Aula 01 Cederj Biocel

Microscopia ptica
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Ao fm desta aula, voc dever ser capaz de:
Traar um breve histrico da microscopia.
Defnir o que um microscpio.
Conceituar limite de resoluo.
Descrever os princpios de funcionamento de um microscpio
simples.
Listar os principais tipos de microscpios pticos e suas aplicaes.
Enumerar as principais etapas do preparo de amostras para
microscopia ptica.
Biologia Celular I | Microscopia ptica
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1 INTRODUO O primeiro problema a enfrentar no estudo das clulas o seu tamanho:
as clulas so pequenas demais para serem observadas a olho nu. Por esse
motivo, as primeiras clulas foram observadas e descritas apenas no sculo
XVII, quando foi inventado o microscpio ptico.
Voc tem idia de qual o tamanho de uma clula? As maiores clulas (algumas
amebas de vida livre, clulas de algas flamentosas) medem cerca de 0,2mm;
mas, em mdia, uma clula 10 ou 20 vezes menor do que isso.
Voc sabe qual o tamanho dos menores objetos que podemos distinguir a olho nu
(sem ajuda de instrumentos especiais)? A resposta voc vai encontrar mais adiante.
Podemos distinguir uma formiga de uma pulga, mas somos capazes de ver os
olhos desses insetos?
Figura 1.1: (a) Insetos como o mosquito Aedes so visveis a olho nu, mas para vermos
detalhes como o olho composto (b), necessitamos utilizar equipamentos especiais
(Fotos: Mrcia Attias).
HISTRICO
No sculo XVII, foram construdos os primeiros microscpios. Com
um deles, Robert Hooke (veja o boxe explicativo) observou lminas de
cortia, chamando clulas aos pequenos espaos regulares da sua estrutura
(Figura 1.2). Mais tarde, tanto Hooke quanto outros pesquisadores da
poca observaram que as clulas vivas no eram ocas como a cortia, mas
o nome original permanece at hoje. No seria injusto ou incorreto dizer
que o estudo da Biologia Celular comeou nessa poca.
a b
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Figura 1.2: (a) Microscpio seme-
lhante ao usado por Hooke.
As partes componentes so anlo-
gas s dos microscpios usados
hoje em dia. (b) Reproduo de
um desenho feito por Hooke a
partir da observao de lminas de
cortia ao microscpio construdo
por ele. Cada um dos espaos
foi por ele chamado de clula.
Robert Hooke (1635-1703)
O ingls Robert Hooke foi, em pleno sculo XVII, o que hoje chamamos de homem
dos sete instrumentos, atuando com contribuies relevantes nos campos da
Fsica, Astronomia, Qumica, Biologia, Geologia, Arquitetura e Tecnologia Naval.
Foi colaborador de cientistas como Isaac Newton, seu grande rival da poca, e
Robert Boyle, a quem auxiliou na determinao das leis dos gases. Correspondeu-
se com Antony van Leeuwenhoek confirmando suas observaes ao microscpio.
Entre outras criaes, inventou ou melhorou instrumentos como o barmetro
e o anemmetro e um mecanismo que tornou os relgios mais precisos.
A Lei de Hooke, equao que descreve a elasticidade, empregada at hoje. Suas
contribuies nos campos da Biologia e Paleontologia no foram menos importantes.
A reputao de Hooke na histria da Biologia se deve em grande parte a sua obra
Micrographia, publicada em 1665. Hooke desenvolveu o microscpio composto
e o sistema de iluminao mostrados na Figura 1.2.a, utilizando-o para descrever
detalhadamente uma grande variedade de organismos como insetos, esponjas, penas
e aquela que parece ser sua maior contribuio, fnas lminas de cortia (Figura 1.2.b).
