Anais do II CoBICET - Trabalho completo

Congresso Brasileiro Interdisciplinar em Ciência e Tecnologia

Evento online – 30 de agosto a 03 de setembro de 2021

ATIVIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL DE Thymus vulgaris E SEU

COMPONENTE MAJORITÁRIO FRENTE A PATÓGENOS DA
MASTITE BOVINA
Mikaela Vieira Beloni1,2, Fábulo Junior Nogueira Fernandes 2, Janaína Cecília Oliveira
Villanova1, Mariana Drummond Costa Ignacchiti 2, Juliana Alves Resende1,2
1
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Centro de Ciências Agrárias e
Engenharias (CCAE), Universidade Federal do Espírito Santo - UFES, Alegre, ES,
Brasil. (mikaelaveloni@hotmail.com)
2
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde (CCENS), Universidade Federal do
Espírito Santo - UFES, Alegre, ES, Brasil.

Resumo: O objetivo foi determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração

bactericida mínima (CBM) do óleo essencial (OE) de Thymus vulgaris e do timol, frente a
patógenos de relevância na mastite bovina. Os valores da CIM variaram entre 0,19-6,25
µL/mL e 0,19-3,12 µL/mL para o OE e timol, respectivamente. Os valores da CBM foram
iguais a CIM, exceto para o timol frente a Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os
resultados indicam notável atividade antimicrobiano do OE e do timol.

