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Lasers Med Sci (2018) 33:469–477 https://

doi.org/10.1007/s10103-017-2376-6

ARTIGO ORIGINAL

Efeitos anti-inflamatórios da terapia a laser de baixa potência

em células do ligamento periodontal humano: estudo in vitro

Ji Hua Lee1&Min-Hsuan Chiang1,2&Ping-Ho Chen1,3,4&Mei Ling Ho2,5,6&

Huey-Er Lee1,7&Yan-Hsiung Wang1,2

Recebido: 19 de junho de 2017 /Aceito: 26 de outubro de 2017 /Publicado online: 7 de novembro de 2017
# O(s) autor(es) 2017. Este artigo é uma publicação de acesso aberto

AbstratoA doença periodontal é uma doença inflamatória crônica
comumente tratada com técnicas cirúrgicas e não cirúrgicas. No
entanto, ambas as abordagens têm limitações. A terapia a laser de
baixa intensidade (LLLT) tem sido amplamente aplicada na redução
de reações inflamatórias, e pesquisas indicam que o LLLT induz um
efeito anti-inflamatório que pode melhorar a terapia da doença
periodontal. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito
antiinflamatório do LLLT nas células do ligamento periodontal
humano (hPDLCs) em um ambiente inflamatório e teve como
objetivo determinar o possível mecanismo de ação. As células
foram cultivadas e tratadas com ou sem lipopolissacarídeo (LPS) de
Porphryromonas gingivalisou Escherichia coli,seguido de irradiação
com um laser de arsenieto de gálio-alumínio (GaAlAs) (660 nm) a
uma densidade de energia de 8 J/cm2. Reações em cadeia da
polimerase quantitativas em tempo real foram usadas para avaliar
a expressão de pro-
genes inflamatórios, incluindo fator de necrose tumoral-α (TNF-
α), interleucina (IL)-1β, IL-6 e IL-8. O ensaio do repórter
dualluciferase foi usado para examinar a atividade
transcricional do fator nuclear-κB (NF-κB). Um ensaio
imunossorvente ligado a enzima foi usado para monitorar a
concentração de monofosfato de adenosina cíclico intracelular
(cAMP). Ambos os tratamentos com LPS induziram
significativamente a expressão de mRNA de citocinas pró-
inflamatórias. No entanto, LLLT inibiu a expressão de citocinas
pró-inflamatórias induzida por LPS e elevou os níveis
intracelulares de cAMP. O efeito inibitório do LLLT pode
funcionar regulando negativamente a atividade transcricional
do NF-κB e aumentando os níveis intracelulares de cAMP. LLLT
pode inibir a inflamação induzida por LPS em hPDLCs através
da regulação de cAMP/NF-κB. Esses resultados devem ser mais
estudados para melhorar a terapia periodontal.

Palavras-chaveTerapia de luz de baixo nível. AMP cíclico. NF-kappa

* Yan-Hsiung Wang B . Citocinas . Interleucinas . Lipopolissacarídeos
yhwang@kmu.edu.tw

