PRÉ-PROJETO PARA A SELEÇÃO DE DOUTORADO (2020-1)

Candidata: Camilla Malcher Pesset

Orientação: Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues
Bruno de Araújo Penna

Título: “Avaliação da participação de diferentes genes na adesão, formação

de biofilme e virulência de Staphylococcus pseudintermedius”

Resumo

Staphylococcus pseudintermedius é uma bactéria comensal e considerado um patógeno

oportunista de cães. É responsável por diversas infecções, incluindo piodermite, bacteremia,
infecções de sítio cirúrgico (ISC) e infecções relacionadas a dispositivos médicos. Apesar de
incomum, tem sido cada vez mais relatada a transmissão zoonótica desse patógeno,
principalmente infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) em humanos. Sua
capacidade de formação de biofilme é o principal motivo de infecções persistentes e quando
formado na superfície de dispositivos médicos, se torna uma fonte de morbidade significativa,
impactando a cicatrização e o tratamento. S. pseudintermedius resistente à meticilina (MRSP)
surgiu rapidamente em animais de companhia causando infecções hospitalares, o que limita
ainda mais as opções de tratamento. As infecções por MRSP também podem ser consideradas
um problema de saúde pública, já que possui potencial zoonótico. A alta densidade bacteriana
nos biofilmes favorece a comunicação célula-célula via quorum-sensing, sendo o sistema agr
o principal regulador da virulência nos estafilococos. Polysaccharide Intercellular Adhesin
(PIA), codificado pelo operon ica, é uma das principais substâncias poliméricas extracelulares
encontradas em biofilmes de estafilococos, atua na adesão às células hospedeiras e está
envolvido na evasão da resposta imune. Assim como as proteínas de superfície (Sps), que são
responsáveis pela colonização inicial, sobrevivência bacteriana e estabelecimento do processo
infeccioso. Porém, em espécies de estafilococos associadas a animais, como S.
pseudintermedius, pouco se sabe sobre o processo de formação de biofilme, seus mecanismos
genéticos e os fatores de virulência envolvidos. Portanto, o objetivo deste trabalho é investigar
o papel dos genes associados a proteínas de superfície (Sps), ao operon ica e ao sistema agr
na formação de biofilme de S. pseudintermedius em dispositivos médicos. Serão silenciados
cinco genes de proteínas de superfície (SpsD, SpsL, SpsO, SpsP e SpsQ), quatro genes do
operon ica (icaA, icaB, icaD e icaC) e quatro genes do sistema agr (agrA, agrB,agrC e
agrD) utilizando-se do sistema CRISPR-Cas9. As cepas silenciadas serão testadas quanto sua
capacidade de formação de biofilme em dispositivos médicos (material ortopédico de titânio,
fios de sutura, cateter, sondas e drenos). Será feito ensaio colorimétrico para quantificar o
biofilme. Contagem de UFC para avaliar a viabilidade. Avaliação da composição do biofilme
através da extração de componentes da matriz extracelular polimérica. Avaliação estrutural e
da arquitetura do biofilme através da microscopia eletrônica de varredura e confocal. Por fim,
avaliação da virulência in vivo com o uso de Galleria mellonella. Como comparativos serão
utilizadas duas cepas selvagens da mesma espécie obtidas em estudos anteriores (uma
resistente à meticilina e outra sensível). E como controle positivo será utilizada uma cepa
referência (ED99). Elucidar o papel dos diferentes genes na formação de biofilme vai
contribuir com a compreensão do estabelecimento do processo infeccioso, bem como abrir
portas para novas abordagens de tratamento.

