Efetores na interação planta-patógenos

EFETORES NA INTERAO PLANTA-PATGENOS
Dalio, Ronaldo J. D.1; Magalhes, Diogo M.1; Atlio, Lsia B.1; Rodrigues,
Carolina M.1; Breton, Michle C.1; Pichi, Simone 1; Pascholati, Srgio F.2;
Machado, Marcos A.1
1 Laboratrio de Biotecnologia de Citros, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, IA
Cordeirpolis-SP
2 Departameto de Nematologia e Fitopatologia, Escola Superior de Agricultura Lus
de Queiroz, USP, Piracicaba-SP
RESUMO
Durante milhes de anos convivendo no mesmo ambiente, plantas e patgenos
desenvolveram um complexo sistema de interao entre eles. Patgenos utilizam um
grande nmero de estratgias para superar a barreiras de defesas e iniciarem a
colonizao nos tecidos do hospedeiro. Enquanto isso, as plantas apresentam um
complexo sistema de defesa para impedir a invaso dos patgenos e, em consequncia,
o desenvolvimento de doena. Esta batalha resulta em uma constante presso de
seleo entre os organismos envolvidos. Neste captulo so apresentados os principais
componentes envolvidos na interao planta-patgeno, que vo desde a ativao de
defesa desencadeada por reconhecimento de padres moleculares associados aos
patgenos (PAMPs), o papel fundamental de efetores e protenas de resistncia para o
desenvolvimento de doenas, as ferramentas de bioinformtica utilizadas para
predio de candidatos a genes efetores no genoma dos patgenos e o potencial uso
dos efetores na proteo da agricultura e ecossistemas naturais.
SUMMARY
Millions of years coexisting in the same environment developed a complex
interactions system between plants and pathogens. A large number of strategies are
used by pathogens to break the plant defense barriers in order to invade and colonize
plant tissues. At the same time a profusion of other strategies are used by plants to
avoid or minimize the pathogen invasion and development. As a consequence of this
battle there is a constant selection pressure in both organisms involved, resulting in a
strategy game which will never have a final winner. Here we reviewed the main
components involved in plant pathogen interaction from the Pathogen-Associated
Molecular Pattern (PAMP) and their recognition by PAMP receptors activating
defense, the role of effectors and R proteins and their importance to help pathogens
and plants respectively in this eternal war for survival, the bioinformatic tools to
predict putative effectors and its potencial use to protect crops and natural ecosystems.
INTRODUO
Milhes de anos de convvio no mesmo ambiente favoreceu o desenvolvendo
de complexo sistema de comunicao entre plantas e microrganismos. Para toda
interao planta-microrganismo, a troca de sinais representa a primeira e fundamental
etapa. Assim, a habilidade de perceber e responder a sinais do ambiente
fundamental para a sobrevivncia (Tyler et al., 2006).
Patgenos apresentam a habilidade de reconhecer sinais das plantas para
iniciar a infeco (Dalio et al., 2014). Por sua vez, as plantas esto expostas
constantemente a mudanas no ambiente, ataque de pragas e doenas. Diferentemente
dos animais, plantas no apresentam um sistema imune adaptativo e nem clulas de
defesa mveis, como os macrfagos (Chisholm et al., 2006), no entanto
desenvolveram um sistema imune simples, porm eficiente, que ativado aps o
reconhecimento de sinais da presena do microrganismo (Gassmann & Bhattacharjee,
2012; Dalio, 2013).
Os processos de reconhecimento pelo sistema imune de plantas podem ser
dividido em duas frentes: (i) aqueles associados imunidade desencadeada por
PAMPs ou MAMPs (pathogen or microbe associated molecular patterns), e (ii)
aqueles associados imunidade desencadeada por efetores. O primeiro usualmente
denominado PTI (PAMP-triggered immunity) e o segundo ETI (effector-triggered
immunity) (Jones & Dangl, 2006). Os PAMPs ou MAMPs, so reconhecidos por
receptores PRRs (PAMP-recognition receptor) localizados na superfcie da
membrana celular ou interior da clula, que desencadeiam uma cascata de transduo
de sinal ativando a resposta de defesa (Hogenhout et al., 2009). Este tipo de sistema
de defesa permite que as plantas respondam rpida e eficientemente a uma gama
ampla de patgenos (Roux et al., 2014).
Patgenos adaptados so capazes de secretar um arsenal de protenas que
podem suprimir PTI, resultando em susceptibilidade desencadeada por efetores (ETS,
effector-triggered susceptibility) (Birch et al., 2009).
Os processos envolvido na resposta ETI envolvem a secreo de efetores para

suprimir essa resposta. No entanto, plantas podem apresentar protenas de resistncia
(R) que reconhecem estes efetores resultando em defesa (Howden & Huitema, 2012).
O reconhecimento de efetores por protenas R pode ser direto (modelo gene-agene) (Owald et al., 2014) ou indireto (modelo guarda) (Jones & Dangl, 2006).
Enquanto patgenos emergem novos efetores para manipular os processos de
defesa das plantas, estas emergem novas protenas R, o que sugere uma constante e
indefinida corrida armamentista na interao planta-patgeno (Fig. 1) (Coll et al.,
2011).
Figura 1: Representao esquemtica da co-evoluo entre plantas e patgenos.

Sob ataque de patgenos, PAMPs ativam PRRs nos hospedeiros, resultando em
cascata de sinais, usualmente atravs de fatores de transcrio como os WRKY, que
leva a defesa. Este processo denominado PTI. Patgenos virulentos podem secretar
efetores que suprimem o reconhecimento de PAMPs e PTI, o que resulta em
susceptibilidade. Este processo denominado ETS. Por outro lado, plantas podem
apresentar genes que codificam protenas de resistncia (R), que reconhecem os
efetores e desencadeiam defesa. Este processo denominado ETI. Sob presso de
seleo, os patgenos alteram ou desenvolvem novos efetores para escapar do
reconhecimento por protenas R, o que resulta em uma nova fase ETS. Desse modo, a
presso de seleo passa para as plantas. Novos genes R podem emergir e
desencadear uma nova ETI, restaurando a imunidade. Estes processos podem se
repetir indefinidamente (Dalio, 2013).
Aps reconhecimento de um PAMP ou efetor, o sistema imune das plantas

ativado atravs de vias de sinalizao semelhantes, baseadas em mudanas nos nveis
de clcio no citoplasma, rpida produo de espcies reativas de oxignio e cascata de
sinalizao via MAP-quinases (mitogen activated protein kinases). A amplificao
desses sinais se d por hormnios reguladores como cido saliclico (SA), cido
jasmnico (JA) e o etileno (ET) resultando na ativao de fatores de transcrio, entre
eles os da super-famlia WRKY, e de genes de defesa, protenas-PR, (pathogenesisrelated proteins) fitoalexinas, lignificao de tecidos, deposio de calose e outros
reforos da parede celular (Grant & Lamb, 2006).
evidente que o reconhecimento do patgeno seja fundamental para qualquer
relao susceptvel ou de resistncia. Poucas protenas efetoras j foram descritas, no
entanto vrios PAMPs/MAMPs j so comprovadamente envolvidas nas relaes de
reconhecimentos entre plantas e microrganismos (Newman et al., 2013).
Sabe-se que os patgenos apresentam diversas estratgias de ataque ao
hospedeiro e que inmeros efetores tem potencial para manipular a defesa das plantas.
No entanto, isso contrasta com o que se v na natureza, onde resistncia regra e
doena exceo, em outras palavras, uma dada espcie de planta pode ser resistente
para a maioria dos patgenos e suscetvel a apenas alguns. Isto se d em funo de
relaes no-compatveis e chamada de resistncia de no-hospedeiro (non-host
resistance). Este captulo, no entanto, foca em relaes compatveis e interao
patgeno-hospedeiro, focando em efetores e seu papel na ativao ou bloqueio de
respostas de defesa das plantas.
O entendimento e manipulao de componentes chave envolvidos em
mecanismos de defesa das plantas, como
PAMPs, PRRs, efetores e genes de
resistncia, podem levar ao desenvolvimento de novas estratgias para o controle de

doenas na agricultura (Raffaele & Kamoun, 2012).
IMUNIDADE DESENCADEADA POR PAMPS (PTI)