1
Faculdade de Odontologia, Faculdade de Medicina Dentária, KaohsiungMedical
University, 100, Shih-Chuan 1st Road, Kaohsiung 80708, Taiwan Introdução
2
Centro de Pesquisa Ortopédica, Faculdade de Medicina, Kaohsiung
Medical University, Kaohsiung, Taiwan A doença periodontal é uma doença inflamatória comum e
3
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Nacional Sun Yat-sen, complexa que resulta na destruição progressiva dos tecidos moles
Kaohsiung, Taiwan e duros de suporte dentário do periodonto.1]. O dano resultante
4
Cancer Center, Kaohsiung Medical University Hospital, Kaohsiung afeta o osso alveolar, bem como o ligamento periodontal (PDL).
Medical University, Kaohsiung, Taiwan Embora terapias cirúrgicas, como cirurgia de retalho aberto e
5
Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina, Kaohsiung Medical cirurgia óssea, e terapias não cirúrgicas, como procedimento
University, Kaohsiung, Taiwan padrão de higiene oral e administração local sustentada de agentes
6
Departamento de Biotecnologia e Recursos Marinhos, Universidade antimicrobianos, sejam úteis no controle dessa doença, ambas as
Nacional Sun Yat-Sen, Kaohsiung, Taiwan opções de tratamento têm limitações. Pacientes com bolsas
7
Departamento de Odontologia, Kaohsiung Medical University Hospital, profundas ou envolvimento de furca não responderam bem à
Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan terapia não cirúrgica, e a terapia cirúrgica foi mais eficaz.
470
invasivo e arriscado ao tratar pacientes com problemas
sistêmicos [2,3].
Foi relatado que uma das funções das células PDL é
responder a estresses ambientais, como citocinas inflamatórias
e patógenos.4,5]. Sol e outros. relataram que a exposição ao
lipopolissacarídeo (LPS) induz a expressão de citocinas nas
células PDL, incluindo fator de necrose tumoral (TNF)-α,
interleucina (IL)-1β, IL-6 e IL-8 [4]. As células inflamatórias,
assim como as células do ligamento periodontal, regulam o
processo de periodontite.4–6], embora as funções exatas de
diferentes tipos de células exijam mais esclarecimentos.
O LPS é uma macromolécula com um elemento lipídico (lipídio A) e
um elemento polissacarídeo.7]. O LPS está localizado na membrana
externa de bactérias gram-negativas e estimula respostas imunes
poderosas em animais. De fato, os sistemas imunológicos dos animais
evoluíram para reconhecer o LPS por meio de receptores do tipo toll
(TLRs) [8]. Os TLRs são uma classe de proteínas transmembrana que
contém numerosas repetições ricas em leucina e são compostas por
regiões intracelulares globulares e domínios extracelulares.9]. Onze
diferentes TLRs em humanos foram identificados [10]. Entre eles, TLR2 e
4 funcionam como os principais sensores inatos para os fatores
virulentos de bactérias periodontopáticas.11,12]. A ligação do LPS aos
TLR 2 e 4 desencadeia a ativação da cascata de sinalização do fator
nuclear kappa B (NF-κB), induzindo a secreção de citocinas pró-
inflamatórias, como TNF-α e IL-1β [13]. Alterações no número, posição e
comprimento dos grupos acil ou grupos monossacarídeos no lipídio A
resultarão em alterações nos efeitos biológicos.14]. Com base nesses
mecanismos, LPS de diferentes espécies bacterianas podem
desencadear diferentes tipos de respostas imunes.
Nas últimas décadas, a terapia a laser de baixa intensidade
(LLLT) tem sido amplamente empregada no tratamento de
cicatrização de feridas, dor musculoesquelética e inflamação
crônica e aguda.15,16]. Estudos identificaram os benefícios do uso
de LLLT [17,18]. Por exemplo, Bortone et al. relataram que a LLLT
induziu um efeito anti-inflamatório através da regulação de mRNAs
pró-inflamatórios.17]. Obradovic et ai. relataram que os lasers de
baixa intensidade mostraram eficácia na redução da inflamação da
periodontite em pacientes com diabetes mellitus [18]. No entanto, o
mecanismo preciso pelo qual o LLLT regula a inflamação
periodontal permanece desconhecido.
O monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) funciona como
