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Evolução do Lipopolissacarídeo (LPS)

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Reconhecimento e Sinalização: Fish TLR4 faz
Não reconhece LPS e regula negativamente
Ativação NF -ÿB
Maria P. Sepulcre, Francisca Alcaraz-Pérez, Azucena López-
Muñoz, Francisco J. Roca, José Meseguer, Maria L.
Cayuela e Victoriano Mulero

J Immunol 2009; 182:1836-1845; ; doi:

10.4049/jimmunol.0801755 http://
www.jimmunol.org/content/182/4/1836

Referências Este artigo cita 50 artigos, 13 dos quais você pode acessar gratuitamente em:
http://www.jimmunol.org/content/182/4/1836.full#ref-list-1

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ISSN Impresso: 0022-1767 ISSN Online: 1550-6606.

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Jornal de Imunologia

Reconhecimento da Evolução do Lipopolissacarídeo (LPS) e

Sinalização: Fish TLR4 não reconhece LPS e
Regula negativamente a ativação de NF-B1

María P. Sepulcre,* Francisca Alcaraz-Pe´rez,2 *† Azucena Lo´pez-Mun˜oz,2 * Francisco J.

Roca,* Jose´ Meseguer,* María L. Cayuela,† e Victoriano Mulero3 *
Há muito se estabeleceu que vertebrados inferiores, principalmente peixes e anfíbios, são resistentes ao efeito tóxico do LPS.
Além disso, a falta de um ortólogo TLR4 em algumas espécies de peixes e a falta das moléculas co-estimuladoras essenciais para a
ativação de LPS via TLR4 (ou seja, proteína de diferenciação mielóide 2 (MD-2) e CD14) em todos os genomas de peixes e bancos de
dados de marcadores de sequência expressa disponível nos levou a supor que o mecanismo de reconhecimento do LPS em peixes pode ser diferente
Para esclarecer o papel dos TLRs de peixes no reconhecimento de LPS, um ensaio de repórter dual-luciferase para estudar a
ativação de NF-B em embriões inteiros de peixe-zebra foi desenvolvido e três modelos diferentes de peixes ósseos foram
estudados: 1) a dourada (Sparus aurata, Perciformes ), um modelo de teleósteo imunologicamente tratável no qual a presença de
um ortólogo TLR4 é desconhecida; 2) o baiacu verde manchado (Tetraodon nigroviridis, Tetraodontiformes), que não possui um
ortólogo TLR4; e 3) o zebrafish (Danio rerio, Cyprini formes), que possui dois ortólogos TLR4. Nossos resultados mostram que o
LPS sinalizou de maneira independente de TLR4 e MyD88 em peixes e, surpreendentemente, que os ortólogos TLR4 do zebrafish
regularam negativamente a via de sinalização dependente de MyD88. Pensamos que a identificação de TLR4 como um regulador
negativo da sinalização de TLR no peixe-zebra, juntamente com a ausência deste receptor na maioria das espécies de peixes,
explica a resistência dos peixes ao choque endotóxico e suporta a ideia de que o complexo receptor TLR4 para reconhecimento de LPS surgiu

padrões moleculares (PAMPs), que são essenciais para a sobrevivência

proteínas de membrana descritas pela primeira vez em do patógeno (5). A interação de um determinado PAMP com seu TLR
A família multigênica
Drosophila. TLR
Eles compreende uma
são altamente família de trans
conservados nas linhagens de específico leva à expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias e à
invertebrados e vertebrados (1, 2). Em mamíferos, esses receptores estão ativação de mecanismos antimicrobianos de defesa do hospedeiro, como
envolvidos principalmente na defesa do hospedeiro, enquanto em a produção de radicais reativos de nitrogênio e oxigênio e peptídeos
Drosophila, os receptores Toll também estão envolvidos no desenvolvimento antimicrobianos. Até o momento, um conjunto completo de TLRs foi

