podem ativar dire
ATP e ubiquitina.
tamente as caspases ou levar as mitocôndrias a liberarem A ubiquitina é ativada por uma reação de duas etapas envol
citocromo c e outros fatores que ativam uma cascata de vendo formação de um anidrido misto transitório de AMP e a
caspases e resultam na rápida degradação de proteínas extremidade carboxi-terminal da ubiquitina (etapa 1a), segui
celulares. Uma caspase do ER age na apoptose induzida da por geração de um tioéster com enzima E1 (etapa 1b). A
por estresse no ER, enquanto outras proteases do Gol enzima E2 forma um tioéster com ubiquitina (etapa 2) e serve
gi e ER degradam proteínas dobradas erroneamente e de doador em transferência de ubiquitina para uma proteína
fragmentos peptídicos que surgem durante a maturação alvo catalisada por E3 (etapa 3). Várias outras moléculas de
de proteínas na via secretória. Proteínas são também ex ubiquitina são ligadas a resíduos de lisina de ubiquitina e/ou
outras lisinas da proteína alvo nesse estágio. Proteína poliu
portadas do ER para degradação por proteassomos.
biquitinilada é degradada por proteólise dependente de ATP
Tiol proteases depententes de cálcio, também chama (etapa 4); a ubiquitina não é degradada, e pode reentrar no
processo na Etapa 1.
das calpaínas, estão presentes na maioria das células e
funcionam, por exemplo, em proliferação, diferenciação
e progressão pelo ciclo celular por proteólise seletiva e
limitada. As calpaínas também funcionam com proteas
somos na reciclagem de proteínas, e outras funções são
indicadas, porém menos estabelecidas. Parece que a de
gradação de proteínas é um processo tão complexo e im
portante quanto a biossíntese de proteínas.
256 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.14
Enovelamento Errado de Proteína e Agregação: Doença de Huntington e Doença de Alzheimer
Proteínas com dobramento errado são geralmente
degradadas, como ocorre com a proteína mutante CFTR
na fibrose cística (ver Correlação Clínica 6.7). Várias
doenças neurológicas ilustram o resultado da agregação
celular de proteínas dobradas erroneamente ou de seus
produtos de degradação parcial.
A doença de Huntington (OMIM 143100) é uma en
fermidade neurodegenerativa autossômica dominante,
na qual os pacientes apresentam movimentos espásti
cos em músculos voluntários, mudança de personalida
de e disfunção cognitiva; todos se tornam mais graves
com o tempo. A doença de Huntington está associada
com o acúmulo de agregados de proteínas derivados da
huntingtina, uma proteína primariamente citoplasmá
tica. Huntingtina é essencial para o desenvolvimento
embrionário e está envolvida na regulação da trans
crição, tráfego de vesículas e sinapse; os mecanismos
não estão bem esclarecidos. Variantes da huntingtina
estão envolvidas na doença de Huntington; um códon
CAG no interior do gene é expandido, resultando em
repetições de poliglutamina com 35 a 180 resíduos
dentro da huntingtina. Repetições de poliglutamina
mais longas estão associadas com doença mais gra
ve. Proteínas e peptídeos derivados da huntingtina
acumulam-se em inclusões no núcleo, e a transcrição
é afetada. A função mitocondrial é também perturba
da e espécies reativas de oxigênio aumentam, e a via
ubiquitina-proteassomo é prejudicada. Várias outras
enfermidades neurodegenerativas também estão liga
das à expanção do traço poliglutamina e à deposição
proteica.
A doença de Alzheimer (OMIM 104300) é caracte
rizada por perda progressiva de memória e cognição,
e é mais comum em pessoas idosas. A disfunção mito
condrial em células neurais é prevalente. A doença de
Alzheimer é caracterizada pelo acúmulo intraneuronal
e extracelular de feixes e filamentos que formam pla
cas. O principal componente da placa é o b-amiloide,
um peptídeo com 39-43 resíduos derivado de uma pro
teína precursora amiloide maior. Outros componentes
incluem o gangliosídeo GM1, a proteína Tau associada
a microtúbulos, e outros componentes muito ubiqui
tinilados, mas protease-resistentes em fibras compac
tadas e entrelaçadas que parecem sobrecarregar a via
degradativa do proteassomo. Regulação alterada do
íon cálcio pode estar por trás da morte neuronal.
A esclerose lateral amiotrófica (ALS ou doença de
Lou Gehrig) é uma doença neurodegenerativa carac
terizada por degeneração progressiva de neurônios
motores e acúmulo de proteínas ubiquinadas em inclu
sões celulares. A superóxido dismutase 1 e a proteína
TAR que se liga ao DNA foram ambas identificadas nas
inclusões nas formas familiar e esporádica da doença.
A doença de Parkinson (ver Correlação Clínica 19.19,
p. 807) também está ligada ao acúmulo de agregados de
proteínas não-degradadas. Dobramento errado da pro
teína pré-sináptica alfa-sinucleína (a-Syn) no retículo
endoplasmático (ER) de neurônios leva à formação de
Corpos de Lewy citoplasmáticos, nos quais a-Syn é um
componente majoritário. A degradação de proteínas as
sociada ao ER é prejudicada. Na doença de Parkinson
de início precoce, os Corpos de Lewy estão geralmente
ausentes e mutações na proteína parkina são comuns
(Correlação Clínica 6.15). Doenças do príon também
estão associadas com a agregação de proteínas (ver
Correlação Clínica 3.6, p. 118).
Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet 369: 218, 2007;
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 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 6.15
Defeitos no Sistema Ubiquitina-Proteassomo
As seguintes são doenças ligadas ao mau funciona
mento da via ubiquitina-proteassomo.
Síndrome de Liddle (OMIM 177200): uma mutação
em uma subunidade do canal de sódio do epitélio re
nal interfere na ligação de Nedd4, uma ligase E3 que
é mediadora de sua degradação. O acúmulo do canal
resulta na reabsorção excessiva de Na+ e em severa hi
pertensão.
Parkinsonismo autossômico recessivo juvenil (OMIM
605909): uma pequena porcentegem de pacientes tem
uma forma familiar de início precoce da doença de
Parkinson. Muitos têm mutações na proteína parkina,
causando perda na atividade enzimática E3 e acúmulo
de substratos parkina. Uma segunda causa da doença
de Parkinson familiar está ligada a uma mutação em
uma enzima de reciclagem de ubiquitina, possivelmen
te resultando em diminuição na ubiquitina livre.
UM OLHAR MAIS ATENTO 6.4
Ubiquitina e SUMO
A ubiquitina desempenha importantes papéis, além
da degradação de proteínas. A ligação reversível de
ubiquitina às histonas H2A e H2B não está relaciona
da com turnover (reciclagem), uma vez que as proteí
nas são estáveis, mas a modificação afeta a estrutura
da cromatina e a transcrição. A ubiquitina participa do
alinhamento e segregação dos cromossomos, do reparo
do DNA, e da regulação da transcrição na resposta in
flamatória. Ubiquitinação é um sinal para endocitose e
um sinal de seleção que direciona os conteúdos para os
lisossomos. Frequentemente, essas funções empregam
ligações ubiquitina que são diferentes daquelas da via
do proteossomo. Proteínas pequenas ubiquitina-rela
• 257
Câncer de mama e ovário: mutações heterozigotas
in BRCA1 (locus de suscetibilidade ao câncer de mama)
são vistas em alguns casos de câncer de mama e ovário.
A proteína BRCA1 é uma enzima E3 cuja atividade é
abolida por mutações observadas no câncer de mama
familiar.
Cancer cervical induzido pelo HPV: infecção por al
gumas cepas do vírus do papiloma humano pode levar
ao câncer cervical invasivo. Uma oncoproteína E6 codi
ficada pelo vírus interage com a proteína supressora de
tumor celular p53; uma enzima E3 reconhece o com
plexo, levando à degradação de p53 pela via ubiquitina
-proteassomo.
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ligação às proteínas alvos são muito similares à da ubi
quitina, também funcionam na regulação transcrição
e outros aspectos da regulação celular, algumas vezes
com efeitos opostos ao da ubiquitina.
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258 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
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Termos Chaves
Aminoacil tRNA sintetase
Anticódons
Chaperone
Códons
Códons de iniciação
Códons de terminação
Código genético
Colágeno tripla-hélice
Complexo RNA indutor
silenciador
Degradação associada ao
retículo endoplasmático
Direcionamento proteico
Fatores de elongação
Fatores de iniciação
Fatores de terminação
Glicosiltransferase
Glicosilação N-ligada
Glicosilação O-ligada
Modificação pós-tradução
Monocistrônico
Mutações com mudança
na fase de leitura (fra
meshift)
Mutações puntuais
Mutações silenciosas Polissomo
Mutações supressoras Proteassomo
Mutações de terminação Regra do N-terminal
Oligossacarídeo alta-manose Regulação traducional
Oligossacarídeo tipo-com Retículo endoplasmático
plexo Ribossomo
Partícula de reconheci RNA de interferência
mento de sinal
RNA silenciador
Peptidase sinal
Sequência de ancoragem
Peptídeo sinal
Tradução
Peptidil transferase
Translocon
Policistrônico
Ubiquitina

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha
1. Degeneração do código genético denota a existên
cia de
A. múltiplos códons para um único aminoácido.
B. códons consistindo de apenas duas bases.
C. tripletes de bases que não codificam nenhum
aminoácido.
D. diferentes sistemas nos quais um determinado
triplete codifica diferentes aminoácidos.
E. códons que incluem uma ou mais das bases
“incomuns”.
2. Na formação de um aminoacil-tRNA,
A. ADP e Pi são produtos da reação.
B. aminoacil-adenilato aparece na solução como
um intermediário livre.
C. acredita-se que a aminoacil-tRNA sintetase
reconheça e hidrolise aminoacil-tRNAs incor
retos que possa ter produzido.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
D. há aminoacil-tRNA sintetases separadas para
todos os aminoácidos da proteína funcional.
D. há uma aminoacil-tRNA sintetase separada
para cada espécie de tRNA.
3. Durante a iniciação da síntese proteica,
A. metionil-tRNA aparece no sítio A do complexo
de iniciação 80S.
B. eIF3 e a subunidade ribossômica 40S partici
pam da formação do complexo de pré-inicia
ção.
C. eIF2 é fosforilado por GTP.
D. o mesmo metionil-tRNA é usado durante a
elongação.
E. um complexo de mRNA, subunidade ribossô
mica 60S e certos fatores de iniciação é forma
do.
4. Durante o estágio de elongação da síntese proteica
eucariótica,
A. o aminoacil-tRNA recém-chegado liga-se ao
sítio P.
B. uma nova ligação peptídica sintetizada pela
peptidil transferase requer hidrólise de GTP.
C. o peptidil-tRNA é translocado para um sítio
diferente no ribossomo.
D. estreptomicina pode causar liberação prema
tura do peptídeo incompleto.
E. formação da ligação peptídica ocorre pelo ata
que do grupo carboxila do aminoacil-tRNA
que está chegando ao amino grupo da cadeia
peptídica nascente.
5. A formação da insulina madura inclui todos os se
guintes, exceto
A. remoção de um peptídeo sinal.
B. dobramento (folding) em uma estrutura tri
dimensional.
C. formação de pontes dissulfeto.
D. remoção de um peptídeo de uma região inter
na.
E. g-carboxilação de resíduos de glutamato.
6. A estreptomicina liga-se à subunidade pequena de
ribossomos procarióticos e
A. causa liberação prematura do peptídeo incom
pleto.
B. impede ligação das subunidades 40S e 60S.
C. interfere com a iniciação da síntese proteica.
D. inibe a atividade da peptidil transferase.
E. age como uma N-glicosidase.
Questões 7 e 8: Fibrose cística é uma doença genéti
ca frequente em caucasianos. O gene CF codifica uma
proteína chamada regulador transmembrânico de con
dutância da fibrose cística (CFTR), que funciona como
um canal de cloreto regulado por cAMP. A proteína tem
• 261
dois domínios que atravessam a membrana, dois domí
nios que interagem com ATP e um domínio regulatório.
O defeito mais comum está no gene de um dos domínios
de ligação a ATP. O resultado é uma proteína que não
dobra corretamente no retículo endoplasmático, não é
adequadamente glicosilada, e não é transportada para
a superfície celular. Em vez disso, é degradada no cito
sol em proteassomos. Uso de drogas que favorecem a
interação de chaperones com a proteína mutante é uma
abordagem terapêutica em potencial.
7. Chaperones
A. são sempre necessários para dirigir o dobra
mento de proteínas.
B. quando ligados a proteínas aumentam a velo
cidade de degradação de proteínas.
C. geralmente se ligam a regiões fortemente hi
drofílicas de proteínas desdobrada.
D. às vezes mantêm proteínas em um estado des
dobrado para permitir sua passagem através
de membranas.
E. favorecem a agregação de proteínas em pla
cas.
8. O direcionamento de uma proteína a ser degradada
em proteassomos geralmente requer ubiquitina. Na
função da ubiquitina, todas as seguintes são verda
des, exceto
A. ATP é necessário para ativação da ubiquitina.
B. forma-se uma ligação peptídica entre o carbo
xi-terminal da ubiquitina e um e-amino grupo
de uma lisina.
C. ligação de uma proteína a ubiquitina nem sem
pre a marca para degradação.
D. o aminoácido N-terminal é um determinante
de seleção para degradação.
D. ATP é requerido pela enzima que transfere a
ubiquitina para a proteína a ser degradada.
Questões 9 e 10: O colágeno é incomum em sua com
posição em aminoácidos e requer uma grande varieda
de de modificações pós-tradução para convertê-lo em
uma molécula funcional. Dada a complexidade da sínte
se de colágeno, existem muitas doenças, resultando em
fragilidade estrutural do tecido conjuntivo, causadas
por defeitos no processo. O escorbuto leva a um coláge
no menos estável, com hidroxiprolina insuficiente.
9. A 4-hidroxilação de resíduos prolil específicos du
rante a síntese do colágeno requer todos os seguin
tes, exceto
A. Fe2+.
B. uma sequência de aminoácidos específica no
sítio de hidroxilação.
C. ácido ascórbico.
D. co-hidroxilação de lisina.
E. cadeias a individualizadas, ainda não organi
zadas em uma tripla hélice.
262 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

10. Boa parte da formação do pró-colágeno ocorre no
retículo endoplasmático e no complexo de Golgi, o
que requer um peptídeo sinal. Todas as afirmati
vas seguintes sobre o direcionamento de proteínas
para o ER são verdadeiras, exceto
A. o peptídeo sinal geralmente tem uma extre
midade N-terminal carregada positivamente e
uma sequência de aminoácidos hidrofóbicos.
B. peptídeo sinal emergindo de um ribossomo li
vre liga uma partícula de reconhecimento de
sinal (SRP).
C. o peptídeo sinal é geralmente clivado da prote
ína antes da proteína ser inserida na membra
na do ER.
D. o encaixe (docking) da proteína ocorre, na
verdade, no receptor de SRP e serve para ligar
SRP ao ER.
E. SRP e proteína de encaixe (docking) não en
tram no lúmen do ER, mas são reciclados.
Questões 11 e 12: Várias doenças ocorrem em de
corrência defeitos nos sinais de direcionamento que
dirigem proteínas para organelas específicas. A doen
ça da célula I (mucolipidose II), caracterizada por re
tardo psicomotor severo e anormalidades esqueléticas,
surge de um defeito no direcionamento de proteínas
para os lisossomos. O direcionamento errado também
pode causar problemas. Na hiperoxalúria primária tipo
I, uma enzima que normalmente funciona em peroxis
somos, em virtude de mutações que criam um sinal de
direcionamento mitocondrial, localiza-se nas mitocôn
drias.
11. Pacientes com doença da célula I não têm a enzi
ma que transfere N-acetilglucosamina fosfato para
oligossacarídeos do tipo alta manose na proteína.
Essa glicosilação N-ligada
A. ocorre somente depois da proteína ter sido
completamente traduzida e dobrada.
B. não requer nenhuma sequência específica de
aminoácidos.
C. ocorre pela transferência de uma cadeia oli
gossacarídica de um dolicol fosfato carregador
para a proteína.
D. possui uma cadeia de oligossacarídeo ligada a
serina ou treonina.
E. contém somente manoses na cadeia.
12. O sinal de direcionamento para a mitocôndria é:
A. uma sequência de ancoragem hidrofóbica.
B. uma a-hélice amfipática carregada positiva
mente.
C. manose 6-fosfato.
D. um ou dois grupos de aminoácidos básicos.
E. uma sequência Ser-Lys-Leu (SKL) carboxi
-terminal.
Problemas
13. A mutação mais comum na fibrose cística é a dele
ção de três bases consecutivas no gene de um dos
domínios de ligação de ATP. Como a proteína desse
gene poderia estar relacionada com uma proteína
normal?
14. Algumas proteínas podem ser degradadas nos li
sossomos. Como isso difere da degradação de pro
teínas nos proteassomos?

Respostas
1. A Essa é a definição da degeneração. B e E não se
sabe se ocorrem, embora às vezes o tRNA leia ape
nas as primeiras duas bases de um triplete (osci
4.
lação ou wobble), e às vezes bases incomuns ocor
ram no anticódon. C denota os códons de parada
(nonsense). D é um desvio da universalidade do
código, encontrado em mitocôndrias.
2. C Ligações entre um tRNA e um aminoácido incor
reto menor podem se formar, mas são rapidamente
hidrolisadas. A e B: o ATP e o aminoácido reagem
para formar um aminoacil-adenilato ligado à enzi
ma; PPi é liberado no meio. D: alguns aminoácidos,
5.
como hidroxiprolina e hidroxilisina, surgem por
modificação co- ou pós-tradução. E: uma aminoacil
-tRNA sintetase pode reconhecer qualquer uma de
várias espécies de tRNA para um dado aminoácido.
3. B Este então se liga ao mRNA. A: Metionil-tRNAMeti
aparece no sítio P. C: fosforilação de eIF-2 inibe ini
ciação. D: metionil-tRNAeMet é usado internamen
te. E: o mRNA associa-se primeiro com a subuni
dade 40S.
C Isso é necessário para liberar o sítio A para o
tRNA seguinte. A: o aminoacil-tRNA que está che
gando liga-se ao sítio A. B: a formação da ligação
peptídica não requer outra fonte de energia além
do aminoacil-tRNA. D: a estreptomicina inibe a
formação do complexo de iniciação 70S procarió
tico e causa leitura errada do código genético. E:
o par de elétrons do amino grupo realiza o ataque
nucleofílico sobre o carbono carbonílico.
E A g-Carboxilação é especialmente importante
em várias proteínas da coagulação do sangue, mas
não na formação da insulina. A: pré-pró-insulina
é inserida no ER. B: todas as proteínas, exceto as
fibrosas, devem se dobrar em uma forma tridimen
sional. C: uma pró-insulina dobra e forma pontes
dissulfeto antes da cadeia ser clivada. D: isso é
chamado peptídeo C.
 CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO
6. CAlterando-se as interações entre tRNA, mRNA e
subunidaderibossômica, interfere com a iniciação e
também causa leitura errada. A: puromicina, pare
cida com aminoacil-tRNA, faz isso. B: estas são su
bunidades eucarióticas. D: cloranfenicol faz isso. E:
esse é o efeito de ricina e de toxinas relacionadas.
7. D Esta é apenas uma das muitas funções que os
chaperones exercem. A: muitas proteínas dobram
espontaneamente de modo correto. B: proteínas
com dobramento errado são reconhecidas e rapi
damente degradadas. C: chaperones se ligam às
regiões hidrofóbicas de proteínas desdobradas. E:
proteínas desdobradas são as de maior possibilida
de de fazerem isso.
8. E ATP é necessário na ativação da ubiquitina e nas
etapas de protease, mas não aqui. B e D: ambos es
tão corretos. C: a ligação com histonas não resulta
em sua degradação.
9. D Lisina é hidroxilada, mas por uma enzima dife
rente. A e C: prolil hidroxilase requer ambos Fe2+
e ácido ascórbico. B: a sequência é –X-Pro-Gly-. E:
hidroxilação é um evento co-tradução.
10. C A peptidase sinal localiza-se na superfície lu
minal do ER. A: estas são características comuns,
juntamente com um segmento polar que a peptida
se sinal reconhece. B, D e E: todas são característi
cas essenciais do processo.
• 263
11. C A cadeia é ligada à amida de uma asparagina em
uma sequência Asn-X-Thr/Ser. A, B e D: essas são
características do tipo O-ligado. E: N-acetilgluco
samina também está presente.
12. B Esta é reconhecida por um receptor mitocon
drial. A: isso mergulharia a proteína na membrana
do ER. C: esse é o sinal para o lissosomo. D: esse
direciona para o núcleo. E: esse é o sinal para os
peroxissomos.
13. Deleção de um códon inteiro significa que um ami
noácido em particular não estará presente na pro
teína. Não é comum que a deleção de três nucleotí
deos cubra dois códons, de modo que não seria de
se esperar uma mutação com mudança na fase de
leitura (frameshift).
14. A degradação nos proteassomos geralmente re
quer adição de ubiquitina à proteína. As proteínas
são levadas para os lisossomos por endocitose, e
enzimas presentes nos lisossomos as degradam.
Proteínas extracelulares específicas ligam-se a re
ceptores da superfície celular em depressões enca
padas por clatrina. A invaginação da membrana e
de receptores ligados a ligante forma vesículas que
podem fundir com lisossomos. Novamente, as pro
teínas são degradadas por enzimas lisossomoais.
264 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
PARTE II CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 265
TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

7 Plasmídeo
Promotor lacZ

DNA Recombinante Sítio de

restrição A

Sítio de
e Biotecnologia Gene de
restrição B

resistência
a antibiótico

Gerald Soslau
Professor Titular, Drexel University College of Medicine

CONTEÚDO 7.3 Mapas de Restrição e Evolução, 271

7.1 INTRODUÇÃO, 266 7.4 Sequenciamento Direto de DNA para Diagnóstico
da Síndrome de Bloom: uma Doença Genética, 273
7.2 REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA, 267
7.5 Análise por PCR Multiplex de Defeitos no Gene da
7.3 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO, MAPAS DE
HGPRTase na Síndrome de Lesch–Nyhan, 279
RESTRIÇÃO E SEQUENCIAMENTO DO DNA, 269
7.6 Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de
7.4 DNA RECOMBINANTE, CLONAGEM E SELEÇÃO
Restrição Determina a Origem Clonal de Tumo
DE CLONES, 274
res, 282
7.5 DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS
7.7 Polimorfismo de Conformação de Cadeia Única
NUCLEICOS E PROTEÍNAS QUE SE LIGAM AO
para Detecção de Mutações Espontâneas que
DNA, 280
Podem Levar a SIDS, 284
7.6 DNA COMPLEMENTAR E BIBLIOTECAS DE DNA
7.8 O Uso de Camundongo Transgênico com Cromos
COMPLEMENTAR, 285
somo Artificial de Levedura (YAC) para Estudar a
7.7 BACTERIÓFAGOS, COSMÍDEOS E VETORES Doença de Huntington, 290
DE CLONAGEM EM LEVEDURA E ANÁLISE DE
7.9 O Uso de Chromosome Walking e Jumping para
LONGOS SEGMENTOS DE DNA, 288
Identificar o Gene da Fibrose Cística, 292
7.8 VETORES DE EXPRESSÃO E PROTEÍNAS DE
7.10 Mutagênese Sítio-Dirigida de Colágeno tipo VII,
FUSÃO, 291
297
7.9 MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA, 295
7.11 Regulação da Expressão Gênica Mediada por
7.10 APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RE siRNA, 301
COMBINANTE, 299
7.12 Terapia Gênica: Genes Normais Podem Ser Intro
7.11 GENÔMICA, PROTEÔMICA E ANÁLISE POR duzidos em Células com Genes Defectivos, 302
MICROARRAY, 306
7.13 Modelos de Animais Transgênicos, 304
7.14 Camundongos Knockout para Definir um Papel
CORRELAÇÕES CLÍNICAS para o Purinoceptor P2Y1, 305
7.1 Reação de Polimerase em Cadeia (Polymerase 7.15 Técnica de Micromatrizes (Microarray) para
Chain Reaction), 268 Detectar e Tratar Doenças, 308
7.2 PCR em Tempo Real Quantitativo (qRT-PCR) na
Análise de um Gene Associado com Câncer de
Próstata, 269
266 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
Conceitos Chaves
• A reação da polimerase em cadeia (PCR) é usada
para determinar as sequências dos ácidos nuclei
cos de genes, de seus sítios regulatórios e de seus
produtos.
• Endonucleases de restrição (RE) geram molécu
las de DNA para síntese de moléculas de DNA re
combinante. Moléculas de DNA de duas espécies
diferentes podem ser clivadas com a mesma RE,
gerando moléculas com extremidades fitas únicas
complementares, que podem ser aneladas e liga
das. Muitas cópias do DNA recombinante podem
ser geradas se uma espécie de DNA for um vetor
que replicará em uma bactéria ou célula.
• A clonagem de uma célula contendo uma molécula
recombinante específica requer técnicas para se
lecionar uma única bactéria ou célula com o DNA
de interesse, depois replicar a célula de modo que
todas as células filhas tenham o mesmo DNA re
combinante.
• Bibliotecas genômicas são geradas com a multi
plicidade de moléculas de DNA recombinante que
têm pedaços do DNA de um genoma inteiro ligados
a um vetor e transformados em bactérias ou célu
las. Clones específicos podem ser selecionados.
• Técnicas de hibridização de ácidos nucleicos com
sondas marcadas de DNA ou RNA podem detectar
padrões de DNA polimórfico nos DNAs genômicos
de diferentes indivíduos digeridos por endonu
cleases de restrição, espécies específicas de RNA e
clones portando um RNA recombinante específico.
7.1 INTRODUÇÃO
Por volta de 1970, o palco estava montado para a
biologia molecular moderna, com base em estudos de
muitos cientistas dos 30 anos anteriores, durante os
quais a ignorância sobre qual a entidade bioquímica
que orquestrava a replicação de formas de vida com tal
fidelidade, deu lugar a um estado no qual o sequencia
mento e a manipulação da expressão de genes tornar
-se-iam comuns. A marcha incansável em direção a um
entendimento total da regulação gênica em condições
normais e patológicas caminhou com rapidez crescen
te desde então. A identificação, purificação e carac
terização de endonucleases de restrição permitiram
o desenvolvimento de metodologias do DNA recombi
nante. O desenvolvimento do sequenciamento do DNA
revelou os segredos encerrados na organização de di
versos genomas procarióticos e eucarióticos, incluindo
o genoma humano. O delineamento de todos os genes
humanos e suas sequências regulatórias ampliaria
enormemente nosso entendimento sobre muitas doen
• Transcrição reversa gera cDNA a partir de mRNA
celular. Uma biblioteca de cDNA consiste de todos
os cDNAs produzidos a partir do total de mRNA
celular.
• Diferentes vetores podem ser recombinados com
DNA estrangeiro, com o número de pares de ba
ses indo de poucos milhares a centenas de milha
res. Pequenos insertos de DNA podem representar
o cDNA de um gene expresso, enquanto insertos
muito maiores são necessários para carregar um
gene genômico, com íntrons e éxons, juntamente
com os sítios regulatórios a montante e a jusante
(upstream e dowsntream, respectivamente).
• Vetores de expressão são espécies de DNA que com
binam com “genes” estrangeiros funcionais de modo
que, quando introduzidos em uma bactéria ou célu
la, o “gene” recombinante é transcrito e traduzido.
• Mutagênese sítio-dirigida com DNA recombinante
clonado pode resultar na perda seletiva de uma re
gião do DNA, a adição ou a perda de um ou alguns
poucos nucleotídeos, ou a troca seletiva de um úni
co nucleotídeo. “Genes” alterados são utilizados
para estudar a estrutura e a função da proteína
codificada.
• A regulação da expressão gênica em estados de
doenças ou metabolicamente alterados pode ser
estudada por tecnologias de DNA recombinante,
incluindo tecnologias de ácidos nucleicos comple
mentares (antisense), introdução de genes nor
mais onde há genes alterados e destruição de genes
em animais inteiros (animais knockout).
ças genéticas. Esse conhecimento, juntamente com
nossos avanços tecnológicos para manipular genes e a
expressão gênica, também abriria novas avenidas para
regular ou curar essas doenças. Centenas de testes clí
nicos em terapia gênica, envolvendo muitos pacientes,
foram iniciados. Doenças genéticas já identificadas e a
serem identificadas poderão eventualmente ser curá
veis por terapia de reposição gênica quando as barrei
ras técnicas tiverem sido removidas. Ao se observar
o enorme avanço feito em biologia molecular apenas
nas últimas três décadas, é razoável acreditar que o
“quando” não está tão longe assim. O velho desafio
que confrontava os cientistas era como sequenciar o
genoma humano; o novo desafio é como manipular efi
cientemente esse conhecimento para o benefício da
humanidade.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 267

Fragmento de DNA de sequência

7.2 REAÇÃO DA POLIMERASE desconhecida, inserido em um vetor
de sequência conhecida. RE
EM CADEIA
Antes de 1987, a análise da sequência e da função
de uma região específica de DNA requeria quantidades
relativamente grandes de um segmento purificado de
Plasmídeo vetor
DNA. A produção rápida de grandes quantidades de
uma sequência específica de DNA deu um salto para
frente com o desenvolvimento da reação da polimerase Fita A
DNA sem purificação,
em cadeia (PCR, polymerase chain reaction). Esta é aquecido a 95°C e
requer dois oligômeros de nucleotídeos que hibridizam RE resfriado. São adicionados
dois oligonucleotídeos
com fitas de DNA complementares em uma região de
RE complementares a cada
interesse. Os oligômeros servem de iniciadores (pri fita, franqueando o
mers) para uma DNA polimerase que estende cada fita. cDNA inserido.
Ciclos repetidos de PCR geram grandes quantidades FIta B
de cada molécula de DNA de interesse em questão de recombinante Etapas 1 e 2
Plasmídeo vetor
horas, em comparação aos dias e semanas necessários Fita A
para técnicas de clonagem. Fita B

A amplificação de uma sequência específica de

DNA por PCR pode ser feita com DNA purificado ou 5! 3! 5!
com uma mistura complexa de DNAs. Os princípios da Oligômero 3!
reação são apresentados na Figura 7.1. A sequência de
nucleotídeos do DNA a ser amplificado deve ser conhe Etapa 3 dNTPs+ DNA polimerase
cida ou deve ser clonada em um vetor (p. 288) para o
qual a sequência do DNA flanqueador tenha sido esta Fita B + Fita A
belecida. O produto do PCR é uma molécula de DNA
dupla-fita (dsDNA), e a reação se completa em cada Repetir etapas 1 & 2

ciclo quando todas as moléculas moldes são copiadas.

Para iniciar um novo ciclo de replicação, a amostra é
aquecida para fundir o dsDNA e, em presença de ex
cesso de oligonucleotídeos iniciadores, resfriada para
permitir hibridização do molde fita-única com oligô
meros livres. Replicação de DNA terá início em pre
sença de DNA polimerase e todos os quatro dNTPs. O
aquecimento a cerca de 95 °C, necessário para fundir
o DNA, inativa a maioria das DNA polimerases, mas
uma polimerase termoestável, chamada Taq DNA po
limerase, isolada de Thermus aquaticus, é hoje em
pregada, e elimina a necessidade de adição de nova
polimerase após cada ciclo. Isso permitiu a automação
do PCR, com cada molécula de DNA podendo ser am
plificada um milhão de vezes.
Uma DNA polimerase estável singular – PhusionTM
DNA polimerase de Alta Fidelidade – foi desenvolvida
comercialmente para PCR em aplicações de rotina e de
maior grau de exigência. Essa enzima foi construída
pela fusão de um domínio singular de ligação a ds-DNA
com uma polimerase de revisão semelhante à de Pyro
coccus. A processividade dessa enzima de fusão é cerca
de duas vezes a da Taq DNA polimerase, com uma taxa
de erro 50 vezes menor. Também, ao contrário da Taq
DNA polimerase, a enzima não é inibida por nenhuma
quantidade de sangue. Portanto, DNA genômico pode
ser amplificado diretamente a partir de gotas de san
gue, sem as custosas e demoradas etapas de purifica
ção, exigidas pela enzima Taq.
Repetir etapa 3
Fitas com uma unidade de comprimento
Repetir o ciclo 25–30 vezes.
Isso vai gerar aproximadamente 106
cópias do DNA com uma unidade
de comprimento.
FIGURA7.1 Reação da polimerase em cadeia (PCR).
Um fragmento de DNA de sequência desconhecida é inserido
em um vetor de sequência conhecida pela metodologia nor
mal de recombinação. O DNA recombinante de interesse não
precisa ser purificado. O DNA é aquecido a 95 °C para disso
ciar a dupla fita e resfriado em presença de excesso de dois
oligômeros diferentes complementares, que hibridizam com
as sequências conhecidas do DNA do vetor que flanqueiam o
DNA estrangeiro inserido. Só espécies recombinantes de DNA
fita-única podem servir de molde para a replicação do DNA, ge
rando fragmentos do DNA estrangeiro de fita-dupla ligados pe
las sequências de DNA dos oligômeros. O ciclo aquecimento
-replicação é repetido muitas vezes para produzir rapidamente
grandes quantidades do DNA estrangeiro original. O fragmento
de DNA de interesse pode ser purificado da mistura de PCR
por clivagem com a endonuclease de restrição (RE) original,
eletroforese da mistura de DNA em gel de agarose e eluição da
banda de interesse do gel.
268 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
PCRAninhado
Quando o DNA a ser amplificado está presente em
concentrações muito baixas em relação ao DNA total da
amostra, a região do DNA de interesse juntamente com
outras sequências espúrias pode ser amplificada. Nes
sa situação, a especificidade da reação de amplificação
pode ser aumentada pelo PCR aninhado. Depois de rea
lizar o primeiro PCR com um conjunto de primers por
10-20 ciclos, uma pequena alíquota é removida para um
segundo PCR. Entretanto, este é realizado com primers
que são complementares ao DNA molde imediatamente
à jusante dos primeiros primers, ou “aninhados” entre o
conjunto original de primers. Esse processo amplifica a
região do DNA de interesse duas vezes, com uma especi
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.1
Reação de Polimerase em Cadeia (Polymerase Chain Reaction)
A. PCR em Screening do Vírus da Imunodeficiência
Humana
O uso do PCR para amplificar quantidades diminu
tas de DNA revolucionou a detecção e a análise de es
pécies de DNA. Com o PCR, é possível sintetizar DNA
suficiente para análise. A detecção e a identificação
convencionais do vírus da imunodeficiência humana
(HIV), por exemplo por Southern blot-hibridização do
DNA e análise do antígeno, é muito trabalhoso e caro,
e tem baixa sensibilidade. Um indivíduo infectado, sem
nenhum sinal de AIDS (síndrome da imunodeficiência
adquirida), pode ter resultado falso negativo para HIV
com esses procedimentos. A detecção precoce de infec
ções por HIV é crucial para iniciar tratamento ou moni
torar a progressão da doença. Além disso, um método
sensível é necessário para se ter certeza que o sangue
doado por doadores não contém HIV. A amplificação
por PCR de sequências de DNA do HIV em potencial
no DNA isolado de glóbulos brancos de um indivíduo
permite a detecção da infecção antes da presença de
anticorpos, o assim chamado estado soro-negativo.
Com o advento de novos tratamentos com a combina
ção de antivirais (inibidores de proteases) para o HIV, o
potencial de mutações virais que levam à resistência a
drogas foi reduzido. Entretanto, alguns pacientes ainda
apresentam resistência a múltiplas drogas. Uma muta
ção comum no genoma viral, L9OM, leva à resistência
ao inibidor de proteases. A região viral gag-pro foi am
plificada e sequenciada usando PCR específico para o
alelo LpOM, com amostras de 15 pacientes no estágio
precoce da doença. Os resultados foram então compa
rados com amostras colhidas depois do tratamento com
drogas malsucedido nos pacientes. Os vírus L9OM eram
minoria dentro o total de vírus nas primeiras amostras.
Entretanto, essas espécies mutantes tornaram-se as
espécies dominantes no plasma de pacientes com re
sistência às drogas. Parece que a emergência dos vírus
dominantes contendo L9OM ocorreu em múltiplas oca
ficidade muito aumentada. O PCR tem muitas aplicações
em diagnóstico genético, investigações forenses para as
quais apenas uma gota de sangue seco ou um único fio
de cabelo está disponível, e em estudos de evolução com
material biológico preservado (Correlação Clínica 7.1).
Em 2008, uma nova tecnologia, PCR/DNA de toque, foi
aplicada para inocentar os pais do assassinato de sua fi
lha pequena, Jon Benet Ramsey. Essa metodologia pode
usar uma ou algumas poucas células aderidas a qualquer
superfície tocada por uma pessoa (nesse caso, a calça de
Jon Benet tocada pelo assassino) como uma fonte sufi
ciente de DNA para amplificar por PCR e analisar o fin
gerprint do DNA. Após mais de uma década de dúvidas,
os resultados finalmente inocentaram os pais nesse caso
horrível e amplamente divulgado.
siões em muitos dos pacientes, como determinado pela
análise evolucionária de Bayesian. A detecção precoce
da conversão do vírus de sensível a drogas para resis
tente a drogas por análise de PCR poderia ajudar a de
terminar o tratamento clínico para esses pacientes.
B. PCR Aninhado para Detectar Microquimerismo
Demonstrou-se que os leucócitos de doadores trans
feridos para pacientes durante transfusão de sangue so
brevivem no sangue periférico do receptor. O significa
do, se há, dessa população microquimérica de leucócitos
ainda não está esclarecido. Uma das melhores maneiras
de se detectar células derivadas do doador no sangue do
receptor é usar detecção por PCR de polimorfismos na
região HLA-DR do complexo maior de histocompatibili
dade (MHC). Um ensaio de PCR aninhado foi pelo menos
100 vezes mais sensível do que um ensaio de PCR padrão.
Entretanto, em virtude da sensibilidade aumentada, pro
dutos inespecíficos podem aparecer, em decorrência de
eventos de iniciação errada que geralmente estão asso
ciados com pseudogenes. Assim, é essencial estabelecer
um padrão de linha de base com amostras de sangue pré
-transfusão. Uma vez que potenciais falsos positivos te
nham sido excluídos com esses padrões de linha de base,
a detecção de leucócitos do doador é muito aumentada.
Kwok, S., e Sninsky, J. J. Application of PCR to the de
tection of human infectious diseases, in PCR technology,
235. Em Erlich, H. A. (Ed.), PCR: Technology Principles
and Applications for DNA Amplification, 2. ed. New York:
Stockton, 1989; e Kapoor, A., Shapiro, B., Shafer, R. W.,
Shulman, N. et al. Multiple independent origins of a protea
se inhibitor resistance mutation in salvage therapy patients.
Retrovirology 5:7, 2008.
Carter, A. S., Cerundolo, L., Bunce, M., Koo, D. D. H. et al.
Nested polymerase chain reaction with sequence-specific
primers typing for HLA-A, -B, and -C alleles: Detection of
microchimerism in DR-matched individuals. Blood 94:1471,
1999.

PCR Quantitativo em Tempo Real
PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) acopla a
reação de amplificação do PCR tradicional com a quan
tificação simultânea do DNA sintetizado após cada ciclo.
Essa técnica permite que se calcule o número de cópias
de uma sequência de DNA em um genoma. Também se
pode usar o método para determinar o nível relativo
de expressão de um gene em uma célula, iniciando
-se a reação com RT-PCR (reverse transcriptase-PCR,
transcriptase reversa PCR), produzindo um cDNA como
molde para o PCR. Em ambos os casos, a quantificação
do DNA produzido deve ser comparada com um gene
interno de manutenção (housekeeping), cujo nível de
expressão é quase igual em todas as células que estão
sendo estudadas. Hoje, existem algumas variações das
técnicas empregadas, sendo algumas mais rigorosas na
quantificação calculada do que outras, mas apenas o
processo mais direto será descrito aqui.
Embora RT-PCR/PCR geralmente usem primers
anteverso e reverso que geram DNAs produtos na fai
xa de 300-600 pb, qRT-PCR frequentemente emprega
primers que distam entre si de apenas 100 bases. O
método descrito aqui tira vantagem do fato do cromo
fluor SYBR green só se ligar ao DNA dupla-fita e não
ao DNA simples-fita. Quando se liga ao DNA dupla-fita,
fluoresce com muitas vezes mais brilho do que quando
está livre em solução. O DNA é amplificado a partir de
moldes de DNA ou cDNA em presença de SYBR green
em um instrumento de PCR que mede a fluorescência
do complexo SYBR green-DNA em cada ciclo. Portanto,
o aumento na fluorescência a cada ciclo é proporcional à
síntese em tempo real do DNA amplificado. Um gráfico
do log das unidades de fluorescência versus número de
ciclos dá uma relação linear durante a fase de ampli
ficação logarítmica do PCR. A parte linear da curva é
comparada com o padrão interno conhecido de manu
tenção (housekeeping) para quantificação do produto
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.2
PCR em Tempo Real Quantitativo (qRT-PCR) na Análise de um Gene Associado com Câncer de Próstata
Câncer de próstata é o tumor maligno predominante
em homens norte-americanos. Não existe cura conhe
cida para o câncer de próstata, depois que tenha ocor
rido metástases. Portanto, é muito importante identifi
car biomarcadores que estão associados com a doença
metastática e que podem servir como novos alvos tera
pêuticos. Duas linhagens celulares foram desenvolvidas
a partir de um paciente com câncer de próstata que,
quando transplantadas em camundongos imunodefi
cientes, ou apresentaram potencial metastático ou fo
ram não-metastáticas. A análise diferencial dos genes
expressos nas duas linhagens celulares detectou um
gene, ASAP1, na linhagem metastáticas, que não havia
sido anteriormente associado com o processo metas
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 269
do DNA/cDNA. Essa técnica é empregada para identi
ficar a expressão diferencial de genes específicos em
tecidos normal versus doente, em que o produto gênico
pode ter um papel no desenvolvimento de células anor
mais (Correlação Clínica 7.2).
7.3 ENDONUCLEASES DE
RESTRIÇÃO, MAPAS
DE RESTRIÇÃO E
SEQUENCIAMENTO DO DNA
Endonucleases de Restrição
Hidrolisam Seletivamente DNA
As endonucleases de restrição são capazes de dis
secar seletivamente moléculas de DNA de muitos tama
nhos e origens em fragmentos menores. Elas conferem
alguma proteção a bactérias contra vírus invasores
(bacteriófagos). Sequências de DNA bacteriano nor
malmente reconhecidas por uma endonuclease de res
trição são protegidas de clivagem em células hospe
deiras por metilação de bases no palíndrome. O DNA
viral não-metilado é reconhecido como estrangeiro e é
hidrolisado. Inúmeras endonucleases de restrição tipo
II estão hoje disponíveis comercialmente (ver p. 62 para
discussão de atividades de endonucleases de restrição).
As endonucleases de restrição permitem a constru
ção de um mapa de restrição, no qual o ponto de cli
vagem no DNA é identificado. Espécies purificadas de
DNA que contêm sequências susceptíveis estão sujeitas
à clivagem por endonucleases de restrição. Controlan
do-se o tempo de exposição de moléculas de DNA pu
rificadas à clivagem, é gerada uma população de frag
tático no câncer de próstata. qRTPCR confirmou que
ASAP1 (que codifica uma proteína ativadora de GTPase
do fator de ADP-ribosilação) estava sendo mais expres
sa (up-regulated) na linhagem celular metastática.
Além disso, a inibição da expressão de ASAP1 em cé
lulas de câncer de próstata por RNA pequeno de inter
ferência (siRNA; ver p. 206) reduziu muito o potencial
metastático dessas células por análise in vitro. Esse
gene pode ser um alvo importante para o tratamento
clínico do câncer de próstata metastático.
Lin, D., Watahiki, A., Bayani, J., Zhang, F. et al. ASAP1, a
gene at 8q24, is associated with prostate cancer metastasis.
Cancer Res. 68:4352, 2008.
270 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

2.2 kb organelas, como DNA mitocondrial, en

tre espécies (Correlação Clínica 7.3).
Também podem ser usados para detec
tar mutações por deleção nas quais um
2.6 kb 4.1 kb fragmento de DNA da cepa parental mi
gra como um fragmento menor na cepa
mutada. E, o mais importante, as endo
nucleases de restrição cortam DNA em
1.2 kb
fragmentos definidos homogêneos, que
Endonuclease de restrição podem ser completamente purificados.
Esses mapas são cruciais para clonagem
Clivagemparcial kb Composiçãodebandas Clivagem kb Nomearbitrário
e paradeosuas
DNA sequenciamento de genes e do
sequências flanqueadoras.
completa

6.3 B+D 1.2 A

5.3
7.9 A+
AC+D
+D 2.2
2.6 C
B Método de Clivagem

4.8 B+C 4.1 D Enzimática Interrompida:

3.8 A+C Procedimento de Sanger
6.0
8.9 A+
B +C
B++C
D B
No final da década de 1970, duas téc
nicas diferentes de sequenciamento fo
ram desenvolvidas, uma por A. Maxam
Arranjo C e W. Gilbert, a abordagem por clivagem
D
deduzido dos química, e a outra por F. Sanger, a abor
fragmentos de DNA dagem enzimática. Ambos os procedi
mentos empregavam marcação de um
A nucleotídeo terminal, seguida pela sepa
ração e detecção dos oligonucleotídeos
FIGURA7.2 Mapeamento do DNA por endonuclease de restrição.
DNA purificado é submetido a digestão por endonuclease de restrição por tempos gerados. O método de Sanger tornou-se
variáveis, o que gera fragmentos de DNA parcialmente ou totalmente clivado. Os o método de escolha em virtude da rela
fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose e corados com bro tiva facilidade do processo e sua capaci
meto de etídio. As bandas são vistas com uma fonte de luz UV e fotografadas. O dade de sequenciar segmentos mais lon
tamanho dos fragmentos é determinado pela migração relativa no gel, em compara gos de DNA (400 bases) em relação ao
ção com padrões de DNA na mesma eletroforese. A disposição relativa de cada frag método de Maxam-Gilbert (250 bases).
mento na molécula de DNA pode ser deduzida a partir do tamanho dos fragmentos
incompletamente hidrolisados. O procedimento de Sanger baseia-se
na terminação aleatória de uma cadeia
mentos de DNA de diferentes tamanhos. A separação de DNA durante síntese enzimática. A técnica depende
desses fragmentos por eletroforese em gel de agarose dos análogos didesoxinucleotídeos de todos os quatro
permite a construção de um mapa de restrição; um nucleotídeos normais (Figura 7.3), ao serem incorpora
exemplo é apresentado na Figura 7.2. O uso sequencial dos em uma cadeia de DNA em crescimento pela DNA
de diferentes endonucleases de restrição permitiu fazer polimerase, bloquearem a elongação. A ribose do dideso
um mapa de restrição detalhado de várias espécies de xinucleotídeo trifosfato (ddNTP) não tem o grupo OH de
DNA circular, incluindo plasmídeos bacterianos, vírus nenhuma das posições 2! e 3!, enquanto dNTP não tem
e DNA mitocondrial. O método é igualmente aplicável a apenas um grupo OH da posição 2!. Portanto, o ddNTP
fragmentos de DNA linear que tenham sido purificados incorporado à cadeia em crescimento é incapaz de for
até homogeneidade. mar ligação fosfodiéster com outro dNTP porque a po
sição 3! da ribose não contém um grupo OH. A molécula
de DNA em crescimento pode ser terminada em pontos
Mapas de Restrição Permitem a aleatórios pela inclusão no sistema da reação de dNTP
e ddNTP (por exemplo, dATP e ddATP), em concentra
Preparação Rotineira de Segmentos ções tais que os dois nucleotídeos possam competir por
Definidos de DNA incorporação. A identificação dos fragmentos de DNA re
quer marcação da extremidade 5! das moléculas de DNA
Os mapas de restrição podem dar pouca informa ou a incorporação de nucleotídeos marcados durante a
ção quanto aos genes ou aos elementos regulatórios síntese. A técnica, esquematizada na Figura 7.4, funcio
nos vários fragmentos de DNA. Eles foram usados para na melhor com DNA fita-única puro; entretanto, DNA
demonstrar a diversidade de sequências em DNAs de fita-dupla desnaturado também pode ser usado.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.3
Mapas de Restrição e Evolução
No passado, os estudos da evolução das espécies
dependiam exclusivamente de mudanças anatômicas
observadas em registros fósseis e na datação por car
bono. Esses estudos têm sido apoiados pelas análises
moleculares das sequências e dos tamanhos de genes
específicos ou moléculas inteiras de DNA. Alterações
em uma molécula específica de DNA de diferentes es
pécies podem ser rapidamente verificadas por mapea
mento de restrição, que requer uma preparação pura de
DNA. Mitocôndrias de mamíferos contêm uma molécu
la de DNA circular fechada com 16.569 pb, que pode ser
rapidamente purificada de células. O DNA mitocondrial
(mtDNA) pode ser empregado diretamente para o estu
do de mudanças evolutivas em DNA, sem a necessidade
de clonar um gene específico.
O mtDNA foi purificado de babuíno da Guiné, ma
caco rhesus, gibão e do homem, e foi clivado por 11 en
donucleases de restrição diferentes. Os mapas de res
trição foram alinhados com relação à direção e ao sítio
nucleotídico por onde a replicação do DNA se inicia.
Uma comparação dos sítios de endonucleases de restri
ção permitiu calcular o grau de divergência nas sequ-
ências de nucleotídeos entre as espécies. A velocidade
de substituição de bases (calculada a partir do grau de
divergência versus tempo de divergência) é cerca de
10 vezes maior do que as mudanças no genoma nuclear.
Essa alta taxa de mutação da molécula de mtDNA fa
cilmente purificada faz dela um excelente modelo para
estudar as relações evolutivas entre espécies.
BASE
O O O um bacteriófago recombinante de fita-única (p. 287), no
5!
–O P O P O P O CH2
O
O– O– O– 4! H H
H 3!
Desoxinucleosídeo trifosfato HO 2!H
BASE
O O O de bacteriófago T 7. A mistura de reação, composta do
5!
–OPOPOPOCH
2O
H H
O– O– O– 4!
H 3! 2!
Didesoxinucleosídeo trifosfato H H
FIGURA7.3 Estrutura de desoxinucleosídeo trifosfato e
didesoxinucleosídeo trifosfato.
O grupo 3!-OH está faltando na ribose componente dos dideso
xinucleotídeos trifosfato (ddNTP). Essa molécula pode ser in
corporada em uma molécula de DNA em crescimento por uma
ligação fosfodiéster com seu 5!-fosfato. Uma vez incorporado,
o ddNTP bloqueia o prosseguimento da síntese da molécula
de DNA, uma vez que não tem o grupo aceptor 3!-OH para um
novo nucleotídeo.
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 271
Análise do mtDNA pode ser usada para estudar os
padrões de migração de pessoas que se assentaram
em diversas regiões geográficas, mas possuem os mes
mos padrões gerados por enzimas de restrição (poli
morfismo de comprimento de fragmentos de restrição
[RFLP]). Os nativos americanos foram agrupados em
quatro haplogrupos principais, com base em seus pa
drões de restrição de mtDNA. Esses grupos parecem
ser descendentes do povo Clovis (Paleoíndio) que mi
grou da Ásia e da Sibéria e entrou na América do Norte
imediatamente antes do período da grande glaciação. O
momento desse evento migratório varia de estudo para
estudo. Entretanto, a análise do mtDNA, amplificado de
fezes fósseis (coprolitos humanos) no Oregon, parece
provar que seres humanos povoaram as Américas antes
do chamado povo Clovis. As sequências de mtDNA re
presentam os haplogrupos A2 e B2 fundadores dos Na
tivos Americanos, e as amostram precedem os restos
Clovis por, pelo menos, 1.000 anos.
Brown, W. M., George, M., Jr., e Wilson, A. C. Rapid evo
lution of animal mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76:1967, 1979; Schurr, J. G. Mitochondrial DNA and the
people of the new world. Amer. Sci. 88:246, 2000; Gilbert,
M. T., Jenkins, D. L., Gotherstrom, A., Naveran, N. et al. DNA
from pre-Clovis human coprolites in Oregon, North Ameri
ca. Science 320:786, 2008; e Balter, M. DNA from fossil feces
breaks Clovis barrier. Science 320:37, 2008.
O DNA a ser sequenciado é frequentemente isolado de
qual uma região que flanqueia o DNA de interesse contém
uma sequência complementar a um primer universal. O
OH
1!
primer pode ser marcado com nucleotídeo 32P ou 35S. A
extensão do primer é realizada com uma dentre várias
DNA polimerases; uma com grande versatilidade é uma
forma geneticamente engenheirada da DNA polimerase
DNA alvo, o primer marcado e todos os quatro dNTPs, é
dividida em quatro tubos, cada um contendo um ddNTP
1!
OH
diferente. Os ddNTPs são incorporados aleatoriamente
durante a síntese enzimática do DNA e causam termina
ção da cadeia. Como o ddNTP está presente no tubo de
reação em baixa concentração em relação ao dNTP cor
respondente, a terminação da síntese de DNA ocorre ale
atoriamente em todos os possíveis sítios complementares
do DNA molde. Isso gera moléculas de DNA de tamanhos
variáveis, marcadas na extremidade 5!, que podem ser
separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. As
espécies marcadas são detectadas por autorradiografia
de raios-X, e a sequência é lida.
272 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

DNA de interesse
5! 3!
35S 5!
“Primer universal”

DNA polimerase
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4
Mistura +ddGTP ddG ddC ddA ddT
de reação +dGTP
+dATP Eletroforese em gel
de poliacrilamida Sequência
+dCTP Topo
+dTTP C
A
FIta molde G
5! 3! G
T
C CC C C
35S 5! T
T
G G
de DNA
Síntese 35S 5! A
C
G
A
35S 5! C
C
G
G
35S 5!
Fundo
G Autoradiografia do gel

(a) Bacteriófago M13 recombinante (b) Eletroforese em gel de poliacrilamida da mistura de reação

FIGURA7.4 O método de Sanger do didesoxinucleosídeo trifosfato para sequenciar DNA.

A região de interesse do DNA é inserida na molécula de DNA de uma DNA polimerase, e todos os quatro dNTPs mais um ddNTP,
um bacteriófago. A replicação do bacteriófago produz uma molé por exemplo, ddGTP. A síntese para toda vez que um ddNTP é
cula de DNA recombinante fita-única, que é facilmente purifica incorporado à molécula nascente. Note que o ddNTP compete
da. A sequência conhecida do DNA do bacteriófago à jusante do pela incorporação com o dNTP. Isso gera fragmentos de DNA
DNA inserido serve de sítio de hibridização para um oligômero marcados na extremidade de todos os comprimentos possíveis,
marcado na extremidade com uma sequência complementar, que são separados por eletroforese. A sequência do DNA pode,
um primer universal. A extensão desse primer é catalisada por então, ser determinada a partir de padrões de eletroforese.

Inicialmente, esse método requeria um molde de
DNA fita-única, produção de um oligossacarídeo inicia
dor complementar específico, e uma preparação relati
vamente pura do fragmento Klenow da DNA polimerase
I de E. coli. Essas dificuldades foram superadas, e mo
dificações simplificaram o procedimento.
Os métodos de PCR e Sanger são combinados para
sequenciamento direto de regiões pequenas do DNA de
interesse. O produto dupla-fita do PCR é empregado di
retamente como molde. As condições são estabelecidas
de modo que uma fita de DNA fundido (molde) anele
com o primer em preferência ao reanelamento com a
fita complementar. O sequenciamento, então, segue a
reação de terminação da cadeia por didesoxi padrão
(tipicamente com Sequenase substituindo a polimerase
Klenow), com síntese de cadeias de comprimentos aleató
rios, ocorrendo como extensão do primer do PCR. Esse
método foi utilizado com sucesso para o diagnóstico de
doenças genéticas (Correlação Clínica 7.4).
Sequenciamento por Corante
Terminador
cos do método enzimático de Sanger são empregados;
entretanto, cada ddNTP tem uma marca fluorescente,
com um fluoróforo de cor diferente. Como cada ddNTP
colorido termina a reação, gerando oligonucleotídeos de
diferentes tamanhos com fluoróforos de diferentes co
res, não é necessário fazer quatro tubos de reação. Uma
única reação é realizada, com os produtos separados
por eletroforese capilar e sequenciados por um sequen
ciador de DNA automatizado, de alto desempenho. A
análise do cromatograma de uma amostra e a sequência
derivada é apresentada na Figura 7.5.
O método de sequenciamento por corante-termina
dor é, como o método de Sanger, capaz de sequenciar 400
bases de uma vez. Novos métodos, que baixariam muito
o custo e, concomitantemente, aumentariam muito ota
manho das cadeias de DNA que estão sendo seqüencia
das, estão sendo desenvolvidos e explorados. O objetivo
final desses métodos mais desenvolvidos é a capacidade
de sequenciar rapidamente o genoma inteiro de indivídu
os, a um custo inferior a US$ 1.000,00. A realização desse
objetivo permitiria aos clínicos e aos cientistas correla
cionar genes alterados ou mutados com doenças genéti
cas, prever a progressão clínica de doenças, e desenvol
ver drogas ou terapias gênicas para cada indivíduo.

O desenvolvimento do método de sequenciamento É possível que a capacidade de sequenciar rotinei

por corante-terminador simplificou, acelerou, e reduziu ramente o genoma de indivíduos seja conquistada em
o custo do sequenciamento do DNA. Os princípios bási poucos anos. Entretanto, hoje, outras tecnologias já
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 273

ça
das
estãoda
umAs
humanas,
víduo
15
de As
morphisms).
p.
vez,
(HapMap)
aparecimento
como
associadas
co
quência
radas
mento
contorna
(BS,
com
Sequenciamento
nação.
permitirá
frequência
geral.
em
DNA
estado
(três
se)
tos
rizadas
pacientes
quatro
diagnóstico
295),
milhões
outubro
SNPs
nucleotídeo
genética
em
resultaram
células
níveis
mutações
diabetesuma
desenvolver
Bloom
BS
genômico
Síndrome
Onciercq-Delic,
tions
12:257,
Amor-Gueret, mais
um
associated
2008.
disponíveis
indivíduo
eram
primeiras
e,
direto
centenas
Postula-se
clínico
pode-se
mutações
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de na
apresentam
dando
CORRELAÇÃO
R., no
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frequentemente,
de
células
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regiões
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2007,
no M., um
paciente.
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alto
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indicações
dificuldades.
foi
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SNPs
DNA
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doenças
paciente.
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introdução
mais
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grau
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Bloom:
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outro
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gene
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DNA
genômico
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BLM.
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instabilidade
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uma
DNA
de
forma
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A
de
Esse
humano
500.000
tipos
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com
para
210900) BS
uma
BLM
amplificado
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síndrome
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Dubois-d’Enghien,
Bloom
al.
CLÍNICA
Three Os
as
Genet.
indivíduos.
Todas
eentre
de
variações
haplótipos
oDoença
syndrome.
7.4
new eram
ou
rara.
para
cromátides
SNPs
com
potencial
método
determinar
nucleotide
que
ade
matrizes
códon
de
detecção
de
população
de
Postula-se
O
mutações
metodológica
possam
polimorfismos
SNPs
caras,
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podem
Diagnósti-
são
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câncer
combinações
C.,foi
Bloom)
genética. uma
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sequencia-
uma
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Genética
de
pacientes
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direto
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detectou
por
genéticas
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gerado.
humanos
Por
genedo
de
(array,
Bloom
demo-
termi-
doen-
de
estar
Lauge,variar
aPCR
com
poly-
volta
indi-
dos
em
e
se-
que
al-
Testing
muta-do
tais
O
oO
A.,

FIGURA7.5 Cromatograma de uma sequência de DNA gerada pelo método de

sequenciamento corante-terminador.
É mostrada a sequência parcial do DNA amplificado por PCR a partir do cDNA da metaloproteinase
de matriz 2 (MMP2), de granulócito humano. Cada ddNTP é marcado com um fluoróforo de cor di
ferente. As cores de cada pico correspondem ao nucleotídeo colorido apresentado no topo da figura.
Dados do laboratório de G. Soslau, Drexel Universty College of Medicine, Philadelphia, PA.
274 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
7.4 DNA RECOMBINANTE,
CLONAGEM E SELEÇÃO DE
CLONES
DNAs de Diferentes Fontes Podem
Ser Ligados para Formar uma Nova
Espécie de DNA: DNA Recombinante
A capacidade de clivar seletivamente uma população
de moléculas de DNA com endonucleases de restrição
levou à técnica de unir duas moléculas diferentes de
DNA, chamada DNA recombinante. Esse procedimen
to, combinado com técnicas de replicação, separação e
identificação, permite a produção de grandes quanti
dades de fragmentos de DNA purificados. As técnicas
combinadas, referidas como tecnologia do DNA recom
binante, permitem a remoção de um pedaço de DNA
de uma molécula maior complexa, tal como o genoma
de um vírus ou humano, e a amplificação do fragmento
de DNA. Foram preparados DNAs recombinantes que
combinam fragmentos de DNA de bactérias com frag
mentos humanos, vírus com vírus, e assim por diante.
A ligação de dois pedaços diferentes de DNA é conse
guida por uma endonuclease de restrição e uma DNA
ligase. São usadas muitas endonucleases de restrição,
variando em sua especificidade de sequência de nucleo
tídeos (Seção 7.3). Algumas hidrolisam as duas fitas do
DNA de modo desencontrado, produzindo extremida
des grudentas, ou coesivas (Figura 7.6), enquanto ou
tras cortam as duas fitas simetricamente, produzindo
uma extremidade cega. Uma enzima de restrição espe
cífica corta o DNA exatamente na mesma sequência
de nucleotídeos, independentemente da fonte do DNA
(bactéria, planta, mamífero etc.). Uma molécula de
DNA pode ter nenhum ou inúmeros sítios de reconhe
cimento para uma endonuclease de restrição em parti
cular. O corte desencontrado resulta em fragmentos de
DNA com extremidades fita-única. Quando diferentes
fragmentos de DNA gerados pela mesma endonuclease
de restrição são misturados, suas extremidades fita
-única podem hibridizar ou anelar. DNA ligase une os
dois fragmentos para produzir uma molécula de DNA
recombinante.
Os fragmentos de DNA que contêm extremidades
cegas também podem ser ligados, mas com eficiência
muito menor. A eficiência é aumentada adicionando-se
enzimaticamente caudas de poli(dA) a uma espécie de
DNA, e caudas de poli(dT) à segunda espécie. Os frag
mentos com caudas complementares podem ser anela
dos e ligados.
EcoRI EcoRI
DNA1 DNA2
Fragmentos de DNA
3! 3!
1A 1B 2B
5! 2A 5!
Os fragmentos são
misturados e as
extremidades
coesivas anelam
3! 3!
5! 5!
Extremidades 3!, 5!
seladas pela DNA ligase
DNA recombinante
FIGURA7.6 A formação do DNA recombinante a partir
de fragmentos gerados por endonuclease de restrição
contendo extremidades coesivas.
Muitas endonucleases de restrição hidrolisam DNA de modo
desencontrado, gerando fragmentos com regiões de fita-única
nas suas extremidades 3! e 5!. Fragmentos de DNA gerados a
partir de moléculas diferentes com a mesma endonuclease de
restrição têm extremidades fita-única complementares, que po
dem ser “aneladas” e ligadas covalentemente com uma DNA
ligase. Todas as diferentes combinações são possíveis numa
mistura. Quando dois fragmentos de DNA de diferentes origens
se combinam, resulta uma molécula de DNA recombinante.
Vetores de DNA Recombinante São
Produzidos por Clonagem
Incorporando-se um DNA recombinante em uma
célula que permita replicação do DNA recombinante,
pode ser conseguida a amplificação do DNA de interes
se. É empregado um DNA carregador, ou vetor de clo
nagem. Plasmídeos bacterianos são ideais como vetores
de DNA recombinante.
Muitas bactérias contêm um único cromossomo cir
cular de aproximadamente 4 × 106 pares de bases (pb)
e moléculas de DNA minicirculares chamadas plasmí
deos. Os plasmídeos geralmente contêm apenas poucos
milhares de pares de bases e raramente estão associa
dos com os cromossomos maiores. Genes em um plasmí
deo incluem os que conferem resistência a antibióticos
para a bactéria, um atributo útil na seleção de colônias
específicas da bactéria. Os plasmídeos replicam-se in
dependentemente da replicação do principal cromos
somo bacteriano. Um tipo de plasmídeo, os plasmídeos
de controle relaxado, pode estar presente em dezenas
ou centenas de cópias por bactéria, e sua replicação
depende exclusivamente das enzimas do hospedeiro
que têm meias-vidas longas. Portanto, a replicação de
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 275

plasmídeos “relaxados” ocorre em EcoRI

4361 BamHI
presença de um inibidor de síntese ScaI 375
proteica. As bactérias podem acumu 3846 SalI
lar milhares de cópias do plasmídeo PvuI 651
por célula nessas condições. Graças 3735 Gene que confere
PstI resistência à tetraciclina
a isso, o tipo de plasmídeo relaxado é
3609 BspMI
rotineiramente usado para produzir Gene que confere 1063
DNA recombinante. Em plasmídeos resistência à ampicilina Plasmídeo
pBR322
sujeitos a controle estringente, a re
plicação depende da síntese contínua
de proteínas codificadas no plasmí
deo. Esses plasmídeos replicam com
mais ou menos a mesma velocidade do
ori
grande cromossomo bacteriano, e só
poucas cópias ocorrem por célula.
FIGURA7.7 O plasmídeo pBR322 construído no laboratório para conter
O primeiro DNA recombinante características que facilitam a clonagem de fragmentos de DNA estrangeiro.
prático continha DNA estrangeiro li Por convenção, a numeração dos nucleotídeos começa com o primeiro T na única
sequência de reconhecimento por EcoRI (GAATTC), e as posições no mapa referem
gado com o vetor plasmídeo pSC101
-se à base 5! dos vários sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição. São
de E. coli, que contém um sítio de en mostrados apenas alguns destes, nos genes de resistência a antibióticos e nenhum dos
donuclease de restrição EcoRI e um sítios onde uma enzima corta mais de uma vez.
gene que confere resistência a anti
biótico para a bactéria. O plasmídeo contém uma ori restrição (Figura 7.8); vetores com polylinkers são
gem de replicação e sequências regulatórias associadas ideais para esse propósito. O uso de duas enzimas gera
no DNA, que são em conjunto chamadas um replicon. fragmentos de DNA e plasmídeos linearizados com ex
Entretanto, o sítio único de endonuclease de restrição tremidades coesivas diferentes. Nessas condições, o
limita os fragmentos de DNA que podem ser clonados plasmídeo é incapaz de reanelar consigo mesmo. Além
aos gerados por EcoR1; o único marcador de seleção disso, o DNA estrangeiro é inserido no vetor em apenas
por resistência a antibiótico reduz a conveniência de se uma orientação. Isso é extremamente importante quan
leção, e o plasmídeo replica pouco. do se clona um gene potencialmente funcional à jusante
dos elementos regulatórios do promotor em vetores de
Plasmídeos vetores com maior versatilidade foram expressão.
construídos pela tecnologia do DNA recombinante.
As características desejáveis de um plasmídeo vetor
incluem um peso molecular relativamente baixo (3-5 Bactérias Transformadas com DNA
quilobases [kb]) para acomodar fragmentos maiores,
vários sítios de restrição diferentes, úteis para clonar Recombinante e a Necessidade de
fragmentos variados, múltiplos marcadores de seleção
para ajudar a selecionar bactérias com moléculas do um Processo de Seleção
DNA recombinante, e uma alta taxa de replicação. O A introdução artificial de DNA em uma bactéria é
primeiro plasmídeo construído (Figura 7.7) para satis chamada transformação. É realizada pela breve expo
fazer essas necessidades foi pBR322, que é usado para sição das células a cátions divalentes, o que as torna
gerar muitos vetores em uso hoje em dia. Estes contêm transitoriamente permeáveis a pequenas moléculas de
uma sequência de DNA inserida chamada polylinker, DNA. Moléculas de plasmídeos recombinantes conten
um banco de sítios de restrição ou sítio de policlona do o DNA estrangeiro podem ser introduzidas na bacté
gem, que contém numerosos sítios para endonucleases ria e replicar normalmente.
de restrição específicos do plasmídeo.
Uma vez que o plasmídeo tenha sido introduzido em
uma bactéria, ambos podem replicar. Durante o pro
Clonagem Direcional: DNA Inserido cesso de transformação, algumas bactérias podem não
captar um plasmídeo ou podem ser transformadas com
em DNA Vetor em uma Direção um vetor que não carrega o DNA estrangeiro; na prepa
Específica ração, alguns vetores podem reanelar sem a inclusão do
DNA estrangeiro. Em algumas condições experimen
A clonagem direcional reduz o número de recombi tais, fragmentos de DNA são gerados que são facilmen
nantes variáveis e aumenta a probabilidade de seleção te purificados a partir de espécies de DNA pequenas,
do recombinante desejado. A inserção do DNA estran muito puras, por exemplo alguns DNAs de vírus. Mais
geiro com uma polaridade definida em um plasmídeo comum, contudo, é que endonucleases de restrição ge
vetor, sem que o plasmídeo se feche novamente, pode rem numerosos fragmentos de DNA, cujo número de
ser realizada empregando-se duas endonucleases de pende do tamanho e da complexidade do DNA que está
276 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

PstI SacI SalI PstI nuclease de restrição. Ajustando-se a

razão entre plasmídeo e DNA estran
geiro, a probabilidade de juntar pelo
1 Digerir ambos os DNAs menos uma cópia de cada fragmento
separadamente com de DNA em um DNA recombinante
Sac I and Sal I Polylinkers
plasmidial cíclico aproxima-se de um.
EcoRI
HindIII
SalI Geralmente, apenas um fragmento de
SacI BamHI XbaI DNA é inserido em cada plasmídeo ve
tor. Bactérias são transformadas com
as moléculas recombinantes de modo
2 Purificar o DNA a ser BamHI
XbaI
que um plasmídeo seja captado por
clonado a partir de um
gel de agarose e misturar uma bactéria. Cada molécula recom
com o plasmídeo digerido binante é, então, replicada dentro da
bactéria; esta produz descendentes,
TCGAC
G C
GAGCT
G TCGAG
C cada uma carregando múltiplas cópias
CAGCT
do DNA recombinante. A população
total de bactérias resultante conterá
3 Anelar e ligar com DNA ligase
fragmentos de DNA que podem repre
sentar o genoma humano inteiro. Isso
CAGCTG
GTCGAC GAGCTC é chamado uma biblioteca genômica.
CTCGAG Como em qualquer biblioteca contendo
milhares de volumes, deve existir um
sistema de seleção para se encontrar o
FIGURA7.8 Clonagem direcional de DNA estrangeiro em vetores, em uma livro ou o gene de interesse.
orientação específica.
A inserção de um fragmento de DNA estrangeiro em um vetor com uma orientação Os plasmídeos são comumente em
específica requer duas sequências diferentes de anelamento, uma em cada extremi pregados para clonar fragmentos de
dade do fragmento, e da sequência complementar correspondente das duas extre DNA gerados a partir de DNA de tama
midades geradas no vetor. Duas sequências de anelamento diferentes são geradas
nho e complexidade limitados, como ví
por endonucleases de restrição específicas, que hidrolisam o fragmento de DNA es
trangeiro e o vetor. Um polylinker, com vários sítios específicos para endonucleases rus, e para subclonar fragmentos gran
de restrição no vetor, facilita a clonagem direcional. O conhecimento do mapa de des de DNA, clonados anteriormente
restrição do DNA de interesse permite a seleção das endonucleases de restrição em outros vetores. Fragmentos de DNA
apropriadas. genômico são geralmente clonados a
partir de vetores capazes de carregar
sendo usado, e fragmentos individuais não podem ser fragmentos maiores de DNA estrangeiro que os plasmí
isolados a partir dessas amostras. As endonucleases de deos (p. 288).
restrição não produzem necessariamente fragmentos
que contêm genes intactos. Um fragmento pode conter
um gene inteiro, mas não as sequências regulatórias
flanqueadoras necessárias, como a região do promotor.
Seleção de Bactéria Transformada
Se o gene estrangeiro for originário de mamífero, suas por Perda de Resistência a
sequências regulatórias não seriam reconhecidas pela
maquinaria de síntese bacteriana. O transcrito primá Antibiótico
rio do gene (pré-mRNA) pode conter íntrons, que não
Quando uma única bactéria transformada carregan
podem ser processados pela bactéria. Foram desenvol
do um DNA recombinante se multiplica, todos os seus
vidos métodos para selecionar bactérias que contêm o
descendentes carregarão cópias do mesmo plasmídeo
DNA desejado.
recombinante. O problema é como identificar a colônia
que contém o plasmídeo desejado em um universo de
milhares a milhões de colônias bacterianas diferen
Moléculas de DNA Recombinante tes. O plasmídeo construído pBR322 e suas modifica
em uma Biblioteca Gênica ções carregam dois genes que conferem resistência a
antibióticos e são sensíveis a várias endonucleases de
Quando uma mistura de milhares de genes diferen restrição. Quando um fragmento de DNA estrangeiro
tes, localizados em diferentes cromossomos como no é inserido em um sítio de restrição dentro de um deles,
genoma humano, é submetida a clivagem por uma úni o gene fica não-funcional e as bactérias que carregam
ca endonuclease de restrição, são gerados milhares de esse plasmídeo recombinante são sensíveis ao antibióti
fragmentos de DNA. Esses fragmentos de DNA podem co (Figura 7.10). Contudo, o segundo gene de resistência
ser anelados com um plasmídeo vetor que foi clivado a antibiótico do plasmídeo permanece intacto e as bacté
para produzir uma molécula linear pela mesma endo rias serão resistentes a esse antibiótico. Essa inativação
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 277

por inserção de produtos de genes no

1 Inativação por inserção
plasmídeo permite a seleção de bacté
rias que carregam os plasmídeos re
combinantes.
DNA genômico
ampr pBR322 tetr
Endonuclease
de restrição n fragmentos de DNA
O pBR322 contém genes que con
ferem resistência à ampicilina (ampr)
e à tetraciclina (tetr). Uma biblioteca
ampr ampr Endonuclease
gênica de fragmentos de DNA celular de restrição
inseridos no gene tetr pode ser sele
cionada e examinada em dois estágios
(Figura 7.9). Primeiro, as bactérias são ampr
crescidas em um meio de cultura con
tendo ampicilina. As bactérias que não
foram transformadas, como não têm
plasmídeo normal nem recombinante,
não crescerão em presença do anti
biótico, e essa população de bactérias
é eliminada. Isso, contudo, não indica tetr tetr
quais das bactérias remanescentes,
viáveis, carregam um plasmídeo vetor
recombinante, e não um plasmídeo
sem inserto de DNA. A segunda etapa tetr

é identificar as bactérias que carregam Plasmídeo reanelado Plasmídeo recombinante Sequências lineares de
vetores recombinantes, com genes tetr sem um fragmento de com o DNA inserido DNA recombinante
DNA estrangeiro inativa o gene tetr
não-funcionais, e que são, portanto,
sensíveis a tetraciclina.
2 Transformação de interesse
As bactérias resistentes à ampicilina
são plaqueadas e crescidas em placas
de agar contendo ampicilina (Figura
7.9). Placas réplicas são feitas tocando ampr tetr ampr tetr não cresce

-se as colônias da placa de agar original

com um filtro e, depois, tocando placas
adicionais estéreis com o filtro. Todas Bactéria com plasmídeo normal Bactéria com plasmídeo Bactéria
as placas conterão partes de cada colô recombinante não-transformada
BIBLIOTECA GÊNICA
nia original em posições identificáveis
nas placas. A placa réplica pode conter
3 Identificação de DNA de interesse Colônias
tetraciclina, que matará as bactérias
que abrigam um gene tetr interrompido. sensíveis à
tetraciclina
A comparação das placas réplicas com
e sem tetraciclina indica quais colônias Placa de
da placa original com ampicilina con agar
contento
têm plasmídeos recombinantes. ampicillina

Sondas de DNA ou RNA (p. 280 e Placa replica

contendo tetraciclina
281) são usadas para identificar o DNA Placa réplica em
filtro de nitrocelulose
de interesse. Colônias de bactérias re
sistentes à ampicilina no agar podem
Hibridizar
ser replicadas em um filtro de nitroce com sonda
lulose e as células aderidas lisadas com de 32P-DNA Colônias contendo o DNA de interesse clonado
NaOH (Figura 7.9). O DNA das bacté
rias lisadas é também desnaturado pelo
Autoradiografia
NaOH e fica firmemente ligado ao filtro.
FIGURA7.9 Inativação por inserção de plasmídeos recombinantes e detecção de bactérias transformadas
carregando um DNA clonado de interesse.
Quando a inserção de um fragmento de DNA estrangeiro em um vetor interrompe uma sequência de um gene funcio
nal, o DNA recombinante resultante não expressa o gene. O gene que codifica a resistência à tetraciclina (Tetr) é des
truído por inserção do DNA, enquanto o gene de resistência à ampicilina (Ampr) permanece funcional. A destruição
de um gene de resistência e retenção de um segundo gene de resistência a antibiótico permite a detecção de colônias
bacterianas que carregam o DNA estrangeiro de interesse no vetor de replicação recombinante.
278 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Etapa 1 Uma sonda marcada de DNA ou de RNA comple

Amplificação da região de DNA de interesse pelo PCR mentar ao DNA de interesse hibridizará com o DNA
ligado à nitrocelulose. O filtro é, então, testado por
5! Primer 1 autorradiografia de raios-X, que detectará todas as
colônias que carreguem o DNA clonado de interesse.
3! Primer 2 Essas manchas indicam as colônias na placa de agar
original que podem ser crescidas em uma cultura em
Região de interesse larga escala para manipulação.

PCR do híbrido DNA/primer

Os fragmentos de DNA clonados e amplificados
desnaturado e anelado geralmente não contêm um gene completo e não são
expressos. Os insertos de DNA, entretanto, podem ser
1
facilmente purificados para sequenciamento ou usa
O produto do PCR
dos como sondas para detectar genes em uma mistura
2
de DNA genômico, para analisar os níveis de transcri
ção de mRNA, e para detectar mutações que provo
cam doenças.
Etapa 2a
Empregar múltiplos primers (1! – 6!) simultâneamente
com o produto do PCR isolado, para gerar produtos
secundários de PCR de tamanhos variados
a-Complementação para
Selecionar Bactérias que Carregam
Plasmídeos Recombinantes
1! 3! 5!
Vetores foram construídos (a série pUC) de tal
modo que as bactérias selecionadas transformadas
a 2! b 4! c 6! com esses vetores carregando insertos de DNA es
trangeiro podem ser identificadas visualmente (Fi
gura 7.11). Os plasmídeos pUC contêm as sequências
Região a Região b Região c regulatórias e parte da sequência 5!-codificadora
c Produtos de PCR (146 aminoácidos N-terminais) do gene da b-ga
a,b,c lactosidase (gene lac Z) do operon lac (p. 319). O
Etapa 2b fragmento traduzido N-terminal da b-galactosidase
Repetir etapas 1 e 2a com produtos do material do
é um polipeptídeo inativo. E. coli mutante, que co
paciente, contendo uma região b potencialmente deletada difica a porção carboxi-terminal inativa que falta da
b-galactosidase, é transformada usando os plasmí
1! 5!
deos pUC. A tradução das porções da b-galactosidase
3!
+ do plasmídeo e da célula hospedeira em resposta a
a 4! um indutor, isopropil tio-b-D-galactosídeo, se com
2! 6! plementam, gerando uma enzima ativa. O processo
Produtos de PCR a,c é chamado a-complementação. Quando essas bac
térias transformadas crescem em presença de um
Etapa 3 substrato cromogênico (5-bromo-4-cloro-3-indolil
Separar e detectar os produtos de PCR das amostras -b-D-galactosídeo [X-gal]) para a b-galactosidase,
controle e do paciente por eletroforese em gel de agarose formam colônias azuis. Se, entretanto, um fragmen
e coloração com brometo de etídio para demonstrar a
delação da região b no DNA do paciente
to de DNA estrangeiro for inserido na sequência da
porção N-terminal da b-galactosidase, a enzima ativa
normal paciente não pode ser formada. Bactérias transformadas com
b esses plasmídeos recombinantes e crescidas em X
-gal resultam em colônias brancas, e podem ser sele
c
cionadas visualmente das colônias azuis não-trans
a formadas.

FIGURA7.10 PCR multiplex para analisar uma região de DNA de interesse quanto a mutações.
Uma região do DNA em uma molécula complexa de DNA é amplificada por PCR com primers que são complementares a sequências
flanqueadoras da região do DNA de interesse (etapa 1). O produto do PCR é, então, usado como molde simultaneamente por múltiplos
pares de primers (etapa 2a) que são complementares ao longo do DNA (aqui eles cobrem três segmentos: a, b e c). Esse procedimento
requer conhecimento prévio do DNA ou do gene normal. A etapa 2a é repetida para o DNA derivado de um paciente com mutação(ões)
em potencial na região do DNA de interesse (etapa 2b). Os produtos do DNA amplificados pela etapa de PCR multiplex (etapas 2a e b)
são, então, analisados por eletroforese em gel de agarose para verificar se a amostra do paciente contém uma mutação (etapa 3).

Sítio de policlonagem
Sequência
ampr 2686 bp
pUC 18 N-terminal do gene
codificadora
da β-galactosidase
do operon lac
Promotor
Transformação
Cromossomo
Sequência
codificacora
C-terminal do gene
pUC18 da β-galactosidase
do operon lac
A bactéria cresce em
agar contendo
X-gal e um indutor
do operon lac
Colônias azuis
Colônias azuis contendo pUC18
sem o DNA estrangeiro
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.5
Análise por PCR Multiplex de Defeitos no Gene
da HGPRTase na Síndrome de Lesch–Nyhan
A síndrome de Lesch–Nyhan (OMIM 300322) re
sulta de uma deficiência na atividade da hipoxantina
-guanina fosforribosiltransferase (HGPRTase) (VER
Correlação Clínica 20.2, p. 43). Diversas formas va
riantes de defeitos na HGPRTase foram detectadas.
A amplificação por PCR Multiplex do locus do gene
HGPRT foi empregada para analisar esse gene em
células derivadas de pacientes com a síndrome de
Lesch–Nyhan, e os resultados são responsáveis pela
variabilidade da HGPRTase. O gene, compostos por
nove éxons, pode ser amplificado por multiplex usan
do-se 16 primers diferentes em uma única reação de
PCR. Os produtos podem ser separados por eletrofo
rese em gel de agarose. A análise do locus do gene
HGPRT por amplificação multiplex do DNA derivado
de células de vários pacientes detectou grandes va
riações que vão desde deleção de regiões de éxons
até a total ausência de éxons.
Rossiter, B. J. F. et al. PCR, A Practical Approach, Vol.
1. Em McPherson, M. J. et al. (Eds)., Oxford: Oxford Uni
versity Press, 1994, 67.
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 279
N-terminal FIGURA7.11 a-Complementação para
interrompido detecção de bactérias transformadas.
ampr N-terminal
inserido
estrangeiro
DNA Um vetor construído (pUC 18) expressa a
pUC 18 sequência codificadora N-terminal da enzi
2686 bp
ma b-galactosidase do operon lac. Bactérias
mutantes que codificam a região C-terminal
interrompido
Colônias da b-galactosidase são transformadas com
pUC 18. Essas bactérias transformadas,
crescidas em presença de um substrato
Transformação
especial para a enzima intacta (X-gal), re
sultam em colônias azuis porque contêm a
enzima para reagir com o substrato. As se
quências codificadoras funcionais N-termi
nal e C-terminal do gene complementam-se
mutuamente, gerando uma enzima funcio
pUC18
nal. Se, entretanto, um fragmento de DNA
recombinante
estrangeiro for inserido, interrompendo a
A bactéria cresce em
sequência codificadora N-terminal da b-ga
agar contendo
X-gal e um indutor
lactosidase, bactérias transformadas com
do operon lac essa molécula recombinante não produzirão
enzima funcional. Colônias de bactérias con
tendo esses vetores recombinantes podem
ser detectadas visualmente como colônias
brancas
contendo
brancas.
pUC18
recombinante
PCR Contorna a Necessidade de
Clonar DNA
Clonagem e amplificação de um fragmento de DNA
são empregadas em subclonagem, mutagênese e estu
dos de sequenciamento. O PCR tem substituído a ne
cessidade de amplificar DNA recombinante em um sis
tema biológico de replicação, reduzindo muito o tempo
e as etapas preparativas necessárias. Não é necessário
conhecer a sequência do DNA inserido (até 6 kb) para
amplificá-lo por PCR, desde que a sequência do DNA do
vetor que flanqueia o inserto seja conhecida.
O PCR pode contornar completamente a neces
sidade de clonar o DNA de interesse. Por exemplo,
um gene de sequência conhecida pode ser facilmente
analisado em DNA de um paciente para a detecção
de mutações por uma estratégia de PCR multiplex.
O DNA é isolado de células sanguíneas do paciente
e múltiplos pares de oligonucleotídeos primers são
sintetizados para amplificar o gene inteiro ou regiões
específicas do gene (Figura 7.10). A análise dos frag
mentos de DNA amplificados por eletroforese em gel
de agarose revela qualquer mutação por deleção em
comparação com os produtos do gene normal. O se
quenciamento direto de múltiplos produtos de PCR
detecta mutações puntuais no gene do paciente. O
PCR multiplex foi usado para detectar defeitos no
gene da HGPRTase em pacientes com síndrome de
Lesch-Nyhan (Correlação Clínica 7.5).
280 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

7.5 DETECÇÃO E te grandes de RNA podem ser transcritas de um molde,

que pode estar disponível em quantidades muito limi
IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS tadas. Uma sonda de DNA dupla-fita (dsDNA) deve ser
desnaturada antes da hibridização com o DNA alvo e
NUCLEICOS E PROTEÍNAS re-hibridização consigo mesma compete com a hibridi
QUE SE LIGAM AO DNA zação com o DNA de interesse. Nenhuma competição
semelhante ocorre com sondas de RNA fita-única, que
hibridizam com moléculas complementares de DNA ou
Ácidos Nucleicos como Sondas RNA. A síntese de uma sonda de RNA requer DNA como
molde. Para ser transcrito, o molde deve estar covalen
(Probes) para Sequências Específicas temente ligado a um promotor a montante do gene, que
possa ser reconhecido por uma RNA polimerase depen
de DNA ou RNA dente de DNA. Foram construídos vetores que são ade
Sondas de DNA e RNA são usadas para a seleção de quados a esta técnica.
bactérias que abrigam o DNA recombinante de interes
se, para a análise do mRNA expresso em uma célula
3!
5! 3!
ou para a identificação de sequências de DNA em um
genoma. Elas contêm sequências complementares ao 5!
ácido nucleico alvo e hibridizam com o ácido nucleico de
interesse. O grau de complementaridade determina a 1 Quebra DNAse I pancreática
força de ligação da sonda. A sonda não precisa conter a
sequência complementar inteira do DNA. A sonda pode 5!
3! OH
P OH
3!
ser marcada, geralmente com 32P ou com marcas não OH P

-radioativas que dependem de substratos de enzimas P 5!

acoplados a nucleotídeos que, quando incorporados ao
ácido nucleico, podem ser detectados por uma reação (a) DNA polymerase
2 Tradução
catalisada pela enzima. 5!
3! de E.coli (pol I)
OH P OH OH P
Sondas marcadas são produzidas por nick trans 3!
lation (tradução com corte) do DNA dupla-fita. Nick
translation (Figura 7.12) envolve a clivagem aleatória P 5!

de uma ligação fosfodiéster do esqueleto de uma fita

de DNA pela DNase I; as quebras são chamadas nicks.
A DNA polimerase I de E. coli, com sua atividade exo
nucleolítica 5! → 3! e sua atividade de DNA polimerase,
cria falhas de fita única por meio de hidrólise de nucle
otídeos do lado 5! do nick e, depois, preenche a falha
com sua atividade de polimerase. A reação é geral
mente realizada em presença de um dNTP marcado
em a-32P e os outros três dNTPS não-marcados. O DNA
empregado nesse método é geralmente purificado e é
derivado de DNA clonado, de DNA viral ou de cDNA.
A marcação de DNA com primer aleatório tem ní
tidas vantagens sobre o método de nick translation. O
método de primer aleatório típico requer apenas 25 ng
de DNA, em comparação com 1-2 mg de DNA para nick
translation, e resulta em sondas marcadas com uma
atividade específica (>109 cpm/mg) aproximadamente
10 vezes maior. Esse método geralmente produz son
das marcadas de DNA mais longas. A sonda dupla-fita
é desnaturada e hibridizada com uma mistura de hexa
nucleotídeos aleatórios, contendo todas as sequências
possíveis (ACTCGG, ACTCGA, ACTCGC etc.). Hexanu
cleotídeos hibridizados servem de primers para sínte
se de DNA com uma DNA polimerase, como a enzima
Klenow, em presença de um ou mais dNTPs marcados.
Sondas de RNA marcadas têm vantagens sobre son
das de DNA. Uma delas é que quantidades relativamen
(b) α-32PdCDP ∗
3!
5! ∗P
P∗∗PO OP∗∗
dATP, dGTP,
P dTTP
OP∗ 3!
5!
FIGURA7.12 Nick translation para marcar sondas de
DNA.
Moléculas purificadas de DNA podem ser marcadas radioati
vamente e usadas para detectar, por hibridização, a presença
de RNA ou DNA complementar em amostras experimentais.
(1) Etapa de nicking (corte): introduz quebras de fita-única
aleatórias no DNA. (2) Etapa de tradução: DNA polimerase de
E. coli (pol I) tem atividade exonucleásica 5!→3!, que remove
nucleotídeos da extremidade 5! do corte (nick) e atividade
de polimerase, que simultaneamente preenche a falha de fita
-única com nucleotídeos marcados radioativamente, usando a
extremidade 3! como primer.
Uma sonda marcada de DNA ou RNA é hibridizada
com ácidos nucleicos ligados a nitrocelulose e identifi
cada por detecção da sonda marcada. Os ácidos nuclei
cos de interesse são transferidos para a nitrocelulose a
partir de colônias bacterianas crescidas em agar ou de
géis de agarose nos quais foram separadas eletroforeti
camente, por tamanho.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 281

Técnica de Southern Blot para blots), como descrito a seguir, e de proteínas (Western
blots) para filtros de nitrocelulose ou membranas de
Identificar Fragmentos de DNA nylon.
A transferência de espécies de DNA separadas por
eletroforese em gel de agarose para um filtro, para aná Indivíduo A Indivíduo B Indivíduo C
lise, foi desenvolvida na década de 1970 por E. M. Sou
thern, e é uma ferramenta indispensável. O método é
chamado técnica de Southern blot (Figura 7.13). Uma DNA genômico humano
mistura de fragmentos gerados por endonuclease de Clivagem com uma
restrição pode ser separada conforme seu tamanho por endonuclease
eletroforese em gel de agarose. O DNA é desnaturado de restrição

mergulhando-se o gel em álcali. O gel é, então, colocado

sobre papel absorvente, e um filtro de nitrocelulose é
colocado diretamente sobre o gel. Várias camadas de A B Eletroforese C
papel absorvente são colocadas sobre o filtro de nitro em gel
de agarose
celulose. O papel absorvente sob o gel é mantido úmi
do com uma solução salina concentrada que é puxada
para cima, através do gel, da nitrocelulose, e para as
Gel
camadas de papel absorvente de cima por capilaridade.
O DNA é eluído do gel pelo movimento para cima da A B C
solução salina concentrada em direção ao filtro de ni
trocelulose de cima, onde fica ligado. A posição do DNA
Transferência
ligado ao filtro de nitrocelulose é a mesma da presente do filtro de
no gel de agarose. O DNA fita-única ligado à membrana nitrocelulose
pode ser analisado com sondas marcadas.
A técnica de Southern blot é utilíssima para a de
tecção e a determinação do número de cópias de se
quências específicas no DNA genômico complexo, para a
confirmação de resultados de clonagem de DNA, e para
a demonstração de DNA polimórfico no genoma huma
no que corresponde a estados patológicos. Um exemplo
do uso do Southern blot é apresentado na Figura 7.13.
Papel
Gel
DNA genômico humano total, isolado de três indivídu
os, foi digerido separadamente com uma endonuclease Filtro de nitrocelulose
Papéis absorventes
de restrição, gerando milhares de fragmentos. Estes fo
ram distribuídos pelo gel de agarose de acordo com o
tamanho, em um campo elétrico. O DNA foi transferido
(blotted) para um filtro de nitrocelulose e hibridizado Filtro

com uma sonda de DNA ou de RNA marcada com 32P

para um gene de interesse. A sonda detectou duas ban
das em todos os três indivíduos, indicando que o gene
de interesse foi clivado em um ponto dentro de sua se
quência. Os indivíduos A e B apresentaram um padrão
normal, enquanto o paciente C tinha uma banda nor
mal e uma banda de menor peso molecular. Esse é um
exemplo de detecção de fragmentos de DNA alterados
gerados por endonuclease de restrição para diferentes
indivíduos de uma única espécie, polimorfismo de com
primento de fragmento de restrição (RFLP, restriction
fragment length polymorphism). A detecção de um
fragmento de peso molecular reduzido no paciente C
implica que a deleção de um segmento do gene ocor
reu e pode estar associada com o estado patológico. O
gene desse paciente pode ser clonado, sequenciado e
analisado completamente para caracterizar a natureza
alterada do DNA (Correlação Clínica 7.6).
Hibridização
com sonda
DNA ou RNAde
marcada
com 32P A B C
FIGURA7.13 Southern blot para transferir DNA de géis
de agarose para nitrocelulose.
A transferência do DNA para a nitrocelulose, na forma de mo
léculas de fita-única, permite a detecção de sequências especí
ficas de DNA numa mistura complexa de DNA. A hibridização
com sondas marcadas por nick translation pode demonstrar
se uma sequência de DNA de interesse está presente na mes
ma região ou em regiões diferentes do genoma.

Outras técnicas que empregam os princípios do

Southern blot são a transferência de RNA (Northern
282 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.6
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição Determina a Origem Clonal de Tumores
Considera-se geralmente que a maioria dos tumores
é de origem monoclonal; isto é, um evento raro altera
o genoma de uma única célula somática de modo que
as células passam a apresentar crescimento anormal,
gerando uma massa tumoral, com todas as células fi
lhas carregando o genoma igualmente alterado. Prova
de que um tumor é monoclonal versus policlonal pode
ajudar a distinguir hiperplasia (produção e crescimen
to aumentados de células normais) de neoplasia (cres
cimento de células novas ou tumorais). A detecção de
polimorfismos de comprimento de fragmentos de res
trição (RFLPs) em amostras de DNA submetidas a Sou
thern blot permite definir a origem clonal de tumores
humanos. Se as células tumorais fossem coletivamen
te derivadas de células parentais diferentes, deveriam
conter uma mistura de marcadores de DNA característi
cos de cada célula de origem. Entretanto, um marcador
de DNA idêntico em todas as células tumorais indicaria
uma origem monoclonal. A análise é limitada ao sexo
feminino, para tirar vantagem do fato de cada célula ter
apenas um cromossomo X ativo, de origem paterna ou
materna, com o segundo cromossomo X sendo inativo.
A ativação ocorre aleatoriamente durante embriogê
nese e é fielmente mantida em todas as células filhas,
com metade das células carregando um cromossomo X
materno ativado e a outra metade, um cromossomo X
paterno ativado.
A análise da natureza clonal de um tumor humano
depende do fato de a ativação de um cromossomo X
envolver alterações na metilação de resíduos específi
cos de citosina (C) na molécula de DNA. Várias endo
nucleases de restrição, como Hha I, que cliva o DNA
em sítios GCGC, não clivam o DNA em suas sequên
cias de reconhecimento se um C estiver metilado nes
se local. Portanto, o estado metilado (ativado versus
inativado) do cromossomo X pode ser verificado com
endonucleases de restrição. Além disso, o cromosso
mo X paterno pode ser diferenciado do cromossomo X
materno em um número significativo de indivíduos por
diferenças na migração eletroforética de fragmentos
gerados por endonucleases de restrição derivados de
regiões específicas do cromossomo. Esses fragmentos
são identificados em Southern blot por hibridização
com uma sonda de DNA que é complementar a essa
região do cromossomo X. Um gene ligado ao X que é
adequado para esses estudos é o gene da hipoxantina
guanina fosforribosil transferase (HGPRTase). O gene
HGPRTase consistentemente tem dois sítios para a en
donuclease de restrição Bam HI (B1 e B3 na figura)
mas, em alguns indivíduos, um terceiro sítio (B2) tam
bém está presente.
A presença do sítio B2 em HGPRTase de apenas um
cromossomo X parental permite a detecção de RFLPs.
Portanto, uma célula feminina pode conter um cro
mossomo X com o gene HGPRTase possuindo 2 sítios
Bam HI (resulta em um fragmento de DNA de 24 kb)
ou 3 sítios Bam HI (resulta em um único fragmento
detectável de DNA de 12 kb). Essa figura mostra os
resultados esperados para a análise do DNA de célu
las tumorais para determinar sua origem monoclonal
ou policlonal. Como esperado, três tumores humanos
examinados por esse método mostraram ter origem
monoclonal.
24 kb
12 kb
HhaI sítios
B1
B2 B3
pPB1.7
(a)
24 kb
12 kb
1.7
1 2 3 4
(b)
Análise de DNA genômico para determinar a origem
clonal de tumores. (a) O gene da hipoxantina guanina fos
forribosiltransferase (HGPRTase) ligado ao cromossomo X
contém dois sítios invariantes para a endonuclease de restri
ção Bam H1 (B1 e B3), enquanto em alguns indivíduos um
terceiro sítio, B2, também está presente. O gene também con
tém vários sítios HhaI; entretanto, todos esses sítios, exceto
H1, estão geralmente metilados no cromossomo X ativo. Por
tanto, apenas o sítio H1 estaria disponível para clivagem por
HhaI no cromossomo X ativo. Uma sonda marcada, clonada,
pPB1.7, é empregada para se determinar qual a forma do gene
HGPRTase que está presente em um tumor e se está presente
no cromossomo X ativo. (b) Os padrões de endonucleases de
restrição previstos para tumores monoclonais versus policlo
nais são os seguintes: (1) Clivado só com Bam H1. Fragmento
de 24 kb derivado de um gene contendo apenas sítios B1 e B3
e fragmento de 12 kb derivado de um gene contendo o sítio
extra B2. O padrão é característico de indivíduos heterozigo
tos. (2) Clivado com Bam H1 mais Hha I, o tumor monoclonal

com 12 kb derivado de um cromossomo X ativo (metilado).
(3) Clivado com Bam H1 mais Hha I; tumor monoclonal com
o fragmento de 24 kb derivado de um cromossomo X ativo
(metilado). (4) Clivado com Bam H1 mais Hhal, tumor po
liclonal. Todos os tumores estudados apresentaram padrões
iguais aos da Linha 2 ou Linha 3.
Polimorfismo de Conformação de
Cadeia Única
Análise por Southern blot e detecção de trocas de
bases em DNA de diferentes indivíduos por análise
de RFLP depende da alteração de um sítio de endo
nuclease de restrição. Uma substituição, deleção ou
inserção de base (um polimorfismo de nucleotídeo
único [SNP, single-nucleotide polymorphism]) ra
ramente ocorre em um sítio de endonuclease de res
trição. Entretanto, essas modificações são detectadas
em sítios específicos pelo polimorfismo de conforma
ção de cadeia única (SSCP, single-strand confor
mation polymorphism). Essa técnica tira vantagem
do fato do DNA fita-única, com menos de 400 bases
de comprimento, sujeito a eletroforese em um gel de
poliacrilamida, migrar com uma mobilidade parcial
mente dependente de sua conformação. A alteração de
uma única base geralmente modifica a conformação
do DNA o suficiente para que seja detectada como uma
mudança de mobilidade na eletroforese em gel de po
liacrilamida não-desnaturante.
A análise de uma região pequena de DNA genô
mico ou de cDNA por SSCP é feita por amplificação
por PCR da região de interesse. Oligonucleotídeos
iniciadores (primers) sense e antisense são sinteti
zados, flanqueando a região de interesse, e esse DNA
é amplificado por PCR em presença de nucleotídeo(s)
marcado(s) radioativamente. O produto do PCR puri
ficado, marcado radioativamente, dupla-fita, é então
desnaturado por calor em formamida 80% e imedia
tamente aplicado a um gel de poliacrilamida não-des
naturante. As mobilidades dos produtos controles são
comparadas com amostras de estudos experimentais
ou de pacientes. A detecção de mutações em amos
tras de pacientes pode identificar lesões genéticas.
Esses procedimentos foram aplicados com sucesso à
análise de genes associados com a síndrome do QT
longo, que foi implicada na síndrome da morte súbi
ta infantil (SIDS) (Correlação Clínica 7.7). O método
depende de conhecimento anterior da sequência do
gene ou fragmento do gene de interesse, enquanto a
análise de RFLP requer apenas análise do mapa de
restrição do DNA.
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 283
Vogelstein, B., Fearon, E. R., Hamilton, S. R., and Fein
berg, A. B. Use of restriction fragment length polymorphism
to determine the clonal origin of tumors. Science 227:642,
1985.
Detecção de mRNA
A análise da quantidade de espécies de mRNA em
um tecido ou em preparações de RNA total é frequen
temente crítica para o nosso entendimento da regula
ção gênica do crescimento celular e da diferenciação
tecidual. É possível acessar o momento, o nível e o lo
cal em um tecido da expressão gênica pela análise de
espécies específicas de mRNA. Várias técnicas estão
disponíveis para analisar a quantidade de uma espécie
específica de mRNA em uma preparação de RNA. (a) A
análise por Northern blot requer a separação eletrofo
rética de espécies de RNA, por tamanho, em um gel de
agarose, seguida pela transferência e ligação cruzada
a uma membrana, como na técnica de Southern blot.
As espécies de RNA fixadas são, então, hibridizadas
com uma sonda marcada específica para as espécies
de mRNA de interesse. Se a sonda for radioativa, os
híbridos podem ser detectados por autorradiografia.
Sondas não-radioativas também estão disponíveis.
Análise por Northern blot permite fácil determinação
do tamanho do mRNA e a identificação de transcritos
com splicing alternativo em potencial e/ou a presença
de transcritos de famílias multigenes. (b) RT-PCR (Se
ção 7.8), ao contrário do Northern blot, permite medir
a quantidade de uma espécie de mRNA presente em
uma amostra de RNA. A medida baseia-se na compa
ração da quantidade relativa do produto de PCR de um
transcrito controle interno com a quantidade de um
mRNA específico na mesma amostra. Transcritos con
troles internos típicos incluem a GAPDH (gliceraldeí
do 3-fosfato desidrogenase) e a b-actina. (c) O ensaio
de proteção de nuclease (NPA, nuclease protection
assay) não dá nenhuma informação sobre o tamanho
do mRNA de interesse, mas é ideal para a análise si
multânea de múltiplas espécies de mRNA. Sondas ra
diomarcadas ou não-isotópicas são hibridizadas com
a amostra de RNA em solução. A hibridização em so
lução é mais eficiente do que a hibridização com RNA
fixado em membrana, como se usa em Northern blot.
A sonda remanescente e os RNAs não-hibridizados
são, então, hidrolisados por nucleases. A mistura de
espécies hibridizadas é, então, separada em um gel de
acrilamida de baixa porcentagem (6%). O tamanho de
cada espécie hibridizada é determinado pelo tamanho
da sonda empregada. O NPA é comumente usado para
detectar mRNAs transcritos em diferentes tecidos
(Figura 7.14). (d) A hibridização in situ é o único mé
todo descrito nesta seção para definir que célula em
uma amostra de tecido fixado por formalina expressa
284 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.7

Polimorfismo de Conformação de Cadeia Única para Detecção de Mutações Espontâneas que Podem Levar
a SIDS

A síndrome da morte súbita infantil (SIDS) é uma
causa importante de morte durante o primeiro ano de
vida nos Estados Unidos. Estudo prospectivo em mais
de 34.000 recém-nascidos que foram monitorados por
eletrocardiografia indicou uma forte correlação entre
risco aumentado de SIDS e intervalo QT prolongado
em seu ECG. Com base nesse estudo, decidiu-se pro
curar uma mutação em um ou mais dos genes que se
sabe estarem relacionados com a síndrome do QT lon
go em um bebê de 44 dias de idade, que se apresentou
cianótica, apneica e sem pulso ao pronto socorro de
um hospital. A arritmia da criança com um interva
lo QT prolongado foi estabilizada com múltiplos ele
trochoques DC, seguidos de tratamento com drogas.
DNA genômico foi preparado a partir de linfócitos do
sangue periférico do bebê e de seus pais. Um gene
associado com a síndrome do QT longo continha a
substituição de AAC para TCC na posição 2971 a 2972
(proteína associada com o canal de sódio) na amostra
de DNA do bebê, mas não dos pais. A mutação substi
tuiu um resíduo de serina por uma asparagina em uma
região muito conservada da proteína, que se presume
participe da função do canal de sódio. A mutação não
foi detectada em 200 indivíduos controles. A conclu
são foi que o bebê tinha uma mutação espontânea em
um gene associado com intervalo QT prolongado e isso
contribuiu para um evento tipo SIDS. Após tratamen
to, a criança ficou livre dos sintomas por volta dos 5
anos de idade. Esse estudo indica o valor potencial do
exame eletrocardiográfico neonatal para reduzir mor
talidade infantil por SIDS.
Schwartz, P. J., Priori, S. G., Dumaine, R., Napolitano, C.
et al. AA molecularmolecular linklink betweenbetween thethe suddensudden infantinfant deathdeath syn-syn
drome and the Long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 343: 262,
2000.

(a) Solução de hibridização

Sonda X 250 bases + Sonda Y 300 bases

mRNAX + mRNAY

outros RNAs
400 bases
SondaZ
+
mRNAZ e sondas não
hibridizadas

(b) Digestão com nuclease

250 bp 300 bp 400 bp

HíbridoX + HíbridoY + HíbridoZ

(c) Reações de amostras de RNA de diferentes tecidos analizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida

o o o
o ã ã r
400 bp
300 ã
r a
ç b
d r m
l e
r e
l
a o u é e
P C P C P FIGURA7.14 Ensaio de proteção de nuclease.
O mRNA celular total pode ser isolado de diferentes tecidos.
Sondas de DNA fita-única que são complementares às se
quências conhecidas de diferentes genes transcritos (mRNAx,
mRNAy, mRNAz) são hibridizadas com a mistura de RNAs. A
250 bp
digestão com uma ribonuclease hidrolisará as regiões de RNA
fita-única de mRNA não-hibridizado com a sonda de DNA e
todas as espécies de RNA que não-hibridizaram. Só os híbridos
DNA-RNA protegidos da nuclease permanecerão para análise
por eletroforese em gel de poliacrilamida. A expressão dife
rencial de genes em diferentes tecidos é, então, facilmente
observada.
 CAPÍTULO 7 DNA-radioativo
DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA
(DNA*) + Proteína(s) • 285

um gene específico. Nesse método, o RNA não é isola

do nem submetido às separações por eletroforese. Em
vez disso, os tecidos de interesse são fixados, cortados
em fatias finas e montados em lâminas para microsco
pia. As proteínas são digeridas com proteinase K para
aumentar a acessibilidade da sonda marcada para hi
bridizar com o mRNA celular de interesse. Esse méto
do suporta dados de ensaios de proteção de nuclease
e também define que tipos celulares nos tecidos estão
expressando o mRNA de interesse.
Detecção de Proteínas que se Ligam
a Sequências Específicas no DNA
Proteínas regulatórias ligam-se a sequências espe
cíficas do DNA que flanqueiam genes e regulam aumen
tando ou diminuindo a expressão gênica. O ensaio de
deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA,
electrophoretic mobility shift assay), ou método de
retardo no gel, foi amplamente empregado para anali
sar proteínas que se ligam ao DNA em sequências es
pecíficas, bem como a sequência de DNA necessária à
ligação. Proteínas com características em potencial de
se ligarem ao DNA podem ser preparadas a partir de ex
tratos de células inteiras, extratos nucleares, preparações
de proteínas purificadas ou proteínas recombinantes de
sistemas de expressão geneticamente engenheirados.
A sonda de DNA é radiomarcada. O DNA empregado
pode ser fragmentos de DNA, oligonucleotídeos sinté
ticos dupla-fita, ou DNA clonado contendo um sítio de
ligação de proteínas ou sítio(s) em potencial para liga
ção de proteínas. O DNA deve ser de dupla fita, uma vez
que DNA fita-única ligaria proteínas não-específicas
que se ligam a fita-única (com extratos celulares ou
nucleares), o que interferiria com a interpretação dos
resultados. A sonda de DNA marcada e purificada e a
amostra de proteína são pré-incubadas para formar um
complexo estável proteína-DNA antes da análise eletro
forética da amostra.
A Figura 7.15 mostra esquematicamente os resulta
dos esperados onde o DNA marcado complexa com uma
proteína, resultando em seu movimento retardado no
gel em relação ao DNA que não reagiu. Se um anticor
po contra a proteína que se liga ao DNA de interesse
for adicionado ao tubo de pré-incubação, ocorre uma
de duas possíveis reações. Se o anticorpo se ligar a um
epitopo que não impede a ligação da proteína ao DNA,
o tamanho do complexo aumenta resultando num su
perdeslocamento (maior retardo) na migração no gel.
Por outro lado, se o anticorpo bloquear o sítio de ligação
da proteína ao DNA, um complexo proteína-anticorpo
se formará e a sonda de DNA marcada não apresentará
modificação em sua migração no gel. Em qualquer caso,
o resultado com o anticorpo confirmaria a identidade
da proteína que se liga ao DNA.
Incubação + Anticorpo
Complexo DNA*-proteína ou
Complexo DNA*
Anticorpo
proteína-
DNA* +
complexoproteína-
Anticorpo
Eletroforese em Gel/Autorradiograma:
Padrão DNA* DNA* DNA*
+
DNA* proteína proteína
proteína Anticorpo Anticorpo
FIGURA7.15 Ensaio de mudança de migração
eletroforética.
DNA purificado migra em um gel quando submetido a um
campo elétrico com base em sua carga e massa molecular. Se
proteína(s) for(em) adicionada(s) ao gel, o DNA purificado,
que complexa com o DNA total, aumenta a massa molecular
aparente do DNA. Isso diminuiria sua migração no gel – uma
mudança de migração. A adição de um anticorpo que reage
com a proteína complexada com o DNA, mas que não inter
fere com a interação DNA-proteína, aumentará ainda mais o
tamanho do complexo DNA-proteína e retardará sua migração.
Se o anticorpo reagir com a região de ligação ao DNA da pro
teína, um complexo DNA-proteína não se formará. Em ambos
os casos, o anticorpo ajuda a identificar a proteína que se liga
ao DNA.
7.6 DNA COMPLEMENTAR
E BIBLIOTECAS DE DNA
COMPLEMENTAR
A inserção de genes eucarióticos específicos funcio
nais em vetores que podem ser expressos em uma cé
lula procariótica poderia produzir grandes quantidades
de proteínas geneticamente engenheiradas, com signi
ficativo potencial médico, agrícola e experimental. Hor
mônios e enzimas, incluindo insulina, eritropoietina,
trombopoietina, interleucinas, interferons e ativador de
plasminogênio tecidual são atualmente produzidos por
esses métodos. Não é possível clonar genes funcionais
a partir de DNA genômico, exceto em casos raros. Uma
razão é que a maioria dos genes do genoma de mamífe
ros gera transcritos que contêm íntrons, que precisam
ser removidos do mRNA transcrito primário. Sistemas
procarióticos são incapazes de remover íntrons para
gerar transcritos de mRNAs funcionais. Esse problema
pode ser contornado pela síntese de DNA complemen
tar (cDNA) a partir de mRNA eucariótico funcional.
286 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

mRNA como Molde para Síntese de contém uma alça fita-única, que é reconhecida e digeri
da pela nuclease S1. As extremidades do cDNA devem
DNA Usando Transcriptase Reversa ser modificadas antes da clonagem em um vetor. Um
método envolve a incubação de moléculas de cDNA com
O RNA mensageiro pode ser reversamente transcri
extremidades retas com moléculas ligantes (linker) e
to em cDNA, e o cDNA pode ser inserido em um vetor uma DNA ligase de bacteriófago T4, que catalisa a liga
para amplificação, identificação e expressão. Células
ção de moléculas de extremidades retas (Figura 7.17).
de mamíferos normalmente contêm 10.000-30.000 es As moléculas linker sintéticas contêm sítios para endo
pécies diferentes de moléculas de mRNA em um dado
nucleases de restrição, que são agora clivados com a en
momento do ciclo celular. Em alguns casos, entretanto, zima apropriada, para inserção do cDNA em um vetor
uma determinada espécie de mRNA pode chegar a 90%
clivado com a mesma endonuclease.
do mRNA total, tal como o mRNA de globina em reti
culócitos. Muitos mRNAs estão normalmente presentes
em apenas poucas cópias (1-14) por célula. Uma biblio
5! Cap
teca de cDNA pode ser construída a partir do mRNA
oligo dT(12–18) AA...An 3!
celular total, mas se apenas poucas cópias do mRNA Cauda de poli A
de interesse estiverem presentes, pode ser muito difícil mRNA
Adição do primer
identificar o cDNA. Métodos que enriquecem a popula
ção de mRNAs ou seus cDNAs correspondentes permi 5!
AA...An 3!
tem reduzir o número de espécies diferentes de cDNA TT(12–18)5!
em uma biblioteca de cDNA e aumentam muito a proba mRNA
bilidade de identificação do clone de interesse. Transcriptase reversa
dATP, dCTP,
mRNA Desejado Pode Ser Enriquecido por dGTP, dTTP

Técnicas de Separação
5! AA...An 3!
O RNA mensageiro pode ser separado por tamanho TT(12–18)5!
por eletroforese em gel ou centrifugação. O isolamento Híbrido cDNA: mRNA

de mRNA de uma faixa específica de tamanho molecu

Aplicação de calor
lar enriquece muitas vezes um mRNA de interesse. O ou álcali
conhecimento do peso molecular da proteína codificada
pelo gene de interesse dá uma ideia do tamanho aproxi
Alça em
grampo 3!
mado do mRNA transcrito ou de seu cDNA; a variabili dT(12–18)5!
dade no tamanho previsto, contudo, surge de diferenças
no comprimento das regiões não-traduzidas dos mRNAs.
Fragmento Klenow
Enriquecimento em uma molécula específica de de DNA polimerase
mRNA também pode ser conseguido por procedimen de E. coli
dATP, dCTP,
tos imunológicos, mas requer a disponibilidade de an
dGTP, dTTP
ticorpos contra a proteína codificada pelo gene de inte
resse. Anticorpos adicionados a uma mistura de síntese
proteica in vitro reagem com a cadeia polipeptídica dAdT(12–18)3!
em crescimento associada com polissomos, e os preci (12–18)5!
pitam. O mRNA pode então ser purificado a partir da S1 nuclease
fração polissomal imunoprecipitada.
3!
5! dA 3!
Síntese de DNA Complementar dT(12–18)
(12–18) 5!
cDNA
Uma mistura de mRNAs é usada como molde para
sintetizar fitas complementares de DNA usando uma FIGURA7.16 Síntese de cDNA a partir de mRNA.
DNA polimerase dependente de RNA, a transcriptase A cauda de poli(A) 3! do mRNA é hibridizada com um oligôme
reversa (Figura 7.16). É necessário um primer; utiliza ro dT (oligo[dT]12-18), que serve de primer para a transcripta
-se a cauda de poli(A) da extremidade 3! do mRNA eu se reversa, que catalisa a síntese da fita de DNA complementar
(cDNA), em presença de todos os quatro desoxinucleotídeos
cariótico. Um oligo(dT) com 12–18 bases é empregado
trifosfato (dNTPs). O híbrido cDNA-mRNA resultante é sepa
como primer que hibridiza com a sequência poli(A).
rado em cDNA fita-única por fusão com aquecimento ou hi
Após síntese do cDNA, o híbrido é desnaturado ou o drólise do mRNA com álcali. A extremidade 3! da molécula de
mRNA é hidrolisado em álcali para obter o cDNA fita cDNA forma uma alça em grampo que serve de primer para a
-única. A extremidade 3! do cDNA fita-única forma uma síntese da segunda fita de DNA, catalisada pelo fragmento Kle
alça em grampo, que serve de primer para a síntese da now da DNA polimerase de E. coli. A alça de DNA fita-única
segunda fita do cDNA pelo fragmento Klenow ou uma não-pareada é hidrolisada pela nuclease S1, gerando uma mo
transcriptase reversa. O cDNA dupla-fita resultante lécula de DNA fita-dupla.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 287

O DNA do bacteriófago (p.292) é o vetor mais conve
niente e eficiente para criar bibliotecas de cDNA porque
pode ser amplificado facilmente e armazenado indefini
damente. Dois bacteriófagos vetores, lgt10 e lgt11, bem
como suas construções mais novas, têm sido emprega
dos para produzir bibliotecas de cDNA. As bibliotecas
de cDNA em lgt10 são examinadas apenas com sondas
de ácidos nucleicos marcados quando a sequência do
DNA é desconhecida, enquanto as de lgt11, um vetor
de expressão, também podem ser examinadas com an
ticorpo para a produção da proteína ou do antígeno de
interesse. Se a sequência do cDNA desejado for conhe
cida, então PCR é usado para examinar o bacteriófago
recombinante.
3!
dA12-18
dT12-18
cDNA 5!
Linker 1 mólecula
RNA Celular Total como Molde para
Síntese de DNA Usando RT-PCR
Métodos alternativos para construir bibliotecas de
cDNA empregam uma técnica de transcriptase rever
sa-PCR (RT-PCR) e eliminam a necessidade de puri
ficar o mRNA. Essa estratégia é apresentada na Figu
ra 7.18 e começa com a produção, pela transcriptase
reversa, de um híbrido DNA-mRNA. O método usa a
transferase terminal para adicionar uma cauda homo
polimérica dG à extremidade 3!, seguida de hidrólise
do mRNA. Primers para PCR são sintetizados para hi
bridizar com as caudas dG e dA, e terminam com duas
sequências de endonucleases de restrição diferentes.
O cDNA resultante amplificado por PCR e, então, hi
drolisado com duas endonucleases de restrição dife
rentes para clonagem direcional (p. 275) em um vetor
apropriado.

de DNA e ligase O RNA celular total é isolado e contém

RE1 uma pequena quantidade de mRNA

DNA:mRNA
Híbrido
mRNA:de 5! AAAAA(A)n 3!
S1 nuclease Adição do primer oligo(dT)
Etapa "RT": +
transcriptase reversa
RE1
3!
5! TTTTT 5! n 3!
AAAAA(A)

O híbrido DNA:mRNA é precipitado com

brometo de cetiltrimetilamônio para remover
Linker 2 mólecula
de DNA e ligaseRE1 o oligo(dT) não incorporado. As extremidades
3′ recebem, então, uma cauda de oligo(dG),
RE2
RE2 com dG + tranferase terminal

3! GGGGG
5!AAAAA(A)nGGGGG 3!
TTTTT 5!
Hidrólize com duas
RE1, RE2 endonucleases Hidrólise do RNA
de restrição com NaOH

3! GGGGG TTTTT 5!

cDNA Primers sense e antisense para o PCR:

Etapa "PCR": A sequências de endonuclease de restrição
O primeiro ciclo de PCR 1(RE1) CCCCC
FIGURA7.17 Modificação do cDNA para clonagem. RE2 - TTTTT
gera cDNA de dupla fita
O procedimento começa com o DNA fita-dupla que con
tém uma alça em grampo. Um DNA linker que contém
5! RE1 CCCCC AAAAA3!
um sítio de endonuclease de restrição (RE1) é adicionado GGGGG TTTTT
à extremidade livre do cDNA por ligação à extremidade
reta. A alça em grampo de fita-única é, a seguir, hidrolisa
da com a nuclease S1. Um segundo linker, com um sítio B
de endonuclease de restrição diferente em (RE2), é ligado de
amplificação
Ciclo Biblioteca
à extremidade reta recém-criada no cDNA livre. O segun
do linker possivelmente irá se ligar às duas extremidades, TTTTT RE2
RE1 CCCCC
RE1GGGGG AAAAA
mas não interferirá com o primeiro sítio de endonuclease de cDNA
de restrição. O DNA modificado é hidrolisado pelas duas
endonucleases de restrição e pode ser inserido em um FIGURA7.18 Geração de cDNA por transcriptase reversa-PCR (RT
plasmídeo ou DNA de um bacteriófago por clonagem di PCR).
recional. O RNA celular total ou mRNA pode ser usado para gerar cDNA por RT
-PCR. O mRNA com uma cauda de oligo rA é transcrito reversamente
com um primer oligo dT. Uma cauda oligo dG é adicionada às extremi
dades 3’ das fitas de RNA e DNA, e a fita de RNA é subsequentemente
hidrolisada com NaOH. Primers sense e antisense, modificados com
sequências de sítios de restrição, são então empregados para amplificar
o cDNA por PCR. Os produtos podem ser hidrolisados com as endonu
cleases de restrição específicas (RE1 e RE2) para clonagem e estudos
subsequentes.
288 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

7.7 BACTERIÓFAGOS, O comprimento do DNA do fago a ser empacotamen

to na partícula viral deve ter cerca de 50 kb. O DNA
COSMÍDEOS E VETORES DE linear do fago l pode ser digerido com uma endonucle
ases de restrição específica, que gera fragmentos termi
CLONAGEM EM LEVEDURA nais pequenos com seus sítios Cos (braços). Estes são
então separados de fragmentos intervenientes maiores.
E ANÁLISE DE LONGOS O DNA genômico celular é parcialmente digerido por
SEGMENTOS DE DNA enzimas de restrição apropriadas para permitir o anela
mento e a ligação com os braços do fago. Os fragmentos
A detecção de sequências não-codificadoras (por de DNA menores ou maiores do que 15–25 kb hibridizam
exemplo, íntrons) na maioria dos genes eucarióticos com os braços Cos, mas são excluídos do acondiciona
e de regiões regulatórias distantes que flanqueiam os mento em partículas infectantes de bacteriófago. Toda
genes exigiu estratégias de clonagem para acomodar a informação necessária à infecção e replicação do fago
fragmentos de DNA maiores do que os que podem ser na bactéria é carregada nos braços Cos. O DNA recom
clonados em plasmídeos. Os plasmídeos acomodam in binante do fago é misturado com proteínas do fago l in
sertos de DNA estrangeiro de 5–10 kb de comprimento. vitro, que se organizam em vírions infectantes. Estes
Os fragmentos de DNA recombinante maiores do que são, então, propagados em uma cepa apropriada de E.
isso são deletados aleatoriamente durante a replicação coli, gerando uma biblioteca em fago l. Muitas cepas de
do plasmídeo na bactéria. Por isso, vetores
DNA genômico completamente isolado DNA de bacteriofago λ
alternativos foram desenvolvidos.
EcoRI
Sítio Sítio
EcoRI
Bacteriófagos como Vetores
Hidrólize enzimática parcial com
a endonuclease de restrição
de
idealClonagem
para insertos de DNA de aproxima- EcoRI 45 kb

Bacteriófago l (fago l), um vírus que

infecta e replica em bactérias, é um vetor
braço Cos A região
braçocentral
Cos do DNA
damente 15 kb de comprimento. O fago l
infecta seletivamente bactérias e replica
por uma via lítica ou uma não-lítica (li
sogênica). O fago l contém uma cauda não é necessária para a
fita-única de 12 bases autocomplemen
+ replicação do fago λ

tares (extremidades coesivas) em ambas

as extremidades de seu DNA fita-dupla
de 50 kb. Quando infecta a bactéria, as
extremidades coesivas (sítios cos) de um
único DNA do fago l autoanela, e as extre
midades são ligadas covalentemente pela
DNA ligase da célula hospedeira. O DNA
circular serve de molde para a transcrição
e a replicação. O fago l, com fragmentos
gerados por endonucleases de restrição
que representam o DNA genômico total da
célula inseridos nele, é usado para infectar
bactérias. Bacteriófagos recombinantes,
liberados de células lisadas, são coleta
dos e constituem uma biblioteca genômica
em fago l. A biblioteca em fago pode ser
examinada mais rapidamente do que uma
biblioteca em plasmídeo em virtude do ta
manho maior dos DNAs inseridos.
Numerosos vetores fagos l foram cons
truídos para diferentes estratégias de clo
nagem. Só um vetor fago l genérico será
descrito. Um segmento de 15 a 25 kb do
DNA do fago pode ser substituído sem
atrapalhar sua replicação em E. coli (Fi
gura 7.19).
População de fragmentos
de DNA gerados pela
Braços Cos purificados por
EcoRI, de 15–25 kb
eletroforese em gel de agarose
Fragmentos de DNA genômico anelados
com os braços Cos
Forma da molécula de DNA concatenada linear
Sítio Cos 15–25 kb Sítio Cos
O acondicionamento In vitro
com proteínas do bacteriófago λ
ocorre apenas com as regiões
genômicas de comprimento
permitido ligadas aos braços Cos
FIGURA7.19 Clonando DNA genômico em bacteriófago l.
O DNA genômico total é parcialmente digerido com uma endonuclease de res
trição (por exemplo, EcoRI). Isso resulta em fragmentos de DNA de tamanhos
aleatórios, com extremidades coesivas fita-única. Fragmentos de DNA chamados
braços Cos são gerados com a mesma endonuclease de restrição a partir do DNA
do bacteriófago. Os braços Cos purificados contêm sequências sinais necessá
rias ao acondicionamento do DNA em um vírion do bacteriófago. Os fragmentos
genômicos são misturados com os braços Cos, anelados e ligados, formando
sequências de DNA linear concatenado. O acondicionamento in vitro com
proteínas do bacteriófago l ocorre só com fragmentos de DNA genômico de com
primento permitido (15-25 kb) ligados aos braços Cos.

E. coli foram geneticamente alteradas para permitir a
replicação de vírions recombinantes específicos.
Examinando (Screening) Bibliotecas de
Bacteriófagos
Uma biblioteca em bacteriófago pode ser examinada
plaqueando-se o vírus sobre uma camada contínua de
bactérias (um tapete de bactérias) crescidas sobre pla
cas de agar (Figura 7.20). Fagos individuais vão infec
tar, replicar e lisar uma célula. Os vírions descendentes
então infectam e subsequentemente lisam bactérias
imediatamente adjacentes ao local da primeira célula
infectada, criando uma região clara ou uma placa nota
pete bacteriano opaco. O fago de cada placa é coletados
em um filtro de nitrocelulose (como para a placa réplica)
e o DNA é fixado ao filtro com NaOH. A localização dos
fragmentos de DNA clonados de interesse é determi
nada por hibridização do DNA ligado ao filtro com uma
sonda marcada de DNA ou RNA, seguida de autorradio
grafia. Os bacteriófagos da placa correspondentes aos
híbridos marcados ligados ao filtro são coletados e am
plificados em bactérias, para análise posterior. O PCR
também é empregado se a sequência total ou parcial do
DNA desejado for conhecida. Nesse caso, coletam-se
partes de várias placas e, se o DNA de interesse estiver
presente em uma ou mais, uma região pode ser ampli
ficada com um par de primers apropriados por PCR. O
produto do PCR é, então, detectado por eletroforese em
gel. Bibliotecas de DNA complementar em bacteriófa
gos também são construídas, contendo os braços cos do
fago. Se o cDNA for recombinado com DNA de fago que
permita a expressão do gene, como lgt 11, placas po
dem ser examinadas imunologicamente com anticorpos
específicos para o antígeno de interesse.
Clonando Fragmentos de DNA em
Cosmídeos e Vetores Cromossomos
Artificiais
Embora o fago l seja o vetor mais comumente usa
do para construir bibliotecas de DNA genômico, o com
primento de muitos genes excede o tamanho máximo
do DNA que pode ser inserido entre os braços do fago.
Um vetor cosmídeo pode acomodar insertos de DNA
estrangeiro de aproximadamente 45 kb. Cromossomos
artificiais de bactéria (BACs) e cromossomos artifi
ciais de levedura (YACs) foram desenvolvidos para clo
nar fragmentos de DNA de 100–200 e de 200–500 kb
de comprimento, respectivamente. Embora seja difícil
trabalhar com vetores cosmídeos e YACs, suas biblio
tecas permitem a clonagem de genes grandes com suas
sequências regulatórias flanqueadoras, bem como famí
lias de genes ou genes contíguos.
Vetores cosmídeos são intermediários entre vetores
plasmídeos e bacteriófagos. Cosmídeos contêm um gene
de resistência a antibiótico para seleção de moléculas
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 289
de DNA recombinante, uma origem de replicação para
propagação em bactérias, e um sítio cos para acondi
cionamento de moléculas recombinantes em partículas
de bacteriófagos. O bacteriófago com DNA de cosmídeo
recombinante pode infectar E. coli e injetar seu DNA
na célula. Vetores cosmídeos contêm apenas cerca de
5 kb das 50 kb do DNA do bacteriófago e, portanto, são
incapazes de dirigir sua replicação e organização de
novas partículas de fago infectantes. Em vez disso, o
DNA do cosmídeo recombinante circulariza-se e replica
como um grande plasmídeo. Colônias bacterianas con
tendo os recombinantes de interesse são selecionadas
e amplificadas por métodos semelhantes aos descritos
para plasmídeos.
E.coli crescida
em placa de agar
recoberta com o
bacteriófago λ
recombinante
Placas
Fazer réplica
em nitrocelulose
da placa de agar
Hibridizar com
sonda de 32P DNA
ou RNA
Fragmento de DNA
clonado
Autorradiografia de raios-X
FIGURA7.20 Examinando (screening) bibliotecas
genômicas em bacteriófago l.
E. coli competente é crescida até atingir confluência em uma
placa de agar e, depois, recoberta com o bacteriófago recom
binante. Desenvolvem-se placas onde bactérias são infectadas
e, subsequentemente, lisadas pelo fago l. Réplicas da placa
podem ser feitas tocando-se a placa com um filtro de nitrocelu
lose. O DNA é desnaturado e fixado à nitrocelulose com NaOH.
O DNA fixado é hibridizado com uma sonda marcada com 32P e
exposto ao filme de raios-X. O autorradiograma identifica a(s)
placa(s) contendo o DNA recombinante de interesse.
Procedimentos de clonagem padrão e alguns méto
dos novos são empregados para construir YACs. Frag
mentos muito grandes de DNA estrangeiro são unidos
às sequências de DNA da levedura, uma que funciona
como telômeros (extremidades distais dos braços do
cromossomo) e outra que funciona como centrômero
e como origem de replicação. O DNA do YAC recom
binante é introduzido na levedura por transformação.
Os YACs construídos são projetados de modo que a
290 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
levedura transformada com cromossomos recombi
nantes cresça em colônias que possam ser identifica
das visualmente. Isso facilita a seleção e a análise dos
fragmentos de DNA clonado. Animais transgênicos
também podem ser gerados pela introdução de DNA de
YACs recombinantes em seus genomas. Se esses ani
mais expressarem um gene humano defectivo, podem
ser usados como modelo para estudar a doença humana
correspondente (Correlação Clínica 7.8).
Subclonagem Permite Definição de
Grandes Segmentos de DNA
A análise completa de elementos funcionais em um
fragmento de DNA clonado requer o sequenciamento da
molécula inteira. As técnicas atuais podem sequenciar
200–400 bases, mas insertos de DNA clonados são fre
quentemente muito maiores. Mapas de restrição do clo
ne de DNA inicial são essenciais para clivar o DNA em
pedaços menores para serem subclonados para análise
mais profunda. A sequência de cada fragmento de DNA
subclonado pode ser determinada. Regiões sobrepostas
do DNA subclonado alinham-se adequadamente e con
firmam a sequência inteira do clone de DNA original.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.8
O Uso de Camundongo Transgênico com Cromossomo Artificial de Levedura (YAC) para Estudar a Doença
de Huntington
Frequentemente, é difícil ou impossível estudar a
função de uma proteína mutante na gênese de uma doen
ça humana. O desenvolvimento de modelos animais é
uma ferramenta valiosa para estudar doenças huma
nas, como a doença neurodegenerativa que aparece no
adulto, doença de Huntington (HD) (OMIM 143100). A
HD é causada pela expansão do trinucleotídeo CAG no
éxon 1 do gene HD, resultando em sequências de poli
glutamina na proteína codificada por Huntington (htt).
As sequências de poliglutamina resultantes parecem
ser tóxicas para regiões específicas do cérebro. Um
modelo de camundongo transgênico foi gerado com um
transgene YAC contendo o gene HD humano completo
mais as sequências de 25 kb a montante e 120 kb a ju
sante, para garantir a inclusão das regiões regulatórias
endógenas. Foram criados camundongos YAC contendo
46, 72 e 128 repetições CAG. O modelo transgênico com
YAC 128 refletiu melhor a doença humana. Esses ca
mundongos apresentaram déficit motor e cognitivo se
melhante aos observados no homem. A proteína htt tipo
selvagem é encontrada principalmente no citoplasma,
enquanto a proteína mutante localiza-se no núcleo. A
avaliação com anticorpos anti-htt dos tecidos cerebrais
de camundongos tipo selvagem (WT) e de camundon
gos Y128 com 1 mês e 2 meses de idade demonstrou
O sequenciamento é frequentemente realizado sem
subclonagem. São usados primers antisense, que se
jam complementares às extremidades 3! sequenciadas
inicialmente do DNA clonado. Esse processo é repetido
até que todo o DNA clonado tenha sido sequenciado.
Esse método elimina a necessidade de preparar subclo
nes, mas requer a síntese ou a compra de muitos pri
mers. Por outro lado, o DNA subclonado é sempre inse
rido de volta na mesma região do plasmídeo. Portanto,
um conjunto de primers complementar às sequências
de DNA do plasmídeo que flanqueiam o DNA inserido
pode ser usado para todas as reações de sequenciamen
to com DNA subclonado.
Caminhar pelo Cromossomo
(Chromosome Walking) Define
Arranjo de Genes em Segmentos
Longos do DNA
O conhecimento de como genes e seus elementos
regulatórios estão dispostos em um cromossomo de
veria levar a um entendimento de como conjuntos de
genes podem ser regulados coordenadamente. É difícil
que as proteínas htt normal e mutada não estavam pre
sentes nos núcleos de camundontos WT nem nos dos
camundongos Y128 com 1 mês de idade; a proteína htt
mutada foi detectada no núcleo apenas no striatum dos
camundongos Y128 com 2 meses de idade; e à medida
que os camundongos Y128 envelheciam mais, embora
um pouco de htt mutante fosse detectada nos núcleos
de outras regiões do cérebro, sua concentração aumen
tou e ficou maior no striatum. O striatum é a região pre
dominantemente afetada tanto na HD humana como
nos camundongos Y128 de 2 meses de idade, e o acú
mulo de htt também foi correspondente à idade em que
defeitos motores e cognitivos foram observados pela
primeira vez nesses camundongos. Parece que o início
da localização nuclear da proteína htt mutante no stria
tum é o principal responsável pela degeneração seletiva
observada na HD. O mecanismo de como a proteína htt
mutante exerce seus efeitos tóxicos quando localizada
no núcleo é desconhecido, mas acredita-se que envolva
modificação da expressão gênica e possivelmente ativa
ção de apoptose.
Van Raamsdonk, J. M., Warby, S. C., and Hayden, M. R.
Selective degeneration in YAC mouse models of Huntington
Disease. Brain Res. Bull. 72: 124, 2007.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 291

clonar fragmentos de DNA suficiente Biblioteca em fago λ

mente grandes para identificar genes

contíguos. A combinação de várias téc Placa
nicas permite a análise de sequências
Examinar com sonda
de DNA de 50–100 kb de comprimen marcada para o Gene 1
to. O método, chromosome walking,
é possível porque bibliotecas de fago l Placa de interesse amplificada
e purificada
ou cosmídeos contêm DNA genômico
parcialmente clivado, cortado em sítios
específicos de endonucleases de restri 15–25 kb
ção. Os fragmentos clonados contêm
braço λ braço λ
sequências sobrepostas a outros frag
mentos clonados. Regiões sobrepostas cos Gene 1 1a cos
são identificadas por mapeamento de Mapeamento de restrição
restrição, subclonagem, screening das
bibliotecas
walking
procedimentos
O procedimento
é apresentado
em de
fago nachromosome
sequenciamento.
ldeou cosmídeos
Figura 7.21.
e EcoRI BamHI 1a

Subclone
HindIII BglI Transformar
bactéria
uma Plasmídeo
com
Uma biblioteca
sonda
a sequência de em
defago
DNAl ou
interesse. éOexaminada
RNA sele-
DNA para BamHI

é feito, eéum
cionado clonado,
pequeno
o mapa
segmento
de restrição
é sub- Sonda marcada com 32P 1aBglI E.coli
1a Purificarefazernicktranslation

lation. emeum
clonado Essa
purificado marcado
sonda
plasmídeo,
marcada
por amplificado,
nické, trans-
então,
ma
para
das
postas.
periores,
o DNA
DNA. uma
sobreposição,
maneira
procurar
Sesubclonado
Emdeve-se
muitas genomas
que
éoutrasnão
então
o ter
clone
sequências
sonda desequências
cuidado
de
tratado
de
contenha
DNA dainicial,
eucariotos
DNA para uma
sobre-
repetitivasmes-
subclonadoque
su-
de Amplificar por infecção

usada para reexaminar a biblioteca em

fago
mentares,
DNA lclonado
a procura
e estas
recém-identificado,
de
são
sequências
então clonadas.
comple-
comO 1a Gene 2 2a
Repetir o processo

Gene 1 1a
Clones sobrepostos
em fagoλ
1a Gene 2 2a Gene 3 3a

Gene 1 1a Gene 2 2a Gene 3 3a Gene n na

contiver uma sequência repetitiva, ela
irá hibridizar com numerosas placas de
bacteriófagos e impedirá a identifica
ção de um clone sobreposto específico.
Esses procedimentos, juntamente com
chromosome jumping, foram empre
gados para identificar o gene da Fibrose
Cística (Correlação Clínica 7.9).
7.8 VETORES DE
Segmento de DNA de interesse contíguo
FIGURA7.21 Chromosome walking para analisar segmentos contínuos de
DNA num genoma.
Inicialmente, um fragmento de DNA é marcado por nick translation para examinar
uma biblioteca a procura do fago l recombinante contendo um gene de interesse.
O DNA amplificado é mapeado com várias endonucleases de restrição para selecio
nar uma nova região (1a) dentro do DNA clonado original que possa ser reclonada
(subclonada).
O DNA subclonado (1a) é usado para identificar outros fragmentos
de DNA na biblioteca original, que se sobreponham à região do DNA amplificado. O
processo pode ser repetido muitas vezes para identificar regiões contíguas no DNA à
montante e à jusante do DNA inicial de interesse (gene 1).

EXPRESSÃO E PROTEÍNAS recombinante é ter um gene estrangeiro expresso em

DE FUSÃO
A metodologia do DNA recombinante descrita até
aqui tratou primariamente de exame (screening),
amplificação e purificação de espécies de DNA clo
nadas. Um objetivo importante dos estudos de DNA
bactéria, com o produto em uma forma biologicamente
ativa. O sequenciamento de muitos genes bacterianos
e de suas regiões flanqueadoras identificou o arranjo
espacial de sequências regulatórias necessárias à ex
pressão de genes. Um promotor e outros elementos
regulatórios a montante do gene são necessários para
292 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.9
O Uso de Chromosome Walking e Jumping para Identificar o Gene da Fibrose Cística
A Fibrose Cística (CF) (OMIM 602421) é uma doen
ça autossômica recessiva comumente encontrada (1
em 2.000 nascimentos) resultante de mutações no re
gulador de condutância transmembrânico CF (CFTR).
Essas mutações resultam em transporte defectivo nos
condutos pulmonares e de glândulas exócrinas. O sin
toma clínico primário associado com CF é doença pul
monar crônica. O locus CF foi determinado por análise
de ligação de numerosos marcadores de DNA polimór
fico, no braço longo do cromossomo 7, banda q31. Uma
região de aproximadamente 500 kb do cromossomo 7
foi analisada mais detalhadamente por chromosome
walking e jumping (salto) para identificar o gene CF.
O chromosome jumping permitiu aos pesquisadores
iniciarem uma nova caminhada bidirecional a partir
do ponto final de cada salto. Um mapa de restrição foi
construído a partir de clones em fago e cosmídeo, deri
vados de chromosome walking e jumping, e levou fi
nalmente à identificação do gene CF (gene CFTR), que
transcrever um gene (p. 319). O mRNA transcrito de
um gene eucariótico recombinante, entretanto, não é
traduzido em um sistema bacteriano porque não tem a
sequência de reconhecimento bacteriano, a sequência
Shine-Dalgarno, necessária para orientá-lo adequada
mente em um ribossomo bacteriano funcional. Vetores
de expressão facilitam a transcrição funcional de in
sertos de DNA. Um gene estrangeiro pode ser inserido
em um desses vetores a jusante de um promotor regu
lado, mas dentro de um gene bacteriano, comumente o
gene lacZ. O mRNA transcrito do DNA recombinante
contém a sequência Shine–Dalgarno do lacZ, códons
de uma parte da extremidade 3! da proteína lacZ, se
guidos por códons do gene estrangeiro de interesse
completo. O produto proteico é uma proteína de fusão,
que contém alguns aminoácidos N-terminais da pro
teína lacZ e a sequência completa do produto proteico
estrangeiro.
Genes Estrangeiros Expressos em
Bactérias Permitem Síntese de suas
Proteínas Codificadas
Muitos vetores plasmídeos e bacteriófagos permitem
a expressão de genes eucarióticos em células bacteria
nas. Bactérias em replicação rápida tornam-se uma fá
brica biológica para produzir grandes quantidades de
proteínas específicas, que têm valor em pesquisa, bem
como clínico e comercial. Como exemplo, tecnologias
recombinantes produziram hormônios proteicos huma
nos para tratamento de pacientes com produção hor
engloba cerca de 250 kb. A identificação do gene CFTR
e de sua principal mutação permitiram o diagnóstico
pré-natal e clínico preciso da doença. Nos anos que se
seguiram à identificação do gene CFTR, muitos estu
dos foram feitos no sentido da correção da doença e dos
aspectos tecnológicos necessários à inserção de genes
a células alvos. Entretanto, o sucesso tem sido difícil.
Recentemente, foi descrito um novo vetor BAC, cons
truído com um inserto de 250,3 kb que contém tanto o
gene CFTR genômico inteiro como seus sítios regulató
rios a montante e a jusante. O gene CFTR humano foi
expresso corretamente em uma linhagem de células de
camundongo em cultura a partir de cópias integradas
do vetor BAC. Esses resultados apontam na direção da
aplicação em potencial da terapia gênica para CF.
Rommens, J. M., Iannuzzi, M. C., Kerem, B., Drumm, M. L.
et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Chromosome
walking and jumping. Science 245: 1059, 1989.
monal aberrante ou ausente. A Figura 7.22 mostra um
plasmídeo vetor generalizado para a expressão de um
gene de mamífero. Lembre-se que o gene inserido deve
estar na forma de cDNA de seu mRNA correspondente,
uma vez que o sistema bacteriano é incapaz de remover
íntrons do pré-mRNA transcrito. O DNA deve ser inse
rido em registro com os códons da extremidade 3! da
proteína bacteriana quando se cria a proteína de fusão.
Isto é, a inserção deve ocorrer após um códon triplete
da proteína bacteriana e no começo de um da proteína
eucariótica para garantir tradução correta. Finalmente,
para gerar um transcrito funcional, o gene estrangeiro
deve ser inserido na orientação correta em relação ao
promotor. Isso pode ser conseguido por clonagem di
recional.
Proteínas eucarióticas sintetizadas em bactérias são
frequentemente instáveis e são degradadas por protea
ses intracelulares. Proteínas de fusão, entretanto, são
geralmente estáveis. Os aminoácidos codificados pelo
genoma procariótico podem ser clivados da proteína
de fusão purificada por procedimentos enzimáticos ou
químicos. Uma estratégia para contornar a instabilida
de intracelular de algumas proteínas é produzir uma
proteína estrangeira que seja secretada. Isso requer a
clonagem do gene estrangeiro em um vetor tal que a
proteína de fusão sintetizada contenha um peptídeo
sinal que seja reconhecido pela peptidase sinal bacte
riana, que processa adequadamente a proteína para
secreção.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 293

Plasmídeo como de mamíferos. Vetores lançadei

Promotor lacZ Sítioderestrição A ras permitem que um gene seja clonado
Sítio de
e purificado em grandes quantidades
restrição B em um sistema bacteriano e, depois,
Sítio de seja transferido para expressão em cé
restrição B Região codificadora do cDNA lulas de mamíferos. Alguns vetores de
Gene
a
resistência
antibiótico
de Sítio de A
restrição lular do hospedeiro
expressão e sãoao
são integrados estavelmente
genoma ce

expressos em células filhas. Outros ve

Promotor Pontodeinício dolacZ
datranscrição Região 5!-terminal 5! Sequência
mRNA
Shine-Dalgarno
AUG da Códons
extremidade
Códons de proteína
estrangeira
dos aminoácidos
N-terminal tores de expressão permanecem como
DNA extracromossômico ou epissômico
e permitem apenas expressão transi
tória de seu gene estrangeiro, antes da
morte da célula.
A
a antibiótico
Genederesistência Plasmídeo T do cDNA
codificadora
Região
N Aminoácidos
lacZ da
pelo
Tradução
estrangeira
Aminoácidos
proteína
gene lacZ
codificada
de proteína C
G A introdução de DNA estrangeiro,
como vetor de expressão viral em cé
lulas eucarióticas em cultura, é cha
mada transfecção, um processo que é
análogo à transformação por DNA em
células bacterianas. Dois métodos co
muns envolvem a formação de um com
plexo de DNA com fosfato de cálcio ou
dietilaminoetil (DEAE)-dextran, que
recombinante Proteína de fusão é endocitado e transferido para o nú
cleo, onde é replicado e expresso. Am
FIGURA7.22 Construção de um vetor de expressão bacteriano. bos os métodos são empregados para
Um cDNA de uma proteína de interesse é inserido á jusante de sequências regulató
estabelecer vetores expressos transi
rias bacterianas (promotor [P]) do gene lacZ, a sequência codificadora da sequência
Shine–Dalgarno do mRNA, o códon AUG e alguns poucos códons dos aminoácidos toriamente, enquanto o procedimento
N-terminais da proteína LacZ. O mRNA produzido a partir desse vetor de expressão de fosfato de cálcio também é usado
dirige a síntese na bactéria de uma proteína de fusão com alguns de seus resíduos de para expressão permanente de genes
aminoácidos N-terminais idênticos aos da proteína LacZ. estrangeiros. Geralmente, 10–20% das
células em cultura podem ser transfec
tadas por esses procedimentos.
Vetores de Expressão em Células
Eucarióticas Elementos de DNA Necessários à
Expressão de Vetores em Células de
Doenças genéticas de mamíferos resultam de pro
teínas intracelulares ausentes ou defectivas. Para usar
Mamíferos
técnicas recombinantes para tratar essas doenças, A expressão de genes recombinantes em células de
devem ser incorporados vetores em células de mamí mamíferos requer a presença de elementos de controle
feros. Eles também requerem alguns mecanismos de adequados no vetor. Para ser expresso, o gene clonado
direcionamento de modo que os vetores sejam seletivos é inserido no vetorna orientação correta em relação aos
para os tecidos ou células afetados, contendo a proteína elementos de controle, que incluem um promotor, sinais
aberrante. Muitos vetores permitem a expressão de ge de poliadenilação e um enhancer. A expressão pode
nes estrangeiros em células de mamíferos crescidas em ser melhorada pela inclusão de um íntron. Alguns ou
cultura de tecidos. Esses vetores são muito usados para todos esses elementos de DNA podem estar presentes
elucidação do processamento pós-tradução e da síntese no gene recombinante se o DNA genômico inteiro for
de proteínas em células eucarióticas em cultura. O en usado para clonagem. Um fragmento específico clona
dereçamento de genes estrangeiros para tecidos espe do, gerado por clivagem com endonuclease de restrição,
cíficos ou estágios específicos do desenvolvimento teve contudo, pode não conter esses elementos. Um cDNA
sucesso muito limitado. não possuiria esses elementos de DNA necessários. É,
portanto, necessário que o vetor de expressão a ser usa
Foram desenvolvidos vetores de expressão que do em células de mamíferos seja construído de modo a
permitem a replicação, a transcrição e a tradução de conter todos os elementos de controle necessários.
genes estrangeiros em células eucarióticas em cultura.
Esses vetores incluem vetores virais de DNA e de RNA. Os elementos de controle podem ser inseridos no ve
Vetores lançadeiras (shuttle vectors) contêm sinais de tor por tecnologias recombinantes. Elementos enhan
replicação bacterianos e eucarióticos, permitindo as cers e promotores devem ser reconhecidos por um
sim a replicação do vetor tanto em células bacterianas amplo espectro de células em cultura, para maior apli
294 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

cabilidade do vetor. São usados elementos de controle dores de seleção, tanto em células bacterianas como de
derivados de vírus com uma ampla faixa de hospedei mamíferos.
ros, por exemplo, papovavírus, vírus símio 40 (SV40),
vírus do sarcoma de Rous e citomegalovírus humano. Genes Estrangeiros Expressos em Células
O vetor deve conter uma sequência de origem de re Eucarióticas Transformadas por Vírus
plicação viral (ori). Fatores proteicos específicos, co
dificados por genes inseridos no vetor ou introduzidos A Figura 7.23 mostra a expressão transitória de um
previamente no genoma do hospedeiro, reconhecem e gene transfectado em células COS, um sistema comu
interagem com a sequência ori para iniciar a replicação mente usado para expressar genes eucarióticos estran
do DNA. geiros. As células COS são células de símio cultivadas,
que foram transformadas com um genoma de SV40 com
Seleção de Células Eucarióticas origem defectiva. O genoma viral defectivo foi integrado
ao genoma da célula hospedeira e expressa constante
Transfectadas Usando Células Mutantes e
mente proteínas virais.
Nutrientes Específicos
É importante crescer seletivamente as células trans
fectadas, uma vez que elas frequentemente represen
tam apenas 10–20% da população celular. Um gene que Genoma
normal
confere resistência a uma droga ou confere capacidade
Núcleo
seletiva de crescimento pode ser incorporado a uma cé CV1 Célula
lula. Isso se consegue por cotransfecção, na qual dois
vetores diferentes são eficientemente captados por cé
lulas, um que carrega o marcador de seleção e outro
que carrega o gene de interesse. Na maioria dos casos,
Vírus SV40
mais de 90% das células transfectadas carregam am defectivo na origem
bos os vetores. Dois marcadores de seleção comumente
DNA de
empregados são os genes da timidina quinase (tk) e da SV40
di-hidrofolato redutase (dhfr). A timidina quinase é ex mRNA
pressa na maioria das células de mamíferos, nas quais
COS 1
participa da via de recuperação (salvage) de timidinas.
Proteínas
Estão disponíveis várias linhagens de células mutantes, de SV40
que não apresentam um gene funcional de timidina qui
DNA estrangeiro
nase (tk–) e não sobrevivem em meio de cultura conten Células transfectadas de interesse
do hipoxantina, aminopterina e timidina. Só as células com um plasmídeo de
mutantes tk– cotransfectadas com um vetor carregando expressão recombinante,
contendo
ori selvagem
SV40
o gene tk, geralmente originário do vírus herpes sim ori

plex, crescerão no meio. Na maioria dos casos, essas SV40 tipo selvagem

células foram cotransfectadas com o gene de interesse.

A di-hidrofolato redutase (dhfr) mantém as concen
trações celulares de tetra-hidrofolato para a biossíntese
de nucleotídeos (p. 836). Células que não têm essa en
zima só sobrevivem em meio contendo timidina, glicina
e purinas. Células mutantes (dhfl-), transfectadas com
o gene dfhr são, portanto, seletivamente crescidas em
um meio sem esses suplementos. A expressão de genes
estrangeiros em células mutantes, cotransfectadas com
marcadores de seleção, é limitada a tipos celulares com o
defeito genético necessário, que podem ser isoladas.
Células normais, transfectadas com um vetor que
carrega o gene dfhr, são resistentes a metotrexate, um
inibidor da di-hidrofolato redutase, e são selecionadas
pelo crescimento em metotrexate. De modo semelhan
te, células normais transfectadas com um gene bacte
riano que codifica a aminoglicosídeo 3!-fosfotransferase
(APH) são resistentes a antibióticos aminoglicosídicos,
como neomicina e kanamicina; isso inibe a síntese pro
teica tanto em procariotos como em eucariotos. Vetores
contendo um gene APH podem ser usados como marca
mRNA do DNA
estrangeiro inserido
Múltiplas
cópias do
Proteína de
interesse
plasmídeo
recombinante
FIGURA7.23 Expressão de genes estrangeiros em células
COS eucarióticas.
CV1, uma linhagem celular estabelecida em cultura de teci
dos, de origem símia, pode ser infectada e suporta a replicação
lítica do vírus símio de DNA SV40. As células são infectadas
com um mutante de SV40 defectivo na origem (ori), cujo DNA
integra-se permanentemente ao genoma da célula CV1 hospe
deira. O DNA viral defectivo codifica continuamente proteínas
que podem se associar com uma ori normal de SV40, para re
gular a replicação. Por causa de sua ori defectiva, o DNA viral
integrado não produz vírus. As proteínas de SV40 sintetizadas
na linhagem celular CV1 permanentemente alterada, COS-1,
podem, entretanto, induzir a replicação de plasmídeos recom
binantes carregando SV40 com oritipo selvagem, até um gran
de número de cópias (até 105 moléculas por célula). A proteína
estrangeira sintetizada nas células transfectadas pode ser de
tectada imunologica ou enzimaticamente.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 295

Vírus infectantes, que são normalmente líticos para
células infectadas, não são produzidos porque a origem
de replicação viral está defectiva. As proteínas de SV40
expressas pela célula COStransformada interagem com
uma ori SV40 normal presente em um vetor transfecta
do e, assim, promovem a replicação repetida do vetor,
que pode chegar ao número de 105 moléculas/célula.
Células COS transfectadas morrem após 3–4 dias, pos
sivelmente em virtude da sobrecarga tóxica do DNA
epissômico do vetor.
que pode ser conveniente e rapidamente identificada.
Um gene repórter comumente usado é o gene da clo
ranfenicol acetiltransferase (CAT) de bactérias. Essa
enzima acetila e inativa cloranfenicol, um inibidor de
síntese proteica em células procarióticas. O efeito de
um elemento regulatório sobre a expressão do gene
CAT pode ser então determinado. O elemento regulató
rio pode ser mutado antes da inserção no vetor que car
rega o gene repórter, para determinar suas exigências
espaciais e de sequência.

Vetor de Expressão Recombinante

7.9 MUTAGÊNESESÍTIO Região flanqueadora a
montante com
DIRIGIDA promotor

Mutando regiõesregiões selecionadasselecionadas ouou nucleotídeosnucleotídeos úni-úni RE RE

cos em um DNA clonado, é possível definir o papel de Promotor
sequências de DNA na regulação do gene e de sequên ori Gene
cias de aminoácidos na função da proteína. A mutagê
nese sítio-dirigida é a alteração controlada de regiões antibióticor

selecionadas de uma molécula de DNA. Pode envolver

inserção ou deleção de sequências específicas de DNA
ou substituição de um nucleotídeo específico por uma Região flanqueadora a
jusante
base diferente. Vários métodos químicos induzem mu
tação no DNA, geralmente em pontos aleatórios na FRAGMENTO DO DNA
GENÔMICO CLONADO
molécula.
Clivagem com endonuclease de
restrição (RE) com sítios únicos em
Papel de Regiões Flanqueadoras ori
torno da sequência a ser deletada

no DNA Avaliado por Mutações de

Elemento
Deleção e Inserção antibióticor de controle
a montante
A mutagênese sítio-dirigida pode ser feita em várias
regiões de uma sequência de DNA, incluindo o próprio Tornar circular Gene
novamente e ligar
gene ou as regiões flanqueadoras. A Figura 7.24 mostra
uma estratégia de mutação por deleção simples, em que
Promotor Promotor
a sequência de interesse é seletivamente clivada com
endonuclease de restrição, as sequências específicas são
removidas, e o vetor recombinante alterado é fechado
com DNA ligase. A função da sequência deletada pode
Gene
ser determinada comparando-se o nível de expressão
(tradução) do produto do gene, medido imunologica ou
ori Transfectar célula
enzimaticamente, com o vetor de expressão recombi
nante inalterado. Uma técnica semelhante é usada para eucariótica e medir
a expressão do gene
inserir novas sequências no sítio de clivagem. Deleção antibióticor
de uma sequência de DNA na região flanqueadora de
um gene clonado pode indicar seu papel regulatório na FIGURA7.24 Uso de vetores de expressão para estudar
expressão gênica. O arranjo espacial de elementos re sequências regulatórias do DNA.
gulatórios, um em relação ao outro, ao gene e ao seu O gene de interesse, com regiões flanqueadoras à montante e à
jusante do DNA, é inserido e clonado em um vetor de expres
promotor, pode ser importante na regulação da expres
são, e a expressão basal do gene é determinada em uma célula
são gênica (p. 321). apropriada. Regiões definidas de sequências regulatórias em
potencial podem ser removidas por clivagem com endonucle
A análise de uma sequência regulatória em potencial
ases de restrição, e o vetor do DNA recombinante truncado
envolve a inserção da sequência à montante de um gene pode ser circularizado novamente, ligado e transfectado em
repórter em um vetor de expressão. Um gene repórter, uma célula hospedeira apropriada. O nível de expressão gê
geralmente de origem procariótica, codifica uma pro nica em ausência do regulador em potencial é determinado e
teína que pode ser facilmente diferenciada de proteínas comparado com controles para verificar o papel regulatório da
normalmente presentes na célula não-transfectada, e sequência flanqueadora deletada da sequência de DNA.
296 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Elementos regulatórios podem não ter sítios de en pla-fita que pode ser transferido para E. coli susceptível,
donucleases de restrição. Em tais casos, mutações por onde a fita de DNA mutado serve de molde para novas
deleção são feitas pela linearização do DNA clonado por fitas (+), que carregam o nucleotídeo mutado.
clivagem com endonuclease de restrição à jusante da se
quência regulatória. O DNA é, então, sistematicamente
RE1 Elemento
truncado com uma exonuclease, que remove nucleotíde potencialmente
os a partir das extremidades livres de ambas as fitas do regulatório
DNA linearizado. Digestão mais longa gera fragmentos
de DNA menores. A Figura 7.25 demonstra como muta
ções maiores por deleção (gerando fragmentos meno DNA DO DNA
res) podem ser testadas quanto à atividade funcional. VETOR CLONADO
A hidrólise do DNA ocorre em ambas as extremidades
do vetor linearizado e destrói o sítio de endonuclease
de restrição original (RE2). Um sítio de endonuclease de
restrição único é restabelecido para circularizar nova Linearizar
RE2
com
mente a molécula de DNA truncada, para manipulações RE2
posteriores visando avaliar a função da sequência dele
tada. Isso é feito por ligação das extremidades retas com RE2 RE1 RE2
um DNA linker, um oligonucleotídeo sintético contendo
um ou mais sítios para endonucleases de restrição. Os
Digerir com
linkers ligados são cortados com a enzima apropriada, exonuclease Bal 31 por
permitindo a recircularização e a ligação do DNA. tempos crescentes

t1 RE1 t2 RE1 t3 RE1

Mutagênese Sítio-Dirigida de um
Espécies de tamanhos predominantes
Único Nucleotídeo RE2 RE1
Linker
Os procedimentos discutidos anteriormente permi com Ligar com DNA
linker e tornar a
tem elucidar as funções de sequências de DNA. Fre RE1 circular novamente
quentemente, entretanto, deseja-se avaliar o papel de RE
RE1
um único nucleotídeo em um local específico do DNA,
para avaliar o papel de aminoácidos específicos numa
proteína (Correlação Clínica 7.10).

Esse método também permite criar ou destruir um sí RE2 RE2

tio de endonuclease de restrição em localizações especí
ficas. A mutagênese sítio-dirigida de um nucleotídeo es
pecífico é um processo com múltiplas etapas que começa
com a clonagem do gene normal em um bacteriófago (Fi
gura 7.26). A série M13 de vetores bacteriófagos recom
binantes é comumente empregada. Esse bacteriófago
filamentoso infecta especificamente E. coli macho, que
expressa pili sexual (fator F) codificado em um plasmí
deo. O bacteriófago M13 contém DNA em uma forma fita
-única ou replicativa, que é replicada em DNA fita-dupla
em uma célula infectada. A forma fita-dupla é isolada de
células infectadas e usada para clonar o gene a ser muta
do. As placas de interesse são visualmente identificadas
por α-complementação (p. 278).
O M13 recombinante é usado para infectar E. coli
susceptível. Os bacteriófagos descendentes liberados no
meio de cultura contêm DNA fita-única. Na mutagênese
oligonucleotídeo-dirigida, é sintetizado um oligonucleo
tídeo (18–30 nucleotídeos de comprimento), que é com
plementar a uma região de interesse, exceto no nucleo
tídeo a ser mutado. Esse oligômero, com uma base com
pareamento errado (mismatch), hibridiza com o gene
fita-única e serve de primer. A extensão do primer pela
DNA polimerase do bacferiófago T4 resulta em DNA du
RE2 no linker no linker
no linker 1
Transformar bactérias para mais análises
FIGURA7.25 Modificação enzimática de sequências
regulatórias de DNA em potencial.
Uma molécula de DNA recombinante purificada, contendo um su
posto elemento regulatório de um gene em regiões flanqueadoras
do DNA, é clivado com uma endonuclease de restrição (RE2). O
DNA recombinante linearizado é digerido por períodos variados
com a exonuclease Bal31, reduzindo o tamanho do DNA que flan
queia o elemento potencialmente regulatório. As moléculas de
DNA recombinante resultantes, de tamanhos variavelmente re
duzidos, têm pequenos oligômeros de DNA (linkers) contendo
uma sequência de restrição para RE2, ligados às suas extremida
des. O DNA modificado por linker é hidrolisado com RE2 para
criar extremidades coesivas de fita única complementares, que
permitem a recircularização dos vetores recombinantes. O ele
mento regulatório em potencial, ligado a várias sequências flan
queadoras de DNA de tamanhos variavelmente reduzidos, pode
ser amplificado, purificado, sequenciado e inserido à montante
de um gene competente em um vetor de expressão. A modifica
ção da expressão do gene em uma célula transfectada apropriada
pode ser monitorada para avaliar o papel do elemento regulatório
em potencial colocado a distâncias variáveis do gene.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 297

CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.10

Mutagênese Sítio-Dirigida de Colágeno Tipo VII (C7)

A epidermólise bullosa distrófica (DEB) (OMIM
226600) é uma doença genética que resulta de uma mu
tação no gene COL7A1 que codifica colágeno tipo VII
(C7). A molécula homotrimérica de C7 é um importan
te componente das fibrilas de ancoragem que ligam a
membrana basal da pele à derme papilar subjacente.
Proteínas mutadas COL7A1 resultam em número re
duzido ou diminuto de fibrilas de ancoragem. Mais de
300 mutações distintas foram identificadas no gene CO
L7A1, com pouca correlação do genótipo com o fenótipo
da doença. Os pacientes com DEB apresentam intensi
dade leve a grave da doença, dependendo da mutação
que apresentam. Todos os pacientes têm algum grau
de vesiculação, cicatrizes e comprometimento da pele.
Mutagênese sítio-dirigida foi usada para gerar quatro
mutações diferentes, de aminoácido único. As proteí
nas C7 mutadas recombinantes foram empregadas para
analisar as propriedades funcionais das proteínas in
vivo que parecem corresponder aos fenótipos clínicos
dos pacientes com DEB.
Woodley, D. T., Hou, Y., Martin, S., Li, W. e Chen, M. Cha
racterization of molecular mechanisms in underlying muta
tions in dystrophic epidermolysis bullosa using site-directed
mutagenesis. J. Biol. Chem. 283:17838, 2008.v

Gene lacZ truncado FIGURA7.26 Mutagênese sítio-dirigida

RE de um único nucleotídeo e detecção do
(–) do M13 Gene clonado
recombinante
Fita Sítiode DNA mutado.
purificado
Gene clonado
Endonuclease de policlonagem
A figura é uma visão simplificada do mé
restrição (RE) todo. Esse processo envolve a inserção de
um fragmento de DNA amplificado puro em
RE Elemento um vetor bacteriófago modificado, M13. E.
regulatório
coli susceptível, transformada com o DNA
lacZ
Vetor M13 recombinante de M13, sintetiza a fita (+)
PLASMÍDEO
do DNA, acondicionada nas proteínas do
Transformar
vírion bacteriófago. Os bacteriófagos são
E.coli isolados do meio de cultura, e o DNA do
susceptível M13 recombinante fita-única é purifica
do. O DNA do M13 recombinante serve de
Isolar DNA fita
molde para a replicação do DNA pela DNA
única de M13
recombinante polimerase, desoxinucleosídeos trifosfato
do meio M13 RECOMBINANTE (dNTPs), DNA ligase e um primer espe
cial. O primer de DNA (oligômero com
Oligômero com pareamento errado) é sintetizado de modo
um único nucleotídeo a ser exatamente complementar a uma re
com pareamento errado DNA polimerase
quatro dNTPs,
gião do DNA (gene) de interesse, exceto
DNA ligase por uma base que se deseja alterar (mutar).
O DNA do M13 recém-sintetizado, portan
to, contém uma base especificamente mu
DNA ligado a filtro de nitrocelulose tada que, quando reintroduzida em E. coli
com NaOH, hibridizado com sonda susceptível, será fielmente replicada. A E.
5! marcada para o oligômero com coli transformada é crescida em placas de
pareamento errado
agar com réplicas das colônias resultantes
3! sendo feitas em filtro de nitrocelulose. DNA
associado com cada colônia é desnaturado
e fixado ao filtro com NaOH, e o DNA ligado
ao filtro é hibridizado com uma sonda oligô
Transformar E.coli, Tocar a placa de agar mero de DNA marcada com 32P, com parea
susceptível e plaquear com filtro de
o bacteriófago
mento errado. Os mutantes putativos são,
nitrocelulose
resultante contendo então, identificados por exposição do filtro
M13 tipo selvagem Mutante a filme de raios-X.
mais DNA mutado putativo
sobre o tapete de
E.coli crescida
em agar
Autorradiografia
298 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

As placas de bacteriófago, que contêm o DNA mu
tado, são examinadas por hibridização com uma son
da marcada do oligonucleotídeo original carregando o
nucleotídeo alterado. Ajustando-se a temperatura de
lavagem da sonda hibridizada, apenas os híbridos com
pareamento perfeito permanecerão complexados
com o DNA mutado, enquanto os oligômeros com nu
cleotídeo pareado erroneamente se dissociarão do DNA
tipo-selvagem.
uma molécula de plasmídeo recombinante mutada,
com falhas (nicks) nas duas fitas. A mistura de reação
é então tratada com uma endonuclease, Dpn-1, que di
gere seletivamente o DNA parental metilado (não-mu
tado). Os plasmídeos remanescentes do DNA mutado
clivado (não-metilados) são transformados em células
competentes, que ligam a falha e replicam os plasmí
deos recombinantes mutados.

O M13 que carrega o gene mutado é então replica Inserto de DNA

do em bactérias, o DNA é purificado e a região mutada
do gene é sequenciada para identificar a mutação. Um
método modificado para replicar seletivamente a fita
mutada foi desenvolvido para melhorar a eficiência da Plasmídeo
recombinante
mutagênese sítio-dirigida. O bacteriófago M13, replica
do em uma E. coli mutante, incorpora alguns resíduos
de uracil em lugar de timina, em virtude de um defeito
metabólico na síntese de dTTP a partir de dUTP e da + um primer complementar
e um primer com uma
falta de uma enzima que normalmente remove uracil única base errada
do DNA. (representada como uma espícula)

O DNA fita-única purificado de M13 contendo uracil

é hibridizado com um oligômero complementar conten
do uma base com pareamento errado no nucleotídeo a
ser mutado. O oligômero serve de primer para a repli
cação do DNA in vitro, com a fita molde (+) contendo
uracilas, e a fita nova (–) contendo timinas. Quando o
DNA dupla-fita de M13 é transformado em uma E. coli
tipo-selvagem, a fita contendo uracilas é destruída, e
a fita mutada (–)serve de molde para os descendentes PCR
dos bacteriófagos, a maioria dos quais carregando a mu
tação de interesse. DNA amplificado por PCR
combaseerradaecomsuabasecomplementar
O PCR também é empregado para mutagênese sítio mutada
-dirigida. Foram desenvolvidas estratégias para incor Tratar com Klenow
porar uma base com pareamento errado em um dos e ligar
oligonucleotídeos que servem de primer para o PCR.
Alguns desses procedimentos empregam bacteriófago
M13 e seguem os princípios descritos na Figura 7.27.
Uma variação desses métodos de PCR, mutagênese por
PCR inverso, foi aplicada a pequenos plasmídeos re
combinantes (4–5 kb). O método é muito rápido, com
50–100% das colônias geradas contendo a sequência
mutante. Os dois primers são sintetizados, de modo
que pareiem final-com-final com um primer contendo
a base errada.

Um método de mutagênese sítio-dirigida que eli Transfectar para determinação

mina a necessidade de ssDNA e etapas trabalhosas de
seleção, foi desenvolvido comercialmente pela Strata
gene. O processo emprega mutagênese oligonucleotídeo
-dirigida e PCR com qualquer plasmídeo DNA vetor
isolado de cepas de E. coli competentes para metila
ção do DNA. Como mostra a Figura 7.28, um anela dois
oligonucleotídeos complementares, carregando o nu
cleotídeo alterado desejado, com uma região do DNA
clonado inserido no vetor. Os oligonucleotídeos são,
então, estendidos por PCR com uma DNA polimerase
tipo Phusion, sem deslocamento do primer, gerando
experimental do efeito de
mutar uma única base
FIGURA7.27 Mutagênese por PCR inverso.
Uma única base pode ser mutada em plasmídeos de DNA re
combinante por PCR inverso. Dois primers são sintetizados
com suas extremidades 5! antiparalelas complementares a ba
ses adjacentes nas duas fitas de DNA. Um dos dois primers
contém uma base específica errada, que é fielmente copiada
durante as etapas de amplificação por PCR, gerando no final
um plasmídeo recombinante contendo uma única base mutada.
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 299

DNA recombinante dos de evolução. O DNA de um único fio

Vetor metilado (Me) Me (estrangeiro)
de cabelo, uma gota de sangue ou esperma
de uma vítima de estupro pode ser isolado,
Primers de DNA
amplificado e mapeado para propósitos fo
Me complementar
Nucleotídeos
renses. O aprimoramento das tecnologias
não-complementares atuais poderá permitir a introdução seleti
PCR va de genes em células defectivas e de áci
dos nucleicos em células específicas para
Me inibir seletivamente a expressão de genes
DNA recém deletérios.
sintetizado +
Me

Ácidos Nucleicos
+Dpn 1
Complementares
DNA parental hidrolizado
com Dpn 1, uma endonuclease
(Antisense) em Pesquisa e
Terapêutica
Ácidos nucleicos complementares ou
antisense (RNA ou DNA) são usados para
Transformado
em E.coli competente estudar a expressão intracelular e a função
de proteínas específicas. Os ácidos nuclei
cos antisense naturais e sintéticos, que
são complementares a mRNA, inativam-no
e bloqueiam a tradução. Existem centenas,
talvez milhares, de microRNAs diferentes
(RNA antisense) codificados no genoma
humano. Cada tipo celular expressa dife
rentes combinações desses microRNAs
FIGURA7.28 Mutagênese sítio-dirigida de DNA fita-dupla. que regulam seletivamente a expressão
Uma molécula de DNA recombinante pode ser mutada em um sítio selecionado gênica em nível de RNA. RNAs antisense
por meio de síntese de primers complementares que contêm um nucleotídeo tanto naturais como sintéticos são proces
que não é complementar à fita de DNA parental, mas que são complementares sados pela, ou associados com o complexo
entre si. Os primers são estendidos por PCR deixando falhas (nicks, X) em cada proteico RISC (RNA-induced silencing
fita que é ligada após transformação em E. coli competente. O DNA parental
complex, completo silenciador induzido
metilado (Me) é removido por hidrólise com a endonuclease Dpn 1, antes da
transformação. por RNA), que apresenta o RNA antisen
se 21 oligomérico (21-mero) ao RNA sense
(geralmente mRNA), e as fitas complementares hibridi
7.10 APLICAÇÕES DA zam. O RNA sense/antisense é então reconhecido para
destruição/inibição (RNA de interferência [RNAi]). Os
TECNOLOGIA DO DNA RNAs naturais ou sintéticos maiores do que 21-mero
RECOMBINANTE devem ser hidrolisados até o tamanho apropriado por
uma enzima chamada Dicer, resultando no RNA peque
Os métodos do DNA recombinante são aplicáveis a no de interferência (siRNA, small-interfering RNA).
numerosas disciplinas biológicas, incluindo agricultura, A introdução estável de siRNA em células pode reduzir
estudos de evolução, biologia forense e clínica médica. permanentemente ou nocautear a expressão de genes
A engenharia genética pode introduzir proteínas novas específicos. As tecnologias de RNAi estão sendo atual
ou alteradas em grãos (por exemplo, milho), de modo mente usadas em vários laboratórios como ferramenta
que eles contenham aminoácidos essenciais para o ho- de pesquisa para elucidar a função de genes específicos
mem, mas frequentemente ausentes de proteínas vege e por muitas companhias farmacêuticas e de biotecno
tais. Toxinas letais a insetos específicos, mas inócuas ao logia para desenvolver terapêuticas baseadas em RNAi.
homem, podem ser introduzidas em grãos para protege A introdução de ácidos nucleicos antisense em células
rem as plantas, evitando assim o uso de pesticidas que abriu novas possibilidades para explorar como proteí
agridem o meio ambiente. O DNA isolado de células do nas seletivamente reprimidas funcionam nessa célula.
líquido amniótico de uma mulher grávida pode ser ana Esse método também é muito promissor no controle de
lisado quanto a doenças genéticas no feto. Quantidades infecções virais. A tecnologia antisense e a mutagêne
minúsculas de DNA de amostras biológicas preservadas se sítio-dirigida são partes da genética reversa (do gene
em antigos depósitos de alcatrão ou em tundras con para o fenótipo), que modifica seletivamente um gene
geladas foram amplificadas e sequenciadas para estu para avaliar sua função, enquanto a genética clássica
300 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
depende do isolamento e da análise de células que con
têm mutações aleatórias que possam ser identificadas.
Um segundo uso do termo genética reversa refere-se ao
mapeamento e, no final, à clonagem de um gene huma
no associado com uma doença para a qual os agentes
moleculares são ainda desconhecidos.
RNA antisense é introduzido em células pelas técni
cas comuns de clonagem. A Figura 7.29 demonstra um
gene clonado em um vetor de expressão à jusante de
um promotor, mas na orientação oposta à normal. Isso
coloca a fita complementar ou antisense do DNA sob o
controle do promotor, com a expressão ou a transcrição
gerando RNA antisense. A transfecção de células com o
vetor de expressão antisense introduz RNA antisense,
que hibridiza com o mRNA normal. O complexo mRNA
-RNA antisense não é traduzido por várias razões, como
sua incapacidade de se ligar aos ribossomos, bloqueio do
processamento normal e rápida degradação enzimática.
Foram produzidos oligonucleotídeos sintéticos de
DNA antisense, capazes de inibir infecção viral in
cluindo a do vírus da imunodeficiência humana (HIV).
Acredita-se que ácidos nucleicos antisense de HIV se
rão introduzidos em células de medula óssea removidas
de pacientes com AIDS. Essas células protegidas serão,
então, reintroduzidas no paciente e substituirão as cé
lulas normalmente destruídas pelo vírus. Tem sido feito
progresso com ácidos nucleicos antisense que regulam
a expressão de oncogenes, genes envolvidos em forma
ção do câncer. Portanto, as tecnologias antisense são
muito promissoras para o tratamento de doenças hu
manas (Correlação Clínica 7.11). Embora tenham sido
feitos muitos estudos com siRNA que têm 21 bases de
comprimento, para desencadear RNAi, demonstrou-se
Gene Normal
RNA-polymerase
Promotor dependente de DNA
RE1 RE2 3!
5!
3! 5!
Ponto de início
da transcrição +1 Pré-mRNA
complementar
Processamento do RNA
5! 3!
RNA com
(RNA sense)
sentido
mRNA funcional
RNA complementar (antisense) hibidriza com o RNA
sense e a tradução do mRNA normal é bloqueada
FIGURA7.29 Produção de RNA antisense.
Um gene, ou uma parte dele, é inserido em um vetor à jusan
te de um promotor por clonagem direcional e em orientação
inversa à que é normalmente encontrado. Transfecção desse
DNA recombinante na célula parental que carrega o gene nor
mal resulta na transcrição do RNA (RNA antisense) do DNA
recentemente que RNAs antisense dupla-fita ligeira
mente maiores, que são substratos para a Dicer, são ini
bidores mais eficientes da expressão gênica. Acredita
-se que isso se deva à participação da Dicer na formação
do complexo RISC (Correlação Clínica 7.11B).
Técnicas Moleculares Aplicadas ao
Animal Inteiro
Como descrito, muitos sistemas in vitro e intrace
lulares facilitam a purificação, o sequenciamento e a
modificação de genes ou de seus cDNAs e as regiões
flanqueadoras de genes com funções potencialmente
regulatórias. A introdução de genes estrangeiros em
um animal inteiro, a deleção de um gene do genoma do
animal inteiro, e a clonagem de um animal inteiro foram
conseguidos. Embora claros aspectos bioéticos e bar
reiras ainda devam ser considerados ao usar algumas
dessas metodologias, os métodos em si são muito pro
missores para futura terapia gênica.
Terapia Gênica: Genes Normais Podem Ser
Introduzidos em Células com um Gene
Defectivo
Indivíduos que possuem um gene defectivo, resul
tando em uma condição debilitante ou fatal, podem te
oricamente ser tratados pelo fornecimento de um gene
normal a suas células. Terapia gênica, a transferência
de um gene normal para seres humanos, tem sido fei
ta usando vetores retrovirais (Correlação Clínica 7.12).
O sucesso da transferência de genes depende, em par
te, da integração do gene ao genoma do hospedeiro, o
Vetor Expressão Recombinante
RE2
Promotor
Clonar o gene por clonagem Ponto de
transcrição
direcional e transfectar célula
Normal +1
RE1
Transcrição da fita de
DNA complementar do
gene (fita antisense)
Promotor
5!
5!
3!5!3! RNA antisense
clonado com a polaridade invertida, juntamente com o mRNA
celular normal (RNA sense) transcrito. Os dois RNAs anti
paralelos complementares hibridizam dentro da célula, resul
tando em expressão (tradução) bloqueada do mRNA normal
transcrito.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.11
Regulação da Expressão Gênica Mediada por siRNA
A. Aptâmero-siRNA para Terapia de HIV-1
O uso de RNA pequeno de interferência, siRNA
(RNA antisense) para regular a expressão gênica de
proteínas do HIV-1 em células doentes requer a entrada
eficiente do siRNA nas células alvos. Um aptâmero foi
engenheirado para reconhecer e se ligar seletivamente
a gp120 (glicoproteína 120). A gp120 é uma proteína
do HIV-1 que é expressa na membrana de células infec
tadas. Um aptâmero é uma molécula de ácido nuclei
co capaz de se ligar seletivamente a moléculas alvos,
como proteínas específicas. Moléculas quiméricas de
aptâmero anti-gp120 e anti-tat/rev siRNA foram produ
zidas por ligação covalente das duas espécies. O siRNA
era um 27-mero que serve de substrato para a Dicer. O
aptâmero-siRNA foi captado seletivamente pelas célu
las infectadas por HIV-1 expressando dp120. O siRNA
27-mero foi então processado intracelularmente pela
Dicer gerando um siRNA 21-mero inibitório anti-tat/rev.
O nocaute da expressão dos genes do HIV-1 tat/rev, jun
tamente com o efeito antiviral do aptâmero anti-gp120,
teve um efeito inibitório combinado sobre a replicação
do HIV-1. O uso de quimeras aptâmero-siRNA é muito
promissor para o tratamento sistêmico de infecções por
HIV e outras doenças que apresentam marcadores de
superfície como potenciais alvos.
que é dirigido pelo sistema retroviral de integração. A
integração, entretanto, é geralmente um evento alea
tório que pode ter consequências deletérias. Estudos
indicam que a maquinaria de integração viral é seleti
vamente direcionada a sequências alvos específicas no
DNA do hospedeiro por interações proteína-proteína,
para evitar esses problemas em potencial.
Animais Transgênicos
Para investigar o papel de um produto gênico especí
fico no crescimento e no desenvolvimento de um animal
inteiro, o gene deve ser introduzido no óvulo fecundado.
Genes estrangeiros podem ser inseridos no genoma de
um óvulo fecundado. Animais que se desenvolvem a par
tir de tal óvulo fecundado carregam o gene inserido em
todas as células e são chamados animais transgênicos.
A Figura 7.30 delineia um método popular para criar
animais transgênicos. O gene de interesse é geralmen
te uma molécula de DNA recombinante clonada com
seu próprio promotor ou é clonada com um promotor
diferente, que pode ser regulado seletivamente. Múlti
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 301
B. Uso de siRNA Substrato da Dicer na Pesquisa de Dor
A maioria das drogas vendidas atualmente, que agem
no Sistema Nervoso Central (SNC), é dirigida para o tra
tamento de dor. As duas classes principais de analgésicos
são as drogas opioides e os anti-inflamatórios não-este
roídicos. Frequentemente, porém, essas drogas não são
efetivas ou perdem sua potência no tratamento de dor
crônica. Demonstrou-se em um modelo que o receptor
acoplado a proteína G NTS2, no SNC, está envolvido na
transmissão da dor. O RNAi (RNA de interferência) foi
empregado para diminuir a expressão do gene NTS2 em
camundongos. Descobriu-se que o uso de um 27-mero
(RNA antisense do mRNA de NTS2) que serviria como
siRNA substrato da Dicer (DsiRNA) suprimiu eficiente
mente a expressão de NTS2. O DsiRNA foi suspenso em
um lipídeo catiônico, i-Fect, e administrado na coluna
espinal do rato por injeção intratecal. A administração
de uma dose baixa de DsiRNA melhorou a dor por até 3-4
dias, correspondendo à redução da expressão da pro
teína receptora NTS2 no mesmo período de tempo. Esse
tipo de tratamento com DsiRNA pode, finalmente, ajudar
a reduzir a dor crônica intratável no homem.
Zhou, J. I., Li, H., Li, S., Zaia, J. e Rossi, J. J. Novel dual inhi
bitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 the
rapy. Mol. Therapy 16:1358, 2008. Dore-Savard, L., Roussy, G.,
Dansereau, M. A., Collingwood, M. A. et al. Central delivery of
Dicer-substrate siRNA: A direct application for pain research.
Mol. Therapy 16:1331, 2008.
plas cópias do gene são microinjetadas no pró-núcleo
do óvulo fecundado. O DNA estrangeiro se insere alea
toriamente no DNA cromossômico. Se um inserto in
terromper um gene celular crítico, o embrião morrerá.
Geralmente, eventos mutagênicos não-letais resultam
da inserção do DNA estrangeiro no cromossomo.
Animais transgênicos vêm sendo usados atualmente
para estudar os elementos regulatórios no DNA, a ex
pressão de proteínas durante a diferenciação, a espe
cificidade tecidual e o papel de produtos de oncogenes
sobre crescimento, diferenciação e indução de tumori
gênese. Tais tecnologias devem permitir substituir ge
nes defeituosos no embrião em desenvolvimento (Cor
relação Clínica 7.13).
Camundongos Knockout
A criação de um animal com um gene específico des
truído em todas as células permite aos pesquisadores
definir a função biológica do gene, se sua perda não for
letal. Os princípios básicos por trás da criação de um ca
mundongo null, ou knockout, envolvem a inativação de
302 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.12
Terapia Gênica: Genes Normais Podem Ser Introduzidos em Células com Genes Defectivos
A. Terapia gênica para tratar a doença da imunodefi
ciência combinada severa (SCID) (OMIM 102700)
Mais de 4.000 doenças genéticas são conhecidas,
muitas das quais são debilitantes ou fatais. A maioria
é, no momento, incurável. Com o advento de novas
tecnologias de biologia molecular, a aplicação clínica
da transferência de genes e da terapia gênica está se
tornando uma realidade. Doenças que resultam de uma
deficiência da adenosina desaminase (ADA) ou de
uma mutação no gene que codifica uma subunidade de
vários receptores de citocinas, γc, são apenas duas das
muitas doenças genéticas que podem ser completamen
te curadas pela terapia gênica.
ADA é importante na recuperação de purinas, ca
talisando a conversão de adenosina em inosina ou de
soxiadenosina em desoxiinosina. Ele contém 363 ami
noácidos e tem atividade mais alta no timo e em outros
tecidos linfoides. Mais de 30 mutações no gene ADA es
tão associadas com a doença da imunodeficiência com
binada severa (SCID, severe combined immunodefi
ciency disease), uma doença autossômica recessiva.
As crianças imuno-comprometidas geralmente morrem
nos primeiros anos de vida, em decorrência de fortes in
fecções. A primeira terapia gênica autorizada no homem
começou em 14 de setembro de 1990, com o tratamento
de uma menina de 4 anos de idade com deficiência de
ADA. As células T do sangue periférico da paciente fo
ram cultivadas com fatores de crescimento adequados.
O gene ADA foi introduzido nessas células por trans
ferência gênica mediada por retrovírus. Um retrovírus
modificado foi construído para conter o gene ADA hu
mano, de modo que ele fosse expresso em células hu
manas sem replicação viral. As células T modificadas,
carregando um gene ADA normal, foram então rein
troduzidas na paciente por transfusão autóloga. Níveis
de ADA de apenas 10% do normal são suficientes para
normalizar o paciente. A paciente, 10 anos mais tarde e
com a idade de 13 anos, estava viva e bem, e mantinha
células T gene-corrigidas em um nível de 20–25% do
total de células T.
A doença hereditária ligada ao X, SCID-X1, resulta
no bloqueio da diferenciação de linfócitos T e natu
ral killer (NK). SCID-X1 resulta de uma mutação na
subunidade γc do receptor de citocinas, comum aos
receptores das interleucinas 2, 4, 7, 9 e 15. A metodo
logia do tratamento, para pacientes de 8 e 11 meses
de idade, foi semelhante à empregada em pacientes
SCID com deficiência de ADA; essa doença tende a ser
menos grave do que SCID-X1. Os estudos de SCID-X1
transduziram células-tronco CD34+ com um vetor re
troviral carregando o cDNA γc normal. Isso resultou
em um nível muito mais alto de transdução do gene
do que o observado em estudos anteriores. Ambos os
bebês tiveram seus sistemas imunes normalizados o
suficiente após 3 meses para deixarem o isolamento
protetor do hospital.
Uma moratória sobre a terapia gênica para SCID-X1
foi introduzida em 2003 pela indução de uma síndrome
tipo-leucemia em 2 das 14 crianças europeias tratadas
para essa doença. A leucemia de células T foi causada
pela inserção retroviral e up-regulation do gene LMO2
que codifica um fator de transcrição necessário para
hematopoiese. Espera-se que modificações futuras no
vetor usado para a terapia gênica possam evitar a apa
rente inserção preferencial do retrovírus próximo a ge
nes ativos.
B. Terapia gênica para tratar a Amaurose Congênita de
Leber
Um interessante uso da terapia gênica foi recente
mente relatado para corrigir a função visual na amau
rose congênita de Leber, que representa múltiplas
formas de distrofias graves de bastonetes-cones, here
ditárias recessivas de início na infância. Uma proteí
na de 65 kD é um componente chave do ciclo visual e
é codificada pelo gene RPE65 no epitélio pigmentado
da retina. Um gene RPE65 não-funcional causa uma
perda de 11-cis retinal, que é necessário para que as
células fotorreceptoras vermelhas respondam à luz.
Parece que crianças possuem uma via alternativa para
a disponibilidade de 11-cis retinal, que desaparece à
medida que ficam mais velhas. As crianças com a do
ença têm função visual que diminui com a idade, com
a degeneração progressiva das células cones fotorre
ceptoras. Três pacientes (idades 17–23) receberam
a administração cirúrgica de um vetor viral adeno
-associado recombinante contendo a sequência codi
ficadora do RPE65 humano, no espaço subretinal de
um olho. No momento da cirurgia, todos os pacientes
tinham alguma função visual com boa iluminação,
mas visão limitada ou nenhuma com pouca luz. Os re
sultados desse estudo indicam que pacientes com de
generação avançada de células cones fotorreceptoras
obtêm modesta melhora na função visual com terapia
gênica com RPE65. Postula-se que tal terapia gênica
em pacientes mais jovens traga mais benefícios do que
em adultos.
Blaese, R. M., Progress toward gene therapy. Clin. Im
mun. Immunopath 61:574, 1991; Mitani, K., Wakamiya, M.
e Caskey, C. T. Long-term expression of retroviral-transdu
ced adenosine deaminase in human primitive hematopoietic
progenitors. Human Gene Therapy 4:9, 1993; Anderson,
W. F. The best of times, the worst of times. Science 288:627,

2000; Cavazzana-Calvo, M., Hacein-Bey, S., de Saint Basile,
G., Gross, F. et al. Gene therapy of human severe combined
imunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 288:669, 2000;
Hacein-Bey, S., VonKalle C., Schmidt, M., McCormack, N. P.
et al. LMO2- associated clonal T-cell proliferation in two
patients after gene therapy for SCID-X1. Science 302:415,
Éxon1 Éxon2 Éxon3
Íntron Íntron Sinais de polyA
Promotor
Gene clonado
DNA recombinante clonado
microinjetado no pró-núcleo
de óvulo fecundado de camundongo
Pró-núcleo
Ovo
Implantar as células-ovos
em camundongos mães
adotivas
Isolar o DNA de
pequenos pedaços
de cauda. Hibidrizar com
sonda marcada para
identificar o camundongo
Camundongo transgênico
transgênico
1. Cruzar para estabelecer camundongos transgênicos
2. Estabelecer linhagens celulares dos tecidos de
camundongos transgênicos para estudar a regulação
e a estrutura de genes, bem como a função do
produto gênico
FIGURA7.30 Produção de animais transgênicos.
Genes funcionais clonados, amplificados e purificados são mi
croinjetados em vários pró-núcleos de óvulos fecundados de
camundongos in vitro. Os ovos são implantados numa mãe
adotiva. DNA é isolado de um pequeno fragmento da cauda
de cada um dos filhotes e hibridizado com uma sonda marcada
para identificar os animais que carregam o gene estrangeiro
(camundongo transgênico). Os camundongos transgênicos po
dem ser cruzados entre si para estabelecer uma nova linhagem
de camundongos. Linhagens celulares também podem ser es
tabelecidas a partir de tecidos de camundongos transgênicos
para estudar regulação gênica e estrutura ou a função do pro
duto do gene estrangeiro.
um gene recombinante purificado, a introdução desse
gene alterado em uma célula tronco embrionária (ES),
de modo que substitua o gene normal, a injeção da cé
lula ES modificada em um blastocisto em desenvolvi
mento, o implante do blastocisto em uma mãe adotiva,
e a seleção do filhote que não têm o gene normal. Uma
abordagem comum para inativar um gene específico é
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 303
2003; Bainbridge J. W., Smith, A. J., Barker, S. S. Robbie,
S. et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber
congenital amaurosis. N. Eng. J. Med. 358:2231, 2008; e
Maguire, A. M., Simonelli, F., Pierce, E. A., Pugh, E. N., Jr. et
al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital
amaurosis. N. Engl. J. Med. 358:2240, 2008.
inserir um gene de resistência a um antibiótico, conhe
cido como neo, no gene clonado de interesse. Isso ina
tiva o gene de interesse e permite identificar as células
ES que foram transfectadas com sucesso. O gene nor
mal numa porcentagem muito pequena de células ES
pode ser substituído pelo gene recombinante interrom
pido por neo por recombinação homóloga. As sequên
cias de nucleotídeos do gene alterado ou interrompido
alinham-se com a sequência homóloga do gene normal
e trocam de lugar, ou podem se introduzir no meio do
gene normal. Em ambos os casos, o resultado final é a
destruição ou knockout (nocaute) do gene normal da
célula ES. A seleção das células ES alteradas, a microin
jeção em um blastocisto de camundongo, o nascimento
de filhotes quimeras e o cruzamento de filhotes homozi
gotos para o gene alterado (Figura 7.31) é um processo
extremamente trabalhoso. O processo foi aplicado em
numerosos experimentos para avaliar o papel de genes
específico (Correlação Clínica 7.14).
Dolly, uma Ovelha Clonada a partir de
uma Célula Adulta
A clonagem de animais levanta inúmeras questões
éticas, tais como: é competência do homem selecionar a
composição genética de animais e propagar esses ani
mais? É claro que há muitas vantagens experimentais
no desenvolvimento de animais com informação genéti
ca idêntica. Entretanto, a aplicação de técnicas de clo
nagem de animais inteiros para o homem levanta ques
tões éticas que a maioria considera inaceitáveis.
A clonagem de descendentes viáveis a partir de cé
lulas de mamíferos adultos é muito trabalhosa. O méto
do que produziu Dolly, a ovelha clonada, começou com
o cultivo de células de glândula mamária derivadas de
uma ovelha Finn Dorset de seis anos de idade. As células
foram paradas em G0 pela manutenção em meio de cul
tura com baixo conteúdo de soro. Os núcleos de células
doadoras diploides quiescentes foram, então, transferi
dos para ovócitos anucleados derivados de uma ovelha
Scottish Blackface. Os óvulos fecundados artificialmente
se desenvolveram até o estágio de mórula ou blastocisto
em cultura e, depois, foram transferidos para uma ove
lha receptora, que levou o feto a termo. Só uma pequena
percentagem dos embriões implantados sobreviveu a ter
mo. Entretanto, a metodologia para clonar descendentes
a partir de células somáticas adultas foi estendida com
sucesso a gado, camundongos e macacos.
304 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.13
Modelos de Animais Transgênicos
Modelos de animais transgênicos são promissores
para corrigir doenças genéticas logo no início do desen
volvimento fetal. São usados para estudar a regulação
da expressão e a função de produtos gênicos específi
cos num animal e podem levar à criação de novas linha
gens de animais comercialmente valiosos. Camundon
gos transgênicos foram produzidos a partir de óvulos
fecundados de camundongos com genes de hormônio
de crescimento (GH) de rato microinjetados em seus
pró-núcleos machos (p. 303). Aproximadamente 600
cópias do gene, fundido com a região do promotor da
metalotioneína-1 (MT-1) de camundongo, foram intro
duzidas em cada ovo que foram, então, inseridos no
trato reprodutor de camundongos mães adotivas. O
camundongo transgênico resultante continha o gene
GH de rato em seu genoma. A dieta dos animais foi
Generação de um camundongo “Knockout”
Cultura das células-troncos
embrionárias (ES) de camundongos
de pelagem preta Transfecção com um
gene clonado mutado,
não-funcional
Microinjeção de células ES
alteradas em blastocisto de
camundongo
Implante do blastocisto Camundongo
em mãe adotiva albina quimérico identificado
visualmente, com
pelos pretos
suplementada com ZnSO4 33 dias após o nascimento
para ativar o promotor MT-1 de camundongo e iniciar
a transcrição do gene GH de rato. Superexpressão con
tínua de GH de rato em alguns animais transgênicos
produziu camundongos com quase duas vezes o tama
nho dos irmãos, que não carregavam o gene GH de rato.
Um camundongo transgênico transmitiu o gene GH de
rato para metade de seus filhotes, indicando que o gene
havia se integrado estavelmente ao genoma da célula
germinativa e que novas linhagens de animais podiam
ser criadas.
Palmiter, R. D., Brinster, R. L., Hammer, R. E. et al. Dra
matic growth of mice that developed from eggs microinjected
with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature
300:611, 1982.
Algumas poucas células ES
contêm o gene não-funcional,
obtido por recombinação
homóloga
É empregada uma técnica de exame
apropriada para isolar as células ES
com o gene alterado
A população homogênea de
células ES com o gene
“deletado” é expandida
FIGURA7.31 Geração de um
camundongo knockout.
Células embrionárias em cultura podem
ser manipuladas pela tecnologia de re
combinação para conterem um gene de
Cruzamento para fectivo ou “deletado”. As células alteradas
obter o filhote raro podem ser introduzidas em um blastocisto
com o gene alterado
que é, então, implantado numa mãe ado
em suas células
germinativas Filhotes inteiramente tiva. Filhotes que têm o gene “deletado”
pretos com o gene não-funcional em todas as suas células
alterado podem, então, ser selecionados – o animal
knockout.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.14
Camundongos Knockout para Definir um Papel para o Purinoceptor P2Y1
As plaquetas desempenham um papel central na
hemostasia e na trombose. Um importante agonista
fisiológico que induz agregação plaquetária é o ADP.
Estudos da década de 1970 estabeleceram o dogma de
que o ADP, ligado a um receptor acoplado a proteína G,
induz agregação, enquanto o ATP extracelular, agindo
sobre o mesmo sítio receptor, inibe competitivamente
a agregação. Às vezes, regras baseadas em evidências
limitadas, são firmemente aceitas e passam-se anos
antes que sejam revistas. Na década de 1990, ficou cla
ro que as plaquetas possuem pelo menos três purino
ceptores diferentes, com diferentes especificidades de
ligação a ATP versus ADP. O entendimento de como
esses receptores, potencialmente interativos, funcio
nam é muito importante clinicamente. ATP e ADP são
liberados no sistema vascular/sangue em várias condi
ções normais e patológicas. O equilíbrio entre a ação
agonista do ADP e antagonista do ATP pode desempe
nhar um papel significativo na regulação da resposta
plaquetária. A definição dos mecanismos de ação pode
levar à produção de novas drogas para combater trom
Dolly foi morta por eutanásia em 2004 em decorrên
cia de uma doença progressiva de pulmão associada
com o que parecia ser um processo de envelhecimento
prematuro. Não está claro se esses defeitos resultaram
do processo de clonagem e/ou de fatores ambientais.
Entretanto, as técnicas de clonagem continuam a ser
exploradas com a expectativa de que tenham grande
valor terapêutico. Recentemente uma fêmea de camun
dongo foi criada a partir de dois óvulos de fêmeas, con
tornando um processo chamado de imprinting. O im
printing determina que alguns genes ativos devem ser
doados pela mãe e outros, pelo pai. Normalmente em
briões de mamíferos engenheirados com dois conjuntos
de cromossomos de fêmea ou macho não se desenvol
vem. O camundongo fêmea criado a partir de duas mães
viveu até a idade adulta e teve sua própria ninhada de
filhotes.
Com o sucesso da criação da Dolly e o isolamento
de células-troncos embrionárias humanas (hESC), os
cientistas começaram sua luta para combinar as duas
técnicas, para criar células-troncos embrionárias gene
ticamente ajustadas a um paciente específico, a clona
gem terapêutica. Um passo importante nessa direção
foi dado pelo esforço hercúleo de se criar uma única
linhagem de hESC derivada de uma blástula clonada.
A blástula clonada foi criada por inserção do núcleo de
uma célula de cumulus humana (células que ficam em
torno do óvulo no ovário) em um óvulo humano anu
cleado, e este foi colocado em um ambiente químico
adequado para induzir a replicação. A linhagem hESC
cresce normalmente em cultura e poderia ser capaz de
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 305
bose. O desenvolvimento recente de um modelo de ca
mundongo knockout (null) permitiu acessar o papel
do receptor de purina P2Y1.
Apesar de o receptor P2Y1 ser encontrado em mui
tos outros tecidos além das plaquetas, o camundongo
knockout não apresentava nenhuma anormalidade
aparente. Entretanto, níveis normais de ADP eram in
capazes de induzir agregação plaquetária, embora altas
concentrações de ADP o fizessem. As plaquetas agre
gadas não mostravam a mudança normal de forma. Os
camundongos P2Y1-null eram resistentes à trombose e,
portanto, esse receptor pode ser um bom alvo para dro
gas antitrombóticas.
Soslau, G. e Youngprapakorn, D. A possible dual physio
logical role of extracellular ATP in the modulation of platelet
aggregation. Biochim. Biophys. Acta 1355:131, 1997; e Leon,
C., Hechler, G., Freund, M., Eckly, A., Vial, C. et al. Defec
tive platelet aggregation and increased resistance to throm
bosis in purinergic P2Y1 receptor-null mice. J. Clin. Invest.
104:1731, 1999.
se diferenciar em todos os tipos de células do corpo.
Essas células poderiam ser induzidas a formar células
normais de qualquer tecido, para substituir tecidos de
fectivos em pacientes.
Células-troncos embrionárias são células pluripo
tentes que podem se desenvolver em qualquer tipo de
célula do organismo, em presença de ambiente e de
moléculas sinalizadoras corretos. Muitas esperanças e
preocupações éticas surgiram em torno do desenvolvi
mento e uso de células-troncos embrionárias para o tra
tamento de muitas doenças humanas. Estudos recentes
demonstraram que células somáticas humanas podem
ser reprogramadas para se tornarem células-troncos
tipo-embrionárias, pluripotentes. A introdução estável
de quatro fatores de transcrição, Oct 4, Sox2, Klf4 e
Myc, em células somáticas de camundongo ou huma
nas por vetores virais resultou na formação de células
-troncos pluripotentes induzidas (iPS). Embora muito
trabalho seja necessário para demonstrar a segurança
de usar essas células iPS para o tratamento clínico de
doenças, seu potencial é enorme. Além disso, células
iPS podem ser paciente-específicas para eliminar qual
quer resposta imune.
DNA Recombinante em Agricultura
Tem Impacto Comercial
Talvez o maior ganho para a humanidade seja o
uso prático da tecnologia recombinante para a melho
ria agrícola de grãos. Devem ser identificados e isola
306 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
dos os genes que codificam propriedades como maior
produtividade em grãos, crescimento rápido da planta,
resistência a condições adversas como períodos áridos
ou frios, e o tamanho da planta. Novos genes, não co
muns em plantas, podem ser engenheirados em plantas
para conferir resistência a insetos, fungos ou bactérias.
Finalmente, genes de proteínas estruturais podem ser
modificados para conter aminoácidos essenciais que
não estão normalmente presentes, sem modificar a fun
ção da proteína. A produção de plantas com novas pro
priedades genéticas requer a introdução de genes em
células da planta que podem se diferenciar em plantas
inteiras.
A nova informação genética presente em plasmídeos
da galha da coroa (crown gall) pode ser introduzida
em plantas infectadas com bactérias de solo conheci
das como agrobactérias. Agrobactérias naturalmente
contêm um plasmídeo da galha da coroa ou Ti (indutor
de tumor), cujos genes integram-se em um cromosso
mo da célula infectada. Os genes do plasmídeo levam a
célula de planta hospedeira a produzir novas espécies
de aminoácidos chamados opinas (como, por exemplo,
os aminoácidos derivados de arginina e piruvato, octo
pina, ou arginina e α-cetoglutarato, nopalina), que são
necessários para o crescimento bacteriano. Uma galha
da coroa, ou massa tumoral de células indiferenciadas
de plantas, desenvolve-se no local da infecção bacteria
na. Novos genes engenheirados no plasmídeo Tipodem
ser introduzidos em células de plantas na infecção com
a Agrobactéria. As células podem, então, ser crescidas
em cultura e induzidas a rediferenciar em plantas intei
ras. Cada célula poderia conter a nova informação gené
tica e representaria uma planta transgênica.
Algumas limitações na produção de plantas com
propriedades genéticas melhoradas devem ser supera
das antes que significativo avanço no suprimento de ali
mentos para o nosso mundo possa ser realizado. É claro,
genes de características desejadas devem ser identifica
dos e isolados. Grãos importantes como milho e trigo
também não podem ser transformados por plasmídeos
Ti; portanto, outros vetores devem ser identificados. Foi
alcançado um sucesso significativo no desenvolvimento
de plantas de grãos resistentes a insetos e vírus. Re
centemente, engenheiros genéticos inseriram um gene
estrangeiro em plantas de ervilha para produzir uma
proteína que inibe a alimentação de larvas de gorgulho
(ou broca) com sementes de ervilha. Isso permitirá o
armazenamento de ervilhas e outras sementes de le
gumes sem a necessidade de proteção com fumigantes
químicos (atualmente, fazendeiros brasileiros perdem
20–40% de seu feijão armazenado em decorrência de
pestes).
7.11 GENÔMICA, PROTEÔMICA
E ANÁLISE POR
MICROARRAY
Genômica é o estudo das características molecula
res do genoma inteiro. Inclui a sequência do genoma,
a identificação dos genes e de suas sequências regu
latórias, além do padrão de expressão gênica. Dúzias
de genomas procarióticos e eucarióticos, bem como
mais de mil vírus, foram sequenciados (Tabela 7.1). O
sequenciamento de numerosos genomas de micróbios
marinhos adicionou recentemente cerca de um mi
lhão de novos genes aos 180.000 genes documentados.
Estima-se que existam mais de 10 bilhões de genes no
repertório da Terra. Um único gene pode dar origem
a múltiplas espécies de proteínas em virtude da esco
lha do splicing do RNA transcrito e do processamento
pós-tradução variável da proteína produzida. O comple
mento de proteínas de uma célula é chamado de proteo
ma. Proteômica é o estudo das proteínas expressas em
tecidos em várias condições, interações de proteínas
e modificações de proteínas. A Correlação clínica 7.15
descreve como a proteômica tem sido usada para diag
nosticar estágios iniciais de câncer por identificação de
biomarcadores associados a tumor.
Análise de Microarray
A análise de genomas e proteomas foi muito facili
tada pelo desenvolvimento das tecnologias de micro
matrizes ou microarrays desenvolvidas primeiro para
analisar ácidos nucleicos. A hibridização de ácidos nu
cleicos e a formação de complexos antígeno-anticorpo
têm sido intensamente empregadas nas técnicas des
critas nas seções anteriores para a análise de uma ou
algumas poucas espécies macromoleculares. Entre
tanto, técnicas com um rendimento alto são neces
sárias para analisar simultaneamente as centenas ou
milhares de genes expressos em uma célula. As técni
cas de microarray dependem das mesmas interações
thern,
macromoleculares
Northern e descritas
Western blots.
anteriormente da sonda
A fixação em Sou-
de DNA a superfícies sólidas impermeáveis reduz os
volumes das soluções e os tempos necessários para hi
bridização. Microarrays de DNA são produzidos por
adições, controladas por computador, de microgotas
de sequências de DNA clonadas ou sintetizadas por
PCR, a uma lâmina de vidro com um substrato poli-L
-lisina ao qual essas sondas de DNA ficam covalente
mente ligadas. O DNA ou o RNA a ser analisado é mar
cado isotopicamente ou por fluorescência e, depois, é
hibridizado com as sondas fixadas sobre a superfície
do vidro (Figura 7.32). Reações positivas são detec
tadas e quantificadas por imagem de alta-resolução e
análise em computador. Muitos microarrays de DNA
estão disponíveis que focalizam genes selecionados
envolvidos em processos discretos ou em vias como a
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 307

TABELA 7.1 Uma Lista Parcial de Espécies Procarióticas e Eucarióticas Cujos Genomas Foram Sequenciados
Espécie Tamanho do Genoma
Procariotos
(mais de 100 micróbios) Hemophilus influenzae 1,83 Mb
Chlamydia pneumoniae 1,23 Mb
Neisseria meningitides 2,27 Mb
Vibrio cholerae 4,0 Mb
Número de cromossomos
Eucariotos simples Saccharomyces cerevisiae (levedura) 16
Plasmodium falciparum (protozoário da malária) 14
Anopheles gambiae (pernilongo) 3
Drosophila melanogaster (mosca de fruta) 5
Plantas Avena sativa (aveia) 7
Hordeum vulgare (cevada) 7
Oryza sativa (arroz) 12
Zea mays (milho) 10
Vertebrados Danio rerio (peixe paulistinha) 25
Gallus gallus (galinha) 39
Mus musulus (camundongo) 21
Rattus norvegicus (rato) 22
Homo sapiens (homem) 24

transdução de sinal e a apoptose. Um exemplo especí
fico de expressão gênica alterada em células infecta
das por malária é apresentado na Figura 7.33.
DNA oligonucleotídeos (geralmente com 20 ou mais
bases) também podem ser sintetizados sobre microma
trizes fixadas a uma lâmina de vidro. O tamanho da mi
cromatriz pode variar de 1 × 10 × 5 μm a 100 × 100 ×
20 μm. Milhares de oligonucleotídeos diferentes, cada
um complementar a um gene específico, podem serimo
bilizados no que é chamado um chip de DNA. Um único
chip microarray para o genoma humano, que estará
disponível comercialmente, contém 1 milhão de sondas
oligonucleotídicas. Esse chip de DNA detectará cerca
de 50.000 RNA transcritos de aproximadamente 30.000
genes humanos. Esses microchips biológicos são com
paráveis a microchips eletrônicos, uma vez que ambos
são capazes de executar múltiplas reações em paralelo
com alta eficiência.
Os microarrays permitem a análise da expressão
do genoma inteiro ou de genes de uma via seleciona
da. Os genes expressos em um tecido específico, ou em
um determinado estado metabólico ou doença, pode
riam dar indicações sobre quais genes estão ativos na
condição específica. Infelizmente, uma única placa de
microarray dá uma fotografia estática dos genes genô
micos expressos em uma condição em particular. Genes
regulatórios envolvidos na expressão alterada final não
podem ser facilmente deduzidos a partir dessa imagem
única, uma vez que muitos genes podem ser ligados ou
desligados por vias subsequentes durante a transição
para o estado celular final. Genes corregulatórios envol
vidos na mudança entre diferentes estados metabólicos
ou de doenças poderiam ser determinados por análise
de microarray em múltiplos pontos no tempo, entre
os estágios inicial e final da expressão gênica alterada.
A análise computacional de microarrays gerados ao
longo do tempo podem agrupar genes que parecem ser
expressos coordenadamente. Análise de grupos (clus
ters) permite a identificação de genes com potencial
para corregularem a alteração da célula de um estado
para outro.
Os microarrays de proteínas são produzidos com
anticorpos ou proteínas não-anticorpos fixados a lâmi
nas ou filtros que podem capturar proteínas alvos em
uma amostra, de modo similar aos usados em micro
arrays de DNA. Outras sondas proteicas estão sendo
desenvolvidas para microarrays de proteínas como
sequências sintéticas curtas de DNA ou RNA (aptâ
meros) que ligam seletivamente proteínas específicas.
As matrizes de proteínas são geralmente produzidas
com proteínas recombinantes que podem ser geradas
a partir de bibliotecas de expressão de cDNA tecido
-específicas. Esses microarrays podem, então, ser ra
pidamente analisados com anticorpos específicos com
marcador fluorescente. Essa abordagem foi empregada
308 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 7.15
Técnica de Micromatrizes (Microarray) para Detectar e Tratar Doenças
A. Análise de Micromatrizes de Ácidos Nucleicos no
Câncer de Mama
A modalidade de tratamento de pacientes com câncer
de mama depende, em grande parte, do estado do re
ceptor de estrógeno (ER) nas células tumorais. Tumores
receptor de estrógeno-positivos geralmente respondem
bem à terapia adjuvante com hormônio ou com droga,
enquanto tumores ER-negativos geralmente não. Pa
cientes com tumores ER-negativos têm respostas va
riáveis à quimioterapia, e não há indicadores conhecidos
para prever o prognóstico pós-operatório. O RNA celular
amplificado derivado de 10 pacientes ER-negativas, que
morreram em 5 anos de câncer de mama, e de 10 pacien
tes ER-positivas que estavam vivas, livres da doença, foi
analisado em uma micromatriz (microarray) de cDNA
consistindo de 25.344 genes. A análise detectou 71 genes
com maior expressão no grupo que morreu do que no
que sobreviveu, e 15 genes expressos em maiores níveis
nas sobreviventes versus as que morreram. Um sistema
de classificação (scoring) foi desenvolvido com base em
marcadores gênicos para classificar pacientes com tu
mor de mama ER-negativo em grupos com prognóstico
ruim versus um prognóstico bom. O sistema de classifi
cação parece ter um alto grau de precisão e pode ajudar
a dirigir protocolos de tratamento e definir novos genes
alvos para tratamento com drogas.
B. Tecnologia de Micromatrizes de Anticorpos para
Tratar Tumores de Cérebro
Glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor mais
comum no sistema nervoso central em seres huma
nos adultos e, infelizmente, um dos tipos mais letais
de câncer. Ativação anormal de componentes da via
da fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) é uma caracte
rística do GBM, bem como de outros tipos de câncer.
Receptores tirosina quinases (RTKs) ativam PI3K. Al
com sucesso para detectar o repertório de anticorpos
em plasma humano associado com algumas doenças
autoimunes.
As técnicas de microarray são críticas para a aná
lise da expressão genômica e o estado proteômico de
células normais comparadas com os padrões de células
que estão alteradas em virtude de mudanças como am
bientes metabólicos alterados, diferenciação, resposta
a drogas, resposta a fatores de crescimento ou estado
de doença.
guns exemplos de RTKs incluem os receptores dos fa
tores de crescimento EGFR, PDGFR e VEGFR. Desco
briu-se que múltiplos RTKs ativam PI3K no GBM pela
análise de extratos de células tumorais incubados com
matrizes de anticorpos contra RTK. Aqui os anticor
pos, específicos para muitos RTKs, são fixados a um
suporte sólido e se ligarão aos RTKs celulares. O RTK
ativado presente no extrato celular é fosforilado em
resíduos de tirosina que são facilmente detectados no
complexo RTK-anticorpo por um segundo anticorpo
conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) con
tra fosfotirosinas. Então, um substrato (fluorescente
ou colorido) para HRP é usado para identificar quais
RTKs ativas estavam presentes em um extrato de cé
lulas tumorais. Após identificação de quais RTKs esta
vam envolvidas na ativação da PI3K em uma linhagem
celular tumoral em particular, inibidores específicos
de RTKs foram testados quanto à sua capacidade de
reduzir a formação de colônias e a viabilidade celular.
Um único inibidor de RTK teve pouco efeito, e inibi
dores duais de RTKs foram mais efetivos. Entretanto,
o uso de três inibidores de RTKs foi o mais efetivo.
Ensaios de tumores GBM humanos primários não-tra
tados demonstraram que todos continham múltiplas
RTKs fosforiladas, enquanto os tecidos de especimens
de cérebro normal não tinham nenhuma ativação de
tectável de RTK. Esses estudos demonstram a capa
cidade de determinar rapidamente o complemento de
RTKs ativadas em amostras de GBM de pacientes, de
modo que os clínicos possam personalizar seus trata
mentos com drogas.
Nagahata, T., Onda, M., Emi, M., Nagai, H. K. et al. Expres
sion profiling to predict postoperative prognosis for estrogen
receptor-negative breast cancer by analysis of 25,344 genes
on a cDNA microarray. Cancer Sci. 95: 218, 2004. Stommel,
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Genoma Humano
Por volta de 1996, o genoma de levedura, um eu
carioto consistindo de aproximadamente 14 × 106 pb
distribuídos entre 16 cromossomos, foi sequenciado.
O genoma do nemátoda C. elegans, sequenciado por
volta de 1998, contém aproximadamente 18.000 genes,
comparados aos 6.000 genes da levedura. Em 2000,
uma abordagem de sequenciamento por tiro (shot
gun) foi empregada para sequenciar essencialmente
o genoma inteiro, com 180 × 106 pb, da mosca de fru
ta Drosophila melanogaster. Esse método envolve a
quebra do genoma inteiro em pequenos pedaços, o se
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 309

quenciamento dos pedaços por um procedi

mento rápido automatizado, e a organização
dos fragmentos sequenciados na ordem cor
Aplicação assistida
reta assistido por sequências sobrepostas e por computador de
um supercomputador. A disponibilidade das microquantidades
de moléculas
sequências clonadas anteriormente facili
tou o sequenciamento.

A abordagem de sequenciamento por

shotgun foi empregada para acelerar o se
quenciamento do genoma humano. Vários Fixação química, por UV etc.,
de moléculas de sondas ao
cromossomos humanos já haviam sido mape suporte sólido Examplo de Preparação de Amostra:
ados e milhares de clones de cDNA haviam cDNA sintetizado a partir de mRNA
sido sequenciados ou estavam prontos para isolado de:
com um
fígado corante
Células
marcadas
de & Células de
serem sequenciados, os quais forneceriam, pulmão marcadas
em última análise, marcas de referências com um corante
para o enorme mapa genético humano. Em fluorescente fluorescente
VERDE VERMELHO
2000, J. C. Venter e F. S. Collins anunciaram Hibridização
conjuntamente que seus grupos haviam se
misturado
quenciado 97% do genoma humano. amostra adicionada

A determinação de uma sequência genômi

ca é apenas parte do quebra-cabeça genômico.
Os pontos de começo e fim de cada gene devem
ser determinados, juntamente com o que os
genes codificam, um processo chamado anota
Análise assistida por
ção. Os genomas eucarióticos geralmente con computador de reações
têm regiões permanentemente condensadas positivas por detecção
por autorradiografia ou
ou heterocromáticas em torno dos centrôme fluorescência
ros. Essas regiões contêm DNA repetitivo que
não é clonado e sequenciado por nenhum dos
métodos atuais de sequenciamento. Podem se
passar décadas ou mais antes que a determi
nação completa de todos os genes e elementos
FIGURA7.32 Análise de microarray de DNA.
regulatórios seja conseguida. A superfície de um suporte impermeável, tipicamente vidro ou polipropileno,
é preparada para aplicar múltiplas amostras de DNA ou oligonucleotídeos. A
O encerramento do projeto genoma hu
lâmina com oligonucleotídeos ou ácidos nucleicos representando centenas de
mano gerou enorme quantidade de dados. A
milhares de genes é incubada em uma câmara em condições apropriadas para
conquista do projeto é só o começo do nosso hibridização, seguida de lavagens adequadas para remover cDNA não-hibridi
entendimento dos fundamentos moleculares zado. Manchas fluorescentes verdes indicariam genes expressos em células de
de como uma única célula funciona, quanto fígado, manchas fluorescentes vermelhas indicariam genes expressos em cé
mais um organismo. Hoje se considera que o lulas de pulmão, e manchas florescentes amarelas indicariam genes expressos
genoma humano codifique cerca de 30.000 em ambos os tecidos.
genes, muito menos genes do que se previa, e
apenas cerca de 20% mais do que o genoma de plantas O delineamento de todos os genes humanos e suas
e 40% mais do que C. elegans (verme). Entretanto, os sequências regulatórias pode aumentar muito nosso
RNA transcritos do genoma “estático” são relativamen entendimento de muitas doenças genéticas. Avanços
te “dinâmicos”, assim como seus produtos proteicos tra tecnológicos para manipular genes e a expressão gêni
duzidos. A escolha do splicing do RNA transcrito pri ca podem abrir novos caminhos para regular ou curar
mário resulta em diferentes produtos proteicos a partir muitas doenças. Doenças genéticas podem eventual
do mesmo gene (p. 295). Produtos proteicos também mente ser curáveis por terapia de substituição gênica;
podem passar por numerosas modificações químicas e testes clínicos limitados para terapia gênica já foram
associação com outras subunidades peptídicas ou pro iniciados. Considerando-se o enorme avanço feito em
teínas. Estima-se que os 30.000 genes deem origem, no biologia molecular apenas nas últimas três décadas, é
final, a 200.000 a 2 milhões de produtos proteicos cuja razoável acreditar que o “quando” não estará tão dis
expressão é dependente, em parte, de tecido-especifici tante assim. O velho desafio confrontando os cientistas
dade, estágio de desenvolvimento e condições metabó foi como sequenciar o genoma humano; o novo desafio
licas. A tarefa a nossa frente é adquirir a capacidade de é como manipular efetivamente aquele conhecimento
analisar transcritos e seus produtos finais de tradução para o benefício da humanidade.
em nível de estrutura ou função.
310 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

MICROARRAY

SUPEREXPRESSOS
DURANTE A MALÁRIA

SEM MUDANÇA DE
EXPRESSÃO EM
VIRTUDE DA
INFECÇÃO

SUBEXPRESSOS
DURANTE A MALÁRIA

FIGURA7.33 Análise por microarray de expressão gênica em camundongos infectados com um parasita de malária de
roedor.
DNA, RNA ou oligonucleotídeos, representando parte ou todo o quimiocinas, seus receptores, moléculas de adesão, moléculas
genoma ou as proteínas celulares, ou anticorpos, representando coestimulatórias, fatores imunorregulatórios, fatores de trans
parte do proteoma celular, são fixados sobre um suporte imper crição, e proteínas de transdução de sinal, entre outras.
meável. As sondas fixadas reagem com os componentes celula
res apropriados marcados, que formarão um complexo estável Amostras: RNA de esplenócito de camundongo não-infectado
por hibridização ou interações proteína–proteína. A identifica foi usado para sintetizar cDNA com o marcador fluorescente
ção de ácidos nucleicos ou proteínas que se associam com as Cy3 (verde). RNA de esplenócito de camundongo no dia 8 da
amostras fixadas no microarray permite a análise da expressão infecção com um parasita de malária de roedor foi usado para
gênica celular em células mantidas em várias condições. sintetizar cDNA com marcador fluorescente Cy5 (vermelho).
As sondas de DNA marcadas para fluorescência e misturadas
Microarrays de DNA de camundongo foram produzidos para o foram hibridizadas com a matriz de oligonucleotídeos alvos.
genoma de camundongo, que contém 13.443 oligonucleotídeos Genes que estão superexpressos em camundongos infectados
sintéticos representando os genes bem caracterizados de ca com malária são vermelhos, e os que são subexpressos nesses
mundongo. Cada oligonucleotídeo tem 70 bases de comprimen animais são verdes. Genes que não são afetados pelo parasita
to, derivados da extremidade 3! de cada gene, otimizado para da malária são amarelos.
minimizar hibridização cruzada com todos os genes conheci
dos de camundongo. A matriz inclui um conjunto abrangente Dados são de trabalho não-publicado do laboratório do Dr. Ja
de genes relacionados com o sistema imune, codificando um mes Burns, Departamento de Microbiologia, Drexel University
subconjunto de linfócitos e marcadores de ativação, citocinas, College of Medicine.

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312 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Termos Chaves
α-complementação didesoxinucleosídeo trifos mutagênese sítio-dirigi reação da polimerase em
ácidos nucleicos antisense fato dainverso cadeia (PCR)
análise por microarray DNA complementar Northern blot RNA de interferência,
(ou micromatrizes) (cDNA) PCR aninhado RNAi
animais transgênicos DNA recombinante PCR multiplex RNA pequeno de interfe
bibliotecas de bacteriófago endonuclease de restrição rência (siRNA)
PCR quantitativo em tem
caminhar pelo cromossomo ensaio de deslocamento de po real sequenciamento com se
mobilidade eletroforética quenciamento direto
(chromosome walking) plasmídeos
sequenciamento por sho
camundongo knockout (ou ensaio de proteção de nu polimorfismo de compri
cleas genômica tgun
nocaute) mento de fragmento de
células pluripotentes
corante-terminador hibridização in situ restrição (RFLP) sítio de policlonagem
inativação por inserção polimorfismo de conforma Southern blot
ção de fita-única (SSCP) terapia gênica
cromossomos artificiais de mapas de restrição
bactéria (BACs) microRNA proteína de fusão transfecção
cromossomos artificiais de mutagênese por PCR proteômica vetor cosmídeo
levedura (YACs) vetores de expressão

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha E. nenhuma das anteriores.
1. A construção de um mapa de restrição do DNA re 4. DNA complementar (cDNA)
quer todos os seguintes, exceto: A. não pode ser expresso por sistemas procarió-
A. hidrólise parcial do DNA. ticos
B. hidrólise total do DNA. B. é transcrito reversamente a partir de mRNA
C. separação eletroforética dos fragmentos em eucariótico funcional.
um gel. C. tem todos os elementos do gene original do
D. coloração de um gel de eletroforese para loca mRNA de interesse.
lizar DNA. D. a síntese requer a formação anterior de um
E. aquecimentos e resfriamentos cíclicos da mis primer de RNA.
tura de reação. E. permanece como uma molécula fita-única.
2. A preparação de DNA recombinante requer: 5. O melhor vetor para carregar um segmento de DNA
A. endonucleases de restrição que cortem de com 350 kb de comprimento seria
modo desencontrado. A. bacteriófago.
B. endonucleases de restrição que quebrem ge B. cromossomo artificial de bactéria (BAC).
rando fragmentos com extremidades retas. C. cosmídeo.
C. poli(dT). D. plasmídeo.
D. DNA ligase. E. cromossomo artificial de levedura (YAC).
E. cDNA.
6. Ácidos nucleicos antisense
3. Na seleção de colônias bacterianas que carregam A. complementares a mRNA aumentariam a tra
DNA clonado em plasmídeos, como pBR322, que dução.
contêm dois genes de resistência a antibióticos:
B. poderiam resultar se um gene fosse inserido à
A. um gene de resistência a antibiótico não é fun
jusante de um promotor, mas na direção opos
cional nas colônias de bactérias desejadas. ta ao normal.
B. bactérias não-transformadas são resistentes a C. não podem ter nenhum uso clínico.
antibióticos.
D. reagem apenas com DNA.
C. ambos os genes de resistência a antibióticos são E. são necessários para a tecnologia do DNA re
funcionais nas colônias de bactérias desejadas.
combinante.
D. sondas de DNA ou RNA marcadas radioativa
mente desempenham um papel.

Questões 7 e 8: Nos Estados Unidos, uma causa im
portante de morte de bebês durante o primeiro ano
de vida é a síndrome da morte súbita infantil (SIDS).
Um estudo mostrou uma forte correlação entre o ris
co aumentado de SIDS e aumento no intervalo QT no
eletrocardiograma. Em uma criança, um gene asso
ciado com a síndrome do QT longo tinha uma substi
tuição de AAC por TCC. Esse gene codifica uma pro
teína associada com o canal de sódio. A mutação foi
detectada por polimorfismo de conformação de cadeia
única (SSCP, single-strand conformation polymor
phism).
7. Qual(is) das seguintes afirmativas sobre SSCP
está(ão) correta(s)?
A. A migração eletroforética em gel de poliacrila
mida de DNA pequeno, fita-única, na técnica
de SSCP depende parcialmente da conforma
ção secundária.
B. Deve existir um sítio de endonuclease de res
trição na região estudada para que SSCP fun
cione.
C. Marcação radioativa não é usada nessa técni
ca.
D. Não é necessário conhecer a sequência do
DNA a ser estudado.
E. Todas as anteriores estão corretas.
8.
Para se conseguir quantidade suficiente de DNA
para analisar, o DNA é amplificado por uma reação
de polimerase em cadeia (PCR). Em um PCR,
A. a sequência de nucleotídeos do DNA a ser am
plificado deve ser conhecida.
B. a amostra é protegida de calor, que causaria a
desnaturação do DNA.
C. a função dos oligonucleotídeos na mistura de
reação é atuar como primers para a síntese de
DNA novo.
D. o produto final é DNA fita-única.
E. o DNA original pode ser amplificado apenas
cerca de 10 vezes.
Questões 9 e 10: A tecnologia do DNA recombinante
tem usos de interesse médico. Uma é a terapia gênica,
que introduz um gene normal em células contendo um
gene defectivo. A primeira terapia gênica humana au
torizada foi aplicada a uma menina de 4 anos de idade
com deficiência severa combinada de deficiência imune,
que tinha o gene da adenosina desaminase (ADA) de
fectivo. Um retrovírus modificado foi construído para
conter o gene da ADA humana, que poderia ser expres
so em células humanas sem a replicação do vírus. Outro
uso clínico para a tecnologia do DNA recombinante é
levar bactérias em replicação rápida a produzirem gran
des quantidades de proteínas específicas, por exemplo,
proteínas humanas como hormônios.
9. A expressão de genes recombinantes em células de
mamíferos
CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA • 313
A. não ocorrerá se o gene contiver um íntron.
B. ocorre mais eficientemente se cDNA for usado
no vetor.
C. não requer inserção direcional do gene no ve
tor.
D. requer
e promotor
que o“engenheirados”
vetor tenha elementos
no vetor.
enhancer
E. não requer que o vetor tenha uma origem de
replicação (ori).
10. A expressão de um gene eucariótico em procario
tos envolve
A. uma sequência Shine-Dalgarno (SD) no
mRNA.
B. ausência de íntrons.
C. elementos regulatórios a montante do gene.
D. uma proteína de fusão.
E. todos os anteriores.
Questões 11 e 12: O DNA genômico total foi isolado de
três indivíduos, digerido separadamente com uma en
donuclease de restrição a fragmentos, e os fragmentos
foram separados em gel de agarose em um campo elé
trico. O gene de interesse foi isolado e analisado usando
a técnica de Southern blot. Cada amostra individual
apresentou duas bandas. As bandas eram idênticas em
dois dos indivíduos. No terceiro, uma banda era idêntica
a uma banda dos outros dois, mas a segunda banda era
de peso molecular mais baixo do que dos outros. Esse é
um exemplo de polimorfismo de comprimento de frag
mento de restrição (RFLP).
11. Uma explicação razoável para esse RFLP é que o
gene do terceiro indivíduo
A. não tinha a sequência de reconhecimento para
a endonuclease de restrição.
B. tivesse uma mutação no sítio de clivagem.
C. tivesse um sítio de reconhecimento adicional
para a endonuclease.
D. tivesse uma deleção de um segmento do gene.
E. tivesse passado por uma clivagem aleatória.
12. A técnica de Southern blot:
A. transfere fragmentos de DNA do gel de agaro
se para um filtro de nitrocelulose.
B. requer que os fragmentos de DNA permane
çam dupla-fita.
C. requer que o DNA seja marcado radioativa
mente antes da adição ao gel de agarose.
D. altera a posição dos fragmentos de DNA du
rante o processo.
E. amplifica a quantidade de DNA.
Problemas
13. O autorradiograma de raios-X de uma fita de um
fragmento de DNA sequenciado pelo método de
314 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Sanger foi obtido. A extremidade 5! do nucleotídeo mento? Construa o padrão de autorradiografia da

foi marcada com 32P. Numerando de baixo para sequência complementar.
cima do radioautograma, a linha do tubo com ddG
14. O que torna a Taq DNA polimerase adequada ao
mostrou bandas nas posições 4 e 11; tubo ddC ti
nha bandas em 1, 2, 7, 8, 9 e 13; ddA em 5, 10 e 15; uso na reação da polimerase em cadeia (PCR), que
é diferente de outras DNA polimerases, e porque
ddT em 3, 6, 12 e 14. Qual é a sequência do frag
ela é preferida?

Respostas

1. E Aquecimento e resfriamento cíclicos são parte do mRNA antisense. A: ácidos nucleicos antisense
do processo de PCR, não do mapeamento de restri ligam-se ao mRNA, bloqueando a tradução. C: se
ção. A e B: mapeamento de restrição envolve todos não agora, no futuro. Nucleotídeos de DNA anti
os graus de hidrólise. A hidrólise parcial dá frag sense foram produzidos que inibem infecção viral.
mentos de tamanhos variáveis, e a hidrólise com D: reagem com ambos, DNA e RNA.
pleta dá os menores fragmentos possíveis. C e D:
7. A A substituição de uma única base geralmente
os fragmentos são separados eletroforeticamente
modifica a conformação o suficiente para mudar a
por tamanho no gel de agarose, que é corado para
mobilidade, detectada por SSCP. B: SSCP é o mé
revelar o DNA.
todo de escolha se não houver sítio de restrição. C:
2. D A DNA ligase conecta covalentemente frag DNA é amplificado por PCR na presença de nucle
mentos mantidos juntos por interações das extre otídeos marcados radioativamente. Deve haver um
midades coesivas. A: esse é o tipo mais desejável método para detecção das bandas. D: SSCP requer
de endonuclease de restrição para uso, mas não é conhecimento prévio da sequência.
essencial. B: endonucleases de restrição que pro
8. C Os oligonucleotídeos hibridizam com os mol
duzem extremidades retas também podem ser usa
des fita-única na região de interesse, de modo que
das, se necessário. C: isso é usado em conjunção
a replicação possa começar. A: DNA de sequência
com poli(dA) se forem utilizadas endonucleases de
desconhecida pode ser usado, mas deve ser inse
restrição que produzem extremidades retas, mas
rido em um vetor com regiões flanqueadoras co
não é essencial para a preparação de DNA recom
nhecidas. B: a amostra deve ser aquecida a 90°C
binante. E: cDNA é apenas um tipo que pode ser
para separar as fitas de DNA. D: PCR produz DNA
usado.
dupla-fita (dsDNA). E: com automação, a amplifi
3. A O DNA estrangeiro é inserido em um gene de cação pode ser de milhões de vezes.
resistência a antibiótico, destruindo-o. B: a resis
9. D Sistemas eucarióticos requerem elementos
tência deve-se aos plasmídeos. C: ver o comentário
de controle, que não são necessários em sistemas
em A, acima. D: a marcação radioativa detecta o
bacterianos. A: expressão pode ser melhorada se
DNA de interesse, não as colônias que contêm o um íntron estiver presente. B: cDNA não possui os
DNA clonado.
elementos de controle necessários. C: o gene deve
4. B Usa uma DNA polimerase RNA-dependente ser inserido na orientação correta, em relação aos
(transcriptase reversa). A e C: sistemas procarióti elementos de controle. E: o vetor precisa replicar;
cos não podem remover íntrons para gerar mRNAs por isso precisa da sequência para promover repli
transcritos funcionais – por isso, o cDNA não con cação.
tém as sequências desses elementos. D: a cauda de
10. E A: a sequência SD é necessária para o ribosso
poli(A) da extremidade 3! do mRNA é usada como
mo bacteriano reconhecer o mRNA. B: bactérias
primer para fazer a fita complementar ao mRNA não têm a maquinaria intracelular para remover
molde. E: uma vez que a primeira fita tenha sido
íntrons do mRNA. C: elementos regulatórios apro
sintetizada, ela se torna o molde para a fita comple
priados são necessários para permitir ao DNA ser
mentar. O cDNA é dupla-fita.
transcrito. D: uma proteína de fusão pode ser um
5. E Pode aceitar DNA de 200-500 kb. A: bacteriófa produto da reação.
go é muito bom para insertos de DNA de cerca de
11. D Isso responderia por uma banda ter menor peso
15 kb. B: BAC pode aceitar DNA de 100-200 kb. C:
molecular. A, B e E: o sítio de clivagem tem uma
cosmídeos aceitam insertos de cerca de 45 kb. D:
sequência de reconhecimento específica. C: isso
vetores plasmídeos podem ser muito úteis, mas só
daria mais do que duas bandas.
podem aceitar pedaços pequenos de DNA.
12. A Isso ocorre por eluição do gel por uma solução
6. B Isso colocaria a fita antisense do DNA sob con
salina concentrada. B: o DNA é hidrolisado por ál
trole do promotor, com a subsequente transcrição cali e o DNA fita-única liga-se ao filtro. C: a sonda
 CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA
para identificar as bandas no filtro é marcada com
radioisótopo. D: as posições no filtro são idênticas
às do gel. E: não acontece.
13. A sequência é CCT GAT C CC A GT CT, lendo de
5! para 3!. A autorradiografia da fita complementar
deveria ter bandas para ddG em 1, 2, 7, 8, 9 e 13; ddC
em 4 e 11; ddA em 3, 6, 12 e 14; ddT em 5, 10 e 15.
14. O PCR requer ciclagem de temperatura entre bai
xas temperaturas, quando a hibridização do DNA
• 315
molde e os oligonucleotídeos primers acontece, e
altas temperaturas, quando o DNA funde. A Taq
DNA polimerase, isolada de organismos termofíli
cos descobertos em uma fonte quente, é estável em
altas temperaturas e torna a ciclagem possível sem
adição de nova polimerase após cada ciclo. A DNA
polimerase PhusionTM de Alta Fidelidade, que foi
desenvolvida comercialmente, tem propriedades
ainda mais desejáveis.
316 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
PARTE II CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 317
TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

8
Regulação da
Expressão Gênica
Daniel L. Weeks
Professor Titular, Carver College of Medicine, University of Iowa

John E. Donelson
Professor Titular, Carver College of Medicine, University of Iowa

CONTEÚDO CORRELAÇÕES CLÍNICAS

8.1 INTRODUÇÃO,318
8.2 UNIDADE DE TRANSCRIÇÃO EM BACTÉRIAS: O
OPERON, 318
8.3 OPERON LACTOSE DE E. COLI, 319
8.4 OPERONTRIPTOFANO DE E. COLI, 323
8.5 OUTROS OPERONS BACTERIANOS, 327
8.6 TRANSPOSONS BACTERIANOS, 328
8.7 EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS, 330
8.8 COMPLEXO DE PRÉ�INICIAÇÃO EM EUCARIO�
TOS: FATORES DE TRANSCRIÇÃO, RNA POLI�
MERASE II E DNA, 333
8.9 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
EUCARIÓTICA, 338
8.1 Resistência Transmissível a Múltiplas Drogas, 329
8.2 O Patógeno Bacteriano do Estômago: Helicobac
ter pylori, 330
8.3 Síndrome de Rubstein�Taybi, 332
8.4 O tamoxifeno e o Receptor de Estrógeno Como
Alvo, 339
8.5 Fatores de Transcrição e Doença Cardiovascular,
339
8.6 Tratamento do Câncer Usando Drogas Que Têm
Como Alvo Modificação de Histonas e de DNA:
Terapia Epigenética, 341

Conceitos Chaves
• A transcrição gênica fornece a ligação entre o re�
servatório de informação genética no DNA e a ex�
pressão do RNA e, finalmente, das proteínas.
• Os genes geralmente incluem um promotor não�
�transcrito que fica a montante da parte do gene
que codifica a proteína.
Os transcritos codificados por organismos proca�
•
rióticos são frequentemente policistrônicos, agru�
pando genes que codificam proteínas com funções
interrelacionadas unidas sob um controle comum.
Em organismos eucarióticos, a maioria dos genes é
monocistrônica.
• A transcrição pode ser ativada ou reprimida em
resposta a sinais nutricionais, ambientais ou outros
sinais celulares. As respostas regulatórias objeti�
vam fornecer expressão gênica apropriada �s con�
dições existentes, frequentemente pela incorpora�
ção de moléculas pequenas, que são indicadores
das condições celulares, como correguladores.
• O controle da transcrição frequentemente depende
318 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
de proteínas que se ligam a sequências específicas.
Os motivos de aminoácidos das proteínas que se li�
gam �s sequências específicas foram identificados,
permitindo que os fatores de transcrição sejam
agrupados por semelhanças estruturais.
• A identificação das sequências do DNA que se li�
gam aos fatores de transcrição pode ajudar a iden�
tificar os genes que são regulados coordenadamen�
te. Promotores eucarióticos frequentemente têm
múltiplos sítios de ligação de fatores de transcrição
e usam combinações de fatores de transcrição para
regular a expressão gênica.
8.1 INTRODUÇÃO
Para sobreviver, uma célula viva deve responder
a mudanças em seu ambiente. Um modo pelo qual as
células se ajustam a essas mudanças é alterando a ex�
pressão de genes específicos; isso afeta o número das
moléculas de proteínas correspondentes na célula. Este
capítulo focaliza alguns dos mecanismos moleculares
que determinam quando um determinado gene é ex�
presso e em que quantidade. Entender como a expres�
são de genes é regulada é uma das áreas mais ativas de
pesquisa bioquímica hoje.
Células de E. coli contêm genes para cerca de 4.300
proteínas diferentes, mas E. coli não precisa sintetizar
todas elas ao mesmo tempo. A ilustração clássica da re�
gulação gênica bacteriana é a do gene da b-galactosidase,
que converte o dissacarídeo lactose em glicose e galacto�
se. Quando E. coli cresce em um meio contendo glicose
como fonte de carbono, apenas cerca de cinco moléculas
da enzima estão presentes em cada célula.célula. QuandoQuandoQuando lac�lac�lac�
tose é a única fonte de carbono, entretanto, há 5.000 ou
mais moléculas. Portanto, quando as bactérias precisam
metabolizar lactose, elas aumentam a síntese de b�galac�
tosidase. Se a lactose for removida do meio, a síntese des�
sa enzima para tão rapidamente quanto começou.
As células eucarióticas têm mecanismos mais ex�
tensos de regulação gênica do que as células procarióti�
cas. As células diferenciadas de organismos superiores
têm uma estrutura muito mais complicada e frequen�
temente uma função biológica especializada, que é de�
terminada pela expressão de seus genes. Por exemplo,
a pré-pró-insulina é sintetizada nas células b do pân�
creas, mas não em células do rim, embora os núcleos de
todas as células do corpo contenham o gene da pré�pró�
�insulina. Durante o desenvolvimento do organismo, a
presença de proteínas em tipos celulares específicos é
estritamente controlada, com respeito ao tempo e � or��or�or�
dem dos eventos do desenvolvimento.
Sabe�se muito mais sobre a regulação gênica em
procariotos do que em eucariotos. Além disso, os estu�
dos sobre procariotos frequentemente fornecem novas
• Modificações do DNA e da cromatina desempe�
nham função significativa na regulação gênica eu�
cariótica. Metilação do DNA e metilação, acetilação
e fosforilação de histonas influenciam a capacidade
de transcrever um gene.
• Os fatores de transcrição são frequentemente mo�
dulares, com domínios de ligação ao DNA, domí�
nios para interação com proteínas, domínios de
ativação e domínios regulatórios.
Os fatores de transcrição podem afetar a organiza�
•
ção do complexo RNA polimerase, o recrutamento
de outros fatores de transcrição ou o recrutamento
de fatores de modificação.
ideias estimulantes, que podem ser testadas em célu�
las eucarióticas e são importantes para o desenvolvi�
mento de terapias racionais para doenças causadas
por bactérias.
Vários exemplos bem estudados de regulação gênica
em bactérias serão discutidos, seguidos por exemplos
dos muitos fatores proteicos de transcrição que regu�
lam a expressão de genes no genoma humano.
8.2 UNIDADE DE TRANSCRIÇÃO
EM BACTÉRIAS: O OPERON
O cromossomo de E. coli é uma molécula de DNA
dupla�fita circular de 4,6 milhões de pares de bases, cuja
sequência completa já foi determinada. A maior parte
dos seus aproximadamente 4.300 genes não está distri�
buída ao acaso; ao contrário, os genes que codificam as
enzimas de uma via metabólica específica ficam agrupa�
dos em uma região do DNA. Do mesmo modo, os genes
das proteínas estruturais associadas, como as cerca de
70 proteínas que constituem o ribossomo, ficam comu�
mente adjacentes uns aos outros. Um conjunto de ge�
nes é, em geral, regulado coordenadamente; isto é, os
genes são transcritos juntos em uma espécie de mRNA
policistrônico, que contém as sequências codificadoras
das várias proteínas. O termo operon descreve a uni�
dade regulatória completa de um conjunto de genes
agrupados. Inclui os genes estruturais adjacentes das
enzimas relacionadas ou das proteínas associadas, um
gene regulatório ou os genes que codificam proteína(s)
regulatória(s), e elementos de controle ou sítios no DNA
próximo dos genes estruturais, nos quais as proteínas
regulatórias agem. A Figura 8.1 mostra um mapa genéti�
co parcial do genoma de E. coli, dando a localização dos
genes estruturais de alguns operons de E.coli.
Quando a transcrição dos genes estruturais de um
operon aumenta em resposta a um substrato especí�
fico no meio, o efeito é conhecido como indução. Um
exemplo é o aumento na transcrição do gene da b�ga�
lactosidase quando lactose é a única fonte de carbono.
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 319

n
ro
pe ac
o l

rD
pu mal K yrB h
sdR pan metD
el purA p proA
m
tsx
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haargE pa lip
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E
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pyr E pyrA
aro
mtlxyl D

pyr C
malT
plsB
pur B
4.6 milhões
de pares de bases

operon
tyr R
str trp

rgR
a
argGtol m
CerCser A t nalA
m
an
aro FIGURA 8.1 Mapa genético parcial de
D E. coli.
uerC pab
hyCc
ys r cA B As localizações de alguns poucos dos
e purC ptsl oC
gylAar his
4.300 genes do genoma circular de E.
coli são mostradas. Três operons discu�
tidos neste capítulo são indicados.
Reproduzido com permissão de Stent,
G. S. e Calendar, R. Molecular Genetics,
o An Introductory Narrative. San Fran�
pe
ron cisco: Freeman, 1978, p.289; modificado
de Bachmann, B. J., Low, K. B. e Taylor,
A. L. Bacteriol. Rev. 40:116, 1976.

