Machine Translated by Google

Imunologia de Peixes e Mariscos 26 (2009) 326–331

Listas de conteúdos disponíveis em ScienceDirect

Imunologia de Peixes e Mariscos

página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/fsi

Resposta e tolerância ao LPS no zebrafish (Danio rerio)

B. Novoa , b TV Bowman uma

, b L.Zon , A. Figueras
uma,*

uma

Instituto de Investigaciones Marinas, Consejo Superior de Investigaciones Cientÿ´ficas (CSIC), Eduardo Cabello, 6, 36208 Vigo, Espanha
b
Children's Hospital, Howard Hughes Medical Institute, Karp Family Research Laboratories, 7th Floor, Room 7211, One Blackfan Circle, Boston, MA 02115, EUA

informações do artigo resumo

Historia do artigo: O peixe-zebra (Danio rerio) foi utilizado no presente trabalho para estudar a resposta de peixes à exposição bacteriana a
Recebido em 23 de setembro de 2008
lipopolissacarídeos (LPS) e tolerância a LPS. Esses mecanismos não são completamente compreendidos em mamíferos e,
Recebido em forma revisada
atualmente, são totalmente desconhecidos em peixes. A sobrevivência larval do peixe-zebra foi avaliada após o tratamento com
4 de dezembro de 2008
vários tipos de LPS em uma variedade de concentrações para determinar a sensibilidade do peixe-zebra à ativação imune induzida
Aceito em 9 de dezembro de 2008
Disponível online em 16 de dezembro de 2008 por LPS. Além disso, peixes pré-tratados com uma concentração subletal de LPS não morreram após a exposição a uma
concentração letal de LPS demonstrando, pela primeira vez, que a tolerância ao LPS também ocorre em peixes. O intervalo de

Palavras-chave:
tempo entre o pré-tratamento e a exposição secundária, bem como o tipo de pré-tratamento ditou a força da proteção. Como os
Endotoxina peixes-zebra estão em contato íntimo com microrganismos, a alta resistência dos peixes ao LPS sugere que deve haver um controle
Zebrafish rígido do cluster de receptores de LPS para evitar um excesso de inflamação. Um desses componentes é o CXCR4, que já
Tolerância LPS demonstrou regular o sinal transduzido pelo TLR4. Tratar peixes com AMD3100, um inibidor específico de CXCR4, aumentou a
LPS mortalidade associada ao tratamento com LPS. O bloqueio do CXCR4 por inibição química ou genética resultou em uma reversão
CXCR4
da tolerância ao LPS, apoiando ainda mais o papel regulador negativo do CXCR4 nessa resposta inflamatória. Em apoio a um papel
inibitório para CXCR4 na cascata inflamatória, os níveis de transcrição de IL-1 foram elevados em larvas de zebrafish Odysseus
(mutante deficiente em CXCR4) não estimuladas e estimuladas por LPS.

2008 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

1. Introdução
Em mamíferos, produtos microbianos, como lipopolissacarídeos (LPS) ou
endotoxinas, são potentes indutores de inflamação que estimulam as células do
sistema imunológico após serem reconhecidos principalmente pelos receptores Toll-
like (TLRs), uma família de proteínas transmembrana intimamente relacionadas
que iniciam cascatas de sinalização . O LPS enterobacteriano gram-negativo
sinaliza através de TLR4, envolve as moléculas a jusante MyD88, TIRAP/Mal, IRAK
e TRAF6, e leva à produção de citocinas pró-inflamatórias, proteases, eicosanóides
e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio [1]. As bactérias Gram-positivas
geralmente ativam as células de maneira dependente de TLR2. No caso de
Pseudomonas aeruginosa LPS, foi relatado o envolvimento de TLR2 e TLR4 [2,3].
Se a resposta inflamatória à infecção não for rigorosamente controlada, vários
processos patológicos podem se desenvolver, incluindo choque séptico. Embora
moléculas pró-inflamatórias induzidas por LPS, como interleucina-1 (IL-1) ou fator
de necrose tumoral (TNFa), sejam importantes para evitar o crescimento e
disseminação de bactérias Gram-negativas, sua superprodução pode
* Autor correspondente. Tel.: þ34 986 214462; fax: þ34 986 295762.
Endereço de e-mail: antoniofigueras@iim.csic.es (A. Figueras).
levar ao choque endotóxico que é uma resposta inflamatória sistêmica grave
desencadeada pela interação do LPS com células hospedeiras, caracterizada por
febre, disfunção miocárdica, insuficiência respiratória aguda, hipotensão, falência
múltipla de órgãos e, em grande número de casos, morte [1 –3]. É bem conhecido
em mamíferos, que uma exposição prévia ao LPS induz ''tolerância à endotoxina''
que se acredita proteger o hospedeiro do choque endotóxico ou séptico, embora os
mecanismos envolvidos não sejam totalmente compreendidos. Na verdade,
resultados contraditórios foram relatados. A tolerância pode limitar as respostas pró-
inflamatórias dos neutrófilos, limitando as respostas dos neutrófilos in vivo,
potencialmente impedindo a ativação celular excessiva [4].
Nos últimos anos, o zebrafish (Danio rerio) tem sido amplamente utilizado em
áreas de pesquisa como câncer, pesquisa ou desenvolvimento de células-tronco,
porém, devido às suas vantagens, está começando a ser utilizado em outros
campos. Também pode ser apreciado na pesquisa de imunologia e doenças
infecciosas: as larvas do peixe-zebra são transparentes, fáceis de criar e apenas o
sistema imunológico inato está presente até várias semanas após a fertilização,
simplificando assim a análise das respostas imunes [5]. Além disso, as respostas
fisiológicas podem ser estudadas com todo o organismo. Além disso, Purcell et al.
[6] caracterizaram os principais componentes da via de sinalização TLR, incluindo
MyD88, TIRAP, TRIF, TRAF6, IRF3, IRF7 em peixe-zebra. Também já foi relatado
que o principal receptor para LPS é expresso em zebrafish no início