um importante segundo mensageiro em muitos processos
fisiológicos celulares, como diferenciação celular, proliferação,
apoptose e inflamação.19]. O cAMP é formado pela ativação da
adenilil ciclase e é convertido a partir do trifosfato de
adenosina.19]. Além disso, o cAMP foi recentemente implicado
em processos pró-inflamatórios, pois demonstrou não apenas
servir como um modulador da função imune, mas também
como um regulador em resposta à sinalização de LLLT [20]. No
entanto, a relação potencial entre cAMP e LLLT em afetar a
resposta inflamatória induzida por LPS em células do ligamento
periodontal humano (hPDLCs) não foi investigada.
Lasers Med Sci (2018) 33:469–477
Neste estudo, investigamos os efeitos anti-inflamatórios do
LLLT em hPDLCs que foram expostos ao LPS de
Porphryromonas gingivalis (P. gingivalis)ouEscherichia coli (E.
coli)e teve como objetivo determinar o possível mecanismo de
ação.
Materiais e métodos
Cultura de células
O procedimento para a preparação de células hPDL foi de acordo
com uma modificação do método relatado por D'Errico et al. [21].
Resumidamente, tecidos hPDL foram coletados do terço médio de
raízes de terceiros molares periodontais saudáveis e não cariadas
extraídas de voluntários saudáveis (20 a 40 anos de idade) durante
o tratamento ortodôntico. O tecido do ligamento periodontal foi
raspado dos terceiros molares, digerido enzimaticamente por 2
mg/mL de colagenase e 0,25% de tripsina por 1 hora a 37 °C. As
células foram colhidas por centrifugação por 10 min a 500 ×g. O
sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e as células foram
lavadas duas vezes com meio Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino. As células foram
expandidas com DMEM suplementado com 10% de soro fetal
bovino, 100 mg/mL de penicilina-G, 100 mg/mL de sulfato de
canamicina e 0,3 mg/mL de anfotericina B. As culturas foram
mantidas a 37 °C em uma incubadora umidificada em a presença de
95% de ar e 5% de CO2. O meio foi trocado dia sim, dia não. As
células foram usadas nas passagens 3 a 9.
Inibidores químicos e tratamentos com reagentes
LPS deE. colieP. gingivalisfoi dissolvido em solução salina
tamponada com fosfato 1× a uma concentração final de 10
mg/mL e armazenado a 4 °C. Os hPDLCs foram tratados
com diferentes concentrações de LPS (0, 10, 20, 50 e 100
μg/mL) deP. gingivaliseE. colirecém-diluído em meio de
cultura. O inibidor de adenilil ciclase SQ22536 (Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi usado para bloquear a
atividade da adenilil ciclase. SQ22536 foi dissolvido em
dimetil sulfóxido (DMSO), e as células foram tratadas com
uma dose de 100 μmol/L. Forscolina (50 μmol/L, Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, EUA), um ativador da adenilil ciclase,
foi dissolvido em DMSO.
Laserterapia de baixa intensidade
Um laser vermelho de arsenieto de gálio-alumínio com perfil de
feixe superior plano (laser de diodo de 660 nm de comprimento
de onda, Transverse Industries Co., Ltd., Taipei, Taiwan) foi
usado como fonte de laser. A saída do dispositivo de laser foi
de 70 mW. A distância entre o fundo da placa de cultura e a
fonte do laser foi de 3 cm e a área irradiada foi de 3,8 cm2. O
Lasers Med Sci (2018) 33:469–477
as células foram irradiadas uma vez por 528 s em modo contínuo e
receberam 8 J/cm2da densidade de energia do laser no total. Todos os
experimentos de irradiação foram realizados em uma bancada limpa à
temperatura ambiente. Os grupos controle foram processados nas
mesmas condições, exceto sem irradiação do laser.
Viabilidade celular
Um ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-
difeniltetrazólio) foi usado para determinar a viabilidade
celular. Os hPDLCs foram semeados em uma placa de 96 poços.
Após a exposição ao LPS deP. gingivaliseE. colipor 24 h, as
células foram incubadas com 5 mg/mL de MTT por 4 h. As
reações foram medidas usando um leitor de ensaio
imunossorvente ligado a enzima (ELISA) a 595 nm.
Vazamento de lactato desidrogenase
