PROGRAMA UNIFICADO DE BOLSAS DE ESTUDO PARA ESTUDANTES DE

GRADUAÇÃO

Área: Pesquisa

Avaliação do papel de neutrófilos na infecção por Leishmania

Coordenador: Prof. Dr. Mauro Javier Cortez Veliz

EDITAL 2022 -2023

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Unidade: Instituto de Ciências Biomédicas

Área: Saúde
Área temática do projeto: Saúde Pública
Grande área: Ciências Biológicas
Área: Parasitologia

Resumo

Leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitas protozoários do gênero
Leishmania, os quais são inoculados na pele dos hospedeiros durante o repasto sanguíneo do inseto
vetor, conhecidos como flebotomíneos. Assim que estes parasitas são depositados no tecido, uma
das primeiras células recrutadas no sitio da inoculação são os polimorfonucleares (PMN) conhecidos
como neutrófilos, células do sistema imune que apresentam diferentes mecanismos para capturar
patógenos, sinalizar ao sistema imune e destruir posteriormente o agente estranho antes dele se
espalhar pelos tecidos. Nesse sentido, formas infectivas de Leishmania tem conseguido ativar
mecanismos de evasão para promover a sobrevida do parasita no hospedeiro, favorecendo
posteriormente a proliferação dos parasitas. Um destes mecanismos tem sido a indução de CD200
em macrófagos do hospedeiro, ligante que quando se une ao seu receptor CD200R, inibe a resposta
do macrófago, mas nenhum dado de modulação deste ligante tem sido obtido em neutrófilosinfectados
com Leishmania. Nesta proposta, pretendemos analisar e investigar o processo de infecção em
neutrófilos por Leishmania, analisando a modulação de CD200 nestas células e analisando a presença
de neutrófilos em biopsias de amostras de leishmaniose no modelo murino e em cães infectados por
imuno-histoquímica.

Palavras chave: CD200; CD200R; Leishmania, leishmaniose cutânea; neutrófilos.

1. Introdução
A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por protozoários da família
Trypanosomatidae, género Leishmania. Estes protozoários são parasitas de fagócitos mononucleares
como macrófagos, neutrófilos e células dendríticas de mamíferos (Pearson et al., 2001). Apresenta
duas formas biológicas, os promastigotas que se desenvolvem no intestino de inseto vector e os
amastigotas que são as formas que replicam no interior das células, no hospedeiro vertebrado (Reimão
et al., 2013; Peres et al., 2008; Cegatti & Giorgio, 2007). O inseto vetor que transmite a infecção
pertencem à família Psychodidae do género Lutzomyia nas Américas e do género Phlebotomus no
resto do mundo (Pearson et al., 2001). Cada ano há aproximadamente 500,000 novos casos de
leishmaniose visceral, que causam 59,000 mortes anuais e sua incidência continuaem ascensão. A
leishmaniose está presente em quatro continentes e é considerada como endémicaem 88 países, dos
quais 72 são países em desenvolvimento. O 90% dos casos de leishmaniose visceral ocorrem em
Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal y Sudan; O 90% dos casos de leishmaniose muco-cutânea ocorrem
na Bolívia, Brasil y Perú; e o 90% dos casos de leishmaniose cutânea ocorrem em Afeganistão, Brasil,
Irán, Perú, Arábia Saudita y Síria (Desjeux, 2001).
A maior parte dos estados do Brasil são endêmicos para a leishmaniose e estão associados à
presença do vetor e de cachorros infectados que participam como reservatórios de infecção (Schafer
et al., 2011). Casos de leishmaniose tem sido registrados em todas as regiões geográficas do pais e
na ultima década, vários reportes tem sido associados com brotes epidêmicos nas regiões urbanas
(Zauli et al., 2010). Alguns dos estados com casos reportados bibliograficamente são: Mato Groso
do Sul, Pará (Silvia et al., 2008), Maranhão (Caldas et al., 2002), Rio de Janeiro (Schubach et al.,
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2004), Pernambuco (Barandão-filho et al., 2003), Ceará (Vasconcelos et al., 1994 citado por
Barandão-filho et al., 2003), Minas Gerais (Rocha et al., 1988 citado por Barandão-filho et al., 2003),
Rio Grande do Norte (Jeronimo et al., 2004), Espírito Santo (Dietze et al., 1997, citado por Jeronimo
et al., 2004), Bahia (Machado et al., 2010) e Amazonas (Camara et al., 2011).