INTRODUÇÃO mastite, tem-se o crescimento do número de

microrganismos resistentes aos antimicrobianos.
A mastite bovina é mundialmente reconhecida como a
Assim, o uso excessivo e indevido de antibióticos na
doença mais frequente e mais cara que acomete os
mastite bovina, pode representar um sério problema
rebanhos leiteiros, causando enormes prejuízos
relacionado a ocorrência de resistência antimicrobiana
financeiros para os produtores e as indústrias de leite,
e a disseminação de microrganismos resistentes,
em razão das perdas na produção e na qualidade do
caracterizando um problema de saúde pública
leite, mortes e abates prematuros de animais afetados
(Gomes; Henriques, 2015).
e pelo custo referente ao tratamento (Mushtaq et al.,
2018). Trata-se da inflamação da glândula mamária de Além disso, esta estratégia terapêutica apresenta
bovinos, comumente causada por uma infecção complicações relacionadas a baixa taxa de cura e a
bacteriana (Gonçalves et al., 2019; Gupta; Kumar; presença de resíduos de antibióticos no leite,
Khurana, 2020; Lopes et al., 2020). colocando em risco a saúde do consumidor (Gomes;
Henriques et al., 2015; Mushtaq et al., 2018; Vliegher;
Mais de 135 microrganismos já foram descritos como
Ohnstad; Piepers, 2018). Lopes et al. (2020), aponta
agentes etiológicos da mastite bovina, entre eles
que nos últimos anos, vários estudos têm descrito a
bactérias, micoplasmas, algas e fungos (bolores e
resistência a antimicrobianos em patógenos isolados
leveduras). Entretanto, a maior parte das infecções são
da mastite bovina, além de uma diminuição nas taxas
causadas por patógenos bacterianos, os quais, segundo
de cura desta infecção. Portanto, os esforços na busca
Gonçalves et al. (2019), são responsáveis por cerca de
por abordagens alternativas para o tratamento da
90% de todos os diagnósticos. Dentre os patógenos
mastite devem ser contínuos, a fim de minimizar o
bacterianos, destacam-se o gênero Staphylococcus
problema.
spp., o Streptococcus spp. e os bastonetes Gram
negativos (Bogni et al., 2011; Gonçalves et al., 2019). Dentro desse cenário, os óleos essenciais (OE) e seus
componentes majoritários destacam-se como uma
Atualmente, a antibioticoterapia é a principal
abordagem alternativa para o tratamento da mastite.
estratégia empregada no tratamento da mastite,
Os OE são misturas de compostos orgânicos voláteis,
comumente realizado pela infusão intramamária de
produzidos a partir do metabolismo secundário
antibióticos, tornando esta patologia a principal causa
vegetal. Por serem lipofílicos, seus constituintes
do uso de antibióticos em vacas leiteiras (Gomes;
podem integrar-se às estruturas da membrana celular,
Henriques, 2015; Mushtaq et al., 2018). Assim, os
causando alterações na permeabilidade, inativação de
impactos causados pela ocorrência desta doença vão
componentes intracelulares e de enzimas (Chouhan;
além dos prejuízos econômicos à pecuária leiteira.
Sharma; Guleria, 2017).
Isto, porque com o uso indiscriminado de antibióticos,
tanto para fins profiláticos como terapêuticos na
O OE de Thymus vulgaris L. (tomilho) e seu 0,048 µL/mL) foram testadas. Após a montagem as
componente majoritário timol já demonstraram microplacas foram incubadas a 35±2º C por 24h.
atividades antimicrobianas. O tomilho é um arbusto
A menor concentração capaz de inibir completamente
perene pertencente à Família Lamiaceae, cultivado em
o crescimento microbiano (ausência de precipitado ou
todo o mundo, especialmente na região do
turvação no meio de cultura) após o período de
mediterrâneo (Gedikoğlu; Sökmen; Çivit, 2019;
incubação foi considerada a CIM. Cada microplaca
Oniga et al., 2018). O timol (2-isopropil-5-metilfenol)
apresentou um controle de crescimento (inóculo +
é um monoterpeno amplamente descrito como
meio de cultura), controle de solvente (inóculo + meio
componente majoritário do OE obtido a partir do
de cultura acrescido de DMSO 5%), controle de
tomilho (Silva et al., 2017). Este composto mostra
esterilidade (somente CMH), controle positivo
atividade antimicrobiana contra cepas de bactérias
(inóculo+ meio de cultura acrescido de antimicrobiano
Gram-positivas e Gram-negativas, bem como contra
padrão), todos submetidos às mesmas condições de
fungos e leveduras. A atividade antimicrobiana do
cultivo. Os testes foram realizados em triplicata e os
timol não é completamente compreendida, acredita-se
resultados expressos em µL/mL. Na Figura 1 pode ser
que envolva a interação com as proteínas da
visto o esquema de montagem do ensaio de
membrana bacteriana e interferência na expressão de
microdiluição em placa.
genes envolvidos na síntese de proteínas da membrana
externa. Além disso, o timol prejudica a via
metabólica do citrato e de muitas enzimas envolvidas
direta ou indiretamente na síntese de ATP (Chouhan;
Sharma; Guleria, 2017).
Nessa perspectiva, este trabalho tem por objetivo
avaliar a atividade antimicrobiana dos OE de tomilho
e de seu componente majoritário frente aos principais
patógenos da mastite bovina, com foco nas tendências
futuras e possíveis implicações no uso desses produtos
na área veterinária.