Em desenhos detalhados, Hooke descreveu a estrutura como pequenos poros, semelhantes a
favos de mel, dando-lhes o nome de clulas (= pequenas celas, alojamentos dos monges nos
conventos). Embora as estruturas observadas correspondessem apenas s paredes celulares
de clulas vegetais j mortas, o nome prevaleceu e dele derivaram os termos Citologia e,
mais modernamente, a Biologia Celular. Sua obra permanece at hoje, embora no exista
nenhum registro de sua prpria aparncia.
Outro pioneiro da Microscopia e da
Biologia Celular foi Antony van Leewenhoek,
holands que construa seus prprios
microscpios (Figura 1.3) com apenas uma
lente, mas com resoluo suficiente para
observar at mesmo protozorios e bactrias.
Figura 1.3: Um dos microscpios
montados por Leeuwenhoek.
a
b
Amostra
Lente
Parafuso de
focalizao
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Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)
Embora tenha feito descobertas fundamentais em Biologia, como as bactrias e os protozorios
(parasitas e de vida livre), Antony van Leeuwenhoek no era um cientista convencional para seu
tempo. Ser flho de comerciantes, sem fortuna, sem educao universitria e sem dominar outros
idiomas seno o holands j seria o bastante para exclu-lo do ambiente acadmico da poca.
Ainda assim, com habilidade extraordinria para polir lentes, uma curiosidade infnda e uma mente
aberta e livre dos dogmas cientfcos de sua poca (o sculo XVII), Leeuwenhoek foi o primeiro a
descrever as hemcias, os espermatozides e muito mais. Acredita-se que, inspirado pelo livro de
Hooke, Micrographia, Leeuwenhoek comeou a polir lentes e a fabricar seus microscpios, tendo
montado mais de 500 deles.
Seus microscpios (Figura 1.3), embora dotados de uma nica lente, eram capazes de aumentar
at em 200 vezes os objetos. Por outro lado, a iluminao era defciente e sua manipulao
bastante desconfortvel para o observador. Em 1673, Leeuwenhoek comeou a enviar cartas com
suas observaes recm-criada Royal Society of London. Em 1680 foi eleito Membro Titular da
mesma, juntando-se a Robert Hooke, Isaac Newton, Henry Boyle e outros cientistas de renome
marcantes at nossos dias.
PRINCPIOS DO FUNCIONAMENTO DE UM MICROSCPIO
PTICO
Os microscpios pticos atuais (Figura 1.4) guardam grande
semelhana com os primeiros modelos usados por Hooke (Figura 1.2.a).
Figura 1.4: Principais compo-
nentes de um microscpio
ptico simples.
Em todos os microscpios pticos, atuais e antigos, teremos uma
fonte de luz que concentrada por um sistema de lentes condensadoras
sobre uma amostra montada sobre uma lmina. O feixe luminoso atravessa
a amostra e captado por uma lente objetiva que produz uma primeira
imagem ampliada do objeto, que ser em seguida captada pela lente ocular
que projetar a imagem fnal na retina do observador (Figura 1.5).
Lente ocular
Foco macromtrico
Foco micromtrico
Objetiva
Platina
Lente condensadora
Fonte de iluminao
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QUANTO AUMENTA UM MICROSCPIO PTICO?
O aumento fnal o resultado da multiplicao do aumento dado
pela lente objetiva pelo aumento da lente ocular. Como existem vrias
lentes objetivas num mesmo microscpio, uma grande variedade de
aumentos pode ser facilmente atingida, bastando girar o revlver. Assim,
se utilizamos uma objetiva de 20x e uma ocular de 10x, o aumento fnal
ser de 200x (10x20=200). Hoje em dia no mais necessrio desenhar
as imagens observadas (como Hooke e seus contemporneos faziam):
a imagem fnal pode ser capturada por uma cmara fotogrfca, de vdeo
ou ainda por um sistema de computao. Uma ampliao suplementar
pode ser obtida ampliando uma fotografa da imagem observada.
Entretanto, de nada adiantaria ampliar a imagem alm de determinado
ponto, pois nenhuma informao suplementar ser obtida. Este o
princpio do limite de resoluo.
