MICROSCOPIA FOTÔNICA E ELETRÔNICA

PROF. DANIEL SIQUIEROLI VILAS BOAS, PHD_____________________________________________________________

INTRODUÇÃO

Hoje temos a tecnologia para decifrar os princípios subjacentes que governam a estrutura e a atividade da
célula. Mas a biologia celular teve início sem essas ferramentas. Para apreciar o apuro enfrentado por aqueles que
primeiro visualizaram as células, imagine a perplexidade de um cientista de uma era passada — digamos, Leonardo
da Vinci — tentando compreender o funcionamento de um computador laptop atual moderno. Não teríamos meios
de saber que a chave para compreender como essa máquina funciona se encontra na identificação e decodificação
dos seus programas. Depois de examinar a caixa externa do laptop, erguer a tela e cutucar as teclas, este
indivíduo culto e curioso poderá abrir o objeto para ver o que tem dentro: nenhuma engrenagem ou manivela,
nenhum duende minúsculo escrevendo mensagens na tela. Em vez disso, ele se confrontaria com placas cobertas
com marcas metálicas e incrustadas com pedaços retangulares pretos; um objeto pesado, semelhante a um tijolo,
que solta pequenas faíscas quando cutucado com um par de pequenas pinças de metal e vários outros pequenos
pedaços e partes profundamente intrigantes.
Os primeiros biólogos celulares concentraram-se em um tipo semelhante de exploração. Eles iniciaram
simplesmente observando tecidos e células, rompendo-as ou fatiando-as e tentando observar atentamente dentro
delas. O que eles viram era para eles, como para o sábio renascentista confrontado com o computador,
profundamente confuso. Contudo, esse tipo de investigação visual foi a primeira etapa em direção à compreensão
e permanece essencial no estudo da biologia celular.
Em geral, as células são muito pequenas — pequenas demais para serem vistas a olho nu. Elas não foram
visíveis até o século XVII, quando o microscópio foi inventado. Durante centenas de anos depois, tudo o que era
sabido sobre as células foi descoberto utilizando esse instrumento. Os microscópios ópticos, que utilizam luz visível
para iluminar os espécimes, ainda são peças vitais de equipamentos em um laboratório de biologia celular.
Embora esses instrumentos agora incorporem muitas melhorias, as propriedades da própria luz colocam
um limite para a nitidez de detalhes que eles podem revelar. Os microscópios eletrônicos, inventados nos anos 30,
vão além desse limite pela utilização de feixes de elétrons em vez de feixes de luz como fonte de iluminação,
aumentando grandemente a sua capacidade para ver os finos detalhes das células e até mesmo tornando algumas
moléculas grandes visíveis individualmente.
A invenção do microscópio óptico levou à descoberta das células. O desenvolvimento do microscópio óptico
dependeu dos avanços na produção das lentes de vidro. Pelo século XVII, as lentes foram refinadas a ponto de
tomarem possível a fabricação de microscópios simples. Utilizando um instrumento como esse, Robert Hooke
examinou um pedaço de rolha e em 1665 comunicou para a Royal Society de Londres que a cortiça era composta
de uma massa de minúsculas câmaras, que ele chamou de "células". O nome "célula" foi estendido até para as
estruturas que Hooke descreveu, que eram apenas as paredes celulares que permaneceram depois que as células
vegetais vivas dentro dela morreram. Mais tarde, Hooke e alguns outros dos seus contemporâneos foram capazes
de visualizar células vivas.
Por quase 200 anos, a microscopia óptica permaneceu um instrumento exótico, disponível apenas para
poucos indivíduos ricos. Foi apenas no século XIX que ela começou a ser amplamente utilizada para visualizar
células. A emergência da biologia celular como uma ciência distinta foi um processo gradual para o qual vários
indivíduos contribuíram, mas o seu nascimento oficial geralmente é dito ser marcado por duas publicações: uma
pelo botânico Matthias Schleiden, em 1838, e a outra pelo zoólogo Theodor Schwann, em 1838. Nesses artigos,
Schleiden e Schwann documentaram os resultados de uma investigação sistemática de tecidos vegetais e animais
com o microscópio óptico, mostrando que as células eram os blocos universais de construção de todos os tecidos
vivos. O seu trabalho e o de outros microscopistas do século XIX lentamente conduziram à compreensão de que
todas as células vivas eram formadas pela divisão de células existentes — um princípio algumas vezes chamado de
A Teoria Celular.
A implicação de que organismos vivos não surgem espontaneamente, porém podem ser gerados apenas a
partir de organismos existentes, foi ansiosamente contestada, mas ela foi finalmente confirmada por experimentos
realizados nos anos de 1860 por Louis Pasteur. O princípio de que as células são geradas apenas a partir de células
preexistentes e herdam suas características a partir delas fundamenta toda a biologia e dá ao assunto uma única
ideia: em biologia, as questões sobre o presente estão inevitavelmente ligadas às questões sobre o passado. Para
entender por que as células e os organismos de hoje se comportam dessa maneira, precisamos entender a sua
história, todo o caminho de volta às origens vagas das primeiras células sobre a Terra.
A teoria de Darwin sobre a evolução, publicada em 1859, forneceu a compreensão-chave que torna essa
história compreensível, mostrando como a variação randômica e a seleção natural podem orientar a produção de
organismos com novas características, adaptados a novos meios de vida. A teoria da evolução explica como a

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diversidade surgiu entre os organismos que compartilham um ancestral comum. Quando combinada com a teoria
celular, ela conduz a uma visão de toda a vida, a partir do seu início até os dias atuais, como uma vasta árvore
familiar de células individuais.

