EFB-1. Microscopia-2022-Elearning

1.
Microscopia
1. Microscopia
1.1 Microscopia: radiação, ampliação, resolução
1.2 Microscopia ótica de campo claro e de campo escuro
1.3 Microscopia de contraste de fase
1.4 Microscopia de fluorescência
1.5 Microscopia confocal
1.6 Microscopia eletrónica
1.7 Microscopia de sonda de varrimento
Departamento Departamento José Carlos Lopes 1

Elementos de Física da Biosfera
de Física de Biologia 2022/23
1. Microscopia
Até onde a vista alcança?
Menor distância a que se consegue focar:

25 cm; resolução ~ 0,1 mm
Giancoli (2016)
Na prática, objetos com 0,04 mm de largura (a largura de um cabelo humano fino) são
distinguíveis apenas por bons olhos, objetos com 0,02 mm de largura não.

1
1. Microscopia
Até onde a vista alcança?
Giancoli (2016)
tan 𝜃 ≈ 𝜃 ≈ sin 𝜃
Isto significa grosso modo que se consegue ver os tracinhos dos milímetros
numa fita métrica colocada a 2m de distância.

1. Microscopia
Giancoli (2016)
2× – 6×
2
1. Microscopia
2× – 6×
Que significa isto?

Como se define ampliação (“magnification”)?

1. Microscopia
Se nada diferente for assinalado, tudo é extraído deste capítulo.

3
1. Microscopia
Girkin (2019)

1. Microscopia
Girkin (2019)

4
1. Microscopia
“best known for his pioneering work in the field

of microscopy and for his contributions toward
the establishment of microbiology as a scientific
discipline.”
(https://en.wikipedia.org/wiki/Antonie_van_Leeuwenhoek)
Antonie van Leeuwenhoek

(séc. XVII)

1. Microscopia
~ 200×, ~1 μm

10
5
1. Microscopia
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/koehler-illumination-a-brief-
history-and-a-practical-set-up-in-five-easy-steps/
Figure 1: The main components

of an upright microscope. The
Field diaphragm controls the
intensity of light from the source.
The condenser focusses the light
from the light source on the
specimen. The aperture
diaphragm controls the angle of
the illumination light cone.

11
1. Microscopia

12
6
1. Microscopia
Ampliação
Objetiva
Mais comuns: 4× (ou 5×), 10×, 20×, 40× (ou 50×) e 100×.
Ocular (amplia imagem intermédia)

Entre 5× e 30×
Mais comuns: 10× e 15×
Ampliação total = (ampliação da objetiva) × (ampliação da ocular)

Ex.: (100×) x (30×) = 3000×

13
1. Microscopia
Murphy & Davidson (2012)

14
7
1. Microscopia
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/specifications.html
15
1. Microscopia
https://www.edmundoptics.com.sg/knowledge-center/application-notes/microscopy/understanding-microscopes-and-objectives/

16
8
1. Microscopia
ABERRAÇÕES
Giancoli (2016)
17
1. Microscopia
A qualidade da imagem depende da

capacidade de a objetiva recolher informação sobre a amostra
— ou seja, a luz difratada pela amostra.

18
9
1. Microscopia
• Uma medida do número de raios de luz altamente difratados pela amostra que a objetiva
consegue recolher para formar a imagem.
• Valores mais altos de abertura numérica significam que raios cada vez mais oblíquos
entrem na objetiva, produzindo uma imagem com maior resolução.

19
1. Microscopia

20
10
1. Microscopia
𝐍𝐀 = 𝟎, 𝟐𝟓 𝐍𝐀 = 𝟎, 𝟓𝟎 𝐍𝐀 = 𝟎, 𝟗𝟓
≈ 10 × ≈ 40 × ≈ 100 ×
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/numaperture.html

21
1. Microscopia
Distância de trabalho de uma objetiva: distância

entre a superfície frontal da lente e a superfície da
lamela (se for usada) ou a amostra quando estiver
em foco nítido.

22
11
1. Microscopia
Quando a objetiva é movida para ficar

mais próxima da lâmina, o plano focal
move-se mais para dentro da amostra.
No entanto, isso é fisicamente limitado
pelo facto de que a objetiva só pode ser
movida até que esteja em contacto com
a tampa de vidro.
Ex.: 10x objective: WD ~ 4 mm,

100x oil: WD ~ 0,14 mm.
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/immersion-objectives-using-oil-glycerol-or-water-to-overcome-some-of-the-limits-of-
resolution/
A distância de trabalho não é necessariamente a mesma que a distância focal frontal. Mesmo que o objeto
seja colocado no foco de feixe de iluminação, esse foco não precisa de estar no plano focal da objetiva.

23
1. Microscopia
https://www.microscopyu.com/tutorials/workingdistance

24
12
1. Microscopia
Objetivas com grandes aberturas numéricas e grande resolução

têm curtas distâncias de trabalho.