Bactérias também respondem a mudanças nutricionais 1.021 aminoácidos cada. LacY codifica uma permease,
desligando rapidamente a síntese de enzimas não mais uma proteína de 275 aminoácidos da membrana celu�
necessárias. Por exemplo, E. coli sintetiza triptofano lar que participa do transporte de açúcares, incluindo a
como produto final de uma via biossintética específica. lactose, através da membrana. LacA codifica a b�galac�
Entretanto, se o triptofano estiver presente no meio, a tosídeo transacetilase, uma enzima de 275 aminoáci�
síntese das enzimas dessa via para. O processo é cha� dos que transfere um grupo acetil do acetil�CoA para
mado repressão, e impede que as bactérias usem sua b�galactosídeos. Das três proteínas, só a b�galactosida�
energia para fazer proteínas desnecessárias. se participa de uma via metabólica conhecida. A perme�
ase ajuda a lactose a passar pela membrana celular. A
Indução e repressão são manifestações do mesmo transacetilase pode estar associada com reações de de�
fenômeno. O sinal para ambos é a molécula pequena sintoxicação e excreção de análogos não�metabolizados
que é um substrato da via metabólica ou um produto de b�galactosídeos.
da via, respectivamente. Essas moléculas pequenas são
chamadas indutores, quando estimulam a indução, e As mutações em lacZ ou lacY que inativam a b�ga�
correpressores, quando causam repressão. lactosidase ou a permease impedem a célula de quebrar
lactose ou de adquiri�la do meio, respectivamente. As
mutações em lacA, que inativam a transacetilase, não
8.3 OPERON LACTOSE DE parecem afetar o crescimento e a divisão celulares.

E. COLI Uma única espécie de mRNA, contendo as sequên�

cias codificadoras dos três genes estruturais, é trans�
O operon lactose contém três genes estruturais ad� crita a partir de um promotor, chamado lacP, localizado
jacentes (Figura 8.2). LacZ codifica a b�galactosidase, imediatamente � montante de lacZ. A indução desses
que é composta de quatro subunidades idênticas de genes ocorre durante a iniciação de sua transcrição.
320 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

lacP
CAP lacO

lacI lacZ lacY lacA

DNA
Pares de bases 1080 3063 ˜800 ˜800

mRNA

Repressor β–Galactosidase Permease Transacetilase

360 aa 1021 aa ˜275 aa ˜275 aa

FIGURA 8.2 Operon lactose de E. coli.

O operon lactose é composto pelo gene lacI, que codifica um lacI é transcrito a partir de seu próprio promotor. Os três genes
repressor; elementos de controle CAP, lacP e laço; e três genes estruturais são transcritos a partir do promotor lacP, formando
estruturais, lacZ, lacY e lacA, que codificam a b�galactosidase, um mRNA policistrônico a partir do qual as três proteínas são
uma permease e uma transacetilase, respectivamente. O gene traduzidas.

Sem o indutor, a transcrição ocorre em nível muito bai� Tem forte afinidade por seu principal sítio de ligação no
xo. Em presença do indutor, a transcrição começa no DNA, chamada operador ou lacO, que fica entre lacP
lacP e prossegue por todos os três genes até um termi� e lacZ. LacO fica parcialmente sobreposto a lacP, de
nador da transcrição, localizado logo após lacA. Assim, modo que o repressor ligado impede que a RNA polime
os genes são expressos coordenadamente; todos são rase se ligue a lacP e inicie a transcrição.
transcritos em uníssono ou nenhum é transcrito.
Além de reconhecer e se ligar a lacO, o repressor
A presença de três sequênciasências codificadorascodificadoras nana mes�mes� tem forte afinidade por moléculas do indutor do ope�
ma molécula de mRNA sugeresugere queque asas quantidadesquantidades re�re� ron lactose. Cada monômero liga�se a uma molécula
lativas das três proteínas sejam sempre as mesmas em de indutor, o que causa uma mudança conformacional
condições variáveis de indução. O indutor éé umumum �inter��inter��inter� que diminui muito a afinidade do repressor por lacO
ruptor” molecular que influencia a síntese de uma es� (Figura 8.3). Assim, quando o indutor está presente, o
pécie de mRNA para todos os três genes. Entretanto, a repressor não mais se liga a laço, e a RNA polimerase
quantidade de cada uma das três proteínas éé comumen�comumen�comumen� começa a transcrição a partir do promotor.
te diferente, por causa das diferenças nas velocidades
de tradução ou de degradação das próprias proteínas. O estudo do operon lactose foi muito facilitado pela
descoberta de algumas moléculas pequenas, como iso�
O mRNA induzido pela lactose tem uma meia�vida propiltiogalactosídeo (IPTG), que servem fortuitamen�
de cerca de 3 min. Portanto, a expressão do operon te de indutores, mas não são metabolizadas pela b�ga�
pode ser alterada muito rapidamente. A transcrição lactosidase. Esses indutores gratuitos ligam�se como
cessa assim que o indutor não está mais presente, as indutores � molécula do repressor.
moléculas de mRNA existentes desaparecem em minu�
tos, e as células param de fazer as proteínas. A proteína repressora age em trans; isto é, ela éca�éca�ca�
paz de se difundir até seu local de ação. Algumas mu�
tações em lacI alteram ou removem aminoácidos do
Repressor do Operon Lactose É uma repressor, que são partes do sítio de ligação ao indutor.
Essas alterações não afetam a afinidade do repressor
Proteína Difusível pelo operador, de modo que o repressor fica sempre li�
gado ao operador, mesmo em presença do indutor, e os
O gene regulatório do operonlactose, lacI, codifica o genes lacZYA nunca são transcritos acima de um ní�
repressor lactose, cuja função é controlar a iniciação da velbasal muito baixo. Outras mutações em lacI trocam
transcrição dos genes estruturais lac. LacI localiza�se os aminoácidos do sítio de ligação ao operador e dimi�
imediatamente �� montantemontantemontante dosdosdos elementoselementoselementos controlado�controlado�controlado� nuem a afinidade do repressor pelo operador. Assim, o
res do grupo lacZYA. Entretanto, um gene regulatório repressor não se liga ao operador, e os genes lacZYA
não precisa ficar próximo do grupo de genes que regu�
são continuamente transcritos. Tais mutações são mu
la. A transcrição de lacI não é regulada; esse gene é
tações repressor�constitutivas porque os genes lac são
transcrito a partir de seu próprio promotor em baixa permanentemente expressos. Alguns mutantes lacIra�
velocidade, que é relativamente independente do esta� ros aumentam a afinidade do repressor pelo operador.
do da célula. Nesses casos, moléculas do indutor podem se ligar ao
repressor, mas são menos efetivas em liberar o repres�
O repressorlactose é sintetizado como um monôme�
ro de 360 aminoácidos, que formam um homotetrâmero sor do operador.
ativo. Geralmente, há cerca de 10 tetrâmeros por célula.
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 321

(a) lacl
Promotor Operador
lacZ lacY lacA
mRNA lac; isto é, são mutações ope
rador-constitutivas. Nesses casos, a
sequência de DNA do operador tem
um ou mais pares de bases trocados,
de modo que o repressor não mais
se liga tão fortemente � sequência.
Assim, o repressor é menos efetivo
em impedir que a RNA polimerase
comece a transcrição.
monomérico
Repressor
lacl Promotor Repressor
Operador lacZ lacY lacA
tetramérico Diferentemente das mutações em
(b) lacI, que codifica o repressor difusí�
β–Galactosidase Permease Acetilase vel, mutações no operador não mu�
dam uma proteína difusível. Estas
exercem sua influência sobre a trans�
crição apenas dos três genes lac
que ficam imediatamente � jusante
do operador, na mesma molécula de
DNA. Se um segundo operon lac for
introduzido em uma bactéria, em um
Indutor plasmídeo recombinante, o operador
de um operon não influencia a ação
do outro operon. Portanto, um ope�
ron com um operador tipo�selvagem
será reprimido nas condições nor�
Repressor Repressor mais, enquanto na mesma bactéria
monomérico tetramérico engenheirada, um segundo operon
com uma mutação operador�consti�
FIGURA 8.3 Controle do operon lac.
tutiva será transcrito continuamente.
(a) O repressor tetramérico liga�se ao operador e impede a transcrição dos genes es�
truturais. (b) O indutor liga�se ao repressor tetramérico, o que impede que o repressor Mutações no operador são fre�
se ligue ao operador. A transcrição dos três genes estruturais pode ocorrer a partir do
quentemente denominadas cis-do
promotor.
minantes, para enfatizar que elas
afetam apenas genes adjacentes,
Os mutantes repressor�constitutivos ilustram as ca� na mesma molécula de DNA. Mutações cis�dominantes
racterísticas de um sistema de controle negativo. Um ocorrem em sequências de DNA que são reconhecidas
repressor ativo, em ausência de um indutor, desliga a por proteínas e não em sequênciasuênciasências dedede DNADNADNA quequeque codifi�codifi�codifi�
expressão dos genes estruturais lac. Um repressor ina� cam proteínas difusíveis. Mutações trans-dominantes
tivo resulta na expressão constitutiva, não�regulada, ocorrem em genes que especificam produtos difusíveis.
desses genes. Usando as técnicas de DNA recombinante Portanto, mutações cis�dominantes também ocorrem em
descritas no Capítulo 7, um plasmídeo contendo o gene sequências de promotor e de terminação de transcrição,
lacI tipo selvagem (mas não o resto do operon lactose) enquanto mutações trans�dominantes também ocorrem
pode ser introduzido em células mutantes constitutivas em genes de subunidades proteicas da RNA polimerase,
lacI. Tais células sintetizam moléculas de repressor de proteínas ribossômicas, e assim por diante.
ativas e inativas. Nessas condições, ocorre a regulação
normal, tipo selvagem, do operon lactose. Portanto, em A Figura 8.4 mostra a sequência do operador e do
termos genéticos, a indução tipo�selvagem é dominante promotor lac. A sequência do operador tem um eixo de
sobre o mutante constitutivo. simetria díade. A sequênciaência dada fitafita superior,superior, nono ladolado es�es�
querdo do operador, é quase idêntica � da fita inferior,
no lado direito; apenas três diferenças ocorrem. Essa
Sequência Operador do Operon simetria na sequênciaência dede reconhecimentoreconhecimentoreconhecimento dododo DNADNADNA re�re�re�
Lactose É Contígua a um Promotor e flete a simetria do repressor tetramérico e facilita a for�
te ligação das subunidades do repressor ao operador.
Três Genes Estruturais Simetria díade na sequência de DNA fita�dupla é uma
característica comum de muitos sítiossítios dede ligaçãoligação ouou re�re�
Os elementos de controle �� montantemontantemontante dosdosdos genesgenesgenes es�es�es�
conhecimento dede proteínas,proteínas, incluindoincluindo aa maioriamaioria dosdos sí�sí�
truturais do operon lactose são o operador e o promo� tios de reconhecimento de endonucleases de restrição.
tor. O operador foi identificado, como lacI, por mutações
que afetam a transcrição da região lacZYA. Algumas O operador lac, de cerca de 30 pb, é uma fração
dessas mutações resultam na síntese constitutiva do extremamente pequena do genoma total de E. coli e
322 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Operador
Promotor

lacI Sítio CAP Sítio de interação da RNA polimerase lacZ

glu ser gly glu stop mRNA fmet thr met

5! GGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG 3!
3! CCTTTCGCCCGTCACTCGCGTTGCGTTAATTACACTCAATCGAGTGAGTAATCCGTGGGGTCCGAAATGTGAAATACGAAGGCCGAGCATACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTTTGTCGATACTGGTAC 5!

FIGURA 8.4 Sequência de nucleotídeos dos elementos de controle do operon lactose.

A extremidade do gene lacI (que codifica o repressor lactose) e mostrados. Linhas acima e abaixo da sequência indicam sequên�
o início do gene lacZ (que codifica b�galactosidase) também são cias simétricas no sítio CAP e no operador.

ocupa uma fração ainda menor do volume da célula. presente para sobrepujar este efeito anti-indutor da
Entretanto, os aproximadamente 10 repressores tetra� lactose.
méricos estão também confinados a uma pequena fra�
ção do volume celular. Como o gene do repressor fica
muito próximo do operador lac, o repressor não precisa RNA Polimerase e uma Proteína
se difundir para longe, se sua tradução começar antes Reguladora Reconhecem a
de seu mRNA ter sido completamente sintetizado. Mais
importante, o repressor tem uma baixa afinidade geral Sequência do Promotor do Operon
por todas as sequênciasências dede DNA.DNA. QuandoQuando oo indutorindutor liga�liga�
�se ao repressor, sua afinidade pelo operador é reduzida Lactose
cerca de 1.000 vezes, mas sua afinidade por sequências Imediatamente � montante do operador lac está o
aleatórias de DNA é inalterada.inalterada. Portanto,Portanto, todostodos osos re�re� promotor. Essa sequência contém os sítios de ligação
pressores lactose da célula estão em associação fraca para a RNA polimerase e para a proteína ativadora de
com DNA. Quando a ligação do indutor libera uma mo� catabólito (CAP; também chamada proteína receptora
lécula de repressor do operador, ela rapidamente se liga de cAMP ou CRP) (Figura 8.4). O local ao qual a RNA
� regiãoregião próximapróxima dodo DNA.DNA. Portanto,Portanto, aa induçãoindução redistri�redistri� polimerase se liga foi identificado por abordagens gené�
bui o repressor no DNA, em lugar de gerar moléculas de ticas e bioquímicas. Mutações puntuais e deleções (ou
repressor que se difundem livremente. inserções) nessa região afetam dramaticamente a liga�
Como a lactose entra numa célula em primeiro lugar, ção da RNA polimerase. Os pontos finais da sequência
se o gene lacY que codifica a permease está reprimido � qual a RNA polimerase se liga foram identificados por
e, no entanto, a permease é necessária para o trans� experimentos de proteção contra DNase. A RNA polime�
porte de lactose através da membrana celular? Mesmo rase purificada foi ligada � região do promotor lac clo�
no estado reprimido, há um nível basal muito baixo de nada no DNA de um bacteriófago ou de um plasmídeo, e
transcrição do operon lac, que fornece cinco ou seis esse complexo proteína�DNA foi digerido com DNase I.
moléculas de permease por célula. Talvez isso seja sufi� O segmento de DNA protegido da degradação pela DNa�
ciente para levar algumas poucas moléculas de lactose se foi recuperado, e sua sequência foi determinada. As
para dentro da célula e iniciar o processo. extremidades desse segmento protegido variaram ligei�
ramente entre diferentes moléculas de DNA, mas cor�
Outra observação curiosa é que a lactose não é o in� respondiam estreitamente aos limites do sítio de ligação
dutor natural do operon lactose. Quando o repressor é da RNA polimerase mostrado na Figura 8.4.
isolado de células completamente induzidas, a molécula
pequena ligada a cada monômero do repressor é alolac O sítio de ligação da RNA polimerase não tem ele�
tose, não lactose. Alolactose, como a lactose, é composta mentos simétricos, como a sequência do operador. Isso
não é surpreendente, uma vez que a RNA polimerase
de galactose e glicose, mas a ligação entre os dois açú�
cares é diferente. Uma reação secundária da b�galacto� deve se associar com o DNA de modo assimétrico para
sidase (que normalmente quebra lactose em galactose e que a transcrição se inicie em apenas uma direção. En�
glicose) converte esses dois produtos em alolactose. tretanto, a parte da sequência do promotor reconhecida
pela CAP contém certo grau de simetria.
Consequentemente, algumas poucas moléculas de
lactose são captadas e convertidas pela b�galactosidase
em alolactose, que se liga ao repressor e induz o operon.
Proteína Ativadora de Catabólito
Confirmação de que a lactose não é o realindutor vem de Liga Promotor Lactose
experimentos indicando que a ligação da lactose com o
repressor purificado, na realidade, aumenta a afinidade E. coli prefere usar glicose a outros açúcares
do repressor pelo operador. Portanto, no estado induzi� como fonte de carbono. Por exemplo, se tanto glicose
do, uma pequena quantidade de alolactose precisa estar como lactose estiverem no meio, as bactérias metabo�
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 323

lizam seletivamente a glicose. A Figura 8.5 mostra que Glicose

a b�galactosidase não aparece até que a glicose tenha Fora
sido consumida. Isso indica que a glicose interfere com
a indução do operon lactose, um processo chamado re
pressão por catabólito, uma vez que ocorre durante o
catabolismo da glicose. Um efeito idêntico é visto em Dentro
ATP cAMP
outros operons indutíveis, incluindo os operons arabi� Glicose
Adenilato
ciclase
nose e galactose. Este é, provavelmente, um sistema ge�
ral de coordenação para desligar a síntese de enzimas cAMP
indesejadas quando a glicose está presente. CAP

A repressão por catabólito ocorre porque a glico�

se inibe a adenilato ciclase, que sintetiza AMP cíclico
(cAMP), levando a uma menor concentração intracelu� CAP -cAMP
lar de cAMP. O cAMP forma um complexo com a prote
lac Z
ína ativadora de catabólito (CAP, Catabolite Activator
cAMP
Protein), que então se liga ao sítio regulatório CAP no
lacO
promotor do operon lactose (e de outros operons) (Fi� CAP
gura 8.6). O complexo CAP�cAMP exerce um controle DNA
positivo sobre a transcrição por causar uma dobra na lacP
hélice do DNA, ou kink, de cerca de 90° no local da liga� mRNA
ção. Essa dobra do DNA e a interação entre CAP�cAMP
e a RNA polimerase ativam o início da transcrição. Se FIGURA 8.6 Controle de lacP por cAMP.
Um complexo CAP�cAMP liga�se ao sítio CAP e aumenta a trans�
o sítio CAP não estiver ocupado, a RNA polimerase tem
dificuldade em se ligar ao promotor e a iniciação de crição em lacP. Quando a glicose baixa a concentração intracelular
de cAMP ocorre uma repressão por catabólito. Isso reduz a quan�
transcrição é muito menos eficiente.
tidade de complexo CAP�cAMP e diminui a transcrição a partir de
O operon lactose demonstra como bactérias podem lacP e de promotores de vários outros operons.
coordenar uma resposta geral a uma condição metabóli�
ca (a necessidade de usar um açúcar como fonte de ener�
gia ou carbono) e uma resposta específica a essa condi�condi� 8.4 OPERON TRIPTOFANO DE
ção (a necessidade de utilizar lactose como o açúcar).
E. COLI
0.8 As bactérias precisam ter a quantidade correta e o
equilíbrio relativo dos 20 aminoácidos que constituem
2000 ) as proteínas. O triptofano, por exemplo, é necessário
L para a síntese de todas as proteínas que o contêm. Por�
Depleção de glicose m
0.6 s
e
tanto, se o triptofano não estiver presente em quan�
d
1500 a
d
tidades suficientes no meio, a célula bacteriana deve
i
n
u
(
fazê�lo. Diferentemente, a lactose não é absolutamente
0.5
e
s
a
necessária para o crescimento da célula; muitos outros
d
i açúcares podem substituí�la. Como resultado, a síntese
1000 s
o
tc
a
das enzimas para a biossíntese do triptofano é regulada
l
a
0.4 G
-
de modo diferente da síntese das proteínas codificadas
500 pelo operonlactose.

0.3 0
50 100 130
Tempo (min)
FIGURA 8.5 Inexistência de síntese de ß-galactosidase
em E. coli quando glicose está presente.
Bactérias estão crescendo em um meio contendo inicialmente
0,4 mg/mL de glicose e 2 mg/mL de lactose. A ordenada da
esquerda indica a densidade óptica da cultura em crescimento,
um indicador do número de células bacterianas. A ordenada da
direita indica as unidades de b�galactosidase por mililitro. Note
que o aparecimento de b�galactosidase é retardado até que a
glicose tenha se acabado.
Redesenhado de Epstein, W., Naono, S. e Gros, F. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 24:588, 1966.
Operon Triptofano É Controlado por
uma Proteína Repressora
Em E.coli, o triptofano é sintetizado a partir de áci�
do corísmico, por uma via de cinco etapas, catalisada
por três enzimas (Figura 8.7). O operon triptofano
contém cinco genes estruturais que codificam essas
três enzimas (duas das quais contêm duas subunidades
diferentes). À montante desse grupo de genes fica um
promotor, onde a transcrição começa, e um operador,
ao qual se liga uma proteína repressora codificada por
um gene trpR separado. A transcrição do operon lacto�
se está geralmente desligada, ou reprimida, a menos
324 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
bp 60 162 1800
Genes líder trpE
estruturais
Elementos
regulatórios
trpP trp a
trpO
Polipeptídeos
mRNAs Componente IASase
Complexos
enzimáticos Col2 Coll2
Reações clorismato antranilato
catalizadas
glutamina PRPP
FIGURA 8.7 Genes do operon triptofano de E. coli.
Os elementos regulatórios são o promotor primário (trpP), ope�
rador (trpO), atenuador (trpa), promotor secundário interno
(trpP2) e terminador (trpt). A direção da síntese de mRNA é
indicada por setas onduladas representando os mRNAs. Col2
e CoII2 significam os componentes I e II, respectivamente, do
que seja induzida por uma molécula indutora pequena.
O operon triptofano, por outro lado, está sempre ativo,
ou desreprimido, a menos que seja reprimido por uma
molécula pequena correpressora, que para o operon
triptofano é o próprio triptofano.
A biossíntese de triptofano é regulada pela síntese e
atividade das enzimas que catalisam a via. Por exemplo,
a antranilato sintetase, que catalisa a primeira etapa,
contém duas subunidades codificadas por trpE e trpD,
e sua atividade enzimática é regulada por inibição por
retroalimentação (feedback). Esse é um meio comum,
de curto prazo, para regular a primeira etapa de com�
prometimento de uma via metabólica. O triptofano
pode se ligar a um sítio alostérico da antranilato sinte�
tase e impedir sua atividade catalítica. Portanto, � me�
dida que a concentração de triptofano sobe, ele inibe a
antranilato sintetase. O triptofano também éé umumum corre�corre�corre�
pressor que desliga a transcrição do operon triptofano.
A inibição por feedback é um controle de curto prazo,
com um efeito imediato sobre a via, enquanto a repres�
são demora mais, mas tem o efeito mais permanente de
reprimir a transcrição.
O repressor triptofano é um homodímero cujas su�
bunidades têm 108 aminoácidos cada. Em condições
1800 1200 1200 800 40
trpD trpC trpB trpA
trpP2 trp t
Componente II ASase PRA Isomerase TSaseβ TSaseα
PR antranilato IGP sintetase
transferase
α2β2
PR antranilato CdRP InGP L-triptofano
L-serina
complexo antranilato sintetase (ASase); PR�antranilato é N�5�fos�
forribosil�antranilato; CdRP é 1�(o�carboxifenilamino)�1�deso�
xirribulose�5�fosfato; InGP é indol�3�glicerol fosfato; PRPP é
5�fosforribosil�1�pirofosfato; e TSase é triptofano sintetase.
Descrito em Yanofsky, C. Trends in Genet. 20:367, 2004.
normais, cerca de 20 moléculas do repressor dimérico
estão presentes. O repressor deve estar complexado
com duas moléculas de triptofano para se ligar ao ope�
rador. Lembre�se que o repressor lactose liga�se a seu
operador só na ausência do seu indutor.
O repressor triptofano também regula a transcrição
de trpR, seu próprio gene. À medida que o triptofano se
acumula nas células, o complexo repressor�triptofano
se liga a uma região a montante de trpR, desligando sua
transcrição e mantendo o equilíbrio de 20 repressores
por célula. O operador trp ocorre inteiramente dentro
do promotor trp, e não adjacente a ele (Figura 8.8). O
operador é uma região de simetria díade, e o mecanis�
mo para impedir a transcrição é o mesmo do operon lac�
tose; isto é, a ligação do complexo repressor�correpres�
sor ao operador impede a ligação da RNA polimerase.
A repressão diminuia velocidade de iniciação da trans�
crição no promotor trp em cerca de 80 vezes. (O nível ba�
sal dos produtos do gene operon lactose é cerca de 1.000
vezes mais baixo do que o nível induzido). Entretanto, o
operon triptofano contém elementos regulatórios adicio�
nais. Um promotor secundário, designado por trpP2, loca�
liza�se dentro da sequência codificadora de trpD (Figura
8.7) e não é regulado pelo repressor triptofano. A trans�
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 325

Promotor está a sequência líder de 14 códons

Operador
TGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAA
ACCGTTTATAAGACTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCTTGATCAATTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTT
FIGURA 8.8 Sequência de nucleotídeos dos elementos de controle do operon
triptofano.
As caixas acima e abaixo da sequência indicam as sequências simétricas do operador.
crição a partir dele ocorre constitutivamente, a uma ve�
locidade relativamente baixa, para gerar um mRNA que
contém as sequências codificadoras de trpCBA. Assim,
dois mRNAs policistrônicos são derivados do operon trip�
tofano, um contendo todos os cinco genes estruturais e o
outro possuindo apenas os últimos três.
Um segundo promotor interno pode ser necessário
porque três dos cinco genes não contêm um códon
para triptofano; apenas trpB e trpC contêm um có�
don para triptofano. Portanto, em extrema carência
de triptofano, essas duas proteínas não são sintetiza�
das, impedindo que a via seja ativada. Contudo, como
ambos os genes ficam � jusante do segundo promotor,
não�regulado, seus produtos proteicos estarão sempre
presentes no nível basal, necessário para manter a via.
Região Atenuadora do Operon
Triptofano
Outro importante elemento de controle do operon
triptofano, que não está presente no operon lactose, é
o atenuador (Figura 8.9), que fica nos 162 nucleotídeos
entre o promotor e o códon metionina iniciador de trpE.
Sua existência foi deduzida pela primeira vez por muta�
ções que mapeavam nessa região e aumentavam a trans�
crição de todos os cinco genes estruturais. Nessa região
adjacentes, que começam com um
códon de metionina e terminam com
mRNA
um códon de terminação em fase.
Esses códons são precedidos por um
sítio canônico de ligação a ribossomo
e poderiam, potencialmente, especifi�
5! car um peptídeo líder de 14 resíduos.
Esse peptídeo nunca foi detectado
em células bacterianas, talvez porque
seja degradado muito rapidamente.
A região atenuadora dá � RNA
polimerase uma segunda chance de regular a transcri�
ção do operon triptofano. Em presença de triptofano,
a transcrição começa no promotor, mas é prematura�
mente terminada no fim da região do atenuador. Isso
produz um transcrito curto de 140 nucleotídeos. Em
ausência de triptofano, a região do atenuador não tem
efeito sobre a transcrição, e é sintetizado o mRNA po
licistrônico inteiro, com os cinco genes estruturais.
Consequentemente, tanto no operador como no atenu�
ador o triptofano exerce a mesma influência geral. No
operador, participa da repressão da transcrição e, no
atenuador, termina a transcrição por aquelas RNA po�
limerases que teriam escapado da repressão. A atenua�
ção tem efeito de cerca de 10 vezes sobre a transcrição
dos genes estruturais do triptofano. A desrepressão
do operador tem um efeito de 80 vezes, de modo que a
transcrição do operon triptofano é regulada na faixa de
mais de 800 vezes.
A transcrição é terminada no sítio atenuador por in�
teração cooperativa entre a transcrição e a tradução.
O peptídeo líder triptofano tem dois códons de tripto�
fano adjacentes nas posições 10 e 11 (Figura 8.9). Isso
é incomum, uma vez que o triptofano é um aminoácido
relativamente raro em E. coli. Esses códons indicam
precocemente se tRNAtrp está envolvido na atenuação.
Se o triptofano da célula estiver baixo, a quantidade de
triptofanil�tRNAtrp carregado também será baixa. Os

Peptídeo lider

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Trp Trp Arg Thr Ser term

pppAAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACA AUG AAA GCA AUU UUC GUA CUG AAA GGU UGG UGG CGC ACU UCC UGA

1 20 40 60

AACGGGCAGUGUAUUCACCAUGCGUAAAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUUGAACAAAAUUAGAG
80 100 120 140

Met Gln Thr Gln Lys Pro

AAUAACA AUG CAA ACA CAA AAA CCG ....
162 trp E

FIGURA 8.9 Sequência de nucleotídeos do RNA líder do operon triptofano.

Os 14 aminoácidos do peptídeo líder putativo são indicados sobre seus códons.
Redesenhado com permissão de Oxender, D. L., Zurawaski, G. e Yanofsky, C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5524, 1979.
326 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Excesso de Trp Carência de Trp Nenhuma tradução

Atenuação da Transcrição
Controla Outros Operons
1
de Biossíntese de
2 3 2 2
4 1
Aminoácidos
3 4 3
1 4 A atenuação da transcrição não
ocorre em organismos eucarióticos
porque a transcrição (no núcleo) e a
Terminação Sem terminação Terminação tradução (no citoplasma) ocorrem em
(a) (b) (c) compartimentos celulares separados.
Entretanto, a atenuação é comum na
FIGURA 8.10 Modelo esquemático da atenuação no operon triptofano de E. expressão gênica de bactérias e ocor�
coli.
re em, pelo menos, seis outros operons
(a) Em condições de excesso de triptofano, o ribossomo (esfera verde) que traduz o
RNA líder recém�transcrito sintetiza o peptídeo líder completo. Durante essa síntese, de enzimas que catalisam vias de bios�
o ribossomo liga�se �s regiões 1 e 2 do RNA e impede a formação da haste e alça 1�2 síntese de aminoácidos. A Figura 8.11
ou 2�3. A haste e alça 3�4 poderá se formar e sinalizar para a molécula de RNA poli� mostra as sequências de peptídeos lí
merase (não mostrada) terminar a transcrição. (b) Em condições de carência de trip� deres especificados por esses operons.
tofano, triptofanil�tRNATrp será limitante, e o ribossomo fará uma pausa nos códons Em todos, o peptídeo líder tem várias
adjacentes de triptofano, no início da região 1, na região que codifica o peptídeo líder. cópias do aminoácido que é o produto
Como a região 1 está ligada ao ribossomo, a haste e alça 2�3 formar�se�á, excluindo a final da via. O peptídeo líder de 16 re�
formação da haste e alça 3�4, que é necessária como sinal para a terminação da trans� síduos codificado no operon histidina
crição. Portanto, a RNA polimerase continuará a transcrição dos genes estruturais.
contém sete histidinas contíguas. A
(c) Em condições nas quais o peptídeo líder não é traduzido, forma�se a haste e alça
1�2, impedindo a formação da haste e alça 2�3 e permitindo a formação da haste e falta de histidina diminui a quantida�
de de histidinil�tRNAhis e aumenta a
alça 3�4. Isso sinaliza o término da transcrição.
Reproduzido com permissão de Oxender, D. L., Zurawaski, G. e Yanofsky, C. Proc. transcrição do operon his. A sequência
Natl. Acad. Sci. USA 76:5524, 1979. de nucleotídeos da região atenuadora
sugere que aa pausapausa dodo ribossomoribossomo nes�nes�
ribossomos serão incapazes de traduzir os dois códons ses códons influencie a formação de alças em grampo
triptofano e pararão na sequência líder do RNA. alternativas, uma das quais se parece com um gram�
po de terminação seguido de vários resíduos U. Ao
A sequência de RNA da região do atenuador pode
contrário do operon trp, a transcrição do operon his é
adotar várias estruturas secundárias (Figura 8.10). A
regulada primariamente pela atenuação, uma vez que
posição do ribossomo na sequência líder determina qual não possui um operador reconhecido por uma proteína
ocorre. A estrutura secundária, por sua vez, é reconheci�
repressora. Em vez disso, o ribossomo age como uma
da pela RNA polimerase que acabou de transcrever essa
proteína reguladora positiva, semelhante ao complexo
região. A estrutura que se forma quando um ribossomo
cAMP�CAP do operon lac. Se o ribossomo estiver ligado
não para nos códons triptofano é um sinal de terminação
(ou seja, parado) no sítio atenuador, a transcrição dos
para a RNA polimerase, de modo que a transcrição para
genes estruturais a jusante estará aumentada. Se o ri�
após a síntese de um transcrito de 140 nucleotídeos, que
bossomo não estiver ligado, a transcrição desses genes
é rapidamente degradado. A estrutura secundária que se
estará muito reduzida.
forma quando os ribossomos param nos códons triptofa�
no não é reconhecida como um sinal de terminação, e a
transcrição continua em direção ao gene trpE.

Operon
his Met-Thr-Arg-Val-Gln-Phe-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Pro-Asp
Sequência do peptídeo lider Aminoácidosregulatórios

pheA
leu
thr
ilv His

Met-Lys-His-lle-Pro-Phe-Phe-Phe-Ala-Phe-Phe-Phe-Thr-Phe-Pro
Met-Thr-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-lle-Ser-Leu-Val-Val-lle-Ser-Val-Val-Val-lle-lle-lle-Pro-Pro-Cys-Gly-Ala-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Lys-Ala
Met-Ser-His-lle-Val-Arg-Phe-Thr-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Asn-Ala-Phe-lle-Val-Arg-Gly-Arg-Pro-Val-Gly-Gly-lle-Gln-His
Met-Lys-Arg-lle-Ser-Thr-Thr-lle-Thr-Thr-Thr-Ile-Thr-lle-Thr-Thr-Gly-Asn-Gly-Ala-Gly Phe

Thr lle

Leu

Leu, Val, lle

FIGURA 8.11 Sequências dos peptídeos líderes especificados por operons biossintéticos de E. coli.
Todas as sequências de peptídeos líderes contêm múltiplas cópias do(s) aminoácido(s) sintetizado(s) por enzimas codificadas pelo
operon.

A transcrição de alguns operons, mostrados na Fi�
gura 8.11, pode ser atenuada por mais de um aminoá�
cido. Por exemplo, o operon thr é atenuadouado porpor treoni�treoni�
na ou isoleucina; o operon ilv é atenuado por leucina,
valina ou isoleucina. Esse efeito pode ser explicado,
em todos os casos, pela pausa do ribossomo no códon
correspondente, o que interfere com a formação de um
grampo de terminação. É possível que em sequências
líderes mais longas, a pausa em mais de um códon seja
necessária para atingir máxima transcrição através da
região de atenuação.
8.5 OUTROS OPERONS
BACTERIANOS
Síntese de Proteínas Ribossômicas É
Regulada de Modo Coordenado
Muitos operons bacterianos possuem os mesmos
mecanismos regulatórios gerais dos operons lac, trp
e his. Entretanto, cada operon tem suas próprias ca�
racterísticas distintas. Um exemplo é dado pelos genes
estruturais das 70 ou mais proteínas que compõem
os ribossomos (Figura 8.12). Cada ribossomo contém
uma cópia de cada proteína ribossômica (exceto as
proteínas L7�L12, que provavelmente estão presentes
em quatro cópias). Portanto, todas as 70 proteínas são
necessárias em quantidades equimolares, e faz senti�
do que sua síntese seja regulada de modo coordenado.
Seis operons diferentes, contendo cerca de metade dos
genes das proteínas ribossômicas, ocorrem em dois
grupos principais de genes. Um grupo contém quatro
operons adjacentes (Spc, S10, str e a) e o outro grupo
contém dois operons (L11 e rif) localizados em outro
ponto do cromossomo de E. coli. Não há nenhum pa�
drão óbvio de distribuição dos genes entre esses ope�
rons. Alguns operons codificam proteínas de uma su�
bunidade ribossômica; outros codificam proteínas de
ambas as subunidades. Esses operons também contêm
genes de outras proteínas (relacionadas). Por exemplo,
o operon str contém os genes dos fatores de elongação
de tradução solúveis, EF�Tu e EF�G, e os genes de algu�
mas proteínas da subunidade ribossômica 30S. O ope�
ron a contém genes de proteínas de ambas as subuni�
dades ribossômicas e um gene da subunidade a da RNA
polimerase. O operon riftem os genes das subunidades
b e b! da RNA polimerase e de proteínas ribossômicas.
Uma característica comum aos seis operons de pro�
teínas ribossômicas é que sua expressão é regulada por
um dos produtos de seus próprios genes estruturais;
isto é, são autorregulados. Em alguns casos, a regu�
lação ocorre em nível de tradução, não de transcrição
como discutido para os operons lac e trp. Depois que o
mRNA policistrônico é feito, a proteína ribossômica re�
gulatória liga�se a esse mRNA e determina que região,
CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 327
Operon regulatória
Proteína Proteínas especificadas pelo operon
S10
Spc
L11
str
rif
α S8 L14-L24-L5-S14-S8-L6-L18-S5-L15-L30
L4 S10-L3-L2-L4-L23-S19-L22-S3-S17-L16-L29
S7 S12-S7-EF.G-EF.Tu
S4 S13-S11-S4-α-L17
L1 L11-L1
L10 L10-L7-β−β!
FIGURA 8.12 Operons contendo genes de proteínas
ribossômicas de E. coli.
Os genes dos componentes proteicos das subunidades ribossô�
micas pequena (S) e grande (L) de E. coli ficam agrupadas em
vários operons. Alguns desses operons também contêm genes das
subunidades a, b e b! da RNA polimerase e dos fatores de síntese
proteica EF.G e EF.Tu. Pelo menos um dos produtos proteicos de
cada operon geralmente regula a expressão desse operon (p. 321).
se alguma, será traduzida. Em geral, a proteína ribossô�
mica que regula a expressão de seu próprio operon as�
socia�se com o RNA ribossômico (rRNA) no ribossomo.
Essa proteína tem uma alta afinidade por rRNA e uma
afinidade menor por uma ou mais regiões de seu próprio
mRNA. Portanto, ocorre competição entre o rRNA e o
operon do mRNA pela ligação com a proteína. À medida
que a proteína se acumula até um nível mais alto do que
o de rRNA livre, ela se liga a seu próprio mRNA e im�
pede a síntese proteica em uma ou mais das sequências
codificadoras desse mRNA (Figura 8.13). À medida que
mais ribossomos são formados, o excesso dessa proteí�
na é usado e a tradução de seu mRNA pode recomeçar.
Resposta Estringente Controla
Síntese de rRNAs e tRNAs
As bactérias respondem de várias maneiras ao ex
tremo estresse geral. Uma dessas situações ocorre
quando não há aminoácidos suficientes para manter a
síntese proteica. Nessas condições, a célula invoca a
resposta estringente, que reduz a síntese de rRNAs e
tRNAs cerca de 20 vezes. A síntese de mRNAs também
diminui cerca de três vezes.
A resposta estringente é disparada pela presença de
um tRNA não�carregado no sítio A do ribossomo, o que
ocorre quando a concentração do tRNA correspondente
carregado é muito baixa. O primeiro resultado é que a
elongação peptídica pelo ribossomo para. Essa parada
leva uma proteína chamada fator estringente, o pro�
duto do gene relA, a sintetizar guanosina tetrafosfato
(ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp), a partir
de ATP e GTP ou GDP, como mostra a Figura 8.14. O
fator estringente fica fracamente associado com alguns
ribossomos da célula. Talvez uma mudança confor�
macional no ribossomo seja induzida pela presença de
328 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

Operon de proteínas ribossômicas GEne de rRNA H

R C N

O
tRNA não carregado
no sítio A

mRNA rRNA mRNA

Proteína relA

GDP + pppGpp
ppGpp +
GTP ATP AMP

Proteínas ribossômicas
Ribosomo parcialmente
Bloqueio de síntese de
organizado
rRNA e tRNA

FIGURA 8.14 Controle estringente de

Operon de proteínas ribossômicas
síntese proteica em E. coli.
Durante carência extrema de aminoácidos,
um tRNA não carregado no sítio A do ribos�
somo ativa a proteína relAa sintetizar ppGpp
e pppGpp que estão envolvidos na redução
da transcrição dos genes que codificam rR�
mRNA NAs e tRNAs.

FIGURA 8.13 Autorregulação da síntese de proteínas ribossômicas.

Se rRNA livre não estiver disponível para a montagem de novas subunidades ribos�
sômicas, as proteínas ribossômicas individuais ligam�se ao mRNA policistrônico de
seu próprio operon, bloqueando a tradução.

um tRNA não�carregado no sítio A, o que, por sua vez,

ativa o fator estringente associado. As funções exatas Transposon
de ppGpp e pppGpp não são conhecidas. Entretanto, repetitivascom
flanqueadoras
sequências invertidas
inibem a iniciação da transcrição dos genes de rRNA e
tRNA, e afetam a transcrição de alguns operons mais
do que outros.

8.6 TRANSPOSONS Genes que codificam transposição

e resistência a antibióticos
BACTERIANOS
FIGURA 8.15 Estrutura geral dos transposons.
Transposons são segmentos móveis de DNA relativamente ra�
do DNA
Transposons São Segmentos Móveis ros, que contêm genes que codificam seu próprio rearranjo e,
frequentemente, genes que especificam resistência a vários
antibióticos.

A imensa maioria dos genes bacterianos tem locali�
zação fixa no cromossomo. De fato, os mapas genéticos
de E. coli e de Salmonella typhimurium são muito
semelhantes, indicando a ausência de muito movimento
evolutivo para a maioria dos genes em cromossomos bac�
terianos. Há uma pequena classe de genes bacterianos,
entretanto, na qual cópias recém�duplicadas de genes
�saltam” de um local para outro no genoma com uma fre�
quência de cerca de 10–7 por geração, a mesma taxa de
mutações puntuais espontâneas. Esses segmentos mó�
veis do DNA são chamados elementos transponíveis ou
transposons (Figura 8.15). Alguns genes de transposons
bacterianos controlam a presença e a transposição do
próprio transposon, enquanto outros, geralmente genes
de resistência a antibióticos, fornecem � bactéria uma
vantagem seletiva sobre outras bactérias.

Os transposons foram detectados inicialmente como
inserções raras de DNA estrangeiro em genes estrutu�
rais de operons bacterianos. Geralmente, essas inser�
ções interferem com a expressão do gene estrutural
afetado e de todos os genes � jusante do operon. Isso
não é surpreendente, uma vez que inserções podem
destruir a fase de leitura da tradução, introduzir sinais
de terminação da transcrição, afetar a estabilidade do
mRNA, e assim por diante. Muitos transposons e os lo�
cais nos quais eles se inserem foram isolados usando�se
técnicas de DNA recombinante e foram extensamente
caracterizados.
Alguns transposons consistem de poucos milhares
de pares de bases e contêm dois ou três genes; outros
são muito mais longos e contêm muitos genes. Às ve�
zes, pequenos transposons podem ocorrer dentro de
um transposon grande. Todos os transposons ativos
contêm pelo menos um gene que codifica uma trans
posase, que é necessária para o evento de transposição
ou �salto”. Frequentemente eles contêm genes que co�
dificam resistência a antibióticos ou a metais pesados.
A maioria das transposições envolve a geração de uma
cópia adicional do transposon e a inserção dessa cópia
em outra localização. A cópia original não é afetada
pela inserção de sua duplicata em um novo sítio alvo. Os
transposons contêm sequências repetitivas terminais
invertidas curtas, que são essenciais para o mecanismo
de inserção, e são frequentemente usadas para definir
os dois limites de um transposon. A maioria dos sítios
alvos é bastante aleatória em sequência, embora alguns
transposons tenham uma propensão para inserção em
pontos específicos ou �hot spots”. O transposon dupli�
cado pode estar localizado em uma molécula de DNA
diferente do seu doador. Frequentemente, transposons
são encontrados em plasmídeos que passam de uma
cepa bacteriana para outra e são fonte de uma resistên�
cia adquirida subitamente a um ou mais antibióticos por
uma bactéria (Correlação Clínica 8.1).
Transposons Tn3 Contêm Três Genes
Estruturais
Um exemplo de transposon é o transposon Tn3,
que contém 4.957 pb, incluindo as repetições inverti�
das de 38 pb em ambas as extremidades (Figura 8.16).
Três genes estão presentes em Tn3. Um codifica a b−
�lactamase, que hidrolisa ampicilina e torna a célula
resistente a esse antibiótico. Os outros, tnpA e tnpR,
codificam uma transposase e uma proteína represso�
ra, respectivamente. A transposase contém 1.021 ami�
noácidos e liga�se a DNA de fita�única. Reconhece as
extremidades repetitivas do transposon e participa da
clivagem do sítio alvo, no qual a nova cópia do trans�
poson se insere. A proteína repressora de 185 amino�
ácidos controla a transcrição tanto do gene da trans�
posase como de seu próprio gene. tnpA e tnpR são
transcritos de modo divergente a partir de uma região
CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 329
CORRELAÇÃO CLÍNICA 8.1
Resistência Transmissível a Múltiplas Drogas
Uma tendência alarmante é que bactérias pato�
gênicas estão ficando cada vez mais resistentes a um
grande número de antibióticos. Muitos casos foram
documentados nos quais uma cepa bacteriana em um
paciente que vinha sendo tratado com um antibióti�
co, subitamente torna�se resistente a esse antibiótico
e, simultaneamente, a vários outros antibióticos, em�
bora essa cepa bacteriana nunca tenha sido expos�
ta a esses outros antibióticos. Isso ocorre quando a
bactéria, subitamente, adquire, de outra cepa bacte�
riana, um plasmídeo que contém vários transposons
diferentes, cada um contendo um ou mais genes de
resistência a antibióticos. Exemplos incluem os genes
que codificam a b�lactamase, que inativa penicilinas
e cefalosporinas; a cloranfenicol acetiltransferase,
que inativa cloranfenicol; e as fosfotransferases, que
modificam aminoglicosídeos como neomicina e gen�
tamicina.
Neu, H. C. The crisis in antibiotic resistance. Science
257:1064, 1992
de controle de 163 pb, localizada entre eles, que liga o
repressor. O repressor também participa da inserção
do novo transposon, mas não afeta a transcrição do
gene de resistência � ampicilina.
As mutações em tnpA que inativam a transposase
diminuem a frequência de transposição de Tn3. As de
tnpR que inativam o repressor aumentam a frequência
de transposição. Essas mutações desreprimem tnpA,
resultando em mais moléculas de transposase, o que
•• •
Transposase Repressor β–lactamase
Extremidade Extremidade
com repetições com repetições
invertidas invertidas
FIGURA 8.16 Componentes funcionais do transposon
Tn3.
Análises genéticas e de sequência de DNA demonstram que
existem quatro tipos distintos de regiões: as extremidades
com repetições invertidas de 30 pb; um gene da enzima b�lac�
tamase, que confere resistência � ampicilina e a antibióticos
relacionados; um gene que codifica uma enzima necessária �
transposição (transposase); e um gene de uma proteína re�
pressora que controla a transcrição dos genes da transposase
e do próprio repressor. Setas horizontais indicam as direções
de transcrição.
Redesenhado de Cohen, S.N. e Shapiro, J. A. Sci. Am. 242:40,
1980. W. H. Freeman and Company, Direitos autorais ©1980.
330 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
aumenta a formação de mais cópias duplicadas do
transposon. Também desreprime tnpR, mas como o re�
pressor é inativo, a desrepressão não tem efeito.
Transposons localizados em plasmídeos bacterianos
são de importância crescente no uso clínico de anti�
bióticos. Plasmídeos bacterianos que não foram altera�
dos para uso experimental geralmente contêm genes
que facilitam sua transferência de uma bactéria para
outra. À medida que esses plasmídeos se transferem
entre diferentes cepas bacterianas infecciosas, seus
transposons contendo genes de resistência a antibió
ticos movem�se para as novas cepas bacterianas. Uma
vez dentro de uma nova bactéria, o transposon pode ser
duplicado no cromossomo e ficar permanentemente es�
tabelecido naquela linhagem celular. O resultado é que
mais e mais cepas de bactérias patogênicas tornaram�
�se resistentes a um número crescente de antibióticos
(Correlação Clínica 8.2).
CORRELAÇÃO CLÍNICA 8.2
O Patógeno Bacteriano do Estômago: Helico
bacter pylori
Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria
gram negativa que infecta o estômago e o duodeno de
mais de 50% da população humana mundial. A forma
helicoidal do organismo aumenta sua mobilidade no
muco que recobre a mucosa gástrica. Embora a maio�
ria das pessoas infectadas não apresente sintomas,
sabe�se que H. pylori causa muitos casos de úlcera
péptica (lesões no revestimento do estômago ou do
duodeno), gastrite, duodenite e câncer de estômago.
A bactéria sobrevive no ambiente muito ácido do es�
tômago porque sintetiza uma grande quantidade da
enzima urease, que metaboliza a ureia do estômago a
dióxido de carbono e amônia, que neutraliza o ácido
gástrico. O pH ácido aumenta a expressão de urease e
de uma proteína do canal de ureia próton�dependen�
te de H. pylori, tanto em nível da transcrição como
da estabilidade do mRNA. H. pylori, geralmente, é
tratadacom uma terapia de três antibióticos ou mais,
mas alguns isolados de H. pylori foram encontrados,
apresentando resistência a drogas. Dois médicos aus�
tralianos, Robin Warren e Barry Marshall, receberam
o Prêmio Nobel de Medicina de 2005 por seu trabalho
com H. pylori.
Scott, D. R., Marcus, E. A., Wen, Y., Oh, J., e Sachs, G.
Gene expression in vivo shows that Helicobacter pylori
colonizes an acidic niche on the gastric surface. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 104:7235, 2007; e Blaser, M. J. The
endangered species in the stomach. Sci. Amer. 292:38,
2005.
8.7 EXPRESSÃO GÊNICA EM
EUCARIOTOS
A transcrição gênica em organismos eucarióticos
é também regulada para dar a resposta adequada �s
necessidades biológicas. Além de modular a expres�
são gênica em resposta �s condições nutricionais ou
ambientais, os organismos multicelulares regulam a
expressão de genes especializados que direcionam a
diferenciação celular e caracterizam tipos celulares
específicos. Alguns genes, chamados genes zeladores
ou housekeeping, são expressos na maioria das célu�
las, outros são ativados sob demanda e outros e, ainda,
ficam permanentemente inativos em todos, exceto al�
guns poucos, tipos de células. Em células eucarióticas,
a membrana nuclear serve de barreira que permite o
acesso seletivo de algumas proteínas ao DNA, enquan�
to mantém outras no citosol. Em bactérias, uma RNA
polimerase é responsável pela transcrição de todos os
RNAs (tRNA, rRNA e mRNA). Em organismos euca�
rióticos, três RNA polimerases diferentes são usadas
(p. 196). A RNA polimerase I transcreve os genes dos
rRNA, a RNA polimerase II transcreve os genes que
codificam proteínas, cujos transcritos se tornam mR�
NAs, e a RNA polimerase III transcreve os genes dos
tRNAs e a maioria dos outros RNAs pequenos. Embo�
ra alguns princípios da ativação gênica e do controle
eucarióticos se apliquem a todas as três RNA polime�
rases, nesta seção o foco será a transcrição pela RNA
polimerase II. A RNA polimerase II é composta por,
pelo menos, 10 subunidades diferentes, com tamanhos
de 10 a 220 kDa. Algumas das subunidades são tam�
bém partes dos complexos das RNA polimerases I e III;
outras são exclusivas da RNA polimerase II. A subuni�
dade maior da RNA polimerase II tem, dependendo da
espécie, até 52 repetições do motivo de aminoácidos
PTSPSYS em sua região C�terminal (CTD, C-terminal
domain). Uma característica própria dessas repeti�
ções é que a treonina (T), a serina (S) e a tirosina (Y)
podem ser fosforiladas.
Para entender melhor a regulação da transcrição em
eucariotos, é útil relembrar a organização do DNA na
cromatina e o papel da modificação no DNA, especial�
mente metilação de citosina, sobre a ativação gênica.
Além disso, vamos considerar como a RNA polimerase
II é posicionada no ponto correto do promotor de um
gene para transcrever esse gene pela formação de um
complexo de pré�iniciação, que envolve a organização
dos fatores de transcrição gerais (TFs) com a RNA
polimerase II. A seguir, vamos ver como a atividade de
genes específicos pode ser regulada pelo uso de enhan
cers, sítios de ligação de fatores de transcrição e sí
tios de organização da RNA polimerase. Finalmente,
vamos discutir a ativação da transcrição por fatores de
transcrição específicos, algumas de suas característi�
cas gerais e como são regulados.
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 331

DNA Eucariótico é Ligado a Histonas

para Formar Cromatina
Core de
histonas
Segmentos de DNA eucariótico são enrolados ao
redor de octâmeros de proteínas histonas, que contêm
duas moléculas de cada histona H2A, H2B, H3 e H4, for�
mando nucleossomos (p. 58). As histonas associam�se
com o DNA por interações eletrostáticas. As histonas
têm um grande número de resíduos delisina carregados
positivamente que interagem com o esqueleto fosfodi�
éster carregado negativamente do DNA. Na maioria das
células, as histonas H1 ou H5 ligam�se quando a asso� Core de
ciação octâmero�DNA está estabelecida. Cerca de 200 histonas

pb de DNA compõem uma única unidade nucleossômica,

com cerca de 130�160 pb em contato direto com o cerne
(ou core) do octâmero. Uma parte do DNA restante liga
histonas H1 e H5, e o resto é o DNA de ligação (linker),
que fica entre os nucleossomos. Embora a interação oc�
tâmero de histonas�DNA não seja sequência�específica,
alguns padrões de associação sequência�dependentes
DNA de
ligação Core de
foram observados. Quando, por exemplo, a hélice de histonas
DNA dupla�fita se dobra em virtude da presença de uma
região rica em A�T, a fenda menor geralmente fica volta�
da para o core da partícula do nucleossomo. Em regiões
ricas em G�C, a fenda menor fica voltada para longe do
(a) (b)
core do octâmero de histonas. A despeito dessas ten�
dências, não há modo claro de prever as sequências em FIGURA 8.17 O acesso às sequências específicas
um DNA duplex que vão compor as fendas maior e me� das fendas maior e menor do DNA depende do
nor no lado externo do complexo do nucleossomo. Esse posicionamento do nucleossomo.
posicionamento é importante porque a organização do (a) O DNA enrolado em torno do cerne de octâmero de his�
complexo iniciador da transcrição e a ligação de outras tonas (duas moléculas de cada histona H2A, H2B, H3 e H4)
proteínas que influenciam a expressão gênica precisam é chamado partícula do cerne (core) do nucleossomo. Na
maioria das condições, histonas H1 ou H5 (não mostradas)
ter acesso �s fendas do DNA duplex. Interações se�
associam�se com o DNA onde o enrolamento em torno do oc�
quência�específicas ocorrem via pontes de hidrogênio tâmero de histonas começa. O DNA entre partículas core de
formadas com as bordas dos pares de bases das fendas nucleossomos é chamado DNA de ligação ou linker. Quando
maior ou menor. Quando o DNA é enrolado em torno de expostas a agentes como a nuclease de micrococcus, as regiões
um octâmero de histonas, as sequências específicas de de ligação são mais acessíveis do que o DNA enrolado em torno
DNA que ligam fatores de transcrição podem ficar es� das partículas core de histonas. (b) No nucleossomo, o lado
condidas. A remoção completa do DNA do nucleossomo da hélice voltado para fora do core de histonas está acessível,
não é necessária para permitir o acesso �s sequências mas o lado voltado para dentro, não. Se girarmos a hélice com
específicas. Por rolamento da hélice do DNA em relação relação ao core de histonas de um nucleossomo e seguirmos a
ao octâmero de histonas, diferentes contatos de fendas posição dos mesmos cinco pares de bases, o acesso �s fendas
maior e menor para outras interações muda, dependendo se o
maior e menor podem ficar disponíveis na superfície ex� par de bases está no lado de dentro ou de fora da partícula core
terna do nucleossomo (Figura 8.17). do nucleossomo enrolado.
Redesenhado de Wolffe, A. P. Chromatin: Structure and
Os genes que não são transcritos em uma célula em
Function, 3. ed. New York: Academic Press, 1998.
particular formam aa heterocromatina,heterocromatina, altamentealtamente con�con�
densada. Diferentemente, as regiões transcripcional� importante para permitir o acesso sequência�específico
mente ativas do DNA apresentam uma estrutura menos ao DNA (Figura 8.18). Acredita�se que a modificação
condensada, mais aberta. Parte dessa diferença deve� de histonas seja crítica no controle epigenético da ex�
�se �� modificaçãomodificaçãomodificação pós�traduçãopós�traduçãopós�traduçãopós�tradução dedededede histonas.histonas.histonas.histonas.histonas. AAAAA acetila�acetila�acetila�acetila�acetila� pressão gênica, como será discutido mais adiante neste
ção do e�amino grupo dos resíduos de lisina próximos
capítulo.
� extremidade N�terminal das histonas reduz a carga
positiva e, assim, enfraquece a atração eletrostática A posição relativa de um nucleossomo também pode
entre as histonas e o DNA. Em geral, a acetilação de ser influenciada pelo complexo SWI/SNF, identificado
histonas leva � ativação da expressão gênica, enquanto pela primeira vez e mais bem caracterizado na levedura
a desacetilação reverte o efeito. A acetilação de histo� S. cerevisiae e assim denominado em referência �s cepas
nas e o subsequente reposicionamento do nucleossomo com troca de tipo para cruzamento e que não fermentam
por desestabilização das interações histonas�DNA é sacarose. Esse complexo contém cerca de 10 proteínas e
332 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
O
NH CCH3
CH2
CH2
CH2
CH2
NHCO
CH
-N-Acetilisina
(a)
(b)
FIGURA 8.18 A força da associação histona-DNA é
modificada pela acetilação de resíduos de lisina na
extremidade N-terminal das histonas.
As histonas que compõem o core octâmero contêm resíduos de
lisina que, em virtude de seu grupo lateral carregado positiva�
mente, podem promover interação com as ligações fosfodiés�
ter carregadas negativamente do DNA. Modificação das lisinas
por acetilação substitui as cargas positivas por grupos acetil
neutros, e enfraquece a interação eletrostática entre o core
octâmero e o DNA. Esse processo é reversível, e a acetilação e
a desacetilação de histonas é um modo de afrouxar ou apertar
a estrutura da cromatina.
Redesenhado de Wolffe, A. P. The cancer�chromatin connec�
tion. Sci. Med. 6:28, 1999.
interage com o domínio C�terminal da subunidade gran�
de da RNA polimerase II, rompendo as matrizes nucleos�
sômicas de maneira dependente de ATP. O resultado é a
abertura de regiões de DNA para interação com fatores
de transcrição e, assim, facilita a ativação gênica. Há me�
nos complexos SWI/SNF na célula do que genes sendo
transcritos, sugerindo que o complexo SWI/SNF funcio�
ne de forma catalítica (Correlação Clínica 8.3).
Metilação do DNA Correlaciona-se
com Inativação de Genes
A metilação do DNA humano envolve a formação
de 5�metilcitosina (Figura 8.19). A reação é sequência�ência�
�específica com 5!CpG3! como substrato. O resultado é
que ambas as fitas do duplex são metiladas. Cerca de
70% das sequências
ências CpG
pG do DNA humano são metila�
das. A metilação está implicada no imprinting (identi�
ficação) do DNA genômico. No imprinting, os padrões
de metilação do DNA herdado do espermatozoide ou do
óvulo correlacionam�se com a escolha do alelo a ser ex�
CORRELAÇÃO CLÍNICA 8.3
Síndrome de Rubstein-Taybi
A regulação da acetilação de histonas influencia
a ativação e a inativação da expressão gênica. Duas
importantes enzimas responsáveis pela acetilação de
histonas em células de mamíferos são a acetiltrans�
ferase p300 e a CBP. A p300 recebeu esse nome por
seu peso molecular, e CBP significa CREB Binding
Protein (proteína que se liga ao CREB), com CREB
(cAMP regulatory-element binding protein) sen�
do um fator de transcrição. Essas acetiltransferases
permitem a ativação de genes apropriados, em as�
sociação com CREB e outros fatores de transcrição,
levando � abertura da estrutura da cromatina por en�
fraquecimento das interações histonas�DNA.
A síndrome
índrome de Rubstein�Taybi (OMIM 180849), ca�
racterizada por retardo mental e outras anomalias de
desenvolvimento, é causada por mutações puntuais,
pequenas deleções e rearranjos no gene CBP. Defei�
tos de desenvolvimento mais graves correspondem a
substancialmente mais mutações. A perda completa
do produto do gene CBP é provavelmente letal.
Petrij, F., Giles, R. H., Dauwerse, H. G., Saris, J. J. et
al. Rubistein�Taybi syndrome caused by mutations in the
transcriptional co�activator CBP. Nature 376:348, 1995; e
Wolffe, A. P. The cancer�chromatin connection. Sci. and
Med. 6:28, 1999.
presso. Os padrões de metilação são conservados após a
replicação por uma hemimetilase (que reconhece a me�
tilação na fita parental e metila a fita recém�replicada).
Mais recentemente, sugeriu�se que a metilação do DNA
que resulta em silenciamento de genes possa ser indu�
zida pela ação de siRNA (short interfering RNA) que é
complementar � sequência que é metilada.
Citosina 5-metilcitosina
H N H H N H
5 4N H3C N
3
6 N
1
2
O
metilação
N
O
FIGURA 8.19 A base metilada mais comum no homem é
5-metil citosina.
Uma terminologia frequentemente encontrada na
literatura sobre a metilação do DNA é ilhas ou regiões
ricas em CpG. A sequência CpG é subrepresentada no
genoma. Isso provavelmente se deve ao acúmulo, ao
longo de muitas gerações, de transições C para T cau�
sadas pela desaminação da 5�metilcitosina. A manu�
tenção de CpGs deve�se, presumivelmente, � pressão
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 333

seletiva para manter uma região regulatória. De fato,
as ilhas CpG são mais comumente encontradas em re�
giões de promotores de genes. A metilação do DNA fre�
quentemente se correlaciona com a falta de atividade
transcripcional. Acredita�se que isso seja mediado por
proteínas que reconhecem e ligam DNA metilado, o que
impede a ligação de fatores de transcrição. A metilação
do DNA correlaciona�se com a desacetilação de histo�
nas, fornecendo dois meios de repressão de transcrição
em uma localização específica (Figura 8.20).
A hipermetilação do DNA é uma característica co�
mum de células em tecido canceroso. Há evidências
crescentes de que metilação ocorre em genes que codi�
ficam proteínas que encaminhariam células em divisão
anormal para a morte celular programada (apoptose).
Por outro lado, em células totipotentes ou pluripoten�
tes de mamíferos, como o óvulo fecundado e as células
do início do desenvolvimento embrionário, o DNA sofre
desmetilação quase global.
8.8 COMPLEXO DE PRÉ
INICIAÇÃO EM
EUCARIOTOS: FATORES
DE TRANSCRIÇÃO, RNA
POLIMERASE II E DNA
Ao contrário da RNA polimerase bacteriana, a RNA
polimerase II eucariótica não faz ligação sequência�es�ência�es�
pecífica com promotores eucarióticos. Ao contrário, um
complexo de iniciação é formado pelo contato inicial do
promotor com o fator de transcrição geral TFIID. TFIID
é um dentre pelo menos seis fatores de transcrição ge�
rais (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH) ne�
cessários � transcrição basal pela RNA polimerase II.
A nomenclatura TFII reflete que são fatores de trans�
crição envolvidos na organização do complexo de pré�
�iniciação da RNA polimerase II (Tabela 8.1).

TFIID é um complexo de múltiplas su�

(a) = CpG SÍTIO DE LIGAÇÃO
bunidades que contém a proteína que se
PONTO DE INÍCIO
DA RNA POL II
DA TRANSCRIÇÃO
liga a TATA (TBP, TATA binding protein)
e várias TAFs diferentes (TBP-associated
factors, fatores associados a TBP). O TFIID
ATIVAÇÃO POR PROTEÍNAS
liga�se � fenda menor do DNA em uma se�
QUE SE LIGAM A METILCITOSINA quência consenso chamada TATA box, loca�
lizada cerca de 27 pb a montante do ponto
de início da transcrição. O TATA box pre�
cisa estar acessível a TFIID, de modo que
ATIVAÇÃO DO GENE não pode estar na face interna do core de
uma partícula nucleossômica se o complexo
(b) de pré�iniciação deve se formar. A intera�
ção de TBP com o DNA causa uma grande
distorção no DNA duplex (Figura 8.21).
METILAÇÃO DO DNA Acreditava�se que TBP fosse essencial para
a transcrição usando qualquer RNA polime�
rase, mas a identificação recente de TLFs
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
(TBP�like factors, fatores tipo TBP) adi�
cionais sugere que alguns genes usem uma
PROTEÍNAS QUE SE LIGAM
A METILCITOSINA
TABELA 8.1 • Fatores Gerais de Transcrição
Encontrados em Eucariotos
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3CH3 CH3 CH3 CH3CH3 CH3 Fator subunidades
Número de Massa
(kDa)
INATIVAÇÃO DO GENE TFIID
FIGURA 8.20 Metilação do DNA leva a atividade gênica alterada. TBP 1 38
Para máxima transcrição da maioria dos genes, fatores de transcrição devem TFIIA
TAFs 12 15�250
reconhecer e se ligar a sequências específicas do DNA, na região do promotor.
Sua interação com o DNA e com os fatores de transcrição gerais no complexo de 3 12, 19, 35
iniciação da RNA polimerase II leva � expressão de um gene. Metilação do DNA, TFIIE
TFIIB 1 15
especificamente a formação de 5�metilcitosina, oferece um novo alvo para inte�
ração proteína�DNA. A associação de proteínas que se ligam a 5�meC DNA com 2 34, 57
o DNA metilado pode bloquear a capacidade de outros fatores de transcrição TFIIH
TFIIF 2 30,74
se ligarem ao DNA. Essa inibição geralmente não é por competição sequência�
�específica pela ligação ao DNA, mas por impedimento estérico. 9 35�89
Redesenhado de Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. e Watson, J. Fonte: Roeder, R. G. Trends Biochem. Sci. 21:329,
Molecular Biology of the Cell. New York: Garland, 1994. 1996
334 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

proteína alternativa. Após a ligação ao TATA box, TBP (a)

dirige a montagem do complexo de pré�iniciação pela
adição ordenada de vários fatores gerais de transcrição
TATA box
e da RNA polimerase II (Figura 8.22). Lembre�se que a
subunidade grande da RNA polimerase II tem um domí� TFIID

nio C�terminal (CTD) contendo muitas repetições da se� (b)

quência de aminoácidos PTSPSYS.
TFIID

TFIIA
TFIIB
TFIIA

TBP
(c)
+1 TFIIB

TFIIA TFIID

TFIIF

RNAPII
TFIIB
(d)
TFIIB TFIIF

FIGURA 8.21 A proteína de ligação a TATA (TBP) foi TFIIA TFIID

cocristalizada com o DNA.
A primeira etapa da formação do complexo de transcrição que
permite a transcrição de genes mediada pela RNA polimera�
se II é a associação do fator geral de transcrição TFIID com o
DNA. Na maioria dos casos, isso é mediado por uma das proteí�
nas do complexo proteico TFIID, TBP, que se liga ao DNA por
contatos com a sequência TATAA. A cocristalização de TBP
com o DNA permitiu uma visão mais detalhada da interação
e indicou que a ligação de TBP introduziu uma dobra signifi�
cativa no DNA. Estão incluídos na figura dois outros fatores
gerais de transcrição, TFIIA e TFIIB, nenhum deles envolvidos
no contato inicial com o DNA. TFIIA liga�se a TBP e estabiliza a
interação TBP�DNA. TFIIB liga�se a TBP, leva ao recrutamento
da RNA polimerase II para o complexo de iniciação, e está en�
volvido na identificação do sítio de início da transcrição.
Figura reproduzida com permissão de Voet, D., Voet, J. e Pratt,
C. W. Fundamentals of Biochemistry. New York: Wiley, 1999.
© (1999) John Wiley and Sons Inc.
A entrada da RNA polimerase II no complexo de
pré�iniciação ocorre quando seu CTD não está fosfo�
rilado. Entretanto, o movimento da RNA polimerase II
para longe do sítio de montagem correlaciona�se com
a fosforilação do CTD. Portanto, a montagem do com�
plexo de pré�iniciação não garante a transcrição; mais
sinais, como a fosforilação, devem ocorrer para que a
transcrição comece.
A formação do complexo de pré�iniciação permite
que a atividade de helicase ATP�dependente associada
com TFIIH abra as duas fitas do DNA, fornecendo um
molde para a fase de elongação subsequente na síntese
do RNA.
RNAPII
TFIIH
TFIIE +
(e)
TFIIB TFIIF
TFIIE
TFIIA TFIID
TFIIH
RNAPII
Transcrição
FIGURA 8.22A formação do complexo de iniciação para
genes transcritos pela RNA polimerase II é ordenada.
Os modelos atuais de montagem do complexo de iniciação in�
cluem as seguintes etapas: (a) A região do promotor de um gene
com um TATA box antes da ligação de TFIID. (b) TFIID, que
inclui TBP, liga�se ao TATA box e dobra o DNA. (c) O comple�
xo DNA�TFIID serve de sítio de coordenação para a ligação de
outros fatores gerais de transcrição. O complexo TFIID associa�
�se com TFIIA e TFIIB. TFIIA serve para estabilizar a interação
TFIID:DNA, e TFIIB fornece um sítio de interação adequado
para a ligação da RNA polimerase II. (d) TFIIF e a RNA poli�
merase II unem�se ao complexo. Nesse estágio, o domínio car�
boxi�terminal (CTD) da RNA polimerase II está defosforilado.
Acredita�se que TFIIF desestabilize as interações inespecíficas
RNA polimerase II:DNA, dirigindo assim a RNA polimerase II
para o complexo de iniciação em formação. (e) Dois fatores
gerais de transcrição adicionais juntam�se ao complexo. TFIIE
recruta TFIIH para o complexo. TFIIH tem atividades de helica�
se, ATPase e quinase. Acredita�se que TFIIH seja mediador da
abertura transitória do DNA duplex e também da fosforilação do
CTD da RNA polimerase II, permitindo que a polimerase deixe o
complexo de iniciação e inicie a transcrição.
Redesenhado de Voet, D., Voet, J. e Pratt, C. W. Fundamen
tals of Biochemistry. New York: Wiley, 1999. Ó (1999) Wiley.

O TFIID fica para trás, ainda ligado ao TATA box,
para promover a montagem de complexos de pré�ini�
ciação adicionais. O TFIIF prossegue com a RNA po�
limerase II durante a fase de elongação, mas os outros
fatores gerais de transcrição se dissociam do complexo
de elongação.
Promotores Eucarióticos e Outras
Sequências Que Influenciam
Transcrição
Promotores de genes eucarióticos transcritos pela
RNA polimerase II são operacionalmente definidos
como as sequências que influenciam a iniciação da
transcrição de genes. A característica marcante dos
promotores eucarióticos é sua utilização de múltiplos
sítios de ligação para fatores de transcrição para regu�
lar atividade gênica. Em geral, esses sítios de ligação
ficam relativamente próximos ao TATA box, que mar�
ca o local de montagem do complexo de pré�iniciação.
Outras sequências consensos frequentemente encon�
tradas em promotores eucarióticos incluem CAAT box
e GC boxes (Figura 8.23). A posição exata do CAAT
box e as posições, orientação e número de GC boxes
variam entre os promotores. O CAAT box serve de sítio
de ligação para vários fatores de transcrição diferentes,
incluindo NF1. A presença de um CAAT box geralmente
indica um promotor forte. O GC box fornece sítio de li�
gação para o fator de transcrição SP1 e é característico
de muitos genes zeladores (housekeeping).
A ligação de fatores de transcrição a outras sequên�
cias em promotores pode ser influenciada por uma mo�
lécula sinalizadora, como hormônios associados com
fatores de transcrição de resposta a esteroides, ou por
modificação de aminoácidos, como fosforilação. As se�
quências de DNA que ligam tais fatores de transcrição
regulados são frequentemente chamadas elementos de
resposta. Os fatores de transcrição podem ser exclusi�
vos de tecidos específicos ou aparecerem em momentos
específicos do desenvolvimento. A eficiência relativa
das sequências regulatórias dos promotores depende de
sua orientação ou direcionamento, e pode ser diminuí�
da alterando�se sua distância do TATA box.
Muitos genomas celulares ou virais também têm
elementos enhancers, que ligam proteínas que ativam
Sítio de início de transcrição
CAAT box
TATA box
= 10 nucleotídeos
FIGURA 8.23 Sequências de DNA em genes transcritos em
eucariotos geralmente contêm um TATA box, e podem
conter um CAAT box, GC boxes e múltiplos sítios de ligação
para fatores de transcrição.
CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 335
a transcrição. Enhancers diferem das sequências do
promotor em dois aspectos importantes. Primeiro,
enhancers podem estar localizados a muitos milhares
de pares de bases de distância do sítio de montagem
do complexo de pré�iniciação e podem estar tanto �
montante como � jusante do sítio de início de trans�
crição. Segundo, o elemento enhancer pode agir em
qualquer orientação. Os fatores de transcrição que se
ligam aos elementos de resposta próximos do ponto de
início de transcrição podem agir diretamente sobre o
complexo de iniciação ou por meio de proteínas que
fazem uma ponte com o complexo de iniciação (ver Fi�
gura 8.30). É bastante comum que as proteínas que in�
fluenciam a transcrição exerçam essa função de ponte.
Entretanto, a distância linear entre um enhancer e
o complexo de pré�iniciação pode ser muito grande.
Fatores de transcrição ligados a enhancers são apro�
ximados do complexo de pré�iniciação por meio de do�
bra do DNA. Isso ajuda a explicar como o enhancer
pode funcionar a distância e porque a orientação da
sequência do enhancer não importa. Contanto que a
proteína tenha se ligado ao enhancer, o alinhamento
correto da proteína com o complexo de pré�iniciação é
ajustado quando o DNA se dobra.
Projeto Modular de Fatores de
Transcrição Eucarióticos
Fatores de transcrição eucarióticos têm múltiplos
domínios que estabelecem interações específicas. Os
domínios de reconhecimento do DNA contribuem com
a ligação sítio�específica, e os domínios de ativação
fazem contato com os fatores gerais de transcrição, a
RNA polimerase II e outros reguladores da transcrição.
Muitos fatores de transcrição também têm domínios
de dimerização, que promovem a formação de homo�
dímeros ou heterodímeros, domínios de interação com
proteínas, que permitem a associação com proteínas
como histona acetilase, ou domínios que se ligam a coa�
tivadores. Coativadores incluem hormônios esteroides e
cAMP, que mudam a capacidade do fator de transcrição
para se ligar ao DNA ou servir de ativador. Os domínios
envolvidos em tais atividade podem ser agrupados em
alguns poucos motivos característicos.
Motivos Comuns em Proteínas Que
Ligam DNA e Regulam Transcrição
Vários motivosmotivos dede aminoácidosaminoácidos sãosãosão comumentecomumentecomumente en�en�en�
contrados em fatores de transcrição (reguladores de
ação trans). Eles incluem proteínas hélice-volta-hélice
(HTH, helix-turn-helix), dedos de zinco, hélice-alça
-hélice (HLH, helix-loop-helix) e região básica zíper
de leucina (bZIP) (p. 336).336).). EssesEssesEsses motivosmotivosmotivos estãoestãoestão presen�presen�presen�
tes em cerca de 80% das proteínas que se ligam �s se�
quências específicas.
336 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

O repressor lactose de E. coli (ver Seção 8.3) e um

grupo de fatores de transcrição importantes durante o
desenvolvimento, chamados proteínas homeodomínio,
estão entre as proteínas com motivo hélice�volta�hélice
(HTH). O homeodomínio é a parte de reconhecimento
do DNA desses fatores de transcrição. Proteínas home�
odomínio foram identificadas pela primeira vez em mos�
hélice de
ca de fruta, quando mutações nos genes que as codifi� reconhecimento
NH2
cam levavam � homeose, ou substituição de uma parte
do corpo por outra. Por exemplo, uma mutação em uma
proteína homeodomínio pode levar � formação de per�
nas onde deveriam estar antenas. Proteínas homeo�
COOH
domínio são reguladores�chaves no desenvolvimento (a)
de mamíferos também. O motivo HTH tem cerca de 20
aminoácidos, e forma uma parte relativamente pequena
de uma proteína muito maior. Dentro do motivo, os pri�
meiros sete aminoácidos formam uma hélice, seguida
de uma volta com quatro aminoácidos e, depois, uma
hélice de nove aminoácidos. A segunda hélice é a hélice
de reconhecimento, que se liga de maneira sequência�
�específica � fenda maior, enquanto interações hidrofó�
bicas entre a primeira e a segunda hélice estabilizam a
estrutura. O resto da proteína pode ter sítios alostéricos
que ligam moléculas reguladoras e regiões que permi�
tem outras interações proteína�proteína (Figura 8.24).

TFIIIA, um fator geral de transcrição que se liga a

promotores de genes transcritos pela RNA polimerase
III, SP1 (que estimula 10 a 20 vezes todos os genes com
GC boxes), Gal4 em levedura e a superfamília de re�
ceptores de hormônios esteroides são todos exemplos
de proteínas dedos de zinco. Diferentes subclasses de
proteínas dedos de zinco são definidas pelos aminoá�
cidos específicos que coordenam a ligação de Zn. Por
exemplo, em TFIIIA, duas cisteínas e duas histidinas
coordenam a ligação do Zn e são da classe C2H2, en�
quanto os fatores de transcrição receptores de hormô�
nios esteroides usam quatro Cys para cada Zn e são da
classe C4. O motivo dedo de zinco liga�se � fenda maior
do DNA de maneira sequência�específica, mediada por
uma α�hélice formada de um lado da região dos dedos.
Como foi visto para proteínas HLH, a α�hélice se encai�
xa na fenda maior e as cadeias laterais dos aminoácidos
estabelecem pontes de hidrogênio com as bases para a
ligação sequência�específica (p. 335).
As duas classes de proteínas dedos de zinco têm
sítios de ligação característicos do modo pelo qual
cada classe se posiciona no DNA. Para TFIIIA, dedos
de zinco sequenciais acompanham a fenda maior, cada
um formando pontes de hidrogênio com bases especí�
ficas. Proteínas dedos de zinco da classe C4, como os
fatores de transcrição receptores de hormônios este�
roides, usam um dedo de zinco para se ligar ao DNA e
um segundo dedo de zinco para estabilizar a ligação do
DNA ao primeiro. Os fatores de transcrição receptores
de hormônios esteroides associam�se com DNA como
dímeros. Seus sítios de ligação consistem de duas �me�
tades” palindrômicas espaçadas para acomodar os dois
dedos de ligação ao DNA do dímero (Figura 8.25).
(b)
FIGURA 8.24 Proteínas hélice-volta-hélice usam uma
hélice para ligar na fenda maior enquanto a outra
suporta essa ligação por interação hidrofóbica.
(a)O domínio HTH de uma proteína contém geralmente cerca
de 20 aminoácidos que formam duas α�hélices, unidas por uma
volta não�helicoidal. (b) As dimensões da α�hélice da proteína
permitem a ela se encaixar na fenda maior da hélice do DNA.
A hélice que interage diretamente com o DNA (a hélice de re�
conhecimento) inclui aminoácidos com cadeias laterais capa�
zes de formar pontes de hidrogênio com bases específicas, que
ficam expostas na fenda maior. A segunda hélice não interage
diretamente com DNA, mas estabiliza a ligação da hélice de
reconhecimento por interações hidrofóbicas. Portanto, ambas
as hélices incluem aminoácidos como valine a leucina, que per�
mitem que essas interações hidrofóbicas ocorram.
Redesenhado de Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Ro�
berts, K. e Watson, J. Molecular Biology of the Cell. New York:
Garland, 1994.
Proteínas região básica�zíperzíper dede leucinaleucina (bZIP)(bZIP)(bZIP) in�in�in�
cluem fos, jun e CREB. Proteínas bZIP contêm resíduos
de leucina a cada sétima posição em uma α�hélice. Es�
sas leucinas formam interações hidrofóbicas com uma
segunda proteína que também tem esse padrão de re�
petições de leucinas, formando homo ou heterodímero
(Figura 8.26).
As proteínas bZIP têm um domínio de ligação ao
DNA composto por uma região básica, definida pela
presença de arginina e lisina, localizada sete aminoá�
cidos antes da primeira leucina e α�hélice. Os amino�
ácidos básicos estabilizam a associação DNA�proteína
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 337

(a) (b) (c)

FIGURA 8.25 Dois diferentes motivos dedos de Zn são encontrados em fatores de transcrição.
Embora ambas as proteínas dedos de Zn usem a ligação coorde� Zn. (b) A classe Cx de proteínas dedos de Zn comumente tem
nada de uma molécula de Zn para assumir sua estrutura final, há dois domínios dedos de Zn. A α-hélice de um dedo de Zn liga�
diferenças notáveis entre os dois motivos principais que foram �se ao DNA na fenda maior, enquanto a α�hélice do outro dedo
identificados. Ambas as classes tiram vantagem da formação de de Zn suporta essa interação por interações hidrofóbicas com o
estrutura em α-hélice para formar domínios que se ligam � fenda domínio de ligação ao DNA. As proteínas dedos de Zn da classe
maior do DNA. (a) A classe C2H2 inclui proteínas que podem Cx normalmente se ligam ao DNA pela formação de dímeros. É
ter muitos domínios dedos de Zn. Cada α�hélice de um dedo de mostrada em (c) a interação do dímero receptor de estrógeno
Zn tem o potencial de se ligar de modo sequência�específico a com cada monômero fazendo contato com o DNA. Moléculas de
sítios ao longo da fenda maior. O resultado pode ser uma pro� Zn são indicadas por esferas.
cissão de interações proteína�DNA, cada uma dependente da (a) Reproduzido de Voet, D. e Voet, J. G., Biochemistry, 2. ed.,
sequência específica das cadeias laterais dos aminoácidos en� New York: Wiley, 1995. Ó (1995) John Wiley and Sons, Inc. Parte
contrados em cada domínio em α�hélice da proteína dedos de (b) e (c) gentilmente cedidas por C. Pabo, M.I.T.

por interações eletrostáticas com o esqueleto carregado

negativamente do DNA, além de formar pontes de hi�
drogênio na fenda maior. Os sítios de ligação dos homo�
dímeros têm simetria díade, enquanto essa simetria não
é encontrada nos sítios de ligação dos heterodímeros.

A classe de fatores de transcrição hélice�alça�hélice

inclui myoD, myc e max. Dois segmentos de α�hélice
anfipática separados por uma alça interveniente carac�
terizam as proteínas hélice�alça�hélice. As hélices não
são responsáveis pela ligação com o DNA, como nas pro�
teínas dedos de zinco, mas pela dimerização com outra
proteína. Como foi descrito para as proteínas bZIP, os
dímeros formados podem ser homo� ou heterodímeros.
O domínio de ligação ao DNA é uma extensão de uma
das α�hélices que formam o feixe de quatro hélices ge�
rado pela dimerização (Figura 8.27).

FIGURA 8.26 Proteínas zíper de leucina ligam-se ao DNA como dímeros.

Proteínas zíper de leucina formam dímeros em virtude da colocação periódica de uma
leucina a cada sete resíduos ao longo de uma α�hélice. Essas leucinas formam uma face
hidrofóbica que interage com a face hidrofóbica de uma α�hélice semelhante. Os domí�
nios de interação proteína�proteína estão em azul. As regiões de α�hélice podem conti�
nuar além do domínio de interação proteína-proteína, permitindo que cada monômero
se ligue � fenda maior do DNA (verde). Para homodímeros, o sítio de ligação no DNA
caracteriza�se por duas metades reconhecidas e metades simétricas.
Modificado de Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. e Watson, J. Molecular
Biology of the Cell. New York: Garland, 1994.
338 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
(a)
(b) homodímero HLS ativo heterodímero HLS inativo
DNA
FIGURA 8.27 A formação do dímero do fator de
transcrição é mediada por interações hélice-alça-hélice.
O motivo hélice�alça�hélice aproxima dois monômeros para
formar um dímero que se liga ao DNA. (a) Cada monômero
tem duas hélices unidas por uma alça. Uma hélice é usada
para a interação proteína�proteína, enquanto a outra é usada
para ligar � fenda maior do DNA. Assim, o dímero consiste de
um feixe de quatro hélices. Se o dímero for formado por dois
monômeros idênticos, então se espera que os sítios de ligação
no DNA sejam muito semelhantes ou idênticos; entretanto, se
os monômeros forem proteínas diferentes (formando hetero�
dímeros), então os sítios de ligação ao DNA podem ser não�
�relacionados. (b) Quando os fatores de transcrição ligam�se
como dímeros, a presença de um monômero truncado pode
impedir a ligação ao DNA, mesmo em presença de monômeros
completos. Por exemplo, se a hélice de dimerização da proteína
for feita sem o domínio de ligação ao DNA, a dimerização com
um monômero completo produz um produto incapaz de se li�
gar eficientemente ao DNA.
Modificado de Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts,
K. e Watson, J. Molecular Biology of the Cell. New York: Gar�
land, 1994.
8.9 REGULAÇÃO DA
EXPRESSÃO GÊNICA
EUCARIÓTICA
Como indicado aqui, uma região relativamente pe�
quena de uma proteína regulatória pode ser dedicada
� ligação sequência�específica ao DNA, enquanto ou�
tros domínios estão envolvidos em interações proteína�
�proteína ou com o ligante. Vários domínios de ativação
característicos foram identificados, incluindo domínios
ácidos (alta concentração de aminoácidos com cadeias
laterais ácidas), domínios ricos em glutamina, e domí�
nios ricos em prolina. Experimentalmente, a superpro�
dução de qualquer desses domínios por técnicas de re�
combinação, mesmo sem seus domínios de ligação ao
DNA correspondentes, pode levar � ativação errônea da
transcrição de uma variedade de genes. Eles parecem
ativar a transcrição por meio do aumento da taxa de
montagem do complexo de pré�iniciação. Alguns inte�
ragem diretamente com TFIID, aumentando a ligação
ao TATA box, enquanto outros interagem com TFIIB ou
TAFs, que são parte do complexo TFIID. Quando múl�
tiplos fatores de transcrição se ligam a um promotor,
eles podem ter um efeito combinatório sobre a ligação
e a montagem do complexo de pré�iniciação. Os domí�
nios de ativação de muitos fatores de transcrição têm
como alvos as mesmas proteínas no complexo de pré�
�iniciação. Portanto, a regulação da transcrição está
ligada ao posicionamento dos sítios de ligação ao DNA
e não �s interações proteína�proteína exclusivas de um
gene específico.
Fatores de transcrição também podem regular a ex�
pressão gênica pelo recrutamento de outras proteínas
para a área do promotor. Essas proteínas podem não
se ligar DNA, mas formam uma ponte entre o fator de
transcrição ligado ao DNA e o complexo de iniciação.
Alternativamente, a proteína que está interagindo pode
trazer enzimas que modificam a cromatina, como histo�
na acetilase (por exemplo, o complexo CBP�p300) para
genes específicos. A acetilação de histonas afrouxa a
estrutura da cromatina. Alguns fatores de transcrição
regulados que recrutam o complexo CBP�p300, e as mo�
léculas ou eventos aos quais respondem, são CREB e
cAMP, SPEBP e colesterol, NFkB e citocinas, e p53 e
parada de crescimento.
Fatores de transcrição que reduzem a expressão
gênica podem se ligar ao DNA, tanto na mesma se�
quência de um fator positivo ou, mais globalmente,
como o efeito negativo de proteínas que se ligam ao
DNA metilado. Alternativamente, fatores negativos
podem inibir a ligação ou a montagem do complexo
de pré�iniciação ou se ligar a um fator de transcrição
positivo para impedir sua ligação ao DNA ou acelerar
sua degradação.
Regulando os Reguladores
Os fatores de transcrição são regulados de várias
formas. Provavelmente, os exemplos mais simples são
os que são sintetizados só em células especializadas ou
em momentos específicos do desenvolvimento. Alguns
são regulados pela ligação a cofatores, que podem ini�
bir ou estimular sua ligação com o DNA. Para os fato�
res de transcrição que formam dímeros, a formação
de complexos homo� ou heterodiméricos não�produ�
tivos pode alterar a ligação ao DNA ou as interações
proteína�proteína que permitem a ativação de genes.
A modificação pós�tradução, como processamento ou
fosforilação de proteínas, pode afetar a ligação do fa�
tor de transcrição ao DNA ou a outras proteínas, e sua
capacidade de ir do citoplasma para o núcleo (Correla�Correla�
ções Clínicas 8.4 e 8.5).

CORRELAÇÃO CLÍNICA 8.4
O Tamoxifeno e o Receptor de Estrógeno
Como Alvo
O tamoxifeno, uma droga usada no tratamento do
câncer de mama, é um inibidor competitivo do recep�recep�
recep�
tor de estrógeno (ER). As células do câncer de mama
respondem ao estrógeno normal com aumento na sua
taxa de proliferação. O estrógeno ativa o receptor de
estrógeno, enquanto o tamoxifeno impede a ativação
normal e reduz a transcrição dos genes regulados pelo
receptor de estrógeno, reduzindo assim o crescimento
das células
Institute afirmou,
do câncer
em de
2004:
mama.
�Os Obenefícios
NationaldeCancer
tamo�
xifeno no tratamento do câncer de mama estão bem
estabelecidos e superam de longe os riscos em poten�
cial”. Entretanto, o tratamento com tamoxifeno pode
aumentar o risco de câncer uterino. A causa aparente
está na presença de dois subtipos de receptores de es�
trógeno (a e b). No tecido mamário existem ambos os
subtipos , mas o receptor de estrógeno�a predomina
no tecido uterino. No tecido uterino, tamoxifeno apa�
rentemente ativa o receptor�a, ao invés de inibi�lo. O
resultado é o estímulo da transcrição, conjuntamente
com os fatores de transcrição fos e jun.
Paech, K., Webb, P., Kuiper, G., Nilsson, S., Gustafsson,
J.�A., Kushner, P. J. e Scanlan, T. S. Differential ligand ac�
tivation of estrogen receptors ERa and ERb at AP1 sites.
Science 277:1508, 1997.
Como os enhancers podem agir a longas distâncias
e em qualquer orientação, deve existir um modo que ga�
ranta que eles atuem no gene correto. Isso é conseguido
pelo uso de sequências isoladoras que estabelecem os
limites de influência de um enhancer. Isoladores são
sequências de DNA que, quando ligadas � proteína dedo
de Zn CCTF (fator de ligação a CCCTF) e posicionadas
entre um enhancer e o TATA box, impedem a ativação
gênica mediada pelo enhancer. Uma atividade adicio�
nal dos isoladores é impedir a propagação da heterocro�
matina, o que levaria ao silenciamento de genes.
Ativação da Transcrição do Gene
do Receptor de LDL Ilustra Muitas
Características Encontradas na
Regulação Gênica Eucariótica
A descrição da regulação da expressão de genes eu�
carióticos específicos pode rapidamente se transformar
numa �sopa de letras” de fatores de transcrição e regu�
ladores de fatores de transcrição, que faz sentido para
CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 339
CORRELAÇÃO CLÍNICA 8.5
Fatores de Transcrição e Doença
Cardiovascular
Entre os genes recentemente identificados como
causadores de doença cardiovascular humana es�
tão dois que codificam fatores de transcrição. Um,
Nkx2�5, é uma proteína contendo homeodomínio.
Proteínas homeodomínios frequentemente estão
envolvidas na regulação do destino celular em cé�
lulas embrionárias, e Nkx2�5 regula genes envolvi�
dos na formação do coração. Mutações em um alelo
de Nkx2�5 estão ligadas a defeitos átrio�septais e
defeitos de condução. A mutação nula (null) no ca�
mundongo é letal ao embrião. Mutações em outro
gene, Tbx, são responsáveis pela síndrome de Holt�
�Oram. A síndrome de Holt�Oram frequentemente
inclui defeitos átrio�septais (ASD), defeitos ventrí�
culo�septais (VSD), defeitos de condução e defeitos
no desenvolvimento de mãos e braços.
Barigana, M. Tracking down mutations that can stop
the heart. Science 128:32, 1998; Schott, J. J., Benson, D.
W., Basson, C. T., Pease, E. et al. Congenital heart disease
caused by mutations in the transcription factor NKX2�5.
Science 281:108, 1998; e Li, Q. Y., Newbury�Ecob, R. A.,
Terrett, J. A., Wilson, D. I. et al. Holt�Oram syndrome is
caused by mutations in TBX5, a member of the Brachyury
(T) gene family. Nature Genetics 15:21, 1997.
os pesquisadores que estudam esse gene, mas é confu�
sa para a maioria dos outros. Entretanto, muitas carac�
terísticas dos fatores de transcrição descritas aqui são
ilustradas pelo controle transcripcional do gene do re�re�
ceptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL). Esse
gene é transcrito em resposta � falta de colesterol ce�
lular. A transcrição aumentada leva a uma quantidade
aumentada do receptor de LDL e � captação aumentada
de LDLs e de seu colesterol do sangue (p. 743).
O promotor do gene do receptor de LDL tem um
TATA box e sítios de ligação para uma variedade de
fatores de transcrição conhecidos (Figura 8.28). O
TATA box é o sítio de ligação de TFIID e de formação
do complexo de pré�iniciação com a RNA polimerase II.
Existem três sítios de consensos para ligação do fator
de transcrição Sp1 que contém dedo de zinco (lembre�
�se que Sp1 liga�se a GC boxes em promotores). Sp1
tem um domínio de ativação rico em glutamina, que se
acredita que ajude a recrutar TFIID para o TATA box.
Esse recrutamento requer um fator adicional, chamado
o cofator necessário � ativação de Sp1 (CRSP, cofactor
required for Sp1 activation). Entretanto, a ligação de
Sp1 não é suficiente para ativar a transcrição do gene.
340 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

SER-1 cleo, deve ser clivado por duas etapas

CACCCCAC
TATA
proteolíticas, a primeira das quais rea�
Região codificadora do receptor LDL lizada por uma protease encontrada em
Sp1 Sp1 uma forma ativa em um compartimento
Repetição 1 2 3
pós�ER chamado cis�Golgi. O transpor�
Repetição 1 A A A C T C C T C CTCTT G C SRE-1 Consenso te de SREBP�1a para o cis�Golgi requer
Repetição 2 A A A AT CA CC C C AC T G C 5!–CACCGTCCAC–3!
a proteína ativadora da clivagem de
Repetição 3 A A A C T C C T C CC C C T G C SREBP (SREBP cleavage activating
TT
Sp1 Consenso A C T C C T C C T C G C
G T C A protein, SCAP),SCAP),, quequeque tambémtambémtambém ficaficafica par�par�par�
cialmente mergulhada na membrana do
ER. SCAP tem uma região sensível a co�
FIGURA 8.28Um esquema do promotor do gene do receptor de LDL. lesterol, e quando os níveis de colesterol
O promotor do gene do receptor de LDL, como a maioria dos genes eucarióticos, na membrana são baixos, o complexo
tem vários sítios de ligação para fatores de transcrição diferentes. Aqui estão mos� SCAP�SREBP�1a é transportado para o
trados os sítios principais envolvidos na regulação do gene do receptor de LDL
cis�Golgi, onde a proteólise de SREBP�1a
em resposta aos níveis de colesterol. Estes incluem o TATA box, imediatamente
� montante do ponto de início da transcrição, vários GC boxes (sítios de ligação ocorre, liberando o domínio citoplasmá�
tico, o fator de transcrição, para entrar
Sp1), e o elemento de resposta (SRE), onde SREBP se liga.
Modificado de Goldstein, J. L. e Brown, M. S. Regulation of the mevalonate path�path� no núcleo (Figura 8.29). Uma vez lá,
way. Nature 343:425, 1990. liga�se ao elemento de resposta a este�
roide (SRE) no promotor LDL e recruta
A ativação requer a participação de um segundo fator uma histona acetiltransferase chamada CBP e outras
de transcrição, a proteína 1a que se liga ao elemento proteínas para a área do promotor. Então, agindo jun�
responsivo a esterol (SREBP�1a, sterol responsive ele tamente com Sp1 e CRSP, o gene do receptor de LDL é
ment-binding protein 1a). SREBP�1a é uma proteína transcrito (Figura 8.30). Isso ilustra a natureza com�
hélice�alça�hélice�zíper de leucina que se liga ao ele� posta da regulação eucariótica de genes, na qual a
mento de resposta a esterol entre os sítios de ligação de ativação de fatores de transcrição, a coordenação de
Sp1 e o gene do receptor de LDL. múltiplos fatores de transcrição e o recrutamento de
enzimas de remodelamento da cromatina trabalham
A capacidade de responder � concentração de co� coordenadamente para regular a expressão gênica.
lesterol é controlada pela liberação de SREBP de um
estado ligado � membrana, que impede que seja trans�
portado para o núcleo. SREBP�1a contém dois domínios
que atravessam a membrana do retículo endoplasmáti�
co (ER), deixando os domínios capazes de funcionarem
como fatores de transcrição expostos ao citoplasma,
mas presos ao ER. Para que SREBP�1a se dirija ao nú�

(a) Colesterol suficiente (b) Baixo colesterol leva ao transporte de SREBP (c) Região N-terminal liberada de SREBP
mediado por SCAP para o cis-Golgi e o pode mover-se para o núcleo.
processamento que libera a região terminal de SREBP

Lúmen do ER Cis Golgi

SREBP Protease
Protease

SCAP
SCAP
SCAP

FIGURA 8.29 SREBP é liberado de um precursor ligado à membrana pela ação de protease.
(a) A proteína de ligação ao elemento de resposta a esterol colesterol e move�se, com SREBP, para o cis�Golgi, onde duas
(SREBP) é sintetizada como uma proteína precursora que deve proteases diferentes clivam SREBP, (c) permitindo que o do�
ser processada proteoliticamente antes de atuar como fator de mínio citoplasmático se dirija ao núcleo. Dessa forma, SREBP
transcrição. O precursor fica preso � membrana do ER por duas não ativa o gene do receptor de LDL, a menos que os níveis de
regiões que atravessam a membrana. Fica firmemente associado colesterol estejam baixos.
com a proteína ativadora da clivagem de SREBP (SCAP), mas Adaptado de Brown, M. S., Ye, J., Rawson, R. B. e Goldstein, J.
permanece não�processado quando os níveis de colesterol na L. Regulated intermembrane proteolysis: A control mechanism
membrana do ER são normais. (b) SCAP sente níveis baixos de conserved from bacteria to humans. Cell 100:391, 2000.
 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 341

igualmente poderoso da expressão gênica.

A modulação da estrutura da cromatina via
CRSP
modificação de histonas, remodelamento
de nucleossomos ou modificação do DNA
?
? via metilação podem todos ser vistos como
CBP regulação da expressão gênica sequência�
130 TAFs Complexo core
P �independente. A regulação sequência�in�
B da RNA Pol II
E TBP
S
R Sp1 dependente da expressão gênica é frequen�
SRE GC TATA Inr temente chamada epigenética (Correlação
Clínica 8.6).
FIGURA 8.30 O gene do receptor de LDL é ativado pelo efeito
coordenado de vários fatores de transcrição.
Muitas modificações pós�tradução foram
A ativação do gene do receptor de LDL requer vários fatores. Uma vez que identificadas em histonas. Lisinas podem ser
SREBP, Sp1 e o cofator necessário para a ativação de Sp1 (CRSP) liguem, a acetiladas, metiladas (mono�, di� e trimetila�
histona acetiltransferase CBP é recrutada para a região do promotor. Essa com� das), ubiquitinadas e sumoiladas. Argininas
binação de fatores fornece o sinal positivo necessário para aumentar a ligação podem ser metiladas (mono� ou dimetila�
do complexo de iniciação ao TATA box e, por recrutamento de CBP, com sua das) ou deiminadas (formando citrulina),
atividade de histona acetiltransferase, também afeta a estrutura da cromatina serina e treonina podem ser fosforiladas,
vizinha.
glutamato pode ser ADP�ribosilado, e proli�
Modificado de Naar, A. M., Ryu, S. e Tijian, R. Cofactor requirements for trans�
na pode ser isomerizada. Mais de 60 enzimas
criptional activation by Sp1. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 63:189,
1998. que adicionam ou removem modificações de
histonas foram identificadas, e algumas,
mas não todas as modificações, estão ligadas � ativação
Controle Epigenético da Expressão ou � repressão gênica. Modificações específicas podem
Gênica alterar a associação de histonas com o DNA, com ou�
tras histonas, com outros nucleossomos e com fatores
Os fatores de transcrição discutidos aqui regulam a de transcrição. Estão surgindo evidências de que RNAs
expressão gênica via interação com sequências especí� pequenos específicos participam da herança estável de
ficas do DNA. Entretanto, como citado anteriormente padrões de modificação de histonas, uma vez que o pa�
neste capítulo, o acesso ao DNA pode ser um regulador drão tenha se estabelecido.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 8.6

Tratamento de Câncer Usando Drogas Que Têm Como Alvo a Modificação de Histonas e de DNA: Terapia
Epigenética

Tanto a metilação do DNA como a modificação de
histonas influenciam a expressão gênica. Por exemplo,
a metilação do DNA está normalmente associada com
uma redução na expressão gênica, e, em alguns tipos
de cancer, a hipermetilação do DNA é encontrada na
região do promotor de genes supressores de tumor. A
metilação do DNA, mediada pela DNA metiltransfera�
se (DNMT), pode ser inibida por 5�azacitidina e outros
análogos de nucleotídeos. Vários desses compostos fo�
ram aprovados pelo FDA para o tratamento da síndro�
me miodisplástica e de leucemia. Outros análogos de
nucleotídeos e análogos não�nucleotídeos que inibem
DNMT estão sendo procurados.
Inibidores da histona deacetilase (HDAC) também
vêm sendo procurados, com o objetivo de reestimular
a expressão dos genes supressores de tumor, por per�
mitirem que a acetilação das histonas seja mantida e a
estrutura da cromatina fique mais aberta. O inibidor de
HDAC vorinostat foi recentemente aprovado pelo FDA
para tratamento de linfoma de células T cutâneo.
O uso desses inibidores, individualmente e como
parte de tratamentos combinados com outras terapias
para o câncer, é muito promissor.
Gore, S. D. Combination therapy with DNA methyl�
transferase inhibitors in hematologic malignancies. Na
ture Clinical Practice Oncology 2:S30, 2005; Lyko, F. e
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342 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
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 CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 343

Termos Chaves
cromatina
correpressor
atenuação
acetilação epigenético histona promotor
fator de transcrição motivo de ligação ao DNA
metilação
indutor
nucleossomos região de ligação (linker)
fenda maior repressor
fenda menor RNA polimerase
dedo de zinco fosforilação sequência líder
elemento de
elementos decontrole
resposta hélice�alça�hélice operon transcrição
hélice�volta�hélice policistrônico zíper de leucina
enhancer

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha C. repressão.
1. Em um operon, D. autorregulação.
A. cada gene do operon é regulado independente� E. resposta estringente.
mente. 5. Várias sequências específicas foram encontradas
B. o controle pode ser exercido via indução ou via em muitas regiões de promotor e operador. A se�
repressão. quência que está muito estreitamente associada
C. operador e promotor podem ser trans aos ge� com a metilação do DNA é
nes que regulam. ilha CG.
D. os genes estruturais ou não são expressos ou CAAT box.
são totalmente expressos. TATA box.
E. o controle da expressão gênica consiste exclu� sítio CAP.
sivamente de indução e repressão.
CTD.
2. A região lacZYA de E. coli será regulada positiva� 6. Na transcrição eucariótica pela RNA polimerase II,
mente (up-regulated) se
a formação de um complexo de pré�iniciação
A. houver um defeito na ligação do indutor ao
A. começa com a ligação de uma proteína (TBP)
produto do gene lacI.
ao TATA box do promotor.
B. glicose e lactose estiverem ambas presentes,
B. envolve a adição ordenada de vários fatores de
mas a célula não puder ligar a proteína CAP.
transcrição e da RNA polimerase.
C. glicose e lactose estiverem ambas disponíveis
C. permite uma abertura dependente de ATP das
facilmente no meio de cultura.
duas fitas do DNA.
D. o operador estiver mutado de modo que não
D. requer que o domínio C�terminal da RNA poli�
mais ligue o repressor.
merase II não esteja fosforilado.
D. o correpressor lac não estiver presente.
E. todas as anteriores.
3. Todos os seguintes descrevem um operon, exceto
Questões 7 e 8: Como a iniciação da transcrição eu�
A. é um mecanismomecanismo dede controlecontrole parapara genesgenes euca�euca�
cariótica envolve a interação de múltiplos fatores de
rióticos. transcrição, deve haver uma regulação deles. O estró�
B. inclui genes estruturais. geno normalmente se liga a seu receptor nuclear e o
C. espera�se que codifique mRNA policistrônico. complexo se liga ao elemento de resposta a esterol para
regular a transcrição. O tamoxifeno, uma droga usada
D. contém sequênciasências dede controle,controle, comocomo umum ope�ope� para tratar câncer de mama, compete pelo receptor de
rador. estrógeno e reduz a transcrição dos genes que regula.
E. pode ter múltiplos promotores. Outro tipo de alteração é visto na síndrome de Holt�
�Oram, na qual ocorre uma mutação no gene de um
4. Em bactérias, a carência de aminoácidos está asso� fator de transcrição (Tbx), levando a defeitos na forma�
ciada com a produção de guanosina tetrafosfato e ção do coração.
guanosina pentafosfato. Essa situação é chamada
7. Elementos de resposta
A. atenuação.
A. são proteínas que se ligam � região do promo�
B. correpressão. tor.
344 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO
B. são tanto mais efetivos quanto mais próximos
estiverem do TATA box.
C. podem estar a milhares de pares de bases de
distância da montagem do complexo de pré�
�iniciação.
D. podem estar � montante ou � jusante do início
da transcrição.
E. ligam fatores de transcrição que interagem
com o complexo de iniciação somente após
formação de uma alça no DNA.
8. Fatores de transcrição são frequentemente proteí�
nas que se ligam a sequências específicas e, muito
provavelmente, têm um ou vários motivos estrutu�
rais específicos. O motivo hélice�volta�hélice
A. coordena zinco entre cisteínas e histidinas.
B. junta duas proteínas por interações hidrofóbi�
cas entre leucinas.
C. forma dímeros mantidos juntos por interação
de uma hélice de cada monômero.
D. tem uma hélice que reconhece e se liga � fenda
maior do DNA, enquanto interações hidrofó�
bicas com uma segunda hélice estabilizam a
estrutura.
E. é o único motivo que se liga � fenda maior do
DNA.
Questões 9 e 10: O problema de bactérias patogênicas
se tornarem resistentes a um grande número de antibi�
óticos é uma grande preocupação para a saúde pública.
Uma cepa bacteriana em um paciente que está sendo
tratado com um antibiótico pode subitamente ficar re�
sistente não só �quele antibiótico, mas também a outros,
embora não tenha sido exposta aos outros antibióticos.
Isso ocorre quando a bactéria adquire um plasmídeo de
outra cepa que contém vários transposons diferentes.
9. Todas as frases seguintes descrevem transposons,
exceto
A. um modo de incorporação permanente de re�
sistência a antibióticos a um cromossomo bac�
teriano.
B. contêm sequências
ências repetidas terminais inver�
tidas curtas.
C. codificam uma enzima que sintetiza guano�
sina tetrafosfato e guanosina pentafosfato, o
que inibem mais transposição.
D. incluem pelo menos um gene que codifica uma
transposase.
E. contêm número variado de genes.
10. Na operação de transposons
A. tipicamente o transposon move�se de seu local
original e reposiciona�se em um local diferen�
te.
B. um transposon duplicado deve ser inserido na
mesma molécula de DNA do original.
C. todos os transposons têm aproximadamente o
mesmo tamanho.
D. os pontos de inserção devem estar em uma se�
quência consenso.
E. a transposase pode reconhecer as extremida�
des repetitivas do transposon e participar da
clivagem do local receptor.
Questões 11 e 12: Genes presentes em uma região do
DNA que está na forma de heterocromatina muito con�
densada não podem ser transcritos. Para serem trans�
critos, essa região do DNA deve mudar para uma estru�
tura mais aberta; isso pode ocorrer por acetilação de
histonas por uma acetiltransferase como CBP, (proteí�
na de ligação a CREB, CREB Binding Protein). CREB
é um fator de transcrição. A síndrome
índrome de Rubinstein�
�Taybi é causada por mutações no gene CBP. Pacientes
com Rubinstein�Taybi são mentalmente retardados e
têm outras anomalias de desenvolvimento, a gravidade
das quais depende da extensão da mutação.
11. Na cromatina,
A. um nucleossomo consiste de quatro moléculas
de histonas envolvendo um núcleo de DNA.
B. o DNA posicionado de modo que as fendas
maior e menor fiquem do lado de fora do nu�
cleossomo é mais acessível para a transcrição
do que com as fendas voltadas para o interior.
C. o DNA deve ser completamente removido da
estrutura do nucleossomo para a transcrição.
D. o DNA de ligação (linker) é o único DNA ca�
paz de ligar fatores de transcrição.
E. o octâmero de histonas consiste de oito tipos
diferentes de proteínas histonas.
12. A acetilação de histonas pode levar a uma estrutu�
ra mais aberta do DNA por
A. enfraquecer a atração eletrostática entre as
histonas e o DNA.
B. levar as histonas a interagirem com o domínio
C�terminal (CTD) da RNA polimerase.
C. causar repulsão eletrostática entre as histonas
e o DNA.
D. facilitar a metilação do DNA.
E. atrair fatores de transcrição para o DNA.
Problemas
13. Qual será o estado de transcrição do operon lac em
(a) presença de glicose e (b) ausência de glicose,
em ambos os casos com lactose presente, se hou�
ver uma mutação que produz uma adenilato ciclase
inativa?
14. Em um operon de síntese de um aminoácido que é
controlado, total ou parcialmente, por atenuação,
por que a presença do aminoácido impede a trans�
crição do operon inteiro, enquanto a ausência do
aminoácido a permite?

Respostas
1. B Indução e repressão estão entre os mecanis�
mos usados para controlar operons. A: os genes es�
truturais estão sob controle coordenado. C: o ope�
rador e o promotor são elementos da mesma fita
de DNA do operon que controlam, não difusíveis.
D: geralmente, a regulação de operadores permite
certo grau de falha. E: outro mecanismo para regu�
lação de um operon é a atenuação.
2. D Se o operador for incapaz de se ligar ao repres�
sor, a velocidade de transcrição será maior do que
o nível basal. A: o produto do gene lacI é a proteína
repressora. Quando essa proteína se liga ao indu�
tor, não mais se liga ao operador e a transcrição au�
menta. A incapacidade de se ligar ao indutor impe�
de essa sequência. B e C: em presença de glicose,
ocorre a repressão por catabólito. A glicose baixa
o nível intracelular de cAMP, de modo que não há
complexo CAP�cAMP para ativar a transcrição. E:
o operon lac não envolve correpressão.
3. A Operons são mecanismos procarióticos. B, C e
D: um operon é a unidade regulatória completa de
um conjunto de genes agrupados, incluindo os ge�
nes estruturais, genes regulatórios e elementos de
controle, como o operador. E: um operon pode ter
mais de um promotor, como o operon triptofano de
E. coli.
4. E O mecanismo não está esclarecido, mas a ini�
ciação da transcrição do rRNA é inibida.
5. A A metilação é na citosina. B: este é um sítio de
ligação para vários fatores de transcrição. C: este é
o ponto ao qual se liga a RNA pol II. D: este é o sítio,
no operon lac, onde se liga a proteína ativadora de
catabólito. E: isso significa o domínio C�terminal
de uma proteína e não é uma sequência de DNA.
6. E A: TBP é parte do fator geral de transcrição
TFIID. B: muitas proteínas estão envolvidas. C: a
atividade de helicase está associada com um dos
fatores de transcrição (TFIIH). D: o CTD deve es�
tar na forma não�fosforilada para que a RNA poli�
merase entre no complexo de pré�iniciação.
7. B São parte da região do promotor. A: são se�
quências de DNA, não proteínas. C, D, e E: são ca�
racterísticas dos enhancers, que também são se�
quências de DNA, mas geralmente não fazem parte
do promotor.
8. D A volta tem apenas quatro aminoácidos, de
modo que as duas hélices ficam bem próximas. A:
esse é o dedo de zinco. B: esse é chamado zíper de
leucina (bZIP). C: isso é característico da hélice�
�alça�hélice. E: todos os motivos têm alguma parte
que se liga � fenda maior.
9. C Essas guanosina�fosfatos são sintetizadas pelo
produto do gene relA; elas inibem o início da trans�
CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA • 345
crição dos genes de rRNA e tRNA, desligando a
síntese de proteínas em geral. Esta é a resposta es�
tringente.
10. E Isso foi demonstrado para o transposon Tn3. A:
a maioria das transposições envolve a geração de
uma cópia adicional do transposon, que é depois
inserido em algum outro lugar do DNA. B: a cópia
poderia ser inserida em uma molécula diferente de
DNA. C: o comprimento varia consideravelmente,
dependendo do número de genes incorporados no
transposon. D: a maioria dos sítios�alvos parece ser
bastante aleatória em sua sequência,ência,, apesarapesarapesar dedede al�al�al�
guns transposons tenderem a se inserirem em hot
-spots específicos.
11. B A montagem do complexo de iniciação da trans�
crição e outras proteínas envolvidas na expressão
gênica precisam ter acesso �s fendas do DNA. A
e E: o core ou cerne dos nucleossomos é um oc�
tâmero de duas moléculas de cada uma de quatro
histonas diferentes. C: um deslocamento de cinco
pares de bases na associação do DNA com o core
de histonas é suficiente para mudar a orientação
das fendas e permitir o acesso. D: parece que é o
DNA associado com o nucleossomo que está envol�
vido na ligação de fatores de transcrição e outras
proteínas.
12. A A acetilação de um e�amino grupo de lisinas
próximo � extremidade N�terminal das histonas
muda uma carga positiva para uma espécie neutra,
de modo que há menos atração pelos fosfatos ne�
gativos do DNA. B: as histonas não interagem di�
retamente com o CTD da RNA polimerase II. C: a
mudança é de positivo para neutro, não�negativo,
de modo que não há repulsão eletrostática. D: a
metilação do DNA afeta a transcrição, mas é um
fenômeno separado da acetilação de histonas. E: o
nucleossomo sofre reposicionamento.
13. Normalmente, a glicose baixa o nível intracelular
de cAMP. Portanto, há pouco ou nenhum comple�
xo CAP�cAMP para ativar a transcrição, de modo
que a transcrição do operon é baixa. A mesma si�
tuação existiria nessa mutação. Normalmente, na
ausência de glicose, cAMP éé alto,alto,alto, ooo controlecontrolecontrole posi�posi�posi�
tivo é exercido, e o operon lac é transcrito. Nessa
mutação, cAMP não pode se formar uma vez que a
enzima que catalisa sua formação está defectiva.
Não há controle positivo, e o operon lac não será
transcrito eficientemente.
14. Tais operons codificarão um peptídeo líder que tem
um ou mais códons para o aminoácido em ques�
tão. Uma vez que o RNA do peptídeo líder tenha
sido sintetizado, pode formar diferentes estruturas
secundárias dependendo de o ribossomo parar ou
não nessa região. Se o ribossomo não parar porque
346 • PARTE II TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

nal
há aminoácido
tRNAde carregado),
terminaçãosuficiente
ae estrutura
a síntese
(e,para.
secundária é um si�
consequentemente,
Se o ribossomo regado, a estrutura secundária que se forma não
é reconhecida como um sinal de terminação e a
transcrição do operon continua.
parar em decorrência da insuficiência de tRNA car�
PARTE III CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 347
FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

9
Proteínas II:
Relações
função
de Proteínas
emEstrutura-
Famílias

Richard M. Schultz
Professor Titular, Strich School of Medicine, Loyola University of Chicago

9.1
CONTEÚDO
9.2 INTRODUÇÃO,
MOLÉCULAS DE348
ANTICORPOS: A SUPERFAMÍ- CORRELAÇÕES CLÍNICAS
9.1 As Proteínas do Complemento, 351
9.2 Funções de Diferentes Classes de Anticorpos, 352
LIA DE PROTEÍNAS IMUNOGLOBULINAS, 349
9.3 Imunização, 353
9.3 PROTEÍNAS COM UM MECANISMO CATALÍTICO
9.4 Formação de Fibrina em um Infarto do Miocár
COMUM: SERINO PROTEASES, 357
dio e Uso de Ativador de Plasminogênio Tecidual
9.4
9.5 HEMOGLOBINA
O
381
COMPLEXO PROTEICO
E MIOGLOBINA,
DA LÂMINA
367 BASAL, Recombinante (rt-PA), 358
9.5 Envolvimento de Serino Proteases em Metástase
de Células Tumorais, 360
9.6 Hemoglobinopatias, 368

Conceitos Chaves
IMUNOGLOBULINAS pervariável que se liga ao antígeno, alvo específico
• As moléculas de imunoglobulinas contêm sequên- para aquele anticorpo.
cias
dobras
pesadas (H) da estrutura
homólogas
de imunoglobulinas
repetidas básica
que
nasproduzem
cadeias
de quatro
leves
múltiplas
polipep-
(L) e • A dobra de imunoglobulina é uma superdobra, que
aparece em uma ampla variedade de moléculas
com sequência e função não-homóloga.
tídeos (LH)2.
• As dobras de imunoglobulinas de diferentes ca
• Os
anticorpos.
mover
ção domínios
é ligar
a polimerização
o antígeno,
N-terminaisemdas
ativarclasses
o complemento
cadeias
específicas
L e eHpro-
(os
de SERINO PROTEASES
deias associam-se para formar domínios cuja fun
• As serino proteases são definidas por um mecanis
mo catalítico comum com resíduos de aminoácidos
essenciais catalíticos idênticos.
• As serino proteases tipo-tripsina têm duas dobras
domínios VL–VH) possuem uma região de alça hi- em b-barril, compreendendo a unidade catalítica
348 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

com os resíduos do sítio catalítico na fenda inter um sítio heme para outros sítios heme na estrutura
domínio. Por evolução convergente, outras famílias quaternária.
de serino proteases evoluíram com uma estrutura
• Prótons e moléculas de 2,3-bisfosfoglicerato que se
terciária não-homóloga, mas com um mecanismo
dissociam da hemoglobina à medida que ela muda
catalítico idêntico ao das proteases na família tipo da conformação desoxi- para a oxi-regulam o equi
-tripsina.
líbrio da associação-dissociação de oxigênio por
• AA expecificidadeexpecificidade dede substratosubstrato parapara diferentesdiferentes subs-subs meio de alterações em suas concentrações.
tratos fisiológicos entre as proteases da família da
• A hemoglobina sequestra NO para entregar para a
tripsina é determinada pelas regiões de alça das
parede do capilar na conversão para a conforma
estruturas em dobras, que permite interações de
ção desoxi.
sítio secundário com os substratos polipeptídicos.
ESTRUTURA DA LÂMINA BASAL
• Proteases catalizam reações pela estabilização da
estrutura tetraédica e oxiânion do estado de tran • A lâmina basal é um complexo estrutural extra
sição hidrolítico. celular molecularmente organizado, composto de
As serino proteases são geralmente sintetizadas múltiplas subunidades proteicas, com um núcleo in
•
terativo que consiste de colágeno tipo IV, laminina,
como zimogênios, ativadas por uma protease a
nidogênio/entactina e heparam sulfato perlecam.
montante em uma cascata de enzimas, e inibidas
por inibidores proteicos conhecidos como serpinas. • As proteínas da lâmina basal estão presentes em
diferentes isoformas, e as isoformas expressas em
HEMOGLOBINA E MIOGLOBINA um tecido em particular são características do te
• As cadeias da hemoglobina e da mioglobina têm es cido que sintetiza sua membrana basal associada.
truturas dobradas idênticas. Laminina e colágeno tipo IV se autopolimerizam,
•
• Um grupo prostético heme é parte do sítio de liga formando redes moleculares definidas, com sítios
ção de O2 nas cadeias de globinas da hemoglobina de ligação para coproteínas e para proteínas recep
e da mioglobina. toras celulares.
• A hemoglobina tem uma estrutura quaternária • A laminina da lâmina basal fica interconectada
com quatro unidades heme que ligam oxigênio com o citoesqueleto intracelular das células vi
com cooperatividade positiva por meio de mudan zinhas nos sítios receptores de adesão focal das
ças conformacionais na subunidade transferida de membranas plasmáticas celulares.

As hemoglobinas oferecem exemplos de proteínas

9.1 INTRODUÇÃO
Os fundamentos da arquitetura de proteínas foram
apresentados no Capítulo 3. Este capítulo discute as
relações entre estrutura e função em três famílias de
proteínas: imunoglobulinas, serino proteases e hemo
globinas, pelo exame da sequência de aminoácidos, da
organização estrutural e da função biológica. A orga
nização das proteínas que formam a membrana basal
da matriz extracelular que circunda células e tecidos
também é descrita.
As imunoglobulinas são exemplos de arquitetura
em multidomínios, que permite reconhecimento e liga
ção com moléculas exógenas e leva ao seu sequestro. A
diversidade entre os membros da família é a fonte do
reconhecimento específico das capacidades de ligação
molecular e individual.
As serino proteases constituem exemplos de en
zimas que parecem ter divergido por evolução para
executarem funções fisiológicas singulares, frequen
temente em cascatas enzimáticas muito organizadas.
Similaridades em seus mecanismos catalíticos e estru
turas tridimensionais são pontos comuns.
muito bem afinadas, que simultaneamente executam
múltiplas funções fisiológicas muito controladas. Elas
podem acomodar pequenas substituições ou mutações,
muitas das quais com implicações clínicas, e ainda man
ter suas funções fisiológicas. Revelam a diversidade de
substituições na sequência de aminoácidos que podem
ser estruturalmente toleradas e permitir que a proteína
funcione. A hemoglobina demonstra, em nível atômico,
como uma proteína desempenha múltiplas funções fi
siológicas de forma regulada.
A membrana basal é um complexo proteico extra
celular formado por proteínas secretadas por células
que se ligam entre si para formar uma rede molecular
no espaço extracelular, que estabelece os limites e o
ambiente regulatório das células e dos tecidos. Fornece
um exemplo de uma rede complexa composta por múlti
plas subunidades proteicas diferentes, que espontanea
mente se associam em um arranjo molecular específico.
Tais redes proteicas permitem funções essenciais intra
celulares, bem como extracelulares.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 349

9.2 MOLÉCULAS DE comum de imunoglobulinas, IgG, as cadeias H contêm

aproximadamente 440 aminoácidos (50 kDa). As ca
ANTICORPOS: deias L contêm cerca de 220 aminoácidos (25 kDa). As
quatro cadeias são covalentemente interconectadas por
A SUPERFAMÍLIA pontes dissulfeto (Figuras 9.1 e 9.2). Cada cadeia H é
DE PROTEÍNAS associada a uma cadeia L, de modo que as extremida
des NH2-terminais de ambas as cadeias ficam próximas
IMUNOGLOBULINAS uma da outra. A cadeia L tem a metade do tamanho da
cadeia H e só a metade NH2-terminal da cadeia H é as
As moléculas de anticorpos são produzidas por lin
sociada com a cadeia L.
fócitos, em resposta a compostos estranhos, que podem
ser proteínas, polímeros complexos de carboidratos, ou
ácidos nucleicos. Elas se associam não-covalentemente
com os compostos estranhos presentes na capa proteica Regiões variáveis (V)
de vírus invasores e células bacterianas, iniciando um NH2 NH2
processo pelo qual o organismo invasor é eliminado. As NH2 NH2
VH VH
moléculas que induzem a produção de anticorpos são
chamadas antígenos e podem conter múltiplos deter
VL VL
minantes antigênicos ou epitopos, pequenas regiões da CH1 CH1
molécula de antígeno que induzem a produção de um
Cadeia
anticorpo específico ao qual o antígeno se liga. Em pro leve
CL CL
S S SS
teínas, por exemplo, um determinante antigênico pode C S S C
O O
compreender apenas seis ou sete resíduos de aminoáci O S S O
H H
dos, e uma única proteína pode conter muitos determi CH2 CH2

nantes antigênicos.
Cadeia
Regiões
Um hapteno é uma molécula pequena que não é pesada constantes (C)
capaz, sozinha, de induzir a produção de anticorpos CH3 CH

específicos, mas quando covalentemente ligada a uma

C C 3
molécula maior, age como um determinante antigênico O O
O O
e induz a síntese de anticorpo. Embora os haptenos pre H H

cisem estar ligados a uma molécula maior para induzi

rem a síntese de anticorpo, em seu estado livre ligam-se
fortemente ao anticorpo.
Cada ser humano pode, potencialmente, produzir
cerca de 1 × 108 diferentes estruturas de anticorpos.
Todos os anticorpos, entretanto, têm estruturas gerais
semelhantes. Isso foi determinado a partir de estudos
de suas sequências de aminoácidos e de difração de
raios-X da molécula de anticorpo sozinha ou em com
plexo com o antígeno. Os estudos estruturais requerem
preparações homogêneas puras de proteínas. Os anti
corpos são extremamente difíceis de purificar a partir
do plasma, em virtude da presença de milhares de mo
léculas diferentes de anticorpos. Anticorpos homogêne
os podem ser obtidos, porém, pela técnica de hibridoma
monoclonal, na qual células de mieloma de camundongo
são fundidas com linfócitos B de camundongo, produto
res de anticorpos, para construir células de hibridoma
imortalizadas, que expressam um único anticorpo.
Moléculas de Anticorpos Contêm
Quatro Cadeias Polipeptídicas
As moléculas de anticorpo são glicoproteínas com
postas por duas cadeias leves (L), de sequências idên
ticas, combinadas com duas cadeias pesadas (H) idên
ticas, para formar a estrutura (LH)2. Na classe mais
FIGURA 9.1 Representação linear de molécula de
anticorpo IgG.
Duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) são coorien
tadas paralelamente uma em relação à outra. Pontes dissulfeto
intercadeias ligam cadeias H entre si, e ligam cadeias L com
cadeias H. As repetições de dobra Ig na região constante (C)
da cadeia H são CH1, CH2 e CH3. A região constante da cadeia
L é designada por CL, e as regiões variáveis (V) são VH e VL das
cadeias H e L, respectivamente.
Baseado em figura de Burton, D. R. Em Calabi, F. e Neuberger,
M. S. (Eds), Molecular genetics of Immunoglobulin. Amster
dam: Elsevier, 1978,1.
Nas outras classes de imunoglobulinas (Tabela 9.1),
as cadeias H são um pouco mais longas do que na classe
IgG. Uma quantidade variável de carboidratos (2–12%,
dependendo da classe) é ligada à cadeia H.
Regiões Constantes e Variáveis da
Estrutura Primária
Comparação de sequências de aminoácidos de molé
culas de anticorpos induzidos por antígenos diferentes
mostram regiões com homologia de sequência e outras
com variabilidade de sequência. Em particular, sequên
cias da metade NH2-terminal das cadeias L e a quarta
parte NH2-terminal das cadeias H são muito variáveis.
Estas são as regiões variáveis (V) designadas VH e VL
das cadeias H e L, respectivamente. Nessas regiões V,
certas subregiões são hipervariáveis. Três regiões hi
350 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

NH2 – terminal sítio de ligação ao antígeno tridimen

sional, complementar à topologia do
doligação
antígeno VL VL antígeno.
Sítio de Sítio de
Cadeia
ligação
leve
do antígeno Diferentemente, os três quartos
CL COOH-terminais das cadeias H e a
CL
metade COOH-terminal das cadeias
S S L são homólogos em sequência com
VH S S VH
outras cadeias H e L da mesma clas
SS S
S S S se. Essas regiões constantes (C) são
Cadeia S S designadas por CH e CL nas cadeia H
pesada
CH1 CH 1 e L, respectivamente.
Papaína quebra As regiões CH determinam a clas
S S
Região de articulação
Papaína quebra S S se do anticorpo, possibilitam a liga
ção de proteínas do complemento
(Correlação Clínica 9.1) e contêm o
sítio necessário para que anticorpos
atravessem a membrana placentária.
CH2 S S S S CH As regiões V determinam a especifi
Região
variável cidade a antígeno do anticorpo.
Região
constante

Região Imunoglobulinas de
determinante de
complementariedade uma Classe Contêm
3 S S S S 2
CH CH3
Regiões CH Homólogas
As diferenças em sequência das
regiões CH entre classes de imuno
globulinas determinam as caracte
COOHCOOH terminal
rísticas de cada classe. Em algumas
FIGURA 9.2 Estrutura diagramática de IgG. classes, a sequência CH promove
As cadeias leves (L) são divididas em dobras Ig VL (sequência variável de aminoácidos) polimerização de moléculas com a
e CL (sequência constante de aminoácidos). As cadeias pesadas (H) são divididas em estrutura básica (LH)2. Assim, anti
VH e CH1, CH2 e CH3. Os sítios de ligação de antígeno são VH–VL. Os polipeptídeos de corpos da classe IgA estão frequen
articulação (hinge) interconectam domínios. As posições de ligações cistina inter e temente presentes como estruturas
intracadeia são mostradas. diméricas [(LH)2]2. Do mesmo modo,
De Cantor, C. R. e Schimmel, P. R. Biophysical Chemistry. Parte I. San Francisco:
moléculas de IgM são comumente
Freeman, 1980. Reproduzido com permissão de Sr. Irving Geis, New York.
pentâmeros [(LH)2]5. As diferentes
pervariáveis de cinco a sete resíduos em VL e três ou cadeias H, que são identificadas por suas sequências
quatro regiões hipervariáveis, de seis a 17 resíduos, no homólogas de aminoácidos, são designadas por g, a, d,
domínio VH são comuns. Essas são as regiões determi- e e m, e ocorrem nas classes IgG, IgA, IgM, IgD e IgE,
nantes da complementaridade (CDRs), que formam o respectivamente (Tabela 9.1; Correlação Clínica 9.2).

TABELA 9.1 Classes de Imunoglobulinas

Concentração no
Classes de Massa Molecular Carboidrato por
Imunoglobulina Aproximada Isotipo de Cadeia H Peso (%) (mg 100mL
Soro –1)

IgG 150.000 g, 53.000 2–3 600–1.800

IgA 170.000–720.000a a, 64.000 7–12 90–420

IgD 160.000 d, 58.000 0,3–40

IgE 190.000 e, 75.000 10–12 0,01–0,10
IgM 950.000 a m, 70.000 10–12 50–190
aFormas de estruturas do polímero de unidade estrutural básica.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 9.1
As Proteínas do Complemento
O sistema do complemento consiste de pelo menos
30 proteínas do complemento distintas no plasma (ver
p. 1006 para suas designações). Essas proteínas par
ticipam de uma cascata bioquímica que atua na eli
minação de patógenos e materiais estranhos de um
organismo. Três vias distintas (vias clássica, da lecti
na e alternativa, ver figura) utilizam diferentes sinais
iniciais para ativar o sistema do complemento. As três
vias convergem no fator C3 para formar os fragmentos
de proteína C3a e C3b, que promovem os eventos de
ativação.
Muitas das proteínas do complemento são precurso
resinativos ou zimogênios de enzimas serino proteases.
Na ativação, elas ativam a proteína seguinte da via pela
clivagem de uma ligação peptídica específica na proteí
na substrato, fazendo que se torne uma serino protease
ativa. A ativação por hidrólise de uma ligação peptídica
específica é um método importante para a ativação de
proteases extracelulares. Por exemplo, as enzimas seri
no proteases que catalisam a formação do coágulo san
guíneo, a fibrinólise de coágulos de sangue e a digestão
de proteínas da dieta no intestino são ativadas princi
palmente por proteases específicas a montante (p. 1007
e 1057). Essas vias de ativações sucessivas de protease
constituem cascatas nas quais ocorre amplificação do
eventos desencadeante.
A via clássica é iniciada pela ligação dos anticorpos
IgG ou IgM a antígenos na superfície externa de células
bacterianas invasoras, protozoários ou células tumo
rais. Na ligação a um antígeno celular, o sítio de ligação
de complemento da região Fc do anticorpo é exposta,
como resultado de uma mudança conformacional. Isso
permite a ligação das proteínas C1 do complemento ao
anticorpo ligado à superfície celular. O complexo C1 é
composto pelas proteínas C1q, C1r e C1s. As proteínas
C1r e C1s do complexo sofrem uma mudança confor
macional e tornam-se enzimas serino proteases ativas
na superfície celular. O complexo C1 ativado (C1a) hi
drolisa uma ligação peptídica em C2 e C4, e então se
associa também com a superfície celular. O complexo
agora proteoliticamente ativo C2a—C4b é a convertase
C3 da via clássica (figura, complexo 5) e hidrolisa uma
ligação peptídica em C3 para produzir os produtos C3a
e C3b. C3a é uma anafilatoxina que causa a ativação
de plaquetas e neutrófilos, degranulação de mastócitos
e aumento da permeabilidade vascular para facilitar o
recrutamento de células inflamatórias. C3b liga-se à su
perfície da célula alvo e o complexo C2—C4—C3b ati
vado hidrolisa proteoliticamente C5 para produzir C5a
e C5b. C5b ativada associa-se com C6, C7, C8 e múlti
plas moléculas de C9, que se ligam à superfície celular
bacteriana e iniciam a lise da membrana.
• 351
IgG ou IgM Clq, Clr, Cls Cla C2, C4
C4b• C2aC3
C4b • C2a • C3b C5, C6, C7, C8, C9
lise
(A linha acima designa protease ativa). Além disso,
a membrana da célula alvo ligada a C5b tem atividade
de opsonização e imuno aderência, promovendo a des
truição da célula alvo por células fagocíticas. O produto
C5a com C3a contribui para a inflamação.
A via alternativa pode ser ativada por polissacarí
deos de microrganismos invasores, na ausência de um
anticorpo específico, ou por agregados de IgA. A via al
ternativa envolve properdina e fator D. O fator D cliva
proteolicamente B em produtos Ba e Bb, que na super
fície da célula alvo se ligam ao C3, e C3 nesse comple
xo hidrolisa autocataliticamente uma ligação peptídica
para produzir C3a e C3b. C3b combina-se com Bb para
produzir uma C3 convertase, diferente da convertase
formada na via clássica, que age mais sobre moléculas
de C3 no sangue para produzir quantidades aumenta
das de C3a e C3b (ver figura, via 3).
A via da lectina é ativada pela opsonina, uma lectina
que liga manose (MBL), que se liga a polissacarídeos de
manose na suprefície do microrganismo invasor. A MBL
da superfície celular então se liga às serino proteases
MBL-associadas MASP-1 e MASP-2. Esse complexo é
semelhante ao complexo C1 da via clássica e cliva C4 no
complexo C2—C4 para produzir C4b, que converte C3
em C3a e C3b (figura, via 2).
Proteases extrínsicas liberadas de leucócitos ou ati
vadas por outras vias também podem ativar o sistema
complemento independentemente dos complexos con
vertases (figura, via 4).
Anormalidades no sistema do complemento po
dem resultar em doenças inflamatórias, infecções
por patógenos recorrentes, doenças autoimunes in
cluindo artrite reumatoide, lesão glomerular e doen
ças oculares como uveíte e degeneração macular. O
complemento desempenha um papel na isquemia e
em doenças cardiovasculares, e no transplante de ór
gãos e de tecidos.
Markiewski, M. M. e Lambris, J. D. The role of comple
ment in inflammatory diseases from behind the scenes into
spotlight. Am. J. Pathology 171:715, 2007; Okroj, M., Hei
negård, D., Holmdahl, R e Blom, A. M. Rheumatoid arthritis
and the complement system. Ann. Med. 39:517, 2007; e Zip
-fel, P. F., Mihlan, M. e Skerka, C. The alternative pathway of
complement: a pattern recognition system. Adv. Exp. Med.
Biol. 598:80, 2007.
352 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

CLÁSSICA (1) LECTINA (2) ALTERNATIVA (3)

Iniciada pelo complexo atígeno-anticorpo Iniciada por estruturas de carboidratos Iniciada por estruturas estrangeiras da superfície celular
C1q se liga ao anticorpo associados ao petógeno: MBL/ficolinas. Ligados à superfície: C3/C3H2
B O→C3a +C3b
Proteases associadas com C1q: C1r e C1s Proteases associadas: MASP1, MASP2 →Ba +Bb

ação da
protease D
C4→ C4b+C2a
C4 C2→ C2a+ C2b
Properdina
C3b Bb
C2 (6)
C4b C2a C3 convertase

(5)
C3 convertase
Proteases extrínsicas (4):
C3 Elastase, Trombina,
C3a Calicreína

C3b+C4b,C2a
C5 convertase (7)
Lise de bactéria
(9)
C5a
C6, C7, C8, Complexo de
Inflamação C5b (C9)n ataque a membrana
C5
(8)

Vias da Ativação do Complemento. As três vias são a invasora (9). Esquema de cores: resultados, vermelho; ati
clássica (1), da lectina (2) e alternativa (3). Adicionalmen vadores, marrom; enzimas proteolíticas, laranja; substratos
te, proteases extrínsicas (4) podem ativar o sistema com proteicos inertes, azul.
plemento. A clássica C3 convertase (5) é gerada por ambas
as vias clássica e lectina, enquanto um complexo C3 conver
tase diferente (6) é formado na via alternativa. O produto
Redesenhado de Markiewski, M. M. e Lambris, J. D. Am.
C3b participa no complexo C5 convertase (7). Os resultados
J. Pathology 171:715, 2007.
das vias convertase são inflamação (8) e lise da bactéria

CORRELAÇÃO CLÍNICA 9.2

Funções de Diferentes Classes de Anticorpos

A classe IgA de imunoglobulinas é encontrada, pri
mariamente, em secreções mucosas (brônquica, na
sal, e secreções mucosas intestinais, lágrimas, leite e
colostro). Eles são a defesa inicial contra a invasão de
patógenos virais e bacterianos, antes de sua entrada no
plasma ou outro espaço interno.
A classe IgM é encontrada somente no plasma. São
os primeiros anticorpos induzidos em quantidades
significativas na exposição a um novo antígeno estra
nho. Eles promovem a fagocitose de microrganismos
por macrófagos e leucócitos polimorfonucleares, e
também são potentes ativadores do complemento (ver
Correlação Clínica 9.1). Eles ocorrem em muitas se
creções externas, mas em níveis menores do que os
de IgA.
A classe IgG ocorre em alta concentração no plas
ma. Sua síntese em resposta a antígenos estranhos de
mora um período de tempo mais longo do que o de IgM.
Em concentração máxima, estão presentes em concen
tração significativamente mais alta do que IgM. Como
IgM, os anticorpos IgG promovem fagocitose no plasma
e ativam complemento.
As funções biológicas normais das classes IgD e IgE
não são conhecidas; contudo, IgE desempenha um pa
pel importante em respostas alérgicas, como choque
anafilático, febre do feno e asma.
A deficiência de imunoglobulinas geralmente causa
susceptibilidade aumentada a infecções. Agamaglobu
linemia ligada ao X e imunodeficiência variável comum
são exemplos. A doença mais comum é a deficiência se
letiva de IgA, que resulta em infecções recorrentes dos
seios da face e do trato respiratório.
Cerutti, A., Qiao, X., e He, B. Plasmocytoid dendritic
cells and the regulation of immunoglobulin heavy chain
class switching. Immunology and Cell Biol. 83:554, 2005;
Rosen, F. S., Cooper, M. D. e Wedgewood, R. J. P. The pri
mary immunodeficiences. N. Engl. J. Med. 333:431, 1995;
e Wines, B. D., e Hogarth, P. M. IgA receptors in health and
disease. Tissue Antigens 68:103, 2006.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 9.3
Imunização
Uma vacina para imunização consiste de células
bacterianas mortas, vírus inativados, parasitas mor
tos, formas não-virulentas de bactérias vivas, toxinas
bacterianas desnaturadas ou proteínas recombinan
tes. A introdução de uma vacina em um ser humano
leva à proteção contra uma forma virulenta de mi
crorganismos ou agentes tóxicos que contêm o mes
mo antígeno. Antígenos em material não-virulento
causam diferenciação de células linfoides, de modo
que produzam anticorpos contra o antígeno estranho,
e diferenciação de algumas células linfoides em célu
las de memória. As células de memória não secretam
anticorpos, mas colocam anticorpos contra o antíge
no em sua superfície externa, onde atuam como fu
turos sensores para o antígeno. Essas células de me
mória são radares de longa duração para o antígeno
potencialmente virulento. Quando da reapresentação
do antígeno, mais tarde, a ligação do antígeno com
o anticorpo da superfície celular das células de me
mória estimula tais células a se dividirem em células
produtoras de anticorpos e novas células de memó
ria. Uma vez que ocorra a introdução de um antígeno,
as células de memória reduzem o tempo necessário
Dois tipos de sequências de cadeias L são sintetizados,
designados por lambda (l) e kappa (k), cada uma das
quais é encontrada combinada com cada uma das cinco
classes de cadeias H.
IgG é a principal imunoglobulina do plasma. A bios
síntese de uma IgG específica em concentrações signifi
cativas leva cerca de 10 dias após a exposição a um novo
antígeno (Correlação Clínina 9.3). Anticorpos da classe
IgM são sintetizados mais rapidamente e são a primeira
linha de defesa, até que grandes quantidades de IgG se
jam produzidas (Figura 9.3).
o
pr
o regiões CH (designadas CH1, CH2 e CH3) (Figuras 9.1 e
ict
n
a (escalog
IgG
e
d repetição contém uma ponte dissulfeto intracadeia (Fi
o
ãç IgM
ar
t )
n
ec
n
o similar de fitas-b antiparalelas conhecido como dobra
C
2 4
Semanas
Antígeno Antígeno
FIGURA 9.3 Curva de tempo de resposta de anticorpo
específico IgM e IgG a antígeno adicionado.
Baseado em uma figura de Stryer, L. Biochemistry. San Fran
cisco: Freeman, 1988, 890.
• 353
para a produção de anticorpos e aumentam as con
centrações iniciais de anticorpo antígeno-específico
produzidos. Essa é a base para a proteção fornecida
por imunização.
Vacinas introduzidas recentemente para adultos in
cluem a vacina pneumocóccica (para evitar pneumonia
induzida por Diplococcus pneumoniae), vacina con
tra hepatite B e vacina contra influenza. A composição
da última muda todo ano, para acompanhar as varia
ções antigênicas do vírus influenza.
Barouch, D. H. Challenges in the development of a HIV
1 vaccine. Nature 455:613, 2008; Benkö, S., Magyarics, M.,
Szabó, A. e Rajnavölgyi, E. Dendritic cell subtypes as prima
ry targets of vaccines: The emerging role and cross-talk of
pattern recognition receptors. Biol. Chem. 389:469, 2008;
Moscicki, A. HPV vaccines: Today and in the future. J. Ado
lescent Health 43:S26, 2008; Pejawar-Gaddy, S. e Finn, O. J.
Cancer vaccines: accomplishments and challenges. Critical
Reviews in Oncology-Hematology 67:93, 2008; e Webby, R.
J. e Sandbulte, M. R. Influenza vaccines. Frontiers in Bios
cience 13:4912, 2008.
Sequências Repetitivas e Domínios
Homólogos Tridimensionais de um
Anticorpo
Dentro de cada cadeia de uma molécula de anticor
po há um padrão repetitivo de sequências de aminoáci
dos. Para a classe IgG, o padrão repetitivo contém apro
ximadamente 110 aminoácidos, em ambas as cadeias L
e H. Essa homologia está longe de ser exata, mas está
claro que um certo número de aminoácidos coincide
exatamente no alinhamento desses segmentos. Outros
resíduos coincidentes na sequência têm cadeias laterais
não-polares ou polares semelhantes. A repetição ocor
re quatro vezes nas cadeias H, na região VH e em três
9.2). A cadeia L contém uma região VL e uma CL. Cada
gura 9.2).
Cada segmento de 110 aminoácidos tem um arranjo
6 de imunoglobulina (Figura 9.4). A dobra consiste de
sete a nove fitas polipeptídicas em duas folhas-b anti
paralelas, alinhadas face a face. A associação de duas
dobras de imunoglobulinas de diferentes cadeias for
ma domínios globulares, VL—VH e CL—CH1, entre as
cadeias H e L e, na metade C-terminal das cadeias H
os domínios CH2—CH2 e CH3—CH3 (Figura 9.2). Uma
354 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

FIGURA 9.4 Dobra de imunoglobulina.

-b
(a)pregueada.
Diagrama esquemático
As setas indicam
de dobramento
fitas de folha-b,
de umedomínio
a CL, mostrando a estrutura em folha
barra (azul) mostra a posição da ligação
cistina. As setas rosa são fitas-b no plano acima, e as setas vermelho escuro são fitas-b no plano
abaixo. (b) Esquema diagramático do arranjo (topologia) das fitas-b no motivo de dobra de
imunoglobulina. Exemplos são as regiões variável (diagrama superior) e constante (diagra
ma inferior) de IgG. As setas grossas indicam fitas-b, e linhas finas as alças que conectam as
fitas-b. Os círculos indicam cisteínas que formam ponte dissulfeto intradomínio. Os quadrados
mostram posições de resíduos de tripto
fano que são componentes invariáveis do G D F E C B C A
131
núcleo da dobra de imunoglobulina. As
letras em negrito indicam fitas que for
mam um plano da folha, enquanto outras
letras formam o plano paralelo, atrás do 161
primeiro plano.
(a) Reproduzido com permissão de Ed 190
mundson, A. B., Ely, K. R., Abola, E. E., COO – 167
Schiffer, M. e Pavagiotopoulos, N. Bio
chemistry 14:3953, 1975. Copyright ©
193
(1975) American Chemical Society.
(b) Redesenhado de Calabi, F. Em: Ca
labi, F. e Neuberger, M. S. (Eds.), Mo 144
lecular Genetics of Immunoglobulin. N
203
Amersham: Elsevier, 1987, 203. (a) 116 (b)

região de articulação (hinge) interconecta os dois do (regiões determinantes complementares, CDRs) do an

mínios N-terminais VH—CH1 com o domínio CH2—CH2
das cadeias H. Portanto, a estrutura básicado do anti
corpo apresenta seis domínios, cada domínio formado
pela interação de duas dobras de imunoglobulina (Fi
guras 9.2 e 9.5). Os domínios NH2-terminais VL—VH
contêm uma fenda rasa, no centro de um núcleo hidro
fóbico que liga o antígeno. O sítio de ligação da fenda
é composto primariamente de sequências hipervariá
veis do domínio V que estão no interior de alças que se
aproximam, e são os sítios complementares de ligação
VH
CH
tígeno (ver Figuras 9.6 e 9.7). As sequências das alças
dos domínios hipervariáveis conferem uma conforma
ção tridimensional singular para cada anticorpo, o que
o torna específico para sua especificidade antigênica.
A ligação do antígeno aos domínios VL—VH pode in
duzir pequenas alterações conformacionais nos CDRs,
induzindo alterações conformacionais funcionalmente
importantes entre os domínios VL—VH e os outros do
mínios da molécula do anticorpo, o que leva à ativação
de sítios efetores, tais como ligação do complemento ao
domínio CH2—CH2; ver sítio C1q na Figura 9.6.
A força de ligação entre o anticorpo e o antíge
no se deve a forças não-covalentes (p. 120). A
complementaridade das estruturas do determi
nante antigênico e do sítio de ligação ao antíge
no resulta em constantes de equilíbrio de afi
nidade extremamente altas, entre 105 e 1010/M
(força de 30-60 kJ/mol ou 7–14 kcal/mol) para
essa associação não-covalente.

Existem Dois Sítios de Ligação

VL
CL
Região variável Região constante
FIGURA9.5 Estrutura do carbono a (O), um fragmento N-terminal
do IgG KOL, mostrando os domínios VL—VH e CL—CH1, cada domínio
formado por duas dobras de imunoglobulinas.
Redesenhado com permissão de Huber, R., Deisenhofer, J., Coleman, P. M.,
Matsushima, M. e Palm, W. Em The Immune System, 27th Mosbach Collo
quium. Berlim: Springer-Verlag, 1976, 26.
de Antígeno por Molécula de
Anticorpo
Existem dois domínios NH2-terminais
VL—VH na estrutura básica do anticorpo (LH)2.
A existência de um sítio de ligação de antígeno
em cada par LH é demonstrada por tratamen
to das moléculas de anticorpo com a enzima
proteolítica papaína, que hidrolisa uma liga
ção peptídica na região de articulação de cada
cadeia H (ver Figuras 9.2 e 9.8), liberando três
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES
52 ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 355

Fab 1 Fab 2 fragmentos da molécula do anticorpo. Dois são idênti

cos, cada um consistindo da metade NH2-terminal da
Sítio de Sítio de cadeia H (VH—CH1), associada com a cadeia L inteira.
ligação ligação Cada um desses fragmentos liga o antígeno com uma
do Ag do Ag
afinidade semelhante à da molécula intacta e é deno
SS
minado um Fab (antigen binding fragment, fragmento
de ligação ao antígeno). O outro fragmento é a metade
Tuftsina CHO C1q COOH-terminal das duas cadeias H (CH2—CH3)2 liga
das por cistina. Esse é o Fc (fragmento cristalizável),
Prot–A Prot–A
que não liga o antígeno.—CH1 correspondente no frag
mento Fab por redução das ligações de pontes dissulfe
to; isso elimina a ligação ao antígeno. Da mesma forma,
cada sítio de ligação ao antígeno deve ser formado por
Fc
componentes de ambos os domínios das cadeias L e H,
FIGURA 9.6 Modelo de uma molécula de anticorpo IgG. agindo juntos.
Somente os carbonos a da estrutura aparecem. As duas ca
deias L são representadas por esferas cinza claro e as cadeias As principais características da estrutura do anti
H, por esferas azuis. Os carboidratos ligados aos dois domí corpo e das interações anticorpo–antígeno são: (1) se
nios CH2 são coloridos em verde e laranja. As regiões CDR dos quências homólogas repetitivas nas cadeias leves (L)
domínios VH—VL são vermelho escuro, nas cadeias H, e rosa, geram duas dobras de imunoglobulinas e, nas cadeias
nas cadeias L. A ponte dissulfeto intercadeia, entre as cadeias pesadas (H) quatro pregas de imunoglobulinas. (2)
L e H, é representada em bola-bastão magenta (parcialmente As dobras de imunoglobulinas de cadeias separadas
escondida). O heptapeptídeo de articulação entre os domínios associam-se para formar os seis domínios da estrutu
CH1 e CH2 é vermelho escuro. O centro do sítio de ligação C1q ra básica da imunoglobulina. (3) O sítio de ligação ao
no domínio CH2 é amarelo, os sítios de aportamento de prote
antígeno é gerado por alças hipervariáveis (CDRs) em
ína A na junção de CH2 e CH3 são magenta, e o sítio de ligação cada domínio VL—VH, que formam uma superfície con
de tuftsina em CH2 é cinza. Tuftsina é um tetrapeptídeo natural
que induz fagocitose por macrófagos e pode ser transportado
tínua com uma topologia complementar ao determinan
ligado a uma imunoglobulina. Proteína A é uma proteína bacte te antigênico. (4) As fortes interações entre antígeno e
riana com uma alta afinidade por imunoglobulinas. CDRs do anticorpo são não-covalentes e incluem forças
Fotografia gentilmente cedida por Dr. Allen B. Edmundson, de de van der Waals, pontes de hidrogênio, interações hi
Guddat, L. W., Shan, L., Fan, Z. C. et al. FASEB J. 9:101, 1995. drofóbicas e, em menor escala, pontes salinas iônicas.
(5) Pequenas mudanças conformacionais ocorrem no
domínio VL—VH após ligação
do antígeno, indicando um
L2(49-53) ajuste induzido que induz
H3(96-100a) H1(26-33)
26 mudanças conformacionais
53 49 27 em domínios distantes do
96 28
52 anticorpo, que alteram a afi
51 50 98
99 32
nidade de ligação dos sítios
29
Regiões 31e 31 efetores nos domínios cons
97 30
hipervariáveis tantes, como para ligação
30 32
100a 52b da proteína C1q do comple
31 33 52a
91 mento ao domínio CH2—CH2
55
29 92 96 (Correlação Clínica 9.1).
VH VL 53
28 93 54
94 56
27
58 57
Genética das
CH1 CL L3(91-96) Imunoglobulinas
(a) (b) L1(27-32) H2(52-58)
A região V das cadeias
FIGURA 9.7 Alças hipervariáveis de imunoglobulinas. L e H são especificadas por
(a) Diagrama esquemático mostrando alças hipervariáveis (CDRs) em domínio VL, —VH que for genes diferentes dos genes
ma o sítio de ligação ao antígeno. (b) Um corte através de um sítio de ligação ao antígeno, mos que codificam a região C. Há
trando contribuição de diferente CDRs, usando modelos CPK de preenchimento de espaço dos quatro genes específicos que
átomos. Os números referem-se a números de resíduos de aminoácidos na sequência das regiões
codificam o segmento poli
de alça hipervariável de cadeias leves (L) e pesadas (H).
(a) Redesenhado de Branen, C. e Tooze, J. Introduction to Protein Structure. New York: Gar
peptídico CH1—CH2—CH3
land Publishing, 1991, 187. (b) Redesenhado de Branden, C. e Tooze, J. Introduction to Protein da cadeia H da classe de an
Structure. New York: Garland Publishing, 1991, 189, e atribuído a Chothia, C. e Lesk, A. J. Mol. ticorpos IgG. Eles são conhe
Biol. 196:914, 1987. cidos como genes gama (g),
356 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Sítio de reconhecimento
do antígeno 3+NH N

Peptídeo de + H3
VH articulação VH
(hinge) NH
VL VL + H3
NH3++ N
CH1 CH1 3
3+
H
N CH2 CH2
Peptídeo
conversão
de C CL VH VH
L papaína
(switch) Ponte de dissulfeto VL VL Fc
CH2CH2 +
CH1 CH1 CH3 CH3
Carboidrato CL CL Fab

CH3 CH3 –OOC COO–

–OOC COO–

FIGURA9.8 Hidrólise de IgG em dois fragmentos Fab e um Fc por papaína, uma enzima proteolítica.

isto é, g1, g2, g3 e g4, que dão origem aos isotipos de IgG lhantes e padrão de dobras estabilizado por uma liga
IgG1, IgG2,
quências dasIgG3
trêseproteínas Figura
IgG4. A dos genes-g.
9.9 apresenta as
Há homologiase ção cistina. Mais tarde, na evolução, mais duplicações
de gênicas levaram aos múltiplos genes (g1, g2, g3 e g4), que
95% na sequência de aminoácidos entre esses genes. codificam as regiões constantes das classes IgG.

É provável que um gene primordial codificasse

a sequência de uma única dobra de imunoglobuli
na com aproximadamente 110 aminoácidos, e que
eventos de duplicação gênica tenham resultado nas
três unidades repetitivas dentro do mesmo gene g H
de IgG. Mutações modificaram as sequências indi
viduais, de modo que não existe mais uma corres
pondência exata na sequência. Entretanto, todas as
dobras de imunoglobulina têm comprimentos seme

FIGURA 9.9 Sequência de aminoácidos das regiões

constantes de cadeias pesadas de genes de cadeia
pesada de IgG g1, g2 e g4.
São apresentadas as sequências de CH1, região de articula
ção H (hinge), regiões CH2 e CH3. A sequência de g1 está
completa,
ração comea são
sequência
mostradas
g1, usando
diferenças em g2 e g4deem
abreviações uma
compa
letra

dos aminoácidos. A linha tracejada (—) indica ausência de

um aminoácido na posição correspondente com g1, com a
finalidade de melhor alinhar as sequências para mostrar a
homologia máxima.
Sequência da cadeia g1 de Ellison, J. W., Berson, B. J. e
Hood, L. E. Nucleic Acid Res. 10:4071, 1982; e sequências
dos genes g2 e g4 de Ellison, J. e Hood, L. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 79:1984, 1982.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 357

Dobra de Imunoglobulinas É 9.3 PROTEÍNAS COM UM

Encontrada em uma Grande Família MECANISMO CATALÍTICO
de Proteínas com Diferentes Papeis COMUM: SERINO
Funcionais PROTEASES
A dobra de imunoglobulina está presente em mui Serino proteases são uma família de enzimas que
tas proteínas não-imunológicas, que desempenham usam um resíduo de serina ativado de modo singular no
funções muito diferentes. Com base em sua homologia sítio de ligação ao substrato, para hidrolisar catalitica
estrutural, elas são agrupadas em uma superfamília de mente ligações peptídicas. Essa serina é caracterizada
proteínas (Figura 9.10). As proteínas do complexo prin pela reação irreversível de seu grupo hidroxila de ca
cipal de histocompatibilidade da Classe I estão nessa deia lateral com diisopropilfluorofosfato (DFP) (Figu
superfamília; elas têm dobras de imunoglobulinas como ra 9.11). De todas as serinas da proteína, DFP reage só
as de moléculas de anticorpos, que consistem de duas com a serina cataliticamente ativa para formar um éster
folhas-b antiparalelas empilhadas, delimitando um es de fosfato.
paço interno, preenchido principalmente por aminoáci
dos hidrofóbicos. Duas cisteínas da estrutura formam
uma ponte dissulfeto que liga as folhas-b de frente uma Enzimas Proteolíticas São
para a outra. Os fatores de transcrição NF-kb e p53
também contêm um motivo em dobra de imunoglobuli Classificadas por seu Mecanismo
na. Pode-se especular que a duplicação gênica durante
Catalítico
a evolução tenha levado à distribuição do motivo estru
tural de dobra de imunoglobulina em proteínas funcio As enzimas proteolíticas são classificadas de acordo
nalmente diferentes. com seu mecanismo catalítico. Além das serino protea
ses, outras classes utilizam cisteína (cisteíno protea
ses), aspartato (aspartato proteases) ou íons metálicos
(metaloproteases) para realizar sua função catalítica.
Aquelas que hidrolisam ligações peptídicas no interior
de um polipeptídeo são endopeptidases, e aquelas que
quebram a ligação peptídica de aminoácidos COOH- ou
NH2-terminais são exopeptidases.
L H LH
ss ss
v ss
v v ss
v FIGURA9.10 Representação
ss ss
diagramática da estrutura em dobra
c c c c
ss ss de imunoglobulinas encontradas em
Hinge ss s
ss vss v v s s s diferentes proteínas da superfamília de
c ss c ? s s genes imunoglobulina.
c ssss c c ss cssssc c s
ss ss As proteínas apresentadas incluem cadeias
c ss
c s c
pesada e leve de imunoglobulinas, recep
tores de células-T, proteínas da Classe I e
da Classe II do complexo principal de his
Pesada Leve β α γ Classe I β2 – m β α tocompatibilidade (MHC), proteínas aces
(κ,λ)
sórias de células-T envolvidas em reconhe
Imunoglobulinas Receptores de células T MHC Classe I MHC Classe II
ss
cimento de MHC da Classe I (CD8) e da
? Classe II (CD4) e possível formação de ca
s
s
s s nais iônicos, um receptor responsável pelo
s s
s s sss transporte de certas classes de imunoglo
s
ss
bulinas através de membranas das mucosas
s s
s (poli-Ig), b2-microglobulina, que se associa
s
s s com moléculas da classe I, uma proteína
s s
s
v s
plasmática humana com função desconhe
s
s s s cida (a1/b-glicoproteína), duas moléculas
s s s
s s s v s ss v ss de função desconhecida com uma distribui
s s
s v
s ção tissular que inclui linfócitos e neurônios
s s s
cs ss
s s s (Thy-1, Ox-2) e duas moléculas cérebro
ss s s
-específicas, molécula de adesão neuronal
(N-CAM) e proteína 3 neurocitoplasmática
(NCP3).
Thy 1 Glicoproteína
α 1/β poly Ig NCP3 N-CAM OX-2 (L3T4)
CD4 CD8 T3ε T3δ Redesenhado de Hunkapiller, T. e Hood, L.
(Lyt2,3) Nature 323:15, 1986.
358 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
CH
H3
H3C
HC C O O
P
F O CH3
+ Enzima
FIGURA9.11 Reação de diisopropilfluorofosfato (DFP) com a serina do sítio ativo em uma serino protease.
As serino proteases frequentemente ativam outras
serino proteases a partir de sua forma precursora ina
tiva, chamada zimogênio, por clivagem de uma ligação
peptídica específica. Esse mecanismo de ativação de
zimogênio permite às serino proteases participarem
de processos fisiológicos cuidadosamente controlados
como coagulação do sangue (Correlação Clínica 9.4),
fibrinólise, ativação do complemento (ver Correlação
Clínica 9.1), fecundação e produção de hormônios (Ta
bela 9.2). As ativações de serino proteases são exem
CORRELAÇÃO CLÍNICA 9.4
Formação de Fibrina em um Infarto do Miocárdio e Uso de Ativador de Plasminogênio Tecidual Recombi
nante (rt-PA)
A coagulação do sangue resulta de um processo en
zimático em cascata, no qual precursores inativos de
serino proteases (zimogênios) são ativados por outras
serino proteases, num processo passo a passo (a via
da coagulação é descrita no Capítulo 22). Esses even
tos de ativação geram produtos catalíticos produzin
do uma drástica amplificação do sinal inicial da via.
O produto final da via da coagulação é um coágulo de
fibrina com ligações cruzadas. Os componentes zimo
gênios incluem fator II (protrombina), fator VII (pró
-convertina), fator IX (fator Christmas), fator X (fator
de Stuart), fator XI (antecedente da tromboplastina
plasmática) e fator XII (fator de Hageman). A designa
ção por numeral romano indica a ordem de sua desco
berta, e não sua ordem de ação na via. Após a ativação,
as enzimas são denotadas com o sufixo “a”. Assim, a
protrombina é denotada como fator II, e o fator trom
bina cataliticamente ativo como IIa.
A função principal da coagulação é manter a in
tegridade do sistema circulatório fechado após lesão
no vaso sanguíneo. O processo, entretanto, pode ser
perigosamente ativado em um infarto do miocárdio,
resultando em diminuição do fluxo sanguíneo para
o músculo cardíaco. Cerca de 1,2 milhão de indiví
duos sofrem ataques cardíacos por ano nos Estados
H3
H3C O
Ser OH HCOPO
C C CH3
H
CH3
Enzima Ser
plos de proteólise limitada porque apenas uma ou duas
ligações peptídicas específicas, dentre as centenas da
proteína substrato, são hidrolisadas. Em condições de
desnaturação, contudo, essas mesmas proteases hidro
lisam múltiplas ligações peptídicas que levam à digestão
de peptídeos, proteínas, e até a autodigestão (autólise).
Acredita-se que várias doenças como enfisema, artrite,
trombose, metástase no câncer (Correlação Clínica 9.5)
e algumas formas de hemofilia resultem da falta de re
gulação de serino proteases específicas.
Unidos, o que resulta em aproximadamente 500.000
mortes.
Uma via fibrinolítica no plasma degrada os coágulos
de fibrina formados. A via contrária também utiliza seri
no proteases ativadas a partir de zimogênios. A reação
final da via fibrinolítica é a formação de plasmina, uma
serino protease que age diretamente sobre a fibrina para
degradar o coágulo de fibrina. O ativador de plasmino
gênio tecidual (t-PA) é um ativador de plasminogênio
(zimogênio da plasmina). O t-PA recombinante (rt-PA)
é produzido pela tecnologia de clonagem gênica (p. 274).
Estudos clínicos mostram que a administração de rt-PA
logo após um infarto do miocárdio melhora significativa
mente a recuperação. Ativadores de plasminogênio como
uroquinase e estreptoquinase também são eficazes.
Os investigadores do GUSTO (autores). An international
randomized trial comparing four thrombolytic strategies for
acute myocardial infartation. N. Engl. J. Med. 329:673, 1993;
Grotta, J. e Marler, J. Intravenous rt-PA: A tenth anniversa
ry reflection. Surgical Neurology 68:S12, 2007; Khaja, A.
M. e Grotta, J. C. Established treatments for acute ischaemic
stroke. Lancet 369:319, 2007; e Simpson, D., Siddiqui, M. A.,
Scott, L. J. e Hilleman, D. E. Reteplase: A review of its use in
the management of thrombotic occlusion disorders. Am. J.
Cardiovascular Drugs 6:265, 2006.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 359

TABELA 9.2 Algumas Serino Proteases e Suas Funções Bioquímicas e Fisiológicas

Doença Possível Decorrente
Protease Ação
de Deficiência ou Disfunção
Calicreína plasmática Coagulação (ver Correlação Infarto cerebral (AVC), infarto
Clínica 9.4) coronariano, trombose,
Fator XIIa doenças hemorrágicas
Fator XIa
Fator IXa
Fator VIIa
Fator Xa
Fator IIa (trombina)
Proteína C ativa

Fator C1r Complemento (ver Correlação Infecções por patógenos,

Clínica 9.1) inflamação, artrite
Fator C1s reumatoide, doença autoimune
Fator D
Fator B
C3 convertase

Tripsina Digestão Pancreatite, doenças

digestivas
Quimotripsina
Elastase (pancreática)
Enteropeptidase

Ativador de plasminogênio uroquinase Fibrinólise, migração celular, Doenças da coagulação,

embriogênese, menstruação metástase tumoral
Ativador de plasminogênio tipo tecidual (ver Correlação Clínica 9.5)
Plasmina

Calicreínas tissulares Ativação hormonal

Acrosina Fecundação Esterilidade

Subunidade a do fator de crescimento neuronal Ativação do fator de

crescimento
Subunidade g do fator de crescimento neuronal

Elastase de granulócito Proteína extracelular e Inflamação, reposta alérgica

degradação de peptídeos,
Catepsina G função de mastócitos
Quimases de mastócitos
Triptases de mastócitos
360 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 9.5
Envolvimento de Serino Proteases na Metástase de Células Tumorais
Acredita-se que o ativador de plasminogênio uroqui
nase, uma serino protease, seja necessário para a me
tástase de células de câncer. A metástase é o processo
pelo qual uma célula de câncer deixa um tumor primá
rio e migra, pelos sistemas sanguíneo ou linfático, para
outro tecido ou órgão, onde um tumor secundário cres
ce. A síntese aumentada do ativador de plasminogênio
tipo uroquinase (uPA) tem sido correlacionada com a
capacidade aumentada de produzir metástases em mui
tos tipos de câncer. O uPA ativa o plasminogênio, for
mando plasmina. O plasminogênio está ubiquamente
localizado no espaço extracelular e sua ativação a plas
mina pode causar degradação de proteínas na matriz
extracelular, através da qual células tumorais metastá
ticas migram. A plasmina também pode converter pró
-colagenase em colagenase, que promove a degradação
do colágeno da membrana basal que circunda os capi
lares e o sistema linfático. Essa promoção de atividade
Serino Proteases Apresentam Notável
Especificidade na Hidrólise de Ligações
Peptídicas
Muitas serino proteases preferem hidrolisar ligações
peptídicas próximas a um tipo específico de aminoáci
do. Assim, a tripsina quebra preferencialmente no lado
carboxílico dos aminoácidos básicos arginina e lisina,
e a quimotripsina quebra no lado carboxílico de resí-
duos de aminoácidos de cadeia lateral hidrofóbica gran
de, como triptofano, fenilalanina, tirosina e leucina. A
elastase quebra no lado carboxílico de resíduos hidro
fóbicos pequenos, como alanina. Uma serino protease
é tipo-tripsina, tipo-quimotripsina ou tipo-elastase se
tiver especificidade semelhante à das enzimas citadas.
A especificidade por um certo tipo de aminoácido só
indica uma preferência relativa da enzima. A tripsina
também cliva ligações peptídicas em seguida a aminoá
cidos hidrofóbicos, mas a uma velocidade muito menor
do que para os aminoácidos básicos. Portanto, a espe
cificidade de hidrólise de uma ligação peptídica pode
não ser absoluta, mas pode ser mais bem descrita como
uma faixa de alvos mais prováveis. Nem todos os sítios
de hidrólise contendo aminoácidos idênticos numa pro
teína substrato são igualmente susceptíveis. A tripsina
hidrolisa cada uma das ligações peptídicas de arginina
de uma proteína em particular com velocidades catalíti
cas diferentes, e algumas podem requerer uma mudan
ça conformacional para ficarem acessíveis.
A especificidade de serino proteases por ligações
peptídicas específicas foi determinada com substratos
sintéticos, com menos de 10 aminoácidos (Tabela 9.3).
catalítica por uPA secretada pelas células tumorais ou
estromais no ambiente de células tumorais permite que
as células tumorais degradem as proteínas da matriz
extracelular e invadam, pela matriz, formando focos de
tumores secundários.
Annecke, K., Schmitt, M., Euler, U., Zerm, M., et al. uPA
and uPAI-1 in breast cancer: Review of their clinical utility
and current validation in the prospective NNBC-3 trial. Adv.
Clinical Chemistry 45:31, 2008; Harbeck, N., Kates, R. E.,
Gauger, K., Willens, A., et al. Urokinase-type plasminogen
activator (uPA) and its inhibitor PAI-1: novel tumor-derived
factors with a high prognostic and predictive impact in breast
cancer. Thrombosis and Hemostasis 91:450, 2004; e Hilden
brand, R. e Schaaf, A. The urokinase-system in tumor tissue
cology
stroma 34:15,
of breast and breast cancer cell invasion. Int. J. On-
2009.
Como estes são significativamente menores do que os
naturais, eles interagem apenas com o sítio catalítico (sí
tio primário de ligação S1) e são ditos sítio ativo-dirigi
dos. Estudos com substratos pequenos e inibidores indi
cam que o sítio de hidrólise em substratos polipeptídicos
é flanqueado por aproximadamente quatro resíduos, em
ambas as direções, que se ligam à enzima e interferem
na reatividade da ligação hidrolisada. Os dois resíduos
do substrato que contribuem com a ligação a ser hidroli
sada são denominados por P1—P1!. Assim, nos substratos
da tripsina, o resíduo P1 será lisina ou arginina, e nos
substratos da quimotripsina o resíduo P1 será um amino
ácido hidrofóbico. A interação do resíduo P1 com o sítio
S1 permite a interação primária entre o substrato e a en
zima. Os outros resíduos de aminoácidos que interagem
da proteína substrato são chamados P4—P2 e P!2—P!4 em
cada lado da ligação susceptível, respectivamente. As
regiões complementares da enzima que se ligam a es
ses resíduos do substrato são designadas por subsítios
S4—S4! (Figura 9.12). Essas são as interações secundá
rias com o substrato, fora de S1—S!1, que determinam, em
última análise, a especificidade de uma protease por um
substrato proteico em particular. Assim, a serino prote
ase da coagulação fator Xa só quebra em uma arginina
específica da protrombina, para produzir trombina. É a
interação secundária que permite que o fator Xa reco
nheça a arginina específica que quebra na protrombina.
As interações de P4—P!4 com os subsítios S4—S!4 são não
-covalentes. O sítio de ligação estendido do substrato in
terage com o sítio de ligação da enzima para produzir
uma estrutura em folha-b entre a enzima e o substrato, o
que posiciona a ligação peptídica susceptível do substra
to na posição S1—S1! (Figura 9.13).
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 361

TABELA 9.3 Reatividade de a-Quimotripsina e Elastase Sobre Substratos de Várias Estruturas

Estrutura Variação do Grupo
S1 de Cadeia Lateral do Sítio Reatividade
(Quimotripsina) Relativaa

Glicil H— 1
Leucil H3C
H3 CH CH2 1,6 × 104
Metionil CH3 C
—S—CH2—CH2— 2,4 × 104

Fenilalanil CH 2 4,3 × 106

Hexa-hidrofenilalaninil SCH 2 8,2 × 106

Tirosil HO CH 2 3,7 × 107

CH2

Triptofanil N 4,3 × 107

Variação no comprimento da cadeia (hidrólise de

elastase de amida com Ala N-terminal)b

Ac-Ala-NH2 1
Ac-Pro-Ala-NH2 1,4 × 101
Ac-Ala-Pro-Ala-NH2 4,2 × 103
Ac-Pro-Ala-Pro-Ala-NH2 4,4 × 105
Ac-Ala-Pro-Ala-Pro-Ala-NH2 2,7 × 105
aCalculado /Km em
bCalculado a partir de valores de kcat/K encontrados
Thompson,para C. e Blout, E. R. Biochemistry
R. N-acetilaminoácido metil ésteres
12:57,
em substratos
1973. de quimotripsina.

Serino Proteases São Sintetizadas zados em células do fígado e são secretados no sangue,
para subsequente ativação, após lesão vascular, por ou
como Zimogênios e em Proteínas tras serino proteases. Os zimogênios são geralmente de
signados pela adição do sufixo -ogênio ao nome da en
com Múltiplos Domínios zima; como no tripsinogênio e no quimotripsinogênio.
As serino proteases são sintetizadas como zimogê Em alguns casos, o zimogênio é chamado pró-enzima;
nios, que requerem proteólise limitada para produzir a por exemplo, o zimogênio da trombina é protrombina.
enzima ativa. Os zimogênios da coagulação são sinteti

FIGURA9.12 Diagrama esquemático de ligação de um

substrato polipeptídico com o sítio de ligação de uma
enzima proteolítica.
S´ 3 aos
P5—P!3
subsítios
são resíduos
S5 de aminoácidos do substrato que se ligam
Enzima C
S´2 —S!3 da enzima, com a hidrólise peptídica ocor
1 S´1 P´3
S5 S4 S3 S2 S P´2 rendo entre P1—P1! (seta). A direção NH2-terminal da cadeia
P´1 polipeptídica do substrato é indicada por N, e a direção COOH
P5 P4 P3 P2 P1
-terminal por C.
Substrato Redesenhado de Polgar, L. Em: A. Neuberger e Brocleburst
N
(Eds.), Hydrolytic Enzymes. Amsterdam, Elsevier, 1987, p. 174.
362 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Asp 189
− Ser 190
O
S2 S1
O Tyr 39
O S1 S2
H Gly 193 S3
Gln 175 S3 Ser 214 H + H
Ser 195
S5 N N – Phe 41 O
N
S4 O H
Gly 216 N
O H H O H
H H
Asn 97
N O H N
H O H
N H
H H N
O H N O
O Lys 318
O Tyr 320
OH P Asn 321
O H 1
P
2 P
H N 3
N Cys 316
Thr 310 N P
3
P9 Glu 312
Ser 314
P
7 P5

FIGURA9.13 Desenho esquemático de ligação do inibidor pancreático de tripsina a tripsina.

Região do sítio de ligação da tripsina (azul) mostrada em complexo dos quais somente a Lys318 está visível).
com região do inibidor pancreático de tripsina (marrom) que mo O diagrama é baseado em difração de raios-X do complexo do
dela a ligação de um polipeptídeo substrato. Linhas tracejadas são inibidor pancreático de tripsina com tripsinogênio. A região de
pontes de hidrogênio. O inibidor tem uma conformação estendida, ligação do tripsinogênio no complexo assume uma conformação
de modo que os aminoácidos P9, P7, P5, P3 e P1—P!3 interagem com como a da tripsina ativa ligada a uma proteína substrato.
os subsítios de ligação S5—S!3 da tripsina. A ligação potencialmente Redesenhado de Bolognest, M., Gatti, B., Menegatti, E., Guar
hidrolisável do inibidor está entre P1—P!1 (aminoácidos 318 e 319, neri, M., Papamokos, E. e Huber, R. J. Mol. Biol. 162:839, 1983.

Várias serino proteases plasmáticas têm

formas zimogênio que contêm múltiplos do
mínios não-semelhantes. A proteína C, en
volvida em uma via fibrinolítica do sangue,
tem quatro domínios distintos (Figura 9.14).
O domínio NH2-terminal contém o aminoá
cido derivado ácido g-carboxiglutâmico (Fi
gura 9.15), que é formado por carboxilação
de resíduos de ácido glutâmico, em uma
reação dependente de vitamina K (p. 1010
e 1017). Os g-carboxiglutamatos quelam
Ca2+ e formam parte de um sítio que se liga
às membranas celulares. A região COOH
-terminal contém os domínios catalíticos. A
ativação a partir da forma zimogênio requer
clivagem de ligação peptídica fora dos domí
nios catalíticos e é controlada pela ligação
da extremidade NH2-terminal contendo os
g-carboxiglutamatos por meio de íons cálcio
a um sítio da membrana.

Estruturas Terciárias dos FIGURA9.14 Esquema da estrutura em domínios da proteína C

ativada, mostrando estrutura em multidomínios.
Domínios Catalíticos de GLA refere-se aos resíduos do aminoácido derivado g-carboxiglutâmico, pre
sentes no domínio GLA NH2-terminal (vermelho) onde eles atuam na ligação
Serino Proteases São a íons de cálcio (bolas vermelhas). Os domínios tipo-EGF (azul) contêm
Semelhantes dobras presentes no fator de crescimento epidérmico, e os dois domínios ca
talíticos (amarelo) compreendem a enzima protease na extremidade COOH
Serino proteases tipo-tripsina contituem -terminal da proteína.
uma superfamília de proteínas com dois do Diagrama preparado pela combinação do domínio GLA da proteína C ativada
humana (PDB 1LQV) com a estrutura da proteína C ativada sem o domínio
mínios b-barril fechados distintos da mesma
GLA (PDB 1AUT). Referências das estruturas: Oganesyan, V. et al. J. Biol.
prega e de igual tamanho (Figura 9.16), os Chem. 277:24851, 2002; e Mather, T. et al. EMBO J. 15:6822, 1996. Struc
quais não penetram um no outro. Regiões de
ture generated using SPDBV, Guex, N., e Peitsch, M. C. Electrophoresis
alças se projetam das estruturas em barril, 18:2714, 1997.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 363

sendo quase que simetricamen TABELA 9.4 Estruturas de Serino Proteases Determinadas por Cristalografia de
uma
te
alças
dois
apresentadas
região
domínios
se combinam cada
para um
de superfície
por
dobrados. que
formar
Essas
dos
se Raios-X
EspéciedeOrigem InibidoresPresentes Resolução (Å)
Enzima

tura Quimotripsinaa Bovina Simb 1,67c

estende
catalítico,
similares
bulinas.
por para
Determinações
cristalografia
aos
e são
CDRs
fora,funcionalmente
acima
das de
imunoglo-
dedo
raios-X
estru-
sítio
Quimotripsinogênio Bovina Não 2,5
Elastase Suína Sim 2,5

foram feitas para muitos membros Calicreína Suína Sim 2,05

da família de proteínas serino pro
Proteinase A S. griseus Não 1,5
teases tipo-tripsina (Tabela 9.4),
incluindo formas enzimáticas ati Proteinase B S. griseus Sim 1,8
vas, zimogênios, a mesma enzima
Proteinase II Rato Não 1,9
em múltiplas espécies, complexos
ras
enzima-inibidor,
pecífica
e emem e uma
diferentes
diferentes
solventes.
temperatu-
enzima es- Tripsinaa Bovina Simb 1,4c
Tripsinogênioa Bovina Simb 1,65c
aA estrutura dessa molécula de enzima foi determinada independentemente por dois ou mais pes
quisadores.
bEstrutura obtida sem inibidor presente (estrutura nativa) e com inibidores. Os inibidores usados in
–OOC CHCOO– cluem inibidores de baixo peso molecular (i.e., benzamidina, DFP e tosil) e inibidores proteicos (i.e.,

CH2
CH
inibidor pancreático bovino de tripsina).
cMais alta resolução para essa molécula, das múltiplas determinações.

dimensionais e o número dos que são quimicamente

–OOC
+
NH3
idênticos na comparação das sequências. Os aminoáci
dos estruturalmente superponíveis, mesmo que sejam
quimicamente diferentes, não podem ser diferenciados
FIGURA 9.15 Estrutura do aminoá
cido derivado ácido g-carboxiglutâ entre si com a resolução da difração de raios-X. As pro
mico (abreviatura Gla), encontrado teínas são mais homólogas em suas estruturas do que
no domínio NH2-terminal de muitas na sequência. As regiões de maior diferença estão nas
proteínas da coagulação. regiões de alça tipo-CDR. Alteração nessas alças altera
a especificidade de ligação macromolecular da pro
O alinhamento das estruturas tridimensionais tease. A estrutura da alça no fator Xa, por exemplo, per
pode ser realizado para serino proteases. A Tabela 9.5 mite que se ligue especificamente à protrombina. Inibi
mostra, para grupos de duas proteases, o número dos dores de proteases interagem com diferentes proteases
aminoácidos que são superponíveis nas estruturas tri por sua afinidade pelas estruturas das alças. Proteases
bacterianas parecidas com a família
Domínio das serino proteases eucarióticas
2 contêm os mesmos dois domínios,
Domínio mas não têm a maioria das alças.
1
Isso concorda com sua falta de uma
exigência de interações complexas e
a observação de que proteases bac
terianas não são sintetizadas como
zimogênios.

A Ser-195 da quimotripsina reage

1
Domínio
com o inibidor diisopropilfluorofos
Domínio fato (DFP), com uma estoiquiome
2 tria 1:1 enzima:DFP (p. 358 e Figura
9.11). A estrutura tridimensional da
FIGURA9.16 Duas vistas dos domínios catalíticos tipo-tripsina mostrando a
quimotripsina revela que a Ser-195
estrutura da dobra em b-barril dos domínios com resíduos do sítios ativos na
interface do domínio.
está situada no interior de um bol
As folhas-b são setas amarelas, as a-hélices são magenta, as voltas são azul claro, e to são interno, com acesso à interface
dos os outros resíduos são brancos. São mostrados a serina-195 (laranja), a histidina-57 com o solvente. His-57 e Asp-102 são
(azul) e o aspartato-102 (marrom-avermelhado) do sítio ativo. orientadas de forma que participam,
As cadeias B e C da a-quimiotripsina humana, PDB 6CHA, são visualizadas com RasMol. com a Ser-195, do mecanismo catalí
364 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

TABELA 9.5 Sobreposição Estrutural de Serino Proteases Específicas da Família da Tripsina e Comparação da Sequência
de Aminoácidos Resultante
Número dos
Aminoácidos na Número de Resíduos Número de Resíduos
Comparação Sequência EstruturalmenteEquivalentes Quimicamente Idênticos
Protease 1 Protease 2

Tripsina-elastase 223 240 188 81

Tripsina-quimotripsina 223 241 185 93
Tripsina-protease de mastócito 223 224 188 69
Tripsina-pré-calicreína 223 232 194 84
Tripsina-protease de S. grieus 223 180 121 25

tico. Portanto, a família das serino proteases constitui
uma série de proteínas estruturalmente relacionadas,
que usa uma serina cataliticamente ativa. Durante a
evolução, a estrutura básica em dois domínios e os resí
duos cataliticamente essenciais foram mantidos, mas as
regiões das interações secundárias (regiões das alças)
mudaram para fornecer as diferentes especificidades
frente aos substratos, ativadores e inibidores, relativos
aos seus diversos papéis fisiológicos.
Serino Proteases Têm Relações
Estrutura-Função Semelhantes
As relações entre a estrutura e a função fisiológica
das serino proteases são resumidas como se segue: (1)
apenas um resíduo de seri
na é cataliticamente ativo
em qualquer serino protease. (3) Serino proteases eu
carióticas apresentam alta similaridade de sequência e
estrutural. (4) Genes que codificam serino proteases
são organizados de modo similar (Figura 9.17). Seus
padrões éxon-íntron mostram que cada um dos resí
duos cataliticamente essenciais (Ser-195, His-57 e Asp
102) está em um éxon diferente. A histidina e a seri
na essenciais ficam quase adjacentes ao limite de seus
éxons. A homologia cruzada entre espécies na estrutura
gênica suporta o conceito de que as serino proteases
evoluíram a partir de um gene primordial comum. (5)
A porção catalítica das serino proteases compreende
dois domínios, de tamanhos aproximadamente iguais.
O sítio catalítico fica em sua interface ou na fenda en
tre os dois domínios. (6) A estrutura tridimensional do
sítio catalítico das serino proteases é complementar à
H D S

e participa da clivagem da Tripsinogênio

H D S
ligação peptídica. A tripsina
bovina
de serina,
contém
com 34
apenas um Quimotripsinogênio
resíduos H D S
Pró-elastase
cataliticamente ativo ou ca H D S
paz de reagir com o inibidor Calicreína
DFP (Figura 9.11). (2) Di H D S
αNGF
fração de raios-X e estudos
H D S
de homologia de sequência γNGF
demonstraram que uma his H D S
rinaCom
tidina
sempre
co. um
ativada
eassociados
baseaspartato
doem
sítio
suas
com
catalíti-
estão
posi-
a se- -PA H D S

Uroquinase D S

ções no quimotripsinogênio,
esses três resíduos invariá
veis são denominados Ser
195, His57 e Asp 102, e cha
mados tríade catalítica.
Essa numeração, baseada
em seu número na sequên
cia do quimotripsinogênio,
é usada para identificar tais
resíduos, independentemen
te de suas posições exatas
Fator VII
FIGURA9.17 Organização de éxons e íntrons nos genes de serino proteases.
O t-PA é um ativador de plasminogênio tecidual, e o NGF é um fator de crescimento neural que
contém uma estrutura homóloga à de serino protease. Os éxons estão mostrados por caixas, e
os íntrons por linhas que fazem a conexão. A posição dos códons de serina, histidina e aspartato
do sítio ativo são designados por S, H e D, respectivamente. As caixas vermelhas, à esquerda,
mostram as regiões que codificam o peptídeo sinal NH2-terminal, que é clivado antes da secreção.
As caixas mais claras, à direita, representam parte da sequência transcrita em RNA mensageiro
(mRNA), mas não traduzida em proteína. As setas indicam os códons de resíduos nos quais a
ativação proteolítica do zimogênio ocorre.
Redesenhado e modificado de Irwin, D. M., Roberts, K. A. e MacGilliwray, R. T. J. Mol. Biol.
200:31, 1988.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 365

estrutura do estado de transição da reação e contém Homologia de Sequência em Serino

um sítio oxiânion para estabilizar o estado de transição
da reação de hidrólise do peptídeo. (7) Serino proteases Proteases
que interagem com membranas, geralmente têm um do
Muito do conhecimento inicial sobre a família das se
mínio adicional para propiciar essa função específica.
rino proteases veio da tripsina e da quimotripsina puri
(8) Substratos proteicos naturais e inibidores de serino
ficadas de materiais bovinos. Isso gerou uma nomencla
proteases ligam-se por um sítio de especificidade es tura útil, mas não intuitiva, que usa um alinhamento de
tendido. (9) A especificidade por inibidores proteicos
sequência contra a sequência de aminoácidos da quimo
naturais é marcada por ligação extremamente forte. A
tripsina, para dar nome e número aos resíduos de outras
constante de ligação da tripsina com o inibidor pancre
serino proteases. Como mencionado anteriormente, os
ático de tripsina é da ordem de 1013/M, refletindo uma
resíduos cataliticamente essenciais são Ser-195, His-57
energia livre de ligação de aproximadamente 75 kJ/mol
e Asp-102. Inserções e remoções dos aminoácidos em
(18 kcal/mol). (10) Inibidores proteicos naturais são
outra serino protease são comparadas à numeração dos
geralmente maus substratos, com inibição forte reque
resíduos na quimotripsina. O alinhamento é realizado
rendo hidrólise de uma ligação peptídica no inibidor
por algoritmos que maximizam a homologia de sequên
pela protease. (11) Serino proteases, em eucariotos, são
cia, com alinhamento exato dos resíduos essenciais de
sintetizadas como zimogênios, para permitir seu trans
serina, histidina e aspartato. Esses três resíduos são in
porte em um estado inativo até seus locais de ação. (12)
variáveis em todas as serino proteases, e as sequências
A ativação do zimogênio frequentemente envolve hidró
em torno deles são invariáveis entre as serino proteases
lise por outra serino protease. (13) Várias serino pro da família da quimotripsina (Tabela 9.6).
teases sofrem autólise ou auto-hidrólise. Às vezes, isso
leva à clivagem de ligação peptídica específica e maior Membros da família da quimotripsina também ocor
ativação da atividade catalítica. Outras vezes, a autólise rem em procariotos. Assim, serino proteases bacteria
leva à inativação da protease. nas de Streptomyces griseus e Myxobacteria 450 são

TABELA 9.6 Sequências Invariáveis em Torno da Serina (S) e da Histidina (H) Cataliticamente Essenciais
Enzima Sequência (Resíduos Idênticos à Quimotripsina Estão em Negrito)
Quimotripsina A F H em
Resíduos F Torno
C G G da SHistidina
L I NCataliticamente
E N W V V Essencial
T A A H* C G V T T S D

Tripsina Y H F C G G S L I N S Q W V V S A A H C Y K S G I Q
Elastase pancreática A H T C G G T L I R Q N W V M T A A H C V D R E L T
Trombina E L L C G G S L I S D R W V L T A A H C L L Y P P W
Fator X E G F C G G T I L N E F Y V L T A A H C L H Q A K R
Plasmina M H F C G G T L I S P E W V L T A A H C L E K S P R
Calicreína plasmática S F Q C G G V L V N P K W V L T A A H C K N D N Y E
Tripsina de Streptomyces – – – C G G A L Y A Q D I V L T A A H C V S G S G N
Subtilisina V G G A S F V A G E A Y N T D G N G H G T H V A G T
Quimotripsina A C A Gem–Torno
Resíduos – – da
A Serina
S G Cataliticamente M G D S* G G P L V
V – – S S CEssencial

Tripsina C A G Y – – L E G G K – D S C Q G D S G G P V V
Elastase pancreática C A G – – – G N G V R – S G C Q G D S G G P L H
Trombina C A G Y K P G E G K R G D A C E G D S G G P F V
Fator X C A G Y – – D T Q P E – D A C Q G D S G G P H V
Plasmina C A G H – – L A G G T – D S C Q G D S G G P L V
Calicreína plasmática C A G Y – – L P G G K – D T C M G D S G G P L I
Tripsina de Streptomyces C A G Y – P D T G G V – D T C Q G D S G G P M F
Subtilisina A G V Y S T Y P T N T Y A T L N G T S M A S P H
Fonte: Barrett, A. J. Em: A. J. Barrett e G. Salvesen (Eds.), Proteinase Inhibitors. Amsterdam: Elsevier, 1986, p.7.
366 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

homólogos à tripsina. Entretanto, uma classe separada exata desses grupos doadores de pontes de hidrogênio
de serino proteases descoberta primeiro em bactérias no sítio ativo é uma característica estrutural cataliti
não tem homologia estrutural com a família da tripsina camente crítica das enzimas proteases.
de mamíferos. A serino protease subtilisina, isolada de
Bacillus subtilis, hidrolisa ligações peptídicas e contém
uma serina ativada, com uma histidina e um aspartato Inibidores Proteicos Específicos de
em seu sítio ativo e uma estrutura de sítio ativo comple
mentar ao estado de transição da reação hidrolítica, mas Serino Proteases
seu sítio ativo surge de regiões estruturais da proteína A evolução da família das serino proteases para
que não apresentam nenhuma homologia de sequência participação em processos fisiológicos promoveu uma
ou estrutural com a família da tripsina. Serino proteases evolução paralela de inibidores. Proteínas específicas
da família da subtilisina são também encontradas em cé inibem a atividade das serino proteases quando seu
lulas humanas. Este é um exemplo de evolução conver papel fisiológico termina (Tabela 9.7). Assim, a coagu
gente de um mecanismo catalítico enzimático. Aparen lação é limitada ao local da lesão vascular e a ativação
temente, um gene completamente diferente desenvolveu do complemento leva à lise somente das células que
o mesmo mecanismo catalítico para hidrólise peptídica. apresentam antígenos estrangeiros. A incapacidade de
controlar essas proteases, como por uma deficiência
de um inibidor específico, pode levar a consequências
Mecanismo de Catálise das Serino indesejáveis, como formação de trombos iniciando in
Proteases farto do miocárdio e acidente vascular cerebral, ou a
reações descontroladas do complemento em doenças
Todas as serino proteases tipo-tripsina catalisam a autoimunes. Esses inibidores naturais de serino pro
hidrólise da ligação peptídica por um mecanismo catalí teases são denominados serpinas, em referência a seri
tico idêntico, com as ações coordenadas de um sítio ati ne protease inhibitors (inibidores de serino protease).
vo Ser-195, His-57 e Asp-102. Esses resíduos ficam em Estes ocorrem em animais que produzem as proteases,
domínios diferentes dos dois domínios que compõem mas surpreendentemente são também encontrados em
a unidade catalítica. Na proteína dobrada, as estrutu plantas que não têm proteases.
ras tridimensionais aproximam esses resíduos
na interface do domínio que compreende o sítio
primário de catálise (Figura 9.18). Os nitrogê
nios do imidazol das His-57s formam pontes de
hidrogênio com o gOH da Ser-195 e a cadeia la
Ser-195 Tetraedro
teral carboxilato do Asp-102. Na hidrólise cata His-57
lisada pela protease, a histidina funciona como O Oxiânion
uma base catalítica geral e o gOH da serina for Asp-102 +
– H N N H.. .............. O
.. – H N
..
ma um ester intermediário transitório covalente O ..
.. ... ..........
.. ... O
com uma parte do substrato. Esses mecanismos C-terminal . . ........
H
do substrato N .... C N
envolvendo a Ser-195 e a His-57 facilitam a que ..
...
bra da ligação peptídica susceptível do substrato H Pontes de hidrogênio
C Estabilizam o estado
ligado ao sítio ativo. de transição
CLIVAGEM
+
Alem dos três aminoácidos cataliticamente –Asp-189
INTERMEDIÁRIO
essenciais do sítio ativo, todos os sítios ativos TETRAÉDICO N-terminal
têm características que estabilizam a estrutura do substrato
do estado de transição da reação. O estado de
transição é a estrutura de maior energia na via
da reação à qual o substrato é elevado. A veloci FIGURA9.18 Estabilização da estrutura da reação do estado de
transição da hidrólise de peptídeo pela tripsina.
dade da reação depende da energia necessária O substrato polipeptídeo é mostrado em vermelho, com os átomos do car
para atingir a estrutura do estado de transi bono a, cadeia lateral (lisina) e ligação peptídica lábil do resíduo P1 do
ção, e as enzimas aceleram as velocidades da substrato. A ligação peptídica lábil está em uma estrutura intermediária
reação, reduzindo a energia necessária para como aquela do estado de transição da reação proposta, na qual a ligação
atingir a estrutura do estado de transição. Uma peptídica entre o carbono da carbonila e o nitrogênio está sendo quebrada,
enquanto a ligação entre o gO da Ser-195 e o carbono da carbonil está sen
forma de reduzir essa energia é estabilizar a es
trutura do estado de transição hidrolítico. To do feita. Nessa estrutura, o carbono da carbonila é ligado transitoriamente
dos os sítios ativos das serino proteases contêm a quatro átomos diferentes, e o oxigênio da carbonila está carregado nega
tivamente. A enzima ativa está em azul e contém Ser-195, His-57 e Asp-102
dois grupos doadores de pontes de hidrogênio
cataliticamente essenciais. A cadeia polipeptídica do sítio ativo da enzima
orientados e posicionados para doar pontes de contribui com duas pontes de hidrogênio que estabilizam a estrutura do
hidrogênios que estabilizam a estrutura do es estado de transição.
tado de transição (Figura 9.18). A localização Modificado de figura de Stroud, R. M. Sci. Am., 231:74, 1974.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 367

TABELA 9.7 Algumas Proteínas Humanas que Inibem Serino Proteases

Inibidor Ação
a1-Inibidor de protease Inibe proteases teciduais, incluindo elastase de neutrófilos; sua
deficiência acarreta enfisema pulmonar
a1-Antiquimotripsina Inibe proteases com especificidade tipo quimotripisina de neutrófilos,
basófilos e mastócitos, incluindo catepsina G e quimase
Inter-a-tripsina inibidor Inibe um amplo espectro de serino proteases ativas no plasma
a2-Antiplasmina Inibe plasmina

Antitrombina III Inibe trombina e outras proteases da coagulação

C1 Inibidor Inibe reação de complemento

a2-Macroglobulina Inibidor de proteases em geral
Protease nexina I Inibe trombina, ativador de plasminogênio tipo uroquinase e plasmina
Protease nexina II Inibe serino proteases associadas a fator de crescimento, idêntica ao
domínio NH2-terminal de proteína amiloide secretada em doença de
Alzheimer
Inibidor do ativador de plasminogênio I Inibe ativadores de plasminogênio
Inibidor do ativador de plasminogênio II Inibe o ativador de plasminogênio tipo uroquinase

9.4 HEMOGLOBINA E contém 141 aminoácidos, e o polipeptídeo b, 146 ami

noácidos. A forma fetal (HbF) (Figura 9.19) contém as
MIOGLOBINA sequência
mesmas da cadeia
cadeias a dabHbA
(Tabela 9.8). Duas
1, e cadeias g que
outras
diferem
formas
em
As hemoglobinas são proteínas globulares, presen
de hemoglobina aparecem nos primeiros meses após
tes em altas concentrações nos eritrócitos, que ligam a concepção (embrionária), na qual as cadeias a são
oxigênio nos pulmões e o transportam para as células substituídas por cadeias zeta (z) de sequência diferen
dos tecidos. Elas também transportam CO2 e H+ dos te, e as cadeias e funcionam como cadeias b. Uma he
tecidos para os pulmões, e carregam e liberam óxido moglobina adulta minoritária, HbA2, compreende cerca
nítrico (NO) nos vasos sanguíneos dos tecidos. NO é de 2% da hemoglobina adulta normal e contém duas
um potente vasodilatador e inibidor da agregação pla
cadeias a e duas cadeias designadas por delta (d) (Ta
quetária. A estrutura molecular e química das hemoglo bela 9.8). Uma discussão sobre hemoglobinas anormais
binas ajusta-se perfeitamente a esses papéis fisiológicos é apresentada na Correlação Clínica 9.6.
complexos e interrelacionados.

A Hemoglobina α α
50
Humana Ocorre em γ
β

Várias Formas
Uma molécula de hemoglobina
% da
síntese
40

total de 30
globina
20
consiste de quatro cadeias polipep
ε
tídicas, duas de cada com duas se ζ β
10 γ
quências diferentes. Cada cadeia δ
contém um grupo prostético heme
6 12 18 24 30 36 1 6 12 18 24 30 36 42 48
que liga oxigênio. Na ligação de O2 Nascimento
a uma molécula de hemoglobina Idade pós-concepcional (semanas) Idade pós-natal (semanas)
para formar Hb(O2)4, os quatro sí
FIGURA9.19 Mudanças na produção de cadeias de globina durante o
tios de ligação de O2 agem de maneira
desenvolvimento.
cooperativa. A forma majoritária de Redesenhado de Nienhuis, A.W. e Maniatis, T. Em: Stamatoyannopoulos, G., Nienhuis, A.
hemoglobina humana adulta, HbA1, W., Leder, P., e Majerus W. (Eds.), The Molecular Basis of Blood Diseases. Philadelphia:
consiste de duas cadeias a e duas Saunders, 1987, p. 68, na qual a referência de Weatherall, D. J. e Clegg, J. B., The Tha
cadeias b (a2b2). O polipeptídeo a lassemia Syndromes, 3. ed., Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1981, é citada.
368 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

TABELA 9.8 Cadeias de Hemoglobina Humana Mioglobina: Um Único Polipeptídeo

Estágio do Composição em
Desenvolvimento Símbolo Cadeias
com Um Sítio de Ligação de O2
Adulto HbA1
HbA2 a2 b2
d2 A mioglobina (Mb) é uma proteína que liga O2, cap
tura e libera O2 com mudanças na concentração de O2
no sarcoplasma de células musculares esqueléticas. Di
ferentemente da hemoglobina, que tem quatro cadeias
Feto HbF a2 g2 e quatro sítios de ligação de O2, a mioglobina contém
Embrião Hb Gower-1 z2 e2 apenas uma cadeia polipeptídica e um sítio de ligação
de O2. A mioglobina é um modelo do que ocorre quan
Embrião Hb Portland z2 g2 do uma única molécula protômero age sozinha, sem as
interações apresentadas entre os quatro sítios de liga
ção de O2 na molécula tetramérica, mais complexa, de
hemoglobina.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 9.6

Hemoglobinopatias

Há bem mais de 800 hemoglobinas humanas mu Hemoglobinas mutantes que formam meta-hemo
tantes conhecidas. As mutações causam instabilidade globina incluem HbIwatea87His→Tyr e HbHydeParkb92His→Tyr,
na estrutura da hemoglobina, afinidade aumentada ou nas quais as histidinas proximais F8 das cadeias a e b,
diminuída por oxigênio, ou um aumento na taxa de oxi e na HbSaskatoonb63His→Tyr,
respectivamente, as histidinas
estão mutadas. Na Hbdistais
Bostona58His→Tyr

dação do ferro ferroso do heme (Fe2+) para o estado E7 estão

férrico (Fe3+). Uma hemoglobina férrica, não-funcional,
é chamada meta-hemoglobina e é simbolizada por HbM.
A hemoglobina instável pode surgir pela substitui
ção de prolina por um aminoácido em uma região de
a-hélice da dobra de globina. Prolinas não participam
da estrutura em a-hélice, e a quebra de um segmento
de a-hélice gera uma hemoglobina instável (exemplos
são HbSakib14Leu→Pro e HbGenova b28Leu→Pro). Outras he
moglobinas instáveis surgem pela substituição por um
aminoácido que é muito grande ou muito pequeno para
estabelecer contatos corretos, ou pela colocação de
um grupo carregado ou polar no lado de dentro de um
domínio. As hemoglobinas instáveis desnaturam facil
mente e podem precipitar, formando corpos de Heinz,
que danificam a membrana do eritrócito. Pacientes com
hemoglobinas instáveis desenvolvem anemia, reticulo
citose, esplenomegalia e urobilinúria.
Algumas
interessante
mentada pelohemoglobinas
é mutantes têm afinidade au
oxigênio
a HbCowtown
(P50 na qual
mais baixa).
b246His→Leu, Um aexemplo
histidi
na que dissocia 50% dos prótons do efeito Bohr é per
dida. Essa mutação impede a regulação da dissociação
do oxigênio pela concentração de íons hidrogênio e de
sestabiliza a conformação T, em relação à conformação
R, causando um aumento na afinidade por oxigênio e
liberação diminuída de O2 para os tecidos. Mutações na
hemoglobina que impedem a ligação de BPG também
aumentam a afinidade pelo oxigênio. As hemoglobino
patias de afinidade aumentada por oxigênio são fre
quentemente caracterizadas por anemia hemolítica e
formação de corpos de Heinz.
mutadas. Mutações de aminoácidos que ficam junto do
heme ou formam o sítio de ligação com oxigênio fre
quentemente levam à meta-hemoglobina. Pacientes
com altas concentrações de meta-hemoglobina apre
sentam cianose (cor azulada na pele).
Duas das mutações mais prevalentes ocorrem
no aminoácido da mesma posição, o b6Glu. Quando
esse glutamato é substituído por valina, o resultado
é HbSb6Glu→Val, enquanto substituição por lisina gera
HbCb6Glu→Lys. Homozigotos com HbS têm anemia fal
ciforme, na qual as moléculas de hemoglobina preci
pitam como tactoides ou longas cadeias, o que produz
a forma de foice dos eritrócitos. HbC forma uma es
trutura agregada diferente, consistindo de cristaloides
de extremidades retas. Isso reduz o tempo de sobrevi
vência dos eritrócitos, mas produz menos hemólise do
que HbS. Essa forma de hemoglobinopatia apresenta
efeitos patológicos mais limitados. Como ambas HbS
e HbC são comumente encontradas em certas popula
ções negras da África, não é raro encontrar indivíduos
heterozigotos para ambos os genes mutantes nessas
populações. Indivíduos com HbSC terão uma anemia
intermediária entre as observadas para os homozigo
tos de HbS e HbC.
Arcasoy, M. O., e Gallangher, P. G. Molecular diagnosis of
hemoglobinopathies and other red blood cell disorders. Se
minars Hematology 36:328, 1999; Benz, E. J., Jr. Genotypes
and phenotypes: Another lesson from the hemoglobinopa
thies. N. Engl. J. Med. 351:1490, 2004; e Dickerson, R. E. e
Geis, I. Hemoglobin: Structure, Function, Evolution, and
Pathology. Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1983.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 369

O Grupo Prostético Heme É o Sítio COO–

de Ligação de O2
As quatro subunidades globinas da hemoglobina e NN His F8 Proximal
a única da mioglobina contêm, cada uma, um grupo COO–
N
prostético heme. Um grupo prostético é uma parte
não-polipeptídica que forma uma parte funcional de
uma proteína. Sem seu grupo prostético, uma proteína
é denominada apoproteína. Com seu grupo prostético,
é uma holoproteína.
N Fe N
Nas hemoglobinas e mioglobina, o heme é protopor
firina IX (p. 814), com um átomo de ferro em seu centro O2

(Figura
se O2 9.20). O ferro está no estado ferroso (carga +2) N N
na hemoglobina e na mioglobina funcionais, onde pode
His E7
formar cinco ou seis ligações covalentes, dependendo Distal N
está ou não ligado. Quatro ligações são com os
átomos de nitrogênio pirrólico da porfirina. Como os
anéis pirrólicos e os carbonos de ligação fazem parte
do mesmo sistema aromático, esses átomos ficam em FIGURA9.21 Ligações de ligantes com o átomo ferroso
um plano comum. O Fe2+ ligado à porfirina tende a fi na oxi-hemoglobina.
car no mesmo plano da porfirina. A quinta e a poten
cial sexta ligações
oxi-globinas, O2 com o Fe2+ são dirigidas para um HC2 Tyr
FG2
eixo perpendicular ao plano do anel porfirínico (Figura
9.21). A quinta ligação é com um nitrogênio do imidazol F9 CD2

de uma histidina. Esta é chamada a histidina proximal C7

nas estruturas das globinas (Figuras 9.21 e 9.22). Nas C3
M P
CD1
His
forma a sexta ligação, sendo que O2 G1 F8
C5
fica entre o átomo ferroso e um segundo imidazol de V
CD7

histidina, designada como histidina distal. Na desoxi M His E7

F1 E1
G5 C1
-hemoglobina, a sexta posição está desocupada. Val D1
H16 E11 D7
V
O heme é posicionado dentro de um bolsão hidrofó M
E5
bico de cada subunidade globina. Nesse bolsão, cerca
de 18 resíduos de aminoácidos, a maioria entre as ca
deias laterais apolares e as regiões apolares da porfiri EF3 EF1 G15
B5
na, ocorrem aproximadamente 80 interações.
NA1
NH3+ E20 A16 B1

NA2 G19
H5
AB1
COO– COO–
CH2 CH2 A1
H1
CH2 CH2
GH4
C CH C
CH3 C C C C
H2O CH3 FIGURA 9.22 Estruturas secundária e terciária
CNNC
C N Fe NC características das globinas da hemoglobina.
CH CH As cadeias laterias da His F8 proximal, His E7 distal, Tyr HC2 e
H2O Val E11 são mostradas. Outros aminoácidos da cadeia polipep
CH2
CH C C C C CH3 tídica são representados pelas posições do carbono-α apenas;
as letras M, V e Preferem-se às cadeias laterais metil, vinil e
C CH C CH2
propionato do heme.
CH3 CH Reimpresso com permissão de Perutz, M. Br. Med. Bull.
32:195, 1976.

Heme A força motriz dessa interação é a exclusão da água

FIGURA 9.20 Estrutura do heme.
O ferro (Fe2+) possui quatro ligações com os nitrogênios pir
rólicos na porfirina planar. As ligações cinco e seis são per
pendiculares ao plano da porfirina. A estrutura da profirina é
protoporfirina tipo IX.
de solvatação na associação do heme hidrofóbico com
as cadeias laterais apolares dos aminoácidos no bolsão
do heme (ver forças hidrofóbicas, p. 120). Interações
adicionais na mioglobina são formadas entre os grupos
propionato carregados negativamente do heme e as ca
370 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

deias laterais carregadas positivamente da arginina e
da histidina. Nas cadeias da hemoglobina, uma diferen
ça na sequência de aminoácidos dessa região do sítio de
ligação do heme leva à estabilização dos propionatos da
porfirina por interação com um imidazol de histidina
não-carregado e com moléculas de água do solvente, na
superfície externa da molécula.
Cristalografia por Raios-X Definiu
as Estruturas da Hemoglobina e da
Mioglobina
As estruturas das formas desoxi e oxi da hemoglo
bina e da mioglobina foram resolvidas por cristalogra
fia de raios-X. De fato, a mioglobina de cachalote foi a
primeira proteína cuja estrutura foi determinada por
essa técnica, seguida pela hemoglobina de cavalo. Es
sas estruturas mostram que cada globina consiste de
múltiplas regiões a-hélice, conectadas por voltas que
permitem o dobramento em uma forma esferoidal ca
racterística da dobra de globina (Figura 9.22 e Figura
3.37, p. 105).
dos quais 83 são invariáveis. Apenas 15 resíduos in
variáveis são idênticos aos resíduos invariáveis das ca
deias globinas das hemoglobinas de mamíferos. Embora
exista uma surpreendente variabilidade de sequência,
as estruturas secundária e terciária são quase idênticas
(Figura 9.23). Além disso, todas as cadeias de globina
funcionam na ligação, de forma reversível, do oxigênio.
Contudo, quando se compara as sequências da mioglo
bina com as sequências das cadeias globina da hemoglo
bina, as mudanças são principalmente conservativas e
preservam as propriedades físicas dos resíduos (Tabe
la 9.9). Mudanças de sequência entre as sequências de
mioglobina e hemoglobina são parcialmente explicadas
pelo fato de a mioglobina agir como um monômero; por
tanto, muitas de suas posições de superfície interagem
com água e impedem que outra molécula de mioglobina
se associe. Diferentemente, os resíduos de superfície
das subunidades individuais da hemoglobina formam
pontes de hidrogênio e contatos não-polares com ou
tras subunidades na estrutura quaternária. As histi
dinas proximal e distal ao ferro heme são preservadas
em todas as cadeias de globina, assim como os bolsões
hidrofóbicos do heme que formam contatos essenciais
não-polares com o heme.

Estruturas Primária, Secundária e Quaisquer diferenças significativas nas proprieda

Terciária da Mioglobina e das Cadeias de des fisiológicas entre as cadeias a, b, g, e d das he
moglobinas e a cadeia da mioglobina se devem a pe
Hemoglobina
quenas alterações específicas em suas estruturas. A
A comparação das sequências de aminoácidos da semelhança de estrutura terciária mostra que a mes
mioglobina de muitas espécies animais mostra que to ma estrutura dobrada de um polipeptídeo pode ser ob-
das as cadeias de mioglobinas contêm 153 aminoácidos, tida por sequências diferentes.

FG2 FG2
COO– CD2
CD2
COO– F9
F9
H24 C7
F6 C7 CD1
HC5 CD1 C3 M P
C3 M P
C5 F8 C5
F8 CD7 G1 CD7
G1
E7 V E7 E1
V E1
M D1
M D1 C1
C1 B14 F1 G5 D7
F1 G5 D7
B16
H16 V
V M E5
H16 M E5

G15 B5
G15 B5
EF1
EF1 EF3
EF3 B1
B1 NA1 A16
A16
+ E20
E20 NH3 G19
G19
AB1
AB1 NA2 H5
H5

+ A1 H1
H3N A1 H1
GH4
GH4

(a) (b)

FIGURA9.23 Comparação da conformação de (a) mioglobina e (b) cadeia ß de HbA1.

As estruturas gerais são muito semelhantes, exceto nas extremidades NH2-terminal
+ e COOH-terminal.
Reproduzido com permissão de Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism. São Francisco: Freeman, 1977, 12 e 13.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS º 371

TABELA 9.9 Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Hemoglobina e Mioglobina"

NA 1 2 3 A1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 15 AB1 B1 2

MIOGLOBINA Val Leu Ser Glu Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Hid Val Val Ala Asp Val Ala Gly Jis
Cavalo Val Leu Ser Ala Ala Asp Thr Asn Val LyS Ala Ala Val Gly His Ala Gly Glu Tyr
Val Gln Leu Ser Gly Glu Glu Ala Ala Val Leu Ala Leu Val Glu Glu Glu Val
Humana Val Leu Ser PrO Ala Asp Thr ASn Val LyS Ala Ala Val Ala His Ala Gly Glu Tyr
Val His Leu Thr PrO Glu Glu Ser Ala Val Thr Ala Leu Val Val Asp Glu Val

Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Ala Thr Ilu Thr Ser Leu Val Val Glu Asp Ala
Val His Leu Thr PrO Glu Glu Thr Ala Val ASn Ala Leu Val Val Asp Ala Val

11 13 14 15 16 C1 3 CD1 D1

MIOGLOBINA Gln Asp Ilu Ilu Leu Phe LyS Ser HiS PrO Glu Thr Phe Arg LyS His LyS Thr

Cavalo Ala Ala Glu Met Phe Leu Gly Phe PrO Thr Thr Phe His Asp Ser His

Gly Ala Gly Leu Leu Val Val Tyr PrO Trp Thr Phe Ser Gly Asp Ser Gly
Humana Ala Ala Glu Met Phe Leu Ser Phe PrO Thr Thr Phe His Asp Ser His

Gly Ala Gly Leu Leu Val Val Tyr PrO Trp Thr Phe Ser Gly Asp Ser Thr

Gly Thr Gly Leu Leu Val Val Tyr PrO Trp Thr Phe Ser Gly Asp Ser Ser

Gly Ala Gly Leu Leu Val Val Tyr PrO Trp Thr Phe Ser Gly Asp Ser Ser

E1 7 12 14 E 15 16 17 18 19 20

MIOGLOBINA Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp HiS Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ilu Leu LyS
Cavalo Ser Ala Gla HiS Gly Ala Gly Leu Thr Le Ala Val Gly
Pro Asp Ala Val Met Asn PrO LyS HiS Gly Leu Ser Phe Gly Glu Gly Val His
Humana Ser Ala Gln HiS Gly Ala Ala Leu Thr ASn Ala Val Ala
PrO Asp Ala Val Met Asn PrO LyS HiS Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala
Ala Der Ala Ilu Met Asn PrO LyS HiS Gly Leu Ser Leu Gly Asp Ala Ilu LyS
PrO Asp Ala Val Met Asn PrO LyS HiS Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala

EF1 2 3 4 5 6 F1 2 5 FG1 G1

MIOGLOBINA LyS Gly His Glu Ala Glu Leu Lys PrO Ala Gln Thr His Lys Ilu PrO Ilu LyS Tyr
Cavalo Leu Leu POr Gly Ala Leu Ser Asp ASn His Leu Arg Val Asp PrO Val
Leu Leu LyS Gly Thr Phe Ala Ala Glu Asp Leu His Val Asp PrO Glu
Humana Val Met PrO ASn Ala Leu Ser Ala Asp His Leu Arg Val Asp PrO Val
Leu Leu LyS Gly Thr Phe Ala Thr Glu Asp Leu His Val Asp PrO Glu
Leu Leu LyS Gly Thr Phe Ala Gln Glu Asp Leu His Val Asp PrO Glu
Leu Leu LyS Gly Thr Phe Ser Gln Glu Asp Leu His Val Asp PrO Glu

5 6 7 8 G9 10 11 12 13 14 15 18 H1 H3

MIOGLOBINA Leu Glu Phe Ser Glu Ala Ilu Ilu His Val Ser Gly Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly
Cavalo LyS | Leu Ser His Cys Leu Ser Thr Val ASn Phe Thr PrO Ala Val HiS

Arg | Leu Gly ASn Val Ala Leu Val Arg LyS Phe Thr PrO Glu Leu Gln
Humana LyS Leu Ser His Cys Leu Val Thr Ala Ala Phe Thr PrO Ala Val HiS

Srg Leu Gly Asn Val Val Cys Val His LyS Phe Thr PrO PrO Val Gln

LyS Leu Gly Asn Val Val Thr Val Ilu LyS Phe Thr PrO Glu Val Gln

Arg Leu Gly Asn Val Val Cys Val Arg LyS Phe Thr PrO Gln Met Gln

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 23 HC1 2 3

MIOGLOBINA Ala Met ASn Ala Leu Glu Leu Phe Arg LyS Ilu Ala Tyr LyS Leu Gly Tyr Glu Gly
Cavalo Ser Ley Asp Phe Leu Ser Ser Val Ser Thr Leu Thr Tyr Arg
Ser Tyr Gln Val Val Ala Gly Val Ala ASn Leu Ala His Tyr His
Humana Ser Leu Asp Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Leu Thr Tyr Arg
Ala Tyr Gln Val Val Ala Gly Val Ala ASn Leu Ala His Tyr HiS
Ser Trp Gln Met Val Thr Gly Val Ala Ser Leu Ser Ser Tyr HiS
ala Tyr Gln Val Val Ala Gly Val Ala Asn Leu Ala His Tyr His

Fonte: Baseado em diagrama de Dickerson, R.E. e Geis, I. The Structure and Function of Proteins. New York: Harper & Row, 1969, p. 52.
"Mioglobina de cachalote. Os resíduos que são idênticos estão dentro dos retângulos. A, B, C, ... designam diferentes hélices de estrutura terciária
(ver texto).

Aproximadamente 70% dos resíduos participam das
O:-hélices da dobra de globina, gerando sete O-hélices
na cadeia o e oito na cadeia B. Essas últimas oito re
giões helicoidais são comumente chamadas A–H, co
meçando pela extremidade NH2-terminal. As regiões
entre as hélices são designadas por AB, BC, CD, ..., GH,
respectivamente. A região não-helicoidal da extremidade
NH2-terminal é designada por NA, e a da extremida
de COOH-terminal é HC (Figura 9.22). Os resíduos de
aminoácidos são numerados Sequencialmente a partir
372 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

pO2 em capilares de
de 1 em cada uma das hélices e regiões inter-hélices
músculo ativo pO2 nos pulmões
designadas por letras. Esse sistema de numeração per 1.0
mite a discussão sobre regiões e resíduos específicos,
que desempenham papéis funcional e estrutural seme Mioglobina
lhantes na hemoglobina e na mioglobina. )
( Hemoglobina (pH 7,4)
o
ã
ç 0.5
a
r
u
Um Equilíbrio Simples Define a t
a
S
Ligação de O2 à Mioglobina
A associação do oxigênio com a mioglobina é ca
racterizada por uma constante de equilíbrio simples 60
20 40 80 100
(Equações 9.1 e 9.2). A [MbO2] é a concentração em so P50 pO2 (torr)
lução de oximioglobina, a [Mb] a de desoximioglobina, e
a [O2] é a de oxigênio, todas em unidades de moles/litro.
A constante de equilíbrio, Keq, tem unidade de moles/ FIGURA9.24 Curvas de ligação de oxigênio para
mioglobina e hemoglobina.
litro. O valor da Keq é dependente do pH, da força iônica Os gráficos colocam a curva da mioglobina próxima do valor
e da temperatura. zero de pO2 nesse sistema de coordenada. Se o eixo do pO2
Mb + O2 K⇌eq fosse expandido em torno da região da P50 da mioglobina, a
MbO2 (9.1) sensibilidade menor da variação de Y na mioglobina com a mu
dança na concentração de oxigênio em relação à hemoglobi
Keq = [Mb] · [pO2] na seria demonstrada (ver Índice de Cooperatividade, Tabela
(9.2)
[MbO2] 9.10). O índice, baseado nos coeficientes de Hill observados,
mostra a mioglobina muda de Y = 0,1 para Y = 0,9 com uma
Como o oxigênio é um gás, é conveniente expres mudança de mais de 81 vezes na concentração de oxigênio,
sar sua concentração como pressão de oxigênio, em enquanto para a hemoglobina basta uma variação de 4,8 vezes
na concentração de oxigênio.
torr (1 torr equivale à pressão de 1 mm Hg a 0 °C e
gravidade padrão). Na Equação 9.3, essa conversão de
unidades foi feita como mostra a troca de símbolos: P50, Uma manipulação algébrica simples da Equação 9.6
a constante de equilíbrio, e pO2, a concentração de oxi leva à Equação 9.7. Tomando-se o logaritmo de ambos
gênio, sendo expressa em torr. os lados da Equação 9.7, resulta na Equação 9.8, a Equa
ção de Hill. Um gráfico do log [Y/(1 - Y)] versus log pO2,
[Mb] · pO2 de acordo com a Equação 9.8, gera uma linha reta, com
P50= (9.3)
[MbO2 inclinação igual a 1 para a mioglobina (Figura 9.25).
Este é o gráfico de Hill, e a inclinação (nH) é o coefi
Em uma curva de ligação ou de saturação de oxigê ciente de Hill (Equação 9.9).
nio, a fração de sítios de ligação de oxigênio que contêm
1−
YY pO2
oxigênio (Y, Equação 9.4) é colocada na ordenada ver
sus pO2 (concentração
] de oxigênio), na abscissa. O va P50 (9.7)
lor de Y é definido para a mioglobina pela Equação 9.5. Y
Substituindo-se na Equação 9.5 o valor de [MbO2] obtido log = = log pO2 − log P50 (9.8)
na Equação 9.3, e, depois, dividindo-se tudo por [Mb], 1−Y
resulta na Equação 9.6, que mostra a dependência entre
Y e o valor da constante de equilíbrio P50 e da pO2. A
partir das Equações 9.3 e 9.6, o valor de P50 é igual a pO2
quando Y = 0,5 (50% dos sítios disponíveis ocupados),
daí a designação da constante de equilíbrio por P50.
Mioglobina
número de s´ıtios de ligaç˜ao ocupados nH = 1,0
Y = número total de s´ıtios de ligaç˜ao em soluç˜ao (9.4)
l
go Hemoglobina
nH = 2,8
Y = [MbO2]
[Mb] + [MbO2 (9.5)

Y = pO2 ] log pO2

P50 + pO2 (9.6)
FIGURA9.25 Gráficos de Hill para mioglobina e
Um gráfico da Equação 9.6 para Y versus pO2 gera hemoglobina A1.
uma curva de saturação de oxigênio para mioglobina, e
tem a forma de uma hipérbole retangular (Figura 9.24).
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 373

A Ligação de O2 à Hemoglobina favorável se deve, em parte, a restrições conformacio

nais impostas à His F8 e à porfirina na conformação da
Envolve Cooperatividade entre desoxi-hemoglobina, que força a aproximação da His
F8 em direção à porfirina, para uma posição particu
Subunidades lar (Figura 9.26). Essas restrições ficam menos sig
A ligação de quatro O2 à hemoglobina manifesta-se nificativas na oxi-hemoglobina. Com o átomo de ferro
como cooperatividade positiva, uma vez que a ligação fora do plano da porfirina, a conformação é relaxada e
do primeiro O2 facilita a ligação de O2 às outras subu energeticamente favorecida para o átomo ferroso com
nidades. Ao contrário, a dissociação do primeiro O2 da cinco coordenações. Quando O2 forma a sexta ligação
do ferro, entretanto, essa conformação fica tensa. Uma
Hb(O2)4 tornará mais fácil a dissociação do O2 das ou
tras subunidades. conformação energeticamente mais favorável para o
ferro ligado a O2 é aquela na qual o átomo de ferro fica
Em decorrência dessa cooperatividade, a curva de dentro do plano da porfirina.
saturação de oxigênio para hemoglobina difere da cur
va da mioglobina. Um gráfico de Y versus pO2 para a
hemoglobina é sigmoidal, indicando cooperatividade na TABELA 9.10 Relação entre Coeficiente de Hill (nH) e
associação com oxigênio (Figura 9.24). Um gráfico da Índice de Cooperatividade (Rx)
equação de Hill (Equação 9.9) dá uma inclinação (nH
igual a 2,8 (Figura 9.25). Valores de nH = 1,0 indicam) nH Rx Observação
nenhuma cooperatividade na ligação do substrato a 0,5 6.560
proteínas com sítios multiativos. Valores de nH > 1,0 in
dicam cooperatividade positiva, com valores mais altos 0,6
0,7 1.520
533 Cooperatividade negativa de
correlacionando-se com maior cooperatividade positiva 0,8 243 substrato
na ligação. Valores de nH maiores do que 0 e menores do 0,9 132
que 1,0 indicam cooperatividade negativa, com valores
proximos de 0 tendo maior cooperatividade negativa. 1,0 81,0 Não-cooperatividade

Y 1,5
log = nH log pO2 − constante (9.9)
1−Y
O significado do coeficiente de Hill para a associação
cooperativa do O2 é avaliado quantitativamente como
apresentado na Tabela 9.10. Um índice de cooperativida
de, Rx, é calculado, o qual mostra o número de vezes de
mudança na pO2 necessário para mudar Y de um valor
de Y = 0,1 (10% dos sítios ocupados) para um valor de Y
= 0,9 (90% dos sítios ocupados), para os valores de coe
ficiente de Hill encontrados experimentalmente. Para a
mioglobina, nH = 1 e uma mudança de 81 vezes na con
centração de oxigênio é necessária para mudar o valor
de Y = 0,1 para Y = 0,9. Para a hemoglobina, nH = 2,8, e
uma mudança de apenas 4,8 vezes na concentração de
oxigênio é necessária para a mesma mudança de Y.
Mecanismo Molecular de Cooperatividade
na Ligação de O2
Dados de difração de raios-X da desoxi-hemoglo
bina mostram que os átomos ferrosos na realidade
situam-se fora do plano de suas porfirinas em cerca de
0,4–0,6 Å. A configuração eletrônica do átomo ferroso
com cinco coordenações na desoxi-hemoglobina tem
um raio ligeiramente maior do que a distância entre o
centro da porfirina e cada átomo de nitrogênio pirróli
co. Consequentemente, o ferro só pode ser colocado no
centro da porfirina com alguma distorção na confor
mação da porfirina. Provavelmente mais importante
é que, se o átomo de ferro ficar no plano da porfirina,
o imidazol da His F8 proximal vai interagir desfavora
velmente com a porfirina. Essa interação estérica des
18,7
2,0 9,0
2,8
3,5 4,8
3,5
Cooperatividade positiva de
6,0 2,1 substrato
10,0 1,6
20,0 1,3
Fonte: Baseado na Tabela 7.1 de Cornish-Bowden, A. Principles of
Enzyme Kinetics. London: Butterworths Scientific Publishers, 1976.
A energia da ligação de O2 supera a interação repul
siva entre a His F8 e a porfirina, e o átomo ferroso move
-se para dentro do plano da porfirina. Esta é a posição
termodinamicamente mais estável para o oxi-heme, o
átomo de ferro com seis ligantes tendo um ligante axial
em cada lado do plano da porfirina, e a repulsão esté
rica de um ligante axial é equilibrada pela repulsão do
segundo ligante axial do lado oposto, quando o átomo
ferroso está no centro. O raio do átomo de ferro com seis
ligações também é reduzido, de modo que ele caiba no
centro da porfirina sem distorção da conformação da
porfirina.
Como a repulsão estérica entre a porfirina e a His
F8 na conformação desoxi deve ser superada na asso
ciação com O2, a ligação do primeiro O2 é caracteriza
da por uma constante de afinidade relativamente bai
xa. Entretanto, após a ligação de O2 ao primeiro heme,
a mudança do ferro para o centro da porfirina dispara
uma mudança conformacional nas outras subunidades
da molécula de hemoglobina. Essa mudança resulta
em uma maior afinidade do O2 pelos outros sítios heme
desocupados.
374 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

C
O do O2 a uma das subunidades heme da molécula tetra
NH
mérica empurra a conformação molecular do estado
CH2 CH conformacional T para o R. A constante de afinidade
Histidina
para O2 é maior no estado R por um fator de 150-300,
repulsive
Contato HC
HN C proximal dependendo das condições da solução.
CH

C CH N
CH
3
C CH CH3 Hemoglobina Facilita o Transporte
C C
N C
O CH2
Grupo C CH C
CH2
N Fe C
C CH de CO2 e NO
Heme N
C N CH
C C
CH3
CH2
A sobrevivência das células depende da capacidade
O C C C C da hemoglobina dos eritrócitos entregar O2 para o meta
CH2 C CH3
CH CH2
O bolismo celular e para facilitar o transporte de CO2, das
O
CH2 células para os pulmões. A hemoglobina também liga o
C
Valina vasodilatador NO, e o entrega para as paredes vascula
CH3
Distal CH CH res dos tecidos. O equilíbrio conformacional entre T e
CH3 O
C CH
N R da molécula de hemoglobina controla a entrega de O2,
NH HN CO2 e NO para seus locais corretos. Em decorrência das
O CH mudanças no pKa dos grupos ácidos das cadeias laterais
C
CH
entre as conformações T e R, o equilíbrio TR é regu
CH2 Histidina
C
Distal lado pela concentração do íon hidrogênio. As mudanças
NH
no pH ligam a entrega de O2 e NO para os tecidos com o
transporte de CO2 para longe dos tecidos.
FIGURA9.26 Impedimento estérico entre a histidina
proximal e a porfirina na desoxi-hemoglobina.
Redesenhado de Perutz, M. Sci. Am. 239:92, 1978. Copyright© Diminuição no pKa de Grupos Ácidos
(1978), Scientific American, Inc. Todos os direitos reservados.
com Carga da Conformação T para R
A mudança de conformação envolve os seguintes
eventos
puxa o Fe2+
sequenciais
para dentro
interligados: da aporfirina.
do plano(1) ligação de O2
Libera Prótons
(2) O A Equação 9.10 mostra a liberação de prótons à me
movimento do Fe2+ move a His F8 proximal ligada em dida que a conformação T é convertida na conformação
direção à porfirina. (3) A posição da hélice F covalen R. Essa liberação de prótons no pH do sangue é o efeito
temente ligada, da qual a His F8 faz parte, consequen Bohr alcalino e é de importância fisiológica.
temente muda. (4) A dobra de interligação FG da subu
nidade muda de posição; isso desestabiliza a interação HbT +4O2 ⇌ HbR(O2)4 + nH+ (9.10)
não-covalente da dobra FG com a hélice C da subunida
de adjacente na interface das subunidades a1b2 ou a2b1
O2 O valor de n na Equação 9.10 (equivalentes de pró
(Figuras 9.27 e 9.28). (5) A estrutura da globina adja tons liberados quando uma molécula de desoxi-Hb é
cente muda para uma conformação que permite que o convertida em oxi-Hb) varia entre 1,2 e 2,7, dependen
se ligue ao seu heme com maior afinidade. do das condições da solução e da concentração de íon
cloreto e de 2,3-bisfosfoglicerato. De acordo com a lei de
Assim, os contatos entre as subunidades FG e Cagem
ação das massas, o aumento na concentração de íons hi
como um comutador entre dois arranjos diferentes da
drogênio no lado direito da Equação 9.10, força o equilí
dobra FG de uma subunidade e da hélice C da subu
brio para a esquerda, em direção a concentrações cres
nidade adjacente. A nova conformação permite que os
centes de desoxi-Hb e O2 livre. A atividade metabólica
resíduos de His F8 nas cadeias da desoxiglobina aproxi
celular elevada aumenta a liberação de ácido carbônico
mem suas porfirinas na associação com O2 com menos
a partir de CO2 e ácido lático (p. 620), e consequente
repulsão estérica (Figura 9.28). O2 liga-se aos hemes
mente eleva a concentração de íons hidrogênio (acidez)
desocupados na conformação modificada, com maior
do sangue no ambiente celular. O aumento de acidez
afinidade. Além disso, interações iônicas que estabili
força a oxi-Hb para desoxi-Hb com a dissociação de O2,
zam a conformação desoxi (Figura 9.29) são quebradas
que é entregue para as células que estão metabolizan
pela mudança de conformação induzida pela ligação do
do. Essa é uma alça de retroalimentação (feedback),
O2 a um dos hemes, permitindo que a conformação oxi na qual o resíduo ácido metabólico celular sinaliza um
de outras subunidades se forme mais facilmente.
aumento na dissociação de O2, necessário para a conti
A conformação desoxi da hemoglobina é a tensa ou nuidade do metabolismo celular. O aumento na concen
estado conformacional T. A forma oxi, com maior afini tração de íons de hidrogênio induz a entrega de O2 por
dade por O2, é relaxada ou estado conformacional R. meio de seu efeito sobre o equilíbrio entre as conforma
O mecanismo alostérico descreve como a ligação inicial ções R e T da molécula de hemoglobina.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 375

Por que os prótons se dissociam

EF1 EF da hemoglobina quando a conforma
F!
ção T se converte na conformação R?
β2 F1 β1 Os prótons se dissociam quando as
A!
cadeias laterais ácidas da hemoglobi
A F E!
na ficam mais acídicas na conforma
F8 ção R do que na conformação T. Isso
H!
H G requer que o pKa desses grupos seja
FG4 mais baixo na conformação R.
B FG5
G9
G G3
G1 G! C3 C B14
G4 C6
CD5 A His-146(b) é a principal contri
C!
E1
E
G3
buidor por essa dissociação de pró
C7
E1
CD5 G! C5 C6
G1 ton na conversão da conformação T
C C3 G2
FG5 G9 para R. Na conformação T, a carga
C2 FG4
FG3 E7
positiva da cadeia lateral imidazólio
F!
da His-146(b) está em um par iônico
D1 F8 E B umcadeia
H! H cargaa positiva
com e tem da
carga negativa pKa late
F
ral carboxilato da Asp-94(b) (Figura
E! A
A!
9.30). O carboxilato carregado ne
α2 F1 α1 gativamente estabiliza o imidazólio
carregado positivamente. O imida
EF EF1
zólio estabilizado tende a reter sua
maior
do que o normal (aproximadamente
(a) 7,7). Conversão da hemoglobina para
Y a conformação R quebra esse par iô
nico, colocando as cadeias laterais de
Asp e His em novas posições na con
N α1 formação R, em que os grupos de car
gas opostas não mais interagem for
F
temente, e essa perda de interação
A de cargas opostas reverte o imidazó
HC
E lio da His-146(b) para um pKa mais
F H normal, de aproximadamente 7,3. A
D mudança no pKa da His-146(b) para
FG um valor mais acídico na conversão
G para a conformação R resulta na dis
B C
sociação de prótons no pH do sangue
X
G C (7,4 ). Aproximadamente 50% dos
B
prótons que se dissociam vêm do
FG imidazólio da b−His-146. O resto vem
de outros grupos ácidos que de modo
H F
HC semelhante mudam seus pKa de va
A E lores mais altos para mais baixos na
β2 mudança de conformação T para R.
F
A Figura 9.31 mostra o gráfico da
N fração de saturação dos sítios de li
gação de O2 na hemoglobina versus
(b)
a concentração de O2 para Hb em di
FIGURA 9.27 Estrutura quaternária da hemoglobina, mostrando as interações ferentes valores de pH. Em pH mais
da dobra FG com a hélice C na interface a1–b2. acídico (maior [H+]), a hemoglobi
(a) São mostrados contatos na interface a1–b2 entre as dobras FG e a hélice C. (b) Re na dissocia seu O2 mais facilmente
presentação cilíndrica das subunidades a1 e b2 da hemoglobina, mostrando os contatos (Equação 9.10), e a curva é desloca
da interface a1–b2 entre a dobra FG e a hélice C, vistos de lados opostos do plano xy da para a direita. Da mesma forma,
de (a). o valor de P50 em pH mais acídico
(a) Reproduzida com permissão de Dickerson, R.E. e Geis, I. The Structure and Ac é maior. O P50 mais alto representa
tion of Proteins. Menlo Park, CA: Benjamim, 1969, 56. (b) Reproduzida com permissão uma afinidade menor pelo O2, visto
de Baldwin, J. e Chothia, C. J. Mol. Biol. 129:175, 1979. Copyright © (1979), Academic
Press. Inc. [London] Ltd.
que os sítios de ligação de O2 estão
50% saturados em p(O2) mais alta.
376 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

89
Val His92
FG1 Leu
85 98 FB
F6 88
Asn102
G4
Fe
Pirrol Fe Prrol 1

Leu86
F7 CO Val
67
Leu31 E11
Cδ B13
Leu91 Lys66
Val93 Cε
FG3 Leu83 E10
FG5 Leu28
His87
Fe F4
B10 His63
E7
CH4 CH2
C
Gly29
O B11

(a) (b)

FIGURA 9.28Diagramas de barras e preenchimento de espaço desenhados por computação gráfica mostrando os
movimentos dos resíduos na vizinhança do heme na transição da desoxi-hemoglobina para a oxi-hemoglobina.
(a)A linha preta delineia a posição da cadeia polipeptídica e His síduos de aminoácidos em uma subunidade b usando diagrama
F8 na monóxido de carbono hemoglobina, um modelo de oxi de preenchimento de espaço. A identificação dos resíduos está
-hemoglobina. A linha vermelha delineia as posições das mesmas no centro de densidade para a conformação desoxi.
regiões para desoxi-hemoglobina. A posição do átomo de ferro é Redesenhado com permissão de Baldwin, J. e Chothia, C. J. Mol.
mostrada por círculos. Os movimentos são da uma subunidade Biol. 129:175, 1979. Direitos autorais 1979, Academic Press.
a. (b) São mostrados movimentos semelhantes na posição de re Inc. [London] Ltd.

Em pH mais alto, a curva é deslocada para a esquerda e gue vizinho e entra nos eritrócitos. Lá o CO2 é rapida
o valor de P50 diminui, refletindo uma maior afinidade mente convertido, pela ação da enzima anidrase carbô
por O2. nica, em ácido carbônico por uma reação de hidratação
(Equação 9.11).

+NH3H10 α1 Lys
CO2 + H2O  H2CO3 (9.11)
COO– –OOC A4α1 Asp H2CO3  HCO3– + H+ (9.12)
HC3 α2 *H3+
NNA1 α1 Val
Arg Cl–
Subsequentemente, o ácido carbônico dissocia-se
espontaneamente em HCO3– e um H+ (Equação 9.12). O
Gua+ –OOC
+ H9 α1 Asp HCO–3 se difunde para fora dos eritrócitos e é carregado
COO–H3NC5 α1 Lys para o pulmão pelo plasma (Figura 9.32). Esse trans
porte de CO2 dos tecidos para o pulmão no plasma como
FG1 β2HC3 β2 His
bicarbonato (HCO3–) é conhecido como transporte iso
Asp COO– *Im+ -hídrico. Aproximadamente 70–80% do CO2 produzido
CD2 β2 GluCOO– Gua+ FG4 α1 Arg pelas células é transportado para o pulmão por esse
mecanismo.
FIGURA 9.29 Pontes salinas entre subunidades da desoxi
Os íons hidrogênio que se dissociam do ácido car
hemoglobina que são quebradas na oxi-hemoglobina.
Im+ é imidazol, Gua+ é guanidina, e os resíduos marcados com bônico ligam-se à hemoglobina, de acordo com a Equa
asteriscos são responsáveis por aproximadamente 60% do efei ção 9.10, e forçam a Hb(O2)4 a dissociar seu O2, que se
to Bohr alcalino. difunde para fora do eritrócito, em direção às células
Redesenhado de Perutz, M. Br. Med. Bull. 32:195, 1976. do tecido. A hemoglobina então age como um tampão
do pH do sangue, ligando os íons hidrogênio produzi
O Transporte de CO2 e de O2 é Ligado por dos pelas células em metabolismo e impedindo que o
Prótons do Efeito Bohr pH do sangue se torne muito ácido. Os prótons se ligam
a cadeias laterais como o imidazólio da His-146(b) nas
Células em metabolismo utilizam O2 e produzem duas cadeias b. A desoxi H+.Hb é transportada para os
CO2. O CO2 produzido pelas células difunde para o san pulmões, nos eritrócitos.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 377

difunde para os alvéolos pulmonares e

é expirado no ar (Figura 9.32).
heme
Um segundo mecanismo de trans
par iônico porte de CO2, que responde por 15–20%
do CO2 transportado dos tecidos para os
F8-His-93 pulmões, é pela carbamino-hemoglobi
na, formada pela reação não-enzimática
de CO2 com os grupos amino NH2-ter
minais das cadeias polipeptídicas de Hb
His-146 (Equação 9.13). Essa reação que produz
+ carbamino-Hb também produz H+.
–
HbNH2 + CO2  HbNHCO2– + H+ (9.13)

O excesso de H+ produzido pela for

Asp-94 mação de carbamino-Hb então se liga à
hemoglobina e estabiliza a forma deso
xi, promovendo a liberação e a entrega
FIGURA 9.30 Par iônico entre os grupos de cadeia lateral imidazol da bHis de O2 às células em metabolismo ativo
146 e carboxilato do ßAsp 94 na conformação desoxi (T) da hemoglobina. (Equação 9.10 e Figura 9.33).
Uma estrutura parcial da cadeia b mostrando o esqueleto da cadeia polipeptídica
para os aminoácidos 87 a 95 e 142 a 146 da cadeia b na conformação desoxi. Só as No pulmão, a alta concentração de
cadeias laterais de Asp-94, His-146 e F8 His-92 ligadas ao heme da subunidade b H+
pO2(Equação
gera Hb(O2)4,
9.10).com
Essedissociação
aumento de
são mostradas. Os átomos de oxigênio estão coloridos em vermelho, os átomos de em
nitrogênio estão em azul, e os átomos de carbono e hidrogênio são pretos. A ponte H+ força a dissociação do grupo carba
de hidrogênio (linha tracejada) é mostrada entre o N-H imidazólio carregado positi mino com a liberação de CO2 (reverso
vamente da ßHis-146 e o oxigênio carboxilato carregado negativamente do bAsp-94. da Equação 9.13), que é expirado dos
Desenho feito com o Swiss-PdbViewer usando PDB estrutura 1A3N.
pulmões (Figura 9.33).

pressão de pO2 (a) Eritrócitos em capilares dos tecidos

em capilares de pressão de pO2
músculo ativo nos pulmões
CO2 CO2 + H2O
das
dosHCO
células
tecidos H2 anidrase carbônica

CO3 + Hb(O2)4
)
P50 pH
(b)
expirado
Eritrócitos
plasma
HCO
COpara
2-3 em
o ar
capilaresHCO
do pulmão
-3 + H+Hb + 4O2 O2
mais baixo
para células
dos tecidos

CO2 + H2O
H2 anidrase carbônica
p(O)2 (torr)
CO3 + Hb(O2)4
P50

plasma
-3 HCO-3 + H+Hb + 4O2 O2
FIGURA 9.31 Mudança na curva de saturação de do ar
oxigênio-hemoglobina para valores mais altos de P50
com queda no pH (aumento em [H+]). FIGURA 9.32 Transporte iso-hídrico de CO2 como
bicarbonato.
(a) Reações nos eritrócitos, nos tecidos. O CO2 difunde para os
Nos pulmões, as mesmas reações que ocorreram eritrócitos a partir dos tecidos e é convertido em ácido carbôni
nos tecidos são agora forçadas na direção reversa co pela anidrase carbônica (Equação 9.11). O ácido carbônico
próton que se dissocia
espontaneamente se dissocia
do ácidoecarbônico
m H+ e HCO(H+
–3 (Equação
em negrito)
9.12).
liga-se
O
pela alta concentração de O2 no pulmão. A alta con
centração pO2 converte H+Hb(T) na conformação
à desoxi-Hb, forçando o equilíbrio de O2-Hb de oxi-hemoglobina
Hb(O2)4(R), os prótons se dissociam (Equação 9.10)
e combinam com para desoxi-hemoglobina (Equação 9.10), com a dissociação de
moléculas de HCO3–, que se difundem O2, que difunde para fora dos eritrócitos, para os tecidos. O HCO3
de volta para os eritrócitos a partir do plasma, para se difunde para fora dos eritrócitos e é transportado no plasma
formar ácido carbônico (H2CO3, reverso da Equação para os pulmões (fora da célula). (b) Reações nos eritrócitos em
9.12). A anidrase carbônica dos eritrócitos converte nível do pulmão. No pulmão, a alta pressão de O2 força as reações
H2CO3 em CO2 e H2O (reverso da Equação 9.11). O CO2 na direção oposta. As reações são o inverso das dos capilares.
378 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

(a) Eritrócitos nos capilares dos tecidos b] (Figura 9.36). O BPG tem uma carga de menos cinco
(Figura 9.34) e é fortemente atraído pelas cargas po
dasCO
células
2 CO2 + HbNH2
sitivas do sítio de ligação da interface b–b. Na confor
dos tecidos mação R, o tamanho do bolsão de ligação fica menor,
HbNH-CO2– + H+ + Hb(O2)4
tornando o BPG incapaz de caber facilmente no bolsão
de ligação. Portanto, a conversão de T para R leva a uma
H+Hb + 4O2 O2
dissociação do BPG ligado.
para as células
dos tecidos

(b) Eritrócitos nos capilares do pulmão O

O OJ OJ

COo2 ar HC HO P O
para CO2 + HbNH2
OJ O C OJ
HbNH-CO2– + H+ + Hb(O2)4 P H
OJ

H+Hb + 4O2 O2
FIGURA 9.34 Estrutura do 2,3-bisfosfoglicerato (BPG). A
do ar
molécula tem uma carga de –5 em pH 7,4.
FIGURA 9.33 Transporte de CO2 como carbamino
hemoglobina.
pressão pO2
(a) Reações nos eritrócitos, nos tecidos. O CO2 difunde-se em capilares
músculo ativode pressão(torr)
pO2
para os eritrócitos e reage com o amino grupo NH2-terminal de nos pulmões
cadeias de hemoglobina para formar carbamino-hemoglobina
(Equação 9.13). A reação libera um próton (H+ em negrito),
que promove a dissociação de O2 da hemoglobina. O O2 difun
de-se para fora dos eritrócitos, para os tecidos. (b) Reações )
P50 BPG p(O)2
nos eritrócitos em nível do pulmão. No pulmão, a alta pressão mais alta
de O2 força as reações na direção oposta, levando à expiração
de CO2 do pulmão. As reações são o inverso das dos capilares.