HISTÓRICO E EVOLUÇÃO DOS MICROSCÓPIOS

Assim como os gregos tinham um sistema de aquecimento radiante em pleno funcionamento, operando
dois mil anos antes daqueles que foram introduzidos nos EUA, as origens do microscópio óptico composto parecem
ser rastreadas, não na Holanda, Inglaterra ou França - mas na China!
De acordo com um texto chinês antigo, os chineses visualizavam espécimes ampliados através de uma
lente no final de um tubo, tubo esse que era preenchido com níveis variáveis de água de acordo com o grau de
ampliação que desejavam alcançar. Engenhoso, eficaz e repetível em casa, hoje. É notável que isso tenha ocorrido
cerca de 4.000 anos atrás na dinastia Chow-Foo e mais de 3.500 anos antes do nascimento do "pai da microscopia
moderna".
Aristóteles, ninguém menos, descreve o funcionamento de um microscópio com alguns detalhes. Os
gregos certamente fizeram bom uso de lentes curvas, que são um componente essencial de qualquer microscópio
estéreo ou composto. Os meninos gregos antigos provavelmente compartilhavam o senso de triunfo de todos os
meninos americanos ao usar uma lente curva ou lupa para iniciar um incêndio. Os gregos, no entanto, também o
usavam para procedimentos cirúrgicos, não em formigas como os meninos costumam fazer, mas em pessoas -
para cauterizar feridas e lesões causadas pela hanseníase e assim por diante.
Os antigos egípcios e romanos também usavam várias lentes curvas, embora nenhuma referência a um
microscópio composto tenha sido encontrada. Os gregos, no entanto, nos deram a palavra "microscópio", que
deriva de duas palavras gregas, "μικρό (Fon mikró)": pequeno, diminuto e "σκοπός (Fon skopós)": visão, escopo,
propósito.
No entanto, enquanto chineses antigos, gregos e romanos todos aplicaram sua infinita sabedoria ao
problema, não há referência conhecida ao uso de luz artificial ou a múltiplas lentes. Em outras palavras, podemos
dar um grande crédito aos Antigos por sua previsão e realizações, mas precisamos procurar em outro lugar para
descobrir o primeiro microscópio de luz e composto.
Incrivelmente, as próximas referências históricas com algo a ver com microscópios, ou mais precisamente,
com a óptica são 1.200 anos após o saque de Roma e, mesmo assim, as referências são apenas para o uso de
lentes na invenção dos óculos. Em outras palavras, algumas das pessoas mais inteligentes que o planeta já
produziu, tocou e trabalhou com lentes únicas por vários milhares de anos, sem levar isso adiante. Dentre eles,
Salvano d'Aramento degli Amati (d. 1317) e Allessandro della Spina (d. 1313).
Somente 200-300 anos após é que são encontradas uma infinidade de referências e evidências concretas
de telescópios e microscópios. O Renascimento havia chegado e, com ele, florescimento abundante nas artes e nas
ciências. Mais importante ainda, com a invenção da impressão, as ideias e os desenvolvimentos poderiam se
espalhar com facilidade e rapidez. Galileu então começou a trabalhar com lentes e desenvolveu um telescópio
aprimorado com um dispositivo de foco e Sir Isaac Newton, na mesma época no Reino Unido inventou o telescópio
refletor.
Hans Lippershey e seu filho, Zaccharias Hanssen, estavam experimentando uma variedade de lentes. No
final dos anos 1590, eles usaram várias lentes em um tubo e ficaram surpresos ao ver que o objeto no final do
tubo foi ampliado significativamente além da capacidade de uma lupa. Eles tinham acabado de inventar o
microscópio composto. Ou seja, eles descobriram que uma imagem ampliada por uma única lente pode ser
ampliada ainda mais por uma segunda ou mais lentes.
Então, em meados do século XVII, um inglês, Robert Hooke e um holandês, Anthony Van Leeuwenhoek
elevaram o microscópio a novos níveis. Hooke era um gênio doentio que adorava experimentar. Ele o fez em uma
enorme variedade de campos científicos e com sucesso prolífico. Ele inventou a junta universal, o diafragma da íris
(outro componente essencial de muitos microscópios de luz modernos), um respirador, um escape de âncora e
uma mola de equilíbrio para relógios. Ele também elaborou a teoria correta da combustão, inventou uma equação
que descreve a elasticidade ainda hoje usada e inventou ou aprimorou instrumentos meteorológicos como o
barômetro, o anemômetro e o higrômetro, e assim por diante. Acima de tudo, porém, ele é conhecido pela
“Micrographia”, seus estudos com um microscópio, publicada em 1665. A Micrographia se tornou uma sensação da
noite para o dia, não apenas pelo que ele descreveu, mas pelos excelentes desenhos que ele fez.
Ele descreveu um novo mundo ao lado de desenhos requintados dos pelos em uma urtiga, uma pulga e,
mais famoso de tudo, a estrutura de favo de mel ou "células" de uma cortiça. Foi Hooke quem cunhou o termo
"células" ao descrever tecido vivo. É interessante notar que, embora Hooke usasse um microscópio composto, ele

