Microscópio óptico

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Microscópio óptico. 1-Ocular; 2-Revólver; 3-Objectiva; 4-Parafuso macrométrico; 5-Parafuso

micrométrico; 6-Platina; 7-Espelho; 8-Condensador

O microscópio óptico é um instrumento usado para ampliar e regular, com uma série de
lentes multicoloridas e ultravioleta, capazes de enxergar através da luz, estruturas
pequenas e grandes, impossíveis de visualizar a olho nu.

É constituído por uma parte mecânica que suporta e permite controlar e por uma parte
óptica que amplia as imagens.

Índice
[esconder]

 1 Estrutura do instrumento
 2 Operação
 3 Microscopia de fundo escuro
 4 Microscopia de fluorescência
 5 Microscopia de contraste de fase

Estrutura do instrumento[editar | editar código-fonte]

Composição mecânica de um microscópio óptico
Parte Imagem Descrição

Serve de apoio às restantes componentes do microscópio.E

Pé ou base
sustentar o microscópio em si.

Coluna ou
Fixo à base, serve de suporte aos outros elementos.
Braço

Onde se fixa a lâmina a ser observada, possui uma janela por

Mesa ou
onde passam os raios luminosos e também parafusos dentados
Platina
que permitem deslocar a preparação.

Peça ligada à platina que possibilita mover a lâmina, permitindo

Charriot
a melhor centralização da mesma.

Tubo ou
Suporta a lente ocular na extremidade superior.
canhão

Revólver ou
Peça giratória que sustenta as objetivas.
Óptico

Composição óptica de um microscópio óptico

Parte Imagem Descrição
Conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e
Condensador espalham regularmente a luz emitida pela fonte luminosa
sobre o campo de visão do microscópio.
Diafragma É constituído por palhetas que podem ser aproximadas ou
 afastadas do centro através de uma alavanca ou parafuso,
permitindo regular a intensidade da luz que incide no campo
de visão do microscópio.
Permitem ampliar a imagem do objecto 10x, 40x, 50x, 90x ou
100x. Existem:

1.
o As objectivas de 10x, 40x e 50x são designadas
objectivas secas pois entre a preparação e a
Lentes objectiva existe somente ar.
Objectivas o As objectivas de imersão, uma vez que, para
as utilizar, é necessário colocar uma gota de
óleo de imersão entre elas e a preparação, o
qual, por ter um índice de refracção
semelhante ao do vidro, evita o desvio do
feixe luminoso para fora da objectiva.

Sistema de lentes que permitem ampliar a imagem real

fornecida pela objectiva, formando uma imagem virtual que se
Lentes situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do observador. As
Oculares' oculares mais utilizadas são as de ampliação 10x, mas nos
microscópios binoculares também existem oculares de 12,5,
8x e 6x.
Esquema do microscópio óptico.

Operação[editar | editar código-fonte]

Microscópio de 1751

A intensidade luminosa é regulável: aumenta-se a intensidade luminosa sobindo-se o

condensador e abre-se o diafragma ou diminui-se a intensidade luminosa descendo o
condensador e baixa-se o diafragma.

A ampliação consiste no grau de aumento da imagem em relação ao objeto. A

ampliação total obtida com o microscópio óptico consiste no produto da ampliação da
objetiva pela ampliação da ocular. Esta, sem distorção, não ultrapassa as 1200x.

O fator mais significativo para a obtenção de uma boa imagem é, contudo, o poder de
resolução, que corresponde à distância mínima que é necessário existir entre dois pontos
para que possam ser distinguidos ao microscópio. Para o microscópio óptico essa
distância é de 0,2 µm devido ao comprimento de onda das radiações visíveis. Com
efeito, a propriedade da ampliação só tem interesse prático se for acompanhada de um
aumento do poder de resolução.