As plantas inicialmente percebem a presena de microrganismos a partir de
receptores de reconhecimento de padres moleculares PRRs (pattern recognition
receptors). Esses receptores so protenas transmembranas pertencentes classe das
protenas receptor-like (RLPs) ou quinases receptor-like (RLKs) e apresentam
geralmente repeties ricas em leucina (LRRs) ou motivo de lisina (Lysm) no

domnio extracelular, o qual est envolvido com o reconhecimento dos sinais (BECK
et al. 2012).
Os PRRs esto presentes na superfcie das clulas e so capazes de reconhecer
PAMPs e ativar resposta de defesa contra os patgenos em potencial. Os PAMPS
foram inicialmente definidos como molculas provenientes dos microrganismos
altamente conservadas e que apresentam funo essencial em sua sobrevivncia
(MEDZHITOV and JANEWAY 1997). Muitas vezes, essas molculas so provenientes de
microrganismos no patgenos, portanto o termo (MAMP) tambm utilizado. Tanto
PAMPs ou MAMPs so capazes de atuar como molculas elicitoras e desencadear
respostas de defesa basal. Da mesma forma, os PRRs podem tambm reconhecer
perfis moleculares associados a insetos herbvoros (HAMPs) (MITHFER and BOLAND
2008) ou mesmo danos resultantes (DAMPs, damage-associated molecular patterns)
que so molculas liberadas pelas prprias clulas do hospedeiro quando so expostas
ao ataque por pragas ou microrganismos (MA et al. 2012).
Molculas de diferentes classes e pertencentes a diferentes microrganismos
foram identificadas como PAMPs/MAMPs, incluindo os peptdeos bacterianos
flagelina e fator Tu de elongamento (EF-Tu), o peptdeo de fungo xilanase induzida
por etileno (EIX) e oligossacardeos de fungos, como as glucanas ou fragmentos de
quitina da parede celular. Tambm foram identificados como PAMPs/MAMPs
eptopos mais complexos, como glicoprotenas de oomicetos ou lipopolissacarideos e
peptideoglicanas de bactrias (SHAN et al. 2007). Com a deteco dos
PAMPS/MAMPS, as protenas PRRs ativam na planta a resposta de imunidade
desencadeada por PAMPs (PTI, de PAMP- Triggered Immunity) e esta representa a
primeira linha do sistema de imunidade das plantas (Tabela 1).
Tabela 1: PAMPs, MAMPs, DAMPs e HAMPs j descritos e seus respectivos

receptores PRRs envolvidos em respostas de defesa tipo PTI.
MAMP/DAMP/HAMP
Planta responsiva
Receptor
Referncia
Arroz
Lyp4/Lyp6
(LIU et al. 2012)
Arabidopsis
Lym1/Lym3
(WILLMANN et al. 2011)
Arabidopsis, tabaco,
Desconhecido
(ZEIDLER et al. 2004)
Bactrias
Peptideoglicana
Lipopolissacardeo (LPS)
pimenta
Flagelina
Ax21
Arabidopsis, tomate,
arroz, tabaco
FLS2
(GMEZ-GMEZ and
BOLLER 2000)
Arroz
Xa21
(WANG et al. 2013)
Brassicaceae
EFR
(KUNZE et al. 2004)
Transglutaminase
Batata, salsa
Desconhecido
(BRUNNER et al. 2002)
-glucanas
Soja
GBP
(FLIEGMANN et al. 2004)
Xilanase
Tabaco, tomate
Eix1/Eix2
(RON and AVNI 2004)
Invertase
Tomate
Desconhecido
(BASSE et al. 1992)
-glucanas
Arroz
Desconhecido
(YAMAGUCHI et al. 2000)
Arroz
CEBiP/CERK1
(SHINYA et al. 2012)
Arabidopsis
CERK1
(MIYA et al. 2007)
Arabidopsis
LYK4
(WAN et al. 2012)
PEPR1/2
Arabidopsis
AtPep
(KROL et al. 2010)
ATP extracelular
Tomate
LecRK-1.9
(CHOI et al. 2014)
Tabaco
Desconhecido
(HALITSCHKE et al. 2001)
Feijo de corda
Desconhecido
(SCHMELZ et al. 2007)
Fator Tu de elongao (EFTu)

Oomicetos
Fungos
Quitina
Sinais da prpria planta
Herbvoros
Conjugado de cidos graxos e
aminocidos (FAC)
Insetinas
A protena PRR mais estudada a FLS2 (Flagelin Sensing 2) que foi

inicialmente identificada em Arabidopsis e possui a capacidade de reconhecer um
eptopo de 22 aminocidos (flg22) na poro conservada N-terminal da protena
flagelina que compe o flagelo, estrutura primariamente envolvida com a locomoo
em bactrias. A flagelina representa um exemplo consistente com a definio de
PAMP, ou seja, essencial para a motilidade bacteriana, apresenta-se conservada em
um grande grupo (bactrias que se locomovem por flagelo) e representa um fator de
virulncia comprovado e necessrio para a patogenicidade bacteriana (RAMOS et al.
2004). O eptopo flg22 reconhecido pela maioria das espcies de plantas e o
receptor FLS2 foi identificado em plantas como arroz, tomate e Nicotiana
benthamiana, alm de Arabidopsis (BOLLER and FELIX 2009). Outros exemplos bem
caracterizados de PRRs incluem o EFR que reconhece o eptopo elf18 de EF-Tu em

bactrias, o receptor CERK1 que reconhece peptideoglicanas bacterianas, Xa21 que
reconhece protena sulfatada AX21 em Xanthomonas, alm do receptor CEBip que
reconhecem regies de quitina em fungos ou LEIX1/2 que percebem xilanases em
fungos (Dardick, Schwessinger, and Ronald 2012).
A resposta de imunidade do tipo PTI se d por ligao fsica entre o domnio
extracelular do receptor (PRR) com o eptopo do ligante (PAMP/MAMP), o que
ocasiona uma mudana na estrutura do receptor e concomitante ativao da cascata de
sinalizao citoplasmtica pelo domnio intracelular do receptor. A percepo
microbiana rapidamente ativa o influxo de ions de clcio (Ca2+) para dentro das
clulas, o que modifica o pH local e regula a sinalizao inicial de eventos que
ocorrem dentro de segundos a minutos, como o efluxo de nions, a produo de
espcies reativas de oxignio (ROS) e expresso de genes envolvidos com
biossntese de peptdeos e compostos antimicrobianos. Estas respostas so
principalmente mediadas por protenas quinases dependentes de clcio (CDPKs) e coreguladas pela cascata de sinalizao por protenas quinases ativadas por mitgenos
(MAPKs), as quais podem ser posteriormente moduladas por calmodulina (CAM). O
aumento de Ca2+ tambm regula respostas tardias que podem ocorrer horas ou dias
aps contato com o patgeno, o que inclui a produo de cido saliclico (SA),
fitoalexinas, camalexinas e outros compostos de defesa pela regulao genica. A
ativao de genes de defesa tambm pode sofrer regulao por fatores de transcrio,
como por exemplo aqueles pertencentes famlia WRKY (MONAGHAN and ZIPFEL
2012). O complexo de sinalizao descrito, principalmente regulado por Ca2+,
apresenta uma viso geral de resposta PTI que contribuem para a defesa das plantas
contra bactria, fungos e oomicetos. Entretanto, outras respostas podem estar
associadas, incluindo a produo de etileno, o fechamento de estmatos ou a
deposio de calose ou lignina na parede celular e, alm disso, em vrios desses
processos h a formao de molculas que potencialmente podem atuar como
mensageiros secundrios (SA, ROS, etileno, clcio, etc) em diversas outras vias
metablicas, o que torna a resposta ainda mais complexa (ZIPFEL and ROBATZEK
2010).
SUSCETIBILIDADE DESENCADEADA POR EFETORES (ETS)
At recentemente, muito pouco se sabia sobre a biologia dos efetores e

principalmente sobre as bases moleculares da interao planta-patgeno. O
conhecimento era limitado a estruturas de infeco especializadas, sintomatologia,
secreo de enzimas hidrolticas e toxinas. Com o avano de tcnicas moleculares e
sequenciamento, muita informao tem sido levantada e a fitopatologia est
avanando no entendimento das estratgias de infeco dos patgenos e mecanismos
de defesa das plantas. Inicialmente, foram elucidadas das funes bioqumicas de
algumas molculas efetoras de bactrias. Depois, o conceito de efetores foi
extrapolado de bactria patognicas para fungos, oomicetos e nematoides, que
tambm tiveram a funo bioqumica de alguns de seus efetores elucidadas e
finalmente,
com
mtodos
computacionais
bioinformtica
baseados
em
sequenciamento de genomas tem sido possvel predizer candidatos a efetores numa