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descobriu que ele era muito tenso e enfraqueceu a visão. Para sua Micrographia, ele preferiu usar um microscópio
simples, de lente única, feito de ouro e couro e iluminado por uma vela. Talvez o primeiro microscópio de luz?
Antonie van Leeuwenhoek - o Pai do Microscópio, no entanto, viveu ao mesmo tempo que Hooke e se
valeu do trabalho de Hooke para levar o design do microscópio a novos níveis de sofisticação. Como comerciante
de tecidos, ele usou um microscópio simples para examinar os tecidos. Como cientista, ele começou a
experimentar novas formas de retificar lentes para melhorar a qualidade óptica. No total, ele moeu cerca de 550
lentes, algumas das quais tinham um poder de ampliação linear de 500 e um poder de resolução de um
milionésimo de polegada - uma conquista impressionante.
Leeuwenhoek detalhou essas realizações em quase 200 cartas à The Royal Society em Londres, onde não
menos que uma pessoa como Robert Hooke as validou. O resultado de todo esse trabalho foi um microscópio de
mão simples, de lente única. A amostra foi montada na parte superior do ponteiro, acima da qual havia uma lente
convexa presa a um suporte de metal. A amostra foi então vista através de um orifício no outro lado do
microscópio e foi focalizada usando um parafuso.
Talvez seu experimento mais famoso tenha ocorrido em 1674, quando ele viu um pouco da água do lago:
“Agora eu via claramente que eram enguias, ou minhocas, todas amontoadas e se contorcendo como se você
visse, a olho nu, uma banheira cheia de enguias e água, com as enguias se contorcendo entre si; e toda a água
parecia estar viva com essas várias espécies de animais”. “Essa foi para mim, dentre todas as maravilhas que
descobri na natureza, a mais maravilhosa de todas; e devo dizer, da minha parte, que ainda não houve nenhuma
visão tão agradável diante de meus olhos do que esses milhares de criaturas vivas vistas em uma pequena gota
d'água, movendo-se entre si, cada uma com suas próprias características de movimento."
Ele havia descoberto as bactérias e ganhou o título de Pai do Microscópio. Curiosamente, levou até 1839,
quase duzentos anos depois, antes que as células fossem finalmente reconhecidas como as unidades básicas da
vida.
O próximo passo importante na história do microscópio ocorreu outros 100 anos depois, com a invenção
da lente acromática de Charles Hall, na década de 1730. Ele descobriu que, usando uma segunda lente de
diferentes formas e propriedades de refração, ele poderia realinhar cores com um impacto mínimo na ampliação da
primeira lente.
Então, em 1830, Joseph Lister resolveu o problema da aberração esférica (a luz se curva em ângulos
diferentes, dependendo de onde atinge a lente), colocando as lentes a distâncias precisas uma da outra.
Combinadas, essas duas descobertas contribuíram para uma melhoria acentuada na qualidade da imagem.
Anteriormente, devido à baixa qualidade do vidro e das lentes imperfeitas, os microscopistas estavam vendo
apenas imagens distorcidas - algo como os primeiros rádios que apresentavam muita interferência.
Vale lembrar que, até agora, cada novo avanço tem sido na qualidade ou aplicação das lentes. Então, em
1863, um dos vários novos fabricantes de microscópios, a empresa Ernst Leitz, abordou um problema mecânico
com a introdução da primeira torre giratória com nada menos que cinco objetivas.
Essa melhoria foi rapidamente seguida em 1866, quando Carl Zeiss recrutou Ernst Abbe como seu diretor
de pesquisa na Zeiss Optical Works. Abbe estabeleceu a estrutura do que se tornaria a moderna abordagem de
desenvolvimento da óptica computacional. Ele deixou clara a diferença entre ampliação e resolução e criticou a
prática de usar oculares com ampliação muito alta como "ampliação vazia". Em 1869, seu trabalho produziu um
novo dispositivo de iluminação patenteado - o condensador Abbe.
O trabalho de Abbe em uma teoria de ondas de imagens microscópicas possibilitou o desenvolvimento de
uma nova gama de dezessete objetivas de microscópio - três delas foram as primeiras objetivas de imersão e
todas foram projetadas com base em modelagem matemática.
Dali em diante, os microscópios foram projetados com base em leis sólidas da física, e não na tentativa e
erro que caracterizaram os pioneiros. Ao mesmo tempo, várias empresas montaram fábricas especializadas focadas
na fabricação de microscópios de precisão.
Em 1880, começaram a ser utilizados os primeiros micrótomos que permitiam preparar amostras
significativamente mais finas para melhorar a amostra. Em 1893, outro funcionário da Zeiss, August Kohler,
descobriu um sistema de iluminação incomparável que ainda é conhecido como iluminação de Kohler. Usando
diafragmas duplos, o sistema oferece benefícios triplos de uma amostra uniformemente iluminada, uma imagem
brilhante e brilho mínimo. Em outras palavras, Kohler alcançou uma imagem quase perfeita.
O mercado de microscópios havia chegado ao mesmo tempo que a engenharia de precisão e não é de
admirar que tenham sido obtidos resultados surpreendentes: Em 1879, Walter Flemming descobriu mitose e
cromossomo celular, uma conquista reconhecida como uma das 100 mais importantes realizações de todos os
tempos. Na virada do século XIX/XX, Louis Pasteur inventou a pasteurização, enquanto Robert Koch descobriu o
bacilo do antraz, o bacilo de tuberculose e o vibrião da cólera.
Em 1900, o limite teórico de resolução para microscópios de luz visível (2000 angstroms) havia sido
atingido. Em 1904, a Zeiss superou essa limitação com a introdução do primeiro microscópio UV comercial com