O LIMITE DE RESOLUO
Se dependssemos apenas de nossos olhos, no conseguiramos
enxergar nada que medisse menos de 0,2mm. Este o limite de resoluo
de nossos olhos (se enxergarmos muito bem, diga-se de passagem). Graas
aos microscpios pticos, pudemos distinguir objetos que medem at
1 milsimo desse valor, isto , o limite de resoluo dos microscpios
pticos de 0,2m. Naturalmente, isso depende da qualidade das lentes,
mas, principalmente, do comprimento de onda da luz utilizada. Para
saber como esse valor foi calculado, consulte o boxe a seguir.
Figura 1.5: Esquema da formao da imagem em um microscpio ptico simples.
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O limite de resoluo
O ponto-chave da Microscopia, seja ela ptica ou eletrnica, o limite de resoluo de
um microscpio. Este conceito bastante simples: trata-se da menor distncia entre dois
pontos em que eles podem ser vistos como objetos distintos.
Complicado? Nem tanto, observe a seguir:
Os objetos A e B esto a uma distncia que nos permite separ-los como distintos, mas se
eles estiverem muito prximos, no podem ser nitidamente separados, ou seja, o poder de
resoluo dos nossos olhos no sufciente para determinar os limites de cada objeto.
Esse conceito universalmente expresso na seguinte frmula:
em que:
d= limite de resoluo.
= comprimento de onda da radiao utilizada; no caso do feixe luminoso do microscpio
ptico, 550nm.
= n.sen , onde n o ndice de refrao do meio (ar/gua) e q metade do ngulo
formado pelo cone de luz que entra na objetiva (Figura 1.6).
Figura 1.6
Feitas as contas, d= 0,2m no microscpio ptico e, como voc deve saber, 1m = 10
-6
m.
A B
A B
d = 0,61

Lente objetiva
Cone de luz
Lmina contendo a amostra
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1 Na prxima aula, voc ver que esse limite foi novamente
ultrapassado com a construo de microscpios eletrnicos, capazes
de resolver (distinguir) objetos de at 0,2nm. Caso voc no esteja
familiarizado com estas UNIDADES DE MEDIDA, consulte a Figura 1.7.
A Figura 1.7 uma escala relativa das dimenses de clulas
e estruturas subcelulares, assim como do alcance dos instrumentos
(microscpios) utilizados na sua descrio e estudo.
Figura 1.7: Escala comparada do limite de resoluo da microscopia ptica
e da eletrnica e os objetos que cada uma pode discriminar.
Se voc ainda no est convencido de que a resoluo no depende
s das lentes, fque sabendo que Antony van Leeuwenhoek j observara
bactrias no sculo XVII, quando a tecnologia para construo de lentes
e microscpios era muito inferior de nossos dias, mas as propriedades
fsicas da propagao da luz eram as mesmas.
Caso voc esteja considerando ampliar indefnidamente uma
imagem observada ao microscpio ptico at conseguir enxergar a
estrutura da membrana celular, por exemplo, podemos adiantar que
isso ser to efcaz quanto ampliar uma foto 3x4 para contar quantos
clios h na plpebra superior esquerda da pessoa.
Concluindo: aumento e resoluo so coisas distintas, e o
aumento que no traz informaes adicionais sobre a amostra
chamado aumento vazio.
Por que ser que isso acontece? Tudo conseqncia da luz.
As clulas e as
estruturas que
as compem so
muito pequenas
para serem medidas
em centmetros ou
milmetros, como
os objetos do nosso
cotidiano. Portanto,
para elas usamos as
UNIDADES DE MEDIDA
dos micrmetros
(smbolo m)
e nanmetros
(smbolo nm).
O micrmetro vale 1
milsimo do milmetro
e o nanmetro
vale 1 milsimo do
micrmetro.
1m= 10
3
mm
ou 10
6
mm
ou 10
9
nm
Observao: 10
3
a
maneira simplifcada
com que os
matemticos escrevem
as potncias de 10,
isto , igual a 1.000;
da mesma forma 10
6

1.000.000, e assim
por diante.