gama imensa de microrganismos. Estas informaes em conjunto levaram a
comunidade cientfica a aceitar os efetores como fatores essenciais para a
compreenso dos processos por trs de qualquer interao planta-patgeno.
EFETORES
Estudos envolvendo bactrias Gram-negativas com sistema de secreo tipo
III (T3SS) revelaram que estas bactrias secretam protenas no interior das clulas que
desencadeiam reaes de hipersensibilidade. Essas molculas foram portanto
chamadas de fatores de avirulncia. No entanto, as mesmas protenas cunhadas como
fatores de avirulncia foram encontradas contribuindo para a virulncia em relaes de
susceptibilidade. Deste modo, havia um impasse no uso do termo avirulncia porque
ele no era correto em todos os casos, demonstrando a necessidade de um termo
neutro. Da surgiu o termo efetores resolvendo o impasse e vem sendo aceito e
utilizado na fitopatologia.
Alguns autores ainda insistem em definir efetores como molculas que
suprimem a defesa das plantas. Como j mencionado acima, este tipo de definio no
correta porque alguns efetores apresentam dualidades em sua funo dependendo do
hospedeiro, ou seja, pode ser relacionado tanto a patogenicidade ou ativao de
resistncia. Por muito tempo a definio mais aceita, proposta por Kamoun, 2009 era:
Efetores, molculas secretadas por um microrganismo que alteram a estrutura/funo
do hospedeiro. Esta definio perdeu um pouco de espao porque nem todos os
efetores so secretados e nem sempre o organismo alvo um hospedeiro. Nesse
sentido a definio de efetores mais correta e atual : molculas liberadas ou

associadas a um organismo que modificam a fisiologia de outro organismo.
Os efetores so divididos em apoplsticos e citoplasmticos em funo do
local de atuao. Os efetores secretados pelos patgenos durante a infeco podem se
acumular na superfcie exposta da clula ou nos espaos intercelulares (Fig. 2), sendo
classificados
como
efetores
apoplsticos,
os
efetores
intracelulares
ou
citoplasmticos, que so os que podem se translocar atravs da membrana celular e

tem contato direto com compartimentos subcelulares ou organelas (Block et al., 2008).
A estrutura tpica de um efetor citiplasmtico est representada na figura 3.
Os processos utilizados por bactrias fitopatognicas para inserir seus efetores
no interior das clulas dos hospedeiros so mais conhecidos quando comparados aos
de oomicetos e fungos. Os tipos de secreo de protenas em bactrias tm sido
bastante estudados ao longo do tempo. No entanto, pouco ainda se sabe sobre o
trafego de efetores para fungos e oomicetos. Sabe-se que alguns efetores apresentam
motivos especiais em sua cadeia que utilizam a prpria maquinaria da planta para
adentrarem no interior da clula, porm estes processos ainda no esto totalmente
esclarecidos e so necessrios novos mtodos que permitam a deteco e a
visualizao do trfego destes efetores at a clula hospedeira (PETRE and KAMOUN
2014).
Uma vez translocados no citoplamasma da planta, os efetores podem trafegar
para diferentes compartimentos subcelulares, incluindo organelas e vrios subcompartimentos da clula. Um grande nmero de efetores se acumula no ncleo da
planta como os TAL de Xanthomonas, SAP11 de fitoplasma, e CRNs e Crinklers de
Phytophthora que utilizam a importina para mediar a entrada no ncleo da planta
(Vandenackerveken, 1996; Bai et al., 2009; Schornack et al., 2010). O efetor TAL de
Xanthomonas atua diretamente no ncleo e ativa no hospedeiro genes envolvidos em
processos diversos como os que definem o tamanho das clulas, transporte de
acares e processos epigenticos (CHEN et al. 2010; DE SOUZA et al. 2012).
Em Phytophthora os efetores apoplsticos esto, geralmente, associados
inibio enzimtica (e.g. hidrolases) (TIAN et al. 2004, 2005, 2007; DAMASCENO et al.
2008), enquanto que o modo de ao dos efetores citoplasmticos em diferentes
compartimentos sub-celulares ainda se obscura. Os efetores citoplasmticos so
protenas modulares que carregam peptdeos N-terminais seguidos por motivos

conservados como os RxLR (R: arginina; x: qualquer aminocido; L: leucina; R:
arginina) (TYLER et al. 2006; BIRCH et al. 2006, 2008; KAMOUN 2006, 2007, 2009;
MORGAN and KAMOUN 2007; WIN et al. 2007) (Fig. 3).
O motivo RxLR viabiliza a entrada de protenas que contem tal motivo no
interior da clula (BHATTACHARJEE et al. 2006; WHISSON et al. 2007; DOU et al.
2008; GROUFFAUD et al. 2008). Um dos efetores RxLR mais estudados at ento o
AVR3a de P. infestans. O AVR3a suprime morte celular induzida pela elicitina INF1, tambm secretada por P. infestans. Em suma, INF-1 teria caractersticas de um
padro molecular associado ao patgeno (PAMP) que induziria morte celular. Em
contrapartida, o AVR3a suprime a ao deste PAMP, contribuindo para a virulncia
do patgeno (BOS et al. 2009).
Figura 2: Esquema ilustrativo da suscetibilidade desencadeada por efetores (ETS).

Os patgenos de plantas como fungos, bactrias, oomicetos, vrus e nematides
colocam efetores no exterior da clula vegetal, os efetores apoplsticos (EA).
Enquanto que os efetores citoplasmticos (EC) so liberados diretamente no interior
da clula, se ligando a diferentes protenas dos hospedeiros (alvos dos efetores
citoplasmticos (AEC). (Adaptado de (WIN et al. 2012b). Tanto os efetores
apoplsticos quanto os citoplasmticos tem o potencial de suprimir respostas de
defesa das plantas.
Figura 3: Estrutura tpica de um efetor citoplasmtico. Todos os efetores,

citoplasmticos ou apoplsticos apresentam um peptdeo sinal na posio N-terminal
da molcula, condio obrigatria para todas as molculas secretadas. Os efetores
citoplasmticos apresentam ainda um motivo especial tambm na posio N-terminal.
Motivos comuns so os RxLR e CRN que esto relacionados a translocao destes
efetores pro interior da clula (estes motivos esto ausentes em efetores apoplsticos).
Na regio C-terminal encontra-se o domnio do efetor que est relacionado a sua
atividade/funo.
ALVOS DOS EFETORES
Algumas atividades tpicas de efetores em inibio de defesa ou inibio do
reconhecimento da infeco pela planta incluem (GHRE and ROBATZEK 2008):
Inibio de enzimas (hidrolases) no apoplasto,
Inibio de ativao de PRRs,
Inibio de cascatas de sinalizao mediadas por MAP-quinases,
Modificao do transcriptoma relacionado a respostas de defesa,
Reprogramao transcricional,
Degradao de componentes/protenas relacionadas a defesa,
Interferncia na secreo de protenas e trfego vesicular,
Secreo orquestrada de efetores