1050-4648/$ – ver matéria inicial 2008 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados. doi:10.1016/
j.fsi.2008.12.004
Machine Translated by Google

B. Novoa et ai. / Imunologia de Peixes e Mariscos 26 (2009) 326–331 327

tempos de infecção [7,8], no entanto, moléculas acessórias como CD14, que são com primers: Forward: CAA CGG AAA CGC TCA TTG C e Reverse: CGA GCA GGA
essenciais para a resposta ao LPS em mamíferos, parecem não estar presentes no GAT GGG AAC C. Os dados foram analisados usando um teste t de Student e as
genoma do peixe-zebra [9]. diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em p < 0,05.
O sistema SDF1-CXCR4 desempenha um papel na migração de células
hematopoiéticas durante o desenvolvimento de mamíferos [10] e recentemente foi
implicado na migração de células germinativas e neuronais no desenvolvimento de 3. Resultados
peixe-zebra [11-14]. A migração celular não está apenas envolvida em aspectos de
desenvolvimento, organogênese e função de órgãos, mas também desempenha um
3.1. Mortalidade causada pela exposição ao LPS
papel em vários processos patológicos, como a disseminação de células tumorais e
formação de metástases [10] e as respostas inflamatórias. De fato, o CXCR4 pertence
Apenas as maiores concentrações (150 e 200 mg/ml) de E. coli 0111:B4 foram
ao cluster que participa do reconhecimento do LPS após a proteína de ligação ao LPS
capazes de induzir a mortalidade de larvas de zebrafish (Fig. 1).
e o CD14 transfere o LPS do espaço extracelular para a membrana, provavelmente
No entanto, o LPS de P. aeruginosa foi capaz de matar os peixes em concentrações
inibindo o TLR4 para controlar um excesso de resposta inflamatória [15].
mais baixas (50–100 mg/ml) do que o LPS de E. coli (Fig. 2).
As concentrações finais de E. coli LPS de 150 mg/ml ou 50–100 mg/ml de P.
Neste trabalho, exploramos o uso de larvas de peixe-zebra como um novo modelo
aeruginosa foram concentrações reprodutivelmente letais para embriões de zebrafish
para o estudo da mortalidade associada à exposição ao LPS e tolerância ao LPS, que
do tipo selvagem.
é um estado hiporresponsivo a uma segunda exposição ao LPS.