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resolução duas vezes maior que a de um microscópio de luz visível. Em 1930, Fritz Zernike descobriu que podia ver
células não coradas usando o ângulo de fase dos raios. Desprezada por Zeiss, sua inovação de contraste de fase
não foi introduzida até 1941, embora ele tenha ganhado o Prêmio Nobel por seu trabalho em 1953.
Em 1933, Max Knoll e Ernst Ruska inventaram o primeiro microscópio eletrônico que ultrapassou as
limitações ópticas da luz. A física determina que os microscópios de luz sejam limitados pela física da luz a
ampliações de 500x ou 1000x e uma resolução de 0,2 micrômetros.
Knoll e Ruska construíram um microscópio eletrônico de transmissão (MET) - que transmite um feixe de
elétrons (em oposição à luz) através da amostra. A interação subsequente do feixe de elétrons com a amostra é
registrada e transformada em uma imagem. Então, em 1942, Ruska melhorou o MET construindo o primeiro
microscópio eletrônico de varredura (MEV) que transmite um feixe de elétrons através da amostra.
Os princípios de Ruska ainda formam a base dos modernos microscópios eletrônicos - microscópios que
podem atingir níveis de ampliação de até 2 milhões de vezes! O segundo grande desenvolvimento para
microscópios no século 20 foi a evolução do mercado de massa. Iniciada no século XIX, quando Leitz alegou ter
exportado 50.000 microscópios para os EUA, essa tendência se acelerou no século XX. Como resultado, um grande
número de fabricantes surgiu para oferecer alternativas com preços mais competitivos a empresas europeias
estabelecidas, como Zeiss e Leitz.
A China se tornou um importante fornecedor de microscópios para o uso diário e, com a evolução de sua
capacidade de fabricação óptica, agora fornece componentes ópticos para algumas das principais marcas de
microscópio. Essa tendência do mercado teve um efeito benéfico no preço dos microscópios, permitindo a
disseminação de microscópios além do domínio do cientista pesquisador para o uso comercial e individual diário.
Novas fontes de luz - halogênio, fluorescente e LED melhoraram ou adicionaram uma maior versatilidade
do microscópio de luz, enquanto o advento dos suportes de barra levou a extensas aplicações de inspeção
comercial que não podem ser realizadas com uma base de microscópio padrão. A inovação mais recente, no
entanto, foi a chegada do microscópio digital.
Os microscópios digitais permitem a transmissão de imagens ao vivo para uma TV ou tela de computador e
ajudaram a revolucionar a microfotografia. Os microscópios digitais simplesmente integram uma câmera de
microscópio digital na porta trinocular de um microscópio padrão.
Uma das inovações mais originais do século XXI foram os microscópios Dino-Lite Digital. Dino-Lite são
microscópios digitais de mão, não muito maiores que uma caneta grossa. Eles oferecem capacidade de zoom de
baixa potência com ampliação de até 500x e tiveram um impacto marcante nas aplicações de inspeção industrial.

LINHA DO TEMPO
 721 aC: Lente de Layard, uma das primeiras lentes criadas.
 1280: Invenção dos óculos.
 1608: Zacharias Jansen constrói um microscópio com duas lentes convergentes.
 1611: Johannes Kepler sugere como fazer um microscópio composto.
 1665: Robert Hooke utiliza um microscópio composto para estudar cortes de cortiça e descreve os
pequenos poros na forma de células que ele chama de "células". Publicou seu livro Micrographia.
 1674: Leeuwenhoek relatou sua descoberta de protozoários. Observará bactérias nove anos depois.
 1828: W. Nicol desenvolve microscopia de luz polarizada.
 1830: Joseph Jackson Lister reduz o problema com a aberração esférica. Quando as lentes foram
colocadas em distâncias precisas uma da outra proporcionaram uma boa ampliação sem desfocar a
imagem.
 1838: Schleiden e Schwann propõem a teoria celular e afirmam que a célula nucleada é a unidade
estrutural e funcional de plantas e animais.
 1849: J. Quekett publica um tratado prático sobre o uso do microscópio.
 1876: Abbe analisa os efeitos da difração na formação da imagem no microscópio e mostra como
aperfeiçoar a concepção do microscópio.
 1881: Retzius descreve muitos tecidos animais com um detalhe que não foi superado por nenhum outro
microscopista de luz. Nas próximas duas décadas, ele, Cajal e outros histologistas desenvolvem novos
métodos de coloração e propõem as bases da anatomia microscópica.
 1886: Carl Zeiss fabrica uma série de lentes, com design de Abbe que permite ao microscopista resolver
estruturas nos limites teóricos de luz visível.
 1903: Richard Zsigmondy desenvolve o ultramicroscópio e é capaz de estudar objetos abaixo do
comprimento de onda da luz.
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 1908: Köhler e Siedentopf desenvolvem o microscópio de fluorescência.

 1930: Lebedeff projeta e constrói o primeiro microscópio de interferência.
 1932: Zernike inventa o microscópio de contraste de fase.
 1933: Ernst Ruska e Max Knoll, físicos alemães, constroem o primeiro microscópio eletrônico.
 1952: Nomarski inventa e patenteia o sistema de contraste de interferência diferencial para o microscópio
de luz.
 1981: Gerd Binnig e Heinrich Rohrer inventam o microscópio de tunelamento por varredura que fornece
imagens tridimensionais de objetos ao nível atômico.

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MICROSCÓPIOS FOTÔNICOS
O microscópio fotônico ou microscópio de luz, também conhecido como microscópio óptico comum é um
instrumento óptico composto que faz uso da refração da luz oriunda de uma série de lentes, dotadas ou não de
filtros multicoloridos e/ou ultravioleta, para ampliar a imagem de objetos invisíveis (ou difíceis de serem
visualizados) a olho nu. É constituído por uma parte óptica para ampliação das imagens e por uma parte mecânica
para suportar o sistema óptico e focar a imagem.