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Figura 1.8: O comprimento de onda da luz sofre interferncia de
objetos de determinado tamanho (a), enquanto objetos menores
no desviam o trajeto da luz (b). Os do primeiro tipo so visveis,
e os do segundo, no.
OS DIFERENTES MICROSCPIOS PTICOS
Alm de pequenas, as clulas possuem outras caractersticas que
tornam difcil sua observao:
1. em geral, so transparentes;
2. so muito hidratadas e frgeis;
3. quando em rgos ou tecidos, precisam ser cortadas em lminas
fnas que permitam a passagem do feixe luminoso.
Por conta disso, foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos tanto
novas tcnicas de preparo das amostras (vide boxe), que lhes conferissem
maior resistncia e contraste, quanto novas tecnologias na construo de
microscpios que permitissem a observao de clulas vivas.
D uma paradinha!
Imagine-se andando de bicicleta numa ciclovia. Voc segue em linha reta velocidade da
luz. Voc um raio de luz! Pedrinhas, formigas e outros pequenos objetos no impedem
que voc continue deslizando suavemente, sem interferncias.
J uma chapinha de refrigerante ou um pedregulho podem fazer sua bicicleta se desviar
do trajeto e, no caso de obstculos maiores, podem impedir sua passagem. Assim se
comporta a luz ao atravessar as amostras observadas ao microscpio ptico. Agora,
chega de passear: de volta ao estudo!
!
Observe a Figura 1.8: a luz se propaga na forma de
ondas. Estas ondas colidem com as partculas que formam a
amostra, sofrendo interferncias. Assim se origina a sensao
de contraste (claro/escuro). A onda, por sua vez, representa
a luz visvel: apenas objetos at um determinado tamanho
so grandes o bastante para causar interferncia no trajeto
do raio luminoso. Objetos menores passam despercebidos,
e no causam alterao na propagao da onda.
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O preparo de amostras para o microscpio ptico de campo claro
Para que possam ser guardadas por muito tempo, as amostras de clulas e tecidos precisam em
geral de um tratamento qumico que garanta sua preservao. Esse tratamento inclui vrias
etapas.
1. Fixao: o tratamento da amostra com substncias qumicas, como o formol, que preservam
sua forma original.
2. Desidratao: a substituio da gua presente dentro e fora das clulas por um solvente
orgnico, como o etanol ou metanol. Esse solvente tanto pode ser removido deixando a lmina
secar quanto pode ser substitudo por parafna ou outra resina que torne o tecido rgido,
permitindo que seja fatiado.
3. Microtomia: tecidos como fgado ou msculo so muito espessos e precisam ser cortados em
fatias mais fnas, que permitam a passagem parcial da luz. Uma vez embebidos em parafna,
deixa-se solidifcar, e o tecido pode ser cortado (fatiado).
4. Colorao: como a maioria das clulas e seus componentes no so naturalmente coloridos, uma
srie de corantes foi testada e, devido a sua afnidade qumica por determinados componentes
celulares, so empregados, ajudando na identifcao dos diferentes compartimentos celulares.
O azul de metileno um desses corantes.
Mais detalhes sobre as tcnicas de preparo de amostras para microscopia ptica, voc ter em
outra disciplina.
OS DIFERENTES MICROSCPIOS PTICOS
O resultado disso que existe hoje uma grande famlia de microscpios
pticos, cada um com suas vantagens e limitaes sobre os demais. Dentre
os de uso mais corriqueiro, essencial que voc conhea:
1. Microscpio de campo claro ou microscpio simples:
o microscpio padro representado na Figura 1.9.a. Em
geral, requer que a amostra seja fxada e corada antes da
observao (Figura 1.9.b). Entretanto, desde que a iluminao
seja ajustada fechando-se um pouco mais a passagem de luz
pela condensadora, possvel observar clulas a fresco, isto ,
sem colorao prvia (Figura 1.9.c).