3.2. Indução de tolerância usando LPS e padrões moleculares associados a

2. Material e métodos patógenos (PAMPs)

Para saber se baixas concentrações de LPS poderiam produzir tolerância em

Zebrafish e embriões foram mantidos de acordo com protocolos padrão [16]. Os
zebrafish, 2 embriões dpf foram primeiro tratados com
mutantes Odysseus [12], que apresentam uma mutação no gene CXCR4, também
foram mantidos de acordo com protocolos padrão.
Todos os experimentos de mortalidade foram conduzidos usando réplicas de 10 a 15
2 peixes dpf tratados com E. coli LPS
peixes cada. Os peixes foram mantidos em placas de 6 poços a 28 C durante os
120
tratamentos.
Larvas de peixe-zebra foram banhadas em uma gama de concentrações de 100
0 µg/ml
Escherichia coli 0111:B4, P. aeruginosa LPS (Sigma). Larvas de zebrafish de 2, 5 e 10 80 5 µg/ml
dias pós-fecundação (dpf) foram tratadas com 0, 5, 25, 50, 150 e 200 mg/ml de 0111:B4 25 µg/ml
60
E. coli LPS. As mesmas concentrações foram usadas para P. aeruginosa LPS (Sigma). 50 µg/ml
40
A mortalidade foi registrada regularmente por 48 h. 150 µg/ml
20 200 µg/ml
Experimentos de tolerância foram conduzidos usando larvas de dois dias de idade 0
que foram expostas a concentrações subletais de LPS (50 mg/ml de E. coli 0111:B4 ou 0 6 20 30
2,5; 5 e 10 mg/ml de P. aeruginosa). Em diferentes momentos após o tratamento, as Horas pós-tratamento
larvas foram expostas a uma concentração letal de E. coli 0111:B4 ou P. aeruginosa
LPS. Peixe 5dpf tratado com E. coli LPS
Experimentos de tolerância cruzada foram conduzidos usando um ou dois pré-
120
tratamentos de 50 mg/ml de diferentes PAMPs (E. coli 0111:B4 LPS, E. coli 055: B5
100
LPS (Sigma), P. aeruginosa LPS, b glucanos (Macrogard), lipoteicóicos ácido de
0 µg/ml
Staphylococcus aureus (Sigma), poli I:C (Sigma)) seguido por uma concentração letal 80 5 µg/ml
de E. coli LPS (150 mg/ml). 60 25 µg/ml
Para investigar o envolvimento do CXCR4 na resposta das larvas ao LPS, foram 50 µg/ml
40 150 µg/ml
estudados tratamentos com AMD3100 (Sigma), que é um inibidor farmacológico
específico do CXCR4. A fim de encontrar uma concentração não tóxica para larvas de 20 200 µg/ml
zebrafish, várias concentrações foram testadas (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 mg/ml, 0
10 mg/ml, 100 mg/ml). 0 6 20 30
Foram utilizados tratamentos com AMD3100 sozinho ou combinado com um pré- Hora pós-tratamento
tratamento subletal com LPS, antes de uma exposição à concentração letal de LPS. Os
mutantes Zebrafish Odysseus, que possuem uma mutação no gene CXCR4, também Peixe 10 dpf tratado com E. coli LPS
foram usados para esclarecer o papel do CXCR4 na tolerância ao LPS.
120
Ensaios de PCR quantitativos foram realizados usando o Sistema de PCR em
100
Tempo Real 7300 (Applied Biosystems) usando amostras reunidas de 4 a 5 larvas de 0 µg/ml
peixe. A amplificação do cDNA foi realizada usando primers específicos projetados pelo 80 5 µg/ml
software Primer 3 [17]. 0,5 ml de cada primer (10 mM) foram misturados com 12,5 ml 60 25 µg/ml
50 µg/ml
de SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems) em um volume final de 25 ml. As 40 150 µg/ml
condições padrão de ciclagem foram 95 C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 C 15
20 200 µg/ml
s e 60 C por 1 min. O método CT comparativo (método 2-DDCT ) foi usado para
determinar o nível de expressão dos genes analisados [18]. A expressão dos genes 0
0 6 20 30
candidatos foi normalizada usando b-actina como um gene de limpeza. IL-1 foi
amplificado com primers Forward: ATC TCC ACC ATC TGC GAA TC e Reverse: AAC Horas pós-tratamento
CTG TAC CTG GCC TGT TG e b-actina foram amplificados
Fig. 1. Sobrevivência de larvas de zebrafish expostas em diferentes dias após a fertilização (dpf) a
E. coli 0111:B4 LPS. Os peixes foram banhados diretamente em água com as diferentes
concentrações de LPS. Os dados correspondem a um experimento representativo conduzido 4 vezes.
Machine Translated by Google

328 B. Novoa et ai. / Imunologia de Peixes e Mariscos 26 (2009) 326–331

Sobrevivência de zebrafish tratados Outros PAMPs foram investigados para determinar sua capacidade de induzir
com P. aeruginosa LPS tolerância cruzada (proteção) à exposição ao LPS. Enquanto alguma proteção foi
120 observada com um único pré-tratamento, dois tratamentos de 50 mg/ml de cada
PAMP foram mais eficazes na indução de tolerância (Fig. 4). Neste caso, o LTA e
100 os dois LPS de E. coli produziram uma proteção completa dos peixes e o poli I:C
induziu um atraso nas mortalidades causadas por uma concentração letal de LPS.
80
Os níveis de transcrição de IL-1 aumentaram com o tempo nas larvas após uma
60 exposição letal ao LPS (Fig. 5). Uma diminuição nos níveis de transcrição de IL-1
foi observada em larvas tratadas com uma concentração subletal após 3 h.