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de(3). Todos os membros da família compartilham a mesma estrutura,
definida pela presença de repetições ricas em leucina (LRRs)4 em seu
domínio extracelular e pela presença de um domínio do receptor Toll/IL-1
descrito em duas espécies de peixes teleósteos filogeneticamente
distantes, ou seja, o peixe- balão Fugu rubripes e o peixe-zebra Danio rerio.
Este conjunto inclui ortólogos das 10 famílias TLR de mamíferos e 2
(domínio TIR) no C-terminal, o citosólico parte da proteína que inicia a transdução do sinalespecíficos
membros (4). de peixes (6 –9). Além disso, parece que alguns
TLRs reconhecem uma variedade de patógenos altamente conservados desses ortólogos são funcionalmente análogos aos seus homólogos
mamíferos (10, 11). No entanto, um dos aspectos mais marcantes
encontrados nesses estudos genômicos é que, enquanto o peixe-zebra
*Departamento de Biologia Celular e Histologia, Faculdade de Biologia, Universidade de Murcia, possui dois parálogos TLR4, o baiacu mais avançado evolutivamente,
Murcia, Espanha; e † Unidade de Pesquisa, Departamento de Cirurgia, Hospital Universitário
“Virgen de la Arrixaca”, Múrcia, Espanha ou seja, Fugu e Tetraodon, não possui um ortólogo TLR4 (6, 7).
Recebido para publicação em 30 de maio de 2008. Aceito para publicação em 3 de dezembro de 2008.
O LPS é o principal componente da membrana externa das
bactérias Gram negativas. Estruturalmente, é composto por um núcleo
Os custos de publicação deste artigo foram cobertos em parte pelo pagamento de taxas de página.
Este artigo deve, portanto, ser marcado como anúncio de acordo com 18 USC Seção 1734 apenas polissacarídeo e um O-polissacarídeo de comprimento variável, além
para indicar este fato. de uma porção lipídica denominada “lipídeo A”, que é responsável pela
1
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Educação e Ciência da Espanha (Grants BIO2005-05078 ativação da resposta imune inata em mamíferos e confere suas
e CSD2007-00002 para VM), o Sexto Programa-Quadro da União Europeia (Grant FOOD-
CT-2005-007103 para VM), o Ministério da Saúde (Grant PI060369 para MLC), e a Universidade de
propriedades endotóxicas (12, 13). Bactérias diferentes produzem
Múrcia (bolsas para FA-P. e AL-M.). moléculas de LPS estruturalmente diferentes, variando em seus
padrões de fosfato, número de cadeias de acil e composição de ácidos
2
FA-P. e AL-M. contribuíram igualmente para este trabalho.
graxos. Mutantes bacterianos que falham em adicionar o núcleo interno
3
Endereço de correspondência e pedidos de reimpressão para Dr. Victoriano Mulero, Departamento ou a cadeia O-específica são chamados de “LPS rugosos” (R) por
de Biologia Celular e Histologia, Faculdade de Biologia, Universidade de Murcia, 30100 Murcia,
Espanha. Endereço de e-mail: vmulero@um.es causa da morfologia das colônias que formam. Cepas de tipo selvagem
4
Abreviaturas utilizadas neste artigo: Ec, Escherichia coli; hu, humano; LRR, repetições ricas em
produzem “LPS suave” (S) e crescem como colônias lisas. Os LPSs
leucina; MD-2, proteína de diferenciação mielóide 2; MO, morfolino; PAMP, padrão molecular associado são moléculas anfipáticas cuja hidrofobicidade diminui com o aumento
a patógenos; Pg, Porphyromonas gingivalis; P/S, penicilina e estreptomicina; R, LPS bruto; S, LPS
do comprimento da parte do açúcar. Devido a essas diferenças, as
suave; Sa, Salmonella abortus equi; Sm, Salmonella minnesota; St, Salmonella thyphimurium; TIR,
receptor Toll/IL-1; TRIF, adaptador contendo domínio TIR induzindo IFN-; TRAM, molécula adaptadora formas S e R mostram diferenças marcantes em sua capacidade de
relacionada ao TRIF; VaDNA, DNA genômico de Vibrio anguillarum ; zf, peixe-zebra. ativar macrófagos e esplenócitos de camundongos (14).
Em mamíferos, o mecanismo pelo qual o LPS inicia um sinal foi
Copyright © 2009 da Associação Americana de Imunologistas, Inc. 0022-1767/09/$2,00 resolvido em 1998 pela clonagem posicional, que revelou que o TLR4 é

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Jornal de Imunologia 1837

Tabela I. Números de acesso de genes e sequências de primers usados para análise de expressão gênicaa

Espécies Gene Número de acesso Nome Sequência (5–3)

Dourada
il1b AJ277166 F2 GGGCTGAACAACAGCACTCTC
R3 TTAACACTTCCCACCCTCCA
il6 AM749958 F AGGCAGGAGTTTGAAGCTGA
R ATGCTGAAGTTGGTGGAAGG
ccl4 AM765840 F GCTGTGTTTGTGCTGATGCT
R GCTGGCTGGTCTTTTGGTAG
il8 AM765841 F2 GCCACTCTGAAGAGGACAGG
R2 TTTGGTTGTCTTTTGGTCGAA
rps18 AY587263 F1 AGGGTGTTGGCAGACGTTAC
R1 CTTCTGCCTGTTGAGGAACC
rps11 NM213377 F1 GGCGTCAACGTGTCAGAGTA
R1 GCCTCTTCTCAAAACGGTTG
Zebrafish
tlr4a XM001335971 F CAATGGCTTGGGTACTTTGC
R GATTTGAGGAGTGCCGGATA
tlr4b AY388400 F TGAATGCTGGACAAGGACAG
R ATGCCACAGAGAAGGGAAGA
il1b NM212844 F5 GCCTGTGTGTTTGGGGAATCT
R5 TGATAAACCAACCGGGACAT
il12a AB183001 F1 AGCAGGACTTGTTTGCTGGT
R1 TCCACTGCCGCTGAAGTTAGA
tnfa NM212859 F2 GCGCTTTTCTGAATCCTACG
R2 TGCCCAGTCTGTCTCCCTTCT
lta AB183467 F2 AAGCCAAACGAAGAAGGTCA
R2 AACCCATTTCAGCGATTGTC
mxc NM001007284 F2 GAGGCTTCACTTGGCAACTC
R2 TTGTTCCAATAAGGCCAAGC
inf1 AY135716 53 TCTTAATACACGCAAAAGATGAGAACT
3 GTCAGGACTAAAAACTTCAC
baiacu verde malhado
il1b ENSTRUG00000016002 F AGCTCCTCCTCCACAAGACA
R CCTCACGGTTGGATTGAAGT
il6 AJ555458 F AGCAAAGTGCCCCTTACTCCCA
R CGCTCCTTCACCTTGTTCTC
tnfa AB183465 F2 CTCCTGGCCATGTTCTTGAT
R2 GGGGTTCTGTTTCTCCTCCTC

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de a Os símbolos dos genes seguem as “Diretrizes de Nomenclatura do Zebrafish” (zfin.org/zf_info/nomen.html).

