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Imunologia de Peixe e Marisco 23 (2007) 901e905

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comunicação curta

Lipopolissacarídeos bacterianos induzem genes envolvidos na

resposta imune inata em embriões do peixe-zebra (Danio rerio)
Joerg Watzke, Kristin Schirmer, Stefan Scholz*
Centro de Pesquisa Ambiental UFZ e Helmholtz, Departamento de Toxicologia Celular, Permoserstr. 15, 04318 Leipzig, Alemanha

Recebido em 5 de janeiro de 2007; revisado em 23 de fevereiro de 2007; aceito em 1 de março de 2007

Disponível online em 14 de março de 2007

Resumo

A resposta imune inata em peixes representa uma defesa precoce e rápida contra patógenos. Contaminantes ambientais podem perturbar essa defesa e
influenciar negativamente a capacidade de proteção contra infecções. No entanto, a análise da imunomodulação ainda não foi incluída nas estratégias de teste
para avaliação de risco ambiental de produtos químicos. A fim de estabelecer um sistema de teste eficiente em pequena escala, a capacidade de induzir a
resposta imune inata por lipopolissacarídeos bacterianos em embriões de peixe-zebra foi investigada. O nível de expressão de vários genes envolvidos na
inflamação foi usado como ponto final. Pudemos mostrar que a imersão de embriões em LPS induziu a expressão gênica de duas citocinas pró-inflamatórias
chave, fator de necrose tumoral a e interleucina 1b em embriões de peixe-zebra com 32 h de idade. A indução do gene exigiu a remoção do córion antes da
exposição ao lipopolysaccha ride.

2007 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

Palavras-chave: Imunidade inata; Zebrafish; Embrião; TNF-a; IL-1b; NF-kB; Expressão genetica; Produtos químicos ambientais; Chorion

A resposta imune inata é importante na defesa precoce e rápida contra patógenos. A perturbação dessa defesa por contaminantes
ambientais pode influenciar negativamente a capacidade de proteção contra infecções e influenciar a saúde de um indivíduo ou
população. Os peixes podem ser considerados organismos de risco primário para modulação da imunidade inata por produtos
químicos ambientais. Isso ocorre porque, em primeiro lugar, a montagem de uma resposta adaptativa leva mais tempo em peixes
do que em vertebrados superiores [1]; e segundo, os peixes são direta e continuamente expostos a produtos químicos lançados no
meio ambiente.
Vários exemplos de interferência de contaminantes ambientais com a resposta imune inata em peixes foram relatados, variando
de excesso de produção de muco, modulação de fatores humorais, defesa celular por macrófagos a inflamação (revisado na ref.
[2]). Apesar de sua relevância, no entanto, a análise de potenciais efeitos imunomoduladores em peixes ainda não foi implementada
em estratégias de teste para avaliação de risco ambiental de produtos químicos. Um sistema de teste apropriado utilizaria o efeito
imunomodulador de uma substância química em teste na inflamação estimulada como o componente final da resposta imune inata.
Portanto, a inflamação em peixes pode ser estimulada experimentalmente por injeção ou imersão em bactérias ou lipopolissacarídeos
bacterianos (LPS).
Estas técnicas têm sido aplicadas em peixes adultos, embriões de peixes e/ou células primárias e permanentes de peixes [3e9].

* Autor correspondente. Tel.: þ49 341 235 2334; fax: þ49 341 235 2434.
Endereços de e-mail: joerg.watzke@ufz.de (J. Watzke), kristin.schirmer@ufz.de (K. Schirmer), stefan.scholz@ufz.de (S. Scholz).

1050-4648/$ - ver matéria inicial 2007 Elsevier Ltd. Todos os direitos

reservados. doi:10.1016/j.fsi.2007.03.004
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902 J. Watzke et ai. / Imunologia de Peixes e Mariscos 23 (2007) 901e905

