PROJETO

PUB – VERTENTE PESQUISA

Programa Unificado de Bolsas de Estudos para Estudantes de Graduação

Título: Estabelecimento de Modelo de Lesão Renal Aguda em Cultura Primária

de Células Renais de Zebrafish

Coordenador: Prof. Niels Olsen Saraiva Câmara

ORCID: 0000-0001-5436-1248

Lattes: http://lattes.cnpq.br/8098379714093877

Instituição: Laboratório de Imunobiologia de Transplantes, ICB, USP

1. Introdução

Os rins são os órgãos responsáveis por diversas tarefas fisiológicas que mantêm o

balanço homeostático do organismo. Estas incluem, a excreção urinária de produtos

metabólicos residuais e drogas, regulação hidroeletrolítica, balanço ácido-base, e a

produção de hormônios e vitaminas [1]. Devido às múltiplas funções dos rins, uma

falha no seu desempenho pode ter consequências graves para a saúde. Danos no

tecido renal podem ser parte de uma condição heterogênea chamada de Lesão Renal

Aguda (LRA). A lesão renal aguda (LRA) tem sido palco para diversas pesquisas, uma

vez que está associada ao alto risco de mortalidade e é altamente prevalente em

Unidades de Cuidado Intensivo (UCIs) [2, 3]. Sua incidência também tem aumentado

nos últimos anos associada à pacientes com COVID-19 [4].

Clinicamente, a LRA é definida como uma queda na taxa de filtração glomerular e

comprometimento da depuração do sangue, sendo comumente diagnosticada pela

detecção de níveis séricos elevados de creatinina e ureia em sangue [5]. As causas

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da LRA são diversas, porém pode se desenvolver devido a infecções bacterianas,

sepse, dano causado por isquemia-reperfusão e exposição a drogas nefrotóxicas [3,

6]. Neste último caso, a perda da função renal pode ocorrer a partir do uso de

fármacos utilizados no tratamento de câncer, como, por exemplo, a cisplatina.

Devido ao seu baixo peso molecular, o acúmulo deste fármaco nos rins contribui

para a nefrotoxicidade causando morte celular e inflamação predominantemente no

segmento tubular proximal do néfron, local onde ocorre o máximo acúmulo de

cisplatina [7].

O efeito nefrotóxico da cisplatina tem sido aproveitado para simular a LRA em

modelos animais [8, 9]. Nosso laboratório também tem usado estes modelos para o

estudo de mecanismos inflamatórios e, na busca de possíveis agentes terapêuticos

[9-11] tomamos vantagem das características do zebrafish (Danio rerio) como

organismo modelo. Este teleósteo de água doce possui um pequeno tamanho,

transparência ótica no estágio larval, rápido desenvolvimento e baixo custo de

manutenção [12]. Além disso, estudos mostram uma alta similaridade genética

entre zebrafish e humanos, sendo que 70% dos genes apresentam homólogos

funcionais [13]. O rim do zebrafish possui aspectos estruturais e fisiológicos

conservados comparáveis aos metanefros dos mamíferos, pelo que tem sido

amplamente usado para estudos de desenvolvimento, função e regeneração tecidual

[14-16]. O rim do zebrafish (pronefros) se encontra totalmente estruturado e

funcional às 48 horas pós-fertilização, onde é composto por um glomérulo e dois

túbulos renais que terminam na cloaca [17]. À medida que o peixe vai se

desenvolvendo e crescendo, esta estrutura básica começa a se ramificar formando o

mesonefros, localizado na parede dorsal do corpo, entre a bexiga natatória e a

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coluna vertebral [15]. Além disso, um ponto interessante a ser ressaltado é que o

rim do zebrafish além de apresentar a função de filtração de água e sangue, também

atua como órgão hematopoiético, equivalente à medula óssea em mamíferos [18].

O rim do zebrafish, tanto na fase larval quanto fase adulta, é um ótimo sistema para

o estudo de processos regenerativos após lesão, visto que este órgão é capaz de

gerar néfrons durante toda sua vida realizando o processo de regeneração sem a

formação de uma cicatriz fibrótica, isso devido à presença de progenitores renais

até a vida adulta [19, 20]. No entanto, hoje em dia não existem modelos in vitro

derivados do rim de zebrafish que poderiam responder algumas perguntas

relacionadas a esta capacidade regenerativa e como esta é afetada na lesão renal

aguda. Desta forma, nós propomos para este projeto o estabelecimento de uma

linhagem primária de células tubulares renais derivadas de rim de zebrafish adulto,

seguido de uma padronização do modelo de LRA de induzido por cisplatina nestas

células.