o componente central do receptor LPS (15). Até o momento, há muitas
evidências que suportam a visão de que a ativação de células por LPS é
mediada pelo TLR4 e que está criticamente envolvido na etiologia do
choque séptico induzido por LPS (16-18). Para interação funcional com
LPS, TLR4 deve estar associado à proteína de diferenciação mielóide 2
(MD-2) (também conhecida como LY96) (19, 20), e a ativação de TLR4 é
precedida pela transferência de LPS para membrana ligada ou CD14
solúvel por proteína de ligação a LPS (LBP) (21, 22). Curiosamente, um
estudo estrutural recente demonstrou que o MD-2 é realmente responsável
pela ligação do LPS (23). Além disso, o CD14 é dispensável para o
reconhecimento do LPS da forma R e do lipídio A, mas é indispensável
para o reconhecimento do LPS da forma S (14, 18). Esse cenário é ainda
mais complicado, pois alguns LPSs (de Leptospira interrongans e
Porphyromonas gingiva lis), que são estruturalmente diferentes dos de
enterobactérias, demonstraram ativar células por meio de TLR2 e/ou
TLR4 (24-26). Assim, P. gingivalis LPS também demonstrou ser ativo em
macrófagos de camundongos C3H/HeJ (27-28), que possuem uma
mutação pontual no gene tlr4 que impede a sinalização por LPS
enterobacteriano (15, 17). Além disso, a ativação celular com P. gin givalis
LPS via TLR2 exigiu heterodimerização com TLR1 e foi independente de
MD-2, enquanto a estimulação celular via TLR4 demonstrou ser
dependente de MD-2 e CD14 (26).
A sinalização a jusante pelo receptor TLR4 envolve vários adaptadores
intracelulares contendo o domínio TIR mediando a expressão do gene
inflamatório da proína (29, 30). Duas vias que iniciaram a sinalização
TLR4 downstream são conhecidas, a saber, MyD88 e
Adaptador contendo domínio TIR induzindo vias dependentes de IFN-
(TRIF). A iniciação da via dependente de MyD88 leva à ativação de NF-B
e à transcrição de vários genes pró-inflamatórios (31). Uma segunda via
é mediada pela proteína contendo TIR chamada molécula adaptadora
relacionada ao TRIF (TRAM) (também conhecida como TICAM2) e TRIF)
(também conhecida como TICAM1). A iniciação da via dependente de
TRIF leva à ativação do fator regulador de IFN 3 (IRF3) e à expressão de
genes induzíveis por INF e IFN (5).
Há muito se estabeleceu que vertebrados inferiores, principalmente
peixes e anfíbios, são resistentes ao efeito tóxico do LPS (32).
De fato, observe que em muitos estudos in vitro sobre leucócitos de
diferentes espécies de peixes, concentrações extremamente altas de LPS
(g/ml) foram usadas para ativar células imunes (33–37) em comparação
com estudos em mamíferos (ng/ml). . Além disso, a falta de um ortólogo
TLR4 em algumas espécies de peixes, bem como a falta de moléculas co-
estimuladoras essenciais para a ativação de LPS via TLR4 (isto é, MD-2
e CD14) em todos os genomas de peixes e bancos de dados de
marcadores de sequência expressa disponíveis nos levaram a levantam
a hipótese de que o mecanismo de reconhecimento do LPS em peixes
pode ser diferente daquele dos mamíferos. Para esclarecer o papel dos
TLRs de peixes no reconhecimento de LPS, três modelos diferentes de
peixes ósseos foram estudados: 1) a dourada (Sparus aurata, Perciformes),
um modelo de teleósteo imunologicamente tratável no qual a presença de
um ortólogo TLR4 é desconhecida ; 2) o baiacu verde manchado
(Tetraodon nigroviridis, Tetraodon tiformes), que não possui um ortólogo TLR4; e 3) o p
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1838 VIA DE SINALIZAÇÃO LPS/TLR4 EM PEIXES

Tabela II. Morpholinos usados para derrubar genes em embriões de peixe-zebra

Gene Seqüência Efeito

myd88 TAGCAAAACCCCTGTTATTCCAGCGA Bloqueio de tradução

tlr4a GTAATGGCATTACTTACCTTGACAG Bloqueio de emenda
GATGCTGCTGAGGTTTCTTCCCATG Bloqueio de tradução
tlr4b CTATGTAATGTTCTTACCTCGGTAC Bloqueio de emenda
AATCATCCGTTCCCCATTTGACATG Bloqueio de tradução
tlr3 GTAAAAACATACCTTTAAGAGAGAG Bloqueio de emenda

a Os símbolos dos genes seguem as “Diretrizes de Nomenclatura do Zebrafish” (zfin.org/zf_ info/

nomen.html).

(Danio rerio, Cypriniformes), que possui dois TLR4 ou tólogos. A

estimulação de leucócitos de dourada e baiacu in vitro com diferentes
preparações de LPS ultrapuro e lipídio A demonstrou que os leucócitos
de ambas as espécies foram capazes de responder a diferentes LPSs
e lipídeos A de Escherichia coli , mas falharam em responder às formas
R e S LPS e lipídio A de Salmo nella spp. Além disso, desenvolvemos
um modelo de embrião de peixe-zebra para estudar a sinalização de
LPS in vivo usando um ensaio clássico de repórter NF-B-luciferase junto
com knockdown antisense mediado por morfolino (MO) ou
superexpressão gênica. Os resultados obtidos demonstraram que o
LPS sinalizou em um TLR4- e MyD88-independente

FIGURA 2. O LPS induz a expressão de citocinas pró-inflamatórias em leucócitos

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de de baiacu malhado verde. Os leucócitos totais do rim da cabeça foram estimulados
por 2 e 16 h com 10 g/ml de EcLPS (sorotipos 055:B5 e 0111:B4), 10 g/ml de
PgLPS, 50 g/ml de VaDNA e 1 g/ml de flagelina , e os níveis de mRNA das citocinas
pró-inflamatórias il1b (A), il6 (B) e tnfa (C) foram determinados por RT-PCR em
tempo real. A expressão gênica é normalizada contra rps11 e é mostrada como
relativa à média de células não estimuladas. Cada barra representa o SE médio de
amostras triplicadas. Letras diferentes denotam diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos de acordo com o teste de Tukey. Os grupos marcados
com “a” não apresentaram diferenças estatisticamente significativas em relação às
células controle.

maneira e que, surpreendentemente, os ortólogos TLR4 do peixe-zebra

regulam negativamente a ativação de NF-B dependente de MyD88
sequestrando os adaptadores TLR. Portanto, nossos resultados podem
ajudar a explicar a resistência dos peixes ao choque endotóxico e apoiar
a hipótese de que o complexo receptor TLR4 para reconhecimento de
LPS surgiu após a divergência de peixes e tetrápodes.