O vazamento de lactato desidrogenase (LDH) foi medido para
quantificar a citotoxicidade com um kit de detecção de
citotoxicidade. Os hPDLCs foram semeados em uma placa de 96
poços e cultivados com diferentes concentrações de LPS deP.
gingivaliseE. coli por 24h. O vazamento de LDH foi calculado de
acordo com as orientações do fabricante. A absorbância foi medida
com um leitor de ELISA a 490 nm.
Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em
tempo real (RT-PCR)
O RNA total de hPDLCs foi extraído usando TRIzol (Thermo
Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A transcrição reversa do
cDNA foi conduzida com um sistema RT contendo a
transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney.
A PCR quantitativa em tempo real foi realizada em um sistema
de detecção de PCR em tempo real Bio-Rad CFX Connect, e as
reações foram realizadas em uma mistura contendo cDNA,
primers para cada gene e iQ™Syber-Green Supermix (Bio-Rad,
Hercules, CA, EUA). As sequências de pares de primers para os
seguintes genes humanos estão listadas na Tabela1. Os níveis
relativos de expressão de mRNA foram analisados com o
método comparativo de Ct, onde a quantidade de alvo é
normalizada para o gene housekeeping GAPDH.
Níveis intracelulares de adenosina monofosfato cíclico
Os kits ELISA para a detecção de cAMP foram obtidos da Enzo
(Farmingdale, NY, EUA). Todos os procedimentos foram
baseados nas instruções do fabricante, e a densidade óptica foi
medida no comprimento de onda de 405 nm.
471
Ensaio de dupla luciferase
Cultivamos 2 × 104hPDLCs em uma placa de 48 poços e
cotransfectou as células com o vetor pGL 4.32 [luc2P/NF-κB-RE/
Hygro] (250 ng) e vetor pTK-Renilla (50 ng) usando
Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
EUA). O procedimento de transfecção foi realizado de acordo
com as instruções do fabricante. Vinte e quatro horas após a
transfecção, as células foram tratadas com LPS, LLLT e SQ22536
por mais 6 h. A atividade da luciferase foi medida usando um
sistema de ensaio de repórter dual-luciferase (Promega,
Madison, WI, EUA) com um luminômetro de microplaca Anthos
Lucy3 (AnthosLabtec Instruments, Áustria).
Análise estatística
Todos os dados foram coletados de três a quatro experimentos
independentes. Os dados foram analisados com o software estatístico
SPSS/Win versão 17.0 e expressos como média ± desvio padrão. Para
análise estatística, a normalidade foi inicialmente testada por meio do
teste de Shapiro-Wilk. Para dados normalmente distribuídos, a análise
de variância unidirecional foi usada para testar as diferenças estatísticas,
seguida pelo teste post hoc de Tukey. Se os dados falhassem no teste de
normalidade, a análise de variância não paramétrica de Kruskall-Wallis
era usada para testar diferenças estatísticas com o teste de
comparações múltiplas de Dunn. Apvalor de 0,05 foi considerado
estatisticamente significativo.
Resultados
A viabilidade e citotoxicidade de hPDLCs desafiados com LPS
Avaliar a influência do LPS deP. gingivaliseE. coli sobre a viabilidade
de hPDLCs, foi realizado um teste MTT. O ensaio MTT mostrou que
a viabilidade de hPDLCs não foi reduzida após o tratamento comP.
gingivalisouE. coli LPS em 24 horas (Fig.1a, b). Os efeitos citotóxicos
de LPS em hPDLCs também foram medidos com o ensaio de
vazamento de LDH. Após a normalização para o grupo controle, as
atividades de vazamento de LDH não mostraram diferenças entre
os grupos controle e tratado com LPS em 24 h (Fig.1cd). Esses
resultados indicaram que o LPS não foi citotóxico e não reduziu a
viabilidade dos hPDLCs nos curtos intervalos de tempo. Todos os
experimentos subsequentes foram analisados em incrementos de
24 horas.
Os padrões de expressão de citocinas inflamatórias em
hPDLCs desafiados com LPS
Os hPDLCs foram tratados com diferentes concentrações
de LPS deP. gingivalisouE. colipor 24h. Em seguida, q-PCR
foi conduzido para avaliar a expressão gênica de citocinas
pró-inflamatórias, incluindo IL-1β, TNF-α, IL-6,
472 Lasers Med Sci (2018) 33:469–477