2. Justificativa

Nos últimos anos, nosso laboratório tem investido no zebrafish como um organismo

modelo e focado seus trabalhos para melhor compreensão dos mecanismos

inflamatórios da lesão renal aguda. Apesar da grande capacidade regenerativa que

possui o rim do zebrafish, ainda não existem protocolos que permitam o estudo de

células derivadas deste órgão em cultura celular. Deste modo, este projeto se

compromete a criar um protocolo de cultura celular primária de células tubulares

renais de zebrafish adultos, baseando-se em protocolos existentes de derivação de

células murinas. Além disso, procuramos que o aluno consiga estabelecer um

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protocolo que permita simular a LRA induzida pela nefrotoxicidade da cisplatina

nessas células primárias renais.

3. Objetivos

Objetivo Geral: Estabelecer uma linhagem de células tubulares renais em

cultura, derivadas de rim de zebrafish adulto.

Objetivos Específicos:

1) Padronizar e estabelecer um protocolo de isolamento e cultura de células

tubulares renais derivadas de rim de zebrafish adulto.

2) Estabelecer um modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina in vitro,

em células tubulares renais de rim de zebrafish adulto.

4. Material e métodos

Animais: Serão utilizados animais Danio rerio adultos, de idade entre 8 a 12 meses,

da linhagem selvagem AB do Biotério de Zebrafish do Departamento de Genética e

Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo – USP.

Todos os protocolos utilizados neste estudo serão submetidos ao Comitê de Ética

para Uso de Animais de Experimentação (CEUA) do Instituto de Ciências Biomédicas

(ICB) e do Instituto de Biociências (IB) da USP.

Isolamento de túbulos renais e cultura celular: Para o estabelecimento da

linhagem celular de células tubulares renais serão utilizados pools de 6 rins de

zebrafish adultos. Os animais serão eutanasiados por overdose de anestésico

Tricaína 0.3 mg/mL e a área externa dos peixes será desinfectada com iodopovidona
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10%. Os peixes serão dissecados em ambiente estéril, as vísceras retiradas e o rim

coletado em placas de 6 poços com 3 mL de PBS 1X com Colagenase D 1,5 mg/mL. O

tecido será cortado com tesouras em pequenos pedaços e incubado a 30/37°C por

15-30 minutos. Após esse período o tecido será triturado passando por uma seringa

com agulha 21G até homogeneização. Logo o tecido será passado por cell strainer de

70 μM, para um tubo falcon de 50 mL, com auxílio de um êmbolo de seringa, lavado

3 vezes com 1 mL de PBS 1X e logo completando com PBS 1X até os 10 mL. Após

centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos a 4°C, o pellet será ressuspendido em 2 mL de

meio DMEM/F12 suplementado com: Soro Fetal Bovino 10%; ITS (Insulina-

Transferrina-Selenita) 100X, Pen/Strep 1%, Mix de Hormônios (PGE1, T3,

Hidrocortisona, em HBSS), e hEGF. A suspensão contendo as amostras será separada

no tubo falcon contendo 10 mL de Percoll 31%, centrifugado a 3000 rpm por 10

minutos (aceleração 8 e break 0). Logo, o conteúdo superior será eliminado e o pellet

ressuspendido em 2 mL de PBS 1X, completando até 10 ml e centrifugado por 1500

rpm por 5 minutos. O pellet será ressuspendido em 1 mL de meio DMEM/F12

suplementado e despejado em 15 mL de meio em garrafa de 75 cm2. As células serão

mantidas em estufa a 30°C e o meio será trocado após 2 dias.

Padronização do protocolo de indução de LRA por cisplatina: Células tubulares

renais isoladas de rim de zebrafish adulto serão expostas a diferentes concentrações

de cisplatina a partir do dia 4 de cultura. Para avaliar o efeito da cisplatina serão

usados testes de viabilidade e apoptose celular.

Teste de Viabilidade: Serão transferidas 1x104 células/poço para uma placa de 96

poços no dia anterior para permitir a adesão ao fundo da placa. Será utilizada a
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coloração com Cristal Violeta para determinar viabilidade celular, medindo a

densidade óptica (OD) a 570 nm.

Teste de Apoptose: Serão transferidas 1x104 células/poço para uma placa de 96

poços no dia anterior para permitir a adesão ao fundo da placa. Logo será utilizado

o kit In Situ Cell Death Detection TMR RED (Roche - 12156792910). Imagens

fluorescentes serão capturadas no confocal LSM 780 NLO e analisadas manualmente

com o Plug-in “Cell Counter” do software ImageJ.

Estatística: Os dados serão apresentados no formato de média e desvio padrão. A

diferença entre os grupos experimentais entre dois grupos será determinada com

teste de t-student e para três ou mais grupos com o teste de ANOVA de duas vias. O

valor de p<0,05 será considerado significante para todos os gráficos. Todos os

gráficos e análises estatísticas serão realizados utilizando o programa GraphPad

Prism®.