FIGURA 1. LPS inicia a explosão respiratória de leucócitos de dourada in vitro. Os
leucócitos do rim da cabeça foram incubados por 16 h com as concentrações
indicadas de EcLPS não ultrapuro (nu) ou EcLPS ultrapuro , S-SaLPS, R-SmLPS e
PgLPS (A) ou EcLipid A e StLipid A (B) e seus re a atividade de explosão respiratória
foi medida como a quimioluminescência dependente de luminol desencadeada por
PMA. Os dados são apresentados como médias SE de aumento em relação às
células incubadas apenas com meio e são representativos de vários experimentos
independentes. Letras diferentes denotam diferenças estatisticamente significativas
entre os grupos de acordo com o teste de Tukey.
Os grupos marcados com “a” não apresentaram diferenças estatisticamente
significativas das células controle.
Materiais e métodos
animais
Espécimes saudáveis (peso médio de 150 g) do peixe marinho hermafrodita pró-
trandroso dourada (S. aurata) foram obtidos da Culmarex. Eles foram mantidos em
aquários de recirculação de água do mar de 260 litros (vazão de 1.500 L/h) a 20
2°C com um ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentados com ração comercial
peletizada (Trouvit) a uma taxa de alimentação de 1% do corpo peso/dia.
O baiacu malhado verde (T. nigroviridis) foi adquirido em uma loja de animais local.
Zebrafish (D. rerio) dos fundos genéticos AB, TL e WIK foram gentilmente cedidos
pelo Zebrafish International Resource Center e mantidos conforme descrito em um
manual do peixe-zebra (38).
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Jornal de Imunologia 1839

FIGURA 3. O LPS induz exclusivamente

a expressão de genes dependentes de
MyD88 no peixe-zebra. Ze brafish foram
injetados no músculo epaxial esquerdo
com os PAMPs indicados, e os níveis de
mRNA de il1b (A), il12 (B), tnfa (C) lta (D),
inf1 (E) e mxc (F) foram determinados por
RT-PCR em tempo real em horários
diferentes
pontos. A expressão do gene é normalizada
contra rps11 e é mostrada como relativa à
média de células não estimuladas.
Cada barra representa o SE médio de
amostras em triplicado. Letras diferentes
denotam diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos de acordo
com o teste de Tukey. Os grupos marcados
com “a” não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas em relação aos controles.

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deCultura de células e tratamentos

Leucócitos de rim de cabeça de dourada (equivalente a medula óssea em peixes),

obtidos como descrito em outro lugar (39), foram mantidos em sRPMI (meio de cultura
RPMI 1640 (Invitrogen) ajustado para osmolaridade sérica de dourada (353,33
mOsm) com 0,35% de NaCl) suplementado com 5% FCS (In vitrogen) e 100 UI/ml de
penicilina e 100 g/ml de estreptomicina (P/S; Bio chrom). Alguns experimentos foram
conduzidos usando frações celulares purificadas de macrófagos e granulócitos
acidófilos, os dois tipos de células fagocíticas profissionais desta espécie (39, 40).
Resumidamente, os granulócitos acidófilos foram isolados por MACS usando um mAb
específico para granulócitos acidofílicos de dourada (G7) (39). Monocamadas de
macrófagos foram obtidas após cultivo noturno de frações G7 em meio livre de FCS
e sua identidade foi confirmada pela expressão do receptor de macrófago CSF (M-
CSFR) (40).
Macrófagos de dourada, granulócitos acidófilos e leucócitos totais de rim de
cabeça de dourada foram estimulados por diferentes tempos de incubação a 23°C
com 0,1–10 g/ml LPS de E. coli (EcLPS, cepa 0111.B4, Sigma Aldrich), 0,1–10 g/ml
LPS ultrapuro na forma S de Salmonella abortus equi (S-SaLPS, Alexis Biochemicals),
0,1–10 g/ml LPS ultrapuro na forma R de Salmonella minnesota (R-SmLPS, Alexis
Biochemicals), 0,1–10 g/ml LPS ultrapuro de P. gingivalis (PgLPS, InvivoGen), 1–10
g/ml de difosforil lipídeo A de E. coli (EcLipid A, Sigma-Aldrich), ou 0,1–10 g/ml de
difosforil lipídeo A de Salmonella thyphimurium (StLipid A, Sigma Aldrich) em sRPMI
suplementado com 5% FCS e P/S.
Leucócitos de rim de cabeça de baiacu manchado verde foram estimulados por
vários tempos de incubação a 23°C com 10 g/ml de EcLPS ultrapuro (cepa 055:B5;
Alexis Biochemicals), 10 g/ml de EcLPS ultrapuro (0111:B4; Alexis Biochemicals), 10
g /ml LPS de PgLPS, 50 g/ml de DNA genômico extraído com fenol de células Vibrio
anguillarum ATCC19264 (VaDNA), ou 1 g/ml de flagelina (Invivogen) em meio de
cultura RPMI 1640 suplementado
com 5% FCS e P/S.
Ensaios de explosão respiratória
A atividade de explosão respiratória foi medida como a quimioluminescência
dependente de luminol produzida por leucócitos de rim de cabeça de dourada (41). Esta
foi provocada pela adição de 100 M de luminol (Sigma-Aldrich) e 1 g/ml de PMA
(Sigma-Aldrich), enquanto a quimioluminescência foi registrada a cada 117 s por 1
h em um luminômetro FLUOstart (BMG Labtechnologies).
Os valores relatados são a média de leituras quádruplas, expressas como a inclinação
da curva de reação de 117 a 1170 s, da qual o fundo do aparelho foi subtraído.
Injeção de peixes com diferentes PAMPs
Quatro zebrafish adultos foram anestesiados por imersão em benzocaína (100 g/ml)
(Sigma-Aldrich) antes da injeção. Cada peixe foi injetado no músculo epaxial
esquerdo com 1 litro de PBS contendo 5 gpoli(I:C)
ou 2,5 g de de EcLPS, 5 g de PgLPS,
(Invivogen). 0,1 de
Amostras g de flagelina
tecido do
local da injeção foram coletadas em diferentes momentos e processadas para análise
de expressão gênica (veja abaixo).
Análise da expressão gênica
O RNA total foi extraído de pellets celulares com reagente TRIzol e purificado com o
sistema de purificação de RNA total PureLink Micro-to-Midi (Invitrogen) seguindo as
instruções do fabricante e tratado com DNase I, grau de amplificação (1 U/g RNA;
Invitrogen).
A transcriptase reversa SuperScript III RNase H (Invitrogen) foi usada para
sintetizar cDNA de primeira cadeia com primer oligo(dT)18 a partir de 1 g de RNA
total a 50°C por 50 min. A PCR em tempo real foi realizada com um instrumento ABI
Prism 7500 (Applied Biosystems) usando SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio). As
misturas de reação foram incubadas por 10 minutos a 95°C, seguidos por 40 ciclos
de 15 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C e, finalmente, 15 segundos a 95°C, 1 minuto
a 60°C e 15 segundos a 95°C. Para cada mRNA, a expressão gênica foi corrigida
pelo conteúdo da proteína ribossômica S11 (rps11) (Tetraodon e peixe-zebra) ou
rps18 (dourada) em cada amostra. Os primers utilizados são apresentados na Tabela
I. Em todos os casos, cada PCR foi realizada com amostras triplicadas e repetidas
pelo menos duas vezes.
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1840 VIA DE SINALIZAÇÃO LPS/TLR4 EM PEIXES