Palavras-chave: Staphylococcus pseudintermedius, biofilme, fatores de virulência,

dispositivos médicos
1 – Introdução
As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) são de difícil erradicação e
correspondem a um número elevado de casos. Principalmente quando associadas a bactérias
formadoras de biofilme, representando cerca de 70% dos casos (HENRIQUES et al., 2013). S.
pseudintermedius resistentes à meticilina (MRSP) emergiram rapidamente em animais de
companhia causando IRAS, tornando-se uma das principais causas de piodermite e infecções
de sítio cirúrgico (ISC) em cães (DICICCO et al., 2012). MRSP também pode ser considerado
um problema de saúde pública, uma vez que pode ocorrer a transmissão zoonótica (PAUL et
al., 2011; PENNA, 2014).
O uso de dispositivos implantáveis está associado às infecções de sítios cirúrgicos,
sendo as bactérias do gênero Staphylococcus importantes patógenos responsáveis por essa
infecção (DAROUICHE, 2004). A patogênese das infecções estafilocócicas relacionadas a
estes dispositivos se dá, principalmente, por conta da habilidade destas bactérias de formar
biofilme (OLIVEIRA, 2014).
Infecções de sítio cirúrgico são potenciais complicações em procedimentos
cirúrgicos, resultando numa maior morbidade do paciente e custos adicionais de tratamento
(TURK et al., 2015). Em alguns casos são necessários procedimentos cirúrgicos adicionais
para remoção do implante (NICOLL et al., 2014). Pouco se sabe sobre a capacidade de adesão
de Staphylococcus pseudintermedius, incluindo cepas MRSP, sobre materiais cirúrgicos e o
risco subseqüente do paciente desenvolver uma ISC (MORRISON et al., 2015). Além disso, há
diversos materiais que compõem dispositivos médicos, que possibilitam a aderência bacteriana
à sua superfície e consequente produção de biofilme (NAZARALI et al., 2017). A presença de
biofilme em um dispositivo médico pode impactar diretamente no tratamento de uma ISC
(DONLAN, 2002).
O biofilme bacteriano é uma comunidade microbiana séssil e complexa, embebida
por uma matriz extracelular composta de carboidratos, material genético e/ou proteínas. Esse
processo favorece a persistência de bactérias no local e aumenta a resistência contra efeitos
adversos do ambiente, incluindo a ação do sistema imune do hospedeiro e dos antimicrobianos
(PERCIVAL et al., 2012). Facilita a comunicação célula-célula via quorum-sensing e os
processos de troca horizontal de genes, gerando vantagem aos microrganismos e contribuindo
com a manutenção do processo infeccioso, bem como garantindo uma forte adesão bacteriana a
superfícies bióticas e abióticas (WOLSKA et al., 2016; OTTO, 2018). Após a implantação de
um dispositivo médico em um paciente, este é rapidamente revestido por proteínas da matriz
extracelular (MEC), como o fibrinogênio, permitindo a colonização bacteriana (PICKERING
et al., 2019). Iniciando o processo de adesão e consequentemente favorecendo a formação de
biofilme (DONLAN, 2002).
Os principais fatores de virulência de S. pseudintermedius responsáveis pela
colonização inicial e estabelecimento do processo infeccioso são as proteínas de superfície
(Staphylococcus pseudintermedius surface proteins – Sps). Até então foram descritas 18 Sps
distintas em S. pseudintermedius (BANNOEHR & GUARDABASSI, 2012). Acredita-se que
estão associadas à sobrevivência bacteriana, formação de biofilme, evasão do sistema imune e
adaptação ao hospedeiro (PHUMTHANAKORN et al., 2017). Porém, a participação destas
proteínas na patogênese da espécie ainda permanece pouco estudada (POMPILIO et al., 2015).
A formação de biofilme em estafilococos está intimamente relacionada com a presença
do operon ica, responsável por codificar o polissacarídeo de adesão intracelular
(Polysaccharide Intercellular Adhesin – PIA) (WOLSKA et al., 2016). O operon ica é
constituído por cinco genes icaA, icaD, icaB, icaC e icaR. O gene icaA codifica a enzima N-
acetilglicosamina transferase, responsável por sintetizar o polímero N-acetilglicosamina,
constituinte do PIA. O gene icaD atua em conjunto com o icaA, aumentando a atividade da
enzima codificada por este. O gene icaC juntamente com os genes A e D permite a formação
de cadeias de N-acetilglicosamina mais longas. O gene icaB é o menos conhecido, mas
acredita-se que ele codifica uma deacetilase que remove grupamentos de acetila, fazendo com
que o polímero N-acetilglicosamina fique carregado positivamente. O gene icaR regula a
expressão dos genes do operon (ARCIOLA et al., 2005).
A alta densidade de bactérias dentro do biofilme forma um ambiente oportuno para a
comunicação via quorum-sensing, exercida pela liberação de moléculas autoindutoras (OTTO,
2018). Permitindo a coordenação de diversos processos nas células bacterianas como, por
exemplo, a expressão de fatores de virulência (ARCIOLA; CAMPOCCIA, 2018). O Sistema
Regulador de Genes Acessórios (Agr System) é o principal regulador de virulência nos
estafilococos, composto por quatro genes: agrA, agrB, agrC e agrD. O gene agrD codifica a
proteína AgrD, que é a precursora do peptídeo autoindutor (autoinducing peptide - AIP). O
gene agrB é responsável por codificar a proteína AgrB, que processa e exporta AIP. Os genes
agrC e agrA são responsáveis por codificar o receptor quinase de dois componentes
AgrC/AgrA, que tem a função de detectar o AIP, promovendo feedback positivo para a
sinalização via sistema agr, produção de proteases e toxinas, bem como um feedback negativo
na expressão de proteínas de superfície (LITTLE et al., 2019).
Apesar de haver muitos estudos sobre biofilme no gênero estafilococos, espécies
veterinárias não seguem o mesmo padrão. Poucos trabalhos tratam sobre a capacidade de
formação de biofilme de S. pseudintermedius, e alguns trazem resultados contraditórios. Sendo
assim, o presente estudo tem como objetivo principal investigar o papel dos genes associados
à formação de biofilme em S. pseudintermedius em diferentes dispositivos médicos, bem como
a sua influência na virulência.

