Microscopia Eletrônica de

Transmissão (MET)
e
Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV)
Princípios Básicos, Aplicações e
Processamento Tecidual
Prof. Dr. Márcio Cajazeira Aguiar
Porque as imagens de MET e
MEV são variações de preto,
branco e cinza?

Como diferencio uma imagem

produzida por MET e daquela
produzida pela MEV?

O processamento histológico
para ME é similar àquele feito
para MO ?

Como posso aplicar a MET e a

MEV em um estudo
experimental?
Microscopia
Eletrônica
de
Transmissão
Princípios Básicos

Prof. Dr. Márcio Cajazeira Aguiar

 Contexto histórico

• Criação do microscópio composto no século 17

(Hans & Jansenn)

• Passagem de um feixe de elétrons através de um campo magnético

em 1924 (Busch)

• Construção do 1º MET em 1931, 17 X (Ruska & Knoll)

 Contexto histórico
Resolução

50 nm em 1932

3 nm em 1940

Resolução atual (?) de 0,14 nm Resolução possível é 1-2 nm

Analogia entre microscópios de luz e eletrônico
Diferenças

• Fonte de “luz”

• Tipo de lente

M. de luz MET
MET
• Tipo de imagem produzida
 Microscópio eletrônico de transmissão
Sistemas

• Sistema de vácuo
Elétrons param após colisões
Descarga elétrica por moléculas
carregadas após serem bombardeadas por
elétrons
Filamento torna-se oxidado

• Sistema elétrico
Entre - 20 kV e – 100 kV

• Coluna
 Coluna do microscópio
Componentes
• Tubo de metal

• Filamento de tungstênio

• Cátodo

• Placa do ânodo

• Lentes eletromagnéticas

• Placa fluorescente

• Filme fotográfico
Produção do feixe de elétrons
 Lentes eletromagnéticas

• Bobinas eletromagnéticas

• Campos eletromagnéticos

• Defletem elétrons
 Lentes eletromagnéticas
Focaliza feixe de
elétrons sobre a
amostra/ diminui
diâmetro do feixe
Platina ou molibdênio
com 200-300 µm de
diâmetro

Traz elétron para o foco

Determina a resolução

Ampliam a imagem

Amplia a imagem
Formação da imagem

Espécime

Porta espécime

Placa fluorescente
 Contraste da imagem
Fatores que influenciam

• Espessura e número atômico do espécime

• Velocidade do feixe de elétrons

Acetato de uranila
Citrato de chumbo
Microscopia
Eletrônica
de
Transmissão
Aplicações

Prof. Dr. Márcio Cajazeira Aguiar

 Aplicações
• Examinar em detalhe objetos dezenas de milhares
vezes menor do que o menor objeto reconhecível em
um microscópio ótico. Empregado na pesquisa do
câncer, virologia, ciência dos materiais e
nanotecnologia
 Aplicações na Odontologia

Estudo da mineralização (matriz de

osso com cristais de HA)

Estudo das organelas e da

morfologia dos osteoblastos e
osteócitos
 Aplicações na Odontologia

Estudos sobre reparo pulpar

(Odontoblastos)

Estudos de como as células se

relacionam (GAP e junção de
adesão)
Microscopia
Eletrônica
de
Transmissão
Processamento Tecidual

Prof. Dr. Márcio Cajazeira Aguiar

 Preparo de amostras para MET

• Fixação

• Desidratação

• Inclusão

• Contrastação
Microscopia
Eletrônica
de
Transmissão
Princípios Básicos

Prof. Dr. Márcio Cajazeira Aguiar

 Tipos de fixadores

• Fixação por métodos físicos

Criofixação

• Fixação química

Glutaraldeído

Paraformaldeído
 Fixação dos sistemas biológicos
Precauções

• Espécime pequenos (1-2 mm)

• Volume do fixador 10-15X maior que volume da amostra

Precaução no manuseio do fixador
 Desidratação
Objetivos
Bateria para M.L.
MET
• Remover traços de água