2,3-Bisfosfoglicerato (BPG) em Eritrócitos

Modula a Liberação de Oxigênio da
Hemoglobina
P50
Um importante modulador do equilíbrio da hemo
globina é o 2,3-bisfosfoglicerato (BPG) ou 2,3-difos FIGURA 9.35 Mudança na curva de saturação de
foglicerato (DPG) (Figura 9.34). BPG é formado em oxigênio–hemoglobina para valores mais altos de P50
uma via minoritária do metabolismo de glicose e está com aumento na concentração de BPG.
presente em pequenas quantidades em todas as célu
Condições que causam hipoxia (deficiência de oxi
las. Entretanto, no eritrócito essa via é muito ativa, e
as concentrações de BPG são aproximadamente equi gênio) como anemia, fumo e altitudes elevadas, aumen
tam os níveis de BPG nos eritrócitos. Por sua vez, as
molares à de hemoglobina. BPG liga-se à conformação
condições que levam a hiperoxia resultam em níveis
desoxi (T), mas não à oxi (R). A ligação de BPG à Hb
mais baixos de BPG. As mudanças nos níveis de BPG
estabiliza a conformação T e aumenta sua concentração
dos eritrócitos são lentas e ocorrem ao longo de horas
em relação à conformação R. BPG dissocia-se à medida
e dias para compensar mudanças crônicas nos níveis
que desoxi-Hb é convertida em oxi-Hb (Equação 9.14).
de pO2.
H+BPG × Hb + 4O2  Hb(O2)4 + BPG + nH+ (9.14)

Concentrações aumentadas de BPG forçam o equi Hemoglobina Entrega Óxido Nítrico

líbrio (Equação 9.14) para a esquerda, e também des
locam a curva de saturação para a direita, com um
aumento na P50 (Figura 9.35). De modo diferente, con
centrações mais baixas de BPG forçam esse equilíbrio
para a direita, e também deslocam a curva de saturação
para a esquerda, com P50 mais baixo.
Uma única molécula de BPG liga-se dentro de um
bolsão formado na interface das subunidades b1–b2 na
conformação T. Esse local contém oito grupos carre
gados positivamente [os resíduos de His-143(b), Lys
-82(b), His-2(b) e o NH2-terminal de ambas as cadeias
(NO) para a Parede Capilar de
Tecidos onde Promove Entrega de
O2
A hemoglobina liga reversivelmente óxido nítrico
(NO), um potente vasodilatador, com um tempo de vida
muito curto no sangue. Por ligar NO, a hemoglobina o
sequestra de rápida destruição. Hb libera NO transfe
rindo-o para moléculas sulfidrila pequenas (X-SH),
quando a hemoglobina muda da conformação oxi(R)
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 379

93 da cadeia b (bCys93). O ferro do heme liga

preferencialmente NO quando na conforma
ção T. O NO é transferido para bCys93 quando
a hemoglobina está na conformação R. Então,
quando a conformação R muda novamente
transferido
para T parada
entregar 2 para
bCys93Opara moléculas
os tecidos,
X-SH peé
o NO

quenas, como a glutationa (Figuras 9.37 e 9.38).

O efeito final é a conversão pela hemoglobina de
NO livre instável no plasma em X-S-NO estável.

A Figura 9.39 mostra a região da hemoglo

bina que contém bCys93-S-NO. Na conforma
ção T, o S-NO fica no lado de fora e acessível
às moléculas de glutationa. Isso permite que
trans-nitrosilação ocorra. Diferentemente, na
conformação R, a bCys93-SH aponta para o
ferro do heme e está inacessível ao solvente
de fora. A distância na conformação R entre o
ferro do heme e a bCys93 é ótima para a trans
ferência do NO do heme para a bCys93-SH.
Assim, as mudanças conformacionais da molé
cula de hemoglobina, induzidas por mudanças
na pressão de oxigênio entre os pulmões e os
tecidos, regulam a captação de NO e a libera
ção da bCys93. O resultado final é a entrega de
NO bioativo para os capilares dos tecidos sob
baixa tensão de oxigênio.

FIGURA 9.36 Sítio de ligação de 2,3-bisfosfoglicerato na interface

b–b da desoxi-hemoglobina.
São mostradas as cadeias laterais carregadas positivamente das amônias
amino-terminais das duas bVal-1, imidazólio da bHis-2, e-amino da bLys-82
e imidazólio da bHis-143. O 2,3-bisfosfoglicerato carregado negativamente
se liga ao meio do anel de grupos carregados positivamente.
Reproduzido com permissão de Dickerson, R. E. e Geis, I. Hemoglobin:
Structure, Function, Evolution, and Pathology. Menlo Park, CA: Ben
jamin-Cummings, 1983. Ilustração de Irving Geis. Imagem de Irving Geis
Collection, Howard Hughes Medical Institute. Direitos pertencem a HHMI.
Não reproduzir sem permissão.

para a desoxi(T). Uma molécula X-SH comum é a glu H3 O

tationa (Figura 9.37). O composto X-S-NO continua a N

estabilizar NO contra degradação e permite a entrega S

eficiente de um equivalente de NO bioativo (X-S-NO) HC H
aos receptores de NO nas células da parede dos vasos H
N+ -Glu NH
Cys C H Gly
sanguíneos, promovendo o relaxamento da parede vas CC
C H C
H CNHC H O
cular. O relaxamento facilita a transferência de gases
entre o sangue e as células dos tecidos. A concentração H H O O C
OJ
molar de NO no sangue é 1/70 da concentração de Hb. O H OH

Entretanto, essa baixa concentração é fisiologicamente

significativa em virtude da potente atividade biológica
de X-S-NO.
NO é primeiro capturado pelo Fe2+ do heme e, de
pois, transferido para a sulfidrila de resíduos de cisteína
FIGURA 9.37 O transportador X-S-NO.
Glutationa (g-glutamil-cisteinil-glicina) transporta NO ligado à
cadeia lateral sulfidrila de sua cisteína.
380 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

VEIA ARTÉRIA
1 HS SH O2
2 O2 HS SH O2
ββααCO CO2 ββ
α
2 α

T O2 R O2

HSON SH ONS
2 SH O
5 6 O 2
β β β β
α α α α
X-SNO
O2 T O2 R O2

X-SNO

CO2
8 HSON SH 7 HS SH
β β β β
α α CO2 α α

T 4 O2 T

4 ββ
HS SH β SH O2
3 O2 HS
NO
β
αNOTα NOααR O

CAPILAR 3 O2 1O2 ARTERÍOLA

FIGURA 9.38 Ligação e liberação de NO pela hemoglobina durante o ciclo

respiratório.
O modelo mostra a ligação e a dissociação de NO, O2 e CO2 enquanto uma mo
lécula de hemoglobina faz dois ciclos completos na circulação. O primeiro ciclo
envolve os intermediários 1–4, e o segundo ciclo, os intermediários 5–8. As con
formações T e R são mostradas, e os grupos SH são da cadeia lateral de bCys93. O
NO é ligado diretamente a um ferro-heme ou ao SH da bCys93.
As etapas-chaves no transporte de NO são sua ligação inicial a um heme no
intermediário 3 e a transferência do heme de uma subunidade b para bCys93 no
intermediário 6 (conformação R) e sua transferência para uma molécula tiolpe
quena X-SH no intermediário 7 (conformação T), quando a hemoglobina é con
vertida de R para T. A molécula de hemoglobina representada pode ser apenas
1 em 1.000 moléculas de hemoglobina circulantes, em virtude da relativamente
baixa concentração molar de NO no sangue.
Redesenhado de Gross, S. S. e Lane, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9967, 1999.

FIGURA 9.39 Estrutura de ßCys93 e de ßCys93-S-NO nas conformações T e R.

Em todas as estruturas, a borda do heme (H, vermelho) aponta para o leitor e mos
tra estar ligada ao imidazol da histidina proximal (F8). Os dois carbonos (cinza) e o
enxofre (amarelo-esverdeado) da cadeia lateral da Cys-93 são apresentados como
modelos de preenchimento espacial. Nos painéis C e D, o NO é ligado ao enxofre
da bCys93 com o átomo de N, em azul, e o átomo de oxigênio colorido em vermelho.
A. A conformação desoxi (T) com a cadeia lateral da bCys93 (—CH2—SH) na su
perfície da molécula, longe do heme. A cadeia lateral da cisteína é impedida de
entrar no sítio de ligação do heme pelo pariônico, ligado por pontes de hidrogênio,
formado pelo imidazólio da bHis146 e o carboxilato do bAsp94 (ponte de H entre
grupos mostrada em amarelo) no lado direito superior e atrás da cadeia lateral da
bCys93-SH.
B. A conformação oxi(R) com a cadeia lateral da bCys93 apontada para o heme e longe do solvente no lado externo da molécula. A ponte
salina entre bHis146 e bAsp94 é quebrada na conformação R, permitindo a dobra de bCys-SH em direção ao bolsão do heme.
C. Modelo de bCys93-SNO na conformação desoxi (T). O SNO é posicionado no lado de fora, ficando acessível para reagir com moléculas
pequenas X-SH no solvente. Como em A, a cadeia lateral da cisteína é impedida de entrar no sítio do heme pelo pariônico bHis146-bAsp94.
D. Modelo de bCys93-SNO na conformação oxi(R). O SNO fica mergulhado próximo do heme e longe do solvente do lado externo. Essa
conformação facilita a transferência de NO do ferro-heme para o SH da cisteína e impede a reação de bCys93-SNO com moléculas X-SH
no solvente.
De Stamler, J. S., Jia, L., Eu, J. P., McMahon, T. J., et al. Science 276:2034, 1997. Reimpresso com permissão de AAAS.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 381

9.5 O COMPLEXO PROTEICO DA Composição em Proteínas da Lâmina

LÂMINA BASAL
Uma lâmina basal é um complexo muito estrutura
do de proteínas de matriz extracelular observado mi
croscopicamente como uma região amorfa densamente
empacotada de cerca de 50–100 nm de espessura cir
cundando tecidos ou células (Figura 9.40). O termo
membrana basal é usado para descrever a lâmina basal
e os colágenos fibrilares ligados ao seu lado externo. A
membrana basal dá suporte aos tecidos e regula o aces
so de células ao estroma intersticial. Também partici
pa da determinação das propriedades das células que
estão ligadas a ela, incluindo os processos críticos de
divisão celular, morte (apoptose), diferenciação e mi
gração. Todas as células produzem constituintes da
membrana basal, e cada membrana basal tem caracte
rísticas do tipo de células a partir do qual é sintetiza
da. Uma membrana basal sublinha camadas de células
epiteliais e endoteliais, e circunda outros tipos de cé
lulas (Figura 9.40). Uma membrana basal separa duas
camadas de células no glomérulo renal, onde
funciona como um filtro seletivo. Camada epitelial
Basal
A lâmina basal é composta de colágeno tipo IV, la
minina, nidogen (também chamado entactina) e perle
cam, um proteoglicano de heparam sulfato. Além disso,
pequenas quantidades de talvez 50 outras proteínas
podem estar presentes, incluindo osteopontina (tam
bém chamada BM-40 ou SPARC), fibulina, colágeno
tipo XV, colágeno tipo XVIII e o proteoglicano agrim.
A diversidade e a especificidade tecidual de uma mem
brana basal é determinada pelas isoformas de colágeno
tipo IV e laminina e os tipos de proteínas minoritárias
presentes. As isoformas de colágeno tipo IV são produ
zidas por sete genes diferentes de colágeno tipo IV. Es
sas isoformas compartilham homologia de estrutura de
domínios, mas diferem em 30–50% em suas sequências
de aminoácidos. Existem pelo menos 12 isoformas dife
rentes de laminina. As isoformas de colágeno tipo IV e
laminina expressas são características do tipo celular
e do tecido que sintetiza a membrana basal associada.
Testísculo

A lâmina basal é formada pela associações

não-covalentes entre sítios específicos locali Membrana
zados nos domínios de ligação das proteínas basal
às células
dapor Cristalino
associadas.
basal tambémMuitas
se ligam
proteínas membrana
meio de

domínios de ligação celular nas proteínas e

receptores celulares proteicos na membrana Músculo
proteínas
celular externa.
é composta
A estrutura
de unidades
de muitas
modulares
das (a)

com homologia de sequência e de dobras com

superdobras comuns, como as dobras de imu
noglobulinas (Ig) e de fator de crescimento
epidérmico (EGF). Essas dobras são encon
tradas repetitivamente e são os blocos cons
trutores de proteínas de matriz extracelular.
Enquanto os módulos EGF dessas proteínas
não parecem ter função de fator de cresci
mento, as proteínas fatores de crescimento e
citocinas são encontradas dentro da lâmina
basal, particularmente em associação com as
partes carboidrato dos componentes proteo
da
glicanos.
membrana
Durante
basalainduzida
reciclagem
por (turnover)
proteases e

heparanases, esses fatores de crescimento e

citocinas
lulas vizinhas.
são liberados
Além disso,
para muitas
agirem proteínas
sobre cé- (b)

da lâmina basal escondem atividades crípti FIGURA 9.40 Membranas basais.

cas que são ativadas quando clivadas da se
quência completa pela ação de proteases (ver
endostatina, p. 1043). O pró-protease plas
minogênio está ubiquamente presente na
matriz extracelular e é ativado pela secreção
celular de ativadores de plasminogênio (p.
1016).
(a) Diagrama de membranas basais circundando vários tecidos e tipos celu
lares. (b) Micrografia eletrônica mostrando a ultraestrutura da matriz extra
celular com membrana basal adjacente à célula epitelial (E). A lâmina lúcida
(LL) e a lâmina densa (LD) ou lâmina basal da membrana basal é mostrada.
Abaixo da lâmina densa está o estroma da matriz extracelular. Barra repre
senta 100 nm.
(a) Reproduzida com permissão de Kalluri, R. Nature Rev. Cancer 3:422-433,
2003. (b) Reproduzida com permissão de Bosman, F. T., e Stamenkovic, I. J.
Pathol. 200:423, 2003.
382 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
A Estrutura Molecular da Lâmina
Basal É Formada a Partir de uma
Rede de Laminina e Colágeno
Tipo IV
A estrutura do complexo de proteínas da lâmina ba
sal é produzida pela conexão de redes planas de lamini
na e colágeno tipo IV. As moléculas do nidogem/entac
tina e do proteoglicano perlecam ligam essas redes. A
estrutura polimérica da laminina inicia a formação da
membrana basal, facilitada por sua ligação a receptores
celulares (Figura 9.41).
Rede de Laminina
A laminina é composta por três cadeias polipeptídi
cas (a, b e g) ligadas por pontes dissulfeto. Cada cadeia
contém cerca de 1.500 aminoácidos, e o peso molecular
da isoforma laminina-1 tem aproximadamente 800 kD. A
estrutura geral parece como uma cruz assimétrica (Fi
gura 9.42). A estrutura cruciforme contém três braços
(a)
Núcleo Citoplasma
(b)
Membrana celular
(c)
Colágeno tipo IV (entactina)
Nidogem Floulina
Perlecam Lamininas Receptor/âncora
FIGURA 9.41 Estrutura molecular da lâmina basal.
As moléculas de laminina e de colágeno tipo IV se autoassociam
para formar estruturas em rede, em folheto, que são ligadas pe
las proteínas nidogem/entactina e pelo proteoglicano de hepa
ram sulfato perlecam. (a) Síntese de proteínas de membrana
basal pela célula. (b) Montagem da rede de laminina iniciada
pela ligação da laminina aos receptores da superfície celular. (c)
Montagem da rede de colágeno tipo IV e associação de proteí
nas ligando os esqueletos da laminina e do colágeno tipo IV. (d)
Rede de colágeno tipo IV unida por interações dos domínios 7S e
curtos, cada um formado por uma cadeia diferente, e um
braço longo composto por todas as três cadeias. Há cinco
genes distintos que codificam uma cadeia a e três para
cada uma das cadeias b e g, que se combinam para for
mar pelo menos 12 isoformas abg distintas. Diferentes
domínios na estrutura ligam-se ao perlecam e ao nido
gem, e pelo menos dois domínios contêm sítios de ligação
para receptores de superfície celular. Perto da superfície
celular, as moléculas de laminina se autoassociam para
formar uma estrutura em rede, em folheto, por meio de
interações entre sítios de ligação nos domínios dos bra
ços curtos da estrutura cruciforme (Figura 9.43).
Rede de Colágeno Tipo IV
As moléculas de colágeno contêm três cadeias poli
peptídicas que inicialmente se associam por interações
não-covalentes (p. 107). Colágenos que formam fibri
las, como o colágeno tipo I, contêm longos trechos das
sequências repetitivas (Gly-Pro-X)n/(Gly-HyPro-Y)n
contendo uma prolina ou hidroxiprolina (HyPro) e uma
glicina aproximadamente a cada três resíduos (p. 109).
Hidroxiprolina é um aminoácido derivado, formado pela
(d)
NC1 e com entactina/nidogem (En), fazendo ponte entre redes
de colágeno e laminina (Ln).
(a) – (c) Reproduzidas com permissão de Kalluri, R. Nature
Rev. Cancer 3:422, 2003. Copyright © (2003) Nature. (d) Re
produzida com permissão de Yurchenco, P. D. Assembly of ba
sement membrane networks. Em: Yurchenco, P. D., Birk, D. E.,
e Mecham, R. P. (Eds.), Extracellular Matrix Assembly and
Structure. New York: Academic Press, 1994, 351. Copyright ©
(1994) Elsevier.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS
α
N
N N
β γ
C com glicerol da molécula de laminina. A NH2-terminal da ca
C C
Domínio G
prolina hidroxilase no retículo endoplasmático a par
tir de resíduos de prolinas na cadeia nascente de pró
-colágeno. O alto conteúdo de prolina e hidroxiprolina
gera uma conformação helicoidal para essa sequência
conhecida como hélice de poliprolina tipo II (p. 109).
Essa hélice é caracterizada por três resíduos por volta
da hélice (n = 3), com uma Gly a cada três resíduos for
mando uma borda longitudinal de glicinas ao longo de
um lado da hélice que promove a autoagregação de três
polipeptídeos, cada um em uma conformação helicoidal
de poliprolina, em uma estrutura em tripla-hélice ou
(a) α α
Ca2+
β γ
β γ
(b)
• 383
FIGURA 9.42 Estrutura da laminina (isoforma 1).
(a) Estrutura diagramática da laminina-1. As cadeias a, b e g
da laminina formam, cada uma, um braço curto da estrutura
cruciforme. O braço longo é formado por uma estrutura espi
ralada-enrolada de regiões de a-hélice de todas as três cadeias
com a cadeia de a-laminina estendendo-se para forma para
formar o domínio globular COOH-terminal. Os braços curtos
são compostos de domínios globulares, que são separados por
repetições tipo fator de crescimento epidérmico (tipo-EGF).
(b) Réplica de sombreamento rotatório de contraste invertido
deia a e o domínio globular (G) da cadeia a indicados.
(a) Redesenhada com base em figura de Yurchenco, P. D. As
sembly of basement membrane networks. Em: Yurchenco, P.
D., Birk D. E. e Mecham R. P. (Eds.), Extracellular Matrix
Assembly and Structure. New York: Academic Press, 1994,
351. (b) Reproduzida com permissão de Yurchenco, P. D. As
sembly of basement membrane networks. Em: Yurchenco, P.
D., Birk D. E. e Mecham R. P. (Eds.), Extracellular Matrix
Assembly and Structure. New York: Academic Press, 1994,
351. © (1994) Elsevier.
super-helicoidal. Esta molécula com três cadeias cons
titui a unidade protomérica do colágeno.
O Colágeno tipo IV não forma estruturas fibrilares
como colágeno tipo I, mas uma rede em folheto. Os po
lipeptídeos do colágeno tipo IV contêm regiões de sequ-
ências (Gly-X-Pro)n/(Gly-HyPro-Y)n que formam regiões
de tripla-hélice em forma de bastão, mas ao contrário do
tipo I, essas regiões são separadas por domínios de liga
ção e globulares que quebram as regiões super-helicoi
dais (Figura 9.44). O domínio globular da extremidade
(c) FIGURA 9.43 Formação da
estrutura em rede da laminina.
(a) e (b) Interações de ligações
entre os braços curtos de molécu
las diferentes de laminina levam a
estruturas em folhetos, em rede. A
entactina é mostrada ligada a um
braço curto de laminina, mas não é
necessária para a polimerização da
rede de laminina. Acredita-se que o
braço longo fique livre para partici
par de outras interações. (c) Rede
de laminina vista por réplicas em
platina com ângulo alto.
Figuras de Yurchenco, P. D. As
sembly of basement membrane
networks. Em: Yurchenco, P. D.,
Birk D. E. e Mecham R. P. (Eds.),
Extracellular Matrix Assembly
and Structure. New York: Acade
mic Press, 1994, 351. (a) e (b) Re
desenhadas e (c) reproduzida com
permissão. Copyright © (1994) El
sevier
384 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

N S 7S TH NC1 C de NC1 a NC1 (Figura 9.45). Então, os

1 500
dímeros interagem por suas regiões 7S
para formar tetrâmeros, que se autoa
gregam mais para formar uma rede pla
na. As interações dos 7S são os nós da
1000 1500 res estrutura em rede do colágeno.

FIGURA 9.44 Diagrama do protômero de colágeno tipo IV composto por três Nidogen/Entactina
cadeias polipeptídicas.
A linha superior mostra a localização, na estrutura primária, da região NC1, a re
Interconecta Redes de
gião da tripla-hélice central (TH) com a estrutura super-helicoidal, e a região 7S Laminina e de Colágeno Tipo IV
N-terminal. As barras pretas, linhas e caixas mostram as localizações das múltiplas
interrupções da sequência de Gly-X-Y nas cadeias de colágeno tipo IV. As duas isoformas, nidogem-1 e ni
Redesenhado de Yurchenco, P. D. Assembly of basement membrane networks. Em: dogem-2, têm 46% de homologia. Am
Yurchenco, P. D., Birk D. E. e Mecham R. P. (Eds.), Extracellular Matrix Assembly bas as formas são compostas por três
and Structure. New York: Academic Press, 1994, 351. Copyright © (1994) Elsevier. domínios globulares (G1, G2 e G3) se
parados por uma região de ligação en
C-terminal do protômero é chamado domínio NC1 (não tre G1 e G2 e uma região mais longa em forma de bas
-colágeno 1). Esse domínio C-terminal é precedido por tão entre G2 e G3 (Figura 9.46). O domínio G3 é uma
uma região central em tripla-hélice (TH) e uma região dobra em hélice-b composta de fitas-b antiparalelas
de articulação conectando a uma região de tripla-hélice que aparecem como lâminas de uma hélice de avião.
menor (7S) na extremidade N-terminal. É semelhante a uma dobra da proteína receptora de
LDL. Os nidogens ligam-se à laminina pela interação
Na montagem da rede de colágeno tipo IV, cada pro da interface da hélice-b com os domínios III e IV da
tômero liga-se a outro por uma interação cabeça-cabeça laminina (Figura 9.47). Outros sítios em nidogem for

Protômero
2

1
Dímero Hexâmero NC1

Tetrâmero de colágeno tipo IV

250 nm 25 nm

Domínio 7S

Supraestrutura do colágeno tipo IV

Hexâmero NC1

Domínio 7S

FIGURA 9.45 Formação da estrutura em rede do colágeno tipo IV.

A. Representação esquemática da formação da rede. (a) A mo ros forma a rede de colágeno tipo IV. B. Redes de colágeno tipo
lécula do protômero do colágeno tipo IV é formada a partir de IV vistas por uma réplica em ângulo alto de membrana basalam
três cadeias polipeptídicas (vermelho, púrpura e azul) no retí niótica observada in situ.
culo endoplasmático e complexo de Golgi da célula. As cadeias A. Redesenhada de Kalluri, R. Nature Rev. Câncer 3:422, 2003.
de colágeno são alinhadas com suas regiões 7S NH2-terminais B. Reimpressa com permissão de Yurchenco, P. D., e Ruben, J.
em uma extremidade e regiões NC1 COOH-terminais na outra Cell. Biol. 105:2559, 1987. Modificado de Yurchenco, P. D. As
extremidade. (b) Dois protômeros são unidos por seus domínios sembly of basement membrane networks. Em: Yurchenco, P. D.,
NC1 para formar um dímero de protômeros (cada protômero Birk D. E. e Mecham R. P. (Eds.), Extracellular Matrix Assem
tem três cadeias de modo que a interação é entre os domínios bly and Structure. New York: Academic Press, 1994, 351. Co
NC1 de seis cadeias). (c) Dois dímeros de protômeros ligam-se pyright © (1994) Elsevier.
pelas regiões 7S. (d) Polimerização de tetrâmeros de protôme
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS • 385

200 400 600 800 1000 1200 FIGURA9.46 Estrutura do nidogem. Estrutura
RGD esquemática da molécula de entactina/
* nidogem-1.
NH2 * * 1 2345
* 6 COOH
Os sítios potenciais para ligação de cálcio são marca
E/N-1
dos por asteriscos. Sítios de ligação de colágeno tipo
G1 G2 G3 IV e proteoglicano ficam no domínio G2, e o sítio de
Linha Bastão
ligação de laminina fica no domínio G3. A sequência
RGD (Arg-Gly-Asp) liga-se a receptores celulares tipo
Colágeno tipo IV Laminina
integrina.
proteoglicano
Redesenhado de Erickson, A. C. e Couchman, J. R. J.
motivo tipo-EGF motivo tipo-Thyroglobulin Região homóloga ao receptor de LDL Histochem. Cytochem. 48:1291, 2000.

hélice-β
do nidogem

(a) (b)

FIGURA 9.47 Detalhes moleculares das interações moleculares entre o nidogem e a laminina.
(a) Diagrama da fita do complexo hélice-b do nidogem do do Ca-traço e cadeias laterais formando a interação são mostrados
mínio G3 com módulos LE3-5 de laminina. As fitas b são nume em dourado. As linhas tracejadas verdes mostram as pontes de
radas na folha-b da hélice. (b) Vista da interação do nidogem hidrogênio.
com o domínio LE4 de laminina e a porção adjacente do domí Reimpresso com permissão de Takagi, I., Yang, Y., Lu, J., Wang,
nio LE3 da laminina. As porções do esqueleto do nidogem como H. e Springer, T. A. Nature 424:969, 2003.

mam complexos com o colágeno tipo IV e o perlecam param sulfato com laminina. Outros sítios do heparam
(Figura 9.48). sulfato ligam-se a receptores celulares e outros ainda, a
fatores de crescimento como TGF-b.
Proteoglicano de Heparam Sulfato
Perlecam Interconecta Redes de Laminina Colágeno IV
Laminina
e de Colágeno Tipo IV
Nidogen/entactina

O perlecam (PM 600 kDa) é o principal proteogli

cano da lâmina basal. Os proteoglicanos têm um es
queleto polipeptídico ligado por cadeias laterais de
serina, por meio de um tetrassacarídeo, a uma cadeia
de glicosaminoglicano (GAG), composta de um dissaca
rídeo de um aminoaçúcar (N-acetilglucosamina ou N G

-acetilgalactosamina) e um ácido urônico (glucurônico

ouidurônico). No perlecam, o GAG é o heparam sulfato
muito sulfatado (Figura 9.49). Cada perlecam contém
2-15 cadeias de heparam sulfato (GAG) (Figura 9.50). Perlecam
As cadeias sulfatadas de GAG são muito carregadas ne
gativamente e ligam cátions e água para formar géis.
Isso fornece uma pressão de inchamento que permite à
FIGURA 9.48 Interações do nidogem e o proteoglicano
membrana basal resistir a forças de compressão. O per perlecam.
lecam interage com os outros três componentes majori As setas mostram interações domínio-domínio entre as princi
tários da membrana basal por meio ou do seu esqueleto pais proteínas na superestrutura da membrana basal.
proteico com colágeno tipo IV ou de suas cadeias de he Redesenhada de Kalluri, R. Nature Rev. Cancer 3:422, 2003.
386 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Ser Contato Focal em

Domínio NS Domínio NA/NS Domínio NA Membrana Celular
OO Interconecta a Matriz
−GlcA−GlcNAc− −IdoA(2-OSO3)−(GlcNSO3(6-OSO3)−
OO
COO− OSO3− Extracelular com o
COO−O
O OSO3−O Citoesqueleto

HNAc OSO3 HNSO3− A membrana basal é um complexo

−
proteico extracelular que é conectado ao
FIGURA 9.49 Estrutura de uma cadeia de heparam sulfato. complexo proteico intracelular do citoes
Os polímeros de dissacarídeos GAGs contêm unidades alternadas de ácido hexurô queleto, uma vez que ambos os complexos
nico (ácido D-glucurônico (GlcA) ou ácido L-idurônico (IdoA)) e D-glucosamina são conectados às mesmas proteínas re
(GlcN). A GlcN é N-acetilada em regiões da cadeia (região NA). Em regiões mais ceptoras presentes nas regiões de conta
processadas do polímero de heparam, os grupos N-acetil foram parcialmente subs to focal das membranas celulares. Essas
tituídos por N-sulfato (regiões NA/NS) ou os grupos N-acetil foram completamen interações proteína-proteína conectam a
te substituídos por N-sulfato (regiões NS). O círculo aberto é 3-O-sulfato.
Os polímeros são mais modificados por epimerização de C5 de GlcA para resíduos matriz extracelular ao citoesqueleto ce
de IdoA e, finalmente, a incorporação de grupos O-sulfato em várias posições. A lular e são críticas para a regulação de
cadeia de heparam é ligada ao esqueleto proteico pela formação de uma ligação a processos intracelulares, como mobilida
uma cadeia lateral de serina. de celular, divisão celular e morte celular.
Redesenhada de Lindahl, U., Kusche-Gullberg, M. e Kjellen, L. J. Biol. Chem. Na maioria das células de câncer, essa li
273:24979, 1998. gação do complexo proteico receptor de
membrana com ambos os complexos proteicos da lâmi
na basal extracelular e do citoesqueleto é quebrada.

HS

NH2 S SEA LA LA LA LA IG L4 LELELE L4 LELELE L4 LELE IG IG IG IG IG IG IG IG IG IG IG IG IG IG LG EGEG LG EGEG LG COOH

H S
S H
H

HS Pontos de ligação de LA Receptor de LDL class A IG Superfamília imunoglobulina EG

LG Tipo-EGF
heparam sulfato
SEA Módulo de SEA L4 Domínio IV de laminina LE Tipo-EGF laminina Domínio-F de laminina

FIGURA 9.50 Organização modular dos domínios do esqueleto proteico do perlecam.

Organização em domínios do perlecam de camundongo. A liga epidérmico de laminina); EG (tipo fator de crescimento epidér
ção das cadeias de heparam sulfato (HS) é indicada. Os domí mico); e LG (homólogo ao domínio tipo-G de laminina).
nios presentes são SEA (homólogo ao domínio encontrado em Redesenhada de Hopf, M., Göhring, W., Kohfeldt, E., Yamada,
proteína de esperma de ouriço do mar, enteroquinase e agrim); Y., e Timpl, R. Eur. J. Biochem. 259:917-925 (1999); e Kvan
LA (homólogo ao domínio do receptor de LDL tipo A); L4 (ho sakul, M., Hopf, M., Ries, A., Timpl, R. e Hohenester, E. EMBO
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388 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Termos Chave
MOLÉCULAS DE ANTI domínio b-barril HEMOGLOBINA mecanismo halostérico
CORPO estabilização do estado de 2,3-bisfosfoglicerato mioglobina
cadeias H transição alterações no pKa P50
cadeias L evolução convergente carbamino-hemoglobina transporte de CO2
classe imunoglobulina endopeptidase coeficiente de Hill transporte de NO
dobra de imunoglobulina sítio ativo-dirigido conformações R e T transporte de O2
fragmento Fab exopeptidase cooperatividade positiva LÂMINA BASAL
fragmento Fc homologia de sequência efeito Bohr contato focal
regiões contante e variável pró-enzima efeito iso-hídrico membrana basal
hapteno resíduos catalíticos HbA1 nidogem
região hiper-variável serino proteases HbF perlecam
SERINO PROTEASES serpina histidina distal rede de colágeno
ácido g-carboxiglutâmico zimogênio histidina proximal rede de laminina

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha 4. Hemoglobina e mioglobina têm, são, podem ou fa

1. Haptenos:
A. podem funcionar como antígenos.
B. ligam-se fortemente a anticorpos específicos
para eles.
C. podem ser macromoléculas.
D. nunca agem como determinantes antigênicos.
E. podem induzir diretamente a produção de an
ticorpos específicos.
2. Na estrutura tridimensional das imunoglobulinas,
5.
A. folhas-balinham-se, borda com borda.
B. em cada cadeia (H e L), as regiões C e V do
bram-se umas sobre as outras, formando asso
ciações CV.
C. associações CL–VL formam os sítios comple
mentares para ligação dos antígenos.
D. grupos SH livres são preservados para funcio
nar na ligação forte, covalente, aos antígenos.
6.
E. domínios de articulação (hinge) conectam
domínios globulares.
3. Nas imunoglobulinas, todas as seguintes são corre
tas, exceto
A. apresentam quatro cadeias polipeptídicas.
B. existem duas cópias de cada tipo de cadeia.
C. todas as cadeias são unidas por pontes dissul
feto.
D. carboidrato está covalentemente ligado à pro
teína.
E. a classe da imunoglobulina é determinada pe
las regiões CL.
zem todas as seguintes características, exceto
A. subunidades que estabelecem pontes de hi
drogênio e interações não-polares com outras
subunidades.
B. muita a-hélice.
C. ligam uma molécula de heme por cadeia de
globina.
D. ligam o heme em um bolsão hidrofóbico.
E.
A. ligam um O2 por heme.
Transporte iso-hídrico de dióxido de carbono dos
tecidos para o pulmão refere-se a
CO2 livre dissolvido no plasma.
B. HCO3– no plasma.
C. compostos carbamino.
D. o efeito Bohr.
E. a presença de anidrase carbônica no plasma.
A mioglobina tem um coeficiente de Hill de 1,0, e a
hemoglobina tem um coeficiente de Hill de 2,8. Isso
indica que
A. uma curva de saturação de oxigênio para mio
globina seria sigmoide.
B. a hemoglobina apresenta um equilíbrio sim
ples de ligação ao oxigênio.
C. a mioglobina apresenta cooperatividade nega
tiva em sua ligação ao oxigênio.
D. a hemoglobina apresenta cooperatividade po
sitiva em sua ligação ao oxigênio.
D. só a mioglobina daria uma linha reta em um
gráfico de Hill.
 CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS
Questões 7 e 8: Acredita-se que uma serino protease
seja necessária para a metástase de células canceríge
nas. As células tumorais secretam o ativador de plas
minogênio tipo-uroquinase (uPA), uma serino protease
que ativa o plasminogênio em plasmina. A plasmina
causa a hidrólise de proteínas da matriz extracelular.
Ela também ativa pró-colagenase em colagenase; isso
degrada o colágeno. A destruição de proteínas da ma
triz extracelular permite que as células tumorais inva
dam a matriz para formar locais secundários de tumor.
7. A estrutura da lâmina basal é produzida pela cone-
xão de redes planares de lamininas e colágeno tipo
IV. Qual(is) das seguintes afirmativas sobre eles
está(ão) correta(s)?
A. Ambos laminina e colágeno tipo IV são com
postos por três cadeias polipeptídicas.
B. Laminina tem uma estrutura cruciforme.
C. Laminina e colágeno tipo IV são interconecta
dos por um proteoglicano de heparam sulfato.
D. Colágeno tipo IV contém sequências repetiti
vas de (Gly-HyPro-Y)n.
E. Todas as anteriores.
A.
8. Além da serina, os outros dois resíduos essenciais
no sítio catalítico das serino proteases são
prolina e hidroxiprolina.
B. histidina e aspartato.
C. histidinas proximal e distal.
D. aminoácidos C-terminal e N-terminal.
E. aspartato e glutamato.
Questões 9 e 10: Quando um vaso sanguíneo sofre uma
lesão, o processo de coagulação inicia-se para evitar
a perda de sangue e manter a integridade do sistema
circulatório. A coagulação é um processo no qual os
zimogênios são convertidos em serino proteases ativas
em um processo em cascata, passo a passo, tendo como
resultado final a produção de um coágulo de fibrina com
ligações cruzadas. Em um infarto do miocárdio, o pro
cesso pode ser ativado a tal ponto que o fluxo sanguíneo
para o músculo cardíaco é diminuído. A via da fibrinó
lise para dissolver coágulos de fibrina também envolve
a ativação de zimogênios em serino proteases ativas,
sendo que a etapa final é a ativação de plasminogênio
em plasmina, que age diretamente sobre o coágulo de
fibrina. Um dos tratamentos atuais para o infarto do
miocárdio é a rápida administração de t-PA (ativador
de plasminogênio tecidual). Na realidade, é usado o
t-PA recombinante, produzido pela tecnologia do DNA
recombinante.
9. Serino proteases
A. hidrolisam ligações peptídicas envolvendo os
grupos carboxílicos de resíduos de serina.
B. são caracterizadas por terem vários sítios ati
vos por molécula, cada um contendo um resí
duo de serina.
• 389
C. são inativadas pela reação com uma molécu
la de diisopropilfluorofosfato por molécula de
proteína.
D. são exopeptidases.
E. reconhecem apenas os aminoácidos que con
tribuem para a ligação a ser quebrada.
10. Todas as seguintes são características da classe
das serino proteases, exceto
A. só um resíduo de serina é cataliticamente ati
vo.
B. substratos proteicos naturais e inibidores li
gam-se muito fortemente à protease.
C. os genes que codificam serino proteases são
organizados de modo semelhante.
D. unidades catalíticas apresentam dois domí
nios estruturais de tamanhos drasticamente
diferentes.
E. a conversão de zimogênio na enzima ativa ge
ralmente envolve uma ou mais reações hidro
líticas.
Questões 11 e 12: Há mais de 800 hemoglobinas mu
tantes humanas. As mutações podem causar insta
bilidade, levando à rápida degradação, alterações na
afinidade por oxigênio, ou oxidação mais rápida do Fe2+
do heme para Fe3+. Tudo isso altera a capacidade da he
moglobina desempenhar suas funções fisiológicas. Na
mutação HbCowtown, a histidina 146 que contribui com
50% do efeito Bohr, é perdida. A regulação da dissocia
ção do oxigênio por prótons é impedida, a conformação
T é desestabilizada em relação à conformação R, e afi
nidade por oxigênio é aumentada.
11. Acredita-se que todos os seguintes contribuam
para a estabilidade da conformação desoxi ou T da
hemoglobina, exceto
A. um raio iônico maior do íon ferroso seis-co
ordenado em comparação com um íon cinco
-coordenado.
B. interação estérica não-tensionada da His F8
com o anel da porfirina quando o ferro está
acima do plano.
C. interações entre a dobra FG (FG corner) de
uma subunidade e a hélice C da subunidade
adjacente.
D. interações iônicas.
12. Quando a hemoglobina é convertida da forma deso
xi (T) para oxi-hemoglobina (R),
A. ela torna-se mais ácida e libera prótons.
B. a formação de carbamino é promovida.
C. a ligação de 2,3-bisfosfoglicerato (BPG) é fa
vorecida.
D. NO ligado é transferido para a glutationa.
E. todas as anteriores estão corretas.
390 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Problemas 14. Qual seria a ordem provável de surgimento das vá

rias imunoglobulinas em resposta a um patógeno
13. Uma das adaptações a altitudes elevadas é um au
viral introduzido pelas vias nasais e subsequente
mento na concentração de BPG. Que efeito isso tem
mente no sangue?
sobre uma curva de saturação versus pO2? Por que
aumento de [BPG] eleva a liberação de O2 para os
tecidos?

Respostas
1. B Haptenos são moléculas pequenas e não são ca são resíduos importantes na hemoglobina. D e E:
pazes de, sozinhas, elicitar a produção de anticor esses não estão envolvidos.
pos; portanto, não são antígenos. Eles podem atu
ar como determinantes antigênicos se estiverem 9. C Essa é a característica principal das serino pro
teases e das serino hidrolases, em geral. A: elas
covalentemente ligados a uma molécula maior, e
têm várias especificidades. B: há apenas um sítio
haptenos livres podem se ligar fortemente aos an
ativo por molécula. D: são todas endopeptidases.
ticorpos assim produzidos. E: um “sítio ativo estendido”, contendo a ligação a
2. E Ver Figuras 9.2. A: as folhas-b alinham-se face ser hidrolisada e cerca de quatro aminoácidos em
a face. B: as regiões V e C são adjacentes umas às ambos os lados, é responsável pela especificidade.
outras. C: as regiões de complementaridade são as
10. DOs domínios são de tamanhos aproximadamente
regiões variáveis tanto das cadeias pesadas como
iguais.
leves [V(H)–V(L)]. D: a ligação de antígeno é não
-covalente. 11. A O íon ferroso seis-coordenado tem menor raio iô
nico do que as espécies cinco-coordenadas, e cabe
3. E As regiões CH determinam a classe. A: existem
justo no centro do anel porfirínico, sem distorção.
duas cópias de cada um dos dois tipos de cadeias
polipeptídicas. 12. A A histidina carregada positivamente não é mais
estabilizada por estreita proximidade com um gru
4. A A hemoglobina tem quatro cadeias e quatro sítios
po carboxilato do aspartato. Este é o efeito Bohr.
para ligação de oxigênio, enquanto a mioglobina B: H+ aumentado favorece a dissociação de grupos
tem uma cadeia e um sítio para ligação de oxigênio.
carbamino; isso é o que acontece no pulmão. C: o
Cada sítio para ligação de oxigênio é um heme.
BPG não se liga efetivamente a oxi-hemoglobina
5. emOs
B HCO
prótons
–3 e H+,liberados
que se liga
como
à oxi-hemoglobina,
H2CO3 dissociam-se porque o bolsão de ligação é muito pequeno. D: na
faci oxi-hemoglobina, NO liga-se à cisteína e é trans
litando a liberação de O2 para os tecidos. A: muito ferido para a glutationa quando o O2 é liberado (a
pouco
de carregarestá
CO2 nesta forma. C: este é outro modo forma R reverte para a forma T).
CO2. D: o efeito Bohr libera H+ quando
13. A ligação de BPG à hemoglobina estabiliza a con
desoxi Hb capta O2. E: a anidrase carbônica fica
formação T, de modo que para qualquer quantida
nos eritrócitos.
de de O2, menos O2 será ligado à hemoglobina. Isso
6. D Um coeficiente de Hill maior do que 1 indica coo desloca a curva de saturação para a direita e au
peratividade positiva, o que a hemoglobina tem. A: menta a P50. O equilíbrio apresentado ilustra que o
um coeficiente de 1,0 indica não-cooperatividade; aumento de BPG leva à liberação de O2, o que deve
isso daria uma curva hiperbólica de saturação de acontecer para que o O2 penetre nos tecidos.
oxigênio. B: esse coeficiente indica um equilíbrio H+BPG×Hb + 4O2  Hb(O 2)4 + BPG + nH+
simples, que é o que a mioglobina mostra. C: o co
(Equação 9.14 do texto)
eficiente é entre 0 e 1 para cooperatividade nega
tiva. A mioglobina é um peptídeo único e não mos 14. A defesa inicial contra patógenos no muco nasal
tra cooperatividade. E: o gráfico de Hill é o log de são as imunoglobulinas da classe IgA. Se o organis
cada valor para uma curva de saturação normal e mo invadir o plasma, as imunoglobulinas IgM são
fornece uma linha reta. As inclinações, que são os os primeiros anticorpos induzidos. Com o tempo,
coeficientes de Hill, diferem. os anticorpos da classe IgG são sintetizados e vão
atingir concentrações mais elevadas do que os an
7. E Todos esses contribuem para a lâmina basal que,
ticorpos IgM.
com o colágeno fibrilar ligado ao lado de fora, é
chamada membrana basal.
8. B São designados Ser-195, His-57 e Asp-102, com
base na numeração da quimotripsina, independen
temente dos números reais das proteases individu
ais. A: esses são encontrados no colágeno. C: esses
PARTE III CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 391
FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

10
Enzimas:
Classificação,
Cinética e Controle
Henry Weiner
Professor Titular, Purdue University

CONTEÚDO CORRELAÇÕES CLÍNICAS

10.1 INTRODUÇÃO, 39�
10.� CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS, 39�
10.3 CONCEITOS GERAIS DOS MECANISMOS DE
ENZIMAS, 396
10.� SÍTIOATIVO DE UMA ENZIMA, �01
10.5 COENZIMAS, COSSUBSTRATOS E COFATO�
RES, �0�
10.6 CINÉTICA DE REAÇÕES QUÍMICAS,�09
10.7 CINÉTICA ENZIMÁTICA DE REAÇÕES COM UM
SUBSTRATO, �11
10.8 CINÉTICA DE REAÇÕES COM DOIS SUBSTRA�
TOS, �19
10.9 INIBIDORES, ��0
10.10 REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA, ��7
10.11 REGULAÇÃO DE VIAS METABÓLICAS, �31
10.1�APLICAÇÕES CLÍNICAS DE ENZIMAS, �3�
10.1 Hidrólise de Asparaginase e Leucemia, 395
10.� Mutação de um Sítio de Ligação de Coenzima Re�
sulta em Doença Clínica, �0�
10.3 Um Caso de Gota Demonstra Duas Fases no Me�
canismo de Ação Enzimática, �15
10.� de
Efeito
Enzimas,
Fisiológico
�16 de Mudanças nos Valores de Km
10.5 Labilidade Térmica da Glicose�6�Fosfato Desi�
drogenase Resulta em Anemia Hemolítica, �19
10.6 Isoenzimas da Álcool Desidrogenase com Dife�
rentes pHs Ótimos, ��0
10.7 Inibidores de Xantina Oxidase Isolados de Plan�
tas, ��1
10.8 Planejamento de um Inibidor Seletivo, ���
10.9 Um Caso de Envenenamento, ��5
10.10 Cogumelos e Metabolismo de Álcool, ��6
10.11Testosterona e Câncer de Próstata, ��6
10.1� Produtos Naturais Como Inibidores de Enzimas,
��7
10.13 Um Caso de Gota Demonstra a Diferença entre
um Sítio Alostérico e um Sítio de Ligação de
Substrato, ��8
10.1� Ambiguidade no Ensaio de Enzimas Mutadas,
��9
10.15 Identificação e Tratamento de uma Deficiência
Enzimática, �33
392 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Conceitos Chaves
IMUNOGLOBULINAS zima e do substrato e são descritas pela equação
• As enzimas são proteínas que catalisam reações de Michaelis�Menten, na qual um termo, Km, está
químicas por meio do aumento na taxa de conver� relacionado com quão bem o substrato liga�se �
são de um substrato específico em um produto es� enzima. Outro termo cinético, kcat, indica quão ra�
pecífico. pidamente a enzima converte o substrato em pro�
duto.
• As enzimas diminuem a energia de ativação das
reações por meio da estabilização do substrato de • Compostos químicos específicos inibem a ligação
uma forma que permite a formação do produto. do substrato e a velocidade de catálise. Muitas dro�
Esse é chamado estado de transição. gas são inibidoras de enzimas por se ligarem ao
sítio de ligação do substrato ou a diferentes domí�
• As coenzimas, a maioria derivada de vitaminas,
nios da proteína.
são participantes essenciais de muitas reações en�
zimáticas; algumas são quimicamente alteradas e • AlémAlém dosdos sítiossítios dede ligaçãoligação dodo substratosubstrato ee dodo cofa�cofa�
outras não mudam durante a reação. Algumas es� tor da enzima, algumas enzimas possuem sítios de
tãoão covalentementecovalentemente ligadasligadas �� enzima.enzima. ÍonsÍons metá�metá� ligação adicionais (sítios alostéricos) de modo que,
licos são necessários para a atividade de algumas quando um composto (ligante) se liga, ele regula a
enzimas; eles estão frequentementefrequentemente ligadosligados �� pro�pro� atividade catalítica. Esses ligantes (modificadores
teína ou a um cofator. ou efetores alostéricos) geralmente induzem a uma
mudança na estrutura da enzima. As propriedades
• AA químicaquímica dasdas transformaçõestransformações enzimáticasenzimáticas estáestá re�re� catalíticas de algumas enzimas são modificadas
lacionada com os princípios químicos gerais, como por modificação covalente.
catálise ácido�base e ataque nucleofílico. A catálise
enzimática é mais eficiente porque os grupos que • As enzimas tecido�específicas liberadas no sangue
protonam (ácidos gerais) ou desprotonam (bases a partir de células danificadas são quantificadas
gerais) e aminoácidos nucleofílicos fazem parte da para determinar a condição clínica. As enzimas
enzima. são também usadas no tratamento de algumas con�
dições médicas.
• AsAs velocidadesvelocidades dasdas reaçõesreaçõesões catalisadascatalisadascatalisadascatalisadas porporporpor enzi�enzi�enzi�enzi�
mas estãoão relacionadasrelacionadasrelacionadas comcomcom aaa concentraçãoconcentraçãoconcentração dadada en�en�en�

10.1 INTRODUÇÃO 10.2 CLASSIFICAÇÕES DAS

As enzimas são proteínas especializadas que catali� ENZIMAS
sam reações biológicas. Praticamente todas as reações
que ocorrem em uma célula requerem a ação de uma Com o advento das sequências genômicas, muitas
enzima porque a maioria dessas reações não ocorre� enzimas foram identificadas. Em meados de �00�, ha�
rá em velocidade detectável nas condições fisiológicas via informação disponível para mais de 83.000 enzimas
(pH, temperatura e ambiente iônico) da célula. As enzi� diferentes, de 9.800 organismos diferentes; em �008
mas são catalisadores eficientes, não só aumentando a o número de entradas dobrou. Todas as enzimas são
velocidade de conversão de substrato em produto, mas classificadas como pertencendo a uma dentre seis clas�
também reconhecendo uma estrutura química específi� ses, definidas pela reação química que catalisam. Um
ca na presença de estruturas semelhantes, para produ� sistema de numeração, consistindo de quatro números
zir um produto específico. para cada enzima, foi desenvolvido pela Internatio
nal Union of Biochemistry and Molecular Biology
Entretanto, nem todos os catalisadores biológicos são (IUBMB) para caracterizar cada enzima. O primeiro
enzimas. Foram identificados RNAs catalíticos (p. 71), número define o tipo de reação que é catalisada, se�
que participam do processamento de íntrons e tRNA, guido por números que definem detalhes da reação. É
enquanto outros executam uma etapa de autoprocessa� interessante que toda a química da vida pode ser re�
mento por hidrólise de uma ligação fosfodiéster em sua duzida a seis tipos diferentes de reações químicas. As
própria cadeia nucleotídica. Enzimas artificiais, chama� classes das enzimas são apresentadas na Tabela 10.1.
das abzimas, foram sintetizadas por meio da obtenção
de anticorpos contra compostos que são análogos do Os nomes sistemáticos das enzimas incluem o subs�
estados de transição. As abzimas foram projetadas para trato e o tipo de reação; o nome da enzima frequen�
catalisar mais de 100 reações químicas diferentes. temente termina em “ase”. Álcool desidrogenase, uma
enzima que oxida um álcool a um aldeído, tem o número
IUBMB 1.1.1.1. Isso indica que (1) a enzima está envol�
vida em uma reação de oxidação–redução (primeiro
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 393

TABELA 10.1 Resumo das Classes de Enzimas e Principais geiramente diferentes. A lactato desidrogenase é uma
Subclasses proteína tetramérica, que consiste dos monômeros M e
H, e pode ter cinco estruturas tetraméricas diferentes
1. Óxido�redutases �. Transferases
(Tabela 10.�).
Hidroxilases
Oxigenases
Catalase
Peroxidases
Redutases
Oxidases
Desidrogenases Transaldolase
e transcetolase
Acil, metil, glicosil TABELA 10.2 Isozimas da Lactato Desidrogenase
e fosforiltransferase
Tipo Composição Localização
Quinases
Fosfomutases LDH1 HHHH Miocárdio e eritrócitos
LDH� HHHM Miocárdio e eritrócitos
3. Hidrolases �. Liases
LDH3 HHMM Cérebro e rim
Amidases
Fosfolipases
Tiolases
Fosfatases
Peptidases
Glicosidases
Esterases Decarboxilases
Aldolases LDH� HMMM
Hidratases LDH5 MMMM Fígado e músculo esquelético
Desidratases
Sintases
Liases Classe 1: Óxido-redutases
Desaminases Enzimas da classe 1 catalisam reações de oxida�
Ribonucleases ção–redução, e são chamadas óxido�redutases. Oxida�
ção significa a perda de elétrons, e redução significa a
5. Isomerases 6. Ligases adição de elétrons. Os elétrons são removidos de um
Isomerases
Epimerases
Racemases Sintetases substrato (doador ou redutor) que é oxidado, e adicio�
Carboxilases nado a um segundo substrato (aceptor ou oxidante) que
é reduzido. Muitos aceptores de elétrons diferentes são
Mutases (nem todas) usados em sistemas biológicos (p. 579). As desidroge�
nases são tipicamente denominadas na direção de oxi�
dação. Exemplos são lactato desidrogenase em vez de
número), (�) remove hidrogênio como um íon hidreto piruvato redutase e gliceraldeído�3�fosfato desidroge�
com NAD+ como o aceptor de elétron (segundo núme� nase em vez de 1,3�bisfosfoglicerato redutase.
ro), e (3) os substratos para a enzima podem ser princi�
palmente alcoóis primários (terceiro número). (�) O úl� Reações de oxidação e redução incluem os seguintes
timo número é reservado para diferenciar cada enzima pares de doadores–aceptores: ligações carbono–carbo�
que catalisa a mesma reação geral, mas com substratos no saturada–insaturada, alcoóis–aldeídos, aldeídos–
diferentes. A lactato desidrogenase (1.1.1.�7) catalisa ácidos e aminas–minas. Oxigênio molecular (O�) como
uma reação idêntica � da álcool desidrogenase, mas o um aceptor de elétrons está envolvido em uma varie�
substrato é lactato. As enzimas são frequentemente de� dade de reações irreversíveis de oxidação–redução. As
nominadas pela direção da reação de importância na monoxigenases catalisam a inserção de um grupo hi�
célula. droxi no substrato, com o outro átomo de oxigênio aca�
bando na água (Figura 10.1), enquanto as dioxigenases
Frequentemente, são dados nomes arbitrários a en� incorporam ambos os átomos de O� em um substrato.
zimas; por exemplo, aldolase foi o nome dado e ainda Os citocromos P�50 (p. ��3) compõem um importante
usado para a enzima que catalisa uma reação de con� grupo de enzimas que usa oxigênio no metabolismo de
densação aldólica entre gliceraldeído 3�fosfato e di�hi� xenobióticos como drogas e toxinas; essas enzimas con�
droxiacetona fosfato (p. 617), e lisozima para uma en� vertem compostos saturados em um álcool, uma reação
zima que quebra paredes celulares de bactérias. Houve de hidroxilação usando um dos átomos de oxigênio da
um esforço para abandonar o nome trivial em favor do molécula de O� para o grupo hidroxila.
nome sistemático de muitas enzimas, mas a literatura
continua a conter referências a ambos os nomes para
muitas enzimas. Classe 2: Transferases
Isoenzimas são diferentes formas estruturais de Membros dessa grande família transferem um gru�
uma proteína que catalisa a mesma reação. Sãoão produ�produ� po químico de uma molécula para outra; portanto, têm
tos de genes diferentes, possuem diferentes graus de dois substratos e produzem dois produtos. A hexoquina�
identidade de sequência,ência,ncia, eee podempodempodem terterter propriedadespropriedadespropriedades ci�ci�ci� se transfere um grupo fosfato do ATP para um aceptor
néticas diferentes. Existem duas isoenzimas da lactato como a glicose (Figura 10.�). Uma enzima que transfe�
desidrogenase, uma forma cardíaca (H) e uma forma re fosfato para outra molécula usando um nucleotídeo
muscular (M), que têm sequências de aminoácidos li� trifosfato como o doador é chamada uma quinase;
394 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

O
CH2OH 2−CH2OPO3
Tolueno
O
+ ATP4−Mg2+ + ADP3− + H
+

CH3
+ α-D-Glicose α-D-Glicose 6-fosfato
O2
FIGURA 10.2 Reação de fosforilação.
Fosforilação de glicose por ATP catalisada pela hexoquinase.

Benzil O
álcool
CH3 CSCoA
+
CH2OH
+ NH2
(a) H2O

OH
O2 +
OH O

Catecol C CH3

NH
(b) OH
COCOOH

+
CoASH
Ácido cis,cis-Mucônico
FIGURA 10.3 Acetilação de resíduos de aminoácidos em
FIGURA 10.1 Reações de oxidação catalisadas por uma proteína.
enzimas.
Hidroxilação do tolueno, um solvente industrial, e oxigenação
do catecol por uma oxigenase. + COO– O COO– + COO–

H3N C H + CH3 C COO– C O + H3N C

o aceptor pode ser uma molécula pequena ou uma pro�
(aminoácido1)
R (cetoácido2) (cetoácido1)
R CH3
(aminoácido2
teína. Outro exemplo de uma transferase é aciltransfe�
)
rase, que catalisa a transferência de um grupo acetil do
acetilCoA para um aceptor como lisina em uma histona Figura 10.4 Exemplo de uma reação catalisada por uma
ou uma serina em outras proteínas (Figura 10.3). aminotransferase.
Reações de aminotransferases requerem piridoxal fosfato
Uma importante reação de transferência de amina (PLP).
ocorre entre um aminoácido e um composto contendo
carbonila. Essas enzimas, aminotransferases, transfe�
rem o grupo amino e convertem o aminoácido em um OPO32–
cetoácido; o substrato aceptor, um cetoácido, é trans� CH2
formado em um aminoácido (Figura 10.�). Aminotrans� +
CH O H2O
ferases requerem piridoxal fosfato, derivado de vitami�
HN C
na B6, como uma coenzima (p. 775).
Cadeia peptídica

Classe 3: Hidrolases
Hidrolases catalisam reações de hidrólise, que é a
adição de água a uma ligação química (Figura 10.5). OH
Isso é essencialmente uma transferência de um —OH
da água para o substrato, mas as enzimas não são clas� CH2

sificadas como transferases. A hidrólise é uma reação CH O + HOPO32–

essencialmente irreversível. O substrato é tipicamente Cadeia

HN C
peptídica
um éster ou uma amida, por exemplo, um éster entre
um álcool e um ácido carboxílico. Tal reação é a hidró�
lise de um colesterol éster para produzir colesterol e FIGURA 10.5 Hidrólise de uma proteína fosforilada por
um ácido graxo. O ácido não precisa ser um ácido car� uma proteína fosfatase.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
boxílico; ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou qualquer
ácido pode formar uma ligação éster. RNases e DNases
são enzimas que hidrolisam a ligação fosfoéster. O uso
clínico de uma hidrolase é apresentado na Correlação
Clínica 10.1.
Classe 4: Liases
Liase implica uma quebra. Essas enzimas geralmen�
te catalisam uma clivagem de ligação carbono�carbono.
Outras enzimas desta classe podem formar ou quebrar
uma ligação carbono–nitrogênio ou liberar um CO� de
um b�cetoácido. Algumas das reações são reversíveis,
de modo que uma ligação carbono–carbono pode se for�
mar, como ilustrado pela reação catalisada pela aldo�
lase (Figura 10.6). Algumas liases requerem piridoxal
fosfato como cofator. Importantes reações neuroquími�
cas, incluindo a formação de dopamina (Figura 10.7)
e serotonina, são exemplos dessa reação. Se um nucleo�
tídeo trifosfato não estiver envolvido na formação da
nova ligação, a enzima é chamada uma sintase, mas se
a energia liberada quando ATP é hidrolisado forneces�
sária, a enzima é chamada uma sintetase (ver Classe 6:
Ligases).
CH22−
OPO3
C 0
HOCH
HCOH
HCOH
CH2OPO32−
D-Frutose 1,6-bisfosfato
CH2OPO32− O
C0 CH
CH2OH
Di-hidroxiacetonafosfato HCOHOPO32−
CH2
D-Gliceraldeído
3-fosfato
FIGURA 10.6 Reação de liase catalisada pela aldolase.
Classe 5: Isomerases
As enzimas desta classe estão envolvidas com o mo�
vimento de um grupo ou de uma dupla�ligação dentro
da mesma molécula. Estes incluem a troca de posição
de uma hidroxila ou uma carbonila, como a encontra�
da quando glicose�6�fosfato é convertida em frutose�6�
�fosfato (p. 616), e no movimento de uma dupla liga�
ção de uma posição para a adjacente, como encontrado
no metabolismo de ácidos graxos (p. 715). A enzima
• 395
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.1
Hidrólise de Asparaginase e Leucemia
Algumas formas de leucemia juvenil necessitam
do aminoácido não�essencial asparagina. Os pes�
quisadores logo imobilizaram uma asparaginase
derivada de bactéria, uma hidrolase que converte
asparagina em ácido aspártico, e passaram o san�
gue dos pacientes por uma coluna com a enzima
imobilizada. Isso colocou os pacientes com leucemia
linfoblástica aguda em remissão. Posteriormente,
os pesquisadores descobriram que podiam injetar
a enzima no paciente, onde ela poderia hidrolisar o
substrato circulante no sangue. Mais recentemen�
te, a enzima foi encapsulada em polietilenoglicol,
uma vez que alguns pacientes tiveram reações � en�
zima bacteriana, embora tenha sido purificada até
a completa homogeneidade. A enzima encapsulada
funcionou bem em crianças e auxiliou a remoção de
asparagina de seu sangue. Essa forma da enzima
está disponível comercialmente e foi aprovada para
uso humano.
Appel, I. M., Kazemier, K. M., Boos, J., Lanvers, C. et al.
Phamacokinetic, pharmacodynamic and intracellular ef�
fects of PEG�asparaginase in newly diagnosed childhood
acute pymphoblastic leukemia: Results from a single agent
window study. Leukemia ��:1665, �008.
+
NH3
CH2 CHCOO−
HO
OH
3,4-Di-hidroxifenilalanina (DOPA)
DOPA descarboxilase
CO2 (PLP)
+
CH2 CH2 NH3
HO
OH
Dopamina
FIGURA 10.7 A síntese de dopamina envolve uma reação
de liase.
A síntese de dopamina requer piridoxal fosfato (PLP).
é chamada uma mutase quando um fosfato é movido
de um carbono para outro dentro da mesma molécula,
como ocorre com a fosfoglicerato mutase que converte
��fosfoglicerato em 3�fosfoglicerato (Figura 10.8). Iso�
merases e epimerases podem mudar a estereoquímica
396 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

de um átomo de carbono. A conversão de D�lactato em COO– COO–

L�lactado é um exemplo de uma isomerase, e D�xilulose ATP + HCO–3 + CO biotina CO + ADP + P
i
5�fosfato para D�ribulose 5�fosfato de uma epimerase
CH3 COOH
CH2
(Figura 10.9). A reação catalisada pela UDP�glicose
��epimerase requer o envolvimento de NAD, de modo
que se assume que uma reação de oxidação�redu�
ção ocorre durante a reação, mas não há oxidação�re� Piruvato Oxaloacetato
dução final da coenzima.
FIGURA 10.10 Reação da piruvato carboxilase.
Ver página 6�� para detalhes sobre o papel da biotina.
COO– O–
HOP
HOH2C
C O O– 10.3 CONCEITOS GERAIS
DOS MECANISMOS DE
2-Fosfoglicerato
ENZIMAS
fosfogliceromutase

Considerações Termodinâmicas
COO–
Energia é necessária para formar o material de par�
H COH O–
tida de uma reação e para formar o produto de uma
CH2 O PO– reação. Essa energia é denominada calores de forma
O ção. Existe uma relação termodinâmica entre a dife�
3-Fosfoglicerato
rença de energia necessária para formar o material de
partida (reagentes) e para formar os produtos. A dife�
FIGURA 10.8 Interconversão de 2- e 3-fosfogliceratos. rença de energia é AG0, e as unidades podem ser expres�
sas em kilojoules/mol (kJ/mol) ou em kilocalorias/mol
HCOH
C O
CH2OH CH2OH
(kcal/mol) (Um Olhar Mais Atento 10.1). Quando o
equilíbrio da reação é estabelecido, a concentração de
epimerase C O cada um é relacionada como indicado na Equação 10.1:
HOCH HCOH
AG0 = –�,3 RT × log [Produtos]/[Reagentes] (10.1)
HCOH

H2COPO32– H2COPO32– R é a constante universal dos gases (8,31 joule/mol/°K

D-Xilulose D-Ribulose
ou 1,99 cal/mol/°K) e T é a temperatura em °K.
5-fosfato 5-fosfato
Quando adicionado a uma reação, um catalisador
aumenta a velocidade para chegar ao equilíbrio entre
COOH COOH
o material de partida e o produto. A razão [Produtos]/
HCOH racemase HOCH [Reagentes]no equilíbrio é a constante de equilíbrio, Keq.
CH3 CH3 Isso implica que a diferença de energia livre (calores
de formação) dos produtos e reagentes determinará a
Ácido D-láctico Ácido L-Lactico
quantidade de cada um presente quando o equilíbrio é
FIGURA 10.9 Exemplos de reações catalisadas por uma alcançado. Isso não determina a velocidade com a qual
epimerase e uma racemase. o equilíbrio é alcançado. Um catalisador aumenta a ve�
locidade de uma reação para alcançar o equilíbrio, mas
não muda o equilíbrio. Keq é governada pelos calores de
Classe 6: Ligases formação, que é uma constante para qualquer reação.
As ligases unem átomos de carbono, mas ao contrá� Muitas reações são consideradas irreversíveis; não
rio das liases, Classe �, requerem energia para que a é possível que os produtos de uma reação irreversível
reação ocorra. São chamadas sintetases. Geralmente, sejam convertidos no material de partida, mesmo na
a energia vem do envolvimento de ATP. Por exemplo, presença de uma enzima, porque essencialmente 100%
para adicionar CO� ao piruvato, CO� é incorporado � do material de partida se tornará produto. Essa afirma�
coenzima biotina, o que requer hidrólise de ATP (Figu� tiva não é completamente válida porque, mesmo para
ra 10.10). O CO� é transferido para piruvato pela mesma reações essencialmente irreversíveis, a razão entre o
enzima. A adição de um aminoácido ao tRNA é outro material de partida e o produto poderia ser 1:�00.000
exemplo de uma enzima dessa classe (p. �16). Deve ou até 1:1.000.000. A reação alcança o equilíbrio, mas
haver alguma interação entre os componentes da rea� a quantidade de material de partida presente no equi�
ção para utilizar a energia liberada na hidrólise do ATP líbrio está abaixo do nível de detecção, de modo que a
para síntese da nova ligação. reação é considerada essencialmente irreversível.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 397

se do ajuste induzido. Uma grande alteração confor�

UM OLHAR MAIS ATENTO 10.1
macional é ilustrada na Figura 3.33, p 101. A Figura
10.11 ilustra uma mudança de conformação.
Unidades de Energia
A estrutura alterada de uma enzima após a ligação
Existem duas convenções diferentes para descre�
de um substrato permite interações complementares
ver as unidades de energia liberadas ou requeridas
entre substrato e enzima. Isto é, uma parte hidrofíli�
por uma reação química. Uma é calorias e a outra ca do substrato ficará perto dos resíduos de aminoáci�
é joules, sendo esta última utilizada atualmente na
dos que permitem que uma ponte de hidrogênio seja
literatura científica. Calorias são ainda usadas para
compartilhada, e uma parte carregada do substrato
descrever quanta energia está disponível nos alimen� vai interagir de modo que ou sua carga é neutralizada
tos. Por exemplo, um típico copo de cerveja contém
por uma carga oposta ou é estabilizada por formar uma
aproximadamente 1�5 Cal (1�5 kilocal) de energia
ponte de hidrogênio. Partes hidrofóbicas do substrato
quando metabolizado. Para converter calorias em
ligam�se de modo a ficarem em uma parte hidrofóbica
joules, multiplica�se o valor calórico por �,18�. As� da proteína, chamada bolsão hidrofóbico.
sim, a constante universal dos gases (R) na Equação
10.1 é 1,987 cal/mol/°K, ou 8,31 J/mol/°K. Este livro
utiliza kilojoule (kJ) para descrever a energética das Estado de Transição
transformações biológicas, mas também apresenta os
A teoria para descrever como uma reação química
valores em kilocalorias (kcal ou Cal). Discussões nu�
ocorre é baseada no modelo do estado de transição. O
tricionais usarão calorias (Cal).
conceito básico é que o material de partida (substra�
to) tem certas propriedades estruturais e químicas, e
o produto tem outras. O estado de transição é uma es�
trutura na qual a(s) ligação(ões) que estão passando
Ligação do Substrato a uma Enzima por uma transformação são tais que não é igual nem ao
material de partida nem ao produto.
Para que uma enzima funcione como catalisador,
ela deve primeiro ligar o(s) substrato(s) e, depois, di� Isso pode ser ilustrado na reação de adição de amô�
minuir a energia de ativação, de modo que a reação nia ao ácido trans�cinâmico para produzir fenilalani�
acontecerá a uma velocidade maior do que aconteceria na (Figura 10.1�), onde a dupla ligação no material de
na ausência do catalisador. Existem duas teorias pre� partida é planar. O produto tem o amino ligado de tal
valentes para explicar como
o substrato se liga � enzima.
A clássica é a teoria chave-e
-fechadura, que propõe que o
sítio de ligação do substrato na
enzima é uma entidade rígida
e só um composto com uma
forma específica se encaixará,
de modo análogo a como uma
fechadura (enzima) permite
que apenas uma chave (subs�
trato) faça o contato correto.
Uma teoria alternativa é a teoria
do ajuste induzido. Essa teoria
considera que a enzima é flexí�
vel e depois que os substratos
se ligam �� enzima,enzima, aa conforma�conforma�
ção da proteína muda de modo
que se forma um complexo
binário estável. Ambas as teo�
rias foram apresentadas antes (a) (b)
de se saber a estrutura real de
qualquer proteína. Agora que FIGURA 10.11 Orotato fosforibosiltransferase.
Orotato fosforibosiltransferase (OPRTase) catalisa a condensação dependente de Mg�+ do
as estruturas tridimensionais
ácido orótico (OA) com PRPP (5�α�D�fosforilribose 1�difosfato) para gerar pirofosfato (PPi)
de muitas enzimas são conhe�
e o nucleotídeo OMP (orotidina 5!�monofosfato). (a) Enzima livre em turquesa e o complexo
cidas, descobriu�se que a liga� ternário em azul. (b) Complexo ternário em vermelho e complexo binário em azul. Ver página
ção do substrato causa um pe�
8�6 para reações envolvidas na biossíntese de pirimidinas.
queno movimento das ligações Reproduzido com permissão de Gonzlaes�Segurea, L, Whitte, J. F., McClard, R.W., and Hur�
peptídicas, apoiando a hipóte� ley, T. D. Biochemistry �6:1�075, �007. Copyright© (1977) da American Chemical Society.
398 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

NH3 H NH3+
H COO− H
δ+
C C + NH3 + H+ C C COO− H
C H
C COO−
H
H
H+

FIGURA 10.12 Estado de transição.

A estrutura do estado de transição mostra elétrons na dupla li� o que torna o outro carbono positivo, de modo que o par de
gação movendo�se para acomodar o próton que está chegando, elétrons do nitrogênio pode atacar.

modo que o carbono que fazia parte da dupla ligação cionada � ligação peptídica, o grupo carbonila torna�
(planar) agora é uma estrutura tetraédrica. O estado �se tetraédrico e, assim, tem de mudar seu ângulo de
de transição é aquele no qual a ligação está começando ligação e forma. O estado de transição não é o interme�
a se formar e a geometria está mudando. Para mudar a diário tetraédrico, mas é a conformação que levaria a
forma do substrato é necessário energia, de modo que ele se a ligação covalente realmente se formar. Durante
ele se pareça com o estado de transição, e a velocidade a reação, não só a ligação carbono–oxigênio do grupo
de uma reação é inversamente proporcional � energia carbonila do substrato muda de planar para tetraédri�
necessária para chegar ao estado de transição. Um grá� ca, mas uma carga negativa se desenvolve no oxigênio,
fico da energia de reação é apresentado na Figura 10.13 que precisa ser estabilizado.
e usado para mostrar a variação de energia necessária
para converter um substrato ao estado de transição. No
estado de transição, existe uma entidade que nunca foi C H(Aminoácido)
··
observada ou isolada. A entidade do estado de transição O H
N H O H H(Aminoácido) Oδ−
H
pode prosseguir para dar produto ou pode retornar ao ··
+
C··
H
N C··
δ+ N
material de partida. Um catalisador simplesmente di� H
minui a energia do estado de transição (AE*), aumen� ·· ··
O
tando assim a velocidade de sua formação a partir do
(Aminoácido) H H
material de partida.
Substrato Estado de transição

FIGURA 10.14 Estado de transição para a hidrólise de

uma ligação peptídica.
Reação O grupo carbonila na ligação peptídica planar torna�se tetraé�
não-catalizada drico quando a água (ou OH–) ataca e o nitrogênio é protona�
do, seguido pela hidrólise da ligação peptídica. Os aminoácidos
a
igre Reação do sítio ativo fornecem um H+ para estabilizar a carga negativa
nE + catalizada que se desenvolve no átomo de oxigênio da carbonila e protona
Eo
o nitrogênio, de modo que este sai como amina. Um aminoáci�
Go do diferente da proteína remove um próton da água, produzin�
do OH–, mais reativo.

Coordenação da reação Ligação Forte no Estado de Transição

FIGURA 10.13 Diagramas de energia para reações
catalisada versus não-catalisada.
Representação diagramática das diferenças de energia entre o
reagente e o produto. O estado basal é indicado por AG0, e o
estado de transição por AE*. A velocidade da reação é inversa�
mente proporcional a AE*, enquanto Keq está relacionada com
a diferença de AG0. AE* é a energia necessária para elevar o
estado basal para o estado de transição hipotético.
As enzimas estabilizam o estado de transição por
diminuírem a energia de ativação, portanto acelerando
a reação. Isso é conseguido pela existência, na enzima,
de resíduos que interagem com o substrato enquanto no
estado de transição.
A hidrólise de uma ligação peptídica para produzir
um ácido carboxílico e um amino grupo livre ilustra
como poderia ser possível para a enzima estabilizar o
estado de transição (Figura 10.1�). Quando água é adi�
Uma enzima liga�se fortemente ao estado de tran�
sição, mas não ao substrato ou ao produto final. Se ela
se ligar fortemente ao substrato, precisará de mais
energia para chegar ao estado de transição. Do mesmo
modo, a enzima não pode se ligar muito fortemente ao
produto porque, se o fizer, ficaria muito difícil para o
produto se dissociar da enzima. A enzima precisa libe�
rar o produto, de modo que possa interagir com outra
molécula de substrato. Esses conceitos estão ilustra�
dos na Figura 10.15.
Reações Iônicas Não Precisam Envolver
Íons
A maioria das reações encontradas na natureza
pode ser explicada usando modelos iônicos. Isto é, a
maioria das reações celulares requer cargas positivas
e negativas na molécula para permitir que os compo�
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 399

nentes interajam. A enzima pode adicionar ou remover não apenas associados com um carbono. O carbânion
prótons de um substrato, mudando sua carga, ou um então pode atacar o grupo carbonila para formar a nova
grupo neutro da enzima ficando iônico. A remoção de ligação. A enzima mantém os dois substratos próximos
um próton torna o grupo mais nucleofílico, que é um entre si, aumentando a probabilidade de colisão favorá�
grupo (nucleófilo) que atacará um centro positivo. Por vel, e está envolvida na polarização da ligação carbonila
exemplo, OH– é mais nucleofílico do que a água, e cis� e remoção do próton.
teína ionizada é mais nucleofílica do que o átomo de
enxofre não�ionizado. Do mesmo modo, enzimas po�
dem protonar um grupo para torná�lo positivo, de modo H2COPO32− H2CO H2COPO32−
que ficará mais susceptível ao ataque nucleofílico. Na
C O + H2COH C O
hidrólise de uma ligação peptídica, o grupo OH– mais
nucleofílico, e não a água, ataca a ligação. Além disso, H2COH H2COPO32− HO C H
o ataque será em um grupo carbonila polarizado, em
H C OH
que o átomo de carbono teria uma carga parcial posi� Di-hidroxiacetona Gliceraldeído-3
tiva, e não um grupo carbonila não�polarizado (Figura fosfato fosfato HC OH

10.1�). A adição e a remoção de prótons são chamadas

catálise ácida geral e básica geral, respectivamente. A H2 H2COPO32−

vantagem das enzimas que usam catálise ácida geral e Frutose 1,6-bisfosfato
(a)
básica geral é que no pH fisiológico neutro, elas podem
catalisar reações mesmo que as concentrações de OH– e COPO32− H2COPO32− H2COPO32−
H+ sejam muito baixas.
δ+C Oδ− −H+ δ+C O− CO−

HCH OH HC OH HC
≠ OH
TS
(b)

FIGURA 10.16 Um grupo carbonila estabiliza uma carga

negativa no carbono adjacente.
a
igrenE (a) Reação da di�hidroxiacetona fosfato e do gliceraldeído
E+ S
3�fosfato para formar frutose 1,6�bisfosfato. (b) Estados de
E +P transição de di�hidroxiacetona fosfato. A carga parcial positi�
ES va do carbono pode ser atacada por um carbânion para for�
EP
mar uma nova ligação carbono–carbono. A presença do grupo
carbonila permitirá que um próton seja removido do átomo de
Coordenação da reação carbono adjacente, permitindo que o carbânion seja produzido.

FIGURA 10.15 Diagramas de energia para o estado de Importância do Grupo Carbonila

transição de substrato ligado fortemente.
A linha vermelha indica ligação forte do substrato, em com�
paração com um substrato menos fortemente ligado. Se o
substrato estiver fortemente ligado, é necessária mais energia
, resultando em reação mais lenta para chegar ao estado de
transição. Uma condição semelhante ocorre se o produto es�
tiver ligado muito fortemente; mais energia seria necessária
para chegar ao estado de transição de liberação do produto.
Há um estado de transição para cada etapa da reação.
Ligações Parcialmente Carregadas
Um modo comum de se formar uma ligação carbo�
no–carbono é por um ataque de carbânion a um grupo
carbonila, como ilustrado para a formação de frutose
1,6�bisfosfato a partir de dois compostos de três car�
bonos (Figura 10.16a). A presença do grupo carbonila
na di�hidroxiacetona fosfato permite que os átomos de
hidrogênio do carbono adjacente fiquem mais acídicos.
A enzima remove um próton, deixando uma carga ne�
gativa no carbono. Elétrons de um grupo carbonila re�
sidem mais próximos do oxigênio; portanto, o carbono
fica com uma carga parcial positiva. Isso estabiliza o
carbânion, uma vez que os elétrons são deslocados e
Muitas transformações biológicas estão baseadas na
natureza especial do grupo carbonila e sua capacidade
de estabilizar uma carga negativa no carbono adjacente
a ele. Por exemplo, b�cetoácidos como o b�cetoglutarato
(Figura 10.17) podem ser descarboxilados, mas é ener�
geticamente mais difícil para um α�cetoácido como o
piruvato ser descarboxilado. Quando a ligação –CH�–
COO– se quebra, os elétrons da ligação são deixados
para trás no carbono�b. A carga negativa que se desen�
volve no que era o carbono�b pode ser estabilizada pela
carga parcial positiva do carbono da carbonila. A enzi�
ma estabiliza o estado de transição por fazer um próton
interagir com o oxigênio da carbonila, que é parcial�
mente negativo em virtude da ressonância do carbono
da carbonila e da carga negativa que se desenvolve no
carbono�b.
Diferentemente, piruvato não pode sofrer uma rea�
ção de descarboxilação simples, porque não haveria
modo de estabilizar a carga negativa que resultaria do
par
sai. Para
de elétrons deixados para
descarboxilação de α�cetoácidos,
trás quando são
o grupo
necessá�
CO�
rias coenzimas.
400 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

O O H O peptídica de modo que a ligação seja mais facilmente

O−CCH2 C CC O− β-cetoglutarato
hidrolisada, por catálise básica geral ou catálise ácida
ou catálise de íon metálico (p. �07).
H
A fosforilação de proteínas, especialmente no grupo
O Oδ− H O hidroxila de resíduos de serina, treonina ou tirosina por
ATP ou GTP, acontece pelo ataque do grupo −OH ao
O−C
O CH2
CCH2 O−
C CC O− Estado de
δ+ transição fosfato (Figura 10.19). É necessário tornar o grupo −OH
H mais nucleofílico perdendo um próton, enquanto a liga�
ção fosfato–oxigênio é polarizada de modo que o átomo
de fósforo fica parcialmente positivo e mais susceptível
O−C H ao ataque nucleofílico. Quase todas as enzimas (quina�
O O
C +CO2 ses) que catalisam esse tipo de reação usam Mg�+. Íons
H
divalentes podem se ligar a dois ou três dos fosfatos.
A presença do íon positivo leva os elétrons da ligação
P=O a ficarem mais próximos do átomo de oxigênio,
FIGURA
adjacente
10.17
O− ao CO�
C Descarboxilação
CH2 C CH3 de ß-cetoglutarato.
α-cetobutirato deixando assim o íon fosfato com uma carga levemente
positiva.

A descarboxilação do b�cetoglutarato ocorre porque a carga

parcial positiva do carbono do grupo carbonila estabiliza a car� NH2
ga negativa em desenvolvimento que se forma quando a liga�
C
ção do grupo carboxila começa a se quebrar. Uma carbonila N C N
que está saindo não pode estabilizar a carga. C H
CH C
N N
Oxidações
~P~
Mg++
Mesmo as reações de oxidação têm um componente –OPO
O O O O
P OCH2
iônico. Durante a oxidação de um álcool a um aldeído/
cetona ou de uma ligação carbono–carbono saturada O
para insaturada, os elétrons são movimentados não Base : OH
O(Ser)
– O– O– C H H C
como elétrons livres, mas como íon hidreto, isto é, um H CC H
próton com dois elétrons, carregando uma carga ne�
OH OH
gativa (Figura 10.18). O íon hidreto não entra no sol�
vente como o próton, mas vai para um aceptor como o
NAD(P) ou FAD. FIGURA 10.19 Fosforilação é um ataque de um nucleófilo
a um nucleosídeo trifosfato (NTP).
ATP ou outro NTP é atacado pelo par de elétrons sobre o oxi�
gênio de um álcool como serina, treonina ou tirosina. Um íon
CH3 OH H+ O− O Mg�+, quando ligado ao NTP, serve para empurrar elétrons para

C
H NAD+ NADH
··COO− CH3 C+COO− CH3C COO−
longe do grupo fosforoso, tornando�o mais susceptível ao ata�
que do nucleófilo.

(a) Lactato Piruvato

Ligação Covalente do Substrato à

H
C C
H
H H+ H
CC
−
H
CCH
Enzima
H··

NAD+ NADH
+
H As enzimas não apenas funcionam realizando ca�
(b) Saturado
FIGURA 10.18 Oxidação de lactato e uma ligação
carbônica saturada.
(a) Lactato para piruvato. (b) Ligação saturada para ligação
insaturada. Essas reações sofrem uma reação tipo iônica, em�
bora o íon hidreto (H–) esteja envolvido.
Adição e Remoção de Prótons
A maioria das enzimas adiciona e remove prótons
eficientemente, mas em geral de um modo singular. As
proteases podem polarizar o grupo carbonila da ligação
tálise geral ácido e base, mas em alguns casos o subs�
Insaturado
trato forma uma ligação covalente com a enzima. Qui�
motripsina e gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase são
exemplos de enzimas assim (Figura 10.�0). Em ambos
os casos, um aminoácido nucleofílico ataca um grupo
carbonila. Até algumas quinases funcionam por catá�
lise covalente; o ATP inicialmente se liga � enzima, e o
fosfato é transferido para um resíduo nucleofílico for�
mando uma enzima fosforilada; nesse caso, um grupo
hidroxila de uma serina ou treonina é ativado e faz o
ataque inicial. O substrato, então, entra e é ativado pela
base geral na enzima; a base ataca o grupo fosfato, for�
mando o produto final.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 401

O OH OPO3 H OH OPO3
10.4 SÍTIO ATIVO DE UMA
Enzima–SH + HCC CH2 2− ESC C CH2 2−
ENZIMA
desidrogenase
gliceraldeído
3-fosfato H OH H
gliceraldeído tio-hemiacetal O sítio ativo de uma enzima é pequeno comparado
(a) 3-fosfato ao tamanho total da molécula de proteína. A maioria
dos resíduos de aminoácidos não fica em contato com
O O
o substrato (Figura 10.��). As distâncias e os ângulos
Enzima–OH + R NCR′ E O C R′ entre os resíduos catalíticos da enzima e do substrato
devem ser exatos para permitir que ocorra a catálise. A
H
maioria dos aminoácidos da proteína funciona como um
(b) quimotripsina peptídeo acil éster grande arcabouço para permitir o alinhamento correto
FIGURA 10.20Alguns substratos formam uma ligação dos grupos funcionais dos substratos. Uma mutação de
covalente com uma enzima.
um resíduo distante do sítio ativo pode levar uma enzi�
(a) Gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase e (b) quimotripsina ma a ter sua atividade alterada. Isso é ilustrado na Figu�
funcionam formando primeiro um intermediário covalente com ra 10.�3 para uma mutação puntual que foi introduzida
o substrato. na aldeído desidrogenase de fígado humano.

O pH Afeta uma Reação por Afetar

Ácidos e Bases Gerais
Como praticamente todas as enzimas envolvem catá�
lise geral ácido/base, espera�se que a velocidade da rea�
ção seja afetada pelo pH. Uma enzima requerendo uma
histidina para doar um próton na reação, não funcionará
em pH superior a 8, quando a maioria dos grupos imida�
zol da histidina está desprotonada. O pKa do imidazol é
próximo de 7 (Figura 10.�1). Todas as enzimas têm um
perfil de pH versus velocidade (p. �19), que em alguns
casos sugere os grupos envolvidos no sítio ativo. Como a Etanol
estrutura geral da proteína é importante na atividade ca�
talítica, se uma carga no pH alterar a conformação geral
NAD+
da proteína, então a atividade também será alterada. Em
algumas doenças, o pH intracelular não está normal; isso
Zinco
afetará a atividade enzimática celular
FIGURA 10.22 As enzimas são muito maiores do que seus
substratos.
Álcool desidrogenase com etanol ligado a um Zn�+ e um NAD+
no sítio ativo. A maioria dos aminoácidos da proteína não está
e
em contato com o substrato. Uma subunidade do dímero é
d mostrada como fitas, e a outra como átomos.
a
d
i
c
o
l
e
V

Estereoquímica do Sítio Ativo

3 5 7 9
pH
FIGURA 10.21Velocidade de uma reação catalisada por
enzima pode ser afetada pelo pH se um grupo dissociar
um H+.
Se um imidazol de histidina precisar ser protonado para a ati�
vidade catalítica de uma enzima, a velocidade da reação dimi�
nuirá � medida que o pH aumenta acima do pKa (assumindo 7)
do resíduo. Se o grupo precisar ser desprotonado para que a
enzima funcione, então a curva teria a forma inversa, com ativi�
dade máxima acima de pH 8. Metade da atividade máxima seria
obtida no pKa do grupo porque 50% das moléculas estariam
ionizadas e 50% não�ionizadas.
O sítio ativo é específico para o substrato. Como
exemplo, restrições geométricas sutis impedem uma
enzima de hidrolisar uma ligação b�glicosídica entre
duas moléculas de glicose, embora permita que a en�
zima hidrolise a ligação α (Figura 10.��). As enzimas
também diferenciam entre isômeros ópticos; embora
existam as formas D e L de muitos compostos, as célu�
las de mamíferos utilizam apenas um estereoisômero.
O D�Lactato é dificilmente reconhecido pela lactato
desidrogenase de mamíferos, que é específica para o
isômero L (Figura 10.�5). A ligação também pode rea�
gir com centros pró�quirais para produzir um compos�
to opticamente ativo. Um carbono quiral tem quatro
grupos diferentes ligados e é opticamente ativo; um
402 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Configuração L Configuração D
CH3
COO− COO−
C19
+
NH
+ 3CH CH NH3
Y203
CH3
alanina

HOCH
COO−
CH3 COO−

CHOH

CH3

NAD+ lactato

FIGURA 10.25 As enzimas podem diferenciar entre

isômeros ópticos.

ma é assimétrica, uma vez que os aminoácidos são to�

FIGURA 10.23 Aminoácidos a uma distância do sítio ativo
são críticos.
Um resíduo de aminoácido na superfície de uma enzima pode
ser necessário para manter a enzima em sua forma correta.
O resíduo 19, uma cisteína, de uma subunidade da aldeído
desidrogenase (500 aminoácidos) foi trocada por tirosina. O
mutante resultante era insolúvel. O resíduo 19 normalmente
se liga ao resíduo �03, o que aparentemente é necessário para
manter a estrutura tridimensional correta
dos da configuração L, e as hélices giram todas para a
direita (p. 96). Embora talvez uma supersimplificação,
frequentemente se afirma que, se houver uma ligação
de três pontos do substrato � enzima, um produto op�
ticamente puro seria formado a partir de um centro
pró�quiral (Figura 10.�6). Ver Um Olhar Mais Atento
10.� para uma discussão sobre como a estereoquímica
explica alguns mecanismos enzimáticos.

centro pró-quiral é um carbono que não é opticamente

ativo, mas se torna opticamente ativo após adição es�
téreo�específica de um grupo. O composto não�optica�
CH2OH
mente ativo liga�se � enzima em apenas uma orienta�
ção, forçando a reação química a produzir um produto
opticamente puro. Glicerol, um composto não�optica�
mente ativo, é fosforilado pela glicerol quinase; apenas
C
o produto L é formado. A enzima liga�se ao composto CH2OH
de tal modo que apenas um dos alcoóis primários fica HO
perto do ATP. Isso ocorre porque a superfície da enzi�

CH2OH CH2OH
H
H OH H O
HOH H OH H (H,OH)

HO O
H OH H OH
Maltose (ligação α)
Enzima

CH2OH O CH2OH
H H O
OH H O OH H (H,OH)
FIGURA 10.26 Ligação de três pontos de um substrato
HO H simétrico a um sítio assimétrico de ligação de substrato.
H OH H OH Glicerol quinase, por causa dos sítios de ligação assimétricos
para o —H e o grupo —OH do glicerol, liga apenas o grupo
Celobiose (ligação β)
α!�hidroximetil ao sítio ativo. Um estereoisômero resulta da
FIGURA 10.24 As enzimas podem diferenciar entre reação da quinase, L�glicerol 3�fosfato. O sítio ativo é a caixa
ligações a e b. � direita.
Uma enzima que hidrolisa maltose, não hidrolisa celobiose.

Influência de Grupos Sobre o
Substrato Distal à Ligação a Ser
Modificada
A química do sítio ativo, em alguns casos, envolve
uma porção limitada do substrato, mas as partes ad�
jacentes do substrato podem ser necessárias para que
a reação ocorra. Por exemplo, a peptidase de proces�
samento de proteína mitocondrial requer pelo menos
1� resíduos antes do sítio de hidrólise para funcionar.
Lisozima, uma enzima que hidrolisa paredes celulares
de bactérias, envolve resíduos de açúcares localizados
em ambos os lados da ligação a ser quebrada (Figura
10.�7). A ligação de resíduos adjacentes de açúcares
ajuda a criar uma mudança de conformação no açúcar,
na ligação que está sendo quebrada. Assim, o sítio ativo
é mais do que apenas os resíduos de aminoácidos en�
volvidos na quebra ou na formação da ligação; é uma
região complexa da enzima que pode ajustar sua estru�
tura para acomodar o substrato correto e estabilizar o
estado de transição.
Substrato
hexassacarídeo
a
P lisozima.
a 6
ED a 4O
D
E a
P
P formação meia�cadeira, e uma hidrólise
a hidrólise
Sítio de
a
Lisozima
CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 403
UM OLHAR MAIS ATENTO 10.2
Estereoquímica Ajuda a Explicar o Mecanismo de
Reações Catalisadas por Enzimas
Muitos substratos de ocorrência natural são op�
ticamente ativos. A esteroquímica do produto pode
dar uma pista do mecanismo que a enzima emprega.
Por exemplo, se a reação produzir um íon carbânion,
poderia se esperar que o produto fosse racêmico.
Entretanto, uma reação de íon carbânion catalisa�
da por enzima produzirá um produto com retenção
de configuração estereoquímica. O íon carbânion
não estaria livre em solução, mas estaria associado
com a enzima, de modo que o ataque nucleofílico que
está entrando poderia vir apenas na mesma direção
do grupo que está saindo. Retenção da configuração
também pode ser conseguida por uma enzima que
funciona com catálise covalente. Reações catalisa�
das por um mecanismo pingue�pongue (p. �19) en�
volvem duas etapas de inversão, que geram um pro�
duto com retenção da configuração. Como exemplo, a
fosforólise de um dissacarídeo começa com o açúcar
na conformação b e termina com um produto fosfo�
rilado, que também é b. A ligação do substrato � en�
zima causa inversão para uma configuração α, mas o
fosfato ataca para dar outra inversão, resultando em
retenção da configuração. Se a reação ocorresse por
um ataque direto do fosfato sobre o substrato, então
o produto seria invertido. A inversão de configuração
em um carbono opticamente ativo geralmente ocorre
quando há um complexo ternário e o nucleófilo ataca
o substrato.
FIGURA 10.27 Ligação de
hexassacarídeo ao sítio ativo da
(a) No substrato modelo apresentado, os
CH
OHOH
62
GlcNAc
3 OH
5 O
NHCOCH23
substrato
Unidade
1 H3(P)da lisozima
OCCHCOOH
repetitiva
O4 CH2OH
MurNAc
5O
3 no NHCOCH
2 (a)
1 OO3 ovais representam anéis individuais de pi�
ranose das unidades repetitivas do subs�
trato da lisozima, mostrado � direita. O
anel D é forçado pela enzima para a con�
ocorre entre os anéis D e E. Seis subsítios
da enzima ligam�se ao substrato. Os sítios
alternativos são específicos para grupos
acetamido (a), mas são incapazes de acei�
tar as cadeias laterais lactil (P), que ocor�
rem nos resíduos de ácido N�acetilmurâ�
mico. Assim, o substrato só pode se ligar �
enzima em uma orientação.
Redesenhado com base em modelo pro�
posto por Imoto, T. et al. Em Boyer, P.
(Ed.), The Enzymes, 3. ed., Vol. 7, New
York: Academic Press, 197�, 713.
404 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
10.5 COENZIMAS,
COSSUBSTRATOS E
COFATORES
Muitas enzimas requerem a participação de uma
molécula não proteica durante a reação enzimática. As
coenzimas são moléculas orgânicas pequenas; a maio�
ria é derivada de vitaminas (Capítulo �6). As coenzi�
mas estão envolvidas em muitas reações e podem ser
ou não modificadas na reação. As que são alteradas são
também chamadas cossubstratos. Para algumas rea�
ções, a energia de hidrólise do ATP é necessária sem
incorporação de fosfato ao produto; nesse caso, o ATP é
um cossubstrato. Para muitas reações enzimáticas são
necessários íons metálicos, e são chamados cofatores.
Coenzimas
A Tabela 10.3 mostra as coenzimas e as vitaminas
das quais são derivadas. As coenzimas participam de
reações catalisadas por enzimas, mas não são os com�
postos primários que estão sendo modificados. Algu�
mas coenzimas participam da ação de muitas enzimas
diferentes, enquanto outras apenas de um número li�
mitado de reações. Elas têm afinidades por enzimas
específicas e podem estar fortemente unidas ou cova�
lentemente ligadas. Algumas são modificadas durante
o curso da reação, mas estão no seu estado original ao
final da reação, enquanto outras permanecem modifica�
das no final. Se estiverem modificadas no final, devem
participar de outra reação para retornar ao seu estado
original. As coenzimas estão presentes em células em
uma concentração razoavelmente constante e desem�
penham um papel dinâmico no metabolismo. O termo
apoenzima é usado para se referir a uma enzima que
não possui a coenzima ligada a ela, e holoenzima refe�
re�se � enzima com o seu cofator ligado. A importância
do sítio de ligação da coenzima e o modo como altera�
ções nesse sítio causam disfunção metabólica são dis�
cutidos na Correlação Clínica 10.�.
TABELA 10.3 Coenzimas
Coenzima Vitamina
Biotina Biotina
Cobalamina (B1�) Cobalamina (B1�)
Coenzima A Pantotenato
Coenzimas flavina Riboflavina (B�)
Ácido lipoico
Coenzimas de niacina Niacina
Piridoxal fosfato Piridoxina (B6)
Tetra�hidrofolato Ácido fólico
Tiamina pirofosfato Tiamina (B1)
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.2
Mutação de um Sítio de Ligação de Coenzima
Resulta em Doença Clínica
Cistationinúria é uma doença genética na qual
g�cistationase está deficiente ou inativa. Cistationase
catalisa a reação
Cistationina → cisteína + α�cetobutirato
A deficiência da enzima leva ao acúmulo de cis�
tationina no plasma. Como cistationase é uma enzi�
ma dependente de piridoxal fosfato, a vitamina B6 foi
administrada aos pacientes cujos fibroblastos con�
tinham material que apresentavam reação cruzada
com anticorpos contra cistationase. Muitos respon�
deram � terapia com B6 com uma queda nos níveis
plasmáticos de cistationina. Esses pacientes produ�
zem a apoenzima, que reagiu com o anticorpo. Em
um paciente, a atividade enzimática era indetectável
em homogenatos de fibroblastos, mas aumentou para
31% do normal com a adição de piridoxal fosfato 1
mM � mistura de reação. Acredita�se que o Km para a
ligação de piridoxal fosfato � enzima estava aumen�
tado em virtude de uma mutação no sítio de ligação.
A atividade é parcialmente restaurada aumentando�
�se a concentração de coenzima. Aparentemente, es�
ses pacientes requerem uma concentração de estado
estacionário mais alta de coenzima para manter a
atividade de g�cistationase.
Pascal, T. A., Gaull, G. E., Beratis, N. G., Gillam, B.
M. et al. Vitamin B6�responsive and unresponsive cys�
tathionuria: two variant molecular forms. Science 190:
1�09, 1975.
Reação Mediada
Carboxilação
Alquilação
Transferência de acil
Oxidação�redução
Transferência de acil
Oxidação�redução
Transferência de amino
Transferência de grupo de um carbono
Transferência de carbonila
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 405

NAD e NADP São Formas Coenzimas da

UM OLHAR MAIS ATENTO 10.3
Niacina
Abreviações para NAD e NADP
Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) e ni�
cotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP) As notações NAD e NADP são usadas generica�
(Figura 10.�8) são derivados da niacina (p. 1103) e mente, para indicar as coenzimas oxidadas ou redu�
estão envolvidos em reações de oxidação/redução ca� zidas. NAD+ e NADP+ especificam as formas oxida�
talisadas por desidrogenases. A diferença entre NAD+ das, e NADH e NADPH as formas reduzidas. Algumas
e NADP+ é a presença de um grupo fosfato no carbono enzimas usam tanto NAD ou NADP, de modo que são
�! da ribose da adenina. A nomenclatura para abrevia� chamadas enzimas NAD(P)�dependentes.
ção dessas coenzimas está descrita em Um Olhar Mais
Atento 10.3. Uma reação generalizada de desidrogena�
se envolvendo NAD+ é apresentada na Figura 10.�9.
Embora a maioria das desidrogenases seja específica
para uma ou outra coenzima, algumas podem usaram� COO−
bas as formas. A maioria das desidrogenases catalisa
HOCH
reações reversíveis.
CH2
A parte funcional da coenzima oxidada é o anel de
nicotinamida que tem um átomo de nitrogênio na posi� COO−

ção 1 e carrega uma carga positiva em virtude da ligação L-Malato

NAD+
a um anel de ribose. A carga positiva torna possível para
a nicotinamida aceitar um íon hidreto, transferindo dois NADH + H+
elétrons (Figura 10.30). Um complexo ternário entre COO−
enzima, coenzima e substrato se forma, e um íon hidre�
C 0
to é transferido do substrato para NAD(P)+. Um próton
do substrato é liberado para o meio. Para a reação re� CH2
versa, o anel reduzido da nicotinamida está envolvido,
e o anel não tem a carga positiva até que o íon hidreto COO−
Oxaloacetato
seja transferido para um substrato oxidado. As reações
das quais NAD(P) participam podem ser consideradas FIGURA 10.29 Reação catalisada por malato
iônicas, embora o íon transferido seja um íon hidreto desidrogenase.
que carrega uma carga negativa. Íons hidreto não exis� A enzima forma um complexo ternário ligando ambos NAD+ e
tem no estado livre; o íon é transferido diretamente en� malato antes do íon hidreto ser passado para o NAD+.
tre substrato e coenzima. Depois de aceitar ou doar o
íon hidreto, a coenzima se dissocia da enzima e entra H O H H O

HCNH2 H C NH2
H N+ + H−
Anel de nicotinamida Anel de nicotinamida
(oxidada) (reduzida) H H N H

) H O Íon deH:hidreto,– H H O
NAD+ Hidreto NADH
4 3 (a) do substrato
+ C NH2 C NH2
D 5
A
N
( O
H
6 2
o .. H+ O
e N+ N
d
ít 1
o –O .
e
l O CH2 .. CH3 C COO− CH3CCOO−
c
u P O
n
i
d O H H H −H−
a
n
i H H (Para NAD+)
n O OH OH (b) Lactato Piruvato
e NH2
d
a
a O N
d
i N FIGURA 10.30 NAD está envolvido em reações de
P
m
a M– P oxidação–redução.
n
it A O O CH2
o
(a) O grupo nicotinamida do NAD+ aceita um íon hidreto (H�)
c O N N
i
N H H quando oxida o substrato. (b) Lactato doa o íon hidreto quan�
H H do oxidado a piruvato.
OH OH

NADP+ contém um P
nesta 2!-hidroxila
nos reservatórios celulares de NAD+ ou NADP+, ficando
FIGURA 10.28 Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) e disponível para outras reações. As razões NAD+/NADH
nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP). e NADP+/NADPH são independentes de uma desidro�
406 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

genase específica, mas medem o estado de oxidação/ fumárico (Figura 10.3�) ou de um ácido graxo saturado
redução do compartimento celular (p. 579). Desidro� para um insaturado, envolve reações de desidrogena�
genases NAD�dependentes estão mais frequentemente ses flavina�dependentes. No caso da monoamina oxi�
envolvidas no catabolismo, e as NADP�dependentes no dase, uma enzima contendo flavina, um íon hidreto é
anabolismo. removido da amina, mas o aceptor final dos elétrons é
o oxigênio molecular, levando � formação de peróxido
Quase todas as desidrogenases NAD(P)�dependen� de hidrogênio.
tes possuem um motivo estrutural semelhante (dobra
de Rossmann) envolvido no domínio de ligação da
coenzima; o motivo da álcool desidrogenase é apresen� H H H
tado na Figura 10.31. H2C
1
C C C
5
CH2OH Ribitol

H3 OH OH OH
6 5 1 2O
H3 9 N N
C 8

10 Dimetil
C 7 4 NH3 isoaloxazina

O
Riboflavina

H H H O

H2CCCCCH2OPOH

OH OH OH OH

N N CO
H3C
NH
H3C N C

FIGURA 10.31 A dobra de Rossmann na álcool

O
desidrogenase do fígado.
NAD(H) liga�se � dobra de Rossmann na maioria das desidro� Flavina mononucleotídeo (FMN)
genases.
FIGURA 10.32 Riboflavina e flavina mononucleotídeo.
FMN e FAD São Formas de Coenzima da
Riboflavina NH2

N N N
As duas formas de coenzima da riboflavina são
FMN (flavina mononucleotídeo) e FAD (flavina ade
nina dinucleotídeo). A vitamina riboflavina consiste N
do anel heterocíclico isoaloxazina (flavina) conectado O O

pelo N�10 ao álcool ribitol (Figura 10.3�). FMN tem CH2OPOPOCH2

um fosfato esterificado ao grupo 5!�OH do ribitol. FAD O
HO C H O– O–
é estruturalmente análogo ao NAD por ter adenosina H H
HO C H H
ligada por uma ligação pirofosfato ao açúcar de uma
CH H OH OH
flavina mononucleosídeo (Figura 10.33). Ambos FAD HO C
e FMN funcionam em reações de óxido�redução, acei� 2
tando e doando �e– no anel de isoaloxazina na forma
de um hidreto. Em alguns casos, essas coenzimas são H3C N N
9 10 1 O
8a 8 9a
aceptores de 1e–, o que leva � formação de flavina se� 10a 2

3
miquinona (um radical livre). As coenzimas de flavina 7a 7
6
5a
5
4a
4
N
não são encontradas livres em solução, mas ligadas ou H3C N H
O
muito fortemente ou covalentemente. São considera�
das um grupo prostético no último caso. Isso requer
que uma enzima envolvida em uma reação de oxidação Flavina adenina dinucleotídeo (FAD) (oxidada)

gerando flavina reduzida ligada, também execute a re� FIGURA 10.33 Flavina adenina dinucleotídeo (FAD).
dução de outro substrato, de modo que flavina oxidada
seja regenerada.

A oxidação envolve ligações saturadas carbono–car�

bono, como na oxidação de ácido succínico para ácido
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 407

R intermediário covalente que a enzima catalisa a remo�

(1)
H3C (9) N N C O ção do grupo. Um par de elétrons é deixado no carbo�
H2CCOOH + no, e sua carga é estabilizada por ressonância com o
H2C COOH H3 NH anel piridoxal. A formação de dopamina e serotonina,
C N C importantes neurotransmissores, envolve uma enzima
(10) O piridoxal fosfato.
succínico
Ácido FAD

Adenosina Trifosfato Pode Ser

um Segundo Substrato ou um
Modulador de Atividade
H3 N
R H
Adenosina trifosfato (ATP) (Figura 10.36) funcio�
HC COOH + H3C N O na como cossubstrato, mas também pode funcionar
como um cofator na modulação da atividade de algu�
HOOC C H NH mas enzimas. Esse composto é central em bioquímica,
C N
H O e é sintetizado em todas as células de mamíferos. A
extremidade bioquimicamente funcional é o trifosfato
fumárico
Ácido FADH2 reativo. A ligação terminal fosfato–oxigênio tem uma
alta energia livre de hidrólise, o que significa que o
FIGURA 10.34 FAD é a coenzima da reação de fosfato pode ser transferido do ATP para outros gru�
desidrogenase succínica. pos aceptores. Por exemplo, como um cossubstrato o
ATP é utilizado por quinases para a transferência do
Piridoxal Fosfato É a Forma Coenzima do fosfato terminal para vários aceptores. Um exemplo
Piridoxal típico é a reação catalisada pela hexoquinase (ver Fi�
gura 15.�; p. 61�).
Piridoxal fosfato (Figura 10.35) está envolvido pri�
mariamente em reações envolvendo aminoácidos. Uma
importante reação utilizando piridoxal fosfato é a tran� NH2

saminação, uma reação (ver Figura 10.�) que introduz N CCN

um amino grupo em um composto. O aceptor é um gru� CH
po carbonila, como um α�cetoácido, e o doador é um HC N
Ligações de C N
aminoácido, como glutamato ou aspartato (ver Figura alta energia
19.3, p. 773). O aminoácido ligado ao piridoxal fosfato O
γ Oβ αO
transfere o amino grupo para ele, formando uma piri�
doxamina ligada � enzima. Depois que o substrato que –OPOPOPOCH2 O

doou o amino grupo sai da enzima, um α�cetoácido di� –O O– O– H OH

H OH
H
ferente entra e ocorre a transferência da amina da piri� H
doxamina. O piridoxal é, portanto, regenerado. Esse é Mg2+ D-Ribose
um exemplo de modificação de uma coenzima durante
a reação, mas retornando a seu estado original ao final
da reação.
Adenosina 5′-trifosfato

FIGURA 10.36 Estrutura do Mg2+-ATP.

CHO O
HO CH2OPO–
O ATP também funciona como um modulador da ati�
vidade de algumas enzimas. Essas enzimas têm sítios
O–
para ligação de ATP, cuja ocupação muda a afinidade
H3C
N ou a reatividade da enzima em relação ao seu substrato.
Piridoxal fosfato Nesses casos, ATP funciona como um modulador alos
térico (p. ��7).
FIGURA 10.35 Piridoxal fosfato.
Piridoxal fosfato liga�se ao amino grupo de um aminoácido e
ajuda na remoção do grupo R, o H ou o CO� do aminoácido. Cofatores Íons Metálicos
Ressonância no anel piridina da coenzima estabiliza Muitas enzimas requerem a presença de um íon
uma carga negativa no que era o carbono α. A base da metálico para sua atividade. Íons metálicos desempe�
reação é que o aldeído do resíduo piridoxal liga�se com nham papel estrutural ou funcionam como um ácido
o aminoácido, formando uma base de Schiff. É nesse de Lewis (um íon positivo que pode se ligar a elétrons
408 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

não�pareados), ou como um aceptor/doador de elétrons O Zn�+ funciona na carboxipeptidase e na termoli�

em reações de oxidação�redução. Eles podem se ligar
diretamente a uma enzima ou ao substrato. O substrato
ligado ao íon metálico é o substrato real da reação. Uma
reação muito comum envolve íons Mg�+ ligados a um
nucleotídeo trifosfato; o íon metálico se liga aos fosfa�
tos tornando o íon fosfato mais positivo e susceptível ao
ataque nucleofílico (Figura 10.37).
HO
sina, proteases com sítios ativos idênticos, para gerar
um grupo hidroxila a partir da água e para estabilizar
o estado de transição resultante do ataque da hidro�
xila sobre a ligação peptídica. A Figura 10.39 mostra
a geração da hidroxila de sítio ativo pelo Zn�+. O Glu
�70 funciona como uma base necessária para remover o
próton da água. A estabilização do estado de transição
tetraédrico pelo Zn�+ é apresentada na Figura 10.�0. O
Zn�+ fornece um contraíon para estabilizar o oxigênio
negativo no carbono tetraédrico.

HO NH2
R1
O N
3 N
HOHO O Glu 270 C O H NH
N N
OCH2O O O O
O O HO C O– +127
H P O P P CH2 Arg
O
O– H H
–O O OH2 H H CH2 NH R
Mg Zn2+
H2O OH2 HO OH
OH2 FIGURA 10.39 Estabilização do estado de transição do
intermediário tetraédrico pelo Zn2+.
A carga positiva do Zn�+ estabiliza a carga negativa que se de�

FIGURA 10.37 Papel do Mg2+ como um complexo ligado senvolve nos oxigênios do carbono tetraédrico do estado de
pelo substrato no sítio ativo das quinases. transição. O intermediário tetraédrico então colapsa como in�
Na hexoquinase, o fosfato terminal do ATP é transferido para a dicado pelas setas, resultando na quebra da ligação peptídica.
glicose, formando glicose 6�fosfato. Mg�+ coordena com o ATP
para formar o verdadeiro substrato e pode fragilizar a ligação Tyr 248
P�O terminal do ATP para facilitar a transferência do fosfato
para a glicose. Há sítios de ligação específicos (azul claro) na Arg 145
enzima (azul mais escuro) para glicose (superior � esquerda,
em vermelho), bem como para os resíduos de adenina e ribose
no ATP (preto).

As metaloenzimas contêm um metal de transição

fortemente ligado, como Zn�+ ou Fe�+, que facilita a li�
gação do substrato por formar um complexo ligado pelo
metal. Os metais funcionam ligando o substrato e pro�
movendo catálise eletrofílica (nucleofílica) no sítio de
clivagem da ligação ou estabilizando intermediários da
via da reação. Na álcool desidrogenase, um Zn�+ ligado
� enzima interage com o oxigênio do substrato, mudan�
Zn+2
do as propriedades do carbono ao qual o oxigênio está
ligado (Figura 10.38).
H2O

Glu 270

Zn2+

• •
• •
O
FIGURA 10.40Zn2+ no mecanismo de reação da
C
carboxipeptidase A.
CH3δ+H O Zn�+ ligado � enzima gera uma hidroxila nucleofílica a par�
tir de água ligada, que ataca a carbonila da ligação peptídica,
FIGURA 10.38 Ligação de uma carbonila a Zn2+. como indicado pela seta. O Glu �70 ajuda por puxar o próton
A ligação de Zn�+ � carbonila de um aldeído resulta em tornar o da água ligada ao zinco.
átomo de carbono parcialmente positivo e mais receptivo para Redesenhado de Lipscomb, W. N. e Robert A. Welch Found.
aceitar um íon hidreto do NADH. Conf. Chem. Res. 15:1�0, 1971.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
Além do papel na ligação entre enzima e substrato,
metais também ligam�se diretamente � enzima para
estabilizá�la em sua conformação ativa ou, talvez, para
induzir a formação de um sítio ativo. O Mn�+ tem tal
papel, bem como metais alcalinos fracamente ligados
(Na+ ou K+). Na piruvato quinase, K+ induz uma mu�
dança de conformação inicial, que é necessária, mas
não suficiente, para a formação do complexo ternário.
Quando o substrato se liga, K+ induz uma segunda mu�
dança conformacional no complexo ternário cataliti�
camente ativo, como indicado na Figura 10.�1. A álcool
desidrogenase de mamíferos é singular porque possui
duas moléculas de Zn�+ por subunidade; uma está en�
volvida na catálise, enquanto a outra tem um papel
estrutural. Cada íon metálico está preso a ligantes;
nesse caso, são as cadeias laterais dos aminoácidos da
proteína.
H de um ou mais grupos de quelatos de íons ligados por
C
H C
H2O
C P Mg
H2O
Sítio do ADP
+K+ –K+
C K
H2O
C Mg
P
H C H2O
H que reage com oxigênio para formar um complexo ativa�
Sítio do ADP
FIGURA 10.41 Modelo do papel de K+ no sítio ativo da
piruvato quinase.
A piruvato quinase catalisa a reação: fosfoenolpiruvato + ADP
→ ATP + piruvato. A ligação inicial de K+ induz mudanças
conformacionais na quinase, que resultam em afinidade au�
mentada pelo fosfoenolpiruvato. Além disso, o K+ orienta o
fosfoenolpiruvato na posição correta para transferência de seu
fosfato para o ADP (não mostrado), o segundo substrato. O
Mg�+ coordena o substrato com o sítio ativo da enzima. Resul�
tados mais recentes mostram que o papel exato do íon K+ não é
conhecido, mas parece que o íon permite a orientação correta
do sítio ativo para permitir que a catálise ocorra.
Modificado com permissão de Mildvan, A. S. Annu. Rev. Bio
chem. �3:365, 1971. Copyright © (1971) Annual Reviews, Inc.;
e Oria�J., Cabrera, N., Oerez�Monfort, R. e Ranirez�Silva, L. J.
Biol. Chem. �80:379��, �005.
• 409
Por exemplo, Zn�+ liga�se a quatro ligantes. Na ál�
cool desidrogenase, o Zn�+ estrutural tem quatro ami�
noácidos ligados a ele, enquanto o Zn�+ do sítio ativo
tem apenas três, com a água ou o substrato servindo
como o quarto. Alguns compostos como o íon azida
(N3–) ou monóxido de carbono (CO) ligam�se ao sítio
de ligação do substrato em metais, impedindo assim
que a enzima ou a proteína se ligue ao seu substrato
correto.
Papel de Metais em Oxidação e Redução
Íons metálicos, como cobre e ferro, com menos do
que um complemento completo de elétrons em sua ca�
mada mais externa, podem aceitar ou doar elétrons em
reações de oxidação–redução, mas íons monovalentes
(Na+ e K+) ou íons divalentes (Zn�+, Mg�+ ou Ca�+) com
suas camadas externas de elétrons completas, não.
Proteínas ferro-enxofre, frequentemente chamadas
proteínas com ferro não�hemínico, são uma classe sin�
gular de metaloenzimas na qual o centro ativo consiste
enxofre. Em alguns casos, os átomos de enxofre vêm só
da cisteína e, em outros, vêm da cisteína e de enxofre
iônico livre. Essas enzimas com ferro não�hemínico têm
potenciais de redução razoavelmente baixos (E0!) e fun�
cionam em reações de transferência de elétrons (p. 580).
Citocromos são proteínas com ferro hemínico nas quais
o ferro passa por transferências reversíveis de um elé�
tron. Em alguns casos, o heme está ligado � apoproteína
por coordenação de cadeias laterais de aminoácidos com
o ferro do heme. Assim, o metal não tem só um papel
estrutural, mas também participa do evento químico.
Cobre e ferro também têm um papel na ativação do oxi�
gênio molecular. Cobre é um participante ativo de várias
oxidases e hidroxilases. Por exemplo, a dopamina b�hi�
droxilase catalisa a introdução de um átomo de oxigênio
de O� na dopamina para formar norepinefrina (Figura
10.��). A enzima ativa contém um átomo de íon cuproso
do oxigênio–cobre. Acredita�se que o complexo cobre–
hidroperóxido seja convertido em uma espécie de cobre
(II)–O– que funciona como oxigênio ativo na hidroxi�
lação da DOPA. Outras espécies de oxigênio ativo são
geradas em metaloenzimas e usadas para hidroxilação.
10.6 CINÉTICA DE REAÇÕES
QUÍMICAS
Velocidade de Formação de Produto
As velocidades de todas as reações químicas podem
ser expressas em termos matemáticos. No desenvolvi�
mento das equações de velocidade, pode ser determi�
nada ou a formação de produto, ou o desaparecimento
410 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

dos reagentes iniciais; na maioria Cu2+ Cu+

dos casos, a formação de produ� Enzima + Ascorbato Enzima + Desidroascorbato + 2H+
to é medida. A partir das relações
matemáticas entre a(s) taxa(s) de
formação de produto(s) (chama�
da velocidade) em função da(s) Cu+ Cu (II)
concentração(ões) de substrato(s), Enzima + O2 Enzima O
alguns aspectos do mecanismo de
catálise enzimática podem ser de� O
terminados. Uma equação que des� H
creve a velocidade de formação de
HO
produto de qualquer reação contém
Cu(II) O NH
uma constante de velocidade (k) e 2
Enzima + HO
a concentração de todos os subs�
tratos que mudam durante o curso H
O
da reação. Na reação A + B → P, a
H Dopamina
variação na concentração de produ�
to em função do tempo é d[P]/ dt, HO
onde [P] é concentração do produ� Cu2+ NH2
to em qualquer tempo t. A equação Enzyme + HO + H2O
básica relacionando velocidade com
OH
reagentes é
Norepinefrina
d[P]/ dt = k[A][B] (10.�)
FIGURA 10.42 Papel do cobre na ativação de oxigênio molecular pela dopamina
k é a constante de velocidade e hidroxilase.
é uma constante para uma reação A forma normal cúprica da enzima não é reativa com oxigênio, mas após redução pelo
específica. [A] e [B] são as concen� cossubstrato ascorbato gera um radical de oxigênio reativo ligado � enzima�cobre que,
trações dos substratos em qualquer então, reage com dopamina para formar norepinefrina e uma enzima cúprica inativa.
tempo. A constante de velocidade
está relacionada com a energia de ativação para chegar dam durante o curso da reação. Em reações envolvendo
ao estado de transição, e muda pela adição de um cata� água, a concentração de água não é alterada (ou não é
lisador. Constantes de velocidade podem ser alteradas possível medir). Assim, se B é água na reação A + B →
só por mudança nas condições da reação, isto é, adição C, o valor de B é uma constante e a reação é de primeira
de catalisador ou mudança de pH ou composição iônica. ordem (Equação 10.3).

Reações de Primeira e Segunda Ordem

Uma reação com apenas um substrato (A → P) é
uma reação de primeira ordem, com
d[P]/dt = k[A] (10.3)
Se existirem dois substratos, a reação é de segunda
ordem (Equação 10.�). As unidades de k são diferen�
tes nas equações de primeira e segunda ordem. Como
d[P]/dt tem as unidades moles/minuto (ou qualquer ou�
tra unidade de concentração ou tempo), k na Equação
10.� teria as unidades de 1/moles × min, enquanto na
Equação 10.3 k estaria em 1/min. Se forem necessárias
duas moléculas do composto A para formar o produto
P, então a equação seria de segunda ordem porque a
velocidade para fazer P seria relacionada a uma reação
de [A] + [A]. A equação seria d[P]/dt = k[A][A] ou k [A]�,
que é idêntica a uma reação de segunda ordem, embora
um composto esteja envolvido. Para d[P]/dt = k[A][B], a
reação é de primeira ordem com respeito a A e B, mas a
reação geral é de segunda ordem.
Os termos de concentração na equação da velocida�
de são só para os substratos cujas concentrações mu�
Velocidade de Desaparecimento de
Substrato
Para a reação simples A → P, a velocidade da reação
também pode ser dada pelo desaparecimento do subs�
trato em função do tempo, –d[A]/dt. O sinal de menos
é necessário uma vez que a concentração de A está di�
minuindo com o tempo. A variação na concentração do
produto P com o tempo é d[P]/dt, o que é igual � perda
de substrato ou –d[A]/dt.
d[P]/dt = d[A]/dt = k[A] (10.�)
A equação para perda de substrato em função do
tempo é
d[A]/dt = –k[A] (10.5)
e a integral de dA/A é ln A levando a
ln[A] = �,3 log [A] = –kt + constante (10.6)
A Equação 10.6 é a relação matemática para a perda
de substrato em função do tempo. No tempo zero, [A]
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 411

é a concentração inicial, [A0], de modo que a equação de substrato e formação de produto. A equação da velo�
pode ser reescrita como cidade para formação de produto reflete que o material
está sendo produzido (k1[A]), mas também está sendo
ln[A] = –kt +[A]0 perdido quando volta para o material inicial (–k�[P]). O
sinal negativo mostra que o material está sendo removi�
Portanto
do. Uma equação semelhante é escrita para a mudança
ln[A/A0] = –kt (10.7) no material de partida. Como no equilíbrio

ou d[P]/dt = d[A]/dt (10.11)

�,3 log[A/A0] = kt então

Um gráfico de ln[A] versus tempo é uma linha reta k1[A] = k�[P] então k1 / k� = [P]/[A] (10.1�)
com uma inclinação de –k (Figura 10.�3).
A razão k1/k� é a constante de equilíbrio Keq, e é
igual a [P]/[A]. Embora as constantes de velocidade in�
dividuais de uma reação reversível sejam independen�
tes da constante de equilíbrio, a razão entre as cons�
tantes é limitada pela constante de equilíbrio. A última
]
A
[ está relacionada com a energia livre necessária para
n
l
inclinação =−k fazer A e P (chamada calor de formação). A cinética
de reações complexas é apresentada em Um Olhar Mais
Atento 10.�.

tempo
Equilíbrio
FIGURA 10.43 Um gráfico de ln[A] versus tempo para
Produto (P)
uma reação de primeira ordem.
o
ãçartne
Para efeitos de comparação, o termo meia-vida é fre�
quentemente usado. A meia�vida (t1/� out50%) é o tempo cnoC
que levaria para que 50% do substrato fosse convertido
em produto. Como o valor [A/A0] seria 0,5 e o ln[0,5] = Substrato (A)
–0,69, isso leva a

–0,69 = –kt50% (10.8)

Tempo

ou meia�vida é igual a 0,69/k. Portanto, quanto maior
a constante de velocidade, mais rapidamente a reação
depletará metade do substrato. O decaimento radioa�
tivo é um exemplo de reação de primeira ordem, como
são reações catalisadas por enzimas sob determinadas
condições.
Reações Reversíveis
Muitas reações são reversíveis. Isto é,
A⇌
k1
P
k2
Pode�se escrever uma equação de velocidade para a
formação de produto P ou para o material de partida A.
d[P]/dt = k1[A] – k�[P] (10.9)
d[A]/dt = k1[A] – k�[A] (10.10)
No equilíbrio, quando não há mudança nas concen�
trações dos componentes, a velocidade de formação de
um componente é igual � velocidade de formação do
outro. A Figura 10.�� é um gráfico de desaparecimento
FIGURA 10.44 Gráfico de desaparecimento de substrato e
formação de produto.
Para uma reação reversível, não ocorre mudança na concentra�
ção de substrato ou produto no equilíbrio.
10.7 CINÉTICA ENZIMÁTICA
DE REAÇÕES COM UM
SUBSTRATO
Uma reação catalisada por enzima é como uma reação
de segunda ordem. Assim, � medida que a concentração
de substrato aumenta, a velocidade da reação aumenta,
como mostra a Figura 10.�5. A velocidade diminui du�
rante o curso da reação porque a concentração de subs�
trato está diminuindo ou o produto está começando a
se acumular. Considerando�se que a reação é reversível,
chegará ao equilíbrio. Calculando�se a velocidade inicial
(v0) (ou seja, velocidade antes que o produto comece a
se acumular) da reação em diferentes concentrações de
substrato, pode�se obter a curva apresentada na Figura
10.�6. A velocidade fica de ordem zero com relação ao
substrato em altas concentrações de substrato. Isto é,
412 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

UM OLHAR MAIS ATENTO 10.4

Reações Complexas

O deslocamento nucleofílico é uma reação orgânica
comum que ocorre em reações bioquímicas. Uma forma
geral da reação é R–X + Y→ Y–R + X (onde R represen�
ta parte de um composto orgânico e X e Y representam
um componente como um grupo álcool ou amino). A
reação pode ocorrer de dois modos diferentes, cada um
levando a uma equação de velocidade diferente.
A primeira possibilidade é que o composto R–X se
dissocie, formando R+ + X–. Em seguida, Y pode atacar
R+ para formar o produto final, R–Y. A segunda possibi�
lidade é Y atacar R–X diretamente, deslocando X para
formar o mesmo produto final. As equações cinéticas
para as duas reações são diferentes.
A velocidade da primeira etapa da reação de R–X
dando R+ + X– é
d[R–X]/dt = –k[RX]
Para a segunda metade da reação, R+ + Y, a veloci�
dade é dada por k’[R+][Y]. Se a primeira etapa for mui�
to lenta em comparação com a segunda etapa, então a
velocidade geral será governada só pela primeira etapa.
Em cinética, só as etapas lentas são medidas. Para ilus�
trar, vamos admitir que R–X vá para R+ + X– a uma ve�
locidade de 10 mM/min, e o ataque de Y sobre R+ ocorra
a 1.000 mM/min. Então, quando uma molécula de R+ é
formada, ela muito rapidamente torna�se o produto fi�
nal. Aumentar a etapa rápida não alterará a velocidade
de formação de produto porque ele não pode ser for�
mado mais rapidamente do que a velocidade da etapa
mais lenta. Isso significa que a velocidade de formação
de produto será descrita pela equação da velocidade
= –kdo
concentração
d[R–X]/dt componente
1[R–X]. Essa reação
Y. é independente da
Isto é, a reação é de
primeira ordem. Pode�se dizer que a reação é de ordem
zero com relação a [Y], significando que a reação é inde�
pendente da concentração de Y. (Lembre�se que [Y]0 =
1.)Aumentar a concentração de Y não terá efeito algum
sobre a velocidade da reação.
Na reação de Y atacando R–X, o termo da velocida�
de contém as concentrações de ambos os substratos.
da
Istoordem
é, d[R–Y]/dt
tradicional.
= –k�[R–Y][Y],
A uma reação de segun�
principal diferença entre as
duas vias de reação é que a etapa mais lenta em uma
envolve o estado de transição de R–X indo para R+ +
X–. Na outra, a etapa de transição envolve Y atacando
R–X (Figura 10.�5). Reiterando, a cinética conta algo
sobre as etapas mais lentas que ocorrem durante uma
reação. A etapa mais lenta que ocorre durante uma rea�
ção catalisada por enzima é chamada a etapa limitan�
te da velocidade.
A cinética de reações complexas ocorre no monito�
ramento do fluxo de compostos por uma via metabólica.
A velocidade da etapa mais lenta é a que governará a
velocidade de formação de produto.

O O

O P O P O− NH3+ O O
O−
CH3 O−
CH3 CH2 CH + NH3 CH3CH2CHCH3 + −OP O P O−

O− O−
(a) ionização +
O O CH3CH2CCH3
H
+
O P O P O− O O NH3
CH3 O− lenta NH3 +
O
O− O−
CH2 CHCH3 −O P O P O− rápida CH3 CH2 C CH3

O− O− H
v = k [substrato]
(b) deslocamento direto H

O CH3 CH2CCH3

O P O O
P− lenta NH3+
CH3 O−
CH3 +
CH2 CH O O

−O P O P O−
NH3
O− O−

v = k¢[substrato][NH3]

Reações de deslocamento nucleofílico. (a) Mecanismo de função da concentração de apenas um substrato, enquanto no
ionização. (b) Mecanismo de deslocamento direto. Note que, deslocamento direto a velocidade depende das concentrações
no mecanismo de ionização, a velocidade da reação é uma de ambos os substratos.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 413

a velocidade não mais aumenta com um aumento em d[P]/dt = k3[ES] (10.1�)

[S]. A razão é que a enzima e o substrato formam um
complexo, e a velocidade de formação de produto é pro�
porcional � concentração do complexo. Toda a enzima
estará no complexo em altas concentrações de substra�
to. A enzima será liberada do complexo por dissociação
reversível do substrato ou prosseguindo, para formar
produtos. A reação geral é escrita como
⇌2 ES 3−→
k1 K =K
E+S E+P
Para determinar a velocidade de formação de produ�
to, é necessário encontrar o valor de ES em função da
concentração de enzima e substrato. A Equação 10.1�
pode ser resolvida para a velocidade da reação (ver Um
Olhar Mais Atento 10.5 para derivação da equação). A
forma final é
k[E][S]
(10.13) v (10.15)
+ [S]

onde k é uma constante de velocidade e K é uma cons�

tante que inclui as constantes de velocidade individu�
Equilíbrio
ais relacionadas com a interação do substrato com a
S4 enzima.
vo
1– vt
L S3
l
o
m
o
t
Equação de Michaelis-Menten
u S2
d
o
r
,
P
A reação enzimática mais simples na qual um subs�
S1 trato vai para um produto é
⇌2 ES ⇌
k1 k3
E+S E+P (10.16)
k4
Tempo
Se a reação da Equação 10.16 for essencialmente
FIGURA 10.45 Curvas de progressão de uma reação
catalisada por enzima em diferentes concentrações de irreversível (k� = 0 ou [P] não estiver presente, o que
substrato e uma concentração constante de enzima. acontece assim que a enzima e S são misturados), a
A velocidade inicial (v0) da reação é determinada a partir da equação para a velocidade de formação de produto é
inclinação da curva de progressão no início da reação. A veloci�
dade inicial aumenta com o aumento na concentração de subs�
v= k3[E][S]
(k3
trato (S1�S�), mas atinge um valor limitante característico de +k2)/k1 +[S] (10.17)
cada enzima. A velocidade em qualquer tempo t é chamada v.
Combinando constantes no denominador em um
termo chamado Km e se a reação ES → E + P na Equa�
Velocidade
(Vmáx) máxima
e
o
ção 10.16 for a etapa limitante da velocidade, então k3
d t
l u
a
ic o
d define a atividade catalítica da enzima (kcat), e a equa�
i rp ção torna�se
n
i e
e d
d o
a ãç kcat[Et][S]
d
i a
c
o
v= (10.18)
l m
e ro (km + [S])
V f
Concentração do substrato
Note a semelhança das Equações 10.15 e 10.18. Como
FIGURA 10.46 Gráfico de velocidade versus concentração kcat (a constante de velocidade) e [Et] (concentração de
de substrato para uma reação catalisada por enzima. enzima total) são constantes, kcat[Et] = Vmáx. A equação
As velocidades iniciais são plotadas contra a concentração de pode ser escrita como
substrato na qual foram determinadas. A curva é uma hipérbo�
le retangular, que se aproxima assintoticamente da velocidade Vm[S]
v=(km + [S]) (10.19)
máxima possível com uma determinada quantidade de enzima.

Constantes de velocidade k serão numeradas de e é chamada equação de Michaelis-Menten. Para reações

modo que as que levam aos produtos terão números ím�
pares (k1, k3 e k5), enquanto as etapas reversíveis serão
pares (k�, k� e k6); algumas são constantes de primei�
ra ordem e outras de segunda ordem. As unidades das
constantes de primeira ordem e de segunda ordem são
diferentes e não podem ser somadas, mas podem ser
multiplicadas ou divididas.
A velocidade de formação de produto é o termo que
leva ao produto multiplicado pela constante de velocidade.
que são mais complicadas, kcat é composto por uma co�
leção de constantes de velocidade. Vm na Equação 10.19
é a velocidade máxima da reação em uma concentração
definida de enzima e tem a unidade de moles de produ�
to por unidade de tempo. Portanto, Vm (isto é, k3[Et] ou
kcat[Et]) é uma constante para uma concentração fixa
de enzima. Se a concentração de enzima for aumentada
ou diminuída, Vmáx aumentará ou diminuirá, respec�
tivamente (Figura 10.�7). Km é composto de constan�
tes de velocidade individuais; entretanto, da Equação
414 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

UM OLHAR MAIS ATENTO 10.5

Derivação da Equação de Michaelis–Menten

Para derivar a equação de Michaelis–Menten, é ne� [ES] = k1[Et][S]

cessário determinar a concentração de ES. A velocida� (k2 + k3) + k1[S]
da,
de dedado
formação de ESeé ES
por k�[ES], dada
indo
porpara
k1[Ef][S],
produtos,
onde k3[ES].
[Ef ] é a
concentração de enzima livre. O uso de ES é governado Como a velocidade de formação de produto (v) da
por duas reações: ES retornando ao material de parti� reação é k3[ES], multiplicando�se a reação anterior por
k3 temos
Combinando esses termos, temos uma equação que
descreve a mudança na concentração de ES. (k2k3k1[Et][S]
v=
. + k3) + k1[S]
d[ES]/dt = k1[Ef][S] – k�[ES] – k3[ES]
Para converter essa equação na equação de Michae�
Considerando que a concentração de ES é constan� lis�Menten, o numerador e o denominador são divididos
te, exceto para os primeiros poucos milisegundos após por k1
contado entre substrato e enzima, d[ES]/dt = 0. Isto é
chamado suposição de estado estacionário, signifi� v= k3[Et][S] Vm+
[S]
(k2 ou v =
cando a concentração de ES durante o período de tem� +k3)/k1+[S] Km [S]
po inicial da reação catalisada pela enzima (período
para medir a velocidade inicial). A validade da condição k3Et é a velocidade máxima da reação (Vm) com toda
de estado estacionário pode ser provada matematica� a enzima na forma ES, e portanto k3 é kcat. As cons�
mente. Substituindo�se [Ef] por [Et] – [ES], onde Et é tantes do denominador são definidas como Km. É claro
a concentração total de enzima e rearranjando, leva a que Kb não é uma simples constante de dissociação. Se
k3 for muito pequena comparada com k�, então a razão
k1([Et] – [ES])[S] = (k� + k3) [ES] resultante seria k�/k1, que é Kd, a constante de disso�
Resolvendo para [ES], obtemos ciação.

10.�8) quando Km = [S]. Quando v é igual a ½Vm, me�

tade da concentração de enzima total está em um com�
8E1 4E1 plexo com substrato e metade está livre. Diferentemen�
te, quando [S] >> Km, essencialmente 100% da enzima
está no complexo ES. Nessa condição, a reação alcança
o
d
a Vm, uma vez que a velocidade seria v = Vm. Geralmente,
8υ0
m
r
o 4υ0 considera�se que Vm é alcançada quando [S] é perto de
f 2E1
o
t
u
2υυ0 �0 [Km ], uma vez que nessas condições v = Vm × �0/�1,
d ou 0,95 Vm. A natureza bifásica do mecanismo enzimáti�
o
r
P
co, isto é, ligação seguida por modificação do substrato,
0 é reforçada na Correlação Clínica 10.3.
E1

Tempo
Vmáx
FIGURA 10.47 Curvas de progressão em concentrações
variáveis de enzima e concentrações de saturação de
substrato. Vmáx2
A velocidade inicial (v0) dobra quando a concentração de enzi�
ma dobra. Como as concentrações de substrato são as mesmas,
as concentrações finais de equilíbrio do produto serão idênti�
cas em todos os casos; entretanto, o equilíbrio será alcançado
em velocidade menor nos ensaios contendo pequenas quanti�
dades de enzima. Km [S]

FIGURA 10.48 Estimativa gráfica de Km a partir do gráfico

10.18, pode�se afirmar que Km é a concentração de subs de v0 versus [S].
trato quando a velocidade da reação (v) é a metade da Km é a concentração de substrato na qual a enzima tem metade
velocidade máxima (Vm), isto é, v = Vm = 0,5 (Figura da atividade máxima.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.3
Um Caso de Gota Demonstra Duas Fases no Mecanismo de Ação Enzimática
As duas fases do modelo de Michaelis�Menten para
ação enzimática, ligação seguida de modificação do
substrato, são ilustradas pelos estudos de uma família
com gota. O paciente excretava três vezes a quantidade
normal de ácido úrico por dia e tinha níveis muito au�
mentados de 5!�fosforribosil�α�pirofosfato (PRPP) em
seus eritrócitos. O PRPP é um intermediário da bios�
síntese de AMP e GMP, que são convertidos em ATP
e GTP. O ácido úrico é um produto de degradação de
AMP e GMP. Ensaios in vitro revelaram que a ativida�
de da PRPP sintetase nos eritrócitos do paciente estava
aumentada três vezes. O pH ótimo e o Km da enzima
para ATP e ribose 5�fosfato estavam normais, mas Vmáx
estava aumentada três vezes! Esse aumento não era
devido a um aumento na quantidade de enzima; testes
Se a reação for mais complexa, como
⇌k
1 ES 3−→K ES 5−→K E+P
E+S (10.�0)
k2
onde ES! representa uma forma modificada, mas inde�
pendente, do complexo, então a equação da velocidade
fica
k3k5/(k3 + k5)[Et][S]
v = k5 (10.�1)
(k2 +k3)/k1(k3 +k5) +[S]
Exame das Equações 10.17 e 10.�1 revela que a for�
ma generalizada da equação é
v = Constante[Et][S]
Constante + [S] (10.��)
Esta é a mesma equação geral da Equação 10.18. As
constantes de velocidade do numerador são agrupadas
para se tornarem o termo kcat, enquanto as constantes
do denominador são definidas como Km. Assim ambos,
kcat e Km, são tipicamente compostos por um conjun�
to complexo de constantes de velocidade individuais.
As constantes específicas que compõem os termos são
relacionadas com o mecanismo cinético real e a mag�
nitude das constantes de velocidade individuais. Por
exemplo, se o valor de k3 for muito maior do que k5 na
Equação 10.�1, kcat seria reduzida em k5 porque a soma
de k3 e k5 seria essencialmente o valor de k3. Se, entre�
tanto, as duas constantes de velocidade tiverem valores
semelhantes, então kcat seria composta de muitos ter�
mos, bem como Km cujas unidades são concentração.
Concentração de Enzima Livre
A derivação da equação de Michaelis�Menten re�
quer uma determinação cuidadosa de todas as formas
• 415
imunológicos com anticorpo específico para a enzima
revelaram quantidades semelhantes da proteína em
comparação com eritrócitos normais. Essa descoberta
demonstra que a ligação do substrato, refletida no Km, e
o evento químico subsequente da catálise, que é refle�
tido na Vmáx, são fases separadas do processo catalítico
geral. Essa situação aplica�se apenas aos mecanismos
enzimaticos em que k3>>k�.
Becker, M. A., Kostel, P. J., Meyer, L. J. e Seegmiller, J.
E. Human phosphoribosyl pyrophosphatase synthetase: In�
creased enzyme specific activity in a family with gout and
excessive purine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70:
�7�9, 1973.
da enzima. Supõe�se que a concentração de substrato é
maior do que a de enzima, de modo que durante o curso
inicial da reação que está sendo medida o valor de [S]
não varia. Obviamente, vários valores de [S] podem ser
usados, mas para todos permanecerá constante duran�
te a reação. Para a reação simples E + S  ES → E + P,
a concentração de enzima é sempre a soma da energia
livre e do substrato ligado � enzima; isto é,
[Et] = [Ef] + [ES] (10.�3)
[Et] é a concentração total de enzima e [Ef] é a concen�
tração de enzima livre. É Ef que é necessária em uma
reação para interagir com o substrato. A concentração
de enzima livre não é medida diretamente, mas a con�
centração de enzima total é conhecida. Isso significa
que
[Et] – [ES] = [Ef] (10.��)
Se existirem outras formas da enzima, como uma
forma com um inibidor (p. ��0), então a Equação 10.��
deveria ser expandida para incluir todas as formas da
enzima.
Significado do Km
Km consiste de várias constantes de velocidade e
não é uma constante de dissociação derivada (Kd). Seu
valor, entretanto, é usado frequentemente para indicar
quão bem um substrato interage com uma enzima. Um
Km
nidade
de 10–7
pelaMenzima
indica que
do que
o substrato for uma maior afi�
se o Kmtem
to menor o valor de Km 10–5 M. Quan�
, mais forte é a interação entre
substrato e enzima. Embora o Km não seja uma cons�
tante de dissociação, valores menores significam que é
necessário menos substrato para ligar 50% da enzima
(Correlação Clínica 10.�).
416 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Um exemplo da importância do Km é a utilização fi�
siológica de glicose. A glicose pode ser fosforilada por
duas quinases diferentes para formar glicose 6�fosfato.
O fígado contém ambas hexoquinase e glucoquinase,
que catalisam a reação idêntica de glicose + ATP → gli�
cose 6�fosfato + ADP. Para a hexoquinase, o Km para
glicose é 0,1 mM, enquanto para a glucoquinase é 5 mM.
Quando a concentração de glicose no sangue é baixa,
como ocorre no estado de jejum, a hexoquinase é usada
para fosforilar glicose, mas quando a glicose sanguínea
sobe após alimentação, a enzima de alto Km também
funciona.
Número de Turnover (kcat)
Na Equação 10.18, kcat no numerador tem unidades
de 1/tempo. Essa constante é também chamada núme
ro de turnover da enzima, isto é, o número de molécu�
las de substrato convertidos em produto por unidade de
tempo por molécula de enzima. Quanto maior o valor
de kcat para uma enzima, mais rápida será a reação. Em
geral, esse termo representa a(s) etapa(s) mais lenta(s)
da reação geral.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.4
Efeito Fisiológico de Mudanças nos Valores de Km de Enzimas
A sensibilidade incomum de alguns asiáticos a be�
bidas alcoólicas tem uma base bioquímica. Em alguns
japoneses e chineses, muito menos álcool é necessário
para produzir vasodilatação, resultando em rubor facial
e aceleração dos batimentos cardíacos, do que o ne�
cessário para causar o mesmo efeito em europeus. Os
efeitos fisiológicos devem�se ao acetaldeído gerado pela
álcool desidrogenase hepática. O acetaldeído é conver�
tido em acetato pela aldeído desidrogenase (ALDH).
Um aminoácido na posição �87 da subunidade de 500
aminoácidos da enzima tetramérica está trocado em al�
guns dos indivíduos afetados. A enzima ativa tem um
glutamato, enquanto a variante inativa tem uma lisina.
Descobriu�se que a variante asiática tem uma atividade
muito baixa, e o Km para NAD+ aumenta de 30 mM para
7.000 mM. Embora a enzima seja ativa, teria muito pou�
ca atividade no fígado porque o Km é muito alto e a kcat
é baixa.
Além disso, indivíduos afetados eram heterozigo�
tos, tendo genes para a enzima glutamato ativa e a
enzima lisina essencialmente inativa. Esperava�se que
sua enzima tivesse 50% de atividade, mas tinha ati�
vidade muito baixa. ALDH forma tetrâmeros com os
dois
e são formas (E�
K� monômeros homotetraméricas
, E3K, E�K�, EK3das
e K�), onde E�
subunidades
Significado de kcat na Equação de
Michaelis–Menten
Quando a Concentração de Substrato É
Muito Maior do que o Km
A Equação 10.18 está na forma de uma equação hiper�
bólica geral. Quando o valor de [S] é muito maior do que o
valor de Km, o valor do denominador é essencialmente o
valor de [S], e a equação pode ser aproximada por
kcat[E][S]
v= [S] = kcat [E] (10.�5)
Isto é, a velocidade torna�se independente da concen�
tração de S; a reação torna�se de ordem zero com relação
a S. Isso é encontrado na parte da curva onde a veloci�
dade essencialmente se nivela, e não aumenta quando a
concentração de [S] aumenta (inclinação = 0) (ver Figu�
ra 10.�6). A reação está acontecendo em sua velocidade
máxima nessas condições porque essencialmente 100%
da enzima está no complexo ES. No instante em que uma
molécula de produto é feita, ela deixa a enzima, e ou�
tra molécula de S liga�se � enzima, mantendo sempre a
enzima saturada com S. Nessas condições, a velocidade
é governada estritamente pelos termos que governam a
reação de ES indo para produto (ES → E + P).
contendo glutamato e lisina, respectivamente, e as ou�
tras são heterotetrâmeros. E3K tinha 50% da atividade
total, não 75%, enquanto EK3 praticamente não tinha
atividade, e não os �5% que se poderia esperar com
uma subunidade ativa. A subunidade K era dominante
porque podia inativar a subunidade � qual estava pa�
reada, uma vez que o resíduo da posição �87 interage
com uma arginina da posição �75. Quando um gluta�
mato estava na posição �87, uma ligação salina estável
se formava, mas quando uma lisina estava na posição
�87, levava a arginina a se mover. O movimento rom�
pia o bolsão de ligação a NAD, embora o resíduo �87
não estivesse em contato com a dobra de Rossmann.
Esse exemplo ilustra o fato de uma mutação puntual
em uma enzima poder afetar o sítio ativo, mesmo que o
resíduo não esteja em contato direto com essa região.
Também mostra como uma subunidade pode ser do�
minante sobre outra.
Crabb, D. W., Edenberg, H. J., Bosron, W. F. e Li, T.�K. Ge�Ge�
notypes for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol
sensitivity: The ALDH�� allele is dominant. J. Clin. Invest.
83:31�, 1989; e Zhou, J. e Weiner, H. Basis for half�of�the� site
reactivity and the dominance of the K�87 oriental subunit
over the E�87 subunit in heterotetrameric human liver mito�
chondrial aldehyde dehydrogenase. Biochemistry 39:1�019,
�000.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 417

Quando a Concentração de Substrato É os mesmos em ambas as direções). Pode ser derivado

Muito Menor do que Km que kf é (kcat/Km)f e kr é (kcat/Km)r. Para uma reação re�
versível, a constante de equilíbrio Keq = ([P]/[S]) é kf/kr
Quando a [S] é muito baixa comparada com Km, a ou
Equação 10.17 pode ser aproximada como
(kcat/Km)f
keq = (kcat (10.�8)
kcat[Et][S] Vmáx[S] /Km)r
= deKm
vvalor Km ou v = Km (10.�6)
Os valores de kcat e Km não podem mudar aleatoria�
Um gráfico de v versus [S] é linear quando [S] << mente uma vez que sua razão deve ser igual � Keq. Isso
. Como para qualquer reação química, a ve� implica em que, se um mutante de uma enzima tiver um
locidade de formação de produto é uma constante de valor de kcat maior do que o da enzima original, alguma
velocidade multiplicada pela concentração dos reagen� outra constante deve mudar para satisfazer a situação
tes, o termo kcat/Km pode ser considerado como uma de equilíbrio. Essas relações tipo�equilíbrio são chama�
constante de velocidade de segunda ordem, uma vez das relações de Haldane.
que existem dois termos de concentração na equação
de velocidade ([Et] e [S]). O fato de essa razão ser equi�
valente a uma constante de velocidade de segunda or� Km Baixo versus kcat Alta
dem impõe certas restrições � razão. Por exemplo, uma
constante de velocidade não pode ser mais rápida do Como a razão de kcat/Km tem um limite superior, a
que a velocidade em que duas moléculas se difundem questão pode surgir se seria preferível para uma enzi�
ma ter um Km muito baixo ou um kcat muito alto. Fre�
em solução. Mesmo se nenhuma energia de ativação
fornecessária, as duas moléculas precisam colidir uma quentemente considera�se que um Km baixo é mais
com a outra para que uma reação ocorra. A constante desejável, e compostos com os Km mais baixos são os
de velocidade para uma reação de difusão de segunda melhores substratos. Na realidade, o composto com o
ordem fica em torno de 109/mol/seg. Portanto, se kcat maior kcat/Km é o melhor substrato. Em kcat/Km cons�
for muito grande, Km não pode ser muito pequeno ou a tante, é melhor ter um alto kcat do que um baixo Km. Um
razão excederia a velocidade de difusão. Como exemplo, exemplo é apresentado na Tabela 10.�. Em uma concen�
a catalase, uma enzima que converte peróxido de hidro� tração fixa de substrato, 1 mM no exemplo, a velocida�
de geral é sempre maior quando Km é alto porque isso
gênio em oxigênio e água, tem uma kcat de � × 107/seg. O
Km
para o peróxido de hidrogênio, entretanto, é 1 molar, força kcat a ser maior para satisfazer a razão kcat/Km.
um
fatorvalor
de �5muito
(109 versus
alto. A �razão
× 107) da/Kvelocidade
kcat por um
m é menor máxima
Portanto, quando se avalia diferentes substratos para
uma enzima, o substrato com o maior valor de kcat/Km
teórica que reações de segunda ordem podem alcançar. seria considerado o melhor substrato para a enzima,
não aquele com o menor Km.
A catalase é uma das enzimas mais rápidas que se co�
nhece quando o termo kcat/Km é medido. Em uma célula, não é apenas os termos kcat e Km
que são importantes, mas deve�se levar em conta a
O kcat pode ser um número muito baixo (como 1
a(como
10/seg)
porsó se o Km1 para o substrato for muito baixo
exemplo, concentração total da enzima. O termo velocidade é
de primeira ordem com relação � enzima, de modo que
× 10–9 M). Essa baixa velocidade
alguns poucos picomoles de uma enzima com kcat /Km
significa que uma molécula de enzima produziria ape�
nas 1 a 10 moléculas de produto por segundo. A reação de 107/seg/M na célula seria menos eficiente na conver�
é tão lenta porque o substrato liga�se muito fortemen� são de um substrato a produto do que um nanomol de
uma enzima com kcat/Km de 105/seg/M.
te � enzima. É necessária uma grande quantidade de
energia para converter o substrato ligado ao estado de
transição. Um Km extremamente pequeno (alta afinida� TABELA 10.4 Relações entre Km e kcata
de) para o substrato requer que a reação química seja
Km (M) kcat (s–1) Velocidade (s–1)
lenta, enquanto um Km alto (baixa afinidade) significa
mas aficam
que na faixa
kcat pode de 10Os
ser alta. a 107/seg.
valores de kcat/Km para enzi� 10–6 1 1
10–5 10 9
Reações Reversíveis 10–� 10� 90

Outra limitação para a razão kcat/Km ocorre quando

a reação é reversível.
10–�
10–3
10–1 105
10�
103 500
909
E+S⇌kkfr E+P (10.�7)
990
1 106 999
kf e kr são as constantes de velocidade para frente e
para trás (os termos ES e EP são ignorados porque são aCondições da reação: kcat/Km = 106M�1s�1 e [S] = 103M.
418 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Calculando as Constantes Efeito das Condições de Ensaio

O Km pode ser aproximado de gráficos de v versus Quando se realiza uma reação nas condições de Vm,
[S]. Apresentações gráficas permitem o cálculo das essencialmente 100% da enzima está no complexo ES.
constantes cinéticas. A apresentação gráfica mais co� Diferentemente, quando uma reação é estudada na qual
mum é baseada na equação de Lineweaver-Burk, que é [S] << Km, o efeito que está sendo medido reflete o que
o recíproco da equação de Michaelis�Menten. O recípro� está ocorrendo com a enzima livre e ligada ao substrato.
co da Equação 10.19 é Assim, para estudar o efeito de uma mudança ambien�
tal, como pH, o ensaio geralmente é conduzido em con�
1 1 Km 1
+ Vm × [S] (10.�9) dições de Vmáx. O efeito das condições experimentais
v =Vm em condições de Vmáx dá informação sobre o termo kcat
porque toda a enzima está ligada ao substrato. Para
Um gráfico de 1/v0 versus 1/[S] é uma linha reta (Fi� avaliar o efeito do pH sobre a enzima livre, então
gura 10.50); o intercepto do eixo y é 1/Vm, o intercepto
kcat/Km em função do pH seria determinada.
no eixo x é –1/[S], que é equivalente a –1/Km; a inclina�
ção da linha é km/Vm. Assim, a partir do gráfico de 1/v0 Condições externas, como pH, temperatura e con�
em diferentes concentrações de 1/[S], dois parâmetros centração salina, afetam atividade enzimática. Esses
chaves da reação catalisada por enzima podem ser de� efeitos são muito importantes quando ensaios enzimá�
terminados. Alternativamente, programas de computa� ticos são realizados in vitro.
dor podem calcular kcat e Km a partir de dados de velo�
cidade e substrato. Temperatura
Um gráfico de velocidade versus temperatura para a
maioria das enzimas de mamíferos é uma curva em for�
ma de sino, com um ótimo entre �0 °C e �5 °C (Figura
1/v0
10.50). Acima dessa temperatura, ocorre a desnatura�
ção térmica da enzima; algumas enzimas desnaturam
em temperaturas mais baixas. Geralmente, entre 0 °C
1/[S]
1/vo VKm e �0 °C, as enzimas mostram um aumento de duas na
Inclinação = =
máx atividade para cada elevação de 10 °C. A mutação em
1/Vmáx uma enzima para uma forma termolábil pode ter graves
–1/Km
consequências (Correlação Clínica 10.5).
1/[S]

FIGURA 10.49 Determinação de Km e Vmáx a partir do

gráfico de duplo-recíproco de Lineweaver-Burk. o
t
u
Gráficos do recíproco da velocidade inicial versus o recíproco d
o
r
da concentração de substrato usados para determinar a velo� p
o
cidade inicial dão uma linha cujo intercepto x é –1/Km porque d
o
ã
em 1/v0 = 0, 1/[S] = 1/Km na Equação 10.�9. ç
a
m
r
o
f
a
Substrato e Produto Ligam-se ao Mesmo d
e
d
Sítio a
d
i
c
o
l
e
A presença de produto atuará como um inibidor da V
reação, uma vez que sua presença é capaz de impedir a
0 10 30 50 70
ligação do substrato. Será um inibidor competitivo, uma
Temperatura (C)
vez que S e P ligam�se a Ef. A equação relacionando a
velocidade inicial da reação em presença de produto é FIGURA 10.50 Dependência da temperatura de uma
Vm[S] típica enzima de mamíferos.
v= À esquerda da ótima, a velocidade é baixa porque a tempera�
Km(1+[P]/Kmp) +[S] (10.30) tura ambiental é muito baixa para fornecer suficiente energia
cinética para superar a energia de ativação. À direita da ótima,
onde Kmp é o Km para produto, considerando�se que a a enzima é inativada por desnaturação térmica.
reação poderia ser reversível. O produto inicialmente
não está presente quando se realiza um ensaio in vitro, pH
mas começa a se acumular com o tempo. Um gráfico de
formação de produto em função do tempo será inicial� Quase todas as enzimas mostram um perfil pH�ve�
mente linear, mas a inclinação diminuirá com o tempo, locidade em forma de sino, mas o máximo (pH ótimo)
� medida que o produto se acumula e age como inibidor varia muito entre diferentes enzimas. Fosfatases alcali�
(ver Figura 10.��). na e ácida, com pHs ótimos muito diferentes, são ambas
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 419

encontradas no homem (Figura 10.51). A curva em for�

ma de sino e sua posição no eixo x são dependentes do CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.5
estado ionizado específico do substrato que será mais Labilidade Térmica da Glicose-6-Fosfato Desidro
bem ligado � enzima. Isso, por sua vez, está relacionado genase Resulta em Anemia Hemolítica
com a ionização de resíduos de aminoácidos específi�
cos que constituem o sítio de ligação do substrato. Além Em eritrócitos, a glicose 6�fosfato desidrogenase
disso, resíduos de aminoácidos envolvidos na catálise (G6PD) é uma enzima importante para manutenção
da reação, para serem funcionais, devem estar no es� da integridade da membrana. Uma deficiência ou
tado carregado correto. A Correlação Clínica 10.6 des� inatividade dessa enzima leva a uma anemia hemo�
creve o efeito de uma mutação levando a uma mudança lítica. Em outros casos, uma enzima variante ,que
no pH ótimo de uma enzima de importância fisiológica. normalmente tem atividade suficiente para manter a
membrana, está presente, mas falha em condições de
estresse oxidativo. Uma mutação nessa enzima leva a
uma proteína com constantes cinéticas normais, mas
o
t
a
fs com estabilidade térmica diminuída. Essa condição é
o
f
o especialmente crítica para o eritrócito, uma vez que
d
o
ã
é desprovido de capacidade de sintetizar proteínas, e
ç
a não pode renovar enzimas quando se desnaturam. O
m
r
o
f resultado final é um tempo de vida muito diminuído
a (a) (b)
d para esses eritrócitos que têm G6PD instável. Esses
e
d eritrócitos também são suscetíveis a hemólise indu�
a
d
i
c zida por drogas.
o
l
e
V
2 4 6 8 10 12 Luzzato, L. e Mehta, A. Glucose�6�phosphate dehydro�
pH da mistura de ensaio genase deficiency. Em: Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W.
S. e Valle, D. (Eds.), The Metabolic and Molecular Bases
FIGURA 10.51 Dependência do pH de reações de of Inherited Disease, 7. ed. New York: McGraw�Hill, 1995,
fosfatase p. 3369.
(a) ácida e (b) alcalina. Em ambos os casos, o ótimo representa
o estado iônico ideal para ligação de enzima e substrato e o
estado iônico correto para as cadeias laterais dos aminoácidos
envolvidos no evento catalítico. E+A EA
EA + B
EAB
EPQ
EP EAB
EPQ
EP
E + +PQ A B Q P

10.8 CINÉTICA DE REAÇÕES E EA EAB EPQ EP E

COM DOIS SUBSTRATOS Enzima

(a) Mecanismo sequencial

Mecanismo Sequencial
Há dois mecanismos de interações para uma reação E+A EA A P B Q
EA
de dois substratos, como ilustrado na Figura 10.5�. No E +B EB
+P E EA E′ EB E
mecanismo sequencial, ambos os substratos ligam�se �
enzima de forma sequencial para formar um complexo
EB E+Q
ternário. Com os substratos A e B, o complexo ternário
seria E�A�B (A, B, C... são substratos e P, Q, R... são pro� (b) Mecanismo pingue-pongue
dutos). Se o substrato A se ligar antes de B, isso é cha�
mado uma reação sequencial ordenada, enquanto se A FIGURA 10.52 Mecanismos de interação para reações de
dois substratos.
ou B puderem se ligar primeiro, a reação é chamada
uma reação sequencial aleatória. A equação para uma (a) Mecanismo sequencial. (b) Mecanismo pingue�pongue.

reação sequencial contém termos de Km para ambos os

substratos A e B (Ka e Kb) e um termo Kia, a constante
de dissociação do substrato A. Para encontrar as várias
constantes, um gráfico duplo recíproco de 1/v versus
1/[A] é feito para a reação com diferentes concentrações
fixas do substrato B (Figura 10.53). O gráfico resultan�
te mostra uma série de linhas que se interceptam
mutuamente. As constantes individuais podem ser en�
contradas fazendo�se um gráfico das inclinações e in�
terceptos em função de [B].
Mecanismo Pingue-Pongue
O segundo mecanismo para uma reação de dois
substratos é chamado mecanismo pingue-pongue. O
substrato A liga�se � enzima e é convertido no produto
P, deixando a enzima modificada. A enzima modificada
liga substrato B, que é então convertido no produto Q.
Enzimas que apresentam cinética pingue�pongue são
modificadas pelo substrato. Quinases que seguem um
420 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.6

Isoenzimas da Álcool Desidrogenase com Diferentes pHs Ótimos

Além da mudança de composição de isoenzimas da
aldeído desidrogenase em alguns asiáticos, diferentes
isoenzimas da álcool desidrogenase (ADH) são também
observadas. A ADH é codificada por três genes, que pro�
duzem três polipeptídeos diferentes, α, b e g. Três alelos
são encontrados para o gene b, que diferem em uma úni�
ca base nucleotídica; isso causa substituição por argini�
na. As substituições são apresentadas a seguir:
Resíduo 47 Resíduo 369
b1 Arg
b� His
b3 Arg
A forma b3 de fígado tem atividade de ADH com um
pH ótimo próximo de 7, comparado com 10 para b1,
e 8,5 para b�. A etapa determinante da velocidade
da álcool desidrogenase é a liberação do NADH. O
NADH é mantido na enzima por ligações iônicas en�
tre os fosfatos da coenzima e as argininas das posi�
ções �7 e 369. Na isozima b1, essa interação iônica
não é quebrada até que o pH seja bastante alcalino, e
o grupo guanidina da arginina comece a dissociar o
H+. A substituição de aminoácidos com valores de pK
mais baixos, como na b� e b3, enfraquece a interação
e abaixa o pH ótimo. Como a liberação de NADH é
mais altos os
facilitada, que para
dovalores deb1Vmáx para b� e b3 são também
Arg .
Arg
Burnell, J. C., Carr, L. G., Dwulet, F. E., Edenberg, H. J.,
Cys Li, T. K. e Bosron, W. F. The human b3 alcohol dehydroge�
nase subunit differs from b1 by a Cys� for Arg�369 substitution
which decreased NAD(H) binding. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1�6: 1��7, 1987.

Ka 1 + Kia Kb 1 + [B]
Kb
tas enzimas que usam coenzimas que não se dissociam
1 1
υ = V Ka [B] 1
A
+
Vmáx empregam reações pingue�pongue.
máx

A equação relacionando a velocidade com as con�

centrações de A e B no mecanismo pingue�pongue é
aumentando
semelhante � equação para a reação sequencial, mas o
Inclinação = [B] mais significativo é que não tem o termo Kia encontra�
do na reação sequencial. Gráficos duplos�recíprocos
para essa reação resultam em uma série de linhas pa�
ralelas (Figura 10.5�). Novamente, os valores indivi�
duais de Km e Vm podem ser obtidos das inclinações
e interceptos, após plotar os valores obtidos em cada
concentração de B.
Ka Kia Kb
1+
Vmáx Ka [B]

−
1 Kmapp
Kia Kb
[B]
Intercepto = 1+
1
Vmáx Frequentemente se deseja saber o Km para apenas
um dos substratos. Fazendo�se a reação em presença de
1
1
1−
Ka [A] concentrações muito altas do substrato A e variando�se
V1 Kia a concentração de B é possível determinar uma Kmapp
para o substrato B. Isso é possível porque, quando [A]
FIGURA 10.53 Gráfico duplo-recíproco de velocidade >> Ka, a equação da velocidade se reduz a uma equação
inicial para uma reação sequencial.
de Michaelis�Menten simples.
O substrato B é fixado em concentrações especificadas, e o
substrato A varia. A equação da velocidade é
(
Ka KiaKbK
aB A
1 + Vmáx
1 ( KbB
v1 = Vmáx 1+ )
1+ ) 10.9 INIBIDORES
Muito do nosso conhecimento básico das vias meta�
bólicas foi obtido pelo uso de inibidores de enzimas es�
mecanismo pingue�pongue, o fazem ligando ATP ou ou� pecíficas. Compostos farmacêuticos são hoje projetados
tro nucleotídeo trifosfato primeiro e, depois, fosforilan� como inibidores de enzimas específicas, e muitos com�
do a enzima. O ADP se dissocia, e o segundo substrato postos de ocorrência natural são inibidores (Correlação
liga�se � enzima fosforilada, seguindo�se a transferên� Clínica 10.7). Compostos inibitórios podem se ligar �
cia do fosfato para produzir o aceptor fosforilado. Mui� enzima livre ou ao complexo ES e afetar a velocidade da
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 421

CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.7

Inibidores de Xantina Oxidase

Isolados de Plantas

Gota é uma doença inflamatória cau�

1
sada pela superprodução ou menor se�
aumentando creção de ácido úrico, o produto final do
[B]
catabolismo de purinas (p. 8�5). A última
etapa do metabolismo de purinas é catali�
sada pela xantina oxidase. Um tratamen�
to comum para gota é o uso de alopurinol,
Ka [B]
Kb
Inclinação = 1+ um análogo estrutural da xantina e um
Vmáx
inibidor da enzima. Muitas sociedades
mais antigas usavam plantas medicinais
Kb
Intercepto = Vmáx
1 1 + [B] e mantiveram registros de quais são efe�
tivas. Registros da medicina tradicional
1 vietnamita indicam que 96 plantas, in�
[A]
cluindo Chrysanthemum sinense, foram
FIGURA 10.54 Gráfico duplo-recíproco de velocidade inicial para uma usadas para tratar gota. Descobriu�se que
reação pingue-pongue. alguns poucos extratos dessas plantas
O substrato B é fixado nas concentrações especificadas, e o substrato A varia. inibem a xantina oxidase de mamíferos,
v
1
A equação da velocidade é alguns quase tão efetivas quanto alopu�
( )
Vmáx
Ka ( Kb
B Vmáx
1 1 + Kb rinol. Suas estruturas são bastante dife�
= 1+ )+
B rentes do alopurinol e da xantina. Esses
resultados indicam que o estudo de com�
postos da medicina tradicional pode levar
reação. Com um inibidor, EI e/ou ESI (onde I é um ini�
a novos produtos farmacêuticos.
bidor) podem existir. Uma equação relacionando a con�
centração todal de enzima com todos os seus possíveis Nguyen, M. T. T., Awale, S., Tezuka, Y.,
complexos resulta em uma nova equação de Michaelis– Tran, Q. L., et al. Xanthine oxidase inhibitory
Menten contendo o termo 1 + [I]/Ki, onde Ki é a cons� activity of Vietnamese medicinal plants. Biol.
tante de dissociação de EI ou ESI. kcat em presença de Pharm. Bull. �7:1�1�, �00�.
inibidor é um kcat aparente (kcatapp), e o Km será um Km
aparente (Kmapp); isto é, um valor será medido, mas será
diferente do valor que seria encontrado em ausência de
inibidor. A concentração de inibidor não muda durante
o curso da reação, de modo que [I] é uma constante. Vá� COO–
rias classes de inibidores são definidos com base nessas CH2 COO–
cinéticas de reação. CH2 CH2

COO– COO–
Succinato Malonato
Inibição Competitiva
FIGURA 10.55 Substrato e inibidor da succinato
Inibição competitiva ocorre quando um inibidor desidrogenase.
compete com o substrato pela ligação com a enzima li�
vre. Alguns inibidores competitivos são estruturalmen�
ES será uma função de [S], [I], Km e Ki (k5/k6). Como Et
te semelhantes ao substrato ou ao produto, enquanto
= Ef + ES + EI, a Equação 10.31 é obtida.
outros são estruturalmente bem diferentes. Por exem�
plo, o malonato é um inibidor competitivo da succinato k3k1[Et][S]
desidrogenase (Figura 10.55 e p. 573), ligando�se pre� v=
(k2 +k3)(1+[I]/Ki) +k1[S] (10.31)
sumivelmente ao sítio de ligação de substrato. O pirazol
é um inibidor competitivo da álcool desidrogenase, mas Dividindo todos os termos por k1, dá a Equação
sua estrutura é bastante diferente do substrato. Se um 10.3�, uma vez que (k� + k3)/k1 é Km em ausência de I.
inibidor se ligar ao sítio ativo ou a um sítio diferente e
impedir que S se ligue, a reação seria como a da Figura k3[E][S]
v = Km(1+[I]/[Ki]) +k1[S] (10.3�)
10.56. O inibidor compete com o substrato pela ligação
com a enzima, de modo que, quando existe uma con�
centração muito alta de substrato, a ação do inibidor Note a semelhança entre as Equações 10.3� e 10.16.
será sobrepujada. A quantidade de enzima no complexo Várias constantes são encontradas no denominador,
422 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

e podem ser agrupadas para serem chamadas Kmapp. alto, de modo que o inibidor possa funcionar mesmo em
Como [I] é constante, o termo 1 + [I]/Ki é uma constan� presença de concentrações até altas do substrato. Bai�
te. O Km medido em presença de inibidor será um Kmapp, xos valores de Ki (ligação forte) são desejáveis de modo
mas é o verdadeiro Km vezes (1 + [I]/Ki). A presença do que grandes quantidades de inibidor não precisam ser
inibidor fará a reação ficar mais lenta em concentrações necessárias para inibir a enzima.
mais baixas de substrato porque as constantes do deno� k1 k3
E+S ES E+P
minador são maiores do que se o inibidor não estivesse k2
+
presente. Só quando [S] é muito maior do que Kmapp,
I
Vmax seria obtida quando o denominador fosse apenas
[S]. Nessas condições, virtualmente nenhum inibidor k5 k6
estaria ligado � enzima (Correlação Clínica 10.8). Am�
bos o substrato e o inibidor competem pela ligação, de EI
modo que aumento na concentração de substrato su�
perará a ação do inibidor. Terapeuticamente, inibidores FIGURA 10.56 Reação de um inibidor competitivo
competitivos são úteis apenas se o valor de [I]/Ki for reagindo com a enzima livre.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.8

Planejamento de um Inibidor Seletivo

As prostaglandinas compõem uma classe muito im� ser inibidores competitivos. Com a COX��, mas não com
portante de hormônios parácrinos derivados de ácidos a COX�1, entretanto, ocorreu uma inibição irreversível
graxos insaturados de cadeia longa (p. 756). Uma das tempo�dependente, que não envolve ligação covalente.
primeiras etapas de sua síntese envolve uma enzima, ci� O VIOXXÒ entrou no mercado em �000 e fez enorme di�
cloxigenase (COX). Entre os muitos efeitos fisiológicos ferença na qualidade de vida de pacientes com artrite.
das prostaglandinas estão a dor e a inflamação associa� Infelizmente, surgiram em alguns pacientes efeitos co�
das com artrite. Tradicionalmente, a artrite tem sido laterais significativos, envolvendo o coração, e a droga
tratada com aspirina e outras drogas anti�inflamatórias foi retirada do mercado.
não�esteroídicas, que se demonstrou funcionarem por
inibição da cicloxigenase, diminuindo assim os níveis
das prostaglandinas “más”, que causam os sintomas. Um
problema sério com essas drogas é o desenvolvimento de
sangramento e perfuração gastrointestinais, causados
por uma diminuição concomitante das prostaglandinas
“boas”, que protegem a mucosa gastrointestinal.

Há duas cicloxigenases diferentes, COX�1 e COX��,

que têm diferentes distribuições teciduais. A enzima
COX�� é induzida por mediadores da condição artrítica, Ser 530 Tyr 385 Val 523
enquanto COX�1 sintetiza constitutivamente as prosta�
glandinas que protegem a mucosa. A única diferença sig�
nificativa nos sítios ativos das duas enzimas é que a COX�
� tem uma valina em lugar de uma leucina no resíduo
5�3. A valina, menor, permite ligação preferencial de ini�
bidores projetados “sob medida”, resultando em inibição
seletiva da COX��. Tal droga projetada “sob medida”, o Arg 120
VIOXXÒé apresentada em modelo do sítio ativo de COX�1.

As cadeias laterais dos aminoácidos chaves que for�

mam o bolsão de ligação do substrato são apresenta�
das em vermelho, e o heme, que participa da síntese de
prostaglandinas, é apresentado em azul. Demonstrou�
�se que aspirina acetila a serina 530 tanto na COX�1
como na ��, enquanto o VIOXXÒ liga�se seletivamente e
inibe COX��, preservando assim a produção das prosta�
glandinas “boas” pela COX�1. O grupo fenil da aspirina
ocupa localização idêntica no sítio ativo do grupo fenil
do VIOXXÒ. Inicialmente, drogas tipo VIOXXÒ pareciam
Leu 357
Gierse, J. K., McDonald, J. J., Hauser, S. D., Rangwala, S.
H., Koboldt, C. M. e Seibert, K. A. A single amino acid dif�
ference between ciclooxugenase�1 (COX�1) and �� (COX��)
reverses the selectivity of COX�� specific inhibitors. J. Biol.
Chem. �71:15810, 1996.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 423

Inibição Acompetitiva Gráficos de Lineweaver–Burk em

Um inibidor pode se ligar ao complexo ES, em lugar
da enzima livre, como indicado na Figura 10.57. Não se
liga ao sítio de ligação de substrato, mas a um sítio de
ligação alternativo que não impede a ligação do subs�
trato. A equação de Michaelis�Menten será
v= Vmáx[S]/(1 + [I]/Ki)
(Km +[S])/(1+[I]/Ki) (10.33)
kcat agora está diminuído, de modo que a Vmáx estará
diminuída em comparação com o valor em ausência de
inibidor, e o termo Kmapp também está modificado. Essa
situação é chamada inibição acompetitiva. Diferente�
mente da inibição competitiva, o aumento da concentra�
ção de substrato não superará o efeito do inibidor porque
[I] está ligado ao complexo ES, e não � enzima livre.
Presença de Inibidores
Inibidores Competitivos e Não
competitivos
A equação de Michaelis–Menten para uma reação en�
zimática realizada em presença de três tipos diferentes
de inibidores reversíveis leva a diferentes gráficos duplos�
�recíprocos (Figura 10.59). A razão é que o termo 1 + [I]/
Ki é encontrado em associação com o termo Km ou kcat,
dependendo de que tipo de inibidor está sendo usado. No
caso de um inibidor competitivo (Figura 10.59a), Vmáx
Aumentando [I]

k1 ES k3 1v
E+S E+P
k2 +
I

1
k5k6 [S]

ESI (a) Inibidor competitivo

FIGURA 10.57 Reação de um inibidor acompetitivo com o

complexo enzima–substrato.
Aumentando [I]
1
v
Inibição Não-competitiva
Uma situação mais complicada ocorre se um inibi�
dor reversível se ligar tanto � enzima livre quanto ao
complexo ES. Uma variedade de situações pode ocor� 1
[S]
rer, dependendo de como a presença de I afeta a ligação
(b) Inibidor não-competitivo
de substrato e a capacidade da enzima catalisar a rea�
ção (Figura 10.58).
Aumentando [I]
k3 +
E+S E-S PE
+I +I 1
v
E-I E-S-I k′3 E + P

FIGURA 10.58 Reação de um inibidor não-competitivo

com uma enzima. 1
[S]

A equação de Michaelis–Menten é muito complexa, (c) Inibidor não-competitivo

uma vez que tanto ES como ES�I podem dar produtos.
Se I se ligar com a mesma afinidade a E e ES e k!3 for
zero, então a seguinte equação pode ser derivada:
Vmáx[S]/(1
(Km + [I]/Ki)
v= (10.3�)
+ [S]
Esse modo de ligação leva a uma inibição da ativi�
dade mesmo em presença de concentrações elevadas
de [S]. Se k!3 não for zero, então uma situação diferente
surge, uma vez que o complexo ES�I produzirá produto.
FIGURA 10.59 Gráficos duplos-recíprocos de inibição
competitiva, acompetitiva e não-competitiva.
Um inibidor competitivo liga�se no sítio de ligação do substrato
e efetivamente aumenta o Km para o substrato. Um inibidor
acompetitivo causa um deslocamento equivalente em ambos
Vmax e Km, resultando em uma linha paralela � obtida para enzi�
ma não�inibida. Um inibidor não�competitivo reversível liga�se
com ambos E e ES, presumivelmente em um sítio diferente
do sítio de ligação do substrato; portanto, o Km efetivo não
muda, mas a Vmax aparente diminui. As linhas vermelhas são
em ausência do inibidor.
424 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

não muda em altas concentrações de substrato, de modo COO− H

que as linhas de velocidade em ausência ou presença de COO−
N N N
diferentes concentrações de inibidor interceptam�se no H H H Base
H H COO−
eixo y. Com a inibição acompetitiva, � medida que a con�
centração de inibidor muda, uma série de linhas parale� L- prolina Estadoplanar
de transição D-prolina
las se formam, uma vez que a inclinação da linha é V/K,
e ambos os termos V e K contêm o termo (1 + [I]/Ki) (Fi�
gura 10.59b). Com a inibição não�competitiva, o inibidor
(a) Reação da prolina racemase
liga�se a ambos E e ES e o gráfico de Lineweaver–Burk é
uma família de linhas que se interceptam no eixo x.
Os gráficos duplos�recíprocos podem ser usados COO−
para determinar o modo de ligação do inibidor. A partir N

dos interceptos nos eixos x e y, Vmapp e Kmapp podem ser

calculados. Se o Km para um substrato for conhecido,
então o Ki para os inibidores pode ser calculado.
Inibidores não�competitivos reduzem efetivamente
a concentração de enzima livre e, assim, a velocidade
diminui (Figura 10.59c). Mesmo se o substrato for satu�
rante ([S] >> Km), a velocidade máxima observada seria
menor do que seria em ausência do inibidor. Compostos
que são inibidores desses tipos são mais úteis como dro�
gas, uma vez que inibem a enzima independentemente
da concentração de substrato.
Inibidores de Reações de Dois Substratos
Um inibidor competitivo de uma reação de dois subs�
tratos geralmente inibe só um dos dois substratos. Se o
composto só se ligar � enzima livre, será competitivo
contra o substrato A. Se o inibidor se ligar ao comple�
xo E�A, então será competitivo contra o substrato B. O
valor de Ki para inibidores de reações de dois substra�
tos pode ser determinado variando�se a concentração
de um substrato, em presença de um excesso do outro
substrato. As reações para inibidores não�competitivos
seriam as mesmas de um único substrato.
Outros Inibidores
(b) Pyirrol-2-carboxilato é planar como no estado de transição.
FIGURA 10.60 Pirrol 2-carboxilato mimetiza o estado de
transição planar e é um excelente inibidor da prolina
racemase.
Mecanismo Baseado em Inibidores
Suicidas
Enzimas executam reações complexas, nas quais
muitos intermediários transitórios ocorrem enquanto o
substrato é transformado no produto. Compostos foram
sintetizados nos quais a enzima executa uma etapa ini�
cial da reação, mas depois converte o substrato em uma
forma que permanece covalentemente ligada � enzima.
A atividade da enzima será destruída e daí o nome ini�
bidor suicida.
Inibidores Irreversíveis
Compostos que modificam quimicamente e inativam
uma enzima são classificados como inibidores irrever
síveis. Estes reagem com resíduos de aminoácidos (Fi�
guras 10.61 e 10.6�). Aspirina e Antabuse, uma droga
usada para evitar consumo abusivo de álcool, são exem�
plos de inibidores enzimáticos irreversíveis usados cli�
nicamente (Correlação Clínica 10.9 e 10.10).

Inibidores do Estado de Transição

Inibidores de Enzimas como Drogas
Enzimas diminuem a energia de ativação por estabi�
lizarem o estado de transição, não a ligação ao substra� Novos compostos farmacologicamente ativos são
to. Assim, se um composto for parecido com o estado de testados quanto a seus efeitos sobre uma variedade de
transição, poderia se ligar mais fortemente � enzima do enzimas. Drogas projetadas para inibir enzimas exclu�
que um composto que se pareça com o subs�
trato. Esses inibidores têm um valor de Ki mui�
to mais baixo do que o Km para o substrato.
Ninguém nunca viu um estado de transição,
de modo que as estruturas propostas são base� CIHg Enzima S Hg
adas na intuição química. Um exemplo de um Enzima SH + + HCI
análogo de estado de transição é um inibidor COO– COO–
da prolina racemase (Figura 10.60). Durante a
reação enzimática, o substrato tetraédrico se
p–Cloromercuribenzoato
tornará planar durante a conversão de L� para
D�prolina; pirrol ��carboxilato lembra estru� FIGURA 10.61 Inibição enzimática por modificação covalente de uma
turalmente o estado de transição proposto. cisteína do sítio ativo.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 425

H2N N CH3 CH3

O F
N CH3 H
N CH2 CH2 C N SO2
H

NH2 O

Ser
Região hidrofóbica Região polar

Sítio ativo Sítios de reconhecimento do substrato

Tetra-hidrofolato Redutase

FIGURA 10.62 Inativação sítio-dirigida da tetra-hidrofolato redutase.

O inibidor irreversível, uma di�hidrotriazina substituída, lembra A extremidade reativa do inibidor contém um sulfonil fluoreto
estruturalmente di�hidrofolato e liga�se especificamente ao sítio reativo que forma uma ligação covalente com a hidroxila de uma
do di�hidrofolato na di�hidrofolato redutase. A porção triazina serina na superfície da enzima. Assim, esse inibidor inibe irre�
do inibidor é parecida com o resíduo de pterina e, assim, liga�se versivelmente a enzima por bloquear o acesso do di�hidrofolato
ao sítio ativo. O grupo etilbenzeno (em vermelho) liga�se ao sítio ao sítio ativo. Este não é um inibidor suicida, mas um exemplo
hidrofóbico normalmente ocupado pelo grupo p-aminobenzoil. de um inibidor que se liga ao sítio ativo e tem um grupo reativo.

sivas de um microorganismo produzirão menos efeitos
colaterais em pacientes. Um exemplo clássico são as
sulfas, porque bactérias convertem ácido p�aminoben�
zoico em ácido fólico, enquanto seres humanos não têm
a enzima para essa reação (Figura 10.63). Diferenças
sutis que existem entre isozimas de enzimas de mamí�
feros estão sendo exploradas para produzir inibidores
específicos. Um exemplo é o sildenafil (nome comercial
Viagra), uma droga para disfunção erétil, que inibe uma
isozima espefícica da fosfodiesterase (p. �63). Pode�se

CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.9

Um Caso de Envenenamento
O pessoal que trabalha em pronto socorro encon�
tra muitos casos de envenenamento por pesticidas e
deve estar equipado para reconhecer e tratar esses
casos. Muitos dos inseticidas comuns são compostos
organofosforados, que inibem irreversivelmente a ação
da acetilcolinesterase, AChE, nas fibras pós�sinápticas
dos neurônios colinérgicos (p. 970), pela formação de
ésteres de fosfato estáveis com uma serina específica
do sítio ativo da esterase. A inibição da AChE impede
a hidrólise da acetilcolina na sinapse, resultando em
estimulação constante dos órgãos finais inervados por
esses neurônios. Os efeitos mais proeminentes do en�
venenamento por pesticidas no homem são paralisia
dos músculos respiratórios e edema pulmonar. Se mi�
nistrada precocemente, uma droga como pralidoxima
pode deslocar o alquilfosfato do pesticida ligado � se�
rina do sítio ativo e regenerar a AChE ativa.
Main, R. Em: E. Hodgson e F. E. Guthrie (Eds.) Intro
duction to Biochemical Toxicity. New York: Elsevier, 1980,
p. 193.

O
O OR
N CHNO POR O H CHNOPOR
N OR
CH3 O seryl (enzima)
CH3
seryl (enzyme)

Pralidoxima AChE AChE Inibidor

inibida ativa inativo
426 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

descobrir que um composto é es� TABELA 10.5 Drogas Representativas que Inibem Enzimas Específicas
pecífico para uma enzima in vitro, Droga Enzima Alvo Doença
mas também pode inibir enzimas
não testadas no processo de análi� Amrubicina Topoisomerase � Quimioterapia do câncer
se (screening). Drogas represen� Antabuse Aldeído desidrogenase
tativas que são inibidores de en� Alcoolismo
zimas são apresentadas na Tabela Captopril Enzima conversora de angiotensina Hipertensão
10.5. As Correlações Clínícas 10.11
Celebrex Cicloxigenase � Artrite
muito
e 10.1�específicos.
descrevemUmdoisOlhar
exemplos
Mais
Digoxina ATPase trocadora de Na+�K+ Problemas cardíacos
Atento 10.6 descreve um método
para identificação rápida de novos Hycamtin Topoisomerase 1 Quimioterapia do câncer
inibidores e ativadores de enzi� Lipitor 3�hidroxi�3�metilglutaril CoA
mas. Colesterol alto
Viagra Fosfodiesterase 5 Disfunção erétil

H2N S NH2

O
Sulfanilamida
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.11
O

H2N C O−
Testosterona e Câncer de Próstata

Câncer de próstata é uma das formas

p-Aminobenzoato
mais comuns de câncer e afeta só homens.
FIGURA 10.63 Estrutura de p-aminobenzoato e Durante um estágio inicial da doença, o
sulfanilamida, um inibidor competitivo de uma enzima tumor requer testosterona. Com o tempo,
bacteriana envolvida na síntese de ácido fólico. as células tumorais são mutadas de modo
que não precisam mais de testosterona. As
células tumorais são ditas células refrati�
vas ao hormônio. Alguns pesquisadores
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.10 sentem que, mesmo nos estágios iniciais
da doença, existem algumas células que já
Cogumelos e Metabolismo de Álcool
são refrativas ao hormônio.
A coprina, uma toxina produzida pelo cogumelo chapéu
Os pesquisadores consideram que as
sujo�de�tinta (Inky Cap), forma uma ligação covalente com a
aldeído desidrogenase, uma enzima envolvida no metabolismo células que pensavam ser refrativas ao
do álcool. A coprina geralmente não é muito tóxica, exceto em hormônio, na realidade respondem a um
indivíduos que consomem bebida alcoólica enquanto comem nível muito baixo de testosterona, que se�
os cogumelos. A pessoa tem uma reação tóxica ao acetaldeído ria encontrado mesmo após castração (ci�
acumulado que se formou na oxidação do etanol. rúrgica ou química). Uma nova abordagem
para combater a doença refrativa ao hor�
O dissulfuram, uma droga usada para deter o consumo abu� mônio é o uso de um inibidor do citocromo
sivo de álcool, é vendido com o nome Antabuse®, que também é P�50 (Cyp17A1), uma enzima envolvida na
um inibidor covalente da aldeído desidrogenase. A droga deixa biossíntese do hormônio. Abiraterona foi
o paciente doente caso consuma álcool. O dissulfuram foi usa� testada como um inibidor in vivo da via
do originalmente como um antioxidante na indústria de borra� da testosterona não�testicular.
cha, em que se observou que os trabalhadores ficavam doentes N
quando bebiam após o trabalho.

O inibidor não se dissocia da enzima e a única maneira de

restaurar a atividade é por biossíntese de nova enzima no te�
cido. H

Wiseman, J. S. e Abeles, R. H. Mechanism ofinhibition of aldehyde H H

dehydrogenase by cyclopropanone hydrate and the mushroom toxin
coprine. Biochemistry 18:��7, 1979. HO
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.12
Produtos Naturais Como Inibidores de Enzimas
Algumas frutas contêm compostos que afetam o
metabolismo de drogas específicas. Os indivíduos que
consomem o alimento e a droga podem ter um efeito ad�
verso. Talvez a interação mais bem estudada é com gra
pefruit. Essa fruta contém uma classe de compostos or�
gânicos chamados furanocumarinas, e se verificou que
alguns membros inibem um citocromo P�50 (CYP3A�)
no intestino, mas não no fígado. Várias drogas estati�
nas, usadas para tratar colesterol alto, e alguns medica�
mentos para pressão sanguínea são parcialmente meta�
bolizados nos intestinos e requerem o envolvimento do
CYP3A�. O consumo de grapefruit enquanto se toma a
droga afeta a farmacocinética de várias drogas, e mui�
tas apresentam consequências perigosas. Uma vez que
a droga esteja no sistema circulatório, seu metabolismo
não é mais inibido.
UM OLHAR MAIS ATENTO 10.6
Varredura de Alto Desempenho para Encontrar Inibidores e Ativadores de Enzimas
Foram encontrados inibidores de enzimas em com�
postos naturais que ocorrem em plantas, bactérias e
fungos. Um procedimento de varredura de uma biblio�
teca química é usado para pesquisar novos inibidores
de enzimas, especialmente pela indústria farmacêuti�
ca. Dezenas de milhares de compostos e extratos de
produtos naturais são rapidamente testados quanto �
sua capacidade de inibir uma enzima ou afetar uma
função celular. Diferentes combinações de materiais
de teste são roboticamente adicionados ao sistema de
teste. Os que afetam a enzima são, então, analisados
10.10 REGULAÇÃO
DA ATIVIDADE
ENZIMÁTICA
Modificação Covalente
As células têm capacidade de regular a atividade de
enzimas�chaves por modificação covalente da proteína.
Existem muitas proteínas quinases que catalisam fos�
forilação de resíduos de serina, treonina ou tirosina em
enzimas específicas e proteína fosforilases que remo�
vem o fosfato por hidrólise. Dependendo da proteína,
a fosforilação pode ativar uma enzima inativa ou ina�
tivar uma enzima ativa. Grupos como sulfato e acetato
também podem ser adicionados para alterar a atividade
enzimática. Como tanto a fosforilação como a defosfo�
• 427
A despeito do efeito do suco de grapefruit sobre
CYP3A�, estudos têm demonstrado que ele tem mui�
tos efeitos bons sobre o corpo em virtude de processos
antioxidantes. O efeito da grapefruit foi descoberto du�
rante um estudo sobre a interação de etanol com uma
medicação para pressão sanguínea chamada felopidina
(nome comercial Plendil®). O suco de grapefruit foi usa�
do como veículo para etanol, e finalmente os pesqui�
sadores perceberam que a inibição do metabolismo da
droga se devia ao suco, e não ao etanol.
Kiani, J. e Imam, S. Z. Medicinal importance of grapefruit
juice and its interaction with various drugs. Nutr. J. 6: 33,
�007.
de modo que novos compostos químicos biologicamen�
te ativos podem ser identificados. A vantagem dessa
abordagem é que os compostos com uma variedade de
estruturas diferentes pode ser testada, sem uma ideia
preconcebida de qual deveria ser a estrutura do efetor.
Dependendo do ensaio, é possível analisar qualquer
tipo de efetor.
Assay Guidance Manual 5.0. Eli Lilly and Company e
NIH Chemical Genomics Center, �008. Disponível em http://
www.ncgc.nih.gov/guidance/manual_toc.html.
rilação são realizadas por enzimas, essa modificação
covalente reversível é um modo rápido e eficiente de
controlar atividade a atividade enzimática.
Controle Alostérico de Atividade
Enzimática
A atividade de muitas enzimas pode ser modulada
por ligantes que se ligam � enzima em sítios diferen�
tes do sítio de ligação de substrato. Esses sítios são de�
nominados sítios alostéricos (Figura 10.6�). O termo
alostérico é derivado da raiz grega allo, significando “o
outro”. Um sítio alostérico é uma região específica da
enzima, bem diferente do sítio de ligação do substra�
to. Os ligantes que se ligam aos sítios alostéricos são
chamados efetores alostéricos ou moduladores, e não
são modificados durante o curso da reação enzimática.
428 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

A ligação de um efetor alostérico causa uma mudança conformacional na

CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.13
enzima, de modo que a afinidade pelo substrato ou outros ligantes também
muda. Efetores alostéricos positivos (+) aumentam a afinidade da enzima Um Caso de Gota Demonstra a
pelo substrato. O inverso é verdade para efetores alostéricos negativos (–). Diferença entre um Sítio Alos
O sítio alostérico ao qual o efetor positivo se liga é chamado um sítio ati� térico e um Sítio de Ligação de
vador; o efetor negativo liga�se a um sítio inibitório. A existência de sítios Substrato
alostéricos é ilustrada na Correlação Clínica 10.13.
A descoberta de que sítios alos�
As enzimas alostéricas são divididas em duas classes, com base no téricos inibitórios são separados dos
efeito do efetor alostérico sobre o Km ou Vmáx. Na classe K, o efetor al� sítios alostéricos ativadores, bem
tera o Km, mas não a Vmáx, enquanto na classe V, o efetor altera a Vmáx,
como dos sítios de ligação de subs�
mas não o Km. Na classe K, um efetor negativo ligando a um sítio alos� trato e catalítico, é ilustrada pelo
térico aumenta o Km para o substrato. Da mesma forma, em enzimas da estudo de um paciente com gota,
classe V modificadores alostéricos positivos e negativos aumentam ou cujo nível de PRPP nos eritrócitos
diminuem a velocidade de quebra do complexo ES para produto. Exis� estava aumentado. Descobriu�se que
tem algumas poucas enzimas nas quais ambos Km e Vmáx são afetados a PRPP sintetase do paciente tinha
pelo modificador. valores normais de Km e Vmáx, e sen�
sibilidade � ativação por fosfato. Os
Em teoria, uma enzima monomérica pode passar por uma transição
níveis aumentados de PRPP e hipe�
alostérica em resposta a um ligante modulador (Figura 10.6�a). Entre�
ruricemia surgiram porque os pro�
tanto, apenas algumas poucas enzimas alostéricas monoméricas são co�
dutos finais da via (ATP, GTP) não
nhecidas, incluindo a ribonucleosídeo difosfato redutase e a piruvato�UDP�
eram capazes de inibir a sintetase
�N�acetilglucosamina transferase. A maioria das enzimas alostéricas é
por meio do sítio alostérico inibitó�
oligomérica, consistindo de várias subunidades (Figura 10.�6b). A ligação
rio. Sugeriu�se que uma mutação no
do ligante a um protômero pode afetar a ligação de ligantes a outros pro�
sítio inibitório ou no mecanismo de
tômeros do oligômero. Se o mesmo ligante se ligar ao sítio alostérico e for
acoplamento entre o sítio inibitório
também o substrato da enzima, o efeito é chamado interação homotrópi
e catalítico tenha levado ao defeito
ca. Interações homotrópicas são quase sempre positivas. Uma interação
do mecanismo de controle por feed
back.
A S
A A
j j j
S A PRPP I
i i i sintetase

I C

S
S
I I
+

(a)

A 2 S
A A PRPP
–
j j j j j j
S S Pi
i i i i i i

ATP
Ribose
(b)

FIGURA 10.64 Modelos de sistemas enzimáticos alostéricos. AMP ATP

GMP GTP
(a) Modelo de uma enzima monomérica. A ligação de um efetor alostérico A (ver�
de), a um sítio ativador, j, induz uma nova conformação na enzima, que tem uma
afinidade maior pelo substrato. A ligação de um efetor alostérico negativo (lilás) ao Sperling, O., Persky�Brosh, S., Boen,
sítio inibitório, i, resulta em uma conformação enzimática tendo afinidade diminuída P. e DeVries, A. Human erytrocyte
pelo substrato (laranja). (b) Um modelo de uma enzima alostérica polimérica. A phosphoribosyl�pyrophosphate synthe�
ligação do efetor alostérico positivo, A, ao sítio j causa uma modificação alostérica na tase mutationally altered in regulatory
conformação do protômero ao qual o efetor se liga. Essa mudança na conformação é properties. Biochem. Med. 7: 389, 1973.
transmitida para o segundo protômero por interações cooperativas protômero–pro�
tômero. A afinidade pelo substrato é aumentada em ambos os protômeros. Um efetor
negativo diminui a afinidade pelo substrato em ambos os protômeros.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
heterotrópica é o efeito da ligação de um ligante ao sí�
tio alostérico e a ligação de um outro ligante ao sítio
ativo. Interações heterotrópicas podem ser positivas ou
negativas. Exemplos são o efeito de um efetor negati�
vo sobre a ligação do substrato ou o efeito positivo de
um ativador alostérico sobre a ligação do substrato. Os
efeitos heterotrópicos e homotrópicos em enzimas oli�
goméricas são mediados por cooperatividade entre as
subunidades.
A maioria da enzimas sujeitas a modulação alosté�
rica, é enzima determinante da velocidade de vias me�
tabólicas, ou está localizada em uma junção na qual o
substrato pode ser usado para mais de uma via.
Enzimas Multi-subunidades:
Cooperatividade
Muitas enzimas são multímeros consistindo de subu�
nidades monoméricas iguais ou diferentes. As su�
bunidades de algumas enzimas multiméricas agem
independentemente uma da outra, com os eventos que
ocorrem em uma subunidade não influenciando a ati�
vidade das outras subunidades. Para essas enzimas,
os valores de kcat ou Vmax podem ser divididos pelo nú�
mero de subunidades para se obter o número de tur
nover real por subunidade. Em outras enzimas multi�
�subunidades, um evento em uma subunidade afeta a
capacidade das subunidades adjacentes funcionarem.
Nessas situações, o Km para substrato é geralmente
modificado, mas, em alguns casos, kcat é alterado (Cor�
relação Clínica 10.1�).
Uma subunidade em um multímero pode afetar as
propriedades de uma subunidade adjacente por mo�
dificar a conformação das subunidades após ligação
do substrato (Figura 10.6�a). O monômero alterado
poderia ligar substrato mais facilmente e, assim, ficar
mais saturado sem aumento na concentração do subs�
trato. Se a ligação ficar mais fácil (diminuição do Km),
então se diz que a enzima apresenta cooperatividade
positiva; isso é análogo � hemoglobina ligando oxigê�
nio (p. 37�). Quando a mudança estrutural torna a li�
gação do substrato � segunda subunidade mais difícil
(aumento do Km), então se diz que a enzima apresenta
cooperatividade negativa.
O teste para uma enzima que apresenta cooperati�
vidade é um gráfico de velocidade versus [S]. A curva
será sigmoidal, e não hiperbólica (Figura 10.65a), e um
gráfico duplo�recíproco não será linear (Figura 10.65b).
Isso ocorre porque o Km mudará � medida que muda a
concentração de substrato.
É muito difícil calcular os valores precisos de Km
para uma enzima apresentando cooperatividade positi�
va ou negativa. O valor, entretanto, é estimado a partir
da concentração de substrato que permite que v seja
50% de Vmáx; é chamado K0,5. A equação de Hill, usada
• 429
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.14
Ambiguidade no Ensaio de Enzimas Mutadas
Mutações em genes estruturais levando � produ�
ção de enzimas com aumento ou diminuição no Km
são frequentemente observados. Um caso que ilus�
tra é um paciente com hiperuricemia e gota, cuja
hipoxantina�guanina�fosforribosiltransferase (HG�
PRT) de eritrócitos apresentava baixa atividade em
ensaios in vitro. Essa enzima está envolvida no rea�
proveitamento de bases púricas e catalisa a reação:
Hipoxantina + PRPP → inosina monofosfato + PPi
na qual PRPP é fosforribosil pirofosfato.
A ausência de atividade de HGPRT resultou na
grave doença neurológica conhecida como síndro�
me de Lesch�Nyhan (p. 8�0), mas esse paciente não
apresentava os sinais clínicos comuns dessa doença.
Um teste imunológico com um anticorpo específico
para a enzima revelou tanto material com reação
cruzada nos eritrócitos do sangue do paciente quan�
to em controles normais, indicando que a enzima
estava sendo sintetizada, mas era inativa no ensaio
in vitro. Aumentando a concentração de substrato
no ensaio do hemolisado de eritrócitos do paciente
restaurou toda a atividade. Essa anomalia é aparen�
temente devida a uma mutação no sítio de ligação do
substrato da HGPRT, levando a um Km aumentado.
A concentração de substrato no ensaio padrão e nos
eritrócitos não era suficientemente alta para permi�
tir a ligação com a enzima. Esse caso reforça que a
determinação precisa de uma enzima é dependente
de cinética de ordem zero, isto é, a enzima deve estar
saturada com substrato.
Sorenson, L. e Benke, P. J. Biochemical evidence for a
distinct type of primary gout. Nature �13: 11��, 1967.
para explicar a ligação cooperativa de oxigênio � he�
moglobina (p. 37�), é usada para calcular o coeficien�
te de Hill, que estima o grau de cooperatividade entre
subunidades interagindo em uma enzima. Valores me�
nores do que 1 demonstram cooperatividade negativa,
e maiores do que 1 cooperatividade positiva. Exemplos
representativos de cooperatividade positiva e negativa
são ilustrados na Figura 10.66.
Modelos para Explicar Cooperatividade
Existem dois modelos para explicar cooperativida�
de. Ambos partem da premissa de que há interações en�
tre as subunidades, e a conformação da subunidade que
se liga a um ligante é diferente daquela da subunidade
em ausência do ligante. A principal diferença entre os
modelos reside em se as duas conformações são pree�
xistentes ou ocorrem só depois da ligação do ligante.
430 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

sinclinação > 1
Sem cooperatividade cooperatividade
e positiva
d
a inclinação = 1
d
i
c
o nenhuma cooperatividade
l
e
V
Cooperatividade
inclinação < 1
cooperatividade negativa

(a) [S] −2
−1 −2 −1 0 1 2 3
log [s]

e
1 d
a
d
i Cooperatividade −3
c
o
le
V
Sem cooperatividade
FIGURA 10.66 Gráfico de Hill para uma enzima alostérica.

subunidade contígua (B). O efeito da ligação do ligante é

1 sequencialmente transmitido pela interface entre as subuni�
(b) [S]
FIGURA 10.65 Gráficos de enzimas que apresentam
cooperatividade são atípicos.
(a) Gráfico de velocidade versus substrato e (b) gráfico
duplo�recíproco. As curvas de cooperatividade são para
cooperatividade positiva.
O modelo sequencial propõe que, quando o li�
gante se liga a uma subunidade (A), ocorre uma
mudança na conformação da subunidade, que en�
tão induz uma mudança conformacional em uma
dades, produzindo afinidade aumentada ou diminuída pelo
ligante por B (Figura 10.67a). Nesse modelo, ocorrem nu�
merosos estados híbridos, dando origem � cooperatividade e
gráficos sigmoides de velocidade versus [S]. Tanto a coope�
ratividade positiva como a negativa podem ser acomodadas
no modelo. Moduladores alostéricos positivos podem induzir
uma conformação na subunidade que tem uma afinidade
aumentada pelo substrato, e um modulador negativo induz
uma conformação diferente na subunidade, resultando em
afinidade diminuída pelo substrato. Um argumento seme�
lhante pode ser usado para enzimas cujo kcat é modificado.

S S

S S S

FIGURA 10.67 Modelos de cooperatividade. (a)Conformação

T (taut) Conformação
R (relaxada)

(a) O modelo coordenado. A enzima existe em S2

apenas dois estados, as conformações T (tensa ou S1
taut) e R (relaxada). Substratos e ativadores têm K1
S
K2
S S
maior afinidade pelo estado R, e inibidores pelo
estado T. Ligantes deslocam o equilíbrio entre os
estados T e R. (b) O modelo de ajuste induzido
sequencial. A ligação de um ligante a qualquer
S3
subunidade induz uma mudança conformacional Conformação T
nessa subunidade. Essa mudança conformacional K3
é transmitida parcialmente �s subunidades vizi�
nhas por meio de interação subunidade–subuni�
dade. Assim, o efeito do primeiro ligante ligado é S S S4 S S
transmitido cooperativamente e sequencialmente
para as outras subunidades (protômeros) do oli� S S K4 S
gômero, resultando em um aumento ou uma di�
minuição sequencial na afinidade pelo ligante dos
outros protômeros. A cooperatividade pode ser
positiva ou negativa, dependendo do ligante. (b) Conformação R
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
O modelo coordenado propõe que as duas conforma�
ções estão em equilíbrio na ausência do ligante, e o equi�
líbrio é deslocado para a conformação ligada ao ligante.
Os dois estados do modelo coordenado são chamados T
(tenso ou taut) e R (relaxado) (Figura 10.67b). Embo�
ra ambos os estados possam ligar ligantes, um estado o
liga mais fortemente. Ativadores e substratos ligam�se
ao estado R e deslocam o equilíbrio preexistente para
o estado R. Com mais proteína no estado R, é mais fácil
para a molécula seguinte de substrato ou ativador se li�
gar. Inversamente, inibidores favorecem o estado T. Na
presença de um inibidor, é mais difícil para o substrato
se ligar � conformação T. Embora esse modelo explique o
comportamento cinético de muitas enzimas, não explica
facilmente a cooperatividade negativa.
Subunidades Regulatórias Modulam
a Atividade de Subunidades
Catalíticas
O sítio de ligação alostérica, como discutido, é con�
siderado como residindo na mesma subunidade do sítio
catalítico, e todas as subunidades da enzima são idênti�
cas. Em várias enzimas, existe uma subunidade protei�
ca regulatória distinta. Essas subunidades regulatórias
(R) não têm função catalítica, mas sua ligação com a
subunidade catalítica (C) modula a atividade da subu�
nidade catalítica por meio de uma mudança de confor�
mação induzida. A proteína quinase A (PKA) é regula�
da por esse mecanismo (Figura 10.68). Em ausência de
R R
Proteína
quinase
inativa
Subunidade Subunidade
catalítica catalítica
C C
cAMP
cAMP cAMP
R R
+
C C Proteína
quinase
ativa
FIGURA 10.68 Modelo de enzima alostérica com
subunidades catalítica (C) e regulatória (R) separadas.
A subunidade regulatória da proteína quinase A contém uma
região de pseudossubstrato em sua sequência primária que se
liga ao sítio do substrato da subunidade catalítica. Em presen�
ça de cAMP, a conformação da subunidade R muda, de modo
que a região de pseudossubstrato não pode mais se ligar, resul�
tando em liberação de subunidades C ativas.
• 431
cAMP, a subunidade R liga�se com a subunidade C cau�
sando inibição da atividade. Quando cAMP liga�se com
a subunidade R, ocorre uma mudança conformacional
de R levando � dissociação de R e C. A subunidade C
está agora cataliticamente ativa.
A calmodulina (p. 51�), uma proteína que liga Ca�+,
é uma subunidade regulatória de algumas enzimas que
usam Ca�+ como modulador de sua atividade. Ligação
de Ca�+ � calmodulina causa uma mudança conforma�
cional, permitindo que ela se ligue � enzima dependen�
te de Ca�+.
10.11 REGULAÇÃO DE VIAS
METABÓLICAS
A integração fisiológica de muitas enzimas em uma
via metabólica, bem como a interrelação dos produtos
de uma via com a atividade de outras vias, é controlada.
Não é necessário regular a atividade de todas as enzi�
mas de uma via. Ao contrário, a modulação da atividade
de uma ou mais enzimas chaves da via é suficiente. Uma
reação catalisada por enzima é geralmente mais lenta
que as outras. Esta é a etapa limitante da velocidade
da via. Portanto, a velocidade de fluxo de substratos na
sequência é dependente de uma enzima da via inteira.
A alteração das propriedades cinéticas dessa única en�
zima tem um grande efeito sobre a velocidade de forma�
ção do produto final.
Outro ponto importante para regular uma via me�
tabólica é a primeira reação irreversível que é especí�
fica para a via; essa etapa é chamada etapa de com
prometimento. A enzima limitante da velocidade não
é necessariamente a que catalisa a etapa de compro�
metimento. Além disso, em algumas vias um substra�
to intermediário serve de intermediário para duas ou
mais transformações metabólicas, cada uma levando
a produtos diferentes. A regulação das enzimas des�
ses pontos de ramificação, poderia controlar o fluxo de
metabólitos por ambas as vias. A atividade de enzimas
associadas com a etapa de comprometimento ou com
a etapa limitante da velocidade pode ser regulada de
várias formas.
Concentração Celular de Enzima
Muitas enzimas indutíveis têm meias�vidas de me�
nos do que 1 h, enquanto muitas enzimas constitutivas
têm meias�vidas de dias. As células regulam a concen�
tração de enzimas modificando a velocidade de sínte�
se de novo em nível de transcrição ou tradução. Por
exemplo, a glicose reprime a síntese de novo de piruva�
to carboxiquinase, a enzima limitante da velocidade na
conversão de piruvato em glicose. Se glicose suficien�
te estiver disponível no sangue, há um nível baixo de
piruvato carboxiquinase no fígado. Níveis sanguíneos
baixos de glicose levam a um aumento na enzima e au�
mento na síntese de glicose.
432 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Ativadores, Inibidores e Modificação
Covalente
Regulação de curto prazo de uma enzima ocorre por
modulação da atividade por ativadores, inibidores e mo�
dificação covalente. Quando a concentração celular de
desoxirribonucleotídeos aumenta, de modo que a célula
tem quantidades suficientes para a síntese de DNA, a
enzima chave da via sintética é inibida pelos produtos
finais da via, resultando em desaceleração da via sin�
tética. Isso é chamado inibição por retroalimentação
ou feedback (Figura 10.69a). Além da retroalimentação
em uma via, a inibição por retroalimentação de outras
vias também pode ocorrer. Isso é chamado regulação
cruzada. Aqui um produto de uma via serve de inibidor
ou ativador de uma enzima que ocorre logo no início de
outra via (Figura 10.69b). Um bom exemplo é a regula�
ção cruzada da produção dos quatro desoxirribonucle�
otídeos para a síntese de DNA.
A B − C D E
(a)
+ −
A a B b′ C c D d
E
+ sente no plasma. A enzima ativada é plasmina, uma se�
− b′ −
− h
g H I
F f
G usada na dissolução de coágulos sanguíneos de pacien�
g′ j
− J K tes que sofrem infarto do miocárdio. O t�PA também
(b)
FIGURA 10.69 Controle de vias metabólicas.
(a) Inibição por retroalimentação (feedback). O produto E
poderia inibir a enzima que catalisa reação de B para C. Esta
pode ser uma reação irreversível ou limitante da velocidade.
(b) Regulação de uma via complexa hipotética. O produto E
poderia inibir a enzimab e ativar a enzima b!. Da mesma forma,
os produtos I e K poderiam inibir sua síntese por inibirem as
enzimas b!, g e g!, enquanto ativam a enzima b.
Compartimentalização
Finalmente, a atividade de uma via pode ser regu�
lada pela separação física de reações em compartimen�
tos celulares específicos, separados por membranas
impermeáveis. O transporte de substratos, produtos e
cofatores através da membrana controla sua concentra�
ção no compartimento. Isso regula sua disponibilidade
e pode limitar a atividade enzimática. Isso é chamado
compartimentalização. Por exemplo, acetil�CoA é for�
mado nas mitocôndrias e deve ser transportado para
o citosol, para ser usado na síntese de ácidos graxos. A
acetil�CoA carboxilase, a primeira etapa da síntese de
ácidos graxos, requer acetil�CoA. O substrato não pode
se difundir para o citosol, de modo que um mecanismo
de transporte específico está presente na membrana (p.
70�). Vias anabólicas e catabólicas são frequentemente
segregadas em diferentes organelas para controlar me�
lhor cada via. Não haveria razão para a oxidação de áci�
dos graxos ocorrer ao mesmo tempo e no mesmo com�
partimento da biossíntese de ácidos graxos. Mantendo
a biossíntese de ácidos graxos no citoplasma, e a oxi�
dação nas mitocôndrias, o controle pode ser exercido
regulando�se o transporte de intermediários comuns
através da membrana mitocondrial.
10.12APLICAÇÕES CLÍNICAS DE
ENZIMAS
Em virtude de suas diversas propriedades, as enzi�
mas encontram muitos usos em terapêutica, análises
clínicas e diagnóstico de doenças. Por exemplo, enzi�
mas hidrolíticas, como as proteases pronase e RNases,
são usadas no debridamento de feridas. Estreptoquina
se, uma mistura de enzimas preparadas de estreptoco�
cus, é útil na dissolução de coágulos sanguíneos que
ocorrem no infarto do miocárdio e das extremidades
inferiores. Essa mistura ativa a pró�enzima fibrinolítica
plasminogênio (p. 1016), que está normalmente pre�
rino protease que cliva a fibrina insolúvel no coágulo em
vários componentes solúveis. Outra serino protease, o
ativador de plasminogênio tecidual humano t�PA, é pro�
duzido comercialmente por E. coli bioengenheirada e
funciona ativando plasminogênio.
Dosagem de Enzimas Plasmáticas
As enzimas encontradas no plasma são de dois tipos:
as que estão normalmente presentes e têm um papel
funcional no plasma e as liberadas de tecidos. As úl�
timas não têm papel funcional no plasma, mas podem
ser usadas para fins diagnósticos. Normalmente o con�
teúdo plasmático de enzimas intracelulares é baixo ou
nulo, mas quando células são danificadas, os conteúdos
podem aparecer no sangue. Um processo de doença
pode causar mudança na permeabilidade de membra�
na ou aumentar a morte celular, resultando na libera�
ção de enzimas intracelulares. Componentes de menor
peso molecular podem se difundir para fora das células
quando há um aumento anormal de sua concentração
celular. A análise do sangue para componentes celula�
res representa um modo conveniente para os clínicos
avaliarem o dano que ocorreu em tecidos específicos.
No diagnóstico do envolvimento de órgãos específicos
em um processo de doença, o ideal seria se existissem
enzimas características de cada órgão, que pudessem
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
ser quantificadas no plasma. Infelizmente, enzimas
idênticas são encontradas na maioria dos tecidos. Em
alguns casos, entretanto, diferentes isozimas (p. 393)
ocorrem em diferentes órgãos; estas são úteis para pro�
pósitos diagnósticos, se liberadas de um tecido doen�
te. Por exemplo, uma isozima da álcool desidrogenase
que é específica para o fígado e uma forma de fosfatase
ácida encontrada primariamente na próstata são úteis
para identificação específica de doenças nesses órgãos.
Para algumas enzimas, as isozimas tecido�específicas
apresentam diferentes propriedades cinéticas, de modo
que a determinação dos valores de Km e kcat pode ser
usada para determinar de que tecido são provenientes.
A avaliação do tempo de aparecimento e desapa�
recimento de enzimas específicas no plasma permite
o diagnóstico do envolvimento de órgãos específicos.
A Figura 10.70 ilustra as variações tempo�dependente
das atividades plasmáticas de enzimas do miocárdio
após um ataque cardíaco. Tais perfis permitem que se
estabeleça quando o ataque ocorreu e se o tratamento
será eficaz. A Correlação Clínica 10.15 descreve como o
CORRELAÇÃO CLÍNICA 10.15
Identificação e Tratamento de uma Deficiência Enzimática
Deficiências enzimáticas geralmente levam ao acú�
mulo aumentado de metabólitos intermediários espe�
cíficos no plasma e, consequentemente, na urina. O re�
conhecimento dos intermediários que se acumulam em
fluidos biológicos é útil na identificação dos possíveis de�
feitos enzimáticos. Depois que a deficiência enzimática
é estabelecida, metabólitos que normalmente ocorrem
na via, mas são distais ao bloqueio, podem ser fornecidos
exogenamente, para contornar os efeitos metabólicos da
deficiência enzimática. Na acidúria orótica hereditária há
uma deficiência enzimática dupla na via de biossíntese de
pirimidinas, levando ao acúmulo do ácido orótico. Am�
bas orotato fosforribosiltransferase e oritidina 5!�fosfato
descarboxilase estão deficientes, causando níveis redu�
zidos in vivo de CTP e TTP. As duas atividades estão
deficientes porque residem em domínios separados de
um polipeptídeo bifuncional de �80 aminoácidos. dCTP
Glutamina
CO2
ATP carbamoil-fosfato
sintetase
J
DNA dCDP dTTP
Citidina
orotidina
5!-fosfato
decarboxilase
Uridina UMP
• 433
diagnóstico de um defeito enzimático específico leva a
um tratamento clínico racional que recupera a saúde do
paciente. Outro exemplo de como isozimas são usadas
para o diagnóstico de doenças é o padrão de isozimas
da lactato desidrogenase em função do tempo após um
infarto do miocárdio (Figura 10.71 e Tabela 10.�). Não
só a atividade enzimática total aumenta, mas há uma
mudança no padrão de isozimas. Mais LDH1, encon�
trada primariamente no miocárdio e em eritrócitos, é
encontrada. Nesse exemplo, LDH5 está aumentada, in�
dicando lesão hepática no paciente. Portanto, complica�
ções secundárias da insuficiência cardíaca podem ser
monitoradas. Após duas semanas, o padrão de isozimas
retorna ao que estava no paciente sadio.
Análise cinética de creatina quinase e lactato desi�
drogenase é útil para propósito diagnóstico. Isozimas
de CPK e LDH são plotadas na Figura 10.7� em função
do tempo após lesão cardíaca. A lesão tecidual libera
CPK� no sangue nas primeiras 6�18 h após um infarto,
mas a liberação de LDH demora mais do que o apa�
recimento de CPK� em um a dois dias. Normalmente,
e dTTP, que surgem de CTP e TTP, são necessários para
síntese de DNA. Nessa doença de deficiência enzimática,
os pacientes são pálidos, fracos e não se desenvolvem.
A administração das pirimidinas ausentes, como uridina
ou citidina, promove o crescimento e o bem�estar geral
e também diminui a excreção de ácido orótico. A última
ocorre porque o TTP e o CTP formados a partir da uri�
dina e da citidina administradas reprime a carbamoil�
�fosfato sintetase, a etapa comprometida, por inibição
por retroalimentação ou feedback, resultando em uma
diminuição na produção de orotato.
Webster, D. R., Becroft, D. M. O. e Suttie, D. P. Hereditary
orotic aciduria and other diseases of pyrimidine metabolism.
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Carbamoil
fosfato Orotato
orotato
fosforibosil
transferase
Orotidina 5!-fosfato
434 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

6x CPK
a
c normal
it
á
m
iz 5x FIGURA 10.70 Cinética de liberação de
n 3x
normal enzimas cardíacas no soro após infarto
e
o do miocárdio.
ã
ç
v
a CPK, creatina quinase; LDH, desidrogena�
e
l normal
e se láctica; HBDH, α�hidroxibutirato desi�
a
d 2x HBDH
drogenase. Tais perfis cinéticos permitem
o
ã
s Normal
normal que se determine onde o paciente está,
n LDH
e
tx com relação ao infarto e � recuperação.
E Nota: CPK sobe rapidamente, mas breve�
mente; HBDH sobe lentamente, mas per�
siste.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Reproduzido com permissão de Coodley,
Dor
peito
no Dias depois do episódio E. L. Diagnostic Enzymes. Philadelphia:
Lea & Febiger, 1970, 61.

3 Tempo a atividade da isozima LDH� é maior do que a de LDH1; en�

2 tretanto, no caso de infarto, a atividade de LDH1 fica maior
do que a de LDH�, mais ou menos no mesmo tempo em que
0 (internação)
os níveis de CPK� estão de volta � linha de base (�8�60 h). A
troca de isozimas de LDH acoplada com o aumento de CPK�
1
é diagnóstico de infarto do miocárdio (MI) em praticamente
100% dos casos.
0

O uso de enzimas no laboratório clínico é descrito em Um

3 Olhar Mais Atento 10.7 e 10.8.

2
12 horas
Metabolômica e Proteômica
1 Com os espectrômetros de massa tornando�se instrumen�
tos relativamente comuns, muitos pesquisadores estão usan�
0 do�os com a esperança de encontrar metabólitos específicos,
proteínas ou enzimas relacionados com tumores. Esses meta�
4 bólitos e proteínas poderiam ser empregados como marcado�
res de tipos específicos de tumores. Espera�se que enzimas e
3
proteínas singulares, associadas com vários estados de doen�
ças, sejam identificados no plasma. Essas enzimas e proteí�
nas deverão ser purificadas e caracterizadas para determinar
2 24 horas
seus efeitos sobre a atividade celular normal.

2 FIGURA 10.71 Traçados de varredura densitométrica de

isozimas de LDH em intervalos de tempo após um infarto do
miocárdio.
1 2 semanas
LDH total aumenta e LDH1 fica mais alta do que LDH� entre 1� e ��
horas. Aumento de LDH5 é diagnóstico de um envolvimento hepá�
0 tico congestivo secundário. Notar que as escalas do eixo y não são
idênticas. Após eletroforese em gel de agarose, a atividade de LDH
é ensaiada medindo�se a fluorescência do NADH formado na reação
Anodo Catodo
catalisada por LDH.
1 2 3 4 5
Cortesia do Dr. A. T. Gajda, Clinical Laboratories, University of Arkan�
Tipo de isozima sas for Medical Science.
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 435

UM OLHAR MAIS ATENTO 10.7

Ensaios de Laboratório Clínico Empregando Enzimas

Geralmente, enzimas encontradas em órgãos não
estão presentes no soro, a menos que ocorra lesão no
tecido. Portanto, a medida dos níveis séricos de enzi�
mas pode ser diagnóstico de um estado de doença. En�
saios para medida de enzimas plasmáticas são baseados
no controle do sistema de ensaio, incluindo tempera�
tura, pH e concentração de substratos, cossubstratos e
cofatores. O Km da enzima a ser determinada deve ser
conhecido. Geralmente, os ensaios são realizados em
condições de Vmáx, embora não precisem ser. As condi�
ções de ensaio são otimizadas para as propriedades da
enzima normal, o que pode não medir corretamente os
níveis de uma enzima variante porque o pH ótimo e/ou
o Km para o substrato e os cofatores podem ser diferen�
tes da enzima normal. Os ensaios enzimáticos medem
a concentração de produto formado ou substrato rema�
nescente em função do tempo. Em algumas reações, os
produtos ou substratos absorvem luz; é medida a mu�
dança de absorção de luz em função do tempo.
Foram sintetizados muitos substratos, nos quais eles
ou seus produtos são compostos cromóforos (absorvem
luz ou emitem fluorescência). As coenzimas NAD(P) e
FAD são facilmente medidas porque suas formas redu�
zidas absorvem luz na faixa visível. Muitas enzimas que
não reduzem diretamente NAD(P) ou FAD geram pro�
dutos que são substratos para desidrogenases NAD(P)
ou FAD�ligadas. Acomplando�se duas reações enzimá�
ticas, pode�se determinar a atividade da enzima de in�
teresse.
As enzimas, como reagentes, são usadas para me�
dir metabólitos em analisadores clínicos automáticos. A
glicose oxidase, uma enzima que oxida glicose, é usada
clinicamente para medir a concentração de glicose em
líquidos corpóreos. Ensaios para colesterol empregam
colesterol oxidase, e, para triacilgliceróis, é empregada
a lípase. Os testes podem ser completados em poucos
minutos usando pequenas quantidades de plasma. As
enzimas podem ser imobilizadas em uma bicamada
sólida, com cofatores e reagentes indicadores, que se
tornam cromóforos quando reduzidos. No caso da co�
lesterol oxidase, o peróxido de hidrogênio é um produto
da reação da oxidase, e o peróxido formado oxida um
corante sem cor para um produto colorido, mediado por
uma peroxidase, outra enzima.

l LDH 1/2 UM OLHAR MAIS ATENTO 10.8

a
m
r
o CPK3
n Imunoensaios Ligados a Enzimas Empregam Enzimas
o
a CPK2
o Como Indicadores
ã
ç
a
l
e
r A química clínica moderna se beneficiou da fusão da
m química de enzimas com a imunologia. Anticorpos espe�
e
K
P
1,25 1 cíficos para um antígeno proteico são acoplados com uma
C H 2
e
d D
L H
enzima indicadora, como a peroxidase de rabanete, para
e
d 1,00
e
d
D
L gerar um ensaio muito específico e sensível. Após ligação
a a
v
d
i
it
o
ã
z
r
a do anticorpo acoplado � peroxidase ao antígeno, a peroxi�
a p
A R dase é usada para gerar um produto colorido que é mensu�
0,75
rável e cuja concentração está relacionada com a quantida�
0 1 2 3 4 de de antígeno em uma amostra. A esse ensaio foi dado o
Dias após o infarto acrônimo ELISA para enzyme-linked immunoadsorbent
assay. Anticorpos monoclonais geram anticorpos que são
FIGURA 10.72 Mudanças características no soro de
muito específicos para um antígeno. Por exemplo, anticor�
isozimas CPK e LDH após um infarto do miocárdio.
pos contra uma isozima específica ou um membro de uma
A isozima CPK� (MB) aumenta, alcançando o máximo
em 1 dia após o infarto. CPK3 vem cerca de 1 dia depois família de enzimas muito semelhantes foram produzidos,
de CPK�. Os níveis de LDH total aumentam mais len� permitindo sua determinação por ELISA.
tamente. O aumento de LDH1 e LDH� em 1���� horas,
acoplado com um aumento em CPK� é diagnóstico de
A peroxidase de rabanete é usada como um indicador
infarto do miocárdio. em ELISA para testar a presença de antígenos proteicos de
capa do vírus da imunodeficiência humana (HIV). A pero�
xidase gera muitas moléculas de produto por antígeno, �
medida que o tempo passa. Tais ensaios enzimáticos ampli�
ficados permitem a medida de quantidades extremamente
pequenas de antígenos.
436 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
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Termos Chaves
ajuste induzido micas
ativadores cooperatividade negativa
catálise ácidae básica cooperatividade positiva
geral energia deativação
catálise covalente enzimas
coenzimas
equação de Michaelis–
cofatores Menten
considerações termodinâ� equilíbrio
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transição inibidores competitivos
estado de transição inibidores não�competiti�
fosfatases vos
gráficos (ou plotes) duplos� isozimase doenças
�recíprocos Ki
inibidores Km
inibidores acompetitivos Km(app)
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE • 437

ligação forte reações de dois substratos regulação de uma via sítio ativo
metais reações irreversíveis plote de Hill uso terapêutico de enzimas
reação pingue�pongue reações redox quinases velocidade máxima
reação sequencial reações reversíveis sítio alostérico vitaminas

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha Cpd 3
1. Em todas as enzimas, o sítio ativo Cpd 1A B
A. contém o sítio de ligação ao substrato. Cpd2C Cpd4 D Cpd5E Cpd 6
B. é vizinho do sítio de ligação ao substrato na
sequência primária. A. A
C. fica numa região da sequência primária dis� B. B
tante do sítio de ligação ao substrato. C. C
D. contém um íon metálico como grupo prostéti� D. D
co. E. E
E. contém as cadeias laterais dos aminoácidos 6. O número de turnover (kcat)
envolvidos na catálise da reação.
A. é a razão das constantes de velocidade para
2. Quando adicionado a uma reação, um catalisador formação de ES e de produto.
A. fornece o calor de formação. B. tem unidades de 1/tempo.
B. altera a constante de equilíbrio Keq para favo� C. é inversamente proporcional a quão veloz a rea�
recer a formação de produtos. ção é.
C. aumenta a velocidade na qual o equilíbrio é al� D. para uma enzima mutante pode mudar sem
cançado. qualquer mudança no Km da reação.
D. muda a ordem da reação (por exemplo, de pri� E. tem unidades de concentração de substrato.
meira ordem para segunda ordem).
E. muda o AG0 da reação. Questões 7 e 8: Um homem descendente de japone�
ses verificou que estava apresentando rubor intenso e
3. Cátions metálicos podem fazer todos os seguintes, batimentos cardíacos muito acelerados após consumo
exceto de uma bebida alcoólica. Seu companheiro, um homem
A. doar pares de elétrons a grupos funcionais en� caucasiano, não apresentou os mesmos sintomas, em�
contrados na estrutura primária de uma pro� bora já tivesse acabado seu segundo drinque. Esses
teína enzima. efeitos fisiológicos estão relacionados com a presença
B. servir como ácidos de Lewis em enzimas. de acetaldeído (CH3CHO), gerado a partir do álcool. O
acetaldeído é normalmente removido pela reação da al�
C. participar de processos de oxidação�redução. deído desidrogenase mitocondrial, que catalisa a reação
D. estabilizar a conformação ativa de uma enzi�
CH3CHO + NAD+  CH3COO– + NADH + H+
ma.
E. formar quelatos com o substrato, sendo o que� 7. A acetaldeído desidrogenase é uma:
lato o verdadeiro substrato. A. óxido�redutase.
4. Uma enzima pode facilitar a velocidade de uma rea� B. transferase.
ção por C. hidrolase.
A. estabilizar o estado de transição. D. liase.
B. ligar muito fortemente ao substrato. E. ligase.
C. ligar muito fortemente ao produto. 8. A explicação para a diferença de efeitos fisiológicos
D. impedir o substrato de mudar seu estado iôni� é que o homem japonês era deficiente na aldeído
co. desidrogenase mitocondrial normal e tinha apenas
E. impedir que a reação aconteça na direção in� uma isozima citosólica. A isozima citosólica:
versa. A. não reage com CH3CHO.
5. Na sequência de reações a seguir, o melhor ponto B. ativa a enzima que produz CH3CHO.
para controlar a produção do Composto 6 é a rea� C. difere da enzima mitocondrial por ter um Km
ção: mais alto para CH3CHO.
438 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
D. esperaria�se que tivesse maior afinidade pelo
substrato do que a enzima mitocondrial.
E. produz um nível baixo de estado estacionário
(steady-state) de acetaldeído após consumo
de álcool.
Questões 9 e 10: Um técnico de pesquisa, trabalhan�
do com compostos organofosforados, deve fazer exames
de sangue semanais para a atividade da acetilcolines�
terase. Geralmente, a atividade de esterase permanece
relativamente constante por algum tempo e, depois, cai
abruptamente a zero. Se isso acontecer, o técnico deve
parar imediatamente de trabalhar com os compostos
organofosforados. Esses compostos organofosforados
formam ésteres estáveis com o grupo hidroxila de uma
serina crítica para a esterase.
9. Na esterase, a serina transfere um próton para um
resíduo de histidina. Qual dos seguintes está corre�
to?
A. A serina está agindo como um ácido geral.
B. A histidina está agindo como um ácido geral.
C. A serina e a histidina formam um intermediá�
rio covalente.
D. A enzima seria relativamente insensível a va�
riações de pH.
E. A serina está agindo como um catalisador de
transmissão de estabilização.
10. Compostos organofosforados inativam a esterase
por
A. inibição competitiva.
B. inibição acompetitiva.
C. inibição não�competitiva.
D. inibição suicida.
E. inibição irreversível.
Questões 11 e 12: Gota é uma doença na qual ácido
úrico está aumentado no sangue e na urina. Um paciente
que excretava três vezes a quantidade normal de ácido
úrico tinha níveis sanguíneos muito altos de PRPP, um
intermediário da biossíntese de AMP e GMP, que são pre�
cursores de ATP e GTP. A degradação desses compostos
produz ácido úrico. A PRPP sintetase do paciente tinha
valores de Km e Vmáx normais, mas era insensível � regu�
Respostas
1. E O sítio ativo contém toda a maquinaria, incluin�
do as cadeias laterais de aminoácidos envolvidos
na catálise da reação. A�D são todos possíveis, mas
nenhum é necessariamente verdadeiro.
2. C Um catalisador diminui a energia do estado de
transição, acelerando assim a velocidade de sua
formação. A: calor de formação é a energia para
formar reagentes ou produtos. B: Keq é governada
pelos calores de formação, que são constantes em
lação pelos produtos finais da via (ATP, GTP). Estes são
modificadores alostéricos negativos de PRPP sintetase.
11. Todas as afirmativas seguintes sobre efetores alos�
téricos estão corretas, exceto que eles
A. podem aumentar a afinidade da enzima por
seu substrato.
B. podem diminuir a afinidade da enzima por seu
substrato.
C. ligam�se ao sítio de ligação do substrato.
D. causam uma mudança conformacional da en�
zima.
E. podem mudar ou o Km ou a Vmáx da reação.
12. A maioria das enzimas alostéricas
A. é monomérica.
B. tem mais de uma subunidade.
C. apresenta apenas interações homotrópicas.
D. apresenta apenas interações heterotrópicas.
E. liga o efetor alostérico sem afetar a ligação de
outros ligantes.
Problemas
13. Um experimento para medir velocidade versus
concentração de substrato foi realizado, primeiro
em ausência da substância A e depois em presença
da substância A. Os seguintes dados foram obtidos:
Velocidade em Velocidade em
[S] ausência de A presença de A
(μM) µmol/min µmol/min
�,5 0,3� 0,�0
3,3 0,�0 0,�6
5,0 0,5� 0,36
10,0 0,69 0,56
A substância A é um ativador ou um inibidor? Se
inibidor, que tipo de inibidor é?
14. Para o experimento do problema 13, calcule o Km
e a Vmáx tanto em ausência como em presença da
substância A. Esses resultados são consistentes
com sua resposta para a questão 13?
uma reação. D: isso é determinado pelo número de
reagentes. E: DG0 está relacionado com a diferença
entre os calores de formação dos reagentes e pro�
dutos – uma constante.
3. A Cátions metálicos são deficientes em elétrons
e podem aceitar pares de elétrons, funcionando
como ácidos de Lewis, mas não doam elétrons a
outros grupos funcionais. C: ao contrário, �s vezes
eles aceitam pares de elétrons de grupos de ca�
 CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE
deias laterais de aminoácidos. D: fazendo isso, eles
podem ser quelados, o que pode estabilizar a estru�
tura correta. E: �s vezes são quelados pelo substra�
to, sendo o quelato o substrato real.
4. A Resíduos da enzima interagem com o substrato
enquanto ele está no estado de transição, baixando
a energia de ativação. B: isso exigiria mais energia
para chegar ao estado de transição. C: seria difí�
cil para o produto se dissociar. D: uma chave para
muitas reações é a enzima adicionar ou remover
prótons do substrato para torná�lo mais ou menos
nucleofílico. E: a catálise é reversível, embora con�
siderações termodinâmicas possam fazer algumas
reações parecerem irreversíveis.
5. D A reação D é irreversível; se não fosse contro�
lada, o Cpd 5 poderia chegar a níveis tóxicos. A:
o controle da reação A controlaria a produção de
ambos os Cpd 3 e 6. B: a reação B não está na rota
direta. C e E: as reações C e E são livremente rever�
síveis, de modo que não precisam ser controladas.
6. B Este é o número de moléculas de substrato con�
vertidas por unidade de tempo, por molécula de
enzima. A e E: estes referem�se ao Km. C: quanto
mais alta a kcat, mais rápida é a reação. D: kcat/Km é
igual a Keq, de modo que ambos devem mudar para
manter o equilíbrio.
7. A Conversão de aldeído em ácido é uma oxidação.
É da subclasse desidrogenases, como indicado pela
presença de NAD+.
8. C A menor afinidade (maior Km) torna mais di�
fícil para a enzima remover CH3CHO. A: isozimas,
por definição, catalisam a mesma reação. B: é pou�
co provável que uma enzima ative outra enzima. D:
com maior afinidade (menor Km), a reação estaria
ocorrendo em alta velocidade, removendo, assim,
CH3CHO. E: esses efeitos são devidos a uma alta
concentração de estado estacionário (steady-state).
9. A Ácidos doam prótons. Ácidos gerais são fraca�
mente ionizados em pH fisiológico. O ambiente da
• 439
serina na proteína facilita sua capacidade de trans�
ferir um próton e, assim, agir como um nucleófi�
lo. B: bases aceitam prótons. C: nenhuma ligação
covalente é formada. D: a capacidade da histidina
aceitar um próton é muito pH�dependente. E: isso
não é provável.
10. E O éster de fosfato não se dissocia e a enzima
não é restaurada. A, B e C: esses tipos de inibidores
ligam�se � enzima e/ou complexo enzima�substrato
reversivelmente. D: um inibidor suicida é formado
a partir do substrato e permanece covalentemente
ligado � enzima. Organofosfatos não são substratos
para a esterase.
11. C “Allo” significa outro. A e B: efetores alostéricos
podem ser positivos ou negativos. D: isso altera a
afinidade pelo substrato. E: classe K altera Km e
classe Valtera Vmáx.
12. B A maioria é oligomérica. A: apenas duas en�
zimas alostéricas monoméricas são conhecidas.
C e D: interações homotrópicas e heterotrópicas
são comuns. E: o princípio do alosterismo é que
a ligação de um ligante afeta a ligação de outros
ligantes.
13. Tome os recíprocos de ambos [S] e v e construa um
gráfico de Lineweaver�Burk. Você descobririá que
as duas curvas cruzam o eixo y no mesmo ponto,
mas a curva em presença de A cruza o eixo x mais
próximo da origem. Esse padrão indica que A é um
inibidor competitivo.
14. –1/Km Km 1/Vmáx Vmáx
Ausência de A –0,1� 7,1 0,8 1,�5
Presença de A –0,08 1�,5 0,8 1,�5
Com um inibidor competitivo, Vmáx permanece cons�
tante (certifique�se que você entende o motivo),
mas o Km aparente é mais alto. É necessário mais
substrato para alcançar uma dada velocidade por�
que o substrato precisa competir com o inibidor.
440 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
PARTE III CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 441
FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

11
Citocromos P450 Adenina
Ribose
Fosfato
Fosfato
Ribitol
Citocromo P450
Redutase

Citocromo b5
2e- O
N N -
CH3 1e Fosfato
?
NADPH
N N CH3 Ribitol

e Óxido Nítrico O
[FAD] H
CC
N NN-
H33C 1e[FMN]O
O
N

N+3N
Fe
C

CNCCitocromoP450
C N C
N Fe N
CCN

Sintases
Linda J. Roman
Professora Associada, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Bettie Sue Siler Masters

Professora Distinta Robert A. Welch de Química, University of Texas Health Science Center
at San Antonio

CONTEÚDO CORRELAÇÕES CLÍNICAS

11.1 INTRODUÇÃO, 442
11.2 CITOCROMOS P450: PROPRIEDADES E FUN
ÇÃO, 443
11.3 SISTEMAS DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS
CITOCROMOS P450, 444
11.4 CITOCROMO P450: NOMENCLATURA E ISO
FORMAS, 446
11.5 CITOCROMO P450: SUBSTRATOS E FUNÇÕES
FISIOLÓGICAS, 447
11.6 CITOCROMO P450: INDUÇÃO E INIBIÇÃO, 456
11.7 ÓXIDO NÍTRICO SINTASES: PROPRIEDADES E
FUNÇÃO ENZIMÁTICA, 461
11.8 ISOFORMAS DA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE E
FUNÇÕES FISIOLÓGICAS, 463
11.1 Hiperplasia Adrenal Congênita: Deficiência de
CYP21A2, 452
11.2 Produção de Hormônios Esteroides Durante a
Gestação, 452
11.3 Inibição do Citocromo P450: Interações Droga–
Droga e Efeitos Adversos, 455
11.4 Papel do Citocromo P4502E1 em Toxicidade
Hepática Induzida por Acetaminofen, 457
11.5 Indução de Citocromo P450: Interações Droga–
Droga e Efeitos Adversos, 458
11.6 Polimorfismos Genéticos de Enzimas P450, 460
11.7 Polimorfismos Genéticos de NADPH-Citocromo
P450 Redutase: Síndrome de Antley-Bixler, 461
11.8 O Mecanismo de Ação de Sildenafil, 465
11.9 Superprodução de Óxido Nítrico no Choque Sép
tico, 466
11.10 História e Efeitos Biológicos de Nitroglicerina,
467
11.11 Usos Terapêuticos de Óxido Nítrico Inalado, 468
11.12 O Papel de eNOS na Disfunção Endotelial, 469
442 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Conceitos Chaves
• Citocromos P450 catalizam a incorporação de um
átomo de oxigênio tanto em substratos naturais
quanto em compostos estranhos. Eles contêm
heme (ferro porfirina IX); o ferro é reduzido pelos
elétrons doados por uma redutase contendo FAD
ou FMN. Seus espectros derivam do quinto ligante
axial do ferro heme com um resíduo de cisteína em
cada uma das proteínas.
• A oxigenação de esteroides produz produtos re
gião-específicos e estereoespecíficos, que são es
senciais para a diferenciação sexual (andrógenos e
estrógenos) e para o equilíbrio metabólico e eletro
lítico (corticosteroides e mineralocorticoides).
Alguns citocromos P450 possuem menor especi
•
ficidade pelo substrato e metabolizam compostos
exógenos, para gerar produtos mais polares para
eliminação. Alguns produtos são mais tóxicos do
que os substratos originais, mas o metabolismo
subsequente neutraliza tais efeitos. A maioria das
drogas é metabolizada por inúmeros citocromos
P450 específicos no retículo endoplasmático. Fre
quentemente ocorrem interações droga–droga.
• Alguns citocromos P450 podem ser induzidos, en
quanto outros são constitutivos. Existem 57 citocro
mos P450 humanos; 50 ocorrem no retículo endoplas
mático e requerem NADPH-citocromo P450 redutase.
• A hidroxilação mitocondrial de esteroides requer
elétrons provenientes do NADPH, que passam
por uma redutase que contém FAD, uma proteína
ferro-enxofre, adrenodoxina, e finalmente para o
citocromo P450.
• Polimorfismos genéticos foram demonstrados na
população humana tanto em citocromos P450 como
em NADPH-citocromo P450 redutase. As mutações
podem resultar no metabolismo reduzido de drogas
e no metabolismo anormal de esteroides sexuais.
11.1 INTRODUÇÃO
O citocromo P450 constitui uma família singular de
heme proteínas, presente em bactérias, fungos, insetos,
plantas, peixes, mamíferos e primatas, que catalisam
a monooxigenação (ou seja, inserção de um átomo de
oxigênio molecular) de uma variedade de compostos
estruturalmente diversos. Os substratos para esse sis
tema enzimático incluem tanto compostos sintetizados
endogenamente, como colesterol, hormônios esteroi
des e ácidos graxos, quanto compostos exógenos, como
drogas, aditivos de alimentos, componentes da fumaça
de cigarros, pesticidas e compostos químicos, que são
ingeridos, inalados ou absorvidos pela pele. Os citocro
mos P450 estão envolvidos em (1) produção de hor
mônios esteroides; (2) metabolismo de ácidos graxos,
• O óxido nítrico (NO, nitric oxide) é uma molécula
sinalizadora produzida por monooxigenação cata
lisada pelas óxido nítrico sintases (NOSs, nitric
oxide synthases), que contêm FAD, FMN e heme
ligados a uma única molécula que funciona como
um homodímero. O NO é derivado do grupo guani
dino da L-arginina, e a N-hidroxi-L-arginina é um
intermediário da reação.
• As NOSs são compostas por dois domínios distin
tos, um contendo FAD e FMN, e o outro contendo
heme, conectados por uma sequência de ligação à
calmodulina. A ligação de Ca2+-calmodulina é ne
cessária para a transferência de elétrons entre os
domínios. Tetra-hidrobiopterina e Zn também são
necessários.
• As NOSs são codificadas por três genes, produzin
do NOSI (NOS neuronal), NOSII (NOS indutível)
e NOSIII (NOS endotelial). A NOSI é constitutiva
mente expressa, principalmente em músculo es
quelético e neurônios do sistema nervoso central e
periférico. Ela é ativada pela ligação com calmodu
lina, e o NO produzido atua como um neurotrans
missor e modulador da contratilidade muscular.
• A NOSII éé primariamenteprimariamente encontradaencontrada ememem neutró-neutró-neutró
filos, macrófagos, astrócitos e hepatócitos. Ela é
induzida por citocinas; a calmodulina fica ligada
em condições fisiológicas basais. A NOSII atua na
resposta imune precoce, produzindo NO como um
agente citotóxico contra patógenos.
• A NOSIII é primariamente encontrada em célu
las endoteliais vasculares, ligada à membrana ca
veolar por resíduos de miristoil e palmitoil. Ela é
constitutivamente expressa e ativada por Ca2+. A
NOSIII produz NO como vasodilatador, o qual age
na guanilato ciclase das células musculares lisas
adjacentes, levando por fim à vasodilatação.
prostaglandinas, leucotrienos e retinoides; (3) inativa
ção ou ativação de agentes terapêuticos; (4) conversão
de produtos químicos em moléculas altamente reativas,
que podem produzir dano celular indesejado; (5) inibi
ção ou indução enzimática, resultando em interações
droga–droga e efeitos adversos.
As óxido nítrico sintases são enzimas bidomínios,
consistindo de um domínio contendo heme (ou oxige
nase) ee umum domíniodomínio contendocontendo ��avinaavina (ou(ou(ou redutase).redutase).redutase). Es-Es-Es
sas enzimas catalisam a formação de óxido nítrico, uma
molécula gasosa radical livre muito reativa que funcio
na na neurotransmissão, na regulação hemodinâmica
ou na resposta imune, dependendo do tecido no qual é
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
produzido. Como os citocromos P450, as óxido nítrico
sintases são enzimas contendo heme que catalisam a
monooxigenação
ooxigenação de seus substratos, usando mecanis
mos catalíticos semelhantes. A seguir, serão discutidos
tanto os citocromos P450 como as óxido nítrico sintases
em detalhes, enfocando tanto as semelhanças como as
diferenças entre os dois sistemas.
11.2 CITOCROMOS P450:
PROPRIEDADES E FUNÇÃO
Citocromos P450 são proteínas integrais de mem
brana que contêm um único grupo prostético ferro
protoporfirina IX (heme) (p. 814). O ferro heme dos
citocromos P450 é capaz de formar seis ligações, qua
tro com cada um dos quatro átomos de nitrogênio pir
rólicos do anel porfirínico e dois com ligantes axiais.
Um dos ligantes axiais (chamado proximal) é um
grupo sulfidrila de um resíduo de cisteína localizado
perto da extremidade carboxila da molécula de cito
cromo P450 (Figura 11.1), e o outro sítio para ligação
de ligante (distal) pode estar em aberto (produzindo
um heme penta-coordenado, de alto spin) ou ocupado
por oxigênio, CO, NO ou água (produzindo um heme
hexa-coordenado, de baixo spin). O estado do spin do
heme é uma descrição da ocupação das camadas ele
trônicas d no átomo de ferro, determinado pelo estado
do ligante; estes podem ser diferenciados espectros
copicamente.
FIGURA 11.1 Modelo do sítio ativo do CYP2C5 de
mamífero mostrando o grupo prostético protoporfirina
IX (vermelho) com o ligante cisteína tiolato (amarelo)
ligado ao ferro heme.
O substrato diclofenaco, uma droga anti-in�amatória não-es
teroídica (verde) está no sítio ativo do P450. A hélice-I (púr
pura) atravessa a molécula e é uma das características mais
facilmente identificáveis dos citocromos P450.
Gerado a partir do Protein Data Bank arquivo INR6, deposi
tado por M. R. Wester, E. F. Johnson e C. D. Stout, usando
WebLab Viewer Lite (Molecular Simulations, Inc.)
Todos os citocromos P450 são moléculas de forma
triangular, muito parecidas com a mostrada na Figu
ra 11.1. Metade da enzima consiste de estrutura em
• 443
a-hélice, e a outra metada é folha-b e outras estrutu
ras; uma longa hélice-I atravessa a enzima, por trás do
heme. Esse arcabouço básico é conservado em todos os
citocromos P450 conhecidos, embora a localização rela
tiva possa diferir e alguns elementos minoritários pos
sam estar faltando. As proteínas de mamíferos contêm
uma sequência N-terminal de ancoragem à membrana
e sequências internas de associação à membrana, que
levam essas proteínas a ficarem profundamente mergu
lhadas na membrana.
Os citocromos P450 são assim chamados em virtude
do espectro de absorção característico, que é produzi
do quando CO é ligado à forma reduzida, ferrosa, do
heme. O espectro apresenta um pico em cerca de 450
nm (Figura 11.2); daí o nome P450 para um pigmento
com uma absorbância a 450 nm. Esse espectro é carac
terístico de uma proteína heme tiolato-ligada. Assim
como o ferro heme da hemoglobina, CO liga-se ao ferro
heme dos citocromos P450 com afinidade muito mais
alta do que o oxigênio e, portanto, é um potente inibidor
de sua função.
A reação geral catalisada por um citocromo P450 é
NADPH + H+ + O2 + SH → NADP+ + H2O + SOH
na qual NADPH é um doador de dois elétrons, e o subs
trato (S) pode ser um esteroide, um ácido graxo, uma
droga ou outro composto químico que tenha um alcano,
um alceno, um anel aromático ou um anel heterocíclico
substituinte que possa servir como sítio de oxigenação.
A reação é uma monooxigenação e a enzima é uma mo
nooxigenase, porque incorpora apenas um dos dois áto
mos de oxigênio ao substrato.
máx 450 nm
400 450 500
Comprimento de onda (nm)
FIGURA 11.2 O espectro de absorbância do citocromo
P450 ligado ao monóxido de carbono.
A forma reduzida do citocromo P450 liga-se ao monóxido de
carbono, produzindo uma absorbância máxima em aproxima
damente 450 nm.
444 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

H3
H3C
H3C
C e H R
11.3 SISTEMAS DE
N C
N C O
TRANSPORTE DE
ELÉTRONS CITOCROMOS NH

P450 O

Os dois elétrons necessários à reação geral da mo

FAD ou FMN
nooxigenase são fornecidos pelo NADPH, mas um pro (oxidado)
blema mecanístico básico é criado porque o NADPH é
um doador de dois elétrons (p. 580). O citocromo P450,
com seu único ferro heme, pode aceitar apenas um elé
tron de cada vez. Esse problema é resolvido pela presen
ça de uma �avoproteína redutase NADPH-dependente,
FAD R
N N C
que aceita dois elétrons do NADPH simultaneamente,
mas transfere os elétrons individualmente ou para uma O

proteína ferro-enxofre intermediária ou diretamente

para o citocromo P450. O grupo redox ativo da �avopro NH
teína é o anel isoaloxazina, que é especialmente apro N C

priado para realizar essa tarefa química, uma vez que Oi

pode existir em estados totalmente oxidados ou em es
à ou FMNÃ
tados reduzidos com um ou dois elétrons (Figura 11.3).
(semiquinona)
A transferência de elétrons do NADPH para o citocromo
P450 é realizada por sistemas de transporte de elétrons
distintos, presentes exclusivamente em mitocôndrias
ou retículo endoplasmático (microssomos).