Lentes e Refração. No contexto da microscopia, a refração é talvez o comportamento mais importante

exibido pelas ondas de luz. A refração ocorre quando as ondas de luz mudam de direção quando entram em um
novo meio. Diferentes materiais transparentes transmitem luz em diferentes velocidades; assim, a luz pode mudar
a velocidade ao passar de um material para outro. Essa mudança de velocidade geralmente também causa uma
mudança de direção (refração), com o grau de mudança dependente do ângulo da luz que chega.
A extensão em que um material diminui a velocidade de transmissão em relação ao espaço vazio é
chamada de índice de refração desse material. Grandes diferenças entre os índices de refração de dois materiais
resultam em uma grande quantidade de refração quando a luz passa de um material para o outro. Por exemplo, a
luz se move muito mais lentamente através da água do que através do ar; portanto, a luz que entra na água pelo
ar pode mudar muito de direção. Dizemos que a água tem um índice de refração mais alto que o ar.
Quando a luz cruza um limite em um material com um índice de refração mais alto, sua direção fica mais
próxima da perpendicular ao limite. Este é o princípio por trás das lentes. Podemos pensar em uma lente como um
objeto com um limite curvo que coleta toda a luz que a atinge e a refrata para que tudo se encontre em um único
ponto chamado ponto de imagem (foco). Uma lente convexa pode ser usada para ampliar, pois pode focalizar a
uma distância menor que o olho humano, produzindo uma imagem maior. Lentes e espelhos côncavos também
podem ser usados em microscópios para redirecionar o caminho da luz.

Refração da luz em um prisma e a diferença do ponto focal nas lentes convexa e côncava.

O olho humano contém lentes que nos permitem ver imagens. Essas lentes focalizam a luz refletida dos
objetos na frente do olho, na superfície da retina, que é como uma tela no fundo do olho. As lentes artificiais
colocadas na frente do olho (lentes de contato, óculos ou lentes microscópicas) focalizam a luz antes de serem
focadas (novamente) pelas lentes do olho, manipulando a imagem que acaba na retina (por exemplo, fazendo-a
aparecer maior).

Ampliação, resolução e contraste. Os microscópios ampliam imagens e usam as propriedades da luz

para criar imagens úteis de objetos pequenos. A ampliação é definida como a capacidade de uma lente aumentar a
imagem de um objeto quando comparado ao objeto real. Por exemplo, uma ampliação de 10× significa que a
imagem aparece 10 vezes o tamanho do objeto, como vista a olho nu.
Uma ampliação maior geralmente melhora nossa capacidade de ver detalhes de objetos pequenos, mas a
ampliação por si só não é suficiente para criar as imagens mais úteis. Muitas vezes, é útil aprimorar a resolução de
objetos: a capacidade de dizer que dois pontos ou objetos separados são separados. Uma imagem de baixa
resolução parece embaçada, enquanto uma imagem de alta resolução parece nítida. Dois fatores afetam a
resolução. O primeiro é o comprimento de onda. Comprimentos de onda mais curtos são capazes de resolver
objetos menores; assim, um microscópio eletrônico tem uma resolução muito mais alta que um microscópio de luz,
uma vez que utiliza um feixe de elétrons com um comprimento de onda muito curto, em oposição à luz visível de
comprimentos longos. O segundo fator que afeta a resolução é a abertura numérica, que é uma medida da
capacidade de uma lente para captar luz. Quanto maior a abertura numérica, melhor a resolução.

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Mesmo quando um microscópio tem alta resolução, pode ser difícil distinguir pequenas estruturas em
muitas amostras porque os microrganismos são relativamente transparentes. Muitas vezes é necessário aumentar
o contraste para detectar diferentes estruturas em uma amostra. Vários tipos de microscópios usam recursos
diferentes de luz ou elétrons para aumentar o contraste da imagem.
Muitos tipos de microscópios se enquadram na categoria de microscópios de luz, pois utilizam a luz para
formar imagens. Exemplos de microscópios de luz incluem microscópios de campo claro, microscópios de campo
escuro, microscópios de contraste de fase, microscópios de contraste de interferência diferencial, microscópios de
fluorescência, microscópios a laser de varredura confocal e microscópios de dois fótons. Esses vários tipos de
microscópios de luz podem ser usados para se complementarem em diagnósticos e pesquisas.

Microscópio de campo claro. Este talvez seja o tipo de microscópio mais usado, é um microscópio
composto com duas ou mais lentes que produzem uma imagem escura em um fundo brilhante. Alguns
microscópios de campo claro são monoculares (com uma única ocular), embora a maioria dos microscópios de
campo claro sejam binoculares (com duas oculares). As lentes oculares normalmente ampliam as imagens 10
vezes (10×). Na outra extremidade do tubo do corpo, há um conjunto de lentes objetivas em um disco rotativo. A
ampliação dessas lentes objetivas varia tipicamente de 4 a 100x, com a ampliação para cada lente designada no
invólucro metálico da lente. As lentes ocular e objetiva trabalham juntas para criar uma imagem ampliada. A
ampliação total é o produto da ampliação ocular multiplicada pela ampliação objetiva. Por exemplo, se uma lente
objetiva de 40x for selecionada e a lente ocular for de 10x, a ampliação total será 40 x 10 = 400x.

Microscópio de campo escuro. É um microscópio de campo claro que possui uma modificação pequena,
mas significativa, no condensador. Um pequeno disco opaco (com cerca de 1cm de diâmetro) é colocado entre o
iluminador e a lente do condensador. Essa parada opaca da luz, como é chamado o disco, bloqueia a maior parte
da luz do iluminador, que passa pelo condensador a caminho da lente objetiva, produzindo um cone de luz oco
que é focado na amostra. A única luz que atinge a objetiva é a luz que foi refratada ou refletida por estruturas na
amostra. A imagem resultante normalmente mostra objetos brilhantes em um fundo escuro.
A microscopia de campo escuro geralmente pode criar imagens de alto contraste e alta resolução de
amostras sem o uso de coloração, o que é particularmente útil para visualizar amostras vivas que podem ser
mortas ou comprometidas pelos corantes. Por exemplo, espiroquetas finas como Treponema pallidum, o agente
causador da sífilis, podem ser melhor visualizadas usando um microscópio de campo escuro.