1.1 Leishmania (Leishmania) amazonensis.

L. (L.) amazonensis é uma espécie que produz lesões cutâneas no hospedeiro mamífero, sendo
associada às formas de leishmaniose cutânea e/ou leishmaniose cutânea-difusa (Reimão et al.,2013;
Cardoso et al., 2010; Cegatti & Giorgio, 2007). Esta espécie de Leishmania vem sendo amplamente
utilizada como modelo de estudo em diferentes aspectos relacionados com a doença como: reações
imunológicas dos hospedeiros (Coêlho et al., 2010; De Souza et al., 2010; Guimarãeset al., 2009;
Santini & Alves, 2008; Arrais et al., 2005; Antoine et al., 1999; Ho et al., 1990); implementação de
novos métodos que avaliam a eficiência de compostos anti-Leishmania (Rocha et al., 2013; Reimão
et al., 2013); Além disso, também tem sido usada para o entendimento de processos celulares como
na avaliação de processos de co-infecção entre duas espécies de Leishmania (Real et al., 2010), no
estudo da correlação entre o processo de autofagia e o processo de infecção dos macrófagos
(Pinheiro et al., 2009) e na formação e propriedades de fusão dovacúolo parasitóforo de L. (L.)
amozonensis (Real & Montara, 2012; Courret et al., 2002; Antoine etal., 1990).
O vacúolo parasitóforo de L.(L.) amazonensis que é formado quando o parasita é fagocitado
pela célula do hospedeiro, caracteriza-se por ser de grande tamanho e por permitir o crescimento da
forma amastigota no interior deste. Outras espécies como L. (L.) major, apresentam vacúolos
pequenos, contendo um único amastigota cada (Castro et al., 2006). O vacúolo parasitóforo de L.
(L.) amazonensis tem um pH luminal ácido e contem moléculas como hidrolases ativas, catepsinas,
enzimas lisosomais, entre outras (Antoine et al., 1998). Nesse sentido, varias evidências apontam
que amastigotas de L. (L.) amazonensis são mais resistentes à morte intracelular por macrófagos
quando comparadas a outras espécies (Gomes, 2003, McMahon-Pratt, 2004, Alexander e Kaye, 1985).
Estes amastigotas são capazes de reduzir a produção de interleucina 12 (IL-12), do fator de necrose
tumoral (TNF-α) e de interferon gama (IFN-γ) no hospedeiro (Lapara & Kelly, 2010), moléculas
importantes que induzem a expressão de óxido nítrico sintase (iNOS), resultando na produção de
óxido nítrico (NO), potente molécula que elimina patógenos intracelulares (Gantt et al.,2001; Kane &
Mosser, 2000; Das et al., 2010). Recentemente foi demonstrado que L. (L.) amazonensis induz no
macrófago a expressão de CD200 (Cortez et al., 2011) que modula a resposta do macrófago impedindo
a produção de NO, e consequentemente prolongando a sobrevivência do parasita. Esta indução re
mediada por amastigotas intracelulares que liberam vesículas extracelulares no interior do PV,
ativando a via de sinalizacaco mediada por receptor do tipo Toll (TLR)-9 e adaptadores intracelulares
associados a TLR, MyD88 e TRIF, no macrófago infectado (Sauter., et al 2019). CD200 é uma
glicoproteína de superfície expressa em vários tipos celulares, principalmente em células linfóides,
neurônios e células endoteliais (Barclay., et al 2002).