MATERIAL E MÉTODOS
A determinação da concentração inibitória mínima
(CIM) do OE de Thymus vulgaris, e de seu
componente majoritário timol, foi realizada no
Laboratório de Microbiologia Farmacêutica do
Departamento de Farmácia e Nutrição, da
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Figura 1. Esquema das microplacas de determinação
Alegre, ES. O OE foi adquirido comercialmente da da concentração inibitória mínima do óleo essencial
empresa FERQUIMA® Indústria e Comércio Ltda. O de Thymus vulgaris e seu componente majoritário
componente majoritário, timol (>98,5%), foi obtido da timol.
Sigma (St. Louis, Mo., US).
Para as análises foram utilizadas as linhagens dos
Após o teste de microdiluição em meio líquido foi
microrganismos padrão Staphylococcus aureus
realizado o plaqueamento de cada um dos poços da
(ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e
CIM que não apresentou crescimento e os controles
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) fornecidas
positivos, em placas de Petri contendo 25 mL de ágar
pelo Laboratório de Microbiologia Farmacêutica.
Nutriente para determinação da concentração
As análises da CIM foram realizadas empregando-se bactericida mínima (CBM). As placas foram
a técnica de microdiluição em caldo, como incubadas a 35±2º C por 24 horas. O resultado será
recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards definido pela presença ou ausência da formação de
Institute (CLSI, 2019), com adaptações. Os ensaios colônia, sendo a ação classificada como
foram realizados em microplacas de poliestireno bacteriostática ou bactericida, respectivamente. A
estéreis com 96 poços, em triplicata. A mistura de CBM foi determinada como sendo a menor
reação final foi um volume de 200 µL, o meio de concentração da droga que impediu crescimento
cultura utilizado foi Caldo Mueller Hinton (CMH) e a visível do subcultivo, formação de colônia.
concentração final do inóculo no teste foi padronizada
Os valores da CIM para o OE de tomilho e para o timol
para 1,0 x 104 UFC/poço. Diferentes concentrações do
dos três microrganismos avaliados foram submetidos
OE e do componente majoritário (100,0; 50,0; 25,0;
ao Teste-T de student.
12,5; 6,25; 3,125; 1,562; 0,781; 0,390; 0,195; 0,097;
 RESULTADOS E DISCUSSÃO Tabela 2 – Concentração Bactericida Mínima do óleo
essencial de Thymus vulgaris e seu componente
Neste estudo, o teste de microdiluição em caldo foi
majoritário, timol, frente aos patógenos bacterianos da
utilizado para avaliar a menor concentração do OE de
mastite bovina.
tomilho e do timol capaz de inibir o crescimento de
quatro microrganismos de importância na mastite Concentração Bactericida Mínima
bovina. Os valores da CIM são apresentados na Tabela (µL/mL)
1. Linhagens
OE de Thymus
A menor CIM do OE de tomilho foi 0,195 µL/mL para Timol
vulgaris
S. aureus. No que se refere ao composto timol, o
microrganismo mais susceptível foi a E. coli (0,195 S. aureus 0,195 3,125
µL/mL). Para P. aeruginosa (3,125 µL/mL) foi E. coli 3,125 0,781
observado o maior valor de CIM.
P. aeruginosa 6,250 3,125

Tabela 1 – Concentração Inibitória Mínima do óleo

essencial de Thymus vulgaris e seu componente Valores maiores que a CIM foram encontrados para a
majoritário, timol, frente aos principais patógenos CBM do timol frente a S. aureus e E. coli. Para P.
bacterianos da mastite bovina. aeruginosa o valor da CIM e CBM foram iguais.

Concentração Inibitória Mínima

(µL/mL)
Linhagens
OE de Thymus
Timol
vulgaris
S. aureus 0,195 0,390
E. coli 3,125 0,195
P. aeruginosa 6,250 3,125