R H
NADPH-Citocromo P450 Redutase É
N N O
a Flavoproteína Doadora de Elétrons
no Retículo Endoplasmático N
NH

O
A maioria dos citocromos P450 de mamíferos é en
contrada profundamente mergulhada no lado citoplas
mático do retículo endoplasmático (fração microssomal) FADH2
(reduzido)
ou FMNH2
de hepatócitos, de células renais e adrenocorticais, de
células ovarianas e testiculares, e de células do trato res FIGURA 11.3 Anel isoaloxazina de FMN ou FAD em seus
piratório. Cinquenta das 57 isoformas de citocromo P450 estados oxidado, semiquinona (forma reduzida por 1e–)
humanas, são do tipo microssomal. Esses citocromos ou completamente reduzido (reduzido por 2e–).
P450 usam uma única NADPH-citocromo P450 reduta
se, uma proteína periférica de membrana, de 76,6 kDa,
contendo �avina adenina dinucleotídeo (FAD) e �avina
mononucleotídeo (FMN) como grupos prostéticos, para
a entrega de elétrons. A estrutura cristalina da isoforma
humana é apresentada na Figura 11.4. Até a recente ca
racterização das óxido nítrico sintases, a P450 redutase

FMN
FIGURA 11.4 Diagrama em fitas da citocromo P450 redutase
humana baseado em sua estrutura cristalina.

Três domínios são apresentados: o domínio de ligação FMN (azul), o do FAD NADP+
mínio de ligação FAD/NADPH (verde) e o domínio de conexão interme
diária (púrpura). Cofatores são mostrados em modelos hastes-e-bolas:
azul,FMN; amarelo, FAD; vermelho, NADP+. A figura foi reproduzida
utilizando-se o programa Molscript (Kraulis, P. J. Molscript: A programs
to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J.
Appl. Cryst. 24:946, 1991). Generosamente fornecida pelo Dr. Jung-Ja
P. Kim, Professor Titular de Bioquímica, Medical College of Wisconsin,
antes da publicação.
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 445

era a única �avoproteína de mamífe Adenina

ros que se sabia conter ambos FAD e Ribose Citocromo P450
FMN. O NADPH doa elétrons para Fosfato Redutase
Fosfato
o resíduo de FAD da P450 redutase,
Ribitol
e a FMN funciona como a �avina de Citocromo b5
2e- O
N N -
CH3 1e Fosfato
?
saída, transferindo dois elétrons, um NADPH
N CH3
N Ribitol C N C
de cada vez, para o citocromo P450. O N N N Fe N
[FAD] H3C O CCN
Como uma única molécula de �avi N 1e-
H3C N
na pode existir em formas reduzidas O
C N C
[FMN]
com um ou dois elétrons, e duas mo N Fe+3 N
léculas de �avina estão ligadas por C N C
molécula de redutase, a enzima pode
receber elétrons do NADPH e arma
zená-los entre as duas moléculas de
Citocromo P450
�avina antes de transferi-los para um
dos numerosos citocromos P450 mi
crossomais (Figura 11.5).
FIGURA 11.5 Componentes do sistema citocromo P450 de retículo
O mecanismo geral pelo qual os endoplasmático (microsomal).
citocromos P450 catalisam a mo A NADPH-citocromo P450 redutase é ligada, por sua cauda hidrofóbica, à membrana
nooxigenação de seus substratos é (uma proteína periférica), enquanto o citocromo P450 fica profundamente mergulhado
na membrana (uma proteína integral). Também é mostrado o citocromo b5, que pode
apresentado na Figura 11.6. O ciclo participar de algumas das reações mediadas pelo citocromo P450.
da reação é iniciado pela ligação do
substrato ao heme na forma nativa,
de baixo spin, hexa-coordenada, férrica do heme, con O oxigênio pode se ligar agora ao heme ferroso, e a
vertendo-a no heme de alto spin, penta-coordenado, segunda transferência de elétrons é facilitada. Subse
férrico. O primeiro elétron pode ser transferido para quentemente, oxigênio molecular é ativado e clivado;
o heme, reduzindo-o para a forma de alto spin, penta um átomo é inserido no substrato (monooxigenação),
-coordenada, ferrosa, só depois do substrato ter sido e o outro se combina com dois prótons e dois elétrons
ligado. Elétrons não podem ser transferidos para o para formar H2O.
heme na ausência de substrato porque o potencial de
redução do heme (–300 mV) neste estado é mais ele A ligação do P450 e da redutase entre si é eletros
tronegativo do que o do resíduo de FMN (–270 mV), tática, e não hidrofóbica, e os níveis de P450 excedem
tornando tal transferência termodinamicamente des os de redutase no fígado por uma razão de 10:1 a 20:1.
favorável. Quando o substrato se liga, há uma mudança Se um P450 específico tiver uma afinidade maior para
conformacional na estrutura da proteína em torno do associação com a redutase, os elétrons �uirão preferen
ferro heme, e o potencial de redução do heme torna-se cialmente para esses P450s. Consequentemente, P450s
mais positivo (–230 mV), permitindo assim que o ferro com menores afinidades devem ter mecanismos que
heme do P450 seja reduzido (Figura 11.6). permitam a eles receberem elétrons. Em alguns casos, a

Produto (SOH)
NADPH
2e Substrato (S) H2O (2nd)
e Potenciais Redox (mV)
[FAD FMN] [FMN
NADPH –FAD] P450 do retículo endoplasmático
Citocromo
Redutase
P450 P450-Fe P450-Fe
(Oxidado)
3+ P450-Fe3+
S O–– 2e
NADPH −324
– 2 Citocromo
Redutase
P450 FAD −290
FMN −270
P450 heme −300
(1st)
e S 3+ Ciclo do P450-Fe3+ –
Citocromo P450 S O–
– 2
P450 heme
+ substrato −230

P450-Fe
S 2+ P450-Fe 2+

S O2

O2

FIGURA 11.6 Ciclo de reações do citocromo P450.

O diagrama mostra a ligação do substrato, a transferência do dutase e a ligação de O2. Os potenciais de redução dos vários
primeiro e do segundo elétron da NADPH-citocromo P450 re componentes também são mostrados.
446 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
ligação de substrato aumenta tanto a afinidade quanto
a taxa de associação do complexo P450/redutase; esse
mecanismo faz sentido porque um P450 “vazio” mono
polizando a redutase seria não-produtivo.
Em algumas reações, a transferência do segundo
elétron pode não ser diretamente da P450 redutase,
mas pode ocorrer a partir do citocromo b5, uma peque
na heme-proteína (15,2 kDa) que pode ser reduzida
pela P450 redutase ou por outra �avoproteína ligada ao
micromosso, a NADH-citocromo b5 redutase. Algumas
reações catalisadas por citocromos P450 específicos re
querem citocromo b5 para atividade enzimática ótima,
possivelmente porque o citocromo b5: (1) altera a afini
dade da interação P450/redutase, (2) altera a afinidade
do P450 por um substrato em particular, ou (3) aumen
ta a taxa de transferência do segundo elétron para o
heme P450.
NADPH-Adrenodoxina Redutase É a
Flavoproteína Doadora de Elétrons
em Mitocôndrias
Os citocromos P450 mitocondriais são encontrados
na membrana interna das mitocôndrias e estão envol
vidos em reações de hidroxilação de esteroides. Sete
das 57 isoformas humanas são desse tipo. Esse siste
ma de transferência de elétrons requer duas proteínas
adicionais, a NADPH-adrenodoxina redutase (51 kDa),
que contém um único grupo prostético FAD, e adreno
doxina, uma proteína ferro-enxofre de 12,5 kDa, para
formação de produto (Figura 11.7). A adrenodoxina re
dutase fica só fracamente associada com a membrana
mitocondrial interna e não pode transferir diretamen
te nem o primeiro nem o segundo elétron para o ferro
Adrenodoxina
Redutase Adenina 3+ 1e-
Fe –S
Ribose
Fosfate
Fosfate 1e-
Ribitol
N N
2e- H C
3
O
NADPH C N C
H C N
3 N
N Fe N
[FAD] O
C N C
Citocromo P450
FIGURA 11.7 Componentes do sistema citocromo P450 mitocondrial.
Citocromo P450 é uma proteína integral da membrana mitocondrial interna. A NA
DPH-adrenodoxina redutase e a adrenodoxina são proteínas periféricas, não mer
gulhadas na membrana.
heme do citocromo P450. Uma segunda proteína, adre
nodoxina, que também fica fracamente associada com
a membrana mitocondrial interna, contém um grupo
ferro-enxofre que serve de centro redox para essa molé
cula e funciona como uma lançadeira de elétrons entre
o FAD da adrenodoxina redutase e o ferro heme de um
citocromo P450 mitocondrial. Uma molécula de adreno
doxina recebe um elétron da sua �avoproteína redutase
mitocondrial e interage com uma segunda adrenodoxi
na, que depois transfere seu elétron para um citocromo
P450 específico. Componentes do sistema citocromo
P450 mitocondrial são sintetizados no citosol como pre
cursores de maior peso molecular, transportados para
dentro da mitocôndria, e processados por proteases em
proteínas maduras de menor peso molecular.
11.4 CITOCROMO P450:
NOMENCLATURA E
ISOFORMAS
Em virtude do grande número de citocromos P450
que foram identificados (mais de 7.000 até fevereiro
de 2008), um sistema de classificação das enzimas em
grupos funcionais e nomenclatura teve de ser desenvol
vido. O sistema escolhido é baseado em classificação
de acordo com a identidade relativa das sequências de
aminoácidos das enzimas. A superfamília dos citocro
mos P450 é, assim, dividida inicialmente em famílias,
nas quais a identidade da sequência de aminoácidos dos
membros é superior a 40%. A família é designada pelo
prefixo “CYP”, em referência a cytochrome P450, segui
do por um numeral arábico (por exemplo, CYP1, CYP2,
CYP3 etc.). As famílias são ainda divididas em subfamí
lias, nas quais a identidade das sequências de amino
ácidos dos membros é superior a 55%.
Adrenodoxina
A subfamília é identificada por uma
letra maiúscula adicional (por exem
plo, CYP1A, CYP1B, CYP1C etc.). Os
membros individuais de cada subfamí
2+
Fe –S lia são, então, numerados na ordem em
-
1e que foram identificados (por exemplo,
CYP1A1, CYP1A2, CYP1A3 etc.). Embo
ra os citocromos P450 sejam enzimas, os
termos isoenzima ou isozima não são
3+
usados para descrever essas proteínas;
em vez disso, é usado o termo forma ou
isoforma.
As Tabelas 11.1 e 11.2 relacionam
as isoformas conhecidas de P450 hu
manos. Há 57 isoformas divididas em
18 famílias e 41 subfamílias. O genoma
humano também codifica 58 pseudo
genes CYP, que não formam proteína
ativa. A Tabela 11.1 lista as isoformas
que utilizam primariamente compostos
exógenos, isto é, drogas e xenobióticos;
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 447

TABELA 11.1 Citocromos P450 Humanos Envolvidos no Metabolismo Exógeno

Família Isoformas Substrato(s) Selecionado(s)
Inibidor(es) Indutor(es)
CYP Selecionado(s) Selecionado(s)
1 1A1 Benzo(a)pireno, diclofenaco Cetoconazol Benzo(a)pireno
1A2 Benzo(a)pireno, warfarina Cipro�oxacina Erva de São João
1B1 Benzo(a)pireno, a�atoxina B1 Tamoxifeno NCa

2 2A6 Acetaminofen, nicotina Canabidol Dexametasona

2A7 NC NC NC
2A13 Hexametilfosforamida NC NC
2B6 Diazepam, mefenitoína Cetoconazol Rifampicina
2C8 Taxol, ibuprofen, verapamil Quinina Fenobarbital
2C9 Amitriptilina, naproxen Sulfafenazol Rifampicina
2C18 Imipramina, metadona NC Rifampicina
2C19 Diazepan, omeprazol Isoniazida Rifampicina
2D6 Fluvastatina, codeína, risperidona Quinidona Dimetilsulfóxido
2E1 Acetaminofen, halotano Agrião Isoniazida, etanol
2F1 Naftaleno, estireno NC NC
2J2 Bufuralol NC NC
2R1, 2S1 NC NC NC
2U1,2W1 NC NC NC
3 3A4 Eritromicina, nifedipina, codeína, cetoconazol
Troleandomicina, Cortisol, rifampina,
warfarina, terfenadina fenobarbital
3A5 Verapamil, prevastatina NC Dexametasona
3A7 Ácido retinoico, codeína, cortisol DHEA NC
3A43 Testosterona NC NC
aNC, não bem caracterizado.

cada isoforma metabiliza uma ampla variedade de subs
tratos. A Tabela 11.2 lista as isoformas envolvidas no
metabolismo de compostos endógenos; essas isoformas
geralmente reconhecem apenas um ou dois substratos
específicos, e estes são apresentados na tabela.
11.5 CITOCROMOS P450:
SUBSTRATOS E FUNÇÕES
FISIOLÓGICAS
Citocromos P450 metabolizam uma variedade de
compostos lipofílicos de origem endógena ou exógena.
Como mostrado na Figura 11.8, os citocromos P450 po
dem catalisar a hidroxilação do átomo de carbono de
um grupo metil, a hidroxilação do carbono metileno de
um alcano, a hidroxilação de um anel aromático para
formar um fenol, ou a adição de um átomo de oxigênio
em uma dupla ligação para formar um epóxido. Tam
bém podem catalisar reações de desalquilação, nas
quais grupos alquila ligados a átomos de oxigênio, ni
trogênio ou enxofre são removidos. Oxidação de átomos
de nitrogênio, enxofre e fósforo e reações de desaloge
nização também são catalisadas por formas de citocro
mos P450.
Tanto substratos endógenos e como exógenos são
metabolizados por citocromos P450. Os substratos en
dógenos incluem colesterol, esteroides, prostaglandi
nas e ácidos graxos. Nesses casos, as reações são mais
estéreo- e região-específicas, e os citocromos P450 se
ligam apenas a substratos específicos. Substâncias exó
genas (xenobióticos, significando “estranhos à vida”)
incluem muitas drogas, compostos químicos, contami
nantes ambientais e aditivos alimentares. Os citocro
mos P450 desse grupo são menos discriminativos entre
os substratos e oxidam esses compostos primariamente
lipofílicos (hidrofóbicos) para torná-los mais solúveis
em água (hidrofílicos) para excreção.
448 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

TABELA 11.2 Citocromos P450 Humanos Envolvidos no Metabolismo Endógeno

FamíliaCYP Isoformas Substrato(s)
Atividade

4 4A11 Ácidos graxos w-Hidroxilase

4B1 Ácido araquidônico 12-Hidroxilase
4F2 Ácido araquidônico, leucotrieno B4 w-Hidroxilase
4F3 Leucotrieno B4 w-Hidroxilase
4F8 Ácido araquidônico, prostaglandinas 18-Hidroxilase
4F12 Ácido araquidônico w-Hidroxilase
4A22, 4F11, 4F22, 4V2, 4X1, 4Z1 Desconhecido Desconhecida
5 5A1 Prostaglandina H2 Tromboxane A2 sintase
7 7A1 Colesterol 7-a-Hidroxilase
7B1 Pregnenolona, de-hidroepiandrosterona 7-a-Hidroxilase
(DHEA)
8 8A1 Prostaglandina H2 Prostaciclina sintase
8B1 Esteróis 12-a-Hidroxilase
11 11A1 Colesterol Clivagem de cadeia lateral
11B1 11-Desoxicortisol, 11-desoxicorticosterona 11-b-Hidroxilase
11B2 Corticosterona 18-Hidroxilase
17 17A1 Pregnenolona, progesterona 17-a-Hidroxilase
17-hidroxipregnenolona, 17-hidroxiproges 17-20-Liase
terona
19 19A1 Androstenediona, testosterona Aromatase
20 20A1 Desconhecido Desconhecida
21 21A2 Progesterona, 17-hidroxiprogesterona 21-Hidroxilase
24 24A1 25-Hidroxi vitamina D3 24-Hidroxilase
26 26A1 Ácido retinoico 4-Hidroxilase
26B1 Ácido retinoico Desconhecida
26C1 Desconhecido Desconhecida
27 27A1 Esterol 27-Hidroxilase
Vitamina D3 25-Hidroxilase
27B1 Vitamina D3 1-a-Hidroxilase
27C1 Desconhecido Desconhecida
39 39A1 24-Hidroxicolesterol 7-Hidroxilase
46 46A1 Colesterol 24-Hidroxilase
51 51A1 Lanosterol 14-a-Desmetilase

Citocromos P450 Participam da no córtex adrenal e nos órgãosórgãos sexuais.sexuais. AmbosAmbosAmbos ososos sis-sis-sis
temas de citocromos P450, mitocondrial e microssomal
Síntese de Hormônios Esteroides (retículo endoplasmático), sãosão necessáriosnecessários parapara conver-conver
e da Oxigenação de Compostos ter colesterol em aldosterona e cortisol no córtex adre
nal, testosterona nos testículos, e estradiol nos ovários.
Endógenos Os citocromos P450 são responsáveis por várias
A importância das reações catalisadas por citocro etapas da síntese adrenal de aldosterona, o mineralo
mos P450 com substratos endógenos é ilustrada pela corticoide responsável por regular o equilíbrio de sal
síntese dos hormônios esteroides a partir de colesterol, e água, e cortisol, o glucocorticoide que governa o me
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 449

tabolismo de proteínas, carboidratos e lipídeos. Além O cortisol é sintetizado a partir de pregnenolona

disso, os citocromos P450 da adrenal catalisam a sín
tese de pequenas quantidades do andrógeno andros
tenediona, um regulador de características sexuais
secundárias e precursor tanto de estrógeno quanto de
testosterona. A Figura 11.9 apresenta um resumo des
sas vias.
Nas mitocôndrias da adrenal, um citocromo P450
(CYP11A1) catalisa a reação de clivagem da cadeia la
teral, convertendo colesterol em pregnenolona, uma
etapa de comprometimento na biossíntese de esteroi
des. Essa reação envolve a hidroxilação sequencial dos
átomos de carbono 22 e 20, produzindo 22-hidroxico
lesterol e, depois, 20,22-di-hidroxicolesterol, respecti
vamente (Figura 11.10). CYP11A1 então cliva a ligação
carbono-carbono entre C20 e C22, para produzir preg
nenolona, um esteroide de 21 carbonos. Essa sequência
de reações requer três moléculas de NADPH e três de
O2, e é catalisada inteiramente por CYP11A1.
A pregnenolona é produzida nas mitocôndrias, mas
é levada para o citosol onde é oxidada pela 3-b-hidro
xiesteroide desidrogenase D4,5-isomerase a progestero
na. A progesterona é hidroxilada na posição C21 do nú
cleo esteroide a desoxicorticosterona (DOC) pelo P450
microssomal CYP21A2. A DOC é subsequentemente
hidroxilada em C11 pelo P450 mitocondrial CYP11B1
para formar corticosterona, que pode depois ser hidro
xilada por outra enzima citocromo P450 mitocondrial,
CYP11B2, em C18, para formar o mineralocorticoide al
dosterona (Figura 11.9).
ou progesterona, começando com a hidroxilação de
C17 pelo P450 microssomal CYP17A1. Hidroxilação em
C21 de 17a-hidroxiprogesterona por CYP21A2 produz
11-desoxicortisol, que é transportado para dentro da
mitocôndria, onde é mais hidroxilado por CYP11N1 em
C11, formando cortisol (Figura 11.9). Deficiências con
gênitas resultantes de mutações no gene que codifica
CYP21A2 são discutidas na Correlação Clínica 11.1.
A sínteseíntese dede esteroidesesteroidesoides contendocontendocontendo 191919 átomosátomosátomos dedede car-car-car
bono, a partir de 17a-hidroxipregnenolona ou 17a-hidro
xiprogesterona, prossegue com a perda do grupo acetil
em C17. Essa reação de desacetilação é catalisada por
CYP17A1 (via reação catalisada por uma 17,20-liase),
o mesmo citocromo P450 que hidroxila esteroides em
C17. Os fatores que determinam se esse citocromo
P450 faz apenas uma etapa de hidroxilação, produ
zindo o produto 17-hidroxi, ou prossegue para clivar
a ligação C17-C20, não foram determinados, embora a
presença de citocromo b5 em tecidos gonadais pareça
permitir que CYP17A1 catalise a reação de clivagem.
Os produtos formados após a remoção do grupo ace
til são des-hidroepiandrosterona (DHEA), a partir de
17a-hidroxipregnenolona, ou androstenediona, a par
tir de 17a-hidroxiprogesterona. DHEA pode ser desi
drogenado no grupo 3-OH a androstenediona, um po
tente esteroide androgênico que serve como precursor
imediato de testosterona.
Os estrógenos são sintetizados a partir dos andró
genos, em uma reação chamada aromatização, porque

Hidroxilação Alifática
R—CH2—CH3 R—CH2—CH2—OH
R—CH2OH—CH3

Hidroxilação Aromática

R R OH

Epoxidação
R—CH2
R CH2—CH3 R R—CH—CH—CH3
O
O

Reações de Desalquilação
N-desalquilação
R—CH2—CH2—NH—CH3 R—CH2—CH2—NH—CH2OH R—CH2—CH2—NH2 + HCHO
O-desalquilação
R—CH2—CH2—O—CH3 R—CH2—CH2—O—CH2OH R—CH2—CH2—OH + HCHO
S-desalquilação
R—CH2—CH2—S—CH3 R—CH2—CH2—S—CH2OH R—CH2—CH2—S + HCHO

N-Oxidation Reactions
Aminas Primárias
Aminas
R—CH2—CH2—NH2 R—CH2—CH2—NH—OH
Secundárias
R—CH2—CH2—NH—CH3 R—CH2—CH2—NOH—CH3
O
Sulfoxidação
R—CH2—S—CH2R R—CH2—S—CH2R
FIGURA 11.8 Reações
Desalogenização comuns catalisadas por
F3C—CHBrCl F3C—COOH + HCl + HBr citocromos P450.
450 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Colesterol

CYP11A1

Pregnenolona 17-OH-Pregnenolona De-hidroepiandrosterona

CYP17A1 CYP17A1

3-β-HSD 3-β-HSD 3-β-HSD

Progesterona 17-OH-Progesterona Androstenediona Estrona

CYP17A1 CYP17A1 CYP19A1

CYP21A2 CYP21A2 17-β-HSD 17-β-HSD

11-Deoxicorticosterona 11-Deoxicortisol Testosterona Estradiol

CYP19A1

Corticosterona
CYP11B1 CYP11B1

Cortisol

CYP11B2

18-OH-Corticosterona

CYP11B2

Aldosterona

FIGURA 11.9 Síntese de hormônios esteroides na glândula adrenal.

Os citocromos P450 envolvidos são CYPs 11A1, 11B1 e 11B2 nas endoplasmático (azul). As outras enzimas mostradas, 3-b-HSD e
mitocôndrias (vermelho) e CYPs 17A1, 19A1 e 21A2 no retículo 17-b-HSD, são hidroxiesteroide desidrogenases.

um anel aromático é produzido no anel A do esteroide
produzido. Nessa reação complexa, múltiplas reações
de hidroxilação são catalisadas por uma única enzima
citocromo P450, CYP19A1 ou aromatase, para formar o
anel aromático com a remoção do grupo metil em C19.
A Figura 11.11 detalha a reação de aromatização. Duas
reações sequenciais de hidroxilação no metil C19 resul
tam na introdução de um grupo aldeído. A etapa final
pode envolver um ataque peroxidativo em C19, com a
perda do grupo metil e a eliminação do átomo de hi
drogênio, para produzir o anel aromático. Todas as três
reações de hidroxilação são catalisadas por CYP19A1.
A complexidade da produção de hormônios esteroides
durante a gestação e o papel das formas de P450 são
ilustrados na Correlação Clínica 11.2.
Citocromos P450 também metabolizam outros com
postos endógenos que estão envolvidos em processos
fisiológicos e, assim, regulam sua atividade. Por exem
plo, o ácidoácido araquidônicoaraquidônico éé metabolizadometabolizado porpor citocro-citocro
mos P450 para formar ácidos 19- e 20-hidroxieicosa
tetraenoicos (HETEs), ácidos epoxieicosatetraenoicos
(EETs) e ácidos di-hidroxieicosatetraenoicos (DiHE
TEs). Esses metabólitos funcionam na regulação dos
sistemas vascular, renal, pulmonar e cardíaco e nas res
postas in�amatória e de crescimento. 20-HETE, forma
do no metabolismo do ácido araquidônico por CYP4As
e CYP4Fs no homem, é um potente vasoconstritor. Os
EETs, formados por CYP1A, 2B, 2C e 2J no homem, são
vasodilatadores derivados do endotélio. Os CYP4As
também catalisam a hidroxilação de prostaglandinas e
ácidos graxos, ativando ou inativando esses importan
tes fatores regulatórios.
Citocromos P450 produzem metabólitos vitais para
a manutenção da homeostase em outros sistemas tam
bém. O CYP7A1 catalisa a primeira etapa, e limitante
da velocidade, da síntese de ácidos biliares no fígado
(p. 747 e 1078). No fígado, o CYP27B1 catalisa a 1-hi
droxilação da 25-hidroxi-vitamina D3, formada no rim,
para produzir o metabólito 1,25-di-hidroxi, que é a for
ma ativa desse hormônio, importante no desenvolvi
mento e na manutenção dos ossos (p. 1094), enquanto
CYP24A1 está envolvido na degradação ou na inativa
ção de metabólitos da vitamina D. No sistema imune, o
leucotrieno B4 é um agente quimioatrativo de leucóci
tos polimorfonucleares, que é hidroxilado por CYP4F3
para o menos ativo 20-hidroxileucotrieno B4, vital na
inativação da resposta imune. O ácido retinoico é meta
bolizado por CYP26A1 no derivado 4-hidroxi, que pode
ter maior atividade do que o ácido retinoico em certos
órgãos, onde desempenha um papel no ciclo celular e
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 451

21 CH3 20 22

CH3
Citocromos P450 Oxidam Substratos
CH3 Lipofílicos Exógenos
CH3 CH3 Os substratos exógenos metabolizados por citocro
mos P450 incluem drogas terapêuticas, agentes quí
micos usados em locais de trabalho, subprodutos in
HO dustriais que se tornam contaminantes ambientais e
Colesterol (C-27)
aditivos alimentares. Os citocromos P450 humanos en
volvidos no metabolismo xenobiótico são apresentados
NADPHO2 na Tabela 11.1, p. 448. Esses citocromos P450 apresen
tam ampla especificidade de substrato, oxidando uma
OH
CH3
enorme variedade de xenobióticos, particularmente
CH3
compostos lipofílicos. A adição de um grupo hidroxila
CH3
torna o composto mais polar e, assim, mais solúvel no
ambiente aquoso da célula. Muitos compostos exógenos
CH3 CH3 são muito lipofílicos e se acumularão dentro de células
ao longo do tempo, potencialmente interferindo com a
função celular, a menos que sejam metabolizados em
HO produtos mais hidrofílicos.
22-Hidroxicolesterol Estima-se que CYP3A4 metabolize aproximadamen
te 50% das drogas terapêuticas, CYP2D6 aproximada
NADPHO2
mente 20%, CYP2C9 e 2C19 aproximadamente 15%,
OH e CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 e outros metabolizem os
CH3 restantes 15% das drogas. CYP3A4 é o principal P450
CH3 que metaboliza drogas no homem. Está presente no
CH3 OH
trato gastrointestinal e no fígado, e é responsável pela
baixa biodisponibilidade oral de muitas drogas. Como
CH3 CH3
os citocromos P450 têm tais amplas especificidades de
substratos, um composto pode ser metabolizado por
mais de uma isoforma de citocromo P450 e/ou em dife
HO
rentes locais, como mostra a Figura 11.12 para o com
20,22-Di-hidroxicolesterol posto diazepam.

NADPHO2 Drogas e xenobióticos são metabolizados primaria

mente por duas vias, Fase I (reações de funcionalização
CH3
oxidativa) e Fase II (reações biossintéticas). Podem ser
C O metabolizados por qualquer uma das duas vias ou por
CH3
ambas. No metabolismo de Fase I, um grupo funcional
como um grupo hidroxila é introduzido em ou exposto
CH3 na droga pelo citocromo P450 (entre outras enzimas;
Tabela 11.3). As enzimas do metabolismo de Fase II,
em muitos casos, então ligam esse grupo funcional com
HO
uma espécie endógena como ácido glucurônico, sulfato,
Pregnenolona (C-21)
glutationa, aminoácidos ou acetato. O resultado final de
+ qualquer uma ou de ambas as modificações é tornar o
H3C composto estranho mais solúvel em água e, assim, facili
CHCH2 H
CH2 C O tar a excreção, geralmente pelos rins, mas também pelos
H3C intestinos, via excreção na bile. Citocromos P450 estão
Aldeída Isocaproico envolvidos no metabolismo de Fase I, mas não de Fase
II. Exemplos gerais de enzimas que metabolizam xeno
FIGURA 11.10 Reação de quebra da cadeia lateral do
bióticos e suas reações são apresentados na Tabela 11.3.
colesterol.
Três reações sequenciais são catalisadas por CYP11A1 para
O metabolismo de xenobióticos por citocromos P450
produzir pregnenolona e aldeído isocaproico.
pode ter um de três efeitos sobre o composto: inativa
ção, ativação ou formação de um metabólito tóxico.
na sinalização. A Tabela 11.2 lista os citocromos P450 Na inativação, a forma ativa de uma droga é conver
humanos que metabolizam substratos endógenos e de tida em uma forma inativa, portanto diminuindo sua
talha suas especificidades de substrato e funções. biodisponibilidade ou, no caso de xenobióticos danosos,
452 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.1
Hiperplasia Adrenal Congênita: Deficiência de CYP21A2
O córtexcórtex adrenal,adrenal, umum locallocal importanteimportante dede produ-produ
ção de hormônios esteroides durante a vida fetal e
adulta, é metabolicamente mais ativo na vida fetal e
pode produzir 100-200 mg de esteroides por dia, em
comparação com os 20-30 mg produzidos por dia na
glândula adrenal adulta não-estressada. Deficiências
enzimáticas foram relatadas para todas as etapas da
produção de cortisol. As doenças associadas com a
produção insuficiente de cortisol são chamadas hi
perplasias congênitas da adrenal (CAH). A deficiência
enzimática mais comum em CAH é no CYP21A2, uma
21-hidroxilase, resultando na incapacidade de meta
bolizar 17α-hidroxiprogesterona a 11-desoxicortisol,
que é convertido por CYP11B1 em cortisol. Como não
há cortisol suficiente, a secreção de ACTH, o hormô
nio da pituitária que regula a produção de cortisol,
aumenta. Períodos prolongados de níveis elevados de
ACTH causam hiperplasia da adrenal e uma produção
aumentada dos hormônios androgênicos des-hidroe
piandrosterona (DHEA) e androstenediona.
Problemas clínicos aparecem porque a produção
adicional de esteroides androgênicos causa virilização
em fêmeas, desenvolvimento precoce de órgãos se
xuais em machos pré-púberes, ou doenças relaciona
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.2
Produção de Hormônios Esteroides Durante a Gestação
Citocromos P450 desempenham um papel impor
tante na síntese de estrógenos. Durante a gestação, é
necessária uma interação singular entre os citocromos
P450 em diferentes órgãos para sintetizar as grandes
quantidades necessárias. A produção de hormônios
esteroides aumenta drásticamente e, a termo, chega a
15-20mg de estradiol, 50-100 mg de estriol e, aproxima
damente, 250 mg de progesterona por dia, quantidades
que são 1.000 vezes maiores do que as produzidas por
mulheres em pré-menopausa, não-gestantes.
O corpo lúteo do ovário é o principal local de produ
ção de estrógeno nas primeiras semanas de gestação,
mas em aproximadamente quatro semanas de gestação,
a placenta começa a sintetizar e secretar progesterona
e estrógenos. Após 8 semanas de gestação, a placenta
torna-se a fonte dominante de síntese de progesterona.
A placenta humana não tem CYP17, que catalisa tanto a
reação de 17α-hidroxilação como a clivagem da ligação
C17-20 e, assim, não pode sintetizar estrógenos a partir
de colesterol. A placenta, entretanto, pode catalisar a
das a desequilíbrio salino, em decorrência dos níveis
diminuídos de aldosterona. Consequências clínicas
de deficiência grave de 21-hidroxilase podem ser re
conhecidas ao nascimento, particularmente em me
ninas, porque a produção excessiva de esteroidesoides an-an
drogênicos pode causar o desenvolvimento irregular
e óbvio de sua genitália. Em recém-nascidos do sexo
masculino, uma deficiência na atividade da 21-hidroxi
lase pode não ser detectada, porque a genitália mascu
lina parece normal, mas ocorrerão masculinização e
desenvolvimento físico precoces um pouco mais tarde.
Na CAH de início tardio, os sintomas clínicos podem
variar consideravelmente, desde o desenvolvimento
precoce de pelos pubianos, fusão precoce das placas
epifisárias de crescimento, causando parada prematu
ra de crescimento, ou padrões de calvície masculina
em mulheres.
Donohoue, P. A., Parker, K. e Migeon, C. J. Congenital
adrenal hyperplasia. Em: Scriver, C. S., Beaudet, A. L., Sly W.
S., and Valle, D. (Eds.), The Metabolic and Molecular Bases
of Inherited Disease. New York; McGraw-Hill, 7. ed., Vol. 2,
1995, Capítulo 94, p. 2929; e e White, P. C. e Speiser, P. W.
Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase defi
ciency. Endocrine Reviews. 21: 245, 2000.
reação de clivagem da cadeia lateral, formando preg
nenolona a partir do colesterol, e oxida pregnenolona a
progesterona, que é secretada na circulação materna.
Como, então, a placenta produz estrógenos, se não pode
sintetizar DHEA ou androstenediona a partir de pro
gesterona? A glândula adrenal fetal, um órgão esteroi
dogênico muito ativo, catalisa a síntese de DHEA a par
tir de colesterol e libera na circulação fetal. Uma grande
parte da DHEA fetal é metabolizada pela adrenal e pelo
fígado fetais em 16α-hidroxi-DHEA, que é convertida
por CYP19, na placenta, no estrógeno estriol. Essa é
uma demonstração elegante da cooperatividade entre
os sistemas de hidroxilação mediados por citocromo
P450 nos sistemas orgânicos fetal e materno, levando
à formação progressiva de estrógenos durante o desen
volvimento gestacional.
Cunningham, F. G., MacDonald, P. C., Gant, N. F., Leveno,
K. J., et al. The placental hormones. Em: Willians Obstetrics,
20. ed. East Norwalk, CT: Appleton & Lange, 1997, Capítulo
6, p. 125.
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 453

OH diminuindo os efeitos deletérios em potencial (por

exemplo, fenobarbital). Diazepam (nome comercial
Valium, prescrito como sedativo), por exemplo, é me
tabolizado por CYPs 2C19 (N-desalquilação) e 3A4 (hi
O droxilação) no biologicamente inativo oxazepam (Figu
Testosterona ra 11.12), que depois passa por conjugação de Fase II
com ácido glucurônico, antes da eliminação.
Enolização

OH
CH3
O
Diazepam (Valium) N
Ativo

HO Cl N

CYP
HO19A1 O2

OH
NO
CYP2C19 CYP3A4

CH3
H N O

HO
OH
19-Hidroxi
Cl N Cl N
CYP 19A1 O2
Nordazepam Temazepam
OH

HO OH
CYP3A4 CYP2C19
HNO
HO
OH
H2O Cl N
OH
Oxazepam
O Inativo

HO FIGURA 11.12 O metabolismo do diazepam pelos

19-Oxo citocromos P450 3A4 e 2C19.
O diazepam pode ser metabolizado por mais de um P450. Os
Fe3+ – OOH
CYP 19A1 metabólitos formados a partir de um composto serão afetados
pela quantidade da forma P450 expressa nos tecidos.
OH
OFe
OHO Outras drogas são biologicamente inativas, até que
sejam metabolizadas por um citocromo P450 em uma
forma biologicamente ativa. A droga terfenadina (nome
HO comercial Seldane, um antagonista do receptor de
CYP 19A1 histamina H1 prescrito para alergias sazonais) é uma
Fe3+–OH HCOOH forma inativa de uma droga, ou uma pró-droga, que é
OH ativada por hidroxilação sequencial por CYP3A4 em fe
xofenadina, a forma funcional, desejada (Figura 11.13).
Problemas associados com interferência na ativação da
terfenadina são detalhados na Correlação Clínica 11.3.
HO
Além de ativação ou inativação de xenobióticos, o
Estradiol
metabolismo por citocromos P450 pode causar inadver
FIGURA 11.11A sequência de reações levando à tidamente a formação de metabólitos tóxicos. Benzo[α]
aromatização de andrógenos em estrógenos. pireno é um carcinógeno fraco produzido a partir da
Adaptado de Graham-Lorence, S., Amarneh, B., White, R. E., queima de carvão, combustão de materiais em produ
Peterson, J. A. e Simpson, E. R. A three dimensional model of tos de tabaco, do preparo de alimentos em churras
aromatase cytochrome P450. Protein Science 4:1065, 1995. queira e de processamento industrial. É convertido
454 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

TABELA 11.3 Reações e Enzimas que Metabolizam Xenobióticos

Tipo de Reação Nome Geral da Enzima
Oxidação Desidrogenases
Monooxidases contendo
�avina (FMO)
Monoamina oxidases
Citocromo P450
Redução Aldeído e cetona redutases
Azoredutases
Quinona redutases
Hidrólise Epóxido hidrolases
Carboxiesterases
Amidases
Conjugação N-acetiltransferases
UDP-glucuronosil
transferases
Sulfotransferase
Metiltransferases
Glutationa S-transferase
Reação Enzimática Geral
Oxidação de grupos álcool ou aldeído
Oxidação de aminas primárias, secundárias e terciárias,
nitronas, tioéteres, tiocarbamatos e fosfinas.
Remoção de uma amina por deaminação oxidativa.
Ver Tabelas 11.1 e 11.2 e Figura 11.7 para reações catalisadas por
enzimas P450
Redução de grupo carbonila em um grupo hidroxila
Redução de grupo azo para formar aminas primárias
Redução de quinonas em hidroquinonas
Adição de água a grupos areno óxido ou epóxido para formar
grupos hidroxila vicinais
Adição de água a uma ligação éster
Adição de água a uma ligação amida
Adição de CoA de acetil-CoA a aminas aromáticas ou a
compostos contendo hidrazinas
Adição de ácido glucurônico de uridina-5!-difosfato (UDP)-ácido
glucurônico a grupos carboxila, fenol, hidroxila alifática, aminas
aromáticas ou alifáticas ou sulfidrila
Adição de grupos sulfato de fosfoadenosil fosfosulfato a grupos
fenol, álcool alifático ou aminas aromáticas
Adição de grupo metil de S-adenosil metionina a compostos
contendo grupos fenol, catecol, aminas alifática ou aromática ou
sulfidrila
Conjugação de compostos contendo heteroátomos eletrofílicos,
íons nitrênio, íons carbânio, radicais livres, epóxido ou grupos
arene óxido

por CYPs 1A1, 1A2 e 1B1 em benzo[a]pireno-7,8-di Metabolismo de terfenadina

-hidrodiol-9,10-epóxido, um carcinógeno muito mais
potente (Figura 11.14). Benzo[a]pireno é convertido na OH Terfenadina
forma 7,8-epóxido por CYP1A1. Hidrólise subsequente HO N (Seldane)
pela epóxido hidrolase forma o derivado hidroxi vicinal
benzo[a]pireno-7,8-di-hidrodiol, e uma segunda rea
ção de epoxidação por CYP1A1 ou 3A4 forma benzo[a]
pireno-7,8-di-hidrodiol-9,10-epóxido, que pode formar CYP3A4
aductos de guanina no DNA, causando impedimento
da função gênica e levando a mutações. A interação
de benzo[a]pireno-7,8-di-hidrodiol-9,10-epóxido com o OH Fexofenadina
gene p53 é uma etapa crítica no mecanismo pelo qual HO N (Allegra)

o benzo[a]pireno é carcinogênico no homem. Benzo[a]

pireno também se liga ao receptor de aril hidrocarbono
(AhR) e induz essas formas de P450, aumentando assim
seu próprio metabolismo.
O acetaminofen, comumente usado como analgésico
e antipirético, é convertido por CYP2E1 em N-acetil
-p-benzoquinonaimina (NAPQI), um composto muito
reativo levando a aductos de proteínas, estresse oxi
dativo e toxicidade. Normalmente, o acetaminofen é
primariamente metabolizado por vias de glucuronida
CO2H
FIGURA 11.13 O metabolismo de terfenadina em
fexofenadina, o composto bioativo.
ção e sulfatação em conjugados polares, inativos, que
são facilmente excretados (Figura 11.5, vias superior e
inferior, respectivamente). O acetaminofen é também
metabolizado por CYP2E1 em um NAPQI muito reativo
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.3
Inibição de Citocromo P450: Interações Droga–Droga e Efeitos Adversos
Os papéis que citocromos P450 desempenham no
metabolismo de drogas e as sérias consequências das
interações droga–droga foram demonstrados com cla
reza para duas drogas, terfenadina (Seldane) e cisapri
da (Propulsid), quando seu metabolismo foi inibido por
outras drogas. Uma pequena porcentagem dos usuários
teve efeitos adversos graves, que forçaram seus fabri
cantes e o Food and Drug Administration (FDA) a di
vulgar avisos de que essas drogas não podem ser toma
das juntamente com outras drogas que inibem CYP3A4.
A gravidade dos efeitos adversos forçou o FDA a remo
ver ambas as drogas do mercado.
O FDA aprovou terfenadina, um anti-histamínico
H1 de segunda geração, em 1985, para tratar alergias
sazonais. A terfenadina é rapidamente metabolizada
no fígado por CYP3A4 em fexofenadina, como mostra
a Figura 11.12, resultando em baixos níveis da droga
original logo depois da ingestão, mas os efeitos tera
pêuticos da terfenadina são realmente causados pela
fexofenadina. Como muitas outras drogas são subs
tratos ou inibidores de CYP3A4, o metabolismo de
terfenadina é potencialmente passível de inibição. In
divíduos que tomaram terfenadina com o antibiótico
macrolídeo eritromicina ou com o agente antifúngico
cetoconazol, ambos fortes inibidores de CYP3A4, apre
sentaram níveis plasmáticos significativamente eleva
dos de terfenadina. Numa pequena porcentagem de
usuários de terfenadina, surgiram problemas cardía
cos sérios, porque a droga parental causou alteração
nos canais cardíacos de potássio e aumentou o risco de
uma taquicardia ventricular rara, chamada Torsade
de Pointes. Alguns indivíduos morreram de problemas
(Figura 11.5, via do meio). A quantidade de acetami
nofen que é metabolizada por CYP2E1 é normalmente
baixa, em comparação com a glucuronidação e a sul
fatação. As pequenas quantidades de NAPQI formadas
são rapidamente conjugadas com glutationa (p. 811) em
um metabólito não-tóxico. Entretanto, se os níveis de
glutationa estiverem baixos, NAPQI escapa da conjuga
ção com glutationa e reage com componentes dos hepa
tócitos, causando lesão celular. Normalmente, os níveis
de CYP2E1 presentes são baixos em comparação com
outras formas de P450, e a produção de NAPQ1, quando
doses normais de acetaminofen são ingeridas, é peque
na. Entretanto, a ingestão de grandes quantidades de
acetaminofen causará um aumento na produção de NA
PQI, o que pode causar lesão hepática grave. Outro fator
na toxicidade hepática induzida por acetaminofen é que
o consumo de bebidas alcoólicas induz CYP2E1, o que
aumenta a produção de NAPQI. Contudo, o álcool tam
bém é um substrato para esse citocromo P450 e inibirá
• 455
cardíacos que se desenvolveram depois que tomaram
terfenadina com eritromicina ou cetoconazol. Como as
propriedades terapêuticas da terfenadina estão asso
ciadas com seu metabólito não-tóxico fexofenadina, o
fabricante testou fexofenadina como um novo medica
mento e buscou aprovação do FDA para esse metabóli
to, agora comercializado como Allegra.
Cisaprida foi aprovado em 1993 para pacientes que
sofrem de azia noturna, que resulta de doença de re
�uxo gastro-esofágico ou GERD. A eliminação des
sa droga do corpo depende do seu metabolismo por
CYP3A4, e quando administrada sozinha ou com ou
tras drogas que não inibem CYP3A4, a droga original
não se acumula no plasma. Entretanto, quando toma
da com outras drogas que são substratos ou inibidores
de CYP3A4, o metabolismo de cisaprida é reduzido e
ela se acumula com as administrações subsequentes.
Em alguns indivíduos, níveis aumentados de cisapri
da causam arritmias cardíacas e, por volta do final de
1999, anomalias de ritmo cardíaco foram relatados em
341 pacientes que tomavam cisaprida, resultando em
80 mortes. Consequentemente, o fabricante da cisa
prida parou de comercializar essa droga nos Estados
Unidos em 2000.
Terfenadine: proposal to withdraw approval of two new
drugs applications and one abbreviated new drug application.
Fed. Reg. 62:1889, 1997. (Esse documento pode ser visto na
página da internet do Federal Register em http://www.ac
cess.gpo.gov/su_docs/aces/aces140.html; e Desta, Z., Sou
khova, N., Mahal, S. K. e Flockhart, D. A. Interactions of cisa
pride with the human cytochrome P450 system: Metabolism
and inhibition studies. Drug Metab. Disp. 28:789, 2000.
o metabolismo de outros substratos de CYP2E1. O grau
de lesão hepática depende do momento e da quantidade
de acetaminofen tomado. Superdosagem de acetamino
fen resulta em mais chamadas dos centros de controle
de envenenamento nos Estados Unidos do que qualquer
outra substância farmacológica. Além disso, de acordo
com a American Liver Foundation, 35% dos casos
envolvendo insuficiência hepática são causados por
envenenamento por acetaminofen. Uma descrição dos
efeitos do álcool sobre o metabolismo de acetaminofen
é apresentada na Correlação Clínica 11.4.
Como exemplificado para benzo[a]pireno e acetami
nofen, o sistema P450 pode produzir metabólitos tóxi
cos. A formação de compostos tóxicos pelo citocromo
P450, entretanto, não significa que ocorrerá lesão celu
lar ou tumor. Outros processos celulares determinarão
a extensão da lesão celular; por exemplo, conjugação
do benzo[a]pireno-7,8-di-hidrodiol-9,10-epóxido pela
456 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

O
HNCCH3

HNCCH3 O
O Glucuronídeo HNCCH3
Benzo[a]pireno

Morte
OP4502
OSulfato
OH
O OO Celular
Proteína
CYP2E1 HNCCH3
OH

GSH
O
HNCCH3
O Acetaminofen NAPQI
Benzo[a]pireneo-7,8-epóxido

epóxido GSH
HNCCH3
O
hidrolase
OH

HO FIGURA 11.15 O acetaminofen pode ser metabolizado pelas

OH enzimas de fase II sulfotransferase e glucuronosil transferase e por
CYP2E1.
Benzo[a]pireno-7,8-di-hidrodiol O metabolismo por CYP2E1 levará à formação de N-acetil-p-benzoquino
naimina (NAPQI). Quando a formação de NAPQI é baixa, NAPQI pode ser
P450 O2
conjugado com glutationa, em um metabólito não-tóxico; entretanto, se
NAPQI se formar em quantidades excessivas, pode escapar da conjugação
com glutationa e reagir com componentes das células hepáticas, causando
lesão celular.
O

tornando a molécula mais polar e/ou mais susceptível

HO
OH
Benzo[a]pireno-7,8-di-hidrodiol-9,10-epóxido
FIGURA 11.14 O metabolismo do benzopireno
por citocromo P450 e epóxido hidrolase para
formar benzopireno-7,8-di-hidrodiol-9,10
epóxido.
glutationa transferase desempenha um papel protetor
chave na inibição da formação do aducto ao DNA e re
duzindo sua atividade carcinogênica. As ações de vários
sistemas enzimáticos de desentoxicação, incluindo rea
ções de conjugação como glucuronidação e sulfatação,
o estado do sistema imune, estado nutricional, pré-dis
posição genética e exposição a vários agentes químicos
ambientais, todos desempenham papéis na determina
ção do grau de lesão celular e toxicidade mediada por
P450. Embora pareça contraprodutivo para os sistemas
de mamíferos possuírem enzimas que potencialmente
criam compostos muito tóxicos, o propósito do sistema
citocromo P450 é adicionar ou expor grupos funcionais,
ao metabolismo por outros sistemas enzimáticos de de
sintoxicação; a criação de metabólitos tóxicos é uma
consequência não-intencional desse processo.
Embora a imensa maioria dos substrados desses
citocromos P450 (Tabela 11.1) sejam compostos exó
genos, algumas funções endógenas foram postuladas.
CYP1A1 e 1A2 parecem estar envolvidos no catabolis
mo do heme e no metabolismo de estradiol, respecti
vamente. Também há evidência de que membros das
subfamílias CYP2A, 2B, 2C e 3A estejam envolvidos no
metabolismo de testosterona, e os das subfamílias 2D e
2E estejam envolvidas no metabolismo de catecolami
nas e gliconeogênese, respectivamente.
11.6 CITOCROMO P450:
INDUÇÃO E INIBIÇÃO
É claro que os níveis e a atividade dos citocromos
P450 em uma dada pessoa in�uenciarão muito o efei
to de uma droga específica ou de um xenobiótico sobre
o sistema. Assim, compostos que inibem ou induzem a
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.4
Papel do Citocromo P450 2E1 na Toxicidade Hepática Induzida por Acetaminofen
Acetaminofen é uma das medicações analgési
cas (alívio da dor) e antipiréticas (redutor de febre)
mais usadas. Está disponível isolado ou como com
ponente de mais de 100 medicações vendidas sem
receita médica.médica. AA viavia dodo metabolismometabolismo dodo acetami-acetami-acetami
nofen é apresentada na Figura 11.15. O consumo de
álcool, um indutor e substrato de CYP2E1, tem um
profundo efeito sobre o metabolismo de acetamino
fen. O consumo de álcool equivalente a uma garra
fa de vinho de 750 ml, seis latas de cerveja de 350
ml, ou 250 ml de uma bebida de graduação alcoólica
80, num período de 6 a 7 horas, causa um aumento
de 22% no metabolismo de acetaminofen mediado
por CYP2E1, que se manifesta várias horas após a
ingestão do álcool. Assim, o tempo entre o último
consumo de álcool e administração de acetaminofen
pode ser muito crítico no desenvolvimento da lesão
hepática induzida por acetaminofen. Em uma pes
soa bebendo álcool, o metabolismo do acetaminofen
tomado concomitantemente ou logo depois de parar
de beber é retardado porque o etanol, assim como o
acetaminofen, é um substrato para CYP2E1 e, por
tanto, compete pela ligação. No consumo crônico de
álcool, CYP2E1 é induzido e quantidades maiores de
N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI) são produ
zidas; contudo, o álcool pode realmente proteger o
fígado da lesão induzida por acetaminofen, se toma
do ao mesmo tempo ou pouco antes. Se acetamino
fen for tomado várias horas após a ingestão de álcool,
o álcool já foi metabolizado e níveis aumentados de
CYP2E1 estarão, então, disponíveis para metaboli
atividade de P450, bem como polimorfismos ocorrendo
em um gene P450, podem produzir resultados inespe
rados.
Interações Droga–Droga
Muitas drogas induzem a formação do citocromo
P450 que as metaboliza. Outras drogas causam inibi
ção da atividade de P450. Alterar o metabolismo de uma
droga em particular a partir de sua taxa prevista pode
causar efeitos inesperados e adversos, e é preocupação
especial em indivíduos que tomam uma combinação de
drogas. Para drogas que são dependentes do metabo
lismo de P450 para sua eliminação do corpo, a inibição
levará ao acúmulo da droga original até concentrações
que podem ser tóxicas. Por outro lado, a indução da
isoforma P450 necessária para metabolizar uma droga
específica pode levar ao supermetabolismo e a concen
trações subefetivas.
• 457
zar o acetaminofen em NAPQI, aumentando o risco
de lesão hepática.
O período de tempo e a quantidade de álcool consu
mido por dia afetam a quantidade de CYP2E1 expressa
em hepatócitos. A quantidade de acetaminofen consu
mida é o principal fator determinante do risco, uma
vez que as doses normalmente recomendadas não ge
ram suficiente NAPQI para induzir lesão de células he
páticas. Doses mais altas de acetaminofen aumentam
o risco de lesão às células hepáticas, visto que mais
droga será metabolizada pela via de CYP2E1. Ambas
as vias de sulfatação e glucuronidação são essenciais
para determinar a quantidade de acetaminofen que
será metabolizada por CYP2E1. Além disso, os níveis
de glutationa intracelular são críticos, uma vez que a
glutationa forma conjugados com NAPQI para prote
ger o fígado desse metabólito reativo. Em presença de
altos níveis de NAPQI, a glutationa é rapidamente con
sumida e não pode mais proteger contra a lesão.
Brunner, L. J., McGuinness, M. E., Meyer, M. M. e Munar,
M. Y. Acute acetaminophen toxicity during chronic alcohol
use. U.S. Pharmacist Sept:HS11-HS19, 1999. Esse artigo
pode ser visto na página da internet: http://www.us-pharma
cist.com/; e Thummel, K. E., Slattery, J. T., Ro, H., Chien, J.
Y., Nelson, S. D., Lown, K. E. e Watkins, P. B. Ethanol and
production of the hepatotoxic metabolite of acetaminophen
in healthy adults. Clin. Pharmacol. Ther. 67:591, 2000. Slat
tery, J. T., Nelson, S. D. e Thummel, K. E. The complex inte
raction between ethanol and acetaminophen. Clin. Pharma
col. Ther. 60:241, 1996.
Os efeitos indesejados que podem ocorrer quando
os níveis de citocromos P450 são induzidos ou inibidos
por outras drogas são chamados interações droga–dro
ga. Se essas drogas indutoras ou inibidoras forem ad
ministradas com outras drogas que são normalmente
metabolizadas pelas enzimas P450, o tempo de vida
dessas drogas será alterado. Se essas drogas afeta
rem sistemas críticos, o resultado pode ser fatal. Por
exemplo, CYP2E1 é induzido por álcool ou isoniazida.
Ele também metaboliza anestésicos, como halotano e
en�urano, a compostos que danificam proteínas hepáti
cas. O sistema imune então ataca essas proteínas anor
mais, produzindo uma forma de hepatite. Pessoas com
atividade acima do normal de CYP2E1 produzida pela
ingestão de álcool têm risco aumentado desse tipo de
hepatite reativa a um anestésico.
Interações droga–droga também ocorrem com
CYP3A4, um dos P450 mais importantes para metabo
lizar drogas e o P450 mais abundante no fígado e no in
458 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
testino delgado. Os níveis de CYP3A4 são induzidos por
rifampicina, anticonvulsivantes como carbamazepina e
fenitoína, e glucocorticoides como dexametasona, e são
inibidos por antifúngicos como cetoconazol, inibidores
da protease de HIV, bloqueadores de canal de cálcio, ci
closporina, antibióticos como eritromicina, antidepres
sivos SSRI e até suco de grapefruit. Alguns poucos dos
muitos compostos metabolizados por essa enzima são
apresentados na Tabela 11.1.
Na realidade, parece que a mistura de indutores e/ou
inibidores de CYP3A4 com várias drogas (que podem,
elas mesmas, serem indutores ou inibidores) pode ter
efeitos indesejados ou até fatais. Tomar rifampicina, um
indutor de CYP3A4, com contraceptivos orais, que são
metabolizados por CYP3A4, tem resultado em menor
eficácia dos contraceptivos, levando a gestações inde
sejadas. Tomar cetoconazol ou até tomar suco de gra
pefruit, ambos inibidores de CYP3A4, juntamente com
o anticoagulante warfarina, pode levar a sangramento
excessivo. As consequências clínicas que se relacionam
com aa inibiçãoinibição ouou aa induçãoindução dede enzimasenzimas queque metabo-metabo
lizam drogas são apresentadas na Correlação Clínica
11.3, e na Correlação Clínica 11.5.
Os mecanismos de indução de citocromos P450
ocorrem em nível transcripcional ou pós-transcriptio
nal (por exemplo, estabilização do mRNA ou diminui
ção na degradação da proteína). Não é possível prever
o modo de indução com base no composto indutor. A
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.5
Indução de Citocromo P450: Interações Droga–Droga e Efeitos Adversos
A indução de citocromos P450 específicos pode
diminuir os efeitos terapêuticos de drogas, porque
aumentos nos níveis hepáticos de P450 aumentam a
taxa de metabolismo e, portanto, a inativação e/ou a
excreção de drogas. A indução do sistema P450 tam
bém pode ter efeitos adversos por causa da formação
aumentada de metabólitos tóxicos (também Correla
ção Clínica 11.4).
A indução de CYP3A4, por exemplo, pela droga anti
tuberculose rifampicina, pode aumentar muito a elimi
nação do contraceptivo oral etinil estradiol, causando
níveis plasmáticos subefetivos da droga, o que aumenta
o risco de gravidez. Tratamento com as drogas anticon
vulsivantes fenitoína e carbanezepina também pode
induzir CYP3A4 e reduzir a potência contraceptiva do
etinil estradiol. É imperativo que uma mulher tomando
etinil estradiol como contraceptivo oral, simultanea
mente com um indutor de CYP3A4, aumente a dose do
contraceptivo ou use um método contraceptivo alterna
tivo ou outra droga.
complexidade do processo de indução é ilustrada por
CYP2E1 no fígado humano versus de rato. A proteína
CYP2E1 é induzida em ambas as espécies por molécu
las orgânicas pequenas, como etanol, acetona ou pira
zol, ou em condições de jejum ou diabetes. No homem,
os níveis do mRNA dessa proteína não são afetados, e
a indução é provável que ocorra por estabilização de
CYP2E1 humana contra degradação proteolítica. En
tretanto, em ratos diabéticos, a indução de seis vezes
da proteína CYP2E1 é acompanhada por um aumento
de 10 vezes no mRNA, sem envolver aumento na trans
crição do gene, sugerindo estabilização do mRNA.
Proteínas receptores citosólicos específicos foram
indicadas por alguns agentes indutores. Um dos mais
amplamente estudados é o receptor de aril hidrocar
boneto (ou Ah), que interage com 2,3,7,8-tetraclorodi
benzo-p-dioxina (TCDD) e causa indução de CYP1A1,
CYP1A2 e CYP1B1. Este é um exemplo de composto
que persiste nos ambientes lipídicos da célula por lon
gos períodos de tempo e pode induzir carcinogênese.
Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos são ligantes
para o receptor de Ah, e produzem um complexo ligan
te-receptor que é deslocado para dentro do núcleo pelo
translocador nuclear do receptor de Ah (Arnt, Ah re
ceptor nuclear translocator), onde se liga a elementos
de resposta específicos nas regiões regulatórias a mon
tante dos genes dos citocromos P450. A Figura 11.16
ilustra esse processo.
O agente fitoterápico amplamente utilizado erva de
São João, que pode ser adquirido sem receita médica,
também induz a atividade de CYP3A4, levando à pos
sibilidade dos indivíduos que ingerem a erva poderem
não receber os benefícios terapêuticos de drogas que
são substratos para CYP3A4. Uma redução nos níveis
plasmáticos de contraceptivos orais, drogas antiprote
ase de HIV, a droga imunossupressora ciclosporina ou
certas estatinas usadas para reduzir os níveis de co
lesterol, pode ocorrer porque todas essas drogas são
substratos para CYP3A4. Como a erva de São João é
considerada uma substância natural, e não uma droga,
os indivíduos podem tomar esse agente sem avisar seu
médico ou saber seus efeitos sobre a eficácia de outras
drogas que estejam tomando.
Roby, C. A., Anderson, G. D., Kantor, E., Dryer, D. A. e
Burstein, A. H. St. John’s wort: effect on CYP3A4 activity.
Clin. Pharmacol. Ther. 67:451, 2000; e Shader, R. I. e Oes
terheld, J. R. Contraceptive effectiveness: cytochromes and
induction. J. Clin. Psychopharmacol. 20:119, 2000.

L +
União do ligante (L) ao receptor específico (R)
(AhR, CAR, PXR, ou PPAR)
L podem mudar o padrão de expressão dos citocromos
Ligação do parceiro do receptor heterodimérico
(Arnt ou RXR)
para formar o complexo ligante–receptor heterodimérico
L
de
Reconhecimento do elemento
genes P450 específicos pelo
decomplexo
resposta receptor
do DNA
L
5!
Elemento de resposta
Regulação da transcrição do gene
Síntese aumentada do mRNA dos genes P450
FIGURA 11.16 A interação de um ligante com seu receptor e
com o parceiro do receptor, formando receptores complexos
heterodiméricos que iniciam a indução de formas de
citocromo P450.
Outro sistema receptor para genes P450 é o recep
tor X de pregnano (PXR), que regula os genes CYP3A.
Pregnano refere-se a esteroides de 21 carbonos, como
o metabólito de progesterona 5α-pregnano-3,20-diona,
que é um ligante de PXR e um potente indutor do gene
CYP3A4 humano. Além dos esteroides de 21 carbonos,
outros compostos estruturalmente diferentes, como
carbamazepina (uma droga usada no tratamento de
convulsões) e rifampina (uma droga antituberculose),
bem como a erva de São João (um agente fitoterápico
vendido sem receita médica, usado no tratamento de
alterações de humor), são ligantes de PXR. PXR liga
-se ao receptor X de retinoide (RXR) para formar um
complexo heterodimérico (PXR-RXR), que se liga espe
cificamente a elementos de resposta na região �anque
adora 5! dos genes CYP3A. Lembre-se que aproximada
mente 50% das drogas prescritas são metabolizadas por
essa forma de citocromo P450.
Outro indutor dos genes dos citocromoa P450 é o fe
nobarbital. Essa indução é mediada pelo receptor cons
titutivo de androstano (CAR), que também forma um
complexo heterodimérico com RXR para interagir com
seu elemento de resposta específico, na região 5!-�an
queadora dos genes CYP2B. Dois esteroides androsta
nos endógenos, androstanol e androstenol, são também
ligantes de CAR e, quando qualquer ligante está ligado
a CAR, eles impedem a interação do complexo recep
tor CAR-RXR com a proteína SRC-1. SRC-1 é um coa
tivador de receptores nucleares e é necessário para a
ativação da transcrição por CAR. A administração de
fenobarbital ou de outro indutor tipo fenobarbital induz
o deslocamento dos androstanos ligantes, permitindo a
ligação de SRC-1 e a transcrição do gene CYP2B.
CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 459
R Polimorfismos Genéticos de
Citocromos P450
Além da exposição a vários agentes indutores que
P450 no fígado e em outros órgãos, os indivíduos
Arnt ou RXR
podem diferir em suas taxas metabólicas para dro
gas específicas em virtude dos genes de citocromos
P450 singulares ou dos alelos que possuem,ou seja,
polimorfismos. Um polimorfismo é uma diferença na
Gene P450 sequência do DNA encontrada em 1% ou mais de uma
população. Essas diferenças na sequência do DNA
podem levar a diferenças no metabolismo de drogas.
Gene P450 Como estas são variações genéticas, muitas delas es
tão presentes em grupos étnicos específicosíficos quequeque po-po-po
dem, portanto, experimentar efeitos adversos mais
frequentes com certas drogas. Estima-se que 40%
das diferentes formas de citocromo P450 humanas
que metabolizam xenobióticos sejam polimórficas.
Polimorfismos genéticos em CYP2D6 foram es
tudados intensamente e 65 alelos diferentes foram
identificados. A população pode ser dividida em me
tabolizadores intensivos ou metabolizadores ruins,
dependendo dos níveis de expressão de CYP2D6. Se
não houver outro modo de eliminar uma droga em par
ticular do sistema, os metabolizadores ruins podem ter
risco de reações adversas a drogas. Por outro lado, os
metabolizadores intensivos podem descobrir que mui
tas drogas são ineficientes.
Muitas pessoas provenientes da Etiópia e da Ará
bia Saudita apresentam expressão elevada de CYP2D6.
Essa isoforma metaboliza uma variedade de drogas,
tornando-as ineficientes; muitos antidepressivos e neu
rolépticos são importantes exemplos. Por outro lado,
pró-drogas serão intensamente ativadas: codeína será
convertida muito rapidamente em grandes quantidades
de morfina.
Diferentemente, muitos indivíduos não têm 2D6
funcional. Esses pacientes serão predispostos à toxi
cidade de drogas causada por antidepressivos e neu
rolépticos, mas considerarão a codeína ineficiente em
virtude da falta de ativação. Perexilina (um bloqueador
de canal de cálcio) foi retirada do mercado por causa
da neuropatia causada em pacientes com 2D6 inativo.
Até mesmo a remoção de beta-bloqueadores pode ser
dificultada (por exemplo, propranolol) em pessoas de
ficientes em 2D6. A Correlação Clínica 11.6 discute os
efeitos de polimorfismos.
Embora o polimorfismo genético de um citocromo
P450 em particular possa afetar o metabolismo de um
conjunto discreto de compostos, polimorfismos gené
ticos da citocromo P450 redutase, a única e obrigató
ria doadora de elétrons para os 50 membros da classe
microssomal de citocromos P450, poderiam ter efeitos
mais globais e drásticos no metabolismo de substratos
endógenos e xenobióticos. De fato, o bloqueio completo
460 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.6
Polimorfismos Genéticos das Enzimas P450
Múltiplos alelos foram demonstrados para aproxi
madamente 40% dos genes P450 humanos. Esses po
limorfismos genéticos podem produzir proteínas P450
defectivas. Uma descrição do CYP21 polimórfico e de
sua importância no metabolismo de um composto en
dógeno foi apresentada na Correlação Clínica 11.1. A
ausência de atividade de um citocromo P450 pode cau
sar muitos problemas, em virtude do acúmulo de dro
gas terapêuticas que não podem ser metabolizadas. A
descoberta de efeitos hipotensivos exagerados com a
droga anti-hipertensiva debrisoquina levou à caracte
rização de indivíduos que metabolizavam muito inefi
cientemente substratos de CYP2D6. Aproximadamen
te 5 a 10% da população caucasiana, 8% da africana
e afro-americana, e 1% da asiática são deficientes na
forma cataliticamente ativa de CYP2D6. Além da de
brisoquina, outras drogas que são metabolizadas por
CYP2D6 são esparteína, amitriptilina, dextrometorfan
e codeína. No caso da codeína, CYP2D6 em indivíduos
normais catalisa a O-desmetilação de aproximadamen
te 10% da codeína a morfina. Os indivíduos que não têm
o gene normal de CYP2D6 são incapazes de catalisar
essa reação e, assim, não obtêm os efeitos analgésicos
associados à codeína.
Um polimorfismo genético associado com CYP2C19
foi demonstrado em indivíduos que metabolizam mal a
mefenitoína, uma droga usada no tratamento da epilep
sia; CYP2C19 hidroxila C4 do S-enantiômero da mefeni
toína para inativar o efeito fisiológico. Os metabolizado
res ruins dessa droga sofrem efeitos sedativos maiores,
com dosagens normais. Aproximadamente 14% a 22%
(knocking out) do gene da citocromo P450 redutase
em modelo animal é embriologicamente letal a esses
animais. Recentemente, mutaçõesões humanas que alte
ram a atividade desse gene foram descritas possuindo
efeitos profundos (Correlação Clínica. 11.7).
Inibição Terapêutica de Citocromo
P450
Como os citocromos P450 estão presentes em quase
todos os organismos e como desempenham funções tão
importantes na homeostase celular, a inibição seletiva
dessas enzimas é de importância clínica. Inibidores azol
(cetoconazol, itraconazol e �uconazol), por exemplo, são
usados para controlar as infecções por fungos contraí
das por pacientes com AIDS, pacientes com câncer em
quimioterapia, e pacientes tratados com drogas immu
nossupressoras. Em levedura, CYP51 catalisa a desme
tilação de moléculas de esterol na síntese de ergosterol,
da população asiática, 4% a 7% da africana e afro-ame
ricana, e 3% da caucasiana não têm a forma ativa do
gene CYP2C19.
Polimorfismos de CYP2C9 ocorrem em menos de
0,003% da população africana ou afro-americana,
0,08% da asiática e 0,36% da caucasiana. A ausência de
uma CYP2C9 funcional pode ter sérias consequências
no metabolismo de S-warfarina, uma droga adminis
trada por via oral, usada para inibir a coagulação do
sangue em pacientes que sofreram um ataque cardíaco
ou um acidente vascular cerebral, para evitar
vitar a recor
rência de coágulos que oferecem risco de vida. Os níveis
plasmáticos da droga devem ser mantidos dentro de
uma faixa específica porque quantidades excessivas da
droga causam sangramento descontrolado e, possivel
mente, morte. A warfarina é metabolizada por CYP2C9,
para eliminação. CYP2C9*3 é um variante alélico no
qual isoleucina é substituída por leucina no resíduo 359,
resultando em perda substancial de atividade enzimáti
ca. Indivíduos deficientes em CYP2C9 podem requerer
apenas 0,5 a 1 mg de warfarina por semana, em com
paração com os 4 a 5 mg por dia prescritos para um
indivíduo com CYP2C9 normal. Se uma dose de 5 mg de
warfarina for tomada por alguém que não tem CYP2C9
funcional, o sangramento descontrolado poderia resul
tar de um simples corte.
Ingelman-Sundberg, M., Oscarson, M. e McLellan, R. A.
Polymorphic human cytochrome P450 enzymes: An opportu
nity for individualized drug treatment. Trends Pharmacol.
Sci. 20:342, 1999.
um importante lipídeo de membrana. No homem, uma
forma relacionada de P450, CYP51A1, catalisa a des
metilação de lanosterol, uma reação que é essencial na
síntese de colesterol. Embora as proteínas CYP51 hu
mana e de levedura sejam semelhantes, há diferenças
suficientes para permitirem que agentes os antifúngi
cos azóis sejam inibidores efetivos da formação de er
gosterol. Como discutido anteriormente, entretanto,
esses agentes também podem induzir ou inibir citocro
mos P450 humanos nativos, possivelmente levando ao
fenômeno de interação droga–droga.
Certos tumores, como tumores de mama, são depen
dentes de estrógeno para seu crescimento. Portanto, a
inibição da síntese de estrógeno sem inibir a produção
de outros hormônios esteroides poderia servir como
uma ferramenta quimioterápica seletiva para reduzir
e eliminar tumores. CYP19A1, o citocromo P450 que
catalisa a formação de estradiol a partir de androste
nediona, é um alvo atraente para esse tipo de inter
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.7
Polimorfismos Genéticos de NADPH-Citocromo P450 Redutase: Síndrome de Antley–Bixler (OMIM 207410)
Foram encontradas mutações na NADPH-citocromo
P450 redutase humana que resultam em um fenótipo
para o paciente de malformações esqueléticas caracte
rizadas por craniosinostoses, sinostoses radioulnar ou
radioumeral e/ou fêmures arqueados, um conjunto de
traços clínicos conhecido como síndrome de Antley–
Bixler. Esses pacientes também apresentaram esteroi
dogênese desordenada e hiperplasia adrenal congênita
(CAH). Como descrito na Correlação Clínica 11.1, um
defeito na CYP21A2 é a causa mais comum de CAH.
Como a deficiência de citocromo P450 redutase po
tencialemente afeta a atividade dos três citocromos
P450 estereoidogênicos (CYPs 19A e 17A, bem como
CYP21A, Figura 11.8), padrões variáveis e anormais
de hormônios esteroides são observados nesses ca
sos, resultando em fêmeas supervirilizadas e machos
subvirilizados. As vias envolvidas no desenvolvimento
embrionário do esqueleto estão também claramente
afetadas em alguns pacientes deficientes na citocromo
P450 redutase, e o metabolismo de drogas mediado por
citocromo P450 estava comprometido em pelo menos
venção. Um tipo particularmente seletivo de inibidor é
um inibidor baseado em mecanismo, ou suicida. Esses
compostos têm forte semelhança com um substrato de
uma enzima, mas formam um produto de inibição ir
reversível durante a ciclagem catalítica, com o grupo
prostético da enzima ou da proteína. Tais inibidores
seriam muito específicos para uma forma específica de
citocromo P450 e seriam, portanto, uma boa abordagem
tática para o design de drogas.
Parece que, sem um entendimento do metabolismo
de drogas e das interações de drogas mediadas pelo
sistema citocromo P450, nenhuma medicação pode
ser prescrita com segurança, particularmente quando
múltiplas medicações são necessárias, como em pa
cientes idosos. É crítico determinar como drogas tera
pêuticas são metabolizadas e se formas de citocromo
P450 podem ser inibidas por diferentes compostos. O
processo de aprovação de drogas pelo Food and Drug
Administration (FDA) exige que extensa informação
seja submetida sobre o metabolismo das drogas, antes
que sejam finalmente aprovadas para uso humano em
geral.
• 461
alguns desses pacientes. Como não há redundância na
parte de transferência de elétrons do sistema citocro
mo P450 microssomal, seria de se esperar que defeitos
na citocromo P450 redutase tivessem efeitos diversos e
pleiotrópicos, dependendo da gravidade do efeito sobre
sua atividade. Além disso, vários citocromos P450 po
deriam interagir com diferentes resíduos da superfície
da redutase, e assim seriam afetados diferencialmente
por mutações em tais resíduos. Portanto, dependendo
do local da mutação na estrutura da redutase (Figura
11.4) e da alteração resultante das atividades enzimá
ticas ou das interações proteína–proteína, as mutações
podem variar muito quanto à gravidade e ao fenótipo
resultante.
Fluck, C. E., Tajima, T., Pandey, A. V., Arlt, W. et al.
Mutant P450 oxidoredutase causes steroidogenesis with
and without Antley-Bixler syndrome. Nat. Genet. 36:228,
2004; e Scott, R. R. and Miller, W. L. Genetic and clinical
features of P450 oxidoredutase deficiency. Horm. Res. 69:
266, 2008.
11.7 ÓXIDO NÍTRICO SINTASES:
PROPRIEDADES E FUNÇÃO
ENZIMÁTICA
As óxido nítrico sintases (NOSs) são enzimas con
tendo heme e �avina, que catalisam a síntese de óxido
nítrico (NO) por duas reações de monoxigenase em sé
rie, análogas às dos sistemas citocromo P450. As NOSs
são dímeros funcionais e consistem de dois domínios
principais, um domínio oxigenase contendo heme, que é
estruturalmente não-relacionado com citocromos P450,
e um domínio redutase contendo �avina, que lembra
estruturalmente a P450 redutase (Figura 11.17). São
transferidoss elétronselétrons dede NADPHNADPH parapara oo domíniodomínio reduta-reduta
se de um monômero, por meio das �avinas FAD e FMN,
para o ferro heme do outro monômero, no qual oxigênio
molecular é ligado e ativado. Os domínios são conecta
dos por um sítio de ligação àà calmodulina,calmodulina,calmodulina, cujacujacuja ocupa-ocupa-ocupa
ção por calmodulina é necessária para a transferência
de elétrons do domínio redutase para o da oxigenase.
O grupo heme das NOSs lembra o dos citocromos
P450 porque forma um ligante tiolato com uma cisteí
na na proteína NOS, e dá o mesmo tipo de espectro de
absorbância quando CO é ligado à forma reduzida, for
ma ferrosa do heme, isto é, um pico de absorbância em
cerca de 450 nm. O domínio NOS oxigenase é, entre
tanto, estruturalmente muito diferente dos citocromos
P450 (compare a estrutura cristalina do domínio NOS
462 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
NOS neuronal Região
autoregulatória
Fluxo de elétrons
L-Arg Ligação
NA
Domínio de CaM
H DP
PDZ em H
e FMN FAD
H4B Zn2+ Região
de cauda
Domínio oxigenase Domínio redutase
FIGURA 11.17 Uma estrutura modular de óxido nítrico sintase
neuronal mostrando as localizações aproximadas dos grupos
prostéticos e cofatores.
oxigenase na Figura 11.18 com o dos P450, na Figura
11.1, p. 443). Além do grupo heme e do sítio de ligação
ao substrato, os domínios oxigenase das NOSs também
contêm um sítio para ligação de tetra-hidrobiopterina,
que aparentemente funciona no transporte de elétrons,
e um átomo de zinco tetra-coordenado, que é importan
te para a integridade estrutural.
FIGURA 11.18 Modelo da estrutura dimérica do heme
da NOSIII bovina mostrando os grupos prostéticos
protoporfirina IX (vermelho) e tetra-hidrobiopterina
(amarelo).
Os dois monômeros são representados em azul claro e azul
escuro, respectivamente. O substrato L-arginina (verde) está
no sítio ativo da NOSIII. Um átomo de zinco está na interface
entre os dois monômeros.
Gerado a partir do Protein Data Bank arquivo 2NSE, deposita
do por C. S. Raman, H. Li, P. Martasek, V. Kral, B. S. Masters
e T. L. Poulos, usando WebLab Viewer Lite (Molecular Simu
lations, Inc.).
O domínio redutase da NOS é estruturalmente mui
to semelhante ao da citocromo P450 redutase (compa
re a estrutura cristalina do domínio redutase da nNOS
na Figura 11.19 com o da citocromo P450 redutase na
Figura 11.4, p. 444). Eles compartilham quase 60% de
homologia de sequência, e a arquitetura geral e as es
truturas de subdomínios, o domínio FMN, o domínio
de conexão e o domínio de ligação de FAD/NADPH são
muito semelhantes entre si. A diferença estrutual pri
mária entre as duas é a inclusão, no domínio redutase
da NOS, de vários elementos regulatórios, que são ape
nas parcialmente visíveis na estrutura cristalina,
em virtude de sua extrema �exibilidade.
A reação geral catalizada pelas NOSs é a mo
noxigenação sequencial do aminoácido L-arginina
para formar NO e citrulina, como mostra a Figura
11.20. O ciclo da reação é iniciado pela ligação de
calmodulina para “abrir a porta” entre os domínios
redutase e oxigenase. O doador de elétrons é NA
DPH, que doa dois elétrons para FAD que, por sua
vez, reduz FMN. O FMN reduz o ferro heme para
sua forma ferrosa, à qual oxigênio pode se ligar. Na
primeira etapa, arginina é oxidada ao intermediário
estável N-hidroxi-L-arginina. Na segunda etapa, N-hi
droxi-L-arginina é oxidada a NO e citrulina. Note que a
fonte de NO é o grupo guanidino do substrato, arginina.
Esse processo inteiro requer 2 moléculas de oxigênio
e 1,5 moléculas de NADPH e, como o dos citocromos
P450, é inibido por monóxido de carbono.
FIGURA 11.19 Diagrama em fita do domínio redutase da
nNOS derivado de sua estrutura cristalina.
Similarmente à citocromo P450 redutase, vários subdomínios
estão presentes – o domínio de ligação de FMN (azul),
azul),
), o do
mínio de ligação de FAD/NADPH (verde)
verde)) e o domínio interve
niente de conexão (púrpura). Ao contrário da P450 redutase,
a nNOS redutase contém um sítio de ligação para calmodulina
(não evidente no diagrama), e regiões regulatórias (vermelho)
no C-terminal (CT), no domínio FMN (AR), e no domínio de
conexão (SI). São mostrados cofatores em modelo de hastes:
azul, FMN; amarelo, FAD; e vermelho, NADP+.
Gerado a partir do Protein Data Bank arquivo 1TLL, deposita
do por E. D. Garcin, C. M. Bruns, D. J. Lloyd, D. J. Hosfield et
al. Usando WebLab Viewer Lite (Molecular Simulations, Inc.).
A cadeia geral de transferência de elétrons e o meca
nismo pelo qual as NOSs formam NO é semelhante aos
dos citocromos P450, mas há algumas diferenças signifi
cativas na regulação do processo de transferência de elé
trons. O mais óbvio é que as NOSs constituitivas reque
rem ligação com calmodulina. A calmodulina não está
ligada à enzima nos níveis intracelulares basais de cálcio.
É necessário um in�uxo de cálcio para elevar a concen
tração de cálcio, aumentando a ligação de cálcio à calmo
dulina (p. 514). O complexo cálcio–calmodulina liga-se
e ativa NOSs. Em ausência de ligação com calmodulina,
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES • 463

a redução do heme ocorre apenas H2N NH2+ H2NN OH H2NO

entre
formação
muitoFAD FMN
lentamente
dee NO, eeaénão
transferência
também
suporta
lena
NH NH OO H2O NH
OO H2O
ta. A ligação de calmodulina cau + N O
sa uma mudança conformacional NADPH NADP+ 0.5 NADPH 0.5 NADP+
na enzima, potencializando a
�avinas
produtivae do
permitindo
transferência heme.
de Osadomínios
elétrons redução
entre as C NH3+ C NH3+ C NH3 +
O O− O O− O O−

L-Arginina NG-Hidroxi-L-arginina L-Citrulina Óxido nítrico

redutase das NOSs também con
têm várias regiões regulatórias, FIGURA 11.20Produção de óxido nítrico.
mostradas na Figura 11.17 e na As NOSs catalizam a formação de NO a partir de L-arginina por duas etapas sequenciais de
Figura 11.19, que estão envolvidas monoxigenação que parecem ser mecanisticamente semelhantes à do sistema de citocromo
na transdução do sinal da ligação P450 microssomal. O átomo de nitrogênio (azul) do NO é derivado do grupo guanidino da
da calmodulia pela enzima. Além cadeia lateral da arginina, e o átomo de oxigênio (vermelho) do NO é derivado do oxigênio
molecular.
do sítio de ligação a calmoduli
na, as regiões regulatórias presentes nas NOSs incluem auto-oxidação do complexo óxi-ferroso. Na presença de
uma extensão C-terminal do domínio de ligação FAD/ tetra-hidrobiopterina, mas em ausência de substrato,
NADPH, um inserto de 45-50 resíduos no domínio FMN, NOS também pode formar peróxido de hidrogênio, em
e uma pequena inserção no domínio de conexão. Todas decorrência da formação e do subsequente decaimento
as isoformas de NOS incluem o inserto C-terminal, mas do complexo peróxi-ferroso. A formação dessas espé
apenas as isoformas denominadas constitutivas contêm cies reduzidas de oxigênio foi implicada em vários pro
os insertos dos domínios FMN e de conexão. cessos de doenças in�amatórias, como disfunção endo
telial e também lesão por isquemia/reperfusão, quando
Outra diferença entre as NOSs e os P450s é que a tecidos são primeiro depletados de oxigênio e, depois,
ligação do substrato não é necessária para que as NOSs reperfundidos com sangue rico em oxigênio. Esse tipo
iniciem o ciclo de reação, e a ligação do substrato não de lesão ocorre na trombose cerebral e em tecidos re
altera o potencial de redução do heme. Se o substrato movidos para transplante.
não estiver presente, o elétron transferido para o heme
pode ativar oxigênio molecular, formando o complexo
oxi-ferroso, que pode decair e ser liberado como supe
róxido. Se o segundo elétron for transferido antes que a 11.8 ISOFORMAS DA ÓXIDO
liberação ocorra, a forma peróxido oxigênio é gerada, a
qual se dissociará como peróxido de hidrogênio. Assim, NÍTRICO SINTASE E
se o substrato não estiver presente, mas a NOS estiver
ativa, espécies reativas de oxigênio, potencialmente
FUNÇÕES FISIOLÓGICAS
destrutivas, podem ser formadas. Além disso, um co Existem três isoformas principais de NOS, neuronal
fator tetra-hidrobiopterina é necessário para a síntese (NOSI ou nNOS), indutível (NOSII ou iNOS) e endote
de NO pela NOS, mas não é necessário para nenhum lial (NOSIII ou eNOS), embora variações em cada um
citocromo P450 conhecido. Tetra-hidrobiopterina serve desses tipos ocorra em muitos organismos diferentes.
como doador de elétrons para o complexo óxi-ferroso As propriedades dessas isoformas são resumidas na Ta
(ou seja, a forma do heme reduzida por um elétron, liga bela 11.4.
da ao oxigênio) da NOS, entregando o segundo elétron
para o heme muito mais depressa do que a transferên Muitas das funções fisiológicas do NO são mediadas
cia interdomínio, relativamente lenta, de um elétron pela ativação da guanilato ciclase solúvel, uma proteí
do FMN da NOS. Assim, na ausência de tetra-hidro na heterodimérica (a/b) contendo heme, que converte
biopterina, NOS produzirá superóxido em virtude da GTP em cGMP. cGMP é um segundo mensageiro en

TABELA 11.4 Propriedades das Isoformas de NOS

Propriedade NOSI NOSII NOSIII
Massa molecular 160 kDa 130 kDa 135 kDa
Expressão Constitutiva Indutível Constitutiva
Fração celular Citoplasmática Citoplasmática Ligada a membrana
Dependência de in�uxo de cálcio Dependente Independente Dependente
Ação fisiológica Neurotransmissão Citotoxicidade Vasodilatação
464 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
volvido em muitas cascatas de transdução de sinal (p.
549). A forma inativa da guanilato ciclase solúvel tem
um heme penta-coordenado, ligado por uma histidina
na subunidade b. NO liga-se como sexto ligante para
formar um heme hexa-coordenado, e causa quebra da
ligação heme-histidina, gerando o complexo nitrosil
penta-coordenado ativo da guanilato ciclase solúvel
(Figura 11.21). A ativação da guanilato ciclase solú
vel causa aumento de até 400 vezes na taxa de forma
ção de cGMP. Os níveis de cGMP são regulados por um
equilíbrio entre a atividade da guanilato ciclase e da
fosfodiesterases (PDE), particularmente PDE5, especí
fica para cGMP, que hidrolisa cGMP a 5!-GMP, desligan
do-se assim o sinal.
NOSI
NOSI é encontrada primariamente em músculo es
quelético e em neurônios, tanto do sistema nervoso cen
tral como do periférico. É uma enzima solúvel, embora
se localize na membrana via interações proteína–prote
ína com uma gama de proteínas regulatórias e de loca
lização. É expressa constitutivamente, o que significa
que não é normalmente induzida em nível transcrip
cional, e é ativada pelo in�uxo de cálcio. No caso da
NOSI (e da NOSIII, p. 466), calmodulina (p. 514) não
está ligada à enzima nos níveis intracelulares basais de
cálcio. É necessário um in�uxo de cálcio para elevar a
concentração intracelular de cálcio, permitindo que a
calmodulina se ligue e, assim, ative a formação de NO.
A quantidade de NO sintetizado no estado ativado é
muito baixa, isto é, picomolar. O NO produzido serve
como um neurotransmissor nos sistemas nervosos cen
tral e periférico. No músculo esquelético, o NO também
serve de mediador da força contrátil.
No sistema nervoso central, o NO é produzido ge
ralmente pela nNOS no neurônio pós-sináptico, mas di
funde de volta na sinapse para o neurônio pré-sinápti
co. A síntese de NO é regulada pelo in�uxo de cálcio por
canais dependentes de receptor, isto é, após estímulo
pós-sináptico dos receptores de N-metil-D-aspartato
(NMDA) pelo neurotransmissor excitatório glutamato.
A guanilato ciclase é ativada por NO, produzindo cGMP,
que regula a síntese dos neurotransmissores norepine
frina e glutamato, aumentando assim a produção de NO
Inativo Ligado
His
α1NO β1 α1 His β1 α1
Fe2+
FeFe
FeF
Fe2+
NO
FIGURA 11.21 Ativação da guanilato ciclase solúvel por NO.
Redesenhado com base em figura de Bellamy, T. C. e Garthwaite, J. The
receptor-like properties of nitric oxide-activated soluble guanylate cycla
se in intact cells. Mol. Cell. Biochem. 230:165, 2002.
(Figura 11.22) em uma retroalimentação (feedback)
positiva. O NO foi implicado na sinalização neural, na
neurotoxicidade, na plasticidade sináptica, no aprendi
zado e na memória, bem como na percepção de dor.
GTP cGMP
pré-sináptico
Terminal
SGC Ca2+
CaM
Glutamato Receptores
Ca2+/
NMDA CaM
L-arg Ca2+/
NO
CaM
NOSI
Neurônio pós-sináptico
FIGURA 11.22 NO produzido por NOSI no sistema
nervoso central.
Nesse caso, NO é produzido pela célula pós-sináptica e vol
ta para a célula pré-sináptica, onde ativa sGC, criando cGMP
que ativa PKG. PKG fosforila proteínas nas vesículas de neu
rotransmissor, levando à liberação de mais neurotransmissor e
potenciando o sinal.
Além de seus domínios oxigenase e redutase, NOSI
tem um domínio PDZ N-terminal de 300 aminoácidos,
que medeia sua interação com outras proteínas. No sis
tema nervoso central, o domínio PDZ da NOSI interage
com a proteína de densidade pós-sináptica PSD-95. O
receptor NMDA também interage com PSD-95, aproxi
mando muito NOSI e o receptor NMDA, de modo que
NOSI fica diretamente exposta ao cálcio entrando pelo
canal iônico do receptor NMDA ativado.
O NO é muito diferente de outros neurotransmisso
res conhecidos (p. 965). O NO é sintetizado por deman
da e não pode ser armazenado em vesículas lipídicas,
uma vez que se difunde livremente através de membra
nas. A ação do NO não é terminada por degradação ou
recaptação, mas é removido por interação com seu alvo,
que é um segundo mensageiro intracelular, e não um
receptor ligado à membrana.
No sistema nervoso periférico, NO é produ
Ativo
zido pela nNOS de neurônios mioentéricos dos
His
sistemas gastrointestinal, pulmonar, vascular e
β1
urogenital. No sistema gastrointestinal, NO está
envolvido na motilidade intestinal e no controle
FeFee2+
FeFeFeF
Fe 2+2+
2 do esfíncter pilórico. O NO medeia a principal via
broncodilatadora no sistema pulmonar humano
NO e está envolvido no controle neural do sistema
vascular, particularmente importante no �uxo
sanguíneo cerebral. No sistema urogenital, NO
está envolvido no controle uretal e da bexiga e na
ereção peniana. Durante a excitação sexual, o NO
é liberado dos nervos adjacentes aos vasos san
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
guíneos do pênis. O relaxamento desses vasos leva o
sangue a engurgitar os corpos cavernosos, produzindo
a ereção. NOSI é ativada nesses sistemas pelo in�uxo
de cálcio por canais de cálcio voltagem-dependentes
(p. 500). Difunde para uma célula muscular lisa vizi
nha, causando ativação de guanilato ciclase solúvel. O
músculo liso relaxa pelo mecanismo descrito a seguir,
para o músculo liso vascular. A Correlação Clínica 11.8
descreve a manipulação terapêutica dos níveis de cGMP
para o tratamento da disfunção erétil.
Altos níveis de NOSI são expressos no músculo es
quelético, onde está envolvida na mediação da força
contrátil, inervação do músculo em desenvolvimento
e, talvez, captação de glicose. Relaxamento do mús
culo esquelético por NO também ocorre pela via do
cGMP, pelo mecanismo descrito a seguir para o mús
culo liso vascular. NOSI é direcionada para o sarco
lema do músculo em virtude de sua associação com
a-sintrofina, um membro do complexo da distrofina
muscular. NOSI é ativada pelo in�uxo de cálcio por
canais de cálcio voltagem-dependentes, bem como do
retículo sarcoplasmático.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.8
Mecanismo de Ação de Sildenafil
Os níveis de nucleotídeos cíclicos (cGMP e cAMP)
presentes nas células são dependentes não só de
sua formação pelas adenilato ou guanilato ciclases,
mas também de sua degradação por fosfodiesterases
(PDEs), que os hidrolisam aos 5!-nucleotídeos e, as
sim, desempenham um papel crítico na modulação
das vias de sinalização desses segundos mensageiros.
A inibição da destruição de nucleotídeos cíclicos por
PDE prolongaria a resposta fisiológica desencadeada
pelos nucleotídeos cíclicos. O Sildenafil (Viagra), uma
droga prescrita para disfunção erétil, é um potente
inibidor da PDE5, que é específica para cGMP e é en
contrada primariamente no corpo cavernoso humano
e no músculo liso vascular e gastrointestinal. No pê
nis, o NO produz ereção por uma via dependente de
cGMP, como discutido no texto. À medida que cGMP
é degradado por PDE5, o sinal vasodilatador éé atenu-atenu
ado, e a ereção desaparece. O Sildenafil inibe a PDE5,
retardando a degradação de cGMP e, assim, prolon
gando a ereção.
O Sildenafil é muito seletivo para PDE5 em relação
a PDE3, uma PDE específica para cAMP envolvida na
regulação da contratilidade cardíaca. Isso é importante
porque a inibição de PDE3 aumenta a incidência de ar
ritmias cardíacas e diminui a mortalidade a longo prazo
em pacientes com insuficiência cardíaca. Curiosamen
te, o Sildenafil também inibe, em menor grau, PDE6,
• 465
NOSII
NOSII é encontrada primariamente em neutrófilos
e macrófagos ativados, astrócitos e hepatócitos, e está
envolvida na resposta imune precoce. É uma enzima
solúvel e é induzida em nível transcripcional por citoci
nas, como interferon-g, interleucina 1 e fator de necrose
tumoral a, ou endotoxinas, como lipopolissacarídeos. A
indução ocorre ao longo de várias horas, por meio da
via in�amatória do NFkB. A calmodulina fica ligada à
NOSII em condições fisiológicas basais, isto é, indepen
dente de in�uxo de cálcio, de modo que a enzima está
sempre ativada uma vez que tenha sido sintetizada. A
quantidade de NO sintetizado pela NOSII está na faixa
nanomolar, aproximadamente 1.000 vezes maior do que
a de NOSI ou NOSIII.
O NO produzido pela NOSII é uma potente citotoxi
na, e seu principal papel é destruir patógenos fagoci
tados por neutrófilos e macrófagos. NOSII controla pa
tógenos intracelulares como, por exemplo, os parasitas
plasmódio (malaria), schistosoma (esquistossomose),
leishmania (leishmaniose) e toxoplasma (toxoplasmo
que está localizada em fotorreceptores da retina, e um
dos efeitos colaterais às vezes relatados com o uso de
Sildenafil é uma coloração azul-esverdeada na visão do
paciente.
Como PDE5 está presente no músculo liso vascular,
o Sildenafil causa uma reduçãoão leve,leve,leve, clinicamenteclinicamenteclinicamente in-in-in
significante, na pressão sanguínea, em decorrência da
vasodilatação, mas, o que é mais importante, exacerba
muito os efeitos de nitratos e de doadores externos de
NO, como a nitroglicerina, usada para angina, causan
do uma hipotensão potencialmente fatal. Esses efeitos
hipotensivos ocorrem independentemente da sequên-ên
cia e/ou horário das drogas. O Sildenafil é, portanto,
contraindicado para pacientes em uso de nitratos de
qualquer forma. Além disso, o Sildenafil é metaboli
zado pelas vias dos CYP2C9 e 3A4. A inibição dessas
vias por outras drogas pode aumentar a concentração
plasmática de Sildenafil, intensificando os efeitos co
laterais.
Cheitlin, M.D., Hutter, A. M., Brindis, R. G., Ganz, P., Kaul,
S., Russell, R. O., et al. Use of Sildenafil (Viagra) in patients
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Urology 60:4, 2002; e Seftel, A. D. Phosphodiesterase type 5
inhibitor differentiation based on selectivity, pharmacokine
tic, and efficacy profiles. Clin. Cardiol. 27: I14, 2004.
466 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
se), bem como micróbios como, por exemplo, bactérias
e micobactérias (tuberculose e lepra), fungos e até cé
lulas tumorais. Os alvos celulares do NO produzido pela
NOSII são heme-proteínas contendo metal, como cito
cromos P450, e proteínas ferro-enxofre, como aconitase
e os complexos mitocondriais I e II, todos os quais são
inibidos. O NO também reage com grupos tiol e tirosi
nas, causando nitrosação ou oxidação de proteínas, e
com oxigênio ou superóxido, formando compostos óxi
dos de nitrogênio muito reativos, por exemplo, peroxini
trito. Esses intermediários reativos causam uma varie
dade de alterações no DNA, incluindo clivagem de fita
e deaminação. Essas modificações, portanto, afetam
muitas enzimas metabólicas cruciais, levando a efeitos
citostáticos e citotóxicos contra esses patógenos.
Embora o NO seja essencial para a funçãoão antimi-antimi
crobiana dos macrófagos, a superprodução de NO pela
NOSII foi implicada no choque séptico circulatório in
duzido por citocina. O choque séptico é caracterizado
por uma resposta in�amatória sistêmica à infecção mi
crobiana, na qual a pressão sanguínea cai rapidamente,
mediada pela superprodução de NO, levando à queda
na perfusão dos tecidos e no aporte de oxigênio e, even
tualmente, à falência múltipla dos órgãos. A hipotensão
nesses pacientes é geralmente refratária às drogas va
soconstritoras convencionais. O papel do NO no choque
séptico e as intervenções terapêuticas com inibidores
de NOS são discutidos na Correlação Clínica 11.9.
Além de ser produzido durante a in�amação aguda,
o NO é gerado pela NOSII durante a in�amação crô
nica. NOSII está presente e ativa em várias condições
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.9
Superprodução de Óxido Nítrico no Choque Séptico
Embora o NO seja essencial nas funções tumorici
da e bactericida de macrófagos, a superprodução de
NO (pela NOSII) tem sido implicada no choque sépti
co circulatório induzido por citocina, no homem. No
choque séptico, a produção excessiva de NO leva a
uma importante vasodilatação sistêmica e uma que
da rápida e geralmente fatal da pressão sanguínea, o
que gera um suprimento insuficiente de sangue e oxi
gênio para órgãos periféricos, eventualmente levando
à falência múltipla dos órgãos. O choque séptico está
associado com uma taxa de mortalidade extrema
mente elevada de 50%–70%; mais pessoas morrem
anualmente de choque séptico do que de infarto do
miocárdio, acidente vascular cerebral, trauma, ou
câncer de pulmão ou mama. A hipotenção induzida
por NO nesses pacientes ocorre pelo mecanismo de
relaxamento da musculatura lisa, isto é, ativação da
guanilato ciclase. Intervenção terapêutica com inibi
dores de NOS está sendo investigada para tratamento
in�amatórias crônicas, incluindo artrite reumatoide,
doença de Crohn e asma, em que pode potencialmente
exacerbar algumas situações, embora efeitos protetores
também tenham sido descritos.
NOSIII
NOSIII é encontrada primariamente em células
endoteliais vasculares, que recobrem todos os vasos
sanguíneos e miócitos cardíacos. Está localizada na
membrana em virtude da miristoilação cotradução e
palmitoilação pós-tradução da extremidade N-termi
nal. Como a NOSI, é expressa constitutivamente e é ati
vada pelo in�uxo de cálcio, que se liga à calmodulina
facilitando sua ligação com ambas NOSI e NOSIII para
ativação. A quantidade de NO sintetizado no estado ati
vado é muito baixa, isto é, picomolar, e o NO produzido
serve de vasodilatador do músculo liso vascular, me
diado por ligante e dependente do �uxo. O NO também
desempenha funções antitrombóticas e anti-in�amató
rias, por inibir adesão e agregação de plaquetas e leu
cócitos. Além disso, NO também inibe angiotensina II,
um vasoconstritor.
A síntese de NO pela NOSIII é ativada em resposta
a aumento do cálciocálcio apósapós ligaçãoligação dede ligantesligantes comocomo ace-ace
tilcolina, bradicinina, histamina ou insulina, ou após
estresse de �uxo (shear stress), a força mecânica do
�uxo sanguíneoíneo sobresobre aa superfíciesuperfície luminalluminal dodo endoté-endoté
lio vascular. Velocidade aumentada do �uxo sanguíneo,
portanto, estimula aa liberaçãoliberação dede cálciocálcio ee aumentaaumenta aa ati-ati
vidade da NOSIII, levando à vasodilatação.
de choque séptico. Curiosamente, embora a inibição
da NOS eleve a pressão sanguínea e a resistência vas
cular sistêmica rapidamente e com sucesso, ela tam
bém causa uma progressiva queda no débito cardíaco
e exacerba a disfunção de órgãos,órgãos,s, levandolevandolevando aaa morta-morta-morta
lidade aumenada nos ensaios clínicos. Assim, o NO
desempenha um papel prejudicial no choque séptico,
devido à sua mediação da hipotensão, mas também
pode desempenhar um papel benéfico na sobrevivên
cia, talvez devido às propriedades do NO na vasodi
latação localizada ou na antiagregação plaquetária,
na antiadesão de leucócitos, na antiapoptose ou an
tioxidação.
Assreuy, J. Nitric oxide and cardiovascular dysfunction
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165, 2006; Cauwels, A. Nitric oxide in shock. Kidney Int. 72:
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 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
O NO se difunde para fora da célula endotelial e para
dentro das células musculares lisas adjacentes, onde se
liga e ativa a guanilato ciclase solúvel, que faz cGMP
(Figura 11.23). cGMP ativa a proteína quinase G, uma
quinase dependente de cGMP que fosforila uma varie
dade de canais, incluindo canais de cálcio tipo L, e re
ceptores, todos levando à inibição do in�uxo de cálcio
na célula muscular lisa. A vasoconstrição do músculo
liso vascular requer in�uxo de cálcio, o qual se liga à
calmodulina que, por sua vez, ativa a quinase muscular
de cadeia leve (MLCK). MLCK então fosforila a cadeia
leve da miosina (MLC, myosin light chain), levando à
formação de pontes cruzadas entre as cabeças de mio
sina e o filamento de actina, resultando na contração
(p. 1001). A inibição do in�uxo de cálcio leva à diminui
ção no estímulo de MLCK pela calmodulina e diminuição
na fosforilação de MLC, causando desenvolvimento di
minuído da tensão do músculo liso e, portanto, vasodi
latação. cGMP aumentado também causa diretamente
desfosforilação de MLC, por ativação da MLC fosfatase.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.10
História e Efeitos Biológicos da Nitroglicerina
Nitroglicerina, mais corretamente chamada glice
ril trinitrato (GTN), foi sintetizada pela primeira vez
por Ascanio Sobrero, em 1846. Como GTN era extre
mamente explosiva e muitos acidentes fatais aconte
ceram, Alfred Nobel desenvolveu um procedimento,
em 1864, para estabilizar GTN misturando-a com ter
ra diatomácea. A fortuna que ele fez com a dinamite é
a base para os Prêmios Nobel, conferidos anualmente
na Suécia para contribuições excepcionais nos cam
pos de física, química, fisiologia ou medicina, litera
tura, economia e paz mundial. Logo depois, em 1867,
Sir Thomas Lauder Brunton relatou, pela primeira
vez, o uso de amil nitrato inalado em seus pacientes
com dores no peito e, em 1879, William Murrell pu
blicou um artigo descrevendo o uso do composto de
maior duração e mais convenientes que o GNT para
aliviar melhor a dor da angina pectoris. O GTN fun
ciona por meio da dilatação das artérias do coração,
permitindo assim mais oxigenação do tecido. Ironica
mente, Murrell morreu em 1912 de insuficiência car
díaca não-tratada, nunca tendo tomado GTN, e Nobel
recusou-a quando foi prescrita por seu médico para
doença cardíaca.
Só em 1987, mais de um século após a publicação
de Murrell, que o óxido nítrico liberado no metabolis
mo de GTN foi postulado como sendo o agente ativo da
dilatação dos vasos sanguíneos coronários. Só 15 anos
mais tarde, o mecanismo da liberação do óxido nítrico
da nitroglicerina foi elucidado. A aldeído desidrogenase
mitocondrial (ALDH2) metaboliza GTN a 1,2-glicerol
dinitrito e nitrito. O nitrito e mais reduzido, formando
• 467
Assim como para NOSI, os níveis de cGMP são regu
lados por um equilíbrio entre a atividade da guanilato
ciclase e das fosfodiesterases, que hidrolisam cGMP a
5!-GMP e, assim, desligam a atividade da proteína qui
nase G e a vasodilatação. Vários tratamentos terapêuti
cos são baseados na administração de NO, tanto dire
tamente como em uma forma precursora. A Correlação
Clínica 11.10 discute o uso da administração direta de
NO como tratamento terapêutico.
NOSIII tem uma sequência N-terminal peculiar, que
sofre miristoilação em um ponto, e palmitoilação em
dois outros pontos dessa sequência,ência, localizandolocalizando aa en-en
zima na membrana, onde é direcionada para cavéolas
do plasmalema. As cavéolas são pequenas invaginações
da membrana plasmática, caracterizadas pela presen
ça de proteínas chamadas caveolinas, que servem para
organizar e ligar moléculas sinalizadoras como recep
tores, proteínas G e NOS, na membrana plasmática.
Nas concentrações citoplasmáticas baixas de cálcio, a
NO. O mecanismo dessa redução não está esclarecido,
mas ALDH2 pode também estar envolvida nessa etapa,
e demonstrou-se que membros da cadeia mitochondrial
de transporte de elétrons reduzem nitrito a NO. Alter
nativamente, um importante mecanismo de redução de
nitrito pode ser por reação direta com hemoglobina de
soxigenada ou mioglobina.
Quando usado por longos períodos de tempo para
condições crônicas, GTN perde gradativamente sua
eficácia. Vários mecanismos foram propostos para
explicar a tolerância do paciente a essa droga. A bio
transformação insuficiente de GTN pela ALDH2, que
ocorre na depleção de uma ALDH2 redutora, ou o
aumento no estresse oxidativo, em virtude do meta
bolismo mitocondrial prejudicado, são duas possibi
lidades.
Beretta, M, Gruber, K., Kollau, A., Russwurm, M., et al.
Bioactivation of nitroglycerin by purified mitochondrial
and cytosolic aldehyde dehydrogenases. J. Biol. Chem.
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gas that heals. Escrito para “Beyond Discovery: The Path
from Research to Human Benefit,” 2002. Esse artigo pode
ser acessado em http://www.beyonddiscovery.org/content/
view.article.asp?a_318.
468 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Acetilcolina
Bradicinina
Substância-P
Endotoxina L-arg Forças de fluxo
Insulina
citocinas
+ +
Ca++ R
NOSII
L-arg
+ árias outras proteínas importantes para a ativi
NOSIII +
Célula endotelial NO + citrulina
Célula NO + GC cGMP
alvo GTP
Figura 11.23 NO produzido pela NOSIII na célula
endotelial.
A concentração de cálcio na célula endothelial sobe em virtude
da ligação de ligante ou estresse de �uxo (shearstress), levan
do à ativação da produção de NO pela NOSIII. O NO se difunde
através da membrana da célula endothelial para uma célula de
músculo liso, onde ativa sGC.
Redesenhado com base em figura de Klabunde, R. E. Cardio
vascular Physiology Concepts. Essa figura pode ser acessada
em http://cvphysiogy.com/blood%20Flow/BFO11.htm.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.11
Usos Terapêuticos de Óxido Nítrico Inalado
O óxido nítrico distribuído sistemicamente causa
hipotensão sistêmica, limitando drasticamente sua uti
lidade como agente terapêutico. Por outro lado, o óxido
nítrico que é inalado, teoricamente deveria relaxar a
vasculatura pulmonar, mas qualquer excesso de NO que
atingisse a corrente sanguínea seria eliminado por óxi
-hemoglobina, impedindo assim a vasodilatação sistê
mica. De fato, estudos demonstraram que a inalação de
NO aumenta a oxigenação sistêmica de recém-nascidos
hipoxêmicos com hipertenção pulmonar persistente do
recém-nascido (PPHN). NO inalado também diminui a
incidência de, e mortalidade por, displasia broncopul
monar (BPD) em bebês prematuros. Em adultos, doen
ça pulmonária obstrutiva crônica (COPD) foi tratada
com sucesso com uma combinação de oxigênio suple
mentar e NO; tal regime reduziu a pressão arterial pul
monar e a resistência vascular pulmonar e aumentou o
débito cardíaco nos pacientes tratados.
Entretanto, muitos pacientes não respondem à te
rapia com NO inalado. Além disso, os efeitos do NO
são transitórios e desaparecem quando o tratamento é
descontinuado, exigindo terapia contínua. Aproxima
damente, 70% do NO inalado é excretado na urina na
forma de nitrato, em 48 h. Vários estudos descreveram
o uso de Sildenafil, uma droga usada no tratamento de
caveolina-1 liga-se e inibe NOSIII, mantendo-a em esta
do inativo. No in�uxo de cálcio, a calmodulina desloca
competitivamente a caveolina da NOSIII, resultando na
ativação da síntese pela NOS.
Várias
dade de NOSIII também estão localizadas nas cavéo
las. O transportador de aminoácidos catiônicos CAT-1,
presente nas cavéolas, está envolvido na captação de
L-arginina, garantindo assim um suprimento de subs
trato para a síntese de NO. NOSIII interage com porina,
um canal de ânion/cátion voltagem-dependente, que lo
caliza NOSIII perto de uma fonte de in�uxo de cálcio.
O receptor B2 de bradicinina também está presente, e
liga-se e inativa NOSIII. Após estimulação por bradi
cinina, esse complexo se dissocia e NOSIII é ativada.
A localização nas cavéolas é um importante regulador
da atividade de NOSIII; se a palmitoilação for inibida,
NOSIII não é encontrada nas cavéolas, e síntese de NO
não ocorre nessas células. Palmitoilação é um processo
reversível, que é in�uenciado por alguns agonistas e é
essencial para localização na membrana; relocalização
celular, resultando em inativação, pode ocorrer por
despalmitoilação.
disfunção erétil, para aumentar ou prolongar os efeitos
vasodilatadores do NO inalado. Como discutido na Cor
relação Clínica 11.8, o Sildenafilinibe a quebra de cGMP
por inibir a fosfodiesterase específica para cGMP, PDE5,
uma isoforma muito expressa no pênis, retina e tecido
pulmonar. Em pacientes com hipertensão pulmonar, a
vasodilatação pulmonar mediada pelo NO inalado foi
aumentada e prolongada pelo tratamento conjunto com
Sildenafil.
Curiosamente, embora o NO inalado não tenha efei
to sobre a pressão sanguínea sistêmica, outros efeitos
sistêmicos foram relatados, incluindo inibição plaquetá
ria e leucocitária, que resulta em trombose diminuída e
redução na lesão por isquemia/reperfusão. Acredita-se
que esses efeitos sistêmicos sejam mediados por tióis de
baixo e de alto peso molecular, originários do sangue,
que reagem com NO e o transportam em sua forma está
vel pelo corpo. A hemoglobina S-nitrosilada e albumina
sérica, bem como outras nitrosaminas, ferro-nitrosilas e
lipídeos nitrados são mediadores propostos.
Bloch, K. D., Ichinose, F., Roberts, J. D., Jr., and Zapol, W.
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75: 339, 2007; e Griffiths, M. J. D. and Evans, T. W. Inhaled ni
tric oxide therapy in adults. N. Engl. J. Med. 353: 2683, 2005.
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
CORRELAÇÃO CLÍNICA 11.12
O Papel de eNOS na Disfunção Endotelial
O óxido nítrico produzido pela eNOS nas células
endoteliais vasculares é responsável pela regulação do
tônus vascular, pela inibição da agregação e adesão de
plaquetas e leucócitos, pela expressão diminuída de
genes pró-in�amatórios, e limitação da proliferação
de células musculares lisas vasculares. Defeito na fun
ção endotelial, disfunção endotelial, é caracterizado
por síntese reduzida de NO levando a vasoespas
mo aumentado, in�amação vascular e trombose, e é
comumente visto conjuntamente com outros fatores
de risco cardiovasculares, como diabetes, hiperten
são, aterosclerose ou hipercolesterolemia. Acredita
-se que estresse oxidativo vascular, devido à produção
aumentada de espécies reativas de oxigênio, particu
larmente superóxido, contribua para a disfunção en
dotelial devida, em parte, à reação do superóxido com
NO para formar peroxinitrito. Não apenas menos NO
está disponível para sua função biológica protetora,
mas o pexorinitrito é um poderoso agente oxidante e
nitrosante de moléculas, que pode danificar moléculas
de proteínas, DNA e lipídeos. Nitração covalente de
resíduos de tirosina de proteínas por espécies reativas
de oxigênio é frequentemente usado como um marca
dor de estresse oxidativo. Peroxinitrito é também res
ponsável pela depleção de tetra-hidrobiopterina, que
leva ao desacoplamento da transferência de elétrons
na eNOS, levando a eNOS a produzir superóxido, em
Muitos processos de doenças, como hipertenção,
hipercolesterolemia e diabetes, levam a disfunção
endotelial, que é caracterizada pelo comprometimento
das funções normais das células endoteliais, incluindo
vasodilatação e mediação da adesão plaquetária. Um
dos principais marcadores da disfunção endotelial é a
biodisponibilidade diminuída de NO, em decorrência da
função diminuída de NOSIII. A Correlação Clínica 11.12
discute algumas funções possíveis para o NO em os me
canismos da disfunção endotelial.
• 469
lugar de óxido nítrico, exacerbando ainda mais o es
tresse oxidativo. Na ausência de NO e na presença de
estresse oxidativo, várias vias pró-in�amatórias e pró
-ateroscleróticas são ativadas; essa é a base molecular
primária da disfunção endotelial.
O tratamento com drogas antioxidantes, como vi
tamina C ou E, não restaura a biodisponibilidade dos
níveis de NO, nem melhora o desempenho cardíaco,
talvez porque as vitaminas não eliminam o superóxido
antes que ele reaja com o NO. Uma das classes de dro
gas mais eficazes éé aa dasdas estatinas,estatinas, queque funcionamfuncionam di-di-di
minuindo o estresse oxidativo, via inibição da atividade
da NADPH oxidase, uma fonte importante de produção
de superóxido, e aumentando a produção de NO pela
eNOS, via expressão proteica e fosforilação. Inibidores
da enzima conversora de angiotensina (ACE) e agonis
tas do receptor de angiotensina II também aumentam
efetivamente o desempenho cardíaco. Essas drogas di
minuem a formação/ação da angiotensina II, uma pro
teína que ativa as NADPH oxidases, reduzindo assim o
estresse oxidativo.
Forstermann, U. Oxidative stress in vascular disease:
Causes, defense mechanisms, and potential therapies. Nat.
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Beyond lipid lowering: The role of statins in vascular protec
tion. Int. J. Cardiol. 86: 5, 2002.
Todas as NOSs produzem NO, que desempenha
funções tão diversas como neurotransmissão, vaso
dilatação, relaxamento muscular e citotoxicidade. As
consequências do NO podem ser benéficas, como na
manutenção do tônus vascular, aquisição de memória e
aprendizado, e proteção contra a invasão de patógenos,
bem como deletéria, como no choque séptico ou na in
�amação crônica e respostas mutagênicas. O resultado
final do NO produzido depende de onde está sendo pro
duzido, da regulação de sua produção, de quanto está
sendo produzido e que outras espécies reativas estejam
presentes.
470 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Bibliografia
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Citocromo P450
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Termos Chaves
arginina
citocromo P450
cGMP
calmodulina
cálcio cortisol
DHEA
�avina
�avoproteína
fosforilação
citocromo P450 redutase guanilato ciclase
citrulina heme
• 471
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heme proteína metabolismo de drogas
hidrofóbico metabolismo de xenobió
interações droga–droga ticos
metabolismo de ácido metabolismo do oxigênio
graxo mono-oxigenase
metabolismo de carcinó NADPH
genos neurotransmissão
472 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
polimorfismos proteína quinase G
porfirina óxido nítrico
proteína integral de mem- óxido nítrico sintase
brana resposta imune
Questões • CAROL N. ANGSTADT
Questões de Múltipla-escolha
1. Todas as alternativas a seguir sobre uma molécula
designada como citocromo P450 são corretas, ex
ceto que ela
A. contém um heme como grupo prostético.
B. catalisa a hidroxilação de um substrato hidro
fóbico.
C. pode aceitar elétrons de uma substância como
o NADPH.
D. sofre mudança no ferro heme após ligação de
um substrato.
E. vem da mesma família gênica que todos os ou
tros citocromos P450.
2. As �avoproteínas são geralmente intermediárias
na transferência de elétrons do NADPH para o ci
tocromo P450 porque
A. NADPH não pode atravessar a membrana.
B. �avoproteínas podem aceitar dois elétrons do
NADPH e doá-los, um de cada vez, para o cito
cromo P450.
C. têm um potencial de redução mais negativo do
que o NADPH, de modo que aceitam elétrons
mais facilmente.
D. a produção de NADPH no citosol é a única fon
te de elétrons.
E. contêm centros ferro-enxofre.
3. NADPH-citocromo P450 redutase
A. usa tanto FAD quando FMN como grupos
prostéticos.
B. liga ao citocromo P450 por fortes interações
hidrofóbicas.
C. requer um centro ferro-enxofre para atividade.
D. sempre passa seus elétrons para o citocromo b5.
E. pode usar NADH tão bem como NADPH.
4. As reações depois da 21-hidroxilação levando a
cortisol e andrógenos ocorrem em mitocôndrias
que requerem NADPH-adrenodoxina redutase e
adrenodoxina; NADPH-adrenodoxina redutase
A. contém ambos FAD e FMN.
B. passa seus elétrons para uma proteína com
centros ferro–enxofre.
C. é uma proteína integral de membrana.
D. reage diretamente com citocromo P450.
retículo
sinalização
síntese
testosterona
de
endoplasmático
esteroide
gasosa tetra-hidrobiopterina
transferência de elétron
vasodilatação
E. reage diretamente com citocromo b5.
5. O polimorfismo genético em genes de citocromo
P450 poderia levar
A. um indivíduo a metabolizar mal certas drogas.
B. um indivíduo a metabolizar certas drogas mais
rapidamente do que o normal.
C. um grupo étnico específico a experimentar
mais efeitos com certas drogas.
D. todas as anteriores.
E. nenhuma das anteriores.
6. Em presença de óxido nítrico sintase ativa, mas
com ausência de substrato
A. elétrons não podem ser transferidos para o
heme.
B. calmodulina não pode ligar Ca2+.
C. os domínios oxigenase e redutase se dissociam.
D. a produção de cGMP é aumentada.
E. serão formados superóxido e/ou peróxido de
hidrogênio.
Questões 7 e 8: O acetaminofen, um analgésico e an
tipirético, está disponível sozinho ou como um compo
nente de muitas medicações vendidas sem prescrição
médica. Superdosagem de acetaminofen, que pode le
var a danos no fígado, é um significativo problema de
saúde. O consumo de bebidas alcoólicas pode exacerbar
o problema, especialmente se o acetaminofen for con
sumido várias horas após a ingestão de álcool. O aceta
minofen, em doses normais, não é tóxico porque é me
tabolizado usando mecanismos normais para aumentar
A.
a solubilidade em água.
7. Normalmente, acetaminofen é primariamente me
tabolizado por
oxidação por citocromo P450 (CYP2E1).
B. conjugação com glucuronídeo ou sulfato.
C. conjugação com glutationa.
D. adição de um –OH ao anel.
E. redução com NADPH.
8. O álcool é um indutor e um substrato de CYP2E1.
O álcool ingerido ao mesmo tempo que o acetami
nofen pode proteger o fígado de lesão. Qual das se
guintes é correta?
A. CYP2E1 metaboliza álcool, mas não acetami
nofen.
 CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES
B. CYP2E1 está aumentado e converte acetami
nofen em uma forma não tóxica.
C. Ingeridos ao mesmo tempo, álcool e acetami
nofen competem pelo CYP2E1, de modo que
menos metabólito tóxico é formado.
D. Com intervalo de tempo maior, só o álcool rea
ge com CYP2E1.
E. Nenhuma das anteriores.
Questões 9 e 10: Como fitoterápicos são drogas que
não requerem prescrição médica, muitos pacientes não
informam seus médicos que estão usando tais produ
tos. Um paciente foi informado por seu médico que seu
nível de colesterol sanguíneo não estava respondendo
à droga estatina, geralmente efetiva, que ele estava to
mando. O paciente estava tomando, também, a erva de
São João, um agente fitoterápico, para melhorar seu hu
mor. A erva de São João induz uma atividade de citocro
mo P450 (CYP3A4). As estatinas são um grupo, dentre
muitas drogas, metabolizadas por CYP3A4.
9. A indução de citocromos P450
A. ocorre só por compostos exógenos.
B. ocorre só em nível transcripcional.
C. necessariamente resulta de transcrição au
mentada do mRNA apropriado.
D. requer a formação de um complexo indutor
-receptor.
D. pode ocorrer por processos pós-transcripcio
nais.
10. As estatinas podem ser consideradas xenobióticos
(substâncias exógenas metabolizadas pelo corpo).
Muitos xenobióticos são oxidados por citocromos
P450 para
A. torná-los carcinogênicos.
B. aumentar sua solubilidade em um ambiente
aquoso.
C. aumentar sua deposição no tecido adiposo.
D. aumentar sua atividade farmacológica.
E. todos os anteriores.
Questões 11 e 12: Alguns pacientes apresentam pro
funda hipotensão após cirurgia abdominal complicada
Respostas
1. E Várias famílias gênicas são conhecidas. A: todos
os citocromos são heme-proteínas. B: os tipos de
substratos são hidrofóbicos. É classificado como
monoxigenase. C: este é o doador de elétrons
usual. D: a mudança de hexa- para penta-coor
denado dá ao composto um potencial de redução
mais positivo.
2. B O heme pode aceitar apenas um elétron de cada
vez, enquanto NADPH sempre doa dois de cada
vez. A: NADPH passa só elétrons; não precisa en
• 473
por infecções bacterianas que produzem endotoxinas.
Tal hipotensão é frequentemente refratária ao trata
mento com drogas vasoconstritoras convencionais.
Essa hipotensão pode ser causada por uma superpro
dução de óxido nítrico, pela forma induzida da óxido
nítrico sintase (NOS). Administração de inibidores de
NOS, específicos para essa forma, pode ser um trata
mento apropriado para tais pacientes.
11. O óxido nítrico
A. é formado espontaneamente por uma redução
de NO2.
B. é sintetizado só em macrófagos.
C. é sintetizado a partir de arginina.
D. age como um potente vasoconstritor.
E. tem três isoformas.
12. Óxido nítrico sintase
A. catalisa uma reação de dioxigenase.
B. é semelhante aos citocromos P450 porque liga
zinco e tetra-hidrobiopterina.
C. aceita elétrons do NADH.
D. usa um �uxo de elétrons de NADPH para FAD,
para FMN, para ferro-heme.
E. é inibida por Ca2+.
Problemas
13. O fenobarbital é um potente indutor de citocromo
P450. A warfarina, um anticoagulante, é um subs
trato do citocromo P450, de modo que a droga é
metabolizada mais rapidamente do que o normal.
Se o fenobarbital for dado a um paciente, sem mu
dar a dosagem de warfarina, o que aconteceria? O
que aconteceria se a dosagem de warfarina fosse
ajustada para uma resposta adequada e, então, o
fenobarbital fosse retirado, sem ajustar a dose de
warfarina?
14. A hiperplasia adrenal congênita (CAH) ocorre
em virtude de uma deficiência de CYP21A2, uma
21-hidroxilase do retículo endoplasmático. A doen
ça resulta em cortisol diminuído, ACTH aumenta
do, hormônios androgênicos aumentados e proble
mas relacionados com o equilíbrio salino. Explique
porque isso acontece.
trar na membrana. C: se isso fosse verdade, o �u
xo de elétrons não ocorreria da forma que ocorre.
D: NADPH é necessário para as reações mediadas
por citocromo P450 no retículo endoplasmático e
na mitocôndria. E: centros ferro-enxofre desempe
nham um papel em alguns, mas não em todos os,
sistemas.
3. A Essa enzima é uma das duas proteínas de ma
míferos conhecida que fazem isso. B: a ligação é
eletrostática. C: algumas redutases fazem isso, mas
474 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
não essa. D: só algumas reações catalizadas pela
enzima o fazem. E: existem redutases NADH-de
pendentes, mas são enzimas diferentes.
4. B a proteína ferro-enxofre é a adrenodoxina. A: só
tem FAD. C: fica fracamente associada com a mem
brana. D e E: adrenodoxina atua como uma lan
çadeira de elétrons entre a redutase e o heme do
citocromo P450.
5. D A: isso ocorre se os variantes alélicos codifica
rem proteínas inativas ou menos ativas. B: se hou
ver duplicação gênica, um indivíduo pode ter quan
tidades maiores da proteína ativa. C: pode haver
maior expressão de variantes alélicos em popula
ções étnicas específicas.
6. E O2 é ativado, levando a esses produtos tóxicos.
A: superóxido resulta da transferência. B e C: isso
não acontece. D: o NO aumenta cGMP, e o NO não
é formado em ausência de substrato.
7. B Esses são mecanismos comuns para aumentar
a solubilidade em água. A: isso ocorre, mas nor
malmente em pequenas quantidades; o produto,
NAPQ1, é o metabólito tóxico. C: glutationa é con
jugada com NAPQ1 e o torna não-tóxico. D e E: não
ocorrem.
8. C A competição diminui a produção de NAPQ1,
o metabólito tóxico. A: ambos são substratos. B:
CYP2E1 converte acetaminofen no metabótilo tó
xico. D: álcool é metabolizado mais rapidamente,
de modo que o CYP2E1 que ele induziu está dispo
nível para metabolizar acetaminofen.
9. E Pode haver uma estabilização do mRNA ou uma
diminuição da degradação da proteína. A: tanto
substâncias endógenas como exógenas podem in
duzir citocromo P450. B e C: modificação trans
cripcional é apenas um dos mecanismos de indu
ção. D: isso foi demonstrado na indução de alguns
compostos, mas não todos.
10. B Xenobióticos oxidados por citocromo P450 são
geralmente muito lipofílicos, mas devem ser excre
tados no meio aquoso da urina ou da bile. A: isso
pode acontecer, mas certamente não é o propósito.
C: fazem isso antes da oxidação. D: oxidação tende
a reduzir a atividade farmacológica.
11. C O outro produto é a citrulina. A: é formado a par
tir de arginina. B: uma das isoformas da NO sintase
foi encontrada em macrófagos, mas isoformas neu
ronal e endotelial também existem. D: óxido nítri
co é um vasodilatador. E: três isoformas de óxido
nítrico sintase foram identificadas, mas óxido nítri
co é um composto específico.
12. D Essa é uma de duas enzima de mamíferos que
usam ambos, FAD e FMN. A: a reação é uma mo
noxigenação. B: citocromos não se ligam a eles.
C: o doador é NADPH. E: o sistema requer Ca2+-
-calmodulina, pelo menos as isoformas neuronal e
endotelial.
13. Se a warfarina for metabolizada e removida mais
rapidamente pelo citocromo P450, sua eficiência
terapêutica é diminuída. Com a mesma dosagem,
será menos eficiente como anticoagulante. Se o fe
nobarbital for retirado, os níveis de citocromo P450
cairão como tempo, até o nível não-induzido. Sem
modificação no nível de warfarina, eventualmente
haverá possibilidade aumentada de hemorragia.
14. Essa enzima converte 17-OH-progesterona em
11-desoxicortisol, o precursor do cortisol. Ela tam
bém converte progesterona em 11-desoxicorticos
terona, um precursor da aldosterona, que regula o
equilíbrio salino. O cortisol diminuído leva a uma
secreção aumentada de ACTH graças a diminui
ção no controle de retroalimentação (feedback).
ACTH elevado por período longo causa hiperpla
sia adrenal e produção aumentada de hormônios
androgênicos. Anormalidades no desenvolvimento
sexual são comuns em crianças com CAH.
PARTE III CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 475
FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

12
Membranas Biológicas:
Estrutura, Receptores
e Transporte de Solutos
Thomas M. Devlin
Professor Emérito, Drexel University College of Medicine

CONTEÚDO 12.10 TRANSPORTADORES ATIVOS PRIMÁRIOS, 510

12.11 TOXINAS FORMADORAS DE POROS E IONÓ
12.1 INTRODUÇÃO, 476
FOROS, 516
12.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS MEMBRANAS,
476
CORRELAÇÕES CLÍNICAS
12.3 MICELAS, BICAMADAS LIPÍDICAS E LIPOSSO
MOS, 484 12.1 Lipossomos como Carregadores de Drogas, Pro
teínas e Ácidos Nucleicos, 486
12.4 ESTRUTURA DAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS,
486 12.2 Anomalias na Fluidez de Membranas Celulares
em Doenças, 492
12.5 RECEPTORES DE MEMBRANAS, 493
12.3 O Rim de Mamíferos e as Aquaporinas, 500
12.6 DESLOCAMENTO DE MOLÉCULAS ATRAVÉS
DE MEMBRANAS, 495 12.4 Doenças Que se Devem à Perda de Sistemas de
Transporte de Membranas, 507
12.7 CANAIS E POROS DE MEMBRANAS, 497
12.5 Fibrose Cística e o Canal de Cl–, 516
12.8 PROTEÍNAS DO TRANSPORTE DE MEMBRA
NA, 504 12.6 Doenças Que Envolvem a Superfamília de Trans
portadores ABC, 518
12.9 TRANSPORTADORES DIRIGIDOS POR POTEN
CIAL ELETROQUÍMICO, 507

Conceitos Chaves
• Os principais lipídeos de membranas biológicas são
glicerofosfolipídeos, esfingolipídeos e colesterol.
A composição em lipídeos específicos varia com a
fonte da membrana.
• Em meio aquoso, lipídeos anfipáticos podem formar
esferas (micelas) e vesículas (lipossomos), que têm
uma membrana consistindo de uma bicamada de
lipídeos distribuídos aleatoriamente. Os grupos po
lares ficam em contato com o meio aquoso. As mem
branas biológicas têm uma estrutura semelhante.
• As proteínas de membrana são classificadas em
integrais (fortemente ligadas) ou periféricas (que
se dissociam facilmente). As proteínas integrais
têm um único segmento ou múltiplos domínios de
aminoácidos que atravessam a bicamada lipídica.
Algumas formam estruturas homo- ou hetero-oli
goméricas. Proteínas periféricas usam vários meios
para ligação à superfície da bicamada. A composi
ção em proteínas varia dependendo da função da
membrana.
476 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
• Os lipídeos e as proteínas se difundem livremen
te na bicamada no sentido lateral, mas não no
transversal. As membranas biológicas têm uma
assimetria química. Existem microdomínios de
lipídeos-proteínas nas membranas, com funções
específicas.
• Proteínas receptores de membranas interagem
com fatores de crescimento, hormônios e outras
moléculas pequenas, iniciando uma resposta celu
lar. Alguns receptores são canais iônicos, enquanto
outros iniciam reações enzimáticas ou interações
intracelulares proteína–proteína.
12.1 INTRODUÇÃO
As membranas das células eucarióticas ou procarió-
ticas têm as mesmas classes de componentes químicos,
são semelhantes em organização estrutural e têm mui
tas propriedades em comum. Há diferenças, entretan
to, em componentes lipídicos, proteicos e carboidratos
específicos. Elas têm uma aparência trilaminar quando
vistas por microscopia eletrônica (Figura 12.1), com
duas faixas escura em ambos os lados de uma faixa cla
ra. A maioria das membranas de mamíferos tem uma
espessura de 7-10 nm, e uma camada densa interna
frequentemente mais espessa do que a camada densa
externa. As membranas intracelulares são geralmente
mais finas do que as membranas plasmáticas. As mem
branas têm uma assimetria química, e suas superfícies
FIGURA 12.1 Micrografia eletrônica da membrana
plasmática de eritrócitos mostrando a aparência
trilaminar.
Um espaço claro separa as duas linhas elétron-densas. A mi
croscopia eletrônica demonstrou que a linha densa interna é
frequentemente mais grossa do que a linha externa. Aumento
de cerca de 150.000 X.
Cortesia de J. D. Robertson, Duke University, Durham, NC.
• Estruturas específicas de proteínas nas membra
nas facilitam o deslocamento através das membranas
de íons e compostos que não se difundem. Elas
são classificadas como proteínas canais/poros ou
transportadores. Transportadores facilitam o des
locamento sem investimento de energia metabóli
ca. Outros requerem energia da hidrólise do ATP
ou um gradiente de [Na+] ou [H+] para o desloca
mento de um substrato.
• Algumas toxinas formam poros em membranas. Io
nóforos facilitam o movimento de íons através das
membranas.
são pontilhadas por proteínas globulares em relevo. São
estruturas dinâmicas que permitem às células e às es
truturas subcelulares ajustarem suas formas e muda
rem de posição. O lipídeo está em um estado líquido,
no qual tanto proteínas como lipídeos são capazes de se
difundir e interagir.
As membranas celulares controlam a composição do
espaço que englobam, por meio da exclusão de vários
íons e moléculas e pela presença de sistemas transpor
tadores seletivos para o movimento transmembrânico
de substâncias. As concentrações das substâncias nos
compartimentos celulares são moduladas pelo controle
do deslocamento de substratos, cofatores e íons através
das membranas. Reguladores extracelulares da função
celular ligam-se a receptores proteicos nas membranas
plasmáticas e seu sinal é transmitido dos receptores da
membrana para a via metabólica adequada. As mem
branas plasmáticas desempenham um papel no reco
nhecimento célula–célula, na manutenção da forma
celular e na locomoção celular.
12.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA
DAS MEMBRANAS
Os lipídeos e as proteínas são os principais compo
nentes de todas as membranas. Suas concentrações va
riam muito entre as membranas (Figura 12.2). As pro
teínas são responsáveis pela função das membranas e,
dependendo da fonte, membranas diferentes têm com
plementos proteicos muito diferentes. Uma pequena
quantidade de vários polissacarídeos, como glicoproteí
nas ou glicolipídeos, está presente em membranas, mas
não há carboidratos livres.
Lipídeos São Importantes
Componentes das Membranas
Glicerofosfolipídeos, esfingolipídeos e colesterol são
os três principais lipídeos componentes das membra
nas eucarióticas. Glicerofosfolipídeos e esfingomielina,
um esfingolipídeo que contém fosfato, são classificados
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 477

como fosfolipídeos. Bactérias e algas azuis-verdes con 1CH2OH

têm glicerolipídeos nos quais um carboidrato é ligado

diretamente ao glicerol. Algumas membranas contêm HO2C H
pequenas quantidades de outros lipídeos, como triacil OHOH
glicerol e diol derivados (ver p. 707, para estruturas),
bem como lipídeos covalentemente ligados a proteínas. 3CH2 O P OH
Os lipídeos têm um papel estrutural, embora muitos (a) O
também tenham outras funções celulares.

Lipídeo Proteína
(b)

Membrana % do componente FIGURA 12.3 L-Glicerol 3-fosfato.

0 100
(a) Configuração estereoquímica do L-glicerol 3-fosfato (sn
-glicerol 3-fosfato). O H e o OH ligados a C2 estão acima, e C1
Mielina
e C3 estão abaixo do plano da página. (b) Modelo de preenchi
Golgi
humano
Eritrócito mento de espaço de L-glicerol 3-fosfato. Esquema de cores: H,
branco; C, cinza; O, vermelho; N, verde; e P, amarelo.
(b) cortesia do Dr. Daniel Predecki, Shippensburg University,
Plasmática
PA

X
Retículo
endoplasmático O Cabeça
polar
Nuclear O P O–

Mitocondrial
Mitocondrialexterna O

1CH2 2CH 3CH2

interna O O

C O C O
FIGURA 12.2 Porcentagem de lipídeos e proteínas em
várias membranas celulares. CH2 CH2
Os valores são para fígado de rato, exceto para a mielina e a
CH2 CH2
membrana plasmática de eritrócito humano. Os valores do
fígado de outras espécies, incluindo a humana, indicam um CH2 CH2
padrão semelhante. CH2 CH2

CH2 CH2
Caudas
Glicerofosfolipídeos São os CH2 CH2 hidrofóbicas

Lipídeos Mais Abundantes das CH2 CH2

CH2 CH
Membranas
CH2 CH
Os glicerofosfolipídeos (fosfoglicerídeos) têm uma
CH2 CH2
molécula de glicerol com um fosfato esterificado no
carbono α (Figura 12.3) e dois ácidos graxos de ca CH2 CH2
deia longa esterificados nos átomos de carbono rema CH2 CH2
nescentes (Figura 12.4). O glicerol não contém car
CH2 CH2
bono assimétrico, mas os átomos de carbono α não
são estequiometricamente idênticos. A esterificação CH2 CH2
de um fosfato a um carbono α torna a molécula as CH2 CH2
simétrica. Glicerofosfolipídeos de ocorrência natural
CH2 CH2
são designados pelo sistema de numeração estereoes
pecífica (sn) (Figura 12.3), discutido na p. 728. CH3 CH3
(a) (b)
1,2-Diacilglicerol 3-fosfato, ou ácido fosfatídico,
é o composto parental dos glicerofosfolipídeos. Uma FIGURA 12.4 Estrutura de glicerofosfolipídeo.
(a) Ácidos graxos de cadeia longa são esterificados em C1 e C2 do
ponte fosfodiéster com glicerol liga colina, etanola
mina, serina, glicerol e inositol (Figura 12.5). Fosfa L-glicerol 3-fosfato. X pode ser H (ácido fosfatídico) ou um dentre os
vários alcoóis apresentados na Figura 12.5. (b) Modelo de preenchi
tidiletanolamina (etanolamina glicerofosfolipídeo ou mento de espaço. Ver Figura 12.3 para esquema de cores.
cefalina) e fosfatidilcolina (colina glicerofosfolipídeo (b) Cortesia do Dr. Daniel Predecki, Shippensburg University, PA.
478 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

CH3CH e fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato nos endossomos (Um

Colina HO CH2 CH2 N
+
3CH
3
Olhar Mais Atento 12.1).

Etanolamina HOCH2CH2 NH+3 OCH2 CHOH CH2O

OPO–

H –O OP
O

Serina CC
HOCH2 +O
NH3 OH O

CH2 CH CH2 CH2CH CH2

O O O O
H
C CO O C CO O
Glicerol HOCH2 CCH2 OH
CH2 CH2 CH2 CH2
OH

H H
H OH
Inositol
OH OH
OH OH H FIGURA 12.7 Fosfatidilglicerol fosfoglicerídeo
H (cardiolipina).
H OH
FIGURA 12.5 Estruturas dos principais alcoóis
esterificados ao ácido fosfatídico para formar
glicerofosfolipídeos.
ou lecitina) são os glicerofosfolipídeos mais comuns nas
membranas (Figura 12.6). Fosfatidilglicerol fosfogli
cerídeo (Figura 12.7) (difosfatidilglicerol ou cardio
lipina) contém dois ácidos fosfatídicos ligados por um
glicerol e é encontrado quase que exclusivamente nas
membranas mitocondriais internas e em membranas
bacterianas. Inositol, um hexa-hidroxi álcool, é este
rificado ao fosfato no fosfatidilinositol (Figura 12.8).
Diferentes derivados fosforilados estão localizados em
diferentes membranas; fosfatidilinositol 4-fosfato pre
domina no Golgi, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato nas
membranas plasmáticas, e fosfatidilinositol 3-fosfato
alifáticas
Cadeias
longas Cadeias
alifáticas
longas
Dois ácidos graxos são esterificados em C1 e C2
do glicerol nos glicerofosfolipídeos; os principais são
apresentados na Tabela 12.1. Um ácido graxo satura
do fica geralmente em C1 do glicerol, e um ácido graxo
insaturado em C2. Existem entre 500 e 1.000 espécies
moleculares de lipídeos nas membranas, principalmen
te por causa do número de possíveis combinações de
ácidos graxos em diferentes fosfo e esfingolipídeos. A
designação das diferentes classes de fosfolipídeos não
especifica os ácidos graxos que contêm. A fosfatidilcoli
na geralmente contém ácido palmítico ou esteárico em
C1, e um ácido graxo insaturado C18, oleico, linoleico ou
linolênico, em C2.
Fosfatidiletanolamina contém ácido palmítico ou olei
co em C1, mas um ácido graxo poli-insaturado de cadeia
longa, como o ácido araquidônico, na posição C2. Cada
tipo de membrana celular tem uma composição distinta

CH3
O CH2N
CH2 + CH3 O CH2CH2NH3
+
CH3
OPO– O PO–

O O

CH2 CH CH2 CH2 CH CH2

CO
C
O O O O O

CCO O

CH2alifáticas
Cadeias
longas
CH2 CH2 CH2

Cadeias
alifáticas
longas

Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina
(a) (b)

FIGURA 12.6 Estruturas dos dois glicerofosfolipídeos mais comuns.

(a) Fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina. (b) Modelo de para esquema de cores. (b) Cortesia do Dr. Daniel Predecki,
preenchimento de espaço da fosfatidilcolina. Ver Figura 12.3 Shippensburg University, PA.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 479

H H
2 3
UM OLHAR MAIS ATENTO 12.1
H OH O–
OH OH 4 Pode estar
1
OH H P OH presente em Fosfatidilinositóis Têm Muitas Funções
C-4 ou
6 5
H O C-4 e C-5
Os fosfatidilinositóis, nas células, têm várias fun
O H OH
ções. Eles estão envolvidos nas membranas como
fontes de segundos mensageiros (p. 552), na ativação
O P O–
de canais iônicos de membranas (p. 497),497),), nanana ativa-ativa-ativa
O ção de enzimas, envolvidos na endo- e na exocitose,
CH2 CHCH2
e como âncoras de proteínas (p. 490).490).). Fosfatidilinosi-Fosfatidilinosi-Fosfatidilinosi
tol 4,5-bisfosfato é a fonte dos segundos mensageiros
O O
CO inositol trisfosfato e diacilglicerol (p. 553), que estão
CO envolvidos na ação de alguns hormônios. Presume
CH2 CH2 -se que fosfatidilinositol 3-fosfato e fosfatidilinositol
3,5-bisfosfato estejam envolvidos no controle do trá
fego de membranas em endossomos. Também estão
Cadeias envolvidos com o citoesqueleto e o controle da for
alifáticas ma e da mobilidade celular, e estão implicados em
longas
funções citosólicas e nucleares. Enzimas que meta
FIGURA 12.8 Fosfatidilinositol. bolizam fosfatidilinositóis foram ligadas a doenças
Grupos fosfato também são encontrados em C-4 ou C-4 e C-5 humanas.
do inositol. Os grupos fosfato adicionais aumentam a carga da
cabeça polar desse glicerofosfolipídeo. Di Paolo, G. e De Camilli, P. Phosphoinositides in cell
regulation and membrane dynamics. Nature 443: 651,
de grupos ácidos graxos em seus glicerofosfolipídeos. A 2006.
composição em ácidos graxos dos lipídeos tem um im
pacto significativo na função da membrana. Grupos de
ácidos graxos do mesmo tecido em diferentes espécies células de câncer metastático, sugerindo um papel para
são muito semelhantes. A composição em grupos acil os lipídeos nas propriedades invasivas dessas células.
pode mudar em diferentes condições
nutricionais e patofisiológicas. COOH COOH COOH

Um ácido graxo saturado é uma

cadeia reta, assim como um ácido
graxo insaturado trans. Duplas liga
ções em cis, que ocorrem na maioria
dos ácidos graxos de ocorrência natu
ral, criam uma dobra na cadeia hidro
carbônica (Figura 12.9). A presença
de
folipídeo
ácidostem um efeito
graxos insaturados
notávelnosobre
fos- 110°
123° 123°
a fluidez da membrana (p. 491).

Glicerol éter fosfolipídeos contêm

uma longa cadeia alifática em ligação
éter ao glicerol, na posição C1 (Figura
12.10). Éter fosfolipídeos contêm um
grupo alquil (alquil acilglicerofosfo
lipídeo) ou um éter a,b-insaturado,
chamado plasmalogênio. Plasmalo
gênios contendo etanolamina (etano
ao Cadeia Dupla ligação Dupla ligação
lamina
fosfato
lina plasmalogênio)
são
plasmalogênio)
abundantes esterificados
no
ou tecido
colina (co-
ner saturada em trans em cis
(a) (b)

voso e no coração, mas não no fígado.
Mais de 50% dos etanolamina glicero
fosfolipídeos do coração humano são
plasmalogênios. Altos níveis de lipí
deos com ligação éter foram identifi
cados nas membranas plasmáticas de
FIGURA 12.9 Conformação de grupos ácidos graxos em fosfolipídeos.
(a) Ácidos graxos saturado (palmítico) e insaturado (palmitoleico) com duplas liga
ções em trans são cadeias retas em sua conformação de mínima energia, enquanto
uma cadeia (palmitoleico) com uma dupla ligação cis tem uma dobra. A dupla ligação
trans é rara em ácidos graxos de ocorrência natural. (b) Modelos de preenchimento de
espaço. Ver Figura 12.3 para esquema de cores.
Cortesia do Dr. Daniel Predecki, Shippensburg University, PA.
480 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

TABELA 12.1 Principais Ácidos Graxos em Glicerofosfolipídeos

Nome Comum Nome Sistemático Fórmula Estrutural
Ácido mirístico n-Tetradecanoico CH3—COOH
–(CH2)12
Ácido palmítico n-Hexadecanoico CH3 –(CH2)14—COOH
Ácido palmitoleico cis-9-Hexadecenoico CH3–(CH2)5—CH=CH—(CH2)7—COOH
Ácido esteárico n-Octadecanoico CH3—(CH2)16—COOH
Ácido oleico cis-9-Octadecenoico CH3—(CH2)7—CH=CH—CH2)7—COOH
Ácido linoleico cis,cis-9,12-Octadecadienoico CH3—(CH2)3—CH2—CH=CH)2—(CH2)7—COOH
Ácido linolênico cis,cis,cis-9,12,15-Octadecatrienoico CH3—(CH2—CH=CH)3—(CH2)7—COOH
Ácido araquidônico cis,cis,cis,cis-5,8,11,14-Icosatetraenoico CH3—(CH2)3—CH2—CH=CH)4—(CH2)3—COOH

+
NH3
Esfingolipídeos Estão Presentes nas
Cabeça polar CH2 Membranas
CH2 Os aminoalcoóis esfingosina (D-4-esfingenina) e di
O -hidroesfingosina (Figura 12.11) são a base dos esfingo
O P O–
lipídeos. Um grupo acil graxo de cadeia longa saturado
ou insaturado em ligação amida com o amino grupo da
O esfingosina (Figura 12.12) é uma ceramida, que é seme
CH2 CH CH2 lhante em estrutura ao diacilglicerol. Várias substitui
O O
ções são encontradas no grupo hidroxila de C1. As es
hidrofóbicas
Caudas CH CH2
fingomielinas, os esfingolipídeos mais abundantes em
C O
tecidos de mamíferos, têm fosforilcolina esterificada
em C1 (Figura 12.13) e são classificadas como fosfoli
CH2 CH2 pídeos. Esfingomielina e colina glicerofosfolipídeos são
semelhantes em estrutura e apresentam muitas proprie
dades em comum; ambos são anfipáticos. A composição
Cadeias em ácidos graxos da esfingomielina varia de tecido para
alifáticas longas tecido; a esfingomielina da mielina contém predominan
temente ácidos graxos de cadeia mais longa (C24).
FIGURA 12.10 Etanolamina plasmalogênio.
Note a ligação éter da cadeia alifática em C1 do glicerol.
CH2OH CH2OH
Glicerofosfolipídeos São Anfipáticos CH
Esfingosina
HC
CH2
C NH2
OH CH
CH2 NH2

H HC OH
Glicerofosfolipídeos são anfipáticos, contendo uma
extremidade polar e uma não-polar. A carga da extre
midade polar (grupo da cabeça) consiste de um fosfato CH CH2
carregado (pK∼2), que é negativamente carregado em
CH2
pH 7,0, e qualquer carga dos grupos (bases) do fosfato
(Tabela 12.2). Colina e etanolamina glicerofosfolipí (CH2)11 (CH2)11

deos são zwitterions em pH 7,0, com uma carga nega
tiva no fosfato e uma carga positiva no nitrogênio. Fos
fatidilserina tem uma carga positiva no grupo a-amino
da serina e duas cargas negativas, uma no fosfato e uma
no grupo carboxila da serina, com uma carga final de
–1. Diferentemente, glicerofosfolipídeos contendo ino
sitol e glicerol têm apenas uma carga negativa no fos
fato. Os derivados 4-fosfoinositol e 4,5-bisfosfoinositol
são compostos muito polares, com cargas negativas no
fosfato. A extremidade não-polar dos glicerofosfolipí
deos consiste de cadeias hidrocarbônicas hidrofóbicas
de grupos acil graxo ligados.
CH3 CH3
Di-hidrosfingosina
(D-4-esfingenina) (D-di-hidrosfingenina)
FIGURA 12.11 Estruturas da esfingosina e da di
hidroesfingosina.
Glicoesfingolipídeos contêm um açúcar ligado por
uma ligação b-glicosídica ao grupo C1 OH de uma ce
ramida; não contêm fosfato e não são carregados. Um
subgrupo é o dos cerebrosídeos, que contêm ou glicose
(glucocerebrosídeos) ou galactose (galactocerebrosí
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 481

TABELA 12.2 Carga Predominante de Glicerofosfolipídeos e Esfingomielina em pH 7,0 Gangliosídeos, os glicoes

Esfingomielina
Difosfatidilglicerol
Fosfatidilinositol
Fosfatidilglicerol
Fosfatidiletanolamina
Fosfatidilserina
Fosfatidilcolina
Lipídeo(cardiolipina)
CH2 Grupo–2
–1
Fosfato +1,
Base+1
–1
0 Carga0Final
–2
–1 fingolipídeos mais complexos,
contêm um grupo oligossaca
rídeo com um ou mais resíduos
de ácido N-acetilneuramínico
(ácido siálico) (ver p.676 para
estrutura); são compostos an
fipáticos, com uma carga ne
gativa em pH 7,0, e represen
tam 5-8% do total de lipídeos
do cérebro. Cerca de 20 tipos
diferentes, que diferem no nú
mero e na posição relativa dos
resíduos de hexose e de ácido
siálico, foram identificados.
OH Uma descrição detalhada dos gangliosídeos é apresen
tada na p. 752. A parte carboidrato dos gangliosídeos,
CH2 que se estende para além da superfície da membrana,
CH NH está envolvida no reconhecimento célula–célula, e serve
HC
HC OH OC
CH2 como ponto de ligação para hormônios e toxinas bacte
rianas, como a toxina da cólera (p. 545).

CH CH2 Colesterol É um Importante

CH2 CH2 Componente das Membranas

CH2 CH2 Plasmáticas
CH2 CH2
CH2 CH2 O colesterol é uma molécula compacta, rígida e hi
drofóbica (Figura 12.16), com quatro anéis fundidos
CH2 CH e uma cadeia hidrocarbônica C8-ramificada ligada ao
CH2 CH anel D, na posição 17. Tem um grupo hidroxila polar em
CH2 CH2 C3. A presença de colesterol nas membranas altera a
fluidez e reduz a permeabilidade.
CH2 CH2

CH2 CH2 A Composição em Lipídeos Varia

CH2 CH2 entre Membranas

CH3 CH2
CH2
CH3
FIGURA 12.12 Estrutura de uma ceramida.
deos). Frenosina (Figura 12.14) é um galactocerebrosí
deo que contém um ácido graxo C24 em ligação amida.
Galactocerebrosídeos predominam no cérebro e no te
cido nervoso, enquanto glucocerebrosídeos ocorrem em
pequenas quantidades em tecidos não-neurais. Galac
tocerebrosídeos contendo um grupo sulfato esterifica
do em C3 do açúcar são classificados como sulfatídeos
(Figura 12.15). Cerebrosídeos e sulfatídeos geralmente
contêm ácidos graxos com 22–26 carbonos. Glicoesfin
golipídeos neutros frequentemente têm 2 (di-hexosíde
os), 3 (tri-hexosídeos) ou 4 (tetra-hexosídeos) resíduos
de açúcar ligados ao grupo 1-OH da ceramida. Os com
ponentes açúcares comuns são diglicose, digalactose,
N-acetildiglucosamina e N-acetildigalactosamina.
As membranas plasmáticas e intracelulares têm
composições lipídicas distintas (Figura 12.17). As
membranas de um tecido específico, por exemplo, fíga
do, em diferentes espécies, contêm classes muito seme
lhantes de lipídeos. A membrana plasmática apresenta
a maior variabilidade em composição percentual por
que o conteúdo de colesterol é afetado pelo estado nu
tricional do animal. As membranas de mielina dos axô
nios neuronais são ricas em esfingolipídeos, e têm uma
alta proporção de glicoesfingolipídeos. As membranas
intracelulares, por exemplo, do retículo endoplasmáti
co, contêm primariamente glicerofosfolipídeos e poucos
esfingolipídeos. A composição lipídica de mitocôndrias,
núcleo e retículo endoplasmático rugoso é semelhante,
com as do complexo de Golgi ficando entre as mem
branas intracelulares e a plasmática. Cardiolipina é
abundante na membrana mitocondrial interna e rara na
membrana externa, estando essencialmente ausente de
outras membranas. Os lipídeos contendo colina, fosfati
dilcolina e esfingomielina, são mais comuns, seguidos
482 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

CH3 H OH
HOH HCH2OH
CH3 N+ CH3

CH2 HO H O
H O(β)
CH2
CH2
O
H C NH
O P O–
H C OH OC
O
HC
(CH2 CH2
CHOH
CH2
CH CH2
CH NH
CH3
CH2)11 CH3
H C OH C O
(CH2)19
HC CH2

CH CH2

CH2 CH2 FIGURA 12.14 Estrutura de um galactocerebrosídeo

CH2 CH2 contendo ácido graxo C24.
CH2 CH2
H OH
CH2 CH2 HO
H O H CH2OH
CH2 CH2 SO3–
H O
CH2 CH H O(β)
CH2 CH CH2

CH2 CH2 H C NH
CH2 CH2 H C OH OC

CH2 CH2 HC (CH2)22

CH2 CH2 CH CH3

CH2 CH2 (CH2)12

CH3 CH2 CH3

CH2
FIGURA 12.15 Estrutura de um sulfatídeo.
(a) CH3

H3C CH2
CH CH2
CH3 CH3
17 CH2 CH
CH3
C D
CH3

A B
3 5
HO
(a)

(b)

FIGURA 12.16 Colesterol.

(b)
FIGURA 12.13 Esfingomielina contendo colina.
(a) Estrutura de esfingomielina contendo colina. (b) Modelo de
preenchimento de espaço. Ver Figura 12.3 para esquema de cores.
Cortesia de Dr. Daniel Predecki, Shippensburg University, PA.
por fosfatidiletanolamina. A constância em composição
de várias membranas sugere uma relação entre lipídeos
e as funções específicas dessas membranas.
(a) Estrutura do colesterol. (b) Modelo de preenchimento de
espaço. Ver Figura 12.3 para esquema de cores.
(b) Cortesia do Dr. Daniel Predecki, Shippensburg University, PA.
Proteínas de Membrana
As proteínas de membranas desempenham várias
funções, incluindo um papel estrutural na manutenção
da forma da célula, como receptores para a ligação de
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 483

Glicerofosfolipídeos Colesterol Fosfatidilcolina Fosfatidilserina

Esfingolipídeos Outros Esfingomielina Fosfatidilinositol

Fosfatidiletanolamina Cardiolipina
Membrana % dos componentes lipídicos
Membrana % dos fosfolipídeos
0 100 0 100

Plasmática Plasmática

Golgi Golgi

Retículo Retículo
endoplasmático endoplasmático
rugoso rugoso

Nuclear Nuclear

Mitocondrial Mitocondrial
externa externa

Mitocondrial Mitocondrial
interna interna
(a) (b)

FIGURA 12.17 Composição em lipídeos de membranas celulares isoladas de fígado de rato.

(a) Quantidade dos principais componentes lipídicos em per de colesterol. (b) Composição em fosfolipídeos como percenta
centagem do total de fosfolípideos. A área indicada como como gem do total de fosfolipídeos. Valores de Harrison, R. e Lunt, G.
“Outros” inclui mono, di e triacilglicerol, ácidos graxos e ésteres G. Biological Membranes. New York: Wiley, 1975.

hormônios e fatores de crescimento, como facilitadores sistemas aquosos. Estão presentes em muitas mem
do movimento transmembrânico de solutos e íons, e branas, mas particularmente na mielina, onde repre
como enzimas envolvidas na transdução de sinais (p. sentam cerca de 50% do componente proteico. Lipofili
529). Cerca de 30% dos genes de células de mamíferos na, uma importante lipoproteína da mielina do cérebro,
codificam proteínas de membrana. contém mais de 65% de aminoácidos hidrofóbicos e
ácidos graxos covalentemente ligados. (Ver p. 489 para
As proteínas de membrana são classificadas com
uma discussão sobre a localização e a ligação de proteí
base na facilidade de separar a proteína dos lipídeos nas de membrana.)
da membrana. O isolamento das proteínas integrais de
membrana (intrínsecas) requer o rompimento da mem
brana por detergentes ou solventes orgânicos e, quando Carboidratos de Membranas
isoladas, geralmente contêm lipídeos firmemente liga
dos. Essas proteínas ficam imersas no meio lipídico da São Parte de Glicoproteínas ou
membrana (p. 487).487).). ElasElasElas contêmcontêmcontêm sequênciassequênciassequências dedede amino-amino-amino
ácidos hidrofóbicos, que constituem os segmentos da
Glicolipídeos
proteína em contato com os lipídeos da membrana. A Os carboidratos estão presentes nas membranas
natureza hidrofóbica dessas proteínas, e, portanto, sua como oligossacarídeos covalentemente ligados a pro
insolubilidade em água, tornou difícil determinar suas teínas (glicoproteínas) e a lipídeos (glicolipídeos). Os
estruturas tridimensionais e estudar suas propriedades açúcares nos oligossacarídeos incluem glicose, galac
funcionais. tose, manose, fucose, N-acetilgalactosamina, N-ace
tilglucosamina e ácido N-acetilneuramínico (ácido
Proteínas periféricas de membrana (extrínsecas)
siálico) (Figura 12.18 e Apêndice). As estruturas das
são fracamente ligadas à superfície da membrana lipí
glicoproteínas e dos glicolipídeos são apresentadas
dica. Tratamento com soluções salinas de diferentes nas páginas 678 e 749, respectivamente. O carboidrato
forças iônicas, pHs ácidos ou básicos do meio, ou cliva
fica na superfície extracelular da membrana plasmá
gem de lipídeos covalentemente ligados, liberam essas
tica e na superfície luminal do retículo endoplasmá
proteínas. As proteínas periféricas de membrana são
tico. As funções dos carboidratos ligados a proteínas
subclassificadas com base em seu modo de ligação à
incluem reconhecimento e adesão célula–célula e ação
membrana (p. 487).487).). MuitasMuitasMuitas proteínasproteínasproteínas periféricasperiféricasperiféricas fraca-fraca-fraca
como receptor. Há pouco ou nenhum carboidrato livre
mente ligadas são típicas proteínas globulares solúveis
nas membranas.
em água.

Proteolipídeos são lipoproteínas hidrofóbicas, so

lúveis em clorofórmio e metanol, mas insolúveis em
484 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

CH2OH
O
12.3 MICELAS, BICAMADAS
H H
H LIPÍDICAS E LIPOSSOMOS
OH H
HO OH

Lipídeos Formam Estruturas

H HNCOCH3

N-Acetil-α-D-glucosamina Vesiculares
CH2OH A característica estrutural básica das membranas
O deve-se às propriedades físico-químicas dos glicerofos
HO H
H
folipídeos e esfingolipídeos. Esses compostos anfipáti
OH H
cos, com uma cabeça hidrofílica e uma cauda hidrofó
H OH bica (Figura 12.19a), interagem em sistemas aquosos
para formar esferas, chamadas micelas (Figura 12.19b).
H HNCOCH3 Os grupos das cabeças polares ficam no lado de fora da
N-Acetil-α-D-galactosamina esfera, enquanto as caudas hidrofóbicas interagem para
excluir água. As micelas têm apenas uma superfície po
H
lar, que é o lado apresentado para a fase aquosa. Podem
O
H H ser preparadas micelas contendo um único lipídeo ou
CH3 uma mistura de lipídeos. A concentração de lipídeos
HO
H HO
OH
necessária para formar micelas é a concentração mi
celar crítica (p. 1083). A formação de micelas também
OH H depende da temperatura e, se uma mistura de lipídeos
α-L-Fucose estiver presente, da razão entre as concentrações dos
diferentes lipídeos. A estrutura de uma micela é muito
H estável, graças às interações hidrofóbicas entre as ca
O deias hidrocarbônicas e à atração dos grupos polares de
H O
CH3 C N HCOH COOH cabeça pela água. Micelas são importantes na digestão
HCOH intestinal e na absorção de lipídeos (p. 1083).
CH2OH
H H H OH Bicamadas Lipídicas Sintéticas e
Lipossomos
OH H
II Lipídeos anfipáticos, como glicerofosfolipídeos, tam
N-Acetil-D-neuramínico
bém podem formar uma estrutura em bicamada, com
FIGURA 12.18 Estruturas de alguns carboidratos de duas camadas de lipídeos. Nessa estrutura existe um
membrana. contato mínimo das cadeias hidrocarbônicas com a
água. Os grupos da cabeça polar ficam na interface en
tre o meio aquoso e o lipídeo, e as caudas hidrofóbicas
interagem, criando um ambiente interior hidrofóbico
que exclui a água (Figura 12.19c). Essa conformação

Cabeça polar

Cauda
hidrofóbica

(a) (b) (c) (d)

FIGURA 12.19 Interações de fosfolipídeos em um meio aquoso.

(a) Representação de um lipídeo anfipático. (b) Corte trans lipossomo. Cada estrutura tem estabilidade inerente em virtude
versal da estrutura de uma micela. (c) Corte transversal da es das cadeias hidrocarbônicas e da atração dos grupos polares das
trutura de uma bicamada lipídica. (d) Corte transversal de um cabeças por água.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 485

em bicamada é a estrutura lipídica básica das membra

nas biológicas. As bicamadas lipídicas são extremamen
te estáveis. São mantidas juntas por forças hidrofóbicas
das cadeias hidrocarbônicas e interações iônicas dos Difusão rotacional
rápida
grupos carregados das cabeças com a água. As bicama
das lipídicas fecham-se espontaneamente, se rompidas. Troca transversa
muito lenta (flip-flop)
Uma bicamada lipídica formará uma vesícula esféri
ca, separando o ambiente externo de um compartimen Difusão lateral
rápida
to aquoso interno. Tais vesículas, chamadas lipossomos
(Figura 12.19d), foram preparadas usando-se lipídeos
Flexão das cadeias
purificados e misturas de lipídeos de membranas bio hidrocarbônicas rápida
lógicas. Dependendo do procedimento, são preparadas
vesículas unilamelares ou multilamelares (vesículas
dentro de vesículas) de vários tamanhos (20 a 1.000 nm
de diâmetro). A capacidade de lipídeos anfipáticos para
FIGURA 12.20 Mobilidade de componentes lipídicos nas
se auto-organizarem em bicamadas é uma propriedade
membranas.
importante para a formação das membranas celulares.
A bicamada lipídica é essencialmente impermeável
a moléculas não-lipídicas (por exemplo, carboidratos) e
Propriedades Gerais de Bicamadas carregadas, mas não a moléculas hidrofóbicas neutras.
Íons inorgânicos (Na+, K+, Cl– etc.), moléculas orgâni
Lipídicas cas carregadas e macromoléculas fora de lipossomos
não têm acesso ao interior dos lipossomos. Durante a
Moléculas de fosfolipídeos trocam de lugar facil formação dos lipossomos, solutos não-permeáveis, en
mente com moléculas vizinhas na monocamada se tretanto, podem ser sequestrados no interior aquoso.
parada, levando à rápida difusão lateral no plano da Assim, ambos os ambientes, externo e interno, dos li
membrana (Figura 12.20). Na preparação de mem possomos podem ser manipulados, e as propriedades,
branas artificiais com diferentes lipídeos, os lipídeos incluindo a capacidade de excluir moléculas, a intera
se distribuem aleatoriamente entre as monocamadas. ção com várias substâncias e a estabilidade em dife
Ocorre rotação em torno das ligações carbono-carbo rentes condições, podem ser avaliadas. Os lipossomos
no nas cadeias de ácidos graxos; de fato, há um maior são importantes ferramentas no estudo de aspectos da
grau de rotação próximo à extremidade metil, levando estrutura e da função da membrana natural. Proteínas
à maior mobilidade no centro do que na superfície da isoladas de membranas biológicas foram incorporadas
bicamada lipídica. As moléculas lipídicas individuais
não mudam facilmente de uma monocamada para a
outra (flip-flop), em virtude dos impedimentos ter
modinâmicos do movimento de um grupo de cabeça
carregado através do centro lipofílico. Além disso, lipí
deos não escapam facilmente da bicamada. Bicamadas
lipídicas, portanto, têm uma estabilidade inerente na
qual as moléculas individuais movem-se rapidamente
em sua própria monocamada, mas não trocam facil
mente com a monocamada adjacente.

A interação de lipídeos em uma bicamada é muito

diferente da ilustada na Figura 12.19c. O interior das
bicamadas das membranas é muito fluido e está em
constante movimento. As cadeias acil dos glicerofosfo
lipídeos e esfingolipídeos têm um movimento aleatório,
intercalando-se com as cadeias da monocamada opos
ta. A viscosidade é maior quanto mais perto dos grupos
de cabeça dos lipídeos. Colesterol, na bicamada, reduz a
fluidez perto da superfície da membrana porque o coles
terol não se estende na camada tanto quanto as cadeias
acil dos fosfolipídeos. A Figura 12.21 é uma representa
ção computacional do arranjo de fosfolipídeos em uma
bicamada, em um determinado momento. Várias cama
das de moléculas ordenadas de água sobre a superfície
das membranas influenciam o ambiente da membrana.
FIGURA 12.21 Modelo de uma bicamada lipídica paralisada
num determinado instante.
Uma bicamada artificial, consistindo de dipalmitoilfosfatidilcoli
na circundada por água, modelada em computador. As cores dos
átomos são C cinza (exceto C metil terminal amarelo e C glicerol
marrom), O éster em vermelho, P e O verde, C e N colina violeta
pálido, O da água azul escuro e H da água azul claro. Os hidrogê
nios dos lipídeos foram omitidos.
Figura generosamente fornecida por Richard Pastor e Richard
Venablr, FDA, Bethesda, MD.
486 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
em membranas de lipossomos para estudar sua função.
Com algum sucesso limitado, foram testados liposso
mos de composições lipídica e proteica variadas, tanto
em animais como no homem, como um substituto para
eritrócitos, para entregar drogas encapsuladas e como
vetores para terapia gênica (Correlação Clínica 12.1).
12.4 ESTRUTURA DAS
MEMBRANAS BIOLÓGICAS
Modelo Mosaico das Membranas
Biológicas
Todas as membranas plasmáticas e intracelulares são
bicamadas lipídicas, com lipídeos anfipáticos e colesterol
orientados de modo que suas partes hidrofóbicas intera
jam, para minimizar o contato com a água ou outros gru
pos polares. Seus grupos de cabeça polar ficam na inter
face com o ambiente aquoso. Proteínas ficam distribuídas
na superfície ouimersas na bicamada lipídica e podem se
difundir lateralmente no mar de lipídeos. Existe, entre
tanto, organização molecular nas membranas biológicas,
incluindo restrições à distribuição aleatória de lipídeos
e proteínas em alguns domínios. A Figura 12.22 é um
modelo de uma membrana biológica, indicando um grau
de organização. As características gerais das bicamadas
lipídicas explicam muitas das propriedades das membra
nas celulares, incluindo a fluidez, a flexibilidade que per
CORRELAÇÃO CLÍNICA 12.1
Lipossomos como Carregadores de Drogas, Proteínas e Ácidos Nucleicos
Os lipossomos têm sido usados para a administra
ção de uma variedade de substâncias terapêuticas,
para alcançar órgãos ou tecidos específicos. Tanto
compostos hidrofílicos como hidrofóbicos podem ser
carregados, sendo os primeiros no interior aquoso e
os últimos na membrana do lipossomo. Lipossomos
preparados a partir de fosfolipídeos purificados são
não-tóxicos e biodegradáveis. Foram avaliados lipos
somos catiônicos, que interagirão com a carga de su
perfície da membrana celular, e outros com proteínas
específicas para se ligarem a receptores específicos
da membrana celular. A captação de lipossomos pode
ser por fusão com a membrana celular ou por endo
citose. Os lipossomos são úteis para drogas que são
metabolizadas muito rapidamente. A incorporação da
droga em lipossomos permite sua liberação ao lon
go de um período de tempo mais longo, aumentando
assim sua eficácia. Agentes antibióticos, antineoplá
sicos, antimaláricos, antivirais, antifúngicos e anti
-inflamatórios são eficazes quando administrados em
lipossomos. Pode ser possível preparar lipossomos
FIGURA 12.22 Modelo da membrana plasmática de
mamífero.
Os vários lipídeos são esferas de cores diferentes; eles seriam
mais aleatórios do que indicado. As proteínas são representa
das por estruturas globulares, e os carboidratos são ligados às
proteínas pelas árvores pretas na superfície externa da mem
brana. A rede de fibras abaixo da membrana representa o cito
esqueleto e sua associação com a membrana.
Figura muito gentilmente oferecida pelo Professor P. Kinnu
nen, University of Helsinki, Finlândia.
mite mudança de forma, a capacidade de se autosselar e
a impermeabilidade.
com um alto grau de especificidade para tecidos, de
modo que a entrega de drogas, e talvez até a reposi
ção enzimática, sejam possíveis por essa técnica. Os
lipossomos foram testados como veículo para intro
duzir ácidos nucleicos em células para terapia gênica
e tratamento com RNAs pequenos. Em outro uso, li
possomos contendo hemoglobina concentrada foram
testados com algum sucesso como uma alternativa
para transfusão, em lugar de eritrócitos.
Torchilin, V. P. Recent approaches to intracellular deli
very of drugs and DNA, and organelle targeting. Annu. Rev.
Biomed. Engineering 8: 343, 2006; Dass, C. R. e Choong, P.
F. Selective gene therapy for cancer therapy using cationic
liposomes: In vivo proof of applicability. J. Controlled Re-Re
lease 113: 155, 2006; Tsuchida, E., Sakai, H., Horinouchi, H.
e Kobayashi, K. Hemoglobin-vesicles as a transfusion alter
native. Artificial cells, blood substitutes. Immobilization
Biotech. 34: 581, 2006; e Sofou, S. e Sgouros, G. Antibody
-targeted liposomes in cancer therapy and imaging. Expert
Opin. Drug Delivery 5: 189, 2008.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
Lipídeos São Distribuídos
Assimetricamente nas Membranas
Os lipídeos são distribuídos assimetricamente nas
duas bicamadas das membranas biológicas. Cada ca
mada tem uma composição diferente em glicerofosfo
lipídeos e esfingolipídeos. A distribuição assimétrica
de lipídeos da membrana plasmática de eritrócito hu
mano é apresentada na Figura 12.23. Esfingomielina
predomina na camada externa, enquanto fosfatidileta
nolamina é predominante na camada lipídica interna.
Fosfatidilinositóis não são mostrados na Figura 12.23
em virtude de suas baixas quantidades, mas localizam
-se primariamente na camada interna; a quantidade
varia de acordo com o tecido. A distribuição de coles
terol entre a bicamada não é apresentada. Os lipídeos
das membranas intracelulares também são distribuídos
assimetricamente, mas não com o mesmo padrão da
membrana plasmática. A assimetria responde por algu
mas das diferenças funcionais entre as duas camadas.
A assimetria dos lipídeos é estabelecida durante a
biossíntese das membranas no retículo endoplasmático.
O movimento transverso não-catalizado (flip-flop) en
50 Fosfolipídeos totais
Camada externa
25 Esfingomielina
Fosfatidilcolina
l
atotodmegatnecreP
Outros
Fosfatidilserina
25
Fosfatidiletanolamina
Camada interna
50
FIGURA 12.23 Distribuição de fosfolipídeos entre as
camadas interna e externa da membrana de eritrócito
humano.
Os valores são as percentagens de cada fosfolipídeo na membra
na. Outros incluem fosfatidilinositol, fosfatidilinositol 4-fosfato,
fosfatidilinositol 4,5-fosfato e ácido fosfatídico.
Dados de Verkeij, A. J., Zwaal, R. F. A., Roelofsen, B. Comfurius,
P. et al. Biochim. Biophys. Acta 323: 178, 1973; e Zachowski, A.
Biochem. J. 294: 1, 1993.
• 487
tre as bicamadas lipídicas das membranas é lento, mas
ocorre. A assimetria de lipídeos é mantida por transpor
tadores de lipídeos, que catalisam o movimento unidi
recional de lipídeos específicos de uma camada para a
outra, às vezes contra seu gradiente de concentração.
Uma subclasse de transportadores de lipídeos ATP-de
pendentes, aminofosfolipídeo translocases ou flippa
ses específicas para fosfatidilserina e fosfatidiletanola
mina, catalisa o transporte desses aminoglicerolipídeos
da camada extracelular para a citoplasmática. São res
ponsáveis por manter a baixa concentração desses fos
folipídeos na camada externa da membrana plasmática.
Um transportador para fora ATP-dependente, chamado
floppase, é não-específico para fosfolipídeos. Um ter
ceiro tipo de transportador de lipídeos, fosfolipídeo
scramblase, facilita a mistura bidirecional de fosfolipí
deos entre as duas camadas, distribuindo aleatoriamen
te os fosfolipídeos entre as camadas. É não-específico
em relação aos fosfolipídeos, não depende de ATP, e é
estimulado pelo aumento do Ca2+ intracelular. A fosfoli
pídeo scramblase 1 (PLSCR1) pode ser reversivelmen
te palmitoilada-despalmitoilada e contém um sítio de
fosforilação para a proteína quinase C, para controle de
atividade (p. 552). A scramblase desempenha um im
portante papel na cascata da coagulação mediada por
células (p. 1007), e no reconhecimento pelo sistema
retículo-endotelial das células que estão morrendo (p.
1034).). EmEm ambasambas asas respostas,respostas, oo movimentomovimento dede fosfa-fosfa
tidilserina da camada interna para a camada externa
leva à exposição de fosfatidilserina na superfície extra
celular e uma mudança na carga da superfície.
Proteínas Integrais de Membrana
As interações de proteínas com as membranas bio
lógicas são ilustradas na Figura 12.24. Proteínas inte
grais de membrana ficam mergulhadas na membrana,
com uma orientação definida, determinada por sua es
trutura primária. Seus segmentos transmembrânicos
contêm sequências ricas em aminoácidos hidrofóbicos
como leucina, isoleucina, valina e fenilalanina, que fi
cam em contato com o meio lipídico. Algumas têm gran
des domínios globulares em contato com o ambiente
aquoso em um ou em ambos os lados da membrana, e
algumas, particularmente as da membrana plasmática,
são glicoproteínas.
Dependendo da proteína específica, as extremida
des amino e carboxi-terminais podem estar em lados
opostos ou ambas no mesmo lado da membrana. No
primeiro caso, a extremidade carboxi-terminal é fre
quentemente encontrada na face citoplasmática. Muitas
proteínas das membranas plasmática e do retículo en
doplasmático têm os aminoácidos carregados positiva
mente lisina e arginina quatro vezes mais abundantes
na superfície citoplasmática do que na superfície extra
celular ouluminal. O movimento transverso (flip-flop)
de proteínas integrais é impedido por seu volume e res
trições termodinâmicas.
488 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Proteínas integrais de membrana Proteínas periféricas de membrana

Lado
extracelular

N
N

PI

– – – – –
Lado + + + + +
citosólico

(a) (b) (c) (d) (e) (f)

FIGURA 12.24 Interações de proteínas de membrana com a bicamada lipídica.

Ligada
membrânico.
O
nadiagrama
ou com
a uma
ailustra
proteína
bicamada
(b) Múltiplos
os múltiplos
integral.
lipídica.
segmentos
(d)
tipos
a) Ligada
Umdetransmembrânicos.
único
ligações
eletrostaticamente
segmento
de proteínas
trans-
(c)
à bicamada lipídica. (e) Ligada por uma sequência de aminoácidos
terminal curta hidrofóbica. (f) Ligada não-covalentemente a um
fosfatidilinositol (PI) da membrana.

Os segmentos transmembrânicos da maioria das

proteínas integrais de membrana são a-helicoidais,
mas motivos em b-barril também são encontrados. Al
gumas proteínas contêm um único segmento a-helicoi
dal transmembrânico, como ilustrado na Figura 12.24a.
Um exemplo é a glicoforina, com 131 resíduos, presen
te na membrana plasmática de eritrócitos humanos; a
sequência transmembrânica consiste dos resíduos de
aminoácidos 73-91. A extremidade amino-terminal
fica no exterior da célula e contém vários oligossacarí
deos, incluindo os determinantes dos grupos sanguí
neos ABO e MN; a glicoforina contém 60%, em peso,
de carboidratos. As integrinas também têm um único
segmento transmembrânico; essa ubíqua família de
proteínas liga o citoplasma com a matriz extracelular
(p. 381) e medeia a sinalização transmembrânica em
ambas as direções. FIGURA 12.25 Proteína integral de membrana.
A ilustração mostra uma subunidade da proteína trimérica
Outras proteínas integrais têm múltiplas sequências transportadora de amônio AmtB de E. coli mergulhada em
transmembrânicas, que se dobram para frente e para uma membrana bicamada lipídica. Note a interação lipídeo–
trás através da bicamada lipídica (Figura 12.24b e c). A proteína, e os compartimentos aquosos periplasmático (supe
Figura 12.25 ilustra tal proteína; note a interação do li rior) e intracelular (inferior) em ambos os lados da membrana.
Figura muito gentilmente cedida por Professor Fritz K. Wink
pídeo com a proteína e os compartimentos aquosos em
ler e Dr. Peter Hasler, Paul Scherrer Institute, Switzerland.
ambos os lados da membrana. O número de segmentos
transmembrânicos putativos é determinado colocando
-se em um gráfico o grau de hidrofobicidade de cada resí proteína integral são frequentemente organizados para
duo de aminoácido da proteína (p. 90). Essas sequências formar uma estrutura tubular, que pode servir de pas
com uma alta proporção de aminoácidos hidrofóbicos su sagem para o movimento de moléculas através da mem
gerem um segmento transmembrânico. O gráfico de hi brana (Figura 12.27). O canal de ânions de eritrócitos
dropatia da aquaporina, uma proteína integral de mem humanos forma um canal tubular (p. 510)510)) eee ééé ooo media-media-media
brana, é apresentado na Figura 12.26; o gráfico indica dor da troca de Cl– e HCO3– através da membrana. Tem
a presença de seis sequências transmembrânicas putati dois domínios principais: um domínio amino-terminal
vas. Proteínas com 2 a 24 sequências transmembrânicas hidrofóbico no lado citoplasmático da membrana, com
putativas foram identificadas com base na análise dos sítios de ligação para anquirina, uma proteína que an
aminoácidos da proteína ou por análise gênica. Múlti cora o citoesqueleto e outras proteínas citoplasmáticas,
plos segmentos transmembrânicos em a-hélice de uma e um domínio de 509 aminoácidos, com 12 sequências
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 489

3
210 tão envolvidas na transdução
intracelular de sinal (p. 529).
a
it
a
p
o
Seus diferentes métodos de
r
d
i
h
ligação são ilustrados na Figu
e
d ra 12-24c-f. Algumas se ligam
e
c
i −1
d
a proteínas integrais de mem
n
Í brana, como a anquirina que se
−2
liga ao canal de ânions nos eri
−3 0 63 126 trócitos (Figura 12.24c). Fosfo
189 252 lipídeos de membrana carrega
Número do resíduo de aminoácido dos negativamente interagem
com as regiões carregadas
FIGURA 12.26 Gráfico de hidropatia da aquaporina 1 de eritrócitos humanos.
positivamente das proteínas e
O índice de hidropatia de um aminoácido é um valor que indica sua tendência hidrofóbica ou
produzem ligação eletrostática
hidrofílica. Quanto mais positivo o valor, mais hidrofóbico é o aminoácido; um valor positivo é
um bom indicador se o aminoácido estará ou não em contato com um ambiente aquoso. Seg (Figura 12.24d); em alguns ca
mentos da proteína contendo uma alta proporção de aminoácidos hidrofóbicos são considera sos, Ca2+ é mediador da ligação.
dos como segmentos transmembrânicos putativos. Várias proteínas periféricas
têm sequências curtas de ami
transmembrânicas. Com um número par de segmentos noácidos hidrofóbicos em uma extremidade, que servem
transmembrânicos, a extremidade carboxila também de âncora (Figura 12.24e). Outras proteínas periféricas
fica no lado citoplasmático. Um motivo comum de proteí de membrana têm um domínio específico conservado
nas integrais é a oligomerização dos mesmos monômeros que se liga não-covalentemente ao grupo de cabeça ino
(complexos homoméricos) e oligomerização de monôme sitol 3-fosfato do fosfatidilinositol fixado na membrana
ros diferentes (complexos heteroméricos). (Figura 12.24f). Algumas proteínas têm várias formas
diferentes de ligação.
Proteínas integrais de membrana contêm domínios
específicos para interação com ligantes, para atividade
Extracelular
catalítica ou de transporte, e para ligação de carboidra
tos. A presença de lipídeos ligados e sítios específicos
para moléculas de água sugerem um alto grau de varia
bilidade estrutural e funcional. Elas não são estruturas
rígidas, e suas formas na membrana podem ser altera
das por interação com outras proteínas e com moléculas
pequenas. Os efeitos moduladores de lipídeos em uma
proteína podem refletir-se em mudança na ordenação e
na fluidez da membrana, bem como em uma influência
direta sobre a atividade da proteína. Muitas proteínas
integrais ligam lipídeos específicos por interações não
-covalentes entre os grupos de cabeça carregados, bem
como com a cauda hidrofóbica. Exemplos da influência
de lipídeos sobre a atividade de proteínas são a neces
sidade de fosfatidilcolina para a atividade da b-hidroxi
butirato desidrogenase (p. 718), e a estabilização dos
complexos da cadeia respiratória por cardiolipina (p.
480).). AtividadeAtividade máximamáxima dada diacilgliceroldiacilglicerol quinasequinase ocor-ocor
re com fosfatidilcolina com cadeias C18, e o colesterol Intracelular

foi implicado na atividade de várias bombas de íons da FIGURA 12.27 Múltiplos segmentos transmembrânicos
membrana e receptores de acetilcolina. em a-hélice.
Modelo em fita do monômero da AQP1 de eritrócito humano.
Múltiplos segmentos transmembrânicos em a-hélice formam uma
estrutura tubular. A extremidade amino-terminal é azul, e a car
Proteínas Periféricas de Membrana: boxi-terminal é vermelha. Seis hélices inclinadas que atravessam
a membrana circundam dois hemiporos (alças com hélices curtas
Âncoras Lipídicas – turquesa e laranja) que se encontram no centro da bicamada. A
seta branca ilustra o canal aquoso através da proteína.
Proteínas periféricas de membrana ficam sobre a
Figura reproduzida com permissão de Kozono, D., Yasui, M.,
superfície da membrana e podem ser facilmente remo King, L. S. e Agre, P. Aquaporin water channels: atomic struc
vidas, sem romper a bicamada lipídica. Muitas têm uma ture and molecular dynamics meet clinical medicine. J. Clin.
associação transitória com a membrana, com ligação e Invest. 109:1395, 2002. Copyright © (2002) Amer. Soc. Clin.
religação cíclicas. Isso controla sua atividade. Muitas es Invest. via Copyright Clearance Center.
490 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Várias proteínas periféricas de membra- (a) (b) (c)

HO
O
na têm um lipídeo covalentemente ligado,
O C
que é inserido na membrana lipídica, an
corando assim a proteína à membrana. Os HO C
sentadas na Tabela
vários tipos de âncoras e na Figura
12.3 lipídicas são12.28.
apre- H2N

CH2
Uma âncora dessas envolve fosfatidilino
NH S
sitol (ver Figura 12.8, p. 479), ligado a um
glicano consistindo de etanolamina, fosfa COOC

to, manose, manose, manose e glucosamina

(p. 678). O glicano é covalentemente ligado
à extremidade carboxi-terminal de uma
proteína por etanolamina (Figura 12.28a),
e a glucosamina é ligada covalentemente FIGURA 12.28Tipos de âncoras lipídicas para ligação de proteínas à
a fosfatidilinositol. Os grupos ácidos gra membrana.
xos do fosfatidilinositol são inseridos na (a) Âncora glicosilfosfatidilinositol (GPI). (b) Âncora miristoil. (c) Âncora
membrana lipídica. Essa forma de ligação é tioéter.
chamada âncora de glicosilfosfatidilinosi
tol (GPI); os grupos acil graxo parecem ser específicos do esteárico (C18) ou ácido oleico (C18) covalentemente
para diferentes proteínas. A liberação e a religação da ligados a uma cisteína. Os grupos acil servem como ân
proteína à âncora são controladas, permitindo a regu coras na membrana (Figura 12.28c), e a acilação afeta
lação da atividade da proteína. Uma fosfolipase C espe a proteína de muitas formas, incluindo função, locali
cífica para fosfatidilinositol catalisa a hidrólise da liga zação subcelular, estabilidade e interação com outras
ção fosfato–inositol, levando à liberação da proteína. A proteínas. O grupo acil é frequentemente encontrado
âncora GPI também controla a localização da proteína próximo a um ácido mirístico em ligação amida com
na membrana. Mais de 50 proteínas, incluindo enzimas, uma glicina N-terminal ou uma cisteína prenilada na
antígenos e proteínas de adesão celular, também são extremidade C-terminal. A função da proteína acilada
ligadas (Tabela 12.3). A âncora GPI foi conservada ao é controlada por ciclos dinâmicos de acilação e deaci
longo da evolução. lação. Essas proteínas aciladas servem de moléculas si
nalizadoras e estão envolvidas no transporte vesicular
As âncoras acil tio-éster ligadas (Tabela 12.3) en
e na sinapse neuronal.
volvem ácido mirístico (C14), ácido palmítico (C16), áci

TABELA 12.3 Tipos de Âncoras Lipídicas

Tipo de Âncora Envolvido na
LipídeoLigação Ligação Proteínas Representativas

(GPI)
Fosfatidilinositol Fosfatidilinositol Glicano (etanolamina, Acetilcolina esterase
fosfato, manose, Fosfodiesterase alcalina
manose, manose e Anidrase carbônica
glucosamina) Moléculas de adesão célula–célula
Hidrolases de superfície celular
Lipoproteína lipase
Proteína scrapie príon
Antígenos de superfície
Miristoil
e hidroxi éster
Tioéster Ácido mirístico (C14
(C14)) Ligação
glicina
–SH dena
ouN-terminal
–OH
amida Receptor b-adrenérgico
Receptores acoplados a proteína G
Proteína quinase c-CAMP
Receptor de insulina
Subunidade a de proteína G

Ácido palmítico (C16) Cisteína Receptor de transferrina

Ácido esteárico (C18) Serina
Ácido oleico (C18) Treonina
Tioéter-ligada Lipídeo
Farnesil
isoprenoide
(C15 Cisteína Muitas proteínas que ligam GTP
) Laminas nucleares
Geranilgeranil (C20) Proteína quinases
Dolicol Proteína fosfatases
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
Outra forma de ligação a lipídeo de uma proteína pe
riférica envolve uma ligação tioéter entre a proteína e
os lipídeos isoprenoides farnesil (C15) ou geranilgeranil
(C20) (Figura 12.29). As ligações são chamadas prote
ínas CAAX preniladas porque o isoprenoide é ligado
a um resíduo de cisteína na sequência Cys – Alifático
– Alifático – qualquer resíduo, próximo à extremidade
carboxi-terminal. O X aparentemente determina qual
isoprenoide é ligado; glutamina, metionina ou serina
são necessárias para a ligação de farnesil, e leucina
para geranilgeranil. Proteínas CAAXpreniladas são ge
ralmente ligadas à superfície citoplasmática.
HN H
C C HN H
C C
O O
CH2 CH2
S S
(a) (b)
FIGURA 12.29 Âncora isoprenoide tioéter para ligação de
proteínas de membrana.
(a) Âncora farnesil. (b) Âncora geranilgeranil.
FIGURA 12.30 Estrutura da bicamada lipídica acima (estado desordenado) e abaixo (estado ordenado) da temperatura de
transição.
Figura reproduzida com permissão de Voet, D. e Voet, J. Biochemistry, 2. ed., New York: Wiley, 1995. Copyright © (1995) John Wiley
& Sons, Inc.
• 491
Proteínas e Lipídeos Difundem nas
Camadas da Membrana
As interações entre diferentes lipídeos e entre lipí
deos e proteínas são muito complexas e dinâmicas. Há
uma fluidez na porção lipídica das membranas, e lipíde
os e proteínas individuais podem se mover rapidamente
pela superfície das membranas. Com membranas arti
ficiais, o grau de fluidez é dependente da temperatu
ra. Em temperaturas baixas, os lipídeos estão em um
estado de gel-cristalino, restringindo sua mobilidade; à
medida que a temperatura sobe, ocorre uma transição
de fase, com um aumento de fluidez (Figura 12.30). Nas
membranas biológicas, há uma mistura de fases líquida
-ordenada e líquida-desordenada, presumivelmente de
pendendo da composição em lipídeos e em proteínas,
e não de uma transição do estado gel-cristalino para
líquido-cristalino. De fato, interações entre lipídeos
e proteínas levam a variações nos estados ordenado
-desordenado ao longo da membrana, e a diferenças de
fluidez em diferentes áreas.
Membranas com glicerofosfolipídeos contendo gru
pos ácidos graxos de cadeia curta e insaturados têm
maior fluidez. Duplas ligações em cis nos ácidos graxos
insaturados dos fosfolipídeos causam dobras na cadeia
hidrocarbônica; isso impede a disposição densa das ca
deias e cria bolsões nas regiões hidrofóbicas. O coles
terol, com sua estrutura em anel plano e rígido, reduz
o enrolamento das cadeias de ácidos graxos e reduz a
fluidez. O significado clínico de colesterol elevado no
sangue sobre a fluidez das membranas celulares é des
crito na Correlação Clínica 12.2. O íon Ca2+ diminui a
fluidez das membranas por sua interação com os gru
pos de cabeça, carregados negativamente, dos fosfoli
pídeos, reduzindo a repulsão entre os grupos polares e
aumentando a proximidade entre as moléculas de lipí
deos. Isso causa a agregação dos lipídeos em conglome
rados e reduz a fluidez. A distribuição assimétrica dos
fosfo- e esfingolipídeos leva a uma diferença na fluidez
492 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 12.2
Anomalias na Fluidez de Membranas Celulares em Doenças
A fluidez da membrana pode controlar a atividade de
enzimas ligadas à membrana e de funções como fagoci
tose, e crescimento e morte celular. Um fator importante
na fluidez da membrana plasmática de organismos supe
riores e de mamíferos é a presença de colesterol. Com
conteúdo crescente de colesterol, as bicamadas lipídicas
tornam-se menos fluidas em sua superfície mais externa,
mas mais fluidas no centro hidrofóbico. As membranas
dos eritrócitos de indivíduos com anemia hemolítica com
acantócitos (spur cells) têm conteúdo aumentado de co
lesterol e uma forma “espinhada”, e as células são des
truídas prematuramente no baço. Essa condição ocorre
em doenças graves do fígado, como cirrose alcoólica.
O conteúdo de colesterol é aumentado em 25–65%, e a
fluidez da membrana diminui. Membranas de eritrócitos
requerem um alto grau de fluidez para passarem pelos
capilares. O colesterol aumentado na membrana plasmá
tica de outras células leva a um aumento no colesterol
de membranas intracelulares, o que também afeta sua
fluidez. O efeito intoxicante do etanol no sistema nervoso
ocorre provavelmente em virtude da modificação na flui
das duas camadas. As cadeias hidrocarbônicas dos lipí
deos são flexíveis, produzindo um maior grau de fluidez
no centro hidrofóbico do que mais próximo à superfície,
onde há mais restrições pelas porções mais rígidas das
cadeias hidrocarbônicas.
A composição em cadeias de ácidos graxos dos fos
folipídeos e em cholesterol das membranas é alterada
pela dieta, por alterações no Ca2+ intracelular, radicais
livres e peroxidação de lipídeos, levando a uma mudan
ça na fluidez da membrana. Anestésicos aumentam a
fluidez das membrane in vitro e podem agir in vivo por
meio de seu efeito sobre a fluidez das membranas de cé
lulas específicas. A anestesia é induzida por compostos
estruturalmente não-relacionados, tendo em comum a
solubilidade em lipídeos. Foram relatadas mudanças na
fluidez de membranas na hipercolesterolemia, hiper
tenção, diabetes mellitus, obesidade, alcoolismo, esqui
zofrenia e doença de Alzheimer.
Microdomínios de Complexos
Lipídeo–Proteína Estão Presentes
nas Membranas
Existe uma distribuição heterogênea, e não homo
gênea, de lipídeos e proteínas nas membranas. Estão
presentes microdomínios contendo lipídeos e proteínas
específicos. Esses domínios, chamados balsas lipídi
cas ou lipid rafts, são estruturas organizadas na bica
dez das membranas, alterando receptores de membrana
e canais iônicos. Indivíduos com abetalipoproteinemia
têm um aumento no conteúdo de esfingomielina e uma
diminuição de fosfatidilcolina nas membranas celulares,
com uma redução na fluidez das membranas.
Sugeriu-se que mudanças na fluidez das membranas
sejam um fator na deficiência de lecitina:colesterol acil
transferase, na hipertensão e na doença de Alzheimer.
À medida que técnicas de medida e avaliação de fluidez
de membranas celulares melhoram, algumas das mani
festações patológicas em doenças serão explicadas, com
base em alterações na estrutura e função de membranas.
Cooper, R. A. Abnormalities of cell membrane flui
dity in the pathogenesis of disease. N. Engl. J. Med.
297:371, 1977; Muller, W. E., Kirsch, C. e Eckert, G. P.
Membrane-disordering effects of beta-amyloid pepti
des. Biochem. Soc. Trans. 29:617, 2001; e Tsudo, K. e
Nishio, I. Membrane fluidity and hypertension. Am. J.
Hypertens. 16:259, 2003.
mada com uma distribuição diferente de lipídeos, em
comparação com a membrana circundante. Portanto,
as membranas biológicas são, na realidade, um mosai
co fluido de microdomínios diferentes (Figura 12.31).
Nas membranas plasmáticas, constituem uma porcen
tagem significativa da área total. A função das balsas
lipídicas é segregar e concentrar proteínas especí
ficas, para facilitar sua atividade. As balsas menores
são montadas e desmontadas constantemente e difun
dem-se livremente na membrana. As membranas plas
máticas e as membranas destinadas a interagir com
a membrana plasmática, como o lado trans do com
plexo de Golgi, contêm uma grande quantidade desses
microambientes, mas eles também podem ocorrer em
outras membranas celulares. Balsas de membranas
são definidas como microambientes pequenos (10–200
nm), heterogêneos, dinâmicos, enriquecidos em coles
terol e esfingolipídeos. Os lipídeos em todas as balsas,
entretanto, não estão necessariamente no mesmo es
tado físico-químico. A concentração mais elevada de
colesterol as torna menos fluidas do que o ambiente
lipídico circundante. O colesterol é importante na or
ganização das balsas lipídicas do complexo de Golgi e
na manutenção de sua integridade e função. Os domí
nios podem desempenhar uma função no transporte
de colesterol.
A camada externa das balsas tem uma concentração
mais alta de ceramidas e glicoesfingolipídeos (p. 480),
que geralmente contêm ácidos graxos de cadeias mais
longas. Seu acúmulo na camada externa leva a áreas
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 493

de membranas de maior espessura. A camada interna Membranas plasmáticas de células de alguns tecidos
contém fosfolipídeos com cadeias acil mais saturadas contêm cavéolas, invaginações pequenas tipo-frascos,
do que nas áreas não-balsas, o que permitem maior cuja composição em lipídeos é semelhante à das balsas
adensamento das cadeias. Assim, os lipídeos nas mem lipídicas; elas têm um alto conteúdo de colesterol e gli
branas ficam mais ordenados e mais densamente dis coesfingolipídeos. Cavéolas contêm as proteínas que se
postos do que na bicamada circundante. Além disso, in ligam a colesterol caveolinas-1, -2 ou -3, que podem ser
terações eletrostáticas de grupos de cabeça, interações responsáveis por estabilizar a estrutura.
hidrofóbicas de colesterol com fosfolipídeos e glicoli
pídeos específicos, e interações proteína-lipídeo limi Balsas lipídicas têm importantes funções em muitos
tam o movimento dos lipídeos. Por meio de interações processos celulares, incluindo seleção e tráfego de mem
proteína-proteína e proteína-lipídeo, balsas menores se branas e polarização celular. Fatores de crescimento e
agrupam para formar subdomínios maiores, ordenados, sinalização por receptor proteína G também envolvem
na membrana. Alguns desses localizam-se em regiões balsas de membranas. Foram relatadas funções para as
específicas da membrana plasmática. balsas lipídicas na patogênese de condições como doen
ças de Alzheimer, Parkinson, cardiovasculares, lúpus
eritematoso sistêmico e HIV. Bactérias, príons (Correla-Correla
ção Clínica 3.6, p. 118), vírus e parasitas utilizam balsas
lipídicas de células para sua infectividade.

Ambiente Dinâmico das Membranas

As membranas biológicas (ver Figura 12.22) estão
em um estado de constante mudança, com movimento
de proteínas e lipídeos lateralmente, com associação e
dissociação de proteínas na membrana, com proteínas
e lipídeos se movimentando para dentro e para fora, e
com modificações (por exemplo, acilação e fosforila
ção) de proteínas. Até mesmo a espessura da bicamada
lipídica varia em virtude de mudanças na composição
em lipídeos e proteínas. Microambientes estão constan
temente sendo formados e dispersos. Uma membrana é
um ambiente muito densamente povoado, consideran
FIGURA 12.31 Representação esquemática das balsas do-se o número estimado de enzimas, receptores, ca
lipídicas (lipid rafts) de membranas. nais e transportadores presentes. Os componentes da
O diagrama indica o movimento das balsas lipídicas, com a fu membrana plasmática de mamíferos interagem com o
são de balsas e a associação de duas proteínas. citoesqueleto do citoplasma, com componentes extra
celulares e entre si. Nem palavras nem ilustrações são
Algumas proteínas de membrana ficam associadas capazes de capturar a complexidade e o estado dinâmi
principalmente com balsas, algumas movem-se para co das membranas biológicas ou de suas intensas fun
dentro e para fora das balsas, e outras estão presentes ções em tantos processos biológicos diferentes.
apenas nas porções não-balsa da membrana.

Proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol

(GPI) (p.. 490)490) predominampredominampredominam nasnasnas balsasbalsasbalsas lipídicas,lipídicas,lipídicas, eee pro-pro-pro 12.5 RECEPTORES DE
teínas ancoradas CAAX feniladas (p. 491) ficam nas MEMBRANAS
balsas, na camada interna. Em algumas células, a balsa
e a proteína sequestrada ficam ligadas ao citoesquele As células biológicas têm um grande número de pro
to da célula. Certas proteínas envolvidas na sinalização teínas receptores específicos que ligam outras molécu
celular são mantidas no estado inativo em balsas indi las ou reagem a estímulos específicos para iniciar uma
viduais; a ativação ocorre quando várias balsas se aglu resposta celular. Proteínas receptores ficam ligadas à
tinam, formando uma balsa maior e aproximando as membrana plasmática ou intracelular, ou estão presen
proteínas inativas (Figura 12.31). Outras proteínas têm tes como proteínas solúveis no citoplasma ou no núcleo.
uma baixa afinidade pelas balsas no estado não-ligado, As moléculas que se ligam a um receptor, chamadas li
mas após ligação de um ligante sofrem uma mudança gantes, são um link de comunicação ou sinal. Moléculas
conformacional ou oligomerizam, aumentando sua afi sinais podem ser geradas em um compartimento de uma
nidade por uma balsa específica. Algumas proteínas célula para estimular uma mudança em uma atividade
periféricas de membrana são palmitoiladas, levando presente em outra parte da mesma célula, ou o sinal pode
à associação com uma balsa; elas se dissociam após a ser gerado por uma célula para alterar a atividade de
despalmitoilação. uma célula diferente. Moléculas sinalizadoras intracelu
494 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

lares, isto é, ligantes gerados por uma célula para mudar tores têm um alto grau de especificidade pelos ligan
a atividade de outra célula, reagem ou com receptores na tes, e alguns receptores respondem a estímulos como
membrana plasmática ou com receptores intracelulares. luz e temperatura (Tabela 12.7). Existem também re
Ligantes tais como moléculas carregadas, peptídeos e ceptores da membrana plasmática, como os receptores
proteínas, não podem atravessar a membrana por cau tipo-Toll (TLR, Toll-like receptors) que induzem uma
sa de sua carga ou tamanho, e reagem com receptores resposta quando bactérias ou vírus se ligam; a ligação
na membrana plasmática, na superfície extracelular da estimula uma defesa do hospedeiro contra os patógenos
membrana. Moléculas que podem se difundir através invasores. O transporte de proteínas destinadas à se
da membrana plasmática, como esteroides, ligam-se a creção entre o retículo endoplasmático e o Golgi envol
receptores intracelulares solúveis. Sinais intracelulares ve receptores de membrana que reconhecem sinais de
podem se ligar a receptores solúveis ou a receptores no seleção específicos codificados pela carga, na proteína.
lado citoplasmático da membrana. Há uma variedade de
respostas iniciais à interação ligante–receptor, incluindo TABELA 12.4 Respostas Celulares à Interação Ligante–
a ativação de uma enzima, liberação de uma molécula Receptor
intermediária que é reconhecida por um intermediário
Estímulo de crescimento e diferenciação
subsequente em uma via de sinalização, ou abertura de
um canal na membrana para permitir o fluxo de íons. As Modulação do sistema nervoso periférico e central
principais vias de transdução de sinal são apresentadas
no Capítulo 13 (p. 525), e as respostas dos tecidos às Controle do sistema reprodutor
moléculas sinalizadoras serão descritas na apresentação Regulação de processos metabólicos
dos processos celulares individuais.
Estímulo de funções imunológicas
A sinalização entre células permite que células indivi
duais respondam às necessidades do organismo inteiro; TABELA 12.5 Classificação dos Receptores da Membrana
respostas representativas à ligação do ligante ao recep Plasmática
tor são apresentadas na Tabela 12.4. Existem centenas
do Receptor
Classificação Exemplos
Insulina
de receptores diferentes na membrana plasmática; a Ta
de Receptores
bela 12.5 apresenta as três classes principais. O grupo
maior e mais diversificado de receptores de membrana Acoplado a proteína G Glucagon
é o dos receptores acoplados a proteína G (p. 542), que Acetilcolina
ocorre tanto em células procarióticas como eucarióticas.
tirosina quinase
Catalítico:
Os receptores de membrana são classificados com Eritropoietina
base na homologia de estrutura da proteína e no me
canismo; receptores representativos com seus ligantes/ Transporte de íon Ácido g-aminobutírico
atividades são apresentados na Tabela 12.6. Os recep Glutamato

TABELA 12.6 Receptores da Membrana Plasmática Representativos

NúmerodeReceptores Ligante Representativo ou Atividade
Receptor

Receptores de citocina tipo 1 43 Leptina

Receptores de citocina tipo 2 11 Interferon
Ancorados por GPI 4 Fator neurotrópico
Receptores guanilil ciclase 7 Retinil guanilato ciclase
Receptores de interleucina-17 8 Interleucina
Integrinas 28 Laminina
Receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) 14 Lipoproteína de baixa densidade
Outros receptores não 7-TM* 156 Transferrina
Proteínas tirosina fosfatases tipo-receptor 24 Proteína tirosina fosfatase
Receptores tirosina quinases 87 Precursor do receptor de insulina
Receptores sete transmembrânicos (7TM) 754 Dopamina; ocitocina; luz
Receptores serina/treonina quinase de TGF-beta 13 Serina/treonina quinase R2
Tetraspaninas 36 Adesão celular
TNF/NGF 33 Precursor de fator de necrose tumoral
*TM, transmembrânico; Fonte: Receptores de Membrana Plasmática Humana, www.receptome.org.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 495

TABELA 12.7 Ligantes de Receptores

12.6 DESLOCAMENTO DE
Íons Proteínas
MOLÉCULAS ATRAVÉS DE
Aminoácidos Sabores
MEMBRANAS
Lipídeos Toxinas
Nucleotídeos Vírus Algumas Moléculas se Difundem
Polipeptídeos Odorantes Através das Membranas Celulares
Hormônios Feromônios
A difusão de uma espécie química através de uma
Neurotransmissores Fótons membrana envolve (1) deixar o ambiente aquoso de
um lado e entrar na membrana; (2) atravessar o meio
Armbruster, B. N. e Roth, B. L. J. Biol. Chem. 280:5129, 2005.
lipídico da membrana, e (3) deixar a membrana e en
A ligação de uma molécula sinalizadora a seu recep trar na fase aquosa do lado oposto (Figura 12.32). O
tor é um processo de equilíbrio (p. 533). É semelhante fluxo só pode ser a favor do gradiente de concentração
à ligação do substrato a uma enzima, mas na maioria da substância. Restrições termodinâmicas e cinéticas
dos casos de ligação ao receptor não ocorre modificação controlam o equilíbrio de concentração nos dois lados
química do ligante ligado. À medida que a concentração da membrana e a velocidade com a qual ela alcança o
de ligante livre na fase aquosa aumenta ou diminui, o equilíbrio. A velocidade de difusão de uma espécie quí
ligante se associa ou dissocia do receptor; a dissocia mica em uma membrana é diretamente proporcional à
ção encerra o processo de sinalização. A maioria dos sua solubilidade e ao coeficiente de difusão em lipídeos;
receptores tem afinidades muito altas por seus ligantes, o último é uma função do tamanho e da forma da subs
e alguns receptores reagem com ligantes de estruturas tância. O movimento de solutos por difusão é de uma
diferentes. Receptores são excelentes alvos para a ação concentração mais alta para uma mais baixa, e a velo
de compostos farmacológicos. cidade é descrita pela primeira lei de difusão de Fick
(Equação 12.1).
Estima-se que cerca de 5% das proteínas codificadas
pelo genoma humano sejam receptores da membrana δcδx )
J = −D ( (12.1)
plasmática. O alto grau de tecido-especificidade de ação
das moléculas sinalizadoras ocorre porque células de
tecidos diferentes expressam receptores diferentes. Por onde J = a quantidade final de substância movida por
exemplo, a insulina, uma molécula sinalizadora, altera o unidade de tempo, D = o coeficiente de difusão e
metabolismo de glicose no músculo e no fígado, mas não δc/δx = o gradiente químico da substância. À medida
na maioria dos outros tecidos. A resposta celular a um li que a concentração do soluto em um lado da membrana
gante é modulada pelo número de moléculas de recepto aumenta, há uma velocidade inicial de difusão crescen
res na membrana plasmática. Um aumento no número de te, como ilustrado na Figura 12.33. O movimentoovimento resul-resul-resul
receptores, chamado superexpressão ou upregulation tante de moléculas de um lado para o outro continuará
do receptor, aumenta a resposta celular; uma diminui até que a concentração de cada um esteja em equilíbrio
ção, ou subexpressão (downregulation), leva a uma di
minuição da resposta. A incorporação de receptores na,
e a remoção da, membrana é um processo controlado. Lado 1 Lado 2

Receptores de membrana que atravessam a mem

brana podem ter um único ou múltiplos domínios de
aminoácidos transmembrânicos. Os receptores acopla
dos a proteína G, que ocorrem em bactérias ou células
eucarióticas (p. 542),542),), têmtêmtêm setesetesete domíniosdomíniosdomínios transmem-transmem-transmem S1 Sm S2
brânicos discretos (receptores 7TM). Os receptores
7TM humanos são classificados em seis famílias, com
base nas similaridades das sequências de seus domí
nios transmembrânicos. Alguns receptores requerem
a formação de oligômeros homoméricos ou heteromé
ricos para sua atividade. A ligação do ligante altera a
estrutura terciária ou quaternária, levando à iniciação
da resposta celular. Em uma classe de receptores, um
receptor de superfície se liga a um ligante e depois se FIGURA 12.32 Difusão de uma molécula de soluto
liga a um segundo receptor (receptor de sinal), que ini através de uma membrana.
cia a reação celular. Nesse caso, o receptor de ligação S1 e S2 são solutos em cada lado da membrana, e Sm é o soluto
do ligante é chamado correceptor. na membrana.
496 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

químico. Troca contínua de moléculas de soluto de um água que circunda muitos solutos deve ser removida an
lado para o outro ocorre depois do equilíbrio ser atingi tes que o soluto entre no meio lipídico. Íons inorgânicos
do, mas não há acúmulo em nenhum dos lados, pois isso e moléculas orgânicas carregadas não se difundem em
criaria um gradiente de concentração. velocidade significante em virtude de sua atração pela
água e da exclusão de espécies carregadas pelo am
biente hidrofóbico das membranas. Moléculas orgânicas
não-carregadas, como açúcares, são essencialmente
s
excluídos, assim como peptídeos, proteínas e ácidos nu
é Transporte mediado
v
a cleicos, em virtude de seu tamanho e carga. Se ocorrer
t
a
o
t
difusão, a velocidade será lenta demais para atender às
n
e necessidades celulares.
m
i
v a
o n
mar
e b
d m
e e
d
Mecanismos Baseados em Proteínas
a m
i a
d
c m
lo u
para Deslocamento
e e
Vd
Várias centenas de sistemas mediados por proteí
Difusão nas, cada um com um conjunto diferente de proteínas,
evoluíram para facilitar o movimento de água, íons,
Concentração de soluto nutrientes, produtos residuais metabólicos e macro
moléculas através de diferentes membranas celulares.
FIGURA 12.33 Cinética do movimento de uma molécula As proteínas envolvidas em cada sistema de diferentes
de soluto através de uma membrana.
organismos, e até mesmo entre órgãos de uma espécie,
A velocidade inicial de difusão é diretamente proporcional à
concentração de soluto. No transporte mediado, a velocidade são muito semelhantes, mas não idênticas. Um sistema
alcançará uma Vmáx quando o transportador ficar saturado. de classificação funcional das proteínas de transporte
de membrana, recomendado pela International Union
Gases, como O2, N2, CO2, NO, CO e H2S, e moléculas of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)
lipofílicas difundem-se através das regiões hidrofóbi (Tabela 12.8), divide-as em classes, subclasses, famí
cas de uma membrana. A água difunde-se sob pressão lias e subfamílias com base no mecanismo de trans
osmótica, mas na maioria das células a velocidade não porte e suas propriedades. Muitas das proteínas estão
atende às necessidades de equilíbrio rápido das fases presentes só em procariotos; muitas outras em ambos,
aquosas em ambos os lados da membrana plasmática; procariotos e eucariotos, incluindo mamíferos. Existe
uma família de proteínas, as aquaporinas, facilita o mo uma homologia estrutural das proteínas de muitas das
vimento transmembrânico da água (p. 596). A capa de subfamílias. A discussão a seguir focaliza os sistemas

TABELA 12.8 Classificação das Proteínas de Transporte de Membrana

Classe Subclasse (# de famílias)
1. Poros e canais 1.A Canais a-helicoidais (36)
1.B Porinas b-fitas (34)
1.C Toxinas formadoras de poros (58)
1.D Canais sintetizados não-ribossomicamente (10)
2. Transportadores dirigidos por potencial 2.A Transportadores ou carregadores (carriers) (uni-, sim
eletroquímico e antiporters) (80)
2.B Transportadores sintetizados não-ribossomicamente (6)
3. Transportadores ativos primários 3.A Transportadores dirigidos por hidrólise de ligação P-P (14)
3.B Transportadores dirigidos por descarboxilação (1)
3.C Transportadores dirigidos por transferência de metil (1)
3.D Transportadores dirigidos por óxido-redução (9)
3.E Transportadores dirigidos por luz (2)
4. Translocadores de grupo 4.A Fosfotransferases (6)
5. Carregadores transmembrânicos de elétrons 5.A Carregadores de dois elétrons (2)
5.B Carregadores de um elétron (3)
Fonte: Moss, G. P. Membrane Transport Proteins. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/mtp/.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 497

de transporte de células de mamíferos e, especifica

UM OLHAR MAIS ATENTO 12.2
mente, os das classes chamadas poro/canal (1.A, 1.B e
1.C) e transportador (2.A e 3.A) (Tabela 12.8). Uma di Deslocamento de Grupo e o Ciclo g-Glutamil
versidade de outros termos para descrever os sistemas
de transporte aparece na literatura científica, mas a no Algumas bactérias têm um mecanismo para cap
menclatura recomendada atualmente será usada aqui. tação de açúcares, chamado deslocamento de grupo,
no qual o açúcar a ser transportado é quimicamente
Poros e canais implicam na presença de um poro modificado durante o deslocamento. O açúcar é fosfo
aquoso na estrutura da proteína através do qual molé rilado após ligação, mas antes da liberação do trans
culas se difundem; o movimento é controlado por um portador. O açúcar fosforilado é liberado no citoplas
mecanismo de porta (gating). As proteínas transporta ma, e não o açúcar original, não-fosforilado. Nenhum
doras são semelhantes a enzimas, ligando o soluto em sistema de deslocamento de grupo foi encontrado em
um lado da membrana, depois mudando de conformação,
células de mamíferos. O ciclo g-glutamil (p. 812), um
e movendo o substrato para o ambiente do lado oposto da importante sistema para captação de aminoácidos
membrana. Isso ocorre dentro da parte membrânica da por algumas células de mamíferos, envolve a modifi
proteína transportadora. A maioria dos poros/canais e cação de um aminoácido pela g-glutamil transferase
transportadores tem um alto grau de especificidade pelo da superfície externa da membrana plasmática. O
soluto. A velocidade de deslocamento do substrato por aminoácido modificado é então transportado para
canais é maior do que por transportadores específicos; o citoplasma por um transportador de aminoácidos.
para canais, a velocidade é cerca de 107 íons/s, que é ave Este ciclo não é classificado como deslocamento de
locidade de difusão de uma substância na água, enquan grupo porque proteínas separadas catalisam a modi
to com transportadores é cerca de 102–103 moléculas/s. ficação química e o transporte.
Uma variedade de substâncias, chamadas substratos,
é transportada, incluindo ânions e cátions, água, inter
mediários metabólicos, moléculas orgânicas, drogas e
macromoléculas. Em células eucarióticas, as substâncias
deslocadas não mudam durante o processo. Algumas passagem, e (4) inibido por vários compostos. Os poros
bactérias têm uma classe de transportadores chamados consistem de várias proteínas diferentes e, em compa
transportadores de grupo (group translocation), em ração com os canais, têm uma estrutura complexa. Uma
que o substrato é quimicamente modificado durante o importante diferença entre canais e poros é a especifi
transporte (UmUm OlharOlhar MaisMais AtentoAtento 12.2).12.2).). AlgumasAlgumasAlgumas subs-subs-subs cidade com a qual o sistema permite o deslocamento.
Os poros têm aberturas relativamente grandes, permi
tâncias são transportadas por dois mecanismos diferen
tes em células diferentes e, em alguns casos, na mesma tindo que várias moléculas pequenas e grandes atraves
célula. Subfamílias de proteínas de transporte de mem sem a membrana, enquanto os canais têm um alto grau
brana têm muitas isoformas, todas com a mesma função. de especificidade pelo soluto.
Por exemplo, o néfron do rim tem, pelo menos, sete iso
formas diferentes de aquaporinas, todas responsáveis
pelo deslocamento de água. Além disso, muitos trans
Estruturas dos Canais de Membrana
portadores são controlados por moléculas sinalizadoras As proteínas dos canais têm uma de duas estrutu
intra- ou extracelulares e também são designados como ras principais: canais tipo-a e canais barril-b. Canais
receptores ligante-específicos (ver Seção 12.5). tipo-a são proteínas homo- ou hetero-oligoméricas, em
alguns casos com várias subunidades diferentes, e po
dem ter de 2 a 22 segmentos a-helicoidais transmem
12.7 CANAIS E POROS DE brânicos (ver Figura 12.27). Uma característica física
comum dos canais é uma estrutura formada por a-héli
MEMBRANAS ces anfipáticas de diferentes segmentos transmembrâ
nicos de uma única cadeia polipeptídica ou de diferen
Canais e poros de membrana são ubíquos em orga tes subunidades proteicas, que criam um canal aquoso
nismos vivos, estando presentes em todos os tipos de central. Além dos domínios contendo o poro real, as
organismos, de bactérias até eucariotos superiores. proteínas dos canais contêm domínios para a ligação de
Canais e poros permitem a difusão em canais aquosos ligante e para sentir mudanças físicas, como mudanças
criados pelas proteínas transportadoras. Eles não se no potencial de membrana, que controlam a abertura
questram moléculas ou íons em trânsito, e sua especifi e o fechamento do canal. Canais tipo-a em mamíferos
cidade é baseada no tamanho e na carga da substância. funcionam como sensores celulares, respondendo a mu
A difusão em canais e poros é (1) a favor do gradiente danças de temperatura, toque, dor, osmolaridade, fero
de concentração da substância que está atravessando mônios, sabor e outros estímulos.
a membrana, (2) ativo sem utilização de energia meta
bólica para o movimento real da substância, (3) regula Canais barril-b têm uma sequência transmembrâ
do por mecanismos específicos que abrem ou fecham a nica consistindo de fitas-b, que formam uma estrutura
498 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
barril-b (p. 97) com um canal cheio de água de 0,6 a 3
nm de diâmetro (Figura 12.34). Algumas bactérias e
plastídeos estão presentes nas membranas externas das
mitocôndrias (porinas). Várias porinas bacterianas
consistem de estruturas barril-b com 16 fitas antipara
lelas, com pontes de hidrogênio entre os vizinhos mais
próximos ao longo da cadeia. Alças polipeptídicas re
vestem a parede interna do barril, limitando a largura
do canal e restringindo o tamanho das moléculas capa
zes de se difundir através dele. Essa subclasse de canais
tem uma ampla faixa de seletividade para substrato, de
íons inorgânicos a proteínas. As porinas podem ser não
-seletivas ou apresentar algum grau de seletividade, e
algumas permitem a passagem de qualquer molécula
menor do que um tamanho limite específico.
FIGURA 12.34 Estrutura de porina Ompf em forma
cristalina tetragonal.
Os segmentos transmembrânicos da porina são hélices-b.
PDB ID: 10 PF. Cowan, S.W., Garavito, R. M., Jansonius, J. N.,
Jenkins, J. A., et al. The structure of Ompf porin in a tetragonal
crystal form.Structure 3:1041, 1995.
Controle e Seletividade dos Canais
de Membrana
As duas classes mais estudadas de canais são as que
respondem a uma mudança no potencial de membra
na, chamadas canais voltagem-dependentes, e as que
respondem à ligação de um ligante, os canais regula
dos por ligante. Os canais voltagem-dependentes têm
um domínio sensor específico que detecta mudanças
no potencial de membrana e transfere a energia para
o domínio do canal para controlar sua abertura. Por
exemplo, a despolarização da membrana plasmática
leva à abertura de canais de Na+. A membrana mito
condrial externa contém um canal de ânions voltagem
-dependente consistindo de folhas-b, que permite a
passagem de substâncias de até 10 kDa e desempenha
um papel na apoptose (p. 1034). Canais regulados por
ligante respondem à ligação extracelular ou intracelu
lar de ligantes químicos específicos (também chamados
agonistas) e, dependendo do canal, leva à abertura ou
ao fechamento do canal. Alguns têm vários domínios
para ligação do ligante, o que permite cooperativida
de na ligação. Abertura e fechamento são realizados de
diferentes formas, incluindo (1) segmentos transmem
brânicos a-helicoidais que revestem o poro movendo-se
como um corpo rígido que se inclina, gira ou dobra, e
(2) uma extremidade terminal ligada que oscila para
dentro do canal, fechando-o fisicamente.
A ligação de acetilcolina ao receptor nicotínico de
acetilcolina abre o canal, permitindo o fluxo de Na+
para dentro da célula. Isso é importante na transmis
são de sinal elétrico neuronal (p. 965). Outros canais
são controlados pela ligação de neurotransmissores (p.
), cAMP (p. 549),
535), ), inositol 1,4,5-trisfosfato, diacil
glicerol (p. 552) e proteínas G (p. 542). A abertura da
maioria dos canais é muito rápida, permitindo surtos
de fluxo iônico de 107 íons por segundo através da mem
brana. Essa velocidade é necessária porque muitos des
ses canais estão envolvidos na condução nervosa e na
contração muscular. A superfície de um terminal ner
voso pode conter várias centenas de diferentes canais,
incluindo canais voltagem-dependentes de Ca2+ e K+,
canais de K+ dependentes de Ca2+, canais de Cl–, canais
ligante-dependentes e canais ativados por estiramento.
Alguns canais são controlados não só pela ligação do
ligante, mas também por fosforilação-defosforilação.
Um grande número de agentes farmacológicos é usado
terapeuticamente para modular canais; os que inibem
são chamados antagonistas.
Diferentes classes de canais são muito seletivas com
relação ao íon inorgânico, moléculas orgânicas peque
nas (por exemplo, ureia), ou proteínas que podem se
mover através do canal. O canal de Na+ da membrana
plasmática de células eucarióticas permite o movimento
de Na+ a uma velocidade mais de 10 vezes maior do que
de K+, e alguns canais de K+ são 100–1.000 vezes mais
permeáveis a K+ do que a Na+. Outros canais são menos
específicos. Alguns membros da família das aquapori
nas são seletivos só para água, enquanto outros permi
tem o deslocamento tanto de água como de moléculas
orgânicas pequenas, neutras. Existem também diferen
ças de tecido para tecido em canais que transportam o
mesmo soluto. Mais de 15 canais de K+ voltagem-depen
dentes diferentes foram descritos no homem. Um méto
do de seletividade envolve anéis de resíduos carregados
positivamente no canal, que excluem cátions e facilitam
o fluxo de ânions; resíduos carregados negativamente
facilitam o fluxo de cátions.
Canais de Membrana e Poros
Representativos
Aquaporinas e Aquagliceroporinas
É essencial, para todas as células, o controle da dis
tribuição de água através das membranas plasmática e
internas porque alterações de pressão osmótica podem
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 499

TABELA 12.9 Local de Expressão de Aquaporinas Selecionadas no Homem

Tecido Local de Expressão Aquaporina Função
Células do sangue Eritrócitos AQP1 Proteção osmótica
Leucócitos AQP9a ?

Cérebro Plexo coroide AQP1 Produção de líquido cérebro-espinal

Células ependimais AQP4 Equilíbrio do líquido cérebro-espinal
Hipotálamo AQP4 Sentir osmolaridade (?)
Olho Células fibrosas do cristalino AQP0 Equilíbrio líquido no cristalino
Epitélio ciliar AQP1 Produção do humor aquoso
Rim Túbulos proximais AQP1 Concentração de urina
Ductos coletores AQP2 Mediador de atividade de ADHb

Ductos coletores AQP3a Reabsorção de água para o sangue

Ductos coletores AQP4 Reabsorção de água

Ductos coletores AQP6 ?
Pulmão Células epiteliais alveolares AQP1 Hidratação alveolar
Epitélio brônquico AQP4 Secreção de fluido brônquico
Boca e garganta Células epiteliais da traqueia AQP3a Secreção de água na traqueia

Glândulas salivares AQP5 Produção de saliva

aUma aquagliceroporina.
b Hormônio antidiurético.

Fonte: King, L. S., Kazono, D. e d Agre, P. From structure to disease: The evolving tale of aquaporin biology. Nature Rev.: Mol. Cell Biol. 5:687, 2004.

causar expansão ou contração dos compartimentos
envolvidos. Ocorre difusão não-facilitada de água atra
vés de membranas biológicas, mas é lenta demais para
responder às velocidades requeridas de movimento de
água. Mais de 200 proteínas de canais diferentes em
plantas, bactérias, insetos e vertebrados permitem o
deslocamento de água e de outras moléculas pequenas
e, como grupo, são chamadas aquaporinas (AQP). Doze
aquaporinas de mamíferos foram identificadas, que são
divididas por homologia de sequência de aminoácidos
e características funcionais em canais que são seleti
vos só para água (aquaporinas) e os que permitem o
deslocamento de água e de pequenos solutos (aquagli
ceroporinas). As aquaporinas permitem o movimento
de H2O, mas não de íons hidrônio (H3O+), mantendo
assim o gradiente de pH através da membrana celular.
O homem tem pelo menos 10 aquaporinas e aquaglice
roporinas (AQP0 a AQP9); os locais de expressão de
aquaporinas selecionadas no homem são apresentados
na Tabela 12.9. Alguns tecidos têm várias isoformas di
ferentes, com diferentes funções; o rim tem pelo menos
sete isoformas, localizadas em pontos diferentes ao lon
go do néfron e do ducto coletor. A Correlação Clínica
12.3 descreve a distribuição das aquaporinas nos rins e
exemplifica alterações patofisiológicas. As aquaporinas
de plantas contribuem para a captação de água pelas
raízes, a transpiração e a dessecação de sementes.
As aquaporinas são proteínas intrínsecas de mem
brana pequenas, hidrofóbicas, com várias sequências de
aminoácidos muito conservadas. Elas se organizam nas
membranas em homotetrâmeros (Figura 12.35). Cada
monômero, consistindo de seis domínios transmembrâ
nicos a-helicoidais, contém um poro de água distinto.
AQP1 do eritrócito humano contém um motivo de se
quência muito conservado, consistindo de asparagina
-prolina-alanina em duas alças separadas. As alças se
dobram para dentro da bicamada lipídica, como uma
ampulheta, formando um canal aquoso. A seletividade
deve-se a uma constrição do canal com cerca de 2,8 Å, o
que limita o tamanho das moléculas que podem passar.
A passagem aquosa de AQP1 (Figura 12.36) é revestida
por resíduos hidrofóbicos conservados e alguns poucos
resíduos hidrofílicos que atraem H2O, mas não molécu
las carregadas como H3O+. Moléculas de água aparente
mente fluem através do canal em uma fila indiana (um
de cada vez).
Além de água, AQP1 permite o deslocamento de
CO2, AQP3 de glicerol, e AQP9 de glicerol, ureia, polióis,
purinas, pirimidinas, nucleosídeos e monocarboxilatos.
AQP1 é inibida reversivelmente por HgCl2.AQP2 no rim
humano está sob controle hormonal, e pelo menos três
outras podem ser controladas por pH.
500 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

CORRELAÇÃO CLÍNICA 12.3

O Rim de Mamíferos e as Aquaporinas

A função primária do rim é regular o pH do sangue, humanos sem atividade de AQP1 do rim aparentemente
eliminar produtos tóxicos do metabolismo e regular não têm problemas detectáveis em condições normais,
o equilíbrio hídrico do corpo. Cada rim contém cerca mas podem ter em condições de estresse (desidrata
de um milhão de néfrons, as unidades funcionais mul ção). Espera-se que condições clínicas adicionais ve
ticelulares do tecido. Cada néfron tem várias regiões nham a ser atribuídas a alterações nas outras aquapo
distintas (ver diagrama), cada uma com funções mui rinas.
to específicas no processamento do filtrado do sangue,
que ocorre no glomérulo. Uma grande quantidade de
sangue é filtrada (cerca de 150 L/dia), e a água deve
ser reabsorvida no néfron e nos ductos coletores, ex
ceto cerca de 1,5 L, que são excretados como urina. As
aquaporinas são responsáveis pela recuperação de água
do filtrado à medida que ele flue pelo lúmen do néfron.
Como indicado no diagrama, pelo menos sete diferen
tes isoformas de aquaporinas, localizadas em diferentes
pontos ao longo do néfron e dos ductos coletores, são
responsáveis pela reabsorção de água.

Existem várias doenças renais nas quais a reab

sorção de água é anormal e nas quais a expressão e a
função das aquaporinas foi investigada. Vários modelos
animais dessas condições foram valiosos para a deter
minação da causa de algumas dessas condições. Baixos
níveis de AQP2 e poliúria (excreção excessiva de uri
na) são encontrados na diabetes insipidus nefrogênica
adquirida (NDI), hipocalemia adquirida (baixo K+ san
guíneo) e hipercalcemia (Ca2+ sanguíneo aumentado).
Em muitos casos, NDI é causada pela incapacidade do
rim responder à vasopressina (p. 916); considera-se que Localização de aquaporinas em cada segmento do né
isso leve a uma expressão diminuída e/ou incorporação fron e ductos coletores do rim. Modificado a partir de
de AQP2 na membrana. Em outros casos de NDI, há um figura das citações a seguir.
defeito no gene da aquaporina; em alguns casos, este
defeito leva a uma incapacidade do monômero formar King, L. S. e Yasui, M. Aquaporins and disease: Lessons
from mice to humans. Trends in Endocrinology & Meta
estruturas tetraméricas normais. Os níveis de AQP1,
bolism 13: 355, 2002; Nielsen, S., Frokiaer, J., Marples, D.,
AQP2 e AQP3 em modelos animais estão reduzidos na Kwon, T-H. et al. Aquaporins in the kidney: From molecules
isquemia tissular. Em algumas condições, como insufi to medicine. Physiol. Rev. 82: 205, 2002; e King, L. S., Ko
ciência cardíaca congestiva, cirrose hepática e gravidez, zono, K., e Agre, P. From structure to disease: The evolving
há um aumento na quantidade de AQP2 no rim, levando tale of Aquaporin biology. Nature Reviews Molecular Cell
a uma expansão no volume líquido extracelular. Seres Biology 5:687, 2004.

Canais iônicos de Na+, Ca2+, K+ e Cl–
controlados por voltagem
Os canais individuais voltagem dependentes (VIC)
para Na+, Ca2+ e K+ são controlados pelo potencial elétri
co transmembrânico. Eles abrem e fecham muito rapida
mente (milissegundos) e, em células de mamíferos, são
responsáveis pela geração de sinais elétricos conduzidos
por neurônios e outras células excitáveis. Os canais iôni
cos são membros de uma grande superfamília encontra
da em bactérias, archaea, vírus e eucariotos. No homem,
existem seis tipos de canais de Ca2+ e pelo menos dez ti
pos de canais de K+, respondendo a diferentes estímulos.
Cada canal iônico consiste de subunidades glico
proteicas específicas, como estruturas homo- e hete
ro-oligoméricas (Tabela 12.10). As grandes subunida
des a (cerca de 260 kDa) contêm o canal condutor do
íon. Elas têm quadro domínios homólogos, cada um
com seis segmentos transmembrânicos, conectados
por alças intracelulares e extracelulares, num total
de 24 segmentos transmembrânicos (Figura 12.37).
Subunidades acessórias (b, gou δ) não têm estrutura
comum; algumas têm vários segmentos transmemb
rânicos, e outras são proteínas periféricas localizadas
inteiramente intra- ou extracelularmente. Estão ge
ralmente envolvidas na regulação do canal; subunida
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
FIGURA 12.35 Simulação da permeação de água por AQP1.
(a) A simulação do tetrâmero AQP1 (laranja/magenta/azul/tur
quesa) mergulhado em uma bicamada de palmitoil oleil fosfa
tidiletanolamina (amarelo/verde) circundada por água (verme
lho/branco), consistindo de aproximadamente 100.000 átomos.
(b) Simulação da via de um dos monômeros de AQP1 para per
– TABELA 12.10 Composição em Subunidades de Canais de
Extracelular
Restrição de
tamanho
180H – + Na+
Repulsão
192N P +A
A R195 eletrostática
do dipolo da água
Reorientação + PN
AAA P 76
– Intracelular
FIGURA 12.36 Canal de água em uma subunidade de AQP1.
A forma do poro aquoso (azul) é derivada de cálculos baseados
na estrutura da AQP1 bovina. Três características do canal es
pecificam a seletividade por água: (a) Restrição de tamanho.
Oito Å acima do ponto médio do canal, o poro se estreita para
um diâmetro de 2,8 Å (aproximadamente o diâmetro de uma
molécula de água). (b) Repulsão eletrostática. Um resíduo con
servado (R, Arg-195) na constrição mais estreita do poro im
põe uma barreira a cátions, incluindo a água protonada (H3O+).
(c) Reorientação do dipolo da água. Duas hélices parciais se
encontram no ponto do meio do canal, fornecendo dipolos car
regados positivamente que reorientam uma molécula de água
quando ela passa por esse ponto. Quebra de pontes de hidro
gênio na fila indiana de moléculas de água impede a formação
de uma condutância de prótons.
Reproduzido com permissão de Kozono, D., Yasui, M., King, L.
S. e Agre, P. Aquaporin water channels: Atomic structure and
molecular dynamics meet clinical medicine. J. Clin. Invest.
109:1395, 2002. Copyright© Elsevier.
• 501
meação de água, observado pelo poro.
Figura reproduzida com permissão de Fujiyoshi, Y., Mitsuoka,
k., de Groot, B. L., Philippsen, A. et al. Structure and function
of water channels. Curr. Opin. Struct. Biol. 12:509, 2002. Co
pyright© Elsevier.
Cátions Voltagem-Dependentes
Canal de Cátion Subunidades
a, b1 e b2
K+ 4a, b
Ca2+ a1, a2, δ e b
des b podem interagir com proteínas do citoesqueleto
e da matriz extracelular. Um modelo do canal de Na+
é apresentado na Figura 12.38. Um segmento trans
membrânico tem um resíduo carregado positivamente
em cada terceira posição, e pode ser o domínio sensor
de voltagem; o deslocamento mecânico desse segmento
pode levar a uma mudança conformacional da proteína,
resultando na abertura do canal. Foram sugeridos dois
mecanismos muito diferentes para o entendimento de
como o canal e os domínios sensores de voltagem são
acoplados para iniciar a abertura do canal, mas nenhum
foi provado. A proteína de membrana responsável pelo
deslocamento de prótons contém domínios para sentir
mudanças de voltagem na membrana, mas não foi des
crito um domínio de canal.
Podem existir canais iônicos voltagem-dependentes
em um de três estados conformacionais e funcionais:
fechado (repouso), aberto (ativo) e fechado (inativo).
Em resposta à despolarização da membrana, há uma
transição do estado fechado para o aberto. A transição
entre os estados de repouso e inativo ocorre quando o
ligante se liga ou por fosforilação da proteína.
Diferentemente dos canais de cátions, não se sabe
muito sobre a estrutura dos canais de Cl– voltagem
502 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

β2 NH3+ ψ
ψ
α +H3N β1 Canais Nicotínicos de
Acetilcolina (nAChR)
O canal nicotínico de ace
12345 + 6 1 2345 + 6 1 2345 +
6 6 1 2345
+
tilcolina, também chamado
+ + + +
receptor de acetilcolina, é um
–OOC Sensor Poro P P P Drogas COO– exemplo de canal regulado por
de voltagem ligante, no qual a ligação de
acetilcolina (Figura 12.39) abre
P
COO– o canal. O nome dual é usado
+H3N P P
para diferenciar esse receptor
de outros receptores de acetil
FIGURA 12.37 Estrutura de subunidades do canal de Na+ voltagem-dependente.
As estruturas primárias das subunidades do canal de Na+ voltagem-dependente são ilustra colina, que funcionam de modo
das como um diagrama de dobramento transmembrânico. Cilindros representam prováveis diferente. O canal é expresso
segmentos de a-hélice. Os cilindros vermelhos representam o sensor de voltagem e cilin os na sinapse nervo-muscular (p.
dros azuis, os segmentos do poro (ver Figura 12.38). Linhas grossas representam as cadeias 971) e é um membro de uma
polipeptídicas de cada subunidade, com comprimentos aproximadamente proporcionais ao superfamília de canais iônicos
número de resíduos de aminoácidos nos subtipos de canais de Na+ cerebrais. Os domínios transmissor-dependentes, que
extracelulares das subunidades b1 e b2 são apresentados como estruturas globulares. São inclui os receptores de seroto
indicados os sítios de fosforilação da proteína. nina, ácido g-aminobutírico e
Redesenhado de Catterall, W. A., Goldin, A. I. e Waxman, S. G. Internat. Union of Pharm.
glicina (p. 964). Acetilcolina
XXXIX. Compendium of voltage-gated ion channels: Sodium channels. Pharmacol. Rev.
difunde para a membrana do
55:575, 2003.
músculo esquelético,, ondeonde inte-inte
-dependentes (p. 967);967);; eleseleseles aparentementeaparentementeaparentemente têmtêmtêm 121212 seg-seg-seg rage com o receptor de acetilcolina, abrindo o canal e
mentos helicoidais transmembrânicos. Canais de Cl– permitindo que íons carregados positivamente e pe
regulam o volume celular, estabilizam o potencial de quenos eletrólitos, mas não íons carregados negativa
membrana, estão envolvidos na transdução de sinal, e mente, fluam através do canal. O complexo do canal
regulam o transporte transepitelial. O regulador trans consiste de um complexo pentamérico de duas subu
membrânico da fibrose cística é um canal de Cl–. nidades a e uma de cada subunidades b, g e δ (Figura
12.40). Cada subunidade a é glicosilada, e duas outras
Os canais iônicos voltagem-dependentes têm um pa subunidades contêm lipídeos covalentemente ligados.
drão de expressão específico em diferentes tecidos. No Todas as subunidades têm extremidades N- e C-termi
homem, há um número considerável de doenças heredi nais extracelulares, quatro domínios que atravessam
tárias de canais iônicos, chamadas canalopatias, causa a membrana (M1, M2, M3 e M4), com uma longa alça
das por mutações nos canais de ânios e cátions (ver Cor-Cor citoplasmática entre M3 e M4, que contém sítios con
relação Clínica 23.8, p. 994). A Correlação Clínica 23.12, sensos para fosforilação por proteína quinases. Cin
p. 1001,1001,, descrevedescrevedescreve mudançasmudançasmudanças nosnosnos canaiscanaiscanais dedede cátionscátionscátions vol-vol-vol co domínios M2 justapostos (um de cada subunidade
tagem-dependentes em doenças musculares miotônicas. proteica) formam o poro condutor de íons. Os domí
nios M2 de canais receptores cátion-seletivos, como o
receptor nicotínico de acetilcolina, são enriquecidos
em aminoácidos carregados negativamente na “boca”
Lado intracelular do poro. Essa região funciona atraindo cá
extracelular
tions como Na+ e repelindo ânions como Cl–. A ligação
do neurotransmissor aos sítios extracelulares do com
plexo do receptor induz rearranjos muito pequenos e
sutis dos domínios M2. Esse rearranjo quase instan
tâneo remove as barreiras energéticas para o fluxo iô
nico pelo poro recoberto por água. A fosforilação da
subunidade a é necessária para a atividade. O fecha
Lado mento do canal ocorre em um milissegundo, em decor
citoplasmático rência da rápida hidrólise da acetilcolina e dissociação
dos produtos, acetato e colina, da proteína.

FIGURA 12.38 Modelo do canal de Na+.