1.2 Infecção de Neutrófilos por Leishmania

O papel dos neutrófilos, primeiras células polimorfonucleares (PMN) de defesa, é o de destruir
parasitas invasores, utilizando-se de mecanismos de fagocitose – são fagócitos “profissionais” – e
posterior destruição do conteúdo fagocitado através da ação de enzimas proteolíticas e de substâncias
reativas do oxigênio (Laskay et al., 2003). Os neutrófilos têm vida curta e, após sofrerem morte por
apoptose, são fagocitados por macrófagos, e novos PMN são liberados da medula óssea, mantendo
células altamente funcionais sempre circulantes. Os PMN são rapidamente recrutados da circulação
sangüínea para o local de inflamação via sinalização por CC-
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quimiocinas, como a IL-8, produzida por células epiteliais, endoteliais, queratinócitos e fibroblastos,
que ativa os neutrófilos de maneira intense (Laskay et al., 2003).
Na leishmaniose, estudos em modelos experimentais demonstraram que em pouco tempo após
a reação inflamatória na pele dos animais inoculados com L. (L.) major, observou-se uma intensidade
considerável de neutrófilos no local da lesão (Muller et al., 2001; Sun and Shi, 2001). O recrutamento
dos neutrófilos para o local inflamatório foi associado aos altos níveis de quimiocina MIP-2 e KC
(homóloga de IL-8 em murinos) (Muller et al., 2001). Já Laufs e colaboradores (2002) demonstraram
que a incubação in vitro de PMN humano em presença de L. (L.) major resultou, também, em secreção
elevada de IL-8. Estes dados sugerem que o recrutamento de PMN pode ser importante para o parasita
durante a infecção in vivo. Van Zandbergen e colaboradores (2002) demonstraram que promastigotas
de Leishmania são capazes de induzir e recrutar ativamente a migração de PMN humanos por meio
da liberação de um fator quimiotático (LCF). LCF possui atividade no recrutamento de neutrófilos,
sem agir nos leucócitos e células NK. Foi sugerido que o recrutamento inicial dos neutrófilos ocorra
por meio do LCF, e que a IL-8 induzida pelo parasita funcione como uma alça de amplificação do
recrutamento dos PMN para o sítio inflamatório. Além disso, demonstraram que ocorre uma
diminuição nos níveis de IP-10 nos PMN incubados com promastigotas de Leishmania. IP-10 é uma
quimiocina da classe CXC, produzida por PMN, com atividade de recrutar e ativar células NK e
linfócitos Th1 para o local da reação inflamatória, auxiliando, assim, no estabelecimento de uma
resposta imune eficiente contra patógenosintracelulares (Passelli et al., 2021). Ao diminuir a produção
desta quimiocina, acredita-se que o parasita evite a formação de uma resposta imune eficiente,
facilitando o estabelecimento da infecção(Serrano-Coll et al., 2021).
Além de influenciar a função dos neutrófilos, o parasita pode determinar o tempo de vida
destas células. Aga e cols. (2002) demonstraram que Leishmania é capaz de aumentar o tempo de vida
dos PMN ao inibir a via da caspase-3 de ativação de apoptose. Os neutrófilos possuem elevadosníveis
de pro-caspase-3 que é clivada durante o processo da apoptose, formando a caspase-3. Este processo
seria bloqueado pelo parasita, sendo dependente da presença de parasitas viáveis e fagocitados por
PMN. Ao inibir apoptose dos neutrófilos, Leishmania seria capaz de sobreviver por mais tempo no
interior de células PMN, que passariam a ter um tempo de vida de 2-3 dias. Apesarde permanecer
mais tempo vivo, o que poderia favorecer a infecção por Leishmania, o neutrófilonão é a célula-
alvo do parasita. Com isso, a apoptose ocorreria após os 2-3 dias, e o parasita, que é incapaz de se
multiplicar nestas células, deveria parasitar os macrófagos. Então, especula-se que a importância em
manter os neutrófilos parasitados mais tempo vivos, seria por que estas células emitiriam sinais
quimiotáticos – MIP-1a e MIP-1b– que atrairiam os monócitos / macrófagos (Laskay et al 2003). Ao
recrutar os macrófagos, estes reconheceriam os PMN infectados em apoptose e iniciariam o processo
de fagocitose destas células, por meio do reconhecimento de moléculas sinalizadoras do processo
apoptótico, como as fosfatidil-serinas na membrana do neutrófilo. Ao fagocitar corpos apoptóticos,
os macrófagos têm suas funções microbicidas silenciadas (Meagher et al., 1992; Sun and Shi, 2001),
representando uma importante via de evasão da resposta imune e conseqüente estabelecimento da
infecção por Leishmania (McConville et al 1992).