construções de expressão

As sequências de codificação de zebrafish (zf)TLR4b (BC068358) e zfTLR3

(NM_001013269) foram obtidas por amplificação por PCR com Pfu DNA polimerase
(Fermentas) usando clones de cDNA completos fornecidos por ImaGenes
(IRBOp991G0340D e IRBOp991H0571D, respectivamente) como modelos.
Os fragmentos amplificados por PCR foram incubados a 72°C por 10 min com 1
unidade de TaqDNA polimerase (Invitrogen) para adição de 3 A-overhangs e clonados
no vetor de expressão pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen) para expressão de V5
Proteínas marcadas com /His6. Todas as construções foram sequenciadas usando
um ABI Prism 377 (Applied Biosystems). A sequência de codificação completa do
zfTLR4a (XM_001335971), bem como das versões truncadas zfTIR3 (NM_001013269),
zfTIR9 (NC_007119), zfTIR4b de tipo selvagem e zfTIR4b (713Ala3His) contendo os
domínios transmembrana e intracelular foram sintetizadas por GenScript e depois
subclonadas no Sítio de restrição BamHI de uma construção pcDNA6/V5-His em
quadro com a sequência que codifica para o poderoso peptídeo de sinal do receptor
de IL-1 do tipo II da dourada (42).
O repórter NF-B luciferase foi fornecido pelo Dr. R. Hay, o huTIR pelo Dr. R. Medzhitov,
e as construções huTLR4, huMD-2 e huCD14 foram fornecidas pelo Dr. MF Smith, Jr.

transfecção celular

O DNA de plasmídeo foi preparado usando o procedimento MiniPrep (Qiagen). Os

pellets de DNA foram ressuspensos em água e posteriormente diluídos, quando
necessário, em PBS. As transfecções foram realizadas com um reagente de
transfecção à base de lipídios catiônicos (LyoVec; InvivoGen) de acordo com as instruções do fabricante.
Resumidamente, as células HEK/Elam-luc (fornecidas pelo Dr. M. Lamphier) foram FIGURA 4. A expressão ectópica de peixe-zebra TLR4a ou TLR4b em HEK293 não
semeadas em placas de 24 poços (120.000 células/poço) juntamente com 25 L de confere sensibilidade ao LPS. As células HEK/Elam-luc foram transfectadas com
agente de transfecção contendo um total de 250 ng de DNA plasmídico total. Os
construtos de expressão para zfTLR4a, zfTLR4b, zfTLR3 ou huTLR4 sozinhos ou em
vetores de expressão Renilla luciferase pRL-CMV ou pRL-TK (Promega) foram usados
na proporção de 10:1 como controles internos para normalizar os valores obtidos com combinação com huMD-2 e huCD14.

a construção de luciferase de vaga-lume.
Western blot
Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lavadas duas vezes com
meio sem soro e lisadas em 100 L de tampão de lise (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1%
SDS). As amostras foram fervidas em tampão de amostra SDS, resolvidas em SDS-
PAGE a 8% e transferidas por 30 min a 200 mA para membranas de nitrocelulose (Bio-
Rad). Os blots foram sondados com Ab específico para o epítopo V5 (Invitrogen) e
desenvolvidos com reagentes ECL (GE Healthcare) de acordo com o protocolo do
fabricante.
A, Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram estimuladas por 8 h
com o ligante específico para cada TLR, e a produção relativa de luciferase foi
determinada conforme descrito em Materiais e Métodos. Cada barra representa o SE
médio de amostras em triplicado. Letras diferentes denotam diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos de acordo com o teste de Tukey. Os grupos marcados
com “a” não apresentaram diferenças estatisticamente significativas em relação às
células transfetadas por simulação. B, Os extratos de células de A também foram
sondados com o mAb anti-V5.