Microscópio de contraste de fase. Usa a refração e interferência causadas por estruturas em uma
amostra para criar imagens de alto contraste e alta resolução sem coloração. É o tipo de microscópio mais antigo e
mais simples que cria uma imagem alterando os comprimentos de onda dos raios de luz que passam através da
amostra. Para criar caminhos de comprimento de onda alterados, uma parada anular é usada no condensador. A
parada anular produz um cone de luz oco que é focado na amostra antes de atingir a lente objetiva. A objetiva
contém uma placa de fase contendo um anel de fase. Como resultado, a luz que viaja diretamente do iluminador
passa pelo anel de fase, enquanto a luz refratada ou refletida pela amostra passa pela placa. Isso faz com que as
ondas que viajam pelo anel tenham cerca de metade do comprimento de onda fora de fase com as que passam
pela placa.
Como as ondas têm cristas e vales, elas podem se juntar (se estiverem em fase juntas) ou cancelar uma à
outra (se estiverem fora de fase). Quando os comprimentos de onda estão fora de fase, os vales das ondas
cancelam as cristas das ondas, chamados de interferência destrutiva. Estruturas que refratam a luz aparecem
escuras contra um fundo brilhante. Como aumenta o contraste sem a necessidade de coloração, a microscopia de
contraste de fase é frequentemente usada para observar amostras vivas. Certas estruturas, como organelas em
células eucarióticas e endósporos em células procarióticas, são especialmente bem visualizadas com microscopia
de contraste de fase.

Microscópio de contraste por interferência diferencial ou interferência de Nomarski (DIC). São

semelhantes aos microscópios de contraste de fase, pois usam padrões de interferência para aprimorar o contraste
entre os diferentes recursos de uma amostra. Em um microscópio DIC, dois feixes de luz são criados nos quais a
direção do movimento das ondas (polarização) difere. Depois que os feixes passam pelo espécime ou pelo espaço
livre, eles são recombinados e os efeitos dos espécimes causam diferenças nos padrões de interferência gerados
pela combinação dos feixes. Isso resulta em imagens de alto contraste de organismos vivos com uma aparência
tridimensional. Esses microscópios são especialmente úteis na distinção de estruturas em amostras vivas e não
coradas.

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Microscópio de fluorescência. Usa cromóforos fluorescentes chamados fluorocromos, que são capazes
de absorver energia de uma fonte de luz e depois emitir essa energia como luz visível. Os fluorocromos incluem
substâncias naturalmente fluorescentes (como clorofilas), bem como corantes fluorescentes adicionadas à amostra
para criar contraste. Corantes como o vermelho do Texas e o FITC (Isotiocianato de fluoresceína) são exemplos de
fluorocromos. Outros exemplos incluem os corantes de ácidos nucleicos DAPI (4',6'-diamino-2-fenil-indol) e laranja
de acridina.
O microscópio transmite uma luz de excitação, geralmente uma forma de radiação eletromagnética (EMR)
com um comprimento de onda curto, como luz ultravioleta ou azul, em direção à amostra; os cromóforos
absorvem a luz de excitação e emitem luz visível com comprimentos de onda mais longos. A luz de excitação é
então filtrada (em parte porque a luz ultravioleta é prejudicial aos olhos), de modo que somente a luz visível passa
através da lente ocular. Isso produz uma imagem da amostra em cores brilhantes contra um fundo escuro.
Microscópios de fluorescência são especialmente úteis em microbiologia clínica. Eles podem ser usados
para identificar patógenos, para encontrar microrganismos específicos em um ambiente ou para localizar os locais
de moléculas e estruturas específicas dentro de uma célula. Também foram desenvolvidas abordagens para
distinguir células vivas de células mortas usando microscopia de fluorescência, com base no fato de elas reagiram
com fluorocromos específicos. Às vezes, vários fluorocromos são usados na mesma amostra para mostrar
estruturas ou características diferentes.
Uma das aplicações mais importantes da microscopia de fluorescência é uma técnica chamada
imunofluorescência, usada para identificar certos micróbios causadores de doenças, observando se os anticorpos
se ligam a eles. Os anticorpos são moléculas de proteína produzidas pelo sistema imunológico que se ligam a
patógenos específicos para matá-los ou inibi-los. Existem duas abordagens para essa técnica: ensaio de
imunofluorescência direta (IFD) e ensaio de imunofluorescência indireta (IFI).
No IFD, anticorpos específicos (por exemplo, aqueles que são direcionados ao vírus da raiva) são corados
com um fluorocromo. Se a amostra contiver o patógeno alvo, pode-se observar os anticorpos que se ligam ao
patógeno sob o microscópio fluorescente. Na IFI, os anticorpos secundários são corados com um fluorocromo em
vez de anticorpos primários. Os anticorpos secundários não se ligam diretamente ao patógeno, mas se ligam a
anticorpos primários. Quando os anticorpos primários não corados se ligam ao patógeno, os anticorpos
secundários fluorescentes podem ser observados ligando-se aos anticorpos primários. Assim, os anticorpos
secundários são ligados indiretamente ao patógeno. Como vários anticorpos secundários podem frequentemente
se conectar a um anticorpo primário, a IFI aumenta o número de anticorpos fluorescentes conectados à amostra,
facilitando a visualização.