40
3.3. Envolvimento do CXCR4 na resposta ao tratamento com LPS
20 (tratamento AMD3100 e peixe mutante Odysseus)

0 Com o objetivo de determinar se o CXCR4 tem um papel no LPS

0h 3h 6h 8h 24h 72h
tolerância dos peixes, bloqueamos sua função por meio de abordagens químicas e
Horas pós-tratamento genéticas. Primeiro, depois de usar várias concentrações de AMD3100, um inibidor
farmacológico específico de CXCR4 [19,20], descobrimos que a concentração de 10
200 µg/ml 100 µg/ml 25 µg/ml mg/ml não era tóxica para larvas de peixe-zebra. As larvas expostas ao AMD3100
150 µg/ml 50 µg/ml 10 µg/ml foram mais sensíveis ao tratamento com LPS; concentrações mais baixas de LPS
Ao controle
levaram à letalidade na presença de AMD3100 (Fig. 6A). Além disso, os peixes que
receberam tratamento com AMD3100 durante o período de tolerância não foram
Fig. 2. Sobrevivência de larvas de peixe-zebra expostas a 2 dpf com P. aeruginosa LPS. Os
capazes de sobreviver após a exposição a uma concentração letal de LPS, embora
resultados são desvios padrão (n ¼ 2 réplicas com 15 peixes cada) de uma experiência representativa
mento repetido três vezes. tenham sido tratados anteriormente com uma concentração subletal protetora de
LPS como nos experimentos já descritos (Fig. 6B).

uma concentração subletal de 50 mg/ml de E. coli 0111:B4 LPS seguida de uma Os mutantes Odysseus, que são mutantes no gene CXCR4, não mostraram

exposição a uma concentração letal do mesmo sorotipo LPS. maior sensibilidade ao LPS, mas nenhuma tolerância ao LPS foi observada (Fig.

O tempo de administração de concentrações subletais e letais foi crítico (Fig. 3). A 6B). Para testar diretamente o efeito da perda de função do CXCR4 nos efeitos a

tolerância foi sempre observada quando o intervalo de tempo entre o pré-tratamento jusante da cascata inflamatória, os níveis de transcrição de IL-1 foram determinados

com o subletal e a exposição à concentração letal foi de pelo menos 24 horas. A em mutantes Odysseus antes e depois de uma exposição subletal ao LPS (Fig. 6C).

exposição a um tratamento subletal 6 h antes da exposição à concentração letal Verificou-se que os níveis de IL-1 eram altos em mutantes Odysseus sem exposição

não foi suficiente para conferir proteção. Pelo contrário, a tolerância foi observada a LPS e, adicionalmente, um aumento significativo no nível de IL-1 foi observado

quando 4 dias foi a diferença entre os tratamentos com as concentrações subletais em mutantes Odysseus após o tratamento.

e letais.

Em todos os experimentos realizados, a tolerância sempre foi observada quando 4. Discussão

LPS de E. coli 0:111 foi usado como concentração subletal um dia antes de uma
concentração letal de E. coli LPS (150 mg/ml) ou Pseudomonas LPS (50–100 mg / A cascata inflamatória começa com os receptores envolvidos na ligação e
ml). No entanto, a tolerância não foi observada quando as larvas foram pré-tratadas captação de bactérias e seus produtos pelas células do sistema imune inato.
com concentrações subletais de Pseudomonas LPS (dados não mostrados). Continua com a produção de citocinas pró-inflamatórias, como TNFa, IL-1 e IL-8,

Dose dose
Fertilização Mortalidades
subletal letal
Controles: 100% (+0) de mortalidade
2 dias 6h 1 dia Tratado: 100% (+0) mortalidade Sem tolerância

Dose dose
Fertilização Mortalidades
subletal letal
Controles: 100% (+0) de mortalidade
2 dias 1 dia 1 dia Tratado: 0% (+0) de mortalidade Tolerância