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deensaio de luciferase

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram estimuladas por 8 h com o
ligante específico para cada TLR nas concentrações indicadas acima, lavadas e
lisadas com tampão de lise passiva (Promega). A atividade de Firefly e Renilla lucif
erase foi medida usando o kit Dual luciferase assay (Pro mega), conforme especificado
pelo fabricante, para discriminar a atividade dos dois tipos de luciferases, em um
luminômetro Optocomp I (MGM Instruments).
Microinjeção
Os MOs de bloqueio de emenda ou tradução foram projetados e adquiridos da Gene
Tools (Tabela II) e solubilizados em água (1 mM). MOs (4 ng/ovo), plasmídeos de
expressão (0,1–1,0 ng/ovo), vaga-lume e plasmídeos repórter Renilla (100 e 10 pg/
ovo, respectivamente) e o PAMP necessário (6,5 ng de VaDNA ou 30 ng de EcLPS)
foram misturados em tampão de microinjeção (tampão Tango 0,5 e solução de
vermelho de fenol a 0,05%) e microinjetados (4 – 6 nl) no saco vitelino de embriões de
estágio de uma célula usando um microinjetor Narishige IM-300. As atividades do vaga-
lume e da Renilla luciferase foram determinadas 24 h após a injeção, conforme descrito
acima, em 5 a 10 réplicas (cada uma contendo os extratos de tecido de três embriões).
Análise estatística
Os dados foram analisados por ANOVA e um teste de intervalo múltiplo de Tukey
para determinar as diferenças entre os grupos. As diferenças entre duas amostras
foram analisadas pelo teste t de Student.
Resultados
EcLPS e PgLPS aumentam a explosão respiratória e induzem a expressão
de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias em leucócitos de dourada
analisado. O EcLPS ultrapuro e o PgLPS aumentaram a explosão respiratória
dessas células de maneira dose-dependente, embora a ativação com PgLPS
tenha sido significativamente maior (Fig.
1A). Notavelmente, o EcLPS ultrapuro mostrou menor capacidade de ativação
do que o comumente usado EcLPS purificado com fenol, uma vez que essas
preparações são frequentemente contaminadas com outros componentes
celulares. Em contraste, S-LPS e R-LPS, ambos de Salmonella spp., falharam
em ativar a explosão respiratória de leucócitos de dourada. Consistente com
essas observações, os leucócitos do rim da cabeça também foram capazes
de responder de maneira dependente da dose ao difosforil lipídio A de E. coli ,
mas não de S. typhimurium (Fig. 1B).
Analisámos por PCR em tempo real a expressão de citoquinas e
quimiocinas pró-inflamatórias em leucócitos totais do rim da cabeça, bem
como nos dois tipos de células fagocitárias profissionais da dourada,
nomeadamente granulócitos acidófilos e macrófagos, que foram estimulados
com diferentes LPS. Os níveis de mRNA de il1b, il6, ccl4 e il8 aumentaram de
maneira semelhante nessas células após estimulação com EcLPS e PgLPS
(dados não mostrados). No entanto, S-SaLPS e R-SmLPS tiveram apenas um
leve efeito nos níveis de mRNA dessas citocinas em comparação com EcLPS
e PgLPS. Surpreendentemente, não houve indução de mxc (dados não
mostrados), um gene cuja expressão em mamíferos é induzida pelo
envolvimento do TLR4 por LPS e a subsequente ativação da via dependente
de TRIF (5).
EcLPS induz a expressão de citocinas pró-inflamatórias em leucócitos do
baiacu-pintado

A capacidade de LPS de diferentes fontes para modular a explosão respiratória Os resultados acima nos levaram a analisar a capacidade do ultrapuro
de leucócitos de rim de cabeça de dourada in vitro foi um EcLPS para ativar in vitro leucócitos do rim da cabeça do manchado
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deFIGURA 5. Os morfos Zebrafish MyD88, TLR4a e TLR4b mostram capacidade
de resposta LPS intacta. Embriões unicelulares de peixe-zebra foram microinjetados
com 6,5 ng de VaDNA (A) ou 30 ng de EcLPS (B) e vetores repórter luciferase NF-
B e pRL-TK (10:1) sozinhos ou em combinação com 4 ng dos morfolinos indicados .
A e B, Vinte e quatro horas após a microinjeção, a ativação do NF-B foi medida
conforme descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são expressos como o
SE médio da atividade lu ciferase normalizada em relação aos embriões de FIGURA 6. Zebrafish TLR4 regula negativamente a via de sinalização de NF-B.
controle não injetados com PAMPs. O asterisco denota diferenças estatisticamente Embriões unicelulares de peixe-zebra foram microinjetados com vetores repórteres
significativas entre as amostras indicadas. C, análise de RT-PCR de splicing NF-B lu ciferase e pRL-TK (10:1) juntamente com 6,5 ng de VaDNA, 30 ng de
alterado induzido por zfTLR4 MO de transcritos de zfTLR4 24 h após a microinjeção. EcLPS e/ou 0,1–1,0 ng dos construtos de expressão zfTLR4b, zfTIR4b , zfTIR3,
O transcrito zfTLR4a intacto de 246 pb só foi detectável em amostras de embriões zfTIR9, zfTIR4b(Ala3His) e huTIR4.
não injetados (Mock). Um produto de 107 pb indicando a inserção de um íntron Vinte e quatro (A–C) e 48 (A) horas após a microinjeção, a ativação do NF-B foi
intacto entre os éxons 1 e 2 do zfTLR4b só foi observado em amostras injetadas medida conforme descrito em Materiais e Métodos. Os resultados
com MO e quando o DNA genômico foi usado como molde (Controle), enquanto são expressos como o SE médio da atividade normalizada da luciferase em
está ausente em embriões não injetados (Mock). Amostras sem cDNA (cDNA ) e relação aos embriões de controle não injetados com PAMPs. Os asteriscos
aquelas obtidas na ausência de transcriptase reversa (RT ) não deram amplificação. denotam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras indicadas.
Os pares de iniciadores (direto e reverso, respectivamente) usados para
amplificação foram (5-TGCATGGGAAGAAACCTCA-3/5-CAA os níveis de mRNA de todas essas citocinas, enquanto o sorotipo EcLPS
GCATCCAGGAGCAAAAT-3) e (5-TGAATGCTGGACAAGGA CAG-3/5-
0111:B4 aumentou apenas o nível de mRNA de il6. Como esperado,
TCTTAGGCTCACATTAACAGACCA-3) para zfTLR4a e zfTLR4b, respectivamente.
PgLPS, VaDNA e flagelina aumentaram fortemente os níveis de mRNA
O recozimento de MOs (linhas tracejadas) e os códons de parada prematuros no
de todos os genes inflamatórios analisados. Tomados em conjunto, os
quadro (pontas de seta) são indicados.
resultados acima demonstram que a ativação de leucócitos de dourada e
baiacu por EcLPS não é mediada por TLR4, e eles sugerem fortemente a
existência de um receptor não identificado para este PAMP.
baiacu verde, que não possui um ortólogo TLR4 (9). Curiosamente, os
O EcLPS ativa a resposta imune do peixe-zebra por meio
dois sorotipos de EcLPS utilizados, 055:B5 e 0111:B4, foram capazes de
de uma via independente de TRIF/ TRAM
induzir a expressão das citocinas pró-inflamatórias il1b (Fig. 2A), il6 (Fig.
2B) e tnfa (Fig. 2C), embora cada um em uma medida diferente. Assim, o O reconhecimento e ativação de LPS por leucócitos do baiacu nos levou
sorotipo EcLPS 055:B5 aumentou a a levantar a hipótese de que os dois ortólogos TLR4 de
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1842 VIA DE SINALIZAÇÃO LPS/TLR4 EM PEIXES