O
O peptídeo único consiste de quatro unidades repetidas, com +
cada unidade se dobrando em cinco hélices transmembrâni CH3 COCH2CH2N (CH3)3
cas. Os segmentos transmembrânicos vermelhos representam
o sensor de voltagem. Redesenhado de Noda, M. et al., Nature, FIGURA 12.39 Estrutura da acetilcolina.
320:188, 1986.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
FIGURA 12.40 Modelo do receptor de acetilcolina (ACh).
(a) O arranjo das subunidades do receptor de ACh e sua to
pologia comum. (b) Receptor de ACh mostrando a estrutura
a-helicoidal do poro (azul, hélices voltadas para o poro; verme
lho, hélices voltadas para o lipídeo) em relação às superfícies
da membrana e a estrutura folha-b (verde) compondo o domí
nio de ligação do ligante; o asterisco denota o espaço aberto
em uma interface da subunidade. (c) Vista de corte transver
sal através do pentâmero, no meio da membrana, mostrando a
partição da estrutura em partes voltadas para o poro e para o
lipídeo, com espaços intervenientes.
(a) Redesenhado de Wilson, G. G. e Karlin, A. Acetylcholine
receptor channel structure in the resting, open, and desensi
tized states probed with the substituted-cysteine accessibility
method. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:1241, 2001. (b) Repro
duzido com permissão de Miyazawa, A., Fujiyoshi, Y. e Unwin,
N. Structure and gating mechanism of the acetylcholine recep
tor pore. Nature 423:949, 2003. Copyright © (2003) Nature.
• 503
Várias neurotoxinas mortais, incluindo δ-tubocura
rina, o ingrediente ativo do curare, e várias toxinas de
serpentes, incluindo a-bungarotoxina, erabutoxina e
cobratoxina, inibem o receptor nicotínico de acetilcoli
na. Succinilcolina, um relaxante muscular, abre o canal
levando à despolarização da membrana; a succinilco
lina é usada em procedimentos cirúrgicos porque sua
atividade é reversível, em virtude da rápida hidrólise do
composto após a parada da administração.
Junções Comunicantes (Gap Junctions) e
Canais do Poro Nuclear
Junções comunicantes (gap junctions) e poros
nucleares são canais grandes de proteínas multimé
ricas. Junções comunicantes (ou gap) encontradas
nas membranas plasmáticas de células de mamíferos
consistem de canais proteicos transmembrânicos,
chamados conexons. Os conexons de uma célula se li
gam extremidade-com-extremidade com os conexons
da membrana de uma célula vizinha, criando um ca
nal de conexão (Figura 12.41). Conexons consistem de
proteínas homo- ou hetero-hexaméricas de conexinas
(proteínas de gap junctions). Doze subunidades, seis
em cada célula, formam uma estrutura hexamérica
em cada membrana. Mais de 15 isoformas de conexi
nas são conhecidas; cada uma tem quatro sequências
transmembrânicas a-helicoidais putativas. A organi
zação molecular de uma gap junction recombinante é
apresentada na Figura 12.42. O diâmetro da abertura
fica entre 1,2 e 2 nm. O canal aquoso é mediador do
acoplamento elétrico, bem como da troca entre célu
las de íons e metabólitos, mas não de macromoléculas.
Gap junctions compostas de diferentes conexinas
podem apresentar diferentes especificidades para so
lutos. Os canais ficam normalmente abertos. Ocorre
fechamento com aumento no Ca2+ citoplasmático, uma
mudança no metabolismo, uma queda no potencial
transmembrânico ou uma acidificação do citoplasma.
O controle também pode envolver fatores de cresci
mento específicos e fosforilação das conexinas. Quan
do o canal está aberto, as subunidades parecem ligei
ramente inclinadas, mas quando fechado elas parecem
estar mais perpendiculares à membrana, sugerindo
que as subunidades deslizem umas sobre as outras.
Os complexos do poro nuclear são organizações
macromoleculares dinâmicas que atravessam as duas
membranas do envelope nuclear. Criam um canal para
a passagem de proteínas, RNA e moléculas pequenas
em ambas as direções. Os poros têm um diâmetro flexí
vel de cerca de 9 a 20 nm, e 45 nm de comprimento. O
complexo do poro nuclear é composto de 50 a 100 prote
ínas, chamadas nucleoporinas. As moléculas pequenas
difundem-se passivamente em ambas as direções atra
vés do canal, mas macromoléculas não. Proteínas, RNA
e partículas ribonucleoproteicas são transportadas em
ambas as direções por proteínas carregadoras especí
ficas. Receptores nucleares, carioferinas, e fatores ci
504 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Citoplasma
Membrana plasmática
Espaço extracelular
Membrana plasmática
Citoplasma
Figura 12.41 Modelo de um canal na junção tipo fenda
(gap junction).
tosólicos estão envolvidos na importação e exportação
nuclear de proteínas. Carioferina b medeia a exporta
ção de macromoléculas ligadas a nucleoporinas e uma
proteína GTPase, Ran. Proteínas destinadas ao núcleo,
do citoplasma, contêm sequências curtas de aminoáci
dos, chamadas sequências de localização nuclear, que
fazem delas alvos para a importação. O transporte pelo
complexo do poro nuclear ocorre por difusão facilitada
das proteínas carregadoras solúveis e complexos carre
gadores-macromoléculas. A atividade é regulada.
(a) (b)
C
M
E centração em ambos os lados da membrana será igual
M
C no final da reação. Sua atividade pode ser avaliada nos
20Å
Figura 12.42 Organização molecular de uma gap junction
cardíaca recombinante.
Modelo desenvolvido a partir de cristalografia eletrônica. (a)
Uma visão lateral completa é mostrada. (b) A densidade foi
cortada para mostrar o interior do canal. M, bicamada da mem
brana; E, espaço extracelular; C, espaço citoplasmático.
Reimpresso com permissão de Unger, V. M., Kumar, N. M., Gi
lula, N.B. e Yeager, M. Science 283: 1176, 1999. Com permis
são de AAAS.
O menos conhecido dos poros é o envolvido na tran
sição de permeabilidade mitocondrial. Essa abertura
ocorre na membrana interna, em resposta a estresse
oxidativo, perda de adenina nucleotídeos e aumento
no Ca2+ mitosólico. A estrutura não foi conclusivamen
te definida. A abertura do poro pode levar à perda de
componentes da matriz mitocondrial e citocromo c, e à
iniciação da apoptose (p. 1034). Esse poro pode ter um
papel importante na lesão por perfusão/reperfusão que
se segue à isquemia do tecido, como o que ocorre no
acidente vascular cerebral.
12.8 PROTEÍNAS DE
TRANSPORTE DE
MEMBRANA
Proteínas de transporte de membrana facilitam o
movimento de íons e moléculas através de uma mem
brana ligando-se e fisicamente movendo-os para chega
rem ao ambiente do lado oposto da membrana. Deve-se
notar que o movimento físico do substrato não requer
que a proteína mova realmente o substrato através de
toda a espessura da membrana. Como será discutido,
uma pequena distância pode mover o substrato entre
dois ambientes diferentes da proteína. Para a maioria
das substâncias, a velocidade do transporte mediado é
significativamente maior do que a simples difusão por
uma membrana lipídica.
Se S1 for o soluto no lado 1, e S2 no lado 2, então o
transportador promove o estabelecimento do equilíbrio
como se segue:
[S1]  [S2]
Os colchetes representam a concentração de soluto.
Se o transportador (T) for incluído, a reação fica
[S1] + T  [S –T]  [S2] + T
Se nenhuma energia de outra fonte for gasta, a con
no equilíbrio, mas se houver gasto de energia, pode
ser estabelecido um gradiente de concentração. Como
numa reação catalisada por enzima, o transportador
aumenta a velocidade, mas não determina o equilí
brio final. A proteína transportadora está inalterada
mesmos termos cinéticos de uma reação catalisada por
enzima, porque tem especificidade pelo substrato a ser
transportado, cinética definida, catalisa um transporte
vetorial, e é afetada por inibidores competitivos e não
-competitivos. O transportador demonstra cinética de
saturação (Figura 12.33, p. 496), enquanto a difusão
simples não. Constantes como Vmáx e Km são determi
nadas para transportadores. Teoricamente, um trans
portador pode facilitar o movimento de um soluto em
ambas as direções através da membrana, mas na maio
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
ria das situações há um movimento unidirecional em
virtude do grande AG0’ da reação.
A maioria dos transportadores tem um alto grau
de especificidade estrutural e estéreo-especificidade
para o substrato. No transporte mediado de D-glico
se nos eritrócitos, o Km para D-galactose é 10 vezes
maior, e para L-glicose 1.000 vezes maior do que para
D-glicose, demonstrando uma afinidade muito menor
por D-galactose e L-glicose. O transportador prati
camente não tem atividade com D-frutose ou dissa
carídeos. Análogos estruturais do substrato de um
transportador inibem competitivamente, e reagentes
que reagem com grupos específicos das proteínas são
inibidores não-competitivos.
Quatro Etapas no Transporte de Moléculas
de Soluto
Há quatro etapas no transporte mediado (Figura
12.43): (1) reconhecimento pelo transportador do solu
to apropriado, a partir de uma variedade de solutos no
ambiente aquoso, (2) deslocamento do soluto, (3) libe
ração do soluto pelo transportador, e (4) recuperação
do transportador à sua condição original.
Reconhecimento: S1 + T1 S – T1
Transporte: S – T1 S – T2
Liberação: S – T2 T2 + S2
Recuperação: T2 T1
FIGURA 12.43 Etapas envolvidas no transporte mediado
através de uma membrana biológica.
S1 e S2 são solutos nos lados 1 e 2 da membrana, respectiva
mente; T1 e T2 são sítios de ligação no transportador, nos lados
1 e 2, respectivamente.
A primeira etapa, reconhecimento de um substrato
específico pelo transportador, é igual ao reconhecimen
to de um substrato por uma enzima (p. 401). Sítios de
ligação específicos na proteína reconhecem a estrutu
ra correta do soluto. A segunda etapa, deslocamento,
requer uma mudança conformacional do transportador
após a ligação do substrato (Figura 12.44), o que movi
menta o substrato uma distância pequena, talvez ape
nas 2 ou 3 Å, em direção ao ambiente do lado oposto da
membrana. Não é necessário que o transportador mova
a molécula pela distância inteira através da membrana
(Figura 12.45). A mudança conformacional da proteína
é suficiente para mudar o ambiente. A etapa 3, libera
ção do substrato, depende da afinidade do transpor
tador pelo substrato. Sem uma mudança na afinidade
(Keq) pelo substrato, o substrato será liberado no novo
ambiente se a concentração de substrato for menor no
novo ambiente do que no ambiente inicial, em virtude
de um deslocamento no equilíbrio entre o substrato li
gado e livre. Para um transportador que move o subs
trato contra um gradiente de concentração, a liberação
do substrato na concentração mais alta requer que o
• 505
transportador mude de modo a ter menor afinidade
(maior Km) pelo substrato. Uma mudança conforma
cional do transportador pode levar a uma diminuição
na afinidade. Finalmente, na recuperação, etapa 4, o
transportador retorna à sua conformação original, após
liberação do substrato.
Lado 1 Lado 2
1 Reconecimento S1
2 Transporte
S1
3 Liberação
4 Recuperação
FIGURA 12.44 Modelo de sistema de transporte mediado
em uma membrana biológica.
O modelo é baseado no conceito de sítios específicos para liga
ção do substrato e uma mudança conformacional no transpor
tador para mover o soluto ligado por uma pequena distância,
mas para dentro do ambiente do outro lado da membrana. Uma
vez movido, o soluto é liberado do transportador.
Essa discussão foi centralizada no movimento de um
único substrato por um transportador (mecanismo uni
porte). Há sistemas que movem dois substratos simulta
neamente em uma direção (simporte) e dois substratos
em direções opostas (antiporte) (Figura 12.46). Quan
do uma substância carregada é deslocada e nenhum
íon de carga oposta é movido, ou duas moléculas com
cargas diferentes são deslocadas por um mecanismo
antiporte, ocorre uma separação de cargas através da
membrana. Esse mecanismo é chamado transporte ele
trogênico e leva ao desenvolvimento de um potencial de
membrana. Se um íon de carga oposta for movido para
equilibrar a carga, ou duas moléculas de mesma carga
forem movimentadas em direções opostas através da
membrana, o mecanismo é chamado transporte neutro
ou eletricamente silencioso.
506 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

estão envolvidos no cálculo da va

riação de energia livre, como indica
a Equação 12.3
∆G =2,3 RTlogC2C1+Z∆Ψ

(12.3)

onde DG! é o potencial eletroquími

co, Z é a carga das espécies trans
portadas,  é a constante de Fara
(a) (b)
day (96,46 kJ/V/mol, 23,06 kcal/V/
FIGURA 12.45 Transporte de um substrato através da membrana. mol) e DY é a diferença de potencial
Após ligação do substrato em um lado da membrana, uma mudança conformacional da elétrico, em volts, através da mem
proteína ocorre, movendo o substrato para um ambiente do lado oposto. brana. A magnitude e o sinal de Z e
Modelo de proteína redesenhado de Arkin, I. T., et al. Mechanism of Na+/K+ antiporting. de DYinfluenciam DG!. Quando DG!
Science 317: 799, 2007.
é negativo, o movimento de solutos
ocorre espontaneamente; este é
frequentemente chamado transporte passivo. Quando
Lado 1 Lado 2
DG! é positivo, investimento de energia de alguma fonte
é necessária e o processo é chamado transporte ativo.
Transportador O transporte em células de mamíferos que requer
investimento de energia é dirigido pela hidrólise de nu
cleosídeos trifosfato (por exemplo, ATP → ADP + fosfa
S1 S2 Uniporte
to) ou pela utilização do gradiente eletroquímico de Na+
(força sódio-motiva, SMF) ou H+ (força próton-motiva,
PMF). Procariotos também têm transportadores diri
S1 S2 gidos por reações de decarboxilação e transferência
Simporte de metil, e plantas têm transportadores dirigidos por
S!1 S!2 absorção de luz. A SMF é gerada às custas de hidrólise
S1 S2
de ATP, e a PMF por reações de oxidação-redução (p.
589). A inibição da síntese de ATP ou o colapso da PMF
Antiporte
dissipará o gradiente de Na+ e/ou K+, levando à parada
S!1 S!2 do transporte.
No mecanismo de transporte mais simples, isto é,
FIGURA 12.46 Mecanismos uniporte, simporte e o transporte de um único soluto por um mecanismo
antiporte para deslocamento de substâncias. uniporte, as moléculas são transportadas a favor de seu
S e S! representam moléculas diferentes. gradiente químico se elas não tiverem carga, ou a favor
de um gradiente eletroquímico, se forem carregadas;
isso é frequentemente chamado difusão mediada por
Energética de Sistemas de proteína ou difusão facilitada. Esses transportado
res não podem criar um gradiente de concentração do
Transporte de Membrana substrato através da membrana. Em um simporte (duas
moléculas sendo movidas simultaneamente na mesma
A Equação 12.2 fornece a variação de energia livre direção) ou antiporte (duas moléculas sendo movidas
quando uma molécula sem carga se move de uma con simultaneamente em direções opostas), o movimento a
centração C1 para uma concentração C2 do outro lado favor do gradiente de concentração de um dos solutos
da membrana. pode direcionar o deslocamento da outra molécula. Es
C2C1 ) tes têm sido chamados transportadores ativos secun
∆G =2,3 RTlog ( (12.2) dários, para diferenciá-los dos transportadores ativos
primários, que utilizam diretamente a energia derivada
do metabolismo celular. O grande gradiente de concen
Quando DG! é negativo – isto é, há liberação de ener
gia livre – o movimento do soluto ocorre sem a necessi tração de Na+ através da membrana plasmática (alta
concentração extracelular e baixa intracelular; Figura
dade de uma força motriz. Quando DG! é positivo, como
1.9, p. 14) é usado para deslocar açúcares e aminoácidos
seria o caso se C2 for maior do que C1, então é necessá por um mecanismo simporte para dentro das células.
rio um aporte de energia para impulsionar o transporte.
Para uma molécula carregada (por exemplo, Na+), tan Alguns transportadores mantêm gradientes de con
to o potencial elétrico como a concentração de soluto centração muito grandes, como o transportador de
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
membrana plasmática que mantém os gradientes de
Na+ e K+ (p. 511). Outro exemplo surpreendente é um
transportador ativo das células parietais das glândulas
gástricas, que é responsável pela secreção de HCl no
lúmen do estômago (p. 1067). O pH do plasma é cerca
de 7,4 (4 × 10–8MH+), e o pH luminal do estômago pode
chegar a pH 0,8 (0,15 MH+). H+ é transportado contra
um gradiente de concentração de 1 × 106. Considerando
que não haja componente elétrico, a energia para se
creção de H+ nessas condições é calculada a partir da
Equação 12.2 e é 38 kJ mol/L (9,1 kcal mol/L) de HCl.
Transportadores de Membrana de
Mamíferos
As duas classes principais de transportadores de cé
lulas de mamíferos (ver Tabela 12.8) são
• transportadores dirigidos por potencial eletro
químico, que movem seus substratos através de
uma membrana utilizando o gradiente de con
centração do substrato ou outro soluto, e
• transportadores ativos primários, que re
querem o investimento de energia metabólica
para mover o substrato.
Células de mamíferos têm uma grande variedade
de transportadores e, em muitos casos, usam dife
rentes subfamílias de transportadores para deslocar
o mesmo substrato, dependendo das necessidades es
pecíficas da célula ou tecido. Sistemas de transporte
estão presentes em plantas, bem como em membranas
intracelulares, incluindo mitocôndrias, lisossomos,
peroxissomos e endossomos. O número de transporta
dores ativos presentes em uma membrana em um dado
tempo estabelece a velocidade máxima de captação
por uma célula ou organela. Assim, em muitos casos,
a síntese da proteína transportadora e sua incorpora
ção em uma membrana controla a concentração de um
substrato específico em uma célula ou compartimento
celular. Todos esses sistemas de transporte são regu
lados, permitindo o controle momento a momento do
transporte. Muitas doenças genéticas são atribuídas a
defeitos nos vários sistemas de transporte (Correlação
Clínica 12.4).
12.9 TRANSPORTADORES
DIRIGIDOS POR POTENCIAL
ELETROQUÍMICO
Os transportadores dirigidos por potencial
eletroquímico utilizam
1. um mecanismo uniporte, onde um único soluto é
transportado por difusão mediada ou de modo de
pendente do potencial de membrana se o soluto for
carregado;
• 507
2. um mecanismo antiporte, no qual dois ou mais so
lutos são transportados em direções opostas em
um processo fortemente acoplado, que não utiliza
qualquer forma de energia a não ser a do gradiente
de potencial eletroquímico; o gradiente através da
membrana de um soluto pode conduzir o movimen
to do outro soluto.
3. um mecanismo simporte, no qual duas ou mais es
pécies são transportadas juntas na mesma direção,
em um processo acoplado, que não usa qualquer
forma de energia a não ser a do gradiente de poten
cial eletroquímico de um substrato; o gradiente de
um soluto dirige o movimento do outro soluto.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 12.4
Doenças Que se Devem à Perda de Sistemas de
Transporte de Membranas
Várias condições patológicas são devidas a altera
ções em um sistema de transporte para componentes
celulares específicos. Os indivíduos com uma dimi
nuição na captação de glicose do trato intestinal não
têm o transportador específico de glicose-galactose
acoplado a sódio. Síndromes com má absorção de fru
tose são causadas por uma alteração na atividade do
sistema de transporte para frutose. Na doença de Har
tnup, ocorre uma diminuição no transporte de ami
noácidos neutros nas células epiteliais do intestino e
dos túbulos renais.
Na cistinúria, a absorção renal de cistina e dos
aminoácidos básicos lisina, arginina e ornitina é
anormal, resultando na formação de cálculos re
nais de cistina. No raquitismo hipofosfatêmico,
resistente à vitamina D, a reabsorção renal de fos
fato é anormal. Recentemente, tem havido relatos
sobre doenças baseadas em genética, envolvendo
os transportadores de substratos para dopamina e
creatinina, e o transportador mitocondrial de as
partato glutamato. Os vários transportadores ativos
que requerem ATP foram implicados em várias con
dições patofisiológicas.
Evans, L., Grasset, E., Heyman, M., Dumontier, A. M.,
et. al. Congenital selective malabsorption of glucose and
galactose. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 4: 878, 1985;
Mueckler, M. Facilitative glucose transporters. Eur. J.
Biochem. 219: 713, 1994; deGrauw, T. J., Cecil, K. M.,
Byars, A.W., Salomons., G. S. et al. The clinical syndrome
of creatine transporter deficiency. Mol. Cell. Biochem.
244: 45, 2003; e Pederson, P. L. Transport ATPases in
biological systems and relationship to human disease: A
brief overview. J. Bioenergetics Biomembranes 34: 327,
2002.
508 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

TABELA 12.11 Substratos Representativos para Proteínas de Transporte de Membrana em Eucariotos

Cátions inorgânicos H+, K+, Na+, NH4+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Zn2+
Ânions inorgânicos Cl–, HCO3–, SO42–, iodeto, fosfato, arsenato
Açúcares Frutose, glicose, hexose, lactose, maltose, mioinositol
Ácidos orgânicos Acetato, ácidos biliares, bilirrubina, citrato, glicose 6-fosfato, a-cetoglutarato, lactato,
malato, oxaloacetato, prostaglandinas
Aminoácidos Ácidos, básicos, neutros, cadeia ramificada
Peptídeos/proteínas Alguns

Nucleosídeos/nucleotídeos ATP, ADP, todos os outros

Vitaminas/cofatores Ascorbato, biotina, folato, lipoato, tiamina
Drogas Múltiplas drogas
Fonte: Moss, G. P. Membrane Transport Proteins. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/mtp/

Centenas de tais transportadores foram descritos,
muitos exclusivamente em bactérias, com especifici
dade para íons inorgânicos, açúcares, aminoácidos
e outros intermediários metabólicos. A Tabela 12.11
ilustra a variedade de solutos transportados em célu
las eucarióticas por esse mecanismo. Muitos dos trans
portadores têm 2 a 24 sequências transmembrânicas
putativas a-helicoidais. Os transportadores direciona
dos por potencial eletroquímico demonstram cinética
de saturação, especificidade para o substrato que está
sendo movido através da membrana, e especificidade
para inibidores.
Transportadores Dirigidos
por Potencial Eletroquímico
Representativos
Glicose É Deslocada por um Mecanismo de
Uniporte Passivo
Uma família de transportadores de glicose (GLUT)
facilita o transporte de D-glicose através da membrana
plasmática de células de mamíferos por um mecanismo
uniporte. Os genes da família GLUT são expresso de
forma tecido-específica.
Os transportadores de glicose, chamados GLUT1,
GLUT2 e assim por diante (Tabela 12.12), todos têm
12 segmentos transmembrânicos, com significativa si
milaridade de aminoácidos. A maioria está na membra
na plasmática, onde a direção do movimento da glico
se é, geralmente, de fora para dentro. Dependendo do
gradiente de concentração, entretanto, GLUT1 de eri
trócito facilita o transporte em ambas as direções, de
monstrando a reversibilidade do sistema. Os três trans
portadores de alta afinidade (GLUT1, GLUT3 e GLUT4)
funcionam in vivo em velocidades próximas à velocida
de máxima porque seus valores de Km são inferiores à
concentração normal de glicose no sangue. D-Galacto
se, D-manose, D-arabinose e vários outros D-açúcares,
bem como glicerol, são deslocados por algumas isofor
mas. GLUT5, das membranas do sarcolema de múscu
lo esquelético, transporta frutose preferencialmente.
GLUT1 é importante para suprir eritrócitos e células do
cérebro com glicose. A velocidade de captação de glico
se pelo GLUT2 de baixa afinidade aumenta em paralelo
com a elevação da concentração de glicose no sangue,
e tem um papel importante na absorção intestinal de
açúcares (p. 1073). Em células do fígado, GLUT2 cata
lisa tanto o influxo como o efluxo de glicose, sendo res
ponsável pela exportação de glicose (p. 616); em células
b pancreáticas, GLUT2 está envolvido na detecção dos
níveis de glicose no sangue. GLUT4 é um transportador
que responde à insulina (p. 615) no tecido adiposo, no
músculo cardíaco e no músculo esquelético. A atividade
de alguns transportadores de glicose no músculo é esti
mulada por exercício e hipóxia, aparentemente porque
há uma necessidade de aumentar a utilização de glicose
pelo tecido. Vários análogos de açúcares, assim como a
floretina e a 2,4,6-tri-hidroxiacetofenona (Figura 12.47)
são inibidores competitivos.
Glicose e Aminoácidos São Deslocados
com Na+ por um Mecanismo Simporte
O gradiente eletroquímico de Na+ (força sódio-mo
tiva, SMF) através da membrana plasmática (p. 14) é
uma fonte de energia para o movimento simporte de
Na+ com açúcares, aminoácidos, íons e outras molécu
las pequenas. Existem mais de 400 transportadores ex
pressos nessa família de proteínas. Como descrito ante
riormente (p. 506), a SMF é gerada pelo transporte de
Na+ acoplado à hidrólise de ATP (Figura 12.48); inibi
ção da síntese de ATP levará à dissipação do gradiente
de Na+ e à parada do transporte.
O mecanismo geral do cotransportador de sódio/gli
cose (SGLT) é apresentado na Figura 12.49. O diagra
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 509

TABELA 12.12 Principais Isoformas de Transportadores de Glicose

Isoforma Tecido Localização Celular Comentários
GLUT1 Músculo Membrana plasmática Atividade no músculo aumentada por insulina,
Coração hipóxia e dieta
Barreira hemato-encefálica
Células da glia
Placenta
GLUT2 Fígado Membrana plasmática
Pâncreas
Intestino
Rim
GLUT3 Neurônio Membrana plasmática
Rim
Placenta
GLUT4 Músculo Membrana plasmática Atividade em músculo e tecido adiposo estimula
Tecido adiposo da por insulina e, no músculo, por hipóxia e dieta
Coração
Blastocistos
GLUT5 Músculo Vesículas do sarcolema Frutose é o substrato
Espermatozoides

OH Lado 1 Lado 2

HO CCH2CH2
O OH Transporte S1 S2
conduzido
por ATP ADP + Pi
OH
Floretina ATP
Transport S1 S2
OH conduzido
por Na+
Na+ Na+
HO OH C
O CH3 Na+gé
O mantido Na+
radiente Na+

por ATP ATP

ADP + Pi
2,4,6-Tri-hidroxiacetofenona

FIGURA 12.47 Inibidores do transporte passivo de

D-glicose em eritrócitos.
ma representa o transporte de D-glicose dirigido pelo
movimento de Na+. No processo, dois Na+ movem-se
para dentro da célula, a favor do gradiente eletroquími
co de Na+ por transporte passivo facilitado, e glicose é
carregada junto, contra seu gradiente de concentração.
FIGURA 12.48 Envolvimento de energia metabólica (ATP)
em sistemas de transporte ativo mediado.
A energia química liberada na hidrólise de ATP a ADP e fosfato
inorgânico é usada para conduzir o transporte ativo de várias
substâncias, incluindo Na+. O gradiente transmembrânico de
concentração de Na+ é usado para o transporte ativo de subs
tâncias por mecanismos simporte e antiporte (não mostrado).

O gradiente de Na+ se dissipa no processo, mas a
ATPase trocadora de Na+/K+ continua a restabelecê-lo.
Portanto, a energia metabólica na forma de ATP está
indiretamente envolvida no transporte porque ela é ne
cessária para manter o gradiente de Na+. Inibição da
ATPase trocadora de Na+/K+ leva a uma diminuição no
gradiente de Na+, impedindo assim a captação de glico
se por esse mecanismo.
Mais de 37 membros da família de genes SGLT fo
ram identificados em células animais, de leveduras e
bactérias; quatro são expressos no homem. Algumas
isoformas são expressas nos túbulos proximais renais
e no epitélio do intestino delgado (p. 1067). Todos os
SGLTs têm uma estrutura central comum com 13 hé
lices transmembrânicas, mas diferentes isoformas têm
segmentos transmembrânicos adicionais, incluindo o
SGLT1 humano, que tem 14. Os SGLTs podem catali
sar um movimento uniporte de Na+ e água em ausên
cia de glicose. Na+ liga-se a uma cavidade extracelular
do transportador, induzindo uma alteração conforma
cional que aumenta a afinidade do transportador por
510 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Extracelular Citoplasma Lado 1 Lado

Glicose Glicose

2 Na+ 2 Na+
CI– 2CI–
3 Na+ 3 Na+ HCO3– HCO3–

2 K+ 2 K+
ADP + Pi
ATP

FIGURA 12.49 Transporte dependente de Na+ de glicose

através da membrana plasmática por um mecanismo FIGURA 12.50 Mecanismo de antiporte passivo de ânions
simporte de transporte. para movimento de Cl– e HCO3– através da membrana
plasmática do eritrócito.

glicose. A ligação de glicose, formando um complexo

ternário, induz outra mudança estrutural que expõe teínas em bactérias, archea, levedura, plantas e ani
Na+ e o substrato a uma cavidade na proteína, contígua mais. Elas variam em tamanho de 541 a 894 resíduos e
ao ambiente intracelular do outro lado da membrana. têm 10–12 segmentos transmembrânicos α-helicoidais
Na+ se dissocia do transportador em virtude da baixa previstos. Uma importante função fisiológica é eliminar
concentração intracelular de Na+, levando ao retorno o H+ gerado durante o metabolismo, regulando assim
do transportador à sua conformação original, que tem o pH citoplasmático e impedindo a acidificação intra
uma afinidade diminuída por glicose. Portanto, a glico celular. No rim, a isoforma-3 serve para recuperar Na+
se é liberada. O transportador vazio é reorientado na do lúmen do néfron. A isoforma-1 no músculo cardíaco
membrana, permitindo que o ciclo se reinicie. é ativada por pH baixo e por fosforilação. Essa isoforma
pode ter um papel significativo na patogênese do infar
Aminoácidos são deslocados através das células epi to do miocárdio e na hipertrofia tecidual.
teliais intestinais por transportadores de Na+/amino
ácidos por um mecanismo simporte; pelo menos sete Mitocôndrias Têm Vários
transportadores foram identificados para diferentes
Transportadores Direcionados pelo
classes de aminoácidos (p. 82). O gradiente de Na+
através da membrana plasmática é também utilizado Potencial Eletroquímico
para dirigir o transporte de outros íons, incluindo um
A membrana mitocondrial interna contém transpor
mecanismo simporte para captação de Cl– e um meca tadores para a troca de ânions entre o citoplasma e a
nismo antiporte para excreção de Ca2+. matriz mitocondrial, incluindo (1) um antiporter para
a troca de ADP e ATP, (2) um simporter para o trans
Cl– e HCO3– São Transportados por um porte de fosfato e H+, (3) um transportador de dicarbo
Mecanismo Antiporte xilatos, e (4) um antiporter para glutamato-aspartato
(ver p. 595 para uma discussão detalhada). Esses trans
Um transportador de ânions em eritrócitos e rins
portadores são importantes na conservação de energia
é mediador do movimento antiporte eletroneutro de
e no metabolismo. Na ausência de um aporte de energia,
Cl– e HCO3– (Figura
do trocador de Cl–-HCO
12.50).
–3 independente
O transportador
de Na+
é chama
esses transportadores podem mediar uma troca passiva
ou pro
de metabólitos a favor de seus gradientes de concentra
teína trocadora de ânions e, em eritrócitos, banda 3, ção para chegar a um equilíbrio termodinâmico. Em al
o último em virtude de sua posição na eletroforese em guns casos, o transportador é mediador do movimento
gel de SDS-poliacrilamida das proteínas da membrana
antiporte de um igual número de cargas elétricas nos
do eritrócito. A direção do fluxo de íons depende dos
substratos, com o potencial de membrana mitocondrial
gradientes de concentração de íons na membrana. O
influenciando o equilíbrio.
transportador é importante no ajuste da concentração
de HCO3– do eritrócito no sangue arterial e venoso. O
transportador do rim é uma forma truncada da proteína
para
do eritrócito
equilibrar efluxo de H+
e éoresponsável pelo
direcionado
efluxo de base
por ATP.
(HCO–)3 12.10 TRANSPORTADORES
ATIVOS PRIMÁRIOS
O Trocador de Na+/K+ Regula o pH Transportadores ativos primários em células de ma
Citoplasmático míferos incluem sistemas de transporte nos quais
As nove isoformas de mamíferos do transportador 1. a energia livre de hidrólise de uma ligação pirofos
de Na+/K+ são membros de uma grande família de pro fato (p. 563) é utilizada para direcionar o movi
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
mento do substrato contra seu gradiente químico
ou eletroquímico; e
2. a proteína transportadora pode ser transitoria
mente fosforilada durante o processo de transpor
te, mas o substrato não é fosforilado ou modificado.
Essa família de transportadores catalisa o desloca
mento de um soluto contra seu gradiente de concen
tração, levando à criação de um gradiente químico ou
eletroquímico. Como todos os transportadores, são ca
racterizados por cinética de saturação, especificidade
para um ou alguns substrato parecidos e capacidade
de serem inibidos. Esses transportadores são encontra
dos em todos os organismos vivos. Células de mamífe
ros utilizam ATP ou outro nucleosídeo trifosfato como
fonte de energia. Os transportadores que utilizam ATP
são também chamados ATPases, indicando sua ativida
de enzimática na hidrólise de ATP durante o desloca
mento. Decarboxilação, transferência de metil, óxido
-redução e absorção de luz podem servir para conduzir
o transporte em outros organismos.
Três subfamílias de transportadores ativos primários
catalisam o deslocamento de cátions inorgânicos (Na+,
K+, Ca2+ ou H+) e são classificados como transportadores
P, V e F. Os transportadores tipo P são fosforilados e de
fosforilados durante o transporte; há mais de 300 mem
bros nessa subfamília. Os transportadores tipo V (V de
vacúolo) são bombas de prótons, responsáveis pela acidi
ficação do interior dos lisossomos, endossomos, vesículas
do Golgi e vesículas secretórias. Os transportadores tipo
F, presentes em mitocôndrias, cloroplastos e bactérias,
deslocam prótons às custas da hidrólise de ATP, mas
sintetizam ATP quando funcionando na direção inversa,
isto é, quando prótons são transportados a favor de seu
gradiente de concentração (p. 589).
Os transportadores com cassete de ligação a ATP
(ATP-binding cassette, ABC) são uma superfamília
muito grande e singular de transportadores ativos pri
mários dependentes de ATP, necessários ao transporte
de uma variedade de moléculas inorgânicas e orgânicas.
Transportadores Ativos Primários
Representativos
Deslocamento Antiporte de Na+ e K+ É por
Transporte Ativo Primário
A membrana externa ou plasmática das células de
todas as formas de vida contém um antiporter tipo P de
Na+/K+, que utiliza a energia de hidrólise do ATP a ADP
+ fosfato para conduzir o deslocamento. O transporta
dor é denominado ATPase trocadora de Na+/K+, mas
é frequentemente chamado Na+/K+-ATPase ou bomba
de Na+. Essa superfamília de proteínas multissubuni
dades, encontrada em bactérias, archae e eucariotos,
tem uma subunidade grande que catalisa a atividade de
ATPase e o deslocamento dos íons. Membros da super
• 511
família foram descritos em bactérias, para captação e/
ou efluxo de K+, Mg2+, Ca2+, Ag+, Zn2+, Co2+, Pb2+, Ni2+,
Cd2+ e Cu2+.
As membranas plasmáticas de todas as células de
mamíferos catalisam a reação
ATP Na++K+
−→ ADP + Pi (12.4)
Mg2+
com uma necessidade absoluta de íons Na+ e K+, e de
Mg2+, um cofator das reações que requerem ATP. O
transportador é responsável pela manutenção das con
centrações altas de K+ e baixas de Na+ no citoplasma
das células de mamíferos (p. 14). Tecidos excitáveis,
tais como músculo e tecido nervoso, e células ativamen
te envolvidas no movimento do íon Na+, tais como as de
glândula salivar e córtex renal, têm altas atividades da
ATPase trocadora de Na+/K+. Estima-se que este trans
portador use cerca de 60–70% do ATP sintetizado por
células nervosas e musculares e cerca de 35% do ATP
gerado em um indivíduo em repouso.
O transportador consiste de uma subunidade a
(110 kDa) e uma subunidade b (55 kDa); existe algum
questionamento quanto ao real transportador ser um te
trâmero com duas subunidades a e duas b. A subunida
de a tem 10 segmentos em a-hélice transmembrânicos
(Figura 12.51), contém ambas atividades de ATPase e de
deslocamento de íons, e é fosforilada e defosforilada em
um resíduo específico de ácido aspártico para formar um
b-aspartil fosfato durante o deslocamento dos íons.
FIGURA 12.51 Estrutura da subunidade a da ATPase
trocadora de Na+/K+.
Modelo da subunidade a da ATPase trocadora de Na+/K+ de car
neiro. Os domínios previstos são o domínio de ligação de nucleotí
deo (N) e o domínio de fosforilação (P). As a-hélices são mostra
das em tons de azul e verde, as folhas b são mostradas em tons de
vermelho e amarelo, e as espirais são mostradas em cinza.
Reproduzido com permissão de Kaplan, J. H. Biochemistry of
Na+, K+-ATPase. Annu. Rev. Biochem. 71: 511, 2002. Direitos
autorais (2002) Annual Reviews; www.annualreviews.org
512 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Os sítios de ligação dos cátions e do ATP estão em o potencial transmembrânico das células. A hidrólise
domínios diferentes da subunidade a. A subunidade b é do ATP pelo transportador só ocorre se Na+ e K+ forem
muito glicosilada, facilita a inserção da subunidade a na deslocados. Um modelo para o movimento de Na+ e K+
membrana após a síntese e estabiliza o complexo; pode é apresentado na Figura 12.53. A proteína sofre mudan
também funcionar ativamente na atividade de trans ças conformacionais durante as quais Na+ e K+ movi
porte. O transportador do rim contém uma subunidade mentam-se por distâncias curtas dentro da proteína.
g, que pode influenciar os parâmetros cinéticos da ati Esta transição conformacional diminui a afinidade do
vidade. A fosforilação da subunidade a requer a ligação sítio de ligação pelos cátions, resultando na liberação
de Na+ e Mg2+, mas não de K+, embora a defosforilação do cátion em um meio em que a concentração é mais
exija a ligação de K+, mas não de Na+ ou Mg2+ (Figura alta do que aquela da qual ele foi transportado.
12.52). O complexo proteico tem duas conformações
distintas, e é classificado como um transportador tipo Várias isoformas do transportador são reguladas por
E1-E2, para indicar a mudança de conformação. diferentes mecanismos, incluindo a concentração de
substrato, o citoesqueleto, inibidores circulantes e uma
variedade de hormônios. A atividade requer fosfolipíde
Citoplasma os; o transportador tem sítios de ligação para cerca de
30 moléculas de lipídeos, e os níveis de ácido docosa
2K+ E1 ATP 3Na+ E1 ATP
E1 ATP -hexaenoico (ácido graxo poli-insaturado de cadeia
longa) no cérebro correlaciona-se com a atividade de
2 K+ 3 Na
ATPase. Esteroides cardiotônicos, como digitalis, são
inibidores da ATPase trocadora de Na+/K+ e aumentam
ATP
E2 2 K+ ADP
a força de contração do músculo cardíaco por alterarem
P
E1
a excitabilidade do tecido. Ouabaína (Figura 12.54) é
3 Na+ um dos inibidores mais ativos da ATPase trocadora de
Pi Na+/K+; liga-se à subunidade pequena, na superfície ex
H2O Na+ terna da membrana.
P P E2 P
E2 E2 O Deslocamento de Ca2+É Catalisado por
2 Na+
2 K+
2 K+ 2 Na+ um Transportador Ativo Primário
Extracelular
Cálcio é um importante mensageiro intracelular,
FIGURA 12.52 Sequência proposta de reações e que regula muitos processos celulares, desde o meta
intermediários na hidrólise de ATP pela ATPase trocadora bolismo de carboidratos até a contração muscular. O
de Na+/K+. Ca2+ citosólico é cerca de 0,10 mM, mais de 10.000 ve
E1 e E2 são diferentes conformações da enzima. Fosforilação zes menor do que o Ca2+ extracelular. O Ca2+ no citosol
da enzima requer Na+ e Mg2+, e defosforilação envolve K+. aumenta rapidamente por liberação de Ca2+ do retículo
endoplasmático ou sarcoplasmático ou abertura tran
O movimento de Na+ e K+ é um processo antiporte sitória dos canais de Ca2+ da membrana plasmática,
eletrogênico, com três íons Na+ movendo-se para fora e permitindo o fluxo de Ca2+ a favor do grande gradien
dois íons K+ para dentro da célula, para cada molécula te de concentração (p.501). Para restabelecer os níveis
de ATP hidrolisada. Isso leva a um aumento na carga citosólicos baixos, Ca2+ é transportado ativamente por
positiva externa e é parte do mecanismo para manter duas ATPases transportadoras de Ca2+ (Ca2+ ATPa

3 Na+
2 K+

lar
do elu
La trac
Ex P
ATP
P
ATP
2 K+
ADP ATP
o 3 Na+ P
do lic
La itosó
C ATP

FIGURA 12.53 Modelo para deslocamento de Na+ e K+ através da membrana plasmática pela ATPase trocadora de Na+/K+.
(1) Transportador na conformação 1 liga Na+. (2) Transportador na conformação 2 desloca e libera Na+. (3) Transportador na con
formação 2 liga K+. (4) Transportador na conformação 1 desloca e libera K+.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 513

ses) diferentes, uma transportando Ca2+ de volta para A Ca2+-ATPase dodo retículoretículo sarcoplasmáticosarcoplasmático dodo mús-mús
o lúmen do retículo endoplasmático ou sarcoplasmáti culo (SERCA) está envolvida nos ciclos de contração-re
co, e a outra para fora da célula, através da membrana laxamento do músculo, representando 80% das proteí
plasmática. As Ca2+-ATPases são transportadores tipo nas integrais de membrana do retículo sarcoplasmático
P, fosforilados por ATP em um resíduo aspartil; exis e ocupando um terço da área de superfície (p. 998).
tem em dois estados conformacionais, sendo portanto Consiste de uma única cadeia polipeptídica com dez hé
transportadores do tipo E1-E2. lices transmembrânicas (Figura 12.55). Dois Ca2+ são
deslocados do citosol para o lúmen contra um grande
gradiente de concentração (104), em uma troca antipor
O O te por 2 H+ por ATP hidrolisado. No estado E1 (Figura
12.56), os sítios de ligação têm uma alta afinidade por
OH CH Ca2+ e são acessíveis do citosol, enquanto no estado E2
3 os sítios de ligação de Ca2+ têm baixa afinidade e ficam
OH OH abertos para o lúmen. A forma livre de Ca2+ mostra
CH2
grandes diferenças conformacionais em relação à forma
OH
ligada a Ca2+(Figura 12.56). Os dois Ca2+ ficam ligados
lado a lado, circundados por quatro hélices transmem
O
brânicas. Foi proposto que a Ca2+-ATPase do retículo
H OH sarcoplasmático também possa desempenhar um papel
O na termogênese por ligação de Ca2+, seguida de hidróli
HO
CH3
H H H se de ATP, mas liberando o Ca2+ de volta no citosol, sem
H deslocamento do cátion. A energia da hidrólise do ATP
OH OH é liberada como calor. Um peptídeo pequeno, sarcolipi
na, aumenta a produção de calor.
FIGURA 12.54 Estrutura de ouabaína, um esteroide
cardiotônico e potente inibidor da ATPase trocadora de
Na+/K+.

FIGURA 12.55 Estrutura da ATPase transportadora de Ca2+.

Mudanças conformacionais da ATPase transportadora de Ca2+ do retículo sarcoplasmático. Os pontos de entrada e saída de Ca2+ são
indicados pelas setas roxas. A figura à esquerda é com Ca2+ ligado, e a figura à direita é sem Ca2+.
Reproduzido com permissão de Toyoshima, C. e Inesi, G. Structural basis ofion pumping by Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticu
lum. Annu. Rev. Biochem. 73: 269, 2004. Direitos autorais (2004) Annual Reviews; www.annualreviews.org.
514 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Citoplasma
E1 ATP 2 Ca2+ E ADP E1
ATP P
1
2 Ca2+ 2 Ca2+

ATP
P P
Hélice
E2 P E2 E2
E
2 Ca2+
i 2 Ca2+
Ca2+
Lúmen

FIGURA 12.56 Sequência de reações e intermediários no

deslocamento de Ca2+ pela ATPase transportadora de
Ca2+.
E1 e E2 são diferentes conformações da enzima. Hélice
F
Calmodulina Controla a ATPase
Transportadora de Ca2+ das Membranas
Plasmáticas
A ATPase transportadora de Ca2+ das membranas
plasmáticas (PMCA) lembra a do retículo sarcoplasmático.
Trinta isoformas de PMCA são conhecidas. Diferentemen
te da SERCA, transporta só um Ca2+ por ATP hidrolisado.
Em células eucarióticas, o transportador é regulado pelos
níveis de Ca2+ citoplasmático por meio da calmodulina,
uma proteína que liga Ca2+ (Figura 12.57). À medida que Mão
EF
os níveis de Ca2+ citosólico sobem, Ca2+ liga-se à calmodu
lina, que tem uma constante de dissociação de ~1 μM para
FIGURA 12.57 Sítio de ligação de Ca2+ na calmodulina.
Ca2+. O complexo Ca2+-calmodulina liga-se ao transpor A calmodulina tem quatro sítios de ligação de Ca2+, cada um
para 0,5
tador de μM
Ca2+,
e aumentando
diminuindo ooKtransporte
m para Ca2+
dedeCa2+.
cerca
A de 20 com um motivo hélice–alça–hélice. O íon Ca2+ liga-se à alça que
ativi conecta duas hélices. Esse motivo ocorre em várias proteínas
dade aumentada reduz o Ca2+ citosólico a seu nível normal que ligam Ca2+ e é conhecido como a mão EF.
de repouso (~0,10 μM), concentração na qual o complexo
Ca2+-calmodulina se dissocia e a velocidade do transporte Transportadores com Cassete de Ligação a
de Ca2+ volta a seu valor basal.
ATP (ABC)
Outros processos celulares são também regulados
Membranas, desde procariotos até eucariotos, têm
pelo complexo Ca2+-calmodulina. Calmodulina é uma
transportadores que pertencem à superfamília de
dentre várias proteínas que se ligam a Ca2+, incluindo
transportadores com cassete de ligação a ATP (ABC)
parvalbumina e troponina C, que têm estruturas muito
que catalisam um movimento vetorial, dependente de
semelhantes. Calmodulina (17 kDa) tem a forma de hal
ATP, de diversas substâncias. Existem dúzias de subfa
teres, com duas extremidades globulares conectadas
mílias na superfamília, e mais de 1.000 genes, a maioria
por uma α-hélice de sete voltas; contém quatro sítios de
de bactérias, de transportadores ABC que foram clona
ligação de Ca2+, dois de alta afinidade em uma extremi
dos; o genoma humano contém pelo menos 49 genes.
dade, e dois de baixa afinidade, na outra. A ligação de
Transportadores ABC estão presentes tanto na mem
Ca2+ aos sítios de ligação de baixa afinidade causa uma
brana plasmática como em membranas intracelulares
mudança conformacional, que revela uma região hidro
de células de mamíferos, catalisando influxo ou efluxo
fóbica que interage com uma proteína que ela controla.
de vários lipídeos (fosfolipídeos, acil graxo-CoA de ca
Cada sítio de ligação ao Ca2+ consiste de uma estrutura
deia longa, sais biliares e colesterol), peptídeos e uma
secundária hélice–alça–hélice (Figura 12.57) com Ca2+
variedade de moléculas orgânicas tóxicas e agentes qui
ligado à alça que conecta as hélices. O motivo é cha
mioterápicos. Os transportadores ABC de bactérias são
mado mão EF, com base em estudos com parvalbumina
muito versáteis, transportando íons, metais pesados,
onde o Ca2+ liga-se entre as hélices E e F da proteína.
açúcares, drogas, aminoácidos, peptídeos e proteínas.
As duas famílias de transportadores de Ca2+ com Esses transportadores têm uma estrutura modular,
partilham algumas propriedades; por exemplo, a alta com um domínio de seis segmentos transmembrânicos
afinidade por Ca2+, a topografia na membrana e a or e um domínio citosólico de ligação ao ATP (ou cassete).
ganização do domínio catalítico. Elas são diferentes Os domínios de ligação ao ATP da superfamília apre
em características estruturais e funcionais, entretanto, sentam extensa homologia de sequência. A maioria das
principalmente em sua regulação. subfamílias tem uma repetição em sequência (tandem)
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
Fora
1 2 3 4 5 6 Membrana 7 8 9 10
Dentro
N
NBD-1
(a)
NBD-1 NBD-2
(b)
FIGURA 12.58 Modelo de uma glicoproteína-P, um transportador
com cassete de ligação a ATP (ABC).
NBD-1 e NBD-2 são domínios de ligação a nucleotídeo
de dois domínios transmembrânicos e dois domínios de
ligação ao ATP (Figura 12.58). Transportadores ABC
individuais funcionam mecanisticamente como canais
ou como transportadores. A ligação do ATP induz uma
mudança conformacional nos domínios transmembrâ
nicos, mas a hidrólise do ATP não leva à fosforilação do
transportador. O mecanismo de acoplamento da ener
gia da hidrólise do ATP ao movimento do substrato ain
da permanece indefinido.
Uma subfamília de transportadores
ABC no homem é codificada pela famí
lia de genes de resistência a múltiplas
drogas (Mdr). Os produtos dos genes
são glicoproteínas, chamadas glicopro
teínas-P, algumas das quais responsá
veis pela extrusão das células de uma
variedade de xenobióticos. A superex
pressão dos genes Mdr por células tu
morais leva à resistência aumentada a
uma variedade de drogas, porque agen
tes quimioterápicos são rapidamente
transportados para fora das células,
com o número aumentado de transpor
tadores. Portanto, a droga não atinge
as concentrações terapêuticas efetivas.
Outras proteínas associadas à resis
tência a múltiplas drogas (MRP) são
responsáveis pelo efluxo das células de
compostos conjugados com glutationa,
glucuronato e sulfato. Transportadores
glicoproteínas-P são responsáveis pelo
efluxo de lipídeos como fosfatidilcolina,
colesterol e ácidos biliares através da
• 515
membrana plasmática canalicular dos hepatóci
tos. Outro membro tem o importante papel fisio
11 12 lógico de transportar bilirrubina glucuronídeos
do fígado para a bile (p.. 823).823).). OutroOutroOutro transpor-transpor-transpor
tador ABC é o receptor de sulfonilureia ligado
NBD-2 a um canal de K+, que funciona na regulação da
secreção de insulina induzida por glicose.
O reguladorregulador dede condutânciacondutância transmembrâni-transmembrâni
co da fibrose cística (CFTR) é um transportador
ABC, mas mecanisticamente é um regulador de
condutância e um canal de Cl–. O canal é media
dor do movimento transepitelial de sal e líquido
na membrana plasmática apical de células epite
liais. CFTR consiste de cinco domínios, dois do
mínios com seis hélices transmembrânicas cada,
dois domínios de ligação ao ATP e um domínio
regulatório globular (Figura 12.59). A fosforila
ção do domínio regulatório regula a atividade
do canal, enquanto a hidrólise do ATP contro
la a abertura do canal. Uma disfunção de CFTR
causa a doença genética fibrose cística. Uma
deleção do resíduo de fenilalanina F508 da alça
de ligação ao ATP NBD-1 (domínio de ligação a
nucleotídeo-1) está presente em cerca de 70%
dos casos de fibrose cística. Essa deleção impede o do
bramento correto de NBD-1 (Correlação Clínica 12.5 e
Correlação Clínica 6.7, p. 236).
Outras doenças genéticas atribuídas a defeitos em
proteínas transportadoras ABC específicas incluem
adrenoleucodistrofia, distrofia macular de Stargardt,
uma doença degenerativa hereditária da mácula lútea,
que leva à rápida perda de acuidade visual, e síndrome
de Dubin-Johnson (Correlação Clínica 12.6).
N C
NBD-1
NBD-2
* R
F508
FIGURA 12.59 Diagrama esquemático do regulador de condutância
transmembrânica da fibrose cística (CFTR), um membro da família de
transportadores ABC.
NBD-1 e NBD-2 são subunidades que se ligam ao ATP, e R é uma subunidade regu
latória. F508 é o sítio de deleção de fenilalanina, que ocorre em cerca de 70% dos
pacientes com fibrose cística.
Redesenhado com base em uma figura de Ko, Y. H. e Pedersen, P. L. Frontiers in
research on cystic fibrosis: Understanding its molecular and chemical basis and re
lationship to the pathogenesis of the disease. Bioenerg. Biomemb. 29: 417, 1997
516 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 12.5
Fibrose Cística e o Canal de Cl–
A fibrose cística (CF), uma doença autossômica
recessiva, é a doença hereditária grave mais comum
em caucasianos, ocorrendo com uma frequência de 1
a cada 2.000 nascidos vivos. É uma doença que afe
ta múltiplos órgãos, com obstrução pulmonar como
principal manifestação; secreções mucosas espessas
obstruem as pequenas vias aéreas, permitindo infec
ções bacterianas recorrentes. Disfunção do pâncreas
exócrino ocorre precocemente e leva a esteatorreia
(evacuação gordurosa); ver p. 1056 para uma discus
são do papel do pâncreas na digestão e na absorção
de gorduras. Pacientes com CF têm permeabilidade
reduzida a Cl–, o que dificulta secreção de fluidos e
eletrólitos, levando a desidratação luminal. Diagnós
tico de CF é confirmado por um significativo aumento
de Cl– no suor dos indivíduos afetados, em compara
ção com normais.
O gene responsável por CF foi identificado em
1989, e foram encontradas mais de 800 mutações le
vando a CF. A mutação mais comum afeta cerca de
70% dos pacientes e é uma deleção de uma única
fenilalanina na posição 508 da proteína, mas muta
ções missence (sentido errado), nonsense (intro
duz códon de terminação), frameshift (mudança na
12.11 TOXINAS FORMADORAS
DE POROS E IONÓFOROS
Bactérias e alguns poucos tecidos de mamíferos
sintetizam toxinas formadoras de poros. Elas perten
cem a uma grande família (58 membros) de peptídeos e
proteínas sintetizados nos ribossomos. São secretadas
pelas células e formam poros transmembrânicos nas
membranas de outra célula. Os poros criados permitem
o fluxo de eletrólitos e de moléculas pequenas através
da membrana, iniciando assim um efeito tóxico. Defen
sina, uma toxina formadora de poros sintetizada por
células epiteliais e hematopoiéticas, tem atividade de
antibiótico de amplo espectro.
Um grupo interessante de compostos de baixo peso
molecular (até alguns milhares de Daltons), sintetiza
dos e excretados por bactérias e fungos, facilita o deslo
camento de íons inorgânicos através das membranas de
outras células. Essas moléculas, chamadas ionóforos,
têm atividade antibacteriana porque rompem o equilí-
brio iônico de uma célula. Também são valiosas ferra
mentas experimentais em estudos de deslocamento de
íons em membranas biológicas e para manipulação das
composições iônicas das células.
estrutura de leitura) e nas junções de splicing (ver
p. 202) também foram relatadas. Muitas mutações
levam a uma mudança no dobramento da proteína.
O produto do gene CF é o regulador de condutância
transmembrânica da fibrose cística (cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator – CFTR).
O CFTR é um canal de Cl– dependente de cAMP, que
pode regular outros canais de íons; é expresso em
tecidos epiteliais. A fosforilação de um domínio cito
plasmático regulatório por proteína quinase A ativa
o canal. O CFTR é um polipeptídeo de 1480 aminoá
cidos, com homologia estrutural com a superfamília
de transportadores com cassete para ligação de ATP
(ABC). O gene foi clonado e um grande esforço vem
sendo feito para tratar a doença por terapia gênica,
usando vetores virais e não-virais, incluindo liposso
mos (ver Correlação Clínica 12.1).
Kunzelmann K. e Mall M. Pharmacotherapy of the ion trans
port defectin cystic fibrosis. Clin. Exp. Pharm. Physiol. 28:857,
2001. Zeitlin, P. L. Therapies directed at the basic defect in cystic
fibrosis. Clin. Chest Med. 19:515, 1998. Frizzell R. A. Functions
of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator pro
tein. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151:54, 1995. Naren, A. P.,
Cormet-Boyaka, E., Fu, J., et al. CFTR chloride channel regula
tion by an interdomain interaction. Science 286:544, 1999.
Os ionóforos são classificados em canais sintetiza
dos não-ribossomicamente (p. 497);497);); existemexistemexistem doisdoisdois sub-sub-sub
grupos principais: transportadores móveis, que ligam
um íon e se difundem facilmente em uma membrana, e
formadores de canal. Alguns ionóforos importantes são
apresentados na Tabela 12.13.
Cada transportador móvel tem uma especificida
de para íons. A Valinomicina (Figura 12.60) tem uma
afinidade por K+ 1.000 vezes maior do que por Na+, e
L-Val O D-Val
O
O N O H N
O
D-Val OL K+ OL N O
O
N O
L-Val
O H
H O
O L O
O N
N O
O
O D-Val
L-Val
FIGURA 12.60Estrutura do complexo valinomicina-K+.
Abreviaturas: D-Val, D-valina; L-Val: L-valina; L, L-lactato; H,
D-hidroxiisovalerato.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS • 517

TABELA 12.13 Importantes Ionóforos

Composto Importantes Cátions Transportados Ação
Valinomicina K+ ou Rb+ Uniporte, eletrogênico
Nonactina NH4+, K+ Uniporte, eletrogênico
A23187 Ca2+/2 H+ Antiporte, elétron-neutro
Nigericina K+/H+ Antiporte, elétron-neutro
Monensina Na+/H+ Antiporte, elétron-neutro
Gramicidina H+, Na+, K+, Rb+ Forma canais
Alameticina K+, Rb+ Forma canais

CH3 Quando um íon é quelado pelo ionóforo, sua capa de água

é removida e o íon é envolvido pela capa hidrofóbica. O
H3C CH3
complexo ionóforo-íon difunde-se livremente através da
H OO membrana. Como a interação entre o íon e o ionóforo é
H CH3
uma reação de equilíbrio, uma concentração de esta
do estacionário (steady state) do íon se estabelece em
C O
N O ambos os lados da membrana. Valinomicina transporta
OH
K+ por um mecanismo eletrogênico uniporte, que cria
NH C um gradiente eletroquímico através de uma membrana,
visto que transporta um K+ carregado positivamente
O NH (Figura 12.62a). Nigericina é um antiporter eletrica
mente neutro; seu grupo carboxila, quando dissociado,
CH3 liga um íon positivo, como K+, formando um complexo
neutro que se move através da membrana. Transporta
FIGURA 12.61 Estrutura de A23187, um ionóforo de Ca2+. um próton de volta na difusão pela membrana, levando
a uma troca de K+ por H+ (Figura 12.62b).
A23187 (Figura 12.61) tem uma afinidade por Ca2+ 10 Gramicidina A é um peptídeo de 15 resíduos com
vezes maior do que por Mg2+. Vários dos transportado D- e L-aminoácidos alternados. Nas membranas, for
res móveis têm uma estrutura cíclica, e o íon fica coor ma uma b-hélice e dimeriza, formando um longo (25
denado com átomos de oxigênio no centro da estrutura; Å) e estreito (5 Å de diâmetro) canal transmembrâni
a periferia da molécula consiste de grupos hidrofóbicos. co (Figura 12.63). Resíduos polares revestem o canal e

Lado extracelular K+

K+Ionóforo

K+

K+

K+ Lado citoplasmático
(a) FIGURA 12.62 Mecanismo proposto para
atividades ionoforéticas de valinomicina
e nigericina.
Lado extracelular H+ K+ (a) Transporte por valinomicina; (b) Trans
porte por nigericina. Irepresentaionóforo. O
H K H complexo valinomicina-K+ é carregado posi
tivamente e o deslocamento de K+ é eletro
Ionóforo – gênico, levando à criação de uma separação
–H de cargas através da membrana. Nigericina
desloca K+ em troca de um H+ através da
K
membrana, e o mecanismo é eletricamente
neutro.
K+ H+Lado citoplasmático
Diagrama adaptado de Pressman, B. C.
(b) Annu. Rev. Biochem. 45:501, 1976.
518 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

grupos hidrofóbicos ficam na periferia do canal, inte C

ragindo com a membrana lipídica. A estrutura permite
a passagem de água e de cátions divalentes, mas não
de ânions. A associação e dissociação dos monômeros
NN
controla a velocidade do fluxo de íons.

Dímero de
gramidicina A

FIGURA 12.63 Ação da gramicidina A.

Duas moléculas de gramicidina A formam um dímero com pon
tes de hidrogênio nas extremidades amino-terminais dos pep
tídeos, criando um canal na membrana.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 12.6

Doenças Que Envolvem a Superfamília de Transportadores ABC

Transportadores com cassete de ligação a ATP (ABC)
são uma superfamília de proteínas com várias subfa
mílias que contêm todas um domínio de ligação a ATP
conservado e diversos domínios transmembrânicos. Os
membros da superfamília catalisam o transporte depen
dente de ATP de uma ampla variedade de substâncias
e estão presentes em muitos tecidos diferentes. Alguns
são encontrados em formas mutantes em várias doenças.
A seguir são apresentados transportadores ABC selecio
nados, seus substratos e doenças relacionadas.

Transportador Substrato Doença

ABCA1 Fosfolipídeo Doença de Tangier
ABCG5 Esteróis de plantas Sitosterolemia
ABCR Fosfatidiletanolamina Degeneração macular juvenil
Retinite pigmentosa
ABC7 Ferro? Anemia sideroblástica com ataxia
BSEP Sais biliares Colestase intra-hepática progressiva familiar
MRP1 Xenobióticos Resistência a múltiplas drogas
MRP2 Bilirrubina glucuronídeos Síndrome de Dubin-Johnson
PGY3 Fosfatidilcolina de cadeia longa Colestase da gestação
TAP1 Transportador de peptídeo Espondilite anquilosante
Diabetes mellitus insulino-dependente
Doença celíaca

Note que as doenças genéticas que envolvem os Borst, P. e Elferink, R. O. Mammalian ABC transporters
transportadores ABC incluem uma variedade de condi in health and disease. Annu. Rev. Biochem. 71:537, 2002.
ções patofisiológicas, afetando vários tecidos diferentes
e vários sistemas bioquímicos.

Para uma lista detalhada dos transportadores ABC

e suas doenças, ver http://nutrigene.4t.com/humanabc.
htm.
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
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Termos Chaves
ácido fosfatídico
âncora de glicosilfosfatidi
linositol
aquaporinas
assimetria da membrana
ATPase trocadora de Na+/
K+
ATPases transportadoras
de Ca2+
aumento e diminuição de
expressão (up e down
regulation)
calmodulina
canais
canais de íons voltagem
-dependentes
canais regulados por
ligante glicerofosfolipídeos proteínas integrais
canal de Na+ glicoesfingolipídeos proteínas periféricas
canal nicotínico de acetil ionóforos receptores
colina (receptor) junções comunicantes toxinas formadoras de
cardiolipina (gap junctions) poros
ceramida ligação pirofosfato transporte ativo primário
colesterol lipídeos anfipáticos transporte dirigido por
complexos do poro nuclear lipossomos potencial eletroquímico
transporte eletricamente
cotransportador de sódio/ mecanismo antiporte
glicose silencioso
mecanismo simporte
transportadores com cas
difusão mediada por pro mecanismo uniporte
sete para ligação de ATP
teína
micelas (ABC)
esfingolipídeos
microdomínios transportadores mitocon
esfingomielina
modelo do mosaico driais
fluidez da membrana
moléculas sinais transportadores tipos P, V
força sódio motiva eF
plasmalogênio
fosfatidilinositol

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha
1. Todos os seguintes são modos pelos quais proteí
nas periféricas ligam-se a membranas, exceto
A. ligação a uma proteína integral.
D. liberação do soluto apenas se a concentração do
novo lado for menor do que a do lado original.
E. um mecanismo para deslocar o soluto de um
lado da membrana para o outro.

B. ligação eletrostática entre fosfolipídeos e gru
pos positivos da proteína.
C. por um grupo hidrofóbico curto em uma ex
tremidade da proteína.
D. ligação pelo grupo carboxila carregado da ex
tremidade carboxila da proteína.
E. ligação não-covalente a fosfatidilinositol da
membrana.
2. Características de um sistema de transporte me
diado incluem
A. ligação não-específica do soluto ao transpor
tador.
B. liberação do transportador da membrana após
o transporte.
C. uma velocidade de transporte diretamente
proporcional à concentração de soluto.
3. O deslocamento de Ca2+ através de uma membrana
envolve todos os seguintes exceto
A. transporte ativo por ATPases transportadoras
de Ca2+.
B. manutenção da [Ca2+] muito mais alta na célu
la do que no líquido extracelular.
C. fosforilação do transportador.
D. regulação pela ligação de um complexo Ca2+
-calmodulina ao transportador em eucariotos.
E. transportadores diferentes para o transporte
para dentro do lúmen ou para fora, através da
membrana plasmática.
4. Membranas celulares típicas
A. são compostas em cerca de 90% por fosfolipí
deos.
B. têm proteínas tanto integrais como periféri
cas.
522 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
C. contêm ésteres de colesterol.
D. contêm carboidratos livres, como glicose.
E. contêm grandes quantidades de triacilglice
róis.
5. Todos os seguintes estão corretos para um ionófo
ro, exceto que ele
A. requer o aporte de energia metabólica para
transporte mediado de um íon.
B. pode se difundir para frente e para trás atra
vés de uma membrana.
C. pode formar um canal na membrana através
do qual um íon pode difundir.
D. pode catalisar transporte mediado eletrogêni
co de um íon.
E. terá especificidade para o íon que move.
6. As células controlam a distribuição de água através
das membranas por aquaporinas e aquagliceropo
rinas porque a difusão não-facilitada é muito lenta.
Aquaporinas (AQP)
A. permitem o deslocamento de água e de peque
nos solutos.
B. reduzem o gradiente de pH porque transpor
tam H3O+.
C. são proteínas periféricas de membrana.
D. formam canais pelos quais água flui.
E. não têm controles específicos para abrir o ca
nal.
Questões 7 e 8: Dois problemas encontrados na admi
nistração oral ou intravenosa de drogas são a falta de
tecido-especificidade na ação da droga e o rápido me
tabolismo e, portanto, período limitado de efetividade
de algumas drogas. Uma tentativa de contornar esses
problemas é usar lipossomos para encapsular as drogas.
Algumas drogas têm um período de eficácia maior quan
do administradas dessa maneira. Lipossomos podem ser
preparados com proteínas específicas para se ligarem a
receptores de membrana celular específicos. Liposso
mos também são úteis como ferramentas de pesquisa,
para estudar as propriedades das membranas biológi
cas, já que apresentam estrutura e propriedades seme
lhantes. Grande parte do nosso conhecimento sobre as
membranas biológicas foi obtida usando lipossomos.
7. Receptores da membrana plasmática
A. geralmente têm moléculas ligantes como este
roides.
B. estão sempre acoplados a proteínas G.
C. são fixos, em número, para uma determinada
célula.
D. frequentemente atravessam a membrana com
um ou mais domínios transmembrânicos.
E. quando ligados ao seu ligante, sempre resul
tam na liberação de uma molécula pequena
(segundo mensageiro) no interior da célula.
8. Qual das seguintes afirmativas relativas a membra
nas está correta?
A. Os microdomínios, chamados balsas lipídicas
(lipid rafts), são fixos em posição nas mem
branas.
B. A composição em lipídeos das duas camadas
da membrana se equilibra.
C. Como demonstrado para lipossomos, a mem
brana é mais fluida nas superfícies.
D. Um aumento no conteúdo de colesterol de uma
membrana aumenta a fluidez da membrana.
E. Transportadores lipídicos catalisam o movi
mento unidirecional de lipídeos específicos de
uma camada para a outra.
Questões 9 e 10: Fibrose cística é uma doença gené
tica relativamente comum (1 em 2.000 nascidos vivos)
em caucasianos. Embora afete muitos órgãos, a obs
trução pulmonar é um problema importante. Pacien
tes com CF têm permeabilidade reduzida para Cl–, e
a doença pode ser diagnosticada por [Cl–] elevada no
suor. Mutações genéticas levam a defeitos na proteína
regulatória da condutância transmembrânica da fibro
se cística (CFTR), que é um canal de Cl– dependente
de cAMP. O regulador CFTR tem homologia estrutural
com a superfamília de transportadores com cassete de
ligação a ATP.
9. Canais de membrana
A. têm uma área aquosa grande na estrutura da
proteína, de modo que não são muito seletivos.
B. comumente contêm α-hélices anfipáticas.
C. são abertos ou fechados apenas como resulta
do de uma mudança no potencial transmem
brânico.
D. são o mesmo que junções comunicantes (gap
junctions).
E. permitem que substratos fluam só de fora para
dentro da célula.
10. Transportadores com cassete de ligação a ATP
(ABC):
A. têm um domínio que atravessa a membrana e
reconhece o substrato e um domínio de liga
ção a ATP.
B. todos efetuam translocação por formação de
canais.
C. só são encontrados em eucariotos.
D. todos têm duas funções – formação de um ca
nal e regulação da condutância.
E. são todos glicoproteínas-P.
Questões 11 e 12: Alterações nos sistemas de trans
porte de membrana para componentes específicos le
vam a várias doenças. Na doença de Hartnup, há uma
diminuição no transporte de aminoácidos neutros pelo
intestino e túbulos renais. Os indivíduos com uma cap
 CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA, RECEPTORES E TRANSPORTE DE SOLUTOS
tação diminuída de glicose no trato intestinal não têm
um transportador específico de glicose-galactose. Nes
sas doenças, os sistemas de transporte são cotranspor
tadores Na+/(aminoácido) ou (glicose).
11. Este tipo de sistema de transporte
A. move Na+ e o aminoácido ou a glicose em dire
ções opostas através da membrana.
B. usa a energia do gradiente de Na+ (SMF) para
concentrar a outra substância, contra seu gra
diente.
C. resulta na hidrólise de ATP durante o trans
porte.
D. é o mesmo codificado pela família de genes de
resistência a múltiplas drogas (Mdr).
E. é o único tipo de sistema usado para transpor
tar glicose através de membranas.
12. Um tipo diferente de sistema de transporte que
mantém os gradientes de Na+ e K+ através da mem
anquirina ao canal de ânions nos eritrócitos. B: a carga negativa dos fosfolipídeos está envolvida. C: este seria
inserido na bicamada lipídica. E: um domínio específico liga-se ao grupo de cabeça do inositol 3-fosfato.
2. E Isso é essencial para conseguir que o soluto seja
transportado através da membrana. A: a especifici
dade de ligação é uma parte integrante do processo.
B: a recuperação do transportador a sua condição
original é uma das características do transporte
mediado. C: apenas em baixas concentrações de
soluto; transportadores apresentam cinética de sa
turação. D: transporte ativo, movimento contra um
gradiente, também é transporte mediado.
3. B O Ca2+ extracelular é cerca de 10.000 vezes mais
alto do que o intracelular. A: este é um transpor
te ativo primário. C: estes são os transportadores
tipo P (fosforilação ocorre em um aspartato). D:
essa ligação diminui o Km para Ca2+ e aumenta o
transporte de Ca2+. E: esses são conhecidos como
CERCA e PMCA.
4. B Algumas proteínas ficam mergulhadas na mem
brana, enquanto outras ficam na superfície. A: isso
é mais do que o total de lipídeos. C: o colesterol da
membrana não é esterificado. D: todo carboidrato
da membrana está na forma de glicoproteínas e gli
colipídeos. E: este é um componente minoritário.
5. A Ionóforos transportam por mecanismos passivos
mediados. B e C: estes são os dois tipos principais
de ionóforos. D: valinomicina transporta K+ por um
mecanismo uniporte. Também há sistemas anti
porte que são eletroneutros. E: valinomicina tem
uma afinidade por K+ 1.000 vezes maior do que por
Na+.
6. D Elas se organizam em homotetrâmeros, com cada
monômero formando um poro específico. A: esta é
• 523
brana plasmática de células:
A. envolve uma enzima que é uma ATPase.
B. é um sistema simporte.
C. move Na+ para dentro ou para fora da célula.
D. é um sistema eletricamente neutro.
E. na membrana, hidrolisa ATP independente
mente do movimento de Na+ e K+.
Problemas
13. Desenhe uma curva ilustrando a velocidade de mo
vimento de um soluto através de uma membrana
em função da concentração do soluto para (a) O2 e
(b) captação de glicose no eritrócito.
14. Que tipo de transportador é o receptor de acetilco
lina de membrana de músculo esquelético, e como
é controlado?
Resposta
1. D Uma única carga eletrostática provavelmente
não seria suficiente. A: um exemplo é a ligação de
uma descrição de aquagliceroporinas. B: elas não
transportam H3O+. C: elas são proteínas integrais
que atravessam a membrana. E: canais requerem
controles.
7. D Esse é um mecanismo comum para ancorar a pro
teína à membrana. A: esteroides podem se difundir
através da membrana plasmática e têm receptores
intracelulares. B: esta é apenas uma das três classes
principais de receptores da membrana plasmática.
C: os receptores podem ser superexpressos (upre
gulated) ou subexpressos (downregulated) para
modificar a resposta celular a um ligante. E: existe
uma variedade de respostas iniciais à ligação recep
tor-ligante, incluindo a abertura de um canal.
8. E A assimetria é mantida por flipases e flopases
dependentes de ATP. A: difundem-se livremente e
podem se agrupar em domínios maiores. B: mover
um grupo de cabeça carregado através do centro
lipídico da membrana é termodinamicamente des
favorável. C: a área de maior fluidez é o centro da
membrana. D: colesterol é uma molécula rígida que
diminui a fluidez.
9. B As hélices geralmente formam o canal com ca
deias laterais hidrofílicas revestindo o canal, e
as hidrofóbicas voltadas para o centro lipídico da
membrana. A: isso descreve um poro; canais são
bastante específicos. C: canais voltagem-depen
dentes, como o de Na+, são controlados assim, mas
outros, como o canal nicotínico de acetilcolina, são
regulados quimicamente. D: grupos de canais de
membrana funcionam juntos para formar uma jun
524 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
ção comunicante (gap junction). E: substâncias
podem se mover em qualquer direção, determina
da pelo gradiente de concentração.
10. A Essas são as características comuns. B: operam
por vários mecanismos, incluindo transportadores
e receptores. C: procariotos e eucariotos os têm.
D: CFTR é incomum por apresentar ambas as fun
ções. E: alguns, como os codificados pela família
de genes MDR ou o transportador de colesterol
para fora das células, são glicoproteínas-P, mas ou
tros não são.
11. B Estes são transportadores ativos secundários
Na+-dependentes. A: estes são simportes, movendo
ambas as substâncias na mesma direção. C: o ATP
é usado para manter o gradiente de Na+, não no
transporte de aminoácidos ou glicose. D: Mdr são
transportadores ABC. E: glicose também pode ser
transportada por um sistema uniporte passivo.
12. A O transportador de Na+, K+ é a ATPase trocadora
de Na+/K+. C e D: é um sistema antiporte, vetorial
(Na+ para fora), eletrogênico (3 Na+, 2 K+). E: hi
drólise de ATP não é inútil.
13. Ver Figura 12.32. (a) O2 cruza a membrana por sim
ples difusão; portanto, a velocidade aumenta com
a concentração, como ilustrado pela curva inferior
da figura. (b) A captação de glicose pelos eritróci
tos é um transporte passivo mediado, de modo que
deve mostrar cinética de saturação, como ilustrado
pela curva superior na figura.
14. Este também é chamado canal nicotínico de acetil
colina, e é um exemplo de um canal regulado por
agonista. A acetilcolina interage com o receptor de
acetilcolina na membrana, causando uma mudança
conformacional na proteína que abre o canal e per
mite que cátions (mas não ânions) fluam através. A
hidrólise da acetilcolina, com a liberação dos pro
dutos, fecha o canal.
PARTE III CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 525
FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

13
Fundamentos
P P
P P

da Transdução de Sinal
George R. Dubyak
Professor Titular, Case Western Reserve University School of Medicine

CONTEÚDO 13.13 INTEGRAÇÃO DE VIAS DE TRANSDUÇÃO

DE SINAL EM REDES DE TRANSDUÇÃO DE
13.1 TRANSDUÇÃO DE SINAL ENTRE CÉLULAS, 526
SINAL, 555
13.2 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTERCELULAR, 526
13.3 RECEPTORES PARA MOLÉCULAS SECRETA
CORRELAÇÕES CLÍNICAS
DAS, 528
13.1 Família de Receptores Tirosina Quinases ErbB/
13.4 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTRACELULAR POR
HER Como Alvos para Quimioterapia do Câncer,
RECEPTORES DE SUPERFÍCIE CELULAR, 529
539
13.5 RECEPTORES CANAIS IÔNICOS LIGANTE
13.2 Antagonistas Endógenos de Receptores de Inter
-DEPENDENTES, 535
leucina-1 Como Terapia para Doenças Inflamató
13.6 RECEPTORES LIGADOS A ENZIMAS, 537 rias, 541
13.7 RECEPTORES DE CITOCINAS, 540 13.3 Receptores de Quimiocinas Acoplados a Proteína
G como Alvos para o Vírus da Imunodeficiência
13.8 RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAG, 542
Humana (HIV), 543
13.9 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM AMP
13.4 Mutações em Proteína G em Tumores da Glându
CÍCLICO, 546 la Pituitária e Doenças Endócrinas, 545
13.10 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM GMP
13.5 Alterações na Sinalização de Receptor b-Adrenér
CÍCLICO, 549
gico na Insuficiência Cardíaca Congestiva, 547
13.11TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM CÁL
13.6 Sinalização por Óxido Nítrico/cGMP Como Alvos
CIO, 551
Terapêuticos em Doenças Cardíacas e Vascula
13.12 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM FOS res, 550
FOLIPÍDEOS, 553

Conceitos Chaves
• A comunicação entre células envolve a sinalização
intercelular via moléculas secretadas (hormônios,
neurotransmissores e outros mediadores) e cas
catas de sinalização intracelular reguladas por re
ceptors que se ligam às moléculas secretadas. Os
receptores incluem: (1) proteínas de superfície ce
lular que se ligam a moléculas secretadas hidrofíli
cas ou grandes, e (2) proteínas intracelulares que
se ligam a moléculas hidrofóbicas secretadas.
• Receptores de superfície celular iniciam reações
que mudam rapidamente as concentrações intra
celulares de moléculas pequenas que são segun
dos-mensageiros, como nucleotídeos cíclicos, íons
Ca2+ ou metabólitos de lipídeos.
• Dois tipos principais de comutadores moleculares
controlam a transmissão de sinais intracelulares:
(1) o estado de fosforilação de proteínas; e (2) pro
526 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
teínas G que, quando ligadas a GTP, alternam entre
estados conformacionais que ligam ou desligam a
atividade de outras proteínas.
• Algumas proteína quinases e fosfatases são ativi
dades intrínsecas de proteínas que são receptores
de superfície celular, os quais ligam fatores de cres
cimento; outras são proteínas separadas que são
reguladas por associação transitória com proteínas
da superfície celular ou pela ligação com segundos
mensageiros pequenos.
• Proteína quinases e fosfatases regulam a sinaliza
ção intracelular por mudança no estado de fosfo
rilação e função de: (1) enzimas, incluindo outras
quinases e fosfatases; (2) canais iônicos e trans
portadores de íons; (3) fatores de transcrição; e (4)
proteínas estruturais que regulam forma, tamanho
e mobilidade celulares.
• Proteínas G são reguladas por sua interação com
outras proteínas que aumentam a velocidade de
troca GTP/GDP pelas proteínas G; estas incluem
os receptores acoplados a proteína G (GPCR), que
constituem a maior superfamília de receptores de
13.1 TRANSDUÇÃO DE SINAL
ENTRE CÉLULAS
A comunicação ou transdução de sinal entre células
e tecidos consiste de duas fases. A transdução de sinal
intercelular caracteriza a passagem de um sinal de uma
célula para células alvos por meio do ambiente extrace
lular. A transdução de sinal intracelular compreende a
decodificação bioquímica desse sinal quando recebido
pelas células alvos, um processo que envolve a regula
ção passo a passo de proteínas sinalizadoras intrace
lulares, o que finalmente resulta em função alterada
das proteínas envolvidas no metabolismo, na regulação
gênica, no transporte de membrana e na mobilidade ce
lular (Figura 13.1). A combinação da sinalização inter
celular e intracelular permite às células de um órgão ou
tecido responder às mudanças na função de células em
outros órgãos ou tecidos, para garantir a homeostase no
organismo inteiro.
13.2 TRANSDUÇÃO DE SINAL
INTERCELULAR
Dois Modos Fundamentais de
Transdução de Sinal Intercelular
A sinalização intercelular descreve os mecanismos
pelos quais uma célula (a célula “emissora”) envia uma
mensagem para mudar a função de outra célula (a célula
“alvo” ou receptora). Duas células podem se comunicar
superfície celular e incluem os receptores senso
riais envolvidos na visão, no olfato e no paladar.
• Proteínas Gregulam a atividade de outras proteínas
incluindo enzimas que sintetizam segundos men
sageiros, canais iônicos que controlam o potencial
de membrana ou o fluxo de íons regulatórios, e ou
tras proteína quinases.
• Combinações de diferentes reações de sinalização
intercelular e intracelular constituem redes de si
nalização que permitem às células de um órgão ou
tecido responder a mudanças na função de células
em outros órgãos ou tecidos; essas redes de sina
lização garantem a homeostase num organismo in
teiro.
• Expressão ou função aberrante de proteínas sina
lizadoras, incluindo moléculas secretadas, recep
tores, proteínas G e proteína quinases é a causa
subjacente de doenças humanas comuns, incluindo
muitos tipos de câncer, insuficiência cardíaca, dia
betes e alguns distúrbios de comportamento; cerca
de 50% das medicações mais comumente usadas
têm proteínas sinalizadoras como alvos.
(ou seja, transmitir informação de uma para a outra)
de várias formas diferenes (Figura 13.2). Uma requer
que elas estejam em contato físico direto; esse modo é
justácrino ou contato-dependente. Um segundo modo,
mais comum, é independente de contato e envolve a
liberação de moléculas secretadas pela célula emisso
ra. As moléculas secretadas difundem-se pelo espaço
extracelular até as células alvos, onde interagem com
proteínas receptoras, resultando em uma ativação da
sinalização intracelular e função alterada. Esse último
modo permite comunicação intercelular entre células se
paradas por grandes distâncias, por exemplo, células
em diferentes tecidos ou órgãos ou entre células sepa
radas por pequenas distâncias. A sinalização contato
-independente por moléculas secretadas inclui quatro
modos: endócrino, parácrino, sináptico ou neuronal
e autócrino. Esses modos são diferenciados por: (1) a
distância real entre as células emissora e alvo; e (2) a
natureza bioquímica das moléculas secretadas.
Sinalização Justácrina ou Contato
dependente
Na sinalização justácrina, as células se comunicam
por um de dois mecanismos. Um é por canais de jun
ções comunicantes (gap junctions) que permitem a
transferência direta de pequenos íons, metabólitos e
moléculas de segundos mensageiros entre células vizi
nhas. A estrutura e a função desses canais são descri
tas em detalhes na p. 497 e nas Figuras 12.41 e 12.42,
p. 504. O segundo mecanismo envolve a interação de
uma proteína expressa na superfície da célula emissora
com uma proteína receptora expressa na superfície da
célula alvo (Figura 13.2a). Essa interação muda a con
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 527

Hormônio Extracelular, hormônio, só aquelas células que expressam receptores

Neurotransmissor, ou
Fator de Crescimento
específicos para aquele hormônio serão células alvos.
Dois aspectos importantes da sinalização endócrina de
vem ser notados. Primeiro, como o hormônio está sen
Receptor: Surperfície
do secretado no volume total do sangue, estará diluído
celular ou Intracelular
muitas vezes quando chegar às células alvos nos tecidos
periféricos. A concentração de hormônios no sangue e
nos espaços intersticiais é sempre baixa (concentra
ções entre picomolares e nanomolares, ou seja, 10–12 a
Reações de Sinalização Intracelular
10–9 M), mesmo durante velocidades máximas de secre
ção pela glândula fonte. Em virtude da baixa concentra
ção dos hormônios, os receptores da célula alvo devem
ter uma alta afinidade e seletividade para um hormônio
em particular. Uma consequência dessa alta afinidade
é que, uma vez que o hormônio tenha se ligado, não
pode se dissociar facilmente de seu receptor. Segun
do, demora um tempo considerável para aumentar e/ou
Transporte Expressão Movimento diminuir a concentração de um hormônio no sangue,
Metabolismo Gênica
de íon Celular em virtude do grande volume ou capacidade do sangue.
Após secreção, as concentrações de hormônio no san
FIGURA 13.1 Elementos básicos de uma via de gue e no líquido intersticial podem permanecer eleva
transdução de sinal em nível celular. das por muitos minutos ou, até, horas. Isso, juntamente
com a alta afinidade das interações hormônio–receptor,
formação da proteína receptora e dis
para uma cascata de eventos de sina
(a) Justácrina (b) Endócrina
lização intracelular na célula alvo, que
Canal da junção comunicante Célula emissora
resulta em função alterada da célula. Célula emissora Célula alvo
Elementos importantes da sinalização
justácrina incluem uma variedade de Hormônio
proteínas, como as integrinas, envolvi
das na adesão célula–célula e na regu
lação da forma e da mobilidade celular.
Macromolécula Receptor
ligada à Vaso sanguíneo
Sinalização Endócrina membrana

Célula alvo Receptor

Esse modo envolve a sinalização
entre células separadas por distâncias
curtas ou longas. Células emissoras (c) Parácrina (d) Sináptica
especializadas em tecidos glandulares Célula alvo Célula emissora
sintetizam, acondicionam e secretam Neurônio emissor Sinapse

moléculas chamadas hormônios (Figu

ra 13.2b). Por definição, hormônios são
moléculas secretadas no sangue para Axônio
transporte de longa distância até as cé Célula alvo Corpo celular Neurotransmissor Célula alvo
lulas alvos em vários tecidos. Este é um
tipo de transmissão de sinalização re Mediador local
mota porque o sangue carrega o hormô
nio para a maioria dos tipos celulares,
na maioria dos tecidos. Embora a maio
ria das células do corpo seja exposta ao (e) Autócrina

FIGURA 13.2 Cinco modos principais de

transdução de sinal intercelular.
Redesenhado com base em figuras de Al
berts, B. et al. Essential Cell Biology, 2. ed.
New York: Garland Science, 2004; e Lodish,
H. et al. Molecular Cell Biology, 4. ed. New
York: Freeman, 2000. Receptores alvos na mesma célula
528 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
tem importantes consequências para o mecanismo pelo
qual as células alvos desligam suas respostas a um hor
mônio. Também garante que a sinalização intracelular
pela célula alvo durará períodos longos.
Sinalização Parácrina
Nesse modo, uma célula emissora não secreta molé
culas sinalizadoras no sangue para transporte de lon
ga distância, mas só secreta tais moléculas em seu am
biente imediato ou local (Figura 13.2c). Isso restringe
muito as distâncias que as moléculas podem percorrer
(por difusão passiva) e, assim, limita as respostas ape
nas às células alvos da vizinhança imediata da célula
emissora. Em virtude de sua ação localizada, as molé
culas secretadas usadas na sinalização parácrina são
chamadas genericamente mediadores locais. Como,
ao contrário dos hormônios secretados, os mediadores
locais não são muito diluídos, sua concentração perto
das células alvos pode ser bastante alta (faixa entre
nanomolar e micromolar, ou seja, 10–9 a 10–6 M). Por
tanto, os receptores da célula alvo para mediadores
locais geralmente têm afinidade mais baixa por essas
moléculas secretadas. Menor afinidade significa que o
mediador local pode se dissociar rapidamente do re
ceptor quando a concentração local, extracelular, do
mediador é reduzida. Além disso, como o mediador é
secretado localmente em um pequeno volume extra
celular, sua concentração na célula alvo será só tran
sitoriamente elevada, em virtude da rápida difusão e
da diluição no maior espaço do tecido. Assim, a sina
lização parácrina é usada para comunicação rápida e
localizada entre células.
Sinalização Sináptica ou Neuronal
Esse tipo de sinalização parácrina é específico para
células nervosas, que enviam extensões celulares es
pecializadas (axônios) até a vizinhança imediata de
uma única célula alvo, que é geralmente outro neurô
nio ou uma célula muscular (Figura 13.2d). As sinap
ses entre um neurônio e suas células alvos constituem
um espaço extracelular restrito no qual o neurônio se
creta moléculas sinalizadoras chamadas neurotrans
missores. Dada esta geometria sináptica especial, os
neurotransmissores só percorrem distâncias muito
pequenas até a célula alvo. Em decorrência dessa pe
quena distância intercelular e do volume sináptico
restrito, a concentração local do neurotransmissor que
chega à célula alvo pode ser muito alta (faixa entre
micromolar e milimolar, ou seja, 10–6 a 10–3 M). Assim,
os receptores das células alvos podem ter afinidade re
lativamente baixa pelo neurotransmissor. Essa baixa
afinidade garante que os neurotransmissores possam
rapidamente se dissociar de seus receptores após di
minuição de sua concentração local. Isso é essencial
para o término muito rápido (milissegundos) da neu
rotransmissão do neurônio pré-sináptico para seus al
vos pós-sinápticos.
Sinalização Autócrina
Esse tipo de sinalização parácrina ocorre quando um
tipo celular é tanto a célula emissora como a célula alvo
(Figura 13.2e). A sinalização autócrina é frequentemen
te usada pelos organismos durante o crescimento tissu
lar, o desenvolvimento dos órgãos, e nas respostas imune
e inflamatória. As características gerais da sinalização
autócrina são as mesmas da sinalização parácrina não
-sináptica, exceto que a célula emissora fornece tanto a
molécula secretada (frequentemente um fator de cres
cimento polipeptídico grande) como um receptor para
essa molécula. Por exemplo, o desenvolvimento tissular
precoce frequentemente envolve expressão aumentada
de um fator de crescimento e do receptor para esse fator
por uma célula progenitora específica, ou célula tronco.
O fator de crescimento liberado induz ativação autócrina
de seu receptor alvo para iniciar a replicação da célula
tronco original e de suas células descendentes.
Moléculas Sinalizadoras Secretadas
Muitos tipos de moléculas biológicas, incluindo
proteínas, glicoproteínas, peptídeos pequenos, amino
ácidos, aminas, lipídeos (ácidos graxos e esteroides),
nucleotídeos, nucleosídeos e gases (por exemplo, óxido
nítrico) são usados como moléculas sinalizadoras secre
tadas por várias células. As principais diferenças entre
as moléculas sinalizadoras estão em seu tamanho e so
lubilidade relativa em água. Os hormônios usados para
sinalização endócrina são produtos de aminoácidos
(proteínas grandes, glicoproteínas, polipeptídeos ou
peptídeos pequenos) ou esteroides. Os neurotransmis
sores usados para a sinalização sináptica são moléculas
pequenas e simples, como aminoácidos (por exemplo, glu
tamato, glicina), aminas substituídas (por exemplo, epine
frina, acetilcolina, ácido g-aminobutírico [GABA]), nu
cleotídeos (por exemplo, ATP), ou peptídeos pequenos.
Os mediadores locais usados para a sinalização parácri
na (não-sináptica) ou autócrina são muito diversifica
dos e incluem proteínas, peptídeos pequenos, molécu
las orgânicas simples (por exemplo, histamina, ATP e
adenosina) e derivados de ácidos graxos (por exemplo,
prostaglandinas).
13.3 RECEPTORES PARA
MOLÉCULAS SECRETADAS
Os receptores para moléculas secretadas podem ser
divididos amplamente em duas classes principais: re
ceptores intracelulares e receptores de superfície ce
lular (Figura 13.3). Moléculas hidrofóbicas atravessam
facilmente a membrana plasmática das células alvos e
se ligam a proteínas que são receptores intracelulares.
Receptores intracelulares são específicos para os
hormônios secretados esteroides, derivados da vitami

(a) Receptores intracelulares
Hormônio Receptor
hidrofóbico intracelular
Núcleo Receptor com
hormônio ligado
(b) Receptores de superfície celular
Receptores de superfície
celular
Fatores de
crescimento
Hormônios
Segundo mensageiro
intracelular
Baixa concentração de
segundos mensageiros
FIGURA 13.3 Propriedades básicas de receptores intracelulares versus receptores
de superfície celular.
na D3, ácido retinoico e hormônio da tireoide (Figura
13.3a). Estes compõem um grupo muito homólogo de
proteínas estruturalmente relacionadas. Suas estrutu
ras e funções (ver Figura 22.46, p. 948, e 22.47, p. 949)
são descritas em detalhes no Capítulo 22. Alguns são
proteínas citosólicas que se deslocam para o núcleo só
quando ligados a seu hormônio cognato; outros entram
no núcleo mesmo em ausência do hormônio ligado.
Em todos os casos, os receptores ligados ao hormônio
funcionam como complexos diméricos (homômeros ou
heterômeros) que se ligam a sequências específicas do
DNA em elementos regulatórios a montante de vários
genes, para aumentar ou reprimir a transcrição e, as
sim, alterar a expressão das proteínas codificadas por
esses genes. Por causa de seus efeitos sobre a expressão
gênica, a ativação dos receptores intracelulares produz
mudanças de longa duração (horas a dias) na função
das células alvos.
Receptores de superfície celular são sítios de re
conhecimento para a imensa maioria das moléculas
sinalizadoras que são muito grandes (proteínas ou
hormônios polipeptídicos) ou muito hidrofílicas para
atravessar rapidamente a membrana plasmática da cé
lula alvo. Tais moléculas sinalizadoras interagem com a
célula alvo ligando-se a receptores da superfície celu
lar, que são proteínas integrais de membrana (Figura
13.3b). Proteínas receptoras de superfície são acopla
das a uma variedade de reações bioquímicas intracelu
CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 529
lares chamadas cascatas ou vias de
transdução de sinal. O evento mais
precoce na transdução de sinal,
desencadeado pela ligação de uma
molécula sinalizadora a um recep
mRNA
tor, é uma mudança conformacio
nal no receptor que resulta em: (1)
geração de moléculas sinalizadoras
intracelulares conhecidas como se
Receptor com de genes
alterada
Transcrição gundos mensageiros (a molécula
hormônio ligado secretada extracelular é o primeiro
no núcleo mensageiro), ou (2) uma mudança
no potencial elétrico de membrana
plasmática, ou (3) ativação de cas
Hormônios, neurotransmissores, catas enzimáticas envolvendo pro
fatores de crescimento
extracelulares
teína quinases, proteína fosfatases
hidrofílicos ou proteases. Quatro superfamílias
principais de receptores de super
fície celular estrutural e funcional
mente relacionados, que são media
dores da imensa maioria das vias de
comunicação intercelular (Figura
13.4), são (1) receptores canais iô
nicos ligante-dependentes, (2) re
ceptores ligados a enzimas ou ca
Alta concentração de talíticos, (3) família de receptores
segundos mensageiros de citocinas, e (4) receptores aco
plados a proteína G ou GPCR.
13.4 TRANSDUÇÃO DE
SINAL INTRACELULAR
POR RECEPTORES DE
SUPERFÍCIE CELULAR
Ligantes, Receptores e Interações
Receptor–Ligante
Um ligante é qualquer molécula que se liga a uma
receptor proteico. Um agonista é um ligante que, ao se
ligar, ativa a transdução de sinal, enquanto um anta
gonista é um ligante que impede a transdução de sinal
quando se liga ao receptor. Um agonista ou um anta
gonista fisiológico é uma molécula de ocorrência natu
ral (como um hormônio ou neurotransmissor) que atua
como um ligante para um receptor. Um agonista ou um
antagonista farmacológico é uma molécula sintética
que atua como um ligante para um receptor. Muitas
drogas terapêuticas são agonistas ou antagonistas de
receptores.
Certos agonistas fisiológicos estimulam múltiplos
tipos de receptores, que são chamados subtipos de re
ceptores. Isso significa que a mesma molécula extrace
lular sinalizadora pode se ligar a diferentes receptores
proteicos, que são produtos de diferentes genes. Por
530 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

(a) Receptor canal iônico ligante-dependente

Membrana Íons
plasmática
Neurotransmissor

Receptor Citosol

(b) Receptores ligados a enzimas

Domínio catalítico inativo Domínio catalítico ativo

(c) Receptores de citocinas

Enzima ativada
(d) Receptores acoplados
aacoplad a prroteína
proteína G
Neurotransmissor ou ormônioho
Neurotrannsmisso hormônio FIGURA 13.4 Principais classes
de receptores de superfície
celular para moléculas
sinalizadoras secretadas.
Redesenhado com base em figu
ra de Alberts, B. et al. Essential
Cell Biology, 2. ed. New York:
Ptí
Proteína G Ei
Enzima Ptí
Proteína G ativada
tid Ei
Enzima ativada
tid
Garland Science, 2004.

exemplo, o neurotransmissor acetilcolina interage com
um receptor canaliônico ligante-dependente que causa
contração do músculo esquelético, ou com um recep
tor acoplado a proteína G que causa relaxamento do
músculo cardíaco (Figura 13.5). Todos os neurotrans
missores, por exemplo, acetilcolina, serotonina e dopa
mina, reconhecem uma dúzia ou mais de subtipos de
receptores. Cada subtipo de receptor pode ser expresso
diferencialmente em vários tecidos ou células, ou pode
ser coexpresso no mesmo tecido ou célula. Mais ainda,
subtipos de receptores frequentemente ativam respos
tas de transdução de sinal opostas. Isso complica muito
o desenho e o teste de agonistas e antagonistas sintéti
cos, e é uma importante razão pela qual a maioria das
drogas dirigidas a receptores tem efeitos colaterais pe
rigosos quando usada inadequadamente.

(a) Célula de músculo cardíaco (b) Célula de músculo esquelético

Receptor canal
iônico acetilcolina
dependente

FIGURA 13.5
Características
básicas de subtipos
Acetilcolina Receptor para Acetilcolina de receptores como
acetilcolina
receptores proteicos
acoplado a
proteína G funcionalmente
distintos que ligam
Contração aumentada uma molécula
sinalizadora
Contração diminuída extracelular comum.

Relações entre Receptores, Efetores
e Segundos Mensageiros
A primeira etapa da sinalização por receptores de
superfície celular é a ligação do agonista extracelu
lar com a proteína do receptor, o que muda a energia
intrínseca e a conformação estrutural da proteína do
receptor. Nessa conformação, o receptor interage com
proteínas efetoras, que são proteínas sinalizadoras (en
zimas ou canais iônicos) distais ao, mas ativados pelo,
receptor ligado ao agonista (Figura 13.4). Em alguns
casos, a própria proteína do receptor é também o efe
tor. A ativação de um efetor leva à geração de segundos
mensageiros ou a mudanças no potencial de membra
na. Alguns receptores interagem diretamente com pro
teínas efetoras, enquanto outros requerem proteínas de
acoplamento ou transdutoras para interagirem com o
efetor. Proteínas regulatórias de ligação a GTP (proteí
nas G) são uma classe muito importante de tais proteínas
acopladoras.
Efetores enzimáticos podem ser um componente in
trínseco de uma proteína receptora (por exemplo, re
ceptores tirosina quinases) ou proteínas separadas (por
exemplo, tirosina quinases não-receptoras). Podem ser
proteínas integrais de membrana (por exemplo, ade
nilato ciclase) ou proteínas citosólicas (por exemplo,
guanilato ciclase) e incluem nucleotídeo ciclases, fos
folipases, proteína quinases e proteína fosfatases. Estes
serão discutidos em seções posteriores. Efetores canais
iônicos são um componente intrínseco de alguns recep
tores (canais iônicos ligante-dependentes), enquanto
outros são regulados indiretamente por receptores, via
proteínas G ou segundos mensageiros.
Segundos mensageiros são moléculas intracelulares
pequenas que transmitem e amplificam o sinal inicial
a partir de receptores ativados por agonistas (Figura
13.6). Podem ser íons inorgânicos ou produtos orgâni
cos de reações catalisadas por enzimas.
Íons que passam por canais regulados por recep
tores funcionam como segundos mensageiros de duas
formas. Se o fluxo iônico for suficientemente grande, as
NH2
N N N
N N N N
Íon Ca2+ OCH2
O
P AMP
O O3!,5!-cíclico
OH OCH2
GMP3!,5!-cíclico
Ca2+ 4 32 1 P 4O32
O OH1
O O
O
FIGURA 13.6 Estruturas de quatro moléculas de segundos mensageiros.
CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 531
concentrações citosólicas de certos íons regulatórios
podem mudar apreciavelmente; Ca2+ é o principal íon
regulatório intracelular. Se o fluxo do íon em particular
for a corrente predominante na membrana plasmática,
o potencial de membrana será conduzido para o poten
cial de equilíbrio daquele íon. Isso resultará em despo
larização ou hiperpolarização da membrana.
Enzimas efetoras frequentemente catalisam a rápi
da produção de moléculas de segundos mensageiros
solúveis em água, por exemplo, AMP cíclico (cAMP),
GMP cíclico (cGMP) e inositol trisfosfato (IP3) (Figu
ra 13.6).
Outras proteínas efetoras, como fosfolipases ou li
pídeo quinases, catalisam a rápida produção de segun
dos mensageiros lipídicos associados à membrana,
por exemplo, diacilglicerol (DAG) ou fosfatidilinositol
3,4,5-trisfosfato (PIP3) (Figura 13.6).
Fosforilação de Proteínas na
Transdução de Sinal
A maioria das vias de transdução de sinal intrace
lular envolve mudanças no estado de fosforilação de
certas proteínas. A fosforilação de proteínas pode mu
dar sua estrutura secundária, terciária ou quaternária,
resultando em função alterada. Tal fosforilação envolve
a atividade regulada de uma variedade de proteína qui
nases e proteínas fosfatases (Figura 13.7a). Proteína
quinases são classificadas com base em sua seletividade
para aminoácidos específicos. A maioria das proteína
quinases ativadas por segundos mensageiros fosforila
proteínas específicas em resíduos de serina ou treo
nina. Muitos fatores de crescimento e citocinas tam
bém estimulam quinases que fosforilam proteínas em
resíduos de tirosina. Essas tirosina proteína quinases
desempenham importantes funções na regulação do
crescimento e da diferenciação celulares. As proteínas
substratos para serina/treonina quinases ou tirosina
quinases são muito diversificadas e incluem enzimas
metabólicas, canais iônicos, fatores de transcrição ou
outras proteína quinases. Proteína fosfatases também
O
N 1 2–
CH3(CH2)XC OCH2 PO3
OPO32–
NH2 O 2 O 6 5
CH3 1,2-Diacilglicerol
(CH2)XCOCH
O CH2
3 1 OH
OH OH 4
OH
2 3 OPO32–
Inositol
1,4,5-trisfosfato
532 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Sinal de DESLIGADO
Sinal de
entrada entradal
ATP Quinase P Ligação
GTP
ativa GDP
ADP
Fosfataseativa
LIGADO
P
Sinal
de saída
(a) Sinalização por fosforilação de proteína (b) Sinalização por proteína regulatória ligada a GTP
FIGURA 13.7 Fosforilação de proteínas versus ligação de nucleotídeo de guanina
como tipos importantes de comutadores moleculares para mudar a função de
proteínas durante a sinalização intracelular.
apresentam seletividade para serina/treonina fosfato
ou tirosina fosfato. A capacidade que algumas proteína
quinases têm de fosforilar e ativar proteínas alvos, que
são elas próprias proteína quinases, ressalta o envol
vimento de cascatas de proteína quinases na regula
ção de respostas celulares complexas. Essas cascatas
são frequentemente elementos críticos no processo de
amplificação que caracteriza as reações de sinalização
intracelular, iniciadas pela ligação de ligantes a recep
tores da superfície celular.
Proteína quinases podem ser reguladas por recep
tores de várias maneiras. Algumas tirosina quinases
são componentes intrínsecos da estrutura da proteína
receptora (por exemplo, receptores tirosina quinases),
enquanto outras são proteínas citosólicas que se asso
ciam transitoriamente com receptores ativados (por
exemplo, tirosina quinases não-receptores que se ligam
a receptores de citocinas). Na maioria, as serina/treoni
na quinases são proteínas solúveis que são reguladas por
um aumento na concentração de segundo mensageiro
(por exemplo, proteína quinases cAMP-dependentes).
Da mesma forma, há múltiplos tipos de fosfatases, que
revertem os sinais gerados pelas quinases ativadas por
receptor ou por segundo mensageiro.
Proteínas Regulatórias Que Ligam
GTP na Transdução de Sinal
As proteínas G que estão funcionalmente acopladas
com os receptores acoplados a proteína G pertencem a
uma família maior de proteínas, que se ligam e hidro
lisam GTP como parte de sua função celular específica
(Figura 13.7b). Essas GTPases têm um importante papel
de comutador molecular, estando envolvidas em funções
biológicas críticas, como iniciação, elongação e termina
ção da síntese proteica; organização de microtúbulos;
regulação de atividade enzimática; e tráfego de membra
nas. Muitas dessas proteínas “comutadoras” que ligam
GTP são proteínas monoméricas;
DESLIGADO
isso as diferencia das proteínas
GDP
G triméricas, acopladas a recep
P
Hidrólise tor. Todas as proteínas que ligam
de GTP
ativa GTP (monoméricas ou triméri
cas) têm diferentes conformações
de GTP e atividades, dependendo se têm
inativa guanosina-5!-difosfato (GDP) ou
GTP ligado. A forma ligada a GDP
LIGADO
interage com outra proteína (um
GTP
Sinal fator trocador de nucleotídeo de
de saída guanina [GEF]), que catalisa a tro
ca de GDP por GTP. A forma ligada
a GTP interage com, e modifica a
atividade de, uma proteína efetora
a jusante. A atividade de GTPase
converte a forma ligada a GTP na
forma ligada a GDP, que tem capa
cidade diminuída de interagir com
proteínas efetoras e deve interagir com um GEF para read
quirir sua conformação ativa. Uma função importante de
muitos receptores de superfície celular é disparar, direta
ou indiretamente, as reações de troca GDP/GTP que re
sultam em ativação de proteína G.
Outros Componentes de Complexos
de Sinalização Mediada por
Receptor e Cascatas
Além de proteínas efetoras, segundos mensageiros,
proteínas G triméricas e proteína quinases, uma gran
de variedade de proteínas intracelulares pode estar en
volvida nas vias intracelulares de sinalização mediadas
por receptor de superfície celular. Por meio da coloca
lização física de múltiplas proteínas sinalizadoras em
uma dada via de sinalização, proteínas de arcabouço
(scaffold) e adaptadoras aumentam a fidelidade e a
velocidade de uma complexa cascata de sinalização.
Proteínas chamadas proteínas de ancoragem localizam
e concentram proteínas sinalizadoras solúveis em lo
calizações subcelulares específicas. Por exemplo, uma
ampla variedade de proteínas de ancoragem de quina
se A (AKAPs, A-Kinase Anchoring Proteins) locali
zam proteína quinases reguladas por cAMP (proteína
quinase A, [PKA]) na membrana plasmática, no citoes
queleto ou dentro do núcleo. A montagem de recepto
res, proteínas adaptadoras, proteínas efetoras e outros
componentes da sinalização em complexos sinalizado
res frequentemente envolve interações específicas de
domínios específicos dessas proteínas (Figura 13.8).
Domínios SH2(Src-Homology type 2, homologia a Src
tipo 2) e domínios PTB (phospho-tyrosine binding,
ligação a fosfotirosina) reconhecem e ligam-se a resíduos
específicos de tirosina fosforilada em uma variedade de
proteínas sinalizadoras. Domínios SH3 (Src-Homology
type 3, homologia a Src tipo 3) ligam-se a domínios ri
cos em prolina que caracterizam certas proteínas si
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 533

Molécula silanizadora quantidades relativamente pequenas

Fosfolipídeo Receptor
inositol proteico por célula, as curvas de ligação ago
nista–receptor apresentam satura
ção. Além disso, para medir direta
mente a ligação de um agonista com
P P Citoplasma seu receptor, pode-se medir indireta
Proteína PH
PTB SH2 P Y mente a interação agonista–receptor
sinalizadora 1 por meio do ensaio das várias respos
P
tas funcionais desencadeadas pelo
Y
Domínio quinase receptor com agonista ligado. Em
Proteína Y
sinalizadora 2
geral, a magnitude dessas respostas
P
é proporcional à quantidade de com
Domínio quinase
SH2
plexo agonista–receptor ligado. A
Proteína adaptadora curva dose–resposta mede a relação
entre concentração de agonista e res
SH3 posta biológica.
P
Proteína PPP
A concentração de agonista que
sinalizadora 3 causa metade da resposta máxima é
a metade da concentração máxima
efetiva ou EC50. Esta é diretamente
proporcional ao KD do complexo ago
Comuta o sinal a jusante nista–receptor (Figura 13.9). Entre
tanto, EC50 é geralmente muito infe
FIGURA 13.8 Funções de proteínas adaptadoras e dos domínios de interação
rior ao KD; isto é, a concentração de
proteína–proteína na montagem de complexos de sinalização intracelular.
Redesenhado com base em figura de Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell, 4. agonista necessária para metade da
ed. New York: Garland Science, 2002. ativação máxima da resposta bioló
gica da célula é mais baixa do que
nalizadoras. Domínios PH (Pleckstrin Homology) re a concentração de agonista necessária para metade da
conhecem especificamente e ligam-se a certos inositol ocupação máxima do número total de receptores da cé
fosfolipídeos que têm funções importantes como segun lula. Isso significa que uma célula geralmente expressa
dos mensageiros lipídicos ou substratos lipídicos para mais receptores do que necessita para respostas bioló
fosfolipase C. gicas efetivas. Esses receptores extras, ou “a mais”, per
mitem que a célula responda a agonistas mesmo após a
inativação ou degradação dos receptores ativados por
ocupação prévia pelo agonista. Como descrito a seguir,
Interação Ligante–Receptor a inativação ou degradação do receptor desempenha
um papel importante no término da transdução de sinal
e Eventos Subsequentes de
por receptores.
Sinalização
A ligação de um ligante agonista a um recep 1.0
Resposta celular
tor é caracterizada pela afinidade e capacidade
de ligação do receptor. A afinidade descreve a o r
relação entre a concentração de agonista e a for d a
l 0.8
a u
l
m
i e
mação de complexos agonista-receptor. A afini x c Fração dos receptores de
á a
t
dade é inversamente proporcional à constante m s superfície com ligante ligado
o o 0.6
ã p
de dissociação (KD) (medida em molaridade do ç s
a e
r
p a
ligante) que caracteriza o complexo agonista–re u
c d
o u 0.4
xo KD (Figura 13.9). O KD é igual à concentração
ceptor e
d
o
r
Concentração de ligante para metade
o
t da máxima resposta celular (EC50)
de agonista livre que permite a ligação de 50% o
ã p
ç e
do número total de sítios de ligação do receptor a c
r e
r
F 0.2
(metade da ocupação máxima). Potência é outro Concentração de ligante para metade
da máxima ocupação de receptores (KD)
termo usado para medir a afinidade relativa de
um agonista por seu receptor. Um agonista com 0
1 2 3 4
alta potência liga-se mesmo quando presente em
Concentração relativa de ligante e receptor
concentrações muito baixas (alta afinidade, bai
). A capacidade de interação refere-se ao FIGURA 13.9 Relação entre Kd, como uma medida de afinidade de
número absoluto de sítios receptores. Como pro ligação ligante–receptor, e EC50, como uma medida de resposta
teínas receptoras são geralmente expressas em funcional para a formação de complexos ligante–receptor.
534 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Término da Transdução de Sinal por
Receptores de Superfície Celular
As células expressam múltiplos mecanismos que
permitem a elas terminar ou atenuar suas respostas a
vários hormônios, neurotransmissores ou mediadores
locais. Esses mecanismos permitem que as células re
tornem ao seu estado basal, pré-estímulo, e impedem
a superativação ou ativação inadequada das funções
controladas por um dado receptor (Figura 13.10). Eles
incluem: (1) redução da disponibilidade de agonista na
vizinhança extracelular de uma célula alvo, (2) inter
nalização e degradação do complexo agonista-receptor
ligado, e (3) modificação rápida do receptor (por exem
plo, por fosforilação), de modo que se torne inativo ou
dessensibilizado.
O mecanismo mais simples para terminar a trans
dução de sinal é reduzir a concentração extracelular do
agonista secretado. A eficiência e a rapidez desse meca
nismo são determinadas por: (1) a estabilidade do agonis
ta secretado, (2) o tamanho ou a capacidade do comparti
mento extracelular no qual o agonista é secretado, e (3)
a proximidade entre as células emissoras e as células al
vos. É difícil terminar a sinalização endócrina por redu
ção da disponibilidade do agonista rapidamente porque
os hormônios são secretados em um ambiente extrace
lular de grande capacidade. Diferentemente, redução
rápida na disponibilidade de agonista desempenha um
papel significativo no término da sinalização sináptica;
neurotransmissores são secretados localmente em um
espaço de capacidade muito baixa, a fenda sináptica,
e difundem rapidamente para longe. Algumas células
também reduzem ativamente a concentração de agonis
ta próximo por reacumulação do agonista liberado (por
exemplo, recaptação sináptica de neurotransmissores
como serotonina e dopamina) ou por metabolização do
agonista extracelular. O metabolismo extracelular pode
Receptor Receptor Proteína
ativo dessensibilizado de receptor Agonista
Desacoplamento
Cascata de
sinalização da cascata de
sinalização
Endossomo
(a) Inativação do receptor (b) Internalização do receptor
FIGURA 13.10 Principais mecanismos para o término da transdução de sinal
dependente de receptor.
ser catalisado por enzimas específicas (por exemplo, as
acetilcolinesterases) presentes na superfície das célu
las alvos. Certas neurotoxinas atuam como inibidores
da quebra de neurotransmissores.
As células também podem terminar a transdução
de sinal por regulação da disponibilidade funcional de
receptores, um processo conhecido como adaptação
ou dessensibilização. Se exposta repetidamente a um
agonista específico, uma célula adapta sua sensibili
dade àquele agonista. Ao longo do tempo, uma célula
tornar-se-á cada vez menos sensível a uma concentra
ção de agonista que normalmente causa máxima ativa
ção. Essa dessensibilização resulta de vários processos.
Primeiro, muitos receptores são rapidamente interna
lizados quando ligados a seus ligantes agonistas. Esses
complexos receptor–ligante são incorporados em en
dossomos, e a subsequente acidificação dos endosso
mos causa dissociação dos complexos ligante-receptor.
Alguns endossomos contendo receptor sem ligante são
encaminhados de volta à membrana plasmática, onde
os receptores podem ser reincorporados na superfície
da membrana. Outros endossomos são encaminhados
aos lisossomos, onde ambos, ligante e receptor protei
co, são degradados. Assim, ao longo do tempo, haverá
menos receptores na superfície da membrana. Segundo,
um mecanismo muito mais rápido de dessensibilização
envolve modificação estrutural do receptor, o que re
sulta em inativação funcional. Tais receptores inativos
permanecem na superfície da membrana e podem até
ligar agonista. Entretanto, eles não podem disparar as
etapas intracelulares da transdução de sinal. Em mui
tos casos, inativação funcional de um receptor deve-se
à fosforilação da própria proteína do receptor. Assim,
enquanto o receptor ocupado por agonista estimula
uma cascata de eventos de transdução de sinal envol
vendo ativação de proteína quinases, algumas dessas
proteína quinases fosforilam o próprio receptor; isso
então inativa aquele receptor. Este é um tipo clássico
de regulação por retroalimentação ne
gativa. Dependendo do receptor, essa
inativação funcional pode ser revertida
rapidamente ou lentamente.
Lisossomo
(c) Degradação do receptor
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
13.5 RECEPTORES CANAIS
IÔNICOS LIGANTE
-DEPENDENTES
A sinalização muito rápida (milissegundos) é neces
sária nas sinapses nervo–nervo ou nervo–músculo. As
sim, receptores de neurotransmissores precisam mudar
as respostas celulares via um número mínimo de etapas
enzimáticas, porque algumas reações bioquímicas são
relativamente lentas (segundos– minutos). Muitos neuro
transmissores (mas não todos) ligam-se a receptores que
são canais iônicos ligante-dependentes (ver Figura 13.4a,
p. 530). Os ligantes extracelulares para esses receptores
são invariavelmente moléculas orgânicas muito pequenas
como aminoácidos, aminas substituídas ou nucleotídeos.
Estes são acondicionados em vesículas e liberados, via rá
pida exocitose, nas sinapses. Como esses ligantes são tão
pequenos, eles se difundem rapidamente (Figura 13.11).
Os ligantes ligam-se a seus receptores com baixa afinida
de (KD micromolar a milimolar). Isso permite rápida dis
sociação do complexo ligante-receptor após redução da
concentração extracelular do neurotransmissor.
A ligação do neurotransmissor aos sítios extrace
lulares de ligação do ligante de tais receptores dispa
ra uma mudança quase instantânea na conformação
do receptor, que permite que íons permeiem através
do complexo proteico do receptor. O fluxo desses íons
muda rapidamente o potencial de membrana da célula.
Terminação nervosa
Neurotransmissoraumentado
Neurotransmissor
na sinapse ligado a receptor iônico
ligante-dependente
Mudança no potencial de
membrana ou concentração
Íons iônica intracelular
Célula alvo
FIGURA 13.11 Receptores canais iônicos
neurotransmissor-dependentes como importantes
elementos de transdução de sinal nas sinapses
neuronais.
Se um cátíon como Na+ passar pelo canal do recep
tor, a célula se tornará despolarizada; se um âníon como
• 535
Cl– for a espécie permeada, a célula se tornará hiper
polarizada (Figura 13.12). Receptores cátion-seletivos
são controlados pelos neurotransmissores excitatórios
(acetilcolina, glutamato, serotonina e ATP), enquanto
receptores ânion-seletivos são controlados pelos neu
rotransmissores inibitórios (ácido g-aminobutírico
[GABA] e glicina). A ativação desses canais iônicos neu
rotransmissor-dependentes muda o potencial da mem
brana plasmática da célula, resultando na regulação
secundária (ativação ou inibição) de muitos tipos de ca
nais voltagem-dependentes, incluindo canais voltagem
-dependentes para Ca2+. Mudanças na atividade desses
canais alterará a concentração citosólica de Ca2+, um
segundo mensageiro chave. Por sua vez, o Ca2+ citosó
lico aumentado determina respostas agudas em células
alvos, como a liberação exocitótica de vesículas conten
do neurotransmissor de neurônios ou a contração de
células musculares, ou respostas de longo prazo, como
ativação da expressão gênica sensível a Ca2+. A maioria
dos neurotransmissores que ativa receptores canais iô
nicos ligante-dependentes também pode interagir com
outros subtipos de receptores, que são receptores aco
plados a proteína G. Assim, os receptores de acetilcoli
na são receptores nicotínicos (porque também ligam
a droga nicotina), que são canais ligante-dependentes,
ou receptores muscarínicos (porque também ligam a
droga muscarina), que são acoplados a proteína G.
Na+
Neurotransmissor
excitatório
+ + + + + +
– – – – – –
Influxo de Na+ despolariza membrana, aumentando
a probabilidade de gerar um potencial de ação
Neurotransmissor Cl–
inibitório
+ + + + + + + + + +
– – – – – – – – – –
Influxo de Cl– mantém membrana polarizada, dimi
nuindo a probabilidade de gerar um potencial de ação
FIGURA 13.12 Neurotransmissores excitatórios versus
inibitórios como agonistas para receptores canais iônicos
ligante-dependentes.
Receptores Canais Iônicos
Todos os receptores canais iônicos são complexos
oligoméricos de três a cinco subunidades proteicas. Al
guns são complexos homoméricos, que contêm múlti
plas cópias da mesma subunidade proteica (ou seja, o
produto do mesmo gene). Outros são complexos hete
536 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
roméricos de diferentes subunidades proteicas (ou seja,
cada subunidade é o produto de um gene diferente).
Cada subunidade individual é uma proteína integral de
membrana com múltiplos domínios transmembrânicos.
Receptores nicotínicos de acetilcolina são um bom
exemplo das importantes características estruturais
que caracterizam receptores canais iônicos ligante
-dependentes. Estes são complexos pentaméricos de
subunidades, cada uma com extremidades extracelula
res N- e C-terminais e quatro domínios que atravessam
a membrana (M1, M2, M3 e M4). Os cinco domínios M2
justapostos, um de cada subunidade proteica, formam
o poro condutor de íons. A ligação do neurotransmissor
aos sítios extracelulares do complexo do receptor cau
sa rearranjos muito pequenos e sutis na forma como os
domínios M2 se ajustam entre si. Esse rearranjo quase
instantâneo remove as barreiras energéticas ao fluxo
iônico pelo poro revestido de água. Nesse estado, o re
ceptor está ligado ao ligante e ativado. Entretanto, o
estado ativado de receptores canais ligados a ligante
persiste por apenas poucos segundos ou minutos (varia
com os diferentes tipos de receptores canais ligante
-dependentes), antes que um segundo rearranjo de
subunidades ocorra. Este leva o canal a assumir uma
conformação não-condutora, embora o neurotransmis
sor permaneça ligado (ou seja, o receptor está ligado
ao ligante, mas inativo). Essa rápida inativação é uma
forma não-covalente de dessensibilização do receptor
(Figura 13.13). A reativação do canal do receptor só
ocorre depois da dissociação do neurotransmissor dos
sítios de ligação extracelulares. Portanto, esses recep
tores ciclam entre três estados funcionais principais
(sem ligante/inativo>ligante ligado/ativo>ligante liga
do/inativo).
Neurotransmissor
Neurotransmissor
liberado
Estado basal
Neurotransmissor
permanece ligado,
Neurotransmissor
mas o canal
se dissocia e os
de fecha
canais se fecham
Estado inativado Estado ativado
FIGURA 13.13 Mudanças de conformação em canais iônicos
ligante-dependentes durante ativação e inativação da função do
receptor.
Redesenhado com base em figura de Alberts, B. et al. Molecular Biolo
gy of the Cell, 4. ed. New York: Garland Science, 2002.
Término da Sinalização por
Receptores Canais Iônicos
Existem vários mecanismos para término da si
nalização por receptores canais iônicos. Primeiro,
os ligantes para esses receptores são secretados mui
to transitoriamente em espaços extracelulares muito
pequenos e definidos, (por exemplo, a sinapse), per
mitindo a eles se difundirem rapidamente para longe
do receptor. Segundo, a concentração extracelular do
neurotransmissor é reduzida por rápida quebra por
enzimas (como acetilcolinesterase) na superfície ex
terna da membrana, ou por rápida recaptação pelo
neurônio secretor. Finalmente, a formação do estado
ligado a ligante inativo garante um período muito cur
to de transdução de sinal por esses receptores de neu
rotransmissores.
Embora o controle rápido dos fluxos iônicos seja sua
função direta, esses receptores também se associam
com um grande número de outras proteínas celula
res. Algumas dessas proteínas associadas atuam como
proteínas adaptadoras para colocalizar eficientemente
esses receptores com outras proteínas de sinalização
subsequente. Elas formam complexos de sinalização
concentrados em domínios subcelulares específicos,
como a membrana plasmática nos contactos sinápti
cos. Por exemplo, a cauda C-terminal intracelular dos
canais iônicos glutamato-dependentes associa-se com
uma proteína adaptadora chamada PSD-95 na Densi
dade Pós-Sináptica abaixo do sítio de contato sináptico.
Essa interação é facilitada por um domínio na PSD-95
chamado domínio PDZ. (PDZ é um acrônimo que com
bina as primeiras letras de três proteínas – proteína da
densidade pós-sináptica [PSD95, postsynaptic density
protein], supressor de tumor grande do disco de Dro
sophila [DlgA, Drosophila disc large tumor supres
sor] e proteína da zonula ocludens-1 [Zo-1] – as
primeiras a serem descobertas como contendo esse
domínio). PSD-95 contém múltiplos domínios PDZ
(além do sítio PDZ específico que se liga aos canais
glutamato-dependentes), que permitem a colocali
zação do receptor com várias quinases, fosfatases e
proteínas do citoesqueleto.
Neurotransmissor
se liga e os canais
Outras proteínas que se associam com canais
se abrem
neurotransmissor-dependentes atuam como cha
perones para garantir a localização e o agrupamen
to desses receptores na membrana sináptica. Por
exemplo, os receptores nicotínicos de acetilcolina
ficam muito concentrados na sinapse neuromuscu
lar por meio de sua interação física com a proteína
rapsina, uma proteína de 43 kDa associada à mem
brana que se associa fortemente com o domínio in
tracelular dos receptores nicotínicos. Quando rap
sina é nocauteada em camundongos, os receptores
nicotínicos não são adequadamente agrupados na
junção neuromuscular, e isso resulta em miastenia
ou fraqueza muscular.

Outros Ligantes de Receptores
Canais Iônicos
Receptores que não os canais iônicos dependentes
de neurotransmissores utilizam canais iônicos para
transdução de sinal intracelular. Certos tipos de canais
são ativados por interação direta proteína-proteína com
subunidades de proteínas G triméricas ativadas que,
por sua vez, são ativadas quando receptores acoplados
a proteína G a montante são ativados por ligantes ago
nistas. Outros tipos de canais iônicos são ativados por
ligação de segundos mensageiros intracelulares, como
cAMP, cGMP ou Ca2+. Esses segundos mensageiros acu
mulam-se após ativação de muitos tipos de receptores
de superfície celular, incluindo receptores acoplados a
proteína G, receptores catalíticos para certos fatores de
crescimento e alguns receptores de citocinas. Assim,
esses canais iônicos ligante-dependentes são regulados
indiretamente por receptores de superfície celular. Ca
nais iônicos dependentes de segundo mensageiro muito
importantes são os canais da Ca2+ localizados no retí
culo endoplasmático. Finalmente, a atividade de outros
canais iônicos pode ser aumentada (ou diminuída) por
fosforilação por várias proteína quinases reguladas
por segundos mensageiros. Esse é outro exemplo de re
gulação indireta de função do canal por receptores de
superfície celular.
13.6 RECEPTORES LIGADOS A
ENZIMAS
Funções Fisiológicas de Ligantes
Extracelulares
Os receptores de muitos fatores de crescimento e
hormônios polipeptídicos são proteínas transmembrâ
nicas que têm atividade catalítica intrínseca (Figura
13.14). Receptores enzima-ligados ou catalíticos dessa
superfamília de proteínas são distinguíveis por várias
características estruturais importantes. Seus domínios
Fator de crescimento
extracelular
Domínio
tirosina
quinase Tirosina
fosforilada
Receptor
INATIVO
quinase
tirosina Atividade de
estimulada
quinase
CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 537
intracelulares têm atividades de proteína quinase, pro
teína fosfatase, protease ou nucleotídeo fosfodiestera
se. Esses receptores regulam primariamente funções
celulares de longo prazo, em uma escala de tempo de
minutos a horas, iniciando cascatas de sinalização in
tracelular que culminam na ativação ou na inibição
da expressão gênica. Por sua vez, essas alterações na
expressão gênica dirigem vias muito fundamentais de
resposta celular integrada, como divisão celular, mor
te celular programada ou diferenciação celular. Seus
agonistas são geralmente proteínas grandes, secreta
das, que funcionam como fatores de crescimento pa
rácrinos/endócrinos ou fatores de diferenciação. Esses
ligantes geralmente se ligam a seus receptores corres
pondentes com afinidade muito alta (KD picomolar).
Entretanto, os ligantes agonistas para alguns tipos de
receptores catalíticos são macromoléculas expressas
nas superfícies extracelulares de células adjacentes
(sinalização justácrina). Os receptores catalíticos mais
comuns têm atividade de tirosina quinase. Estes recep
tores tirosina quinases (RTK) incluem os receptores
de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF), insulina,
e muitos outros fatores de crescimento polipeptídicos.
Alguns receptores catalíticos têm atividade de serina/
treonina quinase. Finalmente, certos hormônios envol
vidos na regulação da pressão sanguínea ligam-se a re
ceptores com atividade de guanilato ciclase (ver Figura
22.33, p. 937).
Receptores Tirosina Quinases (RTK)
A maioria dos RTKs é formada por receptores de su
bunidade única, mas alguns (como o receptor de insuli
na) existem como complexos multiméricos (ver Figura
22.29, p. 933). Cada monômero tem um único domínio
transmembrânico (TM) que compreende 25-28 amino
ácidos. As extremidades NH2-terminais de tais recep
tores são extracelulares e compõem um domínio muito
grande para ligação do fator de crescimento ou hormô
nio. As extremidades COOH-terminais são intracelula
res e contêm os domínios responsáveis pelas atividades
catalíticas dos receptores.
FIGURA 13.14
Membrana
Mudanças
plasmática conformacionais e
Espaço funcionais em um
extracelular receptor tirosina
quinase durante
a ativação por
P P P P Citoplasma
ligação de fator de
Proteínas crescimento.
intracelulares
de
Redesenhado com base
P P P P fosforiladas
ligadasatirosinas
sinalização em figura de Alberts,
B. et al. Essential Cell
Receptor tirosina Biology, 2. ed. New
quinase York: Garland Science,
ATIVO 2004.
538 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Quando um fator de crescimento liga-se ao domínio
extracelular de um RTK, desencadeia a dimerização
com subunidades adjacentes de RTK (Figura 13.14);
isso leva à rápida ativação do domínio quinase citoplas
mático. O primeiro substrato proteico para essa tirosina
quinase ativada é o próprio receptor; o domínio intra
celular do receptor fica autofosforilado em múltiplos
resíduos de tirosina. Os resíduos de tirosina fosforila
dos funcionam, então, como sítios de reconhecimento
ou ancoragem para outras proteínas, que são substra
tos para o RTK. Esses substratos proteicos geralmen
te contêm um domínio de interação proteína–proteína
tipo-SH2, que reconhecem as tirosinas fosforiladas do
receptor. Isso permite forte ligação ao receptor e sub
sequente fosforilação de tirosinas nas proteínas subs
tratos. Assim, a ativação de RTK resulta no acúmulo
de muitos tipos de proteínas fosforiladas em tirosinas.
Esses substratos a jusante agem como efetores para o
RTK e incluem proteínas sinalizadoras, como outras
proteína quinases, reguladores de GTPases pequenas,
e enzimas que modificam síntese e quebra de fosfolipí
deos. Quando fosforiladas em resíduos de tirosina, es
sas proteínas efetoras tornam-se elos ativos em casca
tas de sinalização que, ao final, resultam em mudanças
na localização ou na atividade funcional de fatores de
transcrição ou outras proteínas envolvidas na divisão
ou na diferenciação celular.
Mutação de certos genes RTKresulta na expressão de
receptores que assumem conformações ativadas na au
sência de ligação do fator de crescimento (Figura 13.15).
Genes RTK mutados podem atuar como oncogenes (ver
p. 1039 e Tabela 24.2) que contribuem para iniciação ou
progressão do câncer (Correlação Clínica 13.1).
A dimerização do receptor também desencadeia
uma internalização endocítica do complexo fator de
crescimento-RTK. Acidificação desses endossomos leva
o fator de crescimento a se dissociar do receptor e à
degradação do fator de crescimento internalizado pelos
lisossomos. Embora alguns receptores internalizados
sejam também degradados, a maioria é levada de vol
Receptor
normal de EGF
Domínio extracelular
de ligação do ligante
Exterior
Membrana
Citoplasma Mutação
plasmática Domínio
extracelular
Domínio truncado
intracelular
tirosina quinase
Dimerização e ativação
ligante-independente
FIGURA 13.15 Formas mutadas de receptores tirosina quinases
como produtos de oncogenes que causam câncer.
Fator de crescimento
Espaco
extracelular Proteína Ras inativa Proteína Ras ativa
Citoplasma GDP
GDP GTP
Receptor
tirosina GTP
P P
quinase
ativado Vias subsequentes
de sinalização
(por exemplo,
Proteína Proteína
MAP quinases)
adaptadora ativadora de Ras
FIGURA 13.16 Papel da GTPase Ras durante a transdução de
sinal intracelular por um receptor tirosina quinase ativado.
ta para a membrana plasmática. Essa internalização do
complexo receptor-ligante, seguida pela dissociação do
ligante, é o principal mecanismo para terminação da
transdução de sinal por esses receptores.
Ras GTPase e MAP Quinase
Ras é uma GTPase pequena ou proteína regulatória
monomérica que liga GTP, que é um regulador crítico da
proliferação celular. Cerca de 30% de todos os tumores
humanos envolvem células que expressam oncogenes
Ras mutados. Proteínas que se ligam diretamente a sí
tios de fosfotirosina de um RTK ativado incluem molé
culas adaptadoras que recrutam e estimulam proteínas
ativadoras de Ras (Figura 13.16). As proteínas ativado
ras de Ras estimuladas atuam como GEFs, aumentando
a troca por GTP de GDP no próprio Ras; isso resulta
em acúmulo de moléculas de Ras com uma conforma
ção ativa, ligadas a GTP. Por sua vez, essas proteínas
Ras ativas ligam-se transitoriamente e estimulam uma
família de proteínas serina/treonina quinases, que
desencadeiam a cascata da proteína quinases ativada
por mitógeno (mitogen-activated protein kinase) ou
cascata da MAP quinase (Figura 13.17). Essa cascata
de amplificação envolve ações em série de três proteí
na quinases; a primeira quinase, ativada por Ras (ou
MAP quinase quinase quinase) ativa um conjunto
intermediário de MAP quinase quinases, que ati
vam as MAP quinases terminais efetoras. As MAP
quinases terminais ativadas fosforilam múltiplas
proteínas alvos no citosol e no núcleo, incluindo
fatores de transcrição que regulam a expressão
de genes necessários para divisão celular, sobrevi
vência celular ou diferenciação fenotípica.
Receptores Serina/Treonina
Quinases
Os fatores reguladores de crescimento fator de
crescimento transformante-b (TGF-b) e as prote
ínas morfogenéticas de osso (BMP) têm recep
tores com atividade intrínseca de serina/treonina
quinase. Esses fatores de crescimento têm impor
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
CORRELAÇÃO CLÍNICA13.1
Família de Receptores Tirosina Quinases ErbB/HER Como Alvos para Quimioterapia do Câncer
Receptores pertencentes à família ErbB/HER estão
ligados a muitos tipos diferentes de câncer humano. A
superexpressão do gene ErbB1 humano, que codifica o
receptor de EGF (HER1), é comum em câncer de bexiga,
mama, rim, próstata e pulmão de célula não-pequena.
Um gene ErbB1 mutante produz um receptor que não
tem o domínio extracelular de ligação a EGF, e este é
muito expresso nos glioblastomas, que correspondem a
25% dos tumores de cérebro humano adulto. ErbB3 e
ErbB4 humanos codificam os receptores HER3 e HER4,
que se ligam a proteínas extracelulares da família NRG
(neurregulina/herregulina/neu) de fatores de cresci
mento e diferenciação. ErbB3 está frequentemente su
perexpresso em câncer de mama, cólon, próstata e es
tômago, enquanto superexpressão de ErbB4 ocorre em
tumores de células da granulosa ovariana. ErbB2 codifi
ca a proteína HER2, que não liga nenhum fator de cres
cimento extracelular conhecido. Entretanto, HER2 pode
formar homodímeros ou heterodímeros com receptores
HER1, HER3 ou HER4 ocupados por fator de crescimen
to. Como a dimerização ativa a atividade intrínseca de
tirosina quinase dessa proteína, mesmo modesta supe
rexpressão de HER2 pode alterar a regulação normal
do crescimento celular. É significativo que a expressão
do gene ErbB2 esteja amplificada em até duas ordens
de grandeza em 20–30% dos indivíduos com câncer de
mama invasivo. A expressão aberrante dos genes ErbB/
HER em múltiplos cânceres humanos tem levado ao de
tantes funções sinalizadoras no desenvolvimento dos
tecidos nos estágios fetal e neonatal e na manutenção
de um fenótipo de tecido diferenciado em organismos
adultos. Como no caso dos receptores tirosina quina
ses, mutações nos receptores de TGF-b e em outros
receptores serina/treonina quinases contribuem para a
iniciação ou a progressão de certos cânceres.
Da mesma forma, esses receptores compõem pro
teínas de membrana plasmática com uma extremidade
amino-terminal extracelular, uma única região trans
membrânica, e uma extremidade carboxi-terminal in
tracelular, que contém o domínio catalítico. Também
formam complexos homodiméricos quando seus ago
nistas ligam-se aos domínios extracelulares vizinhos
(Figura 13.18). A mudança conformacional decorrente
resulta em uma subunidade catalítica fosforilando sua
subunidade parceira em resíduos de serina/treonina.
Essa fosforilação inicial permite que a subunidade
parceira recrute e fosforile proteínas citoplasmáticas
chamadas SMADs, que compreendem uma família de
fatores regulatórios de genes. (Proteínas SMAD são ho
mólogas a uma proteína de Drosophila chamada “mães
• 539
senvolvimento de várias terapias por drogas que têm
esses receptores como alvos. Um grupo consiste de
anticorpos monoclonais que se ligam a domínios extra
celulares funcionalmente significativos de diferentes
subtipos de HER. Trastuzumab (Herceptin® da Genen
tech) é um anticorpo anti-HER2 que tem sido usado no
tratamento dos cânceres de mama caracterizados pela
superexpressão de ErbB2/HER2. Seu mecanismo de
ação envolve o recrutamento de fatores imunes que ma
tam as células tumorais e também suprimem a dimeri
zação constitutiva de HER2. Cetuximab (IMC-C225 ou
Erbitux® da ImClone), um anticorpo contra o domínio
de ligação de EGF da proteína ErbB1/HER1, impede a
ativação induzida por ligante do receptor. Ele está sen
do testado em pacientes com câncer de célula escamosa
de cabeça e pescoço ou de câncer de pulmão de célula
não-pequena. Uma variedade de moléculas pequenas
foi projetada para atingir os domínios intracelulares ti
rosina quinase das proteínas ErbB/HER. Essas drogas
são inibidores competitivos dos sítios de ligação de ATP
das quinases, particularmente do subtipo ErbB1/HER1.
Estes estão sendo sendo testados em pacientes que so
frem de cânceres de pulmão de célula não-pequena que
não responderam a outras quimioterapias.
Roskowski, R., Jr. The ErbB/HER receptor protein-tyro
sine kinases and câncer. Biochem. Biophys. Res. Commun.
319:1, 2004.
contra decapentaplégico” (mothers against decapen
taplegic) ou MAD, e uma proteína de C. elegans cha
mada SMA; o nome é uma combinação das duas). Em
seu estado defosforilado, SMADs adotam uma confor
mação dobrada, que impede sua interação com outras
SMADs e também mantém sua localização como pro
teínas citosólicas. Entretanto, a fosforilação pelos re
ceptores quinases ativados permite que certos subtipos
de SMAD se desdobrem e formem complexos diméricos
com outros subtipos de SMAD. Essa dimerização tam
bém expõe sequências de localização nuclear (NLS)
nas SMADs, o que resulta em deslocamento do comple
xo citosólico para o núcleo, onde os dímeros de SMAD
interagem com outras proteínas regulatórias de genes
para modular a transcrição dos genes envolvidos no de
senvolvimento de órgãos ou diferenciação de tecidos.
540 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Membrana plasmática
13.7 RECEPTORES DE
MAP-quinase-quinase-quinase
CITOCINAS
GTP
As citocinas representam outro grupo de polipep
Proteína ATPADP
Ras ativa tídeos secretados que agem como reguladores autócri
P nos/parácrinos de crescimento e diferenciação. Muitas
citocinas controlam o crescimento e a diferenciação de
MAP-quinase-quinase
células hematopoiéticas (formadoras de sangue), in
ATP
cluindo os vários tipos de células brancas ou leucóci
tos. Por essa razão, algumas citocinas são conhecidas
P P ADP
como interleucinas, porque regulam a transferência de
informação entre diferentes tipos de leucócitos durante
MAP-quinase
os vários estágios das respostas imune e inflamatória
ATP
(CorrelaçãoCorrelação ClínicaClínica 13.2).13.2).). OutrasOutrasOutras citocinascitocinascitocinas sãosãosão chama-chama-chama
das interferonspor sua habilidade de interferir com as
ADP
mudanças de função induzidas em células e tecidos in
fectados por patógenos virais ou bacterianos. Como os
fatores de crescimento que se ligam a receptores cata
P de
citosólicas
Proteínas
membrana ou P Proteína
regulatória
de genes
nuclear líticos, as citocinas ligam-se a seus receptores corres
pondentes com alta afinidade e desencadeiam a rápida
ativação da cascatas de proteína quinases e o acúmulo
de proteínas
Mudança
ou de
rápida
membrana
citosólicas
de atividade naMudanças
expressão
de proteínas
conduzem sinalizadoras
a mudanças fosforiladas
de longa duraçãoque, no final,
na expressão

de genes gênica. Entretanto, os receptores de membrana plasmá

tica para citocinas não têm atividade intrínseca de tiro
FIGURA 13.17 Papel da cascata de MAP quinases durante
a transdução de sinal intracelular por um receptor sina quinase ou de serina/treonina quinase (ver Figura
tirosina quinase ativado. 13.4c, p. 530).
Redesenhado com base em figura de Alberts, B. et al. Essential
Cell Biology, 2. ed. New York: Garland Science, 2004.
Receptores de Citocinas: Estrutura e
TGF-β Receptor de TGF-β Função
Receptores de citocinas são receptores mul
timéricos. Cada subunidade tem um único domí
Citoplasma P P Proteínas regulatórias nio transmembrânico, um grande domínio extra
de genes SMAD celular amino-terminal para ligação da citocina,
serina/
Domínio P e um domínio carboxi-terminal intracelular con
tendo diferentes tipos de motivos para interação
ativo
treoninaquinase recruta SMAD
Receptorativadoautofosforilae proteína-proteína, mas sem atividade enzimática
intrínseca. Receptores funcionais de citocinas
dissocia
receptor,
a
SMAD
uma SMAD
ativada
do
liga-se existem como um complexo hetero-oligomérico
estável de duas ou mais subunidades de recepto
res diferentes. Ligação de alta afinidade da citoci
diferente e para
desloca-se na geralmente requer interação com pelo menos
Citosol P
o núcleo duas subunidades de receptores diferentes. Essa
ligação coordenada de ligantes citocinas extrace
Núcleo lulares desencadeia mudanças conformacionais
nos domínios intracelulares das subunidades
P Outras proteínas
regulatórias de genes do receptor que facilitam sua rápida associação
com outras enzimas intracelulares transdutoras
DNA
de sinal. Os receptores de citocinas apresentam
significativa diversidade nas estruturas de suas
Expressão gênica alterada subunidades individuais, bem como em seus
complexos multiméricos montados. Assim, dife
FIGURA 13.18 Cascatas de sinalização intracelular disparadas por rentes subfamílias recrutam uma ampla faixa de
um receptor serina/treonina quinase durante a ativação por TGF-ß
proteínas sinalizadoras intracelulares. Entre as
(fator de crescimento transformante ß).
Redesenhado com base em figura de Alberts, B. et al. Essential Cell Bio mais importantes dessas proteínas associadas
logy, 2. ed. New York: Garland Science, 2004. estão as tirosina quinases não-receptores, como
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
CORRELAÇÃO CLÍNICA13.2
Antagonistas Endógenos de Receptores de Interleucina-1 Como Terapia para Doenças Inflamatórias
Interleucina-1 (IL-1) é a designação combinada
para duas citocinas relacionadas (IL-1a e IL-1b) que
se ligam aos mesmos receptores multissubunidades
(IL-1R). A expressão ampla IL-1R destaca o papel cen
tral da IL-1 em muitas respostas imunes, inflamatórias,
metabólicas e hematopoiéticas. Estas incluem febre,
expressão aumentada de proteínas de adesão de leu
cócitos e células endoteliais, indução de proteínas de
fase aguda pelo fígado, e produção estimulada de ou
tras citocinas e fatores estimuladores de colônia. IL
-1b é uma importante citocina pró-inflamatória, cujos
níveis locais e circulantes são fortemente regulados
para impedir ativação aberrante de vias que podem
levar a doenças inflamatórias crônicas. IL-1b acumula
-se como uma pró-citocina biologicamente inativa no
citoplasma de monócitos e macrófagos. Sua ativação
requer a clivagem para uma forma madura, secretada,
pela protease caspase-1. A ativação da caspase-1 en
volve sua oligomerização via montagem de complexos
multiproteicos chamados inflassomos. Em condições
normais, a montagem dos inflassomos é regulada por
proteínas adaptadoras que só são ativadas em respos
ta a infecção bacteriana ou lesão tecidual. Entretanto,
algumas pessoas expressam versões mutadas dessas
proteínas adaptadoras, e isso causa ativação de inflas
somos e superprodução de IL-1b na ausência de infec
as quinases da família src e as Janus quinases Subunidades do receptor de citocinas
(JAKs) (Figura 13.19). Estas tirosina quinases
não são proteínas integrais de membrana, mas
existem como proteínas solúveis ou fracamen
te associadas à membrana, que só são ativadas
quando se associam com receptores de citoci
nas ocupados por ligante. Elas frequentemente Tirosina
fosforilam as outras subunidades do receptor quinase
DNA
JAK
de citocinas em resíduos de tirosina que, então,
atuam como sítios de reconhecimento para a
ligação de outras proteínas sinalizadoras com
domínios de interação SH2. Assim, vários dos
receptores de citocinas tipo interleucinas re
Núcleo
Citoplasma
crutam JAKs, que fosforilam os receptores para
gerar sítios de ligação para proteínas regulató
rias de genes conhecidas como STATs (signal
transducers and activators oftranscription,
transdutores de sinal e ativadores de transcri
ção). Como as proteínas SMAD, as proteínas
STAT não-fosforiladas são monômeros citosó
licos. A fosforilação subsequente de tirosinas
pelas JAKs ativadas induz dimerização, que
resulta em deslocamento do complexo para o
núcleo e associação com outras proteínas regu FIGURA 13.19 Cascatas de sinalização intracelular iniciadas por
latórias de genes. receptor prototípico não-catalítico de citocina.
• 541
ção microbiana. A superprodução decorrente de IL-1b
foi ligada a múltiplas doenças inflamatórias, incluindo
as síndromes de febres periódicas, doença de Crohn,
artrite reumatoide e gota. Agentes terapêuticos, como
o antagonista do receptor de IL-1 (Anakinra ou Kine
ret®), são muito eficientes no tratamento de síndromes
autoimunes. Curiosamente, Anakinra é uma versão
recombinante de uma proteína de ocorrência natural,
IL-1Ra humano (Ra significa antagonista do receptor),
que é produzida pelas mesmas células que secretam
IL-1a e IL-1b. IL-1Ra endógeno é uma importante pro
teína antiinflamatória natural em artrite, colite e ou
tras doenças inflamatórias; a manutenção de um equi
líbrio entre a produção de IL-1 e de IL-1Ra impede o
desenvolvimento ou a progressão de tais doenças. En
tretanto, quando IL-1 endógena é superproduzida em
indivíduos com mutações nas proteínas regulatórias
dos inflamassomos, a injeção de IL-1Ra recombinante
atua para restaurar esse equilíbrio.
Mariathasan, S. e Monack, D. M. Inflammasome adaptors
and sensors: Intracelular regulators of infectíon and inflam
mation. Nature Rev. Immunol. 7:31, 2007; e Church, L. D.,
Cook, G.P. e McDermott, M. F. Primer: inflammasomes and
interleukin 1beta in inflammatory disorders. Nat Clin Pract
Rheumatol. 4:34, 2008.
Citocina
Citoplasma
P P P P P
P P P P
P
Proteína
regulatória de
genes STAT
P
STATs ativadas
P dimerizam e
deslocam-se
para o núcleo
P Outras proteínas
regulatórias de genes
P Gene alvo ativado
Expressão gênica alterada
542 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
Outros receptores de citocinas recrutam proteínas
adaptadoras, que iniciam a montagem de complexos
proteína quinases, que culminam no deslocamento ci
tosol-para-núcleo do complexo NFκb (nuclear factor
of activated B-cells, fator nuclear de células B ativa
das), um importante fator de transcrição para regula
ção da expressão de genes envolvidos em múltiplos
tipos de respostas imune e inflamatória. Muitos recep
tores de citocinas também desencadeiam a ativação de
cascatas de MAP quinases.
13.8 RECEPTORES ACOPLADOS
A PROTEÍNA G
Funções Fisiológicas e Ligantes
Extracelulares
A superfamília dos receptores acoplados a proteí
na G (GPCR) é alvo de uma faixa extraordinariamente
diversa de ligantes agonistas que inclui proteínas, pep
tídeos, derivados de aminoácidos, catecolaminas, lipí
deos, nucleotídeos e nucleosídeos (Figura 13.20). Esses
ligantes incluem hormônios, neurotransmissores e me
diadores locais. Os receptores acoplados a proteína G
desempenham importantes funções na sinalização en
dócrina, sináptica, parácrina ou autócrina, em virtual
mente todos os tecidos e tipos celulares. Estima-se que
uma boa porcentagem dos genes do genoma humano
codifique GPCR. Ligantes ligam-se a GPCR com afini
dades na faixa de nanomolar a micromolar, que é inter
mediária entre a alta afinidade dos receptores ligados a
enzima e a baixa afinidade dos receptores canais ligan
Ca++ Odoríficos
Feromônios •Moléculas
aminoácidos,
nucleotídeos,
prostaglandinas
peptídeospequenas
aminas
nucleosídeos
e1
e2
Fora e3 NH2
Receptor
Dentro
i2 i1 COOH
γ críticos para ligação do ligante. As alças intracelulares,
i3 α Mensageiros
β
GDP Proteína G
FIGURA 13.20Principais elementos da transdução
de sinal iniciada pelos receptores de sete domínios
transmembrânicos acoplados a proteína G.
Redesenhado com base em figura de Bockaert, J. e Pin, J-P.
Molecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolu
tionary success. EMBO J. 18:1723, 1999.
te-dependentes. Muitas importantes proteínas sensiti
vas são receptores acoplados a proteína G, incluindo a
rodopsina (ver p. 980 e Figura 23.21) e os muitos recep
tores para percepção de gosto e cheiro, cujos ligantes
verdadeiros são muito pouco conhecidos. Muitos GPCR
estão envolvidos na regulação aguda de respostas fisio
lógicas críticas como contratilidade cardíaca, metabo
lismo e comportamento complexo. Esses receptores ou
suas vias de sinalização a jusante são os alvos para mui
tas das drogas mais usadas no tratamento de doenças
humanas (Correlações Clínicas 13.3 e 13.5).
Estrutura dos Receptores Acoplados
a Proteína G
Quando ocupados por ligantes agonistas, GPCRs
agem como GEFs para proteínas regulatórias hetero
triméricas que ligam GTP (proteínas G) (ver Figura
13.20), que interagem com proteínas efetoras a jusan
te, as quais geralmente são enzimas ou canais iônicos.
Os GPCRs não regulam diretamente proteínas efetoras.
Assim, mesmo os eventos de sinalização mais precoces
requerem a participação de pelo menos cinco proteínas:
o próprio receptor, a proteína G intermediária (com suas
três subunidades proteicas distintas) e a proteína efe
tora. A existência de múltiplos tipos de proteínas G que
podem se acoplar diferencialmente a vários receptores
e efetores propicia considerável diversidade molecular
nos tipos de vias de transdução de sinal controladas por
esses receptores. A despeito da extrema diversidade de
ligantes de GPCR, os próprios receptores mostram um
alto grau de similaridade estrutural, mas não de sequên
cia (ver Figura 13.20). A estrutura cristalina da rodop
sina bovina dá as características topográficas essenciais
da família GPCR (ver Figura 23.21). Cada receptor é
uma proteína de membrana de subunidade única, com
sete domínios transmembrânicos em a-hélice. (GPCR
Proteínas também foram chamados hepta-helicoidais ou recep
• TSH tores 7 domínios transmembrânicos). Todos têm uma
• LH extremidade amino-terminal extracelular, três alças
• FSH
• interleucinas
extracelulares, três alças intracelulares e uma extre
• quimiocinas midade carboxi-terminal intracelular. A região extrace
lular contém sítios para glicosilação, e as alças extra
celulares contêm resíduos de cisteína essenciais para a
formação de pontes dissulfeto interalças. Os domínios
Efetor transmembrânicos (TM) são homólogos, mas não idên
• Enzimes
• Canais
ticos entre diferentes GPCR. Estes formam um bolsão
que frequentemente contém os resíduos de aminoácidos
intracelulares particularmente a terceira alça, contêm sequências crí
ticas para interação seletiva com proteínas G. A cauda
intracelular varia muito, em comprimento e sequência,
entre os diferentes receptores, e contém sítios que estão
envolvidos em reconhecimento ou ativação de proteínas
G. A cauda também contém sítios serina e treonina para
fosforilação por proteína quinases. A fosforilação desses
resíduos desempenha importantes funções na termina
ção da transdução de sinal por GPCR ativados.
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
CORRELAÇÃO CLÍNICA13.3
Receptores de Quimiocinas Acoplados a Proteína G como Alvos para o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
Entre os cerca de 1.000 genes humanos que codifi
cam receptores acoplados a proteína G está o subgrupo
de receptores de quimiocinas, que são muito expressos
em leucócitos (células brancas do sangue). Quimioci
nas compõem aproximadamente 50 fatores polipeptí
dicos que são secretados por múltiplos tipos celulares
(por exemplo, células epiteliais e células estromais)
de vários tecidos. São ligantes agonistas para 19 tipos
de receptores de quimiocinas, que são diferencial
mente expressos nas várias classes de leucócitos (por
exemplo, monócitos, linfócitos T, linfócitos B, células
natural killer), que executam respostas imune e in
flamatória críticas em tecidos invadidos por patógenos
invasores (protozoários, bactérias ou vírus). Quimioci
nas funcionam como agentes: (1) quimiotáticos que re
crutam leucócitos para a localização tecidual infectada;
(2) reguladores de vias de sinalização dependentes de
proteína G envolvidas na morte rápida ou no sequestro
de patógenos, e (3) indutores da expressão gênica que
contribuem para imunidade adaptativa de longo prazo
a patógenos. Não é surpreendente que o bloqueio ou a
inativação da sinalização por receptores de quimioci
nas possa contribuir para uma ampla faixa de doenças
infecciosas A descoberta de que o vírus da imunodefici
ência humana (HIV) utiliza GPCR endógeno de quimio
cinas para infectar e matar leucócitos efetores imune é
de particular relevância.
A entrada de HIV em leucócitos requer a interação
direta da glicoproteína do envelope viral (gp120) com
proteínas da superfície extracelular da célula alvo do
hospedeiro. A proteína de membrana CD4, um receptor
imune crítico de linfócitos T helper, é um alvo impor
tante para a ligação de gp120. Isso explica porque as
células T helper são drasticamente reduzidas na maio
ria dos pacientes infectados por HIV que desenvolvem
AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida). Entre
A estrutura terciária de GPCR em membranas biológi
cas envolve um agrupamento de sete hélices transmem
brânicas que controla as conformações e aposição das
alças intracelulares e da extremidade carboxi-terminal.
Ligantes grandes, como hormônios polipeptídicos, ligam
-se às alças extracelulares, enquanto ligantes pequenos,
como acetilcolina e epinefrina, ligam-se ao bolsão for
mado pelos segmentos que atravessam a membrana. Em
ambos os casos, a ligação causa um rearranjo das hélices
que atravessam a membrana e muda as conformações
das alças intracelulares e do carboxi-terminal, expondo
sítios de reconhecimento para proteínas G específicas.
Assim, um GPCR ocupado por um agonista pode formar
transitoriamente um complexo com uma proteína G. Um
antagonista pode se ligar ao receptor, mas não causa os
• 543
tanto, diferentes cepas de HIV infectavam preferencial
mente linfócitos T (vírus T-tróficos) ou monócitos-ma
crófagos (vírus M-tróficos), e análises epidemiológicas
revelavam indivíduos que eram muito resistentes à
infecção por cepas de HIV M-trópico. Essa resistência
deve-se a mutações no gene que codifica CCR5, um re
ceptor de quimiocina que é muito expresso em monóci
tos-macrófagos; essas mutações resultam em expressão
baixa ou nula da proteína CCR5 de superfície celular.
Assim, cepas M-trópicas de HIV requerem a presença
de ambos CCR5 e CD4, como correceptores, para infec
tar eficientemente monócitos-macrófagos.
CXCR4, um receptor de quimiocina que é muito
expresso em linfócitos T, funciona como um correcep
tor com CD4 para ligação de gp120 de cepas T-tróficas
de HIV. Significativamente, a capacidade de CCR5 e
CXCR4 se ligarem a gp120 não requer a ativação de pro
teínas da família Gi, à qual esses receptores estão nor
malmente acoplados. Embora a ativação de proteína G
por CCR5 e CXCR4 não seja obrigatória para a entrada
de HIV, a ligação de gp120 a esses receptores induz a
ativação funcional das cascatas de sinalização a jusante
da proteína G. Parece que a ativação dessas vias de si
nalização nas células infectadas por HIV pode facilitar
a quimioatração de leucócitos não-infectados e, assim,
ajudar na propagação e disseminação do vírus no sujei
to infectado. A identificação de CCR5 e CXCR4 como
correceptores de HIV despertou grande interesse no
desenvolvimento de ligantes antagonistas que atenua
riam seletivamente a ligação de gp120 e retardariam a
colonização e a disseminação desse patógeno devasta
dor em sujeitos infectados.
Sodhi, A., Montaner, S. e Gutkind, J. S. Viral hijacking of
G protein-coupled receptor signaling networks. Nature Rev.
Mol. Cell Biol. 5:998, 2004.
rearranjos adequados dos domínios que atravessam a
membrana ou a exposição dos sítios de reconhecimento
da proteína G nas alças e cauda intracelulares.
A interação transitória entre o receptor ocupado
pelo agonista e sua proteína G afeta a função de ambos.
As mudanças funcionais da proteína G são descritas na
próxima seção. A principal mudança no receptor após
sua ligação com uma proteína G é que sua afinidade
pelo agonista é significativamente reduzida, e isso ge
ralmente leva à dissociação do agonista. O receptor sem
agonista assume sua conformação inativa com perda de
sua capacidade de interagir com a proteína G. A pro
teína G dissocia do complexo receptor-proteína G e o
receptor retorna ao seu estado inativo, sem ligante.
544 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Proteínas G Heterotriméricas a13 da família G12/13 estimulam GEFs para uma varieda
de de GTPases pequenas da família Rho envolvidas em
Proteínas G que são funcionalmente acopladas com migração celular, regulação da forma celular e divisão
GPCR consistem de complexos heterotriméricos de su celular (Correlação Clínica 13.4).
bunidades a, b e g (Figura 13.21). A subunidade a, a
As subunidades b (∼35 kDa) e g (10 kDa) são pro
maior, é uma proteína relativamente hidrofílica, na faixa
de 39-46 kDa. Essa subunidade contém o sítio de ligação teínas muito hidrofóbicas e, em condições não-desna
para nucleotídeo de guanina, a atividade de GTPase que turantes, são isoladas como um complexo dimérico.
é crítica para a regulação correta da interação receptor– Complexos bg purificados, isolados de uma proteína G,
proteína G, e os domínios que interagem com as várias podem frequentemente ser recombinados com a subu
proteínas efetoras. Vinte subunidades a distintas são nidade a específica, purificada, de uma segunda pro
agrupadas em várias subfamílias com base em caracte teína G, para produzir um heterotrímero, que é fun
rísticas estruturais e tipo de acoplamento com proteínas cionalmente indistinguível do heterotrímero nativo da
efetoras específicas e cascatas de segundos mensageiros. segunda proteína G. O complexo bg é necessário para
As subunidades as (subunidades a estimulatórias) da a interação da subunidade a com receptores. Além dis
família Gs estimulam a adenilato ciclase e resultam em so, os complexos bg de algumas proteínas G ativadas
um aumento no cAMP intracelular (Correlação Clínica também interagem diretamente com, e ativam, uma va
a
13.4). Diferentemente, as subunidades ai (subunidades riedade de proteínas efetoras a jusante. Por exemplo,
inibitórias) da família Gi inibem a adenilato ciclase e dímeros
certos canais
bg derivados
de K+ do de
coração,
Gi controlam a abertura de
reduzem os níveis celulares de cAMP. As subunidades induzindo assim hiper
ao e az, que também pertencem à família Gi, preferen polarização do miócito cardíaco e uma diminuição nos
cialmente modulam canais iônicos voltagem-dependen batimentos cardíacos.
tes em tecidos excitáveis. A família Gi também inclui as
subunidades at (t de transducina), as proteínas G que
fazem a transdução da percepção de luz pelo GPCR tipo Ciclo da Proteína G
rodopsina, que estimulam a cGMP fosfodiesterase e ra Em seu estado basal, o complexo heterotrimérico
inclui as subunidades
pidamente diminuem a oqcGMP
, a11, aintracelular.
15, a16, que são
A família Gq
acopladas abg tem GDP no sítio de ligação de nucleotídeo da su
bunidade a (Figura 13.22). A velocidade de liberação
com a fosfolipase C e desencadeiam aumento de três de GDP em presença de receptores não-ocupados (con
(diacilglicerol)
segundos mensageiros:
e Ca2+. Finalmente,
IP3 (inositol trisfosfato), DAG dições basais) é baixa, mas não zero. A atividade de
as subunidades a12 e
GTPase intrínseca da subunidade a converte GTP em
GDP e Pi. Enquanto Pi é rapidamente liberado, o GDP
GPCR
permanece ligado por um tempo muito mais longo. Essa
N
liberação sequencial torna a reação da GTPase irrever
sível. A a-GDP apresenta alta afinidade pelo dímero bg, e
o heterotrímero é, portanto, regenerado. Consequente
mente, no estado estacionário não-estimulado, apenas
γγ uma pequena fração das moléculas de proteína G está
na conformação ativa (GTP ligado). Na interação de um
C α complexo heterotrimérico com GPCR ocupado por ago
β β
nista, a velocidade de liberação de GDP é aumentada
GDP em mais de uma ordem de grandeza. Isso permite que
GTP, que é muito mais abundante do que GDP no cito
sol, ligue-se à subunidade a e desencadeie a dissocia
ção da a-GTP do dímero bg. As subunidades a liberadas
αi αs αq αl2 e os dímeros bgentão interagem com enzimas efetoras a
jusante, para mudar os níveis de segundo mensageiro. A
ativação da proteínas G por GPCR ocupado por agonis
GTP GTP GTP GTP
ta é mais catalítica do que estequiométrica. Assim, de
pendendo do tipo de GPCR, uma molécula de receptor
diminuem
Canais
Fosfolipases
iônicos
cAMP Aumento Fosfolipase C Rho GEFs ocupado por agonista pode interagir sequencialmente
de cAMP
com 10–100 moléculas de proteína G trimérica; isso
Fosfodiesterases resulta em grande amplificação do sinal nos estágios
Ativação mais iniciais da ativação de GPCR. Embora a ativida
de GTPases da de intrínseca de GTPase das subunidades a liberadas
família Rho
garanta que a dissociação do complexo heterotrimérico
FIGURA 13.21 Principais subclasses de proteínas G abgserá transitória, a velocidade geral de repetição do
heterotriméricas que são ativadas por receptores com 7 ciclo será aumentada enquanto houver GPCR ligado a
domínios transmembrânicos acoplados a proteína G. agonista na membrana plasmática da célula.
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
CORRELAÇÃO CLÍNICA13.4
Mutações em Proteína G em Tumores de Glândula Pituitária e Doenças Endócrinas
A glândula pituitária desempenha um papel central
na regulação do estado endócrino de mamíferos por
secretar uma variedade de hormônios que regulam a
função de outros órgãos, incluindo fígado, tireoide,
adrenal e glândulas reprodutoras. A liberação desses
hormônios é regulada por neurotransmissores, neu
ropeptídeos e outros hormônios liberados pela região
hipotalâmica do cérebro. Por exemplo, o hipotálamo e
as células da pituitária conhecidas como somatotropos
atuam de forma coordenada para controlar a liberação
de Hormônio de Crescimento (GH, growth hormone),
que regula o metabolismo e o crescimento celular em
muitos tecidos periféricos. O hormônio liberador do
hormônio de crescimento (GHRH, growth hormone
releasing hormone), derivado do hipotálamo, é um
agonista de um receptor acoplado a proteína Gs que
é expresso por células somatotrópicas da pituitária.
cAMP aumentado em resposta a esse receptor ativa
a transcrição dependente de CREB do gene GH e re
sulta em síntese aumentada e liberação de GH. Certos
tumores da pituitária causam hipersecreção de GH,
o que, em adultos, causa acromegalia, uma condição
caracterizada por padrões de crescimento anormal
em muitos tecidos. Tais tumores são geralmente não
-metastáticos, e acredita-se que surjam da replicação
de células únicas, transformadas, da pituitária, que
adquiriram uma vantagem de crescimento ou sobre
vivência em decorrência de mutações espontâneas em
genes regulatórios chaves.
Cerca de 30–40% dos tumores de pituitárias que
secretam GH no homem expressam uma versão mu
tada do gene GNAS1, que codifica a subunidade as da
proteína Gs. O gene mutado, chamado gsp, resulta de
substituições de um único aminoácido, em resíduos que
Terminação da Sinalização por Receptores
Acoplados a Proteína G
Muitos dos ligantes pequenos de GPCR podem ser
rapidamente metabolizados ou inativados por enzimas
extracelulares, e a maioria dos receptores apresenta
rápida dessensibilização ou adaptação. Embora algu
mas dessas adaptações sejam devidas à internalização
do receptor e down-regulation, o mecanismo primário
para rápida dessensibilização de GPCR envolve fosfo
rilação do receptor, o que resulta em perda de função
(Figura 13.23). Os receptores fosforilados não podem
ativar eficientemente proteínas G. Duas famílias de
proteína quinases fosforilam GPCR e induzem dessen
sibilização. Proteína quinases dependentes de segundo
mensageiro, como a proteína quinase A (PKA) depen
dente de cAMP, fosforilam muitos tipos de GPCR, in
• 545
desempenham papéis críticos na ligação e na hidróli
se do GTP. Tais mutações diminuem muito a ativida
de da GTPase e, assim, causam a ativação constitutiva
de Gs e adenilato ciclase. O aumento na atividade da
adenilato ciclase aumenta muito a geração de cAMP, a
ativação da proteína quinase A (PKA), a fosforilação
PKA-dependente de CREB e de outras proteínas regu
latórias de genes cAMP-sensíveis e, consequentemente,
a expressão de genes indutíveis por cAMP, como o do
GH. Mutações semelhantes de gsp foram encontradas
em tumores corticotrópicos da pituitária, que hiperse
cretam ACTH (hormônio adrenocorticotrópico), com
consequente superprodução de hormônios glucocorti
coides pelo córtex adrenal.
Os dois aminoácidos alterados nos mutantes gsp de
ocorrência natural foram identificados por estudos bio
químicos in vitro como significativos para a regulação
da atividade de GTPase. A arginina-201, que é substituí
da por cisteína no mutante gsp mais comum, é o sítio
aceptor para a ADP-ribosilação covalente induzida pela
toxina da cólera. A glutamina-227, que é substituída por
alanina ou outros aminoácidos em algumas mutações
gsp, é uma glutamina conservada localizada no domí
nio comutador-II, que passa por movimentos confor
macionais grandes, dependendo se GTP ou GDP está
ligado à subunidade a. A substituição desse resíduo de
glutamina em todas as subunidades a conhecidas causa
atividade de GTPase diminuída, e é amplamente usada
para gerar versões ativas das várias proteínas G em es
tudos de animais transgênicos.
Lania, A., Mantovani, G. e Spada, A. Genetics of pituita
ry tumors: Focus on G protein mutatíons. Exp. Biol. Med.
228:1004, 2003.
dependentemente do receptor estar na conformação
ocupada por agonista ou sem agonista. Proteína quina
ses específicas para GPCR (GRKs) são também conhe
cidas como b-ARKs (bAR quinases) porque o receptor
b-adrenérgico (bAR) foi o primeiro substrato identifi
cado (Correlação Clínica 13.5). Diferentemente de PKA
e outras quinases reguladas por segundo mensageiro, b
ARKs só fosforilam GPCR quando estão ocupados por
ligantes agonistas.
Efeitos de Toxinas Bacterianas sobre
Proteínas G Heterotriméricas
Algumas subunidades a de proteínas G contêm resí
duos de arginina ou cisteína que podem ser ADP-ribosi
lados por exotoxinas (toxinas da cólera ou pertussis) se
cretadas por alguns patógenos bacterianos, como Vibrio
546 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Ligação do hormônio ao receptor assim dissociação constitutiva das subunidades a

promove uma mudança conformacional
e troca de nucleotídeo
GTP-ligadas dos dímeros bg, mesmo quando GPCR
não está ocupado por agonista. Esse aumento crô
nico de as GTP-ligada induz contínua ativação da
adenilato ciclase e produção de cAMP. No intestino
GDP GTP
grosso, esse aumento de cAMP resulta em uma fos
forilação sustentada de canais de cloreto, mediada
por PKA, que normalmente regula o transporte de
sais e água; a hiperativação desses canais perturba
fortemente o transporte de sais e água e resulta em
diarreia com risco de vida.
αsβγ não αs ativa
pode ativar γ β adenilato
adenilato ciclase
ciclase
γβ+
αs 13.9 TRANSDUÇÃO DE SINAL
BASEADA EM AMP
GDP GTP
CÍCLICO
NAD+
Bloqueio da Pi
αs
Regulação da Síntese e
hidrólise de GTP Toxina da cólera
(ADP-ribosilação) Degradação de AMP Cíclico
Nicotinamida
GTP ADP-ribose Muitas respostas metabólicas e comportamen
tais a diferentes hormônios e neurotransmissores
são mediadas por aumento no cAMP intracelular. O
uso do cAMP como um segundo mensageiro é, em
Ativação persistente grande parte, limitado a GPCRs. As células regu
da adenilato ciclase lam ativamente a síntese e a degradação desse se
gundo mensageiro. A síntese do cAMP é catalisada
FIGURA 13.22 Ciclo de ativação e inativação de uma proteína G
heterotrimérica.
pela adenilato ciclase, que usa ATP como substra
Redesenhado com base em figura de Lodish, H. et al. Molecular Cell to para produzir cAMP e pirofosfato (PPi) (Figura
Biology, 4. ed. New York: Freeman, 2000. 13.24). O nível normal basal de cAMP no citosol é
∼10–7 a 10–6 M. Durante estímulo hormonal máxi
cholerae ou Bordetella pertussis (ver Figura 13.22). mo, a concentração de cAMP pode subir 2 a 100 vezes,
Essas toxinas possuem atividades de NAD glico-hidro dependendo do tipo de célula. Pelo menos seis genes que
lase, que catalisa a quebra do NAD+ em nicotinamida e codificam diferentes subtipos de adenilato ciclase foram
identificados. Todas são proteínas integrais de membra
ADP-ribose, e atividade de ADP-ribosil transferase, que na, com 12 domínios que atravessam a membrana, um
catalisa a transferência do resíduo de ADP-ribose para
domínio catalítico no segmento intracelular que conecta
a subunidade a de proteínas G. Essas reações de ribo os segmentos transmembrânicos seis e sete, e um se
silação catalisadas pelas toxinas interferem com a fun gundo domínio catalítico na extremidade carboxi-ter
ção normal da proteína G e causam transdução de sinal minal intracelular. Os vários subtipos são expressos em
e regulação da função celular anormais. Por exemplo, padrões tecido-específicos e podem ser diferencialmen
ADP-ribosilação das subunidades a Gs pela toxina da có te regulados por proteínas sinalizadoras específicas. To
lera reprime a atividade de GTPase intrínseca, causando das as isoformas de adenilato ciclase são positivamente

Hormônio ou Hormônio ou
GPCR neurotransmissor neurotransmissor ligado

P P
P P
P P
Ligação Ativação de
proteína quinases FIGURA 13.23 Fosforilação
(GRK, PKA, PKC) do receptor como um
importante mecanismo para
Estado basal: Estado ativado: Estado dessensibilizado:
GPCR não-ocupado, GPCR ocupado por GPCR fosforilado é dessensibilização/inativação
nível baixo de ligante, nível alto de desacoplado da de receptores acoplados a
segundo mensageiro segundo mensageiro produção de segundo mensageiro proteína G.
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
CORRELAÇÃO CLÍNICA13.5
Alterações na Sinalização do Receptor b-Adrenérgico na Insuficiência Cardíaca Congestiva
Na insuficiência cardíaca congestiva, o coração é in
capaz de bombear o sangue em quantidades suficientes
para a perfusão adequada dos tecidos periféricos. A in
suficiência cardíaca resulta de adaptações dos miócitos
cardíacos para a manutenção do débito cardíaco após
lesão do miocárdio ou carga hemodinâmica excessiva,
como pressão alta do sangue. Essas adaptações incluem
hipertrofia do miocárdio e ativação do sistema simpáti
co, especialmente a liberação de norepinefrina e epine
frina de nervos adrenérgicos cardíacos, o que aumenta
a contratilidade do miocárdio. Esses mecanismos adap
tativos, no final, acabam sendo inadequados e resultam
em doença progressiva do desempenho cardíaco.
Esta mudança de resposta adaptativa para mal
-adaptativa é particularmente evidente em alterações
no sistema de sinalização do receptor b-adrenérgico.
Em miócitos cardíacos normais, a epinefrina ativa os
receptores b1- e b2-adrenérgicos, acoplados a proteína
G, que estimulam a adenilato ciclase, aumentam o acú
mulo de cAMP e ativam a proteína quinase A (PKA).
PKA fosforila canais de Ca2+ tipo L, sensíveis a di-hi
dropiridina, e fosfolambam, um regulador alostérico da
ATPase deslocadora de Ca2+ do retículo sarcoplasmáti
co (SR) cardíaco. A fosforilação dos primeiros aumenta
o tempo que esses canais permanecem abertos em res
posta à despolarização, e resulta em influxo aumentado
de Ca2+. Fosfolambam não-fosforilado reprime a função
da bomba Ca2+-ATPase do SR. Quando fosfolambam é
fosforilado pela PKA, esse efeito inibitório é relaxado e
resulta em uma velocidade e intensidade aumentadas
de bombeamento de Ca2+ pelo SR. A ação combinada
do influxo de Ca2+ aumentado na membrana plasmáti
ca (pelos canais tipo L) e o sequestro aumentado de
Ca2+ no SR resulta em maior liberação de Ca2+ induzida
por Ca2+ do SR durante os potenciais de ação cardíacos
subsequentes. Assim, durante o estímulo adrenérgico,
mais Ca2+ é liberado durante cada potencial de ação,
resultando em uma contração mais forte (efeito ino
trópico positivo). Contudo, o Ca2+ liberado é também
mais rapidamente sequestrado pelo SR, resultando em
um ciclo mais rápido de contração/relaxamento (efeito
cronotrópico positivo). Assim, em nível do órgão intei
ro, a estimulação b-adrenérgica do coração resulta em
contrações mais fortes e mais sangue bombeado por
contração do coração (stroke volume ou fração de eje
ção) e em um ciclo contração/relaxamento mais rápido
(frequência cardíaca). O débito cardíaco (fração de eje
ção x frequência cardíaca) é aumentado, enviando mais
reguladas pelas subunidades as de proteínas Gs. Entre
tanto, o complexo de subunidades bgde várias proteínas
G (incluindo Gs) pode estimular algumas isoformas de
• 547
sangue para a circulação sistêmica. Entretanto, isso
significa que o coração trabalhará mais (maior débito
energético) e precisará de maior quantidade de oxigê
nio e metabólitos (ácidos graxos e glicose) para gerar
essa energia.
Em decorrência da função reduzida do miocárdio
como consequência da doença crônica, a insuficiência
cardíaca desencadeia uma secreção aumentada de epi
nefrina/norepinefrina para fornecer uma hiperativação
compensatória das respostas sinalizadoras inotrópicas
descritas. Embora isso aumente inicialmente a ativação
dos receptores b1 e b2, também induz sua dessensibi
lização crônica e down-regulation. Mais ainda, esses
receptores b ativam progressivamente outras cascatas
de sinalização. Por exemplo, receptores b1 estimulam
cascatas que são predominantemente mal-adaptativas,
como expressão diminuída de genes de sobrevivência e
ativação aumentada de sinais pró-apoptóticos. Duran
te o desenvolvimento da insuficiência cardíaca, ocorre
uma diminuição na razão entre receptores dos subtipos
b1 e b2. A insuficiência cardíaca também aumenta a ati
vidade de GRK2/bAR-quinase que fosforila os recepto
res e os desacopla da ativação nas vias de sinalização
dependentes de proteína G.
Embora possa parecer paradoxal, o tratamento
da insuficiência cardíaca é baseado em antagonistas
b-adrenérgicos (b-bloqueadores), mais comumente me
toprolol ou bisoprolol, que são muito seletivos para os
receptores b1. A eficiência da terapia com b-bloqueado
res parece envolver a repressão das vias de sinalização
mal-adaptativas ativadas pelos receptores b1. Estudos
clínicos recentes demonstraram a utilidade de carve
dilol, que bloqueia não-seletivamente ambos os recep
tores b1- e b2-adrenérgicos, mas também antagoniza os
receptores a1-adrenérgicos que são muito expressos
em células musculares lisas vasculares. Esses recepto
res ativam a cascata Gq/fosfolipase C e a liberação das
reservas de Ca2+ sensíveis a IP3 causando contração do
músculo liso, com consequente constrição dos vasos
sanguíneos. O antagonismo dessas últimas respostas
diminui a resistência ao fluxo sanguíneo e a quantidade
de trabalho necessário para o coração realizar débito
cardíaco efetivo.
Lohse, M. J., Englehardt, S. e Eschenhagen, T. What is
the role of b-adrenergic signaling in heart failure? Circ. Res.
93:896, 2003.
adenilato ciclase e inibir outras. As subunidades ai das
proteínas Gi podem inibir diretamente certos subtipos
de adenilato ciclase (Figura 13.25).
548 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

NH2 mentado por inibição das PDEs. Derivados de xantina,

como teofilina e cafeína, inibem as PDEs resultando em
O–
POPOPOCH2 N
N aumento nos níveis de cAMP na ausência de estímulo
O O O hormonal.
N N
–O
O– O– O Mecanismos Intracelulares de
ATP
Sinalização por AMP Cíclico
OH OH
A proteína quinase A dependente de cAMP (PKA)
Adenilato
NH2 é mediadora da maioria dos efeitos do cAMP (Figura
ciclase 13.26). O PKA é um tetrâmero composto por duas su
N N
N bunidades regulatórias (subunidades R), que contêm os
Pirofosfato cAMP
sítios de ligação a cAMP, e duas subunidades catalíticas
(subunidades C), que contêm a atividade de quinase.
O–
POCH2
–O –O CH2
O A forma tetramérica não pode catalisar a fosforilação
de proteínas alvos. Após a ligação cooperativa de várias
O OP O OH moléculas de cAMP às subunidades regulatórias, o tet
râmero se dissocia e as subunidades catalíticas livres fi
cam ativas. Muitas das proteínas substratos da quinase
NH2
dependente de cAMP são elas próprias quinases, com
fosfodiesterase H2O 5’-AMP
AMP cíclico alvos específicos enzimáticos. Isso caracteriza a natu
N reza em cascata desse e da maioria dos outros sistemas
N
de sinalização ligados a receptores. Fosfatases espe
O NN cíficas defosforilam as proteínas fosforiladas e, assim,
inativam a cascata de sinalização mediada por cAMP.
O Essas fosfatases estão sujeitas a regulação mediada por
receptor.

OH OH O cAMP altera profundamente o metabolismo celu

lar por alterar tanto a atividade como a expressão de
FIGURA 13.24 Síntese e degradação de AMP cíclico pelas muitas enzimas catabólicas, incluindo enzimas envol
adenilato ciclases e nucleotídeo cíclico fosfodiesterases. vidas no metabolismo de lipídeos e carboidratos. Regu
lação metabólica por cAMP frequentemente envolve a
A quebra do cAMP é catalisada por nucleotídeo cí regulação mediada por PKA de quinases ou fosfatases
clico fosfodiesterases (PDEs), que hidrolisam a ligação secundárias, mudando os estados de fosforilação das
fosfodiéster cíclico para produzir AMP (Figura 13.24). enzimas subsequentes. A PKA também pode fosforilar
A atividade dessas PDEs pode ser regulada por hor vários tipos de canais iônicos da membrana plasmática
mônios e certas drogas. O cAMP celular pode ser au ou transportadores de íons e levar a um potencial de
membrana alterado ou à ativação/ini
Hormônio ou Hormônio ou bição do influxo de íons regulatórios,
neurotransmissor neurotransmissor como Ca2+. Uma vez que neurotrans
Ativação da Inibição da missores, como serotonina, dopamina
adenilato ciclase adenilato ciclase e epinefrina, interagem com GPCRs
Exterior
que regulam Gs ou Gi, a capacidade de
+ – cAMP e PKA modularem a atividade
de canais iônicos é um componente
Citoplasma
αS αI crítico da regulação do sistema ner
voso central.
γ γ GPCR
GPCR β Adenilato β cAMP elevado em células euca
GDP ciclase GDP
rióticas altera rapidamente a trans
crição e a expressão dos genes que
Proteína G Proteína G codificam importantes enzimas me
estimulatória inibitória
tabólicas, hormônios polipeptídicos
AMP cíclico e proteínas transportadoras de íons.
aumenta ou
diminui
A dissociação entre as subunidades
catalíticas e as subunidades regulató
FIGURA 13.25 Regulação positiva e negativa de enzimas efetoras adenilato rias expõe sequências de localização
ciclase por proteínas G heterotriméricas das famílias Gs e Gi. nuclear nas subunidades catalíticas e
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 549

me sanguíneo. Os níveis celulares de cGMP são

Adenilato
MMolécula
olécula sinalizadora
ciclase dinamicamente regulados por um equilíbrio
ativada entre enzimas sintéticas (guanilato ciclases) e
Membrana
brana degradativas (cGMP fosfodiesterases). Os dois
tipos principais de guanilato ciclase em célu
las de mamíferos são fundamentalmente dife
eceptor
Receptor
Re rentes da adenilato ciclase. Uma atividade de
GTP ATP
guanilato ciclase associada à membrana reside
nos domínios catalíticos de receptores ligados
AMP cíclico
Subunidade α ativada a enzima para o hormônio fator natriurético
da proteína G PKA inativa Fosforilação atrial (ANF) secretado pelos miócitos cardía
cos do átrio em resposta a aumento no volume
de sangue circulante e/ou pressão. Os recepto
Poro res de ANF são expressos primariamente em
nuclear e ativação de
Citosol PKA ativada proteínascitosólicas células musculares lisas vasculares e em célu
ou las renais. Esse receptor tem um grande domí
de membrana nio extracelular para ligação de ANF, um único
PKA
Núcleo ativada
domínio transmembrânico e um domínio catalí
Proteína que
CREB
inativo
tico intracelular relativamente pequeno. A liga
liga CREB ção de ANF estimula a atividade catalítica via
(CBP)P CREB ativado, fosforilado
dimerização do receptor e ligação de proteínas
Gene alvo ativado
regulatórias ao receptor ocupado pelo hormô
DNA
nio (ver Figura 22.32, p. 936, e 22.33, p. 937).
Transcrição Diferentemente da expressão tecido-restrita do
Elemento de
ligação a CREB receptor de ANF-guanilato ciclase, uma forma
Tradução citosólica de guanilato ciclase está presente
Sintese de novas proteínas na maioria dos tipos celulares (Figura 13.27).
citosólicas ou de membrana Essa guanilato ciclase solúvel é um complexo
dimérico de subunidades de 82 kDa e 70 kDa.
FIGURA 13.26 Papel da proteína quinase A nas cascatas Cada dímero liga constitutivamente uma molé
intracelulares de sinalização reguladas por AMP cíclico. cula de heme. Na ausência de ligantes gasosos
Redesenhado com base em figura de Alberts, B. et al. Molecular Biology of
que se ligam a esse grupo heme, a guanilato
the Cell, 4. ed. New York: Garland Science, 2002.
ciclase solúvel tem uma taxa de catálise mui
to baixa. Entretanto, a ligação de óxido nítrico
facilita seu deslocamento citosol-para-núcleo (Figura
13.26). A PKA intranuclear induz fosforilação e ativa
ção de proteínas reguladas por cAMP chamadas CRE NH2
NO NH2
Bs, para controlar a expressão de genes que contêm
elementos regulatórios sensíveis a cAMP (CRE) nas
regiões 5!-flanqueadoras de muitos genes responsivos a
cAMP. Dessa forma, os aumentos transitórios do cAMP
desencadeados por GPCR na superfície celular podem
N N
ser traduzidos em mudanças de longo prazo na expres
são de genes nucleares e na função celular. Fe

N N

13.10 TRANSDUÇÃO DE SINAL

α β
BASEADA EM GMP
CÍCLICO

Regulação da Síntese e Degradação

de GMP Cíclico
PPi
O cGMP é um importante segundo mensageiro na COOH GTP cGMP COOH
regulação da contratilidade muscular e não-muscular,
na transdução de sinal visual e na homeostase do volu FIGURA 13.27 Ligação de NO à guanilato ciclase solúvel.
550 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
(NO) ao grupo heme induz mudanças conformacionais
que aumentam muito a atividade catalítica da guanilato
ciclase. Portanto, um estímulo importante para o acú
mulo de cGMP na maioria das células é um nível eleva
do de NO. O NO é gerado pelas óxido nítrico sintases
(NOS) (p. 463). Como o NO atravessa facilmente as
membranas biológicas, pode ser produzido em um tipo
de célula, por exemplo, uma célula endotelial vascular,
e rapidamente se difundir para tipos celulares vizinhos,
por exemplo, células musculares lisas vasculares, onde
ativa a guanilato ciclase solúvel. O acúmulo de cGMP
em músculo liso desencadeia relaxamento rápido e sus
tentado do aparelho contrátil (Correlação Clínica 13.6).
A degradação do cGMP é catalisada por várias
cGMP fosfodiesterases (PDE) solúveis ou fracamente
associadas à membrana. Embora algumas pareçam ser
enzimas catabólicas passivas (ou seja, não diretamente
reguladas), a PDE cGMP-dependente de células sensí
veis à luz da retina é uma enzima efetora para a proteí
na G trimérica transducina (p. 985).
CORRELAÇÃO CLÍNICA13.6
Sinalização por Óxido Nítrico/cGMP Como Alvos Terapêuticos em Doenças Cardíacas e Vasculares
As células endoteliais que revestem as superfícies
internas de todos os vasos sanguíneos são importantes
fontes do óxido nítrico usado para o relaxamento das
células musculares lisas vasculares. Nesses miócitos, a
geração de cGMP pela guanilato ciclase solúvel é esti
mulada pelo óxido nítrico gerado por células endoteliais
adjacentes. O cGMP induz relaxamento dos miócitos e
vasodilatação dos vasos sanguíneos com aumento no
fluxo sanguíneo aos tecidos vizinhos. Mudanças seme
lhantes podem ser produzidas por drogas que aumen
tam a produção de óxido nítrico. Os níveis de cGMP são
também regulados pelas fosfodiesterases (PDE) que
convertem cGMP em GMP. Assim, drogas que inibem as
isoformas vasculares de PDE aumentam o fluxo sanguí
neo em tecidos específicos.
Angina pectoris é o nome formal para dor no
peito, sentida por pacientes com diferentes tipos de
insuficiência cardíaca. A nitroglicerina é comumente
prescrita e rapidamente alivia a angina (ver Correla-Correla
ção Clínica 11.10, p. 467). Ela é metabolizada em óxido
nítrico e também se liga diretamente a proteínas sen
síveis a óxido nítrico (como a guanilato ciclase solú
vel). Assim, pode induzir relaxamento do músculo liso
e vasodilatação. Como a nitroglicerina alivia a angina
não é completamente entendido. As artérias coroná
rias e a microvasculatura cardíaca durante a insufici
ência coronária provavelmente já estão maximamente
dilatadas, por causa da isquemia local. Então, a nitro
Mecanismos Intracelulares de
Sinalização por GMP Cíclico
O GMP cíclico exerce a maior parte de seus efeitos
de segundo mensageiro por ativação de proteína qui
nases sensíveis a cGMP (PKG), que são amplamente
expressas em muitos tecidos. Dependendo do tipo celu
lar, PKG fosforila uma variedade de alvos importantes,
incluindo enzimas envolvidas no metabolismo, proteí
nas estruturais e proteínas do transporte de íons. Por
exemplo, o estímulo de PKG de células de músculo liso
e não-musculares resulta na fosforilação coordenada
de muitas proteínas que atuam inibindo a contração ou
a mobilidade dependentes de Ca2+. Estas incluem: (1)
proteínas que atenuam canais de liberação de Ca2+ do
retículo endoplasmático, (2) miosina cadeia-leve fosfa
tases, que reprimem a interação de miosina com actina,
e (3) canais de K+, que induzem hiperpolarização da
membrana plasmática e, assim, reprimem o influxo de
Ca2+ voltagem-dependente. O cGMP também atua como
um regulador direto (ou seja, PKG-independente) de
canais de cátions dependentes de nucleotídeo cíclico,
expressos em certos tecidos sensoriais como a retina.
glicerina provavelmente alivia a angina por diminuir a
carga de trabalho cardíaco e a necessidade de oxigê
nio do miocárdio via efeitos vasoditaladores sobre as
veias que retornam o sangue para o coração (pré-car
ga), e por diminuição da pressão sanguínea periférica
(pós-carga), por meio de efeitos vasodilatadores sobre
artérias sistêmicas.
Viagra® é o nome comercial do citrato de Sildenafil,
que é usado para tratar disfunção erétil. O Viagra® ini
be seletivamente a nucleotídeo cíclico fosfodiesterase
tipo 5 (PDE5), que é muito expressa em músculo liso
vascular. É 80 a 4.000 vezes menos potente como ini
bidor de outras isoformas de nucleotídeo cíclico PDE,
incluindo PDE3, que é expressa predominantemente no
músculo cardíaco. Essa é apenas 10 vezes mais seletiva
para PDE5 versus PDE6, que é a PDE predominante na
retina. Quando os vasos sanguíneos do tecido erétil são
vasodilatados em resposta à liberação de NO e ativação
da guanilato ciclase, a inibição da quebra de cGMP pelo
Viagra leva a níveis maiores e mais sustentados de acú
mulo de cGMP e ativação de PKG. Isso aumenta a vaso
dilatação no tecido erétil. Altas doses de Viagra podem
levar a alterações leves na visão de cores, em decorrên
cia dos efeitos colaterais sobre a PDE6 da retina.
Ignarro, L. J., Napoli, C. e Lascalzo, J. Nitric oxide donors
and cardiovascular agents modulating the bioactivity of nitric
oxide, Circ. Res. 90:21, 2001.
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 551

Trocador de Ca2+
13.11 TRANSDUÇÃO conduzido por Na+ Bomba de Ca2+
DE SINAL Ca2+
Ca2+
BASEADA EM Membrana
[Ca2+] 10–3M
CÁLCIO plasmática

Regulação da ATP
Na+
Concentração Citosólica ATP ADP + Pi
ADP + Pi

[Ca2+] 10–7M
de Ca2+
Ca2+ é um importante reguladorin
tracelular de muitas funções celulares
Citoplasma
fundamentais, incluindo: contração
em todos os tipos de músculos, secre
ção de hormônios e neurotransmisso Ca2+

res, divisão celular, migração dirigida

de células não-musculares e regulação Retículo endoplasmático
da expressão gênica. As células res
pondem a muitos tipos de hormônios e
neurotransmissores com aumentos rá
pidos e transitórios de Ca2+ citosólico,
que depois se liga a uma variedade de
proteínas regulatórias dependentes de
Ca2+. Aumentos no Ca2+ citosólico são
desencadeados por abertura de canais
de Ca2+ da membrana plasmática ou
canais de Ca2+ do retículo endoplas
mático (ER). Esse Ca2+ liberado pode FIGURA 13.28 Papel das proteínas de transporte de Ca2+ da membrana
plasmática e de organelas na regulação e na compartimentalização dos
ser rapidamente reacumulado pelo ER
reservatórios intracelulares de Ca2+.
para terminar a resposta ao hormônio/
neurotransmissor.

A concentração basal de Ca2+ livre no citosol da
maioria dos tipos celulares é mantida em aproximada
mente 10–7 M (Figura 13.28). Pequenos aumentos no
Ca2+ citosólico livre, para 10–6 M, ativam rápida e ma
ximamente as várias funções celulares reguladas por
Ca2+. Como a concentração extracelular de Ca2+ é 10–3
M, existe um gradiente de concentração de 10.000 ve
zes para o Ca2+ através da membrana plasmática, e a
força motriz para o rápido influxo de Ca2+ é ainda au
mentada pelo potencial de membrana negativo do lado
de dentro. Em células excitáveis, como neurônios e cé
lulas musculares, o influxo de Ca2+ envolve canais de
Ca2+ voltagem-dependentes (ver Tabela 12.10, p. 501).
Esse tipo de via de sinalização por Ca2+ é geralmente
iniciado pelos receptores canais iônicos para neuro
transmissores excitatórios, como acetilcolina, glutama
to, serotonina e ATP. A membrana plasmática também
contém dois sistemas de transporte, o transportador
antiporte Na+/Ca2+ e a ATPase transportadora de Ca2+,
que eficientemente bombeia o excesso de Ca2+ para fora
do citosol (Figura 13.28).
Íons Ca2+ são eficientemente concentrados dentro do
ER (chamado retículo sarcoplasmático ou SR em célu
las musculares) por bomba ATPase transportadora de
Ca2+. Essa ATPase permite que o Ca2+ seja acumulado
até uma concentração de cerca de 1 mM (10–3 M) no
lúmen do ER/SR; isso é equivalente à concentração de
Ca2+ no espaço extracelular. Esse Ca2+ acumulado pode
ser liberado no citosol por dois tipos de canais de Ca2+
localizados no ER/SR, que são regulados por sinais gera
dos por muitos tipos de receptores de superfície celular.
O primeiro é um canal amplamente expresso, conhecido
um
como
ou canal
segundo
o receptor
de Ca2+
mensageiro,
de
dependente
1,4,5-inositol
é trisfosfato (IP3) (IP3R)
rapidamente
de IP3 (Figura
gerado
13.29).
quando
IP3,
fosfolipase C é estimulada por diferentes hormônios ou
neurotransmissores. Um tipo diferente de canal de li
beração de Ca2+ ligante-dependente é expresso no ER/
SR de músculo esquelético e cardíaco. Este é conhecido
como o receptor de rianodina (RyR) ou canal de libera
ção de Ca2+ sensívelarianodina porque liga a drogaria
nodina (Figura 13.30). Em músculo cardíaco, os canais
RyR são controlados pelo Ca2+ que entra pelos canais da
membrana plasmática voltagem-dependentes sensíveis
a droga que bloqueiam canais, conhecidas como di-hi
dropiridinas. Esse jogo de múltiplos canais de Ca2+ para
regular a função do músculo cardíaco é chamado libera
ção de Ca2+ induzida por Ca2+. No músculo esquelético,
os canais RyR abrem-se via interações diretas proteí
552 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

Molécula sinalizadora
Receptor
Recept tor ligado
ligad
a
a proteína
eína G
prote G Pl 4,5-bisfosfato
Fosfolipase C-β [Pl(4,5)P2]
ativada Diacilglicerol

P
P

Subunidade
da Gq α P P P Proteína
Subunida
ativada 1,4,5-trisfosfato
Inositol quinase C
ativada
(IP3 P
) Ca2+
Lúmen do Abre canal de
retículo liberação de Ca2+
endoplasmático IP3-dependente
FIGURA 13.29 Mobilização dos
reservatórios de Ca2+ do retículo
endoplasmático e ativação da proteína
quinase C por receptores que estimulam
a hidrólise de fosfolipídeos de inositol
mediada por fosfolipase C.

Voltagem
despolarizadora Canal de Ca2+ voltagem-dependente
na–proteína com os canais de Ca2+ voltagem- e di
sensível a di-hidropiridina
-hidropiridina-sensíveis; essa regulação é possível
Exterior
porque SR no músculo esquelético forma contatos
diretos com invaginações especializadas da mem
Citoplasma
brana plasmática.

Abre canal de liberação

Ca2+ sensível a rianodina
Ativação por Cálcio de
Lúmen do
retículo
sarcoplasmático
Proteína Quinases e Fosfatases
Dependentes de Calmodulina
O Ca2+ citosólico aumentado resulta na ati
vação de várias proteínas regulatórias que ligam
FIGURA 13.30 Mobilização dos reservatórios de Ca2+ do retículo cálcio. Algumas, como a troponina-C, que regu
sarcoplasmático em células de músculo estriado por ativação la a contração em músculos estriados, são mui
induzida por despolarização de canais de liberação de Ca2+ to especializadas e expressas em apenas alguns
sensíveis a rianodina.
poucos tecidos (ver Figura 23.35, p. 999).999).). Dife-Dife-Dife
Proteína quinase Pi Domínio inibitório rentemente, a calmodulina (CaM) (p. 514) é uma
dependente de calmodulina Proteína fosfatase
proteína amplamente expressa, que é mediado
ra das ações regulatórias do Ca2+ em uma ampla
P Ca2+ -independente Inativa
faixa de funções celulares, via sua capacidade de
(50-80% ativa) ativar proteínas efetoras Ca2+-sensíveis, incluin
do proteína quinases serina/treonina-específicas
Domínio
catalítico (Figura 13.31), fosfatases e óxido nítrico sintases
(ver Figura 11.17, p. 462). Quando o Ca2+ se liga,
a calmodulina passa por mudanças conformacio
nais que facilitam sua interação com as proteínas
+Ca2+
Calmodulina
+Ca2+/calmodulina
efetoras a jusante. Algumas quinases dependen
tes de calmodulina, como a miosina cadeia leve
Ca2+

ADP ATP FIGURA 13.31 Regulação da calmodulina e de

proteína quinases reguladas por calmodulina por
P Ca2+.
Ativada Redesenhado com base em figura de Alberts, B. et al.
Autofosforilação
Totalmente Molecular Biology of the Cell, 4. ed. New York: Garland
ativa
Science, 2002.
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
quinase, têm como alvos apenas proteínas específicas,
enquanto outras formas, como a CaM quinase II mul
tifuncional, podem fosforilar uma ampla faixa de pro
teínas substratos. Alterar a atividade dessas proteínas
é o mecanismo primário pelo qual o Ca2+ aumentado
altera o comportamento celular. CaM-quinase II tam
bém se autofosforila quando ligada à calmodulina, e
essa autofosforilação permite que a CaMKII permaneça
ativa muito tempo depois do Ca2+ citosólico ter voltado
ao nível de repouso. CaM-quinases podem fosforilar e
modular uma ampla faixa de enzimas, canais iônicos,
proteínas contráteis e proteínas regulatórias de genes.
13.12 TRANSDUÇÃO DE
SINAL BASEADA EM
FOSFOLIPÍDEOS
Metabolismo Regulado de
Fosfolipídeos como um Componente
de Vias Intracelulares de Sinalização
A transdução de sinal por muitos receptores de
superfície celular envolve a ativação de uma ou mais
fosfolipases que catalisam a hidrólise de diferentes
classes de fosfolipídeos (por exemplo, fosfolipídeos de
inositol ou colina). Várias classes de fosfolipases catali
sam a produção de diferentes produtos que agem como
segundos mensageiros ou reguladores da produção
de segundos mensageiros (Figura 13.32). Fosfolipase
C (PI-PLC) hidrolisa fosfolipídeos de inositol gerando
inositol fosfatos e diacilgliceróis como segundos men
sageiros. Inositol fosfolipídeos podem ser mais fosfori
lados por fosfoinositídeo-3-quinase (PI-3K) para pro
duzir fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato (PIP3), outro
segundo mensageiro cuja função é descrita mais adian
te. Fosfolipase D (PLD) hidrolisa predominantemente
fosfolipídeos de colina ou etanolamina para produzir
ácido fosfatídico, que é subsequentemente hidrolisado
por ácido fosfatídico fosfo-hidrolases (PAP), gerando
diacilglicerol. Fosfolipase A2 (PLA2) ataca vários fos
folipídeos para produzir ácidos graxos livres, como áci
do araquidônico, e liso-fosfolipídeos.
Regulação da Fosfolipase C e da
Fosfolipase D
Como descrito anteriormente, muitos receptores
acoplados a proteína G e receptores tirosina quinases
estimulam a liberação de Ca2+ do retículo endoplasmá
tico por meio da ativação da produção de 1,4,5-inositol
trisfosfato (IP3). Este segundo mensageiro solúvel em
água é derivado da hidrólise de fosfatidilinositol-4,5
-bisfosfato (PIP2), um fosfolipídeo de membrana rela
• 553
Grupo de
cabeça polar
O
D OP
Fosfolipase C O–
O
Fosfolipase A2
O
C O
O
CO
FIGURA 13.32 Principais classes de fosfolipases usadas na
transdução de sinal mediada por receptor.
tivamente minoritário que é gerado por fosforilação de
duas hidroxilas do resíduo de inositoldo fosfatidilino-
sitol. A hidrólise de PIP2 é catalisada por fosfolipases
tipo C (PLC), com alta seletividade para inositolfosfoli
pídeos (Figura 13.32), e gera dois segundos mensagei
ros: (1) o produto hidrossolúvel IP3 e (2) diacilglicerol
(DAG), um produto hidrofóbico. Enzimas PI-PLCb são
ativadas por interação com subunidades a de proteínas
G da família Gq/11
Diferentemente, asou as subunidades
enzimas PI-PLCg bg da família Gi.
são ativadas por
fosforilação de tirosinas e associação com receptores
tirosina quinase. Algumas tirosina quinases não-recep
tores também fosforilam enzimas PLC.
Além do IP3, a ativação de PI-PLCb e PI-PLCgresulta
em acúmulo de DAG. Entretanto, a magnitude da pro
dução induzida por receptor de DAG em muitos tipos
celulares não pode ser atribuída exclusivamente à que
bra da PIP2. Embora a hidrólise de PIP2 gere pequenas
quantidades de DAG por curtos períodos de tempo, a
hidrólise de fosfolipídeos mais abundantes, como fos
fatidilcolina (PC), responde pela maior parte da pro
dução sustentada de DAG desencadeada em resposta
à ativação do receptor. Consequentemente, a hidrólise
de PC por PLC e fosfolipase D (PLD) é mediadora da
regulação de processos celulares que requerem eleva
554 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

ção prolongada de DAG. PC-PLD e PC-PLD são ativadas
indiretamente durante a estimulação do receptor por
uma complexa rede de sinais primários, que induzem
Ca2+, GTPases pequenas e proteína quinase C.
teínas regulatórias de genes. A capacidade das enzimas
PKC regularem direta ou indiretamente a fosforilação de
fatores de transcrição caracteriza o papel crítico da PKC
na regulação do crescimento, diferenciação ou morte de
muitas células e tecidos.

Diacilglicerol e Proteína Quinase C

Diacilglicerol (DAG), que resulta da quebra de PIP2
ou PC, liga-se e ativa membros da família das proteína
quinases C (PKC) (ver Figura 13.29, p.. 552).552).). PKCsPKCsPKCs ina-ina-ina
tivas existem como proteínas solúveis, citosólicas, nas
quais a extremidade N-terminal (contendo os sítios de
ligação de DAG) oclui a C-terminal (contendo sítios de
ligação para proteínas substratos e ATP). Quando DAG é
gerado nas membranas, PKC liga-se a ele, e isso resulta
no desdobramento e exposição dos domínios de ligação
de substrato e ATP da quinase. Outros sítios N-terminais
das enzimas PKC ligam-se a fosfolipídeos acídicos e fa
cilitam a associação de PKC com a membrana. Algumas
isoformas de PKC contêm sítios de ligação de Ca2+ em
seus domínios N-terminais, de modo que o Ca2+ citosóli
co aumentado potencializa a ligação de PKC às membra
nas. A ativação de enzimas PKC resulta em fosforilação
em serina/treonina de muitas proteínas substratos que,
por sua vez, elicitam várias respostas celulares. Como
as proteína quinases dependentes de cAMP e as proteí
na quinases dependentes de calmodulina, as isozimas
PKC fosforilam: (1) fatores de transcrição envolvidos
na regulação da expressão gênica, (2) canais iônicos e
transportadores, e (3) outros tipos de proteína quina
ses. Algumas isozimas PKC também disparam as várias
cascatas de MAP quinases que controlam múltiplas pro
PIP3, Fosfatidilinositol 3-Quinases e
Proteína Quinase B
Inositol fosfolipídeos são substratos para inositol
lipídeo quinases que fosforilam especificamente inosi
tol no 3!-OH. Estas fosfatidilinositol 3-quinases (PI3
-quinases) compreendem uma família de proteínas de
sinalização. Algumas associam-se com, e são ativadas
por, tirosinas fosforiladas de receptores de fatores de
crescimento ou receptores de citocinas ativados via in
terações com domínios SH-2.
Outras são ativadas pelos dímeros bg derivados de
proteínas G ativadas. PI-3 quinases fosforilam predo
minantemente fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato para pro
duzir fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato (PIP3), que não
funciona como um substrato para PLC, mas tem funções
críticas como um segundo mensageiro na regulação do
tráfego de membrana, na motilidade celular e na ativa
ção de vias de sinalização de sobrevivência celular (Fi
gura 13.33). A família Akt/proteína quinase B (PKB) é
um dos importantes mediadores da ação do PIP3. PKB
ativa potencializa a sobrevivência celular por reprimir a
atividade de certas vias de sinalização de morte celular e
regular outras proteínas e quinases envolvidas no trans
porte de glicose e no metabolismo de glicogênio.

Sinal de sobrevivência
Pl{4,5}P2

PP PPP
Pl(3,4,5)P3 PPP PPP Citoplasma
P P Domínios

PH P P

Pl 3-quinase ativada dissociação

Fosforilação
e ativação de
Receptor tirosina
PKB por PDK1
quinase ativado
PDK1
PKB

BAD inativada

PKB ativa P P
BAD P 14-3-3
Figura 13.33 Papel da fosfatidilinositol protein
3-quinase e da proteína quinase B nas
cascatas de sinalização intracelular por Fosforilação de BAD Inibiçãp de
3,4,5-fosfatidilinositol trisfosfato. apoptose
Redesenhado com base em figura de Alberts, Proteína inibitória
B. et al. Molecular Biology of the Cell, 4. ed. de morte inativa Proteína inibitória
New York: Garland Science, 2002. de morte ativa
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL • 555

Fosfolipase A2 e Geração de 13.13 INTEGRAÇÃO DE VIAS

Metabólitos de Ácido Araquidônico DE TRANSDUÇÃO DE
A ocupação dos receptores de superfície celular em SINAL EM REDES DE
muitos tipos de células desencadeia a liberação de ácido
araquidônico (AA) de fosfolipídeos da membrana. A li TRANSDUÇÃO DE SINAL
beração de AA é catalisada por membros da família das
Dependendo de sua localização tecidual e do grau de
enzimas
553). A regulação
fosfolipases
de PLA(PLA2) (ver Figura 13.32, p.
A2 2 é complexa,
mas inclui Ca2+, especialização, células individuais podem ser genetica
mente programadas para responderem a muitas molé
que parece controlar o deslocamento de algumas iso
culas sinalizadoras extracelulares distintas. Muitas im
formas de PLA2 do citosol para as membranas, e fosfori
portantes cascatas intracelulares de sinalização podem
lação mediada por quinase. O ácido araquidônico pode
ser reguladas sinergicamente por receptores de vários
ser rapidamente metabolizado a múltiplos produtos de
tipos e famílias (Figura 13.34). Por exemplo, as vias de
oxidação coletivamente conhecidos como eicosanoides MAP quinase podem ser reguladas por receptores aco
(p. 756); estes incluem prostaglandinas, tromboxanes e
plados a proteínas G e quinases de receptores de fato
leucotrienos. Diferentemente de outros segundos men
res de crescimento. Esta “troca de informação” (cross
sageiros, como nucleotídeos cíclicos ou Ca2+, os eicosa
-talk) fornece às células a capacidade de integrar sinais
noides são geralmente secretados das células nas quais
de múltiplos estímulos extracelulares em padrões sin
são produzidos para atuarem como agonistas extrace
gulares e particulares de resposta celular alterada. Em
lulares de receptores de superfície celular em células
outros casos, quinases de segundos mensageiros dife
vizinhas. Os eicosanoides são formados por virtualmen
rentes podem fosforilar resíduos distintos em uma pro
te todos os tipos celulares e desempenham papéis pa
teína alvo comum, como um fator de transcrição, para
rácrinos/autócrinos fundamentais em processos como
produzir mudanças divergentes ou convergentes nos
inflamação, coagulação do sangue, controle do tônus
padrões de expressão gênica. Assim, a resposta integra
vascular, função renal e outros. da de uma célula à ativação de um receptor específico
de superfície celular frequentemente vai variar,
dependendo de outros receptores de superfície
Hormônio
rmônio ou neurotransmissor Fator de crescimento celular estarem sendo simultaneamente ativa
dos. Por exemplo, um receptor que normalmente
induz expressão gênica especializada em um tipo
celular em particular pode desencadear a morte
programada no mesmo tipo celular se outros re
Citoplasma
toplasma P P
ceptores da superfície da célula estiverem sendo
Receptor ligado
a proteína
a proteína G P P
Receptor simultaneamente ativados ou, em alguns casos,
tirosina
P P quinase não estiverem sendo ativados. Embora a biologia
celular moderna tenha feito significativos avan
ços na definição dos componentes básicos e nas
adenilato
AMP
Proteína
cíclico
ciclase
G Calmodulina
Proteína G fosfolipase
Diacilglicerol
C
MAP quinaseRas-GEF
quinase
Grb2
Ras Pl
quinase
Pl(3,4,5)P3
3-quinase etapas sequenciais das vias individuais de sina
lização, um grande desafio continua sendo o en
IP3 tendimento de como essas vias individuais são
integradas em redes de transdução de sinal.
Ca2+

PKA CaM-quinase PKC MAPMAP

Proteínas regulatórias de genes
quinase
quinase
quinase PKB
PDK1
Figura 13.34 Troca de informação e integração
das principais cascatas de sinalização intracelular
reguladas por diferentes receptores de superfície
celular.
Redesenhado com base em figura de Alberts, B. et al.
Proteínas citosólicas ou de membrana Molecular Biology of the Cell, 4. ed. NewNew York:York: Gar-Gar
land Science, 2002.
556 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
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Termos Chaves
adenilato ciclase fosfolipase potência ligante-dependente
agonista GTPase pequena proteína adaptadora receptor ligado a enzima
antagonista guanilato ciclase proteína efetora receptor nuclear
calmodulina hormônio proteína Gheterotrimérica segundo mensageiro
canal de influxo de Ca2+ internalização do receptor proteína quinase regulada serina/treonina quinase
canal de liberação de Ca2+ ligante por segundo mensageiro sinalização autócrina
citocina MAP quinase sinalização justácrina sinalização endócrina
dessensibilização do re mediador local receptor sinalização parácrina
ceptor neurotransmissor receptoracoplado a proteí sinalização sináptica
eicosanoide na G
nucleotídeo cíclico tirosina quinase
fator de crescimento receptor canal iônico
nucleotídeo cíclico fosfo
fosfatase diesterase

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha E. também é chamado GPCR.
1. O tipo de sinalização intracelular no qual uma cé 4. As células podem terminar a transdução de sinal
lula pode se comunicar com outra em longa distân por receptores de superfície celular por
cia é chamado A. redução da disponibilidade de agonista na vi
A. autócrina. zinhança da célula alvo.
B. endócrina. B. internalização e degradação do complexo re
C. justácrina. ceptor–agonista.
D. parácrina. C. modificação do receptor de modo que fique
E. sináptica. inativo ou dessensibilizado.
2. D. todos os anteriores.
Receptores intracelulares
E. nenhum dos anteriores.
A. geralmente ligam-se a ligantes hidrofóbicos.
B. podem estar localizados no citosol ou no nú 5. Calmodulina é
cleo no estado não-ligado. A. uma quinase não-específica.
C. quando ligados a seus ligantes regulam a ex B. uma proteína que liga Ca2+.
pressão gênica. C. um segundo mensageiro.
D. quando ligados a seus ligantes funcionam D. um ativador da óxido nítrico sintase.
como complexos diméricos que se ligam a se
E. uma proteína de canal que facilita o influxo de
quências específicas do DNA.
Ca2+.
E. todos os anteriores.
6. A guanilato ciclase que responde a NO
3. Um receptor de superfície celular
A. fica no domínio catalítico de um receptor de
A. reage apenas com moléculas grandes demais membrana.
para atravessar a membrana plasmática.
B. também é ativada quando o fator natriurético
B. quando ligado a seu ligante, pode resultar em atrial (ANF) se liga ao seu receptor.
ativação de uma cascata enzimática.
C. aumenta a atividade em virtude de uma mu
C. sempre abre um canal iônico quando ligado a
dança conformacional quando NO se liga ao
seu ligante.
seu heme.
D. deve produzir um segundo mensageiro quan
D. é uma enzima monomérica.
do se liga a seu ligante.
558 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
E. é encontrada apenas em células musculares
lisas.
Questões 7 e 8: A psicose maníaco-depressiva pode
ser causada por superatividade de certas células do sis
tema nervoso central, talvez causada por níveis anor
malmente elevados de neurotransmissores que estimu
lam a transdução de sinal baseada em fosfolipídeos (por
exemplo, fosfatidilinositol [PI]). Lítio tem sido usado, há
muitos anos, para tratar psicose maníaco-depressiva.
Em presença de Li+, o sistema PI é desacelerado, a des
peito do estímulo continuado, e as células ficam menos
sensíveis a esses estímulos. Li+ pode ter duas funções:
inibição da fosfatase que defosforila inositol trisfosfato
e interferência direta com a função de proteínas G.
7. O sistema PI começa com ativação da fosfolipase
C, que inicia uma sequência de eventos incluindo
todos os seguintes, exceto
A. ativação de IP3 por ação de uma fosfatase.
B. aumento da concentração intracelular de Ca2+.
C. liberação de diacilglicerol (DAG) de um fosfo
lipídeo.
D. ativação de proteína quinase C.
E. fosforilação de certas proteínas citoplasmáti
cas.
8. Qual das seguintes afirmativas sobre proteínas G
está correta?
A. Proteínas G ligam o hormônio apropriado na
superfície celular.
B. GTP está ligado à proteína G no estado de re
pouso.
C. A subunidade a pode ser estimulatória ou ini
bitória porque tem duas formas.
D. A adenilato ciclase pode ser ativada só se as
subunidades a e b da proteína G estiverem as
sociadas uma com a outra.
E. A hidrólise de GTP é necessária para as subu
nidades da proteína G se separarem.
Questões 9 e 10: O hormônio liberador de hormônio
de crescimento (GHRH) produzido pelo hipotálamo li
ga-se ao seu receptor na pituitária e leva à produção de
hormônio de crescimento (GH) em virtude do aumento
do AMP cíclico. Certos hormônios da pituitária resul
tam em hipersecreção de GH em decorrência de uma
mutação que produz uma proteína Gs-a com atividade
de GTPase muito diminuída.
9. Elementos levando a aumento de AMP cíclico em
resposta a ligação de GHRH a seu receptor incluem
A. ativação de uma proteína G monomérica.
B. ativação de adenilato ciclase por subunidade
as de uma proteína Gs.
C. ativação da nucleotídeo cíclico fosfodiesterase.
D. ativação de proteína quinase A.
E. todos os anteriores.
10. Baixa atividade de GTPase na proteína mutada
resulta em ativação constitutiva de Gs e adenilato
ciclase porque
A. a subunidade a ligada a GTP não forma nova
mente o trímero abg.
B. a proteína G ligada a GTP liga-se mais forte
mente ao receptor de membrana.
C. GTP reage diretamente com adenilato ciclase
para ativá-la.
D. a forma trimérica da proteína G é estabilizada.
E. adenilato ciclase é fosforilada mais facilmente.
Questões 11 e 12: A família ErbB/HER de genes de
receptores tirosina quinase é ligada a muitos tipos dife
rentes de câncer humano. Superexpressão de qualquer
desses genes levaria a um aumento dos vários recep
tores. ErbB2 codifica a proteína HER2. Esse receptor
não liga nenhum fator de crescimento extracelular
conhecido, mas forma dímeros com outros receptores
HER ligados a fator de crescimento. Mesmo expressão
modesta de HER2 pode alterar a regulação normal do
crescimento celular.
11. Qual das seguintes afirmativas sobre receptores ti
rosina quinases está correta?
A. O domínio catalítico fica na extremidade N
-terminal.
B. A ativação da quinase requer ATP.
C. Fator de crescimento ligado ao receptor de
sencadeia dimerização, que ativa a atividade
de quinase.
D. A tirosina quinase ativa pode fosforilar outras
proteínas, mas não a si mesma.
E. Todas as anteriores.
12. A proteína Ras é um regulador crítico da prolifera
ção celular, e sua atividade é aumentada por tirosi
na quinase ativada. Elementos de sua ação incluem
todos os seguintes, exceto
A. formação de GMP cíclico.
B. proteínas adaptadoras ligam a tirosinas fosfo
riladas do receptor tirosina quinase.
C. recrutamento e estímulo de proteína ativada
por Ras.
D. troca de GDP por GTP na proteína Ras.
E. iniciação de uma cascata na qual várias quina
ses são ativadas sequencialmente por fosfori
lação.
Problemas
13. Como a elevação de AMP cíclico em células eu
carióticas leva à transcrição alterada de certos ge
nes?
14. Como neurotransmissores excitatórios e inibitó
rios diferem em seus efeitos sobre canais iônicos
ligante-dependentes?
 CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL
Respostas
1. B Um hormônio é liberado no sangue e viaja até
o tecido alvo. A: um tipo celular é tanto o emissor
como o alvo. C: esta é uma sinalização dependente
de contato. D: as células estão em vizinhança ime
diata uma da outra. E: este é um tipo de sinaliza
ção parácrina, usada por células nervosas.
2. E A: coisas como hormônios esteroides. B: uma
vez ligado ao ligante, os receptores citosólicos des
locam-se para o núcleo. C e D: ligam-se a elementos
regulatórios a montante e aumentam ou reprimem
a transcrição.
3. B Este é um dos modos pelo qual ocorre transdu
ção de sinal. A: também reagem como moléculas
sinalizadoras muito hidrofílicas. C e D: estas são
formas pelas quais receptores de superfície celular
podem atuar. E: isso é verdade apenas se o recep
tor for acoplado a uma proteína G.
4. D Todos são possíveis.
5. B Esta é uma proteína ubíqua que liga Ca2+. A:
Ca2+-calmodulina regula algumas quinases, mas
não esta. C: segundos mensageiros são geralmen
te moléculas pequenas ou íons. D: é o complexo
Ca2+-calmodulina que regula. E: calmodulina liga
o Ca2+ que entra, mas não é parte do canal que per
mite que entre.
6. C A enzima solúvel tem baixa afinidade quando o
heme não tem uma molécula gasosa ligada. A e B:
a enzima ligada à membrana é estimulada quando
ANF liga-se a seu receptor, mas não NO. D: é um
dímero. E: a enzima solúvel está presente na maio
ria dos tipos celulares.
7. A IP3 é a forma ativa. A ação da fosfatase sobre
ele torna-lo-á inativo, quando convertido em ino
sitol. B: IP3 causa liberação de cálcio. C e D: este
é o outro segundo mensageiro e ativa a proteína
quinase C. E: isto é o que a proteína quinase C faz.
8. C Qual forma é liberada depende do hormônio
específico e do receptor que reagiram. A: o recep
tor liga ao hormônio, e o complexo interage com
a proteína G. B e E: GDP está ligado à enzima em
repouso. Sua substituição por GTP leva a subuni
dade a a se dissociar. Na realidade, a hidrólise de
• 559
GTP permite que as subunidades de reassociem.
D: a subunidade a, quando dissociada das outras
duas, interage com a enzima para ativá-la ou inibi
-la, dependendo se for uma as ou ai.
9. B Adenilato ciclase então converte ATP em cAMP.
A: receptores acoplados a proteína G são todos he
terotriméricos. C: isso diminuiria cAMP por hidró
lise a AMP. D: AMP cíclico ativa a proteína quinase,
não o contrário.
10. A a-GTP dissocia do dímero bg. B: proteínas G
não se ligam ao receptor. C: é a a-GTP que ativa a
enzima. D: ver A. E: ativação da adenilato ciclase é
uma mudança conformacional, não fosforilação.
11. C É por isso que HER2 altera o crescimento,
embora não ligue fator de crescimento. A: a ex
tremidade N-terminal é extracelular e é o sítio de
ligação do ligante; o sítio catalítico deve estar em
um domínio intracelular. B: a dimerização causa a
ativação; uma vez ativado, usa ATP para fosforilar
proteínas. D: a primeira proteína fosforilada é o
próprio receptor, que depois atrai outras proteínas
para serem fosforiladas.
12. A Este não é um mecanismo que produz um se
gundo mensageiro pequeno. B a E: estas são etapas
sequenciais.
13. A ligação de cAMP à proteína quinase A leva as
subunidades catalíticas a se dissociarem das re
gulatórias, expondo sequências de localização
nuclear nas subunidades catalíticas. Estas podem
se deslocar para o núcleo, onde podem fosforilar
e ativar proteínas regulatórias de genes reguladas
por cAMP (CREBs), que controlam genes contendo
elementos regulatórios sensíveis a cAMP (CREs).
14. Neurotransmissores excitatórios (por exemplo,
acetilcolina, glutamato) ligam-se a receptores
cátion-seletivos e permitem que íons como Na+
entrem, despolarizando a membrana. Neurotrans
missores inibitórios (por exemplo, GABA, glicina)
ligam-se a receptores ânion-seletivos e permitem
que âníons como Cl– entrem, hiperpolarizando a
membrana.
560 • PARTE III FUNÇÕES DE PROTEÍNAS
PARTE IV CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 561
VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

14 δ β
α α
ATP
β α β

Bioenergética, ADP + Pi F1

b2

Mitocôndria e Lado N
γ
ε

Metabolismo Oxidativo Lado P +

H
c10–14

F0

Diana S. Beattie
Professora, West Virginia University School of Medicine

CONTEÚDO CORRELAÇÕES CLÍNICAS

14.1 SISTEMAS PRODUTORES E CONSUMIDORES 14.1 Deficiência de Piruvato Desidrogenase, 571
DE ENERGIA, 562
14.2 Deficiência de Fumarase, 574
14.2 RELAÇÕES TERMODINÂMICAS E COMPONEN
14.3 Envenenamento por Cianeto, 589
TES RICOS EM ENERGIA, 563
14.4 Neuropatia Óptica Hereditária de Leber, 600
14.3 FONTES E DESTINOS DA ACETIL-COENZIMA
A, 568 14.5 Miopatias Mitocondriais Decorrentes de Muta
ções em Genes de tRNA Mitocondrial, 600
14.4 O CICLO DOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS, 570
14.6 Intolerância a Exercício em Pacientes com Muta
14.5 ESTRUTURA E COMPARTIMENTALIZAÇÃO
ções no Citocromo b, 601
POR MEMBRANAS MITOCONDRIAIS, 577
14.7 NADPH Oxidase (NOX) na Saúde e na Doença,
14.6 CADEIA DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS, 579
603
14.7 FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA, 589
14.8 Lesão por Reperfusão do Miocárdio, 604
14.8 MEMBRANA MITOCONDRIAL INTERNA CON
TÉM SISTEMAS DE TRANSPORTE DE SUBS
TRATO, 594
14.9 GENES MITOCONDRIAIS E DOENÇAS, 599
14.10 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS,
REACTIVE OXYGEN SPECIES), 601

Conceitos Chaves
• Energia é conservada em organismos vivos por
oxidação de combustíveis metabólicos e é armaze
nada como ligações de alta energia do ATP para
fornecer energia para reações de biossíntese, con
tração muscular e transporte ativo de íons.
• A energia livre de Gibbs prediz a direção de uma
reação enzimática e está relacionada com a cons
tante de equilíbrio.
• Piruvato, o produto final do metabolismo da glico
se, é oxidativamente descarboxilado à acetil-CoA
pelo complexo regulado piruvato desidrogenase.
• Acetil-CoA, o produto final do catabolismo de car
boidratos, lipídeos e proteínas, é oxidado pelo ciclo
do ácido tricarboxílico localizado na matriz mito
condrial, produzindo NADH e FADH2.
562 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
• NADH e FADH2 são oxidados pela cadeia dede trans-trans
porte de elétrons, organizada em quatro grandes
complexos enzimáticos na membrana mitocondrial
interna, pela transferência de elétronsétronstrons ememem umaumauma sé-sé-sé
rie de etapas até o aceptor terminal de elétrons, o
oxigênio.
• A energia liberada durante as reações oxidativas
da cadeia de transporte de elétrons é conservada
como gradiente de prótons e de cargas através da
membrana mitocondrial interna. O gradiente dirige
a síntese de ATP catalizada pela ATP sintase. Esse
processo é denominado fosforilação oxidativa.
• Sistemas de transporte localizados na membrana
mitocondrial interna facilitam o movimento de
14.1 SISTEMAS PRODUTORES
E CONSUMIDORES DE
ENERGIA
Célulasélulas vivasvivas dependemdependem dede umum sistemasistema comple-comple
xo, sofisticadamente regulado, de reações químicas
produtoras e consumidoras de energia, chamado me
tabolismo. O metabolismo consiste de dois processos
contrastantes, catabolismo e anabolismo, que juntos
constituem as mudanças químicas que convertem ali
mentos em formas utilizáveis de energia e em moléculas
biológicas complexas. O catabolismo é responsável pela
degradação dos alimentos ingeridos ou de combustíveis
armazenados, como carboidratos, lipídeos e proteínas,
em formas de energia que possam ser utilizadas ou
armazenadas. Reações catabólicas, geralmente, resul
tam na conversão de moléculas grandes e complexas
em moléculas menores (finalmente, CO2 e H2O) e, em
mamíferos, frequentemente requerem consumo de O2.
Reações que utilizam energia realizam várias funções
necessárias e, em muitos casos, tecido-específicas,
por exemplo, condução do impulso nervoso, contra
ção muscular, crescimento e divisão celular. Reações
catabólicas são, em geral, exergônicas, com a ener
gia liberada, geralmente, capturada na formação de
ATP. As reações oxidativas do catabolismo trans
ferem equivalentes de redução para as coenzimas
NAD+ e NADP+ para formar NADH e NADPH. As vias
anabólicas são responsáveis pela biossíntese de mo
léculas grandes a partir de precursores menores, e
requerem investimento de energia, na forma de ATP
ou equivalentes de redução de NADPH (ver Figura
10.28, p. 495).
ATP Liga Sistemas de Produção e
de Utilização de Energia
A relação entre as funções de produção e de utili
zação de energia das células está ilustrada na Figura
14.1. A energia é derivada da oxidação de combustí
substratos e de intermediários para dentro e para
fora da matriz mitocondrial.
• Mitocôndrias de mamíferos têm um DNA circular
singular, que codifica proteínas da cadeia de trans
porte de elétrons, ATP sintase e RNA ribossômico
mitocondrial. Doenças resultam de mutações em
genes mitocondriais.
• A transferência, passo a passo, de elétrons para o
oxigênio resulta na formação de ânions superóxido
(O–),2 peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais li
vres de hidrogênio (OH·), que causam dano celular
por peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e
mutações no DNA.
veis metabólicos utilizados pelo organismo, geralmente
como carboidrato, lipídeo e proteína. A proporção de
cada combustível utilizado como fonte de energia de
pende do tecido e do estado dietético e hormonal do
organismo. Por exemplo, eritrócitos maduros e cére
bro adulto no estado alimentado utilizam apenas car
boidrato como fonte de energia, enquanto o fígado de
um diabético ou de um indivíduo em jejum metaboliza
primariamente lipídeo, para suprir as demandas ener
géticas. A energia pode ser consumida durante a rea
lização de várias funções ligadas a energia (trabalho),
algumas das quais são indicadas na Figura 14.1. Note
que o fígado e o pâncreas estão primariamente envol
vidos em funções de trabalho biossintético e secretório,
enquanto os músculos cardíaco e esquelético conver
tem energia metabólica em energia mecânica durante a
contração muscular.
O elo essencial entre vias de produção e de utili
zação de energia é o nucleosídeo trifosfato adenosina
5!-trifosfato (ATP) (Figura 14.2). O ATP é um nucleotí
deo de purina (adenina), no qual a adenina é ligada por
ATP
NADH
Produção
CO2
Carboidratos
Catabolismo
Proteína
Lipídeo
, H2O,
de energia
NH3 NADPH Anabolismo
Síntese de macromoléculas
Contração muscular
Transporte ativo de íons
Termogênese
ADP
NAD+ Pi
+
NADP+
FIGURA 14.1 Relação energética entre produção (catabolismo)
e utilização (anabolismo) de energia.
Quebra oxidativa de alimentos é um processo exergônico que libera
energia livre e poder redutor, que são capturados como ATP e NADH
ou NADPH, respectivamente. Processos anabólicos são endergônicos
e usam energia química armazenada como ATP e NADPH.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 563

NH2 NH2 Carboidrato

HCN
N CCN CH Adenina N CCN CH H C OH

CN HC
Ligações
alta energia
de Ligação
alta de
energia N C
N
H C O
O O O H2O Pi O O
iOPOPOPOCH2 O iOPOPOCH2 O HCOH

iO Oi Oi H H H H iO Oi H H H H H

Mg2+ OH OH Mg2+ OH OH Oxidado

DRibose Lipídeo

Adenosina 5!trifosfato Adenosine 5!difosfato H C H

FIGURA 14.2 Estruturas do ATP e do ADP complexados com Mg2+.

Reduzido
As ligações de alta energia são apontadas.
FIGURA 14.3 Estados de oxidação
uma ligação glicosídica ààà D-ribose.D-ribose.D-ribose.D-ribose. TrêsTrêsTrêsTrês gruposgruposgruposgrupos fosfo-fosfo-fosfo-fosfo de átomos de carbono típicos em
ril estão esterificados à posição 5 do resíduo de ribose. carboidratos e lipídeos.
Os dois grupos fosforil terminais (ou seja, β e γ) são
ligações fosfoanidrino ricas em energia ou ligações de biossíntese de compostos muito reduzidos, tais como
alta energia. A síntese de ATP, como resultado de um ácidos graxos, é fornecido pelo NADPH (p. 405), um
processo catabólico, ou que consome ATP, em um pro NADH 3!-fosforilado.
cesso ligado à energia envolve a formação e a hidrólise
ou transferência do grupo fosfato terminal do ATP. Esse
nucleotídeo é ligado a um cátion metálico divalente, Substrato
reduzido Catabolismo Produto
como magnésio, em condições fisiológicas. oxidado

NAD+ e NADP+ em Catabolismo e

Anabolismo NADP+ NADPH

Muitos processos catabólicos são de natureza oxi

dativa porque os carbonos do substrato, carboidratos, Anabolismo
gorduras e proteínas, estão em um estado parcial
mente ou altamente reduzido (Figura 14.3). Equiva Produto Precursor
lentes de redução são liberados dos substratos como reduzido oxidado
prótons e elétrons, que são transferidos para nicoti
namida adenina dinucleotídeo (NAD+) por enzimas FIGURA 14.4Transferência de equivalentes de redução
chamadas desidrogenases, com formação de NADH durante catabolismo e anabolismo usando NADPH e
NADH.
(ver Figura 10.28, p. 405). Os equivalentes de redu
ção do NADH são transportados para dentro das mi
tocôndrias e transferidos, pela cadeia de transporte
de elétrons, para O2 como aceptor final de elétrons 14.2 RELAÇÕES
(p. 579). As reações oxidativas em mitocôndrias são
exergônicas; a energia produzida éé usadausadausada paraparapara sín-sín-sín TERMODINÂMICAS E
tese de ATP, em um processo chamado fosforilação
COMPONENTES RICOS EM
oxidativa. As reações redutoras e oxidativas no ciclo
NAD+–NADH são centrais na conversão de energia ENERGIA
química de compostos de carbono dos alimentos em
ligações fosfoanidrido do ATP. Esse processo, chama Células vivas interconvertem diferentes formas de
do transdução de energia, será discutido em detalhes energia e também trocam energia com seu ambiente. Os
mais adiante neste capítulo. princípios da termodinâmica governam reações desse
tipo. O conhecimento desses princípios facilita a per
Anabolismo, diferentemente, é, em grande parte, cepção de como reações que produzem energia e que
um processo redutor, uma vez que moléculas pequenas, utilizam energia ocorrem dentro da mesma célula, e
mais oxidadas, são convertidas em moléculas grandes como um organismo é capaz de executar várias funções
e complexas (Figura 14.4). O poder redutor usado na de trabalho.
564 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

A primeira lei da termodinâmica afirma que energia
não pode ser criada nem destruída. Essa lei da conser
vação de energia estipula que, embora energia possa ser
convertida de uma forma em outra, a energia total de
um sistema permanece constante. Por exemplo, ener
gia química disponível em um combustível metabólico,
como glicose, é convertida, na glicólise, em energia quí
mica de ATP. No músculo esquelético, a energia química
envolvida em ligações fosfato ricas em energia do ATP
é convertida em energia mecânica, durante a contração
muscular. A energia de um gradiente osmótico eletropo
tencial de prótons através da membrana mitocondrial é
convertida em energia química durante a síntese de ATP.
A segunda lei da termodinâmica diz respeito à en
tropia. Entropia, designada por S, é uma medida ou
indicador do grau de desordem ou casualidade de um
sistema. Entropia é vista como a energia de um sistema
que não está disponível para realizar trabalho útil. To
dos os processos, sejam químicos ou biológicos, tendem
a progredir em direção à situação de máxima entropia.
Assim sendo, sistemas vivos que são muito ordenados,
nunca estão em equilíbrio com seu ambiente, uma vez
que equilíbrio em um sistema resulta quando o acaso
ou a desordem (entropia) está no máximo. Em sistemas
biológicos, portanto, é quase impossível quantificar
mudanças de entropia, já que tais sistemas raramente
estão em equilíbrio. Para maior simplicidade e por sua
utilidade inerente nessas considerações, é empregada
uma grandeza chamada energia livre.
A velocidade de uma dada reação depende da ener
gia livre de ativação, mas não da magnitude de AG.
Além disso, a variação de energia livre em um processo
bioquímico é a mesma, independentemente da via ou
do mecanismo usado para chegar ao estado final. A va
riação de energia livre de uma reação química está re
lacionada com a constante de equilíbrio. Por exemplo,
uma reação pode ser descrita como
A+BC+D
e a constante de equilíbrio é expressa como
Keq = [C][D]/[A][B]
Em condições padrões, quando reagentes e produ
tos estão presentes inicialmente em concentrações 1 M,
à pressão de 1 atm e 1 M [H+] ou pH 0, a variação de
energia livre padrão é definida como AG0!. Bioquímicos
modificaram essa expressão de modo que a energia li
vre padrão é calculada em pH 7,0 ([H+] = 10–7 M), no
qual as reações biológicas geralmente ocorrem. Nessas
condições, a variação de energia livre é expressa como
AG0! e K!eq. Como o valor de AG é zero no equilíbrio, a
seguinte relação é descrita:
AG0! =–RTln K!eq
onde R é a constante dos gases, que é 1,987 cal/mol × °K
ou 8,144 J/mol X°K, dependendo se a variação na ener
gia livre é expressa em calorias (cal) ou joules (J) por
mol, e T é a temperatura absoluta em graus Kelvin (K).

Portanto, se a constante de equilíbrio for determi

Energia Livre É a Energia Disponível
para Trabalho Útil
A energia livre (denotada por G ou energia livre de
Gibbs) de um sistema é a parte da energia total do sis
tema que está disponível para trabalho útil. É bem de
finida por
nada, a variação de energia livre padrão (DG0!) também
pode ser calculada. A relação entre AG0! e K!eq é ilustra
da na Tabela 14.1. Quando a constante de equilíbrio de
uma reação é menor do que 1, a reação é endergônica
e AG0! é positivo. Quando a constante de equilíbrio é
maior do que 1, a reação é exergônica e AG0! é negativo.

AG = AH – TAS TABELA 14.1 Valores de Keq e DG0’

Nessa expressão, para um sistema seguindo em di Keq (kcal/mol)
AG0! AG0!
reção ao equilíbrio, em temperatura e pressão constan (kJ/mol)
tes, AG é a variação de energia livre, AH é a variação
10–4 5,46 22,8
em entalpia ou conteúdo de calor, T é a temperatura
absoluta, e AS é a variação da entropia. Se AG de uma 10–3 4,09 17,1
reação for igual 0, o processo está em equilíbrio e não
há fluxo líquido em nenhuma direção. Além disso, qual 10–2 2,73 11,4
quer processo que apresente um AG negativo (variação
de energia livre) ocorre espontaneamente em direção 10–1 1,36 5,7
ao equilíbrio na direção escrita, em parte, em virtude
de um aumento na entropia ou desordem do sistema. 1 0 0
Tal processo libera energia e é exergônico. Um proces
10 –1,36 –5,7
so que apresente um AG positivo ocorrerá espontanea
mente na direção inversa à escrita. A energia de alguma 102 –2,73 –11,4
outra fonte deve ser aplicada para permitir que ocorra
103 –4,09 –17,1
em direção ao equilíbrio. Esse processo é chamado en
dergônico. Note que o sinal e o valor do AG não predi 104 –5,46 –22,8
zem quão rapidamente a reação ocorrerá.