Microscopia de polarização. O microscópio de polarização é uma modificação simples do microscópio

de luz, no qual um filtro polarizante (o polarizador) está localizado entre a fonte de luz e o objeto, e um segundo
polarizador (o analisador) está localizado entre a lente objetiva e a ocular. Esses filtros modificam a luz e são
eficientes na análise de materiais birrefringentes (que produzem dupla refração). Inicialmente foi usado para
estudo de minerais, porém hoje também é usado na biologia. A técnica explora as propriedades ópticas para
revelar informações detalhadas sobre a estrutura e composição dos materiais. É muito utilizado para estudos de
petrografia e mineralogia. Em materiais biológicos usa-se para o estudo de paredes celulares, moléculas de DNA,
colágeno, detecção de substâncias minerais em tecidos diferentes, entre outros.

Microscópio confocal. Enquanto outras formas de microscopia de luz criam uma imagem que é focada
ao máximo a uma única distância do observador (profundidade ou plano z), um microscópio confocal usa um laser
para digitalizar vários planos z sucessivamente. Isso produz inúmeras imagens bidimensionais e de alta resolução
em várias profundidades, que podem ser construídas em uma imagem tridimensional por um computador. Como
nos microscópios de fluorescência, os corantes fluorescentes são geralmente usados para aumentar o contraste e
a resolução. A nitidez da imagem é aprimorada ainda mais por uma abertura estreita que elimina qualquer luz que
não seja do plano z. Microscópios confocais são, portanto, muito úteis para examinar amostras espessas, como
biofilmes, que podem ser examinados vivos e não fixados.

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MICROSCÓPIOS ELETRÔNICOS
A resolução teórica máxima de imagens criadas por microscópios de luz é finalmente limitada pelos
comprimentos de onda da luz visível. A maioria dos microscópios de luz pode ampliar apenas 1000x e alguns
podem ampliar até 1500x, mas isso não começa a se aproximar da potência de ampliação de um microscópio
eletrônico (ME), que usa feixes de elétrons de comprimento de onda curto em vez de luz para aumentar a
ampliação e resolução.
Os elétrons, como a radiação eletromagnética, podem se comportar como ondas, mas com comprimentos
de onda de 0,005nm. Eles, portanto, podem produzir uma resolução muito melhor do que a luz visível. Um ME
pode produzir uma imagem nítida que é ampliada até 100.000x. Assim, os MEs podem resolver estruturas
subcelulares, bem como algumas estruturas moleculares (por exemplo, cadeias únicas de DNA); no entanto, a
microscopia eletrônica não pode ser usada em material vivo devido aos métodos necessários para preparar as
amostras. Existem dois tipos básicos de ME: o microscópio eletrônico de transmissão (MET) e o microscópio
eletrônico de varredura (MEV).

O MET é um pouco análogo ao microscópio de luz de campo claro em termos de funcionamento. No

entanto, ele usa um feixe de elétrons acima da amostra que é focada usando uma lente magnética (em vez de
uma lente de vidro) e projetada através da amostra em um detector. Os elétrons passam pela amostra e, em
seguida, o detector captura a imagem. Para que os elétrons passem através da amostra em um MET, a amostra
deve ser extremamente fina (20 a 100nm de espessura). A imagem é produzida devido à variada opacidade em
várias partes da amostra. Essa opacidade pode ser aumentada impregnando a amostra com materiais como metais
pesados, que são densos em elétrons. O MET exige que o feixe e a amostra estejam no vácuo e que a amostra
seja muito fina e desidratada.

MEVs formam imagens de superfícies de amostras, geralmente a partir de elétrons que são arrancados
das amostras por um feixe de elétrons. Isso pode criar imagens altamente detalhadas com uma aparência
tridimensional exibida em um monitor. Normalmente, as amostras são secas e preparadas com fixadores que
reduzem artefatos, como o encolhimento, que podem ser produzidos por secagem, antes de serem revestidos com
uma camada fina de metal, como o ouro. Enquanto a microscopia eletrônica de transmissão requer seções muito
finas e permite ver estruturas internas como organelas e o interior das membranas, a microscopia eletrônica de
varredura pode ser usada para visualizar as superfícies de objetos maiores (como um grão de pólen), bem como as
superfícies de amostras muito pequenas. Alguns MEs podem ampliar uma imagem até 2.000.000x.

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MICROSCÓPIOS DE VARREDURA POR SONDA

Um microscópio de varredura por sonda não usa luz ou elétrons, mas sim sondas muito afiadas que são
passadas sobre a superfície da amostra e interagem diretamente com ela. Isso produz informações que podem ser
montadas em imagens com ampliações de até 100.000.000x. Ampliações tão grandes podem ser usadas para
observar átomos individuais em superfícies. Até o momento, essas técnicas foram usadas principalmente para
pesquisa e não para diagnóstico. Existem dois tipos de microscópio de varredura por sonda: o microscópio de
varredura por tunelamento (MVT) e o microscópio de força atômica (MFA).

O MVT usa uma sonda que é passada logo acima da amostra, pois um viés de tensão constante cria o
potencial para uma corrente elétrica entre a sonda e a amostra. Essa corrente ocorre via tunelamento quântico de
elétrons entre a sonda e a amostra, e a intensidade da corrente depende da distância entre a sonda e a amostra. A
sonda é movida horizontalmente acima da superfície e a intensidade da corrente é medida. A microscopia de
varredura por tunelamento pode efetivamente mapear a estrutura das superfícies em uma resolução na qual
átomos individuais podem ser detectados.