tabela 1 sequências de primer

Gene sequência de primer Número de acesso

IL-1β Avançar: 5′-AAACCCTTCGAGGCACAAG-3′ 5′- NM_000576

Reverter: GTTTAGGGCCATCAGCTTCA-3′
TNF-α Avançar: 5′-CTCGAACCCCGAGTGACAAG-3′ 5′- NM_000594.3
Reverter: TGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3′
IL-6 Avançar: 5′-CCTGACCCAACCACAAATGC-3′ 5′- NM_000600.3
Reverter: ATCTGAGGTGCCCATGCTAC-3′
IL-8 Avançar: 5′-CAGGAATTGAATGGGTTTGC-3′ 5′- NM_000584.3
Reverter: AAACCAAGGCACAGTGGAAC-3′
GAPDH Avançar: 5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′ 5 NM_002046
Reverter: ′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′

e IL-8. Os resultados mostraram que o LPS deP. gingivalis ouE.
coliaumentou a expressão de mRNA de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8
de uma maneira dependente da dose com o aumento das
concentrações de LPS. LPS deP. gingivalisinduziu uma elevação
de 2 a 4 vezes da expressão de mRNA em uma dose mais baixa
(20 μg/mL), enquanto o LPS deE. coliteve o mesmo efeito em
uma dose maior (50 μg/mL) (Fig.2). Em doses superiores a 50
μg/mL, os níveis de expressão da maioria dos genes de
citocinas pró-inflamatórias foram observados em um platô (Fig.
2a, c-f).
O efeito anti-inflamatório de LLLT em hPDLCs
Os hPDLCs foram tratados com ou sem LPS de
P. gingivalis (20 μg/mL) ouE. coli (50 μg/mL), que foi
imediatamente seguido por irradiação a laser a uma densidade
de energia de 8 J/cm2determinar o efeito de LLLT na resposta
inflamatória induzida por LPS. Vinte e quatro horas após a
exposição de hPDLCs a LPS deP. gingivalisouE. coli,houve um
nível elevado de expressão de mRNA de citocinas inflamatórias
no grupo não irradiado. O grupo tratado com

Figura 1LPS não induziu efeitos citotóxicos nem reduziu a viabilidade de citotoxicidade. Os dados são apresentados como média ± DP.N =3 (Nnúmero
hPDLCs. Os hPDLCs foram tratados com LPS deP. gingivalisouE. coli doses de de experimentos independentes). Não houve diferenças significativas entre os
0 (controle), 10, 20, 50 ou 100 μg/mL. Ensaios MTT (um, b)e análise de grupos
vazamento de LDH (cd)foram usados para avaliar a viabilidade celular e
Lasers Med Sci (2018) 33:469–477 473

Figura 2hPDLCs estimulados por

LPS expressaram genes
inflamatórios. LPS deP. gingivalisou
E. coliaumentou a expressão de
mRNA de IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-8.de
AnúnciosCélulas tratadas com LPS
deP.gingivalis.EhCélulas tratadas
com LPS deE. coli.Os dados são
apresentados como média ± DP. N =
4 (Nnúmero de experimentos
independentes). Os seguintes níveis
estatísticos foram aplicados:
* p <0,05 em comparação com o
grupo 0 μg/mL (controle); †p <0,05
em comparação com o grupo de
10 μg/mL;‡p <0,05 em
comparação com o grupo de 20
μg/mL