• Substituir água por líquido

miscível com meio de inclusão

• Impedir dano provocado por

alterações repentinas na
concentração do solvente
xx
• Acetona 100% é o última
solução da bateria.
Resina/ Acetona (proporção 1: 1 gotas) 1:30 horas
b) Resina/ Acetona (proporção 3: 1 gotas) 3:00 horas
c) Resina pura overnight
Inclusão
Objetivos

• Conferir consistência suficiente às amostras para serem

seccionadas em ultra-micrótomo

• Exemplo de Infiltração
Resina/ acetona (1:1)
Resina/ acetona (3:1)
Resina Pura
 Meio de inclusão
Epoxi (Spurr)
• Resinas Acrilato e matecrilato (Lowcryl)
Resina dimetacrilato Bisfenol A
B(LR White)

• Altas temperaturas no microscópio

Lowicryl
• Amostra com espessura inferior a 80nm

Spurr
LR white
 Inclusão

• Inclusão em moldes
de silicone ou em
cápsulas

• Identificação das amostras

 Trimagem
• Remove excesso de resina para expor superfície da amostra

• Face em forma de trapézio ou quadrado

 Microtomia
• Fator determinante na resolução é a
espessura do corte (60nm)
 Cortes semi-finos
Objetivos
• Identificar área de interesse

• Observar qualidade da fixação e inclusão

Cortes com 1 µm de espessura

Azul de toluidina
 Ultramicrotomia

• Etapa crítica do processamento

Correta execução das etapas anteriores

Bom equipamento

Navalha de boa qualidade

Perícia do operador
 Telas

• Cobre (morfologia)

• Níquel (imunocitoquímica)
 Contrastação

• Reação entre metais pesados e componentes celulares

• Acetato de uranila e citrato de chumbo

ERROS

uranila chumbo
Erros em MET
Interpretação de imagens em MET
Microscopia
Eletrônica
de Varredura
PRINCÍPIOS BÁSICOS

Prof. Dr. Márcio Cajazeira Aguiar

 Contexto histórico
• 1º imagem de varredura pela observação de um artefato de níquel
(Knoll, 1935)

• Resolução excede ao do microscópio de luz

(Ardenne, 1938)

• 1º microscópio de varredura comercial em 1965 (Oatley et al., 1972)

 Microscópio eletrônico de varredura

• Utiliza feixe de elétrons como sítio de radiação

• Molas eletromagnéticas como lentes

• Obtém informação a partir dos elétrons

secundários
 Diferenças entre o MEV e o MET

• Voltagem entre 10-25kV

• Elétrons que formam a

imagem não atravessam
a amostra

Elétrons secundários

MEV MET
• Permite a observação topográfica da superfície
 Elétrons secundários
• Resulta da interação entre elétrons primários e elétrons do espécime

• Diferença na quantidade de elétrons emitidos

em diferentes áreas permite observar o relevo da
sua superfície
Topografia
Afetam Quantidade de
Composição elétrons emitidos
Textura
 Microscópio eletrônico de varredura
Componentes

• Coluna do microscópio
Filamento
Cátodo
Ânodo
Lentes eletromagnéticas

• Equipamentos associados
Tubos de raios catódicos (CRT)

Gerador do scan

Sistema detector
Coluna do microscópio
Tamanho da área iluminada do espécime

Diminui diâmetro do feixe

Focaliza o feixe sobre a amostra

Recebe o feixe de elétrons primário

 Equipamentos associados à coluna
Forma a imagem

CRT Controla a ação de varredura realizada

pelos elétrons sobre o espécime
Magnifica a imagem
Deflection
coils

Filme de alumínio emite luz

Converte luz em corrente elétrica

amplificada
“A imaginação é mais
importante que a
ciência, porque a
ciência é limitada, ao
passo que a imaginação
abrange o mundo
inteiro”

Albert Einstein