No que diz respeito à triagem de imunomodulação em peixes, seria necessário um sistema de teste eficiente para análise de alto
rendimento. Peixes adultos não seriam adequados para uma análise de alto rendimento porque as medições de exposição e ponto final
seriam bastante elaboradas. Além disso, existem preocupações éticas, pois há uma forte demanda da sociedade pela redução de testes
em animais. Em contraste, embriões de peixe, como peixe-zebra (Danio rerio) permitiriam uma análise em pequena escala e são adequados
para testes de alto rendimento. A experimentação com embriões de peixes é considerada uma alternativa in vitro indolor e protocolos para
o uso de embriões de até 48 horas de idade como método substituto para testes de toxicidade aguda já foram estabelecidos [10]. Em
contraste com as células primárias ou permanentes dos peixes, o modelo embrionário oferece um maior grau de complexidade,
assemelhando-se a uma resposta organísmica. Portanto, também pode refletir mais de perto os efeitos em animais adultos. Para o estudo
atual, selecionamos o embrião de peixe-zebra para examinar os componentes da resposta pró-inflamatória. O peixe-zebra é um dos
modelos vertebrados mais amplamente utilizados e também é considerado adequado para estudar doenças e desenvolvimento humano
[11e14]. Uma vez que o sistema imunológico inato é altamente conservado em vertebrados, a análise dos efeitos sobre a resposta imune
inata no peixe-zebra também fornece informações relevantes para a saúde humana [15].

Em embriões de peixe-zebra, uma resposta pró-inflamatória foi estimulada pela injeção de bactérias e a eliminação de uma infecção
bacteriana foi usada como medida da função imune [8,9]. A imersão de embriões em uma suspensão bacteriana também demonstrou
induzir a resposta imune inata [4]. No entanto, a injeção de bactérias é demorada e requer prática técnica adequada. No caso de imersão,
o uso de bactérias patogênicas para peixes acarreta o risco de contaminação da piscicultura. Além disso, a resposta imune pode apresentar
uma variabilidade maior. Em contraste, a estimulação da resposta imune inata por lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) poderia ser uma
abordagem alternativa. Em embriões, esta abordagem até agora só foi aplicada para a análise da indução de tnfa por meio de fluorescência
GFP (proteína verde fluorescente) em um peixe-zebra repórter transgênico que abriga uma construção promotora de tnfa-GFP de solha
japonesa [16].

O objetivo do presente estudo foi testar a capacidade de lipopolissacarídeos disponíveis comercialmente em induzir a reação imune
inata por meio da análise de componentes da resposta pró-inflamatória. A expressão de citocinas, por exemplo, pode ser ativada por LPS
através do receptor Toll-like TLR4 e envolve a via de sinalização NF-kB [17]. A expressão diferencial de genes envolvidos nesta cascata de
sinalização foi detectada em várias espécies de peixes (eg refs. [4,6,7,18e20]). Além disso, receptores semelhantes a Toll e citocinas
também demonstraram ser expressos durante os estágios iniciais do desenvolvimento dos teleósteos [21,22]. A fim de monitorar a
estimulação da resposta imune inata por LPS em embriões de zebrafish, a transcrição das citocinas il1b, tnfa, il10 (interleucina 10), os
homo mologues da ciclooxigenase ptgs1 e ptgs2, as subunidades NF-kB nfkb2 e rela e o inibidor de NF-kB nfkbiab foi analisado por RT
PCR. Pudemos mostrar que a imersão de embriões em LPS de fato induziu a expressão de duas citocinas pró-inflamatórias chave, tnfa
(fator de necrose tumoral a) e il1b (interleucina 1b) em embriões de peixe-zebra com 32 h de idade.

Para os experimentos, foi utilizada a linhagem selvagem de peixe-zebra WiK obtida do Max Planck Institute for Developmental Biology
(Tübingen, Alemanha). Os peixes foram cultivados a 26 1 C em um ciclo claro:escuro de 14:10 h em um sistema de tanque de recirculação
usando água da torneira local (pH 8e8,2, dureza da água 1,2 a 2,4 mM de íons bivalentes, condutividade 520e560 mS/cm).
Os peixes foram alimentados ad libitum três vezes ao dia, uma vez com Artemia e duas vezes com ração comercial em flocos (Tetra, Melle,
Alemanha).
A produção de embriões foi realizada de acordo com Nagel [10]. Os embriões foram coletados uma hora após o início da luz e
incubados a 26 C. Às 28 h pós-fertilização (hpf) o córion foi removido com fórceps e os embriões foram expostos a 0,1, 1 e 10 ng/ml de
lipopolissacarídeos (sorotipos O55:B5, O111:B4 e O127:B8, adquiridos da Sigma, Deisenhofen, Alemanha) até 32 hpf. As concentrações
de LPS foram selecionadas com base em uma pré-triagem para a faixa efetiva com até 10 mg/ml e estavam bem abaixo da toxicidade em
embriões de peixe-zebra (100 mg/ml, [16]). O LPS foi adicionado diluindo uma solução estoque aquosa de 1 mg/ml, que foi armazenada
em alíquotas a 20°C antes dos testes. Os embriões pós-eclosão posteriores não foram considerados para o tratamento com LPS, uma vez
que os protocolos padrão existentes para o uso de embriões de peixe-zebra como método de substituição para experimentos com animais
são limitados a um máximo de 48 horas após a fertilização [23,24].