LPS e LLLT mostraram reduções óbvias nos mRNAs de citocinas em hPDLCs com SQ22536, um inibidor farmacológico de cAMP,
comparação com o grupo somente LPS (Fig.3). e depois tratados com LPS e LLLT. Neste grupo, o nível de
Para elucidar se LLLT inibiu a expressão de mRNA de citocinas expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias não foi
inflamatórias por meio da regulação de cAMP, nós tratamos reduzido por LLLT (Fig.3).
474
Fig. 3Um inibidor de cAMP (SQ22536) impediu o efeito anti-inflamatório
de LLLT na inflamação induzida por LPS deP. gingivalise
E. coli.RT-PCR em tempo real foi realizado para medir os níveis de mRNA
deaIL-1β,bTNF-α,cIL-6, edIL-8. Os resultados foram analisados com
Em seguida, um ELISA foi conduzido para examinar os níveis de
cAMP associados ao LLLT em hPDLCs. Quando hPDLCs foram tratados
com o ativador de adenilil ciclase parascolina ou irradiados com laser de
baixa intensidade, o nível de cAMP aumentou e mostrou uma diferença
significativa em comparação com o grupo controle. No entanto, quando
os hPDLCs foram tratados com SQ22536 e irradiados com o laser de
baixa intensidade, o nível de cAMP não foi elevado e mostrou um nível
significativamente menor quando comparado aos grupos LLLT ou
forskolin-only (Fig.4). Esses resultados indicaram que a LLLT pode
reduzir a inflamação por meio da regulação do cAMP. Investigamos
ainda se o LLLT afetou a atividade transcricional de NF-κB, um fator de
transcrição inflamatório crucial, usando ensaios de repórter de
luciferase. Quando hPDLCs foram tratados com LPS deP. gingivalis (20
μg/mL) ouE. coli (50 μg/mL), o nível de NF-κB foi aumentado e mostrou
uma significativa
Lasers Med Sci (2018) 33:469–477
o 2−ΔTCmétodo baseado no controle. Os dados são apresentados como
média ± DP.N =4 (Nnúmero de experimentos independentes). Os
seguintes níveis estatísticos foram aplicados: *p <0,05 em comparação
com o grupo controle e†p <0,05
diferença em relação ao grupo controle (fig.5). Quando os hPDLCs foram
tratados com LPS e irradiados com laser de baixa intensidade, o nível de
NF-κB não apresentou diferença significativa em relação ao grupo
controle. Com a adição de SQ22536, os hPDLCs estimulados por LPS
irradiados mostraram um nível de NF-κB semelhante ao grupo apenas
LPS e uma grande diferença quando comparados aos grupos de
controle e estimulados por LPS irradiados com laser (Fig.5). Esses
resultados sugeriram que a LLLT regulou a atividade transcricional do
NF-κB afetando o nível de cAMP.
Discussão
Os hPDLCs são fibroblastos humanos com tecido multifuncional
que fornecem suporte físico, formativo e remodelador,
Lasers Med Sci (2018) 33:469–477
Fig. 4A LLLT aumentou os níveis intracelulares de cAMP. Os níveis intracelulares de
cAMP foram medidos por ELISA em hPDLCs tratados com LLLT, inibidor de cAMP
(SQ22536) ou forscolina. Os dados são apresentados como média ± DP. N =4 (N
número de experimentos independentes). Os seguintes níveis estatísticos foram
aplicados: *p <0,05 em relação ao grupo controle;†p <0,05 em comparação com o
grupo apenas forskolina;‡p <0,05 em comparação com o grupo apenas LLLT
funções nutricionais e sensoriais [22]. No presente estudo, os
hPDLCs foram tratados com diferentes concentrações de LPS deP.
gingivalisouE. coli.Nossos dados mostraram que o LPS de ambosP.
gingivaliseE. coliinduziu expressões de mRNA de citocinas pró-
inflamatórias (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) de maneira dose-dependente.
No entanto,P. gingivalis-as células tratadas responderam de
maneira dependente da dose em doses mais baixas quando
comparadas comE. coli-células tratadas (Fig.2). Os diferentes níveis
de inflamação induzida das duas fontes podem ser atribuídos a
diferenças moleculares nos componentes lipídicos. O lipídio A deP.
gingivalisO LPS é um tipo de monofosfato sem um grupo fosfato no
4′posição que não contém um ácido tetradecanóico, mas sim ácidos
graxos de cadeia longa compostos
Fig. 5A LLLT reduziu a atividade
transcricional do NF-κB. A atividade
da luciferase NFκB foi elevada pelo
LPS e reduzida pelo LLLT. Com a
adição do inibidor de cAMP
(SQ22536), a atividade de NF-κB em
hPDLCs estimulados por LPS não foi
reduzida por LLLT:aLPS deP.
gingivalis;b LPS deE. coli.Os dados
são apresentados como média ± DP.
N =4 (N números de independentes
experimentos). Os seguintes níveis
estatísticos foram aplicados:
* p <0,05 em relação ao grupo
controle;†p <0,05
475
de apenas grupos aciloxila [23]. Acredita-se que o LPS de
P. gingivalisé reconhecido principalmente por TLR2, enquanto LPS de
E. colié reconhecido principalmente por TLR4 [23–26]. Uehara et al.
também relataram que os fibroblastos gengivais humanos
mostraram expressão de mRNA mais robusta de citocinas pró-