Ao compararmos os valores da CIM do OE de tomilho

e do composto timol, não foi observada diferença
Figura 2. Fotografia de uma das microplacas de
estatística (p = 0,398) na atividade antimicrobiana do
OE e do composto majoritário frente aos três determinação da Concentração inibitória mínima do
microrganismos avaliados. Alguns autores acreditam óleo essencial de Thymus vulgaris e seu componente
que a atividade antimicrobiana do OE seja atribuída majoritário timol frente aos patógenos da mastite
bovina antes da incubação em estufa bacteriológica.
aos seus compostos majoritários (Čabarkapa et al.,
2019; Nostro et al., 2007; Soni et al., 2013). Esse
pensamento corrobora com os resultados observados
neste trabalho, uma vez que não foi observada uma
atividade antimicrobiana maior no OE quando
comparado ao timol. O OE de tomilho é composto
pelo timol e por outros componentes em menor
quantidade, os quais poderiam atuar sinergicamente
conferindo ao OE uma atividade maior do que quando
o composto majoritário é utilizado separadamente
(Lopes et al, 2020).
No que se refere a CBM, ou seja, a menor
concentração de OE de tomilho ou do composto timol
capaz de matar as células bacterianas, observou-se que
para o OE de tomilho, a CBM encontrada para os Figura 3. Fotografia de uma das microplacas de
quatro microrganismos avaliados foi igual a CIM. determinação da Concentração inibitória mínima do
Porém valores diferentes foram encontrados para o óleo essencial de Thymus vulgaris e seu componente
composto timol, exceto para P. aeruginosa. Os valores majoritário timol para os patógenos da mastite bovina
da CBM são apresentados na Tabela 2. depois da incubação em estufa bacteriológica.
Os resultados mostram que as linhagens Gram
negativas foram ligeiramente menos susceptíveis ao
OE. Segundo Seow et al. (2014), em geral,
fitoquímicos e OEs têm um melhor efeito
antimicrobiano em microrganismos Gram-positivos.
Gram-negativos possuem uma camada externa rica em
lipopolissacarídeo que poderia impedir a penetração
de compostos hidrofóbicos e evitar a ação dos OE na
célula bacteriana. Por outro lado, Gram-positivos não
têm essa barreira o que permitiria que os componentes
hidrofóbicos causem aumento da permeabilidade da
membrana e extravasamentos de constituintes
intracelulares (Rapper e Vuuren, 2020).
Outros trabalhos também avaliaram a atividade
antimicrobiana do OE de tomilho e de seu composto
majoritário. Gavaric et al. (2015) avaliou a atividade
antimicrobiana do OE de tomilho e do composto timol
frente a quatro microrganismos, Bacilus cereus
WSBC 10530, S. aureus ATCC 25923, Salmonella
infantis MJ 106 e E. coli O157:H7 M 370. Tanto OE
como o seu composto majoritário apresentaram
atividade antimicrobiana, sendo que para a linhagem
S. aureus (a mesma utilizada neste trabalho) os valores
de CIM foram 0,6 e 250 µL/mL para o OE de tomilho
e o composto timol, respectivamente. Gedikoğlu,
Sökmen e Çivit (2019), avaliaram a atividade
antimicrobiana do OE de tomilho frente a seis
linhagens bacterianas, B. cereus NRRL B3711, S.
aureus ATCC 9144, S. epidermidis ATCC 12228, E.
coli ATCC 25922, S. enteritidis ATCC 13076 e S.
typhimurium ATCC 14028. O OE apresentou efeitos
antimicrobianos contra todas as bactérias testadas.
Ainda Kačániová et al. (2019) mostrou que o OE de
tomilho apresenta atividade antimicrobiana frente a
linhagens E. coli CCM 3988, P. aeruginosa CCM
1960 e B. cereus CCM 2010.
As bactérias do gênero Staphylococcus spp. e
Pseudomonas spp. e a linhagem E. coli são descritas
entre os principais microrganismos causadores da
mastite bovina. A mastite é uma patologia de difícil
controle e tratamento, caracterizando-se como uma
das doenças que mais causam prejuízos econômicos
aos produtores e as indústrias de leite. Além disso, o
uso de antibióticos para o tratamento da mastite
bovina corrobora com o amplamente discutido
problema de resistência antimicrobiana em patógenos,
agregando riscos e custos à saúde do animal, como
também a saúde pública no geral (Beloni et al., 2020).
Assim, ao demonstrar atividade antimicrobiana frente
aos microrganismos avaliados neste trabalho, o OE de
tomilho e seu composto majoritário, timol, destacam-
se como uma alternativa viável à substituição dos
antimicrobianos comerciais para o tratamento da
mastite bovina.
CONCLUSÃO
O presente estudo confirmou a atividade
antibacteriana do OE de tomilho e do seu composto
majoritário, timol, frente a microrganismos de
importância na mastite bovina, com CIM variando
entre 0,195 e 6,25 µL/mL para o OE de tomilho e entre
0,195 e 3,125 µL/mL para o timol. Não foi encontrada
diferença estatística entre a atividade antimicrobiana
do OE e do componente majoritário. Quanto a CBM,
não houve diferença entre os valores de CIM e CBM
para o OE de tomilho, porém, valores maiores que a
CIM foram encontrados para a CBM do timol frente a
S. aureus e E. coli. Os resultados obtidos com esse
trabalho são promissores e poderão contribuir com o
desenvolvimento de novas formulações para o
tratamento da mastite bovina. Contudo, ainda são
necessários mais estudos acerca da ação e aplicação
desses óleos.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), a
Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do
Espírito Santo (FAPES) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil
(CAPES) - Código de Financiamento 001.
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