O RNA total foi extraído do embrião de zebrafish de 32 hpf usando Trizol Reagent (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) de acordo com as
instruções do fabricante. A contaminação do DNA genômico foi removida por tratamento com DNAse I (Roche, Grenzach, Alemanha) por
15 min a 25 C (10 U/mg RNA). O cDNA foi sintetizado a partir de 1 mg de RNA tratado com DNAse total usando o RevAid First Strand
cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha). Os genes alvo foram amplificados a partir de 1 ml de cDNA usando 1 unidade
de Taq Polimerase (Promega, Mannheim, Alemanha), 50 mM Trise HCl, pH 9,0, 1,5 mM MgCl2, 15 mM (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) Triton -X
100, 200 mM dNTPs e 0,5 mM de cada iniciador
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em um volume de reação de 25 ml e uma temperatura de recozimento de 55 C. Os primers usados para amplificação estão listados na Tabela 1.
Como controle constitutivo, a b-actina foi amplificada. O número do ciclo foi escolhido entre 24 e 40 para obter fragmentos de PCR durante a
fase de amplificação exponencial para cada gene. Os fragmentos de PCR foram visualizados por coloração com brometo de etídio de géis de
agarose.
Diferenças na expressão gênica relativa foram determinadas por densitometria usando o software gratuito ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Para normalização, foram calculadas as proporções da expressão do gene alvo em relação à b-actina. A expressão diferencial mostrou uma
tendência dependente da concentração semelhante em cada experimento replicado, mas a magnitude dos níveis de expressão do mRNA
flutuaram. Portanto, uma padronização de dados que é comum em estatística multivariada foi aplicada [25]. Assim, os dados de expressão
gênica de experimentos independentes foram divididos pela média calculada de todas as concentrações de cada um desses experimentos. A
média resultante desses conjuntos de dados padronizados é igual a um. A vantagem desta técnica sobre outras abordagens, como a
representação dos dados como porcentagem da expressão em controles, é que a variação dos dados de controle é visível. Para obter um
número amostral suficiente, a distribuição normal foi confirmada pela análise abrangente dos resíduos ð¼ Xi XÞ dos dados de todas as
concentrações usando o teste ShapiroeWilks-W (p < 0,05) e o software Statistica 7.0. (StatSoft Europe GmbH, Hamburgo, Alemanha). Diferenças
estatisticamente significativas foram avaliadas com ANOVA paramétrica e pós-teste de Dunnet (p < 0,05) usando o software GraphPad InStat
3.0 (software GraphPad, San Diego, CA).

A expressão de todos os genes do sistema imunológico que foram sondados foi detectada (Fig. 1A), exceto para il12b (subunidade ¼p40,
dados não mostrados). Uma vez que o il12b desempenha um papel proeminente na resposta inicial a vírus e certas bactérias intracelulares,
como Listeria [17], pode não ser expresso constitutivamente ou após uma ativação de LPS. Para o tratamento com o sorotipo LPS O111:B4,
apenas il1b apresentou elevação significativa da expressão gênica (dados não apresentados). A estimulação pelo LPS serotpye O55:B5 revelou
uma indução significativa de tnfa e il1b com níveis máximos de 1 ng/ml (Fig. 1B). Curiosamente, esta indução de tnfa e il1b foi observada apenas
em embriões dos quais o cório foi removido antes da exposição ao LPS (dados não mostrados). Isso provavelmente pode ser atribuído a uma
transferência restrita de tamanho de LPS através do córion. LPS é uma molécula bastante grande com pesos moleculares de 5,6 kDa e acima
(calculado a partir de estruturas moleculares fornecidas na ref. [26]). Como foi demonstrado por Creton [27] para fluoresceína isotiocianato
dextran, o córion se comporta como uma peneira molecular impedindo a captação de moléculas maiores que 3 a 10 kDa. A faixa efetiva de
concentração de LPS para indução de tnfa e il1b foi semelhante à observada para monócitos de sangue periférico humano [28,29], mas mais de
100 vezes abaixo das concentrações usadas em culturas de células de peixes e em embriões de um peixe-zebra transgênico [5e7 ,16]. A
sensibilidade relativamente alta da indução de tnfa e il1b observada neste estudo pode ser explicada pelos diferentes sorotipos de LPS que
foram usados para a estimulação.