2. Justificativa
Infecção por L. (L.) amazonensis esta relacionada a duas formas de leishmaniose: Leishmaniose
cutânea local e leishmaniose cutâneo difusa. A distinta apresentação da doença vai depender de fatores
do parasita e da resposta do hospedeiro, mas vários detalhes e moléculas que participariamdo
processo de infecção por Leishmania, ainda permanecem na escuridão do conhecimento. Como
discutido anteriormente, vários estudos tem analisado a infecção de neutrófilos por Leishmania. A
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maior parte destes trabalhos têm sido focados no processo inflamatório, decorrente da infecção
localizada das infecções por Leishmania. Em vista desta falta de informação referente ao processo
de infecção de Leishmania em neutrófilos e o envolvimento de CD200 no processo de infecção
neste parasita, é que nos propomos investigar o processo de infecção em neutrófilos por Leishmania
e analisar a modulação de CD200 nestas células.

3. Objetivos
Objetivo general. O presente projeto tem como objetivo principal determinar a presença
de CD200 em neutrófilos infectados com L. (L.) amazonensis.

Objetivos específicos
(i) Avaliar a entrada de L. (L.) amazonensis in vitro em neutrófilos de camundongo.
(ii) Quantificar por westernblot a expressão de CD200 em neutrófilos infectados.
(iii) Analisar a presença de neutrófilos e CD200 em biopsias de leishmaniose cutânea no
modelo murino e em tecido de cães infectados por imuno-histoquímica (IHQ).

4. Resultados esperados
Várias são as lacunas científicas existentes sobre os processos biológicos e celulares que envolvem
a infecção por protozoários como Leishmania. Desta forma, o desenvolvimento de pesquisas
envolvendo esta doença é extremamente importante no combate à leishmaniose em regiões endêmicas
do Brasil (principalmente no norte do país) e em regiões não endêmicas, onde os casos de leishmaniose
continuam aumentando. O estudo dos elementos que participam e que estão envolvidos no progresso
da infeção pela Leishmania possibilitará no futuro, o desenvolvimento de estratégias para um
diagnóstico precoce e/ou para tratamentos alternativos que resultem num prognóstico positivo da
doença. O presente projeto visa estudar o envolvimento de células musculares na patogenia de
Leishmania, uma vez que estas células tem sido descritas como alvos deinfecção. Além disso, espera-
se que este projeto contribua para o desenvolvimento científico na forma de trabalhos publicados em
revistas científicas de impacto internacional.

5. Cronograma de execução

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SEMESTRES
● OBJETIVOS
- Comparar a entrada de formas infectivas de L. (L.) amazonensis in vitro
em neutrófilos de camundongo.
- Quantificar por westernblot a expressão de CD200 em neutrófilos
infectados.
- Analisar a presença de neutrófilos e CD200 em biopsias de leishmaniose
cutânea no modelo murino e em tecido de cães infectados (IHQ).

6. Delineamento experimental e metodologia resumida

Purificação e cultura de Leishmania. Culturas de L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8)
serão mantidas como promastigotas a 26oC em meio M199 suplementado com HEPES 0,1 mM, 0,1%
hemina (25 mg/mL em 0,1N NaOH), 10 mM adenina e 10% soro fetal bovino (SFB), pH 7,5 e
antibióticos. Para gerar amastigotas axênicos de Leishmania, culturas enriquecidas em formas
metacíclicas (culturas de promastigotas de 5 a 7 dias) serão incubadas na proporção de 1:1 (cultura
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de parasitas: meio) em meio M199 suplementado 0,25% glucose, 0,5% tripticase, 40 mM tampão
succinato de sódio (pH 4,5), 20% SFB e antibióticos, a 32oC por no mínimo 6 dias. Para obter
amastigotas de lesão, camundongos fêmeas C57BL/6 serão infectados na parte de cima da pata
esquerda com culturas em fase estacionária (enriquecidas de formas metacíclicas) de L. (L.)
amazonensis, e depois de 4-5 semanas os camundongos serão sacrificados e os parasitas recuperados
da lesão como foi descrito por Cortez e colaboradores (2011).