Como discutido, DG0! de uma reação representa a
energia livre disponível em uma reação quando substra
tos e produtos estão presentes em concentrações 1 M.
Essa situação não ocorre em células, já que biomoléculas
raramente estão presentes em concentração 1 M. Por
tanto, uma expressão relacionada com as concentrações
intracelulares reais de substratos e produtos fornece in
formações quanto ao trabalho disponível em uma reação.
A expressão de DG, em qualquer concentração de subs
trato ou produto, inclui a variação de energia para uma
concentração 1 M de substrato e produto para chegar ao
equilibro (DG0!), e a variação de energia para alcançar
uma concentração 1 M de substratos e produtos:
DG = DG0! + RTln([C][D]/[A][B])
Por exemplo, em uma célula muscular a concentra
ção de ATP = 8,1 mM, a de ADP = 0,93 mM, e a de Pi =
8,1 mM. Se DG0! para a reação: ATP + HOH ↔ ADP +
Pi é 32,1 kJ/mol a 37oC, pH 7,4, então o DG geral para
essa reação é
DG = DG0! + RTln([ADP][Pi]/[ATP])
DG = DG0! + RTln(0,93 × 10–3)
DG = –32,1 kJ/mol + (–17,5 kJ/mol) = –49,6 kJ/mol
Esses cálculos demonstram que consideravelmente
mais energia livre está disponível para realizar traba
lho em uma célula muscular do que indicado pelo valor
de DG0!. Além disso, síntese de ATP em células mus
culares nessas condições, a reação reversa requereria
+50,1 kJ/mol de energia.
Nas vias metabólicas que produzem e que utilizam
energia, as variações de energia livre de reações enzi
máticas individuais são somatórias, por exemplo,
A→B→C→D
DG0!A →D = DG0!A →B + DG0!B →C + DG0!C→D
Embora qualquer dada reação enzimática em uma
sequênciaência possapossa terter umauma variaçãovariação dede energiaenergia livrelivre po-po
sitiva, contanto que a soma de todas as variações de
energia livre seja negativa, a via ocorrerá. Outra manei
ra de expressar esse princípio é dizendo que reações
TABELA 14.2 Variações de Energia Livre e Valores Calóricos para Metabolismo Total de Vários Combustíveis Metabólicos
Composto Peso
Molecular
Glicose 180
Lactato 90
Palmitato 256
Tripalmitina 809
Glicina 75
CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 565
enzimáticas com variações positivas de energia livre
podem ser acopladas a, ou direcionadas por, reações
com variações de energia livre negativas. Em uma via
metabólica como a glicólise, várias reações têm valores
de DG0! positivos ou valores de DG0! próximos de zero,
enquanto outras reações têm valores de DG0! altos e ne
gativos, que direcionam a via inteira. A consideração
crucial é que a soma dos valores de DG0! de todas as
reações de uma via deve ser negativa para que tal via
seja termodinamicamente viável. Como para todas as
reações químicas, reações enzimáticas individuais de
uma via metabólica ou a via como um todo seriam faci
litadas se as concentrações de reagentes (substratos)
excederem as de produtos.
Valor Calórico de Componentes da
Dieta
Durante oxidação completa, passo a passo, da gli
cose, um combustível metabólico primário em células,
uma grande quantidade de energia fica disponível. Isso
é ilustrado na equação
C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O;
DG0! = –2864 kJ/mol (–684 kcal/mol)
Quando esse processo ocorre em condições aeróbi
cas na maioria das células, é possível conservar aproxi
madamente metade dessa energia “disponível” como 38
moléculas de ATP. Os valores calóricos para oxidação
de outros combustíveis metabólicos são apresentados
na Tabela 14.2. Carboidratos e proteínas (aminoácidos)
têm um valor calórico de 12 – 16 kJ/g, enquanto lipídeos
(ou seja, palmitato, um ácido graxo de cadeia longa, ou
um triacilglicerol) têm um valor quase três vezes maior.
A razão pela qual mais energia é derivada de lipídeo do
que de carboidrato ou proteína relaciona-se com o estado
de oxidação médio dos átomos de carbono dessas subs
tâncias. Em carboidratos, os átomos de carbono estão
consideravelmente mais oxidados (ou menos reduzidos)
do que em lipídeos (ver Figura 14.3). Portanto, durante
a quebra sequencial de lipídeos, muito mais equivalentes
de redução (um equivalente de redução é definido como
um próton mais um elétron, ou seja, H+ + e–) podem ser
extraídos do que de carboidrato.
DG0! Valor Calórico
kJ/mol (kcal mol–1) kJ/g (kcal g–1)
–2.864 –686 15,9 3,81
–1.361 –326 15,1 3,62
–9.987 –2.380 38,8 9,30
–31.772 –7.510 38,8 9,30
–976 –234 13,0 3,12
566 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Compostos São Classificados mais estável. A hidrólise de fosfoenolpiruvato é um

com Base na Energia Liberada na
Hidrólise de Grupos Específicos
Os dois grupos fosforil terminais do ATP são liga
ções de alta energia, uma vez que a energia livre de
hidrólise de uma ligação fosfoanidrido é muito maior
do que a de um simples éster de fosfato. Alta energia
não é sinônimo de estabilidade da ligação química
em questão, nem se refere à energia necessária para
quebrar tal ligação. O conceito de compostos de alta
energia implica que os produtos de sua quebra hidro
lítica estão em formas mais estáveis do que o compos
to original. Como regra, ésteres de fosfato (compos
tos de baixa energia) apresentam valores de AG0! de
hidrólise negativos, na faixa de 42 kJ/mol, enquanto
ligações de alta energia têm valores de AG0! negativos
na faixa de 21–63 kJ/mol. Ésteres de fosfato como gli
cose 6-fosfato e glicerol 3-fosfato são compostos de
baixa energia.
Existem várias razões para certos compostos ou ar
ranjos de ligações serem ricos em energia. Primeiro, os
produtos de hidrólise de uma ligação rica em energia
podem existir em mais formas de ressonância do que a
molécula precursora. O maior número de formas de res
sonância possíveis nas quais uma molécula pode existir
estabiliza essa molécula. As formas de ressonância de
um fosfato inorgânico (Pi) são indicadas na Figura 14.5.
Menos formas podem ser escritas para ATP ou pirofos
fato (PPi) do que para fosfato (Pi).
exemplo desse tipo de composto (Figura 14.6). O AG0!
de isomerização é considerável, e o produto final, neste
caso, o piruvato, é muito mais estável. Finalmente, se
um produto de hidrólise de uma ligação de alta energia
for um ácido não-dissociado, a dissociação do próton e
seu subsequente tamponamento pode contribuir para
o AG0! geral da reação hidrolítica. Em geral, qualquer
propriedade ou processo que estabiliza produtos de hi
drólise tende a conferir um caráter de alta energia a
aquele composto. O caráter de alta energia do 3!,5!-ade
nosina monofosfato cíclico (cAMP) tem sido atribuído
ao fato de sua ligação fosfoanidrido estar tensionada,
uma vez que faz ponte entre as posições 3! e 5! da ribo
se. O caráter rico em energia de compostos tiol ésteres
como acetil-CoA ou succinil-CoA resulta do caráter re
lativamente acídico do grupo tiol. Portanto, a ligação
tioéster do acetil-CoA é quase equivalente em energia a
uma ligação fosfoanidrido.
CH2 O
C O POi
COOi Oi
Fosfoenolpiruvato
ΔGD! 61.9 kJ/mol HOH
(14.8 kcal/mol)
CH2 O
C OH + HO P Oi

COOi Oi

Enolpiruvato
O O– O– O–
+
HO P O– HO P O HO P O– HO P O– (isomerização espontânea)

O– O– O O– CH3

C O
(a) Formas de ressonância do fosfato
COOi

Piruvato (forma estável)

O O

HO P O P O– FIGURA 14.6 Hidrólise do fosfoenolpiruvato indicando a

energia livre liberada.
O– O–

(b) Pirofosfato
FIGURA 14.5 (a) Formas de ressonância do fosfato. (b)
Estrutura do pirofosfato.
Segundo, muitos arranjos de ligações de alta ener
gia contêm grupos de cargas eletrostáticas semelhan
tes localizadas em estreita proximidade entre si. Como
cargas iguais se repelem, consequentemente a hidrólise
de ligações ricas em energia alivia essa situação e con
fere estabilidade aos produtos de hidrólise. Terceiro,
a hidrólise de certas ligações ricas em energia resulta
na formação de um composto instável, que pode iso
merizar espontaneamente para formar um composto
Variações de Energia Livre Podem
Ser Determinadas a partir de
Reações Enzimáticas Acopladas
O valor de AG0! de hidrólise do fosfato terminal do
ATP é difícil de determinar simplesmente porque a Keq
da reação está muito deslocada para a direita.
ATP + HOH  ADP + Pi + H+
Entretanto, o AG0! da hidrólise do ATP é determi
nado indiretamente graças à natureza aditiva das va
riações na energia livre já discutidas aqui. Assim, a

energia livre de hidrólise do ATP é determinada adicio
nando-se o AG0! de uma reação que utiliza ATP, como a
hexoquinase, ao AG0! de uma reação que quebra fosfato
do produto da reação da hexoquinase, glicose 6-fosfato
(G6P), como indicado aqui.
Glicose + ATP hexoquinase G6P + ADP + H+
AG0! =–16 kJ/mol
G6P + HOHglicose6-fosfatase
AG0! = glicose + Pi
–14 kJ/mol
As energias livres de hidrólise de outros compostos
ricos em energia são determinadas de maneira similar.
Energias de Ligações de Alta
Energia de Vários Grupos Podem Ser
Outro
Transferidas de um Composto para
Compostos ricos em energia podem transferir vá
rios grupos para um composto aceptor, de modo ter
modinamicamente possível, em presença de uma en
zima apropriada. Os intermediários ricos em energia
da glicólise, 1,3-bisfosfoglicerato e fosfoenolpiruvato,
podem transferir seus grupos fosfatos de alta energia
para o ADP nas reações da fosfoglicerato quinase e da
piruvato quinase, respectivamente (Figura 14.7). Os
valores de AG0! dessas duas reações são –18,8 e –31,3
kJ/mol, respectivamente, e, portanto, a transferência
do fosfato de “alta energia” é termodinamicamente
fosfoglicerato quinase
1,3iBisfosfoglicerato
ADP ATP
ΔGD! i18,8 kJ/mol(i4,5 kcal/mol)
piruvato quinase
Fosfoenolpiruvato ADP ATP
ΔGD! i31,3 kJ/mol(i7,5 kcal/mol)
(a)
creatina quinase
Creatina creatina fosfato
ATP ADP
ΔGD! +6,3 kJ/mol(+1,5 kcal/mol)
(b)
hexoquinase
Glicose glicose 6ifosfato
ATP ADP
ΔGD! i16,7 kJ/mol(i4,0 kcal/mol)
(c)
FIGURA 14.7 Exemplos de reações envolvidas na
transferência de fosfato de “alta energia”.
CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 567
possível, e síntese de ATP é o resultado. ATP pode
transferir seu grupo fosforil terminal para formar um
composto de caráter de alta energia relativamente se
melhante (ou seja, creatina fosfato na reação da cre
atina quinase [Figura 14.7]) ou compostos de energia
consideravelmente mais baixa, como glicose 6-fosfato,
na reação da hexoquinase (Figura 14.7). Tais trans
ferências são cruciais na ligação das vias metabólicas
que produzem energia com as que usam energia em
+ H+
células vivas.
Embora nucleotídeos de adenina sejam os principais
envolvidos na geração ou na conservação de energia,
vários nucleosídeos trifosfatos, incluindo ATP, estão
envolvidos na transferência de energia em vias biossin
téticas. O nucleotídeo de guanina GTP é a fonte de ener
gia na gluconeogênese e na síntese proteica, enquanto
UTP (uracil) e CTP (citosina) são utilizados na síntese
de glicogênio e de lipídeos, respectivamente (ver p. 31
para as estruturas). A energia das ligações fosfato do
ATP pode ser transferida para os outros nucleotídeos
pela nucleosídeo difosfato quinase ou pela nucleosídeo
monofosfato quinase (Figura 14.8). Dois nucleosídeos
difosfatos são convertidos em um nucleosídeo trifosfa
to e um nucleosídeo monofosfato em várias reações de
nucleosídeo monofosfato quinase, como a da adenilato
quinase (Figura 14.9). Assim, a ligação fosfato terminal
rica em energia do ATP pode ser transferida para os
nucleotídeos apropriados, e utilizadas em vários pro
cessos biossintéticos.
(d)NDP ATP
3iFosfoglicerato Função difosfato
Nucleosídeo
quinase
+ Energia
Pi
(d)NTP ADP
Piruvato
biossintética
NMP ATP
Nucleosídeo
monofosfato quinase + Energia
Pi
NDP
ADP
FIGURA 14.8 Reações da nucleosídeo difosfato quinase e
da nucleosídeo monofosfato quinase.
N representa qualquer base púrica ou pirimídica; (d) indica um
desoxirribonucleotídeo.
568 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

2ADP O

S CCH3 Grupo acetil

CH2
β-Mercaptoetilamina
Adenilato quinase (mioquinase) CH2

NH
CH2 NH2
C O
N N
ATP + AMP Adenina

FIGURA 14.9 Reação da adenilato quinase N N

(mioquinase). NH
Ácido
pantogênico CO

14.3 FONTES E DESTINOS HO C H

C CH3 OPOPOCH2O
CH2
DA ACETIL H3C O O –

COENZIMA A D-Ribose
O– O– O
O grupo acetato que serve de fonte de
combustível para o ciclo dos ácidos tricarbo OH
OP
xílicos (TCA) é derivado das principais vias O

metabólicas geradoras de energia das célu –O

las. Estas incluem oxidação de ácidos gra

xos de cadeia longa por β-oxidação, quebra FIGURA 14.11 Estrutura de acetil-CoA.
de carboidratos ingeridos ou armazenados Note a presença do ácido pantotênico, uma das vitaminas B essenciais para
seres humanos.
pela glicólise, oxidação dos corpos cetôni
cos (acetato e β-hidroxibutirato), oxidação de etanol e e seus derivados, como acetil-CoA, não são livremente
quebra oxidativa de certos aminoácidos (Figura 14.10). transportados através de membranas celulares. Isso
Todos estes resultam, no final, na produção da unidade exigiu a evolução de certos mecanismos de transpor
de dois carbonos acetil-coenzima A. Coenzima A (CoA te ou de lançadeiras, pelos quais vários intermediários
ou CoASH), consiste de β-mercaptoetilamina, a vitami ou grupos são transferidos através de membranas. Tais
na ácidoácido pantotênicopantotênico eee ooo adenina-nucleotídeoadenina-nucleotídeoadenina-nucleotídeo adenosi-adenosi-adenosi reações de acil transferases para grupos acetil e gru
na 3!-fosfato 5!-difosfato (Figura 14.11). Nas células, a pos acil de cadeia longa serão discutidas no Capítulo 16.
coenzima A existe na forma de tiol reduzido (CoASH), Como a ligação tiol éster dos derivados acil-CoA é uma
que forma ligações tioéster de alta energia com grupos ligação rica em energia, esses compostos são doadores
acil e está envolvida em reações de transferência nas eficientes de grupos acil em reações de aciltransferases.
quais CoA serve como aceptor, depois doador, do gru Para sintetizar um derivado acil-CoA, duas ligações de
po acil. Várias vias metabólicas envolvem apenas deri alta energia do ATP devem ser gastas, como na reação
vados de acil-CoA, por exemplo, β-oxidação de ácidos da acetato tioquinase
graxos e degradação de aminoácidos de cadeia ramifi Acetato + CoASH + ATP acetatoquinase
cada. Como CoA é uma molécula grande, hidrofílica, ela
acetil-CoA + AMP + PPi

Glicogênio Triglicéride Proteína

Fontes e Destinos Metabólicos do
Glicogenólise Lipólise Proteólise
Piruvato
Glicose Ácido graxo livre Aminoácidos
Durante a glicólise aeróbica (p. 613), glicose ou ou
tras hexoses são convertidas em piruvato, o produto fi
Glicólise nal dessa via citosólica. O piruvato é também formado
Piruvato Oxidação na degradação de aminoácidos, como alanina ou serina,
e tem vários destinos, dependendo do tecido e do seu
Oxidação Deaminação e
oxidação
estado metabólico. Os destinos do piruvato e os tipos
de reações das quais participa estão indicados na Fi
Acetil CoA gura 14.12. A descarboxilação oxidativa do piruvato na
reação da piruvato desidrogenase é discutida a seguir;
FIGURA 14.10 Precursores gerais de acetil-CoA. ver página 773 para uma discussão de outras reações
Carboidratos, lipídeos e proteínas são quebrados, formando acetil envolvendo piruvato.
-CoA.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
Glicose
Glicólise
Piruvato
Transaminação Redução
Alanina Carboxilação Descarboxilação Lactato
oxidativa
Oxaloacetato Acetil CoA
FIGURA 14.12 Destinos metabólicos do piruvato.
O piruvato fica numa encruzilhada do metabolismo. Ele pode
ser convertido em lactato, alanina, oxaloacetato ou acetil-CoA,
dependendo das necessidades da célula.
Piruvato Desidrogenase É um
Complexo Multienzimático
O piruvato é convertido em acetil-CoA pelo comple
xo multienzimático piruvato desidrogenase
Piruvato + NAD+ + CoASH
NADH +→H+
acetil-CoA + CO2 +
DG0! =–33,4 kJ/mol
O mecanismo dessa reação é mais complexo do que
poderia ser inferido da estequiometria geral. Três dos co
fatores, tiamina pirofosfato (TPP), lipoamida e flavina
adenina dinucleotídeo (FAD), são ligados às subunida
des do complexo. A reação tem um DG0! de –33,4 kJ/mol
e, portanto, é irreversível em condições fisiológicas. O
complexo piruvato desidrogenase de mamíferos contém
três tipos de subunidades catalíticas associadas em um
complexo multienzimático de massa 7 a 8,5 × 106 kDa
para o complexo de rim, coração ou fígado. As subuni
dades catalíticas e seus cofatores associados são apre
sentados na Tabela 14.3. O arranjo das subunidades ca
talíticas de piruvato desidrogenase (Figura 14.13) em
um complexo multiproteico confere maior eficiência à
reação geral, uma vez que os intermediários ficam for
temente ligados às subunidades e não são liberados no
meio circundante.
O mecanismo da reação é ilustrado na Figura 14.14.
O grupo funcional TPP participa da formação de um in
termediário covalente. Ácido lipoico é ligado por uma
TABELA 14.3 Complexo Piruvato Desidrogenase de Mamíferos
Enzima Número de cadeias Grupo Prostético
Piruvato desidrogenase 20 ou 30
Di-hidrolipoil transacetilase 60
Di-hidrolipoil desidrogenase 6 FAD
• 569
ligação amida com uma lisina de cada subunidade de
transacetilase, e é chamado lipoamida, enquanto o FAD
é fortemente ligado a cada subunidade de di-hidrolipoil
desidrogenase. A estrutura do FAD é apresentada na
Figura 10.33 (p. 406).
FIGURA 14.13 Complexo piruvato desidrogenase de E.
coli.
(a) Micrografia eletrônica. (b) Modelo molecular. (As esferas
brancas são as 24 subunidades de transacetilase, as esferas
pretas são os 12 dímeros de piruvato desidrogenase, as esferas
cinzas são os seis dímeros de di-hidrolipoil desidrogenase.) O
complexo enzimático foi corado negativamente com fosfotun
gstato (×200.000). Cortesia do Dr. Lester J. Reed, University
of Texas, Austin.
Piruvato Desidrogenase É Rigorosamente
Regulada
O complexo piruvato desidrogenase é regulado de
dois modos. Primeiro, dois produtos da reação, acetil
-CoA e NADH, inibem o complexo de modo competiti
vo, como inibidores de retroalimentação (feedback).
Segundo, o complexo piruvato desidrogenase passa por
fosforilação e defosforilação. O complexo é ativo quando
defosforilado e inativo quando fosforilado. Inativação é
realizada por uma proteína quinase Mg2+-ATP-depen
dente, que fica firmemente ligada ao complexo. Ativação
é realizada por uma fosfoproteína fosfatase, que também
fica associada com o complexo e funciona de modo Mg2+
e Ca2+-dependente. A regulação diferencial da piruvato
desidrogenase quinase e da fosfatase é a chave da regu
lação geral do complexo. Produtos da enzima estimulam
a reação da proteína quinase, levando a uma inativação
do complexo (Figura 14.15). A atividade do complexo
é estimulada por Mg2+ e Ca2+, um potente ativador da
Reação Catalisada
TPP Descarboxilação oxidativa do piruvato
Lipoamida Transferência do grupo acetil para CoA
Regeneração da forma oxidada da lipoamida
e transferência de elétrons para NAD
570 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

NAD+ proteína fosfatase. Esses efeitos do

Ca2+ podem desempenhar um papel
importante no músculo esquelético,
FADH2 onde a liberação de Ca2+ durante a
contração ativa a proteína fosfatase,
estimulando a oxidação do piruvato
CO2 CH3CH
OH TPP Lip S desidrogenase
Dihidrolipoil NADH + H+
e, portanto, a produção de energia.
Finalmente, administração de insu
lina ativa a piruvato desidrogenase
FAD no tecido adiposo, e catecolaminas,
SH
C O desidrogenase
Piruvato
TPP transacetilase
Dihidrolipoil Lip SH O SCoA como a epinefrina, ativam a piruva
O CH3C
to desidrogenase no tecido cardíaco
CH3 (Correlação Clínica 14.1).

CH3 C SLipSH
COOi
Acetil-CoA É Usado por
CoASH Várias Vias Diferentes
TPP Tiamina pirofosfate
Os destinos do acetil-CoA gera
Lip Lipoamida
do na matriz mitocondrial incluem
FIGURA 14.14 Mecanismo do complexo multienzimático piruvato desidrogenase. (1) completa oxidação do grupo
A piruvato desidrogenase catalisa a descarboxilação oxidativa do piruvato e a transfe acetil no ciclo TCA para geração de
rência do grupo acetil primeiro para lipoamida. A di-hidrolipoil transacetilase transfere energia; (2) conversão do excesso
o grupo acetil da lipoamida para a coenzima A. A di-hidrolipoil desidrogenase oxida a de acetil-CoA nos corpos cetônicos
lipoamida reduzida. acetoacetato e β-hidroxibutirato no
fígado; e (3) transferência de unida
des acetil como citrato para o citosol, com subsequente
Piruvato Desidrogenase síntese de ácidos graxos de cadeias longas (p. 627) e es
Piruvato Acetil CoA teróis (Figura 14.16).
–

CoASH ATP CO2

NAD+ –
NADH+H+ 14.4 CICLO DOS ÁCIDOS
TRICARBOXÍLICOS
(a)
O acetil-CoA produzido nas vias catabólicas gerado
ras de energia da maioria das células é completamente
Piruvato
Pi
oxidado a CO2 em um ciclo de reações denominado ciclo
Desidrogenase
(Inativa)
dos ácidos tricarboxílicos (TCA). Esse ciclo é também
chamado o ciclo do ácido cítrico ou ciclo de Krebs, em
Fosfatase
homenagem a Sir Hans Krebs que postulou suas carac
NADH
AcetilCoA +
CoASH
NAD+
ADP – Mg2+ terísticas essenciais em 1937. A localização primária das
ADP
Ca2+ + enzimas do ciclo TCA é mitocondrial, embora isoenzi
Quinase mas de algumas enzimas estejam presentes no citosol.
Pi Essa localização é apropriada, uma vez que o complexo
piruvato desidrogenase e a sequência da β-oxidação de
Piruvato – + ácidos graxos, as duas fontes primárias de acetil-CoA,
também estão localizadas nas mitocôndrias. Quatro re
Piruvato ações do ciclo TCA transferem elétrons para NAD+ ou
Desidrogenase
(Ativa) FAD. Os NADH ou FADH2 resultantes são então oxida
dos pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial
(b) (cadeia de transferência de elétrons ou cadeia respirató
ria) para gerar energia, que é usada para formar ATP por
FIGURA 14.15 Regulação do complexo multienzimático fosforilação oxidativa (p. 589). As enzimas da cadeia de
piruvato desidrogenase.
transporte de elétrons e as envolvidas na síntese de ATP
(a) Piruvato desidrogenase é inibida por seus produtos, acetil-CoA
e NADH. (b) Piruvato desidrogenase é também inativada por fos
são localizadas exclusivamente em mitocôndrias. A Fi
forilação e ativada por defosforilação. A fosfatase é estimulada por gura 14.17 é uma visão geral das reações do ciclo TCA. Na
íons Mg2+ e Ca2+. A quinase é estimulada por ATP, NADH e acetil primeira etapa, o resíduo acetil do acetil-CoA é conden
-CoA e inibida por CoASH, NAD+ e ADP. sado com oxaloacetato (um ácido dicarboxílico de quatro
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.1
Deficiência de Piruvato Desidrogenase
Uma variedade de doenças do metabolismo de pi
ruvato foi detectada em crianças. Algumas envolvem
deficiências das subunidades catalíticas ou regulató
rias do complexo piruvato desidrogenase. Crianças
com deficiência de piruvato desidrogenase geralmente
apresentam níveis séricos elevados de lactato, piruva
to e alanina, o que produz uma acidose láctica crônica.
Frequentemente apresentam defeitos neurológicos gra
ves, que geralmente resultam em morte. O diagnóstico
da deficiência de piruvato desidrogenase é geralmente
feito pelo ensaio do complexo enzimático e/ou de suas
subunidades enzimáticas em culturas de fibroblastos de
pele retirados do paciente. Alguns pacientes respondem
Piruvato Aminoácidos Ácidos graxos
Acetil CoA
Ciclo dos ácidos Corpos Esteróides e
tricarboxílicos cetônicos ácidos graxos
FIGURA 14.16 Fontes e destinos de acetil-CoA.
carbonos) para formar citrato (um ácido tricarboxílico
de seis carbonos). Após rearranjo dos carbonos do citra
to, duas reações de descarboxilação oxidativa produzem
duas moléculas de CO2, duas moléculas de NADH + H+,
uma molécula de succinato (um ácido dicarboxílico de
quatro carbonos) e uma ligação de alta energia em GTP.
Mais duas oxidações produzem outro NADH + H+ mais
um FADH2 e regeneram oxaloacetato.
Em resumo, o substrato do ciclo TCA é a unidade de
dois carbonos acetil-CoA, e os produtos de uma volta
completa do ciclo são dois CO2, uma ligação fosfato de
alta energia (como GTP), três NADH, e um FADH2. Os
NADH e FADH2 são subsequentemente oxidados pela
cadeia de transporte de elétrons, com a produção de
nove ATPs (ver p. 590 para rendimentos de ATP duran
te a oxidação das coenzimas). Assim, 10 ATPs ou seu
equivalente (GTP) são produzidos durante a oxidação
de um acetato no ciclo TCA.
• 571
a tratamento dietético no qual uma dieta pobre em car
boidratos é administrada. Os pacientes podem entrar
em choque por causa da acidose láctica, uma vez que o
decréscimo na entrega de O2 inibe a piruvato desidroge
nase e aumenta o metabolismo anaeróbico. Alguns pa
cientes foram tratados com dicloroacetato, um inibidor
da proteína subunidade quinase do complexo piruvato
desidrogenase. A inibição completa da quinase, que ini
be a enzima, ativará, assim, o complexo enzimático.
Patel, M.S. e Harris, R.A. Mammalian α-keto acid
dehydrogenase complexes: Gene regulation and genetic de
fects. FASEBJ. 9:1164, 1995.
Reações do Ciclo dos Ácidos
Tricarboxílicos
As reações individuais do ciclo TCA são
apresentadas na Figura 14.18. A etapa inicial
do ciclo é catalisada pela citrato sintase, na
matriz mitocondrial. Essa reação fortemente
exergônica compromete grupos acetil com a
formação de citrato e a oxidação completa
no ciclo. Como mostrado a seguir, a citrato
sintase condensa um resíduo de acetil com
o carbono α-ceto do ácido dicarboxílico oxa
loacetato. O intermediário citroil-SCoA per
manece ligado ao sítio catalítico da citrato
sintase.
O O
CoASH
Acetil CoA
*CH3*CSCoA *CSCoA +
HO C COOJ
*CH2 H2O *COOJ
*CH2
O HO C COOJ
CCOOJ COOJ
CH2 CH2
CH2COOJ Citroil-SCoA COOJ
Oxaloacetato ligado à enzima Citrato
CITRATO SINTASE
O equilíbrio dessa reação é muito deslocado para a for
mação de citrato, com um DG0! próximo de –38 kJ/mol.
Note que a concentração intramitocondrial de oxaloace
tato é muito baixa (menos de 1 mM); entretanto, o DG0!
fortemente negativo direciona a reação para frente. A
baixa concentração de oxaloacetato, que está abaixo do
572 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
Km da reação, também pode ser um fator importante no
controle dessa reação.
Piruvato Ácidos graxos
Acetil CoA
Ciclo dos ácidos
tricarboxílicos
CO2
GTP
CO2
(4) 2H+ + 2H² (equivalentes de redução)
Sistema de transporte de elétrons
9 ATP
FIGURA 14.17 Descrição geral da oxidação de alimentos
para fornecer energia para síntese de ATP dentro das
mitocôndrias.
Acetil-CoA produzido por oxidação de piruvato e ácidos graxos
é metabolizado pelo ciclo dos ácidos tricarboxílicos a equiva
lentes de redução, que são oxidados pelo sistema de transpor
te de elétrons. A energia liberada durante o processo oxidativo
é usada para dirigir a síntese de ATP.
Citrato é convertido em isocitrato por uma reação
reversível catalisada pela aconitase, na qual o grupo hi
droxila do citrato é trocado por um átomo de H de um
carbono adjacente. O grupo hidroxila fica localizado,
então, vizinho ao grupo carboxila do isocitrato, onde
descarboxilação oxidativa pode ocorrer. A conversão de
citrato em isocitrato ocorre na aconitase, sem liberação
do intermediário cis-aconitato. A aconitase contém um
grupo ferro-enxofre não-hemínico, que está envolvido
no mecanismo catalítico. O equilíbrio geral da reação
favorece a formação de citrato.
Fluoroacetato é um potente inibidor do ciclo, em
bora não iniba diretamente nenhuma das enzimas do
ciclo. O fluoroacetato é convertido em fluorocitrato,
que é um potente inibidor da aconitase. O fluoroacetil
-CoA é formado pela acetil-CoA sintetase, e convertido
em fluorocitrato pela citrato sintase. O fluoroacetato é
letal em pequenas doses e foi usado como um veneno
para rato; a LD50, a dose letal para 50% dos animais
que o consomem, é 0,2 mg por quilograma de peso cor
poral.
A isocitrato desidrogenase converte isocitrato
em α-cetoglutarato em uma reação de descarboxila
ção oxidativa, com concomitante redução de NAD+
a NADH + H+. A isocitrato desidrogenase de mitocôn
drias de mamíferos requer NAD+ como aceptor de equi
valentes de redução, tem uma massa de 380 kDa, e con
siste de oito subunidades idênticas. A reação requer um
cátion de metal divalente (por exemplo, Mn2+ ou Mg2+)
para remoção do β carboxilato do oxalossuccinato.
O equilíbrio dessa reação fica fortemente desloca
do na direção da formação de α-cetoglutarato, com um
DG0! de quase–21 kJ/mol.
Mitocôndrias também contêm uma isocitrato de
sidrogenase que requer NADP+. A enzima ligada a
NADP+ é também encontrada no citosol, onde fornece
equivalentes de redução para processos redutores ci
tosólicos.
A conversão de α-cetoglutarato em succinil-CoA
é catalisada pelo complexo α-cetoglutarato desidro
genase, que é quase idêntico ao complexo piruvato
desidrogenase em termos de reações individuais cata
lisadas e suas características estruturais. De novo, tia
mina pirofosfato, ácido lipoico, CoASH, FAD e NAD+
participam do mecanismo catalítico. O complexo con
siste de subunidades de α-cetoglutarato desidroge
nase, di-hidrolipoil transsuccinilase e di-hidrolipoil
desidrogenase. O equilíbrio da reação é muito deslo
cado em direção à formação de succinil-CoA, com um
DG0! de –33 kJ/mol. Nessa reação, a segunda molécula
de CO2+eH+)
NADH o segundo são produzidos.
do cicloequivalente de redução
O produto
(oudessa
seja,
reação, succinil-CoA, é um tiol éster rico em energia,
semelhante a acetil-CoA.
O caráter de alta energia da ligação tiol éster do
succinil-CoA é conservado por fosforilação no nível do
substrato na etapa seguinte do ciclo. A succinil-CoA
sintetase (ou succinato tioquinase) converte succinil
-CoA em succinato e, em tecidos de mamíferos, resulta
na fosforilação de GDP em GTP. Essa reação é livre
mente reversível, com um DG0! = –3,0 kJ/mol, e o me
canismo catalítico envolve um intermediário enzima
-succinil fosfato.
Succinil CoA + Pi + Enz → Enz-succinil fosfato +
+ CoASH
Enz-succinil fosfato → Enz-fosfato + succinato
Enz-fosfato + GDP → Enz + GTP
A enzima é fosforilada na posição 3 de um resíduo de
histidina durante a reação; isso conserva a energia do
tioéster para formação de GTP. O GTP é usado para a
síntese mitocondrial de proteínas, RNA e DNA.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 573

CH3C S CoA
Acetil CoA
COOi H20

NADH Oxaloacetato
CH2
COOi CoASH
C O
+H+ &22²
COOi
& + NAD+ Citrato &+
+2 sintase +2 & &22² H20
Malato
CH2 desidrogenase
COOi &+
Fumarase Citrato
&22²Aconitase COOi H2
COOiH20 LiMalato CH2

COOi C COOi
)XPDUDWR
HC
CH cisAconitato
CH

COOi

O
FADH2 Aconitase
Succinato
desidrogenase
FAD TRICARBOXÍLICOS
CICLO
ÁCIDOS
DOS COOi
&+


COOi ,VRFLWUDWR
+ & &22²
CH2
+2 & +
Succinato
CH2 Succinil
sintetase
CoA Isocitrato
COOi

CoASH desidrogenase NAD+

GTP Pi &22² NADH + H+

GDP &+
&+
6  &R$ NADH
+ H+
αicetoglutarato
desidrogenase
CoASH &22² desidrogenase
Isocitrato &22²
&+


& 2 CO2 &+

&+ & &22²
& 2

&22² &22²
6XFFLQLO&R$ NAD+ & 2
2[DORVXFFLQDWR
CO2 +
α²&HWRJOXWDUDWR
FIGURA 14.18 Ciclo dos ácidos tricarboxílicos.
Carbonos marcados com asterisco indicam o destino dos carbonos do grupo acetil.

Succinato é oxidado a fumarato pela succinato de
sidrogenase, uma enzima complexa fortemente ligada
à membrana mitocondrial interna. A succinato desi
drogenase é composta de uma subunidade de 70 kDa
que contém o sítio de ligação ao substrato (FAD cova
lentemente ligado a um resíduo de histidina), uma su
bunidade de 30 kDa que contém três centros de ferro
-enxofre (não-hemínico), e duas pequenas proteínas
hidrofóbicas. A enzima é uma flavoproteína típica, na
qual elétrons e prótons são transferidos do substrato
por meio de FAD covalentemente ligado e dos centros
de ferro-enxofre, nos quais o ferro não-hemínico sofre
oxidação e redução. Os elétrons são, então, transferidos
para a coenzima Q para transporte posterior na cadeia
de transferência de elétrons, como será discutido na Se
ção 14.6. A succinato desidrogenase é fortemente inibi
da por malonato e oxaloacetato, e é ativada por ATP, Pi
e succinato. Malonato inibe a succinato desidrogenase
competitivamente com relação ao succinato, em virtu
de da grande semelhança estrutural entre o malonato e
o succinato (Figura 14.19).
Fumarato é, então, hidratado para formar L-malato,
pela fumarase. A fumarase é um homotetrâmero (200
kDa) e é estereoespecífica para a forma trans do subs
trato (a forma cis, maleato, não é substrato) (Figura
14.19). A reação é livremente reversível em condições
fisiológicas. A Correlação Clínica 14.2 descreve uma de
ficiência genética de fumarase.
574 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CH2
COOi CH2
COOi
Malonato
Succinato
FIGURA 14.19 Estruturas do succinato, um intermediário
do ciclo TCA; malonato, um inibidor da succinato
desidrogenase e do ciclo; e maleato, um composto não
envolvido no ciclo.
A reação final do ciclo TCA é catalisada pela mala
to desidrogenase, na qual os equivalentes de redução
são transferidos para NAD+ para formar NADH + H+.
O equilíbrio da reação é fortemente deslocado para a
formação de L-malato, com um DG0! = +29 kJ/mol. Essa
reação endergônica é deslocada na direção para frente
pela ação da citrato sintase e de outras reações que re
movem oxaloacetato.
O NADH produzido pelas três desidrogenases NAD+-
-ligadas no ciclo TCA é rapidamente oxidado a NAD+
pela cadeia respiratória, favorecendo assim a direção
para frente da malato desidrogenase.
Conversão do Grupo Acetil de
Acetil-CoA em CO2 e H2O Conserva
Energia
O ciclo TCA (ver Figura 14.18) é a via oxidativa ter
minal para a maioria dos combustíveis metabólicos.
Resíduos de dois carbonos na forma de acetil-CoA são
completamente
oxidativas
FADH2, que resultam na formação
sãooxidados
usados subsequentemente
a CO2 e H2O, e quatro
paraetapas
gera
de 3 NADH + H+ e 1
ção de ATP. A oxidação de cada NADH + H+ resulta
na formação de 2,5 ATPs por fosforilação oxidativa,
enquanto a oxidação do FADH2 formado na reação da
CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.2
Deficiência de Fumarase (OMIM 606812)
A deficiência de enzimas do ciclo TCA é rara, indi
cando a importância dessa via para a sobrevivência. En
tretanto, foram descritos váriosários casoscasosos dedede severaseverasevera defici-defici-defici
ência de fumarase em mitocôndrias e citosol de tecidos
(por exemplo, linfócitos do sangue). A doença é carac
terizada por grave déficit neurológico, encefalomiopatia
e distonia, que se desenvolvem logo após o nascimento.
A urina contém quantidades anormais de fumarato e
níveis elevados de succinato, α-cetoglutarato, citrato e
malato. As isoenzimas mitocondrial e citosólica da fu
marase são derivadas de um único gene. Em pacientes
H COOi succinato desidrogenase gera 1,5 ATPs. Uma ligação de
C
alta energia é formada como GTP na reação da succinil
-CoA sintetase. Assim, o rendimento líquico em ATP ou
COOi
H Maleato seus equivalentes (ou seja, GTP) para a completa oxida
ção de um grupo acetil no ciclo TCA é 10.
Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos
Serve como uma Fonte de
Intermediários Biossintéticos
A discussão anterior sobre o ciclo TCA se concen
trou em seu papel na quebra oxidativa de grupos acetila
CO2 e H2O, formação de coenzimas reduzidas e síntese
de ATP. No geral, o ciclo TCA é a via final comum para
quebra de alimentos; entretanto, como resumido na Fi
gura 14.20, os compostos de quatro, cinco e seis carbo
nos gerados nas reações do ciclo TCA são importantes
intermediários em processos biossintéticos. Succinil
-CoA, malato, oxaloacetato, α-cetoglutarato e citrato
são todos precursores da biossíntese de importantes
compostos celulares.
A Transaminação converte α-cetoglutarato em glu
tamato, que pode deixar a mitocôndria e ser converti
do em vários outros aminoácidos. No tecido nervoso,
α-cetoglutarato é convertido nos neurotransmissores
glutamato e ácidoγ-aminobutírico (GABA). O glutama
to também é produzido a partir de α-cetoglutarato pela
enzima mitocondrial glutamato desidrogenase, em pre
sença de NADH ou NADPH e amônia. O amino grupo
incorporado no glutamato pode, então, ser transferido
para formar vários aminoácidos, por diferentes amino
transferases. Essas enzimas e a relevância da incorpo
ração ou da liberação de amônia em ou de α-cetoácidos
são discutidas no Capítulo 19.
Succinil-CoA representa um ponto de ramificação
metabólica (Figura 14.21), porque pode ser formado a
partir de α-cetoglutarato no ciclo TCA ou a partir de
metilmalonil-CoA, nas etapas finais da quebra de ácidos
afetados, ambos os pais têm a metade dos níveis nor
mais da atividade enzimática, mas são clinicamente
normais, como seria de se esperar em uma doença au
tossômica recessiva. A primeira mutação caracterizada
no gene da fumarase contém uma glutamina substituí
da por um resíduo de glutamato 319.
Bourgeron, T., Chreiten, D., Poggi-Bach, J., et. al. Muta
tion of the fumarase gene in two siblings with progressive
encephalopathy and fumarase deficiency. J. Clin. Invest.
93:2514, 1994.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 575

Acetil CoA CoA O citrato é exportado da

mitocôndria para o citosol. A
Síntese citrato liase o converte em oxa
de Oxaloacetato Citrato Síntese de ácidos graxos e esteróis loacetato e acetil-CoA, um pre
aminoácidos
cursor da síntesesíntese dede ácidosácidos gra-gra
xos de cadeia longa e esteróis.
O oxaloacetato é rapidamente
Gluconeogênese Malato αCetoglutarato Síntese de aminoácidos reduzido a malato, que é con
vertido pela enzima málica em
piruvato e NADPH, uma fon
Succinil CoA Neurotransmissores te de equivalentes de redução
para processos biossintéticos
no citosol. Além disso, citrato é
Síntese do heme um efetor regulatório de outras
vias metabólicas (p. 704).
FIGURA 14.20 O ciclo TCA é uma fonte de precursores para síntese de aminoácidos,
ácidos graxos e glicose.

graxos de cadeia ímpar ou dos aminoácidos de cadeia Reações Anapleróticas Repõem

ramificada valina e isoleucina. O Succinil-CoA pode Intermediários do Ciclo dos Ácidos
ainda ser convertido em succinato ou condensado com
glicina para formar d-aminolevulinato, a reação inicial Tricarboxílicos
na biossíntese de porfirinas (p. 814).
Em seu papel no catabolismo, o ciclo TCA oxida ace
O oxaloacetato é transaminado a aspartato, o pre til-CoA com liberação de duas moléculas de CO2. Na re
cursor de asparagina e das pirimidinas citosina, uracil alidade, o oxaloacetato, o aceptor do grupo acetato, é re
e timina. O oxaloacetato é convertido em fosfoenolpi generado durante o ciclo. Entretanto, vias metabólicas
ruvato (PEP), um intermediário chave na gluconeo em todos os tecidos removem intermediários do ciclo
gênese (p. 638). O oxaloacetato não pode atravessar a para vias biossintéticas. Consequentemente, para man
membrana mitocondrial interna, mas é convertido em ter o ciclo funcional, é necessária uma fonte de ácidos
malato, que é transportado por um transportador espe de quatro carbonos para repor a perda de oxaloacetato.
cífico para fora da mitocôndria e oxidado a oxaloaceta As reações que fornecem intermediários de quatro ou
to, que é então convertido em PEP (p. 597). cinco carbonos para o ciclo são chamadas reações ana
pleróticas (significa “preencher”)
Propionil CoA (Figura 14.22). A mais importante é
catalisada pela piruvato carboxila
se, que converte piruvato e CO2 em
Metilmalonil CoA ²Cetoglutarato oxaloacetato (Figura 14.23). A enzi
ma contém uma molécula de biotina
ligada ao e-amino grupo de um resí
Metabolismo de ácidos Ciclo dos ácidos duo de lisina, por uma ligação ami
graxos de cadeia ímpar e tricarboxílicos da. A biotina liga CO2 em presença
icetoácidos de cadeia remificada COOi
de ATP e íons Mg2+, e depois o trans
CH2 fere para piruvato como um grupo
CH2
carboxila (p. 1106). Os níveis de pi
ruvato carboxilase são altos no fíga
C O do e no tecido nervoso, porque esses
S CoA tecidos têm um efluxo constante de
intermediários do ciclo TCA, que são
Succinil CoA usados para gluconeogênese no fíga
de
Biosintese
porfirina do e síntese de neurotransmissores
Ciclo dos ácidos
tricarboxílicos no tecido nervoso.
Acetoacetato
Alguns aminoácidos são fontes
Utilização de corpos cetônicos
de intermediários de quatro ou cinco
²Aminolevulinato carbonos. O glutamato é convertido
Succinato
Acetoacetil CoA pela glutamato desidrogenase em
α-cetoglutarato em mitocôndrias.
FIGURA 14.21 Fontes e destinos de succinil-CoA. Aspartato é convertido em oxaloace
576 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Aminoácidos Piruvato drias e da β-oxidação de ácidos graxos são

Acetil CoA determinantes efetivos da atividade do ciclo.
Segundo, como as desidrogenases do ciclo são
dependentes de um suprimento contínuo de
Aspartato Oxaloacetato Citrato
Aminoácidos NAD+ e FAD, suas atividades são muito estrei
tamente controladas pela cadeia respiratória,
que oxida NADH e FADH2. Como discutido na
Aminoácidos Fumarato αCetoglutarato Glutamato Seção 14.7, a atividade da cadeia respiratória
é acoplada obrigatoriamente com a geração
de ATP em reações de fosforilação oxidativa,
Succinil CoA
um processo chamado controle respiratório.
Consequentemente, a atividade do ciclo TCA é
muito dependente da velocidade de síntese de
ATP (e, portanto, da velocidade de transpor
Valina e isoleucina Propionil CoA
te de elétrons), que é fortemente afetada pela
FIGURA 14.22 Reações anapleróticas repõem intermediários do ciclo disponibilidade de ADP, fosfato e O2. Assim,
TCA. um agente inibidor ou qualquer condição me
tabólica que interrompa o suprimento de O2, o
tato por transaminação, enquanto valina e isoleucina suprimento contínuo de ADP ou a fonte de equivalentes
são quebradas a propionil-CoA, que entra no ciclo TCA de redução (por exemplo, substratos para o ciclo) re
como succinil-CoA. Aminoácidos derivados da quebra sulta em atividade diminuída do ciclo TCA. Em geral,
de músculo tornam-se uma fonte importante de malato esses mecanismos de controle do ciclo TCA fornecem
para gluconeogênese durante o jejum (p. 871). um controle grosseiro do ciclo.

Uma variedade de interações regulatórias mediadas

COOH por efetores entre vários intermediários ou nucleotídeos
CO
ATP + HCO3i
+ e enzimas individuais do ciclo foi postulada como exer
CH3 cendo um controle fino do ciclo. Alguns desses efetores
Piruvato são mostrados na Figura 14.24. Note que a relevância
fisiológica de muitas dessas interações regulatórias não
Acetil CoA (+) Piruvato Carboxilase
foi estabelecida.
COOH
A citrato sintase purificada é inibida por ATP, NADH,
CO succinil-CoA e derivados acil-CoA de cadeia longa; en
CH2 tretanto, esses efeitos não foram demonstrados em
COOi
Oxaloacetato Piruvato
NADH i i
FIGURA 14.23 Reação da piruvato carboxilase.
Acetil-CoA é um ativador essencial da piruvato carboxilase.
AcetilCoA

Citrato
Atividade
Ácidos Tricarboxílicos
do Ciclo dos Oxaloacetato i Isocitrato ATP
ADP

é Cuidadosamente
Regulada Malato αCetoglutarato
+
Ca2+ ++

Fumarato
Vários fatores regulam o ciclo
TCA. Primeiro, o suprimento de
unidades
do piruvato
acetil,
(pelasejam
glicólise)
derivadas
ou de Succinato Ca2+
+

ácidos graxos (pela β-oxidação),

NADH i
é crucial na determinação da i
Succinil CoA
velocidade do ciclo. Regulação GTP
i
do complexo
genase, do transporte
piruvatodedesidro-
ácidos

graxos para dentro das mitocôn FIGURA 14.24 Exemplos representativos de interações regulatórias do ciclo TCA.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
condições fisiológicas. O meio mais provável para regu
lar a reação da citrato sintase é a disponibilidade dos
substratos acetil-CoA e oxaloacetato. Como discutido,
concentrações muito baixas de oxaloacetato (menores
do que o Km para oxaloacetato da citrato sintase) estão
presentes nas mitocôndrias.
A isocitrato desidrogenase NAD+-ligada, frequente
mente considerada a enzima regulatória chave do ciclo
TCA, é estimulada por íons Ca2+, ADP e AMP, e é inibi
da por ATP e NADH. Consequentemente, em condições
de alta energia (ou seja, altas razões ATP/ADP + Pi e
NADH/NAD+),
a atividade dessa desidrogenase é inibi
da. Ao contrário, durante períodos de baixa energia, a
atividade dessa enzima e, consequentemente, do TCA,
é estimulada. O controle respiratório pela cadeia de
transporte de elétrons acoplado com a síntese de ATP,
portanto, regula o ciclo TCA na etapa da isocitrato de
sidrogenase NAD+-ligada por afetar os níveis de ADP e
NAD+.
O complexo α-cetoglutarato desidrogenase é inibi
do por ATP e GTP, NADH e succinil-CoA, enquanto
Ca2+ ativa o complexo em certos tecidos. Ao contrá
rio do complexo piruvato desidrogenase, o complexo
α-cetoglutarato desidrogenase não é regulado por uma
fosforilação mediada por proteína quinase.
A estimulação de ambas isocitrato e a-cetoglutarato
desidrogenases por Ca2+ ocorre em concentrações que
inciam a contração muscular e ativam fosforilase b du
FIGURA 14.25 Estrutura mitocondrial.
(a) Micrografia eletrônica de mitocôndrias em hepatócitos
de fígado de rato (× 39.600). (b) Micrografia eletrônica de
mitocôndrias em fibras musculares de coração de coelho (x
39.600).
• 577
rante a glicogenólise. Esses efeitos do Ca2+ asseguram
que o desenvolvimento de tensão e o suprimento de
energia no tecido muscular estejam integrados, seguin
do a estimulação nervosa.
14.5 ESTRUTURA E
COMPARTIMENTALIZAÇÃO
POR MEMBRANAS
MITOCONDRIAIS
As etapas finais da quebra de carboidratos e de áci-áci
dos graxos localizam-se em mitocôndrias,mitocôndrias, ondeonde aa ener-ener
gia liberada durante a oxidação de NADH e FADH2 é
transformada em energia química de ATP pelo proces
so de fosforilação oxidativa. Consequentemente, as
mitocôndrias são frequentemente chamadas de “casa
de força” da célula. O papel de um tecido em funções
metabólicas aeróbicas e sua necessidade de energia re
flete-se no número e na atividade de suas mitocôndrias
(Figura 14.25). O músculo cardíaco é muito aeróbico,
precisando de um suprimento constante de ATP. Apro
ximadamente metade do volume citoplasmático de cé
lulas cardíacas consiste de mitocôndrias, que contêm
numerosas invaginações da membrana interna, chama
das cristas e, consequentemente, uma alta concentra
ção dos complexos enzimáticos da cadeia de transporte
de elétrons. O fígado é também muito aeróbico, com
Cortesia de Dr. W. B. Winborn, Department of Anatomy, The
University of Texas Health Science Center at San Antonio,
e Electron Microscopy Laboratory, Department of Pathology,
The Universty of Texas Health Science Center at San Antonio.
578 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Espaço em músculo cardíaco são oblongas ou cilíndricas e

Membrana mitocondrial intermembranas
contêm cristas mais numerosas do que as mitocôn
interna
drias do fígado.

Membrana mitocondrial
externa
Crista
Matriz
FIGURA 14.26 Diagrama dos compartimentos submitocondriais.
Esferas verdes representam a localização da porção F1 da ATP sintase
da membrana mitocondrial interna.
cada hepatócito de mamíferos contendo 800–2.000 mi
tocôndrias. Ao contrário, eritrócitos não contêm mito
côndrias e obtêm energia apenas da glicólise.
Mitocôndrias têm diferentes formas, dependendo
do tipo celular. Na Figura 14.25, as mitocôndrias do
fígado são quase esféricas, enquanto as encontradas
As Membranas Mitocondriais
Interna e Externa Têm Diferentes
Composições e Funções
As mitocôndrias contêm uma membrana exter
na e uma membrana interna estrutural e funcio
nalmente mais complexa (Figura 14.26); o espaço
entre as membranas é o espaço intermembranas.
As enzimas envolvidas na transferência de energia
da ligação γ-fosforil do ATP, como adenilato quina
se, creatina quinase e nucleosídeo difosfato quinase,
estão localizadas no espaço intermembranas (Tabe
la 14.4). A membrana externa consiste em cerca de
30–40% de lipídeos e 60–70% de proteínas, com relati
vamente poucas proteínas enzimáticas ou de transpor
te. É rica na proteína integral de membrana chamada
porina (ou VDAC, canal de ânions voltagem-dependen
te), consistindo em folhas β que formam um canal que
permite a passagem através da membrana de partícu
las de até 10 kDa. Monoamina oxidase e quinurenina

TABELA 14.4 Enzimas de Subcompartimentos Mitocondriais

Membrana Externa Espaço Intermembranas Membrana Interna Matriz

Monoamina oxidase
Quinurenina hidroxilase
Nucleosídeo difosfato
quinase
Fosfolipase A
Acil graxo-CoA sintetase
NADH:citocromo c
redutase (rotenona
insensível)
Colina fosfotransferase
Adenilato quinase
Nucleosídeo difosfato
quinase
Creatina quinase
Succinato desidrogenase
F1F0 ATP sintase
NADH desidrogenase
β-Hidroxibutirato
desidrogenase
Citocromos b, c1, c, a, a3
Carnitina:acil-CoA
transferase
Adenina-nucleotídeo
translocase
Transportadores de mono-, Malato desidrogenase
di- e e tricarboxilato
Transportadores de
glutamato-aspartato
Glicerol 3-fosfato
desidrogenase
Complexo piruvato
desidrogenase
Citrato sintase
Isocitrato desidrogenase
Complexo α-cetoglutarato
desidrogenase
Aconitase
Fumarase
Succinil-CoA sintase
Sistema de β-oxidação de
ácidos graxos
Glutamato desidrogenase
Glutamato-oxaloacetato
transminase
Ornitina transcarbamoilase
Carbamoilfosfato sintetase I
Enzimas da síntese de heme
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 579

hidroxilase, de importância no tecido nervoso para a Reações de Oxidação-Redução

remoção de neurotransmissores, estão localizadas na
superfície externa da membrana externa.
A membrana interna consiste em 80% de proteínas e
é rica em ácidos graxos insaturados. Além disso, a car
diolipina (difosfatidilglicerol) está presente em altas
concentrações. Os complexos enzimáticos do transpor
te de elétrons e da fosforilação oxidativa localizam-se
nessa membrana, bem como várias desidrogenases e
diversos sistemas de transporte envolvidos na trans
ferência de substratos, intermediários metabólicos e
adenina-nucleotídeos entre o citosol e a matriz. A mem
brana interna parece ser invaginada em dobras ou cris
tas, que aumentam a área de superfície (Figura 14.26).
O espaço dentro da membrana interna, a matriz,
contém as enzimas do ciclo TCA, com exceção da suc
cinato desidrogenase, que fica ligada à membrana in
terna, as enzimas da oxidação de ácidos graxos e algu
mas enzimas da síntese de porfirina (p. 814) e de ureia
(p. 779). Além disso, DNA mitocondrial (mtDNA),
ribossomos e proteínas necessárias à transcrição do
mtDNA e à tradução do mRNA localizam-se na matriz.
14.6 CADEIA DE TRANSPORTE
DE ELÉTRONS
Durante as reações de oxidação de ácidos graxos
e do ciclo TCA, equivalentes de redução derivados da
oxidação de substratos são transferidos para NAD+ e
FAD (formando NADH e FADH2) que são, então, oxida
dos na cadeia de transporte de elétrons, um sistema de
transportadores de elétrons localizados na membrana
interna (Figura 14.27). Em presença de O2, a cadeia de
transporte de elétrons converte equivalentes de redu
ção em energia utilizável, como ATP, por fosforilação
oxidativa. A oxidação completa de NADH e FADH2 na
cadeia de transporte de elétrons produz aproximada
mente 2,5 e 1,5 moles de ATP por mole de equivalente
de redução transferido para O2, respectivamente.
O transporte mitocondrial de elétrons consiste de
uma sequênciaência dede reaçõesreações dede oxidação-reduçãooxidação-redução liga-liga-liga
das. Tais reações transferem elétrons de um doador
de elétrons adequado (redutor) para um aceptor de
elétrons adequado (oxidante). Em algumas reações de
oxidação-redução, apenas elétrons são transferidos do
redutor para o oxidante (por exemplo, transferência de
elétrons entre citocromos).
Citocromo c (Fe2+) + citocromo a (Fe3+) →
citocromo c (Fe3+) + citocromo a (Fe2+)
enquanto em outros, ambos elétrons e prótons (átomos
de hidrogênio) são transferidos (por exemplo, transfe
rência de elétrons entre NADH e FAD).
NADH + H+ + FAD → NAD+ + FADH2
Um oxidante e um redutor formam uma dupla redox,
ou par. A facilidade com que um doador de elétrons (re
dutor) doa seus elétrons para um aceptor de elétrons
(oxidante) é expressa como o potencial de oxidação-re
dução do sistema. Isso é medido em volts, como uma for
ça eletromotiva (emf) de uma hemicélula composta de
um par de oxidação-redução, quando comparada a uma
hemicélula padrão de referência (geralmente a reação do
eletrodo de hidrogênio). O potencial do eletrodo de hi
drogênio padrão é estabelecido, por convenção, em 0,0V
em pH 0,0; entretanto, em sistemas biológicos nos quais
o pH é 7,0, o potencial de referência do hidrogênio é –0,42
V. Os potenciais para uma variedade de importantes re
ações bioquímicas são tabulados na Tabela 14.5. Para in
terpretar os dados da tabela, lembre-se que o redutor de
um par redox com um potencial negativo grande doará
seus elétrons mais facilmente do que pares redox com
potenciais negativos menores ou positivos. Compostos
com potenciais negativos grandes são agentes redutores
fortes. Ao contrário, um oxidante forte (por exemplo,
um caracterizado por um potencial positivo grande) tem
uma afinidade muito alta por elétrons e oxida compostos
com potenciais padrões mais negativos.

Complexo I

NADH desidrogenase
_1
FMN 2 O2 H2O
Centros Fe-S Complexo III Complexo IV

NADH:ubiquinona (Q)
Complexo de citocromo bc1 Complexo de citocromo aa3
óxido redutase
Reserva de Heme tipo 2b Heme tipo 2a
Citocromo c
UQ/UQH2 Centro Fe-S Rieske Íons Cu
Heme tipo c (cyt c1)
Complexo II
Ubiquinol (QH2):citocromo c Citocromo c oxidase
Succinato desidrogenase óxido redutase
FAD (covalente)
Centros Fe-S
Heme tipo b

óxido redutase

FIGURA 14.27Visão geral dos complexos e das vias de transferência de elétrons na cadeia mitocondrial de transporte de
elétrons.
580 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
TABELA 14.5 Potenciais Padrões de Oxidação-Redução para Várias Reações Bioquímicas
Sistema de Oxidação-Redução
Acetato + 2H+ + 2e–  acetaldeído
2H+ + 2e–  H2
Acetoacetato + 2H+ + 2e–  β-hidroxibutirato
NAD+ + 2H+ + 2e–  NADH + H+
Acetaldeído 2H+ + 2e–  etanol
Piruvato 2H+ + 2e–  lactato
Oxaloacetato 2H+ + 2e–  malato
Coenzima Qox
Citocromo b (Fe3+)
+ 2e–+e–coenzima
 citocromo
Qred b (Fe2+)
Citocromo c (Fe3+) + e–  citocromo c (Fe2+)
Citocromo a (Fe3+) + e–  citocromo a (Fe2+)
½O2 + 2H+ + 2e–  H2O
A equação de Nernst caracteriza a relação entre po
tencial de oxidação-redução padrão de um par redox
(E′0), potencial observado (E) e a razão de concentra
ções entre oxidante e redutor do sistema.
E = E′0 + 2,3 (RT/nf)log([oxidante]/[redutor])
onde E é igual ao potencial observado e E′0 é o poten
cial padrão quando todos os reagentes estão presentes
em condições padrão. R é a constante dos gases de
8,3 J/mol × °K, T é temperatura absoluta em unidades
kelvin (K), n é o número de elétrons sendo transferidos
e f é a constante de Faraday de 96.500 J/V.
A partir dos potenciais padrões de oxidação-redu
ção de uma grande variedade de reações bioquími
cas, é possível prever a direção do fluxo de elétrons ou
a transferência quando mais do que dois pares redox
estão ligados pela enzima apropriada. Por exemplo, a
Tabela 14.5 mostra que o par NAD+–NADH tem um
potencial padrão de –0,32 V, e o par piruvato-lactato
tem um potencial padrão de –0,19 V. Isso significa que
elétrons fluirão de NAD+–NADH para piruvato-lactato,
contanto que a lactato desidrogenase esteja presente,
como indicado aqui.
Piruvato + NADH + H+ → lactato + NAD+
Equivalentes de redução são produzidos em rea
ções de desidrogenases ligadas a NAD+ e FAD, que têm
potenciais padrões iguais ou próximos aos do NAD+–
NADH. Os elétrons são subsequentemente transferidos
pela cadeia de transporte de elétrons, que tem como
seu aceptor final o par O2–água,água, comcom umum potencialpotencial re-re
dox padrão de +0,82 V.
Potencial Padrão de Oxidação
-Redução
E!0 (V)
–0,60
–0,42
–0,35
–0,32
–0,20
–0,19
–0,17
+0,10
+0,12
+0,22
+0,29
+0,82
Variações de Energia Livre em Reações
Redox
Diferenças em potencial de oxidação-redução entre
dois pares redox sãosão semelhantessemelhantes àsàs variaçõesvariações dedede ener-ener-ener
gia livre em reações químicas porque ambas as quanti
dades dependem da concentração de reagentes e pro
dutos da reação, e existe a seguinte relação:
DG0! =–nfDE′0
Usando essa expressão, a variação de energia livre
para reações de transporte de elétrons pode ser cal
culada se a diferença de potencial entre dois pares de
oxidação-redução for conhecida. Portanto, para a ca
deia de transporte de elétrons mitocondrial, na qual
elétrons são transferidos entre o par NAD+–NADH
(E′0 = –0,32 V) e o par½ O2–H2O (E′0 = +0,82 V), a varia
ção de energia livre para esse processo pode ser calculada.
DG0! = nfD E′0 = –2 × 96,5 kJ/V × 1,14 V
DG0! =–219 kJ/mol
na qual 96,5 é a constante de Faraday em kJ/V e n é o
número de elétrons transferidos; por exemplo, no caso
do NADH → O2, n = 2. A energia livre disponível pela
diferença de potencial entre NADH e O2 na cadeia de
transporte de elétrons é capaz de gerar energia mais do
que suficiente para sintetizar três moléculas de ATP por
dois equivalentes de redução ou dois elétrons transpor
tados para O2. Além disso, por causa do sinal negativo
da energia livre disponível na transferência de elétrons,
esse processo é exergônico e acontece, se as enzimas
necessárias estiverem presentes.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 581

Transporte Mitocondrial de Elétrons consistem de transportadores de elétrons que incluem

flavoproteínas, que contêm FMN ou FAD fortemente li
É um Sistema com Múltiplos gados e que podem transferir um ou dois elétrons, as
c, a e a3), contendo
proteínas que transferem um elétron (citocromos
heme citocromos do Fe2+ b, c1,
Componentes do heme,
As etapas finais da oxidação geral de alimentos – proteínas ferro-enxofre, que contêm Fe e Sinorgânicos
carboidratos, gorduras e aminoácidos – resultam na ligados e transferem um elétron, e cobre no comple
formação de NADH e FADH2 na matriz. A cadeia de xo IV (citocromo c oxidase), que transfere um elétron.
transporte de elétrons oxida esses cofatores reduzidos UQ participa de reações que transferem um ou dois elé
transferindo elétrons, em uma série de etapas, para O2, trons.
o aceptor final de elétrons, enquanto captura a energia
livre das reações para dirigir a síntese de ATP (Figura
14.27). Durante a remoção de elétrons das coenzimas,
Complexo I: NADH-Ubiquinona
prótons são bombeados da matriz para o espaço inter Óxido-redutase
membranas, para formar um gradiente eletroquímico
através da membrana interna, que fornece energia para O complexo I, o mais complicado encontrado em
síntese de ATP. Os transportadores que transferem elé mitocôndrias de mamíferos, contém pelo menos 40 po
trons do NADH para O2 têm potenciais redox padrões lipeptídeos diferentes, com uma massa total de apro
que cobrem a faixa de –32 V, o do doador de elétrons ximadamente 1 MDa. Um complexo I mais simples
mais eletronegativo NADH, até +0,82 V, o do aceptor contendo 14 subunidades, que catalizam reações seme
de elétrons mais eletropositivo O2 (Figura 14.28). Os lhantes de transferência de elétrons e bombeamento
transportadores de elétrons mitocondriais, entretanto, de prótons, está presente em membranas bacterianas,
não são organizados em um arranjo linear, mas ficam onde a estrutura e a atividade enzimática foram inten
agrupados em quatro grandes complexos (complexos I– samente investigadas. O complexo I transfere elétrons
IV), que catalisam diferentes reações parciais da cadeia do NADH para a ubiquinona (coenzima Q), acoplado
ao transporte de quatro prótons através da membrana,
de transporte de elétrons (ver Figura 14.27).
contribuindo assim para a força próton-motiva necessá
O complexo I, NADH-ubiquinona óxido-redutase, ria para a síntese de ATP. Ambas as formas do comple
catalisa a transferência de elétrons do NADH para a xo I, de mamífero e bacteriana, possuem uma estrutura
ubiquinona (UQ) ou coenzima Q (CoQ); o complexo característica em L, com um longo braço hidrofóbico lo
II, succinato-ubiquinona óxido-redutase ou succinato calizado na membrana e um braço periférico hidrofílico
desidrogenase, transfere elétrons do succinato para a que se projeta na matriz mitocondrial (Figura 14.29).
coenzima Q; o complexo III, ou o complexo citocromo Elétrons são transferidos do NADH para FMN, flavina
bc1, ubiquinol-citocromo c redutase, transfere elétrons mononucleotídeo (ver Figura 10.32, p. 406), que está
do ubiquinol (forma reduzida da ubiquinona, denotada fortemente ligada a uma subunidade no braço hidrofíli
como CoQH2 ou UQH2) para o citocromo c; e o comple co do complexo I.
xo IV, citocromo c oxidase, transfere elétrons do cito
NADH + H+ + FMN → NAD+ + FMNH2
cromo c para o O2 (ver Figura 14.27). Outro complexo, a
ATP sintase, ou complexo V, usa a energia do gradiente Os elétrons são então transferidos, um de cada vez,
eletroquímico para a síntese de ATP. Os complexos I–IV via uma série de centros FeS, de ambos os tipos 2Fe2S
e 4Fe4S (Figura 14.30), localiza
dos em diferentes subunidades
−0.4 FeS do braço hidrofílico do complexo
NAD+/NADH FMN FeS Sítio I de I. Esses grupos de ferro-enxofre
o
−0.2 fosforilação subsequentemente reduzem uma
ã
u
ç Coenzimq Q Citocromo b ubiquinona embebida na membra
d
e 0 FeS CoenzimqQH2 FeS Sítio II de na para formar ubiquinol (Figura
r-
o fosforilação
ãç 14.31). Durante a transferência
a
d
i +0.2
x
Citocromo Citocromo c/Citocromo c Cytochrome a de dois elétrons para ubiquinona
o
e c1 Fe3+ Fe2+ Cu2+ pelo complexo I, quatro prótons
d
l são também deslocados através da
a
ic
n
e a Sítio III de membrana interna para o espaço
t +0.6 Citocromo 3 fosforilação intermembranas por um mecanis
o
P +0.4
mo que sugere envolver proteínas
+0.8 O2/H2O localizadas no braço hidrofóbico
da membrana do complexo I.
FIGURA 14.28 Potenciais de oxidação-redução dos transportadores da cadeia
mitocondrial de transporte de elétrons listados do mais negativo (NAD+/NADH) Demonstrou-se que mutações
para o mais positivo (O2/H2O). nas subunidades do complexo Ile
582 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

FIGURA 14.29 Modelo da estrutura cristalina do domínio hidrofílico do

complexo I.
(a) Visão lateral com o braço da membrana localizado abaixo e estendendo para
a direita. Cada subunidade é representada por uma cor, com FMN indicado por
esferas vermelhas. (b) Visão indicando a ligação proposta do domínio periférico
com o domínio da membrana do complexo I.
Reproduzido com permissão de Sazanov, L. A. Biochemistry 46:2276, 2007.
Copyright© (1977) por American Chemical Society.

O
CH3
CH3O CH3 CH3

O Coenzima oxidada CH2]nH

[CH2 QCHC
O

ei + H+

(a)
OH
CH3
CH3O CH3 CH3

O . [CH2 CHCCH2]nH

O
Forma semiquinona de coenzima Q (radical livre)

ei + H+

OH
CH3
CH3O OH CH3
CH3
(b) O [CH2 CHC CH2]nH

vam a várias doenças neurodegenerativas. Além disso, Coenzima Q reduzida

demonstrou-se que o complexo I é uma importante fon-fon
fon
te
danificar
de espécies
o DNAreativas
mitocondrial
de oxigênio
e que podem
(ROS) que
ser apodem
causa FIGURA 14.31 Oxidação-redução de ubiquinona
(coenzima Q).
do envelhecimento (ver Seções 14.9 e 14.10). Note que ubiquinona pode aceitar um elétron por vez, forman
do um intermediário semiquinona.

Cys Cys
Cys
Cys
Cys
Cys Cys
Cys Cys
Cys
Fe1S0Cys4 Fe2 Cys
S2Cys4

Cys

Fe4S4Cys4

Enxofre
Ferro

Enxofre em cisteina

FIGURA 14.30 Estruturas dos centros ferro-enxofre.

Amarelo, enxofre inorgânico; cinza, enxofre em cisteína; e vermelho, ferro.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
Complexo II: Succinato-Ubiquinona
Óxido-Redutase
O complexo II, mais conhecido como succinato desi
drogenase, é constituído por uma subunidade de 70 kDa
que contém FAD covalentemente ligado a um resíduo
de histidina, uma subunidade de 30 kDa que contém
três centros ferro-enxofre, e duas pequenas proteínas
hidrofóbicas. Na oxidação de succinato a fumarato, dois
elétrons e dois prótons são transferidos para o FAD (Fi
gura 14.32). O FADH2 transfere elétrons para ubiquino
na via centros FeS do complexo II nas reações.
Succinato → fumarato + 2 H+ + 2 e–
UQ + 2 H+ + 2 e– → UQH2
Geral Succinato + UQ → fumarato + UQH2
DE0! = 0,029 V DG0! =–5,6 kJ mol–1
A quantidade de energia livre liberada nessas reações
é insuficiente para o bombeamento de prótons através
da membrana, de modo que nenhum ganho de energia
livre acontece no complexo II. A Figura 14.32 fornece
uma representação esquemática desses eventos.
Outras Desidrogenases Flavoproteínas
Mitocondriais
Outras desidrogenases mitocondriais fornecem elé
trons para a cadeia de transporte de elétrons no nível
da ubiquinona. Glicerol 3-fosfato, formado a partir do
glicerol liberado por hidrólise de triacilgliceróis ou por
redução da di-hidroxiacetona fosfato produzida duran
te a glicólise, é oxidado pela glicerol 3-fosfato desidro
genase (Figura 14.32).
Glicerol 3fosfato
FAD
FeS FeS UQ
FeS
FMN
FeS
FAD
Succinato
NADH NAD+
ETF
FAD
Acil graxo CoA
FIGURA 14.32 Redução da ubiquinona (UQ) na membrana mitocondrial
interna pelas flavoproteínas NADH, succinato, glicerol 3-fosfato e acil
graxo-CoA desidrogenases.
• 583
Glicerol 3-fosfato + FAD →
di-hidroxiacetona fosfato + FADH2
Essa flavoproteína, uma única cadeia polipeptídi
ca, localiza-se na face externa da membrana interna
e transfere elétrons diretamente para a ubiquinona,
na membrana. A importância da glicerol 3-fosfato de
sidrogenase no transporte de equivalentes de redução
do NADH do citosol para a cadeia de transporte de elé
trons mitocondrial será discutida na Seção 14.8.
A acil-CoA desidrogenase, uma flavoproteína que
catalisa a primeira etapa da β-oxidação de ácidos gra
xos, transfere elétrons do acil graxo-CoA para FAD, que
depois transfere elétrons para a flavoproteína transferi
dora de elétrons (ETF, electron transferring flavopro
tein). Os elétrons são, então, transferidos da ETF para
ETF-ubiquinona óxido-redutase, que transfere elétrons
diretamente para a ubiquinona na membrana interna.
A Figura 14.32 ilustra a redução do total de ubiquinona
pelo complexo I, pelo complexo II, pela glicerol 3-fosfato
desidrogenase e pela ETF-ubiquinona óxido-redutase.
O ubiquinol é, em seguida, oxidado pelo complexo III.
Complexo III: Ubiquinol-Citocromo c
Óxido-Redutase
O complexo III, ou complexo citocromo bc1, catalisa
a transferência de dois elétrons do ubiquinol para o cito
cromo c, com o deslocamento de quatro prótons através
da membrana. Em mamíferos, esse complexo enzimáti
co é composto por 11 subunidades, das quais três têm
grupos prostéticos que funcionam como centros redox.
Estes são o citocromo b, que contém dois hemes, b562
e b566; o citocromo c1, que contém um
grupo heme; e a proteína ferro-enxofre
Rieske, que contém um grupo 2Fe2S.
Espaço intermembranas
Lado P A resolução da estrutura completa do
complexo III por cristalografia de raios
-X foi conseguida recentemente (Figura
14.33). O complexo dimérico (250 kDa
FeS
para cada monômero) tem forma de
pera e tem um grande domínio que se
projeta 75 Å na matriz mitocondrial, e
FAD Matriz um domínio menor contendo os grupos
Lado N
de cabeça da proteína ferro–enxofre
Rieske e o citocromo c1 projetando-se
no espaço intermembranas. O domínio
transmembrânico de cada monômero do
complexo III é composto por oito α-hé
lices da proteína hidrofóbica citocromo
b, mais as hélices de ancoragem à mem
brana da proteína ferro–enxofre Rieske,
o citocromo c1, e outras subunidades de
cada monômero. A oxidação do ubiqui
nol ocorre no sítio QO, localizado no lado
P da membrana mitocondrial, voltado
para o espaço intermembranas, com a
584 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

FIGURA 14.33 Modelo da estrutura

cristalina do complexo dimérico
citocromo bc1.
As α-hélices do citocromo b (verde cla
ro) formam o domínio transmembrânico
do complexo. O complexo se projeta 75 Å
para a matriz e 38 Å para o espaço inter
membranas. As cores que identificam as
subunidades são mostradas à esquerda.
ISP é proteína ferro–enxofre.
Reproduzido com permissão de Kim, H.,
Xia, D., Yu, C.-A., Xia, J.-Z., Kachurin,
A. M., Zhang, L., Yu, L. e Deisenhofer, J.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8026, 1998.
Copyright© 1998, National Academy of
Sciences, USA. Figura generosamente ce
dida por Dr. J. Deisenhofer.

transferência de um elétron para a proteína ferro–enxo Citocromos

fre e do segundo elétron para bL e bH, com a liberação de
dois prótons no espaço intermembranas. O mecanismo Os citocromos são proteínas que contêm um grupo
proposto para a transferência de elétrons e prótons no heme fortemente ligado à proteína (p. 814). Ao contrá
complexo III, denominado ciclo Q, é descrito na Figura rio do heme da hemoglobina ou da mioglobina, no qual
14.34 e no Um Olhar Mais Atento 14.1. o ferro do heme permanece no estado Fe2+ durante o
transporte de oxigênio, o ferro do heme de um cito
cromo é alternadamente oxidado (Fe3+) ou reduzido
[Q Espaço (Fe2+), quando funciona na cadeia de transporte de elé
2H+ Intermembranas
Stig Lado P
trons. Os citocromos de mitocôndrias de mamíferos são
–p•] e–
designados por a, b, e c, com base na banda α de seu
Sítio Q0 Q ISP C1 C
espectro de absorção e no tipo de grupo heme ligado
Sítio Q1 Q Q
bLe–2H+ Myxo à proteína (Figura 14.35). A banda de absorção e o po
QH2 tencial redox padrão dependem da estrutura do heme
e de seu ambiente na proteína. O citocromo b e outros
citocromos tipo b contêm o mesmo ferro–protoporfiri
bH
na IX (Figura 14.35) encontrado na hemoglobina e na
Anti
mioglobina; entretanto, esses hemes ficam mergulha
–
n• QH2 dos na membrana e não podem ligar O2. Os citocromos
tipo c contêm heme c, que é covalentemente ligado a
Matriz
LAdo N dois resíduos de cisteína da proteína por ligações tioés
ter envolvendo cadeias laterais vinil da protoporfirina
FIGURA 14.34 O ciclo Q. IX. Os citocromos tipo a contêm heme a, uma forma
O ubiquinol (QH2) é oxidado com a transferência de um elé modificada da protoporfirina IX (p. 815-816), na qual
tron para a proteína ferro–enxofre, liberação de dois prótons um grupo formil e uma cadeia lateralisoprenoide foram
no espaço intermembranas e formação da semiquinona (Q–p·)
no
marlado
umaQO,semiquinona
que transfere
(Q–n·)
elétrons
no via hemes bL e bH para for
adicionados. Duas formas de citocromo a estão presen
sítio Qi. Uma segunda molécula tes na citocromo c oxidase, complexo IV.
de QH2 é oxidada no sítio QO, com liberação de dois prótons e
transferência de um elétron para a proteína ferro–enxofre e
para Q–n· para formar QH2, com a captação de dois prótons da
matriz. São indicados sítios de inibidores mixotiazol (Myxo),
stigmatelina (Stig) e antimicina (Anti).
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 585

UM OLHAR MAIS ATENTO 14.1

O Ciclo Q para Transferência de Elétrons e Bombeamento de Prótons no Complexo III

O complexo III contém dois hemes tipo b, um bL de
potencial alto (+0,50 V) e um bHde potencial baixo (0,10
V), mais o citocromo c1. A transferência de elétrons por
esse complexo é mais bem explicada pelo ciclo Q, no
qual quatro prótons são deslocados através da mem
brana para cada dois elétrons transferidos do ubiquinol
para o citocromo c (Figura 14.38). Para que a transfe
rência de elétrons continue, são necessários dois sítios
de ligação de ubiquinona ou ubiquinol no complexo bc1:
um sítio de oxidação de ubiquinol (QO), envolvendo o
heme b de baixo potencial (heme bL), localizado no lado
positivo (P) da membrana, onde inibidores como mi
xotiazol e stigmatelina se ligam; e um sítio redutor de
ubiquinona (Qi), envolvendo o heme b de alto potencial
(heme bH) localizado no lado negativo (N) da membra
na, onde inibidores como antimicina se ligam. Oxidação
de ubiquinol no sítio QO resulta na transferência de um
elétron para o grupo 2Fe2S da proteína ferro–enxofre,
com a liberação de dois prótons para o espaço inter
membranas. A proteína ferro–enxofre então transfere
um elétron para o heme do citocromo c1. O ânion ubi
semiquinona fortemente redutor, formado no sítio QO
após a transferência do primeiro elétron do ubiquinol,
rapidamente transfere um elétron para o citocromo bL,
que então transfere um elétron para o heme de alto po
tencial do citocromo bH no lado Qi. O citocromo bH re
duzido então transfere esse elétron para ubiquinona no
sítio Qi, para formar uma ubisemiquinona estável. Para
completar o ciclo Q, uma segunda molécula de ubiqui
nol é oxidada no sítio QO, com a liberação de outros dois
prótons e a transferência de um elétron para a proteína
ferro–enxofre e o segundo elétron para o heme bL. O
heme bL transfere um elétron para bH e finalmente para
a ubisemiquinona do sítio Qi para formar ubiquinol, com
a captação de dois prótons da matriz. O ciclo Q explica
como, durante a oxidação de dois ubiquinóis no sítio QO,
quatro prótons são liberados no espaço intermembra
nas, enquanto dois prótons são captados do lado da ma
triz para reduzir ubiquinona no sítio Qi, um rendimento
final de dois prótons liberados por ubiquinol oxidado.

CH3 CH3 CH3

CH2 C CH2 C CH C

CHCH2 CH CH2 CH CH2 2 CH CH3

HO CH3

H3C CH CH2

N N

Fe3+

N N CH

O C 3

H
CH2 CH2
Proteína
HOOC CH2 CH2COOH
Cys (14)
Heme a
CH2 S Cys (17)

CH CH3 H C CH3 CH3

S

H3C CH CH2 H3C C CH3

N N N N H
Fe3+ Fe3+

H N N CH N N

3C CH3 3 CH3

CH2 CH2 CH2 CH2

HOOCCH2 CH2COOH HOOC CH2 CH2COOH

FIGURA 14.35 Estruturas dos heme a,
heme b e heme c. Heme b Heme c
586 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Citocromo cÉ um Transportador Móvel de O citocromo c, como a ubiquinona, é um transpor

Elétrons
Elétrons são transferidos pelo complexo III por cito
cromo c, uma proteína hidrofílica globular de 13 kDa.
O grupo heme planar localiza-se no meio da proteína,
circundado por resíduos hidrofóbicos e covalentemente
ligado a dois resíduos conservados de cisteína, por meio
de ligações vinil éter (Figura 14.35). O ferro do heme é
coordenado com um nitrogênio de uma histidina e um
átomo de enxofre de uma metionina, impedindo assim
a interação do heme com O2 (Figura 14.36).
Proteína
CH3 S Metioninai80
N N
Fe3+
N N
N montagem do complexo.
Histidinai18
tador móvel de elétrons. É ligado fracamente por for
ças eletrostáticas à face externa da membrana interna,
onde se liga ao citocromo c1 do complexo III e aceita
elétrons dele. O citocromo c reduzido, então, se move ao
longo da superfície da membrana para interagir com a
subunidade II da citocromo c oxidase, por ligações ele
trostáticas, e doa elétrons ao sítio CuA.
Complexo IV: Citocromo c Oxidase
O complexo IV transfere elétrons do citocromo c
para O2, o aceptor final de elétrons, para formar água,
acoplado ao deslocamento de prótons através da mem
brana. Esse complexo de mamíferos é composto por 13
subunidades, com uma massa total de 200 kDa, e con
tém dois citocromos, a e a3, e dois centros de cobre,
conhecidos como CuA e CuB. Uma citocromo c oxidase
mais simples, contendo apenas três ou quatro subu
nidades, que catalisa reações semelhantes de trans
ferência de elétrons e bombeamento de prótons, está
presente em membranas bacterianas. As três subuni
dades são homólogas às três subunidades maiores da
citocromo c oxidase de mamíferos, que são codificadas
pelo DNA mitocondrial (mtDNA). As demais subunida
des do complexo IV são codificadas pelo DNA nuclear
e podem ser subunidades regulatórias ou funcionar na

N A estrutura cristalina de uma citocromo c oxidase

bacteriana e do complexo IV isolado de mitocôndrias de
coração bovino foi esclarecida (Figura 14.37). A subu
Proteína nidade I, a maior, contém 12 hélices transmembrânicas,
mas não tem nenhum domínio extramembrânico signi
ficativo. Dois grupos heme, a e a3, são ligados à subuni
FIGURA 14.36 Seis posições de coordenação do
citocromo c.

FIGURA 14.37 Modelo da

estrutura cristalina da
citocromo cdenitrificans.
Paracoccus oxidase da bactéria

A subunidade I (12 hélices trans

membrânicas) é amarela, a subuni
dade II (duas hélices transmembrâ
nicas) é púrpura, e a subunidade III
(sete hélices transmembrânicas)
é azul, com um fosfolipídeo mer
gulhado em rosa. O fragmento de
anticorpo usado para direcionar a
cristalização é azul claro.
Reproduzido com permissão de
Iwata, S., Ostermeier, C., Lu
dwig, B., Michel, H., et al. Nature
376:660, 1995. Copyright© (1995),
Macmillan Magazines Limited. Fi-
gura generosamente cedida pelo
Professor S. Iwata.

dade I, com o heme coordenado por átomos de nitrogê
nio de resíduos conservados de histidina. Os planos de
ambos os hemes ficam perpendiculares à membrana. A
subunidade Itambém contém um átomo de cobre (CuB)
que, com o heme a3, forma um centro binuclear envolvi
do na transferência de elétrons do heme a para O2 (Fi
gura 14.38). A subunidade II tem um domínio grande
que se projeta da face citosólica da membrana interna,
onde se liga citocromo c reduzido, e contém dois átomos
de cobre ligados por grupos sulfidrila a dois resíduos de
cisteína (chamados CuA). A subunidade III contém sete
hélices transmembrânicas com domínios extramemb-
rânicos insignificantes, mas nãonão possuipossuipossui nenhumnenhumnenhum trans-trans-trans
portador redox. As subunidades II e III localizam-se em
lados opostos da subunidade I; o papel da subunidade III
não está esclarecido. Elétrons são transferidos do cito
cromo c reduzido primeiro para o sítio CuA, depois para
o heme a e, finalmente, para o centro binuclear conten
do CuB e heme a3, onde ocorre a transferência de quatro
elétrons para o oxigênio (Figura 14.39 e Um Olhar Mais
Atento 14.2). A transferência de quatro elétrons para
formar água resulta na captação de quatro prótons da
matriz para reduzir oxigênio e no movimento de quatro
prótons através da membrana mitocondrial, contribuin
do com o gradiente eletroquímico (Figura 14.39).
His His
2+
CuB N N
Fe3+
His L
N N
&REUH´%µ +HPHa
FIGURA 14.38 Centro binuclear da citocromo c oxidase
indicando heme a3 e CuB. L é um ligante desconhecido,
mas proposto.
Inibidores da Cadeia de Transporte
de Elétrons
Uma imagem dinâmica da cadeia de transporte de
elétrons se desenvolveu com a ampliação do conheci
mento da química detalhada dos diferentes complexos
da cadeia respiratória (Figura 14.40). Cada complexo
existe independentemente na membrana interna e é
livremente móvel. Os complexos I e II, e as outras fla
voproteína desidrogenases, difundem na membrana e
transferem elétrons para a ubiquinona da membrana
(pool). O ubiquinol também se difunde livremente na
membrana e é oxidado pelo complexo III. Elétrons são
transferidos do complexo III para o citocromo c, que se
move ao longo da superfície da membrana até o com
plexo IV, onde seus elétrons são transferidos para O2.
CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 587
Aceita-se, atualmente, que a transferência de dois elé
trons do NADH para O2 resulte no deslocamento de 10
prótons através da membrana, quatro em cada um dos
complexos I e IV e dois no complexo III. O gradiente ele
troquímico assim formado fornece a energia potencial
que é usada para direcionar a síntese de ATP pela ATP
sintase (p. 589).
4Cytc
Espaço intermembranas
Fe Lado P
4ei
4H+
CuA 4ei
Fe
4ei Membrana
Fe CuB
4H+ O2 2H2O 4H+ Matriz
Lado N
(Substrato) (bombeado)
FIGURA 14.39 Vias de transferência de elétrons pela
citocromo c oxidase.
His
O citocromo c liga-se à superfície da subunidade II e transfe
re elétrons para o CuA. Elétrons são transferidos de CuA para
heme a e, depois, para o centro binuclear (heme a3 e CuB),
onde oxigênio é reduzido a água. Quatro prótons são trans
feridos para o centro binuclear para redução de oxigênio, e
quatro prótons são bombeados através da membrana por um
canal diferente.
A Figura 14.40 indica os sítios onde inibidores es
pecíficos se ligam e bloqueiam o fluxo de elétrons. Ro
tenona, um inseticida comumente usado, liga-se este
quiometricamente ao complexo I e impede a redução da
ubiquinona. Piericidina, Amital e outros barbituratos,
incluindo halotanos usados em anestésicos, também
inibem o complexo I por impedirem a transferência de
elétrons dos centros ferro-enxofre para a ubiquinona. O
complexo II é inibido por carboxina e tenoiltrifluoroace
tona, bem como por malonato, que atua como inibidor
competitivo do substrato succinato. Antimicina, um an
tibiótico, inibe a transferência de elétrons pelo comple
xo III por se ligar ao sítio Qi e bloquear a transferência
de elétrons do heme bH do citocromo para a ubiquinona.
Outros antibióticos, como mixotiazol e a stigmatelina,
inibem a transferência de elétrons pelo complexo III
por se ligarem ao sítio QO e bloquearem a transferência
de elétrons do ubiquinol para o centro 2Fe2S da prote
ína ferro–enxofre. O complexo IV é inibido por cianeto
(CN–), azida (N3–), H2S e monóxido de carbono (CO).
Cianeto e azida ligam-se fortemente à forma oxidada do
588 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

UM OLHAR MAIS ATENTO 14.2

Vias de Transferência de Elétrons no Complexo IV

Elétrons são transferidos do citocromo c reduzido de quatro prótons da matriz, para formar água. Como
para o sítio CuA na subunidade II e, depois, para o heme todos os transportadores redox presentes no complexo
a na subunidade I do complexo IV (Figura 14.43). O para
IV sãoágua
transportadores
requer quatro um elétron
deelétrons, as ereações
a redução
catalisa
de O2
Cu
mitindo
A e o heme
rápida
a são
transferência
localizadosdea 1,5
elétrons.
Å umum dodo
Elétrons
outro,outro, per-per
são, das pelo complexo IV evoluíram para impedir a libera
então, transferidos para o centro binuclear, constituído ção de intermediários tóxicos de oxigênio parcialmente
por CuB e heme a3, onde ocorre a transferência final de
elétrons reduzidos, tais como superóxido, peróxido de hidrogê
feridos parauum
ar, formando
para m2O
O . Inicialmente, dois elétrons são trans nio ou radicais hidroxila (ver Seção 14.10). Todos os in
Dois elétrons adicionais
derivado
2 fortemente
sãoperóxido
transferidos
ligadodoao oxigênio
centro
com captação
binucle fortemente ligados
termediários formados na redução
ao centro binuclear
do Oe 2são
permanecem
(O22–). impedidos
de se dissociar até que água seja produzida.

Espaço Matriz
intermembranas mitocondrial
mitocondrial
Ciclo dos ácidos tricarboxílicos

Malato
α–Cetoglutarato
4 H+
Isocitrate
NADH
FMN Succinato
Complexo I 1
Fe S(4)
Piruvato

FAD
Complexo II α–Glicerol fosfato (FAD)
Fe S
Oxidação de ácidos graxos
e corpos cetônicos
Coenzima
Q
β –Hidroxibutirato
β –Hidroxiacil CoA
2 H+ FAD
Citocromo b
Acil Graxo CoA
2Fe 2S
Complexo III 2

Citocromo c1

FIGURA 14.40 Visão geral

Citocromo
c Sítio Inibidores da cadeia mitocondrial
Halotanos
Amital
Rotenona de transporte de elétrons
1 indicando a localização dos
complexos I-IV, ubiquinona
(CoQ) e citocromo c na
Antimicina A membrana interna, vias de
Citocromo 2 Mixotiazol
3 a1 a3 Stigmatelina transporte de elétrons e
Complexo IV (Cu) sítios de ligação de inibidores
específicos.
Monóxidlo de carbono
4 H+ 3 Os sítios de ligação de inibido
Azida sódica
Cianeto de potássio res específicos nos complexos
1/2 O2 + 2H+
são indicados no complexo I
(rotenona, amital e halotanos),
no complexo III (antimicina A,
H2O
mixotiazol e stigmatelina) e no
complexo IV (monóxido de car
bono, azida sódica e cianeto de
potássio).
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.3
Envenenamento por Cianeto
Inalação de cianeto de hidrogênio gasoso ou ingestão
de cianeto de potássio causa uma rápida e intensa ini
bição da cadeia mitocondrial de transporte de elétrons,
na etapa da citocromo c oxidase. Cianeto é um dos ve
nenos mais potentes e rápidos que se conhece. Liga-se
ao Fe3+ do heme a3 da citocromo c oxidase, que catalisa
a etapa final da cadeia de transporte de elétrons. A res
piração mitocondrial e a produção de energia cessam, e
a morte celular ocorre rapidamente. A morte ocorre por
anóxia tissular, provavelmente no sistema nervoso cen
tral. Um antídoto para o envenenamento por cianeto,
se o envenenamento for diagnosticado rapidamente, é a
administração de vários nitritos, que convertem oxi-he
heme a3 (Fe3+) e impedem a transferência de elétrons
do heme a para o centro binuclear. Diferentemente, o
monóxido de carbono liga-se à forma reduzida do heme
a3 (Fe2+) competitivamente com O2 e impede a transfe
rência de elétrons para O2. Assim, inibição do transporte
mitocondrial de elétrons resulta em prejuízo da função
geradora de energia da fosforilação oxidativa, levando à
morte do organismo (Correlação Clínica 14.3).
A Figura 14.40 também indica os três sítios onde
prótons são deslocadosdeslocados atravésatravés dada membranamembrana mitocon-mitocon
drial durante o transporte de elétrons, contribuindo
para a formação do gradiente eletroquímico usado para
a síntese de ATP. Quatro prótons são deslocados por
transferência de elétron nos complexos I e IV, enquanto
dois prótons são deslocados no complexo III.
14.7 FOSFORILAÇÃO
OXIDATIVA
A energia liberada durante a transferência de elé
trons para o O2 via cadeia mitocondrial de transporte
de elétrons é usada para deslocar prótons através da
membrana interna e estabelecer um gradiente de pró
tons (Figura 14.41). Isso torna o espaço intermembra
nas mais acídico, e o espaço da matriz, mais alcalino. Si
multaneamente, a face externa da membrana torna-se
mais carregada positivamente, e a face da matriz torna
-se mais carregada negativamente, estabelecendo um
gradiente de cargas, uma vez que não há deslocamento
compensatório de um íon carregado negativamente.
Durante a transferência de dois elétrons do NADH
para o O2, aproximadamente 10 prótons são bombea
dos através da membrana para estabelecer o gradiente
eletroquímico (ver Figura 14.40). A energia livre total
derivada do deslocamento de prótons e a distribuição
de cargas através da membrana podem ser calculadas
• 589
moglobina em meta-hemoglobina por oxidação de Fe2+
da hemoglobina para Fe3+. A meta-hemoglobina (Fe3+)
compete com o citocromo a3 (Fe3+) pelo cianeto, for
mando um complexo meta-hemoglobina-cianeto. Ad
ministração de tiossulfato leva o cianeto a reagir com
a enzima rodanese, formando tiocianato não-tóxico. A
citocromo c oxidase é também inibida por monóxido de
carbono (CO), que se liga à forma reduzida do heme a3,
e por H2S.
Holland, M. A. e Kozlowski, L.M. Clinical features and
management of cyanide poisoning. Clin. Pharmacol. 5:737,
1986.
pela seguinte equação, na qual Z é o valor absoluto de
carga, f é a constante de Faraday e ψ é o potencial de
membrana:
DG0! = 2,3 RTDpH + Zfψ
Em mitocôndrias respirando ativamente, a varia
ção de pH observada através da membrana é 0,75–1,0
unidades de pH, e a do potencial de membrana é de
1,5–2,0 V. Portanto, o DG0! calculado é grosseiramente
200 kJ para o deslocamento de 10 H+ através da mem
brana durante a transferência de elétrons do NADH
para o O2. O DG0! também pode ser calculado a partir
da diferença entre os potenciais redox padrões do par
redox. O DG0! calculado para o par redox NADH e O2
é 219 kJ/mol (Seção 14.6), sugerindo que a energia das
reações de transferência de elétrons é eficientemente
capturada no potencial eletroquímico. A energia arma
zenada no gradiente de prótons e de cargas e no gra
diente eletroquímico, também chamada força próton
-motiva, direciona a síntese de ATP pelo movimento de
prótons a favor do gradiente eletroquímico através da
ATP sintase por um mecanismo que será discutido mais
adiante nesta seção.
Espaço intermembranas
H+ H+ H+ H+ H+ H+ Lado P
+ H+ + + H+ H+ + H+ + + H+ H+ pH
i i i i i i i i i i
Lado N
OH i OH i OH i OH i OH i
Matriz
FIGURA 14.41 O gradiente eletroquímico consiste de um
gradiente de cargas (Dψ) e de concentração de prótons
(DpH) através da membrana mitocondrial interna.
590 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
Acoplamento de Síntese de ATP e
Transporte de Elétrons
A velocidade de utilização de ATP regula a velocida
de de síntese de ATP em mitocôndrias, o que, por sua
vez, regula a velocidade de transferência de elétrons.
O acoplamento entre síntese de ATP e transporte de
elétrons é conseguido pelo gradiente eletroquímico,
como ilustrado pelo experimento apresentado na Figu
ra 14.42. A velocidade de transporte de elétrons, medida
pela velocidade de consumo de O2 por uma suspensão
de mitocôndrias hepáticas, aumenta apenas após adi
ção de um doador de elétrons (succinato nesse experi
mento) e ADP (um aceptor de fosfato) mais fosfato (Pi).
A conversão de todo ADP adicionado em ATP retorna
a velocidade àà observadaobservada antesantes dada adiçãoadiçãoição dedede ADP.ADP.ADP. Por-Por-Por
tanto, a velocidade de transporte de elétrons, ou capta
ção de O2, é firmemente acoplada à síntese de ATP. A
quimiosmose explica facilmente essa relação, chamada
controle respiratório. Quando as necessidades energé
ticas da célula são baixas, o ATP se acumulará e o gra
diente de prótons não será usado para síntese de ATP.
A magnitude do gradiente de prótons aumenta até que
a energia necessária para bombear prótons através da
membrana contra o gradiente elétrico existente fique
igual à liberada durante a transferência de elétrons do
NADH para o O2. Nesse ponto, o transporte de elétrons
cessa, uma vez que o equilíbrio foi atingido. Em células
usando ATP, o ADP se acumula, levando a um estímulo
da ATP sintase. Enquanto o ATP é sintetizado, a magni
tude do gradiente de prótons diminui já que prótons se
movem através da ATP sintase, para fornecer a energia
para síntese de ATP. Como resultado, a pressão retroati
va de prótons sobre a cadeia de transporte de elétrons
Mitocondria
de fígado
Succinato
ADP
ADP
ADP 0 fígado fortemente acopladas, com uma baixa velocida
ADP 0 ATP, o transporte de elétrons pode continuar, mas sem
O2
Tempo
FIGURA 14.42 Demonstração do acoplamento entre o
transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa em uma
suspensão de mitocôndrias de fígado.
Em um meio contendo Pi, a adição de ADP estimula a veloci
dade de transferência de elétrons, medida pela captação de
oxigênio. Isso é definido como controle respiratório.
diminuirá. A velocidade aumentada de transporte de
elétrons pela cadeia estimula a oxidação de NADH, re
sultando na formação de NAD+. As concentrações au
mentadas de NAD+ acopladas com as concentrações
aumentadas de ADP nas células que estão consumindo
ATP ativamente estimulam as reações do ciclo TCA e a
oxidação de ácidos graxos. Dessa forma, a necessidade
de ATP em uma célula regula, de modo coordenado, a
velocidade do fluxo de elétrons pela cadeia respiratória
e as reações do ciclo TCA e a oxidação de ácidos graxos.
Razões P/O para Transporte de Elétrons e
Fosforilação Oxidativa nas Mitocôndrias
A razão P/O (fosfato incorporado em ATP por áto
mos de O2 utilizados) é uma medida do número de mo
léculas de ATP formadas durante a transferência de
dois elétronspor toda ou por parte da cadeia de trans
porte de elétrons. Classicamente, pensou-se que a ra
zão P/O fosse um número inteiro, 3 para a transferência
de dois elétrons de substratos ligados ao NADH para
O2, 2 de succinato para O2, e 1 do citocromo c reduzido
para O2. Essas razões P/O sugeriam que um ATP fosse
produzido durante a transferência de elétrons em cada
um dos complexos que bombeiam prótons, I, III e IV. En
tretanto, surgiram questões sobre as razões P/O reais,
com cálculos recentes de 10 prótons bombeados através
da membrana mitocondrial durante a transferência de
dois elétrons do NADH para o O2, enquanto a síntese de
um ATP e seu transporte através da membrana requer
quatro prótons. Essas estequiometrias de prótons re
sultam em uma razão P/O calculada de 2,5. Na verdade,
determinações experimentais recentes da razão P/O
deram valores de aproximadamente 2,5 para substratos
ligados a NADH, e 1,5 com succinato.
Efeitos de Desacopladores e Inibidores
do Sistema de Transporte de Elétrons–
Fosforilação Oxidativa
O acoplamento entre transporte de elétrons e sín
tese de ATP pode ser abolido por reagentes químicos,
ou desacopladores, como 2,4-dinitrofenol ou carbonil
-cianeto-p-trifluorometoxifenil-hidrazona. Após adição
de um desacoplador a uma suspensão de mitocôndrias de
de de captação de O2, um rápido aumento na velocidade
de consumo de O2 é observado (Figura 14.43a). Como
o transporte de elétrons está desacoplado da síntese de
síntese de ATP. Desacopladores são ácidos fracos hi
0
drofóbicos que captam um próton no espaço intermem
branas, onde uma concentração mais alta de prótons
resulta da ativa transferência de elétrons. Esses desa
copladores protonados, sendo lipofílicos, rapidamente
se difundem para a matriz mitocondrial, onde perdem
seu próton, em decorrência da concentração mais bai
xa de prótons lá. Dessa forma, o gradiente de prótons
pode ser completamente dissipado, como mostra a Fi
gura 14.44 e, portanto, a síntese de ATP é abolida.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 591

Mitocondria Mitocondria
de fígado
de fígado
Succinato Succinato
2,4-Dinitrofenol ADP
o
i o
i
n n
ê ê
g
ix g
i
o x
o
e e
d d Oligomicina
o o
ã
ç ã
a ç
rt a
rt
n n
e
c e
n Cianeto c 2,4-Dinitrofenol
o n
C o
C

O2 = 0 O2 = 0

Tempo Tempo
(a) (b)

FIGURA 14.43 Inibição e desacoplamento da fosforilação oxidativa em mitocôndrias de fígado.

(a) Adição do desacoplador 2,4-dinitrofenol estimula a veloci micina, que bloqueia movimentos de prótons através de FO da
dade de captação de oxigênio por dissipar o gradiente de pró ATP sintase. Adição do desacoplador 2,4-dinitrofenol diminui
tons. A adição de cianeto inibe a captação de oxigênio. (b) O a inibição por oligomicina e estimula a velocidade de captação
estímulo de captação de oxigênio por ADP é inibido por oligo de oxigênio.

Membrana Como ilustrado na Figura 14.43b, adição de oligo

mitocondrial
interna micina, um inibidor da ATP sintase, a mitocôndrias
hepáticas respirando ativamente em presença de ADP,
Matriz Espaço resulta em uma inibição da captação de O2. Oligomicina
Mitocondrial intramembrana bloqueia a síntese de ATP por impedir o movimento de
prótons pela ATP sintase. Como a síntese de ATP e o
pH alto pH baixo
fluxo de elétrons são fortemente acoplados, o acúmulo
de prótons no espaço intermembranas bloqueia qua
se completamente o transporte de elétrons, conforme
discutido para o controle respiratório. A subsequente
adição de 2,4-dinitrofenol, que dissipa o gradiente de
NO2 H+ NO2 prótons, resulta em um rápido aumento na velocidade
de captação de O2, porque o transporte de elétrons foi
–O –O desacoplado da síntese de ATP.
HOH
–OH NO2 H+ NO2
NO2
ATP Sintase
HO HO A ATP sintase, ou complexo V, localizada na mem
brana mitocondrial interna de mamíferos, levedura e
NO2 H+ NO2
fungos, e da membrana citoplasmática de bactérias,
H+ catalisa a síntese de ATP usando a energia do gradien
te de prótons, à medida que prótons fluem pela ATP
sintase. A ATP sintase consiste de dois domínios, F1,
um complexo periférico observado pela primeira vez
FIGURA 14.44 Ação do desacoplador 2,4-dinitrofenol, em micrografias eletrônicas como pequenas partícu
um ionóforo de prótons que equilibra o pH através da las ligadas à membrana mitocondrial interna (Figura
membrana mitocondrial interna. 14.45), e F0, um complexo proteico integral de mem
2,4-Dinitrofenol é um ácido fraco que capta um próton do es brana. O domínio F1 contém os sítios de ligação de
paço intermembranas (lado P da membrana), que tem uma
ATP e ADP e catalisa a síntese de ATP (Figura 14.46).
alta concentração de prótons, e o carrega através da membra
na para a matriz (lado N da membrana), onde o próton se dis
O domínio F0 forma um canal para o deslocamento
de prótons através da membrana. A remoção de F1 da
socia em virtude da baixa concentração de prótons lá.
membrana mitocondrial interna por agitação suave
deixa uma cadeia de transporte de elétrons intacta,
capaz de transferir elétrons, sem a formação de um
592 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

le o bombeamento de prótons. Mutações de resíduos

carregados também implicaram a subunidade a de F0
nos movimentos de prótons, enquanto as subunidades
b parecem funcionar na ligação do domínio F1 ao F0. O
domínio F0 encontrado em mitocôndrias contém subu
nidades homólogas às subunidades a, b e c da enzima
de E. coli; entretanto, subunidades adicionais também
estão presentes.

δ β
α α
ATP
β α β

FIGURA 14.46ADP
Modelo
+ Pi da F1 F1

b2

FIGURA 14.45 Micrografia eletrônica de F1 mitocondrial. γ

ε
Lado N
Generosamente cedida por Dr. D. F. Parsons. De Parsons, D. F.
Science 140:985, 1963. Reproduzido com permissão de AAAS a
c10–14

Lado P H+
gradiente de prótons, uma vez que os prótons bombe F0
ados através da membrana durante a transferência de
elétrons fluem de volta para a matriz pelo domínio F0. F0-ATP sintase mitocondrial,
Adição do domínio F1 de volta àsàs membranasmembranas nuasnuas per-per um motor molecular com rotação.
mite a formação de um gradiente de prótons, já que F1 A síntese de ATP ocorre nas subunidades β de F1, enquanto
reconstitui com F0 e bloqueia o fluxo de prótons através F0 contém um canal de prótons. Em F0, as subunidades c da
de F0. A ATP sintase inteira pode ser isolada e, quando membrana são ligadas pela haste contendo γe e de F1 e cons
incorporada em vesículas de membrana artificial, sin tituem um rotor. As duas subunidades b de F0, juntamente
tetiza ATP quando um gradiente eletroquímico é es-ées-es com as subunidades α e β e a subunidade d constituem um
estator (elemento estrutural não móvel). Prótons fluem pelas
tabelecido através da membrana. A ATP sintase é um
subunidades a e c de F0, fazendo o rotor girar, resultando em
complexo com múltiplos componentes de 480-500 kDa mudanças conformacionais das subunidades β, onde ATP é
por cinco
(Tabela 14.6 e Figura 14.46).
subunidades não-idênticas
O domínio (α,
F1β, é composto sintetizado.
γ, d e e),
e e e uma estequiometria de subunidades de α3, β3, γ, d
com Síntese de ATP em F1
massa de 350-380 kDa. Sítios de ligação para
ATP e ADP estão presentes nas subunidades α e β. Os O mecanismo de síntese de ATP por F1 foi derivado
sítios catalíticos ficam nas subunidades β, enquanto de experimentos de troca de isótopos, que revelaram
a função dos nucleotídeos ligados às subunidades a é que em presença de quantidades estequiométricas de
desconhecida. A subunidade γ forma o núcleo central ADP, ATP e fosfato inorgânico, com F1 isolado, a reação
de F1, enquanto a subunidade d
pode estar envolvida na ligação TABELA 14.6 Subunidades da F1F0-ATP Sintase de Escherichia coli
do domínio F1 à membrana. O
domínio F0 da enzima de E. coli Subunidade Massa
Complexo Proteica (kDa) Estequiometria
consiste de três subunidades
madas a, b e c,
hidrofóbicas não-idênticas, cha-
que estão presen F1 α 55 3

tes na estequiometria aparente β 52 3

de a1, b2, c9–12. Cada subunidade
γ 30 1
c contém um resíduo carrega
do essencial (aspartato 61 em d 15 1
E. coli), que está envolvido no
bombeamento de prótons. Cada e 5,6 1
α-hélices consiste de duas
subunidade ctransmembrânicas F0 a 30 1

com o resíduo de aspartato 61 lo b 17 2

calizado no meio. Mutação desse
c 8 9-12
aspartato para asparagina abo
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
ficava essencialmente em equilíbrio, com um DG0!pró
ximo de zero. Essa reação de troca
Enz:ADP + Pi  Enz:ATP
ocorre facilmente, mesmo na ausência de um gradiente
de prótons. O resultado indicou que a síntese de ATP
por F1 não requer investimento de energia; entretanto,
o movimento de prótons pela ATP sintase era neces
sário para a liberação do ATP de sua ligação singular
com a subunidade β de F1. Foi proposto que a energia
liberada durante o movimento de prótons através da
membrana causa uma mudança conformacional na ATP
sintase, que resulta na liberação do ATP fortemente li
gado a uma das subunidades β, na ligação de ADP e Pi
a uma segunda subunidade β em conformação frouxa, e
força a terceira subunidade β para a conformação aper
tada, onde a síntese de ATP ocorre (Figura 14.47 e Um
Olhar Mais Atento 14.3).
Mecanismo da Síntese de ATP
A resolução da estrutura cristalina de F1 forneceu
dramática visualização das conformações das diferentes
subunidades β, o que forneceu evidências para o mode
lo de mudança de ligação descrito em Um Olhar mais
Atento 14.3. Nessa estrutura cristalina, subunidades α
UM OLHAR MAIS ATENTO 14.3
Síntese de ATP em F1
O mecanismo de mudança de ligação sugere que
as três subunidades β adotam diferentes conforma
ções que mudam durante catálise, com apenas uma
subunidade funcionando como o sítio catalítico.
Como mostra a Figura 14.51, uma subunidade tem
uma conformação aberta (O, open), com uma bai
xa afinidade por ligantes e está vazia. Uma segunda
subunidade tem uma conformação frouxa (L, loose),
com uma baixa afinidade por ligantes e é inativa, en
quanto a terceira subunidade tem uma conformação
apertada (T, tight), que tem uma alta afinidade pe
los ligantes e é ativa na catálise. De acordo com esse
modelo, a síntese de ATP ocorre na subunidade β na
conformação T. Durante a catálise, ADP e Pi ligam-se
à subunidade β na conformação L. A energia forne
cida pela passagem de prótons de F0 para F1 resulta
nas seguintes mudanças conformacionais: o sítio T
contendo ATP muda para a conformação O, com libe
ração do ATP, o L muda para a conformação T, com
síntese de ATP, e o sítio O muda para a conformação
L, ligando ADP e Pi. De acordo com esse modelo, a
energia liberada pela transferência de elétrons é con
servada como um gradiente de prótons, que dirige as
mudanças conformacionais na ATP sintase, resultan
do na ligação de substratos, síntese de ATP sobre a
enzima e liberação do produto ATP.
• 593
ADP + Pi ATP
L T
O
+
+
3HP 3HN
3HN
+ ATP
3H+P
ATP ATP
ADP + Pi
ATP
T L O O L
+
3HP 3HN+
T
ATP
ADP + Pi
FIGURA 14.47 O modelo de mudança de ligação para
síntese de ATP pela ATP sintase.
Cada subunidade β de F1 tem um sítio de ligação não-idêntico
para ligação de adenina-nucleotídeo. A qualquer tempo, uma
dessas subunidades β está na conformação T (tight), que liga
ATP fortemente, uma segunda está na conformação L (loose),
que liga ADP e Pi fracamente, e uma terceira está na conforma
ção O (open), que não liga nucleotídeos. O gradiente de pró
tons causa rotação da subunidade γ, o eixo central, que fica em
contato com cada subunidade β em sucessão, produzindo uma
mudança de conformação cooperativa, convertendo o sítio T
em sítio O e liberando ATP, o sítio L em sítio T promovendo
síntese de ATP, e o sítio O em sítio L, ligando ADP e Pi.
e β alternadas formam o botão de F1, com a únicaúnica su-su-su
(Figura 14.48a
bunidade γ formando um eixo
e b). Cada subunidade
central no
β centro de F1
assume uma
conformação diferente, dependendo da presença de
substrato. Assim, F1 cristalizado em presença de ADP
e um análogo não-hidrolizável de ATP revelou a ligação
do análogo de ATP a uma subunidade β, ligação de ADP
a uma segunda subunidade β, e uma terceira subunida
de β vazia (Figura 14.48c).
O modelo de síntese de ATP que se desenvolveu é
que prótons fluem através da membrana primeiro ligan
do-se a resíduos de aminoácidos acídicos conservados
na subunidade a de F0. Os prótons então se ligam a um
resíduo de aminoácido conservado presente na subu
nidades c, fazendo o anel das subunidades c ligado às
subunidades γe e rodar. O movimento da subunidade γ
causa mudanças conformacionais nas subunidades β à
medida que a subunidade γ se associa sequencialmente
com cada subunidade β, uma de cada vez. As subuni
dades a e b de F0 mais a subunidade d de F1 formam o
estator que mantém as subunidades α e β em posição,
enquanto as subunidades γ e c formam o rotor em mo
vimento. (Ver Um Olhar Mais Atento 14.4, p. 578, para
evidências experimentais desse mecanismo proposto.)
594 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
FIGURA 14.48 Complexo ATP sintase mitocondrial.
(a) Vista lateral da estrutura do complexo F1 deduzida da
estrutura do cristal. Três subunidades α (vermelhas) e três
β (amarelas) alternam-se em torno de um eixo central, a su
bunidade γ(azul). (b) Visão lateral da subunidade F1 na qual
duas subunidades α e duas β foram removidas para revelar a
subunidade γ central. As subunidades são coloridas como in
14.8 MEMBRANA
MITOCONDRIAL INTERNA
CONTÉM SISTEMAS
DE TRANSPORTE DE
SUBSTRATO
Enquanto a membrana externa apresenta pouca ou
nenhuma barreira de permeabilidade para moléculas
de substratos ou de nucleotídeos de interesse no me
tabolismo energético, a membrana interna limita os
tipos de substratos, intermediários e nucleotídeos que
podem se difundir do citosol para a matriz. Vários sis
temas de transporte foram descritos em mitocôndrias
(Figura 14.49), alguns dos quais foram intensamente
dicado na parte (a).
tra subunidades α e (c)
β alternadas
Visão superior do complexo
circundando F1 mos
a subunidade
γ central.
Reproduzido com permissão de Abrahams, J. P., Leslie, A. G.
W., Lutter, R. e Walker, J. E. Nature 370:621, 1994. Copyright©
(1994 Macmillan Magazines Limited).
caracterizados. Esses sistemas de transporte facilitam
o movimento seletivo de vários substratos e interme
diários para frente e para trás através da membrana
mitocondrial interna. Por esses transportadores, vá
rios substratos podem se acumular na matriz, já que os
transportadores podem mover o substrato contra um
gradiente de concentração.
Transporte de Adenina-Nucleotídeos
e Fosfato
íntese contínua de ATP na matriz mitocondrial re
A síntese
quer que o ADP citosólico formado durante reações que
consomem energia seja transportado de volta, através
da membrana interna, para a matriz, para conversão em
ATP. Da mesma forma, ATP recém-sintetizado deve ser
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 595

UM OLHAR MAIS ATENTO 14.4

Evidência Experimental da Rotação das Subunidades γ e c pela ATP Sintase

O modelo de mudança de ligação propõe que a su
bunidade γ deve se mover em uma direção durante a
síntese de ATP e na direção oposta durante a hidrólise
do ATP, de forma que a hidrólise de ATP resulte em
formação de um gradiente de prótons. A rotação da su
bunidade γ de uma única subunidade F1 foi demonstra
da pela ligação de um polímero de actina fluorescente
à subunidade γ de um F1 na qual as subunidades α3β3
foram fixadas a uma lâmina de microscopia (ver figu
ra). Rotação da subunidade γfluorescente foi observada
por adição de ATP. Experimentos semelhantes foram
realizados usando o complexo F1/F0 inteiro, nos quais
o complexo de subunidades c girou juntamente com a
subunidade γ, como indicado pela actina fluorescente
ligada a uma subunidade c. Em ambas as condições
experimentais, o movimento do rotor não foi contínuo,
mas ocorreu em etapas discretas de aproximadamente
120°, o que éé consistenteconsistente comcomcom ooo movimentomovimentomovimento passopassopasso aaa pas-pas-pas
so da subunidade γ de uma subunidade β para outra.
ATP sintase é o menor motor molecular conhecido.

O domínio F1 é ligado a uma lamínula coberta com níquel por

resíduos de histidina geneticamente engenheirados na extremi
Filamento de actina
dade N-terminal das subunidades α.
Estreptavidina Biotina, covalentemente ligada às subunidades c, liga-se muito
F0
a fortemente à proteína estreptavidina, que é covalentemente li
c gada a um filamento de actina contendo uma sonda fluorescen
te. A adição de ATP, que é hidrolisado pelo F1 da ATPase, causa
b
rotação do filamento de actina em uma direção, provando que a
subunidade
filamento decactina gira.
de F0foi ligado
Experimentos
à subunidade
anteriores, nos quais o
γ, forneceram
F1
ADP + Pi evidên
cia de que a subunidade γtambém pode girar. Presumivelmente,
ATP
ambas as subunidades γ e c giram como uma unidade.
His tag Lamínula
His tag
Redesenhado de Sambongi, Y., Iko, Y., Tanabe, M., Omote, H., et al.
Complexo Ni Science 286:1722, 1999

transportado de volta através da membrana

interna para o citosol, para satisfazer as ne
cessidades energéticas da célula. Essa troca
de adenina nucleotídeos hidrofílicos, muito
carregados, é catalisada por uma adenina nu
cleotídeo translocase muito específica, loca
lizada na membrana interna (Figura 14.50).
A adenina nucleotídeo translocase, um ho
modímero de subunidades de 30 kDa, cata
lisa uma troca de ATP por ADP, 1:1. A pre
sença de um sítio de ligação de nucleotídeo
no transportador sugere que a enzima fique
voltada alternadamente para a matriz ou para
o espaço intermembranas durante o processo
de transporte. O ATP recém-sintetizado é li-éli-li
gado à translocase na matriz, que então muda
sua conformação para se voltar para o citosol,
onde o ATP é liberado em troca de um ADP.
A translocase então muda sua conformação
novamente, para trazer o sítio de ligação de
nucleotídeo contendo ADP de volta para o
lado da matriz. A translocase favorece o mo
vimento para fora do ATP e o movimento para
dentro do ADP, a despeito de observações de
que ambos os nucleotídeos ligam-se igual
FIGURA 14.49 Transportadores mitocondriais de metabólitos. mente bem ao sítio de ligação. A explicação
596 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
para isso é que, em pH 7, o ADP tem três cargas nega
tivas, enquanto o ATP tem quatro. Portanto, a troca de
um ATP por um ADP resulta em movimento para fora
de uma carga negativa, que é equivalente a importar
um próton. O potencial de membrana estabelecido du
rante a transferência de elétrons é positivo fora, o que
favoreceria o transporte para fora do ATP, mais carre
gado negativamente do que o ADP. A adenina nucleotí
deo translocase está presente em altas concentrações,
até 14% da proteína total, na membrana interna. Assim,
é pouco provável que o transporte de adenina nucleo
tídeos através da membrana mitocondrial interna seja
limitante da velocidade de síntese de ATP.
Um segundo transportador essencial para a fosfori
lação oxidativa é o transportador de fosfato, que trans
porta fosfato citosólico mais um próton para a matriz
(Figura 14.50). Esse simporte também depende do gra
diente de prótons, uma vez que fosfato e prótons são
transportados numa razão 1:1. O transporte de ADP e
de fosfato requer uma fração significativa da energia
presente no gradiente eletroquímico produzido duran
te a transferência de elétrons. Por isso, a força próton
-motiva fornece energia para a síntese de ATP pela ATP
sintase, bem como para a captação dos dois substratos
necessários.
Membrana
mitocondrial
Citosol interna Mitocôndria
Adenina
nucleotídeo
translocase
ADP3i
ATP4i
Atractilosídeo
Transportador
de fosfato
H2PO4i
+ sar a membrana pelo transportador de aspartato–glu
H
Mersalil
FIGURA 14.50 A adenina nucleotídeo translocase e o
transportador de fosfato.
Lançadeiras de Substrato
Transportam Equivalentes de
Redução Através da Membrana
Mitocondrial Interna
Os nucleotídeos envolvidos em reações celulares
de oxidação–redução (por exemplo, NAD+, NADH,
NADP+, NADPH, FAD e FADH2) e CoA e seus derivados
não são transportados através da membrana mitocon
drial interna. Assim, para transportar equivalentes de
redução (por exemplo, prótons e elétrons) do citosol
para a matriz ou o inverso, são necessários mecanismos
de lançadeiras de substrato.
Duas lançadeiras para transporte de substrato são
mostradas na Figura 14.51. A lançadeira malato–aspar
tato e a lançadeira α-glicerol–fosfato são empregadas
em vários tecidos para deslocar equivalentes de redu
ção do citosol para a matriz, para oxidação e geração de
energia. Sua operação requer que as enzimas apropria
das estejam localizadas em ambos os lados da membra
na e que os transportadores corretos estejam presentes
na membrana mitocondrial interna.
Na lançadeira glicerol–fosfato, estão envolvidas
duas glicerol fosfato desidrogenases diferentes, uma
no citosol e outra na face externa da membrana mito
condrial interna. O NADH produzido no citosol é usado
para reduzir di-hidroxiacetona fosfato a glicerol 3-fos
fato pela isoenzima citosólica. O glicerol 3-fosfato, por
sua vez, é oxidado pela isoenzima mitocondrial, uma
flavoproteína, para produzir di-hidroxiacetona fosfato
e FADH2, que é oxidado pela cadeia de transporte de
elétrons.
A lançadeira malato–aspartato opera com base no
mesmo princípio. O NADH do citosol reduz oxaloace
tato a malato, que entra na mitocôndria pelo trans
portador de malato/α-cetoglutarato. Esse malato é
rapidamente oxidado pela malato desidrogenase mito
condrial a oxaloacetato e NADH, que é então oxidado
pela cadeia de transporte de elétrons. O oxaloacetato
produzido é convertido em aspartato pela aspartato
aminotransferase mitocondrial e pode então atraves
tamato, onde a aspartato aminotransferase citosólica
o converte em oxaloacetato. O transporte antiporte de
aspartato para fora da mitocôndria em troca por glu
tamato é conduzido pelo potencial de membrana e é,
portanto, irreversível.
Unidades Acetil São Transportadas
como Citrato
A membrana mitocondrial interna não tem um
transportador para acetil-CoA, mas grupos acetil são
transferidos da mitocôndria para o citosol, onde são
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 597

LANÇADEIRA DE MALATO-ASPARTATO dentro das células é crítica para

Citosol Membrana Mitocôndria
contração muscular, transmissão
mitocondrial neural, secreção e ação hormonal.
interna Distintos pools de Ca2+ foram de
Glutamato-Oxaloacetato
Transaminase tectados no retículo endoplasmá
Glutamato
Oxaloacetato
tico (ou retículo sarcoplasmático),
Transaminase Glutamato
Aspartato Glutamato Oxaloacetato
α-Cetoglutarato nas mitocôndrias, no núcleo e no
Golgi. Uma parte do Ca2+ intra
celular fica ligada a nucleotídeos,
Aspartato metabólitos ou ligantes de mem
brana, enquanto uma parte fica li
vre em solução. A concentração de
Ca2+ citosólico é cerca de 10–7 M,
Oxaloacetato α-cetoglutarato
Malato NAD+
enquanto a concentração extrace
lular é pelo menos quatro ordens
de grandeza maior. A entrada de
NAD+ Malato Malato Ca2+ na mitocôndria ocore por um
NADH
+H+ Desidrogenase transportador uniporte da mem
NADH brana interna, que usa a energia do
Malato gradiente eletroquímico (Figura
Desidrogenase
14.53). A microscopia confocal de
células vivas forneceu evidências
LANÇADEIRA α–GLICEROL FOSFATO convincentes de que as mitocôn
α-Glicerol fosfato drias tomam parte na regulação da
desidrogenase concentração do Ca2+citosólico. As
α-glicerol
NADH NAD+ mitocôndrias ficam localizadas bem
fosfato
+H+
desidrogenase próximas do retículo endoplasmá
mitocondrial
(flavoproteína) tico e do retículo sarcoplasmático.
A ligação de certos hormônios às
Di-hidroxiacetona
membranas celulares resulta na li
α-Glicerol
fosfato FAD UQ beração de inositol trisfosfato (IP3)
fosfato
do fosfatidilinositol, que libera Ca2+
FADH2UQH2 O2
do retículo endoplasmático (p. 17).
Os microdomínios transitórios re
sultantes com altas concentrações
FIGURA 14.51 Lançadeiras para transporte de equivalentes de redução de Ca2+ podem ser modulados por

necessários para a biossíntese de ácidos graxos ou es

da
tão
pelo
gênese
(p.
mediários
é
TCA.membrana
704).
envolvidos
fígado.
teróis (ver
O(Figura
convertido
citrato no
Mecanismos
apropriados
p.em
interna
638)
é, e de
movimento
14.52).durante
ureagênese
em
citrato
então, Acetil-CoA
exportado
pela
as
lançadeiras
ambas
de
citrato
de substrato
períodos
substratos
ativas de
direções
para o(ver
egluconeo-
deatravés
p.inter-
do 779)
intramitocondrial
sintase
citosol es-
ciclo
por Citosol Membrana Mitocôndria
mitocondrial
interna

um transportador de tricarboxilato, em troca de mala

às citosólico
to. O citrato
loacetato, custas de um
é clivado
ATP, pela
em acetil-CoA
ATP-citratoe liase
oxa- Malato Malato

Citrato Citrato Oxaloacetate

CoASH
ATP
Acetil
citrato
liase
CoA Oxaloacetato
CoASH Citratosintase

ATP
ADP + Pi

Acetil CoA

Mitocôndrias Têm um Transportador

de Cálcio Específico Biossíntese
de
esterol ou
ácido graxo
Na maioria dos tecidos de mamíferos, as mitocôn
FIGURA 14.52 Exportação do citrato gerado na
drias têm um sistema de transporte para deslocar Ca2+
mitocôndria para o citosol onde serve como fonte
através da membrana interna. A distribuição/redis de acetil-CoA para a biossíntese de ácidos graxos ou
tribuição dos reservatórios (pools) celulares de Ca2+ esteróis.
598 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
captação por mitocôndrias vizinhas. Nas mitocôndrias,
Ca2+ regula o complexo piruvato desidrogenase, bem
como as isocitrato e α-cetoglutarato desidrogenases.
Uma consequência da captação de altas concentrações
de Ca2+ pelas mitocôndrias é a abertura de um poro na
membrana externa, levando à liberação de citocromo c
no citosol e ativação da apoptose.
Membrana
mitocondrial
interna
Citosol Matriz
Requer
energia
Ca2+ Ca2+
FIGURA 14.53 Transportador mitocondrial de cálcio.
Proteínas Desacopladoras
O tecido adiposo marrom desempenha um papel
importante na termogênese sem tremores de recém
-nascidos, em animais que hiber
nam e em animais experimentais
com termogênese induzida pela
dieta. O agente primário envolvido
na termogênese induzida por frio
na gordura marrom é a proteína de
sacopladora UCP-1, que se localiza
Cérebro
exclusivamente na membrana mito
condrial interna do tecido adiposo
marrom. UCP-1 carrega prótons da
matriz mitocondrial e atua desaco
plando a síntese de ATP do trans
porte de elétrons (Figura 14.54).
Termogênese resulta de ativação
dos nervos simpáticos pela resposta
do cérebro à exposição ao frio, com
a liberação de norepinefrina, que
se liga a receptores β-adrenérgicos
na membrana celular das células da
gordura marrom. EssaEssa ligaçãoligação cau-cau
sa liberação de cAMP e ativação de
proteína quinase A, que estimula li
pólise. A produção de ácidos graxos
livres ativa UCP-1, que transporta
prótons de volta para a matriz (Fi FIGURA 14.54 Ativação de UCP-1 por adaptação ao frio.
gura 14.54). Acredita-se que o estí Frio estimula a liberação de norepinefrina de células nervosas simpáticas. A norepi
mulo do transporte de prótons por nefrina liga-se ao receptor β-adrenérgico, resultando na ativação de uma lipase, com
ácidos graxos livres resulte da libe produção de ácidos graxos livres, que ativam a proteína condutora de prótons UCP-1.
ração de um próton do grupo carboxila do ácido graxo
livre. A UCP-1 é um membro da família de transporta
dores mitocondriais que inclui a adenina nucleotídeo
translocase e o transportador de fosfato, mas com um
poro específico para o transporte de prótons para a
matriz. Estímulo crônico induzido por frio do recep
tor β-adrenérgico por epinefrina resulta em transcri
ção aumentada do gene UCP-1, estímulo da biogênese
mitocondrial e eventual hiperplasia do tecido adiposo
marrom. Em mamíferos grandes, como cães, gatos e
primatas que não hibernam, incluindo o homem, de
pósitos discretos de gordura marrom estão presente
ao nascimento, mas ficam dispersos durante o desen
volvimento posterior.
Quatro outras proteínas desacopladoras, UCP-2,
UCP-3, UCP-4 e UCP-5, com sequências semelhantes
à da UCP-1, foram descobertas em outros tecidos que
não o tecido adiposo marrom. A presença de proteínas
desacopladoras em tecidos como músculo esquelético
sugeriu investigações acerca do possível papel dessas
proteínas na regulação do gasto energético e, talvez, na
obesidade. O desenvolvimento de agentes farmacológi
cos que afetam proteínas desacopladoras foi sugerido
como um tratamento para obesidade. Recentemente, foi
sugerido que as proteínas desacopladoras possam im
pedir a formação de espécies reativas de oxigênio nas
mitocôndrias.
Frio é sentido
pelo hipotálamo
Nervo simpático
Célula
adiposa marrom
Norepinefrina
Receptor
Adrenérgico H+ H+
UCP1
H+
cAMP
H2O
H+ NADHFADH
Proteína quinase A 2
1i2O2 + 2H+
ATP
Ácidos graxos Sintase
Triglicéride
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 599

Origem
14.9 GENES MITOCONDRIAIS E
DOENÇAS 12S
rRNA
Cyt b
F PT
As mitocôndrias contêm seu próprio genoma, um 16S
V
rRNA
DNA circular de fita-dupla que contém genes estru E ND6
turais para 13 proteínas da cadeia de transporte de MELAS
L LHON
elétrons, incluindo sete subunidades do complexo I ND1 LHON
LHON ND5
(NADH:ubiquinona óxido-redutase), uma subunidade I
Q L
(citocromo b) do complexo III (ubiquinol:citocromo c M S
óxido-redutase), três subunidades do complexo IV (ci ND2 W H
A
tocromo c oxidase) e duas subunidades do complexo V N
LHON
C ND4
(ATP sintase) (Tabela 14.7). O DNA mitocondrial (mtD Y MERRF R
NA) também contém genes que codificam dois RNAs ri S D G
COI K ATpase8
bossômicos (rRNAs) e todos os RNAs transportadores ND4L
COIII
(tRNAs) necessários para a síntese proteica em mito COII ND3
côndrias (Figura 14.55). As mitocôndrias, entretanto,
ATpase6
não são organelas que se autorreplicam porque mais
de 90% de todas as proteínas mitocondriais são codifi FIGURA 14.55 Mapa de genes no DNA mitocondrial.
cadas no DNA nuclear, sintetizadas no citosol e depois Os genes indicados CO1, CO11 e CO111 codificam subunida
importadas para as mitocôndrias. des da citocromo c oxidase, ND codifica subunidades do com
plexo I, e ATPase codifica subunidades da ATP sintase. As ban
Defeitos mitocondriais foram implicados em várias das vermelhas escuras indicam por letras únicas os genes para
doenças degenerativas do envelhecimento, incluindo os tRNAs. LHON indica a localização das mutações que causam
doenças de Parkinson e de Alzheimer. Várias doenças Neuropatia Óptica Hereditária de Leber. Mutações no tRNA
resultam de mutações pontuais no mtDNA envolvendo da leucina (L) causam MELAS (encefalopatia mitocondrial,
acidose láctica e atividade tipo-acidente vascular cerebral), e
ou tRNAs ou um dos genes estruturais. Outras doen
ças resultam de deleções de partes grandes do mtDNA. aquelas no tRNA da lisina (K) causam MERRF (epilepsia mio
clônica e fibras vermelhas rotas).
Geralmente, essas doenças resultam de atividade dimi
nuída da cadeia de transporte de elétrons, o que leva ao
acúmulo de piruvato e ácidos graxos com consequente
acidose láctica e acúmulo de triglicérides. A velocidade Outras mutações em genes mitocondriais levam a
de síntese de ATP está também diminuída, resultando fraqueza muscular progressiva, retinite pigmentosa
em fraqueza muscular e intolerância a exercício. Uma (perda da resposta da retina), perda de audição e ata
característica marcante de todas as doenças mitocon xia (ação muscular descoordenada), juntamente com
driais é sua herança materna, porque essencialmente aumento e deterioração do músculo cardíaco. Os efeitos
todas as mitocôndrias presentes em um óvulo fecunda deletérios do envelhecimento também podem resultar
do derivam do óvulo. Ver Correlações Clínicas 14.4, 14.5 de mutações que se acumulam no mtDNA ao longo da
e 14.6 para uma discussão das doenças que resultam de vida do indivíduo, que são causadas por agentes que da
mutações no mtDNA. nificam o DNA, como radicais de oxigênio.

TABELA 14.7 Subunidades dos Complexos de Transporte de Elétrons Codificadas pelo DNA Mitocondrial Humano
Número Total de Número de Subunidades
Complexo Subunidades CodificadaspeloDNAMitocondrial

I NADH-ubiquinona óxido-redutase >40 7

II Succinato desidrogenase 4 0
III Ubiquinol-citocromo c óxido-redutase 11 1
IV Citocromo coxidase 13 3
V ATP sintase 12 2
600 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.4

Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (OMIM 535000)

A primeira doença mitocondrial a ser elucidada
em nível molecular é a neuropatia óptica de Leber, de
herança materna (LHON), que afeta o sistema ner
voso central, incluindo os nervos ópticos, causando
cegueira de início súbito no princípio da idade adulta,
em decorência da morte do nervo óptico. Em quase
todas as famílias, LHON resulta da troca de uma úni
ca base nos genes mitocondriais que codificam três
subunidades do complexo I (ND1, ND4 e ND6), o que
reduz a atividade da NADH:ubiquinona óxido-reduta
se (complexo I).
A gravidade das doenças mitocondriais depende da
quantidade de mtDNA mutado presente em uma dada
célula ou tecido. A presença de centenas ou milhares de
mitocôndrias em cada célula permite considerávelável va-va
riação na quantidade de mtDNA mutado em um tecido,
como consequência da distribuição aleatória do mtD
NA mutante nas células filhas durante a divisão celu
lar. Pacientes com uma percentagem menor de mtDNA
mutado desenvolvem cegueira de início súbito e outros
sintomas típicos de LHON no princípio da idade adulta.
Pacientes com uma percentagem mais alta de mtDNA
mutado, no qual uma alanina conservada é substituída
por uma valina em ND6, desenvolvem uma doença gra
ve caracterizada pelo início precoce de disfunçãoão gene-gene
ralizada de movimentos, dificuldade de fala e retardo
mental.
Chalmers, R. M. e Schapira, A. H. V. Clinical, biochemi
cal and molecular genetic features of Leber’s hereditary optic
neuropathy. Biochim. Biophys. Acta 1410:147, 1999.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.5

Miopatias Mitocondriais Decorrentes de Mutações em Genes de tRNA Mitocondrial

Mutações pontuais em genes que codificam tRNAs

mitocondriais resultam em duas das doenças mitocon
driais mais comuns, caracterizadas por encefalomio
patia. Uma mutação no gene do tRNA da lisina causa
epilepsia mioclônica e fibras vermelhas rotas (MERRF,
myoclonic epilepsy and ragged red fibers) (OMIM
545000). Os sintomas incluem mioclonia e ataxia com
convulsões generalizadas e miopatia. Os músculos es
queléticos contêm mitocôndrias de forma anormal, que
contêm estruturas paracristalinas dando uma aparên Exemplo de inclusões paracristalinas em mitocôndrias de
cia de fibras vermelhas rotas (ragged red fibers) (ver músculos de paciente com miopatia ocular (x36.000).
figura) e atividade diminuída da citocromo c oxidase.

Mutações no tRNA da leucina causam a encefalopa
tia mitocondrial comun, acidose láctica e atividade ti
po-acidente vascular cerebral (MELAS, mitochondrial
encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like acti
vity) (OMIM 540000). Os músculos esqueléticos pare
cem com fibras vermelhas rotas, mas retêm a atividade
da citocromo c oxidase. A gravidade dos sintomas varia
com a percentagem de mtDNA mutado. Pacientes com
>85% do DNA mutado apresentam os sintomas mais
graves no sistema nervoso central, aqueles com 5–30%
do DNA mutado frequentemente apresentam-se com
diabetes mellitus de herança materna e surdez.
Cortesia de Dr. D. N. Landon, Institute of Neurology,
University of London.
A consequência bioquímica dessas duas mutações
em tRNAs é síntese proteica mitocondrial deficiente,
levando a atividades diminuídas do complexo I e da ci
tocromo coxidase.
Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse.
Science 283:1482, 1999.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.6
Intolerância a Exercício em Pacientes com Mutações no Citocromo b
Em 1993, uma mutação no citocromo b, resultando
em atividade diminuída do complexo citocromo bc1,
foi encontrada em um homem de 25 anos de idade
que se apresentava com intolerância a exercício e fra
queza proximal. A mutação substituiu um resíduo de
glicina conservado por um de aspartato na posição
290. Subsequentemente, demonstrou-se que outros
pacientes com sintomas semelhantes e atividade di
minuída do complexo bc1 tinham mutações nas quais
um glutamato substituiu uma glicina conservada na
posição 339, e uma serina substituiu uma glicina con
servada na posição 34. Mais recentemente, demons
trou-se que um paciente com severa cardiomiopatia
hipertrófica tinha uma mutação na qual um glutama
to substituiu uma glicina conservada na posição 166.
As mutações de glicina para aspartato ou glutamato
estavam localizadas no citocromo b próximo ao sítio
QO para oxidação de ubiquinol, enquanto a mutação
glicina para serina localizava-se próxima do sítio Qi
da redução de ubiquinona. Todas essas mutações en
volviam uma transição de guanina para adenina no
mtDNA, sugerindo que a mutação pode ter resultado
14.10 ESPÉCIES REATIVAS
DE OXIGÊNIO (ROS,
REACTIVE OXYGEN
SPECIES)
Oxigênio é essencial para a vida. A maioria das
oxidações intracelulares resulta na transferência de
dois elétrons para aceptores apropriados, como NAD+
ou FAD, que são depois oxidados na cadeia de trans
porte de elétrons. A etapa final dessa cadeia é catali
sada pela citocromo c oxidase, que liga O2 fortemente
ao centro binuclear, onde redução passo a passo do O2
ocorre, sem liberação de intermediários do processo
de oxidação (ver Seção 14.6). A estrutura eletrônica do
O2, entretanto, favorece sua redução por adição de um
elétron de cada vez, levando à geração de radicais de
oxigênio que podem causar dano celular. Um radical é
uma molécula com um elétron não-pareado muito re
ativo em um orbital externo, que pode iniciar reações
em cadeia por remoção de um elétron de outra molécu
la para completar seu próprio orbital. A transferência
passo a passo de elétrons para O2 resulta na formação
sequencial de ânions superóxido (O2–), peróxido de hi
drogênio (H2O2), e finalmente radical hidroxila livre
(OH·) (Figura 14.56). O radical hidroxila é, sem dúvida,
o radical livre mais perigoso, uma vez que está envolvi
do em reações como peroxidação de lipídeos e geração
• 601
de dano oxidativo. Além disso, em todas as mutações
de sentido errado (missense), uma glicina conserva
da foi substituída por uma molécula carregada maior,
o que alterou a estrutura do citocromo b, resultando
em atividade catalítica diminuída do complexo bc1.
Mutações sem sentido (nonsense) resultando em ci
tocromo b truncado e mutações envolvendo deleções
de quatro a 24 pares de bases do mtDNA foram iden
tificadas. Essas mutações nonsense e por deleções
frequentemente levam a grave intolerância ao exer
cício, acidose láctica no estado de repouso e, ocasio
nalmente, mioglobinúria. Diferentemente da maioria
das mutações no mtDNA, as mutações identificadas
no gene do citocromo b não são de herança materna.
Além disso, a maioria foi expressa apenas em teci
dos musculares, sugerindo que sejam mutações so
máticas que ocorreram durante a diferenciação das
células-tronco miogênicas.
Andreu, A. L., Hanna, M. G., Reichmann, H., Bruno, C., et
al. Exercise intolerance due to mutations in the cytochrome b
gene of mitochondrial DNA. N. Engl. J. Med. 341:1037, 1999.
de outros radicais tóxicos. O peróxido de hidrogênio
não é um radical livre, mas é convertido pelas reações
de Fenton ou de Haber-Weiss no radical hidroxila em
presença de Fe2+ ou de Cu+, que são abundantes nas
células (Figura 14.57).
O2
Oxigênio
1ei
O2i
Superóxido
1ei+2H+
H2O2
Peróxido de Hidrogênio
1ei+1H+
H2O + OH‡
Radical Hidroxila
1ei+1H+
H2O
Água
FIGURA 14.56 Etapas de um elétron na redução do
oxigênio, levando a formação das espécies reativas de
oxigênio superóxido, peróxido de hidrogênio e radical
hidroxila.
602 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Reação de Fenton
Bactérias OH‡
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH‡ + OHi

Fe2+
O2 Reação de Haber²Weiss H2O2
H+
i + H2O2 O2 + H2O + OH‡
O2i
FIGURA 14.57 As reações de Fenton e Haber–Weiss para O2
formação de radical hidroxila tóxico.
Cyt. b

Produção de Espécies Reativas de
Oxigênio
Embora processos oxidativos em células geralmente
resultem na transferência de elétrons para o O2 para
formar água sem a liberação de intermediários, um pe
queno número de radicais de oxigênio é inevitavelmen
te formado em decorrência do vazamento nas reações
de transferência de elétrons. A principal fonte intrace
lular de radicais de oxigênio é a cadeia de transporte de
elétrons mitocondrial, na qual o superóxido é produzido
por transferência de um elétron para O2 a partir da se
miquinona estável produzida durante a redução de ubi
quinona pelos complexos I e II, ou durante a oxidação
de ubiquinol pelo complexo III (Figura 14.58). O supe
róxido também pode ser produzido por transferência de
um elétron de uma flavina, como FMN. As espécies rea
tivas de oxigênio produzidas nas mitocôndrias incluem
superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxila.
Espécies tóxicas de oxigênio também são produzidas
em peroxissomos, nos quais ácidos graxos de cadeia
longa e outros compostos são oxidados por transferên
cia de dois elétrons do FADH2 para o O2, com formação
do peróxido de hidrogênio, que é facilmente converti
do no radical hidroxila (ver Figura 14.56). O sistema
NADPH NADP+
FIGURA 14.59 Explosão respiratória (ou burst
respiratório) em fagócitos.
Uma cadeia de transferência de elétrons envolvendo um cito
cromo b singular transfere elétrons do NADPH para o oxigênio,
com a formação de ânion superóxido. Superóxido é convertido
em radical hidroxila, que mata bactérias, subsequentemente
endocitadas por fagócitos.
citocromo P450 localizado no retículo endoplasmático
também pode produzir radicais de oxigênio.
Uma fonte adicional de ROS em muitos tecidos no
corpo, incluindo neutrófilos, é o sistema oxidase NA
DPH-dependente ligado à membrana. A inflamação por
infecção bacteriana em neutrófilos resulta em ativação
da NADPH oxidase, que produz superóxido em um pro
cesso conhecido como explosão respiratória (ou burst
respiratório). A conversão de superóxido em radical hi
droxila mata as bactérias, que são depois englobadas
por fagócitos (Figura 14.59). Em uma infecção aguda, a
produção de radicais de oxigênio e a morte de bactérias
são processos eficientes; entretanto, em infecções pro
longadas, os fagócitos tendem a morrer, liberando radi
cais de oxigênio tóxicos, que afetam as células vizinhas.

Além de sua presença em fagó

Complexo I citos, diferentes formas de NADPH
NADH oxidase foram descritas em muitos
FMNCentros
tecidos do corpo, onde são a princi
FeS pal fonte não-mitocondrial de ROS.
NAD+ O papel fisiológico dessas NADPH
Complexo III Complexo IV oxidases em tecidos cardiovascula
UQ 1i2O2
res inclui processos celulares como
Citocromo
Citocromoc1
b Citocromo c CitocromoaCitocromoa3
transdução de sinal, proliferação
Proteína FeS Ìons Cu celular e apoptose. Evidências suge
UQH‡ H2O
rem que o excesso de NADPH oxida
+O2
se pode gerar ROS que contribuem
Succinato para condições patológicas como
FADCentros O2i
aterosclerose, hipertensão e outras
FeS doenças vasculares (Correlação Clí
Fumarato nica 14.7).
Complexo II
Radiação cósmica, ingestão de
FIGURA 14.58 Geração de ânions superóxido pela cadeia mitocondrial de
compostos químicos e drogas, bem
transporte de elétrons.
A semiquinona formada durante a redução por dois elétrons da ubiquinona pelos cen como fumaça, podem levar à for
tros ferro-enxofre de ambos os complexos I e II pode transferir um elétron para o oxigê mação de espécies reativas de oxi
nio para formar o ânion superóxido. Diferentemente, o centro binuclear da citocromo c gênio. Lesões causadas por espécies
oxidase impede a liberação de intermediários na redução de oxigênio. reativas de oxigênio frequentemen
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.7
NADPH Oxidase (NOX) na Saúde e na Doença
A descoberta e a caracterização de uma oxidase
NADPH-dependente (NOX) em células fagocitárias su
geriu que esse tecido era a única localização de NOX no
corpo, onde seu papel fisiológico era produzir grandes
quantidades de superóxido para matar micróbios. A elu
cidação das propriedades bioquímicas da NOX fagocíti
ca também se beneficiou de estudos de pacientes com
doença granulomatosa crônica, que se apresenta como
uma incapacidade dos indivíduos afetados combaterem
infecções em virtude de mutações na NOX, o que leva
à perda de capacidade de produzir quantidades ade
quadas de superóxido. O desenvolvimento recente de
métodos mais sensíveis para detectar as espécies rea
tivas de oxigênio, superóxido e peróxido de hidrogênio,
indicou que a NOX era mais amplamente distribuída no
corpo e que, além disso, ROS poderia contribuir para
processos fisiológicos em tecidos não-fagocíticos. Sub
sequentemente, sete diferentes isoformas da família da
NOX foram identificadas em quase todos os tecidos do
corpo. O papel da NOX e da produção de superóxido em
tecidos não-fagocíticos ainda não foi completamente es
clarecido, uma vez que os baixos níveis dessas enzimas
impedem medidas diretas; entretanto, NOX em todos
os tecidos é ativada por vários estímulos e pode dispa
rar vias de sinalização redox-sensíveis que estão envol
vidas na ativação endotelial, no crescimento celular e
te ocorrem durante a perfusão de tecidos com soluções
contendo altas concentrações de O2, como acontece em
pacientes que sofreram um episódio isquêmico no qual
níveis localizados de O2 estavam reduzidos, em virtude
de um bloqueio de uma artéria e, depois, passaram por
procedimentos trombolíticos ou outros processos para
remover o bloqueio (Correlação Clínica 14.8).
Dano Causado por Espécies Reativas
de Oxigênio
Espécies reativas de oxigênio causam danos a todas
as principais classes de macromoléculas das células. Os
fosfolipídeos das membranas plasmática e de organelas
estão sujeitos a peroxidação de lipídeos, uma reação
em cadeia de radicais livres, iniciada pela remoção de
hidrogênio de um ácido graxo poli-insaturado por um
radical hidroxila. Os radicais lipídicos resultantes rea
gem, então, com O2, formando radicais peróxi de lipíde
os e peróxidos de lipídeos, juntamente com malondial
deído, que é solúvel em água e pode ser detectado no
sangue. O efeito da peroxidação de lipídeos no homem
é exemplificado pelas manchas escuras comumente ob-
• 603
na apoptose. Estudos recentes revelaram a presença
de três isoformas distintas de NOX em tecidos cardio
vasculares, músculo liso, endotélio, cardiomiócitos e
adventícia vascular. Acredita-se que essas isoformas de
NOX contribuam para a manutenção do tônus vascular,
proliferação celular, angiogênese e apoptose. Além do
papel da NOX nessas vias, a via regulatória de manuten
ção do tônus vascular reflete uma interação complexa
entre ROS e espécies reativas de nitrogênio (NO) pro
duzidas pela óxido nítrico sintase endotelial.
Apesar do papel benéfico de NOX em processos ce
lulares, o excesso de ROS gerado por NOX pode re
sultar em numerosas condições patológicas, incluindo
disfunção da célula endotelial, que contribui para ate
rosclerose, hipertensão, insuficiência cardíaca con
gestiva, lesão por isquemia/reperfusão e problemas
vasculares associados com diabetes. A investigação
contínua do papel que a NOX desempenha na fisiologia
normal e em processos patológicos fornecerá informa
ções quanto ao desenvolvimento de terapias necessá
rias para o combate de doenças crônicas que assolam
os seres humanos.
Nauseff, W. M. Biological roles for the NOX family NADPH
oxidases. J. Biol. Chem. 283:16961, 2008.
servadas nas mãos de idosos. Essas manchas “da idade”
contêm o pigmento lipofuscina, que é provavelmente
uma mistura de lipídeos unidos por ligações cruzadas e
produtos da peroxidação de lipídeos, que se acumulam
ao longo de toda uma vida. Uma consequência
ência signifi
cativa da peroxidação de lipídeos é permeabilidade au-au
mentada de membranas, levando a um influxo de Ca2+
e outros íons, com subsequente inchamento da célula.
Aumentos semelhantes na permeabilidade de membra
nas de organelas podem resultar em má-distribuição de
íons e causar dano intracelular. Por exemplo, acúmulo
de quantidades excessivas de Ca2+ nas mitocôndrias
pode desencadear apoptose.
Prolina, histidina, arginina, cisteína e metionina são
susceptíveis a ataque por radicais hidroxila, com sub
sequente fragmentação de proteínas, ligação cruzada e
agregação. Proteínas danificadas por radicais de oxigê
nio podem ser alvos de digestão por proteases intrace
lulares.
A consequência
ência mais importante dos radicais de oxi
gênio é o dano ao DNA mitocondrial e nuclear, resultan
do em mutações. A ligação não-específica de íonss ferro
so (Fe2+) ao DNA pode resultar em formação localizada
604 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 14.8
Lesão por Reperfusão do Miocárdio
A oclusão de uma artéria coronária importante du
rante infarto do miocárdio resulta em isquemia ou su
primento diminuído de oxigênio para a área afetada, le
vando a células danificadas, o infarto. Após um infarto
agudo do miocárdio, a reperfusão precoce com terapia
adequada resulta em redução do tamanho do infarto e
um melhor prognóstico clínico para o paciente. A res
tauração do fluxo sanguíneo no tecido isquêmico, en
tretanto, pode danificar o coração em um processo de
nominado lesão por reperfusão do miocárdio. Durante a
reperfusão, o miocárdio isquêmico fica sujeito a mudan
ças bioquímicas rápidas, que podem causar ainda mais
danos ao miocárdio. Essas mudanças incluem a rápida
restauração da transferência de elétrons pela cadeia de
transporte de elétrons mitocondrial, com a concomitan
te geração de ROS, que também são geradas pela xan
tina oxidase presente em células endoteliais e, algumas
horas mais tarde, pela NADPH oxidase localizada em
neutrófilos. Esses níveis aumentados de ROS causam
dano ao coração, por contribuírem com a sobrecarga de
Ca2+ intracelular, restauração rápida do pH intracelular
e inflamação. O aumento no Ca2+ intramitocondrial leva
à abertura do poro de transição mitocondrial (MRP),
que desencadeia apoptose e subsequente morte celular.
ROS também danificam o retículo sarcoplasmático e a
membrana celular por peroxidação de lipídeos, indu
zem desnaturação de enzimas e causam dano oxidativo
ao DNA. O rápido aumento nos níveis intracelulares de
ATP, que ocorre quando oxigênio é introduzido durante
a reperfusão, em decorrência do estímulo da transfe
rência de elétrons estímulo mitocondrial, combinado
com os altos níveis de Ca2+ intracelular e restauração
do pH fisiológico, pode resultar em hipercontratura e
resultante morte dos cardiomiócitos.
de radicais hidroxila, que atacam bases individuais e
causam quebras de fitas. O DNA mitocondrial é mais
susceptível ao dano, uma vez que a cadeia de transporte
de elétrons é uma fonte importante de radicais tóxicos
de oxigênio. Além disso, o DNA nuclear está protegido
de dano permanente por uma capa protetora de histo
nas, bem como por mecanismos ativos e eficientes de
reparo do DNA. Dano ao mtDNA geralmente resulta em
mutações que afetam a produção de energia. Os sinto
mas nos indivíduos afetados são manifestados em pro
cessos que requerem energia, como a contração mus
cular. Um exemplo das consequências de uma mutação
somática no gene mitocondrial do citocromo b que pode
ter sido causada por radicais de oxigênio é apresentado
na Correlação Clínica 14.6.
A formação de ROS durante a reperfusão do mio
cárdio também resulta em níveis diminuídos de óxido
nítrico (NO), uma importante molécula sinalizadora,
reduzindo assim seus efeitos protetores como acúmulo
de neutrófilos, inativação de radicais superóxido e me
lhora do fluxo sanguíneo coronário. Durante a reper
fusão do coração isquêmico, a presença do radical de
oxigênio peroxinitrito (ONOO–), produzido a partir de
NO e superóxido, foi observada. O peroxinitrito tam
bém pode contribuir para a baixa recuperação da fun
ção mecânica em corações isquêmicos.
A isquemia/reperfusão do miocárdio representa
um problema clínico associado com trombólise, an
gioplastia e cirurgia para colocação de pontes coroná
rias (bypass). Lesões no miocárdio, em decorrência
de isquemia/reperfusão incluem disfunção contrátil
cardíaca, arritmias e dano irreversível aos miócitos. A
isquemia também pode surgir durante cirurgia, espe
cialmente durante transplante de tecidos. Pesquisas
atuais de possíveis intervensões para evitar lesão por
reperfusão concentram-se no melhor entendimento dos
fatores envolvidos na lesão, especialmente a abertura
de PTP mitocondrial, que resulta em morte celular por
apoptose. Ensais clínicos estão em andamento para tes
tar novas hipóteses para reduzir a lesão por reperfusão.
O uso aumentado de procedimentos invasivos na clí
nica médica indica a importância do desenvolvimento
de métodos para proteger contra a lesão por isquemia/
reperfusão.
Yellon, D. M. e Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion in
jury. N. Engl. J. Med. 357:1121, 2007.
Defesas Celulares Contra Espécies
Reativas de Oxigênio
élulas que vivem em um ambiente aeróbico de
Células
senvolveram múltiplas formas para remover espécies
reativas de oxigênio e, assim, se protegem contra seus
efeitos deletérios. Os mamíferos têm três isozimas dife
rentes da superóxido dismutase, que catalisam a con
versão de superóxido em peróxido de hidrogênio (Figu
ra 14.60). A forma citosólica da supersóxido dismutase
contém Cu/Zn no seu sítio ativo, assim como a enzima
extracelular; entretanto, a enzima mitocondrial contém
Mn no seu sítio ativo. O peróxido de hidrogênio é remo
vido pela catalase, uma enzima contendo heme presen
te nas concentrações mais altas em peroxissomos e, em
menor escala, em mitocôndrias e citosol.
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 605

OH‡ para evitar a necrose hepática induzida pelo analgésico

2H+ O2 Fe2+ H2O2
comum acetaminofen (vendido como Tylenol, Panadol
ou Paracetamol), especialmente em crianças pequenas.
2O2i Superóxido H2O2 Catalase 2H2O + O2
A proteção contra espécies reativas de oxigênio
dismutase
também pode ser obtida por ingestão de agentes que re
FIGURA 14.60 Superóxido dismutase e catalase protegem movem oxigênio (oxygen scavengers), como vitamina
as células por removerem superóxido e peróxido de C e E e β-caroteno. Evidências recentes indicaram que
hidrogênio. substâncias presentes no chá verde, em berries (espe
cialmente mirtilo ou blueberries) e em vinho tinto po
dem também proteger contra o dano oxidativo por ROS.
A glutationa peroxidase catalisa a redução de peró
xido de hidrogênio e de peróxidos de lipídeos (Figura
Glutationa
14.61). Essa enzima contendo selênio usa os grupos sul peroxidase
fidrila da glutationa (GSH) como doador de hidrogênio H2O2 2 H2O
com formação da forma oxidada ou dissulfeto da gluta
tiona (GSSG). A Glutationa redutase converte a forma 2GSH GSSG
NADPH + H+
dissulfeto de volta na forma sulfidrila usando o NADPH
produzido na via das pentoses fosfatos como doador Glutationa
de elétrons. A importância do NADPH na manutenção redutase

dos níveis de glutationa e, assim, na prevenção do dano FIGURA 14.61 Glutationa peroxidase remove peróxido
oxidativo àsàs célulascélulascélulas ééé manifestadamanifestadamanifestada nanana doençadoençadoença heredi-heredi-heredi de hidrogênio bem como peróxidos de lipídeos.
tária que resulta em baixos níveis de glicose 6-fosfato Elétrons são transferidos para o peróxido de hidrogênio dos
desidrogenase (ver Correlação Clínica 16.1, p. 669), na grupos sulfidrila da glutationa reduzida (GSH), para formar
qual o estresse oxidativo resulta em anemia hemolíti água e glutationa oxidada (GSSG). A glutationa redutase, en
ca aguda. Os níveis de glutationa no fígado são críticos tão, reduz GSSG a GSH, com NADPH como agente redutor.

Bibliografia
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Mitocondriais
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Termos Chaves
adenina nucleotídeo trans- centros ferro–enxofre complexo IV: citocromo c espécies reativas de oxi
locase ciclo do ácido tricarboxílico oxidase gênio
adenosina trifosfato citocromo b, citocromo c constante de equilíbrio F1F0
ATP sintase
anabolismo
cadeia
catabolismo
elétrons
de transporte de complexo I: NADH-ubiqui desacopladores flavina adenina dinucleo
nona óxido-redutase DNA mitocondrial tídeo
complexo II: succicinato doenças mitocondriais flavina mononucleotídeo
-ubiquinona óxido-redutase energia livre força próton-motiva
complexo III: ubiquinol-ci equivalente de redução fosforilação oxidativa
catalase tocromo c óxido-redutase
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO • 607

glicerol 3-fosfato desidro- matriz mitocondrial piruvato desidrogenase reações exergônicas

genase membrana mitocondrial potencial de oxidação succinato desidrogenase
glutationa externa -redução superóxido dismutase
glutationa peroxidase membrana mitocondrial processos biossintéticos tiamina pirofosfato
lançadeiras para equivalen- interna radicais livres hidroxila transporte de substrato
tes de redução nicotinamida adenina razões P/O mitocondria
ligações de alta energia dinucleotídeo
reações anapleróticas ubiquinona-ubiquinoll
lipoamida par redox
reações endergônicas

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha E. ao ADP para
a energia é usada
formar
diretamente
ATP. na adição de Pi
1. Uma ligação pode ser de alta energia por qualquer
das seguintes razões, exceto 5. ATP sintase (também conhecida como Complexo
A. produtos de sua quebra são estabilizados por V) consiste de dois domínios, F1 e F0.
mais ressonâncias do que o composto original. A. Fgrais
1 e F
de0 são ambos complexos proteicosicos inte-inte

B. a ligação é excepcionalmente estável, reque membrana da membrana externa.

rendo um investimento de muita energia para
clivá-la.
C. a repulsão eletrostática é aliviada quando a li
gação é clivada.
D. um produto de clivagem pode ser instável, tau
tomerizando para uma forma mais estável.
E. a ligação pode ser tensa.
2. Todos os seguintes intermediários do ciclo dos áci
dos tricarboxílicos podem ser adicionados ou re
movidos por outras vias metabólicas, exceto
A. citrato.
B. fumarato.
C. isocitrato.
D. α-cetoglutarato.
E. oxaloacetato.
3. A membrana mitocondrial interna contém um
transportador para
A. NADH.
B. acetil-CoA.
C. GTP.
D. ATP.
E. NADPH.
4.
Durante a transferência de elétrons para o O2 via
cadeia de transporte de elétrons mitocondrial,
A. a energia liberada é utilizada para deslocar
prótons através da membrana interna.
B. um gradiente de próton é gerado, com a matriz
ficando mais positiva do que o espaço inter
membranas.
C. o bombeamento de protons através da membra
ne ocorre a cada vez que os elétrons se movem.
D. nenhum gradiente de cargas se desenvolve
porque um OH– se move a cada vez que um
próton o faz.
B. Omento
domínio
de prótons
F1 fornece um da
através canal
membrana.
para desloca
C. F1 liga ATP, mas não ADP.
D. O domínio F1 catalisa a síntese de ATP.
E. bunidade.
Apenas o domínio F0 contém mais de uma su
6. Todas as seguintes alternativas são corretas, exceto
A. espécies reativas de oxigênio (radicais de oxi
gênio) resultam quando há adição combinada
de quatro elétrons de uma vez ao O2.
B. ânion superóxido (O2–) e radical hidroxila
(·OH) são duas formas de oxigênio reativo.
C. superóxido dismutase é uma enzima de ocor
rência natural que protege contra danos por
converter O2– em H2O2.
D. espécies reativas de oxigênio danificam fosfo
lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos.
E. glutationa
água. protege contra H2O2 por reduzi-lo a
Questões 7 e 8: Uma criança apresentava defeitos
neurológicos graves. Exames de sangue indicaram ní
veis séricos elevados de lactato, piruvato e alanina.
Culturas de fibroblastos de pele mostraram atividade
deficiente do complexo piruvato desidrogenase. Mais
estudos poderiam indicar qual subunidade do comple
xo está defeituosa, embora os efeitos metabólicos se
jam essencialmente os mesmos, independentemente de
qual subunidade está defeituosa.
7. A forma ativa da piruvato desidrogenase é favore
cida pela influência de todos os seguintes sobre a
piruvato desidrogenase quinase, exceto
A. baixa [Ca2+].
B. baixa acetil-CoA/CoASH.
C. alta [piruvato].
D. baixa NADH/NAD+.
608 • PARTE IVVIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

8. Suponha que o defeito específico era uma piruvato Questões 11 e 12: Cianeto é um veneno potente e de
desidrogenase mutada (a primeira subunidade ca ação rápida. Liga-se ao heme do citocromo a3 da cito
talítica), com fraca ligação com seu grupo prosté cromo oxidase. Morte ocorre por anóxia tecidual, es
tico. Nesse tipo de defeito, às vezes um grande au pecialmente no sistema nervoso central. Um antídoto
A.
mento, na dieta, do precursor do grupo prostético, para o envenenamento por cianeto, que deve ser usa
ajuda. Nesse caso, aumento de qual dos seguintes do rapidamente, é a administração de um nitrito para
poderia ser útil? converter oxi-hemoglobina em meta-hemoglobina. A
Ácido lipoico. meta-hemoglobina compete com o citocromo a3 pelo
cianeto.
B. Niacina (para NAD).
C. Ácido pantotênico (para CoA). 11. Cianeto
D. Riboflavina (para FAD). A. só inibe minimamente a cadeia de transporte
E. Tiamina (para TPP). de elétrons porque a citocromo oxidase é um
componente terminal da cadeia.
Questões 9 e 10: Existe um número de doenças mito B. inibe a respiração mitocondrial, mas a produ
condriais decorrentes de mutações em genes mitocon ção de energia não é afetada.
driais que codificam proteínas mitocondriais outRNAs
C. também liga o cobre da citocromo oxidase.
mitocondriais. A Neuropatia Óptica Hereditária de Le
D. liga-se ao Fe3+ do citocromo a3.
ber (LHON) decorre de trocas de uma única base nos
genes mitocondriais que codicam três subunidades do E. o envenenamento também poderia ser reverti
complexo I, diminuindo sua atividade. LHON afeta o sis do por aumento na concentração de O2.
tema nervoso central, incluindo o nervo óptico, causan
do cegueira de início súbito no início da idade adulta.
12. Se cianeto for adicionado a mitocôndrias acopla
9. O complexo I das, que estão oxidando ativamente succinato,
A. transfere elétrons diretamente do NADH para A. adição subsequente de 2,4-dinitrofenol causa
ubiquinona. rá hidrólise de ATP.
B. pode transferor elétrons do NADH2 para a suc B. adição subsequente de 2,4-dinitrofenol res
cinato desidrogenase, bem como para NADH. taurará a oxidação de succinato.
C. não contém centros ferro–enxofre. C. o fluxo de elétrons vai parar, mas a síntese de
D. transfere elétrons acoplados ao transporte de ATP continuará.
quatro prótons através da membrana. D. o fluxo de elétrons vai parar, mas a síntese de
E. éé consideradoconsideradoconsiderado umumum transportadortransportadortransportador móvelmóvelmóvelmóvel dededede elé-elé-elé-elé ATP pode ser restaurada por adição subse
tronsporque pode percorrer a face externa da quente de 2,4-dinitrofenol.
membrana interna. E. adição subsequente de 2,4-dinitrofenol e do
10. Uma incapacidade de reoxidar NADH em decor inibidor de fosforilação oligomicina causará
rência de um defeito do complexo I hidrólise de ATP.
A. inibiria a isocitrato desidrogenase e, portanto, Problemas
diminuiria a velocidade do ciclo TCA.
13. Para a reação A  B, DG0! = –29,7 kJ/mol. A 37°C,
B. forçaria o equilíbrio oxaloacetato–malato em
–2,303 RT = –5,94 kJ/mol. Qual a razão de equilí
direção ao oxaloacetato.
brio B/A?
C. estimularia a lançadeira α-glicerol fosfato a
transportar equivalentes de redução. 14. Usando piruvato marcado com 14C em seu grupo
ceto, pela reação da piruvato desidrogenase do ci
E. causaria a difusão livre de NADH da mitocon
clo TCA, onde o carbono marcado estaria ao final
dria para o citosol.
de uma volta do ciclo TCA? Onde o carbono marca
D. forçaria o equilíbrio succinato-fumarato em do estaria ao final da segunda volta do ciclo?
direção ao succinato.

Respostas
1. B Alta energia não se refere a uma alta energia de côndria para ser usado como uma fonte de acetil
formação (estabilidade da ligação). Uma ligação de -CoA citoplasmático. B: fumarato é produzido du
alta energia é assim designada porque tem uma rante a degradação de fenilalanina e tirosina. D:
alta energia livre de hidrólise. Isso poderia surgir α-cetoglutarato pode ser formado a partir de glu
pelas razões A, C, D ou E. tamato. E: oxaloacetato é produzido pela piruvato
2. carboxilase, e é usado na gluconeogênese. Eviden
C A: citrato é transportado para fora da mito
temente, a maioria dos intermediários do ciclo dos
 CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA, MITOCÔNDRIA E METABOLISMO OXIDATIVO
ácidos tricarboxílicos desempenha múltiplas fun
ções no corpo.
3. D ATP e ADP são transportados em direções
opostas. A e B: equivalentes de redução do NADH
são transportados através da membrana, assim
como o grupo acetil do acetil-CoA, mas NADH e
acetil-CoA não podem atravessar. C: dos nucleotí
deos, só ATP e ADP são transportados. E: como
NADH, NADPH não atravessa a membrana.
4. A Essa é a utilização direta da energia. B: o movi
mento de prótons é da matriz para o espaço inter
membranas, de forma que o último se torna mais
positivo. C: só alguns transportadores de elétrons
têm energia suficiente para bombear prótons. D:
nenhum íon negativo é transportado com o próton,
de modo que surge um gradiente de cargas. E: a
energia é necessária para liberar o ATP da subuni
dade, não para a síntese em si.
5. D Isso está correto. A: ambos ficam associados
com a membrana mitocondrial interna. B: essa é a
função do domínio F0. C: ambos ligam-se e síntese
de ATP ocorre. E: mudanças de conformação de di
ferentes subunidades são importantes nas ações de
ambos os domínios.
6. A A transferência de quatro elétrons para o oxi
gênio produz água. Radicais de oxigênio ocorrem
quando elétrons são adicionados passo a passo ao
O2. B: H2O2 também é incluído como oxigênio reati
vo porque pode produzir ·OH. C: H2O2 é degradado
pela catalase. D: todos esses estão sujeitos a oxida
ção, com efeitos deletérios. E: a glutationa peroxi
dase catalisa essa reação.
7. A Ca2+ elevado favorece a desidrogenase ativa,
mas por ativação da fosfatase. B, C e D: NADH e
acetil-CoA ativam a piruvato desidrogenase quina
se, inativando assim a piruvato desidrogenase. O
piruvato inibe a quinase, favorecendo a desidroge
nase ativa.
8. E TPP é o cofator da primeira reação, que des
carboxila o piruvato. A e C: esses são cofatores da
di-hidrolipoil transacetilase. B e D: esses são cofa
tores da di-hidrolipoil desidrogenase.
9. D Isso contribui para a força próton-motiva ne
cessária para a síntese de ATP. A e C: a transfe
rência não é direta, mas ocorre por FMN e centros
FeS. B: elétrons são transferidos do NADH para
FMN ligados a uma das subunidades do complexo
• 609
I, mas o complexo I não pode reagir com a succina
to desidrogenase. E: este é o citocromo c.
10. A Essa é a enzima chave reguladora do ciclo TCA.
B: malato é a forma reduzida, de modo que seria
favorecido. C: a enzima citossólica usa NADH e
transporta equivalentes de redução para dentro da
mitocôndria. A enzima mitocondrial é FAD-ligada.
D: NADH não atravessa a membrana. E: essa rea
ção é FADH2-ligada.
11. D É por isso que a meta-hemoglobina é um antí
doto eficiente, uma vez que também tem Fe3+. B:
respiração e produção de energia são acopladas, de
modo que inibindo uma, inibe a outra também. C:
cobre é uma parte importante da citocromo oxida
se, mas o cianeto não se liga a ele. E: o problema é
a incapacidade de reagir com O2, não falta de O2.
12. A O cianeto inibe o transporte de elétrons no sí
tio III, bloqueando o fluxo de elétrons pelo sistema.
Em mitocôndrias acopladas, a síntese de ATP tam
bém para. A adição de um desacoplador permite
que a ATPase mitocondrial (que está normalmente
dirigida no sentido da síntese) opere e catalise a
reação favorável de hidrólise de ATP, a menos que
seja inibida por um inibidor de fosforilação, como a
oligomicina.
13. DG0! =−RTln K=−2,303 RTlog K. Substituição dá
log K = 5. K é, então, 100.000, de modo que B/A =
100.000/1.
14. O carbono ceto marcado do piruvato torna-se o
carbono da carboxila marcada no acetil-CoA. Após
condensação com oxaloacetato, o primeiro gru
po carboxila do citrato fica marcado. Essa marca
é retida nas reações subsequentes até succinato.
Entretanto, o succinato é um composto simétrico
para a enzima, de modo que, na realidade, ambos
os grupos carboxila do succinato ficam marcados.
Isso significa que o oxalato regenerado é marcado
em ambos os grupos carboxila ao final de uma volta
(na verdade, metade das moléculas é marcada em
um grupo carboxila e metade no outro, mas isso
não pode ser diferenciado experimentalmente).
Note que CO2 não é marcado. Na segunda volta,
acetil-CoA marcado na mesma carboxila é adicio
nado, mas, desta vez, ao oxaloacetato marcado.
Ambos os grupos carboxila do oxaloacetato são
liberados como CO2, de modo que este estará mar
cado, bem como o oxaloacetato regenerado.
610 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
15
PARTE IV
Vias Metabólicas e seu controle
CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 611

Metabolismo
Glicogênio G C
de Carboidratos I:
Principais Vias
Metabólicas e Seu Controle
Robert A. Harris
Professor Emérito Distinto e Professor Eméritoérito ��o���ter��o���ter �e�e �io���mi����io���mi��� �n�i�n��n�i�n� �ni�er��ni�er�
sity ���oo� of Me�i�ine

15.1 INTRODUÇÃO, 612

CONTEÚDO 15.3 Intolerância a Frutose, 626
15.4 Diabetes Mellitus, 628
15.4 VIA
15.2
15.3
15.5 GLICÓLISE,
GLUCONEOGÊNESE,
REGULAÇÃO
GLICOLÍTICA,
612
DA GLICÓLISE,
616638 623 15.5 Acidose Láctica, 630
15.6 “Picles” de Porco e Hipertermia Maligna, 631
15.7 Angina Pectoris e Infarto do Miocárdio, 632
15.8 Deficiência de Piruvato Quinase e Anemia Hemo�
15.6
CORRELAÇÕES
GLICOGENÓLISE
CLÍNICAS
E GLICOGÊNESE, 648 lítica, 638
15.9 Hipoglicemia e Bebês Prematuros, 639
15.10 Hipoglicemia e Intoxicação Alcoólica, 648
15.1 Álcool e Barbituratos, 622 15.11 Doenças de Armazenamento de Glicogênio, 653

15.2 Envenenamento por Arsênico, 624

Conceitos Chaves
• ca
mamíferos
A glicose épara
(ausênciametabolizada
de formar
oxigênio)
ATP.
por
produz
Atodas as células
glicólise
duas moléculas
anaeróbi�
de da glicólise e é regulada tanto negativamente como
positivamente por efetores alostéricos.
• Gluconeogênese, a formação de glicose a partir
de lactato e de ATP a partir de uma molécula de
de substratos não�carboidratos, é necessária para
glicose. A glicólise aeróbica (presença de oxigênio)
manter a glicose sanguínea e envolve as enzimas
produz duas moléculas de NADH e de piruvato. O
glicolíticas que catalisam reações reversíveis. As rea�
NADH deve ser reoxidado para que a glicólise con�
ções da glicólise que são irreversíveis são contorna�
tinue.
das por reações específicas da gluconeogênese. Al�
• to�1�quinase
A glicólise éé reguladaregulada
catalisa aemememetapa
trêstrêstrêsde
etapas.etapas.etapas.
comprometimento AAA 6�fosfofru�6�fosfofru�6�fosfofru� guns aminoácidos são glucogênicos, mas os ácidos
graxos com número par de carbonos não são.
612 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

• A gluconeogênese é inibida por insulina e estimu� • A glicogênio sintase existe em uma forma fosfori�
lada por glucagon, mediados pela regulação dos lada, que é dependente para atividade da presença
estados de fosforilação de enzimas regulatórias. de glicose 6�fosfato, um efetor alostérico positivo, e
Efeitos de longo prazo, estimulatórios do glucagon uma forma não�fosforilada, que é independente de
e inibitórios da insulina, sobre a gluconeogênese glicose 6�fosfato.
são mediados por indução e repressão de enzimas
• A glicogênio fosforilase, uma enzima chave na de�
chaves de vias glicolítica/gluconeogênica. gradação do glicogênio, é ativada por AMP e ini�
• Quando a glicose é abundante, o fígado e o músculo bida por glicose e ATP, e é ativada também por
esquelético sintetizam e armazenam glicogênio. O uma cascata de sinalização envolvendo proteína
músculo esquelético utiliza o glicogênio armazena� quinases.
do para a síntese de ATP durante o exercício, e o
• Doenças do armazenamento de glicogênio são cau�
fígado libera glicose a partir do glicogênio quando
sadas por defeitos hereditários em enzimas envol�
os níveis de glicose sanguínea estão baixos. O mús�
vidas na degradação do glicogênio.
culo não libera glicose livre.

15.1 INTRODUÇÃO (glicogenólise) de glicogênio. Muitas células armaze�

nam glicogênio para suas próprias necessidades futu�
As principais vias do metabolismo de carboidratos ras. O fígado é menos egoísta, armazenando glicogênio
começam ou terminam com a glicose (Figura 15.1). principalmente para a manutenção da glicose sanguí�
Este capítulo descreve a utilização da glicose como nea, para garantir que outros tecidos, especialmente o
uma fonte de energia, a formação de glicose a partir de cérebro, tenham um suprimento adequado. A regulação
precursores não�carboidratos, o armazenamento de gli� da síntese e da degradação de glicogênio é um modelo
cose na forma de glicogênio, e a liberação de glicose do para nosso entendimento de como hormônios funcio�
glicogênio. É necessário um entendimento das vias e de nam e como vias metabólicas são reguladas. Esses tó�
sua regulação, em virtude do importante papel desem� picos contribuem para nosso entendimento da condição
penhado pela glicose no corpo. A glicose é a principal diabética, do jejum e de como os tecidos do corpo res�
forma na qual o carboidrato absorvido no trato intesti� pondem ao estresse, trauma severo e lesões.
nal é apresentado às células do corpo. ÉÉ ooo únicoúnicoúnico com�com�com�
bustível usado em quantidades significativas por algu� A química e a nomenclatura dos carboidratos são
mas células especializadas, e é o principal combustível apresentadas no Apêndice.
do cérebro. Portanto, a glicose sanguínea deve ser man�
tida em nívelnível suficientesuficiente parapara satisfazersatisfazer essasessas necessida�necessida�
GLICOGÈNIO
des,, oo tempotempo todo.todo. VáriosVáriosários tecidostecidostecidos dododo corpocorpocorpo desenvolve�desenvolve�desenvolve�
ram uma relação de trabalho coordenada que assegura Glicogenólise Glicogênese
um suprimento contínuo desse substrato essencial para GLICOSE
estas células e para o cérebro. Por outro lado, a glicose
Glicólise Gluconeogênese
é tóxica e pode causar lesão tecidual quando sua con�
centração não é controlada dentro de limites estreitos. LACTATO
Isso ocorre no diabetes e é um fator contribuinte para o
desenvolvimento de aterosclerose, hipertensão, doença FIGURA 15.1 Relação da glicose com as principais vias do
de microvasculatura, doença renal e cegueira. metabolismo de carboidratos.

A discussão começa com a glicólise, uma via usa�

da por todas as células do corpo para extrair parte da
energia química inerente à molécula de glicose. Essa via 15.2 GLICÓLISE
também converte glicose em piruvato e prepara a oxi�
dação completa da glicose a CO2 e H2O. A gluconeogê�
nese, a síntese �e no�o de glicose, é convenientemente
Glicólise Ocorre em Todas as Células
discutida depois da glicólise, porque envolve muitas das Humanas
mesmas enzimas usadas na glicólise, embora as reações
catalisadas ocorram na direção oposta. Diferentemente A via de Embden�Meyerhof, ou glicolítica, representa
da glicólise, que produz ATP, a gluconeogênese requer um processo ancestral, que ocorre em todas as células
ATP e é, portanto, um processo que requer energia. As� do corpo humano, no qual ocorre degradação anaeróbi�
sim, algumas etapas catalisadas por enzimas precisam ca da glicose a lactato, com liberação de energia como
ser diferentes entre a glicólise e a gluconeogênese. Ao ATP. Esse é um exemplo de ferment�ção �n�eróbi��,
longo do capítulo, será enfatizado como a regulação é um termo usado para vias metabólicas que organismos
exercida em enzimas chaves. Isso será particularmente usam para extrair energia química de combustíveis ri�
verdadeiro para a síntese (glicogênese) e a degradação cos em energia, em ausência de oxigênio. Para muitos
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 613

tecidos, a glicólise é só uma via fornecedora de energia DGlicose glicólise 2 piruvato PDH
2 acetil CoA
de emergência, capaz de produzir 2 moles de ATP a par
tir de 1 mol de glicose, em ausência de oxigênio (Figura
2 Llactato 2CO2 TCA 4CO2
15.2). Quando o suprimento de oxigênio de um tecido
é interrompido, os níveis de ATP ainda podem ser man
tidos pela glicólise, pelo menos por um curto período. Nenhum
paraOa2 glicólise
é necessário Necessidade
desidrogenase
de O2(PDH)
para amais
piruvato
Poderiam ser dados muitos exemplos, mas a capacidade atividade do ciclo TCA
de utilizar a glicólise como uma fonte de energia é par
ticularmente importante durante o nascimento natural FIGURA 15.3 A glicólise é uma via preparatória para o
de bebês humanos. Com a exceção do cérebro, a circu metabolismo aeróbico da glicose.
lação do sangue diminui para a maioria das partes do PDH refere-se ao complexo piruvato desidrogenase, TCA ao ciclo
dos ácidos tricarboxílicos.
corpo do bebê durante o parto. Normalmente, o cérebro
não é privado de oxigênio durante o parto, mas outros
glicose). Isso tem importantes consequências a serem
tecidos passam a depender da glicólise para seu supri
consideradas em detalhes mais adiante. A importân
mento de ATP, até que um suprimento normal de oxigê
cia da glicólise como uma via preparatória é mais bem
nio esteja disponível. Isto economiza oxigênio para ser
exemplificada pelo cérebro, que tem uma necessidade
usado pelo cérebro, ilustrando um dos muitos mecanis
absoluta de glicose. O piruvato produzido pela glicólise
mos que evoluíram para assegurar a sobrevivência do
é oxidado a CO2 nas mitocôndrias. Um cérebro humano
tecido cerebral em momentos de estresse. Oxigênio não
adulto usa aproximadamente 120 g de glicose por dia
é necessário para a glicólise; de fato, o oxigênio pode para suprir sua necessidade de ATP. Diferentemente, a
suprimir indiretamente a glicólise pelo efeito Pasteur,
glicólise com lactato como produto final é o principal
que será considerado mais adiante (p. 628). Contudo,
mecanismo de produção de ATP em alguns outros te
a glicólise ocorre em células com um suprimento abun
cidos. Os glóbulos vermelhos não têm mitocôndrias e,
dante de oxigênio molecular. Contanto que as células
portanto, não podem converter piruvato em CO2. A cór
também contenham mitocôndrias, o produto final da
nea, o cristalino e regiões da retina têm um suprimento
glicólise em presença de oxigênio é o piruvato, e não
limitado de sangue, e também são desprovidos de mito
o lactato. O piruvato é, então, completamente oxidado
côndrias (porque as mitocôndrias absorveriam e difra
a CO2 e H2O pelo complexo piruvato desidrogenase e
tariam a luz), e dependem da glicólise como o principal
enzimas do ciclo TCA alojadas dentro das mitocôndrias
mecanismo para produção de ATP. A medula renal, os
(Figura 15.3). A glicólise, portanto, prepara o palco
para a oxidação aeróbica do carboidrato. O processo ge testículos, os leucócitos e as fibras musculares brancas
ral d glicólise e da oxidação mitocondrial do piruvato a têm relativamente poucas mitocôndrias e são, portan
to, dependentes quase que totalmente da glicólise como
CO2 e H2O tem a seguinte equação:
fonte de ATP. Os tecidos que dependem primariamente
D-Glicose(C6H12O6)
→ 6 CO2 + 6 H2O
+ 6+O2
32+ATP4
32 ADP3–
– + 32+OH–P2–i
32 → da glicólise para a produção de ATP, consomem cerca
de 40 g de glicose por dia, em um adulto normal.

Amido é a forma de armazenamento de glicose em

CH2OH plantas e contém ligações a-1,4-glicosídicas e ramifica
O H ções a-1,6-glicosídicas. O glicogênio é a forma de arma
H
zenamento de glicose em tecidos animais e contém os
HO OH H
OH mesmos tipos de ligações glicosídicas e ramificações.
O glicogênio exógeno refere-se ao glicogênio que obte
α'*OLFRVH
H OH
mos de produtos animais; glicogênio endógeno é o sin
tetizado e armazenado em nossos tecidos. O amido ou
2 ADP3i + 2 Pi2i
glicogênio exógeno é hidrolisado a glicose no trato in
2 ATP4i testinal, enquanto o glicogênio endógeno armazenado
em nossos tecidos é convertido em glicose ou glicose-6
O Oi -fosfato por enzimas de dentro das células. Dissacarídeos
C como o açúcar do leite (lactose) e o açúcar de cana
2 HO H
(sacarose) são importantes fontes de glicose na nossa
C
dieta. Sua hidrólise por enzimas da borda em escova
CH3 do trato intestinal é discutida na página 1050. Embora
//DFWDWR
a glicose possa ser uma fonte de energia para as células
FIGURA 15.2 Equação geral balanceada da soma das do trato intestinal, essas células não dependem muito
da glicose; a maior parte de suas necessidades energé
reações da glicólise.
ticas é suprida pelo catabolismo de glutamina (p. 777).
Muito mais ATP é produzido na oxidação comple A maior parte da glicose é absorvida pelas células do
ta da glicose a CO2 e H2O (32 ATP/glicose) do que é trato intestinal para o sangue da veia porta e, depois,
produzido na conversão de glicose em lactato (2 ATP/ para a circulação geral, para uso em outros tecidos. O
614 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

a
A. Glóbulos vermelhos B. Células do tecido cerebral a
Glicose Glicose

b b
Pentoses
fosfato c Glicose 6-P Pentoses
fosfato c
Glicose 6-P

d d

(2) Piruvato
(2) Lactato– (2) CO2 f

(2)H+ e (2) AcetilCoA

(4) CO2

C. Células de tecido muscular a D. Células de tecido adiposo a

e cardíaco Glicose Glicose

b h b
Pentoses
fosfato c d i Pentoses
fosfato c d h
Glicose 6-P Glicogênio Glicose 6-P i Glicogênio

(2) Piruvato– (2) Lactato– (2) Piruvato–

(2) CO2 f (2) CO2 f
(2) H+ e

(2) AcetilCoA (2) AcetilCoA

j
g
Gordura
(4) CO2

E. Células do parênquima a
hepático b
Glicose

Pentoses
fosfato c Glicose 6-P Glicogênio
FIGURA 15.4 Visão geral das principais vias
h pelas quais a glicose é metabolizada dentro
de células de tecidos específicos do corpo.
Glucuronídeos n d l A. Glóbulos vermelhos. B. Células do tecido
i cerebral.C. Células de tecido muscular e cardíaco.
D. Células de tecido adiposo. E. Células do parên�
Glicose m (2) Piruvato (2) Lactato– quima hepático. (�) Transporte de glicose para
(2) CO2 f dentro de uma célula por um transportador de
(2) H+
e glicose (GLUT). (b) Fosforilação da glicose por
(2) AcetilCoA hexoquinase. (�) Via das pentoses fosfato. (�) Gli�
cólise. (e) Transporte de ácido láctico para fora da
j g célula. (f) Descarboxilação do piruvato pela piru�
VLDL VLDL k
Gordura vato desidrogenase. (g) Ciclo TCA. (�) Glicogêne�
(4) CO2 se. (i) Glicogenólise. (j) Lipogênese. (k) formação
e liberação de lipoproteínas de densidade muito
baixa (VLDL). (�) Gluconeogênese. (m) Hidrólise
de glicose 6�fosfato e liberação de glicose da célu�
la para o sangue. (n) Formação de glucuronídeos
(desintoxicação de drogas e bilirrubina por conju�
gação) pela via do ácido glucurônico.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
fígado é o primeiro tecido importante a ter oportunida�
de de remover glicose do sangue da veia porta. Quando
a glicose sanguínea está alta, o fígado remove glicose
para glicogênese e glicólise. Quando a glicose sanguí�
nea está baixa, o fígado fornece glicose ao sangue por
glicogenólise e gluconeogênese. O fígado é também o
primeiro órgão exposto ao sangue que flui do pâncreas
e, portanto, está exposto às concentrações mais altas
de glucagon e insulina. Os efeitos desses importantes
reguladores hormonais dos níveis de glicose sanguínea
serão discutidos mais adiante.
Glicose É Metabolizada
Diferentemente em Várias Células
A glicose é metabolizada principalmente por glicó�
lise em eritrócitos (Figura 15.4A). O transporte atra�
vés da membrana plasmática é catalisado por GLUT1
(transportador de glicose 1; p. 508). Como essas célu�
las são desprovidas de mitocôndrias, o produto final
da glicólise é ácido láctico, que é liberado no sangue.
A glicose usada pela via das pentoses fosfato em eri�
trócitos fornece NADPH para manter a glutationa no
estado reduzido, o que tem um papel importante na
destruição de peróxidos orgânicos e H2O2 (ver Figura
14.61, p. 605). Peróxidos causam danos irreversíveis a
membranas, DNA e outros componentes celulares, e de�
vem ser removidos para evitar lesão
e morte celular. Insulina
O cérebro capta glicose por
transporte facilitado, de modo in�
dependente de insulina, por GLUT3
(transportador de glicose 3) (Fi�
gura 15.4B). A glicólise produz pi�
ruvato, que é subsequentemente
oxidado a CO2 e H2O pelo complexo
piruvato desidrogenase e pelo ciclo
TCA. A via das pentoses fosfato é
ativa nessas células, gerando parte
do NADPH necessário para a síntese
redutora e a manutenção da gluta�
tiona no estado reduzido.
As célulasélulas muscularesmusculares ee cardía�cardía�
cas utilizam prontamente a glicose
(Figura 15.4C). A insulina estimula
o transporte de glicose para dentro
destas células por meio do GLUT4
FIGURA 15.5 Insulina estimula a
captação da glicose pelos tecidos
adiposo e muscular, aumentando
o número de transportadores de
glicose (GLUT4) na membrana
plasmática.
• 615
(transportador de glicose 4). Na ausência de insulina,
GLUT4 existe em vesículas intracelulares, onde não
pode facilitar o transporte de glicose (Figura 15.5). A
ligação da insulina ao seu receptor na membrana plas�
mática inicia uma cascata de sinalização que promove
o deslocamento e a fusão de vesículas contendo GLUT4
com a membrana plasmática, colocando assim o GLUT4
onde pode facilitar o transporte de glicose. A glicose
captada por células musculares e cardíacas pode ser
utilizada pela glicólise para dar piruvato, que é usado
pelo complexo piruvato desidrogenase e ciclo TCA para
fornecer ATP. O músculoúsculo ee ooo coraçãocoraçãocoração sintetizamsintetizamsintetizam quan�quan�quan�
tidades significativas de glicogênio, um importante
combustível que esses tecidos acumulam para consumo
posterior.
Como no músculo, a captação de glicose pelo teci�
do adiposo é dependente de, e estimulado por, insulina
(Figuras 15.4D e 15.5). O piruvato, como em outras cé�
lulas, é gerado pela glicólise e é oxidado pelo comple�
xo piruvato desidrogenase, formando acetil�CoA, que é
usado primariamente para síntese �e no�o de ácidos
graxos. A glicólise também fornece carbono para a sín�
tese de glicerol 3�fosfato (não mostrado), necessário
para síntese de triacilglicerol (p. 707). O tecido adiposo
pode realizar glicogênese e glicogenólise, mas sua capa�
cidade para esses processos é muito limitada em rela�
ção ao músculo, ao coração e ao fígado.
de insulina
Receptor Glicose Glicose Glicose Glicose
+
GLUT4
Membrana
plasmática
Sinalização em cascata mediada pela quinase +
Microvesicula
com GLUT4
616 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

O fígadoígado temtemtem ooo maiormaiormaior númeronúmeronúmero dedede caminhoscaminhoscaminhos paraparapara uti�uti�uti� Estágio de óxido-redução-fosforilação (Figura 15.6�):
lizar glicose (Figura 15.4E). A captação de glicose ocor� 2D�gliceraldeído
→ 2 L�lactato–
3�fosfato2�
++ 4 ATP4– + 2 Pi2– + 2 H+ →
4 ADP3–+
reindependentemente de insulina por meio de GLUT2,
um transportador de baixa afinidade e alta capacidade 2 H2O
de transporte de glicose. Glicose é usada pela via das Soma:
pentoses fosfato para a produção de NADPH, que é ne�
cessário para a síntese redutora (síntese �e no�o de →
D�Glicose
2 L�lactato–
+ 2ADP3–
+ 2 ATP4–
+ 2 Pi2– →
ácidos graxos e colesterol), a manutenção da glutationa + 2 H2O
reduzida e numerosas reações catalisadas por sistemas
enzimáticos do retículo endoplasmático. Uma função O estágio preparatório envolve investimento de duas
vital da via das pentoses fosfato é o fornecimento de moléculas de ATP para converter a glicose em frutose
ribose fosfato para a síntese do resíduo de açúcar de 1,6�bisfosfato. O ATP é “investido”, e não perdido, nes�
nucleotídeos, como ATP e aqueles do DNA e do RNA. se estágio porque háhá subsequentesubsequenteente ganhoganhoganho maiormaiormaior ememem eta�eta�eta�
O armazenamento de glicose como glicogênio é uma pas posteriores. O estágio de quebra “cliva” a frutose
característica particularmente importante do fígado. A 1,6�bisfosfato em duas moléculas de gliceraldeído 3�fos�
glicose também é usada na via do ácido glucurônico, fato. No estágio de óxido�redução�fosforilação, duas
que é importante na desintoxicação de drogas e de bi� moléculas de gliceraldeído 3�fosfato são convertidas em
lirrubina (p. 674 e 821). O fígado realiza glicólise, sendo duas moléculas de lactato, com a produção de quatro
que o piruvato produzido é usado como fonte de acetil� moléculas de ATP. O processo total, portanto, gera duas
�CoA para oxidação completa pelo ciclo dos ácidos tri� moléculas de lactato e duas moléculas de ATP a partir
carboxílicos e para síntese de ácidos graxos. A glicólise de uma molécula de glicose.
também fornece carbono para a síntese do resíduo de
glicerol do triacilglicerol, que é sintetizado pelo fígado Estágio Um: Preparação da Glicose
durante a produção de lipoproteínas de densidade mui�
to baixa (VLDL) (p. 744). O fígado também converte Embora a reação da hexoquinase (Figura 15.6�)
precursores de três carbonos (lactato, piruvato, glicerol consuma ATP, ela representa um bom início da glicólise
e alanina) em glicose pelo processo de gluconeogênese, porque retém glicose como glicose 6�fosfato (G6P) no
para suprir as necessidades de glicose de outras células citosol, onde todas as enzimas glicolíticas estão loca�
e do cérebro. lizadas. Os ésteres de fosfato são carregados e hidro�
fílicos e, portanto, não podem atravessar membranas
celulares. A fosforilação da glicose pelo ATP é uma
reação termodinamicamente favorável, irreversível em
15.3 VIA GLICOLÍTICA condições celulares. A reação inversa não pode ser usa�
da para sintetizar ATP.
Glicose é combustível e queima em tubo de ensaio,
gerando calor e luz, mas, é claro, nenhum ATP. As cé� A reação seguinte, catalisada pela fosfoglucose iso�
lulas usam cerca de 30 etapas para levar glicose a CO2 merase, é facilmente reversível, e não está sujeita a re�
e H2O, um processo aparentemente ineficiente, já que gulação.
pode ser feito em uma única etapa em tubo de ensaio.
Entretanto, reações colaterais e algumas das etapas re� A 6�fosfofruto�1�quinase (ou fosfofrutoquinase�1)
ais utilizadas pela célula para oxidar glicose a CO2 e catalisa a fosforilação dependente de ATP da frutose
H2O levam à conservação de uma quantidade significa� 6�fosfato (F6P) para frutose 1,6�bisfosfato (FBP). Essa
tiva de energia na forma de ATP. Em outras palavras, enzima está sujeita a regulação por vários efetores, e é
as células produzem ATP pela “queima” controlada de frequentemente considerada a enzima regulatória cha�
glicose, sendo que a glicólise representa apenas as pri� ve da glicólise. A reação é irreversível e usa o segundo
meiras etapas, apresentadas na Figura 15.6. ATP necessário para “preparar” a glicose.

Estágio Dois: Quebra de um Intermediário

Glicólise Ocorre em Três Estágios Fosforilado
A glicólise tem três estágios principais. A frutose 1,6�bisfosfato aldolase cliva a frutose
1,6�bisfosfato em uma molécula de di�hidroxiaceto�
Estágio preparatório (Figura 15.6�): na fosfato (DHAP) e uma de gliceraldeído 3�fosfato
(GAP) (Figura15.6b). Esta é uma reação reversível,
D�Glicose + 2ATP4– →
→ D�frutose 1,6�bisfosfato4– + 2ADP3� + 2 H+ correspondendo a uma clivagem de aldol em uma di�
reção, e uma condensação de aldol, na outra. A triose
Estágio de quebra (Figura 15.6b): fosfato isomerase catalisa a interconversão reversível
de DHAP e GAP. Com a transformação de DHAP em
D�frutose 1,6�bisfosfato4– → GAP, uma molécula de glicose é convertida em duas
→ 2 D�gliceraldeído 3�fosfato2– moléculas de GAP.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 617

CH2OH H
CH2O P
HO
H OH O
H H
OH ATP
hexoquinase
ADP H O H
H H
HO OH H OH

H OH OH
Glicose Glicose 6-fosfato

CH2OPO fosfoglucoseisomerase

CH2OH
ADP
ATP
HFrutose
HOH 6-fosfato
OH
H OH HCOH
O
CH Pi desidrogenase
gliceraldeído
3-fosfato O

COP

HCOH
CH2OP NAD+ NADH, H+ CH2OP

Gliceraldeído 1,3 Bisfosfoglicerato

6-fosfofruto-1-quinase 3-fosfato

fosfoglicerato
quinase ADP

CH2OP OP ATP
O CH2

H H OH
OH O O

OH H CO– CO–
Fosfoenolpiruvato
2-Fosfoglicerato
OH
P ADP piruvato
fosfoglicerato
mutase
quinaseATP OP
Frutose 1,6-bisfosfato
frutose-bisfosfato
aldolase HCO HCOH

CH2 CH2
(a) 3-Fosfoglicerato

CH2O PO CH2OP CH2OP enolase

CH2 C O
Di-hidroxiacetona
fosfato Frutose 1,6-bisfosfato HCOH H2O
H OHH H OH
OH ou HOCH OP O
CO–

HCOH
(b) CO–
O
CH2 (c)

CH2 Piruvato
COP C O

CH3

NADH, H+

O NAD+
O L O lactato
CH2
C OP CH CO– desidrogenase

OH triose
isomerase
fosfato HCOH
CH2 HOCH
OP
Gliceraldeído
CH3

3-fosfato -Lactato

FIGURA 15.6 A via glicolítica, dividida em seus três estágios.

O símbolo Prefere�se ao grupo fosforil PO32–; �� indicaindicaindica umaumauma liga�liga�liga� de quebra. (�) Estágio de óxido�redução�fosforilação.
ção fosfato de alta energia. (�) Estágio preparatório. (b) Estágio

Estágio Três: Reações de Óxido-Redução e que é realizado. Um aldeído (gliceraldeído 3�fosfato) é

Síntese de ATP oxidado a um ácido carboxílico, com a redução de NAD+
a NADH. O ácido produzido é 1,3�bisfosfoglicerato, um
A reação catalisada pela gliceraldeído 3�fosfato desi� anidrido misto de um ácido carboxílico e ácido fosfórico,
drogenase (Figura 15.6�) é de interesse em virtude do que tem uma energia negativa livre de hidrólise grande,
 618 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

o que lhe dá condições de participar de uma reação sub� A reação final envolve o acoplamento dos compo�
sequente que forma ATP. A reação geral pode ser vista nentes endergônico e exergônico, dando uma variação
como o acoplamento de uma reação exergônica muito de energia livre padrão de +6,3 kJ/mol (1,5 kcal/mol).
favorável com uma reação endergônica desfavorável. A
O
reação exergônica é aquela na qual um aldeído é oxida�
do a um ácido carboxílico, a qual é depois acoplada com NAD+ O Soma:
+ HPO42J RCH + NAD+ + HPO42J
uma meia reação endergônica, na qual NAD+ é reduzido O
a NADH. R COPO32J + NADH + H+, ∆G°! + 1,5 kcal molJ1

O O
R CH + H2O RCOH + 2H+ + 2eJ Essa reação é totalmente reversível nas células. O
mecanismo catalítico envolve gliceraldeído 3�fosfato re�
NAD+ + 2H+ + 2eJ NADH + H+
agindo com o grupo sulfidrila de um resíduo de cisteína
A reação geral (soma das meias reações) é bastante para gerar um tio�hemiacetal (Figura 15.7). Uma reação
exergônica. interna de oxidação�redução ocorre, na qual o NAD+li�
gado é reduzido a NADH e o tio�hemiacetal é oxidado
R O
CH NAD+ H2 O a um tiol éster de alta energia. O tiol éster reage com
o Pi para formar o anidrido misto e regenerar o grupo
+ + O R COH +
sulfidrila livre. O anidrido misto se dissocia da enzima
O
e NAD+ exógeno substitui o NADH ligado. Deve�se no�
D H2O R COH NADH H, G° 10,3 kcal mol 1 tar que um grupo ácido carboxílico livre (—COOH) não
é gerado a partir do grupo aldeído (—CHO) durante a
Um segundo componente endergônico da reação é a reação. Ao contrário, a enzima gera um grupo carboxila
formação de um anidrido misto entre o ácido carboxíli� na forma de um tiol éster de alta energia, que é conver�
co e o ácido fosfórico. tido pela reação com Pi em um anidrido misto de ácidos
carboxílico e fosfórico.
O O
Essa reação catalisada pela gliceraldeído 3�fosfato
RCOH + HPO42J R C O
desidrogenase requer NAD+ e produz NADH. Como o
O
citosol tem só uma quantidade limitada de NAD+, a
HPO42 RCOPO32 H2O, ∆G° 11,8 kcal mol1 continuidade da atividade glicolítica só pode ocorrer
se NADH for reoxidado a NAD+; caso
contrário, a glicólise vai parar, por falta
O OH de NAD+. As opções que as células têm
SH HC R
S C R
para regeneração de NAD+ a partir de
Gliceraldeído NADH são descritas em uma sessão pos�
3fosfato H
desidrogenase condensação Tiohemiacetal terior (p. 620).
Na reação seguinte, a fosfoglicerato
NAD+ NAD+
quinase produz ATP a partir do compos�
to de alta energia 1,3�bisfosfoglicerato
(Figura 15.6�). Esse é o primeiro ponto
óxidoredução de produção de ATP na glicólise. Como
do
deslocamento
nucleotídeo NADH interna
duas moléculas de ATP foram investidas
para cada molécula de glicose no está�
NAD+
gio preparatório, e como duas moléculas
de 1,3�bisfosfoglicerato são produzidas a
SH O O
partir de cada glicose, todo o ATP “inves�
P OC R Pi S C R tido” é recuperado nessa etapa. O sistema
Tioéster gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase�
transferência
�fosfoglicerato quinase é um exemplo
de acil de fosforilação em nível de substrato, na
NADH NADH qual um substrato participa de uma rea�
ção catalisada por enzima que gera ATP
ou GTP. Fosforilação em nível de substra�
FIGURA 15.7 Mecanismo catalítico da gliceraldeído 3-fosfato to contrasta com fosforilação oxidativa
desidrogenase. catalisada pela cadeia de transporte de
Os círculos grandes representam a enzima; os círculos pequenos, o sítio de ligação
elétrons mitocondrial e ATP sintase (p.
de NAD+; RCOH, o grupo aldeído do gliceraldeído 3�fosfato; �SH, o grupo sulfidrila
do resíduo de cisteína localizado no sítio ativo da enzima; e �, as ligações de alta 589). Observe que a combinação da glice�
energia do tioéster e do anidrido misto. raldeído 3�fosfato desidrogenase e da fos�
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 619

foglicerato quinase faz o acoplamento de uma oxidação o efetor alostérico mais importante da hemoglobina, em
(um aldeído é oxidado a um ácido carboxílico) com uma condições fisiológicas e patológicas que afetam o pH in�
fosforilação (um anidrido misto de um ácido carboxíli� tracelular de eritrócitos (Um Olhar Mais Atento 15.1).
co e um ácido fosfórico é formado), sem o envolvimento
de um sistema de membrana. Enolase elimina águaágua dodoo 2�fosfoglicerato2�fosfoglicerato2�fosfoglicerato paraparapara for�for�for�
mar fosfoenolpiruvato (PEP) na reação seguinte (ver
Fosfoglicerato mutase converte 3�fosfoglicerato em Figura 15.6�). Essa reação gera um fosfato de alta
2�fosfoglicerato. EstaEsta éé umauma reaçãoreação completamentecompletamente re�re� energia a partir de um de nível energético muito mais
versível, na qual 2,3�bisfosfoglicerato é um intermediá� baixo. O DG0’ de hidrólise do fosfoenolpiruvato é –61,9
rio obrigatório no sítio ativo. kJ/mol (–14,8 kcal/mol), enquanto o de 2�fosfoglicera�
to é –17,6 kJ/mol (–4,2 kcal/mol). A piruvato quinase
E�fosfato + 3�fosfoglicerato  E + 2,3�bisfosfoglicerato (Figura 15.6�) realiza outra fosforilação em nível de
E + 2,3�bisfosfoglicerato  E�fosfato + 2�fosfoglicerato substrato. Essa reação não é reversível em condições
Soma: 3�fosfoglicerato  2�fosfoglicerato intracelulares.

O envolvimento de 2,3�bisfosfoglicerato nessa reação A última etapa da glicólise é uma reação de óxido�
cria uma necessidade absoluta de quantidades catalíti� �redução francamente reversível, catalisada pela lac�
cas desse composto nas células.células. IssoIssoo podepodepode serserser consta�consta�consta� tato desidrogenase (Figura 15.6�). O piruvato é redu�
tado observando�se que E�P não pode ser gerado sem zido para dar L�lactato e NADH é oxidado a NAD+. A
2,3�bisfosfoglicerato e, da mesma forma, que 2,3�bisfos� direção para frente dessa reação é a única reação do
foglicerato não pode ser gerado sem E�P. As célulasélulas re�re� corpo na qual L�lactato pode ser produzido. A direção
solvem esse problema sintetizando 2,3�bisfosfoglicerato inversa dessa reação é a única reação do corpo na qual
a partir de 1,3�bisfosfoglicerado com uma 2,3�bisfosfo� L�lactato pode ser utilizado. A lactato desidrogenase é,
glicerato mutase. portanto, responsável pela produção e pela utilização
de L�lactato.
O O
CH2
COPO32J COJ
+H+ Rendimento em ATP e Equação
2J
HCOH HCOPO3
Balanceada da Glicólise Anaeróbica
OPO32J CH2OPO32J
A conversão de uma molécula de glicose em duas mo�
3�fosfoglicerato e Pi
1,3-Bisfosfo-D-glicerato 2,3-Bisfosfo-D-glicerato
léculas de lactato resulta na formação líquida de duas
moléculas de ATP. Duas moléculas de ATP são usadas no
Essa enzima é bifuncional, servindo como muta� estágio preparatório, mas as etapas subsequentes produ�
se para a formação de 2,3�bisfosfoglicerato, e também zem quatro moléculas de ATP, de modo que o rendimen�
como fosfatase que hidroliza 2,3�bisfosfoglicerato em to total líquido é de duas moléculas de ATP.
. Todas as células contêm as quan�
tidades minúsculas de 2,3�bisfosfoglicerato necessárias
para produzir a forma fosforilada (E�P) da fosfoglice�
1/2 Glicose
rato mutase recém�sintetizada. Em notável contraste
com as outras células do corpo, eritrócitos contêm con�
centrações muito altas de 2,3�bisfosfoglicerato, o qual ADP 1,3Bisfosfoglicerato 2,3BP
Gm
utase
funciona como um importante regulador alostérico
negativo da ligação do oxigênio com a hemoglobina (p. ATP 2,3Bisfosfoglicerato
378). Em contraste com as quantidades extremamente tase
fosfa
pequenas de glicose usadas para 2,3�bisfosfoglicerato B PG )
3Fosfoglicerato 2,3
em outras células, 15 a 25% da glicose convertida em BC
(R
e
lactato em eritrócitos segue o �es�io �PG para a sínte� tas
Pi fa
fos
se de 2,3�bisfosfoglicerato (Figura 15.8). Deve�se notar IP
M
que o desvio BPG contorna a etapa da PGK. Portanto,
nãoão háhá produçãoproduçãoprodução líquidalíquidalíquida dedede ATPATPATP quandoquandoquando glicoseglicoseglicose ééé con�con�con� 2Fosfoglicerato
vertida em lactato via desvio BPG. O 2,3�Bisfosfoglice�
rato é também hidrolizado em eritrócitos pelas inositol Lactato
polifosfato múltiplas fosfatases (MIP fosfatases) (Fi�
gura 15.8). Ao converter 2,3�BPG em 2�fosfoglicerato, FIGURA 15.8 As reações do desvio do
2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) são catalisadas pela
em lugar de 3�fosfoglicerato, a MIP fosfatase expande
enzima bifuncional, 2,3-BPG mutase/fosfatase.
o desvio BPG, por contornar a reação catalisada pela
2,3�BPG é também hidrolisado a 2�fosfoglicerato pelas múl�
fosfoglicerato mutase. A excepcional sensibilidade da tiplas inositol polifosfato fosfatases (MIP fosfatases), assim
MIP fosfatase a variações de pH sugere que a atividade
chamadas porque a inositol múltipla fosfatase foi identificada
dessa enzima possa ajustar a concentração de 2,3�BPG, antes do 2,3�BPG como sendo substrato dessa enzima.
620 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
UM OLHAR MAIS ATENTO 15.1
2,3-Bisfosfoglicerato e Altitude Elevada
A entrega de oxigênio para os tecidos depende da
regulação da hemoglobina por efetores alostéricos,
sendo o mais importante o 2,3�bisfosfoglicerato, que
promove a liberação de oxigênio por se ligar à desoxi�
�hemoglobina. O suprimento de oxigênio para os teci�
dos em várias condições é dependente da regulação da
concentração de 2,3�bisfosfoglicerato nos eritrócitos.
Variações relativamente pequenas no pH sanguíneo e
as sensibilidades opostas da 6�fosfofruto�1�quinase e
da MIP fosfatase às variações de pH parecem ser os
fatores mais importantes. Por exemplo, em pacientes
com acidose metabólica, os níveis de DPG estão dras�
ticamente reduzidos nos eritrócitos, provavelmente
porque uma diminuição no pH reduz a atividade da
6�fosfofruto�1�quinase e aumenta a atividade da MIP
fosfatase. Ao contrário, em resposta a altitude elevada
ou anemia causada por perda de sangue, os níveis de
DPG estão drasticamente aumentados nos eritrócitos
→
D�Glicose
2 L�lactato–
+ 2ADP3– + 2 Pi2– →
+ 2ATP4–
+ 2 H2O
As células têm apenas uma quantidade limitada de
ADP e Pi. O fluxo pela glicólise é dependente de um su�
primento adequado desses substratos. Se o ATP não for
utilizado para realização de trabalho, a glicólise para
por falta de ADP e/ou Pi. Consequentemente, o ATP
gerado deve ser usado em processos relacionados com
trabalho normal para que a glicólise ocorra. O uso de
ATP para qualquer processo relacionado com trabalho
é representado simplesmente por
ATP4– + H2O → ADP3– + Pi2– + H+ + “trabalho”
Quando as quantidades são dobradas e adicionadas
à equação anterior da glicólise, excluindo o trabalho reali�
zado uma vez que isso é necessário para o t�rno�er do
ATP, a equação total balanceada fica
D�Glicose → 2 L�lactato– + 2H+
Isso mostra que a glicólise anaeróbica gera ácido,
que pode criar importantes problemas para o corpo
(descrito mais adiante na Correlação Clínica 15.5),
uma vez que o pH intracelular deve ser mantido perto
da neutralidade para atividade enzimática ótima.
nessas situações porque um aumento no pH aumenta
a atividade da 6�fosfofruto�1�quinase e reduz a ativi�
dade da MIP fosfatase. Alcalose é induzida por perda
de sangue e altitudes elevadas porque a hiperventi�
lação decorrente da hipóxia nessas situações elimina
mais CO2, o que reduz a concentração de H+ no sangue
por forçar a reação catalisada pela anidrase carbônica
para a esquerda.
CO2 + H2O  H2CO3  H+ + HCO3–
Wallis, J. P., Wells, A. W., Whitehead, S., e Brewster, N.
Recovery from postoperative anaemia. Tr�nsf�sion Me�.
15: 413, 2005; Cho, J., King, J. S., Qian, X., Harwood, A. J., e
Shears, S. B. Dephosphorylation of 2,3�biphosphogycerate by
MIPP expands the regulatory capacity of the Rapoport�Lu�
bering glycolytic shunt. Pro�. N�t�. A���. ��i. USA 105:998,
2008.
NADH Gerado pela Glicólise Deve
ser Oxidado de Volta a NAD+: Papel
da Lactato Desidrogenase e das
Lançadeiras de Substrato
Glicólise Anaeróbica
NADH e NAD+ não aparecem na equaçãoequaçãoção balancea�balancea�balancea�
da de soma da glicólise anaeróbica porque a geração de
NADH e sua utilização são acopladas (balanceadas) na
via (ver Figura 15.6�). Duas moléculas de NADH são ge�
radas pela gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase, e duas
são utilizadas pela lactato desidrogenase. NAD+ está
disponível só em quantidades limitadas e deve ser rege�
nerado que a glicólise possa continuar. As duas reações
envolvidas são
D�Gliceraldeído 3�fosfato ++NAD+
→ 1,3�bisfosfo�D�glicerato NADH+P
+i →
H+
Piruvato + NADH + H+ → L�lactato + NAD+
A soma das reações é
D�Gliceraldeído 3�fosfato + piruvato + Pi →
→ 1,3�bisfosfoglicerato + L�lactato
O perfeito acoplamento de equivalentes de redução
por essas reações ocorre em condições anaeróbicas ou
em células sem mitocôndrias.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 621

Oxidação Mitocondrial de NADH Essa enzima localiza�se quase que exclusivamente

Produzido pela Glicólise
Quando oxigênio e mitocôndrias estão presentes,
os equivalentes de redução de NADH gerados pela gli�
ceraldeído 3�fosfato desidrogenase são transportados
para dentro da mitocôndria para oxidação, formando
no citosol dos hepatócitos. O acetaldeído atravessa a
membrana mitocondrial interna para oxidação por uma
aldeído desidrogenase no espaço da matriz mitocon�
drial.
O O

piruvato, e não lactato, como produto final da glicólise.
A membrana mitocondrial interna não é permeável ao
NADH (p. 594), mas a lançadeira malato–aspartato e
a lançadeira glicerol–fosfato (ver Figura 14.51, p. 597)
transportam equivalentes de redução para dentro do
espaço da matriz mitocondrial (p. 578). O fígado faz
mais uso da lançadeira malato–aspartato, mas algumas
células musculares são mais dependentes da lançadei�
ra glicerol–fosfato. Os sistemas de lançadeiras movem
equivalentes de redução do citosol para dentro da mito�
côndria, mas não transportam equivalentes de redução
da mitocôndria para o citosol. A soma de todas as rea�
ções da lançadeira malato–aspartato é simplesmente
CH3CH + NAD+ + H2O CH3COJ + NADH + 2H+
Acetaldeído Acetato
O NADH gerado pela última etapa pode ser usado
diretamente pela cadeia de transporte de elétrons mi�
tocondrial. Entretanto, o NADH gerado pela álcool desi�
drogenase citosólica é oxidado de volta a NAD+ por uma
das lançadeiras de substrato (ver Figura 14.51, p. 597).
Assim, a capacidade de oxidar álcool é depende da
capacidade do fígado para transportar equivalentes de
redução do citosol para dentro das mitocôndrias por es�
ses sistemas de lançadeiras.

NADHcitosol + H+
→ NAD+citosol + citosol
NADH + mito
NAD+ + H+
mito →
mito Formação de Glucuronídeo
Glucuronídeos hidrossolúveis de bilirrubina e de vá�
brana
A lançadeira
mitocondrial
glicerol
interna
fosfato Figura FADH
(verproduz 14.40, 2p.na
588).
mem� rias drogas (p. 447) são eliminados na urina e na bile.
O Para a formação de glucuronídeos, UDP�glicose (ver es�
sítio ativo da glicerol 3�fosfato desidrogenase mitocon� trutura na p. 674) é oxidada a UDP�ácido glucurônico
drial é exposto na superfície citosólica da membrana
(ver estrutura na p. 675) por
mitocondrial interna. A soma de todas as reações da
lançadeira glicerol fosfato é UDP�D�glicose + 2 NAD+ + H2O →
→ UDP�ácido D�glucurônico + 2 NADH + 2H+
NADHcitosol
→ NAD++citosol
H+citosol
+ FADH
+ FAD
2 membrana interna →
membranainterna
Primariamente no fígado, esse ácido glucurônico
O NADH mitocondrial formado pela atividade da lan� “ativado” é transferido para uma molécula aceptora
çadeira malato–aspartato pode ser usado pela cadeia não�polar, como a bilirrubina ou um composto (R�OH)
de transporte de elétrons mitocondrial para a produção estranho ao corpo.
de 2,5 moléculas de ATP por fosforilação oxidativa.
UDP�ácido D�glucurônico + R�OH →
NADHmito H+ +mito
→+NAD+ 2 + 2,5 ADP + 2,5 Pi →
0,5+O2,5 → R�O�ácido glucurônico + UDP
ATP + H2O
O NADH gerado pela primeira reação é reoxidado
Diferentemente, o FADH2 formado pela lançadeira pelas lançadeiras de substrato. Como a oxidação de eta�
glicerol fosfato dá apenas 1,5 moléculas de ATP. nol e a conjugação de drogas ocorrem no fígado, as duas
ocorrendo juntas podem sobrecarregar a capacidade
FADH2membrana
→ FADmembrana
interna +interna
0,5 O+2 +
1,51,5
ATP
ADP+H Pi → das lançadeiras de substrato. Isso explica o conselho de
+21,5
O não misturar a ingestão de compostos farmacologica�
Assim, o rendimento em ATP da oxidação do NADH mente ativos com álcool (ver Correlação Clínica 15.1).
gerado pela glicólise é 3 ou 5, dependendo da lançadeira
de substrato usada para sua oxidação.
Reagentes Sulfidrila e Fluoreto
Lançadeiras São Importantes para Inibem a Glicólise
Outras Vias de Óxido-redução A gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase é inibida por
reagentes sulfidrilas por causa do resíduo de cisteína
Oxidação de Álcool cataliticamente importante em seu sítio ativo. Durante
um ciclo catalítico, o grupo sulfidrila reage com glice�
Álcool (ou seja, etanol) é oxidado a acetaldeído com
raldeído 3�fosfato para formar um tio�hemiacetal (ver
produção de NADH pela álcool desidrogenase. Figura 15.7). Reagentes sulfidrila, que são frequente�
O mente compostos contendo mercúrio ou compostos
CH3CH2OH + NAD+ CH3CH + NADH + H+ alquilantes como iodoacetato, impedem a formação do
Etanol Acetaldeído tio�hemiacetal (Figura 15.9).
622 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.1
Álcool e Barbituratos
A intoxicação aguda por álcool aumenta a sensibilida�
de aos efeitos depressores gerais dos barbituratos. Barbi�
turatos e álcool interagem com o canal de cloreto ativa�
do por g�aminobutirato (GABA). A ativação desse canal
inibe o disparo neuronal, o que pode explicar os efeitos
depressores de ambos os compostos. Essa combinação
é muito perigosa, e as doses normalmente prescritas de
barbituratos são potencialmente letais quando tomadas
com etanol. Além disso, o etanolinibe o metabolismo dos
barbituratos, prolongando assim o tempo que os barbi�
turatos permanecem ativos no corpo. A hidroxilação de
barbituratos pelo sistema citocromo P450 NADPH�depen�
dente do retículo endoplasmático do fígado é inibida pelo
etanol. Isso diminui a formação de derivados hidrossolú�
veis dos barbituratos para eliminação pelos rins e bile.
Os níveis sanguíneos de barbituratos permanecem altos
e causam maior depressão do SNC.
Surpreendentemente, o alcoólatra sóbrio é menos
sensível aos barbituratos. O consumo crônico de etanol
aparentemente causa alterações adaptativas na sensi�
E SH + CH3 iHg+Cli E SiHg i CH3 + Cli + H+ 
Cloreto
de metil
mercúrio
Enzima ativa Enzima inativa
E SH + ICH2COOi E S i CH2COOi + H+ + li 
Enzima ativa Enzima inativa
FIGURA 15.9 Mecanismo para inativação da gliceraldeído
3-fosfato desidrogenase por reagentes sulfidrílicos.
O fluoreto é um potente inibidor da enolase. O Mg2+
e Pi formam um complexo iônico com o fluoreto, que ini�
be a enolase por interferir com a ligação de seu substra�
to (Mg2+2�fosfoglicerato2�).
bilidade aos barbituratos (tolerância cruzada) e induz
os citocromos P450 do retículo endoplasmático do fíga�
do envolvidos nas reações de hidroxilação de drogas.
Consequentemente, o alcoólatra sóbrio pode metabo�
lizar os barbituratos mais rapidamente. Isso monta o
seguinte cenário: um alcoólatra sóbrio tem problemas
para dormir, mesmo após tomar várias pílulas para dor�
mir, porque seu fígado tem capacidade aumentada de
hidroxilar o barbiturato contido nas pílulas. Frustado,
ele consome mais pílulas e, depois, álcool. O sono vem,
mas pode ser seguido de depressão respiratória e mor�
te, porque o alcoólatra, embora menos sensível aos bar�
bituratos quando sóbrio, permanece sensível ao efeito
sinérgico do álcool.
Misra, P. S., Lefevre, A., Ishii, H., Rubin, E. e Liber, C. S.
Increase of ethanol, meprobamate and pentobarbital meta�
bolism after chronic ethanol administration in man and in
rats. Am. J. Me�. 51:346, 1971; e Tabakoff, B., Cornell, N.,
Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann. Emerg. Me�. 14:1005,
1986.
Hiperglicemia Inibe Glicólise
A gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase é vulnerá�
vel à inibição em células expostas a altos níveis de
glicose. Isso ocorre poque a hiperglicemia promove
superprodução de espécies reativas de oxigênio, as
quais ativam a poli(ADP�ribose) polimerase (PARP).
Em uma reação que usa NAD+ como substrato e pro�
duz nicotinamida, PARP catalisa a poli(ADP�ribosil)
ação de resíduos de cisteína de várias proteínas, in�
cluindo a cisteína do sítio ativo da gliceraldeído 3�fos�
fato desidrogenase (Um Olhar Mais Atento 15.2).
Arsenato Impede Síntese Líquida
de ATP sem Inibir a Glicólise
O Arsênico pentavalente ou arsenato impede a
síntese líquida de ATP por causar arsenólise na rea�
ção da gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase (Figura
15.10). A estrutura do arsenato lembra a do Pi (tam�
bém pentavalente) e substitui facilmente o Pi em re�
ações catalisadas por enzimas. O anidrido misto do
ácido arsênico e o grupo carboxila do 3�fosfoglicerato
é formado pela gliceraldeído 3�fosfato desidrogenase. O
1�Arsenato 3�fosfoglicerato é instável, e sofre hidrólise
espontânea para 3�fosfoglicerato e arsenato inorgânico.
Como consequência, a glicólise continua normalmente
em presença de arsenato, mas o 1,3�bisfosfoglicerato
não é formado. O ATP, portanto, não é sintetizado pela
fosfoglicerato quinase. Assim, não há síntese de ATP
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 623

UM OLHAR MAIS ATENTO 15.2

Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase e a Hiperglicemia

Quando os níveis de glicose no sangue estão eleva�
dos, as células do corpo que são incapazes de restringir
a captação de glicose ficam vulneráveis ao dano causado
pelo excesso de glicose intracelular. As células mais sus�
ceptíveis são encontradas na retina, no rim, e os neurô�
nios de nervos periféricos, locais precoces do dano no
diabetes. Superprodução do radical superóxido (O2–·) por
mitocôndrias é a causa primária do dano, pelo menos em
parte em virtude da inativação da gliceraldeído 3�fosfato
desidrogenase, uma enzima necessária para a glicólise. A
oxidação da sobrecarga de glicose nessas células resul�
ta em redução excessiva da cadeia de transporte de elé�
trons mitocondrial. Transferência de um único elétron
de um dos transportadores sobrecarregados da cadeia
de transporte de elétrons para oxigênio produz o radi�
cal superóxido. O radical superóxido ativa a poli(ADP�
�ribose) polimerase, uma enzima de reparo do DNA que
ADP�ribosila grupos sulfidrila livres de muitas enzimas,
incluindo o resíduo de cisteína do sítio ativo da gliceral�
deído 3�fosfato desidrogenase. Inibiçãoção parcialparcial dada glicó�glicó�
lise por essee mecanismomecanismo podepode contribuircontribuir parapara oo danodano in�in�
duzido pela hiperglicemia nas células susceptíveis.
Brownlee, M. Banting Lecture 2004. The pathology of
diabetic complications: A unifying mechanism. Di�betes 54:
1615, 2005.

quando a glicólise acontece em presença do arsenato, uma vez que a força de controle das etapas de uma via
sendo que o ATP investido no estágio preparatório é linear deve somar 1,0, por definição.
balanceado pelo ATP gerado na etapa da piruvato qui�
nase. A arsenólise também interfere com a formação de
ATP por fosforilação oxidativa, daí a toxicidade do arse� O

nato (Correlação Clínica 15.2). CH

HCOH
CH2OPO32J
15.4 REGULAÇÃO DA '*OLFHUDOGHtGRIRVIDWR

GLICÓLISE HAsO42J
NAD+
Como em outras vias complexas que envolvem múl�múl� NADH + H+
tiplas etapas, oo fluxofluxo pelapela glicóliseglicólise éé determinadodeterminado pe�pe�
las atividades de várias enzimas, e não por uma única
O
enzima �imit�nte �� �e�o�i���e. A informação quan�
COAsO32J
titativa quanto à contribuição relativa de uma enzima
para o fluxo por uma via em um conjunto específico de HCOH
condições é mais bem determinada a partir da forç� �e CH2OPO32J
�ontro�e da enzima. O efeito que uma pequena inibição
$UVHQDWRIRVIR'JOLFHUDWR
da atividade de uma enzima tem sobre o fluxo por uma
via é usado para determinar a força de controle de uma
espontânea
enzima de acordo com a equação HAsOH422O
J H+
Força de controle = Mudança no fluxo
Mudança na atividade da enzima
O
Para ilustrar, considere que a inibição de 10% de COi
uma enzima em particular não tenha efeito sobre o flu�
xo. A força de controle da enzima é, então, zero (0 di� HCOH
OPO32J
vidido por 10). Agora, considere que a inibição de 10% CH2
de uma enzima resulte em 10% de inibição do fluxo. A )RVIR'JOLFHUDWR
força de controle seria 1,0 (10 dividido por 10), o que
FIGURA 15.10 O arsenato desacopla a oxidação de
significa que o fluxo é inteiramente dependente da ati�
fosforilação na reação da gliceraldeído 3-fosfato
vidade da enzima nessas condições. Agora, considere desidrogenase.
que inibição de 10% de uma enzima resulte em apenas
5% de inibição do fluxo pela via. A força de controle é Uma vez que a regulação do fluxo pela glicólise é
agora 0,5 (5 dividido por 10), o que significa que metade dependente do tecido e do estado nutricional e hormo�
do controle do fluxo é determinada por essa enzima. O nal, as enzimas da glicólise com maior força de controle
resto do controle é exercido por uma ou mais etapas, são a hexoquinase, a 6�fosfofruto�1�quinase e a piruva�
624 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.2
Envenenamento por Arsênico
A maioria das formas de arsênico é tóxica, sendo a
ca do que
forma trivalente
a forma(arsenito
pentavalente
como AsO
(arsenato
2–) muito
oumais
HAsOtóxi�
2–).
Menos ATP é produzido sempre que arsenato substitui 4
Pi em reações biológicas. O arsenato compete pelos sí�
tios de ligação de Pi das enzimas, resultando na forma�
ção de ésteres de arsenato, que são instáveis. O arseni�
to funciona por um mecanismo diferente, envolvendo
a formação de um complexo estável com ácido lipoico
ligado à enzima. (Ver a ilustração).
Em grande parte, o envenenamento por arsênico
é explicado pela inibição de enzimas que requerem
ácido lipoico como coenzima. Estas incluem piruvato
desidrogenase, a�cetoglutarato desidrogenase e a�ce�
toácidoácido dede cadeiacadeia ramificadaramificada desidrogenase.desidrogenase. Enve�Enve�Enve�
nenamento crônico por arsênico a partir da água de
poço contaminada por pesticidas arseniacais ou por
ação de um assassino é mais bem diagnosticado de�
terminando�se a concentração de arsênico no cabelo
ou nas unhas da vítima. Cerca de 0,5 mg de arsênico
está presente em 1 kg de cabelo de um indivíduo nor�
to quinase (Figura 15.11). Essas enzimas são reguladas
por efetores alostéricos e/ou modificação covalente.
Uma enzima não�regulatória tem maior chance de
catalisar uma re�ção próxim� �o e��i��brio, enquan�
to uma enzima regulatória tem mais chance de catali�
sar uma re�ção for� �o e��i��brio. A atividade de uma
enzima não�regulatória traz rapidamente seus substra�
tos e produtos às concentrações de equilíbrio. Uma en�
zima regulatória não é ativa o suficiente para equilibrar
seus substratos e produtos. Se uma reação catalisada
por enzima está próxima do equilíbrio ou não, isso pode
ser determinado comparando�se a constante de equilí�
brio estabelecida para a reação com a razão de ação das
massas existentes dentro de uma célula. A constante de
equilíbrio para a reação A + B → C + D é definida por
[C][D]
Keq =
[A][B]
onde os colchetes indicam as concentrações de equilí�
brio. A razão de ação das massas é calculada de modo
semelhante, exceto que são usadas as concentrações de
estado estacionário (ss) de reagentes e produtos dentro
da célula.
[C]ss [D]ss
Raz˜ao de aç˜ao das massas =
[A]ss[B]ss
Se a razão de ação das massas for aproximadamen�
te igual à Ke�, considera�se que a enzima catalisa uma
mal. O cabelo de uma pessoa exposta cronicamente a
arsênico pode ter até 100 vezes mais.
O
(CH2)4C enzima
+ ASO2J + H+
SH SH
O
(CH2)4C enzima
+ H2O
S S
As
OH
Hindmarsh, J. T., e McCurdy, R. F. Clinical and environ�
mental aspects of arsenic toxicity. CRC Crit. Re�. C�in. L�b
��i. 23:315, 1986; e Mudur, G. Half of Bangladesh population
at risk of arsenic poisoning. �ritis� Me�i��� Jo�rn�� 320:
822, 2000.
reação quase�equilíbrio, e é pouco provável que seja
regulada. Quando a razão de ação das massas é consi�
deravelmente diferente de Ke�, considera�se que a enzi�
ma catalisa uma reação não�equilíbrio, e é geralmente
regulada. A comparação de razões de ação das massas
e constantes de equilíbrio para enzimas da glicólise no
fígado indica que muitas catalisam reações de equilí�
brio. As reações da glucoquinase (isoenzima hepática
da hexoquinase), 6�fosfofruto�1�quinase e piruvato qui�
nase, no fígado, estão longe do equilíbrio, sugerindo
que sejam pontos prováveis de regulação.
Hexoquinase e Glucoquinase Têm
Propriedades Diferentes
Quatro isoenzimas diferentes da hexoquinase (I, II,
III e IV) são expressas de maneira tecido�específica no
corpo. As isoenzimas da hexoquinase encontradas na
maioria dos tecidos (I, II e III) têm um Km baixo para gli�
cose (<0,1 mM) em relação a sua concentração no sangue
(�5 mM) e são fortemente inibidas pelo produto glicose
6�fosfato (G6P). O último é importante porque impede
que a hexoquinase comprometa todo o fosfato inorgânico
de uma célula na forma de hexoses fosforiladas (Correla�
ção Clínica 15.3). Embora a reação da hexoquinase não
esteja em equilíbrio, em virtude da inibição imposta pela
G6P, o nível no qual a hexoquinase é expressa nas células
pode ter um impacto importante na taxa de glicólise das
células (Um Olhar Mais Atento 15.3).
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 625

Glicose a glucoquinase como um complexo

ATP
Pi inativo no núcleo. Frutose 6�fosfato
ADP – promove a ligação da glucoquinase
Glicose 6-fosfato com a proteína regulatória, inibindo
Via das pentose Síntese assim a glucoquinase. De fato, fruto�
fosfato de glicogênio se�6�fosfato promove o deslocamen�
to de glucoquinase do citosol para o
Frutose 6-fosfato
núcleo, onde a glucoquinase é com�
Pi ATP AMP, Frutose 2,6-P2
ATP, citrato, H+
pletamente inibida pela proteína ini�
–
ADP bitória. Esse efeito inibitório da fru�
AMP, Frutose 2,6-P2 +
tose 6�fosfato sobre a glucoquinase
–
Frutose 1,6-bisfosfato pode ser completamente revertido
por um grande aumento na concen�
tração de glicose. A glicose dispara a
(2) Gliceraldeído 3-fosfato
dissociação da glucoquinase da pro�
(2) Pi
teína regulatória, promovendo assim
(2)NADH(2)+NAD+ 2H+
deslocamento da glucoquinase do
núcleo para o citosol. Essas carac�
terísticas regulatórias especiais da
(2) 1,3-Bisfosfoglicerato glucoquinase (alto S0,5 para glicose,
cooperatividade com respeito à con�
centração de glicose e deslocamen�
(2) ADP (2) Fosfoenolpiruvato to estimulado por glicose do núcleo
+ para o citosol) contribuem para a ca�
– ATP, alanina
(2) ATP pacidade do fígado de “tamponar” os
níveis de glicose sanguínea. Como o
(2) Piruvato GLUT�2, o transportador de glicose
(2)NADH + 2H+ das células hepáticas, equilibra rapi�
damente a glicose através da mem�
(2)NAD+
brana plasmática, a concentração
(2) Lactato celular de glicose é a mesma que a
do sangue. Como a S0,5 da glucoqui�
FIGURA 15.11 Características regulatórias importantes da glicólise.
Em virtude das diferenças entre os tecidos na expressão de isoenzimas, nem todos os
nase para glicose (�7 mM) é maior
tecidos do corpo têm todos os mecanismos regulatórios mostrados aqui. do que as concentrações normais de
glicose no sangue (�5 mM), e glico�
As células do parênquima hepático e as células b se promove o deslocamento de glucoquinase do núcleo,
do pâncreas são singulares porque contêm a isoenzi� qualquer aumento na glicose do sangue portal acima do
ma IV da hexoquinase, geralmente chamada glucoqui� normal leva a um drástico aumento na taxa de fosforila�
nase, que tem propriedades cinéticas muito diferentes. ção de glicose pela glucoquinase no fígado (ver Figuras
A glucoquinase catalisa a fosforilação ATP�dependente 15.12 e 15.13). Da mesma forma, qualquer diminuição
da glicose como as outras hexoquinases, mas seu S0,5 na concentração de glicose tem o efeito oposto. Portan�
(concentração de substrato que dá atividade enzimáti�
ca igual à metade da velocidade máxima) para glicose
é consideravelmente mais alta do que o Km para glicose 1.0
Hexoquinase
das outras hexoquinases (Figura 15.12). Além disso,
a glucoquinase é muito menos sensível à inibição pelo
produto G6P, e sua curva de saturação de glicose é sig�
moidal, o que é indicativo de cooperatividade (p. 429).
Como a equação de Michael�Menten não se aplica (p.
Glucoquinase
413) sua cinética é descrita por um valor de S0,5 (con�
centração de substrato necessária para produzir meta�
de de Vmáx) ao invés de um valor de Km para glicose.
Embora não seja sensível à inibição por concentrações
fisiológicas de G6P, a glucoquinase é indiretamente
regulada por frutose�6�fosfato, que está apenas uma 0 5 10 15 20
etapa adiante e em equilíbrio com G6P. Uma proteína
Concentração de glicose (mM)
especial inibitória da glucoquinase (GK�RP), que fica
localizada no núcleo das célulascélulas hepáticas,hepáticas,hepáticas, ééé respon�respon�respon� FIGURA 15.12 Comparação das curvas de saturação de
sável por esse efeito (Figura 15.13). GK�RP sequestra substrato para hexoquinase e glucoquinase.
626 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.3

Intolerância a Frutose
Pacientes com intolerância hereditária à frutose são Embora pacientes com intolerância à frutose sejam
deficientes na enzima do fígado (aldolase B) que que� particularmente sensíveis a esse açúcar, os seres huma�
bra a frutose 1�fosfato em di�hidroxiacetona fosfato e nos em geral têm uma capacidade limitada para lidar
gliceraldeído. Três isoenzimas (A, B e C) são expressas com a frutose. A capacidade do fígado normal para fos�
em mamíferos. A aldolase B está presente em maiores forilar frutose excede muito sua capacidade de quebrar
quantidades no fígado. Ela age sobre ambas frutose frutose 1�fosfato. Isso significa que o uso de frutose pelo
1�fosfato e frutose 1,6�bisfosfato, mas tem afinidade fígado é mal controlado e que o excesso de frutose pode
muito maior (menor Km) para a frutose 1,6�bisfosfato. depletar o fígado de Pi e de ATP. A frutose foi testada,
O consumo de frutose por um indivíduo com deficiência por pouco tempo, em hospitais como um substituto de
de aldolase B resulta em acúmulo de frutose 1�fosfato e glicose em pacientes mantidos em nutrição parenteral.
depleção de Pi e ATP no fígado. As reações envolvidas A suposição que orientou o teste foi a de que frutose se�
são as da frutoquinase e das enzimas da fosforilação ria uma fonte de calorias melhor do que glicose porque
oxidativa. sua utilização é relativamente independente do estado
de insulina de um paciente. Logo, verificou�se que a ad�
Frutose + ATP → frutose 1�fosfato + ADP ministração de grandes quantidades de frutose por via
endovenosa resulta em severa lesão hepática. Tentati�
ADP + Pi + energia fornecida pela cadeia
vas semelhantes foram feitas para substituir glicose por
de transporte de elétrons → ATP
sorbitol e xilitol, mas estes também tendem a depletar o
Soma: Pi + frutose → frutose 1�fosfato fígado de ATP e, como a frutose, não devem ser usados
em nutrição parenteral.
Comprometer Pi como frutose 1�fosfato torna im�
possível para as mitocôndrias do fígado gerarem ATP
Steinmann, B., Gitzelmann, R. e Van den Berghe, G. Di�
por fosforilação oxidativa. Os níveis de ATP caem ver�
sorders of fructose metabolism. Em: Scriver, C.R., Beaudet,
tiginosamente, tornando impossível para o fígadofígado de�de�de� A. L., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.), T�e Met�bo�i� �n� Mo�e�
sempenhar suas funções normais. Os danos às células ����r ��ses of �n�erite� Dise�se, 8. ed., New York: McGraw�
resultam, em grande parte, pelo fato de estas ficam �Hill, 2001, p. 1489. Ali, M., Rellos, P. e Cox T.M. Hereditary
incapazes de manter os gradientes iônicos normais pe� fructose intolerance. J. Me�. Genet. 35:353, 1998; e Wong, D.
las bombas dependentes de ATP. As células incham e Hereditary fructose intolerance. Mo�. Gen. Met�b. 85: 165,
sofrem lise osmótica. 2005.

UM OLHAR MAIS ATENTO 15.3

Hexoquinase II e Câncer
Via de regra, cânceres de crescimento rápido me� o 18F é administrada aos indivíduos com suspeita de
tabolizam glicose mais rápido do que células normais, câncer. Grandes quantidades de 18F�2�desoxiglicose�6�
pelo menos em parte porque a superexpressão de he� �P acumulam�se nas células cancerosas que metabo�
xoquinase II dá às células cencerosas maior capacidade lizam glicose rapidamente. A ausência de um grupo
enzimática para fosforilação de glicose. Além disso, a hidroxila na posição 2 do resíduo de 2�desoxiglicose
forte ligação da hexoquinase II com a membrana mi� impede a continuação do metabolismo da 18F�2�deso�
tocondrial externa dá à enzima prioridade para o ATP xiglicose�6�P.
produzido por fosforilação oxidativa. A capacidade ex�
cepcional que as célulasélulas cancerosascancerosascancerosas têmtêmtêm paraparapara ooo meta�meta�meta� Mathupala, S. P., Ko, Y. H., e Pedersen, P. L. Hexokinase II:
bolismo de glicose é usada para detectar o câncer por Cancer’s Double�edged sword acting as both facilitator and
tomografia por emissão de pósitrons (PET, positron gatekeeper of malignancy when bound to mitochondria. On�
emission tomogr�p�y). 2�Desoxiglicose marcada com �ogene 25:4777, 2006.

to, o fígado usa glicose a uma velocidade significativa aconteceria se a glucoquinase tivesse o Km baixo carac�
apenas quando os níveis de glicose sanguínea estão terístico de outras hexoquinases, porque estaria então
muito elevados e diminui seu uso de glicose quando completamente saturada nas concentrações fisiológicas
os níveis de glicose sanguínea são baixos. Esse efeito de glicose. Por outro lado, uma forma de hexoquinase
tamponante sobre os níveis de glicose sanguínea não de baixo Km é uma boa escolha para tecidos como o cé�
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
Glicose Frutose
Glut 2
Glc
GK +
ativa
G6P
GK-RP
Frutose
inativa
+
F6P − antes que mudança significativa ocorra. A insulina pro�
Nócleo
Piruvato Frutose
1-fosfato
FIGURA 15.13 Atividade da glucoquinase é regulada por
deslocamento da enzima entre o citoplasma e o núcleo.
Glicose aumenta a atividade da glucoquinase (GK) por pro�
mover o deslocamento da enzima para o citoplasma. Frutose
6�fosfato diminui GK por estimular o deslocamento para o nú�
cleo. Frutose 1�fosfato aumenta GK por inibir o deslocamento
para o núcleo. Ligação de GK com a proteína regulatória (RP)
no núcleo inibe completamente a atividade de GK.
rebro, porque permite a fosforilação de glicose mesmo
quando as concentrações de glicose no sangue e no te�
cido são perigosamente baixas.
A reação da glucoquinase não está em equilíbrio
em condições intracelulares normais por causa da res�
trição de velocidade imposta pelo alto valor de S0,5 e
inibição pela proteína regulatória. Outro fator, em opo�
sição à atividade da glucoquinase, é a glicose 6�fosfata�
se que, como a glucoquinase, tem um Km alto (3 mM)
para glicose 6�fosfato, em relação à sua concentração
intracelular normal (∼0,2 mM). Assim, o fluxo por essa
etapa é quase que diretamente proporcional à concen�
tração intracelular de glicose 6�fosfato. Como mostra
a Figura 15.14, a ação combinada da glucoquinase e
da glicose 6�fosfatase constitui um ciclo fútil; isto é,
a soma de suas reações é a hidrólise de ATP para dar
ADP e Pi, sem a realização de qualquer trabalho. Quan�
do as concentrações de glicose no sangue são cerca de
5 mM, a atividade da glucoquinase é quase exatamente
balanceada pela atividade oposta da glicose 6�fosfata�
se. O resultado é que não há fluxo líquido em nenhu�
ma direção. Esse ciclo fútil gasta ATP, mas, combinado
com o processo de gluconeogênese (p. 638), contribui
significativamente para a ação “tamponante” do fígado
sobre os níveis de glicose sanguínea. Também fornece
um mecanismo para impedir que a glucoquinase com�
prometa todo o Pi do fígado.
A frutose, um componente de frutas, mel, vegetais
e calda de milho rica em frutose usada em bebidas car�
bonatadas populares, promove a utilização da glicose
hepática por um mecanismo indireto. É convertida, no
fígado, em frutose 1�fosfato (Correlação Clínica 15.3),
que promove dissociação da glucoquinase de sua pro�
teína regulatória (ver Figura 15.13) e, assim, o deslo�
camento para fora do núcleo. Essa ação, que é capaz
de superar a inibição da glucoquinase normalmente
imposta pela frutose 6�fosfato, pode ser um fator nos
efeitos adversos às vezes associados com o consumo
• 627
excessivo de frutose na dieta, por exemplo, utilização
hepática aumentada de carboidratos, lipogênese e hi�
pertriacilglicerolemia.
Glucoquinase é também uma enzima indutível. A
indução e a repressão da síntese de uma enzima são
processos lentos, geralmente demorando várias horas
move transcrição do gene da glucoquinase. Um aumen�
to nos níveis de glicose sanguínea sinaliza um aumento
na liberação de insulina das células b do pâncreas, o
que promove transcrição e aumenta a quantidade da
proteína da enzima glucoquinase no fígado. Portanto,
uma pessoa que consumiu uma refeição grande e rica
em carboidratos terá maiores quantidades de glucoqui�
nase do que uma que não consumiu. O fígado com glu�
coquinase induzida contribui mais para baixar os níveis
elevados de glicose sanguínea. A ausência de insulina
torna o fígado de pacientes com diabetes mellitus de�
ficiente em glucoquinase, a despeito dos altos níveis
de glicose sanguínea,ínea, ee diminuidiminui aa capacidadecapacidade dodo fíga�fíga�
do “tamponar” a glicose sanguínea (Correlação Clínica
15.4). Defeitos no gene que codifica a glucoquinase, que
alteram sua S0,5 e/ou Vmáx causam diabetes do jovem
com início na maturidade (MODY, m�t�rity�onset �i��
betes of t�e yo�ng), uma forma de diabetes mellitus
tipo 2.
Glicose
Pi ATP
6fosfatase
glicose glucoquinase
H2O ADP
Glicose 6fosfato
Soma: ATP + H2O ADP + Pi
FIGURA 15.14 Fosforilação de glicose seguida de
defosforilação constitui um ciclo fútil em células do
parênquima hepático.
6-Fosfofruto-1-quinase É uma
Enzima Regulatória da Glicólise
A 6�Fosfofruto�1�quinase éé umumum importanteimportanteimportante pontopontoponto re�re�re�
gulatório da glicólise. Ela catalisa a primeira etapa de
comprometimento da glicólise porque a reação catali�
sada pela fosfoglicose isomerase é reversível, e as célu�
las fazem uso da glicose 6�fosfato na via das pentoses
fosfato e para a síntese de glicogênio. Citrato, ATP e
íons hidrogênio (pH baixo) são os importantes efetores
alostéricos negativos, enquanto AMP e frutose 2,6�bis�
fosfato são importantes efetores alostéricos positivos
(ver Figura 15.11). Esses compostos sinalizam a neces�
sidade de diferentes velocidades da glicólise em respos�
ta a mudanças em (a) estado energético da célula (ATP
e AMP), (b) ambiente interno da célula (íons hidrogê�
nio), (c) disponibilidade de combustíveis alternativos,
628 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.4
Diabetes Mellitus
Diabetes mellitus é uma doença crônica caracteriza�
da por erros no metabolismo de carboidratos, lipídeos e
proteínas. Dois tipos principais são clinicamente reco�
nhecidos: tipo 1 (ver Correlação Clínica 21.8, p. 893) e
tipo 2 (ver Correlação Clínica 21.7, p. 892).
Em pacientes sem hiperglicemia de jejum, o teste
de tolerância à glicose por via oral pode ser usado para
diagnóstico. Ele consiste em determinar o nível de gli�
cose sanguínea no estado de jejum e em intervalos de
30–60
–60 min., por 2 h ou mais, após o consumo de car�
ga de 100 g de carboidrato. Em indivíduos normais, a
glicose sanguínea retorna aos níveis normais em 2 h
após ingestão do carboidrato. Em diabéticos, a glicose
sanguínea atinge um nível mais alto e permanece ele�
vada por períodos de tempo mais longos, dependendo
da gravidade da doença. Entretanto, muitos fatores
podem contribuir para um teste de tolerância à glico�
se anormal. O paciente deve ter consumido uma dieta
rica em carboidratos nos três dias anteriores, presu�
mivelmente para permitir a indução das enzimas das
vias de utilização da glicose, por exemplo, glucoquina�
se, acil graxo sintase e acetil�CoA carboxilase. Qua�
se todas as infecções (até mesmo um resfriado) e o
estresse menos definido (presumivelmente por efeitos
como ácidos graxos e corpos cetônicos (citrato), e (d)
a razão insulina/glucagon do sangue (frutose 2,6�bis�
fosfato).
Regulação da 6-Fosfofruto-1-quinase por
ATP e AMP
O efeito Pasteur refere�se à inibição da utilização de
glicose e ao acúmulo de lactato que ocorre quando a
respiração (consumo de oxigênio) é iniciada em células
anaeróbicas. É perfeitamente compreensível em base
termodinâmica, uma vez que a oxidação completa da
glicose a CO2 e H2O gera muito mais ATP do que a gli�
cólise anaeróbica.
Glicólise
D�Glicose + 2ADP3– + 2 Pi2– → 2 L�lactato– + 2ATP4–
Oxidação Completa
+ 66 O2
D�Glicose→ CO2++
326ADP3– Pi2– + 32 H+ →
H2O ++3232ATP4–
As célulasélulas usamusam ATPATP parapara fornecerfornecer aa energiaenergia neces�neces�
sária a seus processos inerentesinerentes dede trabalho.trabalho. ComoComo mui�mui�
to mais ATP é produzido a partir de glicose em presença
de oxigênio, muito menos glicose precisa ser consumida
sobre o sistema nervoso simpático) podem resultar em
anomalias transitórias no teste de tolerância à glicose.
Por causa desses problemas, a hiperglicemia de jejum
(> 126 mg/dl) seria, provavelmente, o teste sine ���
non para o diagnóstico de diabetes. A captação de gli�
cose por tecidos sensíveis à insulina, isto é, muscular
e adiposo, é diminuída no estado diabético. O paciente
diabético ou não tem insulina ou desenvolveu resis�
tên�i� à ins��in� nesses tecidos. A resistência à in�
sulina resulta de anomalias no receptor de insulina ou
em etapas subsequentes, mediadoras dos efeitos me�
tabólicos da insulina. Células do parênquima hepático
não requerem insulina lina para captar glicose. Sem insu�
lina, contudo, o fígado tem capacidade diminuída para
remover glicose do sangue. Isso é explicado, em parte,
por atividade diminuída de glucoquinase e a perda de
ação da insulina sobre enzimas chaves da glicogênese
e da via glicolítica.
Taylor, S. I. Insulin action, insulin resistance and type 2
diabetes mellitus. Em: Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W.
S. e Valle, D. (Eds.), T�e Met�bo�i� �n� Mo�e����r ��ses of
�n�erite� Dise�se, 8. ed., New York: McGraw�Hill, 2001, p.
1433; American Diabetes Association web site www.diabetes.
orp/home.jsp.
para satisfazer a demanda de energia. O efeito Pasteur
ocorre em parte em virtude da inibição por ATP da gli�
cólise, no nível da 6�fosfofruto�1�quinase. Isso pode ser
facilmente entendido, uma vez que o ATP é um inibidor
da 6�fosfofruto�1�quinase, e muito mais ATP é gerado
na presença de oxigênio do que na sua ausência. Como
a 6�fosfofruto�1�quinase é fortemente inibida em con�
centrações de ATP (2,5�6 mM) normalmente presentes
nas células, variações relativamente pequenas na con�
centração de ATP que ocorrem com �ers�s sem oxigê�
nio não podem justificar as grandes mudanças no fluxo
pela 6�fosfofruto�1�quinase. Contudo, variações muito
maiores ocorrem nas concentrações de AMP, um efetor
alostérico positivo da 6�fosfofruto�1�quinase (ver Fi�
gura 15.11). A concentração de estado estacionário de
AMP quando oxigênio é introduzido cai drasticamente,
diminuindo a atividade da 6�fosfofruto�1�quinase, su�
primindo a glicólise e respondendo, em grande parte,
pelo efeito Pasteur. Os níveis de AMP caem automatica�
mente quando os níveis de ATP sobem porque a soma
dos nucleotídeos de adenina em uma célula, isto é, ATP
+ ADP + AMP, é quase constante na maioria das condi�
ções fisiológicas, e a quantidade de ATP é sempre mui�
to maior do que a quantidade de AMP. Além disso, os
nucleotídeos da adenina são mantidos em equilíbrio no
citosol pela adenilato quinase, que catalisa a reação re�
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
versível de 2 ADP → ATP + AMP. A constante de equi�
líbrio (K!eq) para essa reação é dada por
[ATP][AMP]
Keq = [ADP]2
Como essa reação opera próximo do equilíbrio em
condições intracelulares, a concentração de AMP é
dada por
[AMP] = Keq
[ATP]
[ADP]2
Como as concentrações intracelulares [ATP] >>
[ADP] >> [AMP], uma pequena diminuição no [ATP]
causa um aumento percentual substancialmente maior
no [ADP], e como [AMP] está relacionado com o quadra�
do de [ADP], um aumento percentual ainda maior no
[AMP]. Graças a essa relação, uma pequena diminuição
no [ATP] leva a um aumento percentual maior no [AMP]
do que a diminuição percentual no [ATP]. Isso torna o
[AMP] um excelente sinal do estado energético da cé�
lula e um importante regulador alostérico da atividade
da 6�fosfofruto�1�quinase. A efetividade da 6�fosfofru�
to�1�quinase é influenciada por [AMP] por outro modo,
ainda. A frutose 1,6�bisfosfatase catalisa uma reação
irreversível, que éé opostaoposta àà reaçãoreaçãoeação dadada 6�fosfofruto�1�6�fosfofruto�1�6�fosfofruto�1�
�quinase.
Frutose 1,6�bisfosfato + H2O → frutose 6�fosfato + Pi
A frutose 1,6�bisfosfatase fica muito próxima da
6�fosfofruto�1�quinase no citosol de muitas células. Jun�
Glicose
Sangue
a Citosol
Membrana
plasmática
Glicose
(2) ADP + (2) Pi
Glicólise
(2) Lactatoi
(2) Lactatoi
• 629
tas, elas catalisam um ciclo fútil (ATP + H2O → ADP
+ Pi + “calor”) e são, portanto, capazes de diminuir
mutuamente sua “eficiência”. Entretanto, AMP inibe a
frutose 1,6�bisfosfatase, o que é oposto ao efeito que o
AMP tem sobre a 6�fosfofruto�1�quinase. Assim, uma
pequena queda no [ATP] desencadeia um aumento per�
centual grande no [AMP] o que, por sua vez, sinaliza um
grande aumento na conversão líquida de frutose 6�fos�
fato para frutose 1,6�bisfosfato, devido ao seu efeito so�
bre essas duas enzimas. Isso aumenta o fluxo glicolítico
por aumentar a quantidade de frutose 1,6�bisfosfato
disponível para o estágio de quebra.
A diminuição do lactato, que ocorre por causa do
efeito Pasteur, é facilmente explicada pelo fluxo glico�
lítico diminuído. Além disso, a lactato desidrogenase
perde a competição com os sistemas de lançadeiras de
substratos pelo NADH e a competição com o complexo
piruvato desidrogenase pelo piruvato.
Regulação da 6-Fosfofruto-1-quinase por
pH Intracelular
Faria sentido que o lactato, como produto final da
glicólise, inibisse a enzima regulatória mais importante
da glicólise. Entretanto, são os íons hidrogênio e não o
lactato que inibem a 6�fosfofruto�1�quinase (ver Figura
15.11). Como mostra a Figura 15.15, a glicólise anaeró�
bica gera ácido láctico, e a célula deve dispor dele como
tal ou sofrer as consequênciasênciass negativasnegativasnegativas dadada acidifica�acidifica�acidifica�
ção. Isso explica porque glicólise excessiva baixa o pH
do sangue e leva a uma situação médica de emergência
conhecida como acidose láctica (Cor�
relação Clínica 15.5). As membranas
plasmáticas contêm um simporte para
lactato e íons hidrogênio que permite
a transferência de ácido láctico para a
corrente sanguínea. Esse mecanismo
de defesa impede que o pH fique tão
baixo que os tecidos produzindo ácido
láctico tornem�se “picles” (Correlação
Trabalho
b
(2) ATP
FIGURA 15.15 A menos que o lactato
formado pela glicólise seja transportado
para fora da célula, o pH intracelular
cairá pelo acúmulo de ácido láctico
intracelular (equivalente a lactato– mais
H+, porque o ácido láctico ioniza no pH
(2) H+ intracelular).
O baixo pH diminui a atividade da 6�fosfofru�
to�1�quinase, de modo que a produção adi�
cional de ácido láctico pela glicólise é inibida.
(�) Transporte de glicose para dentro da cé�
lula. (b) Execução de todos os trabalhos que
Sangue convertem ATP em ADP e Pi. (�) Simporte
lactato�H+ (estequiometria real de um lacta�
(2) H+
to– e um H+ transportado pelo simporte).
630 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.5
Acidose Láctica
É caracterizada porpor altosaltos níveisníveis sanguíneossanguíneosíneos dedede lac�lac�lac�
tato, geralmente superiores a 5 mM, com diminuição
no pH do sangue e nas concentrações de bicarbonato
(ver Correlação Clínica 1.2, p. 11). Acidose láctica é
a forma mais frequente de acidose metabólica e pode
ser consequênciaência dede superproduçãosuperprodução dede lactato,lactato, subuti�subuti�
lização de lactato, ou ambos. A produção de lactato é
normalmente equilibrada pela utilização de lactato, de
modo que normalmente lactato não está presente no
sangue em concentrações superiores a 1,2 mM. Todos
os tecidos podem produzir lactato por glicólise anae�
róbica, mas a maioria dos tecidos não produz grandes
quantidades uma vez que são bem supridos de oxigê�
nio e mitocôndrias. Entretanto, todos os tecidos res�
pondem com um aumento na geração de lactato quan�
do a oxigenação é inadequada. Uma queda no ATP em
virtude da fosforilação oxidativa diminuída aumenta
a atividade da 6�fosfofruto�1�quinase. Assim, os teci�
dos precisam depender da glicólise anaeróbica para
produção de ATP em tais condições, e superproduzem
ácido láctico. Um bom exemplo é o exercício muscular,
que pode depletar o tecido de oxigênio e causar uma
superprodução de ácido láctico. Hipóxia tecidual ocor�
re, contudo, em todas as formas de choque, durante
convulsões e em doenças envolvendo insuficiência cir�
culatória e pulmonar.
O principal destino do lactato no corpo é com�
pleta combustão a CO2 e H2O ou conversão de volta
em glicose, pelo processo de gluconeogênese. Ambos
requerem oxigênio. A disponibilidade diminuída de
Clínica 15.6). O transporte de ácido láctico para fora
da célula requer que sangue esteja disponível para levá�
�lo para longe. Quando o fluxo sanguíneo é inadequado,
por exemplo, no coração durante um ataque de angina
pectoris ou no músculo esquelético durante exercício
intenso, os íons hidrogênio não conseguem escapar das
células em velocidade suficiente. No entanto, a necessi�
dade de ATP, manifestada por um aumento no [AMP],
pode subrepujar parcialmente a inibição da 6�fosfofru�
to�1�quinase por íons hidrogênio. Acúmulo desequili�
brado de íons hidrogênio, então, causa dor que, no caso
do músculo esquelético, pode ser aliviada simplesmente
parando o exercício. No coração, descanso ou agentes
farmacológicos que aumentam o fluxo sanguíneo ou di�
minuem a necessidade de ATP nos miócitos podem ser
eficazes (Correlação Clínica 15.7).
Regulação da 6-Fosfofruto-1-quinase por
Citrato
Muitos tecidos preferem usar ácidos graxos e corpos
cetônicos como combustíveis oxidáveis no lugar da
da gli�
oxigênio, portanto, aumenta a produção de lactato e
diminui a utilização de lactato. A última também pode
ser diminuída por doenças hepáticas, etanol e várias
outras drogas. Foi bem documentado que fenformina,
uma droga que foi usada para tratar a hiperglicemia do
diabetes tipo 2, induz acidose láctica como consequên�
cia da inibição do complexo I da cadeia mitocondrial
de transporte de elétrons. A deficiência de tiamina,
comum em alcoólatras desnutridos, causa acidose lác�
tica como uma consequência da perda de atividade do
complexo piruvato desidrogenase. A tiamina deve ser
administrada imediatamente em pacientes com acido�
se láctica grave.
Bicarbonato é geralmente administrado em uma
tentativa de controlar a acidose associada com acúmulo
de ácido láctico. A chave para o sucesso do tratamento,
entretanto, é encontrar e eliminar a causa da superpro�
dução e/ou subutilização de ácido láctico, o que, muito
frequentemente, envolve a restauração da circulação de
sangue oxigenado.
Newsholme, E. A. e Leech, A. R. �io��emistry for t�e
Me�i��� ��ien�es. New York: Wiley, 1983; Kruse, J. A e Carl�
son, R. W. Lactate metabolism. Crit. C�re C�in. 3:725, 1985;
Stacpoole, P. W. Lactic acidosis and other mitochondrial di�
sorders. Met�bo�ism 46: 306, 1997; Ammari, A. N. e Schulze,
K. F. Uses and abuses of sodium bicarbonate in the neona�
tal intensive care unit. C�rr. Opin. Pe�i�tr. 14:151, 2002; e
Klein, M., Weksler, N., e Gurman, G. M. Fatal metabolic aci�
dosis caused by thiamine deficiency. J. Emer. Me�. 26:301,
2004.
cose. A maioria desses tecidos pode usar glicose, mas
prefere oxidar ácidos graxos e corpos cetônicos. Isso
ajuda a economizar glicose para tecidos, como o cére�
bro, que são absolutamente dependentes dela. A oxida�
ção de ácidos graxos e corpos cetônicos eleva os níveis
de citrato citosólico, o que inibe a 6�fosfofruto�1�quina�
se (ver Figura 15.11) e diminui a utilização de glicose.
Controle Hormonal da 6-Fosfofruto
1-quinase por cAMP e Frutose
2,6-bisfosfato
Frutose 2,6�bisfosfato (Figura 15.16), assim como
AMP, é um efetor alostérico positivo da 6�fosfofruto�1�
�quinase e é um efetor alostérico negativo da frutose
1,6�bisfosfatase (ver Figura 15.11). Na realidade, sem sua
presença, a glicólise não poderia ocorrer no fígado por�
que a 6�fosfofruto�1�quinase teria atividade insuficiente
e a frutose 1,6�bisfosfatase seria ativa demais para a con�
versão de frutose 6�fosfato em frutose 1,6�bisfosfato.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 631

CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.6

“Picles” de Porco e Hipertermia Maligna (OMIM 145600)

Na hipertermia maligna, uma variedade de agentes, Em resposta ao halotano, os músculos esqueléticos

especialmente o anestésico geral halotano, produzem
uma dramática elevação na temperatura corporal, aci�
dose metabólica e respiratória, hipercalemia e rigidez
muscular. Essa doença hereditária dominante ocorre
em cerca de 1 a cada 15.000 crianças, e 1 a cada 50.000–
100.000 adultos. A morte pode resultar na primeira vez
que uma pessoa susceptível é anestesiada. O início
ocorre minutos após exposição à droga, e a hiperter�
mia deve ser reconhecida imediatamente. Envolver o
paciente em gelo é eficiente e deve ser acompanhado de
medidas para combater a acidose. A droga dantroleno
também é eficaz.
Um fenômeno semelhante à hipertermia maligna
ocorre em porcos; é chamada síndrome do estresse por�
cino.. Os porcos respondem mal ao estresse. Essa do�
ença genética geralmente se manifesta quando o porco
está sendo enviado para o mercado. Quando expostos a
halotano, porcos susceptíveis têm a mesma resposta ob�
servada no homem com hipertermia maligna. A carne
dos porcos que morreram da doença é pálida, aguada, e
o pH é muito baixo (ou seja, como do picles).
de indivíduos afetados ficam rígidos e geram calor e
ácido láctico. O retículo sarcoplasmático tem um re�
ceptor de rianodina anormal, um canal de liberação de
Ca2+ que é importante no acoplamento excitação–con�
tração. Em decorrência do defeito nessa proteína, o
anestésico desencadeia liberação incorreta de Ca2+ do
retículo sarcoplasmático e estímulo descontrolado de
processos que geram calor, incluindo miosina ATPase,
glicogenólise, glicólise e captação e liberação cíclicas
de Ca2+ por mitocôndrias e retículo sarcoplasmático.
As célulasélulas muscularesmusculares ficamficam irreversivelmenteirreversivelmentelmente danifi�danifi�danifi�
cadas pela produção excessiva de calor, acidose láctica
e perda de ATP.
Kalow, W. e Grant, D. M. Pharmacogenetics. Em: Scriver,
C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.), T�e Met��
bo�i� �n� Mo�e����r ��ses of �n�erite� Dise�se, 8. ed., New
York: McGraw�Hill, 2001, p. 225; McCarthy T. V., Heffron, J. J.
A., e Macrill, J. Molecular and clinical genetics of RYRI disor�
ders. Em: Wehrens, X. H. T., e Marks, A. R. (Eds). Ry�no�ine
Re�eptors: �tr��t�re� F�n�tion �n� Dysf�n�tion in C�ini�
��� Dise�se. New York: Springer, 2005, 219.