No que respeita a microscopia óptica vulgar existem dois métodos fundamentais de

observação, de acordo com o tipo de preparação a observar:

 Se a lâmina não está corada (exame a fresco): a observação é feita com objetivas
secas, do seguinte modo:
1. Desce-se o condensador e sobe-se o diafragma para que a iluminação não seja
muito intensa, já que as lâminas não estão coradas.
 2. Com a objetiva de 10x escolhe-se o pormenor a observar.
3. Seguidamente foca-se com a objetiva de 40x, fazendo uma primeira
aproximação da objetiva à lâmina por controlo visual externo, e só depois a
focagem por afastamento usando o parafuso macrométrico e posteriormente
o micrométrico para focagem final.
 Se a lâmina está corada: a observação é feita com objetivas de imersão, procedendo
do seguinte modo.
1. Sobe-se o condensador, abre-se o diafragma e regula-se a iluminação da fonte
luminosa no máximo, de modo a conseguir-se uma iluminação intensa,
apropriada à observação de lâmina coradas.
2. Coloca-se na lâmina uma gota de óleo de imersão e procede-se à focagem.
Primeiro aproximando a objectiva à lâmina com controlo visual externo,
seguidamente a focagem propriamente dita com o parafuso macrométrico e
finalmente o aperfeiçoamento da focagem com o parafuso micrométrico.

Alguns microorganismos estão no limiar do poder de resolução do microscópio óptico.

A sua observação pode ser facilitada com o emprego de técnicas especiais de
microscopia óptica.

Microscopia de fundo escuro[editar | editar código-

fonte]
É uma aplicação do princípio de Tyndall. Assim os corpúsculos a examinar são
fortemente iluminados por feixes luminosos que penetram lateralmente, o que é
conseguido com condensadores especiais. Deste modo, a única luz que penetra na
objectiva é a difractada pelas partículas presentes na preparação, pelo que passam a ser
visíveis em fundo escuro também.

Microscopia de fluorescência[editar | editar código-

fonte]
Permite observar microorganismos capazes de fixar substâncias fluorescentes
(fluorocromos). A luz UV, ao incidir nessas partículas, provoca a emissão de luz visível
e observa-se os microorganismos a brilhar em fundo escuro. Como exemplo, o bacilo da
tuberculose fixa a auramina, pelo que o diagnóstico da doença pode ser feito por
microscopia de fluorescência.

Microscopia de contraste de fase[editar | editar código-

fonte]
Permite visualização de microrganismos vivos, sem coloração, através do contraste
devido à diferença de fase dos raios luminosos que atravessam o fundo relativamente à
fase da luz que atravessa os microrganismos. Esta diferença de fase é conseguida por
utilização de uma objectiva de fase, que consiste num disco de vidro com um escavação
circular, de modo que a luz que atravessa a escavação tem diferença de 1/4 de fase em
relação à que travessa a outra porção do vidro. Assim, os objectos não corados podem
funcionar como verdadeiras redes de difracção, pois os pormenores da sua estrutura
resultam de pequenas diferenças nos índices de refracção dos componentes celulares, e
estes originam diferenças de fase nas radiações que os atravessam.

Categorias:

 Microscópios
 Instrumentos ópticos

Lupa
A lupa é um instrumento óptico de uma lente convergente, de distância focal pequena e
grande convergência. Podendo ser chamada de microscópio simples ela é utilizada para
ampliar imagens, de tal modo que consigamos ver os mínimos detalhes da imagem. Pelo
fato da lente ser convergente a imagem formada será virtual.

Para que ocorra a ampliação da imagem, e esta seja direita, é necessário que o objeto
esteja entre o foco objeto e a lente.

É possível determinar a o aumento produzido pela lupa através da expressão:

Al = d0C
Onde,

d0 é a distância mínima de visão distinta;

C é a convergência da lupa.

Microscópio composto
O microscópio composto ou simplesmente microscópio é um sistema de duas lentes
convergentes, seria a mesma coisa que uma lupa associada a uma lente convergente.

Ele é muito utilizado para ampliar imagens que não são vistas a olho nu.

O microscópio é composto de duas lentes convergentes onde uma lente é chamada de

lente objetiva, que é fortemente convergente e possui pequena distância focal (foc), esta
lente produz uma imagem real e invertida e fica voltada ao objeto, a outra lente é
chamada de lente ocular, que é menos convergente que a objetiva e também possui
pequena distância focal (fob), ela é localizada no foco objeto e é ela que produz a
imagem final.

Essas lentes ficam em extremidades opostas dentro de um tubo de comprimento L,

chamado de canhão.