Figura 1.9: Em (a), microscpio ptico de campo claro. Em (b),
hemcito (clula do sangue) de um molusco corado. Em (c), clulas
que revestem a mucosa bucal observadas sem nenhum tipo de
corante. Que estruturas voc reconhece? (Fotos b: Marco Antonio
V. Santos, c: Raul D. Machado).
Lente ocular
Foco macromtrico
Foco micromtrico
Objetiva
Platina
Condensador
Fonte de iluminao
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Figura 1.10: A luz, ao interagir com um slido (= clula), tem sua trajetria atrasada, criando um contraste em
relao luz que no encontrou nenhum obstculo (a) (esquema esquerda). Esse o princpio do microscpio
de contraste de fase. direita (b), voc v as mesmas clulas epiteliais (retiradas da mucosa bucal) j observadas
em campo claro tal como aparecem nesse microscpio. H um halo em torno da clula e de algumas de suas
estruturas internas.
3. Microscpio de contraste interferencial: tambm utiliza fltros
para criar contraste a partir de diferenas no trajeto da luz. A imagem
fnal mais agradvel para o observador (Figura 1.11), mas o sistema
menos comum, pois mais caro que o contraste de fase. Tambm permite
observar clulas vivas. Quando essas clulas esto dispostas em camadas,
pode-se focalizar apenas um plano, obtendo-se assim cortes pticos sem
que o tecido seja cortado.
Figura 1.11: As mesmas clulas epite-
liais, observadas na Figura anterior,
agora em contraste interferencial.
A imagem sombreada d noo de
relevo das estruturas celulares (Foto:
Raul D. Machado).
2. Microscpio de contraste de fase: dispensa o uso de corantes,
permitindo a observao de clulas vivas (Figura 1.10). Um sistema de fltros
(anis de fase) interfere no trajeto da luz, criando um contorno claro/escuro
em torno das estruturas celulares. Esse contraste permite a observao de
clulas vivas, mas se elas estiverem muito aglomeradas, a imagem se torna
confusa, requerendo um sistema ptico mais elaborado.
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1 4. Microscpio de fuorescncia: utiliza uma fonte de luz ultravioleta
e requer o uso de corantes fuorescentes (voc ver mais detalhes na Aula
6) que se ligam a componentes especfcos das clulas. Esses corantes
so capazes de absorver luz de um determinado comprimento de onda
(ultravioleta, por exemplo) e emitir num outro, dentro do espectro visvel
(Figura 1.12). Em algumas situaes, as clulas podem ser observadas
vivas; em outras, no.
O mais comum que um modelo possa ter seus jogos de lentes
e fontes de luz alternados (intercambiados) para que se possa observar
amostras pelos trs mtodos.
5. Microscpio confocal de varredura a laser: a conjugao da
cincia da computao aos microscpios de fuorescncia trouxe uma
nova dimenso microscopia ptica.
O microscpio confocal possui, alm de uma fonte de luz visvel,
uma fonte de luz ultravioleta e uma fonte de raio laser. O feixe de laser
incide sobre a amostra; um sistema de fltros e aberturas especiais captura
sucessivamente a fuorescncia emitida de vrios planos focais.
Este conjunto de imagens capturado digitalmente, e imagens como
as da Figura 1.13.b em que voc pode ver a distribuio de microtbulos
em uma clula so geradas em programas especfcos de computador.
Figura 1.12: (a) Microscpio confocal de varredura a laser do Laboratrio de Ultra-
estrutura Celular do Instituto de Biofsica da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ). (b) Distribuio de microtbulos em uma clula de mamfero (Foto: Tecia
Ulisses de Carvalho).
a b
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1 Alguns links interessantes apesar de serem em ingls, vale a
pena visitar esses endereos na internet.