Os efetores precisam estar no local certo e no tempo certo para uma
colonizao de sucesso. Fungos fitopatognicos como Colletotrichum higginsianum e
C. graminicola, infectando Arabidopsis thaliana e milho, respectivamente, usam
reguladores de transcrio para sntese e secreo de diferentes conjuntos de efetores
e importantes enzimas para as diferentes fases de infeco. A fase biotrfica
aumentada por efetores e enzimas do metabolismo secundrio, considerando que na
fase necrotrfica h a liberao de hidrolases e transportadores (OCONNELL et al.
2012). Em C. higginsianum a regulao ainda mais refinada sendo que no perodo
anterior entrada do patgeno so liberados efetores ChCEs para preparar a entrada

na clula hospedeira (KLEEMANN et al. 2012). No oomiceto Phytophthora, vrios
efetores RxLR so induzidos no estdio de germinao do esporo ou na fase inicial da
infeco, e vrias protenas Nep1- indutoras de necrose (NLPs), so expressas em
estgios posteriores a infeco, sugerindo que contribuam para a fase necrotrfica
(QUTOB et al. 2002; HAAS et al. 2009). Em P. infestans, um efetor conhecido como
SNE1 expresso durante a fase biotrfica, para suprimir morte celular que se
expressa durante a fase necrotrfica da infeco (KELLEY et al. 2010). Uma vez que
os efetores chegam ao local certo nas clulas hospedeiras, no momento certo, eles
podem interagir com protenas do hospedeiro para exercer as suas funes para que a
invaso e colonizao sejam bem sucedidas (WIN et al. 2012a).
IMUNIDADE DESENCADEADA POR EFETORES (ETI)
A ETI ativada aps o reconhecimento por parte do hospedeiro de efetores
dos patgenos. Essas protenas dos patgenos so reconhecidas pelas protenas
intracelulares R dos hospedeiros, as quais possuem domnios NB-LRR (nucleotide
bindingleucin rich repeat) (Fig. 4) (WIN et al. 2012a). Esse reconhecimento pode ser
atravs
da
interao
direta,
altamente
especfica,
entre
as
protenas
hospedeiro/patgeno de acordo com a teoria gene a gene (Flor, 1971; Boller & Felix,
2009). Contudo, os efetores podem ser reconhecidos de forma indireta, conhecida
como teoria guarda (Flor, 1971; Jones & Takemoto, 2004). Nesse reconhecimento
indireto, as protenas R reconhecem efetores ligados a protenas da planta chamadas
alvos de efetores de patgenos representados na Figura 4 como alvo dos efetores
citoplasmticos (AEC). A maior evidncia dessa teoria guarda foi encontrada no
sistema R/Avr entre Arabidopsis thaliana e Pseudomonas syringae pv. Tomato, onde
RIN4 modificada pela Avr dessa bactria e essa modificao ativa a protena R
(RPM1) resultando na resistncia dessa planta (MACKEY et al. 2002).
Figura 4. Resposta da planta ao ataque de patgenos (bactrias, fungos e oomicetos)

mostrando a imunidade desencadeada por efetor (ETI). Os patgenos secretam os
efetores para dentro da planta hospedeira (efetores citoplasmticos, EC) atravs do
sistema de secreo do tipo III, no caso das bactrias, ou por estruturas de infeco
especializadas chamadas de haustrios, por fungos e oomicetos. Os efetores trafegam
por vrios compartimentos, ligando-se, e manipulando diferentes protenas dos
hospedeiros chamadas de alvo. Este quando est localizado no citoplasma do
hospedeiro designado como alvo dos efetores citoplasmticos (AEC). Em interaes
incompatveis, os receptores intracelulares (NBS-RR) induzem a ETI aps o
reconhecimento dos EC e/ou as interaes com AEC evitando assim a doena
(Adaptado de Win et al., 2012b).
A maioria dos genes R codifica para uma protena que apresenta um domnio
central de ligao a nucleotdeos (NB), outro com regies repetidas ricas em leucina
(LRR), o qual medeia o reconhecimento de diversos efetores de todas as classes de
patgenos de plantas, e um terceiro domnio varivel no N-terminal que pode ser TIR
(Toll/Interleucina-1) ou CC (Coiled-coil) (Elmore et al., 2011; Gururani et al., 2012)
(Figura 5).
Alm das classes TIR e CC das protenas R, existem mais seis que se
destacam. Dentre elas est a eLRR que possui um domnio LRR extracelular ligado a
um domnio transmembrana (TrD) (GURURANI et al. 2012) (Figura 5). A quarta classe
a LRR quinase, a qual apresenta um domnio intracelular de quinases serina/treonina
citoplasmticos, um domnio extracelular LRR e um domnio transmembrana (TrD)
(Afzal et al., 2008; Gururani et al., 2012) (Figura 5).
A quinta classe representada pelas protenas R que possuem um domnio
TrD, qual est ligado um domnio CC (WIN et al. 2012b) (Figura 5). Genes R
contendo os domnios LRR, seguido pelo domnio TrD ligado ao domnio PEST
(prolina-glicina-serina-treonina) para degradao proteica, alm de pequenos motivos

de ECS (domnio de sinalizao celular de endocitose) representam a sexta classe
(GURURANI et al. 2012).
A stima classe representada pelas protenas R que contm os domnios TIRNBS-LRR, alm de ter na extenso C-terminal um domnio putativo de sinal de
localizao nuclear (NLS) e um domnio WRKY, qual possui uma regio de 60
aminocidos que definida pela sequencia conservada WRKYGQK na regio Nterminal, associada um motivo zinc-finger (THOMMA et al. 2011) (Figura 5).
E a ltima classe representada pelos genes R enzimticos, os quais no
possuem nenhum dos domnios LRR e NBS, como por exemplo, o gene Hm1de milho
que fornece proteo contra o fungo patognico Cochliobolus carbonum (JOHAL and
BRIGGS 1992) (Figura 5).
Figura 5. Principais classes dos genes de resistncia de plantas baseado nos domnios
funcionais. NBS - stio de ligao a nucleotdeos; LRR - regies repetidas ricas em
leucina; TIR - Toll/Interleucina-1; CC - Coiled-coil; TrD - domnio transmembrana;
PEST - domnio de degradao proteica (prolina-glicina-serina-treonina); ECS domnio de sinalizao celular de endocitose; NLS - sinal de localizao nuclear;
WRKY e HM1 -uma redutase que inativa uma toxina (Adaptado de Win et al.,
2012b).
Diferentes patgenos como bactrias, fungos, oomicetos e vrus que produzem
efetores para atacar diferentes plantas, que por sua vez, usam seus genes de resistncia
para evitar a doena (Tabela 2).
Tabela 2. Interao dos efetores de diferentes patgenos com os genes R de diversos

hospedeiros (Adaptado de (WIN et al. 2012b).
Patgenos
Bactrias
Xanthomonas oryzae
Xanthomonas oryzae
P. syringae
P. syringae
P. syringae
Fungos
Blumeria graminis
Fusarium oxysporium
Melamspora lini
Magnoporthe grisea
Puccinia graminis f sp.
tritici
Oomicetos
Bremia lactucae
Hospedeiros
Efetores
gene R
Oryza sativa
Oryza sativa
Arabidopsis thaliana
Avr-Xa1
Avr-Xa21
AvrRpm1
AvrRpt2
AvrPphB
Xa1
Xa21
RPM1
RPS2
RPS5
Hordeum vulgarae
Lycopersicum
esculentum
Linum usitatissimum
Oryza sativa
AvrMla
Mla
Avr1
AyrL
Avr-Pita
I2
L
Pi-ta
Hordeum vulgarae
Avr-Rpg1
Rpg1
Lactuca sativa
Avr3
AvrB,
AvrRPP1A
Avr1
Avr3a
Avr1a, Avr3a
and Avr3c,
Dm3
Perenospora parasitica
Phytophthora infestans
P. infestans
A. thaliana
Solanum tuberosum
Solanum demissum
Phytophthora sojae
Vrus
Bean dwarf mosaic
virus
Glycine max
Phaseolus vulgaris
Cucumber mosaic virus

Potato virus X
A. thaliana
Solanum tuberosum
Soybean mosaic virus

Turnip mosaic virus
Glycine max
Bdm
Vpg (viral
genomeelinked
protein)
Coat protein
Hc-Pro and
P3 cistron
VPg
RPP1
R1
R3a
Rps1a, Rps3a,
Rps3c
BV1 protein
At-eIF4E1
(cum1)
Rx1, Rx2
Rsv1
At-eIF(iso)4E
Quando a ETI ativada, a planta desencadeia uma rpida morte celular no

stio de infeco conhecida como reao de hipersensibilidade (HR, hypersensitive
response) (WIN et al. 2012a). Associada a HR, outras resposta de defesa so ativadas
como alteraes nos nveis de clcio no citoplasma, produo de espcies reativas de
oxignio e cascata de sinalizao via quinases. A amplificao desses sinais se d de
modo similar a PTI, por mensageiros secundrios como cido saliclico (SA), cido
jasmnico (JA) e o etileno (ET) resultando na ativao de fatores de transcrio de

genes de defesa e, subsequentemente, na resistncia sistmica adquirida ou resistncia
sistmica induzida (TSUDA and KATAGIRI 2010a).
Quando ocorre ETI, a resposta imune das plantas mais prolongada e possui
uma sinalizao dominante em relao PTI. Tsuda & Katagiri (2010b) propuseram
que a ETI tem uma rede de setores interligados, ou seja, quando o setor primrio,
por exemplo, o da via do SA comprometido por efetores de patgenos algum outro
setor como o da via do JA ativada garantindo assim a resistncia da planta ao ataque
do patgeno. Contudo, esse tipo de resistncia pode ser rapidamente superado pelo
patgeno atravs da aquisio de novos efetores, ou pela perda ou diversificao do
stio de reconhecimento do gene R para evitar a ETI (JONES and DANGL 2006).
Entretanto, a seleo natural resulta em novos alelos dos NB-LRR, que por sua vez,
podem reconhecer um desse novos efetores resultando novamente em ETI (JONES and
DANGL 2006).
COMO PROCURAR EFETORES NO GENOMA DO PATGENO?