Dose dose
Fertilização Mortalidades
subletal letal
Controles: 100% (+0) de mortalidade
2 dias 2 dias 1 dia Tratado: 0% (+0) de mortalidade Tolerância

dose
Dose
Fertilização letal Mortalidades
subletal

Controles: 100% (+0) de mortalidade

2 dias 4 dias 1 dia Tolerância
Tratado: 2% (+2,8) mortalidade

Fig. 3. Resumo dos diferentes experimentos conduzidos para demonstrar a tolerância ao LPS no peixe-zebra. Embriões de 2 dpf foram tratados com uma concentração subletal de LPS (50 mg/ml de E. coli
0111:B4) e depois em diferentes momentos pós-exposição a uma concentração letal (150 mg/ml) do mesmo LPS.
Machine Translated by Google

B. Novoa et ai. / Imunologia de Peixes e Mariscos 26 (2009) 326–331 329

1 pré-tratamento
UMA

140 120

120
100
0 µg/ml
100 Controle
Gluc 80 10 µg/ml

80 25 µg/ml 50
Poly I:C
µg/ml 100
60
A. Lipot.
60 µg/ml
E coli 055
E coli 0111 40
40

20 20

0 0
0h 3h 6h 8h 24h 0 min 30 min 1 h 3h 5h 24h

Tempo após a exposição ao LPS Tempo pós tratamento

B
120
2 pré-tratamentos

100 100

90
80
peixe tipo selvagem
80
peixe Ulisses
70 Controle 60 peixe tratado AMD
60 Gluc

50 Poly I:C 40
A. Lipot.
40
E coli 055 20
30 E coli 0111
20 0
10 2h 3h 4h 20h 24h 30h
0 desafio de postagem de tempo
0h 3h 6h 8h 24h
C
Tempo após a exposição ao LPS
0,0015 *
Fig. 4. Sobrevivência de larvas de peixe-zebra incubadas com outros PAMPS para determinar
se podem induzir tolerância ao LPS. Os tratamentos com a concentração letal de E. coli LPS
foram conduzidos a 7 dpf. (A) um pré-tratamento em 3 dpf (B) dois pré-tratamentos em 3 e 6 0,001
dpf de PAMPs ou dois sorotipos de E. coli LPS. Os resultados são desvios padrão de n ¼ 2 *
réplicas de um experimento representativo de três.
0,0005

mediadores, radicais de oxigênio e enzimas que danificam os tecidos

[21]. Neste trabalho mostramos que desde cedo larvas de zebrafish (2
dpf) são capazes de produzir uma resposta inflamatória quando expostas
ao LPS.
A concentração letal mínima de LPS foi muito maior do que em
mamíferos e isso nos levou a perguntar por que e como os peixes são
tão resistentes ao LPS e em geral a outros PAMPs como também foi
relatado [9,22-24]. Embora a resistência ao LPS tenha sido observada
0,0000035
0,000003
0,0000025
0
Ao controle LPS Ody Control Ody LPS
peixe tipo selvagem peixe Ulisses
Fig. 6. Participação do CXCR4 na sensibilidade ao LPS e tolerância. (A) Sobrevivência de
peixes selvagens tratados com AMD3100, um inibidor específico de CXCR4, mostrando que
peixes tratados com AMD3100 não sobrevivem à exposição a concentrações subletais de
LPS. Os resultados são desvios padrão (duas réplicas com 10 peixes cada). (B) Reversão da
tolerância ao LPS em peixes Odysseus e peixes tratados com AMD3100 de tipo selvagem em
comparação com peixe-zebra de tipo selvagem não tratado. Os peixes foram tratados com
uma concentração subletal de LPS e após um dia foram expostos a uma concentração letal
30m de P. aeruginosa. Os resultados são desvios padrão (duas réplicas com 10 peixes cada). (C)
1h qPCR de IL-1 de peixes Odysseus e Tubingen (tipo selvagem) 24 h após o tratamento com 50 mg/ml de LP
3h Os resultados são desvios padrão de n ¼ 4 amostras agrupadas. *: indica diferenças
significativas, p < 0,05, em relação aos controles.