1- Dados biogrfcos de Leeuwenhoek
http://www.ucmp.berkeley.edu/history/leeuwenhoek.html
2- Dados biogrfcos de Robert Hooke
http://www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke.html
3- Museu da Microscopia. Tutoriais sobre princpios de ptica. Galeria
de imagens, vdeos on line. Vale a visita
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/museum/index.html
4- Pgina da Sociedade Americana de Biologia Celular que disponibiliza
muitos links, imagens e vdeos interessantes.
http://www.ascb.org/
5- Atlas de imagens de Microscopia (ptica e eletrnica), organizado
pelo departamento de Histologia da UERJ.
http://www2.uerj.br/~micron/
6- Maravilhosas imagens de fuorescncia obtidas em microscpio de
fuorescncia confocal.
http://www.molbio.princeton.edu/confocal/510image2/
Zeisslist2.html
7- Imagens de protistas em Microscopia ptica de contraste interferencial
e de fase. Links para imagens desses mesmos organismos em microscopia
eletrnica, mostrando como vrios mtodos de observao devem ser
conjugados na anlise de um organismo.
http://megasun.bch.umontreal.ca/protists/gallery.html -
8- Pgina da Nikkon, com tutoriais onde se pode manusear virtualmente
vrios tipos de microscpio ptico.
http://www.microscopyu.com/tutorials/
Faa sua prpria busca na internet a partir de palavras-chave como:
Microscopia
Microscope
Fluorescncia
Fluorescence
Clulas
Se quiser, faa outras buscas, com palavras que voc escolher.
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R E S UMO
Os microscpios pticos comearam a ser construdos no sculo XVII, e com
eles foram observadas e batizadas as primeiras clulas. O aperfeioamento na
construo de lentes, fltros e sistemas de iluminao deu origem a uma grande
variedade de microscpios pticos. Alm dos de campo claro, que requerem que
o material seja corado, existem microscpios de contraste de fase e de contraste
interferencial, onde as clulas podem ser observadas vivas e sem colorao
especial. Os microscpios de fuorescncia permitem ver estruturas normalmente
muito fnas para serem observadas com os comprimentos de onda da luz visvel.
O microscpio confocal a laser inaugurou uma nova era na microscopia ptica,
mas a observao da maior parte das estruturas que compem a clula s
possvel com um instrumento de maior poder de resoluo: o microscpio
eletrnico, tema da prxima aula.
EXERCCIOS
1. Com base no que foi estudado, calcule o aumento fnal de um microscpio
ptico que utilize as seguintes combinaes de lentes oculares e objetivas:
2. Por que as clulas receberam esse nome?
3. Compare o microscpio de Hooke (Figura 1.2) com o modelo atual (Figura 1.4),
identifcando as partes anlogas.
4. Qual a importncia de cada um dos componentes listados a seguir para
observao ao microscpio ptico?
fonte de luz;
lente condensadora;
espessura da amostra;
contraste da amostra.
Ocular Objetiva Aumento fnal
5x 40x
10x 20x
20x 10x
10x 100x
20 CE DE R J
5. Em que tipo(s) de sistema ptico podemos observar clulas vivas e sem a adio
de corantes?
6. O que voc entende por microscopia de fuorescncia?
7. O que limite de resoluo? Qual o limite de resoluo do microscpio ptico?
8. Uma hemcia mede 8mm(oito milmetros ). Quando observada sob um aumento
total de 1000 vezes, quanto medir?
9. Por que, em geral, o ncleo a nica estrutura claramente visvel dentro de
uma clula observada ao microscpio ptico?
10. Converta para as unidades correspondentes:
5m =...nm
0,5mm= .. m
100m = ..nm
1000m= .mm
60nm=...m
11. Uma clula foi fotografada com 2000x de aumento no microscpio ptico. Uma
estrutura que tenha na realidade 2m aparecer com que comprimento na foto?
12. Procure determinar em que tipo de microscpio ptico foram obtidas as imagens
que esto na ltima pgina deste livro. Se conseguir identifcar as amostras, melhor
ainda; caso contrrio, consulte o gabarito desta aula no fnal do livro.

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