FIGURA 7. Alinhamento múltiplo de peixe-zebra e TLR4

humano. Resíduos idênticos e semelhantes identificados em
todas as proteínas são indicadas por asteriscos e dois
pontos, respectivamente. São mostrados o peptídeo líder
previsto e o domínio transmembrana (cinza), o domínio
TIR (número de acesso Prosite PS50104) (em negrito) e o
resíduo importante para a atividade do TLR4 de mamífero
(#). Os números de acesso para as sequências são
CAH72619 para huTLR4, XP_001336007 para zfTLRa e
AAH68358 para zfTLR4b. Observe que nenhum peptídeo
líder aparente está presente em zfTLR4a.

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o peixe-zebra está envolvido no reconhecimento de LPS. Como o TLR4 genes dependentes e independentes no local da injeção de peixe-
de mamíferos sinaliza via MyD88- e vias dependentes de TRIF/TRAM, zebra injetado com diferentes PAMPs. Os resultados mostraram que
e apenas a última via resulta na produção de IFN- e vários genes a os níveis de mRNA de vários genes dependentes de Myd88 (por
jusante, analisamos a expressão de MyD88- exemplo, il1b, il12, tnfa e lta) aumentaram com todos os PAMPs testados, incluindo
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EcLPS ultrapuro do sorotipo 0111:B4 (Fig. 3A-D). No entanto, o padrão
de expressão e a cinética do gene induzido por PgLPS e EcLPS foram
completamente diferentes, de acordo com dados anteriores mostrando
que EcLPS e PgLPS ativam a resposta imune por diferentes vias (24 –
26). Curiosamente, no entanto, os genes dependentes de TRIF analisados
(ou seja, inf1 e mxc) foram drasticamente induzidos com poli(I:C), como
era esperado, embora o EcLPS não tenha induzido nenhum deles (Fig.
3, E e F) . Nenhum dos tratamentos utilizados afetou os níveis de mRNA
de ifn2 e ifn3 (dados não mostrados). Portanto, esses dados revelam
que, ao contrário do que ocorre nos mamíferos, o LPS não é capaz de
induzir a expressão de genes dependentes de TRIF/TRAM no peixe-zebra.
Expressão ectópica de zebrafish TLR4a ou TLR4b em HEK293 não
confere sensibilidade a EcLPS
Uma vez que o peixe-zebra não possui as moléculas co-estimuladoras
TLR4 MD-2 e CD14, as células HEK293 foram transitoriamente
transfectadas com ze brafish TLR4a e TLR4b com ou sem MD-2 humano e
CD14, e a ativação do receptor foi analisada usando um repórter NF-B
luciferase (Fig. 4A). Enquanto a expressão de huTLR4/MD-2/CD14, mas
não TLR4 sozinho, promoveu a ativação de NF-B após a adição de
EcLPS, nenhum ortólogo do peixe-zebra induziu a ativação do NF-B
sozinho ou em conjunto com MD-2 e CD14 humanos . Notavelmente, a
ativação do peixe-zebra TLR3 com poli(I:C) levou à indução de NF-B,
indicando que a via de sinalização é bem conservada entre peixes e
mamíferos. Os níveis de expressão de todos os zfTLRs foram analisados
por Western blot usando o V5 mAb e foram considerados semelhantes
(Fig. 4B).
Os morfantes Zebrafish MyD88, TLR4a e TLR4b mostram-se intactos
Capacidade de resposta do LPS
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dePara finalmente demonstrar o envolvimento dos TLRs de peixe-zebra na
sinalização de LPS, desenvolvemos um modelo de embrião de peixe-
zebra para estudar a via de sinalização de NF-B usando o sistema
clássico de relato de luciferase de NF-B, combinado com knockdown
antisense mediado por MO (Tabela II) ou superexpressão gênica.
Primeiro usamos um MO bloqueador de tradução contra MyD88 que
demonstrou prejudicar a depuração embrionária de Salmonella (43).
Morfantes MyD88 mostraram indução de NF-B significativamente reduzida
quando injetados com VaDNA em comparação com os controles
(morfantes TLR3 e embriões não injetados com MO) (Fig. 5A). Em nítido
contraste, os morfos Myd88 mostraram indução inalterada de NF-B
quando injetados com EcLPS (Fig. 5B). Além disso, a indução de NF-B
por EcLPS (das cepas 0111:B4 ou 055:B5) em morfos TLR4a, TLR4b e
TLR4a/ TLR4b também não foi afetada (Fig. 5B). A eficácia de MO para
alterar o splicing de transcritos de peixe-zebra TLR4 foi confirmada por
RT-PCR (Fig. 5C). Os resultados mostraram que o íntron entre o exon 1
e o exon 2 de zfTLR4a e zfTLR4b não foi ignorado durante o splicing em
embriões injetados com MO. Mais especificamente, a integração desses
íntrons criou códons de parada prematuros no quadro, resultando em
proteínas truncadas sem a maior parte do domínio extracelular, bem
como transmembrana e TIR
domínios. Resultados semelhantes foram obtidos com outro MO (Tabela
II) para cada zebrafish TLR4 (dados não mostrados). Nenhum defeito de
desenvolvimento aparente foi observado nos morfos TLR4a, TLR4b e
MyD88 (dados não mostrados). Todos esses resultados demonstraram