CH2OPO32− A frutose 2,6�bisfosfato é produzida a partir de F6P

O OPO32− pela enzima 6-fosfofruto-2-quinase (Figura 15.19),
H OH (β) como um subproduto, e não como um intermediário
H CH2OH da glicólise. Portanto, devemos lidar com duas fosfo�
OH H frutoquinases, uma (6�fosfofruto�1�quinase) produz
um intermediário da glicólise (frutose 1,6�bisfosfato),
FIGURA 15.16 Estrutura da frutose 2,6-bisfosfato.
Glucagon
A Figura 15.17 resume o papel da Receptor Adenilato
de glucagon ciclase
frutose�2,6�bisfosfato no controle hor�
monal da glicólise hepática. O meca� +
nismo usa cAMP (Figura 15.18) como
seg�n�o mens�geiro da ação hormo�
nal. Glucagon é liberado das células α Gs +
do pâncreas e circula no sangue até
encontrar receptores de glucagon na
superfície externa da membrana plas� ATP
mática do fígado (ver p. 634 para mais
detalhes). A ligação de glucagon ao seu
receptor desencadeia o estímulo da Inibição da Diminuição de
cAMP
adenilato ciclase por meio do segundo Glicólise Frutose 2,6–P2
Membrana
mensageiro AMP cíclico (cAMP), o que plasmática
resulta em uma diminuição da frutose
2,6�bisfosfato. Isso torna a 6�fosfofru�
to�1�quinase menos efetiva, e a frutose
1,6�bisfosfatase mais efetiva, restrin� FIGURA 15.17 Mecanismo pelo qual o glucagon inibe a glicólise hepática.
gindo severamente, dessa forma, o A ligação de glucagon ao seu receptor de membrana ativa a adenilato ciclase (uma
fluxo de frutose 6�fosfato para frutose proteína intrínseca de membrana) pela ação de uma proteína G estimulatória (Gs;
1,6�bisfosfato na glicólise. uma proteína periférica de membrana). O símbolo (+) indica ativação.
632 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.7
Angina Pectoris e Infarto do Miocárdio
Dor no peito associada com isquemia reversível do
miocárdio é chamada de �ngin� pe�toris (literalmen�
te, dor lancinante no peito). A dor resulta de um de�
sequilíbrio entre a demanda e o suprimento de fluxo
sanguíneo
íneo para os músculos cardíacos, e é mais comu�
mente causada por estreitamento das artérias coroná�
rias. O paciente sente uma pesada pressão ou “aperto”
ou dor subesternal, frequentemente se irradiando para
ombro e braço ou, ocasionalmente, para queixo ou pes�
coço. Os ataques ocorrem com esforço, duram de 1 a
15 min., e são aliviados por repouso ou morte. As arté�
rias coronárias envolvidas são obstruídas por ateroscle�
rose (ou seja, recobertas por depósitos de gordura) ou,
menos frequentemente, estreitadas por espasmo. O in�
farto ocorre se a isquemia persistir por tempo suficiente
para causar lesão grave (necrose) do músculo cardíaco.
Comumente, um coágulo sanguíneo se forma no ponto
do estreitamento e obstrui completamente o vaso. No
infarto, morte tecidual ocorre e a dor dura mais e, fre�
quentemente, é mais intensa.
Nitroglicerina e outros nitratos são frequentemen�
te prescritos para aliviar a dor. Podem ser usados pro�
filaticamente, permitindo que os pacientes participem
de atividades que, de outro modo, precipitariam um
ataque. A nitroglicerina pode funcionar, em parte, por
causar dilatação das artérias coronárias, melhoran�
do a oferta de oxigênio e removendo o ácido láctico.
Provavelmente, o mais importante é o efeito sobre a
circulação periférica. Quebra da nitroglicerina produz
óxido nítrico (NO) (p. 463), que relaxa o músculo liso,
causando venodilatação em todo o corpo. Isso reduz
a pressão arterial e permite que o sangue se acumu�
e a outra (6�fosfofruto�2�quinase) produz um efetor
alostérico positivo (frutose 2,6�bisfosfato) da enzima
anterior. A frutose 2,6�bisfosfatase se opõe à 6�fosfo�
fruto�2�quinase por converter frutose 2,6�bisfosfato em
F6P por simples hidrólise. Essas atividades de quinase
e fosfatase que determinam a quantidade de frutose
2,6�bisfosfato residem na mesma proteína, uma enzi�
ma bifuncional chamada 6�fosfofruto�2�quinase/fruto�
se 2,6�bisfosfatase. O cAMP regula os níveis da frutose
2,6�bisfosfato no fígado por ativar a parte fosfatase e
inativar a quinase da enzima bifuncional. Isso é conse�
guido pela ativação mediada por cAMP da proteína qui
nase A. A proteína quinase A inativa consiste de duas
subunidades regulatórias e duas subunidades catalí�
ticas. A ligação de cAMP às subunidades regulatórias
causa mudanças conformacionais que liberam e ativam
as subunidades catalíticas. As subunidades catalíticas
ativadas então fosforilam resíduos específicos de serina
presentes em muitas enzimas (Figura 15.20).
le nas veias. O resultado é retorno diminuído de san�
gue para o coração e volume reduzido de sangue a ser
bombeado, o que reduz a necessidade de energia. O
coração também se esvazia contra menor pressão, o
que também poupa energia. O efeito geral é uma queda
na necessidade de oxigênio para o coração, ficando de
acordo com o suprimento de oxigênio pelas artérias
coronárias doentes. Outros agentes úteis são osos blo�
queadores de canal de cálcio, que são vasodilatadores
coronários e bloqueadores b�adrenérgicos. Os b�blo�
queadores impedem o aumento no consumo de oxigê�
nio pelo miocárdio, induzido pelo estímulo do sistema
nervoso simpático sobre o coração, como ocorre com
exercício físico.
A cirurgia de pontes coronárias é usada em casos
graves de angina, que não podem ser controlados por
medicação. Nessa operação, veias são removidas da
perna e colocadas entre a aorta e as artérias coroná�
rias, para contornar a porção afetada pela aterosclerose
e prover o tecido afetado de um maior suprimento de
sangue. Pode ser obtido um alívio notável da angina por
essa operação, sendo que o paciente pode retornar à
vida normal produtiva em alguns casos.
Hugenholtz, P. G. Calcium antagonists for angina pectoris.
Ann. N. Y. A���. ��i. 522: 564, 1988; Feelishch, M. e Noack,
E. A. Correlation between nitric oxide formation during degra�
dation of organic nitrates and activation of guanylate cyclase.
E�r. J. P��rm��o�. 139:19, 1987; Ignarro, L. J. Biological ac�
tions and properties of endothelium�derived nitric oxide for�
med and released from artery and vein. Cir�. Res. 65:1, 1989; e
Miller, M. R. e Megson, I. L. Recent development in nitric oxide
donor drugs. �ritis� J. P��rm. 151: 305, 2007.
NH2
C N
N C
CH
HC C
C N
O CH2
O
H H
H H
O P O OH
O–
AMP cíclico
FIGURA 15.18 Estrutura do cAMP.
A fosforilação de uma enzima pode conveniente�
mente ser abreviada por
 + ATP → –P + ADP
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 633

onde  e –P são usados para indicar enzimas des� proteína quinase A
fosforilada e fosforilada, respectivamente. A fosforila�
ção causa uma mudança na conformação que afeta o
ATP ADP
sítio ativo da enzima. A atividade de algumas enzimas é P ²P
aumentada, enquanto a de outras éé diminuídadiminuída porporpor fos�fos�fos� i H2O
forilação. Muitas enzimas são reguladas por esse tipo
de modificação covalente, que pode ser revertida sim� fosfoproteína fosfatase
plesmente removendo�se o fosfato. Independentemente
de a fosforilação ou desfosforilação ativar a enzima, a FIGURA 15.21 Modelo geral de regulação de enzimas por
enzima ativa é chamada de forma a, e a enzima inativa, fosforilação-defosforilação.
Os símbolos  e –P indicam que diferentes conformações e
forma b. Do mesmo modo, a ação de uma proteína qui�
nase é sempre oposta à de uma fosfoproteína fosfatase, estados de atividade da enzima são produzidos, em virtude da
fosforilação�defosforilação.
que catalisa a reação de
–P + H2O →  + Pi
A Enzima Bifuncional 6-Fosfofruto
Em conjunto, criam um sistema cíclico de controle
(Figura 15.21), tal que a razão da enzima fosforilada para 2-quinase/Frutose 2,6-bisfosfatase É
a desfosforilada depende das atividades relativas da pro� Regulada Por Fosforilação
teína quinase e da fosfoproteína fosfatase, ambas quase
que invariavelmente também sujeitas a regulação. Geralmente, uma enzima sujeita a fosforilação é ou
ativada ou inativada como um resultado de fosforila�
ção. A natureza bifuncional da 6�fosfofruto�2�quinase/
6Fosfofruto2quinase frutose 2,6�bisfosfatase torna�a singular nesse aspecto.
Uma única fosforilação da 6�fosfofruto�2�quinase/fru�
ATP ADP tose 2,6�bisfosfatase de fígado inativa a atividade en�
Frutose 6fosfato Frutose 2,6bisfosfato zimática de quinase, mas ativa a atividade enzimática
Pi H2O de fosfatase (Figura 15.22). Desfosforilação tem efei�
tos opostos. Isso fornece um mecanismo muito sensível
Frutose 2,6bisfosfatase para estabelecer a concentração intracelular de frutose
2,6�bisfosfato em células hepáticas, em reposta a mu�
FIGURA 15.19 Reações envolvidas na formação e na danças nos níveis sanguíneos de glucagon ou epinefrina
degradação da frutose 2,6-bisfosfato.
(Figura 15.23). Níveis aumentados de glucagon ou epi�
nefrina, agindo por meio dos receptores de glucagon da
OH membrana plasmática e dos receptores b�adrenérgicos,
respectivamente, têm o efeito comum de aumentar os
CH2
níveis intracelulares de cAMP. Este ativa proteína qui�
CH O nase A, que fosforila um resíduo de serina da 6�fosfofru�
HNC
to�2�quinase/frutose 2,6�bisfosfatase (Figura 15.24), o
que inibe a atividade de quinase e ativa sua atividade
Cadeia peptídica
+ de fosfatase. A queda resultante em frutose 2,6�bisfos�
ATP4i fato torna a 6�fosfofruto�1�quinase menos efetiva e a
frutose 1,6�bisfosfatase mais efetiva, inibindo assim a
Mg2+ glicólise no nível da conversão de frutose 6�fosfato em
frutose 1,6�bisfosfato. Uma diminuição no glucagon ou
na epinefrina do sangue resulta no efeito oposto. Uma
OPO32i

CH2
SURWHtQDTXLQDVH$
HN CH O
C
$73 $'3
Cadeia peptídica 3).D)3!DVHE 3).E)3!DVHD
+
ADP3i 3L +2 ²3
+
H+ IRVIRSURWHtQDIRVIDWDVH

FIGURA 15.20 Enzimas sujeitas a modificação covalente
são geralmente fosforiladas em resíduos específicos de
serina.
Resíduos de tirosina e treonina também são sítios importantes
de modificação covalente pela fosforilação.
FIGURA 15.22 Mecanismo de modificação covalente da
6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase.
O nome da enzima é abreviado por 6�PF�2�K/F�2,6�P’ase. As
letras a e b indicam as formas ativa e inativa das enzimas, res�
pectivamente.
634 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Adenilato Epinefrina
Glucagon Receptor
ciclase
Receptor de Adrenérgico
glucagon

 +

Gs   Gs

Membrana
ATP
plasmática

cAMP


Proteína quinase A

ATP ADP

Frutose 6P

ATP
Pi

PFi2iKa/Fi2,6iP!ase b PFi2iKb/Fi2,6iP!ase a

iP

ADP

Frutose2,6P2

FIGURA 15.23 Mecanismo de inibição Glicose

da glicólise hepática por glucagon e
epinefrina por queda mediada por ² Frutose 6iP 
cAMP da concentração de frutose
Fi1,6iP!ase PFi1iK
2,6-bisfosfato.
Frutose 1,6ibisP
Ver legenda da Figura 15.19. As setas Pi
grossas indicam reações que predomi�
Piruvato
nam em presença de glucagon. As setas
pequenas antes da frutose 2,6�bisfosfato
Fosfoproteína fosfatase
indicam uma queda em sua concentração

Quinase Fosfatase fosfoproteína fosfatase remove o fosfato da enzima bi�

H3+
N COOi
P frutose 2,6�bisfosfato acumula�se até uma concentração
470 Aminoácidos
FIGURA 15.24 Diagrama esquemático da estrutura
primária da isoenzima hepática da 6-fosfofruto-2
quinase/frutose 2,6-bisfosfatase.
H3N+ e COO– indicam as extremidades N�terminal e C�ter�
minal, respectivamente. O domínio com atividade de quinase
localiza�se na metade N�terminal; o domínio com atividade de
fosfatase, na metade C�terminal. A letra Pindica o sítio (serina
32) fosforilado pela proteína quinase A.
funcional para ativar a quinase e inativar a fosfatase. A
de estado estacionário mais alta e aumenta a taxa de
glicólise. Portanto, o glucagon e a epinefrina são sinais
extracelulares que impedem o fígado de usar glicose,
enquanto a frutose 2,6�bisfosfato é um sinal intracelu�
lar que promove a utilização de glicose por esse tecido.
A insulina tem efeito oposto ao do glucagon e da
epinefrina, por meio de uma cascata de sinalização ini�
ciada pela ativação da atividade da tirosina quinase do
seu receptor (p. 931). A insulina também ativa a cAMP
fosfodiesterase (reduz os níveis de cAMP), inibe a pro�
teína quinase A, e ativa a fosfoproteína fosfatase, ações
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 635

Receptor de Insulina
glucagon ou Adenilato Receptor
β-adrenérgico ciclase de insulina

Gs +

Membrana
plasmática

ATP cAMP + AMP Cascata de sinalização

mediada por quinase
?

+ –
proteína quinase A

ATP ADP

Frutose 6-P

ATP
Pi

PF–2–K a/F–2,6–P2! aseADP

b PF–2–K b/F–2,6–P2! ase a

–P

FIGURA 15.25 Mecanismo

Frutose 2,6-P2 responsável por velocidade
aumentada de glicólise hepática,
Glicose quando as concentrações de
glucagon e epinefrina são baixas e a
F–1, 6–P2!ase
– Frutose 6–P PF–1–K de insulina é alta no sangue.
+ Ver legendas das Figuras 15.17e 15.23.
Frutose 1,6–P2 O receptor de insulina é uma proteína
Pi
intrínseca da membrana plasmática. A
Piruvato seta pequena antes da frutose 2,6�bis�
fosfato indica um aumento em sua con�
centração. O cAMP é convertido em
fosfoproteína fosfatase + AMP pela cAMP fosfodiesterase.

todas com efeitos opostos aos do glucagon e da epinefri�
na (Figura 15.25). Insulina, portanto, age estimulando
a taxa de glicólise.
Coração Contém uma Isoenzima
Diferente da 6-Fosfofruto-2
quinase/Frutose 2,6-bisfosfatase
Um aumento no nível sanguíneo de epinefrina tem
um efeito completamente diferente sobre a glicólise do
coração, em comparação com o fígado. Embora a glicó�
lise seja inibida no fígado para economizar glicose para
uso por outros tecidos, a epinefrina estimula a glicóli�
se no coração para atender à demanda aumentada de
ATP, causada por um aumento sinalizado por epinefri�
na na carga de trabalho. Como no fígado, a epinefrina
age no coração por meio de um receptor b�adrenérgi�
co da membrana plasmática, promovendo a formação
de cAMP (Figura 15.26). Isso resulta em ativação da
proteína quinase A que, por sua vez, fosforila a 6�fos�
fofruto�2�quinase/frutose 2,6�bisfosfatase. Entretanto,
diferentemente do que acontece no fígado, fosforilação
da enzima bifuncional no coração aumenta, em vez de
diminuir, os níveis de frutose 2,6�bisfosfato. Isso porque
a isoenzima da enzima bifuncional expressa no coração
é diferente da isoenzima expressa no fígado. A fosforila�
ção da isoenzima cardíaca ocorre em um sítio que ativa,
em vez de inibir, a atividade da quinase (Figura 15.27).
636 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

(SLQHIULQD
$GHQLODWR 5HFHSWRU
FLFODVH $GUHQpUJLFR

+ *V

0HPEUDQD
SODVPiWLFD

$73 F$03

+
3URWHtQDTXLQDVH$

$73 $'3

²3
3).E $73 3).D

$'3
)UXWRVH3 )UXWRVH3

FIGURA 15.26 Mecanismo de

aceleração da glicólise no coração
+ em resposta à epinefrina.
3).
Ver legendas das Figuras 15.17 e 15.25.

Concentração aumentada de frutose 2,6�bisfosfato en� A Piruvato Quinase É também uma

tão aumenta a atividade de 6�fosfofruto�1�quinase e au�
menta o fluxo glicolítico.
Quinase Fosfatase
+ (ver Figura 15.11), tanto que provavelmente sua ativida�
H3N
P
530 Aminácidos
FIGURA 15.27 Diagrama esquemático da estrutura
primária da isoenzima cardíaca da 6-fosfofruto-2
quinase/frutose 2,6-bisfosfatase.
Ver legenda da Figura 15.24. A letra P indica o sítio (serina
466) fosforilado pela proteína quinase A.
Papel da 6-Fosfofruto-2-quinase/Frutose
2,6-bifosfatase no Câncer
Muitas células de câncer expressam uma isoforma
especial de 6�fosfofruto�2�quinase/frutose 2,6�bisfos�
fatase, na qual a atividade do componente 2�quinase
excede muito a atividade do componente 2�fosfatase.
Isso resulta em uma alta concentração de estado es�
tacionário de frutose 2,6�bisfosfato, o que estimula ao
máximo a atividade da 6�fosfofruto�1�quinase. Esse é
um importante componente do mecanismo responsá�
vel pela alta taxa de glicólise característica de tumo�
res de crescimento rápido (Um Olhar Mais Atento 15.4
e 15.5).
Enzima Regulatória da Glicólise
A piruvato quinase (Correlação Clínica 15.8) é dras�
ticamente inibida por concentrações fisiológicas de ATP
COO–
de potencial nunca é completamente atingida em condi�
ções fisiológicas. A isoenzima do fígado é muito ativada
por frutose 1,6�bisfosfato (FBP), ligando assim a regula�
ção da piruvato quinase com a da 6�fosfofruto�1�quinase.
Portanto, se as condições favorecerem o fluxo aumen�
tado pela 6�fosfofruto�1�quinase, o nível de FBP sobe e
age como um ativador que estimula a piruvato quinase.
A enzima hepática também é regulada por modificação
covalente pela proteína quinase A, sendo ativa no esta�
do desfosforilado e inativa no estado fosforilado (Figura
15.28). A inibição concomitante da glicólise hepática e o
estímulo da gluconeogênese hepática por glucagon po�
dem ser explicados, em parte, por inibição da piruvato
quinase causada por ativação da proteína quinase A por
cAMP. Esse aspecto é explorado em maior profundidade
na Seção 15.5, na discussão da gluconeogênese.
A piruvato quinase, assim como a glucoquinase, é in�
duzida no fígado por ingesta rica em carboidratos e ní�
veis altos de insulina. Essa é uma razão pela qual o fíga�
do de indivíduos bem alimentados tem capacidade muito
maior de utilizar carboidratos do que o de uma pessoa
em jejum ou diabética (ver Correlação Clínica 15.4).
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 637

UM OLHAR MAIS ATENTO 15.4

6-Fosfofruto-2-quinase/Frutose-2,6-bisfosfatase e o Câncer
Tumores agressivos geralmente crescem mais rá� hipóxia da enzima bifuncional pela proteína quinase
pido do que novos vasos sanguíneos podem ser forma� ativada por AMP (AMPK) cause um aumento ainda
dos a partir dos já existentes. Isso pode resultar em maior na atividade de quinase em relação à atividade
um centro de células carentes de oxigênio no interior de fosfatase. Como consequência, o aumento no AMP
de tumores que poderiam morrer por necessidade do que ocorre em resposta a hipóxia ativa AMPK, que au�
ATP normalmente produzido por fosforilação oxidati� menta a atividade de 2�quinase da enzima bifuncional,
va. Entretanto, as células cancerosas têm uma grande que aumenta a produção de 2,6�bisfosfato, o qual ativa
capacidade de sobreviver a hipóxia, graças àà capaci�capaci�capaci� a 6�fosfofruto�1�quinase, que aumenta a taxa de gli�
dade excepcional que possuem de gerar ATP pela via cólise, que, por sua vez, gera o ATP necessário para
glicolítica. Expressão de uma forma de 6�fosfofruto�2� satisfazer as necessidades energéticas das células de
�quinase/frutose 2,6�bisfosfatase induzida por hipóxia câncer em hipóxia.
é uma das principais razões para a atividadeatividade glicolí�glicolí�
tica singular das células de câncer. Como no fígado, Kim, S.�G., Manes, N. P., El�Maghrabi, M. R., e Lee, Y. –H.
a atividade de quinase excede muito a atividade de Crystal structure of the hypoxia�inducible form of 6�phos�
fosfatase da enzima bifuncional não fosforilada em cé� phofructo�2�kinase/fructose�2,6�biphodphatase (PFKFB3):
lulas de câncer. É notável, e em completo contraste A possible new target for cancer therapy. J. �io�. C�em. 281:
com o fígado, que a fosforilação da forma induzida por 2939, 2006.

UM OLHAR MAIS ATENTO 15.5

TIGAR e Câncer

TIGAR significa glicólise induzida por TP53 (pro� por p53 reduz frutose 2,6�bisfosfato, que reduz a ativi�
teína 53 tumoral) e regulador de apoptose (TP53��n� dade de 6�fosfofruto�1�quinase, que por sua vez reduz o
���e� G�y�o�ysis �n� Apoptosis Reg���tor). Como fluxo pela via glicolítica. Como a glicólise é importante
subentendido por seu nome, a TIGAR regula a glicólise para a sobrevivência e o crescimento de células de cân�
e a apoptose e é induzida por ativação do gene TP53. cer (ver Um Olhar Mais Atento 15.4), superexpressão
O gene TP53 codifica a proteína supressora de tumor da TIGAR por p53 reduz a probabilidade de formação
p53, um fator de transcrição que regula a expressão de de tumor. A perda desse mecanismo regulatório como
várias proteínas, incluindo TIGAR, que impede o de� uma consequência de mutações no gene TP53 é comum
senvolvimento do câncer. A TIGAR é estruturalmente no câncer.
parecida com o domínio bisfosfatase da enzima bifun� Bensaad, K., Tsuruta, A., Selak, M. A., Vidal, M. N. et al.
cional 6�fosfofruto�2�quinase/frutose�2,6�bisfosfatase. TIGAR, a p53�inducible regulator of glycolysis and apoptosis.
Não tem atividade de quinase, mas possui atividade de Ce�� 126:107, 2006; e Green, D. R. e Chipuk, J. E. p53 and me�
fosfatase para frutose 2,6�bisfosfato. Indução da TIGAR tabolism: Inside the TIGAR. Ce�� 126:30,2006.

Papel da Piruvato Quinase no Câncer proteína quinase A

Célulasélulas dedede câncercâncercâncer expressamexpressamexpressam umaumauma isoformaisoformaisoforma espe�espe�espe�

cial de piruvato quinase chamada PKM2, uma varian� ATP ADP
Piruvato quinase a Piruvato quinase b
te de sp�i�ing da forma muscular da piruvato quinase Pi H2O iP
(PKM1). PKM2 é necessária para o rápido crecimento
das células tumorais. Embora PKM1 e PKM2 sejam
fosfoproteína fosfatase
muito parecidas, PKM1 não pode substituir PKM2 em
células cancerosas. O porquê de os tumores precisarem FIGURA 15.28 Glucagon age via cAMP, causando
dessa isoforma específica de piruvato quinase é uma fosforilação e inativação da piruvato quinase hepática.
área ativa de pesquisa (Um Olhar Mais Atento 15.6).
638 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.8
Deficiência de Piruvato Quinase e Anemia Hemolítica (OMIM 266200)
Eritrócitos maduros são absolutamente dependen�
tes da atividade glicolítica para produção de ATP. ATP
é necessário para as bombas de íons, especialmente a
ATPase transportadora de Na+, K+, que mantém a for�
ma de disco bicôncavo dos eritrócitos, o que os ajuda a
deslizarem pelos capilares enquanto entregam oxigênio
aos tecidos. As células incham e se rompem sem ATP.
Anemia devida à destruição excessiva de eritrócitos é
chamada anemia hemolítica. A deficiência de piruvato
quinase é rara, mas é o defeito genético mais comum
da glicólise que causa anemia hemolítica. A maioria
dos pacientes tem de 5 a 25% do nível normal de piru�
vato quinase nos eritrócitos, e o fluxo pela glicólise é
severamente restrito, resultando em concentrações de
ATP muito diminuídas. Os intermediários da glicólise
proximais à etapa da piruvato quinase acumulam�se,
enquanto as concentrações de piruvato e lactato dimi�
nuem. Os níveis de 2,3�bisfosfoglicerato estão aumen�
tados. Como resultado, a anemia é mais bem tolerada
em alguns pacientes do que seria previsível, porque
UM OLHAR MAIS ATENTO 15.6
Piruvato Quinase M2 e o Câncer
Todas as células cancerosas expressam PKM2,
uma isoforma da piruvato quinase encontrada em
embriões, mas não em tecidos adultos normais. Por
razões desconhecidas, a capacidade excepcional que
as células cancerosas têm de realizar glicólise aeró�
bica depende dessa isoforma particular de piruvato
quinase. A glicólise aeróbica por células cancerosas,
descoberta por Otto Warburg, laureado com o Prêmio
Nobel de Fisiologia e Medicina em 1931, refere�se a
uma taxa excepcionalmente alta de glicólise e super�
produção de lactato em presença de oxigênio. Célu�
las não�cancerosas extraem mais ATP por glicose e,
portanto, usam menos glicose e produzem pouco ou
nenhum lactato quando o oxigênio está presente. Isso
porque a taxa de glicólise está fortemente coordenada
com as taxas do ciclo TCA e da fosforilação oxidati�
va em células normais. Em células cancerosas, a gli�
15.5 GLUCONEOGÊNESE
Síntese de Glicose É Necessária para
Sobrevivência
Síntese líquida ou formação de glicose a partir de
substratos não�carboidratos é chamada gluconeogê�
nese. Vários aminoácidos, lactato, piruvato, propiona�
to e glicerol são fontes de carbono para a via (Figura
15.29). Glicose também pode ser produzida a partir da
a afinidade da hemoglobina por oxigênio é diminuída
pelo aumento de 2,3�bisfosfoglicerato. Níveis normais
de ATP são observados em reticulócitos dos pacientes.
Embora deficientes na piruvato quinase, esses glóbulos
vermelhos imaturos têm mitocôndrias e podem gerar
ATP por fosforilação oxidativa. A maturação dos reticu�
lócitos em eritrócitos resulta na perda das mitocôndrias
e completa dependência da glicólise para a produção de
ATP. Portanto, as células maduras são rapidamente eli�
minadas da circulação. A anemia ocorre, porque elas
não podem ser substituídas com velocidade suficiente
por eritropoiese.
Valentine, W. N. The Stratton lecture: Hemolytic anemia
and inborn errors of metabolism. ��oo� 54:549, 1979. Hirono,
A., Kanno, H., Miwa, S. e Beutler, E. Pyruvate kinase deficiency
and other enzymopathies of the erythrocyte. Em: Scriver, C.R.,
Beaudet, A.L., Sly, W.S. e Valle D. (Eds.), T�e Met�bo�i� �n�
Mo�e����r ��ses of �n�erite� Dise�se, 8. ed., New York: Mc�
Graw�Hill, 2001, p. 4637.
cólise excede a capacidade de oxidação completa da
glicose, resultando em superprodução de ácido lático,
a despeito da presença de oxigênio. Warburg propôs
que a substituição da respiração por fermentação é a
causa primária do câncer. Pesquisas subsequentes de�
monstraram que não é o caso. Câncer é causado por
mutações que ativam protooncogenes e inibem genes
supressores de tumor. Contudo, expressão alterada de
genes que codificam PDKM2 e outras enzimas que au�
mentam a capacidade de glicólise fornece às células
cancerosas vantagens de sobrevivência e crescimento
sobre as células não�cancerosas.
Christofk, H. R., Vander Heiden, M. G., Harris, M. H., Ra�
manathan, A., et al. The M2 splice isoform of pyruvate kinase
is important for cancer metabolism and tumor growth. N�t��
re 452: 230, 2008.
frutose. Glicogenólise, isto é, formação de glicose ou
glicose 6�fosfato a partir de glicogênio, deve ser dife�
renciada da gluconeogênese. Glicogenólise refere�se à
quebra de glicogênio em glicose e, portanto, não cor�
responde à síntese �e no�o de glicose. Gluconeogêne�
se é essencial para a sobrevivência humana e de outros
animais, uma vez que os níveis de glicose no sangue
devem ser mantidos para suportar o metabolismo dos
tecidos que usam glicose como seu substrato primário
(Correlação Clínica 15.9). Estes incluem cérebro, eri�
trócitos, medula renal, cristalino, córnea e testículos.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
A gluconeogênese permite a manutenção dos níveis
sanguíneos de glicose muito tempo depois de toda a
glicose da dieta ter sido absorvida e completamente
oxidada e da glicose armazenada como glicogênio ter
sido consumida.
(2) Lactato (2) Piruvato Aminoácidos
Aminoácidos (2) Oxaloacetato (2) Propionato
(2) Glicerol (2) Trioses fosfato Frutose
Glicose
FIGURA 15.29Vias resumidas da gluconeogênese,
ilustrando os principais substratos precursores para o
processo.
Ciclos de Cori e da Alanina
A gluconeogênese está envolvida em dois ciclos que
são críticos para a manutenção dos níveis sanguíneos
de glicose. O ciclo de Cori (ou ciclo glicose�lactato) e
o ciclo da alanina (ou ciclo glicose�alanina) (Figura
15.30) dependem da gluconeogênese no fígado, seguida
por liberação de glicose e seu uso em um tecido peri�
férico. Ambos os ciclos fornecem um suprimento con�
tínuo de glicose a tecidos que necessitam dela como
sua fonte primária de energia. Para participar desses
ciclos, os tecidos periféricos devem liberar alanina ou
lactato como produtos finais do metabolismo de glicose.
Uma importante diferença entre os ciclos é que o NADH
gerado pela glicólise no ciclo da alanina não é usado
para reduzir o piruvato a lactato; se o fizesse, o piruva�
to não estaria disponível para a conversão em alanina
por transaminação com glutamato. Em tecidos que têm
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.9
Hipoglicemia e Bebês Prematuros
Os recém�nascidos prematuros e pequenos para a
idade gestacional são mais susceptíveis à hipoglicemia
do que crianças nascidas a termo, com o tamanho cer�
to para a idade. As crianças em geral são também mais
susceptíveis do que adultos, simplesmente porque têm
maiores razões peso do cérebro/corpo e o cérebro uti�
liza quantidades desproporcionalmente maiores de
glicose do que o resto do corpo. Os bebês recém�nas�
cidos têm uma capacidade limitada de cetogênese,
aparentemente porque o transporte de ácidos graxos
de cadeia longa para dentro de suas mitocôndrias he�
páticas é pouco desenvolvido. Como o uso de corpos
cetônicos pelo cérebro é diretamente proporcional à
concentração de corpos cetônicos circulantes, o neo�
nato é incapaz de economizar glicose em quantidade
significativa, usando corpos cetônicos. Assim, o cére�
bro do neonato depende quase que exclusivamente da
glicose proveniente da glicogenólise hepática
ática e da glu�
coneogênese.
• 639
mitocôndrias, os equivalentes de redução do NADH são
transportados para dentro das mitocôndrias pela lan�
çadeira malato–aspartato ou pela lançadeira glicerol–
fosfato para síntese de ATP por fosforilação oxidativa.
H+NAD+
NADH + → + 0,5+O2,5ATP
2 + 2,5 ADP
+ H2O+ 2,5 Pi →
ou
FADH2→
+ FAD
0,5 O+2 1,5
+ 1,5
ATP
ADP
+H Pi →
+21,5
O
A consequência é que cinco a sete moléculas de ATP
podem ser formadas por molécula de glicose em tecidos
periféricos que participam do ciclo da alanina. No ciclo
de Cori (Figura 15.30�), só duas moléculas de ATP por
molécula de glicose são produzidas.
→ATP
6 6 (ADP
fígado++P2i)(ADP
fígado +
+2PIATP
)eritrócitos →
eritrócitos
Seis moléculas de ATP são necessárias, no fígado,
para a síntese de glicose. O ciclo da alanina (Figu�
ra 15.30b) transfere energia do fígado para os tecidos
periféricos e, graças às cinco a sete moléculas de ATP
produzidas por molécula de glicose, é energeticamente
mais eficiente. Contudo, o ciclo da alanina entrega ao
fígado nitrogênio do grupo amino, que deve ser elimina�
do como ureia (p. 778). Isso requer quatro moléculas de
ATP para cada molécula de ureia produzida, e aumenta
a quantidade de ATP necessária para 10 moléculas por
molécula de glicose durante o ciclo da alanina.
10 ATP
→fígado +5 – +
10 (ADP 7 Pi)fígado
(ADP + + Pi)5músculo
– 7 ATP+O 2 músculo →
músculo
Isto e a necessidade de oxigênio e mitocôndrias nos
tecidos periféricos distinguem o ciclo da alanina do ci�
clo de Cori.
A capacidade hepática de síntese de glicose a partir
de lactato e alanina é também limitada em bebês recém�
�nascidos, uma vez que a enzima limitante da velocida�
de, fosfoenolpiruvato carboxiquinase, está presente em
quantidades muito baixas durante as primeiras poucas
horas após o nascimento. Sua indução até o nível neces�
sário para evitar hipoglicemia durante o estresse do je�
jum leva várias horas. Crianças prematuras e pequenas
para a idade gestacional também têm menores reservas
de glicogênio hepático. O jejum depleta suas reservas
de glicogênio mais rapidamente, tornando�as mais de�
pendentes de gluconeogênese do que crianças normais.
Newsholme, E. A. e Leech, A. R. �io��emistry for t�e Me�
�i��� ��ien�es, New York: Wiley, 1983. Duvanel, C. B., Fawer,
C. �L., Cotting, J., Hohlfeld, P., e Matthieu, J. M. Long�term
effects of neonatalhypoglycemia on brain growth and psycho�
motor development in small�for�gestacional�age preterm in�
fants. J. Pe�i�tr. 134:492, 1999.
640 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

plamento das reações catalisadas pela

Glicose piruvato carboxilase, que requer ATP,
Glicose
e PEP carboxiquinase, que requer GTP
6ATP Glicose (Figura 15.32). GTP é equivalente a um
gluconeogênese ATP pela ação da nucleosídeo difosfato
glicólise
quinase (GDP + ATP → GTP + ADP).
e oCO
O HCO
2 gerado
3– requerido
pela PEP
pela
carboxiquinase
2 Lactato Sangue
2ATP piruvato car�
2 Lactato
boxilase são ligados pela reação cata�
(a) Fígado
Fígado Eritrócitos H2O « H
lisada pela 3 «H+ + HCO
2COanidrase carbônica
3–). Somando
(CO2 +
2 Alanina Sangue
2Ureia
Lactatorins 2 Alanina Glicose

essas reações com as reações da Figura

15.32, temos
gluconeogênese Glicose

Piruvato– + 2ATP4– →
6ATP ureogênese
Ureia
4ATP 2NADH
→ fosfoenolpiruvato3– + 2ADP3– +
2–
2 Piruvato
Glicose
+ Pi + 2 H+
2iNH2
Portanto, a conversão de piruvato
2 Alanina 2NAD+ 3i5 em PEP durante a gluconeogênese cus�
ATP
glicólise O2
ta à célula duas moléculas de ATP. Isso
contrasta com a conversão de PEP em
2ATP
2 Piruvato piruvato durante a glicólise, que gera
apenas uma molécula de ATP.
2iNH2

A localização mitocondrial da pi�

ruvato carboxilase e a necessidade de
Célula muscular
ATP tornam a mitocôndria obrigatória
para a conversão de piruvato citosólico
em PEP citosólico (ver Figura 15.31).
(b)
Entretanto, como a PEP carboxiquina�
FIGURA 15.30 Relação entre gluconeogênese no fígado e glicólise no resto se está presente em ambos os compar�
do corpo. timentos, citosol e matriz mitocondrial,
(a) Ciclo de Cori. (b) Ciclo da alanina. existem duas rotas que o oxaloacetato
usa para chegar à glicose. A primeira
usa a PEP carboxiquinase mitocondrial, que converte
Síntese de Glicose a Partir de oxaloacetato em PEP que, depois, atravessa a membra�
Lactato na mitocondrial interna. A segunda converte oxaloa�
cetato em aspartato, que sai da mitocôndria por meio
Gluconeogênese a partir de lactato é um processo do antiporteglutamato�aspartato. O aspartato doa seu
que requer ATP. grupo amino para a�cetoglutarato no citosol, produzin�
do oxaloacetato, que é usado pela PEP carboxiquinase
2 L�Lactato– + 6 ATP4– + 6 H2O →
citosólica para produzir PEP.
→ glicose + 6 ADP3– + 6 Pi2– + 4H+

Muitas das enzimas da glicólise são usadas na glu�
coneogênese a partir de lactato. Entretanto, reações di�
ferentes são necessárias ao processo porque a glicólise
produz dois ATPs, enquanto a gluconeogênese requer
seis ATPs por molécula de glicose, e três etapas da gli�
cólise são irreversíveis, a saber, as reações catalisadas
por glucoquinase, 6�fosfofruto�1�quinase e piruvato
quinase.
A etapa inicial da lactato gluconeogênese é a con�
versão de lactato em piruvato pela lactato desidroge�
nase (Figura 15.31). O NADH gerado é necessário para
uma etapa subsequente da via. O piruvato não pode ser
convertido em fosfoenolpiruvato (PEP) pela piruvato
quinase porque a reação é irreversível nas condições in�
tracelulares. O piruvato é convertido em PEP pelo aco�
Gluconeogênese Usa Muitas Enzimas
Glicolíticas na Direção Inversa
As enzimas da glicólise operam na direção inversa
para converter PEP em frutose 1,6�bisfosfato durante
a gluconeogênese. A geração de equivalentes de redu�
ção (NADH) pela lactato desidrogenase é equilibrada
pelo uso de equivalentes de redução pela gliceraldeí�
do�3�fosfato desidrogenase. A 6�Fosfofruto�1�quinase
catalisa uma reação irreversível e não pode converter
FBP em frutose 6�fosfato. Um modo de contornar isso
é fornecido pela frutose 1,6�bisfosfatase, que hidrolisa a
frutose 1,6�bisfosfato a F6P (Figura 15.33).
A fosfoglicose isomerase é completamente reversível
e funciona na glicólise e na gluconeogênese. A glicose
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 641

12Glicose

12Pi

12 Glicose 6fosfato

12 Frutose 6fosfato

12Pi

12 Frutose 1,6bisfosfato

Gliceraldeído 3fosfato DHAP Lactato

Pi NAD+

NADH + H+

Piruvato
1,3Bisfosfoglicerato
ADP

ATP
3Fosfoglicerato Citosol Mitosol

αKG αKG Piruvato

CO2 ATP
2Fosfoglicerato Glut Glut ADP + Pi

OAA Asp Asp OAA

CO2 GTP ADP
GTP ADP
CO2 GDP ATP
GDP ATP
PEP PEP

FIGURA 15.31 Via da gluconeogênese a partir de lactato.

atas
OPEP
envolvimento
tracejadas
carboxiquinase
referem�se
da mitocôndria
mitocondrial
a umano
rota
processo
emalternativa,
lugar da
é indicado.
isoenzima
que emprega
Ascito�
se� sólica. Abreviaturas: OAA, oxaloacetato; α�KG, α�cetoglutarato;
PEP, fosfoenolpiruvato; e DHAP, di�hidroxiacetona fosfato.

gluconeogênese
glicose
se
6�fosfatase
6�fosfatase é uma
parasubstitui
liberação
(Figura na15.34),
aproteína
glucoquinase
corrente nada
integral
sendo
sanguínea.ínea.
sua
última
membrana
funçãoetapa da
AAA glico�glico�glico�
gerar do Glicose É Sintetizada a Partir da
Maioria dos Aminoácidos
Todos os aminoácidos, exceto leucina e lisina, po�
retículo endoplasmático, com seu sítio ativo disponível
para hidrólise de G6P na superfície luminal (Figura dem fornecer carbono para a síntese de glicose por gluco�
neogênese (p. 638). Se o catabolismo de um aminoácido
15.35). Um transportador move G6P através da mem�
produzir piruvato ou oxaloacetato, síntese de glicose
brana do retículo endoplasmático. Um defeito genético
pode ocorrer a partir desse aminoácido. Oxaloacetato é
no transportador ou na fosfatase interfere com a gluco� um intermediário da gluconeogênese, e piruvato é facil�
neogênese e resulta em acúmulo de glicogênio no fíga�
mente convertido em oxaloacetato pela piruvato carbo�
do, como discutido mais adianta para o metabolismo de
xilase (ver Figura 15.31). O catabolismo de aminoácidos
glicogênio.
fornece carbonos para o ciclo TCA em vários pontos.
Enquanto ocorrer a síntese de intermediários do ciclo
TCA, a síntese de oxaloacetato continuará. Reações que
levam à síntese de intermediários do ciclo TCA são cha�
madas reações anapleróticas (anaplerose), e sustentam
642 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

a gluconeogênese porque permitem que ocorra sínte�

se de oxaloacetato. Reações catalisadas pela piruvato 2iCH2OPO3 CH2OH
carboxilase e pela glutamato desidrogenase são bons O O
exemplos de reações anapleróticas. + H2O + HPO42i

COOi COOi α'*OLFRVH α'*OLFRVH

IRVIDWR
CO + ATP4i + HCO3i CO + ADP3i + Pi2i + H+

FIGURA 15.34 Reação catalisada pela glicose 6-fosfatase.

CO
CH2
COOi
CH3 CH2
COOi Piruvato– + ATP4– + HCO3– →
Piruvato + GTP4i Oxaloacetato → oxaloacetato2– + ADP3– + Pi2– + H+
COOi Glutamato– + NAD(P)+ →
COPO32i + GDP3i + CO2 → a�cetoglutarato2– + NAD(P)H + NH4+ + H+

CH2 Por outro lado, a reação catalisada pela glutamato�

�oxaloacetato aminotransferase (a�cetoglutarato + as�
partato → glutamato + oxaloacetato) não é anapleróti�
Oxaloacetato Fosfoenolpiruvato
ca porque não realiza síntese de intermediários do ciclo
FIGURA 15.32 Etapas que requerem energia envolvidas TCA; isto é, a geração de oxaloacetato a partir de as�
na formação de fosfoenolpiruvato a partir de piruvato. partato é equilibrada pela conversão de a�cetoglutarato
As reações são catalisadas por piruvato carboxilase e PEP car� em glutamato.
boxiquinase, respectivamente.
Como a gluconeogênese a partir de aminoácidos
impõe uma carga de nitrogênio sobre o fígado, existe
CH2OPO3
CH2 2i CH2OH uma relação estreita entre síntese de ureia e síntese de
glicose a partir de aminoácidos. Na Figura 15.36, são
CO
HOCH
HCOH
)UXWRVH CO
CH2
metabolizadas duas moléculas de alanina, uma gerando
HOCH NH4+ e a outra aspartato, os substratos primários para o
+ H2O HCOH + HPO42i ciclo da ureia. O aspartato sai da mitocôndria e torna�se
parte do ciclo da ureia depois de reagir com citrulina.
O carbono do aspartato é liberado como fumarato, que
OPO32i OPO32i
é convertido em malato pela fumarase citosólica. Esse
)UXWRVH malato e outro malato da mitocôndria são convertidos
ELVIRVIDWR IRVIDWR em glicose por enzimas citosólicas da gluconeogênese.
Um equilíbrio é atingido entre equivalentes de redução
FIGURA 15.33 Reação catalisada pela frutose
(NADH) gerados e os necessários no citosol e na matriz
1,6-bisfosfatase.
mitocondrial. A soma das reaçõesões apresentadasapresentadas nana Fi�Fi�
gura 15.36 dá simplesmente

2 Alaninas + 10 ATP + CO2 →

→ Glicose + ureia + 10 ADP + 10 Pi
Glicose 6–P
Leucina e lisina são os únicos aminoáci�
dos que não podem funcionar como fontes
de carbono para síntese de glicose. Eles são
cetogênicos, mas não glucogênicos. Todos
os outros aminoácidos são glucogênicos
Glicose 6–P ou ambos, glucogênicos e cetogênicos (Ta�
glicose 6–fosfatase

FIGURA 15.35 Glicose 6-fosfato é

Lúmen do hidrolisada pela glicose 6-fosfatase
Glicose Pi
retículo
endoplasmático
localizada na superfície luminal do retículo
endoplasmático.
Três transportadores estão envolvidos: um trans�
Citosol porta glicose 6�fosfato para o lúmen, um segundo
transporta Pi de volta para o citosol, e um tercei�
Glicose Pi
ro transporta glicose de volta para o citosol.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 643

bela 15.1). Os aminoácidos glucogênicos dão origem Assim, não ocorre síntese de um intermediário do ci�
à síntesesíntese dede piruvatopiruvato ouou oxaloacetato,oxaloacetato, enquantoenquanto ami�ami� clo TCA durante a oxidação completa de acetil�CoA pelo
noácidos que são, ambos, glucogênicos e cetogênicos, ciclo TCA. É, portanto, impossível, para animais, a reali�
também geram o corpo cetônico acetoacetato, ou ace� zação de síntetize de glicose a partir de acetil�CoA.
til�CoA que é facilmente convertido em acetoacetato.
Acetil�CoA é o produto final do metabolismo de lisina,
e acetoacetato e acetil�CoA são produtos finais do me� Glicose Pode Ser Sintetizada a partir
tabolismo de leucina. Não existe nenhuma via que seja
capaz de converter acetoacetato ou acetil�CoA em pi�
de Ácidos Graxos com Número
ruvato ou oxaloacetato. Acetil�CoA não pode ser usado Ímpar, mas Não com Número Par de
para síntese de glicose porque a reação do complexo
piruvato desidrogenase é irreversível. Carbonos
Piruvato + NAD+ + CoASH → A maior parte dos ácidos graxos encontrados no ho�
→ acetil�CoA + NADH + CO2. mem tem cadeias lineares, com número par de átomos
de carbono. Seu catabolismo por oxidação de ácidos
TABELA 15.1 Aminoácidos Glucogênicos e Cetogênicos graxos, seguida de cetogênese ou oxidação completa
Glucogênicos Cetogênicos Ambos a CO2, é resumida na Figura 15.37. Como acetil�CoA e
outros intermediários da oxidação de ácidos graxos de
Glicina Leucina Treonina número par não podem ser convertidos em oxaloaceta�
to ou qualquer outro intermediário da gluconeogênese,
Serina Lisina Isoleucina é impossível sintetizar glicose a partir de ácidos graxos.
Valina Fenilalanina Uma exceção a essa regra aplica�se aos ácidos graxos
ramificados com grupamentos metil (por exemplo, áci�
Histidina Tirosina do fitânico, um produto de quebra da clorofila; ver dis�
Arginina Triptofano cussão da doença de Refsum, Correlação Clínica 17.6, p.
701), e aos ácidos graxos com número ímpar de átomos
Cisteína de carbono. O catabolismo desses ácidos graxos gera
propionil�CoA.
Prolina
Ácido graxo com número ímpar (n) de átomos de
Hidroxiprolina
carbono → (n – 3)/2 acetil�CoA + 1 propionil�CoA
Alanina
Propionil�CoA é um bom precursor da gluconeogê�
Glutamato nese, uma vez que gera oxaloacetato (Figura 15.38) por
uma via anaplerótica (ver Figura 19.53, p.. 802).802).802). Pro�Pro�Pro�
Glutamina pionil�CoA é também produzido durante o catabolismo
Aspartato de valina e isoleucina (ver Figura 19.50, p. 800), e na
conversão de colesterol em ácidos biliares (ver Figura
Asparagina 18.42, p. 748).
Metionina Às vezes afirma�se, sem muita precisão, que gor���
r� não po�e ser �on�erti�� em ��rboi�r�to (g�i�ose)
Poderia�se argumentar que oxaloacetato é gerado a pe�os �nim�is. Isso certamente é verdade para ácidos
partir de acetil�CoA pelo ciclo TCA, por meio dessa sé� graxos com número par de átomos de carbono. Contu�
rie de reações. do, o termo gor��r� geralmente se refere aos triacilgli�
Acetil�CoA → citrato → 2 CO2 + oxaloacetato cerois, que são compostos por três grupos O�acil com�
binados com uma molécula de glicerol. Hidrólise de um
Contudo, isso não considera o oxaloacetato neces� triacilglicerol gera três ácidos graxos e glicerol, sendo o
sário para a formação de citrato, a partir de acetil�CoA. último composto um excelente substrato para a gluco�
neogênese (Figura 15.39).
Acetil�CoA + oxaloacetato → citrato + CoA
Fosforilação do glicerol pela glicerol quinase pro�
Descarboxilação de citrato pelo ciclo TCA regenera duz glicerol 3�fosfato, que é convertido pela glicerol
oxaloacetato. 3�fosfato desidrogenase em di�hidroxiacetona fosfato,
um intermediário da via gluconeogênica (ver Figura
Citrato →→ 2 CO2 + oxaloacetato
15.31, p. 641). Dependendo do estado nutricional, o
Somando essas reações, obtém�se a reação para último estágio da glicólise pode competir com a via
uma volta do ciclo TCA. gluconeogênica e converter di�hidroxiacetona fosfato
em lactato (ou em piruvato, para subsequente oxida�
Acetil�CoA → 2 CO2 + CoA ção completa a CO2 e H2O).
644 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Glicose

Alanina
(2) Gliceraldeído 3-fosfato Glu α-KG

Pi (2) NAD+
(2) NADH Piruvato Citosol

(2) 1,3-Bisfosfoglicerato

Espaço
(2) OAA (2) NAD+ Piruvato
NAD+ da
CO2 matriz

(2) NADH OAA

OAA NADH Glu
α-KG

(2) Malato Malato NH4+

Ureia Orn
Citrulina Orn
Citrulina

Asp Piruvato
Asp
α-KG
FIGURA
relação
Abreviaturas:
com
15.36aOAA,
Via
síntese
da
oxaloacetato;
gluconeogênese
de ureia. Asp, aspartato;
a partir de
Orn,
alanina
ornitina;
e sua
Glu, Glu
Glu

CO2

Piruvato

α-KG

glutamato; a�KG, α�cetoglutarato. Alanina

Glicose É Também Sintetizada a ou, alternativamente, em piruvato ou lactato, pelo últi�

Partir de Frutose
Os seres humanos consomem quantidades consi�
deráveis de frutose na forma de sacarose, que resulta
em glicose e frutose após hidrólise pela sacarase no
intestino (p. 1076), e como resultado do uso ampla�
mente difundido de xarope de milho, rico em frutose,
como adoçante pela indústria alimentícia. No fígado, a
frutose é fosforilada pela frutoquinase (Figura 15.40),
que gera frutose 1�fosfato, e não frutose 6�fosfato (ver
Correlação Clínica 15.3). A mesma aldolase que quebra
frutose 1,6�bisfosfato, depois quebra frutose 1�fosfato,
formando di�hidroxiacetona fosfato e gliceraldeído. O
último tem vários destinos possíveis. Pode ser oxidado
por uma aldeído desidrogenase, reduzido por uma álcool
desidrogenase, ou fosforilado por uma quinase. A via
favorecida é a conversão em gliceraldeído 3�fosfato pela
triose quinase. Duas moléculas de di�hidroxiacetona
fosfato, obtidas de uma molécula de frutose, podem ser
convertidas em glicose por enzimas da gluconeogênese
mo estágio da glicólise. Em analogia à glicólise, a con�
versão de frutose em lactato é chamada frutólise.
A principal fonte de energia dos espermatozoides é
a frutose, formada a partir de glicose por células das
vesículas seminais, como mostra a Figura 15.41. A redu�
ção NADPH�dependente de glicose a sorbitol é seguida
por uma oxidação NAD+�dependente de sorbitol a fru�
tose. A frutose é secretada pelas vesículas seminais em
um fluido que se torna parte do sêmen. Embora a con�
Ácido graxo com número par
(n) de átomos de carbono
FOX
n2
acetilCoA
n4 corpos cetônicos n CO2
FIGURA 15.37 Visão geral do catabolismo de ácidos
graxos a corpos cetônicos e CO2.
Abreviatura: FOX, oxidação de ácidos graxos.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 645

centração de frutose no sêmen humano possa exceder Frutose

10 mM, os tecidos que entram em contato com o sêmen ATP

utilizam pouca frutose, permitindo que esse substrato frutoquinase ADP

seja reservado para atender à demanda energética dos

espermatozoides em sua procura pelo óvulo. Os esper� Frutose 1-fosfato
matozoides contêm mitocôndrias e, portanto, podem
metabolizar frutose completamente a CO2 e H2O, pela aldolase B
Gliceraldeído
combinação de frutólise e atividade do ciclo TCA.
ATP
triose quinase
ADP
Ácido fitânico
Ácidos graxos de cadeia ímpar (2) Di-hidroxyacetona fosfato Gliceraldeído 3-fosfato
Valina
Isoleucina
Colesterol
Glicose (2) Lactato

FIGURA 15.40 Via da formação de glicose a partir de

frutose e via da frutólise, competidora.
O As setas grandes indicam etapas da glicólise e da gluconeogê�
nese dadas nas Figuras 15.6, p. 617, e 15.31, p. 641, respecti�
CSCoA
vamente.
CH2

CH3
CH2OH
Propionil CoA
HCOH

HOCH

Oxaloacetato DGlicose+NADPH+H+ HCOH+NADP+

HCOH

CH2OH
½ Glicose
'6RUELWRO
FIGURA 15.38 Via da gluconeogênese a partir de
propionil-CoA.
A seta grossa refere�se às etapas do ciclo TCA mais etapas da DSorbitol + NAD+ Dfrutose + NADH + H+
gluconeogênese.
FIGURA 15.41 Via responsável pela formação de sorbitol
e frutose a partir de glicose.
Glicerol

glicerol ATP Gluconeogênese Requer Gasto de

quinase ADP
ATP
A síntese de glicose é custosa em termos de ATP.
Glicerol 3-fosfato Fat Seis moléculas são necessárias para a síntese de uma
molécula de glicose a partir de lactato, 10 para síntese
glicerol
NAD+ de glicose a partir de alanina. ATP para a síntese de gli�
3-fosfato NADH + H+ cose é fornecido, em grande parte, pela oxidação de áci�
desidrogenase
dos graxos. Condições metabólicas nas quais o fígado
é exigido para sintetizar glicose geralmente favorecem
Di-hidroxiacetona fosfato disponibilidade aumentada de ácidos graxos no sangue.
Esses ácidos graxos são oxidados pelas mitocôndrias
hepáticas a corpos cetônicos, com produção concomi�
12 Glicose Lactato
tante de grandes quantidades de ATP.
FIGURA 15.39 Via da gluconeogênese a partir de glicerol, Palmitato + 7 O2 + 26 ADP + 26 Pi →
juntamente com vias competitivas.
→ 4 Acetoacetato + 26 ATP
As setas grandes indicam etapas da glicólise e gluconeogênese,
dadas em detalhes nas Figuras 15.5, p. 615, e 15.31, p. 641, res�
pectivamente. A seta grande apontando para a gordura indica
síntese de triacilglicerois e glicerofosfolipídeos.
646 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Gluconeogênese Tem Vários Pontos é um efetor alostérico positivo da piruvato carboxilase

que, juntamente com a inibição do complexo piruvato
de Regulação desidrogenase, encaminha o carbono do piruvato para
oxaloacetato, para síntese de glicose. O aumento no oxa�
A regulação da gluconeogênese ocorre em múlti�
loacetato, devido ao aumento na atividade de piruvato
plos pontos (Figura 15.42). As enzimas que são usadas
carboxilase, juntamente com o aumento de acetil�CoA a
para contornar as etapas irreversíveis da glicólise es�
partir da oxidação de ácidos graxos, também promove
tão primariamente envolvidas na regulação da via, isto
maior síntese de citrato, um efetor alostérico negativo da
é, piruvato carboxilase, PEP carboxiquinase, frutose
6�fosfofruto�1�quinase. Inibição da 6�fosfofruto�1�quina�
1,6�bisfosfatase e glicose 6�fosfatase. A regulação da
se diminui a concentração de frutose 1,6�bisfosfato, um
gluconeogênese hepática é muito semelhante à regula�
ção da glicólise hepática. A inibição da glicólise em seus ativador da piruvato quinase. Isso reduz o fluxo de PEP
para piruvato pela piruvato quinase e, assim, aumenta
principais pontos regulatórios ou repressão da síntese
a eficácia do acoplamento da piruvato carboxilase com
de enzimas que contornam esses pontos (glucoquina�
a PEP carboxiquinase para a conversão de piruvato em
se, 6�fosfofruto�1�quinase e piruvato quinase) aumen�
PEP. Um aumento nos níveis de ATP, com o consequente
ta muito a efetividade das enzimas gluconeogênicas.
decréscimo nos níveis de AMP, favorece a gluconeogêne�
Ativação da gluconeogênese é, portanto, realizada, em
se por inibição da 6�fosfofruto�1�quinase e da piruvato
grande parte, por inibição da glicólise.
quinase, e ativação da frutose 1,6�bisfosfatase (ver Figu�
ra 15.42). Por outro lado, a falta de oxigênio, a falta de
A oxidação de ácidos graxos invariavelmente ocorre
junto com a gluconeogênese. Promove a síntese de glico� ácidos graxos para oxidação, ou uma inibição ou desa�
se, em parte por suprir o ATP necessário e por aumentar coplamento da fosforilação oxidativa levaria o fígado a
as concentrações de estado estacionário de acetil�CoA passar de gluconeogênese para glicólise.
mitocondrial e NADH. Esses dois produtos da oxidação
de ácidos graxos são potentes ativadores da piruvato
desidrogenase quinase, que fosforila e inativa o comple�
Controle Hormonal da
xo piruvato desidrogenase. Isso impede que o piruva� Gluconeogênese É Crítico para a
to seja convertido em acetil�CoA, economizando assim
piruvato para a síntese de glicose. Acetil�CoA também Homeostase
(2) Lactato O controle hormonal da gluconeogê�
nese trata da regulação do suprimento
de ácidos graxos para o fígado, bem como
das atividades das enzimas da glicólise
(2)Piruvato
e da gluconeogênese. As catecolaminas
(2) ATP  acetil CoA aumentam os ácidos graxos plasmáticos
(2) CO2 por promoverem lipólise do tecido adi�
ATP ² (2) ATP (2) ADP + (2) Pi poso, uma ação oposta à da insulina. A
alanina ² maior disponibilidade de ácidos graxos
(2) ADP (2) Oxaloacetato
citrato
ATP
AMP
Frutose 1,6
bisfosfato
2,6 ²
 ATP
ADP (2) GTP (2)
Pi GDP + (2) CO2 AMP
Frutose
bisfosfato
2,6 resulta em maior oxidação de ácidos gra�
bisfosfato xos pelo fígado, o que promove síntese de
glicose. A insulina produz o efeito oposto
(2) Fosfoenolpiruvato por inibir a lipólise do tecido adiposo. O
glucagon e a insulina também regulam a
gluconeogênese diretamente no fígado,
Frutose 1,6bisfosfato por influenciarem o estado de fosforilação
² das enzimas hepáticas que estão sujeitas
² ATP ² a modificação covalente. Como descrito
ADP anteriormente (ver Figura 15.28, p. 637),
a piruvato quinase é ativa quando des�
Frutose 6fosfato fosforilada e inativa quando fosforilada.
O glucagon ativa a adenilato ciclase para
produzir cAMP, que ativa a proteína qui�
Glicose 6fosfato nase A, a qual fosforila e inativa a piru�
vato quinase. A inativação dessa enzima
Frutose ² Pi glicolítica estimula a gluconeogênese por
6fosfato bloquear a conversão fútil de PEP em pi�
Glicose ruvato. O glucagon também estimula a
gluconeogênese por diminuir a concen�
FIGURA 15.42 Características importantes de regulação alostérica da
gluconeogênese. tração de frutose 2,6�bisfosfato, um ati�
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
vador alostérico da 6�fosfofruto�1�quinase e um inibidor
alostérico da frutose 1,6�bisfosfatase. O glucagon, por
meio do seu segundo mensageiro cAMP, reduz a fruto�
se 2,6�bisfosfato por estimular a fosforilação da enzima
bifuncional 6�fosfofruto�2�quinase/frutose 2,6�bisfosfa�
tase, que inativa a atividade de quinase, mas ativa a ativi�
dade de fosfatase. A queda induzida por glucagon dos ní�
veis de frutose 2,6�bisfosfato leva à redução na atividade
da 6�fosfofruto�1�quinase, enquanto a frutose 1,6�bisfos�
fatase fica mais ativa (Figura 15.42). O efeito final é con�
versão aumentada de FBP em F6P e um aumento cor�
respondente na taxa de gluconeogênese. Um aumento na
frutose 6�fosfato também favorece a gluconeogênese por
inibir a glucoquinase, via sua proteína inibitória. Os efei�
tos da insulina são opostos aos do glucagon, por ativa�
ção por sinalização da cAMP fosfodiesterase, inibição da
proteína quinase A, e ativação da fosfoproteína fosfatase.
Glucagon
Receptor Adenilato
de glucagon ciclase
+
+ ves (p. 928; Figura 22.21). Quando a síntese de glicose
Gs
cAMP
Citosol +
Proteína quinase A
Núcleo
CREBP CREB
+ PEPCK
CRE
FIGURA 15.43 Glucagon promove a transcrição do gene
da PEP carboxiquinase.
Abreviaturas: PEPCK, PEP carboxiquinase; CRE, elemento de
resposta a cAMP; CREB, proteína que se liga ao elemento de res�
posta a cAMP.
O glucagon e a insulina também têm efeitos de lon�
go prazo sobre a glicólise e a gluconeogênese hepáticas
por indução e repressão de enzimas chaves de ambas
as vias. Uma razão glucagon/insulina alta no sangue
aumenta a capacidade de gluconeogênese e reduz a de
• 647
glicólise no fígado. Uma razão glucagon/insulina baixa
tem os efeitos opostos. A razão glucagon/insulina au�
menta quando gluconeogênese é necessária, e diminui
quando a glicose é abundante no trato gastrointestinal.
O glucagon sinaliza a indução de grandes quantidades
de PEP carboxiquinase, frutose 1,6�bisfosfatase, glico�
se 6�fosfatase e várias aminotransferases. Um modelo
de como isso ocorre é apresentado na Figura 15.43. Li�
gação de glucagon ao seu receptor da membrana plas�
mática aumenta cAMP, que ativa a proteína quinase A.
Proteína quinase A, então, fosforila uma proteína cha�
mada proteína ligante ao elemento de resposta a cAMP
(CREB, �AMP�response e�ement bin�ing protein),
um fator de transcrição que, quando fosforilado, liga�se
a um elemento de resposta a cAMP (CRE, �AMP�res�
ponse e�ement), um elemento de ação �is dentro da
região regulatória dos genes responsivos a cAMP. CREB
fosforilada promove a transcrição de genes de enzimas
gluconeogênicas chaves, como PEP carboxiquinase. Por
repressão da transcrição gênica, o glucagon reduz as
quantidades de glucoquinase, 6�fosfofruto�1�quinase, e
piruvato quinase. A insulina tem ação oposta à do glu�
cagon por meio de uma cascata de sinalização mediada
por quinases que culmina na inativação de um fator de
transcrição para genes de enzimas glucogênicas cha�
não é necessária, a síntese das enzimas gluconeogêni�
cas chaves diminui, e a síntese das enzimas glicolíticas
chaves aumenta em decorrência de uma queda na razão
glucagon/insulina do sangue.
Oxidação de Álcool Inibe
Gluconeogênese
A oxidação de álcool (etanol) pelo fígado produz
uma grande carga de equivalentes de redução na forma
de NADH que precisam ser transportados para dentro
das mitocôndrias pela lançadeira malato–aspartato. O
excesso de NADH no citosol interfere com a gluconeo�
gênese (Correlação Clínica 15.10) porque força o equilí�
brio das reações catalisadas pela lactato desidrogenase
e pela malato desidrogenase na direção da formação de
lactato e malato, respectivamente:
CH3CH2OH + NAD+ CH3CH + NADH + H+
Etanol Acetaldeído
piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
Soma: etanol + piruvato acetaldeído + lactato
ou
oxaloacetato + NADH + H+ malato + NAD+
Soma: etanol + oxaloacetato acetaldeído + malato
Isso inibe a gluconeogênese por limitar a disponibili�
dade de piruvato e oxaloacetato para as reações catali�
sadas pela piruvato carboxilase e PEP carboxiquinase,
respectivamente.
648 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.10

Hipoglicemia e Intoxicação Alcoólica

O consumo de álcool, especialmente por uma pes�
soa subnutrida, pode causar hipoglicemia. O mesmo
efeito pode resultar do consumo de álcool após exer�
cício extenuante. Em ambos os casos, a hipoglicemia
resulta dos efeitos inibitórios do álcool sobre a gluco�
neogênese hepática, e ocorre em circunstâncias de de�
pleção de glicogênio hepático. O fígado simplesmen�
te é incapaz de lidar com os equivalentes de redução
formados pela oxidação do etanol, em velocidade su�
ficientemente grande para evitar desvios metabólicos.
Os equivalentes de redução extras bloqueiam a con�
versão de lactato em glicose e promovem a conversão
de alanina em lactato, com considerável acúmulo de
lactato no sangue, e acidose láctica (ver Correlação
Clínica 15.5) pode se desenvolver, embora seja geral�
mente leve.
Baixas doses de álcool causam perda de desempe�
nho motor e intelectual; altas doses são depressivas, e
podem levar a estupor e anestesia. Baixa glicemia pode
contribuir para esses efeitos indesejáveis do álcool.
Mais ainda, pode�se pensar que um paciente está em�
briagado quando, de fato, ela ou ele está sofrendo de hi�
poglicemia, que pode levar a lesão irreversível no siste�
ma nervoso central. Crianças são muito dependentes da
gluconeogênese durante o jejum, e a ingestão acidental
de álcool por uma criança pode produzir hipoglicemia
grave (ver Correlação Clínica 15.9). O álcool potencia�
liza o efeito hipoglicêmico da insulina. Portanto, não é
incomum pacientes com diabetes serem apresentados
nas salas de emergência com hipoglicemia decorrente
da combinação de insulina autoadministrada e consu�
mo de álcool.
Krebs, H. A., Freedland, R. A., Hems, R. e Stubbs, M. Inhi�
bition of hepatic gluconeogenesis by ethanol. �io��em. J.
112:117, 1969; Service, F. J. Hypoglycemia. Me�. C�in. Nort�
Ameri�� 79:1, 1995; Gibson, E. M., e Tingen, M. S. Nursing
care for diabetic patients with alcohol induced hypoglycemia.
J. Emer. N�rsing 24: 165, 1998.

15.6 GLICOGENÓLISE E
GLICOGÊNESE

Glicogênio É a Forma de
Armazenamento de Glicose
A glicogenólise refere�se à quebra de glicogênio em
glicose ou glicose 6�fosfato; a glicogênese refere�se à
síntese de glicogênio. Esses processos ocorrem em qua�
se todos os tecidos, mas especialmente no músculo e
no fígado. No homem bem alimentado, o conteúdo de
glicogênio do fígado pode responder por até 10% do
peso úmido desse órgão. O músculo armazena menos
glicogênio quando expresso na mesma base – um máxi�
mo de apenas 1%–2% do seu peso úmido. Entretanto,
a maioria das pessoas tem mais músculo do que fígado,
com o total do glicogênio muscular chegando ao dobro
da quantidade de glicogênio hepático.

Os grânulos de glicogênio são abundantes no fíga�

do de animais bem alimentados (Figura 15.44), mas
estão virtualmente ausentes desse órgão após 24 h de
jejum. Exercício pesado causa a mesma perda de grâ�
nulos de glicogênio em fibras musculares. Esses grânu�
los são grupos de moléculas individuais de glicogênio
que têm uma massa de até 2 × 107 Da. O glicogênio é
composto de resíduos glucosil, ligados principalmente
por ligações glicosídicas α�1,4 (Figura 15.45). Ramifica�
ções surgem de ligações α�1,6 frequentes. Um braço da
“árvore” do glicogênio (Figura 15.46) é caracterizado
FIGURA 15.44 Micrografia eletrônica mostrando grânulos
de glicogênio (material corado escuro) no fígado de um
rato alimentado.
Micrografia generosamente cedida por Dr. Robert R. Cardell
do Department of Anatomy da University of Cincinnati, Cin�
cinnati, OH.
por ramos a cada quatro resíduos glucosil no esquele�
to (�ore) mais central da molécula, e muito menos fre�
quentemente nas regiões mais externas. O glicogênio
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
contrasta com proteínas e ácidos nucleicos em virtude
dessa ramificação, mas, é claro, é uma forma de arma�
zenamento de combustível e não catalisa reações e nem
contém informação em uma célula.
CH2OH CH2OH
O O
O O
Ligação glicosídica α1,4
(a)
CH2OH
O importante do que a síntese de glicogênio no músculo.
O O
CH2
O O
Ligação glicosídica α1,6
(b)
FIGURA 15.45 Dois tipos de ligações entre as moléculas
de glicose estão presentes no glicogênio.
FIGURA 15.46 Estrutura ramificada do glicogênio.
Glicogênio é armazenado em músculomúsculo ee fí�fí�
gado por razões bem diferentes. O glicogênio
muscular é uma reserva de combustível para
a produção de ATP dentro dessedesse tecido,tecido, en�en�
quanto o glicogênio hepático é uma reserva de
glicose para a manutenção das concentrações
de glicose no sangue. Os níveis de glicogênio
hepático são altos logo após uma refeição e, de�
pois, diminuem lentamente à medida que ele é
usado para ajudar a manter o nível de glicose
no sangue (Figura 15.47) entre as refeições e
durante o jejum noturno. No homem e no rato,
o glicogênio armazenado dura entre 12 e 24 ho�
ras durante o jejum, dependendo muito, é cla�
ro, de o indivíduo em consideração estar confi�
nado ou correndo muito.
• 649
A maior parte do glicogênio muscular é consumida
por esse tecido, sem formação de glicose livre. Entre�
tanto, em decorrência da forma como os ramos são cor�
tados, cerca de 8% do glicogênio muscular é convertido
em glicose livre no tecido, a maior parte da qual sofre
glicólise no músculo. Como músculo não tem glicose
6�fosfatase e a maior parte da glicose livre formada é
catabolizada, o glicogênio muscular não é importante
para a manutenção dos níveis de glicose sanguíneaínea du�du�
O rante o jejum. Ao contrário, o glicogênio hepático é uma
fonte crítica de glicose sanguíneaínea nono estadoestado pós�absor�pós�absor�
tivo. PorPor outrooutro lado,lado, glicogêneseglicogênese nono músculomúsculo desempe�desempe�
nha um papel importante na redução dos níveis de gli�
cose no sangue após uma dieta rica em carboidratos.
Glicogênese hepática contribui, mas pode ser menos
Exercício mobiliza glicogênio muscular para forma�
ção de ATP. As fibras musculares vermelhas têm um
fluxo sanguíneo rico, contêm uma grande quantidade
O
de mioglobina e têm muitas mitocôndrias. O glicogênio
mobilizado nessas células é convertido em piruvato,
que é depois convertido em CO2 e H2O pelo ciclo TCA.
As fibras musculares brancas contêm menos mioglobina
e menos mitocôndrias. A glicogenólise nessas células só
fornece substratos para a glicólise, com o produto final
sendo principalmente lactato. Fibras musculares bran�
cas têm maior capacidade de glicogenólise e glicólise,
mas só podem funcionar com capacidade total por pe�
ríodos relativamente curtos. Músculo de peito e de per�
na de galinha são bons exemplos de músculos branco e
vermelho, respectivamente. Músculo de peito de gali�
nha não está executando trabalho continuamente, mas
permite à galinha voar rapidamente por curtas distân�
cias, como na fuga de predadores (ou galos amorosos).
É projetado para atividade máxima por curtos períodos.
A maioria dos músculos esqueléticos do corpo humano
é uma mistura de fibras vermelhas e brancas, que per�
mitem capacidade de contração rápida e sustentada. A
distribuição de fibras musculares brancas e vermelhas
em cortes transversais de um músculo esquelético hu�
mano é demonstrada por um procedimento de colora�
ção especial na Figura 15.48.
Almoço Jantar Café da manhã
8 hs Meiodia 16 hs 20 hs Meianoite 4 hs 8 hs
FIGURA 15.47 Variações nos níveis de glicogênio, no fígado, entre
refeições e durante o jejum noturno.
650 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

2–
→ (glicose)n�1
(Glicose)n + Pi →
+ a�D�glicose
1�fosfato2–

A etapa seguinte da glicogenólise é catalisada pela

fosfoglucomutase.

Glicose 1�fosfato → glicose 6�fosfato

Essa é uma reação próxima do equilíbrio usada na

degradação e na síntese de glicogênio.

A enzima seguinte depende do tecido (Figura

15.49). No fígado, a glicose 6�fosfato é hidrolisada pela
glicose 6�fosfatase em glicose livre.
2–
Glicose 6�fosfato2– + H2O → glicose + Pi

A falta dessa enzima ou do transportador para o

deslocamento de G6P para dentro do retículo endoplas�
mático (ver Figura 15.35, p. 642) resulta na doença de
armazenamento de glicogênio tipo I (Correlação Clíni�
ca 15.11).
FIGURA 15.48 Corte transversal de músculo esquelético
humano mostrando fibras musculares vermelhas e
brancas. (Glicose)n
O corte foi corado para atividade de NADH desidrogenase. Fi� Pi
bras vermelhas são escuras, e fibras brancas são claras. glicogênio fosforilase
Figura gentilmente fornecida por Dr. Michael H. Brooke, do
Jerry Lewis Neuromuscular Research Center, St. Louis, MO.
Glicose 1fosfato

fosfoglucomutase
Glicogênio Fosforilase Inicia
Glicogenólise Glicose 6fosfato
glucose CO2
A glicogênio fosforilase catalisa a fosforólise do gli� 6fosfatase
Glicose
(no fígado)
P
cogênio, uma reação na qual Pi é usado para clivar li� glicólise
(no músculo)
gações glicosídicas a�1,4, para gerar glicose 1�fosfato.
Essa reação sempre ocorre em extremidades não�redu� i

toras de uma molécula de glicogênio: Lactato (branco)

Piruvato
desidrogenase
lactato
(vermelho) complexo
CH2OH CH2OH CH2OH piruvato
desidrogenase
O O O
CO2
O O HPO22–
AcetilCoA
Ciclo TCA
Glicogênio (estrutura parcial) α-D-Glicose
e H2O
CH2OH CH2OH
O O FIGURA 15.49 Glicogenólise e o destino do glicogênio
HPO22–
degradado no fígado versus seu destino nos tecidos
+
OPO32– O periféricos. Branco refere-se ao músculo branco, e
vermelho ao músculo vermelho.
α-D-Glicose 1-fosfato Glicogênion-1
Como resultado da ação da glicose 6�fosfatase, a
equação geral balanceada para a glicogenólise no fígado
Essa reação é diferente da da a�amilase, que usa é simplesmente a hidrólise do glicogênio.
água, e não fosfato inorgânico (Pi), para clivar ligações
glicosídicas a�1,4 de glicogênio e amido no intestino (p. (Glicose)n + H2O → (glicose)n–1 + glicose
1075). Embora uma molécula de glicogênio possa con�
Note que o ATP não é usado nem produzido no pro�
ter até 100.000 resíduos de glicose, éé convenienteconveniente resu�resu�
mir sua estrutura simplesmente por (glicose)n, onde n cesso.
é o número de resíduos glucosil da molécula. A reação Em tecidos periféricos, G6P sofre glicólise, levando
pode ser escrita como primariamente a lactato em fibras musculares brancas,
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 651

e primariamente a CO2 em fibras musculares vermelhas normal de componentes intracelulares deve ser degra�
(Figura 15.49). Como nenhum ATP precisou ser inves� dado. A incapacidade de degradar glicogênio captado
tido para produzir G6P a partir de glicogênio, a equação por lisossomos cria um grave problema médico, descrito
final da glicogenólise seguida pela glicólise é na Correlação Clínica 15.11.

→ (glicose)n–1
(Glicose)n +
+ 23 lactato– 2–i + H+ →
ADP3– ++33PATP4–
+ 2 H2O

Enzima Cortadora de Ramos É

Necessária para Glicogenólise
A glicogênio fosforilase é específica para ligações gli�
cosídicas a�1,4. Ela para de atacar ligações glucosídicas
a�1,4 há quatro resíduos de glucosil de distância de um
ponto de ramificação a�1,6. Uma molécula de glicogênio
(6) Pi
que tenha sido degradada pela fosforilase até o limite glicogênio
fosforilase
imposto pelos ramos é chamada dextrina fosforilase�li� (6) Glicose
mite. A ação da enzima cortadora de ramos permite que 1-fosfato
P

a fosforilase continue a degradar o glicogênio. A enzima

cortadora de ramos é uma enzima bifuncional, que ca�
talisa duas reações necessárias à remoção dos ramos
do glicogênio. A primeira é uma atividade de 4�a�D�glu�
canotransferase, que remove um segmento de três re�
síduos glucosil de um ramo de quatro resíduos glucosil
da molécula de glicogênio, deixando um único resíduo
glucosil em ligação a�1,6 (Figura 15.50). O segmento de
três resíduos glucosil permanece ligado covalentemen�
te à enzima, até ser transferido para uma 4�hidroxila enzima cortadora de ramos
(atividade de transferase)
livre de um resíduo glucosil, na extremidade da mesma
molécula de glicogênio, ou de uma molécula adjacente,
para produzir um ramo mais longo. A ligação a�1,6 do
resíduo glucosil único é hidrolisada pela segunda ativi�
dade enzimática da enzima cortadora de ramos, que é
sua atividade de amilo�a�1,6�glucosidase.

CH2OH CH2OH
O O

O CH2 H2O + CH2OH

O O
α-D-Glucose
O Glicogênio O O Glicogênio O
enzima cortadora
(atividade de glucosidase)
de ramos H2O
Glicose

A ação cooperativa e repetitiva da fosforilase e da

enzima cortadora de ramos resulta na quebra comple�
ta do glicogênio em glicose 1�fosfato e glicose. Doen�
ças de armazenamento de glicogênio resultam quando
qualquer uma dessas enzimas está defeituosa. Uma mo�
lécula média de glicogênio gera cerca de 12 moléculas
de glicose 1�fosfato, por ação da fosforilase, para cada
molécula de glicose livre produzida por ação da enzima
cortadora de ramos.

Existe outra via, embora quantitativamente menos

importante, para a degradação de glicogênio, que de� FIGURA 15.50 Combinação da ação da glicogênio
pende de glucosidases presentes em lisossomos. O gli� fosforilase e enzima cortadora de ramos de glicogênio é
cogênio que entra em lisossomos durante a reciclagem requerida para a glicogenólise.
652 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Glicose extremidade não�redutora (carbono 4 de um resíduo

ATP
glucosil) da cadeia de glicogênio. De acordo com isso,
hexoquinase cada molécula de glicogênio deveria ter uma extremi�
ADP
dade redutora livre, mergulhada dentro do seu núcleo.
Glicose 6fosfato Na verdade, ela não tem extremidade redutora livre
fosfoglucomutase
porque seu único grupo aldeído potencialmente livre é
covalentemente ligado a uma proteína chamada glico�
Glicose 1fosfato genina dentro do seu núcleo (descrita na p. 654). O UDP
formado como produto da reação da glicogênio sintase
glicose 1fosfato
uridililtransferase UTP
é convertido de volta em UTP pela nucleosídeo difosfato
PPi 2Pi
quinase.
H2O
UDP + ATP → UTP + ADP
CH2OH O
H H O H
A glicogênio sintase não pode formar as ligações
O O HN glicosídicas a�1,6. Trabalhando sozinha, ela produziria
HO OH H OPOPOCH2 N apenas amilose, um polímero de cadeia linear da gli�
O
O cose, com ligações glicosídicas ��1,4. Uma vez forma�
H OH OH OH
da uma cadeia de amilose com pelo menos 11 resíduos,
H H uma enzim� r�mifi���or�, chamada enzima 1,4�a−
H H

HO(Glicose)n
OH
�glucano ramificadora remove um bloco de cerca de
UDPglicose
7 resíduos glucosil de uma cadeia em crescimento e o
transfere para outra cadeia, para produzir uma ligação
glicogênio sintase
(Glicose)n + 1
a�1,6 (Figura 15.52). O novo ramo deve ser introduzido
a uma distância de, pelo menos, quatro resíduos gluco�
UDP sil do ponto de ramificação mais próximo. Portanto, a
criação da estrutura altamente ramificada do glicogê�
FIGURA 15.51 Via da glicogênese.
nio requer as ações coordenadas da glicogênio sintase e
da enzima ramificadora. A reação final balanceada para
Glicogênese Requer Enzimas a síntese de glicogênio é
Singulares →
(Glicose)n
(glicose)n+1
+ glicose
+ 2 ADP3– + 2 P+H
+ 2ATP4– i2– +
2O2H+
→
A primeira reação (Figura 15.51) é a da glucoquina�
se no fígado e hexoquinase em tecidos periféricos. Como já observado, a combinação de glicogenólise
e glicólise gera três moléculas de ATP por resíduo glu�
Glicose + ATP → glicose 6�fosfato + ADP
cosil.
A fosfoglucomutase então forma glicose 1�fosfato.
→ (glicose)n–1
(Glicose)n +
+ 2 3lactato–
ADP3– + 3 P
ATP4–
2–i + H+→

Glicose 6�fosfato  glicose 1�fosfato + 2H2O

A glicose 1�fosfato uridililtransferase então produz Portanto, a combinação de glicogênese e degrada�

ção de glicogênio a lactato rende apenas um ATP.
UDP�glicose.
2–
Glicose 1�fosfato + UDP → UDP�glicose + PPi Glicose + ADP3– + Pi → 2 lactato– + ATP4– + H2O + H+

A última reação gera UDP�glicose, uma molécula de Lembre�se, entretanto, que a síntese e a degradação
glicose ativada, a partir da qual o glicogênio pode ser de glicogênio são normalmente efetuadas em momentos
sintetizado. A formação de UDP�glicose torna�se ener� diferentes em uma célula. Por exemplo, fibras muscula�
geticamente favorável e irreversível pela hidrólise de res brancas sintetizam glicogênio durante o repouso,
pirofosfato em fosfato inorgânico, pela pirofosfatase. quando glicose é abundante e menos ATP é necessário
para a contração muscular. O glicogênio é depois usado
4–
PPi + H2O → 2 P2–i durante períodos de esforço. Embora não seja um pro�
cesso muito eficiente, o armazenamento de glicose na
A glicogênio sintase então transfere o resíduo glu� forma de glicogênio fornece às células um combustível
cosil ativado da UDP�glicose para o carbono 4 de um de reserva que pode ser mobilizado rapidamente.
resíduo glucosil da cadeia de glicogênio em crescimen�
to, para formar uma nova ligação glicosídica no grupo
hidroxila do carbono 1 do açúcar ativado. A extremi�
dade redutora da glicose (carbono 1, um aldeído que
pode reduzir outros compostos durante sua oxidação
para um ácido carboxílico) é sempre adicionada a uma
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 15.11
Doenças de Armazenamento de Glicogênio
Existem várias doenças bem caracterizadas de ar�
mazenamento de glicogênio, todas devidas a defeitos
hereditários em enzimas envolvidas na degradação do
glicogênio. O fígado é geralmente o tecido mais afetado,
mas o metabolismo de glicogênio no coração e no mús�
culo também pode estar comprometido.
Doença de Von Gierke (OMIM 232200)
A doença de armazenamento de glicogênio mais co�
mum, chamada de tipo I ou doença de von Gierke, surge
de uma deficiência de glicose 6�fosfatase no fígado, na
mucosa intestinal e no rim. Assim, o diagnóstico por
biópsia intestinal é possível. Pacientes com essa doença
podem não ter a própria glicose 6�fosfatase (tipo Ia) ou
o transportador de glicose 6�fosfato (tipo Ib) (ver Figu�
ra 15.37). Deficiência de glicose 6�fosfatase ocorre em
cerca de 1 pessoa a cada 200.000, e é transmitida como
um traço autossômico recessivo. Ela se manifesta como
hipoglicemia de jejum, acidemia láctica, hiperlipidemia
e hiperuricemia com artrite gotosa. A hipoglicemia de
jejum é uma consequência da deficiência de glicose
6�fosfatase. O fígado desses pacientes libera um pouco
de glicose, pela ação da enzima cortadora de ramos do
glicogênio. A acidemia láctica ocorre porque o fígado
é incapaz de usar lactato eficientemente para gluco�
neogênese e porque produz ácido láctico inadequada�
mente em resposta a glucagon. Esse hormônio deveria
desencadear a liberação de glicose sem a produção de
lactato; entretanto, o oposto ocorre devido à falta da gli�
cose 6�fosfatase. Hiperuricemia pode resultar de degra�
dação aumentada de purinas no fígado, hiperlipidemia
decorrente da disponibilidade aumentada de ácido lác�
tico para lipogênese e mobilização de lipídeos do tecido
adiposo, causada por níveis altos de catecolaminas, em
resposta à hipoglicemia. Essas manifestações podem
ser muito diminuídas pela administração de carboidra�
tos ao longo do dia, para evitar hipoglicemia. Durante o
sono, isso pode ser feito por infusão de carboidratos no
estômago, por um tubo nasogástrico.
Doença de Pompe (OMIM 232300)
A doença de armazenamento de glicogênio tipo II
ou doença de Pompe é causada pela ausência de α�1,4�
�glucosidase (ou maltase ácida), normalmente encon�
trada em lisossomos. Isso leva ao acúmulo de glicogê�
nio, principalmente em lisossomos, em praticamente
todos os tecidos. Isso é um tanto surpreendente, mas os
lisossomos captam grânulos de glicogênio e ficam de�
fectivos com respeito a outras funções, se não tiverem
capacidade de hidrolisar os grânulos. Como as outras
vias sintéticas e degradativas do metabolismo de gli�
cogênio estão intactas, desarranjos metabólicos como
• 653
os da doença de Von Gierke não são observados. Ocor�
rem hipotonia grave, cardiomegalia importante e car�
diomiopatia, e morte resulta de insuficiência cardíaca,
geralmente nos primeiros meses de vida. Uma forma
da doença que surge no adulto causa grave fraqueza
muscular, particularmente nos músculos respiratórios
(diafragma), com morte frequentemente resultando de
insuficiência respiratória.
Doença de Cori (OMIM 232400)
A doença de armazenamento de glicogênio tipo III
ou doença de Cori é causada por deficiência da enzima
cortadora de ramos do glicogênio. Glicogênio acumu�
la�se porque apenas os ramos mais externos podem
ser removidos pela fosforilase. Ocorre hepatomegalia,
que diminui com a idade. As manifestações clínicas
são semelhantes, mas muito mais leves, do que as da
doença de Von Gierke, porque a gluconeogênese não é
afetada e a hipoglicemia e suas complicações são me�
nos graves.
Doença de McArdle (OMIM 232600)
A doença de armazenamento de glicogênio tipo V ou
doença de McArdle é causada por ausência da fosfori�
lase muscular. Os pacientes sofrem de cãimbras mus�
culares dolorosas e são incapazes de executar exercí�
cio extenuante, presumivelmente porque as reservas
de glicogênio no músculo não estão disponíveis para
o músculo em exercício. Assim, a elevação normal de
lactato no plasma (liberado do músculo) após exercício
não ocorre. Os músculos são provavelmente danifica�
dos em virtude de suprimento inadequado de energia
e acúmulo de glicogênio. A liberação de creatina fosfo�
quinase, aldolase e mioglobina do músculo é comum;
níveis elevados dessas proteínas no sangue sugerem
uma doença muscular.
Chen, Y.�T. Glycogen storage diseases. Em: Scriver, C. R.,
Beaudet, A. L., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.), T�e Met�bo�i�
�n� Mo�e����r ��ses of �n�erite� Dise�se, 8. ed., New York:
McGraw�Hill, 2001, 1521.
Cori, G. T., e Cori, C. F. Glucose 6�phosphatase of the liver
in glycogen storage disease. J. �io�. C�em. 199:661, 1952.
Raben, N., Plotz, P., e Byrne, B. J. Acid alpha�glucosidase
deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). C�rr. Mo�.
Me�. 2:145, 2002.
Van Hoff, F. e Hers, H. G. The subgroups of type III glyco�
genosis. E�r. J. �io��em. 2:265, 1967.
McArdle, B. Myopathy due to a defect in muscle glycogen
breakdown. C�in. ��i. 10:13, 1951.
654 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
(7) UDP-glicose
(7) UDP
enzima
ramificadora
FIGURA 15.52 Ação coordenada da glicogênio sintase e
da enzima ramificadora do glicogênio é necessária para
a glicogênese.
Ação da enzima ramificadora do glicogênio.
Características Especiais da
Glicogenólise e da Glicogênese
Por Que Armazenar Glicose Como
Glicogênio?
O fato do glicogênio ser um combustível de reserva
tão bom torna óbvio o porquêê dedede sintetizarmossintetizarmossintetizarmos eee arma�arma�arma�
zenarmos glicogênio no fígado e no músculo. Mas, por
que não armazenar nosso excesso de calorias da glico�
se inteiramente como gordura, em vez de glicogênio?
A resposta tem, pelo menos, três desdobramentos: (1)
os ácidos graxos não podem ser liberados de gordura
tão rapidamente como a glicose pode ser liberada do
glicogênio, (2) a gordura não pode ser usada como fon�
te de energia em ausência de oxigênio, e (3) a gordura
não pode ser convertida em glicose para manter os ní�
veis de glicose no sangue requeridos pelo cérebro. Por
que não bombear, simplesmente, a glicose para dentro
das células e armazená�la como glicose livre, até ser
necessária? Por que gastar ATP fazendo um polímero
de glicose?
O problema é que a glicose é osmoticamente ativa.
Custaria ATP para “bombear” a glicose para dentro
de uma célula contra um gradiente de concentração, e
sua concentração teria que chegar a cerca de 400 mM
nas células do fígado, para alcançar a reser�� �e g�i�
�ose conseguida pelos níveis normais de glicogênio no
glicogênio fígado. A menos que equilibrada pelo movimento para
sintase
fora de algum outro composto osmoticamente ativo, o
acúmulo de glicose causaria considerável captação de
água, com lise osmótica da célula. Considerando�se que
a massa de uma molécula de glicogênio seja cerca de
107 Da, 400 mM de glicose é, de fato, armazenado em
uma concentração de glicogênio de apenas 0,01 μM. O
armazenamento de glicose como glicogênio, portanto,
não cria problema de pressão osmótica para a célula.
Glicogenina É Necessária Como Iniciador
da Síntese de Glicogênio
Como na síntese de DNA, um iniciador ou primer é
necessário para a síntese de glicogênio. Nenhum mol�
de, entretanto, é necessário. O próprio glicogênio é o
iniciador comum, uma vez que a síntese de glicogênio
adiciona unidades glucosil a moléculas “núcleo” de gli�
cogênio, que estão quase que invariavelmente presen�
tes nas células. As regiões mais externas das molécu�
las de glicogênio são removidas e ressintetizadas mais
rapidamente do que o núcleo interior. O glicogênio de
dentro de uma célula é frequentemente cortado pelas
ações combinadas da glicogênio fosforilase e da enzima
cortadora de ramos, mas raramente é totalmente dige�
rido, antes que a pessoa se alimente novamente e a gli�
cogênio sintase e a enzima ramificadora reconstruam a
molécula. Isso coloca a questão de porque o glicogênio é
uma molécula ramificada, com apenas um início real (o
resíduo de glicose iniciador original) e muitas ramifica�
ções, terminando em unidades glucosil não�redutoras.
A resposta é que isso oferece numerosos pontos para o
ataque da glicogênio fosforilase em uma molécula ma�
dura de glicogênio, e o mesmo número de pontos para
servir de iniciador para a adição de unidades glucosil pela
glicogênio sintase. Se as células sintetizassem α�amilo�
se, um polímero não�ramificado de glicose, haveria ape�
nas uma extremidade não�redutora por molécula. Isso
tornaria a degradação e a síntese de glicogênio muito
mais lentas. Na verdade, a glicogênio fosforilase e a gli�
cogênio sintase ocorrem em estreita associação com os
grânulos de glicogênio, e têm fácil acesso a uma multi�
plicidade de açúcares não�redutores nas extremidades
dos ramos. Este não é o caso na doença de Lafora, uma
epilepsia mioclônica com início na adolescência carac�
terizada pelo acúmulo neuronal de depósitos de glico�
gênio pouco ramificado e insolúvel chamados corpos de
Lafora (Um Olhar Mais Atento 15.7).
Um iniciador é necessário para a síntese de glicogê�
nio porque a glicogênio sintase não pode iniciar a sín�
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
tese de glicogênio com uma única molécula de glicose
como aceptora de um resíduo glucosil ativado de UDP�
�glicose. A glicogênio sintase tem um Km muito baixo
para moléculas grandes de glicogênio e, portanto, adi�
ciona facilmente resíduos glucosil para construir molé�
culas de glicogênio ainda maiores. Entretanto, o Km fica
cada vez maior conforme a molécula de glicogênio fica
menor, de modo que a glicose, em sua concentração fi�
siológica, não pode funcionar como iniciador. Isso levou,
por algum tempo, à noção de que o glicogênio deveria
ser imortal; isto é, um pouco de glicogênio deveria ser
passado de uma geração celular para a seguinte, para
que glicogênio pudesse ser sintetizado. Contudo, um
polipeptídeo de 332 aminoácidos chamado glicogenina
funciona como iniciador para a síntese de glicogênio.
A glicogenina é uma enzima que se autoglicosila e que
usa UDP�glicose para ligar glicose a um de seus pró�
prios resíduos de tirosina (Figura 15.53). A glicogenina
forma uma cadeia de resíduos glucosil em si mesma por
catalisar a adição de mais sete resíduos glucosil, com
ligações α�1,4. A glicogenina glicosilada, então, serve
de iniciador para a síntese de glicogênio pela glicogênio
sintase. Infelizmente, glicogênio não é imortal.
7\U2+
Glicogenina
8'3JOLFRVH
Autoglicosaçmo
8'3
7\U2JOLFRVH
 Glicogenina iniciada
glicogrnio sintase n8'3JOLFRVH
enzima eremificadora
n8'3
 *OLFRVHQαH
7\U2
OLJDo}HVα
Complexo GlicogênioGlicogenina
FIGURA 15.53 A glicogenina fornece um iniciador para
síntese de glicogênio pela glicogênio sintase.
Tyr designa um resíduo de tirosina da glicogenina.
Glicogênio Limita Sua Própria Síntese
Se a glicogênio sintase fica mais eficiente à medida
que a molécula de glicogênio fica maior, como a sínte�
se dessa bola de açúcar é controlada? Os adipócitos têm
uma capacidade quase ilimitada de armazenar gordura,
mas os adipócitos não têm mais nada a fazer. As células
musculares participam da atividade mecânica, e as cé�ascé�
lulas hepáticas desempenham muitos processos além da
síntese de glicogênio. Mesmo frente ao excesso de glico�
se, deve haver um jeito de limitar o acúmulo intracelular
de glicogênio. O próprio glicogênioênio inibeinibe aa glicogênioglicogênio sin�sin�
tase, por um mecanismo discutido mais adiante.
• 655
UM OLHAR MAIS ATENTO 15.7
Glicogênio Fosforilado e Doença de Lafora
A doença de Lafora é atribuída a um defeito
no gene da laforina, uma fosfatase que remove re�
síduos de fosfato do glicogênio fosforilado. Sur�
preendentemente, antes dos estudos sobre o me�
canismo responsável pela doença de Lafora não
se havia percebido que o glicogênio é fosforilado.
Como isso ocorre e se serve a um propósito, ainda
não se sabe. O glicogênio isolado de camundon�
gos com doença de Lafora é menos ramificado,
mas mais fosforilado do que o glicogênio isolado
de camundongos tipo selvagem. Isso sugere que a
presença de grupos fosfato no glicogênio promove
a formação dos corpos de Lafora por inibição da
enzima ramificadora.
Tagliabracci, V. S., Turnbill, J., Wang, W., Girard, J. –M.,
et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of whi�
ch leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.
Pro�. N�t�. A���. ��i. ��A 104: 19262, 2007.
Síntese e Degradação de Glicogênio
São Muito Reguladas
Glicogênio sintase e glicogênio fosforilase são as en�
zimas regulatórias da síntese e da degradação de glico�
gênio, respectivamente. Ambas catalisam reações que
não estão em equilíbrio, e ambas estão sujeitas ao con�
trole por efetores alostéricos e modificação covalente.
Regulação da Glicogênio Fosforilase
Glicogênio fosforilase é ativada por AMP e inibida
por glicose e ATP (Figura 15.54). O controle por esses
efetores alostéricos é integrado com um controle muito
elaborado por modificação covalente. A fosforilase exis�
te em uma forma ativa � e uma forma inativa b. Essas
formas são interconvertidas pela fosforilase quinase e
pela fosfoproteína fosfatase. Uma mudança conforma�
cional causada pela fosforilação cria um estado cata�
lítico mais ativo. A fosforilase não�fosforilada, que é a
forma b, tem baixa atividade, mas é muito estimulada
por AMP. Esse efetor alostérico tem pouco efeito ativa�
dor sobre a fosforilase �, já ativa. Portanto, a regulação
por modificação covalente pode ser superada por um
mecanismo mediado por AMP.
A fosforilase quinase fosforila e ativa a fosforilase
(Figura 15.54) e está, ela própria, sujeita a regulação
por fosforilação-desfosforilação. A proteína quinase
A fosforila e ativa a fosforilase quinase; a fosfoproteína
fosfatase a desfosforila e inativa. A fosforilase quinase
é um complexo (1,3 milhões de Da) composto por qua�
tro subunidades diferentes com quatro cópias de cada
656 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Glucagon; Epinefrina cAMP Insulina

ATP fosforilase
+ quinase b Pi

fosfoproteína
cAMP + proteína
quinase A Ca2+
+ fosfatase
–

H2O
fosforilase
ADP ATP quinase a –P
ADP

Glicose

–
Fosforilase b + AMP Fosforilase a
– –P
ATP

Pi H2O
fosfoproteína
fosfatase
–
FIGURA 15.54 Regulação da glicogênio fosforilase
por modificação covalente e efetores alostéricos.
A fosforilação converte a glicogênio fosforilase e a fos�
forilase quinase de suas formas inativas b em suas for�
cAMP ATP + Insulina
ADP
mas ativas �.

Ca2+
cAMP Diacilglicerol

Insulina

+ dependente
proteína
de+quinase
calmodulina + glicogênio
quinase
proteínaA + fosforilase
quinase proteínaquinaseC −

+ sintasequinase-3 +

caseína quinases I & II

Glicogênio sintase a Glicose + Glicogênio sintase b

6-fosfato –P

Pi H2O

fosfoproteína
fosfatase
– +

FIGURA 15.55 Regulação da glicogênio sintase por

modificação covalente.
cAMP Insulina A fosforilação converte a glicogênio sintase de sua for�
ma ativa � para sua forma inativa b.

subunidade no complexo (a4b4g4d4). A atividade cata�+ fosforiladas na transição da forma inativa b para a for�
lítica reside na subunidade g; as subunidades a, b e d ma ativa �. A proteína quinase A só pode exercer efeito
exercem controle regulatório. As subunidades a e b são sobre a fosforilase via fosforilação e ativação da fosfori�
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
lase quinase. Portanto, um sistema bicíclico é necessá�
rio para a ativação da fosforilase em resposta aos sinais
mediados por AMP.
A subunidade d é a proteína regulatória que liga
Ca2+ calmodulina (p. 514). Ela está presente em células
em sua forma livre e é ligada fortemente em complexos
enzimáticos. Funciona como um receptor de Ca2+ em
células, respondendo a variações na concentração in�
tracelular de Ca2+ e afetando a atividade de vários siste�
mas enzimáticos. A ligação de Ca2+ à calmodulina torna
a fosforilase quinase mais ativa. Como mostra a Figura
15.55, Ca2+ é um ativador de ambas fosforilase quinase
� e fosforilase quinase b. Ativação máxima da fosfori�
lase quinase requer fosforilação de resíduos específi�
cos de serina mais interação de Ca2+ com calmodulina.
Este é um mecanismo pelo qual Ca2+ funciona como um
segundo mensageiro da ação hormonal.
A ativação da fosforilase quinase por fosforilação e
Ca2+ tem um efeito substancial sobre a atividade da gli�
cogênio fosforilase. É óbvio, entretanto, que inibindo a
fosfoproteína fosfatase, que modula ambas fosforilase
quinase e glicogênio fosforilase, pode�se obter o mes�
mo efeito. Controle definitivo da glicogênio fosforilase,
portanto, envolve regulação recíproca das atividades
de fosfoproteína fosfatase e fosforilase quinase. Regu�
lação da atividade da fosfoproteína fosfatase envolve
cAMP. Hormônios que aumentam os níveis de cAMP,
como glucagon e epinefrina, promovem ativação da
glicogênio fosforilase por ativação da sinalização da
fosforilase quinase e inativaçãoão dada fosfoproteínafosfoproteína fos�fos�
fatase. A insulina, por meio de uma cascata de sinais
mediados por quinases, tem o efeito oposto sobre a
fosforilase, por promover ativação da atividade da fos�
foproteína fosfatase.
Glicogênio Fosforilase é Regulada por uma
Cascata que Amplifica Muito um Pequeno
Sinal em um Efeito Muito Grande
O sistema de controle bicíclico para fosforilação da
glicogênio fosforilase amplifica enormemente um sinal
inicial muito pequeno. Ativação da adenilato ciclase por
uma molécula de epinefrina leva à formação de muitas
moléculas de cAMP. Cada molécula de cAMP ativa uma
molécula de proteína quinase A que, por sua vez, fos�
forila muitas moléculas de fosforilase quinase, que são
ativadas, bem como muitas moléculas de fosfoproteína
fosfatase, que são inativadas. Por sua vez, a fosforilase
quinase fosforila muitas moléculas de glicogênio fosfo�
rilase que, por sua vez, catalisam fosforólise de muitas
ligações glicosídicas do glicogênio. Esse é, portanto, um
sistema de amplificação no qual o sinal desencadeado
por algumas poucas moléculas de hormônio é amplifi�
cado em um número enorme de moléculas de glicose
1�fosfato. Se cada etapa representar uma amplificação
de um fator 100, então quatro etapas resultariam em
uma amplificação de 100 milhões! Esse sistema é tão
• 657
rápido que todo o glicogênio armazenado em fibras
musculares brancas poderia ser convertido em glicose
6�fosfato em segundos.
Regulação da Glicogênio Sintase
A glicogênio sintase precisa estar ativa para a glico�
gênese e inativa para a glicogenólise. A combinação das
reações da glicogênio sintase, da glicogênio fosforilase,
da glicose 1�fosfato uridililtransferase e da nucleosídeo
difosfato quinase contribui para um ciclo fútil, com a
equação geral ATP + H2O → ADP + Pi. Portanto, a gli�
cogênio sintase precisa ser inibida quando a glicogênio
fosforilase estiver ativa, e vice�versa.
Se G6P ativa a glicogênio sintase, isso depende de
seu estado de fosforilação (Figura 15.55). A glicogê�
nio sintase existe em uma forma “D” fosforilada, que é
dependente da presença de G6P para atividade, e em
uma forma “I” não�fosforilada, que é independente de
G6P. A forma D corresponde à forma b� ou inativa, da
enzima, a forma I à forma �� ou ativa, da enzima. Fos�
forilação da glicogênio sintase é catalisada por várias
proteína quinases que, por sua vez, são reguladas por
segundos mensageiros da ação hormonal, incluindo
cAMP, Ca2+, diacilglicerol e provavelmente outros ain�
da não identificados. Cada proteína quinase identifica�
da na Figura 15.55 pode fosforilar e contribuir para a
inativação da glicogênio sintase. A glicogênio sintase
é um homotetrâmero (a4) de massa 85 kDa, que pode
ser fosforilada em pelo menos nove diferentes resí�
duos de serina. Onze proteína quinases foram identi�
ficadas, que podem fosforilar a glicogênio sintase. Isso
contrasta fortemente com a glicogênio fosforilase, que
é regulada por fosforilação em um único sítio, por uma
quinase específica.
AMP cíclico induz efetitos opostos nas atividades da
glicogênio sintase (Figura 15.55) e da glicogênio fos�
forilase (Figura 15.54). Um aumento em cAMP sina�
liza ativação da glicogênio fosforilase e inativação da
glicogênio sintase, via ativação da proteína quinase A
e inibição da fosfoproteína fosfatase. Ca2+, da mesma
maneira, influencia os estados de fosforilação de am�
bas as enzimas e regula reciprocamente suas ativida�
des por seus efeitos sobre a fosforilase quinase. Duas
proteína quinases independentes de cAMP ativadas por
Ca2+ foram identificadas, que podem ter significado fi�
siológico. Uma é a proteína quinase dependente de cal�
modulina e a outra, uma proteína quinase dependente
de Ca2+ e de fosfolipídeo (proteína quinase C). Ambas
fosforilam a glicogênio sintase, mas nenhuma delas é
capaz de fosforilar a glicogênio fosforilase. A proteína
quinase C requer fosfolipídeo, diacilglicerol e Ca2+ para
atividade máxima. É de considerável interesse porque
agentes promotores de tumor chamados forbol ésteres
mimetizam diacilglicerol como ativadores de sua ativi�
dade. Diacilglicerol é um segundo mensageiro da ação
hormonal, agindo via proteína quinase C para regular
numerosos processos celulares.
658 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
A glicogênio sintase também é fosforilada pela gli�
cogênio sintase quinase�3, caseína quinase I e caseína
quinase II. Essas quinases nãoão estão sujeitas à regula�regula�
regula�
ção por cAMP ou Ca2+, mas para elas existem mecanis�
mos regulatórios especiais. Uma cascata de sinalização
por insulina resulta em ativação da proteína quinase B,
que inativa a glicogênio sintase quinase�3 por fosforila�
ção, uma ação que permite que ocorra ativação da gli�
cogênio sintase por desfosforilação pela fosfoproteína
fosfatase.
A fosfoproteína fosfatase que converte a glicogênio
sintase b em glicogênio sintase � (Figura 15.55) é regu�
lada de maneira análoga à da glicogênio fosforilase (Fi�
gura 15.54). AMP cíclico promove inativação, enquanto
insulina promove ativação da glicogênio sintase, por
meio de efeitos opostos sobre a atividade da fosfopro�
teína fosfatase.
Em geral, fosfoproteína fosfatases estão presentes
como subunidades catalíticas associadas com subuni�
dades regulatórias, que controlam sua atividade, deter�
minam que substrato(s) pode(m) ser desfosforilado(s),
e direcionam a associação com estruturas específicas
dentro de uma célula. Uma proteína regulatória impor�
tante para o metabolismo de glicogênio é a subunidade
G ou proteína de ligação ao glicogênio. A subunidade G
liga ambos, glicogênio e uma subunidade catalítica de
fosfatase (Figura 15.56), tornando a fosfatase 10 ve�
zes mais ativa sobre a glicogênio sintase e a glicogênio
fosforilase. Entretanto, fosforilação da subunidade G
pela proteína quinase A libera a subunidade catalítica
de fosfatase, que fica então menos ativa. Interação da
subunidade catalítica livre com outra proteína regula�
tória (chamada inibidor 1) inibe ainda mais a atividade
de fosfatase. A inibição efetiva da atividade residual de
fosfatase requer fosforilação do inibidor 1 pela proteína
quinase A, criando assim outra ligação com hormônios
que aumentam os níveis de cAMP. A insulina tem efei�
tos opostos aos do cAMP; isto é, promove ativação da
subunidade catalítica da fosfatase.
Controle Efetor do Metabolismo de
Glicogênio
Certos músculos mobilizam suas reservas de glico�
gênio rapidamente em resposta a condições anaeróbi�
cas, sem conversão importante da fosforilase na forma
b para � ou da glicogênio sintase na forma � para b.
Presumivelmente isso é realizado por controle efetor,
no qual os níveis de ATP diminuem, causando menor
inibição da fosforilase; os níveis de glicose 6�fosfato di�
minuem, causando menor ativação da glicogênio sinta�
se; e os níveis de AMP aumentam, causando ativação
da fosforilase. Isso permite ao músculo continuar tra�
balhando, pelo menos por um curto período, usando o
ATP produzido pela glicólise da glicose 6�fosfato deri�
vada do glicogênio.
Glicogênio G C
Fosfatase
ativa
ATP Pi
proteína quinase A Fosfatase
ADP (ativada pela insulina)
Glicogênio G P + C
Fosfatase
menos ativa
I1 proteína
ATP quinase
ADPA I1
PP
I1 C
Fosfatase
inativa
FIGURA 15.56 Mecanismo de regulação de uma fosfatase
que se liga ao glicogênio.
A subunidade G de ligação ao glicogênio liga�se diretamente
ao glicogênio; a subunidade fosfoproteína fosfatase catalítica C
liga�se ao glicogênio pela subunidade G; e o inibidor fosforilado
1 (I�1) liga�se à subunidade catalítica livre. Proteína quinase A
inativa a fosfatase por fosforilação da subunidade G e do I�1.
Insulina sinaliza ativação da fosfatase por promover desfosfori�
lação da subunidade G e do I�1 (não mostrado).
Uma prova de que controle efetor pode operar foi
também obtida a partir de uma cepa de camundongos
deficientes na fosforilase quinase de músculo. A fosfo�
rilase b do músculo de tais camundongos não pode ser
convertida em fosforilase �. Contudo, exercício pesado
resulta em depleção do glicogênio muscular em decor�
rência do estímulo da fosforilase b por AMP.
Controle por Retroalimentação Negativa
da Síntese de Glicogênio pelo Glicogênio
Glicogênio exerce controle de retroalimentação
(fee�b��k) sobre sua própria formação. A porção da
glicogênio sintase na forma ativa � diminui, à medida
que glicogênio se acumula em um tecido. O mecanis�
mo não é bem entendido, mas glicogênio pode tornar
a forma � um substrato melhor para uma proteína
quinase ou, alternativamente, glicogênio pode inibir a
desfosforilação da glicogênio sintase b pela fosfopro�
teína fosfatase. Qualquer dos mecanismos responderia
pelo deslocamento do estado estacionário em favor da
glicogênio sintase b, que ocorre em resposta ao acú�
mulo de glicogênio.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
Fosforilase a É um “Receptor de
Glicose” no Fígado
Uma refeição rica em carboidratos eleva a glicose no
sangue e no fígado, o que aumenta a síntese de glicogê�
nio no tecido hepático. O mecanismo envolve estímulo
pela glicose da liberação de insulina do pâncreas e seus
efeitos sobre a glicogênio fosforilase e a glicogênio sin�
tase hepáticas. Contudo, mecanismos independentes de
hormônios também parecem ser importantes no fígado
(Figura 15.57). A inibição direta da fosforilase � por gli�
cose é, provavelmente, importante. A ligação de glicose
à fosforilase torna a forma � da fosforilase um substrato
melhor para desfosforilação pela fosfoproteína fosfata�
se. Portanto, a fosforilase � no fígado funciona como um
receptor intracelular de glicose. A ligação de glicose à
fosforilase � promove sua inativação, inibindo assim a
glicogenólise. Esse controle de retro��iment�ção ne�
g�ti�� da glicogenólise pela glicose não promoveria ne�
cessariamente síntesesíntese dede glicogênio.glicogênio. Entretanto,Entretanto, aa
fos�afos�fos�
forilase � inibe a desfosforilação da glicogênio sintase
b pela fosfoproteína fosfatase. Essa inibição é perdida
logo que a fosforilase � é convertida na forma b (Figu�
ra 15.57). Em outras palavras, a fosfoproteína fosfatase
pode voltar sua atenção para a glicogênio sintase b só
depois da desfosforilação da fosforilase �. Assim, como
resultado da interação da glicose com a fosforilase �,
glicogênio é sintetizado e não degradado no fígado. A
fosforilase � pode desempenhar essa função de “recep�
tor de glicose” no fígado porque a concentração de gli�
cose no fígado reflete a do sangue. Isso não é verdade
para tecidos extra�hepáticos. As células do fígado têm
um transportador de glicose de altíssima capacidade
(GLUT�2) e uma enzima com S0,5 alto para fosforilação
Glicose
Membrana
plasmática
Glicose
² 
Fosforilase a fosfatase
² beração de (Figura
sintase b
Glicogênio fosfatase Glicogênio
sintase a
UDPglicose Glicogênio
FIGURA 15.57Visão geral do mecanismo de estímulo pela glicose da
glicogênese no fígado.
• 659
de glicose (glucoquinase), enquanto em tecidos extra�
�hepáticos, os sistemas de transporte de glicose e de
fosforilação mantêm a glicose intracelular em uma con�
centração baixa demais para que a fosforilase � funcio�
ne como um “receptor de glicose”.
Controle Hormonal e Neural
da Síntese e da Degradação de
Glicogênio
Glucagon e Epinefrina Estimulam
Glicogenólise no Fígado
Glucagon é liberado das células a do pâncreas em
resposta a níveis baixos de glicose no sangue. Nessas
condições, por exemplo durante jejum, glucagon esti�
mula a glicogenólise para garantir que concentração
adequada de glicose no sangue esteja disponível para
os tecidos dependentes de glicose (Figura 15.58). A li�
gação de glucagon aos seus receptores em células hepá�
ticas ativa a adenilato ciclase e dispara as cascatas que
ativam a glicogênio fosforilase e inativam a glicogênio
sintase (ver Figuras 15.54 e 15.55, respectivamente).
Também inibe a glicólise no nível da 6�fosfofruto�1�
�quinase e da piruvato quinase, como mostram as Fi�
guras 15.25 e 15.38, respectivamente. O resultado final
de todos esses efeitos mediados por cAMP e modifica�
ções covalentes é um aumento muito rápido dos níveis
normais de glicose sanguínea. Hiperglicemia não ocor�
re porque menos glucagon é liberado pelo pâncreas à
medida que os níveis de glicose no sangue aumentam.
A epinefrina é liberada no sangue a partir de células
cromafins da medula adrenal, em resposta ao
estresse. Este hormônio “medo, fuga ou luta”
prepara o corpo para o combate ou fuga. A
ligação de epinefrina aos receptores b�adre�
nérgicos de células hepáticas ativa a adenilato
ciclase (Figura 15.58), e cAMP tem os mesmos
efeitos do glucagon, isto é, ativação da glicoge�
nólise e inibição da glicogênese e da glicólise,
para maximizar a liberação de glicose. Ligação
de epinefrina a receptores a�adrenérgicos em
células hepáticas sinaliza formação de inositol
Fosforilase b 1,4,5�trisfosfato (IP3) e diacilglicerol (Figura
15.59). Estes são segundos mensageiros, pro�
duzidos pela ação de uma fosfolipase C sobre
fosfatidilinositol 4,5�bisfosfato da membrana
plasmática retículoIP3
Ca2+ do 15.60). endoplasmático,
estimula a li�
o qual ativa a fosforilase quinase que, por sua
vez, ativa a glicogênio fosforilase (ver Figura
15.54). Além disso, ativação mediada por Ca2+
da fosforilase quinase e da proteína quinase
dependente de calmodulina, bem como ati�
vação mediada por diacilglicerol da proteína
quinase C, podem todos contribuir para inati�
vação da glicogênio sintase (ver Figura 15.55).
660 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Glucagon Adenilato Epinefrina Epinefrina Fosfolipase C

Receptor
de glucagon ciclase Receptor
Receptor
adrenérgico αiadrenérgico

+ +
PIP2

Gs + + Gs
ATP
cAMP IP3

Ca2+
Diacilglicerol
Glicogênio 
Retículo
i Ca2+
+ endoplasmático
UDPGlicose Glicogênio

Glicose 1P

i ² 
Piruvato Glicose

Glicose UDPiglicose
GORDURA

Glicose 1iP

Glicose 6iP
Glicose Membrana
plasmática
Glicose

FIGURA 15.58 AMP cíclico medeia estímulo da

glicogenólise no fígado por glucagon e b-agonistas
(epinefrina).
Ver legendas das Figuras 15.17 e 15.23. Membrana
Glicose plasmática

FIGURA 15.59 Inositol trisfosfato (IP3) e o Ca2+ medeiam

Uma velocidade aumentada de liberação de glicose
estímulo de glicogenólise no fígado por a-agonistas.
no sangue é uma importante consequência da ação da O receptor a�adrenérgico e o transportador de glicose são
epinefrina no fígado. Isso torna glicose disponível para componentes intrínsecos da membrana plasmática. Fosfati�
tecidos que são exigidos para enfrentar o desafio da si� dilinositol 4,5�bisfosfato (PIP2) é também um componente da
tuação estressante que disparou a liberação de epine� membrana plasmática.
frina da medula adrenal.
O
Epinefrina Estimula Glicogenólise no CH2 O C R
O
Coração e no Músculo Esquelético
Rҋ C O CH O
A epinefrina também estimula glicogenólise no co� CH2 O P O
ração e no músculo esquelético (Figura 15.61). Ela se P
Oi
liga aos receptores b�adrenérgicos, que estimulam ade�
nilato ciclase a produzir cAMP, que ativa glicogênio fos� Fosfatidilinositol
forilase e inativa glicogênio sintase. Como esses tecidos 4,5bisfosfato P
não têm glicose 6�fosfatase, isso leva a estímulo da gli�
H2O
cólise, e não liberação de glicose no sangue. Portanto,
o efeito da epinefrina no coração e no músculo esquelé�
tico é tornar mais glicose 6�fosfato disponível para gli� O P
cólise. O ATP gerado pela glicólise pode, então, atender CH2 O C R P
O
à necessidade de energia imposta sobre esses músculos +
pelo estresse, que disparou a liberação de epinefrina. Rҋ C O CH

CH2OH P
Controle Neural da Glicogenólise no
1,2Diacilglicerol Inositol
Músculo Esquelético 1,4,5trisfosfato

Excitação nervosa da atividade muscular é media�
da por mudanças na concentração intracelular de Ca2+
(Figura 15.62). Um impulso nervoso causa despolariza�
ção da membrana, que causa liberação de Ca2+ do re�
tículo sarcoplasmático para o sarcoplasma das células
FIGURA 15.60 Fosfolipase C cliva fosfatidilinositol
4,5-bisfosfato em 1,2-diacilglicerol e inositol
1,4,5-trisfosfato.
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE • 661

musculares. Isso dispara contração muscular, enquanto Impulso nervoso

via acetilcolina
reacúmulo de Ca2+ no retículo sarcoplasmático causa Receptor de
relaxamento. A mudança na concentração de Ca2+ tam� acetilcolina
bém ativa a fosforilase quinase e a glicogênio fosfori� +

lase, e talvez inative a glicogênio sintase. Assim, mais

glicogênio é convertido em glicose 6�fosfato, de modo
que mais ATP é produzido para atender à maior deman�
da energética da contração muscular. Depolarização

Ca2+
+
Epinefrina
Receptor
iAdrenérgico Retículo
Adenilato Ca2+
endoplasmático
ciclase
Glicogênio
+

Gs + i
+
ATP cAMP
UDPiglicose
Glicogênio
Glicose 1iP

Glicose 6iP
Lactato
i
+
Piruvato
UDPiglicose
Lactato CO2
Glicose 1iP

Lactato Membrana
Glicose 6iP plasmática

FIGURA 15.62 Ca2+ medeia o estímulo da glicogenólise

+
no músculo por excitação nervosa.

Piruvato
Insulina aumenta a utilização de glicose, em parte
Lactato CO2
por promover glicogênese e inibir glicogenólise no mús�
culo e no fígado. Estímulo por insulina do transporte
de glicose é essencial para esses efeitos no músculo,
Membrana
plasmática
mas não no fígado. Os hepatócitos têm um transporta�
dor de glicose de alta capacidade, insensível à insulina
FIGURA 15.61 AMP cíclico medeia estímulo da (GLUT2), enquanto células de músculo esquelético e
glicogenólise no músculo por ß-agonistas (epinefrina). adipócitos têm um transportador de glicose sensível à
O receptor b�adrenérgico é um componente intrínseco da insulina (GLUT4) (p. 508). Insulina aumenta o número
membrana plasmática que estimula a adenilato ciclase por
de proteínas do transportador de glicose 4 associadas
meio de uma proteína G estimulatória (Gs).
com a membrana plasmática por promover seu deslo�
camento de um reservatório intracelular (ver Figura
Insulina Estimula Glicogênese em Músculo 15.5). A insulina promove acúmulo de glicogênio em
e Fígado ambos os tecidos por ativar a glicogênio sintase e inibir
a glicogênio fosforilase.
Um aumento na glicose sanguínea sinaliza liberação
de insulina das células b do pâncreas. Os receptores de
insulina, nas membranas plasmáticas de células sen�
síveis à insulina, respondem à ligação de insulina por
uma cascata de sinalização que promove uso de glico�
se (Figuras 15.63 e 15.64). O pâncreas responde a uma
queda na glicose sanguínea com menor liberação de in�
sulina, e maior liberação de glucagon. Esses hormônios
têm efeitos opostos sobre a utilização de glicose pelo
fígado, estabelecendo assim o pâncreas como um “apa�
relho” de sintonia fina que impede flutuações perigosas
nos níveis sanguíneos de glicose.
662 - PARTE IV VIAS METABOLICAS E SEU CONTROLE

Insulina Insulina

Y Receptor
G) de insulina

Cascata de Sinalização
mediada por quinases
Cascata de Sinalização
mediada por quinases

i UDP-glicose

Glicose 1–P
UDP-glicose

Glicose 1–P
Glicose 6–P
Glicose 6–P

Membrana Membrana
Glicose plasmática Glicose plasmática

FIGURA 15.63 A insulina age por um receptor de FIGURA 15.64 A insulina age por um receptor de
membrana plasmática para promover glicogénese no membrana plasmātica para promover glicogénese no
musculo. fígado.

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Termos Chaves
6-fosfoſruto-1-quinase efetores alostéricos frutose 2,6-bisfosfatase hexoquinase
6-fosfoſruto-2-quinase enzima bifuncional frutose 2,6-bisfosfato indução e repressão de en
acetil-CoA enzima COrtadora de ramos glicogénese ZlſſlaS

de glicogénio glicogénio insulina

aminoácidos cetogénicos
enzima ramificadora de gli glicogénio fosforilase lactato
aminoácidos glucogénicos
AMP CíclicO
cogénio langadeiras de substrato
glicogénio sintase
anaerobico
epinefrina glicogenina modificação covalente
etanol
ATP glicogenólise oxidação de àcidos graxos
Ciclo de COri fosfoenolpiruvato carboxi glicólise piruvato carboxilase
Quinase
citrato glicose 6-fosfatase piruvato quinase
fosforilação-desfosforilação
diabetes glucagon proteina quinase A
fosforilase quinase
doenças de armazenamen glucoquinase reagóes de óxido-redução
frutose
to de glicogénio gluneogénese UDP-glicose
efeito Pasteur
frutose 1,6-bisfosfato
GLUT 4
664 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha 6. UDP�glicose
1. Glucoquinase A. é formada pela reação entre UTP e glicose.
A. tem um S0,5 maior do que a concentração nor� B. é um intermediário tanto na síntese como na
mal de glicose no sangue. degradação de glicogênio.
B. é encontrada no músculo. C. sua formação é irreversível porque gera piro�
fosfato.
C. é inibida por glicose 6�fosfato.
D. adiciona unidades de glicose a um glicogênio
D. também é conhecida como proteína GLUT�2.
pré�existente nas ligações α�1,6.
E. tem atividade de glicose 6�fosfatase, bem E. é o substrato para a enzima ramificadora.
como atividade de quinase.
2. Atividade de 6�fosfofruto�1�quinase pode ser dimi� Questões 7 e 8: A intoxicação alcoólica pode levar a
nuída por todos os seguintes, exceto hipoglicemia principalmente se o álcool for consumi�
A. ATP em altas concentrações. do por um indivíduo subnutrido ou após exercício ex�
tenuante. Em ambos os casos, a hipoglicemia resulta
B. citrato. dos efeitos inibitórios do álcool sobre a gluconeogênese
C. AMP. hepática e ocorre sob circunstâncias de depleçãoção hepá�hepá�
D. baixo pH. tica de glicogênio. O álcool potencializa o efeito hipogli�hipogli�
E. concentração diminuída de frutose 2,6�bisfos� cemiante da insulina, de forma que diabéticos que se
autoadministraram insulina e em seguida consumiram
fato.
álcooltêm risco aumentado.
3. No ciclo de Cori,
7. O metabolismo do álcool produz grande quantida�
A. somente tecidos com metabolismo aeróbico de de NADH que inibe a gluconeogênese por
(ou seja, mitocôndrias e O2) estão envolvidos. A. deslocar o equilíbrio piruvato�lactato em dire�
B. um composto de três carbonos formado na ção ao lactato.
glicólise é convertido em glicose, às custas da
B. favorecer a produção de oxaloacetato a partir
energia da oxidação de ácidos graxos.
de malato.
C. glicose é convertida em piruvato em tecidos
C. impedir o movimento do fosfoenolpiruvato da
anaeróbicos, e esse piruvato retorna ao fígado,
mitocôndria para o citosol.
onde é convertido em glicose.
D. inibir a cadeia de transporte de elétrons.
D. a mesma quantidade de ATP que éé usadausada nono fí�fí�
E. inibir a lançadeira malato�aspartato.
gado para sintetizar glicose, é liberada durante
a glicólise, levando a um efeito final nulo sobre 8. Insulina promove hipoglicemia por uma variedade
o balanço energético do organismo inteiro. de mecanismos incluindo todos os seguintes, exceto
E. o nitrogênio da alanina deve ser convertido em A. inativação de um fator de transcrição dos ge�
ureia, aumentando a quantidade de energia nes das enzimas gluconeogênicas chaves.
necessária para conduzir o processo.
B. inibição da lipólise no tecido adiposo, dimi�
4. Quando o glucagon do sangue sobe, qual das se� nuindo assim o suprimento de energia para
guintes atividades enzimáticas hepáticas cai? gluconeogênese hepática.
A. Adenilato ciclase. C. redução dos níveis de cAMP.
B. Proteína quinase. D. aumento da ativação da fosfoproteína fosfata�
C. 6�Fosfofruto�2�quinase. se.
E. aumento da atividade da proteína de ligação
D. Frutose 1,6�bisfosfatase.
ao elemento de resposta a cAMP (CREB) e sua
E. Hexoquinase.
ligação com o elemento de resposta a cAMP
5. Glicose 6�fosfatase, que está deficiente na doença (CRE).
de Von Gierke, é necessária para a produção de gli�
cose no sangue a partir de Questões 9 e 10: Hipertermia maligna é uma anoma�
A. glicogênio hepático. lia genética na qual a exposição a certos agentes, es�
pecialmente o anestésico geral amplamente utilizado
B. frutose. halotano, produz um dramático aumento na temperatu�
C. cadeias carbônicas de aminoácidos. ra do corpo, acidose, hipercalemia e rigidez muscular.
D. lactose. Morte é rápida se a condição não for tratada, e pode
ocorrer na primeira vez que uma pessoa susceptível é
E. todos os anteriores.
anestesiada. O defeito causa uma liberação inadequada
 CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
de Ca2+ do retículo sarcoplasmático do músculo. Muitos
processos produtores de calor são estimulados de modo
descontrolado pela liberação de Ca2+, incluindo glicóli�
se e glicogenólise.
9. Ca2+ aumenta glicogenólise por
A. ativação da fosforilase quinase b, mesmo em
ausência de cAMP.
B. ligação com a fosforilase b.
C. ativação da fosfoproteína fosfatase.
D. inibição da fosfoproteína fosfatase.
E. proteção do cAMP de degradação.
10. Fosforilação–desfosforilação e ativação alostérica
A.
de enzimas desempenham papeis no estímulo da
degradação de glicogênio. Todos os seguintes re�
sultam em ativação enzimática, exceto
fosforilação da fosforilase quinase.
B. ligação de AMP à fosforilase b.
C. fosforilação da fosforilase.
D. fosforilação da proteína quinase A.
E. desfosforilação da glicogênio sintase.
Questões 11 e 12: Pacientes com intolerância here�
ditária à frutose são deficientes na forma hepática da
enzima aldolase. O consumo de frutose leva a uma de�
pleção de ATP e Pi no fígado, o que, por sua vez, leva
a lesão celular. Grande parte da lesão celular pode ser
atribuída à incapacidade de manter gradientes iônicos
normais por bombas dependentes de ATP.
Respostas
1. A A concentração de glicose no sangue é �5 mM.
S0,5 da glucoquinase é �7 mM. B: a glucoquinase é
hepática e, ao contrário da hexoquinase muscular,
não é inibida por glicose 6�fosfato.
2. C AMP é um regulador alostérico que alivia a
inibição por ATP. B e D são provavelmente impor�
tantes reguladores fisiológicos no músculo, e E é
crítico no fígado.
3. B O fígado deriva a energia necessária para glu�
coneogênese da oxidação aeróbica de ácidos gra�
xos. A: o fígado é um órgão essencial no ciclo de
Cori; ele é aeróbico. C: em tecidos anaeróbicos, o
produto final da glicólise é lactato; em tecidos ae�
róbicos, é piruvato, mas lá é provável que o piruva�
to seja oxidado aerobicamente. D: gluconeogênese
requer seis moléculas de ATP por glicose sintetiza�
da; glicólise gera duas moléculas de ATP por glico�
se metabolizada.
de Cori. E: alanina não faz parte do ciclo
4. C Quando glucagon do sangue sobe, A é ativada
produzindo cAMP; cAMP ativa B, e B inativa C.
Baixos níveis de frutose 2,6�bisfosfato aumentam
a atividade de D. E não é uma enzima hepática im�
• 665
11. A primeira etapa do metabolismo hepático de fru�
tose é
A. isomerização a glicose.
B. fosforilação a fructose 1,6�bisfosfato por ATP.
C. fosforilação a frutose 1�fosfato por ATP.
D. fosforilação a frutose 6�fosfato por ATP.
E. clivagem pela aldolase.
12. Os produtos inicialmente produzidos pela ação da
aldolase sobre o substrato formado a partir de fru�
tose são
A. duas moléculas de di�hidroxiacetona fosfato.
B. duas moléculas de gliceraldeído 3�fosfato.
C. duas moléculas de lactato.
D. di�hidroxiacetona fosfato e gliceraldeído 3�fosfa�
to.
E. di�hidroxiacetona fosfato e gliceraldeído.
Problemas
13. Se uma célula for forçada a metabolizar glicose
anaerobicamente, quão rapidamente a glicólise te�
ria de ocorrer para gerar a mesma quantidade de
ATP que seria obtida se metabolizasse glicose ae�
róbicamente?
14. O ciclo da alanina requer mais ATP por molécula
de glicose formada do que o ciclo de Cori. Por quê?
portante; seu papel é realizado no fígado pela glu�
coquinase.
5. E Para entrar no sangue, glicose deve estar livre,
não fosforilada. A: glicogênio é degradado a glicose
1�fosfato, que é convertida em glicose 6�fosfato. B:
frutose é metabolizada a di�hidroxiacetona fosfato,
que pode prosseguir na glicólise ou reverter a gli�
cose 6�fosfato, dependendo do estado da célula. C e
D: cadeias carbônicas de aminoácidos e lactato são
substratos para gluconeogênese.
6. C A hidrólise de pirofosfato a fosfato inorgânico
torna a reação irreversível. A: glicose 1�fosfato rea�
ge com UTP. B: é um intermediário da síntese, mas
não da degradação. D: é adicionado apenas em li�
gação α�1,4. E: a enzima ramificadora remove uma
cadeia de unidades glicosil da extremidade de uma
ramificação longa e move para outro lugar.
7. A Lactato deve ser convertido em piruvato para
iniciar a gluconeogênese. B: NADH desloca oxaloace�
tato para malato. C e D: o NADH não está na mi�
tocôndria. E: equivalentes de redução de NADH
podem ser deslocados para a mitocôndria pela lan�
çadeira, mas as grandes quantidades geradas pelo
666 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

metabolismo de álcoolálcool sobrecarregamsobrecarregamsobrecarregam aaa capacida�capacida�capacida� 12. E Gliceraldeído pode ser convertido em gliceral�
de da lançadeira e da oxidação mitocondrial. deído 3�fosfato de modo que os dois produtos ali�
mentam a via glicolítica ou a gluconeogênese.
8. E CREB é ativada por fosforilação (e levaria a
aumento de enzimas gluconeogênicas), mas insu� 13. Anaerobicamente, há um rendimento de 2 moles
lina promove desfosforilação. A: isso é verdade. B: de ATP/mol de glicose. Aerobicamente, o mesmo
gluconeogênese é dependente do suprimento de rendimento de 2 ATPs é obtido, mais 2 NADH, por�
ácidos graxos para o fígado, para fornecer energia. que piruvato é o produto. Vamos assumir que a cé�
C: isso ocorre pela ativação da cAMP fosfodieste� lula use a lançadeira malato�aspartato, onde cada
rase. D: isso promove desfosforilação de enzimas NADH rende 2,5 ATP. Portanto, há um rendimento
chaves, por exemplo, aumentando a síntese de gli� de 7 moles de ATP/mol de glicose. Cada piruvato
cogênio e reduzindo a glicogenólise. é convertido em acetil�CoA, e o AcCoA é oxidado
pelo ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Cada mol de
9. A A subunidade g da fosforilase quinase é uma
piruvato então rende 12,5 moles de ATP ou 25 mo�
proteína tipo�calmodulina. Ambas as formas a e b
da enzima são ativadas por Ca2+. B e E: isso não les de ATP para os 2 piruvatos. Isso dá um total
de 32 moles de ATP/mol de glicose aerobicamente.
acontece. C e D: Ca2+ não afeta a fosfatase.
(Ver Capítulo 14) Portanto, a glicólise deve ocor�
10. D A proteína quinase A catalisa fosforilações, mas rer 16 vezes mais rápido em condições anaeróbicas
é ativada por ligação com cAMP. A e C: ambas as para gerar a mesma quantidade de ATP de quanto
enzimas são fosforiladas em suas formas a. B: fos� ocorre aerobicamente.
forilase b é ativada alostericamente por ligação
14. Ambos os ciclos requerem a mesma quantidade de
com AMP. E: a forma a da sintase é a forma não�
ATP para converter piruvato em glucose (lactato em
�fosforilada.
piruvato e alanina em piruvato). No ciclo da alani�
11. C O ADP formado é convertido em ATP às custas na, o NADH produzido não é utilizado para reduzir
de Pi. A incapacidade de metabolizar mais fruto� piruvato a lactato e poderia ser oxidado pelo siste�
se 1�fosfato resulta em depleção de Pi. A: isso não ma de transporte de elétrons para produzir energia.
acontece. B: isso requeriria duas fosforilações. D: Mas o ciclo alanina deixa no fígado o nitrogênio do
isso não acontece no fígado. E: a frutose deve ser amino, que deve ser descartado como ureia. Isso re�
fosforilada primeiro. quer quatro ATPs por molécula de ureia produzida,
e esse ATP não é consumido no ciclo de Cori.
PARTE IV CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 667
Vias Metabólicas e seu controle

16
Metabolismo H
COO–
O –O SO
3
CH2OH

H
O
O–
H
OH H O H
de Carboidratos II: H

OH
H H

H
H

HNCOCH3
n

Vias Especiais Unidade repetitiva do condroitim 4-sulfato

e Glicoconjugados
Nancy B. Schwartz
Professora Titular, University of Chicago

CONTEÚDO 16.4 Galactosemia: Incapacidade de Transformar

16.1 VIA DAS PENTOSES FOSFATO, 668
16.2 INTERCONVERSÕES DE AÇÚCARES E FOR
MAÇÃO DE AÇÚCAR LIGADO A NUCLEOTÍ
DEO, 672
16.3 BIOSSÍNTESE DE POLISSACARÍDEOS COM
PLEXOS, 676
16.4 GLICOPROTEÍNAS, 678
16.5 PROTEOGLICANOS, 683
CORRELAÇÕES CLÍNICAS
16.1 Deficiência de Glicose 6-Fosfato Desidrogenase,
669
16.2 Síndrome de Wernicke–Korsakoff: Anomalias
Associadas e Atividade de Transcetolase, 671
16.3 Frutosúria Essencial e Intolerância a Frutose:
Deficiência de Frutoquinase e de Frutose 1-Fos
fato Aldolase, 673
Galactose em Glicose, 674
16.5 Pentosúria: Deficiência de Xilitol Desidrogenase;
L-Xilulose Redutase, 675
16.6 O Ácido Ascórbico (Vitamina C) É Derivado de
Ácido Glucurônico, 675
16.7 Ácido Glucurônico: Significado Fisiológico da
Formação de Glucuronídeos, 675
16.8 Substâncias dos Grupos Sanguíneos, 678
16.9 Doenças Congênitas de Glicosilação (CDGs, con
genital disorders of glycosylation), 681
16.10 Defeitos no Catabolismo de Glicoproteínas, 682
16.11 Doenças de Glicolipídeos, 683
16.12A Heparina É um Anticoagulante, 683
16.13 Condrodistrofias Decorrentes de Defeitos de
Sulfatação, 686
16.14 Mucopolissacaridoses, 687

Conceitos Chaves
• A fosforilação da glicose mediada por hexoquina glicose-6-fosfato como NADPH, ao passo que a gli
ses produz glicose-6-fosfato, que tem papel funda cólise promove produção de energia.
mental como precursor comum para diversas vias
• A via pentose fosfato fornece ribose 5-fosfato para
metabólicas que utilizam glicose.
a síntese de ácidos nucleicos.
• O metabolismo de glicose-6-fosfato pela via das
• A via das pentoses fosfato degrada a molécula de açú
pentoses fosfato conserva os equivalentes redox de
car um carbono de cada vez, em duas fases distintas.
668 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
• A primeira etapa, e limitante da velocidade, na via
das pentoses fosfato é catalisada pela glicose-6
-fosfato desidrogenase, que oxida glicose-6-fosfato
a 6-fosfogluconato.
• A maioria dos componentes açúcares de biomolé
culas é derivada da glicose por uma variedade de
transformações químicas e interconversões. Açú
cares ligados a nucleotídeos são elementos chave
para muitas transformações de açúcares, assim
como para a síntese de polissacarídeos complexos.
• Oligo- ou polissacarídeos são ligados a proteínas
por um número limitado de ligações N- ou O-glico
sil em glicoproteínas e proteoglicanos.
16.1 VIA DAS PENTOSES
FOSFATO
A Via das Pentoses Fosfato Tem
Duas Fases
A via das pentoses fosfato fornece um meio para de
gradar a cadeia carbônica de uma molécula de açúcar,
um carbono de cada vez. Contudo, essa via não constitui
um conjunto de reações consecutivas que levam direta
mente ao CO2, mas ocorre em duas fases. Na primeira,
a hexose é descarboxilada a pentose por duas reações
de oxidação que formam NADPH; na segunda, por uma
série de transformações, seis moléculas de pentose so
frem rearranjos para gerar cinco moléculas de hexose.
Oxidação de Glicose 6-Fosfato
Conserva Equivalentes Redox como
NADPH e a Descarboxilação Fornece
Pentoses Fosfato
A primeira reação catalisada pela glicose 6-fosfato
(G6P) desidrogenase (Figura 16.1) é a desidrogenação
da G6P para formar 6-fosfoglucono-δ-lactona e NA
DPH, e é um importante ponto regulatório dessa via. O
interesse especial nessa enzima advém da severa ane
mia que pode resultar da ausência de G6P desidrogena
se em eritrócitos ou da presença de uma das muitas va
riantes genéticas da enzima (Correlação Clínica 16.1).
A lactona produzida nessa reação é um substrato para
a gluconolactonase, o que garante que a reação ocorra
por completo. O equilíbrio geral de ambas as reações
fica muito deslocado na direção do NADPH, mantendo
uma alta razão NADPH/NADP+ nas células. Uma se
gunda desidrogenação e descarboxilação, catalisada
pela 6-fosfogluconato desidrogenase, produz a pentose
fosfato ribulose 5-fosfato e uma segunda molécula de
NADPH. A ribulose 5-fosfato é, então, isomerizada a
ribose 5-fosfato por meio de um intermediário enediol.
• A N-glicosilação envolve uma via de montagem
ligada ao dolicol e uma via de processamento em
multi-compartimentos celulares.
As estruturas dos glicanos modulam numerosas
•
interações moleculares como sinalização celular,
adesão e ativação de receptor.
• Doenças genéticas da glicosilação causam ampla
variação de fenótipos, com exemplos em todas as
especialidades médicas. Muitas doenças genéticas
do metabolismo de carboidratos complexos resul
tam de deficiências de glicosidases.
Em certas condições metabólicas, a via das pento
ses fosfato pode terminar nesse ponto, com utilização
do NADPH para reações biossintéticas redutoras e da
ribose 5-fosfato como um precursor na síntese de nucleo
tídeos. A equação geral pode ser escrita como
ribose
Glicose
5-fosfato
6-fosfato
+2+ NADPH
2 NADP+++2H+
H2O+CO

2
Interconversões de Pentoses Fosfato
Levam a Intermediários da Glicólise
Se for necessário mais NADPH para biossíntese re
dutora do que ribose 5-fosfato para incorporação em
nucleotídeos, um sistema de interconversão de açúca
res (Figura 16.2) formará açúcares trioses, tetroses,
hexoses e heptoses a partir das pentoses, e fornecerá
uma ligação reversível entre a via das pentoses fosfato
e a glicólise, por meio de intermediários comuns. Xilu
lose 5-fosfato é formada por isomerização da ribulose
5-fosfato pela fosfopentose epimerase, de modo que
ribulose 5-fosfato, ribose 5-fosfato e xilulose 5-fosfa
to existem como uma mistura em equilíbrio e podem
sofrer transformações catalisadas por transcetolase e
transaldolase.
A transcetolase requer tiamina pirofosfato (TPP) e
cátions divalentes, transfere uma unidade C2 de glico
aldeído ativo de xilulose 5-fosfato para ribose 5-fos
fato e produz sedo-heptulose e gliceraldeído 3-fosfato,
um intermediário da glicólise. Alterações na transce
tolase podem levar à síndrome de Wernicke-Korsakoff
(Correlação Clínica 16.2). A transaldolase transfere
uma unidade C3 (di-hidroxiacetona) da sedo-heptulose
7-fosfato para o gliceraldeído 3-fosfato, formando eri
trose 4-fosfato e frutose 6-fosfato, outro intermediário
da glicólise. A transcetolase produz frutose 6-fosfato e
gliceraldeído 3-fosfato, a partir de eritrose 4-fosfato e
xilulose 5-fosfato. A soma dessas reações é
2 Xilulose 5-fosfato + ribose 5-fosfato 
2 frutose 6-fosfato + gliceraldeído 3-fosfato
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 669

NADP+ NADPH + H+
Deficiência
A deficiência de glicose-6-fosfato
de Glicose
Desidrogenase
CORRELAÇÃO 6-Fosfato
CLÍNICA 16.1 desidrogena- CH2OPO32– CH2OPO32–
H H
OH O OH HO
HO H 6-fosfato
glicose OH
H H O
H HO
H OH desidrogenase H OH

Glicose
das
para
se da
homem
dessa
é
normal
tretanto,
mentar
ficiência
mente
estiver
disso,
assim, eade
as
(G6PD)
glutationa
de pode
seéem
ao
particularmente
NADPH
pentoses
manter
membrana
enzima
leve,
proteger
quando
aumentada,ligadas
velocidade
células
reduzida
podem
G6P não
as
defeito
aestar
glutationa
fosfato ao
da
presente
velocidadeaenzimático
eritrócitos.
contra
demanda via
desidrogenase
dos Os
importante,
oxidar
éé
eritrócitos,
necessária
areduzem
células
em uma
do
não
em
peroxidação
principal
cromossomo
de
glicose
deseu mais
via
apara
uma
até 400
de
adequadamente.
utilização
NADPH
eritrócitos
estado
tornando
NADP+
tipo A,
comum
conseguem
vez
éX.
de milhões
anormal.
reduzido
de
velocidade
lipídeos.
com no
via
au-
a En-
integrida-
suficiente
A
que
produção
assim
relativa-
NADPH
enzima
Além
de-
os
e,
A 6-fosfato 6-Fosfoglucono-δ-lactona

de
140 As manifestações
aminoácidos,
mas.pessoas
mutações noforam
causando
mundo
descritas
clínicas
inteiro. mais
amplanessa
variedade de de
Aproximadamente
proteína
frequentes da
sinto-
516 C 6-fosfo- H2O
gluco-lactonase

H+

mia
da nana
um
hemolítica
deficiência
antipiréticos
administrados
aparentemente
susceptibilidade
drogas
ciência
sidrogenase
indicações
por
hemolítica
é, que
aguda,
atividade
de
agente
de
em
maioria
ou
G6PD
aaguda de
das
são
eritrócitos,
inofensivas,
àantibióticos
pacientes
exógeno.
doença
que
existem
pode
glicose
éicterícia
vezes, uma
geralmente
hemolítica
eocorrer emdas
susceptíveis,
Quando
deficiências
foi
como
a 6-fosfato
devida
base
neonatal48-96
certasuma
antimaláricos,
de
induzida
desencadea-
a (G6P) de-
são
primeiras
sulfa
genéticas
e drogas,
anemia
hs.
ane-
defi-
por
A O O–
C

HC OH

HOC H

H C OH

HC OH

HCOPO32–

6-Fosfogluconato

NADP+
6-fosfogluconato
desidrogenase CO2
NADPH + H+

O H H

HCOH

HC
H H
HCOPO32–
HCOH
C OH C O

HCOH
isomerase
ribose5-fosfato
HC
+
OH

HCOPO32–

eritrócitos deficientes na enzima mais susceptíveis
à hemólise por uma ampla variedade de compostos.
Essa deficiência ilustra a interação de hereditarie
dade e ambiente na produção de doença. A conduta
mais efetiva na deficiência de G6PD é prevenir a he
mólise evitando o estresse oxidativo. A deficiência
completa de G6PD é letal.
Luzzatto, L., Mehta, A. e Vulliamy, T. Glucose 6-phos
phate dehydrogenase deficiency. Em: Scriver, C. R., Beau
det, A. R., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.). The Metabolic and
Molecular Bases of Inherited Disease, 8. ed., New York:
McGraw-Hill, 2001, III, 4517; e Cappellini, M. D., and Fio
relli, G. Lancet 371:64, 2008.
H
Ribose 5-fosfato Ribulose 5-fosfato
FIGURA 16.1 Fase oxidativa da via das pentoses fosfato:
formação de pentoses fosfato e NADPH.
Como a xilulose 5-fosfato é derivada da ribose 5-fos
fato, a reação final começando com ribose 5-fosfato é
3 Ribose 5-fosfato 
2 frutose 6-fosfato + gliceraldeído 3-fosfato
Portanto, o excesso de ribose 5-fosfato, produzido
no primeiro estágio da via das pentoses fosfato ou a par
tir da degradação de ácidos nucleicos, é eficientemente
convertido em intermediários da glicólise.
670 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

HCOH
H

HOHC
Ribose
H
HCOH
O CH
5-fosfato
C HOH
OPO3
H
O HC
O C HC
H HOPO3
OH
C OPO3
OH
C O

HOCH

HCOH

HCOPO32–
HC
Ribulose
H
HCOH
H
CC5-fosfato
OH
OPO3
O fosfopentoseisomerase
fosfopentose
epimerase H transcetolase HC OPO3 transaldolase H
2– HC
Gliceraldeído
H 3-fosfato
OH 2–

Frutose 6-fosfato

+
tra O + H
H C

H C OH
2– 2–
C O HCOH
HO
HCOH
C H H C OPO3

HC
H C OH Eritrose 4-fosfato
Xilulose H
5-fosfato H HC OH

2– + H

Sedo-heptulase 7-fosfato C O

H 2– neslatoesc HO C H

H C OH

HC OPO32–
H C OH O H
H
C
HC
HO
HCOH
H C
C H
OH
OPO3
O
Xilulose 5-fosfato

2–

Gliceraldeído 3-fosfato
2–

FIGURA 16.2 Reações não-oxidativas da via H

das pentoses fosfato: interconversões de
pentoses fosfato. Frutose 6-fosfato

Glicose 6-Fosfato Pode Ser para gerar cinco moléculas de G6P. A equação geral, en
tão, se torna
Completamente Oxidada a CO2
5 glicose
6 glicose
6-fosfato
6-fosfato
+ 6 CO12
+ 2 + NADP+
12 NADPH
+ 7 H2O
+ 12
A completa oxidação da glicose 6-fosfato (G6P) a H+ + Pi
CO2, com redução de NADP+ a NADPH, também pode
ocorrer (Figura 16.3). G6P entra continuamente nessa E a reação final é
via, e CO2 e NADPH são produzidos na primeira fase.
glicose 6-fosfato + 12 NADP+ + 7 H2O 
Uma equação balanceada inclui a oxidação de seis mo
6 CO2 + 12 NADPH + 12H+ + Pi
léculas de G6P a seis moléculas de ribulose 5-fosfato
e seis de CO2. Isso resulta na transferência de 12 pa
res de elétrons para o NADP+, a quantidade necessária
para oxidação total de uma glicose em seis CO2. As seis
moléculas de ribulose 5-fosfato são, então, rearranjadas
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 671

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.2

Síndrome de Wernicke–Korsakoff (OMIM
277730): Anomalias Associadas e Atividade de
Transcetolase
Os sintomas da síndrome de Wernicke–Korsakoff
surgem após estresse moderado, que não afeta indi
víduos normais, e depois uma anomalia na transceto
lase tenha sido observada. A clonagem e sequencia
mento do gene da transcetolase parecem excluir um
defeito genético. Ao contrário, a disfunção da trans
cetolase pode estar relacionada a uma deficiência de
tiamina, visto que a transcetolase utiliza tiamina fos
fato como um cofator. A síndrome apresenta-se como
uma doença mental, com perda de memória e para
lisia parcial, e pode se manifestar em alcoólatras,
cuja dieta pode ser deficiente em vitaminas. A impor
tância médica da via das pentoses fosfato é também
ressaltada pelas deficiências de transaldolase, que
estão vinculadas a um espectro de doenças clínicas,
incluindo cirrose hepática e infertilidade masculina.
Perl, A. The pathology of transaldolase deficiency. Life
59:365, 2007.
Via das Pentoses Fosfato Serve
como um Sistema Regenerador de
NADPH e Fornecedor de Pentoses
Fosfato
A via das pentoses fosfato serve a vários propósitos,
incluindo síntese e degradação de açúcares que não são
hexoses, particularmente ribose 5-fosfato para a sínte
se de nucleotídeos e síntese de NADPH. O fluxo de pro
cessamento de G6P, após a entrada na via, é determi
nado, em grande parte, pelas necessidades da célula de
NADPH ou dos açúcares intermediários. Quando mais
NADPH do que ribose 5-fosfato é necessário, a via le
de
vando
G6Pàacompleta
partir deoxidação
ribulose 5-fosfato
de G6P aéCOfavorecida.
2 e à ressíntese
Alter
nativamente, se a demanda de NADPH for relativamen
te baixa, a conversão de G6P em ribulose 5-fosfato para
síntese de ácidos nucleicos ou reciclagem para produzir
intermediários da via glicolítica predomina.
A distribuição tecidual da via das pentoses fosfato é
consistente com suas funções. NADPH, necessário para
manter a glutationa reduzida, que protege a integridade
das membranas dos eritrócitos, é produzido nos eritró
citos, assim como no fígado, na glândula mamária, no
testículo e na córtex adrenal, que são locais de síntese
de ácidos graxos ou de esteroides. O equilíbrio entre
a entrada de glicose na glicólise ou a via das pentoses
fosfato depende das necessidades metabólicas do órgão.
proveniente da viadodas
Cerca de 20–30% CO2pentoses
produzido
fosfato.
no fígado
No pode ser
músculo
estriado de mamíferos, que realiza pouca síntese de
ácidos graxos e esteroides, todo o catabolismo de G6P
ocorre via glicólise e ciclo TCA, com nenhuma oxidação
direta de glicose 6-fosfato na via das pentoses fosfato.

ATP ADP (6) NADP+ (6) NADPH + (6) H+ H2O

Glicose (6) Glicose 6-fosfato 6-Fosfogluconolactona 6-Fosfogluconato

(6) NADP+

(6) CO2 (6) NADPH + (6)H+

(6) Ribulose 5-fosfato

(4) Xilulose 5-fosfato (2)Ribose 5-fosfato

(2) Frutose 6-fosfato

(2) Gliceraldeído 3-fosfato + (2) Sedo-heptulose 7-fosfato

+

Gliceraldeído 3-fosfato

(2) Eritrose 4-fosfato + (2) Frutose 6-fosfato

FIGURA 16.3 Via das pentoses fosfato.

672 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

16.2 INTERCONVERSÕES DE por uma frutoquinase especial. Entretanto, nenhuma

mutase interconverte frutose 1-fosfato e frutose 6-fos
AÇÚCARES E FORMAÇÃO fato, e a fosfofrutoquinase não pode sintetizar frutose
1,6-bisfosfato a partir de frutose 1-fosfato. Em vez dis
DE AÇÚCAR LIGADO A so, a frutose 1-fosfato aldolase quebra a frutose 1-fos
NUCLEOTÍDEO fato em di-hidroxiacetona fosfato (DHAP), que entra
diretamente na via glicolítica, e o gliceraldeído, que é
A maioria dos monossacarídeos encontrados em primeiro reduzido a glicerol, fosforilado e, então, reoxi
compostos biológicos deriva da glicose. As transforma dado a DHAP (Figura 15.39). A falta dessa aldolase leva
ções de açúcares mais comuns em sistemas de mamífe à intolerância à frutose (Correlação Clínica 16.3).
ros são resumidas na Figura 16.4.

Açúcares Ligados a Nucleotídeos

Isomerização e Fosforilação São
Reações Comuns para Interconverter
Carboidratos
A formação de alguns açúcares pode ocorrer dire
tamente, começando com glicose, por reações de mo
dificações, como a isomerização aldose-cetose catali
sada pela fosfomanose isomerase, que produz manose
6-fosfato. A deficiência dessa enzima leva a uma forma
da síndrome de doenças congênitas da glicosilação
(CDGS, congenital disorders of glycosilation syn
drome) (p. 681).
A fosforilação e a transferência interna de um gru
po fosfato na mesma molécula de açúcar são também
modificações comuns. A glicose 1-fosfato, resultante da
glicogenólise, é convertida em G6P pela fosfoglucomu
tase. Galactose é fosforilada a galactose 1-fosfato pela
galactoquinase, e manose a manose 6-fosfato pela ma
noquinase. A frutose livre, um importante constituin
te da dieta, é fosforilada no fígado a frutose 1-fosfato,
São Intermediários em Muitas
Transformações de Açúcares
Muitas reações de transformação de açúcares re
querem conversão em açúcares ligados a nucleotídeos.
Uma pirofosforilase une hexose 1-fosfato e nucleosídeo
trifosfato (NTP) para produzir um nucleosídeo difos
fato (NDP)-açúcar e pirofosfato. Pirofosfatase rapida
mente hidrolisa o pirofosfato, direcionando, assim, a
reação de síntese. Essas reações são resumidas como
segue:
NTP + açúcar 1-fosfato + H2O  NDP-açúcar + PPi
PPi + H2O  2 Pi
A reação final é
NTP + açúcar 1-fosfato + H2O  NDP-açúcar +2 Pi
Por exemplo, UDP-glicose é usado na síntese de
glicogênio e glicoproteínas e é sintetizado pela UDP
-glicose pirofosforilase.

Galactose Glicose Frutose Manose

ATP ATP ATP ATP

Galactose 1-P Glicose 6-P Frutose 6-P Manose 6-P

UTP or UDP-glicose Glucosamina
glutamina
6-P Manose 1-P
UDP-galactose UDP-glicose Glicose 1-P
NAD UTP TTP GTP
Ácido dTDP-glicose N-Acetilglucosamina 6-P GDP-manose
UDP-glucurônico
NADH NADH
–CO2 N-Acetilgalactosamina 1-P GDP-fucose
dTDP-ramnose
UDP-xilose
UTP
UDP-N-acetilgalactosamina UDP-N-acetilglucosamina

N-Acetilmanosamina
ATP
N-Acetlmanosamina 6-P
fosfoenolpiruvato
Ácido N-Acetilneuramínico 9-P

–Pi
Ácido CMP-N-acetilneuramínico CTP ÁcidoN-Acetilneuramínico

FIGURA 16.4 Vias de formação de açúcares ligados a nucleotídeos e interconversões de algumas hexoses.
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 673

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.3

Frutosúria Essencial (OMIM 229800) e Intolerância a Frutose (OMIM 229600): Deficiência de Frutoquinase
e de Frutose 1-Fosfato Aldolase
A Frutose pode corresponder a 30–60% do total de
carboidratos ingeridos por mamíferos, e é predominan
temente metabolizada por uma via frutose-específica.
A frutoquinase está deficiente na frutosúria essencial.
Essa doença é uma anomalia metabólica assintomática
benigna, que parece ser herdada como um traço autos
sômico recessivo. Após a ingestão de frutose, os níveis
sanguíneos e urinários de frutose dos indivíduos afeta
dos ficam excepcionalmente elevados; contudo, 90% da
frutose ingerida por eles é eventualmente metabolizada.
Diferentemente, a intolerância hereditária à frutose é
caracterizada por grave hipoglicemia, icterícia, hemor
ragia, hepatomegalia, uricemia e eventual insuficiência
renal. A ingestão de frutose ou a ingestão prolongada
por crianças pequenas afetadas pode levar à morte. A
frutose 1-fosfato aldolase pode também estar deficiente,
situação na qual frutose 1-fosfato acumula-se dentro das
células (ver Correlação Clínica 15.3, p. 626).
Steinmann, B., Gitzelmann, R. e Vanden Berghe, G. Disor
ders of fructose metabolism. Em: Scriver, C. R., Beaudet, A.
R., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.). The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8. ed. New York: McGraw-Hill,
2001, I:1489.

HOCH2 pela galactoquinase e ATP, para formar galacto

HO
H H H
O se 1-fosfato. Então, a galactose 1-fosfato uridilil
H O O O O transferase forma UDP-galactose, pela galactose
OH OPO– + 1-fosfato deslocando glicose 1-fosfato de UDP
–O P O P O PO Uridina
-glicose. Essas reações são resumidas como se
H OH O– O– O– O– segue:
Glicose
galactose + ATP  galactose 1-fosfato + ADP
HOCH2
UDP-glicose + galactose 1-fosfato 
H H O
HH OUDP-glicose
O UDP-galactose + glicose 1-fosfato
OH
H OH OPOPO
O– O–
HO Uridina + PPi
A galactose da dieta pode ser transformada por uma
combinação dessas reações em glicose 1-fosfato e meta
bolizada como anteriormente descrito, ou a 4-epimera
se pode produzir a UDP-galactose necessária para bios
síntese. Uma forma grave de galactosemia hereditária
resulta de ausência da uridililtransferase (Correlação
Os nucleosídeos difosfato-açúcares são constru
Clínica 16.4).
ções importantes: eles contêm duas ligações fosforil,
cada uma com um AG de hidrólise negativo grande, que
ressalta seu valor como doadores de glicosil em trans HOCH2
H H
HO H O
formações e reações de transferência subsequentes, e H O O
conferem especificidade de substrato nessas reações. OH OPOPOUridina
UDP é geralmente o transportador de glucosil, enquan
to ADP, GDP e CMP são transportadores de outros açú H OH O– O–
cares. Muitas reações de transformação de açúcares UDP-glicose
ocorrem no nível de açúcares ligados a nucleotídeos
(Figura 16.4).
UDP-glicose-4
epimerase

Epimerização Interconverte Glicose HOCH2

HO H O
e Galactose Ligadas a Nucleotídeo H O O
H OH H OPOPOUridina
A interconversão de glicose e galactose em células
animais ocorre por epimerização de UDP-glicose em H OH O– O–
UDP-galactose, catalisada pela UDP-glicose-4-epime UDP-Galactose
rase (Figura 16.5). A UDP-galactose também é forma
da a partir de galactose livre, derivada da hidrólise de
lactose no trato intestinal. A galactose é fosforilada FIGURA 16.5 Conversão de glicose em galactose.
674 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.4

Galactosemia: Incapacidade de Transformar Galactose em Glicose

As reações da galactose são de particular interes
se porque, no homem, estão sujeitas a defeitos genéti
cos que produzem a doença hereditária galactosemia.
Quando há um defeito, os indivíduos são incapazes de
metabolizar a galactose derivada da lactose (açúcar
do leite) em metabólitos da glicose, o que, frequente
mente, resulta em formação de catarata, crescimento
deficiente, retardo mental ou eventual morte por lesão
hepática. Esses fenótipos podem ser devidos a uma defi
ciência celular de galactoquinase (Tipo 2, gene GALK1)
(OMIM 230200), causando uma doença relativamente
leve, caracterizada por formação precoce de catarata;
de galactose 1-fosfato uridililtransferase (Tipo 1, gene
GALT) (OMIM 606999), resultando em doença grave;
ou de deficiência da UDP galactose-4-epimerase (Tipo
3, gene GALE) (OMIM 230350). A galactose é reduzida
a galactitol em uma reação semelhante à de glicose em
sorbitol. O galactitol inicia a formação de catarata no
cristalino e pode desempenhar um papel na lesão do
sistema nervoso central. O acúmulo de galactose 1-fos
fato é responsável pela insuficiência hepática; os efei
tos tóxicos dos metabólitos de galactose desaparecem
quando galactose é removida da dieta.
Petry, K. G. e Reichardt, J. K. The fundamental importan
ce of human galactose. Trends Genet. 14:98, 1998; Scriver,
C. R., Beaudet, A. L., Valle, D., Sly, W. S., Vofelstrin, B. e Kinz
ler, K.W. Galactosemia Online Metabolic and Molecular Basis
of Inherited Disease (http://www.ommbid.com/). New York:
McGraw Hill, 2006.

A síntese de GDP-fucose (ver Figura 16.4) começa *OLFRVH

com a conversão de GDP-manose em GDP-4-ceto-6
-desoximanose pela GDP-manose-4,6-desidratase, se *OLFRVHIRVIDWR
guida por sua epimerização a GDP-4-ceto-6-desoxi-L
-galactose e, finalmente, redução a GDP-fucose. Essas
*OLFRVHIRVIDWR
últimas reações são catalisadas pela GDP-4-ceto-6
-desoximanose 3,5-epimerase-4-redutase bifuncional
(proteína FX), que é abundante em eritrócitos. A epi 8'3JOLFRVH
merização do ácido D-glucurônico em ácido L-idurôni
co ocorre após a incorporação do primeiro em heparina
ÉFLGR8'3JOXFXU{QLFR
e dermatam sulfato (p. 684).

ÉFLGR'JOXFXU{QLFRIRVIDWR
Ácido Glucurônico É Formado por
Oxidação de UDP-Glicose ÉFLGR'JOXFXU{QLFR

FIGURA 16.6 Biossíntese do ácido D-glucurônico a partir

A síntese do ácido glucurônico a partir de glicose é de glicose.
resumida na Figura 16.6. Uma etapa crítica é a oxidação
de UDP-glicose pela UDP-glicose desidrogenase (Figu HOCH2
H H H
ra 16.7). O ácido glucurônico é reduzido por NADPH a HO O H OPO
ácido L-gulônico (Figura 16.8). O ácido gulônico pode H H O O
ser oxidado a ácido 3-cetogulônico e descarboxilado OH POUridina

a L-xilulose. No homem, a L-xilulose é a cetopentose

OH Oi Oi
excretada na pentosúria essencial (Correlação Clínica
8'3JOLFRVH
16.5). A L-xilulose é normalmente reduzida a xilitol, +
reoxidada a D-xilulose e fosforilada a xilulose 5-fosfa 2 NAD+
to, que pode entrar na via das pentoses fosfato descrita
anteriormente. O ácido glucurônico é também um pre
COOH
cursor do ácido L-ascórbico (Figura 16.8) nos animais
HO
H OH O O
que sintetizam vitamina C (Correlação Clínica 16.6). O
acido glucurônico também participa na desintoxicação OH OPOPOUridina
pela formação de conjugados glucuronídeos (Correla
ção Clínica 16.7). A via do ácido glucurônico opera no OH Oi Oi
tecido adiposo, e sua atividade, geralmente, está au ÉFLGR8'3JOXFXU{QLFR
mentada em tecidos de animais em jejum ou diabéticos. +
2 NADH + 2 H+

FIGURA 16.7 Formação de ácido UDP-glucurônico a partir

de UDP-glicose.
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 675

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.5

Pentosúria (OMIM 260800): Deficiência de Xilitol Desidrogenase; L-Xilulose Redutase

A via de oxidação do ácido glucurônico parece não
ser essencial para o metabolismo humano de carboidra
tos, uma vez que indivíduos nos quais a via está bloquea
da não sofrem nenhum efeito negativo. Uma variação
metabólica, chamada pentosúria idiopática, resulta de
atividade reduzida da L-xilulose redutase NADP-ligada,
que reduz xilulose a xilitol. Assim, os indivíduos afeta
dos excretam grandes quantidades de pentose na uri
na, especialmente após ingestão de ácido glucurônico.
Hiatt, H. 2001. Pentosuria. Em: Scriver, C. R., Beaudet, A.
R., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.), The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8. ed. New York: McGraw-Hill,
2001, I: 1589.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.6

O Ácido Ascórbico (Vitamina C) É Derivado de Ácido Glucurônico

O ácido glucurônico é reduzido a ácido L-gulônico tona em ácido L-ascórbico, e, para eles, o ácido ascór
e então convertido, pela L-gulonolactona, em ácido bico é uma vitamina. A falta de vitamina C na dieta
L-ascórbico (vitamina C) em plantas e na maioria dos causa o escorbuto, uma condição de tecidos conjun
animais superiores. O homem, outros primatas, e as tivos que leva a múltiplas hemorragias e cicatrização
cobaias não têm a enzima que converte L-gulonolac deficiente.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.7

Ácido Glucurônico: Significado Fisiológico da Formação de Glucuronídeos

O significado biológico do ácido glucurônico inclui
sua conjugação com certas substâncias endógenas e
exógenas para formar glucuronídeos, em uma reação
catalisada pela UDP-glucuroniltransferase. A conjuga
ção com ácido glucurônico produz um composto forte
mente acídico, que é mais solúvel em água no pH fisio
lógico do que seu precursor, aumentando, assim, seu
transporte ou excreção. A formação de glucuronídeos
é importante na desintoxicação de drogas, na excre
ção de esteroides e no metabolismo de bilirrubina. A
bilirrubina é o principal produto metabólico da quebra
do heme, o grupo prostético da hemoglobina. A etapa
central na excreção de bilirrubina é a conjugação com
ácido glucurônico pela UDP-glucuroniltransferase.
Essa enzima pode levar de vários dias a duas sema
nas após o nascimento para se tornar completamen
te ativa no homem. A maioria dos casos de icterícia
fisiológica do recém-nascido resulta da incapacida
de do fígado do recém-nascido para formar glucuro
nídeo de bilirrubina a uma velocidade comparável à
da produção de bilirrubina. A cepa mutante de ratos
Wistar Gunn tem uma deficiência de UDP-glucuronil
transferase, o que resulta em hiperbilirrubinemia he
reditária. No homem, um defeito semelhante ocorre na
icterícia não-hemolítica congênita familiar (síndrome
de Crigler-Najjar); os pacientes são incapazes de con
jugar eficientemente compostos exógenos com ácido
glucurônico.
Chowdhury, J. R., Wolkoff, W., Chowdhury, N. R., e Arias,
I. W. Hereditary jaundice and disorders of bilirubin metabo
lism. Em: Scriver, C. R., Beaudet, A. R., Sly, W. S., e Valle,
D. (Eds.). The Metabolic and Molecular Bases of Inherited
Disease, 8. ed. New York: McGraw Hill, 2001, II: 3063.

Descarboxilação, Óxido-Redução desidrogenase (Figura 16.7), regulando assim o nível

desses precursores açúcares ligados a nucleotídeos por
e Transaminação de Açúcares Dão um sensível mecanismo de retroalimentação.

Produtos Necessários Desoxi-hexoses e didesoxi-hexoses são também sin

A única descarboxilação conhecida de um açúcar
ligado a nucleotídeo é a conversão de ácido UDP-glu
curônico em UDP-xilose, que é necessário para a sínte
se de proteoglicanos (p. 683) e é um potente inibidor da
produção de ácido UDP-glucurônico pela UDP-glicose
tetizadas a partir de açúcares precursores ligados a nucleo
sídeos difosfatos. A L-Ramnose é sintetizada a partir de
glicose por uma série de reações de oxidação-redução, co
meçando com dTDP-glicose e gerando a dTDP-ramnose; a
GDP-fucose é sintetizada de forma semelhante a partir da
GDP-manose, assim como várias didesoxi-hexoses.
676 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

A formação de aminoaçúcares, H H
nismo
6-fosfato
componentes
6-fosfato
polissacarídeos
e
re constituintes
por
A glucosamina
(Figura
transamidação;
ée formada
glutamina
importantes
16.9).
de
complexos
6-fosfato
aantibióticos,
partir
por
a glucosamina
esse
de
de
pode
humanos
oligo-
frutose
meca-
ocor-
ser
e H C OH HC OH H CC OH

NADPH HC OH HCC OH
H C OH
HOC
CO
desidrogenase
L-gulônico O–
HO
H C H
OH O H C H

H C OH C OH

H C H C OH O C OH

O OC
O–
N-acetilada a N-acetilglucosamina Ácido D-Glucurônico Ácido L-Gulônico Ácido L-Ascórbico
6-fosfato, seguida por isomerização a
N-acetilglucosamina 1-fosfato e forma β-L-hidroxiácido desidrogenase
ção subsequente de UDP-N-acetilglu
NAD+
cosamina. O último é um precursor da
síntese de glicoproteínas e de UDP-N
-acetilgalactosamina, que é necessária
H ATP H H
para a síntese de proteoglicanos. A fru
na
Ácidos
São
N-Acetilglucosamina
tose
está
negativaDerivados
Siálicos
significativa
pele,
20%(ver
6-fosfato-glutamina
sob
do
onde
Figura
fluxo
controle
por
essa
em
de de
UDP-N-acetilglucosami-
16.4).
glicose.
via
certos
decorresponde
retroalimentação
Essa
tecidos
transamidase
regulação
como
a até
éa H C OH xilulose quinase HC OH HC OH
NADPH HC –CO2 C O
HCOH HC OH HC OH

HOCH redutase
xilulose HO C H β-ceto-L-gulonatodescarboxilase HO C H

H C OH CC O O

HCOH HC OH HC OH

H
O–
Xilitol L-Xilulose Ácido 3-Cetogulônico

NAD+

H H

mínico,
de Outroum
glucosamina
açúcares
produto
membro
C9
é o ácido uma família
dadeN-acetilneura-
UDP-N-acetil- HC OH H C OH

C O C O

HO C H HO C H
de (Figura 16.10).
2-epimerase
licos
UDP-N-acetilglucosamina
produz
chamados por uma
AN-acetilmano-
epimerização
ácidos siá- H HC
HC OH OH
OPO3 Via das pentoses fosfato

H C OH 2–

H
samina. Essa reação provavelmente
ocorre por trans eliminação de UDP D-Xilulose Xilulose 5-fosfato

e formação do intermediário insatu FIGURA 16.8Via de oxidação do ácido glucurônico.

rado 2-acetamidoglucal. Em tecidos
de mamíferos, a N-acetilmanosamina é fosforilada a siltransferases específicas que transferem a unidade
N-acetilmanosamina 6-fosfato, que condensa com fos glicosil do nucleotídeo derivado para a extremidade
foenolpiruvato para formar ácido N-acetilneuramínico não-redutora de um açúcar aceptor. Mais de 180 genes
9-fosfato. Segue-se a remoção do fosfato e a formação de glicosiltransferases foram identificados. Uma dada
de ácido CMP-N-acetilneuramínico. Todas essas reações glicosiltransferase é específica para o açúcar aceptor, o
ocorrem no citosol, com exceção da última que ocorre açúcar transferido e a ligação formada. Uma reação de
no núcleo, com subsequente exportação do ácido CMP glicosiltransferase é como se segue:
-N-acetilneuramínico para o citoplasma.
Nucleosídeo-difosfato-glicose glicose
(doador) (aceptor)
16.3 BIOSSÍNTESE DE glicosiltransferase

POLISSACARÍDEOS glicosil1-O-glicose2 + nucleosídeo

+ difosfato
COMPLEXOS (glicosídeo)
Os resíduos de açúcares nos polissacarídeos são Mais de 40 tipos de ligações glicosídicas foram iden
ligados por ligações glicosídicas, formadas por glico tificados em oligossacarídeos de mamíferos, e cerca de
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 677

NH2 C(CH2)2CH COO−

+
NH3

Glutamina
Frutose
H 6-fosfato transamidase CH2OPO32−
O32−POCH2
H O OHOH H OH
−OOC(CH2CHCOO− HO H H
UDP CH2OH
CH2OHO H Glutamato
)2+
CH2OH Glucosamina
CH2OH 6-fosfato
OH

OH H NH3 H NH2 FIGURA 16.9 Formação de

aminoaçúcares.

H H O H H O H
HO H H –UDP HO H HO H
OH OH
OH H OH +H2O N

OH CO CO
H C
NH O H NH H H
CH3

CH3 CH3

UDP-N-acetilglucosamina 2-Acetamidoglucal N-Acetilmanosamina

CH2OPO32– COOH O H
2–
O
O O+ CH2
COPO3 H CHOH
HN OH OPO32– COO–
CH2
OH
H H N Pi H3C CCHOH

H OH
HO H H C O N-acetilneuraminato H

9-fosfato sintase H

CH3

N-Acetilmanosamina Fosfoenolpiruvato Ácido N-Acetilneuramínico

6-Fosfato 9-fosfato

O H

CHOH COO–
H3C C HN
CHOH
+ CTP
CH2OH
H H OH CTP: acilneuraminato
H citidililtransferase
OH H PPi
O H
O O
CHOH
Ácido N-Acetilneuramínico H3C C HN OPOCH2 Citidina
CHOH
CH2OH
H H OH O–
H

OH H
Ácido CMP-N-Acetilneuramínico FIGURA 16.10 Biossíntese de ácido
CMP-N-acetilneuramínico.

mais 15 em glicosaminoglicanos. A multiplicidade de Por exemplo, a especificidade antigênica dos principais

ligações surge da diversidade de monossacarídeos en
volvidos e da formação de ligações α e β com cada um
dos grupos hidroxila disponíveis no sacarídeo aceptor.
Isso sugere que os oligossacarídeos tenham o potencial
para grande conteúdo informacional; consequentemen
te, a bioatividade de muitas moléculas é determinada
pela natureza dos resíduos de açúcares constituintes.
tipos sanguíneos é determinada pela composição em
açúcares de moléculas da superfície celular (Correlação
Clínica 16.8). N-acetilgalactosamina é o imunodetermi
nante do sangue tipo A, e galactose do sangue tipo B.
A remoção de N-acetilgalactosamina de eritrócitos do
tipo A, ou de galactose de eritrócitos do tipo B, conver
te-os em eritrócitos do tipo O. Cada vez mais, outros
678 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.8
Substâncias dos Grupos Sanguíneos
A superfície dos eritrócitos humanos é coberta por
um complexo mosaico de determinantes antigênicos es
pecíficos, muitos dos quais são polissacarídeos comple
xos. Há cerca de 100 determinantes de grupos sanguí
neos, pertencentes a 21 sistemas de grupos sanguíneos
independentes. Os mais estudados são os do sistema
ABO de grupos sanguíneos e do sistema Lewis, estreita
mente relacionado. A variação genética é conseguida por
glicosiltransferases específicas responsáveis pela síntese
dos determinantes heterossacarídicos. O gene H codifica
uma fucosiltransferase, que adiciona fucose a uma galac
tose periférica do heterossacarídeo precursor. O alelo A
codifica uma N-acetilgalactosamina glicosiltransferase,
o alelo B codifica uma galactosiltransferase, e o alelo O
codifica uma proteína inativa. Os açúcares transferidos
exemplos de açúcares como determinantes de especifi
cidade de receptores de superfície celular e interações
com lectinas, do direcionamento de células para certos
tecidos e da permanência ou remoção da circulação de
certas moléculas, têm sido reconhecidos. Todas as liga
ções glicosídicas identificadas em compostos biológicos
são degradadas por enzimas hidrolíticas específicas, gli
cosidases. Além de serem instrumentos valiosos para a
elucidação da estrutura de oligossacarídeos, essa classe
de enzimas é de interesse com base nas muitas doenças
genéticas do metabolismo de carboidratos complexos
que resultam de defeitos em glicosidases (ver Correla
ção Clínica 16.10 e 16.11).
16.4 GLICOPROTEÍNAS
As glicoproteínas são definidas como proteínas
conjugadas, que contêm um ou mais sacarídeos, sem
uma unidade repetitiva serial, e que são ligados cova
lentemente a uma proteína. Essa definição exclui os
proteoglicanos (p. 683). As glicoproteínas, em mem
branas celulares, têm um papel importante no com
portamento das células e, especialmente, nas funções
biológicas da membrana. As glicoproteínas são cons
tituintes do muco secretado por certas células epite
liais, servindo para lubrificar e proteger tecidos que
revestem os sistemas respiratório, gastrointestinal e
reprodutor feminino. Muitas proteínas secretadas são
glicoproteínas e incluem hormônios como hormônio
folículo-estimulante, hormônio luteinizante e gonado
trofina coriônica e proteínas plasmáticas como oroso
mucoides, ceruloplasmina, plasminogênio, protrombi
na e imunoglobulinas.
pelas enzimas A e B são adicionados ao oligossacarídeo
H-específico. O gene Lewis (Le) codifica outra fucosil
transferase, que adiciona fucose a um resíduo periféri
co de N-acetilglucosamina do precursor. Ausência do
produto do gene H dá origem ao determinante Lea es
pecífico, enquanto a ausência de ambas as enzimas H e
Le é responsável pela especificidade Leb. A elucidação
das estruturas desses oligossacarídeos determinantes
representa um marco na química de carboidratos. Esse
conhecimento é essencial para a prática de transfusão de
sangue e para propósitos legais e históricos.
Yamamoto, F., Clausen, I., White, T., Mark, J. e Hakomori,
S. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO sys
tem. Nature 345:229, 1990.
Glicoproteínas Contêm Quantidades
Variáveis de Carboidratos
A quantidade de carboidratos de glicoproteínas é
muito variável. As IgGs contêm cerca de 4% de carboi
drato em peso, enquanto a glicoforina contém 60%, a
glicoproteína do cisto ovariano humano 70%, e a gli
coproteína gástrica humana 82%. O carboidrato pode
estar uniformemente distribuído ao longo da cadeia
polipeptídica ou concentrado em regiões definidas. Na
glicoforina A humana, o carboidrato é restrito à metade
extracelular NH2-terminal da cadeia polipeptídica.
Os componentes carboidrato das glicoproteínas, ge
ralmente, contêm menos de 12-15 resíduos de açúcares.
Alguns consistem de um resíduo de açúcar, como na
glicoproteína da glândula submandibular (um resíduo
N-acetil-α-D-galactosaminil) e em alguns colágenos de
mamíferos (um resíduo α-D-galactosil). Em geral, os
resíduos de açúcares são da forma D, com exceção de
L-fucose, L-arabinose e ácido L-idurônico. Glicoproteí
nas ortólogas de diferentes espécies animais frequen
temente têm estruturas primárias proteicas idênticas,
mas diferentes componentes carboidratos. A heteroge
neidade de uma dada proteína também ocorre em um
organismo. Por exemplo, as ribonucleases pancreáticas
A e B têm estruturas primárias idênticas e especificida
des semelhantes por substratos, mas diferem significa
tivamente em suas composições em carboidratos.
Carboidratos São Ligados a Glicoproteínas
por Ligações N- ou O-Glicosil
As estruturas dos carboidratos foram completamen
te elucidadas para apenas de um número limitado de
glicoproteínas. A micro-heterogeneidade de glicopro
teínas, advindas de síntese incompleta ou degradação
parcial, torna as análises estruturais extremamente di
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 679

fíceis. Contudo, surgiram certas generalizações. A liga GalNAc 1→3 Gal 1→3 GalNAc O-Ser/Thr
ção covalente do açúcar com a proteína é uma caracte
1→2 1→2
rística essencial da estrutura da glicoproteína, e apenas
um pequeno número de tipos de ligações é encontra Fuc NeuAc
do (p. 116). Os três tipos principais de ligações glico
peptídicas, como mostra a Figura 16.11, são N-glicosil A classe complexa é exemplificada pelas substân
com asparagina (Asn), O-glicosil com serina (Ser) ou cias dos grupos sanguíneos ABO e Lewis(ver Correla
ção Clínica 16.8), na qual o oligossacarídeo é N-glico
treonina (Thr), e O-glicosil com 5-hidroxilisina, geral
mente confinada aos colágenos. Ligações N- ou O- estão sidicamente ligado à asparagina. Essas glicoproteínas
presentes em muitas glicoproteínas e ligam dois tipos comumente contêm uma estrutura central (core) que
de oligossacarídeos (simples e complexo). A classe consiste de resíduos de manose (Man), ligados a N-ace
simples tem uma estrutura central (core) de galactose tilglucosamina (GlcNAc) na estrutura.
(Gal) ligada por ligação β(1-3) a N-acetilgalactosamina (Man)n 1→4 Man 1→4 GlcNAc 1→4 GlcNAc Asn
(GalNAc) ligada por ligação O-glicosídica a resíduos de
serina ou treonina. L-Fucose (Fuc), ácido siálico (Neu A diversidade estrutural de glicoproteínas N-ligadas
Ac) e N-acetilgalactosamina estão presentes na extre surge de remoção e modificação desse core para pro
midade não-redutora. A estrutura geral é a seguinte: duzir um amplo repertório de subtipos de N-glicanos
alta-manose, híbrido ou complexo.

CH2OH O NH2 Síntese de Glicoproteínas N-Ligadas

H H O NHCCH2CCOOH
Envolve Dolicol Fosfato
OH H H Enquanto a síntese das glicoproteínas O-glicosidi
HO H
NH camente ligadas envolve a ação sequencial de glicosil
H transferases, a síntese de glicoproteínas N-glicosidica
CO mente ligadas envolve um mecanismo diferente e mais
complexo (Figura 16.12). Um núcleo (core) comum é
CH3 pré-montado como um oligossacarídeo ligado a lipí
deo no lado citoplasmático do ER e depois deslocado
Type I Ligação N-Glicosil com asparagina (flipped) através da bicamada para o lúmen do ER e

H
CH2OH CH2 NH2
H O
H OCH
H H COOH

HO OH C
NH O

HO
H OH
H
CH2OHO
H
OH
CH3HH2NCH
O CH
NH2
CH2
COOH
2

Type II Ligação O-Glicosil com serina

Type III Ligação O-Glicosil com 5-hidroxilisina

FIGURA 16.11 Estrutura dos três tipos FIGURA 16.12 Biossíntese do oligossacarídeo central (core) das
principais de ligações glicopeptídicas. glicoproteínas ligadas por asparagina-N-acetilglucosamina. Dol, dolicol.
680 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

transferido como uma unidade para o polipeptídeo. Du Manα-Manα

Manα
rante a síntese, os oligossacarídeos intermediários são Manα-Manα Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
ligados ao dolicol fosfato. Glcα-Glcα-Glcα-Manα-Manα-Manα

Manα-Manα Glc
CH3 CH3
Manα
Manα-Manα Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
(CH2 C CHCH)n CH2 CHCH2 CH2O PO3H2
Glcα-Glcα-Manα-Manα-Manα
Dolicol fosfato
Manα-Manα (Glc)2
Manα
Dolicóis são poliprenóis (C80-C100) que contêm 16-20 Manα-Manα Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
unidades isopreno, nos quais a unidade final é saturada. Manα-Manα-Manα
Manα (Man)4

Esses lipídeos funcionam de dois modos na síntese do

oligossacarídeo. O primeiro envolve formação de N-ace Manα
Manα Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
tilglucosaminil pirofosforildolicol a partir de açúcares Manα UDP-GlcNAc
UDP-ligados e dolicol fosfato-ligados. O segundo envol
UDP
ve N-acetilglucosamina, e a manose é transferida dire Manα
Oligossacarídeos híbridos
Manα
tamente do nucleotídeo, sem a formação de intermediá Manα Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
rios. Em ambos os casos, o oligossacarídeo é transferido GlcNAcβ-Manα
em uma etapa final do dolicol pirofosfato para um resí- Oligossacarídeos complexos
duo de asparagina da cadeia polipeptídica. (Man)2
GlcNAc-βManα
Manα Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
Após transferência para o polipeptídeo, as estrutu UDP-GlcNAc
ras centrais são completadas por glicosiltransferases, (4)
UDP
sem participação de lipídeos intermediários (Figura Sínese do queratam sulfato
GlcNAcβ-Manα
16.13). Uma série de reações de processamento preco Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
ce, que são muito conservadas entre as espécies de ver GlcNAcβ-Manα
GDP-Fuc
tebrados e os tipos celulares, ocorre em grande parte GDP Fucα
no ER e parece estar acoplada com o dobramento cor GlcNAcβ-Manα
reto da glicoproteína. Após a remoção inicial e a libe GlcNAcβ-Manα (5)
Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
UDP-Gal
ração do ER, N-glicanos sofrem maiores modificações
UDP Fucα
por glicosidases e glicosiltransferases, principalmente
no Golgi. Várias avenidas existem na via de processa Galβ-GlcNAcβ-Manα
Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
mento que determina a diversidade final da estrutura Galβ-GlcNAcβ-Manα
CMP-NeuNAc
do glicano (ou seja, subtipos alta-manose, híbrido ou
CMP Fucα
complexo), bem como o destino final das glicoproteí
NeuNACα-Galβ-GlcNAcβ-Manα
nas. O N-glicano Man8 GlcNAc2-Asn em glicoproteínas Manβ-GlcNAcβ-GlcNAc-Asn
destinadas ao compartimento lisossomal é modificado NeuNACα-Galβ-GlcNAcβ-Manα
pela adição de um resíduo de GlcNAc, catalisada por
GlcNAc fosfotransferase, e subsequente remoção pela Degradação do N-glicano
GlcNAc fosfodiéster glicosidase, expondo um resíduo
FIGURA 16.13 Via de processamento para
de Man-6-P. Um defeito nesse processo forma a base da
oligossacarídeos N-ligados
doença de acúmulo lisossomal conhecida como doença
da célula I (ver Correlação Clínica 6.8).
quencialmente a partir da extremidade não-redutora,
Como as estruturas dos oligossacarídeos complexos expondo o substrato para a glicosidase seguinte. A au
requerem vias de síntese complicadas e intrincadas, sência de uma glicosidase específica causa interrup
houve uma rápida expansão no número de doenças con ção do catabolismo, resultando no acúmulo do produto
gênitas da glicosilação (congenital disorders of glyco anterior (Correlação Clínica 16.10). Endoglicosidases
silation, CDG), identificadas como doenças genéticas com especificidade mais ampla também existem, de
resultantes da deficiência ou do aumento de glicosilação. modo que o catabolismo de glicoproteínas resulta da
Atualmente, 28 doenças foram identificadas, incluindo ação combinada de endo- e exoglicosidases. Muitas
16 na N-glicosilação de proteína, 6 na O-glicosilação de das mesmas cadeias de glicanos N- e O-ligados são en
proteínas, 4 em ambas O- e N-glicosilação, e 2 na glicosi contradas em glicoproteínas e glicolipídeos, de modo
lação de lipídeos. Uma notável variação de fenótipos, de que certos defeitos enzimáticos podem afetar a degra
brandos a letais e de órgão-específicos a multisistêmicos, dação de ambos os tipos de glicoconjugados (Correla
foram registrados (Correlação Clínica 16.9). ção Clínica 16.11).

O catabolismo de glicoconjugados também pode

produzir fenótipos anormais. A degradação de hete
ro-oligossacarídeos é catalisada por glicosidadses
específicas. Exoglicosidases removem açúcares se
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 681

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.9

Doenças Congênitas de Glicosilação (CDGs, congenital disorders of glycosylation)

As doenças congênitas de glicosilação (CDGs) são
doenças clinicamente heterogêneas de glicosilação.
Usando o estado de glicosilação da transferrina sérica
como indicador sensível, vários tipos de CDGs foram
identificados. O tipo I é o mais comum, representando
doenças de montagem do N-glicano no início da via de
biossíntese de manose. Vários genes defectivos, que
levam a doenças genéticas no homem, foram identifi
cados (ver tabela). Por exemplo, a manosiltransferase
I adiciona o primeiro resíduo de manose ao oligossaca
rídeo ligado a lipídeo (ver Figura 16.12). Pacientes com
deficiência dessa enzima apresentam epilepsia, retardo
psicomotor grave, dismorfia, microcefalia, hipotonia,
cardiomiopatia e síndrome nefrótica, seguida por mor
te precoce (uma semana a dez meses). Doenças CDG-II
envolvem defeitos enzimáticos nas enzimas de proces
samento do N-glicano (ver Figura 16.13 e tabela). Note
as enzimas de transformação de carboidratos (ver Se
ção 16.3) CDG-1a (fosfomanomutase II) e CDG-1b (fos
fomanose isomerase), que também causa doenças de
glicosilação. Outras doenças podem envolver defeitos
na O-glicosilação, como a síndrome de Walker-Warburg,
devida, às vezes, à deficiência de O-manosiltransferase
I; defeitos combinados de N- e O-glicosilação, como a
deficiência do transportador de CMP-ácido siálico e
defeitos na glicosilação de lipídeos como a deficiência
de glicosilfosfatidilinosiltol. Tem sido alcançado pouco
progresso na terapia para qualquer uma dessas doen
ças; apenas CDG-1b é tratável eficientemente.

Defeitos enzimáticos na síntese de glicoproteínas N-ligadas

Doença Proteína defectiva
CDG-Ia Fosfomanomutase II
CDG-Ib Fosfomanose isomerase
CDG-Ic DoI-P-Glc:Man9-GlcNAc2-P-P-Dol glicosiltransferase (glicosiltransferase I)
CDG-Id Dol-P-Man: Man5-GlcNAc2-P-P-Dolmanosiltransferase (manosiltransferase VI)
CDG-Ie GDP-Man: Dol-P- manosiltransferase (Dol-P-Man sintase I) (3)
CDG-If Lec35 (utilização 1 Man-P-DoI)
CDG-Ig Dol-P-Man: Man7-GlcNAc2-P-P-Dol manosiltransferase (manosiltransferase VIII)
CDG-Ih Dol-P-Glc: Glc1 -Man9-GlcNAc2-P-P-Dol glicosiltransferase (glicosiltransferase II)
CDG-Ii GDP-Man: Man1-GlcNAc2-P-P-Dol manosiltransferase (manosiltransferase II)
CDG-Ij UDP-GlcNAc: Dol-P-GlcNAc-P transferase (1)
CDG-Ik GDP-Man: GlcNAc2-P-P-Dolmanosiltransferase (manosiltransferase I) (2)
CDG-II Dol-P-Man: Man6-and Man8-GlcNAc2-P-P-Dolmanosiltransferase (manosiltransferase VII-IX)
CDG-IIa N-acetilglicosaminiltransferase II (4)
CDG-IIb Glucosidase I
CDG-IIc Transportador GDP-fucose
CDG-IId β-1,4 galactosiltransferase (5)

Fonte: Jacken, J. e Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Ann. Rev. Gemonics Hum.
Genetics 8:261, 2007.

Função do Glicano carboidrato ou glicano das glicoproteínas e dos glicoli

pídeos participa de muitos processos biológicos impor
A glicosilação é uma das modificações pós-tradução tantes, incluindo ativação de receptor, transdução de
mais comuns e quase a metade de todas as proteínas co sinal, endocitose, adesão celular e tráfego de leucócitos.
nhecidas em eucariotos são glicosiladas. O componente Os glicanos de superfície celular são as primeiras mo
682 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.10

Defeitos no Catabolismo de Glicoproteínas

Alguns erros inatos do metabolismo humano envol
vem acúmulo de glicolipídeos, glicopeptídeos, mucopo
lissacarídeos1 e hetero-oligossacarídeos. Essas doenças
são causadas por defeitos na atividade de glicosidases
lisossomais, que impedem o catabolismo de oligossa
carídeos. Envolvem acúmulo gradual nos tecidos e na
urina de compostos derivados da degradação incomple
ta dos oligossacarídeos, e podem ser acompanhadas de
anomalias esquélicas, hepato-esplenomegalia, catarata
ou retardo mental. Por exemplo, um defeito no catabo
lismo de oligossacarídeos ligados a asparagina-N-ace
tilglucosamina leva a aspartilglicosilaminúria, na qual
uma deficiência de 4-L-aspartilglicosilamina amido-hi
drolase permite o acúmulo de estruturas aspartilgluco
samina-ligadas (ver tabela). Outras doenças envolvem o
acúmulo de oligossacarídeos derivados de ambos, glico
proteínas e glicolipídeos, que compartilham estruturas
de oligossacarídeos semelhantes (ver tabela e Correla
ção Clínica 16.11).

Defeitos Enzimáticos na Degradação de Glicoproteínas do Tipo Asn-GlcNAca

Doença Enzima Deficienteb

Aspartilglicosaminúria 4-L-Aspartilglucosamina amido-hidrolase (2)

β-Manosidose β-Manosidose (7)
α-Manosidose α-Manosidose (3)
GM2 gangliosidose, variante O (doença de β-N-acetil hexosaminidases (A e B) (4)
Sandhoff-Jatzkewitz)
GM1 gangliosidose β-Galactosidase (5)
Mucolipidose I (sialidose) Sialidase (6)
Fucosidose α-Fucosidase (8)
aUma estrutura típica de oligossacarídeo Asn-GlcNAc.

NeuAc(6)αGal (5)
ß GIcNAc (4)
ß
Man
NeuAcαGalßGIcNAc ß
(3)
α

Man(7)ßGlcNAc (2)ß GIcNAc

(8) Asn

NeuAc α Gal ß GIcNAc ß Manα GlcNAc Fuc

(6) (4)ß
NeuAc α Gal(5)ßGIcNAc
bOs números entre parênteses referem-se às enzimas que hidrolisam essas ligações.

Aula, P., Janlanko, A. e Peltonen, L. Aspartylglucosami D. (Eds.). The Metabolic and Molecular Basesof Inherited
nuria. Em: Scriver, C. R., Beaudet, A. R., Sly, W. S. e Valle, Disease, 8. ed. New York: McGraw Hill, 2001, III: 3507.

léculas a serem encontradas e reconhecidas por outras
células, anticorpos, vírus e bactérias. Por exemplo, o
repertório de glicanos fornece biomarcadores oncofe
tais e de células tronco que refletem a especificidade
de ligação de vários anticorpos monoclonais; uma das
barreiras para neutralização do HIV por anticorpos é a
rede de carboidratos protetores que cobre os antígenos
na superfície do vírus. Embora a diversidade de estru
turas de glicanos seja enorme, a especificidade é dada
pelas enzimas de glicosilação, glicosiltransferases e gli
cosidases. Assim, a regulação de processos biossintéti
cos desses biopolímeros abundantes e diversos direcio
na os mecanismos moleculares pelos quais os glicanos
contribuem para o desenvolvimento e para doenças.

1 NT: desde a década de 1970, o nome mais usado para designar um “mucopolissacarídeo” é glicosaminoglicano. Apesar disso, as doenças do cata
bolismo desses compostos, que resultam no seu acúmulo dentro dos lisossomos e excreção aumentada na urina (mucopolissacaridúria), ainda são
chamadas mucopolissacaridoses, razão pela qual o termo “mucopolissacarídeo” ainda aparece, às vezes, na literatura.
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 683

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.11 CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.12

Doenças de Glicolipídeos A Heparina É um Anticoagulante

Um grupo de doenças genéticas humanas surge
de deficiências em hidrolases, que agem predomi
nantemente sobre substratos glicolipídicos, resultan
do em acúmulo de produtos de glicolipídeos e gan
gliosídeos. Os sintomas clínicos associados com cada
um dos glicoconjugados podem variar muito. Entre
tanto, em virtude da preponderância de lipídeos no
sistema nervoso, tais doenças frequentemente têm
neurodegeneração associada e grave deterioração
mental e motora.
Defeitos Enzimáticos na Degradação de Glicolipídeos
Doença Deficiência Enzimática
Tay-Sachs β-Hexosaminidase A
de Sandhoff β-Hexosaminidase AeB
A heparina é um glicosaminoglicano sulfatado
de ocorrência natural que é usado para reduzir a
tendência à coagulação de pacientes. Tanto in vivo
como in vitro, a heparina impede a ativação de fato
res da coagulação por se ligar a um inibidor do pro
cesso de coagulação. O inibidor é a antitrombina III,
um inibidor plasmático proteico de serino proteases.
Na ausência de heparina, a antitrombina III combi
na-se lentamente (10-30 min) com vários fatores da
coagulação, formando complexos desprovidos de ati
vidade proteolítica; em presença de heparina, com
plexos inativos são formados em poucos segundos. A
antitrombina III contém um resíduo de arginina que
se combina com a serina do sítio ativo dos fatores Xa
e IXa; assim, a inibição é estequiométrica. Hetero
zigose na deficiência de antitrombina III resulta em
risco aumentado de trombose venosa e resistência à
ação da heparina.

GM1 gangliosidose β-Galactosidase Hirsh, J. Drug therapy: Heparin. N. Engl. J. Med.

324:1565, 1991.
Sialidose Sialidase

de Fabry α-Galactosidase
de Gaucher β-Glucoceramidase
de Krabbe β-Galactoceramidase
metacromática
Leucodistrofia Arilsulfatase A
(cerebrosídeo sulfatase)
Beutler, E. e Garabowski, G. Gaucher Disease. Em:
Scriver, C. R., Beaudet, A. R., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.),
The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disea
se, 8. ed. New York: McGraw Hill, 2001, III: 3635.
16.5 PROTEOGLICANOS
Proteoglicanos são macromoléculas complexas que
podem ser compostas em 95% ou mais de carboidratos,
parecendo mais polissacarídeos do que proteínas. Suas
cadeias de carboidratos são chamadas glicosaminogli
canos (ou mucopolissacarídeos), especialmente em
referência às doenças de acúmulo, as mucopolissacari
doses, que resultam de uma incapacidade de degradar
essas moléculas (ver Correlação Clínica 16.14).
Existem Seis Classes de
Proteoglicanos
Proteoglicanos consistem de uma ou mais de mui
tas cadeias de glicosaminoglicanos diferentes, ligadas
covalentemente a um esqueleto proteico. Seis classes
distintas são reconhecidas: condroitim sulfato, derma
tam sulfato, queratam sulfato, heparam sulfato, hepa
rina e hialuronato. Certas características são comuns
às diferentes classes de glicosaminoglicanos. Essas lon
gas cadeias heteropolissacarídicas não-ramificadas são
compostas, em grande parte, por unidades dissacarídi
cas repetitivas, consistindo de uma hexosamina e um
ácido urônico. Grupos sulfatos, ligados por ligações és
ter a certos monossacarídeos ou por ligações amida ao
grupo amino da glucosamina, são substituintes comuns
dos glicosaminoglicanos. Somente o hialuronato não
é sulfatado e não é covalentemente ligado a proteína.
As carboxilas dos ácidos urônicos e os grupos sulfatos
contribuem para a natureza fortemente carregada dos
glicosaminoglicanos. Sua carga elétrica e sua estrutura
macromolecular são importantes em suas funções como
lubrificantes e elementos de sustentação no tecido con
juntivo. Os glicosaminoglicanos dos proteoglicanos são
componentes predominantes da matriz extracelular e
das superfícies celulares, onde participam da adesão e
da sinalização celular.
Hialuronato É um Copolímero de
N-Acetilglucosamina e Ácido Glucurônico
O hialuronato difere dos outros tipos de glicosami
noglicanos. É não-sulfatado, não-covalentemente liga
do a proteína, e produzido tanto por bactérias como por
células animais. O hialunorato é classificado como gli
cosaminoglicano em virtude de sua similaridade estru
tural com esses polímeros, consistindo exclusivamente
684 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

COO– CH2OH COO– CH2OH lissacarídicas, no comprimento das

O O O O –O SO O cadeias de condroitim sulfato e no
H H – H 3
H H H H O– grau de sulfatação. Proteoglicanos de
OH H O H OH H O H condroitim sulfato podem se agregar
H HO H n H H H
não-covalentemente com hialurona
H OH H HNCOCH3 H HNCOCH3
H OH
n to, e são componentes importantes na
cartilagem, nos tendões, nos ligamen
Unidade repetitiva do ácido hialurônico Unidade repetitiva do condroitin 4-sulfato
tos e na aorta, bem como no cérebro,
no rim e no pulmão.
COO– –O3SOCH2 HO CH2OH –O3SOCH2

H
O
H H H O H H O H O Dermatam Sulfato Contém
H H O–
OH H O OH H O– H
O
OH H
Ácido L-Idurônico
OSO3
H HNSO3 H H H
O dermatam sulfato difere do con
H H H H OH H HNCOCH3
– – n droitim sulfato por seu ácido urônico
n

Unidade repetitiva da heparina Unidade repetitiva do queratam sulfato

predominante ser ácido L-idurônico,
embora algum ácido D-glucurônico
também esteja presente. A epimeriza
CH2OH ção de ácido D-glucurônico para ácido
O –O SO O L-idurônico ocorre após incorporação
H
COO–
3
H O–
na cadeia polimérica, e é acoplada com
OH H O H
H H
H H o processo de sulfatação. As ligações
OH H HNCOCH3
glicosídicas têm a mesma posição e
n configuração dos condroitim sulfatos,
Unidade repetitiva do dermatam sulfato com cadeias polissacarídicas médias
de 2-5 × 104 Da. Como a heparina, o
FIGURA 16.14 Principais unidades repetitivas das cadeias de dermatam sulfato é antitrombótico,
glicosaminoglicanos. mas tem pouca atividade anticoagu
lante e antilipêmica no sangue total. O
de unidades dissacarídicas repetitivas de N-acetilglu dermatam sulfato é encontrado em pele, vasos sanguí
cosamina e ácido glucurônico (Figura 16.14). Embora neos e válvulas cardíacas.
tenha a estrutura química menos complexa dos glicosa
minoglicanos, as cadeias podem alcançar 105-107 Da. A Heparina e o Heparam Sulfato Diferem
alta massa, o caráter polieletrolítico, e o grande volume dos Outros Glicosaminoglicanos
que ocupa em solução contribuem para as propriedades
do hialuronato como um lubrificante e absorvente de A glucosamina e o ácido D-glucurônico ou ácido L
choque. O hialunorato é ubíquo na matriz extracelular, -idurônico formam a unidade dissacarídica repetitiva
e é encontrado no líquido sinovial, no humor vítreo e no característica na heparina (Figura 16.14). Diferente
cordão umbilical. mente da maioria dos outros glicosaminoglicanos, a
heparina contém ligações α-glicosídicas1. Quase todos
Condroitim Sulfatos São os os resíduos de glucosamina contêm ligações sulfamida,
embora um pequeno número de resíduos de glucosami
Glicosaminoglicanos Mais Abundantes na seja N-acetilado. O conteúdo de sulfato da heparina
Os condroitim sulfatos são ligados a resíduos espe aproxima-se de 2,5 resíduos por unidade dissacarídica
cíficos de serina em um esqueleto proteico, por meio de nas preparações com maior atividade biológica. Além
um módulo tetrassacarídico de ligação. dos grupos N-sulfato e O-sulfato em C6 da glucosamina,
a heparina pode conter sulfato em C3 da hexosamina e
GluUA 1→3 Gal 1→3 Gla 1→4 Xyl O-Ser C2 do ácido urônico. Ao contrário dos outros glicosami
noglicanos, a heparina é um componente intracelular
Cada cadeia contém 30 a 50 unidades dissacarídi de mastócitos, e funciona predominantemente como
cas (15-25 kDa), consistindo de N-acetilgalactosamina um agente anticoagulante e antilipêmico (Correlação
e ácido glucurônico, que são ligados ao módulo de liga Clínica 16.12).
ção (Figura 16.14). Os dissacarídeos podem ser sulfa
tados na posição C4 ou C6 da N-acetilgalactosamina. O Heparam sulfato contém uma unidade dissaca
Uma molécula média de proteoglicano de condroitim rídica repetitiva, semelhante à da heparina, mas tem
sulfato contém aproximadamente 100 cadeias de con mais grupos N-acetil, menos grupos N-sulfato e um me
droitim sulfato ligadas ao esqueleto proteico, resul nor conteúdo de grupos O-sulfato. O heparam sulfato
tando em uma massa de 1,5-2 × 106 Da. Preparações como componente de proteoglicanos pode ser extrace
de proteoglicanos são extremamente heterogêneas,
diferindo no número e na distribuição das cadeias po 1 NT: Na maioria dos outros glicosaminoglicanos, as ligações são β.
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS
[Esqueleto protéico]-Ser
-Ser-Xyl-Gal-Gal-GlcUA-GalNAc-GlcUA
SO4–
(UDP, PAP)n
(UDP-GalNAc,
UDP-GlcUA, PAPS)n
-Ser-Xyl-Gal-Gal-GlcUA-GalNAc-GlcUA
SO4–
PAP
PAPS
-Ser-Xyl-Gal-Gal-GlcUA-GalNAc-GlcUA
UDP
-Ser-Xyl-Gal-Gal-GlcUA-GalNAc
UDP-GlcUA
FIGURA 16.15 Síntese do proteoglicano de condroitim
sulfato.
Xyl, xilose; Gal, galactose, GlcUA, ácido glucurônico; GalNAc,
N-acetilgalactosamina; PAPS, fosfoadenosina fosfossulfato.
lular ou um componente integral e ubíquo da superfície
celular de muitos tecidos, incluindo paredes de vasos
sanguíneos e cérebro, e pode atuar como um correcep
tor de certos fatores de crescimento.
Queratam Sulfato Existe em Duas Formas
O Queratam sulfato é composto principalmente da
unidade dissacarídica formada por N-acetilglucosa
mina e galactose, e não contém ácido urônico (Figu
ra 16.14). O teor de sulfato é variável, como ésteres de
sulfato em C6 da galactose e da hexosamina. Dois tipos
de queratam sulfato diferem pelo conteúdo de carboi
dratos e distribuição tecidual. Ambos também contêm
manose, fucose, ácido siálico e N-acetilgalactosamina.
O queratam sulfato I, de córnea, é ligado à proteína por
uma ligação N-acetilglucosamina-asparaginil, típica de
glicoproteínas. O queratam sulfato II, de cartilagem, é
ligado por N-acetilgalactosamina a serina ou treonina.
Os queratam sulfatos esqueléticos são frequentemente
ligados covalentemente ao mesmo esqueleto proteico
das cadeias de condroitim sulfato.
• 685
UDP-Xyl
UDP
-Ser-Xyl UDP-Gal
UDP
n
-Ser-Xyl-Gal
UDP-Gal
UDP
-Ser-Xyl-Gal-Gal
UDP-GlcUA
UDP
-Ser-Xyl-Gal-Gal-GlcUA
UDP-GalNAc
UDP
Biossíntese de Condroitim
Sulfato É Típica da Formação de
Glicosaminoglicanos
Os glicosaminoglicanos são montados pela ação se
quencial de glicosiltransferases, que transferem um mo
nossacarídeo de um derivado nucleotídeo-ligado para
um aceptor apropriado, a extremidade não-redutora de
outro açúcar ou um polipeptídeo. A biossíntese do con
droitim sulfatos é a mais bem conhecida (Figura 16.15).
A formação do esqueleto proteico é a primeira etapa,
seguida pela ação de seis reações de glicosiltransfera
ses. Especificidade restrita de substrato é exigida para
construção do tetrassacarídeo singular da região de li
gação. A polimerização, então, resulta de reações repe
tidas de N-acetilgalactosaminiltransferase e glucurono
siltransferase, para formar as unidades dissacarídicas
características. Sulfatação da N-acetilgalactosamina na
posição C4 ou C6 ocorre com a elongação da cadeia. O
doador de sulfato, como em outros sistemas biológicos,
é o 3!-fosfoadenosina 5!-fosfossulfato (PAPS), que é
formado a partir de ATP e sulfato em duas etapas cata
lisadas pela PAPS sintetase bifuncional (Figura 16.16).
686 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

NH2

N
N
NH2 O O
ATP ADP
5!
N –O S O P O CH2 N
N O N
2–
SO4 O O O O– H H
5!
ATP –O S O P O CH2 O N H O H
N
3!
O O– H H OH
PPi
H OH H –O P O
3!
OH –O

Adenosina 3!-Fosfoadenosina 5!- fosfosulfato

5!-fosfosulfato (APS) (PAPS)

FIGURA 16.16 Biossíntese de 3!-fosfoadenosina 5!-fosfossulfato (PAPS).

A importância da sulfatação é enfatizada pela prepon
derância de condições condrodistróficas em animais e
no homem, causadas por deficiências no processo de
sulfatação (Correlação Clínica 16.13).
A síntese dos outros glicosaminoglicanos requer
reações adicionais de transferases, específicas para os
açúcares e as ligações apropriados. A finalização fre
quentemente envolve O-sulfatação, epimerização, ace
tilação ou N-sulfatação. A síntese de proteoglicanos e
de glicoproteínas é regulada pelo mesmo mecanismo,
no nível da síntese de hexosamina. A reação da fruto
se 6-fosfato-glutamina transamidase (ver Figura 16.4)
está sujeita à inibição por retroalimentação pela UDP
-N-acetilglucosamina, que está em equilíbrio com UDP
-N-acetilgalactosamina. Da mesma forma, as concen
trações de UDP-xilose e de ácido UDP-glucurônico são
rigorosamente controladas pela inibição por UDP-xilose
da conversão, catalisada pela UDP-glicose desidrogena
se, de UDP-glicose em ácido UDP-glucurônico (ver Fi
gura 16.4). Como a xilose é o primeiro açúcar adiciona
do durante a síntese de condroitim sulfato, dermatam
sulfato, heparina e heparam sulfato, o efeito mais pre
coce da síntese diminuída de esqueleto proteico seria o
acúmulo de UDP-xilose, que ajuda a manter o equilíbrio
entre a síntese da proteína e dos glicosaminoglicanos.
Os proteoglicanos, assim como as glicoproteínas e
os glicolipídeos, são degradados pela ação sequencial
de proteases e glicosidases, desacetilases e sulfatases.
Muitas das informações sobre o metabolismo e a degra
dação dos proteoglicanos foram derivadas do estudo
das mucopolissacaridoses (Correlação Clínica 16.14).
Essas doenças genéticas são caracterizadas pelo acú
mulo tecidual e excreção urinária de produtos hetero
-oligossacarídicos derivados da quebra incompleta dos
proteoglicanos, por causa de uma deficiência de uma ou
mais hidrolases lisossomais.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.13

Condrodistrofias Decorrentes de Defeitos de Sulfatação

A sulfatação é uma modificação essencial dos glico perinatal. Doenças genéticas que se devem a defeitos
saminoglicanos das várias famílias de proteoglicanos. na síntese de PAPS pela sulfurilase/quinase bifuncional
O processo de sulfatação envolve transporte de sulfato (PAPS sintetase) foram identificadas tanto em animais
da
inorgânico para dentro célula, via transportadores da como no homem. O camundongo braquimórfico apre
membrana plasmática, ativação por transformação em senta uma grave alteração de crescimento, resultando
fosfoadenosilfosfosultato (PAPS), via um processo de em tronco e membros extremamente curtos e crânio
duas etapas catalisado pela PAPS sintetase no citosol, pequeno. No homem, a displasia espondiloepimetafiseal
e, depois, utilização direta por sulfotransferases citosó (tipo Pakistani) é caracterizada por membros inferiores
licas ou transporte do PAPS do citosol para o complexo curtos e arqueados, articulações dos joelhos aumenta
de Golgi, para utilização por um elenco de sulfotrans das e início precoce de doença articular degenerativa.
ferases luminais. Três doenças autossômicas recessi Esses fenótipos demonstram claramente a importância
vas, displasia diastrófica (DTD), atelosteogênese tipo II dessa modificação pós-tradução para o funcionamento
(AOII) e acondrogênese tipo 1B (ACG-1B), resultam de dos proteoglicanos, especialmente no desenvolvimento
mutações no gene DTDST que codifica um transporta e na manutenção do sistema esquelético.
dor de sulfato. Pacientes com DTD apresentam baixa
estatura desproporcional e displasia articular generali Schwartz, N. B. e Domowicz, M. Chondrodysplasias
zada, mas geralmente têm tempo de vida normal; ACG due to proteoglycan defects. Glycobiology 12:57R, 2002; e
-1B é caracterizada por extremidades e tronco muito Schwartz, N. B. Chondrodysplasias. Encyclopedia of Endo
curtos; AOII é uma condrodisplasia letal no período crine Disorders, 2004, 1:502.
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS • 687

CORRELAÇÃO CLÍNICA 16.14

Mucopolissacaridoses
Doenças genéticas humanas caracterizadas por
excessivos acúmulo e excreção de oligossacarídeos de
proteoglicanos são as mucopolissacaridoses. Essas
doenças resultam de deficiência de uma ou mais
hidrolases lisossomais, que são responsáveis pela
degradação de dermatam e/ou heparam sulfato. A
síndrome de Hurler e a síndrome de Sanfilippo são
condições autossômicas recessivas, enquanto a sín
drome de Hunter é ligada ao X. As síndromes de
Hurler e de Hunter são caracterizadas por anomalias
esqueléticas e retardo mental que, em casos graves,
podem resultar em morte prematura. Diferentemen
te, os defeitos físicos na síndrome de Sanfilippo são
relativamente leves, enquanto o retardo mental é se
vero. Coletivamente, a incidência das mucopolissaca
ridoses é 1 por 30.000 nascimentos. A deficiência de
sulfatases múltiplas (MSD) é caracterizada por ati
vidade diminuída de todas as sulfatases conhecidas.
Evidência recente sugere que uma modificação co- ou
pós-tradução de uma cisteína para ácido 2-amino-3
-oxopropiônico é essencial para a atividade de sulfa
tase, e que uma falta dessa modificação resulta em
MSD. Essas doenças podem ser detectadas por diag
nóstico pré-natal, uma vez que o padrão metabólico
apresentado pelas células afetadas obtidas do líquido
amniótico é muito diferente do normal.

Defeitos Enzimáticos nas Mucopolissacaridoses

Síndrome Produtos Acumuladosa Enzima Deficienteb

Hunter Heparam sulfato Iduronato sulfatase (1)

Dermatam sulfato
Hurler-Scheie Heparam sulfato α-L-iduronidase (2)
Dermatam sulfato
Maroteaux-Lamy Dermatam sulfato N-acetilgalactosamina sulfatase (3)
Mucolipidose VII Heparam sulfato β-Glucuronidase (5)
Dermatam sulfato
Sanfilippo tipo A Heparam sulfato Heparam sulfamidase (6)
Sanfilippo tipo B Heparam sulfato N-Acetilglucosaminidase (9)
Sanfilippo tipo C Heparam sulfato Acetil-CoA:a-glucosaminídeo acetiltransferase
Sanfilippo tipo D Heparam sulfato N-acetilglucosamina 6-sulfato sulfatase (8)
Morquio tipo A Queratam/condroitim sulfato Galactose 6-sulfatase
Morquio tipo B Queratam sulfato β-Galactosidase
aEstruturas do dermatam sulfato e do heparam sulfato.

Dermatam sulfato IdUA(2)ɑGaINAcßGIcUA(4)ßGaINAcß

(1) (3)

OSO3H OSO3H OSO3H

Heparam sulfato IdUA(2)ɑGIcN(7)ɑGIcUAßGIcNAc (9)ɑ

(1) (6) (8)

OSO3H OSO3H OSO3H

bOs números entre parênteses referem-se às enzimas que hidrolisam essas ligações.

Neufeld, E. e Muenzer, J. 2001. Mucopolysaccharidoses. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,
Em: Scriver, C. R., Beaudet, A. R., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.). 8th ed. New York: McGraw-Hill, 2001, III:3421.
688 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
Embora proteoglicanos continuem sendo definidos
com base nas cadeias de glicosaminoglicanos que con
têm, novos foram descritos com base principalmente
em propriedades funcionais ou localização. Agrecam e
versicam são as espécies extracelulares predominan
tes; sindecam, CD44 e trombomodulina são proteínas
integrais de membranas; neurocam, brevicam, cere
brocam e fosfacam são basicamente restritos ao siste
ma nervoso. Muitos proteoglicanos (ou seja, agrecam,
sindecam e betaglicam) carregam mais de um tipo de
Bibliografia
Collins, P. M. e Ferrier, R. J. Monosaccharides: Their
Chemistry and Roles in Natural Products. Chiches
ter, UK: Wiley, 1995.
Dutton, G.J. (Ed.). Glucuronic Acid, Free and Com
bined. New York: Academic Press, 1966.
Horecker, B. L. Pentose Metabolism in Bacteria. New
York: Wiley, 1962.
Kornfeld, R. e Kornfeld, S. Assembly of asn-linked oli
gosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 54:631, 1985.
Kornfeld, S. Diseases ofabnormal protein glycosylation:
An emerging area. J. Clin. Investigation 101:1293,
1998.
Neufeld, E. F. Lysosomal storage diseases. Annu. Rev.
Biochem. 60:257, 1991.
Ohtsubo, K., and Marth, J. D. Glycosylation in cellular
mechanisms of health and disease. Cell 126:855, 2006.
Termos Chaves
ácido siálico dolicol fosfato
ácido glucurônico
carboidrato
agrecam epimerização
glicoproteína
glicosaminoglicano
condroitim sulfato glicose-6-fosfato
dermatam sulfato glicose-6-fosfato desidroge
descarboxilação nase
desidrogenação glicosidase
cadeia de glicosaminoglicano, e seus tamanhos e quan
tidades relativas podem variar com desenvolvimento,
idade ou doença. Muitos genes que codificam os es
queletos proteicos dos proteoglicanos e as enzimas da
biossíntese foram clonados, revelando que as proteínas
relevantes pertencem a famílias de origem e possíveis
funções relacionadas.
Schwartz, N. B. Proteoglycans. Em Embryonic
Encyclopedia of Life Sciences. London: Nature Pu
blishing Group, 2000. www.els.net.
Schwartz, N. B. Biosynthesis and regulation of expres
sion of proteoglycans. Front. Biosci. 5:649, 2000.
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Molecular Medicine. New York: Wiley, 2002, 1:284.
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sease, 8. ed., New York: McGraw Hill, 2001.
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P. L. Pentose phosphates in nucleoside interconversion
and catabolism. FEBS Journal 273:1089, 2006.
Zhao, Y. Z., Takahashi, M., Gu, J.-G., Miyoshi, E., Matsu
moto, A., Kitazume, S., e Taniguchi, N. Functional roles
of N-glycans in cell signaling and cell adhesion in can
cer. Cancer Sci. 99:1304, 2008.
heparina sulfato
heparam
glicosilação
glicosiltransferase
NADPH
mucopolissacarídeo
hialuronato oligossacarídeo
oxidação
pirofosforilase
proteoglicano
redução
ribulose-5-fosfato
transamidação
nucleotídeo açúcar via das pentoses fosfato
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS
Questões • CAROL N. ANGSTADT
Questões de Múltipla Escolha
1. Todas as seguintes interconversões de monossaca
rídeos (ou derivados) requerem um intermediário
açúcar ligado a nucleotídeo, exceto
A. galactose 1-fosfato para glicose 1-fosfato.
B. glicose 6-fosfato para manose 6-fosfato.
C. glicose para ácido glucurônico.
D. ácido glucurônico para xilose.
E. glucosamina 6-fosfato para ácido N-acetilneu
ramínico (um ácido siálico).
2. Todas as seguintes afirmações são verdadeiras so
bre o ácido glucurônico, exceto
A. é uma molécula carregada em pH fisiológico.
B. como UDP-derivado, pode ser descarboxilado
a um componente usado na síntese de proteo
glicanos.
C. é um precursor de ácido ascórbico no homem.
D. sua formação, a partir da glicose, está sob con
trole de retroalimentação (feedback) por um
intermediário ligado a UDP.
E. pode ser finalmente convertido em xilulose
5-fosfato e, assim, entrar na via das pentoses
fosfato.
3. NADPH/NADP+ é mantido em um alto nível nas cé
lulas primariamente pela
A. lactato desidrogenase.
B. ações combinadas da glicose 6-fosfato desi
drogenase e da gluconolactonase.
C. a ação da cadeia de transporte de elétrons.
D. troca com NAD+/NADH.
E. ações combinadas de transcetolase e transal
dolase.
4. Fucose e ácido siálico
A. são ambos derivados da UDP-N-acetilglucosa
mina.
B. são as partes da cadeia de carboidratos que
ficam covalentemente ligadas à proteína.
C. podem ser encontrados na estrutura do core
de certas glicoproteínas O-ligadas.
D. são transferidos para uma cadeia de carboi
drato quando ligado ao dolicol fosfato.
E. são a unidade repetitiva dos proteoglicanos.
5. Glicosaminoglicanos
A. são a porção carboidrato das glicoproteínas.
B. contêm grandes segmentos de uma unidade
repetitiva consistindo, geralmente, de uma he
xosamina e um ácido urônico.
C. sempre contêm sulfato.
• 689
D. existem apenas em duas formas.
E. são ligados à proteína por interação iônica.
6. Todas as seguintes são verdadeiras sobre proteo
glicanos, exceto
A. a especificidade é determinada, em parte, pela
ação de glicosiltransferases.
B. a síntese é regulada, em parte, pela inibição
por UDP-xilose da conversão de UDP-glicose
em ácido UDP-glucurônico.
C. a síntese envolve sulfatação de resíduos de
carboidratos por PAPS.
D. a síntese do esqueleto proteico está em equilí
brio com a síntese dos resíduos polissacarídi
cos.
E. a degradação é catalisada, no citosol, por gli
cosidases não-específicas.
Questões 7 e 8: Galactosemia é uma incapacidade de
transformar galactose em glicose e pode levar a pro
blemas como formação de catarata, crescimento insu
ficiente, retardo mental ou morte eventual por lesão
hepática. Galactose é reduzida a galactitol, que inicia a
formação de catarata. O acúmulo de galactose 1-fosfato,
a condição mais séria, leva à insuficiência hepática.
7. A forma mais severa de galactosemia
A. é uma deficiência genética de uma uridilil
transferase que troca galactose 1-fosfato por
glicose, na UDP-glicose.
B. resulta de uma deficiência de uma epimerase.
C. é insignificante em recém-nascidos, mas um
problema importante mais tarde.
D. é um defeito na galactoquinase.
E. esperar-se-ia que interferisse com o uso de
frutose, bem como de galactose, porque a en
zima deficiente é comum ao metabolismo de
ambos os açúcares.
8. UDP-galactose
A. deve ser formada a partir de galactose 1-fosfato.
B. é geralmente o primeiro açúcar ligado ao doli
colfosfato.
C. é usado na síntese de condroitim sulfato.
D. não pode levar à formação de derivados de
açúcar como ácido glucurônico ou xilose.
R. é o precursor direto de N-acetilgalactosamina.
Questões 9 e 10: Um bebê de seis meses de idade apre
sentou hipoglicemia, vômitos, diarreia, enteropatia com
perda de proteína e fibrose hepática. Medida do estado
de glicosilação da transferrina sérica endógena revelou
CDG tipo Ib (doença congênita de glicosilação), que é
um defeito na atividade da fosfomanose isomerase.
690 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
9. O papel da fosfomanose isomerase é a interconver
são de
A. manose 6-fosfato e manose 1-fosfato.
B. glicose 6-fosfato e manose 6-fosfato.
C. frutose 6-fosfato e manose 6-fosfato.
D. frutose 1-fosfato e manose 1-fosfato.
E. glicose 6-fosfato e manose 1-fosfato.
10. Na CDG tipo Ic, um defeito em uma enzima que
transfere um resíduo glucosil para um precursor
dolicol pirofosfato alta-manose, a estrutura de car
boidrato seria parte de
A. glicoproteína N-ligada.
B. glicoproteína O-ligada.
C. proteoglicano.
D. glicosaminoglicano.
E. lipídeo complexo.
Questões 11 e 12: Um bebê apresentava múltiplas
anomalias esqueléticas, com as mais proeminentes sen
do tronco curto e membros pequenos. A urina estava
livre de oligossacarídeos parcialmente degradados ou
oligossacarídeos de proteoglicanos. A concentração de
sulfato no sangue e a atividade de hidrolase ácida ex
tracelular estavam normais.
Respostas
1. B A glicose e a manose fosfatos estão, ambas, em
equilíbrio com a frutose 6-fosfato por ação das fos
fo-hexose isomerases. A: ocorre por meio de uma
epimerase, no nível de UDP-galactose. C e D: essa
oxidação da glicose é catalisada pela UDP-glicose
desidrogenase, e o produto pode ser descarboxi
lado a UDP-xilose. E: de novo, uma epimerização
ocorre no intermediário nucleotídeo.
2. C O homem não produz ácido ascórbico. A: o
grupo ácido carregado aumenta a solubilidade em
água, que é um importante papel fisiológico do
ácido glucurônico, por exemplo, no metabolismo
de bilirrubina. B e D: descarboxilação de ácido
UDP-glucurônico dá UDP-xilose, que é um potente
inibidor da oxidação da UDP-glicose ao ácido. E: a
redução de ácido D-glucurônico a ácido L-gulônico
leva a ascorbato, bem como a xilulose 5-fosfato
para a via das pentoses fosfato.
3. B Embora a reação da glicose 6-fosfato desidro
genase, específica para NADP, seja reversível, hi
drólise da lactona assegura que o equilíbrio geral
fique deslocado na direção de NADPH. A e C: essas
usam NAD, não NADP. D: isso não ocorre. E: es
sas enzimas são partes da via das pentoses fosfato,
mas catalisam reações livremente reversíveis, que
não usam NADP.
11. Provavelmente a doença descrita é causada por um
defeito
A. na capacidade de gerar manose 6-fosfato.
B. na atividade de glicosidase lisossomal.
C. no gene que codifica um transportador de sul
fato.
D. na PAPS sintetase.
E. em uma sulfatase.
12. Sulfatação é um importante componente da sínte
se
A. da maioria dos proteoglicanos.
B. do hialuronato.
C. da maioria das glicoproteínas.
D. da bilirrubina conjugada.
E. de todos os anteriores.
Problemas
13. Qual é a função da transaldolase e da transquetola
se no metabolism da glicose?
14. Frutosuria essencial é um defeito na frutoquina
se, enquanto intolerância à frutose é um defeito na
frutose 1-fosfato aldolase. Qual dessas duas doenças
leva a severa hipoglicemia após ingestão de frutose
e por quê?
4. C A estrutura do core também contém galactose
e N-acetilgalactosamina. A: apenas ácido siálico é.
Fucose vem de CDP-manose. B: geralmente en
contrados na periferia do carboidrato. D: estrutura
do core dos carboidratos N-ligados contém manose
e N-acetilglucosamina. E: a unidade repetitiva é
hexosamina e ácido urônico.
5. B Esta é uma distinção importante das glicopro
teínas que, por definição, não têm unidade repeti
tiva em série. A: esses são os carboidratos dos pro
teoglicanos. C: a maioria sim, mas hialuronato, não.
D: existem pelo menos seis classes diferentes. E:
carboidratos estão ligados por ligações covalentes.
6. E A degradação é lisossomal; deficiência de uma
ou mais hidrolases lisossomais leva ao acúmulo de
proteoglicanos nas mucopolissacaridoses. A: espe
cificidade de substrato rigorosa para as enzimas é
importante na determinação do tipo e da quantida
de dos proteoglicanos sintetizados. A formação de
aceptores proteicos específicos para o carboidrato
também é importante. B e D: os níveis de ambos,
xilose e ácido glucurônico, são controlados assim;
xilose é o primeiro açúcar adicionado na síntese de
quatro dos seis tipos, e acumular-se-ia se a síntese
do esqueleto proteico diminuisse. C: isso é necessá
rio para a formação da maioria dos proteoglicanos.
 CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS
7. A B: a epimerase está normal. C: galactose é um
importante açúcar para bebês. D: nessa doença, a
galactoquinase está normal, mas está deficiente na
forma leve da doença. E: metabolismo de frutose
não utiliza a uridililtransferase que está deficiente
na galactosemia.
8. C A cadeia inicial de carboidrato construída so
bre o grupo –OH de uma serina contém duas galac
toses mais uma N-acetilgalactosamina, fornecidas
como UDP-derivados. A: também pode ser formado
por epimerização da UDP-glicose. B: esse é uma N
-acetilgalactosamina. D: como pode ser epimeri
zado a UDP-glicose, pode levar a esses produtos.
E: esta é uma das interconversões mais complexas
que ocorrem por meio de derivados ligados a nucleo
tídeos de glicose e ramnose.
9. C Esta é semelhante à interconversão glicose
6-fosfato-frutose 6-fosfato. A: mutases catalisam a
conversão 1-6 fosfato. B, D e E: essas conversões
não ocorrem diretamente.
10. A Uma cadeia de carboidratos construída sobre
dolicol fosfato é característica de glicoproteínas
N-ligadas. B, C e D: síntese de glicoproteínas O
-ligadas envolve a adição sequencial à N-acetilga
lactosamina ligada a serina ou treonina. E: dolicol
• 691
fosfato é um lipídeo, mas é eliminado quando a ca
deia de carboidrato é adicionada à proteína.
11. D Essas anomalias estruturais estão associadas a
defeitos na sulfatação dos proteoglicanos. A: isso
levaria a uma incapacidade de direcionar hidro
lases ácidas para os lisossomos e, assim, aumen
taria sua concentração extracelular. B e E: essas
são enzimas lisossomais cuja deficiência levaria a
oligossacarídeos parcialmente degradados na uri
na. C: falta de um transportador levaria a níveis de
sulfato elevados no soro.
12. A B: hialuronato é um glicosaminoglicano que não
é sulfatado. C: glicoproteínas não contêm sulfato. D:
bilirrubina é conjugada com ácido glucurônico.
13. 3 pentoses fosfatos (ribose 5-fosfato + 2 xilulose
5-fosfato) são convertidas em 2 frutose 6-fosfato e gli
ceraldeído 3-fosfato pela transladolase e pela trans
cetolase, via uma série de transferências de 2-carbo
nos e 3-carbonos. Essas reações são reversíveis.
14. A falta de frutoquinase causa acúmulo de frutose,
que é excretada. A falta de aldolase resulta em au
mento de frutose 1-fosfato, que sequestra fosfato
inorgânico celular, inibindo a capacidade da célula
gerar ATP.
692 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
PARTE IV CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOS I: … • 693
Vias Metabólicas e seu controle

17
Metabolismo Fígado

Ácidos graxos Glicose

gluconeogênese
deUtilização
e
Armazenamento
Lipídeos I:deSíntese, AcetilCoA

corpos*
Glicerol

cetônicos

Ácidos Graxos e Triacilgliceróis

Martin D. Snider
Professor Associado, Case Western Reserve University School of Medicine

J. Denis McGarry (falecido)

Professor Titular, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Richard W. Hanson
Professor Leonard & Jean Skeggs de Bioquímica, Case Western Reserve University School of
Medicine

CONTEÚDO CORRELAÇÕES CLÍNICAS

17.1 INTRODUÇÃO, 694 17.1 Obesidade, 697
17.2 ACILGLICERÓIS,
NATUREZA QUÍMICA
695 DE ÁCIDOS GRAXOS E 17.2 Papel Chave do Metabolismo de Ácidos Graxos
no Diabetes Tipo 2: Um Tributo a J. Denis Mc
17.3 GRAXOS
TRANSPORTE
E SEUS
INTERÓRGÃOS
PRODUTOS PRIMÁRIOS,
DE ÁCIDOS696 Garry, 698
17.3 Ciclo Triacilglicerol/Ácido Graxo, 710
17.4 700
SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS: LIPOGÊNESE, 17.4 Deficiências Genéticas no Transporte por Carni
tina ou na Carnitina Palmitoil Transferase, 713
17.5 COMO
ARMAZENAMENTO
TRIACILGLICERÓIS,
DE ÁCIDOS
707 GRAXOS 17.5 Deficiências Genéticas das Acil-CoA Desidroge
nases, 714
17.6 UTILIZAÇÃO
DUÇÃO DE ENERGIA,
DE ÁCIDOS
709GRAXOS PARA PRO- 17.6 Doença de Refsum, 717
17.7 Corpos Cetônicos Como Combustíveis: A Dieta
17.7 721
REGULAÇÃO DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS, de Atkins, 719
17.8 Ácidos Graxos Como Moléculas Regulatórias, 722
694 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Conceitos Chaves
• Triacilgliceróis são moléculas hidrofóbicas que
constituem a principal reserva de combustível em
todos os organismos. Em mamíferos, a maioria dos
triacilgliceróis é encontrada no tecido adiposo.
• No estado alimentado, há deposição de gordura,
como triacilglicerol, no tecido adiposo, embora o te
cido adiposo quebre o triacilglicerol para fornecer
combustível para outros tecidos durante o jejum.
• Os ácidos graxos são sintetizados principalmente
no fígado pela adição sequencial de unidades de
dois carbonos, usando acetil-CoA derivado da gli
cose da dieta e de outros combustíveis.
• Os ácidos graxos podem ser modificados por elon
gação da cadeia e adição de duplas ligações para
produzir uma família de moléculas. Em mamíferos,
alguns ácidos graxos poli-insaturados só podem
ser produzidos a partir de precursores, ácidos gra
xos essenciais da dieta.
• A maioria dos tecidos pode construir triacilglice
róis a partir de acil-CoAs e glicerol 3-fosfato.
Os ácidos graxos são convertidos em acetil-CoA
•
por b-oxidação e, depois, usados como combustível
em muitos tecidos.
• Durante jejum prolongado, os corpos cetônicos,
acetoacetato e b-hidroxibutirato, são sintetizados
a partir de acetil-CoA no fígado. O uso de corpos
cetônicos como combustível pelo cérebro e outros
tecidos é uma importante adaptação ao jejum pro
longado.
• A síntese e a quebra de ácidos graxos são regula
das para promover armazenamento de energia no
estado alimentado e mobilização de energia no es
tado de jejum. Além disso, a mobilização de ácidos
graxos a partir do triacilglicerol armazenado é re
gulada para atender às necessidades celulares de
energia.