25
1. Microscopia
“Typical immersion oils have a refractive index of 1.51 and a dispersion similar to that of glass coverslips. Therefore,
light rays passing through the specimen encounter a homogeneous medium between the coverslip and immersion
oil and are not refracted as they enter the lens, but only as they leave its upper surface.”

26
13
1. Microscopia
Abramowitz (2003), Fig. 12

27
1. Microscopia
> NA, > resolução, > brilho da imagem, < profundidade de campo

28
14
1. Microscopia

29
1. Microscopia
ABERTURA e DIFRAÇÃO
Adaptado da Fig. 36 de Abramowitz (2003)

30
15
1. Microscopia
ABERTURA e DIFRAÇÃO
Adaptado da Fig. 37 de Abramowitz (2003)

31
1. Microscopia
Girkin (2019)
Critério de Rayleigh: duas imagens são resolvíveis no limite em que o centro do

disco de difração de uma imagem está diretamente sobre o primeiro mínimo do
padrão de difração da outra.
32
16
1. Microscopia
Giancoli (2016), Fig. 25-30

1,22 𝜆
𝜃min =
𝐷

33
1. Microscopia
Para se determinar a distância 𝑠 entre dois pontos

Giancoli (2016),Adaptado de Fig. 25-31
que mal podem ser resolvidos, considera-se que a

amostra está colocada no foco da objetiva e,
portanto, o ângulo𝜑 subtendido por dois pontos é
𝜑 = 𝑠/𝑓.
Então 𝑠 = 𝑓𝜑 e a resolução da lente objetiva vem:
1,22 𝜆𝑓
𝑠= ,
𝐷
onde 𝑓 é a distância focal da lente objetiva e 𝐷 seu diâmetro. Daquela equação obtém-se uma
expressão que frequentemente se escreve assim (usando 𝑑 em vez de 𝑠):
0,61 𝜆
𝑑= .
𝑁𝐴

34
17
1. Microscopia
Usar o modelo da rede de difração: qual é a separação mínima entre duas fendas
para que entre na objetiva pelo menos a 1ª ordem de difração.
Abbe chegou à seguinte expressão para o limite de

resolução:
0,5 𝜆
𝑑=
𝑛 sin 𝜃
35
1. Microscopia
0,5 𝜆
𝑑=
𝑛 sin 𝜃
http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/phyopt/gratcal.html

36
18
1. Microscopia
0,5 𝜆
Limite de resolução de Abbe: 𝑑=
𝑛 sin 𝜃
𝜆 Τ2
𝑑= 𝑑 ≈ 𝜆 Τ2
𝑛 sin 𝜃
Abertura Numérica: NA = 𝑛 sin 𝜃
Equação de Abbe: 𝜆
𝑑=
2 NA
Quanto MENOR 𝑑, MAIOR a “potência resolvente” ou a resolução

37
1. Microscopia
O condensador é uma grande lente coletora de luz usada para

projetar um amplo cone de luz através da lamela, na lente objetiva.
A maioria dos microscópios tem um condensador com NA entre 1,2

e 1,4. No entanto, a NA do condensador não será muito superior a ~
0,9, a menos que a parte superior do condensador seja lubrificada
na parte inferior da lâmina.
Durante a operação de rotina do microscópio, o condensador

geralmente não é lubrificado e isso limita a resolução geral, mesmo
com uma objetiva imersa em óleo.
Embora a resolução do microscópio deva considerar tanto o

condensador quanto a lente objetiva, na maioria dos casos o limite
de resolução de um microscópio óptico é calculado pela equação de
Abbe, que considera apenas a lente objetiva.

38
19
1. Microscopia
A resolução de um microscópio deve ter em conta também a abertura numérica de seu

condensador:

39
1. Microscopia
Adaptado de https://en.wikipedia.org/wiki/Microscope

40
20
1. Microscopia
https://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy#Resolution_limits

41
1. Microscopia
1. Microscopia
1.1 Microscopia: ampliação, resolução e radiação
Departamento Eletricidade & Magnetismo José Carlos Lopes 42

de Física 2020/21
42
21
1. Microscopia
Na melhor das hipóteses, um

microscópio de campo claro
pode ampliar até 1000x e
distinguir entre dois pontos
separados por cerca de 0,2 μm
(o tamanho de uma bactéria
muito pequena).
Esta limitação é devida ao
comprimento de onda da luz,
não à qualidade das lentes.
Alberts et al. (2014), p. 10

43
1. Microscopia
Como criar contraste?
Aegerter (2018)

44
22
1. Microscopia
Microscópio de campo escuro
Aegerter (2018)

45
1. Microscopia
Aegerter (2018)

46
23
1. Microscopia
1. Microscopia

de Física 2020/21
47
1. Microscopia
1.3 Contraste de fase
https://en.wikipedia.org/wiki/Phase-contrast_microscopy
Microscopia de campo claro Microscopia de contraste de fase
Um microscópio de contraste de fase converte pequenas diferenças no índice de

refração e na densidade celular em variações na intensidade da luz.
É uma excelente maneira de observar células vivas.