Biopsias e Animais de experimentação. Amostras de tecido infectado (lesão e baço) foram

obtidos e processados de Camundongos C57BL/6 obtidos do biotério do Departamento de
Parasitologia da Universidade de São Paulo, os quais foram aprovados pelo CEUA com No de
protocolo 056. Estes tecidos já estão em blocos de parafina para processar. Amostras de cães
infectados foram cedidas em blocos em parafina para análise e receberam aprovação do Comitê de
Ética Animal do ITPAC-Porto Nacional, conforme No de protocolo 005/2015).
Fêmeas de camundongos C57BL/6 serão utilizadas para obtenção de neutrófilos, injetando
Amido (0,5%) na cavidade peritoneal dos animais. Após 4 h, os amimais serão sacrificados e o
conteúdo peritoneal coletado para posterior análise e delineamento experimental. O procedimento e
usso de animais recebeu aprovação da CEUA com o No de protocolo 08/2017, recentemente
prorrogado. Todos os procedimentos e inclusão de novos alunos terão a aprovação pela Comissão de
Ética em Pesquisa do Instituto de Ciências Biomédicas (ICBII) da Universidade de São Paulo.

Infecção experimental in vitro. Os ensaios de infecção in vitro serão realizados em placas

de 6 poços contendo neutrófilos em 2 ml de meio RPMI. As células serão incubadas por 24 h e
posteriormente infectadas com formas amastigotas (5:1; parasitos: neutrófilos) de L. (L.)
amazonensis ou com formas metacíclicas (10:1; parasitos: fibra). Após uma hora de incubação (sendo
definido este ponto como tempo 0 h), as amostras serão lavadas em PBS e um meio novoserá
adicionado para incubar as células nos diferentes pontos de infecção (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, etc).
Amostras de neutrófilos infectados serão retiradas em cada tempo após a infecção para ensaios
imunofluorescência, microscopia eletrônica, qPCR e western blot.

PCR em tempo real quantitativo ou qPCR. PCR em tempo real será realizado num
aparelho “StepOnePlus” (Applied Biosystems) utilizando a sonda fluorescente verde SYBR green
(BioRad Laboratories), de acordo com as instruções do fabricante. Oligonucleotideos iniciantes ou
“primers” serão utilizados para amplificação de diferentes genes alvos (CD200, iNOS, miosina,
LYST, IFN-gamma) e genes controle (HPRT1). A reação será incubada por 3 minutos a 95°C e depois
45 ciclos de 20 segundos cada a 95°C, e 1 minuto a 55°C. Todas as reações serão feitas em triplicata
e controles negativos serão incluídos em cada experimento. Os dados serão normalizados pelo nível
do gene controle em amostras individuais e expressadas como valores normais sobre os valores
obtidos de fibras musculares não infectadas.