Secretadas na interface intercelular entre o patgeno e a planta ou translocadas
para o citoplasma das clulas hospedeiras, as molculas efetoras fazem parte de um
complexo arsenal molecular que o patgeno utiliza para colonizar os tecidos da planta
hospedeira (STERGIOPOULOS and WIT 2009). O fato destas protenas serem
obrigatoriamente secretadas do patgeno para o hospedeiro tornou-se a principal
caracterstica na sua busca, primeiramente in vivo, analisando o secretoma destes
microrganismos, e mais tarde in silico, na minerao de dados em busca destas
sequencias nos genomas dos patgenos.
Os primeiros experimentos realizados pelos fitopatologistas tinham como
objetivo conhecer um pouco mais sobre o secretoma dos patgenos e a natureza de
potenciais das protenas efetoras. Para tanto, a primeira estratgia utilizada foi a
clonagem molecular. O primeiro gene Avr clonado, em 1984, foi da bactria P.
syringae pv. Glycinea (STASKAWICZ et al. 1984), mais tarde, em 1991, foi a vez do
primeiro gene Avr de fungo, Cladosporium fulvum (VAN KAN et al. 1991), e em 2004
o gene Avr do oomiceto P. infestans (TIAN et al. 2004).
Mas a necessidade de se conhecer melhor o sistema de secreo destas

protenas fez com que tcnicas de imunolocalizao e utilizao de transformantes
fossem empregadas nestes estudos, permitindo visualizar a complexidade dos
secretomas de fitopatgenos e seus hospedeiros, catalogar estes secretomas e fornecer
novos dados para elucidar os processos apoplsticos e a natureza do conjunto de
efetores secretados.
Simultaneamente, com a evoluo das tecnologias visando obter maior
nmero de dados, algumas abordagens para caracterizao de efetores em larga escala
se iniciaram. Uma destas abordagens o sistema de armadilha de sinal de secreo
em levedura (YST secretion trap library), onde feita uma biblioteca contendo a
seqncia codante completa do gene para expresso e outra onde as sequencias que
codificam o primeiro e segundo aminocido da protena, que so retirados via
oligonucleotdeos iniciadores (primers), por reao em cadeia da polimerase (do
ingls, polymerase chain reaction - PCR) tornando esta protena inativa quando
subclonada em vetor de expresso de protenas e expressas em leveduras. Para o
oomiceto P. infestans, forma identificados 23 genes que codificam protenas
secretadas, e todas estas protenas estavam localizadas nas folhas do hospedeiro e no
no miclio cultivado in vitro (LEE et al. 2006). Para o fungo Uromyces fabae, foram
encontrados 62 genes que codificam protenas secretadas pelo haustrio e 42 genes
que codificam protenas secretadas em esporos germinados, das quais 28 delas
apresentaram similaridade com protenas encontradas somente na ordem Uredinales,
indicando um possvel papel na virulncia e especificidade de hospedeiro (Link &
Voegele, 2008).
Associando esta tcnica ao sequenciamento, foi atribuda caracterizao de
efetores em larga escala uma nova abordagem, a clonagem de fragmentos genmicos
diretamente do sistema de secreo onde o DNA genmico do patgeno
fragmentado aleatoriamente em fragmentos de tamanho desejado, clonados em vetor e
sequenciados a fim de se identificar clones de DNA genmico nicos. Para U. maydis
estirpe haploide selvagem Um521, fragmentos do genoma com ~300pb foram
sequenciados e foi possvel identificar 52 clones nicos. A fim de se testar o papel
destes genes na infeco, foi utilizada a tcnica de mutantes nulos (knock-outs) para
diferentes genes. O knock-out duplo para genes envolvidos na patogenicidade no
afetaram o crescimento da levedura, o acasalamento, a formao de hifas areas e a
hidrofobicidade de superfcie, no entanto, o desenvolvimento patognico em plantas

logo aps a penetrao foi afetado, levando a perda da patogenicidade (KLEIN et al.
1996).
Com o surgimento da tcnica de microarranjo (microarray), a avaliao da
expresso global de genes diferencialmente expressos em plantas infectadas com o
patgeno permitiu a identificao de genes que codificam protenas secretadas
durante o crescimento e infeco do patgeno (MOSQUERA et al. 2009) e a descoberta
de novos locus associados a efetores. Em P. infestans, foi possvel descrever um novo
locus de avirulncia utilizando esta tcnica (QUTOB et al. 2006), e em Pectobacterium
atrosepticum foram caracterizadas protenas associadas ao sistema de secreo tipo
IV (MATTINEN et al. 2008) e protenas do qurum sensing, sistema que controla a
produo de enzimas de degradao de parede celular e outros fatores de virulncia
deste patgeno, principalmente aos fatores ligados sua disperso (LIU et al. 2008).
Esta abordagem permite avaliar protenas efetoras envolvidas na penetrao do
patgeno na clula hospedeira (DOEHLEMANN et al. 2008), na inibio da sntese de
resposta imune inata do hospedeiro (FONTANA et al. 2011), predio de novos
efetores cuja anotao dos domnios no est associada patogenicidade (SAUNDERS
et al. 2012) e a identificao de protenas efetoras associadas ao desenvolvimento
simbintico com o hospedeiro (PLETT et al. 2014). Apesar da tcnica de microarray
ser considerada obsoleta para algumas reas da biologia molecular, para a descoberta
de novos efetores e elucidar sua forma de atuao na clula hospedeira, esta tcnica se
mostra bastante eficiente e ainda bastante utilizada.
Entretanto, o uso do sequenciamento na obteno do genoma completo dos
patgenos, primeiro pela metodologia de Sanger, depois pelo sequenciamento de nova
gerao (next generation sequence) que permitiram o aumento exponencial da
quantidade de dados gerados e a possibilidade de se minerar novos genes candidatos a
efetores em diversas espcies de patgenos. As plataformas de sequenciamento mais
usadas atualmente para estes estudos so a 454 pirosequenciamento (454 Life Science
Roche Diagnostic), baseado na deteco do pirofosfato liberado na incorporao do
nucleotdeo na cadeia de DNA sintetizada; e sequenciamento Illumina (Illumina
sequencing Solexa), baseado na deteco dos nucleotdeos previamente marcados
com um fluorfo, durante a sntese da cadeia. Ambos geram sequencias curtas,
entretanto, os fragmentos gerados pelo pirosequenciamento um pouco maior que o
gerado pelo sequenciamento Illumina, 700 pb contra de 50 a 300 pb, conferindo uma
maior acurcia dos dados, 99,9% contra 98% obtidos no sequenciamento Illumina. O
pirosequenciamento gera um menor nmero de dados, cerca de um milho de
fragmentos, enquanto o Illumina gera mais de 3 milhes de fragmentos. Isto torna o
sequenciamento Illumina mais demorado, de um a 10 dias, dependendo do tamanho
do fragmento gerado; em contrapartida, o pirosequenciamento pode ser realizado em
24 horas. Em termos de custo, o sequenciamento Illumina mais vantajoso: US$ 0,05
a 0,15 por milho de bases, enquanto que, no pirosequenciamento o custo de
US$ 10 (LIU et al. 2008; QUAIL et al. 2012). Outro aspecto vantajoso de ambas as
plataformas a sua aplicao no s no sequenciamento de genomas mas tambm no
sequenciamento de transcriptoma do organismo, metodologia esta denominada
RNAseq.
O emprego desta tcnica, tanto na genmica como na transcriptmica, tem
gerado muitos trabalhos com fitopatgenos e a sua interao com o hospedeiro,
visando principalmente, a busca por molculas efetoras e a resposta adaptativa da
planta a estas molculas, evidenciando a coevoluo deste sistema. Como exemplo
desta abordagem, podemos citar a descoberta de um gene de virulncia envolvido na
induo de tumor em uma planta lenhosa (RODRGUEZ-PALENZUELA et al. 2010);
microevoluo e relao filogentica de efetores P. syringae na adaptao ao
hospedeiro (CAI et al. 2011); anlise de polimorfismo das protenas candidatas a
efetoras secretadas pelo haustrio de Puccinia striiformis f. sp. tritici (CANTU et al.
2013); a identificao de genes candidatos a efetores no transcriptoma do nematoide
do n da raiz do arroz Meloidogyne graminicola (HAEGEMAN et al. 2013); busca por
genes efetores expressos na interao com o hospedeiro, no transcriptoma de
Melampsora lini (NEMRI et al. 2014); comparao entre genomas da mesma espcie a
qual pertence o patgeno, avaliando a conservao das protenas efetoras ao longo do
tempo evolutivo (QI et al. 2011); e a identificao de efetores de domnio
caracterizado, como os RXLR, no genoma de patgenos de grande impacto na
economia agrcola (THAKUR et al. 2013).
Para que estas diversas abordagens tivessem sucesso, simultaneamente ao
aparecimento do sequenciamento de nova gerao, diversas ferramentas de
bioinformtica foram desenvolvidas, visando analisar o secretoma dos patgenos
permitindo a predio de protenas efetoras e a minerao destas a partir de domnios
caracterizados, como os RXLR. As ferramentas desenvolvidas para a predio de