48
24
1. Microscopia

49
1. Microscopia
Aegerter (2018)

50
25
1. Microscopia
Aegerter (2018)

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1. Microscopia
Aegerter (2018)

52
26
1. Microscopia
Princípio de funcionamento
Princípio básico para tornar visíveis os desvios de fase na microscopia de contraste de fase:
separar a luz de iluminação (fundo) da luz difundida pela amostra (que compõe os
detalhes do primeiro plano) e manipulá-las de maneira diferente.
Aegerter (2018)

53
1. Microscopia
Aegerter (2018)

54
27
1. Microscopia
A luz de iluminação em forma de anel que passa pelo anel do condensador é

focada na amostra pelo condensador. Parte da luz de iluminação é difundida pela
amostra. A luz restante não é afetada pela amostra e constitui a luz de fundo.
Aegerter (2018)

55
1. Microscopia
https://depts.washington.edu/cmditr/modules/lum/electromagnetic_radiation.html

56
28
1. Microscopia
Giancoli (2016)

57
1. Microscopia
Ao observar uma amostra biológica não corada, a luz difundida é fraca e

tipicamente desfasada em -90° (devido à espessura típica das amostras e à
diferença do índice de refração entre o tecido biológico e o meio circundante) em
relação à luz de fundo.
Giancoli (2016)
δ = (2π/λ)(OPD)
58
29
1. Microscopia

59
1. Microscopia
O que se explicou acima refere-se

ao contraste de fase positivo. Na
sua forma negativa, a luz de
fundo tem a fase desviada de -90°.
A luz de fundo estará assim em
fase com a luz difundida. A luz
difundida é então somada à luz de
fundo para formar uma imagem
com um primeiro plano mais claro
e um fundo mais escuro.
https://en.wikipedia.org/wiki/Phase-contrast_microscopy

60
30
1. Microscopia

61
1. Microscopia
Ctenoid Fish Scale
https://www.microscopyu.com/galleries/phase-contrast

62
31
1. Microscopia
Frog Blood Cells

63
1. Microscopia
Blue Mold (Peronospora tabacina) Fungus

64
32
1. Microscopia
1. Microscopia

de Física 2020/21
65
1. Microscopia
1.4 Fluorescência
Os microscópios até agora considerados produzem uma imagem a partir da luz que
atravessa uma amostra.
Um objeto também pode ser visto por emitir luz, e esta é a base da microscopia de
fluorescência.
Quando algumas moléculas absorvem energia radiante, elas ficam excitadas e mais tarde
libertam grande parte dessa energia emitindo luz.
A luz da fluorescência é emitida muito rapidamente pela molécula excitada.

66
33
1. Microscopia
1.4 Fluorescência
Qualquer luz emitida por uma molécula excitada terá um comprimento de onda maior (ou
seja, os fotões têm menor energia) do que a radiação originalmente absorvida.
? Porquê?

67
1. Microscopia
1.4 Fluorescência
O microscópio de fluorescência expõe uma amostra à luz ultravioleta, violeta ou azul, e forma
uma imagem do objeto com a luz fluorescente resultante.
A amostra geralmente é corada com moléculas de corantes especiais chamadas

fluorocromos. O fluorocromo absorve a energia luminosa da luz de excitação e emite
fluorescência brilhante.

68
34
1. Microscopia
1.4 Fluorescência

69
1. Microscopia
1.4 Fluorescência
Nordlung (2011)

70
35
1. Microscopia
1.4 Fluorescência
Nadeau (2018)

71
1. Microscopia
1.4 Fluorescência
(c) Fluorescent antibodies tag specific molecules.

(a) Dyes that cause live cells to fluoresce green
In this case, the antibody binds to a molecule that
and dead ones red
is unique to Streptococcus pyogenes

72
36
1. Microscopia
Lodish et al. (2016)

73
1. Microscopia

74
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1. Microscopia
1. Microscopia

de Física 2020/21
75
1. Microscopia
1.5 Confocal

76
38
1. Microscopia
1.5 Confocal

77
1. Microscopia
1.5 Confocal
Os espécimes biológicos são tridimensionais.
Objetos tridimensionais vistos com microscópios ópticos tradicionais, a luz que entra no
microscópio (e é usada para criar uma imagem) é proveniente de todas as áreas do objeto,
não apenas do plano de foco. A imagem resultante é turva e difusa.
O microscópio confocal usa um feixe de laser para iluminar uma amostra, geralmente
corada por fluorocromo.
Um componente importante do microscópio confocal é uma filtro espacial (anteparo com

abertura) colocada acima da lente objetiva, que elimina a luz difusa de partes da amostra que
estão acima e abaixo do plano de foco. A imagem formada é muito mais nítida.