É possível determinar o aumento produzido pelo microscópio composto através da

expressão:

Am = d0L / focfob

MICROSCOPIA

Microscópio Óptico (M.O.) - Partes

Mecânica

1. pé
2. braço
3. tubo ou canhão
4. revólver
5. platina
6. charriot
7. parafusos para ajuste macro e/ou micrométrico do foco
Óptica

Sistema de aumento:
- oculares
- objetivas

Sistema de iluminação:
- espelho
- condensador
- diafragma
- filtro

Observações:

1. A imagem proporcionada pelo M.O. é aumentada, virtual e invertida em

relação ao objeto examinado.
2. Calcula-se o aumento da imagem obtida ao M.O. multiplicando-se o valor
do aumento da ocular pelo valor do aumento da objetiva.
3. Campo microscópico é a área da preparação que se está observando ao
M.O. Quanto maior o aumento da imagem, menor é a abrangência do campo.
4. Em virtude do último item, sempre se inicia a observação ao M.O. com
uma combinação de lentes que proporcione o menor aumento, a fim de se ter
uma visão panorâmica da região que se quer observar com maior aumento.

MANEJO DO MICROSCÓPIO

1. Acender a lâmpada do sistema de iluminação.

2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador -
diafragma na posição mais elevada, pois é aquela que permite melhor
iluminação.
3. Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de menor
aumento (4X).
4. Tomar a lâmina com a lamínula para cima e colocá-la na platina,
prendendo-a com os grampos.
5. Movimentar o charriot, fazendo com que o preparado fique em baixo da
objetiva.
6. Com o parafuso macrométrico, elevar a platina ao máximo, observando
que a objetiva não toque na lamínula, pois poderá quebrá-la.
7. Focalizar a preparação para a obtenção de uma imagem nítida,
movimentando o parafuso macrométrico e abaixando a platina até que se
possa visualizar a imagem.
8. Aperfeiçoar o foco com o parafuso micrométrico.
9. Colocar a região do preparado que se quer ver com maior aumento bem no
centro do campo visual da lente.
10. Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de 10X (aumento
médio).
11. Repetir o procedimento do item 6.
12. Para focalizar a nova imagem, repetir o procedimento do item 7.
13. Repetir o item 8.
14. Repetir o item 9.
15. Colocar a objetiva de 40X (maior aumento) em posição e repetir os itens
6, 7 e 8.
16. A objetiva de 100X é chamada de imersão e seu uso será explicado
posteriormente.

OBSERVAÇÕES:

1. A maior parte de nossos microscópios possuem lentes parafocais. Isto

significa que, uma vez obtido o foco com a objetiva de menor aumento,
basta girar o revólver, colocar a objetiva 10X em posição e acertar o foco
apenas com o parafuso micrométrico.
2. Age-se da mesma forma, ao focalizar a objetiva 40X, desde que a imagem
esteja em foco com a objetiva 10X.
3. A objetiva de 100X é chamada “de imersão” e seu uso será explicado
oportunamente.
4. O aluno deverá repetir várias vezes as operações descritas no “manejo do
microscópio”, a fim de atingir maior desenvoltura no manuseio do
microscópio óptico.
TÉCNICA PARA OBTENÇÃO DE LÂMINAS
(preparados histológicos permanentes)
Sob este título, estudaremos os passos para a obtenção de um preparado
histológico permanente, denominado lâmina, que serão descritos a seguir:

1. Colheita do material - é a obtenção da peça, por biópsia ou necropsia.

2. Fixação - o tratamento assim denominado visa impedir a destruição das

células por suas próprias enzimas (autólise), ou bactérias.
Este tratamento é feito imediatamente após a retirada do material
(biópsia), ou até antes (fixação por perfusão do animal). A fixação visa ainda
endurecer os tecidos, tornando-os mais resistentes e favoráveis às etapas
subsequentes da técnica histológica.
Resumindo, pode-se dizer que a fixação é o tratamento da peça histológica a
fim de que possamos observar ao microscópio os componentes teciduais,
com a morfologia e a composição química semelhantes às existentes no ser
vivo.
A fixação pode ser feita por processos físicos ou químicos. A fixação
química, mais usada em Histologia, é feita por fixadores que podem ser
simples ou compostos. Como exemplo de fixador simples temos o formol e,
de composto, citamos o líquido de Bouin (uma mistura de formol, ácido
pícrico e ácido acético).