Imunohistoquímica. As amostras de tecido fixadas em PFA 4% foram embebidas em

parafina (Sigma-Aldrich) no banho histológico EP31-20151 (Easy Path) e cortadas a cada 3 µm
longitudinalmente em micrótomo HM315 (MICROM). As amostras em blocos de parafina serão
cortadas, desparafinadas e hidratadas, montando varias amostras em laminas de vidro. Os cortes de
tecido serão bloqueadas para peroxidasse endógena com uma solução de H2O2 e metanol, e mantidas
em tampão Tris (Trisma base, NaCl, H2O destilada, pH 7,6). Posteriormente, o tecido será
bloqueado com UltraVision Protein Block (Thermo Scientific) por 30 min a 37°C em câmera
húmida, e lavado uma vez com tampão Tris. O tecido será incubado overnight com anticorpos
primários (marcadores específicos de neutrófilos como: anti-mieloperoxidase, anti-elastase, anti-
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Ly6G (Rheabiotech, Campinas); anti-CD200 and anti-CD200E da R&D Systems; e anticorpo anti-
Leishmania), diluídos em BSA 5% em câmera húmida a 8°C. O anticorpo primário será retirado
com tampão Tris e o anticorpo secundário R.T.U Vectastain Kit (composto por: RTU Biotinylated
Universal Antibody anti-Rabbbit/Mouse Ig -feito em cavalo- e Vectastain-RTU Elite abc Reagent)
(VECTASTAIN, Vector Laboratories) será incubado por 30 min a 37°C. Após retirar o anticorpo
secundário com tampão Tris, a diaminobenzidina (DAB, tampão Tris, H2O2) será adicionada por 5
segundos e posteriormente lavado com água. Finalmente, os cortes serão corados com hematoxilina
e submersos em álcool em concentrações crescentes (70, 95, 100%) e xilol. Os cortes serão montados
com resina e será observada a presença de sinal dos diferentes marcadores de neutrófilos, assim como
também de parasitos no tecido. As imagens serão obtidas com microscópio Leica DMLB acoplado à
câmera Leica DFC265.

Avaliação da viabilidade celular. A viabilidade das células murinas será avaliada por
coloração com azul de Trypan (Gibco) e por marcação com iodeto de propídeo e analisadas por
citometria de fluxo. No segundo método, células a uma concentração de 1 ×107 células/mL, em
PBS, serão incubadas na presença de iodeto de propídeo (Sigma-Aldrich), a uma diluição de 1:500,
por 1 minuto, a 25°C. As células serão então lavadas com PBS (pH 7,2) e ressuspendidas em uma
solução de 1% de paraformaldeído, 47,7 mM cacodilato de sódio e 113 mM NaCl (pH 7,2). Por fim,
as células serão analisadas por citometria de fluxo.

“Western Blot” e imunoprecipitação. De 15-50 µg de proteína de extrato celular serão

separadas em condições reduzidas em gel de poliacrilamida-SDS 10% ou 12%, transferidas à
membrana de nitrocelulose e marcadas com diferentes anticorpos primários e respectivos anticorpos
secundários acoplados à peroxidase. Para procedimentos de imunoprecipitação será usado o kit da
Pierce “Pierce Crosslink Immuno-precipitation Kit” segundo descrito pelo fabricante.

Análise estatística. Para avaliar a significância dos resultados será feita a análise estatística
de todos os experimentos pelos testes ANOVA disponíveis no programa GraphPad Prism versão
5.1.

7. Detalhamento das atividades a serem desenvolvidas pelo aluno PUB

- Introdução ao laboratório: O aluno aprenderá da organização e estruturação do laboratório,
assim como de procedimentos de biossegurança. Presencial.
- Introdução às técnicas de laboratório: O aluno acompanhará de forma teórica as atividades
dos alunos do laboratório. Presencial.
- Prática em técnicas do laboratório. O aluno aprenderá a realizar de forma prática algumas
das técnicas do laboratório. Presencial.
- Revisão bibliográfica. O aluno deverá ler material bibliográfico disponibilizado pelo
coordenador do laboratório para introduzir dados importantes no material a ser divulgado. A data e
horário serão escolhidos de comum acordo entre o supervisor e o aluno, cumprindo com a carga
horária do PUB. Ambiente virtual.
- Mini-projeto de pesquisa. O aluno(a) desenvolverá o projeto apresentado com a supervisão
de um aluno de pós-graduação que acompanhará o desenvolvimento dos objetivos citados.
Presencial.

8. Resultados esperados
Para o presente trabalho, têm-se como resultados esperados:
• Inserção do estudante de graduação no processo de aprendizado em pesquisa, colaborando
com o grupo de pesquisa em diferentes técnicas de laboratório, assim como também participando de
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experiências teóricas como reuniões de laboratório, seminários e estudo específico do tópico de

pesquisa;
• Inserção de atividades interativas no ambiente presencial, possibilitando novas
experiências de interação;

9. Referencias bibliográficas.
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