O MFA tem uma sonda fina que é passada logo acima da amostra. No entanto, em vez de medir variações
na corrente a uma altura constante acima da amostra, um MFA estabelece uma corrente constante e mede
variações na altura da ponta da sonda à medida que passa sobre a amostra. À medida que a ponta da sonda passa
sobre a amostra, forças entre os átomos (forças de van der Waals, forças capilares, ligação química, forças
eletrostáticas e outras) fazem com que ela se mova para cima e para baixo. A deflexão da ponta da sonda é
determinada e medida usando a lei da elasticidade de Hooke, e essas informações são usadas para construir
imagens da superfície da amostra com resolução no nível atômico.

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ESCALA MICROSCÓPICA
Escala microscópica é a escala de objetos e fenômenos menores do que aqueles que conseguem ser
observados a olho nu, pelo que a sua observação só consegue ser feita através de lentes ao microscópio. As
unidades de medidas mais utilizadas em microscopia biológica são o micrômetro e o nanômetro.

O micrômetro (do grego μικρό + μέτρον) é uma unidade de comprimento do Sistema Internacional de
Unidades (SI) de símbolo μm, definido como 1 milionésimo de metro (1x10 -6m) e equivalente à milésima parte do
milímetro (1mm/1.000).
O termo "mícron", de símbolo µ (plural: micra), utilizado entre 1879 e 1967, foi oficialmente retirado pelo
Bureau Internacional de Pesos e Medidas (BIPM) a partir de 1968, passando o símbolo µ a designar
exclusivamente o prefixo micro (que significa 1x10-6) das unidades do Sistema Internacional de Unidades. Portanto
o uso da antiga denominação mícron, embora ainda se mantenha, especialmente entre os anglófonos, é
desaconselhado, assim como é incorreto usar isoladamente a letra grega µ para se referir ao micrometro.

O nanômetro, (do grego νάνος + μέτρον) antes conhecido como milimícron, é também uma unidade de
medida de comprimento do sistema métrico, correspondente a 1 bilionésimo de metro (1x10−9m) e equivalente à
milionésima parte do milímetro (1mm/1.000.000). Tem como símbolo o nm.
Trata-se de uma unidade do Sistema Internacional frequentemente usada para a medição de
comprimentos de onda da luz visível (400nm a 700nm), da radiação ultravioleta, da radiação infravermelha, da
radiação gama e de estruturas submicroscópicas. Também é utilizado para expressar dimensões em escala
atômica: o diâmetro de um átomo de hélio, por exemplo, é cerca de 0,1nm e o diâmetro de um ribossomo é
aproximadamente 20nm. Quando usado como prefixo numa palavra que não seja unidade de medida (como em
"nanociência"), nano se refere à nanotecnologia ou a fenômenos que ocorram numa escala nanoscópica.

Relembrando as potências de base 10. Quando positivas, indicam o número de zeros da grandeza e
quando negativas, indicam o número de dígitos, após a vírgula, sendo 100 = 1. Assim, temos:

101 = 10 10-1 = 0,1

102 = 100 10-2 = 0,01
103 = 1.000 10-3 = 0,001
104 = 10.000 10-4 = 0,0001
105 = 100.000 10-5 = 0,00001
106 = 1.000.000 10-6 = 0,000001
107 = 10.000.000 10-7 = 0,0000001
108 = 100.000.000 10-8 = 0,00000001
109 = 1.000.000.000 10-9 = 0,000000001
1010 = 10.000.000.000 10-10 = 0,0000000001

Em relação a escala microscópica, temos as seguintes proporções:

cm mm µm nm
1 10 10.000 10.000.000
0,1 1 1.000 1.000.000
0,0001 0,001 1 1.000
0,0000001 0,000001 0,001 1

ou

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cm mm µm nm
100 101 104 107
10-1 100 103 106
10-4 10-3 100 103
10-7 10-6 10-3 100

A partir dessas proporções, podemos estabelecer as seguintes relações:

1cm = 10mm 100cm = 101mm

1cm = 10.000µm ou 100cm = 104µm
1cm = 10.000.000nm 100cm = 107nm

1mm = 1.000µm 100mm = 103µm

ou
1mm = 1.000.000nm 100mm = 106nm

Exercício 1: 0,5cm equivale a quantos micrômetros?

Sabendo-se que 1cm = 10.000µm, então, 0,5cm está para X µm.

1cm = 10.000µm
0,5 cm = X µm

1X = 0,5 x 10.000  1X = 5.000  X = 5.000/1  X = 5.000µm.

Exercício 2: 4.125nm equivalem a quantos milímetros?

Sabendo-se que 1mm = 1.000.000nm, então, 4.125nm está para X mm.

1mm = 1.000.000nm
X mm = 4.125nm

1.000.000X = 1 x 4.125  1.000.000X = 4.125  x = 4.125/1.000.000  x = 0,004125mm.

Exercício 3: Uma célula ampliada 400x revelou um comprimento de 1,5cm. Qual o comprimento real
dessa célula em micrômetros?
Dividindo-se o comprimento ampliado pela ampliação, temos: 1,5cm/400 = 0,00375cm.
Sabendo-se que 1cm = 10.000µm, então, 0,00375cm está para X µm.

1cm = 10.000µm
0,00375 cm = X µm

1X = 0,00375 x 10.000  1X = 37,5  X = 37,5/1  X = 37,5µm.

Exercício 4: Uma estrutura subcelular mede 15µm de comprimento. Quantos milímetros ela
apresentará se for ampliada 100x?
Multiplicando-se o comprimento real pela ampliação, temos: 15µm x 100 = 1.500µm.
Sabendo-se que 1mm = 1.000µm, então, 1.500µm está para X mm.

1mm = 1.000µm
X mm = 1.500µm

1.000X = 1 x 1.500  1.000X = 1.500  x = 1.500/1.000  x = 1,5mm.

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