0,000002 *#
expressão
valores
qPCR
de em outros vertebrados não mamíferos [9,25], os peixes vivem na água
0,0000015 e, portanto, em contato íntimo com uma quantidade potencialmente
elevada de microorganismos. Se uma alta reação inflamatória fosse
0,000001 desencadeada após cada contato com patógenos externos, os peixes
# simplesmente não sobreviveriam. Assim, a inflamação e a sepse devem
0,0000005 ser rigorosamente reguladas nesses animais devido à sua localização no ambiente
De acordo com o que é relatado para mamíferos [26] P. aeru ginosa
0
Ao controle LPS 50 LPS 150
LPS foi mais letal do que E coli LPS. Curiosamente, o pré-tratamento de
larvas de zebrafish com diferentes concentrações de P. aeruginosa LPS
Fig. 5. Expressão de IL-1 por qPCR mostrando sua diminuição após exposição à concentração não protegeu a exposição subsequente com uma concentração letal com
subletal de E. coli LPS (50 mg/ml) em comparação com seu aumento quando uma o mesmo LPS. Pelo contrário, o pré-tratamento com um LPS não letal
concentração letal foi usada (150 mg/ml). Os resultados são desvios padrão de n ¼ 4 amostras
agrupadas. *: indica diferenças significativas, p < 0,05, em relação ao controle. #: indica
(E. coli) protegeu quando os peixes foram expostos ao LPS P. aeruginosa.
diferenças significativas, p < 0,05, em relação ao valor inicial após 30 min de Isso precisa de mais pesquisas para esclarecer os mecanismos
tratamento. moleculares envolvidos.
Machine Translated by Google
330 B. Novoa et ai. / Imunologia de Peixes e Mariscos 26 (2009) 326–331
Como observado em macrófagos de mamíferos, a exposição de larvas
de peixe-zebra a altas concentrações de LPS leva à morte, provavelmente
relacionada à alta produção de citocinas pró-inflamatórias e outras moléculas. 2R01HL048801-15A2 e HHMI.
No entanto, o presente trabalho mostra que se os peixes forem primeiro
tratados com uma concentração subletal, isso induz um estado hipo-
responsivo a um segundo tratamento de LPS que é conhecido como tolerância ao LPS.
Em mamíferos, a homotolerância TLR é consistentemente mais forte do que
a heterotolerância TLR (com outros PAMPs diferentes) [27]. Isso está de
acordo com nossos experimentos, pois embora pudéssemos detectar um
papel protetor completo após duas administrações de ácido lipoteicóico
(componente da superfície de bactérias Gram-positivas) a uma exposição a
uma concentração letal de LPS, isso não foi observado quando apenas um
pré-tratamento mento foi dado. No entanto, nenhuma proteção foi alcançada
quando o b-glucano foi usado; essa molécula interage com um receptor
sinalizador de reconhecimento de padrão não-TLR, a dectina-1, mas se essa
é a causa da falta de proteção observada precisa de mais pesquisas. Poly
I:C, que imita uma infecção viral, mostrou um efeito intermediário. Essas
diferentes respostas são mecanismos pouco compreendidos em mamíferos
e, até agora, totalmente desconhecidos em peixes.
A IL-1 tem sido envolvida como um mediador de tolerância in vivo em
mamíferos [28]. Nossos resultados mostram que a expressão de IL-1
aumenta quando os peixes são tratados com altas concentrações de LPS, o
que imitaria a superprodução de citocinas pró-inflamatórias produzidas nos
casos de sepse. No entanto, IL-1 diminui no estado hipotolerizado induzido
por concentrações mais baixas de LPS, o que está de acordo com a
expressão inibida relatada de muitas citocinas, por exemplo, TNFa, IL-1ß,
IL-6 e IL-12 em casos de tolerância a LPS [29].
Vários estudos apontaram que o receptor de quimiocina CXCR4 parece
ser uma parte funcional do aparelho de detecção de LPS [15,28] e pode ter
um papel na inibição da cascata de sinalização iniciada por TLR4. Nos
peixes Odysseus, nos quais a função do CXCR4 é inibida, a expressão de
IL-1 foi maior do que nos tipos selvagens no estado não estimulado e
aumentou ainda mais quando os peixes foram tratados com LPS.