protenas efetoras so baseadas nas caractersticas do peptdio sinal (do ingls,
secretion signal target) das protenas pertencentes aos cinco tipos de sistema de
secreo descrito para patgenos (PRESTON et al. 2005). O peptdeo sinal uma
pequena sequencia de aminocidos (entre 15 e 60), localizada na poro N-terminal
da protena, com a funo de marcar as protenas que sero exportadas pelo aparato de
secreo, seja atravs da interao direta com os componentes citoplasmticos ou
periplasmticos da maquinaria de secreo, ou atravs de um intermedirio, como as
chaperonas.
O peptdeo sinal Sec/SRP se caracteriza por compartilhar pequenas sequencias
que apresentam caractersticas em comum, como uma sequencia de carga positiva na
poro N-terminal, uma sequencia de aminocidos hidrofbicos de 7 a 15
aminocidos e uma sequencia polar que contm o stio de clivagem AXA. Similares
a este, o peptdeo sinal TAT-especficos so um pouco mais longos, apresentam de 26
a 52 aminoacidos, devido a presena de uma regio N-terminal a mais. Estes
peptdeos apresentam o motivo S(T)-RRxhhh, onde h um resduo hidrofbico, e so
menos hidrofficos do que seus homlogos Sec, apresentando uma alta carga negativa
na poro N-terminal e positiva na poro C-terminal. Apesar da dificuldade de se
caracterizar peptdeos sinais vinculados ao sistema de secreo tipo III superada
pela estrutura conservada destas protenas efetoras em mltiplos gneros de micrbios
patognicos de plantas. Estudo de mutao por deleo mostrou que a informao
essencial para a secreo destas protenas est localizada no 10 e 15 primeiros
aminocidos (PRESTON et al. 2005). Muitas das protenas de secreo do tipo III
requerem uma chaperona para sua secreo, que, a exemplo da protena HopPtoV que
necessita da ligao da chaperona ShcV na poro N-terminal de sua sequencia, entre
os aminocidos 76 e 125 (WEHLING et al. 2004). A fim de se identificar padres
associados com estas protenas, observou-se um vis nos primeiros 50 resduos de
aminocidos, com uma frequncia maior de serina e prolina nas primeiras cinco
posies, alm de um aminocido hidrofbico na posio 3 ou 4 e a falta de nas
primeiras 12 posies (GUTTMAN et al. 2002; PETNICKI-OCWIEJA et al. 2002; ALFANO
and COLLMER 2004), e ento foi possvel estabelecer parmetros para o treinamento
de mquina (learning machine) para seleo destas protenas a partir de um banco de
dados de protenas.
Para os sistemas de secreo tipo I, II e V, as tentativas de se criar uma

ferramenta de bioinformtica para predio destas protenas no tem sido bem
sucedidas, pois, a exemplo do sistema de secreo tipo II, o sinal para que a protena
seja secretada depende da estrutura secundria ou terciria da protena. Alguns
estudos indicam que cada protena se dobrou e apresentou o motivo de secreo sua
maneira, o que resulta num alto grau de especificidade com a exoenzima, que ir atuar
neste motivo; e at comparaes estruturais tridimensionais de protenas secretadas
pelo mesmo sistema no revelam um padro de secreo unificado (BOULEY et al.
2001; CHAPON et al. 2001). Alm disto, existem outros fatores a serem considerados,
como a proximidade dos genes que codificam para a maquinaria de transporte,
homologia com protenas ou domnios identificados previamente, e a presena de
sequencia promotora a montante do gene (do ingls, upstream).
A bem pouco tempo atrs, o sistema de secreo tipo IV tambm se
enquadrava neste panorama. Entretanto, atualmente, foram desenvolvidas algumas
ferramentas capazes de predizer protenas do sistema de secreo tipo IV, um sistema
homlogo aos sistemas de conjugao e ao sistema VirB de A. tumefaciens,
facilitando a translocao de DNA, e secretando tanto cidos nuclicos quanto
protenas. A disponibilidade destas ferramentas hoje s possvel graas ao
sequenciamento de diversos genomas de patgenos, pois so baseadas na triagem
feita nestes genomas associados a natureza bioqumica destas molculas. Basicamente,
o learning machine feito baseado nas seguintes caractersticas: busca pelo motivo
RRRSNTTTTY em 300 pb, denominado de novo motif search; homologia com
molculas efetoras conhecidas; presena de domnios eucariticos (no total, so 58
domnios); protenas com domnio de funo desconhecida (DUF); busca por
peptdeo sinal de localizao nuclear (NLS, do ingls, nuclear localization signal);
probabilidade com P>0,095 da protena possuir um sinal de localizao mitocondrial;
presena de um resduo de cistena seguido de dois resduos alifticos e um quarto
aminocido (CaaX); probabilidade de formao de estrutura em espiral nos 28
resduos da protena; basicidade C-terminal; hidrofobicidade da poro C-terminal e
global; e a presena do bloco EEXXE nos 30 aminocidos da poro C-terminal
(MEYER et al. 2013).
Na Tabela 3 esto sumarizadas algumas destas ferramentas disponveis, tanto
para anlises via internet, quanto para instalao da ferramenta na mquina.
possvel observar o tipo de algoritmo utilizado para o desenvolvimento destas

ferramentas; para o sistema de secreo tipo III, com caractersticas mais bem
definidas, so utilizados principalmente o Modelo oculto de Markov (Hidden Markov
Model HMM), Mquina de vetores de suporte (Support Vector Machine) e Redes
neurais (do ingls, Neural Networks); enquanto que o sistema de secreo tipo IV,
mais complexo, utiliza uma forma modular escrita em Perl (linguagem de
programao estvel e multiplataforma).
Para facilitar ainda mais o uso de ferramentas de bioinformtica e possibilitar
ao usurio agrupar vrios softwares numa nica interface, surge o software Galaxy,
que executado na plataforma Linux/Unix e fornece ao usurio uma interface
baseada em navegador (COCK et al. 2013). Para a predio de sistemas de secreo
em protenas h um repositrio (WHISSON et al. 2007) que contem as ferramentas
SignalP (PETERSEN et al. 2011), para a predio de peptdeo sinal; TMHMM, para a
predio de domnios trans-membrana(KROGH et al. 2001); PSORTb (YU et al. 2010),
para protenas de arquea/bactrias; WoLF PSORT (HORTON et al. 2007), para
protenas fngicas, animais e de plantas; Promoter , para promotores eucariticos para
polimerase II; e Oomycete RXLR motifs (WIN et al. 2007; WHISSON et al. 2007), para
predio de motivos RXLR; onde o usurio entra com o arquivo fasta na pgina do
Galaxy e o resultado mostrado na mesma interface, com possibilidade de download
dos dados.
Tabela 3 Ferramentas de bioinformtica desenvolvidas para predio de peptdeos

sinais (secreo) na poro N-terminal das protenas (adaptado de Preston et al.,
2005)
Ferramenta
Referncia
Tipo de Algoritmo
CELLO v.2.5
(YU and LIN