5. Detalhamento das atividades a serem desenvolvidas pelo bolsista

Neste projeto, o aluno irá estudar e padronizar protocolos que permitam

estabelecer uma cultura primária de células isoladas do rim de zebrafish. Para isso

o aluno irá:

1) Revisar protocolos presentes na literatura relacionados aos temas e suas

possíveis adequações para o modelo de zebrafish;

2) Padronizar o protocolo de isolamento de células tubulares do rim do zebrafish

adulto;

3) Testar diferentes suplementos para o meio de cultura e concentrações de

reagentes para otimizar a manutenção das células renais em cultura;

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4) Estabelecer um protocolo de indução da lesão renal aguda por cisplatina em

células tubulares renais de zebrafish em cultura;

5) Observar e testar a viabilidade das células tubulares renais em cultura;

6) Investigar a indução de apoptose das células tubulares renais expostas à

cisplatina.

6. Resultados previstos e seus respectivos indicadores de avaliação

O aluno será acompanhado diariamente por supervisores responsáveis que

auxiliarão no planejamento do desenho experimental, bem como na execução de

todas as atividades. Semanalmente serão realizadas reuniões com o orientador do

projeto (Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara) para avaliação crítica dos resultados

e planejamento estratégico. Será esperado que a cada trimestre o aluno atinja as

metas descritas abaixo no cronograma de execução, para que no fim seja possível

estabelecer protocolos que resultem no isolamento e estabelecimento da cultura

primária de células tubulares renais de zebrafish e a indução in vitro da lesão renal

aguda por exposição à cisplatina.

7. Cronograma de execução

Trimestre
Objetivo 1 2 3 4
Estabelecimento de um protocolo para isolar células

tubulares renais de zebrafish adulto.
Teste de concentração de suplementos para otimizar a

manutenção das células renais em cultura.
Padronização da LRA induzida por cisplatina nas células

tubulares renais de zebrafish
Teste de viabilidade e apoptose
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Análise dos dados

Elaboração do relatório

8. Outras informações que sejam relevantes para o processo de avaliação

O perfil de estudante procurado é de uma pessoa responsável, curiosa e pró-ativa.

Procuramos alunos que tenham interesse pela pesquisa e que priorizem o estudo e

o trabalho em laboratório. Comumente trabalhamos em equipe em contato com

animais de experimentação, e isso é um fator que precisa ser considerado pelo

estudante.

O projeto tem condições de oferecer vagas para 2 (dois) alunas(os) de graduação

que apresentem estas características. O trabalho em grupo em projetos que

envolvem experimentação animal é fundamental, como forma de compartilhamento

de expertises e busca por soluções para os problemas.

A pandemia pelo novo coronavírus impactou parte das pesquisas do laboratório.

Porém, a manutenção dos animais no biotério foi mantida por ser atividade

essencial. Além disso, o laboratório cresceu nas análises in silico e soube focar mais

nas perguntas, com otimização do tempo e redução de trabalho em bancada. No

entanto, com as regras de retorno no laboratório, acreditamos que a realização do

presente projeto é viável dentro do cronograma proposto.

9. Referências

1. Foundation, N.-N.K. How your kidneys work. 2022; Available from:
https://www.kidney.org/kidneydisease/howkidneyswrk.
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2. Lewington, A.J., J. Cerdá, and R.L. Mehta, Raising awareness of acute kidney
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67.
3. Kellum, J.A., et al., Acute kidney injury. Nat Rev Dis Primers, 2021. 7(1): p. 52.
4. Bandelac, L., et al., Acute Kidney Injury Incidence, Stage, and Recovery in
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5. Khwaja, A., KDIGO clinical practice guidelines for acute kidney injury. Nephron
Clin Pract, 2012. 120(4): p. c179-84.
6. Agarwal, A., et al., Cellular and Molecular Mechanisms of AKI. J Am Soc
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7. Xu, Y., et al., A Role for Tubular Necroptosis in Cisplatin-Induced AKI. Journal
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8. Perše, M. and Ž. Večerić-Haler, Cisplatin-Induced Rodent Model of Kidney
Injury: Characteristics and Challenges. BioMed Research International, 2018.
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9. Morales Fénero, C., et al., Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in
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10. Andrade-Silva, M., et al., TLR2 and TLR4 play opposite role in autophagy
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11. Miyagi, M.Y.S., et al., Physical exercise contributes to cisplatin-induced
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12. Santoriello, C. and L.I. Zon, Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin
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13. Howe, K., et al., The zebrafish reference genome sequence and its relationship
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14. Outtandy, P., et al., Zebrafish as a model for kidney function and disease.
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15. Drummond, I.A. and A.J. Davidson, Zebrafish kidney development. Methods in
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16. Morales, E.E. and R.A. Wingert, Zebrafish as a Model of Kidney Disease. Results
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20. McCampbell, K.K., K.N. Springer, and R.A. Wingert, Atlas of Cellular Dynamics
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