Quando as larvas de peixe-zebra do tipo selvagem foram tratadas com
AMD3100, um inibidor farmacológico específico de CXCR4 [19,20], nenhuma
tolerância foi obtida. Resultados semelhantes foram obtidos em peixes
Odysseus. Essas observações sugerem fortemente que o CXCR4 pode ter
um papel fundamental na modulação das respostas imunes do peixe-zebra
à endotoxina LPS, uma vez que o comprometimento do CXCR4 (genético
ou farmacológico) induz respostas inflamatórias mais altas e reversão da
tolerância. Esses resultados sugerem que o peixe-zebra pode ter
experimentado uma pressão seletiva evolutiva para evitar estados
inflamatórios excessivos que podem estar associados a um aumento da
atividade do receptor CXCR4. Nossos achados concordam com estudos
anteriores, nos quais o CXCR4 é descrito como envolvido na ligação do LPS,
mas também responsável pelo desencadeamento da sinalização. No entanto,
existe uma controvérsia sobre esse assunto, pois alguns autores acham que
o CXCR4 atua como um inibidor do receptor LPS TLR4 [30], mas outros
afirmam que o CXCR4 interage com o TLR4 aumentando a sinalização do LPS [15]. [21] Decker T. Sepsis: evitando seu pedágio mortal. J Clin Invest 2004;113:1387–9.
Zebrafish pode ser um bom modelo para estudar doenças infecciosas,
choque séptico e tolerância a endotoxinas. Zebrafish tem várias vantagens
em comparação com outros modelos: um grande número de indivíduos pode
ser usado, a disponibilidade de peixes transgênicos ou mutantes e a
facilidade de manipulação química, o que facilita a observação de reações
inflamatórias de todo o organismo a estímulos externos. Este é um benefício
substancial em comparação com outros estudos em que apenas uma linha
celular pode ser avaliada e, portanto, pode não refletir a verdadeira resposta
in vivo.
Reconhecimentos
Queremos agradecer a todas as pessoas do Dr. Zon Lab, Children's
Hospital (Boston) por sua hospitalidade e amizade. Este trabalho foi
parcialmente financiado pelo projeto CSD2007-00002
Aquagenômica financiada pelo programa Consolider-Ingenio 2010 do
Ministerio de Ciencia e Innovación espanhol e NIH concede
Referências
[1] West MA, Heagy W. Tolerância à endotoxina: uma revisão. Crit Care Med 2002;30:S64–73.
[2] Power MR, Peng Y, Maydanski E, Marshall JS, Lin TJ. O desenvolvimento da resposta inicial
do hospedeiro à infecção pulmonar por Pseudomonas aeruginosa é criticamente dependente
do fator de diferenciação mielóide 88 em camundongos. J Biol Chem 2004;279:49315–22.
[3] Sly LM, Rauh MJ, Kalesnikoff J, Song CH, Cristal G. A regulação positiva de SHIP induzida
por LPS é essencial para a tolerância à endotoxina. Imunidade 2004;21:227–39.
[4] Parker LC, Jones EC, Prince LR, Dower SK, Whyte MK, Sabroe I. A tolerância à endotoxina
induz alterações seletivas na função dos neutrófilos. J Leukoc Biol 2005;78:1301–5.
[5] Lam SH, Chua HL, Gong Z, Lam TJ, Sin YM. Desenvolvimento e maturação do sistema imune
em zebrafish, Danio rerio: um perfil de expressão gênica, hibridização in situ e estudo
imunológico. Dev Comp Immunol 2004;28(1): 9–28.
[6] Purcell MK, Smith KD, Hood L, Winton JR, Roach JC. Conservação de vias de sinalização de
receptores toll-like em peixes teleósteos. Comp Biochem Physiol Parte D Genomics
Proteomics 2006;1:77–88.
[7] Meijer AH, Krensa SFG, Medina Rodrÿ´guez IA, Hea S, Bitterb W, Snaar Jagalsk BE, et al.
Análise de expressão das famílias de receptores toll-like e adaptadores de domínio TIR de
peixe-zebra. Mol. imunol. 2004;40:773–83.
[8] Jault C, Pichon L, Chluba J. Família de genes de receptores semelhantes a Toll e domínio TIR
adaptadores em Danio rerio. Mol Immunol 2004;40:759–71.
[9] Iliev DB, Roach JC, Mackenzie S, Planas JV, Goetz FW. Reconhecimento de endotoxinas: em
peixes ou não em peixes? FEBS Lett 2005;579:6519–28.
[10] Müller A, Homey B, Soto H, Ge N, Catron D, Buchanan ME, et al. Envolvimento dos receptores
de quimiocinas na metástase do câncer de mama. Nature 2001;410(6824): 50–6.