inflamatórias após a ligação de TLR2 (Mycoplasma-tipo diacil
lipopeptídeo) em comparação com a ligação TLR4 (E. coli-lipídio tipo
A) [27]. Esses resultados indicam que diferentes fontes de LPS
podem induzir inflamação por meio de diferentes mecanismos.
Nas últimas décadas, muitos estudos mostraram que a LLLT
reduz as reações inflamatórias in vitro e in vivo. Corrêa et al.
induziu periodontite em camundongos com LPS e descobriu
que LLLT (laser GaAs, 904 nm) diminuiu a migração de células
inflamatórias de maneira dose-dependente, com uma dose de
energia de 3 J/cm2identificada como a dose mais eficaz [28].
Pires e cols. relataram um modelo de tendinite induzida por
colagenase e demonstraram que a LLLT (780 nm), a uma dose
de energia de 7,7 J/cm2, suprimiu a expressão de IL-6 [29].
Boschi et ai. relataram que LLLT (InGaAlP laser, 660 nm) reduziu
significativamente a expressão de IL-6 e TNF-α [30]. De acordo
com estudos anteriores realizados em nosso laboratório [31],
LLLT (laser GaAlAs, 660 nm) mostrou a supressão mais eficaz da
inflamação na dose ideal de 8 J/cm2, que foi utilizado neste
estudo. No presente estudo, observamos que os hPDLCs
desafiados com LPS mostraram resultados semelhantes aos
estudos mencionados acima, sugerindo que o LLLT suprimiu
significativamente a expressão de mRNA de citocinas pró-
inflamatórias (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8), levando concluímos que
a LLLT tem um efeito anti-inflamatório em hPDLCs (Fig.3). Além
disso, notamos que o efeito antiinflamatório da LLLT foi
neutralizado quando o inibidor de cAMP SQ22536 foi usado (fig.
3). Também observamos que o nível de cAMP de hPDLCs foi
elevado tanto por forscolina (promotor de cAMP) quanto por
LLLT, mas
476
diminuiu quando SQ22536 (inibidor de cAMP) foi adicionado (Fig. 4),
consistente com estudo anterior de que o nível de cAMP aumentou
aproximadamente 3 a 4 vezes após o tratamento com LLLT de
células-tronco derivadas de tecido adiposo humano [31]. Esse
achado sugere que o LLLT pode agir para estimular o nível de
cAMP. Outros estudos mostraram que a elevação dos níveis de
cAMP intracelular inibiu a atividade transcricional do NF-κB, que é
um fator de transcrição crucial na regulação da inflamação [32,33].
Possíveis mecanismos que regulam a atividade de NF-κB incluem a
capacidade do cAMP de gerenciar a degradação de IκB e a atividade
de IKK, bem como alterar a composição dos dímeros de NF-κB e,
assim, bloquear a transcrição [34]. De fato, observamos que o LLLT
inibiu significativamente a atividade transcricional de NF-κB em
nosso estudo anterior de células-tronco derivadas de tecido
adiposo humano estimuladas por LPS [31]. No presente estudo,
tratamos hPDLCs estimulados por LPS com LLLT e o inibidor de
adenilil ciclase SQ22536 e observamos que o efeito inibitório de
LLLT na atividade transcricional de NF-κB foi significativamente
reduzido (Fig.5). Aimbire et ai. [35] também relataram resultados
semelhantes aos nossos, mostrando que um laser de baixa
intensidade (660 nm) com uma dose de energia de 7,5 J/cm2
inibiu a atividade transcricional do NF-κB e reduziu ainda mais a
expressão gênica apoptótica.
Explorar o papel do LLLT na regulação da indução de
citocinas pró-inflamatórias na patologia periodontal é
importante, pois pode levar a novas abordagens terapêuticas
para a periodontite. Este estudo demonstrou que a LLLT inibe a
inflamação, induzida por LPS deE. colieP. gingivalis,através do
cAMP/NF-ĸVia de sinalização B em hPDLCs. Pesquisas futuras
sobre a regulação detalhada da LLLT no cAMP podem ser de
grande valor para melhorar a terapia periodontal.
Conformidade com os padrões éticos
Aprovação éticaEste estudo foi revisado e aprovado de forma independente
pelo conselho de ética de seres humanos da Kaohsiung Medical University e
foi conduzido de acordo com a declaração de Helsinki de 1964 e suas
emendas posteriores ou padrões éticos comparáveis. O consentimento
informado foi obtido de todos os participantes individuais incluídos no estudo.
FinanciamentoEste estudo foi financiado pelo Ministério da Ciência
e Tecnologia de Taiwan (MOST-104-2314-B-037-059-) e Kaohsiung
Medical University Aim for the Top Universities Grants (KMU-
TP103B08 e KMU-TP104B11).
Conflito de interessesOs autores declaram não haver conflito de
interesses.
Acesso livreEste artigo é distribuído sob os termos da Licença
Internacional Creative Commons Attribution 4.0 (http://
creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite uso, distribuição e
reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que você dê o devido
crédito ao(s) autor(es) original(is) e à fonte, forneça um link para a
licença Creative Commons e indique se foram feitas alterações.
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