tabela 1
Sequências de primers de genes analisadas por RT-PCR em embriões de zebrafish expostos a lipopolissacarídeos
nome do gene Função Número de Adesão do GenBank Sequências de primer
direto e reverso (50 -30 )
il1b Interleucina 1b (citocina) AY340959 TGGACTTCGCAGCACAAAATTG
GTTCACTTCACGCTCTTGGATG
tnfa Necrose tumoral AY427649 ACCAGGCCTTTTCTTCAGGT
fator a (citocina) TGGTCATTCTCCAGTCTAAGG
il10 Interleucina 10 (citocina) AY887900.1 ACGAGATCCTGCATTTCTACTTG
AGCTCCCCCATAGCTTTATAGAC
il12b (p40) Interleucina 12 (citocina) AB183002.1 CATATGCAGAGGAGCTGGAG
TCTGCTTCCGGTTTTTCTTG
nfkbiab inibidor de NF-kB AY163841.1 CCATCCAGGGTTACTTGTCATT
CTCCGTCGCTACCTCACTATC
nfkb2 subunidade NF-kB NM_001001840.1 AGTATCCAGTCCATCTCGCTGT
GCTTCTTCTCGCTCTCTTCATC
relação subunidade NF-kB NM_001001839.1 CACCCACCTCCCTTTTTCTCTCTC
GGTTTGGGTTCCCTTCTTTTTG
ptgs1 Ciclooxigenase NM_153656.1 AGAATTGACAGGAGAGCAGGAG
CACCATTTCGTATTAAGGCACA
ptgs2 Ciclooxigenase NM_153657.1 ACTCTATCGTCACCACACATGG
TGTCTCCTGTCATTCTCCTCAAA
bactina1 gene de limpeza b-actin1 AF057041 GCCACAGAGAGAGAGAGACAG
CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG
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Fig. 1. Expressão de genes envolvidos na resposta imune inata em embriões de peixe-zebra expostos ao sorotipo O55:B5 de lipopolissacarídeo (LPS) de
E. coli. Os embriões foram descorionados e expostos ao LPS de 28 a 32 h pós-fertilização. A. Imagem de uma análise RT-PCR representativa.
Os números entre parênteses indicam o número de ciclos de PCR. B. A expressão relativa de tnfa e il1b em embriões de zebrafish foi calculada por uma
análise densitométrica de intensidades de banda resultantes de RT-PCR de lotes de 30 embriões. A expressão foi normalizada por comparação com o
gene doméstico bactin1 (n ¼ 5 para tnfa en ¼ 6 para il1b, * ¼ significativamente diferente dos controles (p < 0,05). Para mais detalhes, consulte o artigo.

Em comparação com a estimulação da resposta imune por imersão de embriões de zebrafish em uma suspensão
bacteriana [4], a resposta ao LPS observada neste estudo parece relativamente fraca (cerca de 2,2 vezes com base na análise
densitométrica). Pressley e outros. [4] demonstraram uma indução de até 8 e 32 vezes dos números de transcritos tnfa e il1b,
respectivamente. A indução mais forte pode ser explicada pelo uso da bactéria patogênica Edwardsiella tarda, específica para
peixes. Além disso, bactérias intactas podem fornecer componentes imunoestimulantes adicionais, levando a uma ativação
aprimorada.
Em resumo, mostramos que o LPS é capaz de induzir a expressão de genes de citocinas pró-inflamatórias como parte da
resposta imune inata em embriões de peixe-zebra. A estimulação da resposta imune inata em peixes-zebra descorionados
pode ser usada para uma triagem para identificar potenciais compostos imunomoduladores. Otimização adicional do teste de
embrião de peixe-zebra pode ser alcançada pelo uso de LPS ou extratos de bactérias patogênicas de peixes para a estimulação
da expressão de citocinas.
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Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. A. van der Sar, Departamento de Microbiologia Médica, Vrije Universiteit Amsterdam, NL, pelo apoio
na configuração do teste de embrião de peixe-zebra para análise de imunidade inata e fornecimento de sequências de primers
para il1b e tnfa. N. Stetefeld é reconhecida por sua assistência com a descorionação de embriões.

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