2004)
(KLL et al.
2007)
Mquina de vetores de
suporte
Modelo
oculto
de
Markov
PSORT-b
v.3.0
(YU et al.
2010)
SigCleave
(VON HEIJNE
1986)
Modelo
oculto
de
Markov e
suporte
Matriz de contagem
(Scoring matrix)
Phobius
Sistema de
Secreo
Tipo III
Caminho
http://cello.life.nctu.edu.tw/
Tipo III
http://phobius.binf.ku.dk/
Tipo III
http://psort.org/psortb/inde
x.html
Tipo III
http://emboss.sourceforge.n
et/
Parte
do
pacote
de
programas EMBOSS
SignalP4.1
(PETERSEN
et al. 2011)
Redes neurais e
Modelo
oculto
Markov
Redes neurais
Tipo III
http://www.cbs.dtu.dk/servi
ces/SignalP/
Tipo III
http://gpcr.biocomp.unibo.i
t/predictors/
requer autenticao para o
uso
http://www.bioinfo.tsinghu
a.edu.cn/~guotao/predict.ht
ml
de
SPEPlip
(FARISELLI
et al. 2003)
SubLoc 1.0
(GUO et al.
2004)
suporte
Tipo III
Effective
(JEHL et al.
2011)
Tipo III
Galaxy
(COCK et al.
2013)
S4TE
(MEYER et
al. 2013)
(WANG et al.
2014)
Banco de dados. Une

anotao motivos de
diversos genomas pelo
Pfam e SignalP para
predio de sinal de
secreo
Interface baseada em
navegador.
Usa
repositrios
com
algumas ferramentas de
predio de protenas
secretadas
Perl
T4SE
T4EffPred
(ZOU et al.
2013)
suporte
Matriz de contagem
(Scoring matrix)
suporte
Matriz de contagem
(Scoring matrix)
Tipo III e
IV
http://effectors.org/
https://usegalaxy.org/
Tipo IV
http://sate.cirad.fr/
Tipo IV
http://biocomputer.bio.cuhk
.edu.hk/softwares/T4SEpre/
Tipo IV
http://bioinfo.tmmu.edu.cn/
T4EffPred/prediction.html
OS EFETORES NA AGRICULTURA
Desde os primrdios da agricultura, fitopatgenos causam devastadoras

epidemias que afetaram a humanidade (AGRIOS 2004). A seleo de culturas
resistentes a doenas tem sido prtica comum no melhoramento de plantas. Para isso,
por um longo perodo o que foi feito em quase todas as culturas foi introduzir genes
de resistncia a doenas (R) em novas variedades. Hoje sabido que os genes R esto
presentes em clusters multignicos e podem ocorrer naturalmente como verdadeiros
alelos atravs de variantes da gentica original (DANGL et al. 2013). A ativao da
funo de cada uma das protenas R feita pelo produto dos genes efetores de um
patgeno especfico de virulncia (FLOR 1971). Como mencionado anteriormente,
vrios efetores podem ser expressos por um nico patgeno e a diversidade de
efetores em uma populao de qualquer espcie patognica pode ser muito grande
(RAFFAELE et al. 2010; BALTRUS et al. 2011).
No campo, a utilizao da maioria dos alelos do gene R pode ser de curta

durao, isto porque a sua implantao em monocultura foi selecionada para variantes
do patgeno, em que o alelo correspondente do efetor, sofreu mutao ou se perdeu.
Efetores so fatores de virulncia, mas cada um contribuindo parcialmente para a
virulncia. Efetores independentes podem atuar de forma redundante podendo assim,
alterar uma mesma via de sinalizao do hospedeiro. Portanto os genes efetores
podem ser perdidos sem causar impacto significativo na virulncia do patgeno.
Excees a este princpio so os efetores fundamentais, definidos operacionalmente
por sua ampla distribuio na populao de um determinado patgeno e sua
contribuio para a virulncia do mesmo (DANGL et al. 2013). As bases genmicas
so utilizadas para identificar efetores fundamentais e defini-los como funcionalmente
novos alelos R e suas atividades so usados como estratgia promissora para a
pesquisa e implantao de plantas resistentes a doenas.
Em 1986 foi demonstrado o sucesso da construo de uma planta transgnica
resistente doena. Esta planta apresentava expresso constitutiva de uma sequencia
gnica da protena da capa viral que conferiu resistncia ao vrus atravs de pequenos
RNAs. Hoje, este mecanismo conhecido e amplamente aplicvel para a inibio da
replicao viral (LINDBO and DOUGHERTY 1991). A tabela 4 mostra um exemplo de
hbridos de abbora que adquiriram resistncia multiviral atravs da combinao de
genes da capa proteica de trs tipos diferentes de vrus. Em 1994, uma estratgia
semelhante foi implantada para combater o vrus da mancha anelar do mamoeiro, que
em testes de campo demonstrou excelente eficcia e frutos de alta qualidade (Tabela
4). Hoje este fruto aprovado para venda no Hava, Canad e Japo. No final de 1990,
desde a aprovao e comercializao dessas duas culturas, nenhuma nova cultura
modificada para resistncia a doena chegou ao mercado. A tabela 4 mostra algumas
pesquisas em outras culturas que apresentaram sucesso e ainda com potencial para
reduo de perdas de produo e insumos qumicos associados doena.
Outra estratgia para obteno de plantas resistentes a doena durvel o uso
de efetores alvos. Para isso, mesmo nos genomas de plantas mais complexas,
atualmente o uso da gentica e genmica uma realidade facilitando assim o
isolamento de gene R (PERIYANNAN et al. 2013; SAINTENAC et al. 2013). Com as
tecnologias rpidas e de baixo custo de sequenciamento de DNA, um novo patgeno
pode ser isolado e seu genoma gerar informaes com impacto sobre estratgias de
melhoramento para um durvel controle de doenas de planta (VLEESHOUWERS et al.
2011). Sendo agora possvel definir os genomas de isolados patognicos de plantas

infectadas e tambm de maneira rpida e eficiente, definir o complemento do efetor.
Usando ensaios de co-expresso transiente seguida por melhoramento de marcador
assistido ou desenvolvimento de transgnico, possvel definir os efetores
fundamentais que facilitam a identificao de genes R ativados pelos seus efetores
correspondentes de germoplasma selvagem. Esses novos genes R podem ser
validados pelo mtodo de edio de genoma que usa efetor ativador de transcrio de
nucleases (TALEN) (SCHORNACK et al. 2013) e tecnologia de repeties de
agrupados de palndromo curto intervalados regularmente (CRISPR) (JINEK et al.
2013; GAJ et al. 2014).
de grande importncia que a funo de qualquer gene R apenas ser durvel
se o efetor que o ativa estiver presente na estirpe patognica que a virulncia est
tentando ser controlada. Como por exemplo, o controle da doena da ferrugem tardia
da batata no qual o conhecimento do contedo de efetores em locais do patgeno
isolado pode informar a implantao do gene R ou tratamento qumico para o controle
desta doena (VLEESHOUWERS et al. 2011).
O emprego de receptores de sistema imune tambm uma estratgia usada na
agricultura. Existem duas classes de receptores imunes e atualmente seguem duas
estratgias principais. A primeira para transferir PRRs que detectam produtos
microbianos comuns em espcies que no as tem. Isto , identificao funcional das
PRRs e sua transferncia para uma espcie receptora que no tenha um receptor
ortlogo e que poderia fornecer um caminho geral para exemplos adicionais de
repertrio ampliados de PRRs (DANGL et al. 2013). Por exemplo, o receptor PRR EFTu (EFR) reconhece o fator de traduo de alongamento EF-tu bacteriano. A
implantao de EFR em Nicotiana benthamiana ou Solanum Lycopersicum (tomate),
que no pode reconhecer o EF-Tu, conferiu resistncia a uma ampla gama de
patognicos bacterianos (LACOMBE et al. 2010).
A segunda estratgia conhecida como estratgia de empilhamento no qual
explora respostas imunes em contextos em que vrios genes NLR so implantados
simultaneamente. Cultivares geradas por qualquer melhoramento molecular de DNA
assistido ou por transferncia gnica deve proporcionar resistncia mais durveis a
doenas porque a evaso de patgeno exigir mutaes em mltiplos genes efetores.
O acesso a uma enorme diversidade gentica permitido devido aos avanos em
sequenciamento de DNA das principais culturas e seus parentais para uma grande
quantidade de genes NLR funcionalmente dirigidos contra diferentes efetores