3. Desidratação - visa retirar a água dos tecidos, a fim de permitir a

impregnação da peça com parafina. Para isto, a peça é submetida a banhos
sucessivos em álcoois de teor crescente (ex.: álcool a 70%, 80%, 90% e
100%).

4. Diafanização - visa impregnar a peça com um solvente de parafina. O

mais usado é o xilol.

5. Impregnação pela parafina fundida - tem a finalidade de permitir a

obtenção de cortes suficientemente finos para serem observados ao
microscópio. Para isso os tecidos devem ser submetidos a banhos de
parafina a 60°C, no interior da estufa. Em estado líquido, a parafina penetra
nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza.

6. Inclusão - é a passagem da peça que estava na estufa para um recipiente

retangular (forma) contendo parafina fundida que, depois de solidificada à
temperatura ambiente, dá origem ao chamado “bloco de parafina”. A
inclusão pode também ser feita com celoidina, gelatina ou resorcina epóxi,
sendo estas últimas usadas para microscopia eletrônica.
7. Microtomia - é a etapa em que se obtém delgadas fatias de peças
incluídas na parafina, através de um aparelho chamado micrótomo, que
possui navalha de aço. A espessura dos cortes geralmente varia de 5 a 10 um
(micrômetros). (1 um = 0,001 mm)

8. Extensão - os cortes provenientes da microtomia são “enrugados”. Para

desfazer estas rugas, são esticados num banho de água e gelatina a 58°C, e
“pescados” com uma lâmina. Leva-se então, à estufa a 37°C, por 2 horas,
para que se dê a colagem do corte à lâmina, pela coagulação da gelatina
contida na água quente.

9. Coloração - tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos

tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros. Para realizá-la,
são observados 3 itens:
a) Eliminação da parafina - por meio de banhos sucessivos em xilol, benzol ou
toluol.
b) Hidratação - é executada quando o corante utilizado é solúvel em água.
Deve ser gradativa, com álcoois de teor decrescente, para evitar o
rompimento dos tecidos.
c) Coloração - os corantes são compostos químicos com determinados
radicais ácidos ou básicos que possuem cor, e apresentam afinidade de
combinação com estruturas básicas ou ácidas dos tecidos. Rotineiramente,
usa-se hematoxilina, corante básico, que se liga aos radicais ácidos dos
tecidos, e eosina, corante ácido que tem afinidade por radicais básicos dos
tecidos. Os componentes que se combinam com corantes ácidos são
chamados acidófilos e os componentes que se combinam com corantes
básicos são chamados basófilos. Por exemplo, os núcleos das células, onde
predominam substâncias ácidas (DNA), são basófilos, ou seja, coram-se pela
hematoxilina (corante básico de cor roxa); por sua vez, o citoplasma, onde
predominam substâncias básicas (proteínas estruturais), é acidófilo,
corando-se pela eosina (corante ácido de cor rosa).

10. Desidratação - visa retirar a água, quando os corantes utilizados forem

soluções aquosas, a fim de permitir perfeita visualização dos tecidos, pois a
água possui índice de refração diferente do vidro, e ainda prevenir a
difusão dos corantes. Para isto usam-se banhos em álcoois de teor
crescente.

11. Diafanização - a diafanização é feita com xilol, a fim de tornar os

cortes perfeitamente transparentes.
12. Montagem - é a etapa final da técnica histológica, e consiste na
colagem da lamínula sobre o corte, com bálsamo do Canadá, que é solúvel em
xilol e insolúvel em água. A lamínula impede que haja hidratação do corte
pela umidade do ar ambiente, permitindo então que estas lâminas se
mantenham estáveis por tempo indefinido. Após a montagem, levam-se as
lâminas à estufa, para secagem do bálsamo do Canadá.

Figura 1. Etapas da Técnica Histológica:

Figura 2. Diferentes planos de cortes histológicos:
Figura 3. Diferentes planos de cortes histológicos (continuação):