78
39
1. Microscopia
1.5 Confocal

79
1. Microscopia
1.5 Confocal
Os computadores são essenciais para

o processo de criação de imagens
confocais.
As informações digitalizadas de cada

plano da amostra podem ser usadas
para criar uma imagem composta
muito nítida e detalhada, ou para criar
uma reconstrução tridimensional do
espécime.
A three-dimensional reconstruction of a Pseudomonas
aeruginosa biofilm.
The biofilm was exposed to an antibacterial agent and
then stained with dyes that distinguish living (green) from
dead (red) cells. The cells on the surface of the biofilm
have been killed, but those in the lower layers of the
biofilm are still alive.

80
40
1. Microscopia
1. Microscopia

de Física 2020/21
81
1. Microscopia

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1. Microscopia
1.6 Eletrónica

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1. Microscopia
1.6 Eletrónica

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42
1. Microscopia
1.6 Eletrónica

85
1. Microscopia
1.6 Eletrónica https://www.youtube.com/watch?v=a0G7iyz4McM

86
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1. Microscopia
1.6 Eletrónica https://www.youtube.com/watch?v=a0G7iyz4McM

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1. Microscopia
1. Microscopia

de Física 2020/21
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1. Microscopia

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1. Microscopia
1.7 Sonda de varrimento
~ 𝟏𝟎𝟖 ×, ~ 0,01 nm

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1. Microscopia
https://www.youtube.com/watch?v=HE2yE8SvHmA

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1. Microscopia
https://www.youtube.com/watch?v=8gCf1sEn0UU&t=3s

92
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1. Microscopia
Referências
Aegerter, C. M. (2018). Introductory Physics for Biological Scientists. Cambridge University Press.
Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A. D., Lewis, J., Raff, M., . . . Walter, P. (2014). Essential cell
biology (4th ed.). NY: Garland Science.
Giancoli, D. (2016). Physics Principles with Applications, Global Edition-Pearson Education Limited.
Girkin, J. (2019). A practical guide to optical microscopy. CRC Press.
Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C. A., Krieger, M., Bretscher, A., Ploegh, H., Amon, A., & Martin, K. C. (2016).
Molecular cell biology. W. H. Freeman..
Murphy, D. B., & Davidson M. W. (2012). Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (2nd
ed.). Wiley-Blackwell.
Nadeau, J. L. (2017). Introduction to experimental biophysics: biological methods for physical scientists.
CRC Press.
Nordlund, T. M., & Hoffmann, P. M. (2019). Quantitative understanding of biosystems: an introduction to

biophysics. CRC press.
Willey, J., Sherwood, L., Woolverton, C. P. (2008). Prescott, Harley, and Klein's Microbiology (7th ed.).
McGraw-Hill Science Engineering.

93
47

EFB-1. Microscopia-2022-Elearning

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1.2 Microscopia ótica de campo claro e de campo escuro

1.3 Microscopia de contraste de fase

1.4 Microscopia de fluorescência

1.5 Microscopia confocal

1.6 Microscopia eletrónica

1.7 Microscopia de sonda de varrimento

Departamento Departamento José Carlos Lopes 1

Até onde a vista alcança?

Menor distância a que se consegue focar:

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Figure 1: The main components

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Ocular (amplia imagem intermédia)

Ampliação total = (ampliação da objetiva) × (ampliação da ocular)

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A qualidade da imagem depende da

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Distância de trabalho de uma objetiva: distância

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Quando a objetiva é movida para ficar

Ex.: 10x objective: WD ~ 4 mm,

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Objetivas com grandes aberturas numéricas e grande resolução

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Abramowitz (2003), Fig. 12

Departamento Departamento José Carlos Lopes 27

Departamento Departamento José Carlos Lopes 28

Departamento Departamento José Carlos Lopes 29

Adaptado da Fig. 36 de Abramowitz (2003)

Departamento Departamento José Carlos Lopes 30

Adaptado da Fig. 37 de Abramowitz (2003)

Departamento Departamento José Carlos Lopes 31

Critério de Rayleigh: duas imagens são resolvíveis no limite em que o centro do

Giancoli (2016), Fig. 25-30

Departamento Departamento José Carlos Lopes 33

Para se determinar a distância 𝑠 entre dois pontos

que mal podem ser resolvidos, considera-se que a

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Abbe chegou à seguinte expressão para o limite de

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Abertura Numérica: NA = 𝑛 sin 𝜃

Quanto MENOR 𝑑, MAIOR a “potência resolvente” ou a resolução