fundamentais (DANGL et al. 2013). Baseado na descoberta do gene efetor avrBs2 da
bacteria Xanthomonas perforans, agente causal da doena da pinta bacteriana do
pimento e do tomate, possibilitou a procura de um gene R potencialmente durvel.
Este gene encontrado na maioria das espcies de Xanthomonas que causam doena
e necessrio para a aptido do patgeno (KEARNEY and STASKAWICZ 1990). Plantas
de tomates foram transformadas com o gene Bs2, que um gene NLR isolado de uma
pimenta selvagem, Capsicuum chacoense e este, inibiu o crescimento de estirpes do
patgeno que foram transformadas com o gene avrBs2. Foram realizados ensaios de
campo com essas plantas transgnicas que expressam Bs2 de tomate, sem o uso de
produtos qumicos bactericidas, essas plantas demostraram robusta resistncia para X.
perforans (HORVATH et al. 2012).
Outra classe de genes relacionados resistncia de plantas a doena e que tem
evoludo para agregar funes de virulncia do patgeno criando armadilha para
impedir a proliferao do patgeno so chamados de executores e estes so
contrastantes aos PRRs e NLRs. Como por exemplo, em Xanthomonas e Ralstonia
foram identificados efetores de ativao de transcrio (TAL) que so protenas
secretadas dentro das clulas da planta que se ligam no DNA e ativam a expresso de
genes de acolhimento para melhorar a virulncia do patgeno (SCHORNACK et al.
2013). A expresso de um gene executor s ocorre pela induo de um efetor TAL
especfico e eles no so expressos na ausncia de infeco. Transformaes
utilizando genes executores foi demonstrado com sucesso em plantas de pimenta
(RMER et al. 2009) e arroz (HUMMEL et al. 2012).
Estes foram alguns exemplos de aplicao dos efetores como ferramenta para
desenvolver novas variedades de plantas resistentes a doenas. Muitos so os desafios
e a rea a ser explorada ainda grande, porm as perspectivas de melhora dessas
estratgias avanam significativamente por causa dos estudos moleculares minuciosos
e continuo do sistema imunolgico das plantas cada vez mais rpido e com
tecnologias de sequenciamento de genomas cada vez mais baratas.
Tabela 4. Exemplo de publicaes de culturas transformadas para resistncia doenas e situao atual das plantas.
Ano de publicao
2012
2012
Cultura
Tomate
Arroz
Mecanismo
geneR da pimenta
Transformada com geneE
Estado de desenvolvimento
8 anos de ensaios em campo
Laboratrio
Trigo
Resistencia a Doena
Pinta bacteriana
Crestamento bacteriano e risca
bacteriana
Bolor quebradio
2012
geneR do trigo superexpressado
2011
Maa
Crosta da Maa por fungus
Gene tionina da cevada
2011
Batata
Virus Y da Batata
2010
Maa
Fogo da ferrugem
Resistncia derivada de
patgeno
Protena antibacteriana da traa
2010
2010
2010
Tomate
Banana
Laranja doce
PRR de Arabidopsis
Gene raro de pimenta
Xa21
2009
2009
Batata
Batata
Resistncia multibacteriana
Murcha por Xanthomonas
Resistncia/tolerncia
Xanthomonas axonopodis pv. citri
Requeima
Requeima
2 anos de ensaio em campo at

o momento da publicao
1 ano de ensaio em campo at o
momento da publicao
Escala de Laboratrio
2 anos em ensaio de campo
Green house
2008
Batata
Requeima
Genes R de parental selvagem
2008
Ameixa
Varola da ameixa
2005
2002
Arroz
Cevada
Risca bacteriana
Ferrugem da Haste
2001
Laranja doce
1997
Mamo
Resistncia/tolerncia a
Phytophthora citrophthora
Vrus da mancha anelar
patgeno
geneR do milho
Gene RLK da cultivar de
cevada resistente
PR-5
1995
Abbora
Mosaico de trs vrus
1993
Batata
Vrus X da batata
Fonte: (DANGL et al. 2013); e as informaes sobre laranja doce: (FAGOAGA et al. 2001; MENDES et al. 2010)
Genes R de parentais selvagens

Genes R de parental selvagem
patgeno
patgeno
Enzima induzida por interferon
de Mammalian
3 anos em ensaio de campo

Regulamentao aprovada, sem
vendas comerciais
Laboratrio
Laboratrio
Green house
Aprovada e vendida
comercialmente desde 1998,
vendido no Japo desde 2012
Aprovada e comercialmente
vendida desde 1994.
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Efetores na interação planta-patógenos

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EFETORES NA INTERAO PLANTA-PATGENOS

Os processos envolvido na resposta ETI envolvem a secreo de efetores para

Figura 1: Representao esquemtica da co-evoluo entre plantas e patgenos.

Aps reconhecimento de um PAMP ou efetor, o sistema imune das plantas

PAMPs, PRRs, efetores e genes de

resistncia, podem levar ao desenvolvimento de novas estratgias para o controle de

IMUNIDADE DESENCADEADA POR PAMPS (PTI)

geralmente repeties ricas em leucina (LRRs) ou motivo de lisina (Lysm) no

Tabela 1: PAMPs, MAMPs, DAMPs e HAMPs j descritos e seus respectivos

(LIU et al. 2012)

(WILLMANN et al. 2011)

(ZEIDLER et al. 2004)

(WANG et al. 2013)

(KUNZE et al. 2004)

(BRUNNER et al. 2002)

(FLIEGMANN et al. 2004)

(RON and AVNI 2004)

(BASSE et al. 1992)

(YAMAGUCHI et al. 2000)

(SHINYA et al. 2012)

(MIYA et al. 2007)

(WAN et al. 2012)

(KROL et al. 2010)

(CHOI et al. 2014)

(HALITSCHKE et al. 2001)

(SCHMELZ et al. 2007)

Fator Tu de elongao (EFTu)

Sinais da prpria planta

A protena PRR mais estudada a FLS2 (Flagelin Sensing 2) que foi

caracterizados de PRRs incluem o EFR que reconhece o eptopo elf18 de EF-Tu em

At recentemente, muito pouco se sabia sobre a biologia dos efetores e

sequenciamento de genomas tem sido possvel predizer candidatos a efetores numa

sentido a definio de efetores mais correta e atual : molculas liberadas ou

citoplasmticos, que so os que podem se translocar atravs da membrana celular e

protenas modulares que carregam peptdeos N-terminais seguidos por motivos

Figura 2: Esquema ilustrativo da suscetibilidade desencadeada por efetores (ETS).

Figura 3: Estrutura tpica de um efetor citoplasmtico. Todos os efetores,

Inibio de enzimas (hidrolases) no apoplasto,

Inibio de ativao de PRRs,

Inibio de cascatas de sinalizao mediadas por MAP-quinases,

Modificao do transcriptoma relacionado a respostas de defesa,

Degradao de componentes/protenas relacionadas a defesa,

Interferncia na secreo de protenas e trfego vesicular,

Secreo orquestrada de efetores

anterior entrada do patgeno so liberados efetores ChCEs para preparar a entrada

Figura 4. Resposta da planta ao ataque de patgenos (bactrias, fungos e oomicetos)

(prolina-glicina-serina-treonina) para degradao proteica, alm de pequenos motivos

Tabela 2. Interao dos efetores de diferentes patgenos com os genes R de diversos

Cucumber mosaic virus

Soybean mosaic virus

Quando a ETI ativada, a planta desencadeia uma rpida morte celular no

jasmnico (JA) e o etileno (ET) resultando na ativao de fatores de transcrio de

COMO PROCURAR EFETORES NO GENOMA DO PATGENO?

Mas a necessidade de se conhecer melhor o sistema de secreo destas

hidrofobicidade de superfcie, no entanto, o desenvolvimento patognico em plantas

caracterizados, como os RXLR. As ferramentas desenvolvidas para a predio de

Para os sistemas de secreo tipo I, II e V, as tentativas de se criar uma

possvel observar o tipo de algoritmo utilizado para o desenvolvimento destas

Tabela 3 Ferramentas de bioinformtica desenvolvidas para predio de peptdeos

(YU and LIN

Banco de dados. Une

Desde os primrdios da agricultura, fitopatgenos causam devastadoras

No campo, a utilizao da maioria dos alelos do gene R pode ser de curta