[11] David NB, Sape`de D, Saint-Etienne L, Thies C, Thies B, Dambly-Caudie` re C, et al. Base
molecular da migração celular na linha lateral de peixes: papel do receptor de quimiocina
CXCR4 e de seu ligante, SDF1. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:16297–302.
[12] Knaut H, Werz C, Geisler R, Nuësslein-Volhard C, Tübingen 2000 Screen Consortium. Um
homólogo do peixe-zebra do receptor de quimiocina Cxcr4 é um receptor de orientação de
células germinativas. Nature 2003;421(6920):279–82.
[13] Knaut H, Blader P, Stra¨hle U, Schier AF. Montagem dos gânglios sensoriais do trigêmeo por
sinalização de quimiocinas. Neuron 2005;47:653–66.
[14] Li Q, Shirabe K, Thies C, Thies B, Okamoto H, Masai I, et al. A sinalização de quimiocinas
orienta os axônios na retina do peixe-zebra. J Neurosci 2005;25: 1711–7.
[15] Triantafilou M, Lepper PM, Briault CD, Ahmed MAE, Dmochowski JM. Che mokine receptor
4 (CXCR4) faz parte do aparelho de detecção de lipopolissacarídeos. Eur J Immunol
2008;38:192–203.
[16] Nusslein-Volhard C, Dahm R. Zebrafish, uma abordagem prática. NY: Oxford University Press
Nova York; 2002.
[17] Rozen S, Skaletsky H. Primer3 na WWW para usuários em geral e para biólogo
programadores. Métodos Mol Biol 2000;132:365–86.
[18] Livak KJ, Schmittgen TD. Análise de dados de expressão gênica relativa usando PCR
quantitativo em tempo real e o método 2 (-Delta Delta C(T)). Métodos 2001;25:402–8.
[19] Fricker SP, Anastassov V, Cox J, Darkes MC, Grujic O, Idzan SR, et al. Caracterização da
farmacologia molecular de AMD3100: um antagonista específico do receptor de quimiocina
acoplado à proteína G, CXCR4. Biochem Pharmacol 2006;72:588–96.
[20] Hatse S, Princen K, Bridger G, Clercq ED, Schols D. A inibição do receptor de quimiocina
pelo AMD3100 é estritamente confinada ao CXCR4. FEBS Lett 2002;527:255–62.
[22] Renshaw SA, Loynes CA, Trushell DM, Elworthy S, Ingham PW, Whyte MK.
Um modelo de zebrafish transgênico de inflamação neutrofílica. Sangue 2006;108:3976–8.
[23] Mathias JR, Perrin BJ, Liu TX, Kanki J, Look AT, Huttenlocher A. Resolução da inflamação por
quimiotaxia retrógrada de neutrófilos em peixes-zebra transgênicos.
J Leukoc Biol 2006;80:1281–8.
[24] Yazawa R, Hirono I, Ohira T, Aoki T. Indução da atividade do promotor tnf do linguado japonês
por lipopolissacarídeo em embrião de peixe-zebra. Mar Biotechnol (NY) 2005;7:231–5.
[25] Keestra AM, van Putten JP. Propriedades únicas do complexo TLR4/MD-2 de frango: ativação
seletiva de lipopolissacarídeos da via dependente de MyD88. J Immunol 2008;181:4354–62.
[26] Koyama S, Sato E, Nomura H, Kubo K, Miura M, Yamashita T, et al. O potencial de vários
lipopolissacarídeos para liberar IL-8 e G-CSF. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol
2000;278:658–66.
[27] Dobrovolskaia MA, Medvedev AE, Thomas KE, Cuesta N, Toshchakov V, Ren T, et al. Indução
de reprogramação in vitro por Toll-Like Receptor (TLR)2 e agonistas de TLR4 em macrófagos
murinos: efeitos da ''homotolerância'' de TLR versus ''heterotolerância'' em componentes da
via de sinalização do NF-B. J Immunol 2003;170:508–19.
Machine Translated by Google

B. Novoa et ai. / Imunologia de Peixes e Mariscos 26 (2009) 326–331 331

[28] Henricson BE, Neta R, Vogel SN. Um antagonista do receptor da interleucina-1 bloqueia
a produção do fator estimulante de colônia induzida por lipopolissacarídeo e a
tolerância precoce à endotoxina. Infect Immun 1991;59:1188–91.
[29] Medvedev AE, Kopydlowski KM, Vogel SN. Inibição da transdução de sinal induzida
por lipopolissacarídeo em macrófagos de camundongos tolerantes a endotoxinas:
desregulação da expressão gênica de citocinas, quimiocinas e receptores toll-like 2 e
4. J Immunol 2000;164:5564–74.
[30] Kishore SP, Bungum MK, Platt JL, Brunn GJ. Supressão seletiva da ativação do receptor
toll-like 4 pelo receptor 4 da quimiocina. FEBS Lett 2005; 579:699–704.