17.1 INTRODUÇÃO
Os lipídeos são moléculas hidrofóbicas, o que sig
nifica que não são solúveis em água e tendem a se au
toassociarem em fases lipídicas separadas. A maioria
dos lipídeos contém, ou é derivada de, ácidos graxos
(Figura 17.1). Os lipídeos têm muitas funções biológicas
importantes. Os triacilgliceróis (Figura 17.2) formam
a principal reserva de combustível do corpo. Outros li
pídeos, incluindo os fosfolipídeos, os glicolipídeos e o
colesterol, são constituintes cruciais das membranas FIGURA 17.1 Ácidos graxos de cadeia longa.
biológicas; as singulares propriedades de superfície ati Esquerda: palmítico (saturado). Direita: cis-palmitoleico (in
va dessas moléculas permitem a elas formar o esqueleto saturado). Esquema de cores: H, branco; C, cinza; O, vermelho.
da membrana, separando e definindo compartimentos Cortesia de Dr. Daniel Predecki, Shippensburg University, PA.
aquosos em células. Os lipídeos superfície-ativos têm
outras funções importantes, incluindo manutenção da
integridade alveolar nos pulmões e solubilização de
substâncias não-polares nos fluidos corpóreos. Final
mente, alguns lipídeos são importantes moléculas sina
lizadoras. Ácidos graxos, hormônios esteróides e eico
sanóides, incluindo prostaglandinas, são importantes
na comunicação entre as células. Outros lipídeos têm
funções sinalizadoras dentro das células.

O metabolismo de ácidos graxos e triacilgliceróis é

tão importante que desequilíbrios e deficiências nesses
processos podem ter sérias consequências patológicas
no homem. Estados de doenças relacionados com esses
lipídeos incluem obesidade, diabetes mellitus, hyper FIGURA 17.2 Triacilglicerol (1-palmitoil-2,3-dioleil
triglyceridemia e cetoacidose. Existem ainda doenças glicerol).
Ver Figura 17.1 para esquema de cores.
genéticas humanas que afetam o metabolismo de ácidos
Cortesia de Dr. Daniel Predecki, Shippensburg University, PA.
graxos, incluindo a doença de Refsum e deficiências de
carnitina e na oxidação de ácidos graxos.

O Apêndice descreve a nomenclatura e a química

dos lipídeos, e uma discussão sobre a digestão e a ab
sorção de gorduras é apresentada no Capítulo 25.

17.2 NATUREZA QUÍMICA
DE ÁCIDOS GRAXOS E
ACILGLICERÓIS
Ácidos Graxos São Cadeias Alquila
Terminando em um Grupo Carboxila
Os ácidos graxos (Figura 17.1) consistem de uma
cadeia alquila com um grupo carboxila terminal. A fór
mula básica de uma espécie completamente saturada
é CH3(CH2)nCOOH. Quase todos os ácidos graxos hu
manos têm um número par de átomos de carbono, em
bora alguns organismos sintetizem moléculas com um
número ímpar. O homem pode usar o último para obter
energia, mas são muito pouco incorporados em lipídeos
mais complexos. Ácidos graxos insaturados ocorrem
comumente, com até seis duplas ligações por cadeia. Se
houver mais de uma dupla ligação por molécula, elas
são separadas por um grupo metileno (—CH2—). As
duplas ligações estão quase sempre na configuração
cis, que induz uma dobra na cadeia de ácido graxo,
impedindo o ajuste ordenado dessas cadeias em fases
lipídicas. Por induzirem desordem, duplas ligações di
minuem a temperatura de fusão e aumentam a fluidez
das fases lipídicas.
A maioria dos ácidos graxos humanos tem 16-20
carbonos, mas moléculas C14 são encontradas ligadas a
proteínas, e ácidos graxos muito longos são encontra
dos em lipídeos complexos do sistema nervoso.
Estes incluem o ácido nervônico (22:1) e o ácido do
cosa-hexaenóico, um ácido C22 que tem seis duplas liga
ções (Figura 17.3). Alguns ácidos graxos com um grupo
α-OH são encontrados como constituintes de lipídeos
de membrana. Ácidos graxos de cadeia ramificada, que
têm grupos metil em uma ou mais posições ao longo
da cadeia, são também encontrados em alguns animais,
incluindo o homem. Esses ácidos graxos conferem
propriedades físicas específicas a algumas moléculas
secretórias e estruturais. Por exemplo, grandes quan
tidades de ácidos graxos de cadeia ramificada, particu
larmente o ácido isovalérico (Figura 17.4), ocorrem em
lipídeos de estruturas de ecolocalização de mamíferos
marinhos.
O O
H2C O C
O O
HC O C
H2COCR
FIGURA 17.5 Acilgliceróis. Triacilglicerol
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 695
CH3 (CH2)7 CHCH(CH2)13COOH
Ácido nervônico
CH3 (CH2 CHCH)6 (CH2)2COOH
Ácido todo-cis-4,7,10,13,16,19,-docosa-hexaenóico
FIGURA 17.3 Ácidos graxos de cadeia muito longa.
Os ácidos graxos mais abundantes no homem são
apresentados na Tabela 17.1. Os símbolos mostram o
número de átomos de carbono e, depois dos dois pon
tos, o número de duplas ligações. Os átomos de carbono
são numerados a partir do carbono da carboxila. As lo
calizações das duplas ligações são apresentadas entre
parêntesis, usando o número do átomo de carbono do
lado carboxila da ligação.
CH3
CH3 CHCH2COOH
FIGURA 17.4 Ácido isovalérico.
A Maioria dos Ácidos Graxos no
Homem Ocorre como Triacilgliceróis
Os ácidos graxos são armazenados primariamente
como ésteres de glicerol (Figuras 17.2 e 17.5). A maioria
dos ácidos graxos no homem é encontrada em triacil
gliceróis, nos quais todos os três grupos hidroxila do
glicerol são esterificados com ácidos graxos. Compostos
esterificados com um (monoacilgliceróis) ou dois (dia
cilgliceróis) ácidos graxos ocorrem em quantidades
relativamente pequenas, principalmente como inter
mediários metabólicos da síntese e da degradação de li
pídeos contendo glicerol. Os nomes triviais mono-, di- e
triglicérides são também usados para esses compostos.
A maioria dos triacilgliceróis tem ácidos graxos di
ferentes esterificados nas três posições do glicerol. A
distribuição de ácidos graxos é influenciada por mui
tos fatores, incluindo dieta e localização anatômica da
molécula armazenada. No homem, a maioria dos ácidos
graxos é saturada ou contém uma dupla-ligação, com
ácido oleico (18:1) sendo o mais comum. Embora tria
cilgliceróis sejam facilmente catabolizados, são, compa
O
R H2COCR H2COCR H2C OH
O
R HCO C R HC OH HC OCR
H2COH H2COH H2COH
Diacilglicerol 1–Monoacilglicerol 2–Monoacilglicerol
696 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

TABELA 17.1 Ácidos Graxos Importantes para o Homem

Nome Fórmula Numérica Funções no homem
Ácido fórmico 1
Ácido propiônico
acético 2:0
3:0
Produzido pelo metabolismo de ácidos graxos de cadeia ímpar,
bem como de isoleucina, valina e metionina
Ácido butírico 4:0 Triacilgliceróis do leite contêm ácidos graxos de cadeia curta
Ácido mirístico 14:0 Ligado covalentemente a algumas proteínas
Ácido palmítico 16:0 Produto da ácido graxo sintase
Ácido palmitoleico 16:1(9) Ácidos graxos com 16-18 carbonos compreendem a maior parte dos
ácidos graxos em triacilgliceróis e lipídeos complexos
Ácido esteárico 18:0
Ácido oleico 18:1(9)
Ácido linoleico 18:2(9,12) Ácido graxo essencial
Ácido linolênico 18:3(9,12,15) Ácido graxo essencial
Ácido araquidônico 20:4(5,8,11,14) Precursor de prostaglandinas e outros eicosanóides
Ácido lignocérico 24:0
Ácido nervônico 24:1(15) Enriquecido em esfingolipídeos

rativamente, quimicamente inertes. Os ácidos graxos
muito insaturados de triacilgliceróis são muito mais
susceptíveis à oxidação não-enzimática.
Hidrofobicidade dos Triacilgliceróis É
Importante para Suas Funções
Os triacilgliceróis e outros lipídeos complexos são
insolúveis em água porque as longas cadeias hidrocar
bônicas dos ácidos graxos constituintes não formam
pontes de hidrogênio. Consequentemente, tendem a
se associar entre si ou com outros grupos hidrofóbi
cos, como esteróis e as cadeias laterais de aminoácidos
hidrofóbicos. Essa insolubilidade em água é essencial
para o armazenamento de triacilgliceróis e para a mon
tagem das membranas biológicas.
Os triacilgliceróis são formas muito mais eficientes
para o armazenamento de energia do que o glicogênio.
Numa base de peso, triacilgliceróis rendem quase 2½
vezes mais ATP na oxidação completa do que o glico
gênio. Além disso, os triacilgliceróis são armazenados
sem água associada, enquanto o glicogênio é hidrofílico
e liga cerca de duas vezes o seu peso em água. Portanto,
o rendimento energético por grama de triacilglicerolar
mazenado é cerca de quatro vezes a do glicogênio hidra
tado. Seres humanos armazenam muito mais combus
tível como triacilglicerol do que como glicogênio. Uma
pessoa média, pesando 70 kg, armazena cerca de 250 g
de glicogênio no fígado e no músculo. Isso representa
cerca de 1.000 kcal de energia, o que é menos do que a
necessidade de um dia. Diferentemente, o mesmo indi
víduo armazena ∼16 kg de triacilglicerol, o que fornece
energia suficiente para sobreviver a várias semanas de
jejum. Ao contrário dos estoques de glicogênio e amino
ácidos, que são limitados, os estoques de triacilglicerol
podem se expandir muito, dependendo da ingestão ca
lórica. Isso torna o triacilglicerol uma excelente reserva
de combustível, mas também pode levar à obesidade e,
em alguns casos, diabetes (Correlações Clínicas 17.1 e
17.2). O tecido adiposo é uma fonte significativa de hor
mônios que regulam o apetite, e a gordura subcutânea é
também importante na regulação da temperatura por
que fornece uma camada de isolamento.
17.3 TRANSPORTE
INTERÓRGÃOS DE
ÁCIDOS GRAXOS E SEUS
PRODUTOS PRIMÁRIOS
Em todos os mamíferos, o transporte e o armazena
mento de ácidos graxos é regulado pelo estado dietético.
O triacilglicerol é armazenado no estado alimentado, com
deposição no tecido adiposo. Durante o jejum, o triacilgli
cerol do tecido adiposo é hidrolisado, e os produtos são
distribuídos por todo o corpo para serem usados para pro
dução de energia. À medida que o jejum progride, o fígado

CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.1
Obesidade
A obesidade tornou-se uma epidemia em todo o
mundo. Estima-se que, em 2004, 25% da população
dos Estados Unidos era obesa, e projeta-se que esse
número aumente para 40% até 2020. Números igual
mente preocupantes foram observados em países com
economia em rápido crescimento, como China e Índia.
A definição de obesidade é arbitrária e é baseada em
estimativas de peso corpóreo ideal (IBW, ideal body
weight), isto é, o peso corpóreo associado com menores
índices de morbidade e mortalidade. O sobrepeso é de
finido como o peso até 20% acima do IBW, e obesidade
é o peso que está 20% (ou mais) acima do IBW. O índice
de massa corpórea (BMI, body mass index) é outra
medida comumente usada para a obesidade. É calcula
do dividindo-se o peso (em quilogramas) pela altura2
(em metros quadrados). Um indivíduo com BMI de 25
ou mais está com sobrepeso, e com 30 ou mais é con
siderado obeso. A localização anatômica da deposição
de gordura é um bom indicador do risco de morbidade
e mortalidade da obesidade; uma distribuição central
da gordura do corpo (tecido adiposo abdominal) é um
maior risco à saúde do que uma distribuição mais peri
férica de gordura (tecido adiposo subcutâneo).
A obesidade é parte do que foi chamado Síndrome
Metabólica, um conjunto de sintomas que incluem obe
sidade central, pressão sanguínea elevada, triglicérides
elevados e baixos níveis de lipoproteína de alta densida
de no sangue, bem como resistência à insulina. Até 45
milhões de americanos têm essa síndrome. Indivíduos
com Síndrome Metabólica têm alto risco de diabetes e
doença cardiovascular. A ligação bioquímica entre obe
sidade e diabetes é discutida na Correlação Clínica 17.2.
Por causa desses riscos à saúde, o controle da obesidade
é um importante objetivo de saúde pública.
As causas da obesidade e as razões que levam a
esse dramático aumento nas populações humanas são
complexas. Doenças endócrinas, como hipotireoidismo
ou Doença de Cushing (superprodução de corticoste
roides) são causas raras, assim como mutações em ge
nes que codificam hormônios envolvidos no controle da
ingestão de alimentos, como leptina ou seu receptor.
Parece mais provável que a predisposição genética de
um indivíduo, juntamente com o ambiente (escolha de
alimentos, nível de exercício), resultem em obesida
de. Uma mudança no estilo de vida é, evidentemente,
converte ácidos graxos em corpos cetônicos, acetoace
tato e b-hidroxibutirato, que são liberados no sangue e
tornam-se uma importante fonte de energia para muitos
tecidos. Esses processos são resumidos na Figura 17.6.
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 697
um elemento importante na obesidade epidêmica. Um
consumo aumentado de alimentos ricos em gordura e
carboidratos, juntamente com uma diminuição no exer
cício é a principal causa de ganho de peso e deposição
de gordura corporal em populações em todo o mundo.
Portanto, a obesidade não é uma única doença, mas um
grupo heterogêneo de condições com múltiplas causas.
Infelizmente, a obesidade é uma condição raramen
te curável; seu tratamento continua sendo um problema
médico persistente. O procedimento padrão de reduzir
ingestão calórica e aumentar o gasto energético é inefi
ciente em indivíduos obesos uma vez que, para ser efe
tivo, deve ser continuado indefinidamente para garantir
um peso corporal reduzido. Indivíduos muito obesos,
frequentemente, recorrem a procedimentos cirúrgicos
para remover gordura indesejada ou reduzir o estôma
go para impedir fome e absorção de alimento. Várias in
tervenções farmacológicas foram usadas no tratamento
da obesidade. Estas incluem o uso de compostos como
b-fenilamina, que inibe seletivamente a recaptação de
norepinefrina, serotonina e dopamina. Esse composto
reduz a ingestão de alimentos e aumenta a termogênese.
Outra abordagem é bloquear a absorção de gordura usan
do orlistat, que bloqueia a lipase pancreática, diminuin
do, assim, a digestão de triacilglicerol. Demonstrou-se
que o composto termogênico (que aumenta a geração de
calor) efedrina aumenta em 10% o consumo de oxigênio
no homem, quando combinado com cafeína. Entretan
to, uma parte importante da perda de peso observada
com essa combinação de drogas deve-se à ingestão dimi
nuída de alimentos. Novas abordagens potencialmente
importantes para o tratamento da obesidade incluem o
desenvolvimento de compostos que regulem a saciedade.
Sabe-se há muito tempo que peptídeos gastrointestinais
como colecistocinina e o peptídeo tipo-glucagon redu
zem a ingestão de alimentos. Além disso, antagonistas
do receptor de canabinoide no cérebro reduzem o ape
tite. Moléculas pequenas que atuam por se ligarem a es
ses receptores são candidatas a drogas que poderiam ser
usadas para controlar o apetite.
Hirsch, J. Salens, L. B. e Aronne, L. J. Obesity. Em: K.
L. Becker (Ed.). Principles and Practice of Endocrinology
and Metabolism, 3. ed. New York: Lippincott, Williams and
Wilkins, 2001, p. 1239; e Freidmann, J. M. Obesity in the new
millennium. Nature 404:632, 2000.
O transporte de lipídeos apresenta problemas sin
gulares, porque essas moléculas (especialmente triacil
gliceróis, colesterol e seus ésteres) são insolúveis em
água. Consequentemente, os lipídeos são transportados
na corrente sanguínea em lipoproteínas plasmáticas ou
698 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.2
Papel Chave do Metabolismo de Ácidos Graxos no Diabetes Tipo 2: Um Tributo a J. Denis McGarry
O falecido Denis McGarry, um colaborador de lon
ga data deste livro, escreveu um artigo premonitivo em
1992 entitulado “What if Minkowski had been ageusic?
An alternative angle on diabetes”. Oskar Minkowski
(1858-1931) e Josef von Mering foram os primeiros a
perceber que o pâncreas produz uma substância que
regula o nível de glicose no sangue; sua pesquisa levou,
finalmente, ao isolamento da insulina das células b do
pâncreas. O conceito de diabetes como uma doença do
metabolismo de carboidratos começou com observa
ções antigas de que a urina diabética é doce. Diz a lenda
que o Dr. Minkowski colocou seu dedo na urina de um
paciente diabético, provou e notou que era “doce como
mel”. Até hoje, o diabetes é amplamente visto como
um desequilíbrio no metabolismo de carboidratos. Dr.
McGarry levantou a suposição humorística de que, se
Minkowski fosse ageusico (ou seja, incapaz de sentir sa
bor), mas pudesse sentir o cheiro de acetona na urina,
o diabetes teria sido classificado como uma doença do
metabolismo de lipídeos, e não de carboidratos. Esta é
uma importante percepção no diabetes tipo 2 (não-in
sulino-dependente), que está associado com obesidade
e resistência à insulina.
Como a maior parte das reservas energéticas huma
nas é triacilglicerol, esse combustível é extremamente
importante, particularmente durante o jejum. Após uma
refeição, a glicose é rapidamente removida do sangue e
usada para obtenção de energia ou armazenada como
glicogênio; em algumas horas, o homem muda para oxi
dação de ácidos graxos como principal fonte de energia,
com os corpos cetônicos tornando-se importantes du
rante o jejum prolongado. Após três dias de jejum, até o
cérebro metaboliza corpos cetônicos. O metabolismo de
gordura em lugar do suprimento limitado de glicose é
chamado economia de combustível. Os ácidos graxos
desempenham um papel importante nesse processo por
inibirem a utilização de glicose no músculo esqueléti
co. Em 1963, Phillip Randle e colaboradores propuse
ram o que é hoje conhecido como a hipótese de Randle,
que afirma que a oxidação de ácidos graxos bloqueia o
metabolismo de glicose por inibir enzimas regulatórias
chaves envolvidas na utilização de glicose, incluindo a
fosfofrutoquinase e o complexo piruvato desidrogena
se (ver Capítulo 15) e inibe a síntese de glicogênio no
músculo esquelético. Ácidos graxos também diminuem
muito a captação de glicose do sangue por bloquearem
o recrutamento de GLUT 4 do retículo endoplasmático
para a superfície celular. Isso se deve, em parte, à ati
vação de isoformas específicas de proteína quinase C,
bem como do fator de transcrição NF-kB, por acil-CoAs
geradas pelo metabolismo de ácidos graxos.
Embora o efeito de economia de combustível dos
ácidos graxos seja uma clara vantagem para a so
brevivência, existe também uma desvantagem na
obesidade, que é frequentemente caracterizada por
uma alta concentração de ácidos graxos no sangue.
Isso reduz a captação e o metabolismo de glicose no
músculo esquelético, resultando em um aumento nos
níveis de jejum da glicose sanguínea e um aumento
concomitante na secreção de insulina. A condição re
sultante é chamada resistência à insulina (níveis
elevados de glicose e insulina no sangue). Nos está
gios precoces da resistência à insulina, as células b
pancreáticas produzem insulina suficiente para regu
lar a glicose sanguínea. Entretanto, a superprodução
prolongada de insulina pode causar insuficiência das
células b, resultando em diabetes tipo 2. Embora essa
progressão não ocorra em todos os pacientes obesos,
a resistência à insulina evolui para diabetes em ~40%
dos pacientes ao longo de 5-10 anos. Atualmente,
mais de 220 milhões de pessoas em todo o mundo
têm diabetes tipo 2 e há uma previsão de crescimento
dramático desse número nos próximos 20 anos. Mais
alarmante, diabetes tipo 2 substituiu diabetes tipo 1
como a forma predominante dessa doença entre as
crianças. A prevenção e o tratamento do diabetes
tipo 2 são, é claro, importantes prioridades médicas;
em muitos casos, a resistência à insulina é reversível
com a perda de peso e o aumento de exercício, parti
cularmente em estágios iniciais.
Em seu artigo, Denis McGarry observou que a rees
terificação de ácidos graxos em triacilglicerol é um fa
tor crítico na regulação de sua concentração no sangue.
Essa previsão é amplamente suportada pelo amplo uso
clínico atual das drogas antidiabéticas tiazolidinedio
nas, que agem no receptor nuclear PPARγ2. Essas dro
gas baixam os ácidos graxos livres do plasma, em parte
aumentando a velocidade de reesterificação de ácidos
graxos em triacilgliceróis no tecido adiposo branco, re
movendo, assim, ácidos graxos do sangue. Dr. McGar
ry estava, claramente, à frente do seu tempo ao prever
a importância da regulação do metabolismo de ácidos
graxos no controle do diabetes.
McGarry, J. D. What if Minkowski had been ageusic? An
alternative angle on diabetes. Science 285:766, 1992; Roden,
M. How FFA inhibits glucose utilization in human skeletal
muscle. News Physiol. Sci. 19:92, 2004; Randle, P. J. Regula
tory interactions between lipids and carbohydrates: the glu
cose fatty acid cycle after 35 years. Diabetes Metabol. Rev.
14:263, 1998; e Zimmet, P. Alberti, K. G. M. M. e Shaw, J. Glo
baland social implications of the diabetes epidemic. Nature
414:782, 2001
 CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 699

(a) Estado alimentado Fígado Glicose e então, acondicionados em quilomícrons, uma

outros combustíveis
lipoproteína plasmática rica em triacilglice
Acetil CoA róis (p. 1076). Os quilomícrons são secreta
Intestino delgado Ácidosgraxos dos na linfa e depois circulam na corrente
sanguínea.
Triacilglicerol da dieta Triacilglicerol
O fígado é outra fonte de triacilgliceróis
Quilomícrons Lipoproteínas de no estado alimentado. Ácidos graxos são sin
densidade muito baixa
tetizados nesse tecido a partir do excesso
Triacilglicerol em quilomícrons e de carboidratos e aminoácidos. Esses ácidos
Corrente sanguínea
lipoproteínas de densidade muito baixa
graxos são ligados em triacilgliceróis e acon
dicionados em lipoproteínas de muito baixa
Ácidos graxos Ácidos graxos densidade (VLDL), uma segunda lipoproteí
(oxidados para na rica em triacilgliceróis, que é secretada na
obtenção de energia)
Triacilglicerol corrente sanguínea (p. 741).
Músculo
Os triacilgliceróis nos quilomícrons e nas
Tecido adiposo
VLDL circulantes são hidrolisados pela lipo
proteína lipase, localizada na superfície das
células endoteliais dos capilares de tecidos
(b) Estado de jejum como tecido adiposo e músculo esquelético.
Cérebro
Corpos cetônicos* Fígado A apoproteína ApoC-II, que é encontrada em
Ácidos graxos Glicose
quilomícrons e VLDL, ativa o processo por li
gar as Os
obtenção
(oxidados
Acetil CoA Corpos*cetônicos Ácidos de
paracetônicos
Acetil CoA
graxos•albumina Glicerol Glicerol
gluconeogênese tos da lipoproteínas com a enzima.
ação da lipoproteína lipase são produ
ácidos
de
obtenção
(oxidadosenergia)
para energia) corpos* graxos e glicerol. Os ácidos graxos livres são
utilizados no tecido em que ocorre a hidró
lise. O glicerol é transportado pela corrente
Corrente sanguínea sanguínea e captado pelo fígado, onde é usa
do para glicólise ou gluconeogênese.
Glicerol
+ A lipoproteína lipase está presente em al
Ácidos graxos
Ácidos graxos (+ Corpos cetônicos*)
tos níveis no tecido adiposo, no músculo car
(oxidados para obtenção de díaco e no músculo esquelético, permitindo
energia) Triacilglicerol
que esses tecidos utilizem os triacilgliceróis
Músculo e outros tecidos Tecido adiposo
das lipoproteínas. No tecido adiposo, os pro
dutos da lipoproteína lipase são captados e
FIGURA 17.6 Transporte interórgãos de ácidos graxos. ligados em triacilgliceróis, permitindo depo
(a) No estado alimentado, há deposição de triacilglicerol no tecido adiposo. As sição de combustível (p. 708). No músculo, os
fontes são gordura da dieta e ácidos graxos sintetizados no fígado, a partir dos ácidos graxos produzidos pela ação da lipase
excessos de carboidratos e aminoácidos. (b) No estado de jejum, triacilglice
são captados e usados para gerar energia,
róis são hidrolisados, e ácidos graxos livres e glicerol são liberados no sangue.
*Durante o jejum, o fígado sintetiza corpos cetônicos, que se tornam um im
embora alguma síntese de triacilgliceróis
portante combustível no sangue, à medida que o jejum progride. ocorra nesse tecido.

ligados a proteínas. Além disso, o transporte de triacil Transporte de Lipídeos no Estado de

gliceróis através das membranas, geralmente, envolve
quebra a constituintes menores, pelas lipases.
Transporte de Lipídeos no Estado
Alimentado
Os triacilgliceróis da dieta são digeridos no estôma
go e no intestino delgado por lipases gástrica e pancre
ática (p. 1076). Os principais produtos são 2-monoacilgli
ceróis e ácidos graxos livres, que são absorvidos pelas
células epiteliais que revestem o intestino delgado.
Estas células ligam os ácidos graxos e os monoacilgli
ceróis absorvidos em triacilgliceróis (p. 707), que são,
Jejum
Os triacilgliceróis armazenados no tecido adiposo
são mobilizados para uso como combustível no estado
de jejum. Esse processo é iniciado pela lipase hormô
nio-sensível, que fica localizada nos adipócitos. Essa
enzima é ativada quando é fosforilada pela proteína
quinase A cAMP-dependente. Por outro lado, a insulina
inibe a atividade dessa enzima por induzir sua defosfo
rilação. A proteína perilipina, que recobre a superfície
das gotículas de gordura, também é importante nessa
regulação. Quando a perilipina não está fosforilada,
bloqueia o acesso da lipase ao triacilglicerol. Quando
a perilipina é fosforilada pela proteína quinase A, a li
700 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
pase hormônio-sensível desloca-se para a superfície da
gotícula de gordura e hidrolisa os triacilgliceróis. Os
principais produtos dessa enzima são monoacilglice
róis e ácidos graxos livres. Outras enzimas completam
a hidrólise. Um resumo da regulação do metabolismo de
triacilgliceróis é apresentado na Tabela 17.2. Essa regu
lação resulta na mobilização de ácidos graxos durante o
jejum e deposição após uma refeição. O equilíbrio entre
síntese e hidrólise de triacilgliceróis ajuda a garantir re
servas adequadas de energia e evitar a obesidade (ver
Correlação Clínica 17.1 e 17.2). Outras lipases, incluin
do a lipase triglicéride do adiposo, podem também de
sempenhar um papel na degradação de triacilgliceróis.
Estas podem contribuir para desacelerar a lipólise não
-regulada.
Outras lípases rapidamente completam a hidrólise,
liberando ácidos graxos e glicerol no sangue. Os ácidos
graxos são chamados ácidos graxos livres, embora cir
culem ligados à albumina sérica. Cada molécula de al
bumina pode ligar ∼10 ácidos graxos, de modo que sua
capacidade de ligação é muito alta. Ácidos graxos livres
ligados à albumina, entretanto, são uma fração relativa
mente pequena do total de lipídeos do plasma, quando
se considera a presença dos lipídeos nas lipoproteínas
plasmáticas (p. 741). Entretanto, esses ácidos graxos
livres são reciclados rapidamente, de modo que repre
sentam uma fração significativa do fluxo de lipídeos na
corrente sanguínea.
A hidrólise dos triacilgliceróis presentes no tecido
adiposo e nas lipoproteínas plasmáticas também pro
duz glicerol livre. Esse glicerol é usado pelo fígado, que
contém altos níveis de glicerol quinase, uma enzima
que sintetiza glicerol 3-fosfato a partir de glicerol e ATP
(Figura 15.39, p. 645). O glicerol é pouco metaboliza
do em outros tecidos, em decorrência dos baixos níveis
dessa enzima. A glicerol 3-fosfato desidrogenase hepá
tica converte glicerol 3-fosfato em di-hidroxiacetona
fosfato, que entra na via glicolítica no estado alimen
tado. No estado de jejum, é convertida em glicose via
gluconeogênese. Durante o jejum prolongado, quando
grande parte da energia do corpo é derivada da gordura
armazenada, o glicerol produzido na hidrólise dos tria
cilgliceróis no tecido adiposo é um importante substra
to para a gluconeogênese no fígado.
TABELA 17.2 Regulação do Metabolismo de Triacilgliceróis
Proteína Efeito
Mobilização de triacilglicerol
Lipase hormônio-sensível e Ativação por fosforilação mediada por PKA
perilipina Inibição por desfosforilação
Lipoproteína lipase Síntese aumentada de enzimas
Síntese de triacilgliceróis
Fosfatidato fosfatase Síntese aumentada de enzimas
17.4 SÍNTESE DE ÁCIDOS
GRAXOS: LIPOGÊNESE
Glicose É o Principal Precursor para
Síntese de Ácidos Graxos
O excesso de carboidratos da dieta, em relação ao
necessário para produção de energia e síntese de glico
gênio, é convertido em ácidos graxos no fígado, durante
o estado alimentado em mamíferos. A glicose fornece o
carbono para a síntese de ácidos graxos (via acetil-CoA),
bem como os equivalentes de redução (NADPH) neces
sários para esse processo. Outros substratos, como ami
noácidos, também podem contribuir para a lipogênese.
Via de Biossíntese de Ácidos Graxos
A síntese de ácidos graxos ocorre no citosol, usando
o acetil-CoA produzido a partir de glicose ou de outros
precursores (ou seja, esqueleto carbônico de aminoáci
dos). O ácido saturado C16, ácido palmítico, é sintetiza
do primeiro, e todos os outros ácidos graxos são feitos
por modificação dele. Os ácidos graxos são sintetizados
pela adição sequencial de unidades de dois carbonos do
acetil-CoA à extremidade carboxila ativada de uma ca
deia em crescimento, pela ácido graxo sintase. Em bac
térias, a ácido graxo sintase é um complexo de várias
proteínas, enquanto em células de mamíferos é uma
única proteína multifuncional.
A Formação de Malonil-CoA É a Etapa de
Comprometimento na Síntese de Ácidos
Graxos
A síntese de ácidos graxos a partir de acetil-CoA re
quer o intermediário ativado malonil-CoA, que é feito por
carboxilação de acetil-CoA pela acetil-CoA carboxilase
(Figura 17.7). A reação requer ATP e bicarbonato como
fonte de CO2. Na primeira etapa, CO2 é ligado a um re
síduo de biotina da enzima, usando energia derivada da
hidrólise de ATP; o CO2 é então transferido para acetil
-CoA. Essa reação é semelhante à carboxilação do piru
vato a oxaloacetato pela piruvato carboxilase (p. 640).
Agente Regulatório
Glucagon, epinefrina, ACTH
Insulina
Insulina
Hormônios esteróides
 CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 701

O inibição por retroalimentação (feedback) da

CH3CSCoA + HCO3– + ATP acetil-CoA síntese de ácidos graxos pelo produto final da
Acetil CoA carboxilase
via. A fosforilação da acetil-CoA carboxilase,
pela proteína quinase A dependente de AMP
O cíclico e pelas proteína quinases dependentes
–OOC CH2SCoA
C + H2O ADP+ + Pi de AMP, inibe essa enzima. A importância des
sa regulação é discutida na página 721.
Malonil CoA

FIGURA 17.7 Reação da acetil-CoA carboxilase.

Sequência de Reações para a
Síntese de Ácido Palmítico
A acetil-CoA carboxilase catalisa a etapa limitante A primeira etapa catalisada na síntese de ácidos
da velocidade da síntese de ácidos graxos. Essa enzi graxos é a transferência da molécula iniciadora, seja
ma existe em um estado inativo, protomérico, e, quan um grupo acetil ou butiril, da CoA para um resíduo
do ativada, na forma de polímeros lineares. A enzima de 4!-fosfopanteteína na proteína carregadora de acil
de mamíferos é ativada por citrato ou isocitrato. Isso (ACP, acyl carrier protein), uma proteína constituinte
representa ativação positiva (feed-forward) da síntese do complexo multienzimático (Figura 17.8, Reação 1).
de ácidos graxos porque o citrato é exportado da mito A unidade fosfopanteteína é idêntica à da CoA; ambas
côndria para gerar acetil-CoA citosólico para síntese de são derivadas da vitamina ácido pantotênico. Em bac
ácidos graxos (ver a seção sobre a via de clivagem do térias, a ACP é uma proteína pequena, enquanto, em
citrato na p. 704). A acetil-CoA carboxilase é também mamíferos,é um domínio da ácido graxo sintase. Seis
inibida por acil-CoAs de cadeia longa, resultando em ou sete unidades de dois carbonos são adicionadas ao
complexo enzimático (dependendo
O (proteína carregadora de acil) O deo iniciador ser acetil-CoA ou butiril
(1) CH3C SCoA + ACPSH acetiltransferase CH3 CSACP + CoASH
-CoA) em uma sequência repetitiva de
reações, até que a molécula de palmi
(2) (a) CH3 O
C SACP
O + Enz (proteína
SH (proteína
β-cetoacil-
carregadora
sintase de acil) de
carregadora CH3 CS
acil)O Enz + ACPSH tato esteja completa. A sequência de
reações, começando com um acetil-CoA
iniciador e chegando a butiril-ACP, é
apresentada na Figura 17.8.
(b) CH2 malonil transferase
–OOC
C SCoA + ACPSH Um ciclo de elongação de ácido gra
O xo é iniciado pela adição de dois átomos
de carbono à cadeia em um processo de
–OOC CH2 C SACP + CoASH
três etapas. Primeiro, a cadeia de ácido
graxo é transferida do resíduo de fosfo
drila de umadacisteína da um
(c)
CH3 O
C
S Enz + –OOC CH2
O
C
(proteína carregadora
SACP
β-cetoacil-
sintase de acil) panteteína ACP para b-cetoacil-ACP
grupo sulfi

sintase (Reação 2a). O grupo -SH da

O O ACP então aceita uma unidade de ma
CH3 C CH2 C SACP + CO2 + Enz SH lonil do malonil-CoA (Reação 2b). En
tão, a etapa de condensação liga a ca
deia de acil em crescimento com o C2
β-cetoacil
(3) CH3CCSACP
O CH2 O + NADPH + (proteína
H+ carregadora de acil) do grupo malonil, com a perda de CO2
redutase (Reação 2c). Este é o mesmo CO2 que
foi adicionado pela acetil-CoA carboxi
OH O
lase, de modo que os átomos de carbo
CH3 CHCH2 C SACP + NADP+ no do palmitato são todos derivados do
acetil-CoA. O produto acil é b-cetoacil
O β-hidroxiacil -ACP. Esse intermediário é reduzido
OH (proteína carregadora de acil) O a b-hidroxiacil-ACP usando NADPH
desidratase
(4) CH3 CHCH2 C SACP CH3 CHCHC SACP + H2O como doador de elétrons (Reação 3).
O b-Hidroxiacil-ACP é desidratado a
enoil um enoil-ACP (Reação 4) e, depois, re
O (proteína carregadora de acil)
redutase duzido a um acil-CoA saturado, usan
(5) CH3CH CHC SACP + NADPH + H+ do uma segunda molécula de NADPH
O como redutor (Reação 5). A cadeia
CH3CH2 CH2 C SACP + NADP+ nascente de ácido graxo prossegue por
mais seis ciclos de reação para produzir
FIGURA 17.8 Via de síntese de ácidos graxos. palmitoil-ACP, que sofre a ação de uma
702 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

tioesterase para produzir ácido palmítico livre (Figura
17.9). A especificidade dessa enzima determina o com
primento da cadeia do ácido graxo produzido. Note que,
nesse estágio, os grupos sulfidrila da ACP e da sintase
estão ambos livres, de modo que outro ciclo de síntese
de ácidos graxos pode começar. O produto liberado é
convertido em palmitoil-CoA, preparando-o para modi
ficação ou incorporação em lipídeos complexos.
(CH2 O ta por duas subunidades idênticas, cada uma das quais
CH3)14 C SACP + H2O
tioesterase
CH3 (CH2)14 COO– + ACPSH
FIGURA 17.9 Liberação de ácido palmítico da ácido graxo
sintase pela tioesterase.
Ácido Graxo Sintase de Mamíferos É um
Polipeptídeo Multifuncional
As reações delineadas acima são a sequência básica
para síntese de ácidos graxos em todos os organismos.
O complexo enzimático ácido graxo sintase catalisato
das essas reações, mas sua estrutura e suas proprieda
des variam consideravelmente. Em Escherichia coli, o
complexo é composto por enzimas separadas. Diferen
temente, a ácido graxo sintase de mamíferos é compos
é um polipeptídeo multienzimático que contém todas as
atividades catalíticas. Há também variações na enzima
entre espécies de mamíferos e entre tecidos.
A cadeia de ácido graxo em crescimento fica sem
pre ligada à proteína multifuncional e é transferida se
quencialmente entre o grupo 4!-fosfopanteteína da ACP,
que é um domínio da proteína, e o grupo sulfidrila da

O
CH3 CH2(CH2)13 COO–
PhP SH CH3CSCoA
(ou butiril CoA)

Cys SH CoASH SH
O
PhP S C CH3
–OOC COO–

(CH2 O Cys Cys

PhP SCH3
CH3CH2)13 C S PhP

HS Cys

SH
O

Repetem-se as reações O
1 - 5, seis vezes CH2 C CoA)
(ou metilmalonil SCoA
1

CoASH

HS PhP O
O
PhP
Cys SC
S C CH3
CH2
CH3CH2CH2CS Cys
PhP
Cys S O2 O O

CO2
6
O
PhP C CH2 C CH3
CH3CH2CH2SC
SH 3,4,5
redução
Cys SH
desidratação
redução

cisteína da proteínanaenzima
Cys = 4!-fosfopanteteína
PhP
proteína transportadora de acil

PhP SH
= ácido graxo sintase
FIGURA 17.10 Mecanismo proposto para elongação de ácidos graxos Cys SH
pela ácido graxo sintase de mamíferos.
 CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 703

cisteína da b-cetoacil-ACP sintase, durante a reação de Para descrever a conversão geral de acetil-CoA em
condensação (Reação 2, Figura 17.8 e 17.10). palmitato, o ATP usado na formação de malonil-CoA
deve ser incluído.
Os níveis de ácido graxo sintase nos tecidos são con
trolados pela velocidade de sua síntese e degradação. O
Como mostra a Tabela 17.3, a insulina aumenta a veloci 7 CH3CSCoA + 7 CO2 +7 ATP
dade de síntese de ácidos graxos por estimular a trans O
crição do gene da ácido graxo sintase, aumentando as 7JOOCCH2CSCoA + 7 ADP + 7 P
i
sim os níveis de enzima no fígado e em outros tecidos.
Os fatores que estão envolvidos na regulação da lipo
Então, a estequiometria da conversão de acetil-CoA
gênese em mamíferos são apresentados na página 704.
em palmitato é
Estequiometria da Síntese de Ácidos O
Graxos 8 CH3 C SCoA
O + 7 ATP +14 NADPH + 14 H+

Com acetil-CoA como iniciador da biossíntese de

palmitato, a reação geral é CH3 (CH2)14COJ + 8 CoASH +7 ADP+ 7 Pi
+
+
CH3 O SCoA +7JOOCCH2 O + 6 H2O +14 NADP

CH3 (CH2)14COOJ
C + 7 CO2 + 14+14
NADP+
C NADPH
SCoA
+ 8 CoASH
+
+14 H++ 6 H2O

TABELA 17.3 Regulação da Síntese de Ácidos Graxos

Enzima Efeito Agente Regulatório
Biossíntese do Palmitato
Acetil-CoA Curto prazo Ativação alostérica Citrato, isocitrato
carboxilase (ACC) Inibição alostérica C16-C18 acil-CoAs
Inibição via fosforilação por
PKA da ACC Glucagon e epinefrina
Inibição via fosforilação
Ativação por AMPK
mediada da ACC da
defosforilação AMP

ACC Insulina
Longo prazo Síntese da enzima aumentada
diminuída Hormônio da tireoide, dieta rica em
carboidrato, insulina
Jejum, dieta rica em gordura, via baixa
insulina e alto glucagon. Ácidos graxos
poli-insaturados (PUFAs) também inibem
síntese
Ácido graxo sintase Longo prazo Síntese da enzima aumentada Dieta rica em carboidratos via insulina
Síntese da enzima diminuída Jejum, dieta rica em gordura, via baixa
insulina e alto glucagon. PUFAs também
inibem síntese
Biossíntese de Outros Ácidos Graxos que não o Palmitato
Ácido graxo sintase Síntese aumentada de ácidos graxos de cadeia Metilmalonil-CoA/malonil-CoA
ramificada aumentados
Síntese de ácidos graxos de cadeia curta Expressão de tioesterase específica na
glândula mamária
Estearil-CoA Síntese de enzimas aumentada Insulina, hormônio da tireoide,
dessaturase hidrocortisona, colesterol da dieta
Síntese de enzimas diminuída PUFAs da dieta
704 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
Via de Clivagem do Citrato
Fornece Acetil-CoA e NADPH para
Lipogênese no Citosol
A quebra de glicose no fígado via glicólise resulta na
produção de piruvato, que é convertido em acetil-CoA
na mitocôndria pelo complexo piruvato desidrogenase.
Entretanto, a síntese de ácidos graxos é um processo
citosólico, e acetil-CoA não é facilmente transportado
através da membrana mitocondrial interna. A via de
clivagem do citrato contorna esse problema. O citrato,
formado pela citrato sintase no ciclo dos ácidos tricar
boxílicos, é transportado através da membrana mito
condrial interna via o transportador de tricarboxilato
(ver Figura 14.49, p. 595). O citrato é, então, clivado no
citosol pela ATP citrato liase (também chamada enzi
ma de clivagem do citrato) para formar acetil-CoA e
oxaloacetato (Figura 17.11).
citrato + ATP + CoA → acetil CoA + oxaloacetato + ADP + Pi
Essa reação não é o reverso da citrato sintase, uma
vez que requer a hidrólise de ATP. Como mencionado
anteriormente, o citrato tem um segundo papel na sín
tese de ácidos graxos, como ativador alostérico da ace
til-CoA carboxilase, a enzima limitante da velocidade
da lipogênese.
O oxaloacetato gerado pela clivagem de citrato no
citosol não é facilmente transportado de volta para
a mitocôndria. Em vez disso, ele é reduzido a malato
pela isoforma citosólica da NAD malato desidrogena
se. O malato, então, sofre descarboxilação oxidativa a
piruvato, catalisada pela NADP malato desidrogenase
(também chamada enzima málica). O piruvato entra na
Citosol
Glicose
CO2
NADPHNADPH
Malato
Síntese de
ácidos graxos
NADPNADH
desidrogenase
+ H+
Oxaloacetato
Acetil CoA
ATP
FIGURA 17.11 Transferência de acetil
CoA da mitocôndria para o citosol
para biossíntese de ácidos graxos
pela via de clivagem do citrato.
mitocôndria para seguir no metabolismo. A remoção do
citrato da mitocôndria (cataplerose) deve ser acompa
nhada por sua reposição (anaplerose) para manter o
fluxo do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Isso é conse
guido pela conversão de piruvato em oxaloacetato pela
piruvato carboxilase (p. 640), a principal enzima ana
plerótica das mitocôndrias.
A conversão de oxaloacetato em piruvato pela via
de clivagem do citrato transfere um par de elétrons do
NADH para gerar NADPH, que é usado na síntese de
ácidos graxos. A fonte do NADH para esse processo é a
reação da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase da via
glicolítica. O metabolismo de glicose, portanto, fornece
tanto os átomos de carbono como os equivalentes de
redução necessários para a lipogênese.
A produção dos equivalentes de redução usados na
síntese de ácidos graxos pode ser resumida como se
segue: a via de clivagem do citrato transfere um par de
elétrons do NADH para o NADPH para cada acetil-CoA
transferido da mitocôndria para o citosol. A transfe
rência dos oito acetil-CoAs que são usados para a sín
tese de uma molécula de palmitato fornece oito NA
DPHs. Como a síntese de palmitato requer 14 NADPHs
por mole, os outros seis NADPHs são fornecidos pela
via das pentoses fosfato, que também está presente no
citosol.
A estequiometria real desse processo é mais compli
cada, porque o transporte de citrato e de outros ácidos
di- e tricarboxílicos através da membrana mitocondrial
interna ocorre por meio de trocas um para um. As ve
locidades de fluxo são provavelmente controladas por
uma composição de gradientes de concentração de vá
rios desses sistemas de troca.
Matriz Mitocondrial
Piruvato Piruvato
Enzima málica
NADPH+NADP+ + H+ Piruvato
carboxilase
NADPNAD++ H+
Malato Complexo
piruvato
desidrogenase
Oxaloacetato Acetil CoA
ADP + Pi
Citrato
ATP-Citrato liase sintase
Citrato Citrato
 CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 705

Modificação de Ácidos Graxos síntese de ácidos graxos insaturados é importante para

regular a fluidez dos triacilgliceróis e dos fosfolipídeos
O homem é capaz de sintetizar os outros ácidos gra de membrana. Também é necessária para a síntese de
xos de que necessita a partir do palmitato, com exceção ésteres de colesterol no fígado e de secreções de cera na
de alguns ácidos graxos poli-insaturados (ver Tabela pele, que usam preferencialmente ácidos graxos recém
17.1). Ácidos graxos são modificados como os CoA-de -sintetizados, e não ácidos graxos da dieta. A expressão
rivados por três processos: elongação, dessaturação e de estearoil-CoA dessaturase é fortemente regulada por
hidroxilação. mecanismos dietéticos e hormonais. Insulina, triiodoti
ronina, hidrocortisona e colesterol da dieta aumentam
Reações de Elongação a transcrição gênica e, assim, os níveis de estearoil-CoA
dessaturase no fígado, enquanto ácidos graxos poli-insa
A elongação dos ácidos graxos em mamíferos ocor
turados da dieta têm o efeito oposto.
reno retículo endoplasmático ou na mitocôndria. Esses
processos são ligeiramente diferentes nas duas loca
lizações. No retículo endoplasmático, acil graxo-CoAs
são elongadas por reações semelhantes às catalisadas O
pela ácido graxo sintase citosólica; malonil-CoA é a fon RSCoA
CH2C
te de unidades de dois carbonos e NADPH fornece o
O
poder redutor. O substrato preferencial para elongação
CH3 CSCoA
é palmitoil-CoA, que é convertido quase que exclusiva
β–cetotiolase
mente em estearato (18:0) na maioria dos tecidos. O
CoASH
cérebro, entretanto, contém um ou mais sistemas de
elongação adicionais, que sintetizam ácidos de cadeia
mais longa (até C24), que são necessários para lipídeos O O
de membrana. Esses sistemas de elongação também RCH2C
CH2C SCoA
usam malonil-CoA.

A elongação de ácidos graxos nas mitocôndrias usa NADH +NAD+

H+
β–hodroxiacil-CoA
acetil-CoA e tanto NADH como NADPH como doadores desidrogenase
de elétrons (Figura 17.12). Esse sistema opera pelo re
verso da via de b-oxidação de ácidos graxos (p. 713),
exceto que a enoil-CoA redutase NADPH-ligada (última
OH O
etapa da elongação) substitui a acil-CoA desidrogena
se FAD-ligada (primeira etapa da b-oxidação). Esse RCH2CHCH2SCoA
H2 C

processo tem baixa atividade com substratos acil-CoA enoil-CoA

de 16 carbonos ou maiores; serve primariamente para O hidratase
elongar moléculas mais curtas.
O

Formação de Ácidos Monoenoicos pela RCH2CHCHCSCoA

Estearoil-CoA Dessaturase
Em vertebrados, a dessaturação de ácidos graxos NADPH + H+ enoil-CoA
ocorre no retículo endoplasmático, e as reações e en redutase
zimas que introduzem duplas ligações cis são signifi NADP+

cativamente diferentes das acil-CoA desidrogenases

da b-oxidação mitocondrial. Dessaturação é realizada O

por monooxigenases, que têm acil graxo-CoA, NADH RCH2CH2CSCoA

e O2 como substratos (p. 715). Os três componentes do
sistema são a enzima dessaturase, o citocromo b5 e a
NADPH-citocromo b5 redutase. A reação geral é
R—CH2 O
—CH2—(CH2)7CSCoA + NADPH + H+ + O2 →
O
R—CH——CH—(CH2)7CSCoA + NADP+ + 2H2O
A etapa inicial na formação de ácidos graxos insatura
dos é a formação da dupla ligação D9 pela estearoil-CoA
dessaturase no ácido palmítico ou no esteárico para pro
duzir ácido palmitoleico ou oleico, respectivamente. A
CH2
FIGURA 17.12 Via de elongação de ácidos graxos nas
mitocôndrias.
Formação e Modificação de Ácidos Graxos
Poli-insaturados
Ácidos graxos poli-insaturados, particularmente áci
do araquidônico (20:4), são precursores de importantes
moléculas sinalizadoras: prostaglandinas, tromboxanes
e leucotrienos (p. 756). Ácidos graxos poli-insaturados
são também necessários para a síntese de lipídeos com
plexos, particularmente no sistema nervoso. Esses áci
706 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

dos graxos também podem sofrer reações de oxidação
não-enzimática, criando produtos que danificam cons
tituintes celulares e podem ter efeitos patológicos.
Em mamíferos, duplas ligações podem ser adiciona
das apenas na metade proximal dos acil graxo-CoAs;
não podem ser adicionadas depois de C9. Consequen
temente, os ácidos linoleico (18:2) e linolênico (18:3)
são ácidos graxos poli-insaturados necessários na dieta
(Figura 17.13). Esses ácidos graxos essenciais são obti
dos na dieta a partir de plantas e de peixes de água fria.
Existem duas séries de ácidos graxos poli-insaturados.
A dupla ligação distal do ácido linoleico está a seis car
bonos do grupo metil; é chamado n-6 ou w-6. Uma se
gunda série, n-3 ou w-3, tem a dupla ligação distal a três
carbonos do grupo metil. Um isômero do ácido linolêni
co faz parte desta série.
CH3(CH2)3(CH3CHCH)n(CH2)mCOOH
Fórmula básica da série do ácido linoleico
CH3 (CH2 CHCH)n (CH2)m COOH
Fórmula básica da série do ácido linolênico
FIGURA 17.13 As séries linoleico e linolênico.
Os ácidos graxos essenciais são modificados por
elongação e dessaturação para formar os ácidos graxos
poli-insaturados encontrados em mamíferos. Uma va
riedade de ácidos graxos poli-insaturados é sintetizada
no homem usando dessaturases que introduzem duplas
ligações nas posições 4, 5 ou 6 (Figura 17.14). Essas en
zimas atuam apenas na síntese de ácidos graxos poli
-insaturados porque elas só podem usar substratos com
uma dupla ligação na posição 9. Essa elongação e des
saturação ocorrem em qualquer ordem. A conversão de
ácido linolênico em ácido todo cis-4,7,10,13,16,19-doco
sa-hexaenoico no cérebro é um exemplo específico de
tal sequência de reações.
CH3 (CH2 CHCH)3 CH2 CH2CH2 CH2CH2
Ácido linolênico
"Δ6-dessaturase"
CH3(CH2 CHCH)3 CH2CHCHCH2CH2
elongação
CH3(CH2 CHCH)3 CH2CHCHCH2CH2
"Δ5-dessaturase"
CH3(CH2 CHCH)3 CH2CHCHCH2CHCHCH2CH2
Formação de Hidroxiácidos Graxos no
Tecido Nervoso
Dois processos diferentes produzem a-hidroxiáci
dos graxos em mamíferos. Um ocorre nas mitocôndrias
de muitos tecidos e age sobre ácidos graxos de cadeia
relativamente curta. O outro só foi demonstrado no
sistema nervoso, onde produz ácidos graxos de cadeia
longa hidroxilados em C2, que são necessários na for
mação de alguns lipídeos da mielina. A enzima do cére
bro que catalisa essa reação é uma monooxigenase que
requer O2 e NADH ou NADPH, e preferencialmente usa
ácidos graxos C22 e C24. Esse processo é fortemente co
ordenado com a síntese de esfingolipídeos que contêm
ácidos graxos hidroxilados (ver p. 748).
O Ácido Graxo Sintase Pode
Produzir Outros Ácidos Graxos além
do Palmitato
Os principais ácidos graxos sintetizados no homem
para armazenamento de energia são palmitato e seus
produtos de modificação. Entretanto, menores quanti
dades de ácidos graxos diferentes são sintetizadas para
outros propósitos. Dois exemplos são a produção de áci
dos graxos mais curtos do que o palmitato na glândula
mamária e a síntese de ácidos graxos de cadeia ramifi
cada em algumas glândulas secretórias.
O leite contém ácidos graxos com cadeias que são
mais curtas do que o palmitato. As quantidades relati
vas dos ácidos graxos produzidos pela glândula mamá
ria variam com a espécie e com o estado fisiológico do
animal. Em ruminantes, a via de síntese de ácidos gra
xos, que normalmente produz palmitato, é modificada
para sintetizar ácidos graxos tão curtos quanto C4. Isso
O
CH2CH2 CCoA
O
CH2CH2 CCoA
O
CH2CH2CH2 CH2 CCoA
O
CH2 CCoA

elongação
O
CH3(CH2 CHCH)3CH2CHCHCH2CHCHCH2CH2 CH2CH2 CH2 CCoA
"Δ4-dessaturase"
O
CH3(CH2 CHCH)3CH2CHCHCH2CHCHCH2CHCHCH2 CH2 CCoA

Ácido todo-cis-4,7,10,13,16,19-docosa-hexaenoico

A
o e
s
C a
r
li u
o
r
a
t
a
s
e
ts s
e
e d
" O
CH3 (CH2)6+n CH2 CH2 CH2 CH2CH2 CH2 (CH2)2 C CoA
FIGURA 17.14 Posições na cadeia de ácido graxo onde
dessaturação pode ocorrer no homem.
Em mamíferos, devem existir pelo menos seis carbonos adiante da
ligação que está sendo dessaturada.
é feito pela expressão de tioesterases solúveis, que cli
vam cadeias mais curtas da ácido graxo sintase. O leite
humano não contém nenhum ácido graxo com cadeia
menor do que 10 carbonos.
Existem relativamente poucos ácidos graxos de ca
deia ramificada em vertebrados. Até recentemente, seu
metabolismo foi estudado principalmente em bactérias
como a Micobactéria, em que estão presentes em varie
dades e quantidades maiores. Ácidos graxos simples de
cadeia ramificada são sintetizados por tecidos de ver
tebrados com propósitos específicos, como a produção
de ceras em glândulas sebáceas e na glândula uropigial
de aves, e a elaboração de estruturas em sistemas de
ecolocalização de golfinhos.
Muitos ácidos graxos de cadeia ramificada em verte
brados são derivados metilados de ácidos saturados de
cadeia linear saturados, que são sintetizados pela ácido
graxo sintase. Quando metilmalonil-CoA é usado como
substrato em lugar do malonil-CoA, uma cadeia lateral
metil é inserida no ácido graxo pela seguinte reação:
CH3 O + CH3 O
(CH2)n CSACP HOOCCHC SCoA
O CH3 O
CH3 (CH2)n CCHCSACP + CO2+ CoA
Seguem-se etapas normais de redução. Essas rea
ções ocorrem em muitos tecidos, em uma velocidade
várias ordens de grandeza menor do que a utilização de
malonil-CoA na síntese de ácidos graxos. A proporção
de ácidos graxos de cadeia ramificada que é sintetizada
é determinada, em grande parte, pela disponibilidade
relativa dos dois precursores. Um aumento de ramifica
ção pode ocorrer por diminuição da razão entre malo
nil-CoA e metilmalonil-CoA. Uma malonil-CoA descar
boxilase que é responsável por essa diminuição ocorre
em muitos tecidos. Foi sugerido que uma concentração
aumentada de metilmalonil-CoA, que ocorre na deficiên
cia de vitamina B12, possa levar à produção excessiva de
ácidos graxos de cadeia ramificada.
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 707
Acil Graxo-CoAs Podem Ser
Reduzidos a Alcoóis Graxos
Muitos fosfolipídeos contêm cadeias de ácidos
graxos em ligação éter, em vez de ligação éster. Os
precursores sintéticos dessas cadeias éter-ligadas
são alcoóis graxos (Figura 17.15), em lugar de ácidos
graxos. Esses alcoóis são formados em vertebrados
por uma redução em duas etapas, NADPH-ligadas,
de acil graxo-CoAs, no retículo endoplasmático. Em
tecidos que produzem quantidades relativamente gran
des de lipídeos contendo éter, a produção simultânea
de ácidos graxos e alcoóis graxos é rigorosamente co
ordenada.
17.5 ARMAZENAMENTO DE
ÁCIDOS GRAXOS COMO
TRIACILGLICERÓIS
A maioria dos tecidos de mamíferos converte ácidos
graxos em triacilgliceróis por uma sequência comum de
reações, mas o fígado, o tecido adiposo e o músculo rea
lizam esse processo em maior escala. O tecido adiposo é
um órgão especializado na síntese, no armazenamento
e na hidrólise de triacilglicerol, e é o principal local de
armazenamento de energia a longo prazo. Triacilglice
róis são armazenados no citosol como gotículas líquidas
circundadas por uma monocamada de lipídeos de mem
brana e da proteína perilipina. Essas gotículas não são
um estoque “sem saída”; ocorrem contínuas síntese e
quebra de triacilgliceróis no tecido adiposo. Algum ar
mazenamento também ocorre no músculo esquelético e
cardíaco, mas só para consumo local. A síntese de tria
cilglicerol no fígado é primariamente para a produção
de lipoproteínas do plasma, e não para armazenamento
de energia. Os ácidos graxos para esse processo podem
vir da dieta, do tecido adiposo por meio do sangue, ou
de síntese de novo, primariamente do catabolismo da
glicose da dieta.
CH3 (CH2)nCH2OH
FIGURA 17.15 Álcool graxo.
Triacilgliceróis São Sintetizados a
partir de Acil Graxo-CoAs e Glicerol
3-Fosfato
Triacilgliceróis são sintetizados na maioria dos teci
dos a partir de acil graxo-CoAs e um precursor de gli
cerol, glicerol 3-fosfato (Figura 17.16). O glicerol 3-fos
fato é derivado de várias fontes. Na maioria dos tecidos,
é sintetizado pela redução da di-hidroxiacetona fosfato.
No estado alimentado, a di-hidroxiacetona fosfato é de
708 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

CH2OH
fosfato
Gliceraldeído 3-fosfato HO CH
Glicose glicólise gliceroneogênese
Piruvato 2–
CH2 OPO3
Di-hidroxiacetona fosfato
Glicerol 3-fosfato
NADH + H+
O
NAD+
R C SCoA
aciltransferase
Glicerol 3-fosfato Acil-di-hidroxiacetona fosfato CoASH

NADPH + H+
Pool de acil O
graxo-CoA HO CH2
CH O C R
NADP+
Éter
lipídeos
Ácidos lisofosfatídicos CH2 O PO32–

Ácido lisofosfatídico
Pool
graxo-CoA
de acil
O

O R C SCoA
aciltransferase
Ácidos fosfatídicos Lipídeos CoASH
complexos

Pi
O
Diacilgliceróis R C CH2 O C R

O CH

CH2 O PO32–
Triacilgliceróis
Ácido fosfatídico
FIGURA 17.16Vias de síntese de triacilglicerol.
Alguns desses intermediários são usados como precursores para a síntese de FIGURA 17.17 Síntese de ácido fosfatídico a
lipídeos de membrana. partir de glicerol 3-fosfato.

rivada da glicose via glicólise; no estado de jejum, no te
cido adiposo e no fígado, o glicerol 3-fosfato é derivado
de gliceroneogênese (p. 709). No fígado, há uma fonte
adicional de glicerol 3-fosfato; glicerol pode ser fosforila
do pela glicerol quinase, que é muito ativa nesse tecido.
Ácidos graxos são ativados para prosseguimento no
metabolismo por conversão em seus ésteres de CoA nas
seguintes reações:
O
acil-CoA
R C OJ + sintase
ATP + CoASH
O
RCSCoA + AMP + PPi + H2O
Essa reação de duas etapas tem um acil adenilato
(acil graxo-AMP) como intermediário. A reação geral
é direcionada pela hidrólise do pirofosfato produzido a
dois Pi.
A síntese de triacilgliceróis envolve a formação de
ácido fosfatídico, que é formado por duas acilações se
quenciais do glicerol 3-fosfato para formar ácido liso
fosfatídico e, depois, fosfatídico (Figura 17.17). O ácido
fosfatídico é usado na síntese de triacilglicerol com a
hidrólise do grupo fosfato pela fosfatidato fosfatase,
gerando diacilglicerol, que é então acilado a triacilgli
cerol (Figura 17.18).
O ácido fosfatídico é também um intermediário cha
ve na síntese de outros glicerolipídeos (p. 733). Em uma
via alternativa, a di-hidroxiacetona fosfato é acilada, re
duzida a ácido lisofosfatídico e, depois, acilada uma se
gunda vez para formar ácido fosfatídico (Figura 17.16).
Embora esta não seja uma via muito importante na sín
tese de triacilgliceróis, é importante para a síntese dos
lipídeos de membrana com cadeias alquila éter-ligadas.
A síntese de triacilgliceróis segue uma via diferente
em células epiteliais do intestino delgado. Essas células
captam 2-monoacilgliceróis e ácidos graxos livres do in
testino, que são os principais produtos de digestão dos
triacilgliceróis da dieta pela lipase pancreática. Uma
enzima das células da mucosa acila esses monoacilgli
ceróis usando acil-CoAs como substratos. Os diacilgli
ceróis resultantes podem ser acilados para formar triacil
gliceróis, que são acondicionados em quilomícrons.
Análise dos triacilgliceróis humanos mostra que
cada posição do glicerol é esterificada com ácidos gra
xos de diferentes composições. Ácidos graxos satura
dos são encontrados preferencialmente na posição 1,
e ácidos graxos insaturados nas posições 2 e 3. Dois
 CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 709

O Síntese de Triacilgliceróis Ocorre

O CH2 O C R
durante o Jejum como Parte de um
R C O CH

CH2 O PO32–
Ciclo Triacilglicerol-Ácido Graxo Via
Ácido fosfatídico Gliceroneogênese
A liberação de ácidos graxos livres do tecido adiposo
fosfatidato
fosfatase é uma adaptação metabólica crítica no jejum. A quan
tidade de ácidos graxos liberados pelo tecido adiposo,
O
entretanto, excede a quantidade usada para obtenção
de energia por outros tecidos. Até 60% desses ácidos
O CH2 O C R
graxos são redepositados no tecido adiposo como tria
R C O CH + Pi cilgliceróis. Tanto o fígado como o tecido adiposo de
CH2 OH
sempenham um papel importante nesse processo (Cor
relação Clínica 17.3). No estado alimentado, o glicerol
Diacilglicerol 3-fosfato para síntese de triacilglicerol é derivado da
glicose via glicólise. Durante o jejum, entretanto, a en
O trada de glicose no tecido adiposo é limitada porque a
RC SCoA
concentração de insulina é baixa e a glicose está sendo
aciltransferase usada por outros tecidos. Nesse estado dietético, glice
CoASH
rol 3-fosfato é sintetizado em ambos os tecidos, adiposo
e hepático, pela gliceroneogênese. Como mostra a Fi
O gura 17.19, substratos que entram no ciclo dos ácidos
O CH2 O C R tricarboxílicos, como piruvato, glutamato ou aspartato,
podem suportar a gliceroneogênese. Essa via é essen
R C O CH O
cialmente uma versão abreviada da gluconeogênese,
CH2 O C R na qual o malato formado no ciclo dos ácidos tricarbo
xílicos deixa a mitocôndria e é convertido em oxaloa
Triacilglicerol
cetato no citosol. A fosfoenolpiruvato carboxiquinase
FIGURA 17.18 Síntese de triacilglicerol a partir de ácido então converte oxaloacetato em fosfoenolpiruvato, que
fosfatídico. é convertido em di-hidroxiacetona fosfato e, depois, em
glicerol 3-fosfato, que é usado para a síntese de triacil
fatores importantes que determinam a composição em glicerol. A enzima chave desse processo é a fosfoenol
ácidos graxos de cada posição do glicerol são a especi piruvato carboxiquinase; sua atividade é induzida no
ficidade das aciltransferases envolvidas e a disponibi fígado e no tecido adiposo durante o jejum.
lidade relativa dos diferentes ácidos graxos no pool de
acil graxo-CoAs.
17.6 UTILIZAÇÃO DE ÁCIDOS
Mobilização de Triacilgliceróis GRAXOS PARA PRODUÇÃO
Requer Hidrólise DE ENERGIA
A primeira etapa na mobilização dos ácidos graxos Ácidos graxos da circulação são captados pelas célu
armazenados para produção de energia é a hidrólise dos las e usados para produção de energia, primariamente
triacilgliceróis. Várias lipases catalisam essa reação, e a em mitocôndrias, em um processo integrado com gera
sequência de hidrólise das três cadeias acil é determi ção de energia a partir de outras fontes. Ácidos graxos
nada pelas especificidades das lipases envolvidas. são quebrados em acetil-CoA nas mitocôndrias, com a
O
produção de NADH e FADH2. Esses três produtos são,
depois, usados na matriz mitocondrial para produção
OCR
O CH2 de energia via ciclo dos ácidos tricarboxílicos e fosfori
RC CH O 3H2O lipases
lação oxidativa.

CH2OCR A utilização de ácidos graxos para produção de

energia varia consideravelmente de tecido para tecido
CH2 OH O O O e depende, em grau significativo, do estado metabóli
HO CH R C OH R COH RCOH co, isto é, alimentado ou em jejum, em exercício ou em
repouso. A maioria dos tecidos pode usar ácidos graxos
CH2 OH como combustível. Ácidos graxos são uma importante
710 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.3
Ciclo Triacilglicerol/Ácido Graxo
O triacilglicerol que é armazenado no tecido adipo
so é hidrolisado a ácidos graxos livres (FFA) durante o
jejum para fornecer energia para tecidos como músculo
esquelético e cardíaco, e indiretamente para o cérebro,
via corpos cetônicos. Hormônios, principalmente insu
lina, controlam esse processo. À medida que o nível de
insulina cai durante o jejum, a velocidade de hidrólise de
triacilgliceróis (lipólise) aumenta, resultando em libera
ção de FFA do tecido adiposo. Um aspecto surpreenden
te desse processo é o destino dos FFA; em seres huma
nos em jejum, até 65% desses FFA são reesterificados a
triacilgliceróis no fígado e em outros tecidos periféricos.
No fígado, os triacilgliceróis produzidos são liberado no
sangue como VLDL e enviado de volta para o tecido adi
poso, para deposição como triacilglicerol. Esse processo
foi chamado o ciclo triacilglicerol/ácido graxo.
A síntese de triacilglicerol em tecidos de mamífe
ros requer glicerol 3-fosfato, que pode ser derivado da
glicose da dieta, via glicólise, no estado alimentado.
Durante o jejum, quando a baixa insulina inibe a uti
lização de glicose, o glicerol 3-fosfato para a reeste
rificação de FFA é gerado por gliceroneogênese, uma
versão abreviada da gluconeogênese. Nessa via, piru
vato – ou compostos que podem gerar piruvato, como
alanina ou lactato – é convertido em glicerol 3-fosfato
via di-hidroxiacetona fosfato (Figura 17.19). Estudos
recentes mostraram que a gliceroneogênese, e não a
glicólise, é a via predominante para síntese de glicerol
3-fosfato, mesmo durante o estado alimentado. A en
zima chave da via da gliceroneogênese é a fosfoenol
piruvato carboxiquinase (PEPCK), que é muito ativa
no tecido adiposo marrom e branco. Se a expressão do
gene PEPCK for abolida no tecido adiposo de camun
dongos, a gliceroneogênese é inibida e o estoque de
triacilglicerol é reduzido. Ao contrário, super-expres
são do gene PEPCK no tecido adiposo de camundon
fonte de energia no músculo esquelético e no cardíaco,
mas o cérebro não oxida ácidos graxos porque eles não
conseguem atravessar a barreira hemato-encefálica.
Eritrócitos de mamíferos não podem oxidar ácidos gra
xos porque não têm mitocôndrias, o local da oxidação
de ácidos graxos. Durante o jejum, o fígado converte
acetil-CoA, gerado pela oxidação de ácidos graxos e
pela quebra de aminoácidos, em corpos cetônicos, que
se tornam um importante combustível após 2-3 dias de
jejum. A maioria dos tecidos, incluindo o cérebro, adap
ta-se ao jejum pela utilização desses corpos cetônicos.
gos transgênicos aumenta a velocidade da gliceroneo
gênese, resultando em obesidade.
A lógica metabólica do ciclo triacilglicerol/ácido
graxo reside provavelmente na importância dos ácidos
graxos como combustíveis durante o jejum. Para ga
rantir que exista FFA suficiente no sangue, mais FFA
é liberado das células adiposas do que o necessário; o
que não é usado é reesterificado a triacilglicerol e re
depositado no tecido adiposo, com um pequeno custo
energético. O ciclo triacilglicerol/ácido graxo consome
3%–6% da energia de uma molécula de triacilglicerol;
aparentemente, é melhor ter o combustível necessário
disponível e pagar por isso energeticamente, do que
ficar sem ele em um momento crítico! A velocidade de
reesterificação de FFA no ciclo triacilglicerol/ácido
graxo é um fator chave na determinação da concen
tração de estado estacionário de FFA no sangue, um
parâmetro que está diretamente envolvido na etiologia
do diabetes tipo 2 (ver Correlação Clínica 17.2). As tia
zolidinedionas, uma classe de drogas antidiabéticas,
induzem a atividade de PEPCK no tecido adiposo e
aumentam a velocidade de reesterificação a triacilgli
cerol via gliceroneogênese nesse tecido, suportando o
importante papel desse processo na manutenção da
homeostase lipídica.
Nye, C., Kalhan, S. C. e Hanson, R. W. Reassessing the
pathway of triglyceride synthesis in adipose tissue. Trends
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nolpyruvate carboxykinase by fatty acids, retinoic acid and
thiazolidinediones. Biochimie 85:1213, 2003.
ß-Oxidação de Ácidos Graxos de
Cadeia Linear É um Importante
Processo de Produção de Energia
Ésteres de CoA dos ácidos graxos são os substratos
para oxidação. Na maior parte, a via de oxidação de áci
dos graxos é semelhante, mas não idêntica, ao reverso
do processo de síntese de palmitato. Isto é, fragmentos
de dois carbonos são removidos sequencialmente da
extremidade carboxila do ácido graxo por oxidação,
hidratação e oxidação enzimáticas, formando um b−
-cetoácido, que é depois quebrado por tiólise. A via é
chamada b-oxidação porque o carbono 3 (carbono b) é
oxidado duas vezes antes da clivagem.
 CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 711

Triacilglicerol

Lipase hormônio-sensível

NADH NAD+

Glicerol
Di-hidroxiacetona-P 4 Glicerol
3-fosfato
Alanina, Lactato
Ácidos graxos livres FIGURA 17.19 A via da
GDP
GTP gliceroneogênese no fígado
PEP Oxaloacetato
e no tecido adiposo.
3 CO2 Piruvato Durante o jejum, essa via, que
NADH é uma versão abreviada da glu
1Acetil CoA
2 coneogênese, produz glicerol
Oxaloacetato
NAD+ 3-fosfato para síntese de tria
NADH
NAD+ Citrato
Aspartato cilglicerol. As enzimas chaves
Malato Malato da glicerogênese são (1) piru
vato carboxilase, (2) as formas
α-Cetoglutarato mitocondrial e citosólica da
NAD malato desidrogenase,
(3) fosfoenolpiruvato carboxi
quinase e (4) glicerol 3-fosfato
Glutamato desidrogenase.

Ácidos Graxos São Ativados por
Conversão em Acil Graxo-CoA
A primeira etapa da utilização de um ácido graxo
é sua ativação a um acil graxo-CoA. Essa reação é ca
talisada por enzimas do retículo endoplasmático e da
membrana mitocondrial externa, e é a mesma usada na
síntese de triacilgliceróis. Os acil graxo-CoAs são libe
rados no citosol.
Carnitina Transporta Grupos Acil Através
da Membrana Mitocondrial Interna
A maioria dos acil graxo-CoAs de cadeia longa é for
mada fora da mitocôndria, mas é oxidada na matriz. A
membrana mitocondrial é impermeável a CoA e seus
derivados. Ácidos graxos são transportados para dentro
da mitocôndria usando carnitina (4-trimetilamino-3
-hidroxibutirato) como transportador. O processo é re
sumido na Figura 17.20.
+ (p. 700), é um inibidor da CPT I.
CH3 C N(CH3)3
brana mitocondrial externa. Acilcarnitina e carnitina
livre são então trocadas na membrana mitocondrial
interna pela carnitina-acilcarnitina translocase. Final
mente, o grupo acil graxo é transferido de volta para
CoA pela carnitina palmitoiltransferase II (CPT II) no
lado da matriz da membrana interna. Esse processo
funciona primariamente no transporte de acil graxo
-CoAs com 12–18 carbonos. Anomalias genéticas nes
se sistema levam a graves consequências patológicas
(Correlação Clínica 17.4). Diferentemente, a entrada
de ácidos graxos de cadeia mais curta é independen
te de carnitina; eles cruzam a membrana mitocondrial
interna como ácidos graxos livres e são ativados a seus
derivados CoA na matriz. CPT I é um importante pon
to de regulação da oxidação de ácidos graxos porque
sua velocidade controla a entrada de ácidos graxos na
mitocôndria e, portanto, determina o suprimento de
substratos para b-oxidação na matriz mitocondrial.
Malonil-CoA, que é o produto da acetil-CoA carboxilase
e um intermediário chave na síntese de ácidos graxos

O CH2 ß-Oxidação É uma Sequência de Quatro

(CH2)nSCoA + HO CHCH2COOH Reações
b-oxidação é uma série de quatro reações que agem
carnitina palmitoiltransferase
sobre o acil graxo-CoA para produzir um acetil-CoA e
+ um novo acil-CoA com dois átomos de carbono a me
N(CH3)3 nos do que o substrato inicial (Figura 17.21). Uma vez
CH2
que um acil graxo-CoA tenha se formado na superfície
O
interna da membrana mitocondrial interna, pode ser
CH3 (CH2)nCOCHCH2COOH + CoASH oxidado pela acil-CoA desidrogenase, uma flavopro
teína que usa FAD como aceptor de elétrons (Reação
O grupo acil é transferido da CoA para a carnitina 1). O produto é um enoil-CoA com uma dupla ligação
pela carnitina palmitoiltransferase I (CPT I) na mem trans entre os átomos C2 e C3 e um FADH2 ligado à en
712 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Ácidos graxos Acil graxo CoA CoASH CH3 H H

(CH2)nCβCα O
C SCoA

H H
Acil graxo CoA
Membrana Acil-CoA CPT I
mitocondrial Sintase
externa FAD Proteína
acil-CoA
FADH2
1. desidrogenase
Proteína
–
malonil CoA
H O
Carnitina Acilcarnitina
CH3 (CH2)nCCCSCoA

H
trans-2-Enoil CoA

H2O
2. enoil-CoA hidratase

Membrana Translocase
mitocondrial
interna
Matriz
mitocondrial 3. H O

CH3(CH2)nCCH2CSCoA
CPT II
OH
3-L-Hidroxiacil CoA

NAD+
3-L-hidroxiacil-CoA
β-Oxidação Acil CoA CoASH desidrogenase
NADH + H+

FIGURA 17.20 Os ácidos graxos são transportados para dentro da O O

CH3 (CH2)nCCH2CSCoA
mitocôndria como acilcarnitinas para oxidação.
A inibição da carnitina palmitoiltransferase I (CPT I) por malonil-CoA regula a β-Cetoacil CoA
velocidade de oxidação de ácidos graxos.
CoASH
zima. Como no ciclo dos ácidos tricarboxílicos, o FADH2 4. β-cetoacil-CoA tiolase
transfere seus elétrons para enzimas da via da fosforila
ção oxidativa, regenerando FAD.
CH3 O O

A segunda etapa da b-oxidação é a hidratação da (CH2)nC SCoA + CH3CSCoA

dupla ligação trans para um 3-L-hidroxiacil-CoA, que Acil graxo CoA Acetil CoA
é oxidado para um intermediário 3-cetoacil-CoA, com (2 átomos C a menos)

a geração de NADH na terceira etapa. A etapa final é

a clivagem da cadeia pela cetotiolase, gerando acetil
-CoA e um acil graxo-CoA que foi encurtado em dois
átomos de carbono. Esse acil-CoA encurtado está
pronto para o ciclo seguinte de oxidação, começando
com a acil-CoA desidrogenase. Na maioria dos tecidos,
o acetil-CoA será usado pelo ciclo dos ácidos tricar
boxílicos, e o FADH2 e o NADH serão reoxidados pelo
sistema de fosforilação oxidativa, com a produção de
ATP.
Figura 17.21 Via da b-oxidação de ácidos
graxos.
à membrana. MCAD tem especificidade para uma fai
xa ampla de comprimentos de cadeia, mas é mais ativa
sobre substratos C6 e C8, enquanto a ordem de prefe
rência de SCAD é C4>C6>C8. LCAD está envolvida na
iniciação da oxidação de ácidos graxos de cadeia rami
ficada, por exemplo, 2-metilpalmitoil-CoA.

Cada uma das quatro reações apresentadas na Figu
ra 17.21 é catalisada por várias enzimas diferentes, que
têm especificidades para substratos de diferentes com
primentos de cadeia. Por exemplo, pelo menos, quatro
enzimas catalisam a primeira etapa de desidrogenação.
Elas são acil-CoA desidrogenases de cadeia-muito-lon
ga, de cadeia-longa, de cadeia-média e de cadeia-curta
(VLCAD, LCAD, MCAD e SCAD). VLCAD, que oxida
acil-CoAs de cadeia linear na faixa de C12 a C24, dife
re dos outros membros da família porque é associada
Uma característica singular da oxidação de ácidos
graxos de cadeia longa é que as etapas da enoil-CoA
hidratase, da 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase e da b−
-cetotiolase são todas catalisadas por um complexo li
gado à membrana das três enzimas, chamado proteína
trifuncional. Esse complexo é distinto das enzimas que
catalisam a oxidação de acil-CoAs de cadeias média e
curta, todas proteínas solúveis da matriz mitocondrial.
A Correlação Clínica 17.5 descreve deficiências genéti
cas de acil-CoA desidrogenases.

CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.4
Deficiências Genéticas no Transporte por Carnitina (OMIM 212140) ou na Carnitina Palmitoil Transferase
(OMIM 600650)
Várias doenças resultam de anomalias genéticas no
transporte de ácidos graxos de cadeia longa através da
membrana mitocondrial interna. Elas se originam de
deficiências no nível de carnitina ou na síntese e trans
porte de acilcarnitinas. Mutações podem afetar a carni
tina palmitoiltransferase (CPT) ou a carnitina-acilcar
nitina translocase mitocondrial.
Duas categorias de deficiência de carnitina, pri
mária e secundária, são hoje reconhecidas. A deficiên
cia primária de carnitina é causada por um defeito
no transportador de carnitina de alta afinidade, da
membrana plasmática de tecidos como músculo, rim,
coração e fibroblastos (mas, aparentemente, não de
fígado, onde opera um transportador diferente). Re
sulta em níveis extremamente baixos de carnitina
nos tecidos afetados e no plasma (em decorrência da
incapacidade renal de reabsorver carnitina). Os sin
tomas clínicos da deficiência de carnitina vão desde
câimbras musculares recorrentes leves, até fraqueza
grave e morte. Os níveis muito baixos de carnitina
no coração e no músculo esquelético comprometem
seriamente a oxidação de ácidos graxos de cadeia
longa. A terapia com carnitina na dieta, que eleva a
concentração plasmática de carnitina e força sua en
trada nos tecidos de maneira inespecífica, é frequen
temente benéfica. A deficiência secundária de car
nitina está frequentemente associada com defeitos
hereditários na via da b-oxidação. Essas doenças fre
quentemente ocasionam acúmulo de acilcarnitinas,
que são excretadas na urina (ver Correlação Clínica
17.5), depletando, assim, a reserva de carnitina. Es
sas acilcarnitinas também podem impedir a captação
de carnitina livre pelos tecidos.
Existem várias deficiências diferentes de CPT. A
forma mais comum resulta de mutações no gene CPT
II, que causa uma perda parcial da atividade enzimá
tica. Os pacientes geralmente apresentam fraqueza
muscular durante exercício prolongado, quando os
músculos dependem muito de ácidos graxos como
fonte de energia. Mioglobinúria, decorrente de rup
Rendimento Energético da
ß-Oxidação de Ácidos Graxos
Cada ciclo de b-oxidação produz um acetil-CoA, um
FADH2 e um NADH. Na oxidação de palmitoil-CoA, sete
clivagens de ligações carbono–carbono ocorrem, com a
formação de dois acetil-CoAs na última clivagem. As
sim, a b-oxidação do palmitato produz oito acetil-CoAs,
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 713
tura do tecido muscular, é frequentemente obser
vada. A doença é geralmente descrita como a forma
muscular da deficiência de atividade de CPT II. Mu
tações causando perda mais severa (90% ou mais) da
atividade de CPT II podem ter sérias consequências
no início da infância. Estas são geralmente desenca
deadas por períodos de jejum e incluem hipoglicemia
hipocetótica, hiperamonemia, disfunção cardíaca e,
às vezes, morte. Morbidade e mortalidade semelhan
tes estão associadas com mutações no gene da CPT
I hepática. Até o momento, apenas alguns poucos
pacientes com deficiência de CPT I hepática foram
descritos, provavelmente porque a doença é frequen
temente letal. Nenhum defeito na isoforma muscular
da CPT I foi descrito.
O primeiro paciente com deficiência da carnitina
-acilcarnitina translocase foi descrito em 1992. Os si
nais clínicos incluem coma hipoglicêmico intermitente,
hiperamonemia, fraqueza muscular e cardiomiopatia.
A doença mostrou-se fatal aos três anos de idade. Vá
rios casos adicionais, com sintomatologia semelhante,
foram relatados desde então.
Essas doenças podem ser tratadas com uma dieta
pobre em ácidos graxos de cadeia longa e evitando-se
o jejum, para minimizar condições nas quais os tecidos
requerem oxidação de ácidos graxos para obtenção de
energia. A dieta também pode ser suplementada com
triacilgliceróis de cadeia média, porque esses ácidos
graxos entram nas mitocôndrias por um mecanismo in
dependente de carnitina.
Stanley, C. A., Hale, D. E., Berry, G. T., et al. A deficiency
of carnitine-acylcarnitine translocase in the inner mitochon
drial membrane. N. Engl. J. Med. 327:19, 1992; Roe, C. R.
e Dong, J. Mitochondrial fatty acid oxidation disorders. Em:
Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. e Valle, D. (Eds.), The
Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Vol.
II, 8. ed. New York: McGraw-Hill, 2001, II: 2297; e Bonnefont,
J. P., Demaugre, F., Prip-Buus, C., Saudubray, J. M., et al. Car
nitine palmitoyltransferase deficiencies. Mol. Gen. Metab.
68:424, 1999.
sete FADH2 e sete NADH. Com base na estimativa atual do
rendimento em ATP na fosforilação oxidativa (p. 589),
cada FADH2 rende 1,5 ATPs e cada NADH gera 2,5 ATPs
quando oxidados pela cadeia de transporte de elétrons.
Portanto, a oxidação de sete NADH e um FADH2 produz
28 ATPs A oxidação de cada acetil-CoA no ciclo dos áci
dos tricarboxílicos rende 10 ATP (p. 590), de modo que
os oito fragmentos de dois carbonos de uma molécula
de palmitato produzem 80 ATP, dando um total de 108
714 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.5
Deficiências Genéticas das Acil-CoA Desidrogenases
Deficiências de acil-CoA desidrogenases represen
tam um grupo de defeitos hereditários, descoberto re
centemente, que afetam a primeira reação da b-oxida
ção de ácidos graxos. Foram descritos pacientes com
mutações que afetam enzimas com especificidade para
diferentes comprimentos de cadeia. Essas mutações
incluem a acil-CoA desidrogenase de cadeia muito lon
ga (VLCAD), a acil-CoA desidrogenase de cadeia lon
ga (LCAD), a acil-CoA desidrogenase de cadeia média
(MCAD) e a acil-CoA desidrogenase de cadeia curta
(SCAD). Os pacientes com essas mutações autossômi
cas recessivas compartilham muitos dos mesmos sinais
clínicos. A mais bem caracterizada é a deficiência de
MCAD, que, apesar de somente ter sido reconhecida em
1982, é hoje considerada um dos mais comuns de todos
os erros inatos de metabolismo.
A deficiência de MCAD geralmente se manifesta du
rante os primeiros dois anos de vida. Os sintomas típi
cos, que se observam após um período de jejum de 12
horas ou mais, incluem vômitos, letargia e, frequente
mente, coma, acompanhados de hipoglicemia hipoce
tótica e acidúria por dicarboxílicos. A ausência de ceto
se por jejum deve-se ao bloqueio da oxidação hepática
de ácidos graxos, que também causa desaceleração da
gluconeogênese. Esse bloqueio, acoplado com a oxida
ATP. Entretanto, dois equivalentes de ATP são usados
para ativar palmitato a palmitoil-CoA (1 ATP é conver
tido em 1 AMP + PPi). Portanto, cada ácido palmítico
rende 106 ATP/mol na oxidação completa. A importân
cia dos ácidos graxos no suprimento das necessidades
energéticas do metabolismo humano é discutida na pá
gina 874.
Comparação entre Síntese e
Oxidação de Ácidos Graxos
As vias de síntese e oxidação de ácidos graxos são
semelhantes. Entretanto, como muitas vias pareadas
anabólicas e catabólicas, a síntese e a oxidação de áci
dos graxos não são o reverso uma da outra. As dife
renças críticas entre as duas vias são apresentadas na
Tabela 17.4, e incluem diferentes localizações celulares,
diferentes cofatores (NADPH na biossíntese e FAD e
NAD+ na oxidação) e o uso de ATP para direcionar a
formação de malonil-CoA para síntese de ácido graxo.
Essas diferenças permitem que ambas as vias ocorram
no sentido direta porque o DG < 0 para ambas. As dife
renças também permitem regulação independente, que
impede ciclo fútil.
ção de ácidos graxos deficiente no músculo, promove
utilização de glicose, levando a profunda hipoglicemia.
O acúmulo de acil-CoAs de cadeia média nos tecidos
força seu metabolismo por vias alternativas, incluindo
w-oxidação e transesterificação a glicina ou carnitina.
A excreção urinária excessiva dos produtos da reação
(ácidos dicarboxílicos de cadeia média, juntamente
com ésteres de cadeia média de glicina e carnitina) são
sinais diagnósticos dessa doença. Muitos casos ante
riormente diagnosticados como síndrome tipo-Reye
ou síndrome da morte súbita na infância eram, de
fato, devidos a deficiência de MCAD. Pacientes com
essa doença são tratados evitando-se jejum prolongado
e pela ingestão de uma dieta rica em carboidratos. Su
plemento da dieta com carnitina repõe a carnitina que
é perdida pela excreção aumentada de acilcarnitinas.
Isso é consistente com o fato de que as complicações
metabólicas da deficiência de MCAD só aparecem quan
do os tecidos do corpo ficam muito dependentes de áci
dos graxos como fonte de energia.
Rinaldo, P., Matern, D. e Bennett, M. J. Fatty acid oxida
tion disorders. Annu. Rev. Physiol. 64:477, 2002; e Wanders,
R. J. A., Vreken, P., den Boer, M. E. J., et al. Disorders of mi
tochondrial fatty acyl CoA b-oxidation. J. Inher. Metab. Dis.
22:442, 1999.
ß-Oxidação de Alguns Ácidos
Graxos Requer Etapas Adicionais
A via de b-oxidação oxida ácidos graxos saturados
com número par de átomos de carbono a acetil-CoA. En
tretanto, outros ácidos graxos da dieta, incluindo aque
les com duplas ligações cis, com cadeias ramificadas e
com número ímpar de átomos de carbono, requerem
etapas adicionais para sua completa oxidação. Essas
etapas permitem que esses ácidos graxos sejam usados
como combustíveis e impedem seu acúmulo. Outras
reações catalisam a a- e a w-oxidação de ácidos graxos.
A a-Oxidação ocorre em C2, em vez de C3, como ocorre
na b-oxidação, enquanto a w-Oxidação ocorre na extre
midade metil da molécula de ácido graxo.
CH3 O
CH2CSCoA
FIGURA 17.22 Propionil-CoA.
 CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 715

TABELA 17.4 Comparação dos Esquemas de Biossíntese e b-Oxidação do Palmitato

Parâmetro Biossíntese b-Oxidação

Localização subcelular Primariamente citosólica Primariamente mitocondrial
Carregador de acil contendo fosfopanteteína Proteína carregadora de acil Coenzima A
Fragmento carbônico pequeno adicionado ou Átomos C1 e C2 de malonil Acetil-CoA
removido CoA após iniciação
Coenzima de oxidação-redução NADPH FAD quando a cadeia saturada
é desidrogenada, NAD+ quando
hidroxiácido é desidrogenado
Configuração estereoquímica dos D-b-Hidroxi L-b-Hidroxi
b-hidroxi intermediários
Equivalentes de energia gerados ou 7 ATP + 14 NADPH = 7 FADH2 + 7 NADH – 2 ATP = 26
utilizados na interconversão de palmitato e 49 equiv. de ATP equiv. de ATP
acetil-CoA

Oxidação de Ácidos Graxos de Cadeia Alguns Ácidos Graxos Sofrem a-Oxidação

Ímpar Produz Propionil-CoA
Como apontado anteriormente, existem vários me
Os ácidos graxos com um número ímpar de átomos canismos para hidroxilação de ácidos graxos. Alguns
de carbono são oxidados pela via da b-oxidação. Os ácidos graxos de cadeia longa são hidroxilados para sín
produtos da clivagem final pela tiolase são acetil-CoA tese de esfingolipídeos e outros ácidos graxos de cadeia
e propionil-CoA (Figura 17.22). O propionil-CoA, que curta são hidroxilados no carbono a para iniciar sua
também é produzido pelo catabolismo de isoleucina, oxidação. A sequência é a seguinte:
valina e metionina, é metabolizado por carboxila CH3 O
ção a metilmalonil-CoA e conversão em succinil-CoA
(p. 802). (CH2)n CH2COH CH3 (CH2)n

Oxidação de Ácidos Graxos Insaturados
Requer Enzimas Adicionais
Os ácidos graxos insaturados são utilizados por
b-oxidação, mas reações adicionais são necessárias
para lidar com duplas ligações cis. O metabolismo
começa com vários ciclos de b-oxidação, o que gera
intermediários que têm duplas ligações perto do car
bono da carboxila. Duplas ligações começando em
átomos de carbono ímpares ou pares requerem dife
rentes estratégias. A oxidação de linoleil-CoA, (18:2)
(Figura 17.23) ilustra esse processo. A b-oxidação
gera um intermediário enoil-CoA com uma dupla liga
ção cis entre C3 e C4, em lugar do intermediário com
uma ligação trans entre C2 e C3 que é necessário para
a enoil-CoA hidratase. Enoil-CoA isomerase muda o
cis-D3 para um trans-D2-enoil-CoA, que pode então
ser metabolizado por b-oxidação.
Um segundo problema ocorre quando a dupla li
gação cis do acil-CoA intermediário reside entre C4 e
C5. Nesse caso, a ação da acil-CoA desidrogenase dá
origem a um trans-2, cis-4-enoil-CoA. Sobre este, age
a 2,4-dienoil-CoA redutase, que produz um trans-3
enoil-CoA, usando equivalentes de redução de NADPH.
Enoil-CoA isomerase então produz trans-2-enoil-CoA,
que é um substrato para b-oxidação.
OH O O O
CH COH CH3 (CH2)n C C OH
O
CH3 (CH2)n COH + CO2
Algumas dessas hidroxilações ocorrem no retículo
endoplasmático e na mitocôndria e envolvem monoo
xigenases (família P450) que requerem O2 e NADH ou
NADPH. A a-hidroxilação de ácidos graxos também
ocorre em peroxissomos. Esta é particularmente im
portante no metabolismo de ácidos graxos de cadeia ra
mificada (Correlação Clínica 17.6). Um ácido graxo de
cadeia ramificada, como fitanoil-CoA, que é derivado da
clorofila da dieta, sofre a ação de uma hidroxilase, em
uma reação envolvendo a-cetoglutarato, Fe2+ e ascor
bato, com a geração de 2-hidroxifitanoil-CoA e formil
-CoA. O último é metabolizado a CO2 via ácido fórmico.
O 2-hidroxifitanoil-CoA é, depois, metabolizado a ácido
pristânico, que passa pela b-oxidação.
-Oxidação Dá Origem a Ácidos
Dicarboxílicos
A w-Oxidação é outra via minoritária para oxidação
de ácidos graxos, que ocorre no retículo endoplasmáti
co de muitos tecidos. Nessa via, a hidroxilação ocorre
no carbono metil da extremidade oposta da molécula, a
716 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

H HH H
O
C C C C
CH3(CH2)4 CH2 CH2(CH2)4 CH2 CH2 CSCoA Linoleoil CoA

βOxidação O

3CH3 C SCoA

H HH H
O
C C C C
CH3(CH2)4 CH2 CH2CSCoA Um cis-3-enoil CoA

enoil-CoA isomerase

H H H C SCoA
C C C C
CH3(CH2)4 CH2CH2 H
Um trans-2-enoil CoA

O
βOxidação CH3C SCoA

H H
C C O

CH3(CH2)4 CH2CH2CSCoA Um cis-4-enoil CoA

acil-CoA desidrogenase

H C C H H O

CH3(CH2)4 H C C CSCoA Um trans-2, cis-4-enoil CoA

2,4-dienoil-CoA NADPH + H+

redutase NADP+

H O

CH3(CH2)4CH2CCCH2CSCoA Um trans-3-enoil CoA

H

enoil-CoA isomerase

O
H
CH3(CH2)4CH2CH2CCCSCoA Um trans-2-enoil CoA
H

βOxidação
O

5CH3 C SCoA
FIGURA 17.23 Oxidação de linoleil-CoA.

partir
tremidade
se quedo
requer
grupo
metil.
O2carboxila, ou nousa
A w-Oxidação uma monooxigena-
carbono vizinho à ex- podem ser mais oxidados no citosol a ácidos dicarboxí
licos, pela ação sequencial de álcool e aldeído desidro
e NADPH. Ácidos graxos hidroxilados genases citosólicas. Os ácidos graxos de cadeia média

CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.6
Doença de Refsum (OMIM 266500)
Embora a a-oxidação de ácidos graxos seja relati
vamente minoritária em termos de produção total de
energia, é significativa no metabolismo de ácidos gra
xos de cadeia ramificada da dieta. O principal exemplo
é o ácido fitânico, um produto metabólico do fitol, que é
um constituinte da clorofila. O ácido fitânico é um cons
tituinte significativo da gordura do leite e de animais.
Esse ácido não pode ser oxidado pela b-oxidação em
virtude da presença do grupo 3-metil. É metabolizado
por a-hidroxilação seguida de desidrogenação e des
carboxilação. b-Oxidação pode degradar completamen
te a molécula resultante, produzindo três moléculas de
propionil-CoA, três moléculas de acetil-CoA e uma mo
lécula de isobutiril-CoA.
CH3 CH3
CH3 CH(CH2CH
)3(CH2)3CH(CH2)3
Ácido fitânico
são os principais substratos para essa via. As reações
gerais são
O O
CH3 (CH2)n C OH HOCH2(CH2)n COH
O O
HO C(CH2)n C OH
Esses ácidos dicarboxílicos formam ésteres de CoA
em qualquer um dos grupos carboxila e, depois, passam
pela b-oxidação para produzir ácidos dicarboxílicos de
cadeia mais curta, como ácidos adípico (C6) e succínico
(C4). Esse processo ocorre primariamente nos peroxis
somos.
Corpos Cetônicos São Formados a
partir de Acetil-CoA
Os corpos cetônicos são produtos hidrossolúveis
da oxidação de lipídeos, que são formados nas mito
côndrias do fígado e do rim durante o jejum prolon
gado. Os corpos cetônicos, ácido acetoacético e seu
produto de redução ácido b-hidroxibutírico, são feitos
a partir do acetil-CoA que é produzido no catabolismo
de ácidos graxos e de aminoácidos (Figura 17.24). Os
corpos cetônicos são uma importante adaptação ao je
jum prolongado; eles podem estar presentes em altas
concentrações no sangue (>3 mM) e são uma impor
tante fonte de energia para muitos tecidos (ver Corre
lação Clínica 17.3).
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 717
Pacientes com uma doença genética rara chamada
doença de Refsum não têm a enzima de peroxissomos
que catalisa a a-hidroxilação e acumulam grandes
quantidades de ácido fitânico em seus tecidos e no soro.
Isso leva a graves problemas neurológicos como retinite
pigmentosa, neuropatia periférica, ataxia cerebelar e
surdez neurológica. A restrição de produtos derivados
do leite e de carne de ruminantes, na dieta, resulta na
diminuição do ácido fitânico plasmático e na regressão
dos sintomas neurológicos.
Wanders, R. J. A., van Grunsven, E. G. e Jansen, G. A. Lipid
metabolism in peroxisomes: enzymology, functions and dys
functions of the fatty acid a- and b-oxidation systems in hu
mans. Biochem. Soc. Trans. 28:141, 2000.
CH3 CH3
CHCH2 COOH
HGM-CoA É um Intermediário da Síntese
de Acetoacetato a partir de Acetil-CoA
Os corpos cetônicos são formados no fígado (e, em
menor escala, na córtex renal durante o jejum prolon
gado). Sua síntese ocorre na matriz mitocondrial e co
meça com a condensação de duas moléculas de acetil
-CoA para formar acetoacetil-CoA, em uma reação que
é o inverso da etapa final da b-oxidação (Figura 17.25).
A enzima envolvida, b-cetotiolase, é uma isoenzima da
enzima que funciona na b-oxidação. HGM-CoA sintase
catalisa a condensação de acetoacetil-CoA com outra
molécula de acetil-CoA, para formar b-hidroxi-b-me
tilglutaril-coenzima A (HGM-CoA). A HGM-CoA liase
então cliva HMG-CoA para produzir ácido acetoacético
e acetil-CoA.
O O
CH3 C CH2 C OH
Ácido acetoacético
OH O
CH3 CHCH2COH
Ácido β-Hidroxibutírico
FIGURA 17.24 Estrutura dos corpos cetônicos.
718 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

O ∼3:1. b-Hidroxibutirato e acetoacetato são liberados do

2 CH CSCoA fígado e do rim para uso de outros tecidos. O b-hidro
3
xibutirato também exporta equivalentes de redução da
Acetil CoA
oxidação de ácidos graxos.
cetotiiolase Algum acetoacetato passa por descarboxilação es
CoA pontânea, não-enzimática, para acetona:

O O O O O
CH CCH2CSCoA CH3 CC
CH2 OJ + H+ CH3CCH3 + CO2
3
Acetoacetil CoA
O A formação de acetona é desprezível em condições
CH3CSCoA HMG-CoA sintase normais, mas em altas concentrações de acetoacetato,
Acetil CoA que pode ocorrer na cetoacidose diabética grave (Cor
CoA relação Clínica 17.7), a acetona pode chegar a níveis su
ficientemente altos para ser detectada no hálito.
OH
HOOCCH2CCH2CSCoA
O
HMG-CoA é também um intermediário da síntese
de colesterol (p. 738). Entretanto, o HMG-CoA usado
CH3 na síntese de corpos cetônicos e na de colesterol está
3-Hidroxi, 3-metil-glutaril CoA presente em reservatórios metabólicos diferentes. O
(HMG CoA) HMG-CoA usado para cetogênese é sintetizado nas
mitocôndrias hepáticas (e renais) por uma isozima da
O HMG-CoA sintase que é expressa em altos níveis du
HMG-CoA liase CH3CSCoA
rante o jejum prolongado. Além disso, a HGM-CoAliase,
Acetil CoA que converte HMG-CoA em acetoacetato e acetil-CoA,
O é expressa só em mitocôndrias hepáticas (e renais). Di
CH CCH2COOH ferentemente, o HMG-CoA para síntese de colesterol é
3
Acetoacetato feito em baixos níveis no citosol de muitos tecidos por
NADH + H+ uma isozima citosólica da HMG-CoA sintase.
espontânea β-Hidroxibutirato
desidrogenase
CO2 NAD+ Utilização de Corpos Cetônicos por
CH3 O OH Tecidos Não-Hepáticos Requer a
C
Acetona CH3 CH3CHCH2COOH
b-Hidroxibutirato
Formação de Acetoacetil-CoA
Acetoacetato e b-hidroxibutirato produzidos pelo
FIGURA 17.25 Os corpos cetônicos são sintetizados a
partir de acetil-CoA em mitocôndrias hepáticas. fígado são excelentes combustíveis para muitos tecidos
não-hepáticos, incluindo músculo cardíaco, músculo
esquelético e cérebro, particularmente quando o su
Acetoacetato Forma D-b-Hidroxibutirato e primento de glicose é baixo (jejum prolongado) ou é
Acetona deficientemente usada (deficiência de insulina). Nessas
condições, esses tecidos oxidarão ácidos graxos livres,
Parte do acetoacetato é reduzida a D-b-hidroxibu cuja concentração no sangue aumenta à medida que os
tirato nas mitocôndrias pela b-hidroxibutirato desi níveis de insulina caem. Durante o jejum prolongado, os
drogenase. Note que o produto da b-hidroxibutirato corpos cetônicos substituem a glicose como combustí
desidrogenase é o D-b-hidroxibutirato, enquanto o b− vel, particularmente no cérebro, que começa a usar cor
-hidroxibutiril-CoA formado durante a b-oxidação é o pos cetônicos após 2-3 dias de jejum. Isso reduz a ne
isômero L. A extensão dessa reação depende da razão cessidade de produção de glicose por gluconeogênese
intramitocondrial NAD+/NADH. Como a b-hidroxibu durante o jejum prolongado, “economizando”, assim, a
tirato desidrogenase tem muita atividade no fígado, as proteína muscular que fornece aminoácidos para a glu
concentrações de seus substratos e produtos são man coneogênese (p. 638). Acetoacetato e b-hidroxibutirato
tidas perto do equilíbrio. Portanto, a razão entre b-hi também servem de precursores para a síntese de lipíde
droxibutirato e acetoacetato no sangue reflete a razão os cerebrais durante o período neonatal.
NAD+/NADH nas mitocôndrias hepáticas. Durante o je
jum, essa razão é relativamente alta por causa do NADH Corpos cetônicos são metabolizados nas mitocôn
gerado pela oxidação de ácidos graxos, favorecendo a drias de tecidos não-hepáticos. A b-hidroxibutirato
formação de b-hidroxibutirato; no homem em jejum desidrogenase converte b-hidroxibutirato em acetoace
de uma noite, a razão b-hidroxibutirato/acetoacetato é tato por uma oxidação NAD-ligada na matriz mitocon

CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.7
Corpos Cetônicos Como Combustíveis: A Dieta de Atkins
A popularidade atual de dietas pobres em carboi
dratos para perda de peso enfatiza a importância do
metabolismo de corpos cetônicos como combustíveis
no homem. A mais conhecida dessas foi populariza
da pelo falecido Dr. Robert Atkins em seu livro Dr.
Atkins’ Diet Revolution, que vendeu mais de 6 mi
lhões de cópias. A dieta de Atkins é rica em gordu
ra e proteína e muito pobre em carboidratos (menos
de 20 g/dia durante a fase inicial) e tem sido muito
controversa entre os médicos em virtude de seu alto
conteúdo de gordura. Os indivíduos que fazem essa
dieta frequentemente perdem uma quantidade consi
derável de peso, a despeito da promessa do autor que
os pacientes podem “parar de contar calorias e medir
porções”. Estudos clínicos controlados demonstraram
que indivíduos obesos perdem mais peso em uma die
ta rica em gordura/pobre em carboidratos do que em
uma dieta isocalórica com níveis mais altos de carboi
dratos. Surpreendentemente, uma notável queda foi
observada nos níveis de triacilgliceróis no sangue de
indivíduos em uma dieta rica em gordura/pobre em
carboidratos. Por exemplo, um teste de dois anos que
comparou uma dieta pobre em carboidratos/rica em
gordura (uma dieta tipo Atkins) com uma dieta pobre
em gordura/rica em carboidratos, uma dieta no estilo
Mediterrâneo, foi feito em 322 sujeitos, com um BMI
médio de 31. Os indivíduos da dieta rica em gordura/
pobre em carboidratos perderam em média 10,2 libras
(4,7 kg) comparados com uma perda de 6,4 libras (2,9
kg) para o grupo da dieta rica em carboidratos/pobre
em gordura. Além disso, houve uma redução em 20%
na razão de colesterol total para HDL colesterol no
grupo da dieta rica em gordura, e uma redução de ape
nas 12% nessa razão para os indivíduos da dieta rica
em carboidratos. Os autores concluíram que a dieta
rica em gordura/pobre em carboidratos era mais segu
ra para o consumo humano a longo prazo, e que trouxe
benefícios metabólicos; eles sugeriram que esta fosse
considerada em programas de perda de peso para pa
cientes obesos.
Na dieta de Atkins, a mobilização de ácidos graxos
do tecido adiposo e sua conversão pelo fígado em cor
pos cetônicos (b-hidroxibutirato, acetoacetato e aceto
na) é central. A dosagem de corpos cetônicos na urina
é o método prescrito para determinar o estado metabó
lico durante a dieta, uma vez que, mesmo quantidades
pequenas de carboidratos na dieta reprimem a síntese
de corpos cetônicos, principalmente por inibirem a li
pólise no tecido adiposo. À medida que a concentração
de corpos cetônicos sobe no sangue, uma fração é ex
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 719
cretada na urina, e uma parte é eliminada pela respi
ração. Poderia isso ser responsável pela maior perda de
peso observada em indivíduos na dieta de Atkins? Para
comparação, após sete dias de jejum, a taxa de excre
ção urinária diária de acetoacetato e b-hidroxibutirato
no homem é aproximadamente 110 mmol/dia; a taxa de
excreção é ainda menor no início do jejum (60 mmol/dia
após dois dias de jejum). Essa excreção poderia con
tribuir para o balanço calórico negativo e a perda de
peso característicos da dieta de Atkins, embora a perda
de energia não exceda 100 kcal/dia. É mais provável,
entretanto, que o alto conteúdo de gordura da dieta de
Atkins reduza o apetite e, assim, a ingestão de alimen
tos. Além disso, na ausência de carboidratos, a dieta é
monótona e persistência é um grande problema.
Em geral, a cetose surge quando a oxidação de glico
se é suprimida e o catabolismo de gordura é acelerado.
Existem dois tipos de cetose: a cetose normal do jejum
e a hipercetonemia patológica da cetoacidose diabéti
ca. Nenhum outro combustível do sangue humano pode
mudar tão drasticamente como corpos cetônicos e ain
da ser compatível com a vida. Após uma noite de jejum,
a concentração de corpos cetônicos é aproximadamen
te 0,05 mM, mas essa concentração pode subir para 2
mM após dois dias de jejum e para 7 mM após 40 dias,
uma mudança de 140 vezes na concentração. Em um
estudo original, O. E. Owen e colaboradores demonstra
ram que durante o jejum prolongado, acetoacetato e b−
-hidroxibutirato substituem a glicose como o combustí
vel predominante no cérebro. Isso reduz a necessidade
de síntese de glicose a partir de aminoácidos derivados
de proteína muscular e do fígado. O músculo consome
avidamente corpos cetônicos logo no início do jejum,
mas muda para oxidação de ácidos graxos à medida que
o jejum progride, economizando assim corpos cetônicos
para o metabolismo do cérebro. Portanto, corpos cetô
nicos são um combustível normal para uma variedade
de tecidos, e são parte de um padrão complexo de me
tabolismo de combustíveis que ocorre durante o jejum
no homem.
Owen, E. E., Morgan, A. P., Kemp, H. G., Sullivan, J. M., et
al. Brain metabolism during fasting. J. Clin. Invest. 46: 1589,
1967; Feinman, R. D. e Fine, E. J. Thermodynamic and me
tabolic advantage of weight loss diets. Metabolic Syndrome
and Related Disorders 1:209, 2003; Samaha, F. F., Iqbal, N.
Seshadri, P. Chicano, K. L. et al. A low-carbohydrate, as com
pared with a low-fat diet in severe obesity. N. Engl . J. Med.
348:21, 2003; e Shai, I., Schwarzfuchs, D., Henkin, Y., Shahar,
D. R. et al. Weight loss with a low-carbohydrate, Mediterrane
an, or low-fat diet. N. Engl. J. Med. 359: 229, 2008.
720 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Ácidos graxos
Aminoácidos

2 Acetil-CoA
Ciclo TCA
cetotiolase
CoA

Acetoacetil-CoA 2 Acetil-CoA
Acetil-CoA
HMG-CoA
cetotiolase
sintase
CoA CoA

Hidroximetilglutaril-CoA Acetoacetil-CoA
Succinato
HMG-CoA
liase tioforase Succinil-CoA
Acetil-CoA

Acetoacetato Acetoacetato

β-hidroxibutirato NADH + H+ NADH + H+

corrente sanguínea desidrogenase
β-hidroxibutirato
desidrogenase
NAD+ NAD+
β-Hidroxibutirato β-Hidroxibutirato

FIGURA
e utilização
17.26
deSíntese
corpos
mitocôndria hepática mitocôndria de músculo,
cetônicos. cérebro e outros tecidos

drial. O acetoacetato é, então, convertido em seu deri
vado CoA pela acetoacetato:succinil-CoA transferase
(tioforase), que está presente em tecidos que usam cor
pos cetônicos, mas não no fígado. Succinil-CoA serve de
fonte de CoA. A reação é apresentada na Figura 17.26. A
b-cetotiolase converte o acetoacetil-CoA em dois acetil
-CoAs, que entram no ciclo dos ácidos tricarboxílicos
para produção de energia.
Em resumo, as vias de síntese e utilização de corpos
cetônicos compartilham várias etapas. Entretanto, há
etapas que são específicas para cada via. As enzimas
chaves da síntese de corpos cetônicos, HMG-CoA sinta
se e HMG-CoAliase, são expressas no fígado (e na córtex
renal), mas não em outros tecidos. A enzima chave da
utilização de corpos cetônicos, acetoacetato;succinil
-CoA transferase, está presente em muitos tecidos, mas
não no fígado. Essas diferenças garantem que os corpos
cetônicos sejam produzidos no fígado e utilizados em
outros tecidos.
mas difere da b-oxidação mitocondrial em três aspec
tos importantes. Primeiro, a desidrogenação inicial é
realizada por um sistema de oxidase que usa O2 e pro
duz H2O2 (Figura 17.27). A H2O2 formada é consumida
pela catalase. As etapas remanescentes são as mesmas
do sistema de b-oxidação mitocondrial. Segundo, as
enzimas de peroxissomos e de mitocôndrias diferem
em sua especificidade; as enzimas de peroxissomos
preferem ácidos graxos de mais do que oito carbonos.
Embora as mitocôndrias de fígado de rato realizem a
oxidação completa de acil graxo-CoAs até acetil-CoA,
a b-oxidação em peroxissomos de fígado não vai além
de octanoil-CoA (C8). Portanto, os peroxissomos encur
tam ácidos graxos de cadeia longa até um ponto no qual
a b-oxidação possa ser completada nas mitocôndrias.
É interessante notar que as tiazolidinedionas, drogas
antidiabéticas que reduzem a resistência periférica à
insulina e diminuem os níveis de triacilglicerol em pa
cientes, causam um grande aumento nos peroxissomos.

CH3 O

A Oxidação em Peroxissomos de (CH2)n CH2 CH2 C SCoA

Ácidos Graxos Cumpre Muitas flavoproteína H2O2

Funções flavoproteína-H2 O2

Embora a maior parte da oxidação de ácidos graxos CH3 O

ocorra na mitocôndria, uma fração significativa tam
(CH2)n CHCH C SCoA
bém ocorre nos peroxissomos do fígado, do rim e de
outros tecidos. Os peroxissomos são uma classe de or FIGURA 17.27 Etapa inicial da oxidação de ácidos graxos
ganelas subcelulares com características morfológicas nos peroxissomos.
e químicas distintas (p. 21). Os peroxissomos do fígado
contêm as enzimas necessárias para b-oxidação. A via Outras reações de peroxissomos incluem o encurta
de oxidação de ácidos graxos nos peroxissomos de mento de ácidos dicarboxílicos, a conversão de coleste
mamíferos é semelhante à dos glioxissomos de plantas, rol em ácidos biliares e a formação de lipídeos éteres.

Graças a esses diversos papéis metabólicos, não é sur
preendente que a ausência congênita de peroxissomos
funcionais, um defeito hereditário conhecido como sín
drome de Zellweger, tenha efeitos tão devastadores (ver
Correlação Clínica 1.7, p. 212).
17.7 REGULAÇÃO DO
METABOLISMO DE
LIPÍDEOS
Regulação no Estado Alimentado
O metabolismo de lipídeos no homem é controlado
pelo estado dietético do indivíduo via um conjunto com
plexo de sinais hormonais. Depois de uma refeição que
contém lipídeos, carboidratos e proteínas, o lipídeo da
dieta é depositado como triacilglicerol no tecido adipo
so. Além disso, os carboidratos e os aminoácidos da die
ta, em excesso em relação ao necessário para energia
ou para síntese de proteínas, são convertidos em ácidos
graxos e depositados no tecido adiposo como triacilgli
cerol. O principal hormônio anabólico, insulina, é ne
cessário para síntese de ácidos graxos e para a forma
ção de triacilglicerol no tecido adiposo. Um resumo é
apresentado nas Tabelas 17.2 e 17.3. A insulina age em
dois níveis; induz a transcrição de genes que codificam
enzimas críticas das vias de síntese e armazenamento
de lipídeos (regulação de longo prazo) e controla pro
cessos como captação de glicose e hidrólise de triacil
glicerol (regulação de curto prazo).
A insulina estimula a síntese de ácidos graxos por au
mentar os níveis de enzimas chaves, incluindo a ácido
graxo sintase, a NADP-malato desidrogenase (enzima
málica) e a acetil-CoA carboxilase, no fígado, por induzir
a transcrição de seus genes. A insulina também estimula
a síntese de glicose 6-fosfato desidrogenase e 6-fosfoglu
conato desidrogenase, as duas enzimas da parte oxidati
va da via das pentoses, que geram parte do NADPH que
é necessário para a síntese de ácidos graxos. O efeito de
curto prazo da insulina na síntese hepática de ácidos
graxos é exercido pela ativação de uma fosfoproteína
fosfatase específica, que remove fosfato da acetil-CoA
carboxilase, ativando assim essa enzima. O fluxo aumen
tado pela glicólise é também importante para fornecer
acetil-CoA para a síntese de ácidos graxos.
No tecido adiposo, a insulina é necessária no estado
alimentado para captação de glicose via GLUT 4. O meta
bolismo dessa glicose via glicólise fornece glicerol 3-fos
fato para a síntese de triacilglicerol. A insulina também a
quebra de triacilglicerol por inibir a lipólise, evitando as
sim um ciclo fútil. Como no fígado, a insulina exerce seus
efeitos de curto prazo por meio da ativação de fosfopro
teína fosfatases. Isso diminui a fosforilação de proteínas
chaves, incluindo a lipase hormônio-sensível e a perilipi
na, levando à quebra diminuída de triacilgliceróis.
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 721
Regulação no Estado de Jejum
O jejum resulta em uma mudança drástica no meta
bolismo de lipídeos, com parada da deposição de lipídeos
e dependência do triacilglicerol armazenado. À medida
que a concentração de glicose no sangue diminui, há
um decréscimo paralelo na concentração de insulina na
circulação.
Há também um aumento de epinefrina e glucagon,
os quais elevam o nível de cAMP hepático e ativam a
proteína quinase A. No tecido adiposo, há uma fosfo
rilação aumentada da lipase hormônio-sensível e da
perilipina, resultando em um aumento na quebra de
triacilglicerol e na liberação de ácidos graxos livres e
glicerol desse tecido (ver Tabela 17.2, para um resumo
desses controles).
No fígado, essas mudanças hormonais levam a uma
diminuição na síntese de ácidos graxos, em virtude
da redução nos níveis de enzimas chaves (ver Tabela
17.3). Há também inibição da enzima limitante da ve
locidade, acetil-CoA carboxilase, por causa da fosfori
lação cAMP-dependente da enzima. A glicólise é tam
bém inibida; isso diminui o suprimento de acetil-CoA
para a lipogênese. O fígado começa a produzir corpos
cetônicos à medida que o jejum progride, em virtude
de um aumento na taxa de oxidação de ácidos graxos
causado pelos níveis aumentados de ácidos graxos no
sangue. Durante o jejum prolongado, cerca da metade
dos ácidos graxos que entram no fígado é convertida em
corpos cetônicos e liberada no sangue para utilização
por tecidos como músculo, coração e (após dois dias de
jejum) o cérebro, economizando assim o uso de glicose.
Regulação da Oxidação de Ácidos
Graxos
A velocidade de oxidação de ácidos graxos na mi
tocôndria é controlada pela regulação da entrada de
substratos nessa organela. A enzima chave é a carnitina
palmitoiltransferase I (CPT I), que sintetiza acilcarni
tina a partir do acil-CoA citosólico (ver Figura 17.20).
No fígado, a acetil-CoA carboxilase é ativada no esta
do alimentado, porque os níveis da enzima são altos,
a fosforilação cAMP-dependente é baixa, e a enzima é
ativada por citrato. A alta concentração resultante de
malonil-CoA estimula a síntese de ácidos graxos, mas
bloqueia a oxidação de ácidos graxos por inibir a CPT I.
Essa regulação impede um ciclo fútil. Ao contrário, no
estado de jejum, a atividade da acetil-CoA carboxilase
no fígado é baixa porque os níveis da enzima estão di
minuídos, a enzima está fosforilada, e o citrato também
está diminuído. A CPT I está ativa e a oxidação de áci
dos graxos ocorre em alta velocidade, nessas condições,
em virtude dos baixos níveis de malonil-CoA.
A oxidação de ácidos graxos no músculo é também
regulada por malonil-CoA, embora esse tecido não sin
722 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
tetize ácidos graxos. O músculo contém uma isoenzima
da acetil-CoA carboxilase que produz malonil-CoA ex
clusivamente para regulação da CPT I. A enzima é ati
vada por citrato e inibida por fosforilação. É fosforilada
pela proteína quinase A e por uma quinase dependente
de AMP. A fosforilação pela primeira enzima permite
que a oxidação de ácidos graxos seja regulada pelo esta
do dietético. No estado alimentado, a alta concentração
de insulina resulta em baixos níveis de fosforilação. A
acetil-CoA carboxilase produz malonil-CoA, que inibe a
CPT I e bloqueia a oxidação de ácidos graxos. Ao con
trário, no estado de jejum, a alta concentração de cAMP
estimula a fosforilação da acetil-CoA carboxilase, re
sultando em sua inibição.Como consequência, a CPT I
facilita a entrada de ácidos graxos na mitocôndria para
oxidação. Essa regulação promove a oxidação de ácidos
CORRELAÇÃO CLÍNICA 17.8
Ácidos Graxos como Moléculas Regulatórias
A maioria dos livros de bioquímica trata extensa
mente do papel crítico dos ácidos graxos no metabo
lismo energético e, para isso, enfatiza as vias de sua
síntese, degradação e modificação. Entretanto, os
ácidos graxos também funcionam como moléculas
regulatórias, que desempenham um papel chave no
controle da expressão gênica, do apetite e da síntese
hepática de glicose. Os ácidos graxos da dieta regulam
a expressão gênica por alterarem a atividade de um
dentre vários receptores ativados por proliferadores
em peroxissomos (PPARs, peroxisome proliferator
-activated receptors), que são fatores de transcrição
da família dos receptores nucleares. A importância
dos PPARs no controle da homeostase energética é
exemplificada pelo amplo uso clínico de tiazolidine
dionas, que são antagonistas do PPARγ, para o contro
le do diabetes (ver Correlação Clínica 17.1 para uma
discussão detalhada sobre a função desses fatores de
transcrição). Os ácidos graxos ativam os PPARs e pro
movem a deposição de triacilglicerol e a utilização de
glicose pelos adipócitos. Os ácidos graxos de cadeia
longa (LCFA, long chain fatty acids) também atuam
no cérebro para regular o apetite via seus derivados
CoA. A administração de ácido oleico nos ventrículos
do cérebro de rato suprime o apetite por diminuir a
expressão de neuropeptídeos hipotalâmicos que au
mentam1 o apetite (neuropeptídeo Y e proteína rela
cionada com agouti); ácidos graxos elevados no hipo
tálamo sinalizam um excesso de energia. Esse efeito é
independente da leptina, um hormônio produzido no
tecido adiposo e um inibidor chave do apetite de ma
míferos (ver Correlação Clínica 21.1). A administração
de ácido oleico no cérebro também diminui muito a
produção hepática de glicose e a atividade da glico
se 6-fosfatase, uma enzima chave da gluconeogênese.
graxos no estado de jejum e a inibe no estado alimen
tado.
A segunda quinase, que é regulada por AMP, liga a
velocidade de oxidação de ácidos graxos com o estado
energético do músculo. No músculo em repouso, os ní
veis de AMP são baixos. Como resultado, a quinase de
pendente de AMP está inativa, a acetil-CoA carboxilase
está ativa e o malonil-CoA que é gerado inibe a CPT I e a
oxidação de ácidos graxos. No músculo em exercício, al
tos níveis de AMP ativam a proteína quinase. A inibição
resultante da acetil-CoA carboxilase resulta em baixos
níveis de malonil-CoA e a ativação de ambos, CPT I e
oxidação de ácidos graxos. Essa regulação permite que
o exercício estimule a velocidade de oxidação de gordu
ra, por meio da produção aumentada de AMP.
Esse efeito representa um eixo cérebro-fígado, uma
vez que a elevação da concentração de ácido oleico no
sangue não altera a produção hepática de glicose. O
efeito do ácido oleico no cérebro depende da ativação
de canais de K+ pela proteína quinase C (PKC); várias
isoformas de PKC são ativadas por ácidos graxos. Ou
tro ponto de regulação é o intestino delgado superior.
Há evidências em roedores e no homem indicando que
a gordura ativa um eixo intestino-cérebro-fígado, que
sinaliza a saciedade e controla a síntese e a liberação
de glicose pelo fígado. A administração direta de áci
dos graxos no intestino superior aumenta os níveis de
LCFA-CoA e reprime a produção hepática de glicose.
A importância desse eixo é estabelecida por experi
mentos mostrando que o efeito de LCFA-CoA é aboli
do quando a inervação do intestino pelo nervo vago é
interrompida. Fica claro que a visão dos ácidos graxos
apenas como combustível para o metabolismo energé
tico e como constituintes de lipídeos complexos é uma
super-simplificação. Essas moléculas também desem
penham funções complexas na regulação de adapta
ções metabólicas à disponibilidade de nutrientes.
Yki-Jarvinen, H. Thiazolidinediones. N. Engl. J. Med.
351: 1106, 2004; Wang, P.Y., Caspi, L., Lam, C. K., Chari, M.,
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T. K., Schwartz, G. J. e Rossetti, L. Hypothalamic sensing of
fatty acids. Nat. Neurosci. 8: 579, 2005.
_
1 No original, “neuropeptídeos que inibem o apetite”. Porém, tanto o
neuropeptídeo Y como AGRP (proteína relacionada com agouti) indu
zem ou aumentam o apetite, induzindo obesidade (N.T.).

Ácidos Graxos Como Moléculas
Regulatórias
Os ácidos graxos são, eles próprios, moléculas regu
latórias no fígado, no músculo e no tecido adiposo. No
músculo, acil-CoAs de cadeia longa ativam a proteína
Bibliografia
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Lipídeos
Ducharme, N.A. e Bickel, P. E. Lipid droplets in lipoge
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CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 723
quinase C, bem como os fatores de transcrição PPARγ
e NFkB que, por sua vez, inibem a ação da insulina por
meio do bloqueio da ativação de intermediários da via
de sinalização da insulina. Esses efeitos dos ácidos
graxos têm dramáticas consequências na regulação do
metabolismo de carboidratos no músculo (Correlação
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Termos Chaves
ácido fosfatídico
ácido graxo sintase
ácido palmítico
ácidos graxosessenciais,
insaturados, (saturados,
de
cadeia ramificada)
ácidos graxos poli-insatu
livres
rados
acilgliceróis (mono, die
tri)
anaplerose/cataplerose
ATP citrato liase lançadeira carnitina/car oxidação de ácidos graxos
cetogênese nitina (b-oxidação)
coenzima A (CoA) lipase hormônio-sensível perilipina
corpos cetônicos lipase pancreática peroxissomos
dessaturação de ácido lipase triglicéride do adi propionil-CoA
graxo poso proteína carregadora de
elongação de ácido graxo lipogênese acil
enzima málica lipólise quilomícron
lipoproteína de densidade síntese de ácidos graxos
glicerol 3-fosfato
muito baixa (VLDL) tecido adiposo branco
glicerol quinase
lipoproteína lipase
gliceroneogênese tecido adiposo marrom
malonil-CoA via da clivagem de citrato
insulina

Questões • CAROL N. ANGSTADT

Questões de Múltipla Escolha C. introduz duplas ligações primariamente na
configuração trans.
1. Todas as afirmações seguintes sobre a acetil-CoA
carboxilase são corretas, exceto D. só pode ocorrer depois que o palmitato foi
A. catalisa a etapa limitante da velocidade da sín alongado a ácido esteárico.
E. introduz a primeira dupla ligação na extremi
tese de ácidos graxos
dade metil da molécula.
B. requer biotina.
4. Lipoproteína lipase:
C. é inibida por fosforilação mediada por cAMP.
A. é uma enzima intracelular.
D. é ativada por palmitoil-CoA.
B. é estimulada por fosforilação mediada por
E. seu conteúdo em uma célula responde a mu cAMP.
danças no conteúdo de gordura da dieta.
C. funciona para mobilizar triacilgliceróis arma
2. Durante a síntese de palmitato em células do fígado, zenados no tecido adiposo.
A. a adição de malonil-CoA à ácido graxo sintase D. é estimulada por uma das apoproteínas pre
alonga a cadeia nascente em três átomos de sente na VLDL.
carbono. E. produz ácidos graxos livres e um monoacilgli
B. um resíduo b-ceto na porção 4!-fosfopanteteína cerol.
é reduzido a um resíduo saturado por NADPH. 5. a-Oxidação
C. palmitoil-CoA é liberado da sintase. A. é importante no metabolismo de ácidos graxos
D. a transferência da cadeia em crescimento da de cadeia ramificada.
ACP para outro -SH ocorre antes da adição do B. metaboliza um ácido graxo completamente até
malonil-CoA seguinte. acetil-CoA.
E. o primeiro composto a ser adicionado à ácido C. produz peróxido de hidrogênio.
graxo sintase é malonil-CoA.
D. impede que o ácido graxo produza energia.
3. No homem, a dessaturação de ácidos graxos E. requer NADPH.
A. ocorre primariamente nas mitocôndrias. 6. Outra via minoritária de oxidação de ácidos graxos
B. é catalisada por um sistema enzimático que é a w-oxidação, que resulta em uma hidroxilação.
usa NADPH e um citocromo. A w-oxidação

A. ocorre em mitocôndrias.
B. introduz o OH no carbono adjacente ao grupo
carboxila.
C. oxida primariamente ácidos graxos de cadeia
muito longa.
D. oxida o grupo metil terminal.
E. produz ácidos dicarboxílicos na oxidação ini
cial.
Questões 7 e 8: Após um forte resfriado que causou
perda de apetite, um menino de 1 ano de idade foi hos
pitalizado com hipoglicemia, hiperamonemia, fraqueza
muscular e irregularidades cardíacas. Esses sintomas
eram consistentes com um defeito no sistema carnitina
de transporte. Foi tentada, sem sucesso, a terapia com
carnitina na dieta, mas uma dieta pobre em ácidos gra
xos de cadeia longa e suplementada com triacilgliceróis
de cadeias médias foi benéfica.
7. O transporte de ácidos graxos pela carnitina do ci
tosol para a mitocôndria envolve todos os seguin
tes, exceto
A. hidrólise de ATP.
B. troca de acilcarnitina e carnitina livre através
da membrana mitocondrial interna.
C. duas carnitina palmitoil transferases (CPT I e
CPT II) localizadas em diferentes membranas
mitocondriais.
D. liberação de CoASH da acil graxo-CoA no cito
sol.
E. consumo de CoASH mitocondrial.
8. A criança foi diagnosticada como tendo deficiência
de carnitina-acilcarnitina translocase. O tratamen
to dietético foi benéfico porque
A. a criança podia obter toda a energia necessá
ria de carboidratos.
B. a deficiência estava no sistema de peroxisso
mos, de modo que a carnitina não ajudaria.
C. ácidos graxos de cadeias médias (8–10 carbo
nos) entram na mitocôndria antes de serem
convertidas em seus derivados CoA.
D. triacilgliceróis de cadeias médias contêm
principalmente ácidos graxos hidroxilados.
E. ácidos graxos de cadeias médias, como C8 e
pelo
C 10, fígado.
são facilmente convertidos em glicose
Questões 9 e 10: Deficiência de acil-CoA de cadeia mé
dia desidrogenase (MCAD), um defeito na b-oxidação,
geralmente produz sintomas nos primeiros dois anos
de vida, após um período de jejum. Sintomas típicos
incluem vômitos, letargia e hipoglicemia hipocetótica.
Secreção urinária excessiva de ácidos dicarboxílicos de
cadeia média e ésteres de cadeia média de glicina e car
nitina ajudam a estabelecer o diagnóstico.
9. A b-oxidação de ácidos graxos
A. gera ATP só se acetil-CoA for subsequente
mente oxidado.
CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOSI: … • 725
B. é geralmente suprimida durante o jejum.
C. usa apenas ácidos graxos de cadeias pares, sa
turados, como substratos.
D. usa NADP+.
E. ocorre por uma sequência repetida de quatro
reações.
10. A falta de corpos cetônicos em presença de bai
xa glicose sanguínea nesse caso é incomum, uma
vez que as concentrações de corpos cetônicos ge
ralmente aumentam com a hipoglicemia induzida
pelo jejum. Corpos cetônicos
A. são formados pela remoção de CoA do inter
mediário correspondente da b-oxidação.
B. são sintetizados a partir de b-hidroxi-b-metil
glutaril-coenzima A (HMG-CoA).
C. são sintetizados primariamente no tecido
muscular.
D. incluem b-hidroxibutirato e acetoacetato, sen
do que a razão reflete a razão [NADH]/[NAD+]
intramitocondrial do fígado.
E. formam-se quando a b-oxidação é interrompi
da.
Questões 11 e 12: Um dos problemas associados com
a obesidade é o risco aumentado de diabetes tipo 2.
Concentração alta de ácidos graxos no sangue reduz
a captação e o metabolismo de glicose pelo músculo
esquelético, aumentando os níveis de glicose no san
gue e a secreção de insulina (resistência à insulina).
A superprodução prolongada de insulina pode causar
insuficiência das células b do pâncreas e diabetes tipo
2. Isso ocorre em ~40% dos indivíduos obesos por cin
co a dez anos. Uma forma de regular a concentração
de ácidos graxos no sangue é sua reesterificação em
triacilgliceróis. Um tipo de droga antidiabética (tiazo
lidinediona) age sobre um receptor nuclear (PPARγ2),
facilitando a taxa de reesterificação de ácidos graxos
no tecido adiposo branco.
11. Todos os eventos seguintes estão geralmente en
volvidos na síntese de triacilgliceróis no tecido adi
poso, exceto
A. adição de um acil graxo-CoA a um diacilglice
rol.
B. adição de um acil graxo-CoA a um lisofosfatí
deo.
C. uma reação catalisada pela glicerol quinase.
D. hidrólise de ácido fosfatídico por uma fosfatase.
E. redução de di-hidroxiacetona fosfato.
12. O glicerol 3-fosfato para a síntese de triacilglicerol
A. é sempre formado pela redução de di-hidro
xiacetona fosfato.
B. pode ser formado no fígado por glicerogênese,
mas não no tecido adiposo.
C. deriva seus carbonos primariamente de ami
noácidos no estado alimentado.
D. só pode ser sintetizado na presença de fosfoe
nolpiruvato carboxiquinase.
726 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
E. é derivado primariamente da glicose, via gli
cólise, no estado alimentado.
Problemas
13. Como a b-oxidação de um ácido graxo insaturado
lida com a dupla ligação cis de ocorrência natural,
Respostas
1. D É ativada por citrato e inibida por acil graxo
-CoAs de cadeia longa. C: como cAMP aumenta
quando energia é necessária, é consistente que
em um processo que utilize energia seja inibido. E:
controle de longo prazo relaciona-se com síntese
da enzima e responde adequadamente a mudanças
na dieta.
2. B A: quebra de CO2 de malonil-CoA é a força mo
triz para a reação de condensação, de modo que a
cadeia cresce dois átomos de carbono por vez. C:
em mamíferos, palmitato é liberado como ácido li
vre; a conversão em éster de CoA é por uma enzi
ma diferente. D: é importante entender que apenas
ACP liga o malonil-CoA que entra, de modo que
ele deve ser liberado antes que outra adição pos
sa acontecer. E: acetil-CoA é adicionado primeiro,
para formar o fundamento para o resto da cadeia.
3. B A: dessaturação ocorre no retículo endoplas
mático. C: ácidos graxos de ocorrência natural são
cis. D: elongação e insaturação podem ocorrer em
qualquer ordem. E: se isso fosse verdade, podería
mos fazer ácido linoleico.
4. D ApoC-II liga a lipoproteína à enzima. A-C: estas
são características da lipase hormônio-sensível. E:
esta é a lipase pancreática.
5. A A presença de um grupo metil impede o pro
cesso de b-oxidação neste ponto. B: uma vez ul
trapassado o grupo metil, a b-oxidação pode
prosseguir. C: a reação é por uma hidroxilase que
adiciona uma ligação OH. D: durante as fases da a−
-oxidação, energia é produzida. E: esta hidroxilase
usa ascorbato como agente redutor.
6. D É por isso que é chamada w-oxidação. A: ocor
re no retículo endoplasmático. B: esta é a-oxida
ção. C: ácidos graxos de cadeia média são substra
tos preferidos. E: o grupo hidroxila requer álcool e
aldeído desidrogenases para convertê-lo em ácido.
7. A Atroca do grupo acil entre CoA e carnitina não
requer energia adicional. B: isso é catalisado pela
carnitina-acilcarnitina translocase. C: CPT I fica
no lado externo da membrana, e CPT II fica no lado
da matriz da membrana interna. D e E: apenas a
porção acil da molécula é transportada; as molé
culas de CoASH permanecem em seus respectivos
compartimentos.
8. C Como ácidos graxos de cadeia média atraves
sam a membrana mitocondrial diretamente, não
quando a primeira etapa da b-oxidação produz um
intermediário trans enoil-CoA?
14. Como a oxidação de um ácido graxo de 17 carbo
nos (de plantas) leva à produção de propionil-CoA?
Seja específico em sua resposta.
requerem o sistema da carnitina. A: isso nunca é
verdade. B: oxidação em peroxissomos não requer
carnitina, mas este não é um sistema de peroxisso
mos. D: ácidos graxos hidroxilados não são cons
tituintes comuns de triacilgliceróis. E: o fígado é
incapaz de sintetizar glicose a partir de ácidos gra
xos com um número par de átomos de carbono.
9. E A e D: é importante entender que a b-oxidação,
por si só, gera FADH2 e NADH, que podem ser reo
xidados para gerar ATP. B: a oxidação de ácidos
graxos geralmente aumenta durante o jejum. C: b−
-oxidação é um processo geral, que requer peque
nas modificações para oxidar quase que qualquer
ácido graxo da célula.
10. D A e E: b-oxidação vai até o fim; corpos cetô
nicos são formados por um processo separado. B,
C: corpos cetônicos são formados, mas não usados,
em mitocôndrias hepáticas; HMG-CoA citosólico é
um precursor de colesterol. Corpos cetônicos não
são facilmente sintetizados pelo músculo.
11. C Isso não ocorre em extensão significativa no
tecido adiposo. A, B e D: a adição sequencial de
acil graxo-CoAs ao glicerol 3-fosfato forma ácido
lisofosfatídico, depois ácido fosfatídico, cujo fosfato
é removido antes da adição do terceiro resíduo de
ácido graxo. E: esta é a formação de a-glicerol fos
fato no adiposo.
12. E Esta é a via primária no fígado e no tecido adi
poso. A: o fígado pode formá-lo a partir de glicerol
porque tem glicerol quinase. B: ambos os tecidos
têm a mesma via. C e D: esses são substratos para
a gliceroneogênese no estado de jejum e requer fos
foenolpiruvato carboxiquinase.
13. Quando vários ciclos de b-oxidação produzem um
intermediário com uma dupla ligação cis entre
C3 e C4, a enoil-CoA isomerase muda cis D3 para
trans D2 enoil-CoA e a b-oxidação continua. Se
outra dupla ligação cis for encontrada entre C4 e
C5, primeiro a desidrogenase normal, depois uma
redutase com NADPH, seguida pela enoil-CoA iso
merase agem sobre a molécula para produzir um
trans 2-enoil-CoA. A b-oxidação continua.
14. b-Oxidação prossegue normalmente, mas a cliva
gem final pela tiolase gera acetil-CoA e propionil
-CoA. Propionil-CoA não é substrato para SCAD
(acil-CoA desidrogenase de cadeia curta), de modo
que a b-oxidação termina.
PARTE IV CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 727
Vias Metabólicas e seu controle

18
Metabolismo
Acetil CoA
CE

de
Vias
Lipídeos
do Metabolismo
Especiais
II: β-oxidação

FFA
SR-BIApoA-1

Fígado FFA HL CE

HDL 2

CE

Robert H. Glew
Professor Emérito, University of New Mexico

18.1
CONTEÚDO
18.2
18.3
18.4
18.5
18.6 PROSTAGLANDINAS
INTRODUÇÃO,
FOSFOLIPÍDEOS,
COLESTEROL,
ESFINGOLIPÍDEOS,
LIPOXIGENASE728
738
E 728
ÁCIDOS
748
E TROMBOXANES, 756 CORRELAÇÕES CLÍNICAS
18.1 Remoção (clearance) de Eritrócitos: Papel da
Fosfatidilserina, 731
18.2 Síndrome do Desconforto Respiratório, 732
18.3 Tratamento da Hipercolesterolemia, 747
18.4 Aterosclerose, 747
18.5 Diagnóstico da Doença de Gaucher em um Adul
to, 756
OXIEICOSATETRAENOICOS, 761

Conceitos Chaves
• A maioria das células sintetiza os principais glice
rofosfolipídeos e esfingolipídeos a partir de compo
nentes da dieta e de intermediários metabólicos.
Ambos são componentes majoritários das membra
nas celulares.
• Os glicerofosfolipídeos têm outras funções, incluin
do as de componentes do surfactante pulmonar. A
fosfatidilcolina desempenha um papel no processo
dependente de HDL que transporta colesterol dos
tecidos periféricos para o fígado, e fosfolipídeos
contendo inositol servem de segundos mensageiros
e como sítios de ligação de proteínas na superfície
celular.
• O colesterol é sintetizado a partir de acetil-CoA em
um processo com múltiplas etapas, nas quais a sín
tese de mevalonato, catalisada pela HMG-CoA re
dutase, é a etapa regulada, limitante da velocidade.
A redutase é o alvo para a classe estatina de drogas
para baixar o colesterol. O colesterol é o precursor
da síntese de ácidos biliares e hormônios esteroi
des, como testosterona, estrógeno, glucocorticoi
des e mineralocorticoides.
• As lipoproteínas plasmáticas, incluindo HDL, LDL,
quilomícrons, VLDL e uma variedade de proteínas
acessórias, transportam colesterol e triacilglice
róis no sangue. A colesteril éster transferase de
sempenha um importante papel no processo. LDL
e os receptores de LDL são os principais elementos
regulatórios, que controlam os níveis de colesterol
no plasma e nos tecidos.
• Existem várias classes de esfingolipídeos, in
cluindo esfingomielina, cerebrosídeos, globosí
deos, gangliosídeos e sulfatídeos. A degradação
dos esfingolipídeos envolve enzimas lisossomais;
728 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

uma deficiência genética de uma ou mais dessas
enzimas resulta no acúmulo de esfingolipídeos e
glicosaminoglicanos parcialmente catabolizados
nos tecidos.
• O ácido araquidônico é o precursor de hormônios
lipídicos que incluem prostaglandinas, leucotrie
nos e lipoxinas, que são mediadores de vários fe
nômenos inflamatórios. As enzimas chaves dessas
vias são a cicloxigenase e a lipoxigenase.

18.1 INTRODUÇÃO geralmente contêm um resíduo de sn-glicerol 3-fosfato.

Embora ambos contenham o resíduo de glicerol como
Lipídeo é um termo geral que descreve substâncias um elemento estrutural fundamental, triacilgliceróis
que são relativamente insolúveis em água e que podem neutros e fosfolipídeos iônicos carregados têm proprie
ser extraídas por solventes não-polares. Os lipídeos dades físicas e funções muito diferentes.
complexos do homem são classificados em duas cate
gorias amplas: (1) lipídeos neutros, não-polares, como
triacilgliceróis e ésteres de colesterol, e (2) lipídeos po CH2 Número
do carbono
lares, como os fosfolipídeos e os glicolipídeos. Os lipíde OH 1
os polares são anfipáticos, contendo uma região hidro
HO C H 2
fóbica e uma hidrofílica na mesma molécula. As regiões
hidrofóbicas e as hidrofílicas dos glicerofosfolipídeos CH2OH 3
são unidas por um resíduo de glicerol e, na esfingomie
lina e nos glicoesfingolipídeos, por uma esfingosina. O FIGURA 18.1 Numeração estéreo-específica do glicerol.
triacilglicerol é encontrado, primariamente, nos locais
de armazenamento no tecido adiposo, enquanto os lipí
deos polares ocorrem, primariamente, em membranas
Fosfolipídeos Contêm Ácido
celulares. Fosfatídico Ligado a uma Base
Os lipídeos complexos desempenham muitas fun Os fosfolipídeos são lipídeos polares, iônicos, com
ções. Além de sua função na estrutura das membra postos por 1,2-diacilglicerol e uma ponte fosfodiés
nas, alguns glicerofosfolipídeos são necessários para ter, que liga o esqueleto do glicerol a alguma base,
a atividade de enzimas de membrana, e fosfolipídeos geralmente nitrogenada, como colina, serina ou eta
contendo inositol servem de precursores de moléculas nolamina (Figuras 18.2 e 18.3). Os fosfolipídeos mais
sinalizadoras. Os glicoesfingolipídeos desempenham abundantes em tecidos humanos são a fosfatidilcolina
um papel no reconhecimento célula–célula, na fagoci (também chamada lecitina), a fosfatidiletanolamina e
tose, na inibição por contato e na rejeição de tecidos a fosfatidilserina (Figura 18.4). Em pH fisiológico, a
e órgãos transplantados. Os determinantes antigênicos fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina não têm car
dos grupos sanguíneos são primariamente de natureza ga líquida, e existem como zwitterions dipolares, en
glicolipídica. Colesterol é importante na aterosclerose e quanto a fosfatidilserina tem uma carga líquida de -1,
vários esfingolipídeos acumulam-se em doenças genéti
cas chamadas esfingolipidoses.
HOCH2 CH2 NH
+ 3 Etanolamina
A nomenclatura e a química dos lipídeos é apresen
tada no Apêndice. HOCH2CH2N+(CH3)3 Colina

HO CH2 C NH+3 Serina

18.2 FOSFOLIPÍDEOS
COO–
As duas classes principais de acilglicerolipídeos são
triacilgliceróis e glicerofosfolipídeos, que têm em seu HO CH2 CH CH2OH Glicerol
núcleo o poliol C3 glicerol. Os dois grupos álcool primá OH
rio do glicerol não são estereoquimicamente idênticos,
e, no caso de fosfolipídeos, é geralmente o mesmo gru
po hidroxila que é esterificado ao resíduo de fosfato. O
HO OH
sistema de numeração esteroespecífica designa os di
H OH
ferentes grupos hidroxila. Nesse sistema, quando a es 2 1

3 OH
H H myo-Inositol
trutura do glicerol é desenhada na projeção de Fischer,
com o grupo hidroxila C2 projetando-se para a esquerda HO 4 5 H6
da página, os átomos de carbono são numerados como
H OH
mostra a Figura 18.1. Quando o sistema de numeração
estéreo-específica (sn) é utilizado, o prefixo sn- é usa FIGURA 18.2 Estrutura de alguns grupos polares comuns
do antes do nome do composto. Os glicerofosfolipídeos de fosfolipídeos.
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 729

O tante incomum porque frequentemente contém, quase

O CH2 O C R1 que exclusivamente, ácido esteárico (18:0) na posição
sn-1 e ácido araquidônico na posição sn-2.
R2 C O C H O

CH2 OPOR3 Outro fosfolipídeo composto por um grupo poliol

na cabeça polar é o fosfatidilglicerol (Figura 18.5),
O–
que ocorre em quantidades relativamente grandes nas
Ponte
fosfodiéster membranas mitocondriais e no surfactante pulmonar,
e é um precursor da cardiolipina. Fosfatidilglicerol e
FIGURA 18.3 Estrutura geral de um fosfolipídeo, onde R1 fosfatidilinositol apresentam, ambos, uma carga for
e R2 representam as cadeias alifáticas de ácidos graxos, mal de -1 em pH neutro e são, portanto, lipídeos ací
e R3 representa um grupo polar.
dicos.

sendo, portanto, um fosfolipídeo acídico. A fosfatidi

letanolamina (PE) está relacionada à fosfatidilcolina O
pois a trimetilação de PE produz lecitina. A maioria O CH2 O C R1
dos fosfolipídeos contém mais de um tipo de ácido
R2 C O C H O H OH
graxo por molécula, de maneira que uma dada classe
de fosfolipídeos de qualquer tecido, na verdade, repre CH2 O O–
P O H
OH
senta uma família de espécies moleculares. A fosfati OH HO
dilcolina (PC) contém, principalmente, ácido palmí OH

tico (16:0) ou ácido esteárico (18:0) na posição sn-1 HH

e, primariamente, os ácidos graxos insaturados de 18 Fosfatidilinositol
carbonos oleico, linoleico ou α-linolênico, na posição
sn-2. A fosfatidiletanolamina tem os mesmos ácidos O
graxos saturados que a PC na posição sn-1, mas con O CH2
CH2O C R1
tém mais dos ácidos graxos poli-insaturados de cadeia
R2 C O C H O
longa, a saber, ácido linoleico [18:2(9,12)], ácido ara
quidônico [20:4(5,8,11,14)] e ácido docosa-hexaenoico O P O CH2CHCH2OH

[22:6(4,7,10,13,16,19)] na posição sn-2. O– OH

Fosfatidilglicerol

O
FIGURA 18.5 Estrutura do fosfatidilglicerol e
R2 O H2COCR
H2 1 fosfatidilinositol.
COCH O

C OP OCH2CH2
+
NH3
A cardiolipina é um fosfolipídeo muito acídico (car
ga -2), o qual é composto por duas moléculas de ácido
O–
fosfatídico ligadas covalentemente por uma molécu
Fosfatidiletanolamina la de glicerol (Figura 18.6). Ocorre primariamente na
membrana interna de mitocôndrias de tecidos metabo
O licamente ativos (por exemplo, músculo cardíaco) e em
R2 O H2
H2COC R1 membranas bacterianas. A cardiolipina está presente
na membrana de Treponema palladium e é o antígeno
COCH O
+ detectado no teste de Wasserman para sífilis. A síndro
C OP OCH2CH NH3
me de Barth é uma doença mitocondrial rara, ligada ao
O– COO– X, causada por um defeito no gene RAZ, que codifica
Fosfatidilserina a proteína tafazin, que é necessária para a síntese de
cardiolipina. Pacientes com essa doença hereditária
O apresentam cardiomiopatia, miopatia esquelética e mi
O H2COCR1
tocôndrias anormais.
R2 COCH
H2 O

COPOCH2CH2N+(CH3)3 O O
O– O H2COCR1 H2COPOCH2 O
Fosfatidilcolina (lecitina) R2 COH
C O
O– HO C H O– HC OCR3

FIGURA 18.4 Estruturas de alguns fosfolipídeos comuns. H2OP

COCH2 H2COCR4

O
Fosfatidilinositol, um fosfolipídeo acídico que ocor
re em membranas de mamíferos (Figura 18.5), é bas FIGURA 18.6 Estrutura da cardiolipina.
730 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
Os fosfolipídeos mencionados até agora contêm ape
nas resíduos O-acil ligados ao glicerol. Substituintes
O-(1-alquenil) ocorrem em C1 do sn-glicerol de fos
foglicerídeos, em combinação com um resíduo O-acil
esterificado na posição C2; compostos dessa classe
são conhecidos como plasmalogênios (Figura 18.7) ou
plasmenil lipídeos. Quantidades relativamente grandes
de etanolamina plasmalogênio (também chamado plas
meniletanolamina) ocorrem na mielina, com menores
quantidades no músculo cardíaco, onde colina plasma
logênio é abundante. O resíduo de alquenil é geralmen
te 16:0, 18:0 ou 18:1(9).
O H2COCHCH(CH2)15CH3
R2 C O C H O
+
CO
H2OPO– CH2CH2 NH3
FIGURA 18.7 Estrutura do etanolamina plasmalogênio.
Um fosfolipídeo incomum chamado fator ativador
de plaquetas (PAF) (Figura 18.8) é um importante me
diador de hipersensibilidade, de reações inflamatórias
agudas, de respostas alérgicas e do choque anafilático.
Em indivíduos hipersensíveis, células da família dos
leucócitos polimorfonucleares (PMN) (basófilos, neu
trófilos e eosinófilos), macrófagos e monócitos são re
cobertos por moléculas de IgE que são específicas para
um antígeno em particular (por exemplo, pólen de am
brosia americana e veneno de abelha). A subsequente
reexposição ao antígeno e formação de complexos an
tígeno-IgE na superfície das células inflamatórias ante
riormente mencionadas provoca síntese e liberação de
PAF. O fator ativador de plaquetas contém um resíduo
O-alquil em sn-1 e um resíduo acetil, em vez de um áci
do graxo de cadeia longa, na posição 2 do resíduo de gli
cerol. PAF não é armazenado; é sintetizado e liberado
quando as células PMN são estimuladas. A Agregação
plaquetária, alterações cardiovasculares e pulmonares,
edema, hipotensão e quimiotaxia de células PMN são
afetados pelo PAF. A inativação de PAF envolve hidróli
se do resíduo de acetil, seguida por reacilação com um
ácido graxo de cadeia longa, para formar um fosfolipí
deo de membrana tipo-éter.
CH3 O H2CO CH2(CH2)16CH3
C O C H O
H2C O POCH2CH2 N(CH+3)3
O–
FIGURA 18.8 Estrutura do fator ativador de plaquetas
(PAF).
Fosfolipídeos de Membranas
Desempenham uma Variedade de
Funções
Embora presentes em fluidos corpóreos como plas
ma e bile, os fosfolipídeos estão presentes em concen
trações mais altas nas membranas celulares, onde ser
vem como componentes estruturais e funcionais. Quase
metade da massa da membrana do eritrócito é compos
ta por vários fosfolipídeos (p. 476). Eles também ativam
certas enzimas; como exemplo, a β-hidroxibutirato
desidrogenase da membrana mitocondrial interna
(p. 718) tem uma necessidade absoluta de fosfatidilco
lina; fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina não podem
substituí-la. A fosfatidilserina, aparentemente, desem
penha uma função na remoção de eritrócitos (Correla
ção Clínica 18.1). A fosfatidilcolina também desempe
nha um papel central no processo de transporte reverso
de colesterol.
Dipalmitoil-Lecitina É Necessária para a
Função Normal do Pulmão
A função normal do pulmão depende de um supri
mento constante de dipalmitoil-lecitina cuja molécula
contém resíduos de ácido palmítico (16:0) nas posições
sn-1 e sn-2. Mais de 80% dos fosfolipídeos da camada
fluida extracelular que recobre os alvéolos de pulmões
normais são dipalmitoil-lecitina. Esse surfactante, pro
duzido pelas células epiteliais tipo II, impede a atelecta
sia no final da fase de expiração da respiração (Figura
18.9). Ele diminui a tensão superficial da camada fluida
do pulmão. Moléculas de lecitina que não contêm dois
resíduos de ácido palmítico não são efetivas na diminui
ção da tensão superficial. O surfactante também contém
fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, colesterol e proteí
nas de 18 e 36 kDa (chamadas proteínas surfactantes),
que contribuem significativamente para diminuir a
tensão superficial. As proteínas surfactantes alteram a
estrutura molecular do filme de fosfolipídeo secretado
pelos pneumócitos tipo II, de modo a estabilizar o filme
e manter sua flexibilidade. A maior parte do colesterol
do surfactante é derivada de lipoproteínas plasmáticas,
mas os fosfolipídeos são sintetizados pelas células tipo
II. Antes da 28ª semana de gestação, o pulmão fetal sin
tetiza, primariamente, esfingomielina. Normalmente,
nessa época, o glicogênio que foi armazenado nas cé
lulas epiteliais do tipo II é convertido em ácidos graxos
e, depois, em dipalmitoil-lecitina. Durante a maturação
pulmonar, há uma boa correlação entre o aumento dos
corpos de inclusão lamelar, que representam organelas
de armazenamento de fosfatidilcolina chamadas corpos
lamelares, e a diminuição no conteúdo de glicogênio
dessas células. Na 24ª semana de gestação, os pneumó
citos granulares do tipo II aparecem no epitélio alveolar
e começam a produzir corpos lamelares. Seu número
aumenta até a 32ª semana, quando o surfactante apa
rece no pulmão e no líquido amniótico. Nas poucas se
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 731

CORRELAÇÃO CLÍNICA 18.1

Remoção (clearance) de Eritrócitos: Papel da Fosfatidilserina

Os fosfolipídeos da membrana plasmática das célu
las, incluindo os eritrócitos, são distribuídos assimetri
camente: a camada externa, voltada para o espaço ex
tracelular, contém os lipídeos de colina fosfatidilcolina
e esfingomielina, enquanto a camada interna, voltada
para o citoplasma, contém fosfatidiletanolamina e fos
folipídeos carregados negativamente, incluindo fosfati
dilserina. Os macrófagos contêm receptores de fosfati
dilserina que ligam, internalizam e degradam células
que expõem fosfatidilserina. O envelhecimento normal
dos eritrócitos está associado com a exposição de fos
fatidilserina na superfície da membrana plasmática, o
que sinaliza para células do sistema dos macrófagos que
devem removê-las da circulação.
Há evidências de que a anemia e o tempo de vida
abreviado de eritrócitos em certas condições patoló
gicas, tais como intoxicação por chumbo e uremia em
pacientes com insuficiência renal, podem se dever a ex
posição aumentada de fosfatidilserina nos eritrócitos.
Uma enzima chamada semblase transporta fosfatidilse
rina da camada interna da membrana plasmática para
a camada externa. A semblase é inativa em células sa
dias; entretanto, essa enzima sensível ao cálcio é ativa
da quando células são expostas a indutores de estresse
(por exemplo, choque osmótico, depleção de ATP, expo
sição a espécies reativas de oxigênio), que aumentam a
concentração intracelular de cálcio.
Kempe, S. K., Lang, P.A., Eisele, K. et al. Stimulation of
erythrocyte phosphatidylserine exposure by lead ions. Am.
J. Cell Physiol. 288:C396, 2005.

As propriedades de detergente
dos fosfolipídeos, especialmente fos
expiração
inspiração atelectasia fatidilcolina, são importantes na bile
para ajudar na solubilização do coles
terol. Produção e secreção deficientes
de fosfolipídeos na bile podem levar à
formação de cálculos de colesterol e
de pigmentos biliares na vesícula. Os
Alvéolo totalmente expandido Alvéolo parcialmente vazio Alvéolo colabado fosfolipídeos de membrana são um
no final da inspiração no final da expiração por falta surfactante
reservatório de mediadores lipídicos
FIGURA 18.9 Papel do surfactante na prevenção da atelectasia. que regulam muitas vias e processos
metabólicos. Fosfolipases catalisam a
manas antes do termo, testes de screening no líquido liberação desses mediadores. Fosfatidilinositol e fosfa
amniótico podem detectar recém-nascidos com risco tidilcolina são fontes de ácido araquidônico para a sín
de síndrome do desconforto respiratório (RDS) (Cor tese de prostaglandinas, tromboxanes, leucotrienos e
relação Clínica 18.2). Estes são úteis para determinar compostos relacionados.
a hora certa de partos eletivos, para determinar se a
mãe deve receber uma terapia pré-natal, com corticos Inositídeos São Importantes na Função da
teroide, para acelerar a maturação do pulmão fetal, ou Membrana
na aplicação de terapia preventiva ao recém-nascido. A
dexametasona tem sido usada em recém-nascidos com Fosfolipídeos contendo inositol (inositídeos), especi
doença pulmonar crônica (displasia bronco-pulmonar). ficamente fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) (Figu
Embora a terapia com corticoesteroide seja eficiente, ra 18.10), desempenham um papel central nos sistemas
em alguns casos, para melhorar a função pulmonar, em de transdução de sinal. Quando certos hormônios se
outros, causa anomalias periventriculares no cérebro. ligam a seus receptores (p. 528), PIP2 da camada inter
O surfactante exógeno humano, administrado por meio na da membrana plasmática é hidrolisado pela fosfoino
de instilação intratraqueal, é amplamente usado para dispara
sitidase aCliberação
(PIC) em de
i nositol
Ca2+ do
1,4,5-trisfosfato
retículo endoplasmático,
(IP3), que
tratar RDS.
e 1,2-diacilglicerol (DAG), que aumenta a atividade da
Insuficiência respiratória devida à insuficiência de proteína quinase C (PKC) (Figura 18.11). A remoção do
surfactante também ocorre em adultos, cujas células lular de Ca2+
5-fosfato do IPdeclina.
3 abole o Osinal
1,2-diacilglicerol
e a concentração
é convertido
intrace
II
tipo tenham sido destruídas como efeito colateral ad
verso de medicamentos imunossupressores ou de dro em ácido fosfatídico pela diacilglicerol quinase (Figura
gas quimioterápicas (por exemplo, bleomicina). 18.12). Ácido fosfatídico, um produto da ação da fosfoli
732 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

CORRELAÇÃO CLÍNICA 18.2

Síndrome do Desconforto Respiratório

Síndrome do desconforto respiratório (RDS, respi
ratory distress syndrome) é uma importante causa
de morbidade e mortalidade neonatal em muitos pa
íses. É responsável por, aproximadamente, 15–20%
de todas a mortes de recém-nascidos em países oci
dentais, e um pouco menos em países em desenvolvi
mento. A doença afeta apenas bebês prematuros, e a
incidência varia diretamente com o grau de prematu
ridade. Bebês prematuros desenvolvem RDS em virtu
de da imaturidade de seus pulmões, por deficiência do
surfactante pulmonar. A maturidade do pulmão fetal
pode ser avaliada pela razão lecitina/esfingomielina
(L/S) no líquido amniótico. A razão L/S média na gra
videz normal aumenta gradualmente com a gestação,
até cerca de 31 ou 32 semanas, quando o valor sobe
rapidamente. A razão de 2,0 é característica do nas
cimento a termo, e é alcançada com idade gestacional
de 34 semanas. Na maturidade pulmonar, a razão L/S
é 2,0 ou mais. O risco do desenvolver RDS quando a
razão L/S é 1,5–1,9 é aproximadamente 40%, e cerca
de 75% para razão inferior a 1,5. Embora a razão L/S
ainda seja muito usada para prever o risco de RDS, os
resultados não são confiáveis se o líquido amniótico
estiver contaminado com sangue ou mecônio. A deter
minação de palmitoil fosfatidilcolina saturada (SPC),
fosfatidilglicerol e fosfatidilinositol, permite também
prever o risco de RDS. Terapia de reposição usando
surfactante exógeno de pulmão humano e de animal é
eficaz na prevenção e no tratamento de RDS.
Merritt, T. A., Hallman, M., Bloom, B.T. et al. Prophylactic
treatment of very premature infants with human surfactant.
N. Engl. J. Med. 315:785, 1986; e Simon, N.V., Williams, G.
H., Fairbrother, P. F., Elser, R. C. e Perkins, R. P. Prediction
of fetal lung maturity by amniotic fluid fluorescence polari
zation, L/S ratio, and phosphatidylglycerol. Obstet. Gynecol.
57:295, 1981.

O pase D sobre fosfolipídeos, foi implicado como segundo

O H2COCR1
mensageiro.
R2COC H O Essas vias do metabolismo de inositol fosfato fun
H2C O O
P O cionam em: (1) remoção e inativação de IP3, (2) con
– servação de inositol, e (3) síntese de polifosfatos como
H O
OH H inositol pentaquisfosfato (InsP5) e inositol hexaquis
HO
1
6O P O– fosfato (InsP6), cujas funções não foram determinadas.
OH
H23 5 O– IP3 é metabolizado pela 5-fosfomonoesterase em inosi
4 H tol 1,4-bisfosfato, e por uma 3-quinase que forma ino
H O

O P O–
O

O H2COCR1
FIGURA 18.10 Estrutura do COC
R2 H
fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2 ou
PtdIns(4,5)P2). H2C OH
O
H2O Diaciglicerol (DAG)
O H2COCR1
+
R2 CO C H O

O–
H2COPIns4,5P2 –O
O
P
O–

Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato O H O

HO O P O–
HO
OH H O–
H H

H O

O P O–

O–
FIGURA 18.11 Geração de 1,2-diacilglicerol e inositol
1,4,5-trisfosfato pela ação da fosfolipase C sobre fosfatidilinositol Inositol
1,4,5-trisfosfato (IP3)
4,5-bisfosfato.
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 733

Inositol
1,3,4,5-tetraquisfosfato
Biossíntese de
ATP 3-quinase Fosfolipídeos
fosfolipase C
O Ácido Fosfatídico É
Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato Diacilglicerol + Inositol 1,4,5-trisfosfato
Sintetizado a Partir de
Fosfatidilinositol-5 ATP a-Glicerofosfato e Acil
5!-fosfomonoesterase
ATP quinase diacilglicerol Graxo-CoA
quinase
Ácido Ácido 1-α-fosfatídico (comumente
Fosfatidilinositol-4-fosfato fosfatídico Inositol 1,4-bisfosfatochamado ácido fosfatídico) e 1,2-dia
cil-sn-glicerol são intermediários
Fosfatidilinositol-4 inositolpolifosfato
ATP quinase comuns das vias de síntese de fosfo
fosfatase
lipídeos e de triacilgliceróis (Figura
18.13). Todas as células sintetizam
Fosfatidilinositol Inositol 4- fosfato fosfolipídeos em algum grau (exce
to eritrócitos maduros), enquanto a
inositolmonofosfato biossíntese de triacilgliceróis só ocor
fosfatase re no fígado, no tecido adiposo e no
FIGURA 18.12 Vias de síntese e remoção intestino. Na maioria dos tecidos, a
de inositol 1,4,5-trisfosfato e diacilglicerol via de síntese de ácido fosfatídico co
intracelulares. myo-Inositol
meça com α-glicerol 3-fosfato (sn-gli
cerol 3-fosfato). A fonte mais geral de α-glicerol 3-fos
sitol 1,3,4,5-tetraquisfosfato. Uma família de fosfatases fato, particularmente no tecido adiposo, é a redução do
converte Ins(1,4)P2 em mio-inositol (Figura 18.12), que intermediário glicolítico di-hidroxiacetona fosfato, pela
então entra no pool de fosfolipídeos. α-glicerol 3-fosfato desidrogenase.
Além de ser um componente das membra
nas e fonte de ácido araquidônico para sínte H2C
CH2OH
se de prostaglandinas e leucotrienos (p. 762), HO C H Glicerol 3-fosfato
fosfatidilinositol serve para ancorar (âncora de
GPI) certas glicoproteínas à superfície exter OPO32–
na (p. 490). Um importante problema médico O
refere-se a parasitas tripanossomatídeos (por transferase
glicerolfosfato:acil R1C SCoA
exemplo, Trypanosoma brucei, que causa a CoA
doença do sono). Esse parasita tem resistido a
O
abordagens imunológicas para tratamento por
H2C O C R1 α-Lisofosfatidato
mudar seus antígenos de superfície. A super
fície externa da membrana plasmática é reco HO CH (ácido α-lisofosfatídico)

berta com uma proteína chamada glicoproteína CH2OPO32–

variável de superfície (VSG), ligada à membra
O
na por uma âncora de fosfatidilinositol. A fos
folipase tipo C da superfície celular catalisa a 1-acilglicerolfosfato:acil R2C SCoA
transferase CoA
remoção de proteínas ancoradas, permitindo
que o tripanossoma descarte antígenos de su O
perfície, mudando, assim, sua capa e escapando O H2CO C R1
de anticorpos do sistema imune do hospedeiro. R2CO C H Fosfatidato
(ácido fosfatídico)
CH2OPO32–
H2O
acil-CoA:diacilglicerol
aciltransferase P
i
O
OCR
O H2C 1
Diaciglicerol
R2COC H
FIGURA 18.13 Biossíntese de ácido fosfatídico (1,2 diacil-sn-glicerol)
a partir de glicerol 3-fosfato e o papel da CH2OH
ácido fosfatídico fosfatase na síntese de
fosfolipídeos e triacilgliceróis.
R1 e R2 representam ácidos graxos de cadeia longa. Triacilgliceróis Glicerofosfolipídeos
734 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

Di-hidroxiacetona fosfato + NADH + H+  da fosfatidilcolina é formada por metilação repetida da

α-glicerol 3-fosfato + NAD+ fosfatidiletanolamina. A fosfatidiletanolamina N-metil
transferase do ER transfere grupos metil em sequência
O fígado e o rim derivam α-glicerol 3-fosfato por de S-adenosilmetionina (AdoMet) (Figura 18.16).
meio da reação da glicerol quinase:
A síntese de fosfatidiletanolamina no fígado e no cé
Glicerol + ATP Mg+2 α-glicerol 3-fosfato + ADP
rebro envolve a etanolamina fosfotransferase do retícu
lo endoplasmático (Figura 18.17). CDP-etanolamina é
A síntese de ácido fosfatídico começa com a glice formada pela etanolamina quinase
Mg2+
rol 3-fosfato:aciltransferase ligando ácidos graxos pre Etanolamina + ATP fosfoetanolamina + ADP
dominantemente saturados ou ácido oleico ao glicerol
3-fosfato para produzir 1-acilglicerol fosfato ou ácido
e fosfoetanolamina citidililtransferase
α-lisofosfatídico. A 1-acilglicerol fosfato:aciltransferase
então acila a posição sn-2, geralmente com um ácido Fosfoetanolamina + CTP Mg2+
CDP-etanolamina + PPi
graxo insaturado, para produzir ácido fosfatídico (Fi
gura 18.13). Os doadores de grupos acil são derivados As mitocôndrias de fígado também geram fosfatidile
CoA dos ácidos graxos apropriados. tanolamina por descarboxilação de fosfatidilserina, mas
esta é considerada uma via minoritária (Figura 18.18).
A especificidade dessas aciltransferases nem sem
pre corresponde à assimetria dos ácidos graxos nos fos A principal fonte de fosfatidilserina em tecidos de
folipídeos de membrana de uma célula em particular. mamíferos é a troca de bases (Figura 18.19), na qual
Reações de remodelamento, discutidas na próxima seção, o grupo da cabeça polar da fosfatidiletanolamina é tro
modificam a composição em C1 e C2 do esqueleto de
glicerol fosfato. A ácido fosfatídico fosfatase citosólica
hidrolisa o ácido fosfatídico gerado no retículo en HO CH2 CH2 N(CH
+ 3)3 Colina
doplasmático, formando assim 1,2-diacil-sn-glice
rol, que serve como ponto de bifurcação na síntese ATP
de triacilglicerol e de fosfolipídeo (Figura 18.13). colina quinase
ADP
O

Fosfolipídeos São Sintetizados –O P O CH2 CH2 N(CH

+ 3)3 Fosfocolina

por Adição de uma Base ao Ácido O–

fosfocolina CTP
Fosfatídico
citidililtransferase PPi

A principal via de síntese de fosfatidilcolina

O O
envolve a conversão sequencial de colina em fos
focolina, CDP-colina e fosfatidilcolina. Colina li Cytidine POPO O CH2 CH2 +
N(CH3)3 CDP-colina

vre, uma necessidade dietética para a maioria dos O– O–

mamíferos, incluindo o homem, é fosforilada pela
colina quinase (Figura 18.14). A fosfocolina citi Ligação
diltransferase converte fosfocolina em CDP-colina. pirofosforil
O pirofosfato inorgânico (PPi) é um produto dessa
FIGURA 18.14 Biossíntese de CDP-colina a partir de colina.
reação. O resíduo de fosfocolina é então transferido
para C3 do 1,2-diacilglicerol pela colina fosfotrans
ferase (Figura 18.15). Essa é a principal via para O
síntese de dipalmitoil-lecitina no pulmão.
O H2COCR1
1,2-Diacilglicerol
A etapa limitante da velocidade da síntese de R2COCH
fosfatidilcolina é a reação da citidililtransferase H2COH
(ver Figura 18.14). Essa enzima é regulada pelo +
O O
deslocamento entre o citosol e o retículo endoplas
CitidinaOPOPOCH2CH2N+)(3
CH3 CDP-colina
mático. A forma citosólica é inativa; ligação da en
zima à membrana do ER a ativa. O deslocamento da O– O–
citidililtransferase do citosol para o retículo endo CMP
O
plasmático é regulada por cAMP e acil graxo-CoA.
A fosforilação reversível da enzima por uma pro O H2C OCR
1 Fosfatidilcolina
teína quinase cAMP-dependente a libera da mem R2COCH O
+
brana, tornando-a inativa. A desfosforilação leva à H2C OP OCH2CH2N )(CH33
sua ligação novamente à membrana do ER e ela fica O–
ativa. Acil graxo-CoAs promovem sua ligação com
o retículo endoplasmático. No fígado, a maior parte FIGURA 18.15 Reação da colina fosfotransferase.
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 735

O H2C O
C O
FIGURA 18.16
R2COCH O 3 AdoMet R2COC OR Biossíntese de
O R1 O H2C C 1
fosfatidilcolina
Citidina Fosfatidiletanolamina
C O– CH2N
H3+ O C OP
H O–
O OCH2CH2N+)(CH33
O a partir de
H2 OPOCH2H3 3 AdoHcys H2 fosfatidiletanolamina
e S-adenosilmetionina
(AdoMet) e S-adenosil
Fosfatidilcolina homocisteína (AdoHcy).

POPOCH2N
O O + O H2COCR1
R2COC O H2C O C R1
O– CH2 + H2 H C OH
H2PONH
R2CCC H O COO– + H+
+
O– COH COCH2C 3

O– H
CDP-etanolamina 1,2-Diacilglicerol
fosfatidilserina
fosfotransferase
etanolamina CO2 descarboxilase

O O H2C O C R1
O H2C OCR1 R2 O O
R2COCH O H2C O P O CH2CH2 NH+3

H2C OPOCH2N
O– CH2 +H3 + CMP O–

FIGURA 18.18 Formação de fosfatidiletanolamina pela

Fosfatidiletanolamina descarboxilação de fosfatidilserina.
FIGURA 18.17 Biossíntese de fosfatidiletanolamina a partir
de CDP-etanolamina e diacilglicerol.

cado por serina. Como não há alteração no número ou
no tipo de ligações, essa reação é reversível e não re
quer ATP ou qualquer outro composto de alta energia.
O fosfatidilinositol é feito a partir de CDP-diacilglicerol
e mioinositol livre (Figura 18.20) pela fosfatidilinositol
sintase do retículo endoplasmático.
Distribuição Assimétrica de Ácidos
Caso se torne necessário, para uma célula, a remoção
de alguns ácidos graxos indesejados, como o ácido esteá
rico da posição sn-2 da fosfatidilcolina, e a substituição
deste por um mais insaturado, como o ácido araquidôni
co, isso pode ser feito pela ação da fosfolipase A2, seguida
por uma reação de reacilação. A inserção de ácido ara
quidônico na posição 2 da sn-2-lisofosfatidilcolina pode
ser realizada por acilação direta, a partir do araquidonil
-CoA pela araquidonil-CoA transacilase (Figura 18.22),

Graxos em Fosfolipídeos Deve-se a

O CH2
Reações de Remodelamento O H2C O C R1 COO–

A fosfolipase A1 e a fosfolipase A2 ocorrem em R2 C O C H O + HO CH2 C +

NH3
muitos tecidos e funcionam no remodelamento das H2C
Fosfatidiletanolamina
O P O CH2 NH
+ 3 Serina
H
estruturas de fosfolipídeos específicos nas posições
O–
sn-1 e sn-2. A maioria das acil graxo-CoA transfe
rases e das enzimas da síntese de fosfolipídeos não
tem a especificidade necessária para determinar fosfatidilserina
a distribuição dos ácidos graxos encontrada em sintase

muitos fosfolipídeos dos tecidos. Os ácidos graxos O

encontrados nas posições sn-1 e sn-2 dos vários O H2C O C R1
fosfolipídeos, frequentemente, não são os mesmos
COO– + HOCH2
CH2 NH+3
transferidos para o esqueleto de glicerol nas rea R2 C O C H O

ções iniciais das aciltransferases da biossíntese de H2COPOCH2C NH+3

fosfolipídeos. Fosfolipases A1 e A2 catalisam as rea O– H
ções indicadas na Figura 18.21, onde X representa
Fosfatidilserina Etanolamina
o grupo da cabeça polar de um fosfolipídeo. Os fos
folipídeos produzidos são chamados lisofosfatídeos FIGURA 18.19 Biossíntese de fosfatidilserina a partir de serina e
ou lisofosfolipídeos. fosfatidiletanolamina por troca de base.
736 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

O O
O citidina OH C
H2C O C R1 HO OH O H2 O C R1
R2COCH O O + OHOH R2COCH O OH + CMP

OP OH H2CO P
H2C O P O
O– O
OH
O– O– OH OH
OH

CDP-diacilglicerol Inositol Fosfatidilinositol

FIGURA 18.20 Biossíntese de fosfatidilinositol.

2-Acil lisofosfatídeo 1-Acil lisofosfatídeo

O O
O R1H2COH H2O O H2COC R1 H2O H2COCR1 O
R2COCH
H2O O A1
fosfolipase R2 COCH O
H2OPOX fosfolipase
A2 CH O
HO H2O + R2CO–
CPOX CPOX
C

+ O – O–
O – Fosfolipídeo
C O–

FIGURA 18.21 Reações catalisadas pela fosfolipase A1 e pela fosfolipase A2.

ou a partir de outro fosfolipídeo contendo araquidonil, Os lisofosfolipídeos, particularmente sn-1-lisofosfa

por uma troca catalisada pela lisolecitina:lecitina acil
transferase (LLAT) (Figura 18.23). Como não há mu
dança no número nem na natureza das ligações envol
vidas em produtos e reagentes, o ATP não é necessário.
A eeacilação de lisofosfatidilcolina a partir de acil-CoA é
a via principal para remodelamento de fosfatidilcolina.
tidilcolina, também servem como fonte de ácidos gra
xos em reações de remodelamento. Os envolvidos na
síntese de dipalmitoil-lecitina (surfactante) a partir de
1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina são apresentados na
Figura 18.24. Note que sn-1-palmitoil-lisolecitina é a
fonte de ácido palmítico na reação da aciltransferase
de troca.

H2COCR1 Plasmalogênios São Sintetizados a

HOC H O
Partir de Alcoóis Graxos
H2OPOCH2
CCH2N(CH3)3
+

O–
Éter glicerolipídeos são sintetizados a partir de
Lisofosfatidilcolina DHAP, ácidos graxos de cadeia longa e alcoóis graxos
O de cadeia longa, como resumido na Figura 18.25.A acil
R2 CSCoA
di-hidroxiacetona fosfato é formada pela acil-CoA:di
-hidroxiacetona fosfato aciltransferase (enzima 1). A
CoASH ligação éter é introduzida pela alquildi-hidroxiacetona
fosfato sintase (Figura 18.25, enzima 2), por troca do
O grupo 1-O-acil da acildi-hidroxiacetona fosfato por um
O H2C O C R1 álcool graxo de cadeia longa. A sintase ocorre em pero
R2 C O C H O xissomos. A síntese de plasmalogênio é completada pela
H2CO P OCH2CH2N(CH3)3
+ transferência de um ácido graxo de cadeia longa do seu
doador CoA para a posição sn-2 do 1-alquil-2-liso-sn-gli
O–
Fosfatidilcolina cero-3-fosfato (Figura 18.25, Reação 4). Pacientes com
a síndrome de Zellweger não possuem peroxissomos e
FIGURA 18.22 Síntese de fosfatidilcolina por reacilação são incapazes de sintetizar quantidades adequadas de
O plasmalogênio (ver Correlação Clínica 1.7, p. 22).
de lisofosfatidilcolina, onde R2—C— || representa ácido
araquidônico.
Essa reação é catalisada pela acil-CoA:1-acilglicerol-3-fosfoco
lina O-aciltransferase.
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 737

H2CO R1 O
CO O H2COCR1
HOC H O + R2COCH O
+
H2CO P OCH2CH2 N(CH+3)3 H2CO P OCH2CH2NH3

O– O–
Lisofosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina
O O
R2 O H2COC R1 H2CO CR1
COCH O +HOC H O
+
H2CO P O CH2CH2N(CH+3)3 H2CO P OCH2NH
CH2 3

O– O–
Fosfatidilcolina Lisofosfatidiletanolamina

FIGURA 18.23 Formação de fosfatidilcolina por troca de lisolecitina, onde R2—C—

|| representa o ácido araquidônico.

Acilação
Palmitoildireta
CoA Dipalmitoil-lecitina Glicerolfosfocolina
(surfactante)

Via de troca

sn-1-Palmitoil-lisolecitina sn-1-Palmitoil-lisolecitina

ácido oleico fosfolipase A2

H2O FIGURA 18.24 Duas vias para biossíntese de dipalmitoil

sn-1-Palmitoil, sn-2-Oleoil-lecitina lecitina a partir de sn-1 palmitoil-lisolecitina.

C O O
R1C CoA H2OP O–
H2COCR1 R2OH
H2COH
H2 O O CO O 2

COPO– CoA
1 C O– R1CO– H2COR2

R3 CO O
O– H2 O C O–
H2OP O–
DHAP 4

O H2COR2 NADPH + H+
3
R3C O CH O
NADP+
C
H2O P OCH2CH2 N(CH
+ 3)3 R3 CoA

O–
6 CMP Colina plasmalogênio Pi H2COR2

CDP-colina HOCH O

O H2OP
C O–
OC O–
R3COCH
H2COR2
H2OH
C 5 OR2 C
O

CoA
C CH O
H2O
H2C O P O–

O–

FIGURA 18.25Via de biossíntese de colina plasmalogênio a partir de DHAP.

(1) NADPH:alquil-di-hidroxiacetona
(2)
(3)
(4) Acil-CoA:di-hidroxiacetona
Alquil-di-hidroxiacetona
Acil-CoA:1-alquil-2-liso-sn-glicero-3-fosfato
fosfato
fosfato
sintase.
fosfato
aciltransferase.
óxido-redutase.
aciltransferase. (5) 1-alquil-2-acil-sn-glicerol-3-fosfato fosfo-hidrolase.
(6) CDP-colina:1-alquil-2-acil-sn-glicerol colinafosfotransferase.
R2OH é um álcool graxo de cadeia longa.
738 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
18.3 COLESTEROL
Colesterol É Amplamente
Distribuído nas Formas Livre e
Esterificada
O colesterol é um composto alicíclico cuja estrutu
ra inclui (1) o núcleo per-hidrociclopentenofenantreno
com seus quatro anéis fundidos, (2) um único grupo
hidroxila em C3, (3) um centro insaturado entre C5 e
C6, (4) uma cadeia hidrocarbônica ramificada de oito
membros ligada ao anel D em C17, e (5) um grupo metil
(designado por C19) ligado à posição C10, e outro grupo
metil (designado por C18) ligado à posição C13 (Figu
ras 18.26 e 18.27).
12
13
11
1 9
C O colesterol total é medido no laboratório clínico
2 10 14
8
A B
3 5 7 matografia gás-líquida ou por cromatografia líquida de
4 6
FIGURA 18.26 O anel ciclopentenofenantreno.
22
21
20
18 17
19
3 das do cérebro e do sistema nervoso central, mas está
HO
FIGURA 18.27 Estrutura do colesterol (5-colesteno-3ß-ol).
O colesterol tem solubilidade muito baixa em água;
a 25 oC, o limite de solubilidade é aproximadamente
0,2 mg/dL, ou 4,7 μM. A concentração real de coleste
rol no plasma de uma pessoa sadia é, geralmente, 150
a 200 mg/dL. Esse valor é quase duas vezes a concen
tração normal de glicose no sangue. Essa alta concen
tração de colesterol no sangue é possível graças às li
poproteínas plasmáticas (principalmente LDL e VLDL),
que contêm grandes quantidades de colesterol (p. 114).
Apenas cerca de 30% do total de colesterol plasmático
está livre (não-esterificado); o restante é colesteril és
teres, nos quais um ácido graxo de cadeia longa, geral
mente ácido linoleico, é esterificado na hidroxila C3 do
anel A. Esse resíduo de ácido graxo aumenta a hidrofo
bicidade do colesterol (Figura 18.28).
O colesterol, um componente ubíquo e essencial das
membranas celulares de mamíferos, é abundante na
bile (a concentração normal é 390 mg/dL, apenas 4%
do qual é esterificado). O colesterol livre é parcialmente
solubilizado pela propriedade de detergente dos fosfoli
pídeos da bile, que são produzidos no fígado (p. 1089).
Um distúrbio crônico do metabolismo de fosfolipídeos
no fígado pode levar à deposição de cálculos ricos em
colesterol no trato biliar. Os sais biliares, que são me
tabólitos do colesterol, também ajudam a solubilizar o
colesterol. O colesterol da bile protege as membranas da
vesícula biliar dos efeitos potencialmente irritantes ou
lesivos dos sais biliares. O colesterol é também precur
sor da vitamina D (p. 1094).
O
CH3(CH2)14OC
17
FIGURA 18.28Estrutura do colesteril (palmitoil) éster.
16
D
15 pela reação de Liebermann–Burchard. A razão entre o
colesterol livre e o esterificado é determinada por cro
fase reversa de alta pressão (HPLC).
Colesterol é um Componente de
24
Membranas e Precursor de Sais Biliares e
26
25 Hormônios Esteroides
23
27
O colesterol é derivado da dieta ou sintetizado de
novo em todas as células do corpo. É o principal este
rol humano e um componente de todas as membranas.
É especialmente abundante nas estruturas mieliniza
presente em pequenas quantidades na membrana mito
condrial externa (p. 484). Diferentemente do plasma,
em que a maior parte do colesterol está esterificado, o
colesterol das membranas celulares está na forma livre.
A estrutura em anel do colesterol não pode ser metabo
lizada a CO2 e água no homem. A excreção de colesterol
ocorre por meio do fígado e da vesícula biliar para o
intestino, na forma de sais biliares. O colesterol é o pre
cursor imediato dos sais biliares sintetizados no fígado;
eles facilitam a absorção de triacilgliceróis e de vitami
nas lipossolúveis da dieta (p. 1083).
O colesterol é o precursor de vários hormônios este
roides (p. 938), incluindo progesterona, corticosteroi
des (corticosterona, cortisol e cortisona), aldosterona
e os hormônios sexuais estrógeno e testosterona. Em
bora todos os hormônios esteroides sejam estrutural
mente relacionados com, e bioquimicamente derivados
de, colesterol, eles têm propriedades fisiológicas muito
diferentes. O esqueleto hidrocarbônico do colesterol
também ocorre em esteróis de plantas, por exemplo no
ergosterol (Figura 18.29), um precursor da vitamina D,
que é convertido na pele pela irradiação ultravioleta em
vitamina D2 (p. 1094).
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS
21 22
23 26
20
CH3 25
24
CH3
27
CH3
HO
FIGURA 18.29 Estrutura do ergosterol.
Colesterol É Sintetizado a Partir de
Acetil-CoA
Embora a síntese de colesterol ocorra em, virtual
mente, todas as células, a capacidade de síntese é maior
no fígado, no intestino, na córtex adrenal e nos tecidos
reprodutores, incluindo ovários, testículos e placenta.
Todos os átomos de carbono do colesterol são deriva
dos do acetato. O poder redutor na forma de NADPH é
fornecido principalmente pela glicose 6-fosfato desidro
genase e pela 6-fosfogluconato desidrogenase do desvio
das hexoses monofosfato (p. 668). A síntese do coles
terol ocorre no citosol e no retículo endoplasmático e
é direcionada, em grande parte, pela hidrólise de liga
ções tioéster de alta energia do acetil-CoA e de ligações
fosfoanidrido do ATP.
Ácido Mevalônico É um Intermediário
Chave
O primeiro composto exclusivo da síntese de co
lesterol é o ácido mevalônico, derivado de acetil-CoA.
Existem várias fontes de acetil-CoA: (1) β-oxidação de
ácidos graxos (p. 711), (2) oxidação de aminoácidos ce
togênicos, como leucina e isoleucina (p. 801), e (3) a
reação da piruvato desidrogenase. Acetato é convertido
em acetil-CoA às custas de ATP pela acetoquinase ou
acetato tioquinase.
O nio catalítico C-terminal se projetando para o citosol.
ATP + CH3COOJ + CoASH CH3 C SCoA + AMP + PPi
Como na via que produz corpos cetônicos (p. 718),
duas moléculas de acetil-CoA são condensadas em
acetoacetil-CoA pela acetoacetil-CoA tiolase (acetil
-CoA:acetil-CoA acetiltransferase):
O O
CH3 CSCoA + CH3 CSCoA
O O
CH3 CCH2 CSCoA + CoASH
A formação da ligação carbono-carbono do acetoa
cetil-CoA é favorecida energeticamente pela clivagem
de uma ligação tioéster e geração de coenzima A.
• 739
O C SCoA O C SCoA
CH2 O CH2
CO + CH3 C SCoA +H2O HO C CH3 + CoA SH
CH3 CH2
COOH
Acetoacetil CoA Acetil CoA HMG CoA
FIGURA 18.30 Reação da HMG-CoA sintase.
Uma terceira molécula de acetil-CoA é usada para
formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA)
de cadeia ramificada (Figura 18.30) pela HMG-CoA
sintase (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA:acetoacetil
-CoA liase). As células do parênquima hepático con
têm uma forma citosólica da HMG-CoA sintase, que
está envolvida na síntese de colesterol, e uma forma
mitocondrial, que funciona na síntese dos corpos ce
tônicos (p. 718). A enzima catalisa uma condensação
aldólica entre o carbono metil do acetil-CoA e o grupo
β-carbonila do acetoacetil-CoA, com hidrólise da liga
ção tioéster do acetil-CoA. A ligação tioéster original
do acetoacetil-CoA permanece intacta. O HMG-CoA é
também formado a partir da degradação oxidativa do
aminoácido de cadeia ramificada leucina, por meio dos
intermediários 3-metilcrotonil-CoA e 3-metilglutaco
nil-CoA (p. 800).
O ácido mevalônico é formado a partir de HMG
-CoA, pela enzima do retículo endoplasmático HMG
-CoA redutase (mevalonato:NADP+ óxido-redutase),
que tem uma necessidade absoluta de NADPH (Figura
18.31). A redução consome duas moléculas de NADPH,
resulta na hidrólise da ligação tioéster do HMG-CoA,
e gera o grupo álcool primário do mevalonato. Essa
redução é irreversível e produz (R)-(+)mevalonato. A
HMG-CoA redutase catalisa a reação limitante da ve
locidade da biossíntese do colesterol. É uma proteína
intrínseca do retículo endoplasmático, com seu domí
A fosforilação da HMG-CoA redutase diminui sua ati
vidade catalítica (Vmáx) e aumenta sua degradação,
por aumentar sua susceptibilidade a proteólise. Coles
terol intracelular aumentado estimula a fosforilação
da HMG-CoA redutase.
O papel central da HMG-CoA redutase na homeos
tase do colesterol é evidenciado pela eficácia de uma
família de drogas chamadas estatinas, usadas para re
duzir os níveis de colesterol plasmático. As estatinas
(por exemplo, lovastatina, pravastatina, fluvastatina,
cerivastatina, atorvastatina, simvastatina) inibem a ati
vidade da HMG-CoA redutase, particularmente no fíga
do, e comumente diminuem o colesterol total do plasma
e o LDL-colesterol em até 50%.
740 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

O Colesterol É Formado a partir de

C SCoA
CH2 CH2OH
Farnesil Pirofosfato via Esqualeno
CH2

CHO
CH2
COO–
CH3 + 2NADPH + 2H+ HO CCH3
CH2
COO–
HMG CoA Mevalonato
FIGURA 18.31 Reação da HMG-CoA redutase.
Ácido Mevalônico É um Precursor de
Farnesil Pirofosfato
As reações que convertem mevalonato em farnesil
pirofosfato são resumidas na Figura 18.32. A transfe
rência passo a passo do grupo fosfato terminal de duas
moléculas de ATP para o mevalonato (A) para formar
5-pirofosfomevalonato (B) é catalisada pela mevalona
to quinase (enzima I) e pela fosfomevalonato quinase
(enzima II). Descarboxilação de 5-pirofosfomevalona
to pela pirofosfomevalonato descarboxilase gera D3
-isopentenil pirofosfato (D). Nessa reação, são produ
zidos: dependente de ATP, ADP, Pi e CO2. Acredita-se
que descarboxilação-desidratação ocorram por meio
do intermediário 3-fosfomevalonato 5-pirofosfato (C).
O isopentenil pirofosfato é convertido no seu isômero
alílico 3,3-dimetil-alil pirofosfato (E) pela isopentenil
pirofosfato isomerase. A condensação de 3,3-dimetil
-alil pirofosfato (E) e 3-isopentenil pirofosfato (D) pro
duz geranilpirofosfato (F).
A condensação passo a passo de três unidades iso
pentenil C5 para formar farnesil pirofosfato C15 (G) é
catalisada por uma preniltransferase citosólica chama
da geraniltransferase.
+ CoA + 2NADP+ As últimas etapas da biossíntese de colesterol
envolvem a fusão “cabeça-a-cabeça” de duas mo
léculas de farnesil pirofosfato para formar o es
qualeno e, finalmente, a ciclização do esqualeno
para gerar o colesterol. A formação da molécula
C30 do esqualeno (Figura 18.33) pela esqualeno
sintase do retículo endoplasmático libera dois
grupos pirofosfato e requer NADPH. Provavel
mente, ocorrem vários intermediários. Por rotação em
torno de ligações carbono-carbono, a conformação do
esqualeno indicada na Figura 18.34 pode ser obtida.
Note que a forma geral do esqualeno lembra a do co
lesterol e que o esqualeno é desprovido de átomos de
oxigênio.
A síntese de colesterol a partir de esqualeno pela es
qualeno sintase prossegue pelo intermediário lanoste
rol, que contém o sistema tetracíclico de anéis fundidos
e uma cadeia lateral de oito carbonos:
Esqualeno → esqualeno 2,3-epóxido → lanosterol
A enzima do ER que catalisa essa reação é bifun
cional e contém atividade de esqualeno epoxidase ou
monooxigenase e de ciclase (lanosterol ciclase). As
muitas ligações carbono–carbono formadas durante a
ciclização do esqualeno são geradas de maneira coorde
nada, como indica a Figura 18.35. O grupo OH do la
nosterol projeta-se para cima do plano do anel A; isto é,
está na orientação β. Nessa sequência de reações, um
grupo OH é adicionado a C3, dois grupos metil sofrem
deslocamentos, e um próton é eliminado.
A ciclização é iniciada pela formação de epóxido en
tre os futuros C2 e C3 do colesterol, sendo o epóxido
formado às custas de NADPH.

CH2
A B C D

OH CH2OP CH2OPP CH2OPP

CH2
C CH3 ATP enzima ADP CH2
C CH3 ATP ADP CH2
C CH3 ATP ADP CH2 CH3 CO2 + Pi CH2OPP

I C
CH2 C CH3
CH2
COO–
CH2 OH CH2 OH
COO– enzima
II CH2 OH
COO– O OP

O– CH2

OPP
CH2

CHCH3 D PPi CH3 D PPi CH3 CH3

CH3 CCHCH2 CH2CCHCH2OPP CH3 CH2 CH2C CH2CCHCH2OPP
CH3
CE F CCH CHCH2
G

FIGURA 18.32 Formação de farnesil-PP (F) a partir de mevalonato (A).

As linhas tracejadas dividem as moléculas nas unidades derivadas de isoprenoide. D é 3-isopentenil pirofosfato.
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 741

O O

O P O P OH
Farnesil pirofosfato
O– O–
+
O O

HO O–
P O P O

O–

Farnesil pirofosfato

NADPH, H+

2PPi + NADP+

FIGURA 18.33 Formação

de esqualeno a partir
de duas moléculas de
Esqualeno farnesil pirofosfato.

Esqualeno + O2 + NADPH + H+ → na de densidade intermediária (IDL), lipoproteína de

→ esqualeno 2,3-epóxido + H2O + NADP+ densidade muito baixa (VLDL) e quilomícrons. Suas
características físicas são apresentadas na Tabela 3.13,
A hidroxilação de C3 desencadeia a ciclização do es p. 112, e sua composição em lipídeos na Tabela 3.15, p.
qualeno em lanosterol (Figura 18.35). 115. Todas contêm fosfolipídeos e uma ou mais proteí
nas chamadas
comuns (Tabelaapoproteínas;
18.1). existem 10 apoproteínas
A transformação de lanosterol em colesterol envolve
muitas etapas pouco conhecidas e várias enzimas. Essas
reações incluem (1) remoção do grupo metil de C14, (2) CH3
remoção de dois grupos metil em C4, (3) migração da CH3
dupla ligação de C8 para C5, e (4) redução da dupla li
gação entre C24 e C25 da cadeia lateral (Figura 18.36).
CH3
CH3
CH3
CH3
H+
O
CH3 CH3

Esqualeno 2,3-epóxido

ciclase

FIGURA 18.34 Estrutura do esqualeno (C30).

CH3
CH3

Lipoproteínas Plasmáticas CH3

O sangue contém triacilgliceróis, colesterol e co CH3

CH3 14
lesteril-ésteres em concentrações que excedem muito CH3
suas solubilidades em água. Os lipídeos do sangue são
mantidos em solução, ou pelo menos em dispersão, pela
incorporação em estruturas macromoleculares chama HO CH3 H
das lipoproteínas. As lipoproteínas plasmáticas facili CH3
tam o metabolismo de lipídeos e transferem os lipídeos
Lanosterol
entre os tecidos. Existem cinco classes principais de
lipoproteínas: lipoproteína de alta densidade (HDL), FIGURA 18.35 Conversão de esqualeno 2,3-epóxido em
lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteí lanosterol.
742 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

NADH
O2
R NADPH R NADPH
O2 HO CH3 R

CH3
HCOOH

HO H3C CH3 HO CH3 CH3 COOH

HO Lanosterol CO2 NAD+

R NAD
O2+ R NADPH
R
CO2
NADPH

HO O
CH3 CH3
Zimosterol

R NADPH
O2 R′ NADPH R′

HO HO HO

7-Desidrocolesterol Colesterol

FIGURA
em colesterol.
18.36 Conversão de lanosterol R R′

TABELA 18.1 Apoproteínas de Lipoproteínas Plasmáticas Humanas

Apolipoproteína Peso Molecular Concentração Plasmática (g L–1) Distribuição em Lipoproteínas
ApoA-I 28.000 1,0–1,2 Quilomícrons, HDL
ApoA-II 17.000 0,3–0,5 Quilomícrons, HDL
ApoA-IV 46.000 0,15–0,16 Quilomícrons, HDL
ApoB-48 264.000 0,03–0,05 Quilomícrons
ApoB-100 512.000 0,7–1,0 VLDL, IDL, LDL
ApoC-I 7.000 0,04–0,06 Quilomícrons, VLDL, HDL
ApoC-II 9.000 0,03–0,05 Quilomícrons, VLDL, HDL
ApoC-III 9.000 0,12–0,14 Quilomícrons, VLDL, HDL
ApoD 33.000 0,06–0,07 HDL
ApoE 38.000 0,03–0,05 Quilomícrons, VLDL, IDL, HDL
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 743

ApoA-I Célula periférical (não-hepática)

Hepatócito

HDL HDL ApoA-I

ApoB-100 LDL

ApoC-II ApoE ApoC-II HDL LDL Aminoácidos,

ApoA-I Colesterol e colesterol,
VLDL ApoB-100
colesteril-ésteres FA, glicerol
ApoE ApoB-100
VLDL
Glicose FA TG
ApoE ApoC-II
Glicerol ApoB-100 Fosfolipídeos ApoB-100
LpL
VLDL ApoE ApoC-II Macrófago
Glicerol
Aminoácidos, colesterol, LDL
LpL
FA, glicerol Glicerol IDL LDL
Aminoácidos,
ApoB-100 ApoE ApoC-II
colesterol,
pH~5.0 Glicerol
ApoB-100 FA, glicerol
+
LDL (rece FA
pto
CR res
re
cic
la Apo-48 Célula
Endolisossomos m muscular
)
LDL
CR Quilomícrons FA
remanescentes (CR)
Lisossomos CR Acetil CoA
ApoE ApoC-II
Endossomos
CO2 + H2O
LDL
LpL

Apo-48

Quilomícrons
LDL(or IDL)
ApoE ApoC-II ApoA-I
Adipócito
Intestino FA
HDL +
glicerol
HDLApoEApoC-II TG
Enterócito Apo-48
ApoA-I Glicose
MG + FA Quilomícrons

ApoB-48

TG
MG + FA

Lipase pancreática
TG

Gordura da dieta
(TG)

FIGURA 18.37 Órgãos e vias envolvidos no metabolismo de lipoproteínas plasmáticas.

FA, ácido graxo; TG, triacilglicerol (triglicéride); HDL, lipopro teína de densidade muito baixa; LpL, lipoproteína lipase; apo-,
teína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; apoproteína.
IDL, lipoproteína de densidade intermediária; VLDL, lipopro

As lipoproteínas são partículas esféricas, com os
lipídeos mais hidrofóbicos, como colesteril-ésteres e
triacilgliceróis, localizam-se no centro, sequestrados
para longe da água, enquanto colesterol livre (não-es
terificado), fosfolipídeos e proteínas ficam organizados
na superfície (ver Figura 3.47, p. 114). Os fosfolipídeos
anfipáticos e as proteínas mantêm os lipídeos, muito in
solúveis, em solução. As apoproteínas da superfície das
partículas também funcionam como ligantes para re
ceptores celulares e cofatores para enzimas envolvidas
no metabolismo de lipoproteínas.
As lipoproteínas são os veículos pelos quais o co
lesterol e seus ésteres e triacilgliceróis são transpor
tados pelo corpo. Por exemplo, uma função da LDL é
entregar colesterol para os tecidos periféricos que re
querem colesterol para a formação de membranas ou
a síntese de hormônios esteroides. O colesterol trans
portado para o fígado dos tecidos periféricos e o co
lesterol em quilomícrons regulam a síntese hepática
de colesterol (Figura 18.37). Diferentemente, a HDL,
que é rica em colesterol, mas pobre em triacilglicerol,
carrega colesterol da periferia para o fígado, onde é
744 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
excretado na bile como colesterol ou após conversão
em sais biliares. O VLDL e os quilomícrons transpor
tam triacilgliceróis para serem usados para obtenção
de energia (por exemplo, músculo) ou armazenados
(por exemplo, células adiposas).
As lipoproteínas plasmáticas são substratos para
várias enzimas do sangue. A lipoproteína lipase é liga
da à superfície luminal do endotélio vascular por liga
ção com proteoglicanos de heparam sulfato e hidrolisa
triacilgliceróis de VLDL e quilomícrons. É ativada pela
apolipoproteína C-II (apoC-II) e pela heparina libera
da de mastócitos e de células do sistema macrófago/
retículo-endotelial. Os ácidos graxos liberados pela
lipoproteína lipase podem ser, depois, captados pelas
células e oxidados por β-oxidação, incorporados em
fosfolipídeos para organização de membranas ou, em
adipócitos, armazenados como triacilgliceróis. Esses
ácidos graxos são incorporados na gordura do leite,
na glândula mamária. A hidrólise de triacilgliceróis
também resulta na liberação de fosfolipídeos, coles
terol livre e apolipoproteínas intercambiáveis na capa
de superfície e sua transferência para outras lipopro
teínas circulantes, especialmente HDL. À medida que
os quilomícrons perdem seu núcleo de triacilglicerol,
tornam-se os quilomícrons remanescentes, menores,
que são ricos em colesteril-ésteres, ligam-se a recep
tores específicos nas membranas hepáticas e são cata
bolizados no fígado, após endocitose (Figura 18.37). É
claro que as lipoproteínas são dinâmicas em estrutura
e composição.
Os principais locais de síntese das apoproteínas
componentes são o fígado e o intestino delgado. Por
exemplo, a apoB-48 é produzida no intestino, enquanto
a apoB-100 é sintetizada principalmente em hepatóci
tos. A apoB-48 tem 48% do comprimento da apoB-100 e
é formada a partir da mesma mensagem que a apoB-100.
Um códon de terminação (stop condon) introduzido no
mRNA da apoB do intestino termina a tradução em 48%
do caminho ao longo da molécula de mRNA. A apoB-48
é sintetizada durante o curso da digestão de gordura e é
usada na produção de quilomícrons. A apoB-100 é usa
da na produção de VLDL. Os ácidos graxos dos triacil
gliceróis de partículas de VLDL recém-produzidas são
sintetizados a partir de açúcares, glicose em particular,
depois de terem sido oxidados a acetil-CoA, ou do ace
tato derivado da oxidação de etanol. A VLDL adquire
colesteril-ésteres recém-sintetizados no fígado, bem
como de outras lipoproteínas, durante seu transporte
na circulação. Na circulação, a transferência de coleste
ril-éster e triglicérides entre HDL e VLDL e LDL é faci
litada pela proteína de transferência de colesteril-éster
(CETP). A CETP fica associada com HDL no plasma. A
CETP é sintetizada e secretada por hepatócitos e adipó
citos, e sua expressão é estimulada pela hipercolestero
lemia induzida pela dieta. A lipoproteína lipase (LpL)
converte VLDL em lipoproteína de densidade interme
diária (IDL) e, depois, à medida que mais triacilglicerol
é sujeito à lipólise, em LDL (Figura 18.37).
A HDL é sintetizada principalmente no fígado e, em
menor escala, no intestino, e tem a função singular de
ser um reservatório de apoE e apoC-II, que são ativa
dores da lipoproteína lipase. É secretada como apopro
teína A-1 sem fosfolipídeos ou triacilglicerol. A HDL
regula a troca de apoproteínas e de lipídeos entre vá
rias lipoproteínas no sangue. Partículas de HDL doam
apoE e apoC-II para quilomícrons e VLDL. Uma vez que
os triacilgliceróis dos quilomícrons e de VLDL tenham
sido extensamente hidrolisados e essas lipoproteínas
tenham sido transformadas em LDL e quilomícrons re
manescentes, respectivamente, as apoE e apoC-II retor
nam a HDL (Figura 18.37).
HDL também participa da remoção do excesso de
colesterol de células e seu transporte para o fígado para
eliminação como colesterol e sais biliares. Esse fenô
meno é chamado transporte reverso de colesterol (Fi
gura 18.38). É o colesterol livre (não-esterificado) que
troca facilmente entre lipoproteínas e a membrana plas
mática de células. A transferência de colesterollivre da
membrana plasmática para apoA-I ou uma espécie de
HDL pobre em lipídeos para produzir o que é chamado
pré-β HDL ou HDL nascente é mediada por um trans
portador de membrana chamado transportador cas
sete de ligação a ATP (ABCA-1). O ABCA-1 também
transfere fosfolipídeos, juntamente com o colesterolli
vre, da membrana para o HDL nascente, para produzir
HDL3. Ausência do transportador ABCA-1 resulta na
deficiência de HDL chamada doença de Tangier. Mais
adição de colesterol esterificado a HDL3 produz HDL2.
O colesterol é esterificado pela lecitina:colesterol
aciltransferase (LCAT) associada com HDL. Essa rea
ção livremente reversível (Figura 18.39) transfere o ácido
graxo da posição sn-2 de fosfatidilcolina para a 3-hidro
xila do colesterol. A LCAT é produzida principalmen
te pelo fígado, ligada à HDL do plasma, e ativada pelo
componente apoA-I da HDL. O colesteril-éster gerado
na reação da LCAT é transferido para VLDL e HDL pela
CETP, associada com a partícula de HDL, e é eventual
mente captado pelo fígado.
A proteína de transferência de fosfolipídeo (PLTP)
catalisa a transferência de lipídeos, particularmente
fosfolipídeos, entre as lipoproteínas. À medida que a
hidrólise de triacilglicerol catalisada pela LpL ocorre,
VLDL e quilomícrons ficam ambos menores; PLTP re
move o excesso de fosfolipídeos da superfície dessas
partículas e os transfere para HDL. Isso fornece subs
tratos para a reação da LCAT no transporte reverso de
colesterol.
A degradação de HDL ocorre no fígado após a cap
tação seletiva de colesteril-ésteres, mediada por uma
proteína de membrana plasmática chamada receptor
scavenger-BI (receptor “lixeiro” SR-BI). SR-BI é um re
ceptor multiligante, que liga não só HDL, mas também
VLDL e HDL. A captação e a degradação de HDL pelo
fígado envolve a lipase hepática da superfície celular,
que hidrolisa os triglicérides das partículas de HDL. A
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 745

Tecido periférico

Membrana plasmática
PL BCA1
FC
A liso-PC Tecidos
FC CE
PC
Pré-β HDL
HDL 3 LCAT
(HDL nascente) LCAT CE FC
ApoA-1
PC

VLDL liso-PC
Acetil CoA CE
CE CETP
SR-BI CE
β-oxidação FFA
ApoA-1 LpL
IDL HDL 2
FFA PL
CE
PLTP

Fígado FFA
HL LPL
CE FA
LDL
HDL 2

CE

FIGURA 18.38 Transporte reverso de colesterol mostrando as proteínas e as enzimas envolvidas.

PL, fosfolipídeo; FC, colesterol livre; ABCA1, cassete de ligação A-1; FFA, ácido graxo livre; SR-BI, receptor scavenger classe
a ATP 1; VLDL, lipoproteína de densidade muito baixa; HDL, B tipo I; TG, triacilglicerol; HL, lipase hepática. FA, ácido graxo;
lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa den TG, triacilglicerol (triglicéride); HDL, lipoproteína de alta den
sidade; IDL, lipoproteína de densidade intermediária; PC, fosfa sidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; IDL, lipoproteína
tidilcolina; lyso-PC, lisofosfatidilcolina; LCAT, lecitina colesterol de densidade intermediária; VLDL, lipoproteína de densidade
aciltransferase; CE, colesteril-éster; CETP, proteína de transfe muito baixa; LpL, lipoproteína lipase; apo-, apoproteína; Y, re
rência de éster de colesterol; PLTP, proteína de transferência de ceptor de LDL. Quilomícrons contêm B-48, VLDL e LDL contêm
fosfolipídeo; LpL, lipoproteína lipase; apoA-1, apolipoproteína B-100.

apoA1 da degradação de HDL é reciclada para nova for Síntese do Colesterol É

mação de HDL. Existe uma relação inversa entre a con
centração plasmática de HDL e a incidência de doença
arterial coronária, e existe uma relação positiva entre
os níveis de colesterol plasmático e doença coronária.
Células de fígado metabolizam quilomícrons rema
nescentes por um mecanismo semelhante; entretanto,
macrófagos e muitas outras células têm receptores es
pecíficos que reconhecem quilomícrons remanescentes
e os internalizam. Esses receptores reconhecem a apoE
dos quilomícrons remanescentes. Parte do LDL é cap
tado por receptores scavengers inespecíficos de certas
células, macrófagos em particular.
Cuidadosamente Regulada
Colesterol plasmático elevado predispõe à doença
vascular aterosclerótica. Em indivíduos sadios, os ní
veis de colesterol plasmático são mantidos numa faixa
de concentração relativamente estreita, principalmente
pelo fígado, que (1) expressa a maior parte dos recep
tores de LDL do corpo, (2) é o principal local de con
versão de colesterol em sais biliares, e (3) tem os mais
altos níveis de atividade de HMG-CoA redutase. O total
de colesterol do corpo é derivado do colesterol da dieta
e da síntese de colesterol, primariamente no fígado e
no intestino. A síntese de colesterol aumenta no fígado
e no intestino quando a ingestão de colesterol na dieta
diminui. Esse colesterol é depois transportado do fíga
do e do intestino para os tecidos periféricos por VLDLs
e quilomícrons, respectivamente.

Colesterol Fosfatidilcolina
CH Colesteril-éster Lisofosfatidilcolina

O
O
O H2COC R1
O H2COC R1
OR C R2 + HO C H O
R +OH R2 OC O +
H2C OP OCH2CH2N (CH3)3
+
OP
COCH2N)3
H2CH2 (CH3
O–
O–

FIGURA 18.39 Reação da lecitina:colesterol aciltransferase (LCAT).

R-OH = colesterol.
746 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE
A etapa de comprometimento e a reação limitante
da velocidade da síntese de colesterol (Figura 18.40) é
a da HMG-CoA redutase, que catalisa a etapa que pro
duz ácido mevalônico. O colesterol exerce inibição por
retroalimentação (feedback) sobre a HMG-CoA reduta
se e promove a degradação da enzima por mecanismos
que ainda não foram elucidados.
Em um adulto normal saudável em dieta de baixo
colesterol, cerca de 1.300 mg de colesterol são apre
sentados ao fígado a cada dia, para eliminação. Esse
colesterol vem da dieta e dos tecidos periféricos, e é
eliminado por (1) excreção na bile de cerca de 250 mg
de sais biliares e cerca de 550 mg de colesterol, (2) ar
mazenamento de colesteril-ésteres, e (3) incorporação
em VLDL e secreção na circulação. No mesmo adulto, o
fígado sintetiza cerca de 800 mg de colesterol por dia,
para repor sais biliares e colesterol.
A LDL é responsável pela entrega e transporte de
colesterol nos tecidos periféricos que requerem coles
terol para síntese e manutenção de suas membranas ou
para células especializadas para síntese de hormônios
esteroides. A remoção de LDL da circulação envolve
receptores de LDL na superfície dos hepatócitos e de
células da periferia.
Cerca de 75% do catabolismo de LDL ocorre no fí
gado via um processo mediado pelo receptor de LDL. A
ligação de LDL aos hepatócitos e às células da periferia
é caracterizada por saturação, alta afinidade e alto grau
de especificidade. O receptorreconhece a apolipoproteína
E (apoE) e a apolipoproteína B-100 (apoB-100) em LDL
e VLDL. A ligação ocorre na membrana plasmática, em
depressões encapadas com clatrina, e leva a complexos
ligante-receptor internalizados em vesículas encapadas
por clatrina. Isso é chamado endocitose mediada por
NAD
2
+
2H
+ A correlação entre altos níveis plas
PH
NAD
2
HMG-CoA
Acetil CoA acetoacetil CoA HMG CoA
acetil CoA
FIGURA 18.40 Sumário da síntese de colesterol, indicando a inibição por
feedback da HMG-CoA redutase por colesterol.
receptor. Intracelularmente, as vesículas perdem sua
clatrina e se tornam endossomos que se fundem com
lisossomos, os quais contêm proteases e colesteril este
rase. Nesse ambiente relativamente ácido (pH aproxi
madamente 5,0), o receptor se separa da LDL e retorna
para a superfície celular, enquanto os colesteril-ésteres
são hidrolisados pela colesteril esterase a colesterol e
um ácido graxo de cadeia longa, e a proteína é degrada
da a aminoácidos que passam a fazer parte do pool de
aminoácidos da célula. O colesterol livre difunde para
o citosol, onde inibe a HMG-CoA redutase e suprime
a síntese da enzima. Ao mesmo tempo, a acil graxo
-CoA:colesterol aciltransferase (ACAT) do retículo
endoplasmático é ativada pelo colesterol, promovendo
a formação de colesteril-ésteres, principalmente coles
teril oleato.
Colesterol + oleil-CoA → colesteril-oleato + CoA
O acúmulo intracelular de colesterolinibe a síntese
e a reposição de receptores de LDL por inibição (do
wn-regulation) de sua expressão, bloqueando assim
maior captação e acúmulo de colesterol e aumentando
a concentração de colesterol plasmático. O mecanis
mo de regulação pelo colesterol da HMG-CoA redutase
envolve um fator de transcrição, chamado proteína de
ligação ao elemento regulatório de esterol (sterol re
gulatory element binding protein, SREBP), e duas
outras proteínas chamadas COPII e InSig. Grande parte
do LDL-colesterolinternalizado pelos hepatócitos é me
tabolizado a ácidos biliares e secretado na bile ou libe
rado diretamente como colesterol na bile.
O receptor de LDL é uma glicoproteína de cadeia
única; numerosas mutações em seu gene estão associa
das com a hipercolesterolemia familiar. O receptor atra
vessa a membrana plasmática uma vez, com a extremi
dade carboxila na face citoplasmática
e a extremidade amino, que liga apoB
P
+ 100 e apoE-100, estendendo-se para o
espaço extracelular.
Ácido mevalônico + CoA
máticos de colesterol, particularmente
LDL colesterol, e ataques cardíacos e
redutase acidentes vasculares cerebrais levou ao
desenvolvimento de abordagens dietéti
cas e terapêuticas para baixar o coleste
rol do sangue (Correlação Clínica 18.3).
Pacientes com hipercolesterolemia fami
–
liar (genética) sofrem de aterosclerose
acelerada (Correlação Clínica 18.4). Na
maioria dos casos, chamados receptor
-negativos, há falta de receptores de LDL
funcionais porque os alelos mutantes
Colesterol produzem pouca ou nenhuma proteína
do receptor de LDL. Em outros casos,
Inibição por feedback
o receptor é sintetizado e transportado
normalmente para a superfície celular,
mas uma substituição de um aminoáci
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS
CORRELAÇÃO CLÍNICA 18.3
Tratamento da Hipercolesterolomia
Muitas autoridades recomendam a dosagem de co
lesterol plasmático em indivíduos assintomáticos, por
medida do colesterol plasmático. Um nível inferior a
200 mg% é considerado desejável; acima de 240 mg%,
requer análise de lipoproteínas, especialmente deter
minação de LDL-colesterol. A redução de LDL-coleste
rol depende da restrição de colesterol na dieta a menos
de 300 mg/dia, de calorias para atingir o peso corporal
ideal, e da ingestão de gordura total para menos do que
30% do total de calorias. Aproximadamente, dois ter
ços da gordura deveria ser mono- ou poli-insaturada. A
do ou outra alteração na estrutura primária da proteína
afeta negativamente a ligação de LDL. Como resultado,
há pouca ou nenhuma ligação de LDL à célula, a sínte
se de colesterol não é inibida e o nível de colesterol no
sangue aumenta. Alguns pacientes deficientes em LDL
sintetizam o receptor de LDL, mas têm um defeito no
mecanismo de transporte que leva a glicoproteína para
a membrana plasmática. Outro grupo tem receptores de
LDL que têm um defeito na extremidade citoplasmática
carboxi-terminal e são incapazes de internalizar o com
plexo LDL-receptor de LDL.
Em tecidos especializados, tais como córtex adrenal
e ovários, o colesterol derivado de LDL é o precursor
de hormônios esteroides, como cortisol e estradiol, res
pectivamente. No fígado, o colesterol extraído de LDL
e HDL é convertido em sais biliares, que funcionam na
digestão intestinal de gordura.
CORRELAÇÃO CLÍNICA 18.4
Aterosclerose
Aterosclerose é a principal causa de morte em paí
ses ocidentais industrializados. O risco de desenvolvê-la
está diretamente relacionado com o LDL-colesterol plas
mático e inversamente relacionado com o nível de HDL
-colesterol. Isso explica porque o primeiro é frequente
mente chamado colesterol “ruim”, e o último colesterol
“bom”, embora quimicamente não exista diferença. Na
aterosclerose, a parede arterial contém colesteril-és
teres acumulados em células derivadas da linhagem
monócito-macrófago, há também proliferação de células
musculares lisas e fibrose. A anomalia mais precoce é a
migração de monócitos do sangue para o subendotélio
da artéria. Essas células então se diferenciam em macró
fagos e acumulam colesteril-ésteres derivados da LDL
plasmática. Parte da LDL pode ser captada por vias que
não requerem receptor de LDL. Por exemplo, existem re
• 747
segunda linha de terapia é com drogas. Colestiramina e
colestipol são drogas ligantes de sais biliares que pro
movem sua excreção, aumentando a síntese hepática de
sais biliares e a captação de LDL pelo fígado. A lovas
tatina inibe a HMG-CoA redutase, diminui a síntese en
dógena de colesterol e estimula a captação de LDL pelo
receptor de LDL. A combinação de lovastatina e colesti
ramina, às vezes, é usada na hiperlipidemia severa.
Expert Panel. Evaluation and treatment of high blood cho
lesterolin adults. Arch. Intern. Med. 148:36, 1988.
Colesterol É Excretado
Primariamente como Ácidos Biliares
Os ácidos biliares são os produtos do metabolismo
de colesterol. Os ácidos biliares primários são sintetiza
dos nos hepatócitos, a partir de colesterol. Os ácidos bi
liares são derivados de ácido colânico (Figura 18.41). O
ácido cólico e o ácido quenodesoxicólico (Figura 18.42)
são compostos C24 contendo três e dois grupos OH, res
pectivamente, e uma cadeia lateral C-5 que termina em
um grupo carboxila, que está ionizado em pH 7,0 (daí o
nome sal biliar). O grupo carboxila é frequentemente
conjugado, por uma ligação amida, com glicina (NH2
-CH2-COOH) (Figura 18.43) ou taurina (NH2-CH2-CH2
-SO3H), para formar ácido glicocólico ou taurocólico,
respectivamente.
ceptores que captam LDL acetilada ou LDL complexada
com dextran sulfato; entretanto, essa via não é regulada
pelo conteúdo celular de colesterol. A distorção do su
bendotélio leva à agregação plaquetária na superfície do
endotélio e liberação de mitógenos derivados de plaque
tas, como o fator de crescimento derivado de plaquetas
(platelet derived growth factor, PDGF), que estimula
o crescimento de células musculares lisas. A morte das
células esponjosas leva à deposição do lipídeo celular e
fibrose. A placa aterosclerótica resultante estreita o vaso
sanguíneo e leva à formação de trombo, o que precipita o
infarto do miocárdio (ataque cardíaco).
Wick, G, Knoflach, M. e Xu, Q. B. Autoimmune and inflam
matory mechanisms in atherosclerosis. Annu. Rev. Immu
nol. 22:361, 2004.
748 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

21 Os ácidos biliares e fosfolipídeos solubilizam coleste

H3C 22
23 rol na bile, impedindo assim que o colesterol se precipite
20 na vesícula biliar. No intestino, os ácidos biliares atuam
18
CH3
12 17
COOH como agentes emulsificadores para os triacilgliceróis
24
11 13 16 da dieta, facilitando sua hidrólise pela lipase pancreá
19
CH2 14 15 tica. Os ácidos biliares desempenham um papel direto
1 9
2 10 8
na ativação da lipase pancreática (p. 1076) e facilitam
3 5 7
a absorção de vitaminas lipossolúveis, particularmente
4 6 vitamina D (p. 1094), do intestino.
H

FIGURA 18.41 Estrutura do ácido colânico.

H3C

OH
Microrganismos do intestino modificam os ácidos CH3 O C NCOOH
CH2
graxos primários em ácidos graxos secundários. Os
H
ácidos desoxicólico e litocólico são derivados dos áci CH3
dos cólico e quenodesoxicólico, respectivamente, pela
remoção de um grupo OH (ver Figura 18.42). A trans
formação de colesterol em ácidos biliares requer (1) HO H OH

epimerização do grupo 3β-OH, (2) redução da dupla

ligação C5, (3) introdução de grupos OH em C7 (ácido FIGURA 18.43 Estrutura do ácido glicocólico, um ácido
quenodesoxicólico) ou em C7 e C12 (ácido cólico), e biliar conjugado.
(4) conversão da cadeia lateral C27 em um ácido carbo
xílico C24 por eliminação de um equivalente de propil.
Os ácidos biliares são secretados na bile, armazena 18.4 ESFINGOLIPÍDEOS
dos na vesícula biliar, e depois secretados no intestino
delgado. A produção hepática de ácidos biliares é in Síntese de Esfingosina
suficiente para atender às necessidades fisiológicas, de
modo que o corpo depende de uma circulação êntero Esfingolipídeos são lipídeos complexos cuja estrutu
-hepática, que carrega os ácidos biliares do intestino de ra central é fornecida pelo aminoálcool de cadeia longa
volta para o fígado, várias vezes ao dia. esfingosina (Figura 18.44) (4-esfingenina ou trans-1,3
-di-hidroxi-2-amino-4-octadeceno).
A esfingosina tem dois átomos de
HOH
3C
HO H3C carbono assimétricos (C2 e C3); dos
OH OH quatro isômeros ópticos possíveis, a
H CH3 COOH CH3 esfingosina de ocorrência natural é a
COOH
forma D-eritro. A dupla ligação tem
CH3 a configuração trans. O grupo álcool
HO CH3
primário em C1 é um centro nucleofí
lico que é ligado com açúcares nos gli
coesfingolipídeos. O amino grupo em
H C2 sempre carrega um ácido graxo de
cadeia longa (geralmente C20-C26) em
Ácido cólico Ácido desoxicólico
ligação amida nas ceramidas. O álcool
secundário em C3 está sempre livre.
Note a similaridade estrutural dessa
CH3 parte da molécula de esfingosina com
H3C
o resíduo de glicerol dos acilgliceróis
CH3 COOH (Figura 18.44).
CH3
COOH
Os esfingolipídeos ocorrem no san
HO CH3
H OH HO CH3 gue e nas membranas plasmáticas de
quase todas as células. As concentra
ções mais altas são encontradas na mas
H
sabranca do sistema nervoso central.

A esfingosina é sintetizada por

Ácido quenodesoxicólico Ácido litocólico
meio da esfinganina (di-hidroesfingo
FIGURA 18.42 Estruturas de alguns ácidos biliares comuns. sina), a partir de serina e palmitoil
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 749

-CoA. A serina fornece C1, C2 e o amino-grupo da esfin
gosina, e o ácido palmítico fornece os demais átomos de
carbono. A condensação de serina e palmitoil-CoA é ca
talisada pela serina palmitoiltransferase, uma enzima
dependente de piridoxal fosfato. A força que direciona
a reação é fornecida pela clivagem da ligação reativa
tioéster de alta energia do palmitoil-CoA e pela libera
ção de CO2 da serina (Figura 18.45). Redução do grupo
carbonila da 3-ceto-di-hidroesfingosina pela 3-cetoes
finganina redutase, para produzir esfinganina (Figura
18.46), ocorre às custas de NADPH. Inserção da dupla
ligação na esfinganina produz esfingosina.
HH
CHC CH2OH
OH
Glicerol
OH
H HH
CH3)(CH212CCC3C2 C1H2OH
H OH NH2
Esfingosina
FIGURA 18.44 Comparação das estruturas de glicerol e
esfingosina (trans-1,3,di-hidroxi-2-amino-4-octadeceno).
Ceramidas São Amidas de Ácidos
Graxos Derivadas de Esfingosina
A esfingosina é o precursora da ceramida, uma amida
derivada de ácido graxo de cadeia longa da esfingosina,
que constitui a estrutura central dos esfingolipídeos. O
ácido graxo é ligado ao grupo 2-amino da esfingosina por
uma ligação amida (Figura 18.47). Mais frequentemente,
o grupo acil é ácido beênico, um ácido graxo saturado
de 22 carbonos, mas outros grupos acil de cadeia longa
podem ser usados. Os dois domínios hidrocarbônicos de
cadeia longa na molécula de ceramida são responsáveis
pelo caráter lipídico dos esfingolipídeos.
A ceramida é sintetizada a partir de di-hidroesfin
gosina (esfinganina) e um acil graxo-CoA de cadeia
longa, por uma enzima do retículo endoplasmático. A
di-hidroceramida é um intermediário que é, depois,
dessaturado em C4 e C5 (Figura 18.48). Ceramida não
é um componente dos lipídeos de membrana, mas sim
um intermediário na síntese e no catabolismo de glicoes
fingolipídeos e esfingomielina. As estruturas de impor
tantes esfingolipídeos humanos são apresentados na
Figura 18.49, de forma esquemática.
Esfingomielina É um Esfingolipídeo
que Contém Fósforo
A esfingomielina, um importante componente das
membranas do tecido nervoso, é um fosfolipídeo. Como
essa ceramida fosfocolina contém uma carga negativa e
uma carga positiva, é neutra em pH fisiológico (Figura
18.50). Os ácidos graxos mais comuns na esfingomielina
são ácidos palmítico (16:0), esteárico (18:0), lignocérico
(24:0) e nervônico (24:1). A esfingomielina da mielina
contém, predominantemente, ácido lignocérico e ácido
nervônico, enquanto a da massa cinzenta contém princi
palmente ácido esteárico. Acúmulo excessivo de esfingo
mielina ocorre na doença de Niemann-Pick. A conversão
de ceramida em esfingomielina pela esfingomielina sin
tase envolve a transferência de um resíduo de fosfocolina
da fosfatidilcolina (lecitina) (Figura 18.51).
Glicoesfingolipídeos Geralmente
Contêm Galactose ou Glicose
As principais classes de glicoesfingolipídeos são ce
rebrosídeos, sulfatídeos, globosídeos e gangliosídeos.
Nos glicolipídeos, o grupo da cabeça polar ligado à es
fingosina é uma molécula de açúcar.
Cerebrosídeos São Glicosilceramidas
Cerebrosídeos são ceramida mono-hexosídeos; os
mais comuns são galactocerebrosídeo e glucocere

O O
CH3 )(CH214CSCoA + –OOC CHCH2 Mn2+
OH CH3)(C
CH214CHCH2OH + CO2 + CoASH
+ piridoxalfosfato
NH3 NH2

Palmitoil CoA L-Serina 3-Cetodi-hidrosfingosina

FIGURA 18.45 Formação de 3-cetodi-hidroesfingosina a partir de serina e palmitoil-CoA.

CH3 O
)(CH212 CH2 CH2 CCH CH2OH CH3)(CH212CH2CH2CHCHCH2OH

NH2 NADP+ OH NH2

H++NADPH

3-Cetodi-hidrosfingosina Esfinganina (di-hidrosfingosina)

FIGURA 18.46 Conversão de 3-cetodi-hidroesfingosina em esfinganina.

750 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

H CH3 (CH2)12 CH2 CH2 CHCHCH2OH

CH3)(CH212 CCCHCHCH2OH Di-hidrosfingosina OH NH2
H OC
OH NH CH3 O

(CH2)20 C SCoA

CH2 Beenil CoA

)(20
CoA
CH3

FIGURA 18.47 Estrutura de uma ceramida (N-acil CH3 (CH2)12 CH2 CH2 CHCHCH2OH
esfingosina). OH NH

brosídeo. A menos que especificado de outro modo, o C(CH2)20 CH3

termo cerebrosídeo geralmente se refere ao galactoce Di-hidroceramida O

rebrosídeo, também chamado galactolipídeo. Na Figu
FAD

Esfingomielina
FADH2

cer Fosfocolina

Esfingolipídeos neutros H

CH3 (CH2)12 CC CHCHCH2OH

Glucosilceramida cer Glu H OH NH

C(CH2)20 CH3
O
Galactosilceramida cer Gal
Ceramida

FIGURA 18.48 Formação de ceramida a partir de di

Lactosilceramida -hidrosfingosina.
cer Glu Gal

ra 18.52, note que C1 da unidade monossacarídi

Tri-hexosilceramida cer
ca está ligado ao C1 da ceramida, e a configuração
Globosídeo Glu Gal Gal
anomérica do resíduo de açúcar em ambos, ga
lactocerebrosídeos e glucocerebrosídeos, é β. A
maioria dos galactocerebrosídeos de indivíduos
NAc
cer Glu Gal Gal
Gal
saudáveis é encontrada no cérebro. Quantidades
moderadas de galactocerebrosídeos acumulam-se
na massa branca na doença de Krabbe, ou leuco
Esfingolipídeos ácidos
distrofia globoide, uma deficiência da galactoce
rebrosidase lisossomal.

Glucocerebrosídeo (glucosilceramida) (Figu

Sulfatídeo cerGal ra 18.53) não é normalmente um componente das
membranas. É um intermediário da síntese e da
OSO3H
degradação de glicoesfingolipídeos mais comple
xos. No entanto, aumentos de 100 vezes no conteú
Gangliosídeos do de glucocerebrosídeos ocorrem no baço e no
fígado na doença genética de armazenamento de
GM1
GM2
GM3 cerGlu Gal lipídeos chamado doença de Gaucher, uma deficiên
cia da glucocerebrosidase lisossomal.
NANA

cerGlu Gal NAcGal

NANA FIGURA 18.49 Estruturas de alguns esfingolipídeos

comuns, em forma esquemática.
cerGlu Gal NAcGal Gal
Cer = ceramida; Glu = glicose, Gal = galactose, NAcGal
= N-acetilgalactosamina, e NANA = ácido N-acetilneura
NANA mínico (ácido siálico).
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 751

CH3)(CH212 H
CCCHCHCH2 O tidades de sulfatídeo acumulam-se no sistema nervoso
+
OPOCH2 CH2N)(CH33 central na leucodistrofia metacromática, em virtude de
H OH NH O— uma deficiência da sulfatase lisossomal.
C
O )(CH216CH3
6CH2OH

FIGURA 18.50 Estrutura da esfingomielina. CH3(CH2)12CHCHCHCHCH2O

OH NH O2 3
5 OH
1 4
HO
Galactocerebrosídeos e glucocerebrosídeos são sin
tetizados a partir de ceramida e de UDP-galactose e C
O R OH
UDP-glicose, respectivamente. As glucosil- e galactosil
transferases que catalisam essas reações ficam associa FIGURA 18.52 Estrutura do galactocerebrosídeo
das com o retículo endoplasmático (Figura 18.54). Em (galactolipídeo).
alguns tecidos, a síntese de glucocerebrosídeo ocorre por
glucosilação de esfingosina pela glucosiltransferase.
(CH2CHCH CH2OH
Esfingosina + UDP-glicose → CH3)12CHCHCH2O O
→ glucosil-esfingosina + UDP
OH C
NH HO OH

seguida por acilação com ácido graxo

O R OH
Glucosil-esfingosina + estearoil-CoA →
→ glucocerebrosídeo + CoASH FIGURA 18.53 Estrutura do glucocerebrosídeo.

Sulfatídeo É um Éster de Ácido Sulfúrico

Galactocerebrosídeo Ceramida Glucocerebrosídeo
de Galactocerebrosídeo (galactolipídeo) (glucosilceramida)

O Sulfatídeo, ou sulfogalactocerebrosídeo, é um UDP UDP–galactose UDP–glicose UDP

éster de ácido sulfúrico de galactocerebrosídeo. O ga
FIGURA 18.54 Síntese de galacto- e glucocerebrosídeos.
lactocerebrosídeo 3-sulfato é o principal sulfolipídeo
do cérebro, correspondendo a ~15% dos lipídeos da
massa branca (Figura 18.55). É sintetizado a partir de
galactocerebrosídeo e 3’-fosfoadenosina 5!-fosfosulfato CH3 CH2OH
(CH2)12CHCHCHCHCHO O OH
(PAPS) pela sulfotransferase.
OH NH –O3SO

Galactocerebrosídeo + PAPS → C
→ PAP + galactocerebrosídeo 3-sulfato O R OH

A estrutura do PAPS, algumas vezes chamado sulfa FIGURA 18.55 Estrutura do galactocerebrosídeo sulfato
to ativado, é mostrada na Figura 18.56. Grandes quan (sulfolipídeo).

O H2COCR
H CHC
CH3(CH2)12CCH CH2OH + RCOCH
H2 P
O

H OH C
NH CO OCH2N(CH3
CH2)3
+

O–
O R
Ceramida Fosfatidilcolina

O H2COCR
H O

CH3(CH2)12CCHCH2OPOCH2
CHC CH2 +
N(CH3)3 + RCOCH

H OH NH O– H2COH

C Diacilglicerol
O R
Esfingomielina

FIGURA 18.51 Síntese de esfingomielina a partir de ceramida e fosfatidilcolina.

752 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

O O Átomo de carbono
PO–
–O O
S O O– OCH2 O O
P Adenina
1 COO– COO–
H H H H
2 CO COH

3 CH2 CH2
OH
4 CHOH O CHOH
CNCH
O
O O
O–
5 CH3 CH3 C N C H

FIGURA 18.56 Estrutura do PAPS (3’-fosfoadenosina H H

5’-fosfosulfato). 6
9
8
7 HO C H C H

HCOH HCOH

Globosídeos São Ceramida HCOH HCOH

Oligossacarídeos CH2OH CH2OH

Os globosídeos são cerebrosídeos que contêm dois

ou mais resíduos de açúcar, geralmente galactose, gli
cose ou N-acetilgalactosamina. Os oligossacarídeos
são neutros e não contêm amino-grupos livres. A lac
tosilceramida está presente na membrana do eritrócito
(Figura 18.57). Outro globosídeo importante do sis
tema nervoso é a ceramida tri-hexosídeo ou ceramida
galactosil-lactosídeo: ceramida-β-glc-(4 → 1)-β-gal-(4
→ 1)-a-gal. Note que o resíduo de galactose termi
nal desse globosídeo tem a configuração anomérica
a. A ceramida tri-hexosídeo acumula-se nos rins de
pacientes com a doença de Fabry, uma deficiência na
a-galactosidase A lisossomal.
Gangliosídeos Contêm Ácido Siálico
Os gangliosídeos são glicoesfingolipídeos que con
têm ácido siálico, muito concentrados em células gan
glionares do sistema nervoso central, particularmente
nas terminações nervosas. O sistema nervoso central é
singular entre os tecidos humanos porque mais da me
tade do seu ácido siálico está em gangliosídeos, sendo
que o restante ocorre em glicoproteínas. Quantidades
menores de gangliosídeos estão presentes na membra
na plasmática de células da maioria dos tecidos extra
neurais, onde correspondem a menos de 10% do ácido
siálico total.
O ácido neuramínico(abreviadoporNeu)está presen
te em gangliosídeos, glicoproteínas e mucinas. Seu grupo
amino ocorre, mais frequentemente, como o derivado N
-acetil, produzindo ácido N-acetilneuramínico (NANA)
ou ácido siálico (Figura 18.58). O grupo OH de C2 ocorre
mais frequentemente na configuração a-anomérica e é
CH2OH
CH3(CH2)12CHCHCHCHCH2O O
H O
NH H H H
OHO C R
H OH
H H
HO H HO
FIGURA 18.57 Estrutura da ceramida-ß-glc(4 → 1)-ß-gal
(lactosilceramida).
Forma de cadeia aberta Forma -hemiacetal
FIGURA 18.58 Estrutura do ácido N-acetilneuramínico
(NANA).
ligado ao oligossacarídeo da ceramida pelo grupo OH da
posição 2 do ácido N-acetilneuramínico. As estruturas
de alguns gangliosídeos comuns são indicadas na Tabe
la 18.2. Os principais gangliosídeos do cérebro são GM1,
GD1a, GD1b e GT1b. Quase todos os gangliosídeos do corpo
são derivados da glucosilceramida. Na nomenclatura dos
sialoglicoesfingolipídeos, a letra G refere-se a gangliosí
deo. Os subscritos M, D, Te Q indicam gangliosídeos con
tendo mono-, di-, tri- e quadra(tetra)-ácidos siálicos, e os
subscritos 1, 2 e 3 designam a sequência de carboidratos
ligada à ceramida, como segue: 1, Gal-GalNAc-Gal-Glc
-ceramida; 2, GalNAc-Gal-Glc-ceramida; e 3, Gal-Glc-ce
ramida. No gangliosídeo do Tay-Sachs, a designação GM2
denota a estrutura mostrada na Tabela 18.2.
Um gangliosídeo de células da mucosa intestinalli
ga-se à toxina da cólera, uma proteína de 84 kDa secre
tada pelo patógeno Vibrio cholerae. A toxina estimula
a secreção de íons cloreto no lúmen intestinal, resultan
do na intensa diarreia da cólera. A toxina da cólera con
tém uma subunidade A (28 kDa) e cinco subunidades
B (~11.000 Da cada). Depois de se ligar à superfície da
membrana celular pelas subunidades B, a subunidade A
entra na célula e age como uma ADP-ribosiltransferase
que transfere ADP-ribose do NAD+ para a subunidade
Gas de uma proteína G no lado citoplasmático da mem
brana celular (p. 542). Isso leva à ativação da adenilato
ciclase que estimula a secreção de íons cloreto e produz
diarreia. O domínio coleragenoide, como as su
CH2OH bunidades B são chamadas, liga-se ao gangliosí
OH deo GM1 (Tabela 18.2).
O HO Os gangliosídeos também podem ligar outras
H
toxinas, como a toxina tetânica, e certos vírus,
como o vírus influenza. Podem desempenhar um
papel informacional em interações célula–célula,
por fornecerem determinantes específicos de re
conhecimento na superfície celular.
 CAPÍTULO 18 METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS • 753

TABELA 18.2 Estruturas de Alguns Gangliosídeos Comuns dula óssea. A degradação começa com o engurgitamen
Nome Estrutura Química to das membranas de leucócitos e eritrócitos, que são
Código ricos em lactosilceramida (Cer-Glc-Gal) e hematosídeo
(Cer-Glc-Gal-NANA). No cérebro, em sua maioria, os
GM3 Galβ→4Glcβ→Cer cerebrosídeos são gangliosídeos e, particularmente du
3 rante o período neonatal, o turnover dos gangliosídeos
↑ é intenso. O catabolismo de esfingolipídeos é resumido
aNANA na Figura 18.59. Essa via requer enzimas que clivam
GM2 GalNAcβ→4Galβ→2Glcβ→Cer ligações específicas, incluindo a- e β-galactosidases,
3 uma β-glucosidase, uma neuraminidase, hexosamini
↑ dase, fosfodiesterase esfingomielina-específica (esfin
aNANA gomielinase), uma sulfato esterase (sulfatase) e uma
GM1 Galβ→3GalNAcβ→4Galβ→4Glcβ→Cer amidase ceramida-específica (ceramidase). Importan
3 tes características da via catabólica são: (1) todas as
↑ reações ocorrem dentro dos lisossomos; (2) as enzi
aNANA mas são hidrolases; (3) o pH ótimo das enzimas está
GD1a Galβ→3GalNAcβ→4 Galβ →4Glcβ→Cer na faixa ácida, pH 3,5-5,5; (4) a maioria das enzimas
3 3 é relativamente estável e ocorre como isoenzimas, por
↑ ↑ exemplo, hexosaminidase A (HexA) e hexosaminidase
aNANA aNANA B (HexB); (5) as enzimas são glicoproteínas e frequen
Gd1b Galβ→3GalNAcβ→4 Galβ →4Glcβ→Cer temente ocorrem firmemente ligadas à membrana lisos
3 somal; (6) os intermediários adjacentes da via diferem
↑ por uma molécula de açúcar, um grupo sulfato ou um
aNANA8←aNANA resíduo de ácido graxo e são formados pela remoção de
GT1a Galβ→3GalNAcβ→4Galβ→4Glcβ→Cer um constituinte de cada vez, como açúcares e sulfato,
3 3 por reações irreversíveis.
↑ ↑
aNANA←aNANA aNANA O catabolismo de esfingolipídeos normalmente fun
GT1b Galβ→3GalNAcβ→4 Galβ →4Glcβ→Cer ciona bem, sendo todos os glicoesfingolipídeos e esfin
3 3 gomielina degradados até seus constituintes. Entretan
↑ ↑ to, quando a atividade de uma enzima da via está muito
aNANA aNANA8←aNANA reduzida em decorrência de um erro genético, então,
GQ1b Galβ→3GalNAcβ→4Galβ→4Glcβ→Cer o substrato dessa enzima se acumula e é depositado
3 3 dentro dos lisossomos dos tecidos nos quais o catabo
↑ ↑ lismo daquele esfingolipídeo normalmente ocorre. Uma
aNANA8←aNANA aNANA8←aNANA deficiência enzimática foi descrita para a maioria das
reações da Figura 18.59. Essas doenças, chamadas es
fingolipidoses, são resumidas na Tabela 18.3.
Várias doenças de armazenamento de lipídeos en Características comuns das doenças de armazena
volvem acúmulo de glicoesfingolipídeos contendo ácido mento de lipídeos são (1) geralmente apenas um único
siálico. As duas gangliosidoses mais comuns envolvem esfingolipídeo se acumula nos órgãos envolvidos, (2)
os gangliosídeos GM1 (GM1 gangliosidose) e GM2 (doença a porção ceramida é comum aos vários lipídeos arma
de Tay-Sachs). zenados, (3) a velocidade de síntese do lipídeo que se
acumula é normal, (4) uma enzima catabólica está fal
A GM1 gangliosidose é uma doença metabólica au tando, e (5) a deficiência enzimática ocorre em todos
tossômica recessiva caracterizada por função psicomo os tecidos.
tora deficiente, retardo mental, hepato-esplenomegalia
e morte nos primeiros anos de vida. O grande acúmulo
cerebral e visceral de GM1 deve-se a uma acentuada de
Ensaios Enzimáticos para Esfingolipidoses
ficiência de β-galactosidase. O diagnóstico de uma esfingolipidose é feito a partir
da biópsia do órgão envolvido, geralmente medula óssea,
fígado ou cérebro, com base nos aspectos morfológicos
Esfingolipidoses São Doenças da aparência muito característica do armazenamento
Lisossomais de Armazenamento de lipídeos dentro dos lisossomos. O ensaio da ativida
de enzimática confirma o diagnóstico. Leucócitos pe
Os esfingolipídeos são degradados dentro dos lisos riféricos, fibroblastos de pele em cultura e vilosidades
somos de células fagocíticas, particularmente os his coriônicas, que normalmente expressam a enzima rele
tiócitos ou macrófagos do sistema reticulo-endotelial vante, são usados para o propósito de diagnóstico. Em
localizados primariamente no fígado, no baço e na me alguns casos (por exemplo, doença de Tay-Sachs), soro
754 • PARTE IV VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

NANA

NANA
Cerβ Gluβ Galβ GalNAc β Gal

neuraminidase

NANA
Cer β GluβGalβ GalNAcβ Gal (GM1)