2 – Justificativa para o estudo

S. pseudintermedius é o principal patógeno de infecções caninas, associado a
diferentes manifestações clínicas. O surgimento de cepas resistentes à meticilina é uma
preocupação tanto para medicina veterinária quanto para humana, por conta do seu potencial
zoonótico. Poucos estudos são dedicados a elucidar os fatores de virulência desta espécie, em
especial o biofilme. Apesar de ser um fator intimamente ligado a infecções associadas a
dispositivos médicos. Logo,os resultados encontrados neste estudo poderão contribuir para um
maior entendimento dos fatores de virulência e elucidar os mecanismos genéticos associados à
formação de biofilme por esta espécie em dispositivos médicos.

3 – Material e métodos
3.1 Obtenção de cepas knockouts: Estabelecer uma metodologia para padronizar a tecnologia
CRISPR-Cas9 para silenciar os genes sps (spsD, spsL, spsO, spsP e spsQ), genes do operon ica
(icaA, icaD e icaC) e genes do sistema agr (agrA, agrB, agrD e agrC). A partir de uma cepa
de referência (ED99) (TAGLIAFERRI et al., 2019). A técnica já está bem padronizada para
outros grupos bacterianos, inclusive outros Gram-positivos.
3.2 Formação de biofilme em dispositivos médicos: As amostras serão testadas quanto a
capacidade de formação de biofilme em dispositivos médicos (material ortopédico de titânio,
fios de sutura, cateter, sondas e drenos). A comparação será feita com uma cepa de referência
(ED99) e duas amostras selvagens (uma sensível à meticilina e outra resistente), já
caracterizadas previamente.
- Avaliação da estrutura e arquitetura do biofilme através da microscopia eletrônica de
varredura e confocal (POMPILIO et al., 2015).
- Avaliação da viabilidade do biofilme através da contagem de UFC (MORRISON et al.,
2016).
- Avaliação quantitativa do biofilme através do ensaio colorimétrico (STEPANOVIC et al.,
2007).
- Avaliação da composição do biofilme através da metodologia de Chiba e colaboradores
(2015).

3.3 Modelo de infecção por Galleria mellonella: Avaliar a virulência das amostras silenciadas
através do ensaio in vivo, com adaptações, em Galleria mellonella. (CLAVIJO-GIRALDO et
al., 2016)

4 – Bibliografia
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