que os ortólogos de peixe-zebra de TLR4 não estão envolvidos no
reconhecimento de LPS e que EcLPS induz a ativação de NF-B e a
expressão de citocinas pró-inflamatórias por meio de uma via independente
de MyD88.
1843
Zebrafish TLR4 regula negativamente a via de sinalização de
NF-B
Como foi demonstrado anteriormente que a deleção do domínio
extracelular de TLRs torna mutantes constitutivamente ativos (44),
geramos mutantes de peixe-zebra TLR4b, TLR3 e TLR9 sem seus
domínios extracelulares (denominados zfTIR4b, zfTIR3 e zfTIR9,
respectivamente). Curiosamente, enquanto a superexpressão de huTIR4
(44), zfTIR3 e zfTIR9 induziu a ativação de NF-B, a superexpressão de
zfTIR4b diminuiu ligeiramente a ativação basal de NF-B (Fig. 6A). Esses
resultados nos levaram a examinar o alinhamento de zebrafish e
polipeptídeos TLR4 humanos. Notavelmente, embora o domínio TIR seja
bem conservado entre peixes e mamíferos, e quase idêntico nos dois
parálogos do peixe-zebra (94% de identidade de aminoácidos), eles têm
uma substituição (alanina em vez de prolina) no resíduo 681 do TLR4a e
713 do TLR4b (correspondente ao resíduo 712 de TLR4 de camundongo
e 714 de TLR4 humano) (Fig. 7).
A substituição de prolina por histidina nesta posição torna um TLR4 de
camundongo não funcional (15). Portanto, substituímos a alanina por
histidina no zfTIR4b de tipo selvagem e o mutante resultante foi injetado
em embriões de peixe-zebra. Curiosamente, este mutante falhou em inibir
a ativação de NF-B induzida por VaDNA (Fig. 6B).
Além disso, zfTIR4b de tipo selvagem diminuiu drasticamente a ativação
do NF-B induzida por TIR4 ou VaDNA humano (Fig. 6, B e C). No entanto,
o zfTLR4b não afetou significativamente a ativação do NK-B induzida
pelo huTIR4 (Fig. 6C), sugerindo que o envolvimento desse receptor por
seu ligante desconhecido regularia negativamente a sinalização de NF-B
no peixe-zebra. Surpreendentemente, a superexpressão de zfTIR4b ou
zfTLR4b não teve efeito sobre a ativação de NF-B induzida por EcLPS
(Fig. 6C), confirmando ainda mais que TLR4 não é o ligante para LPS no
peixe-zebra e sugerindo que este receptor inibe especificamente o
ativação de NF-B através da via dependente de MyD88.
Discussão
Estudos anteriores de Berczi e colaboradores (32) descobriram
inesperadamente que vertebrados inferiores, principalmente peixes e
anfíbios, eram resistentes aos efeitos tóxicos do LPS. Mais recentemente,
foi demonstrado que concentrações extremamente altas de LPS (g/ml)
são necessárias para ativar leucócitos isolados in vitro de várias espécies
de teleósteos filo geneticamente distantes (33-37). Além disso, a
disponibilidade da sequência do genoma de várias espécies de teleósteos
revelou a presença de dois ortólogos TLR4 em um antigo peixe teleósteo,
o peixe-zebra (Cypriniformes), mas sua ausência em baiacus
evolutivamente mais avançados (Tetraodon e Fugu, ambos Tetra
odontiformes). Este trabalho in silico também revelou que as moléculas
co-estimuladoras essenciais para a ativação do LPS via TLR4 (ou seja,
MD-2 e CD14) estão ausentes em todos os genomas de peixes e anfíbios
e bancos de dados de marcadores de sequência expressa disponíveis
até o momento. Aqui, usando diferentes preparações de LPS ultrapuro,
demonstramos que os leucócitos de seabream, Tetraodon e zebrafish
são realmente capazes de responder a este PAMP com sensibilidade
muito menor do que em mamíferos e por meio de uma via de sinalização
independente de TLR4/MyD88. Esta observação é apoiada por 1) a
ativação de leucócitos de dourada por LPS ultrapuro e lipídio A de E. coli,
2) a ausência de um ortólogo TLR4 em Tetraodon, 3) a capacidade de
resposta LPS intacta de TLR4a, TLR4b e peixe-zebra morfológico MyD88
embriões e 4) a capacidade de zfTIR de regular negativamente em
embriões de peixe-zebra a indução de NF-B por DNA bacteriano (agonista
de TLR9) ou a superexpressão de um TLR4 humano constitutivamente ativo, mas não
Em mamíferos, o TLR4 é um receptor promíscuo capaz de reconhecer
não apenas LPS, mas também diferentes ligantes endógenos de tecidos
danificados/estressados, como o grupo de alta mobilidade box 1
(HMGB1), hialuronano e biglicano (45, 46). Pelo reconhecimento da maioria dos
Machine Translated by Google
1844
desses ligantes, o MD-2 parece ser indispensável, mas o CD14 pode
não ser essencial (18, 47, 48). De fato, MD-2, mas não TLR4, é
responsável pela ligação de LPS (23). Embora a ausência de
ortólogos MD-2 e CD14 em peixes dificulte a predição do ligante de
zfTLR4s, nossos resultados sugerem que a capacidade desse
receptor de reconhecer LPS, e provavelmente a maioria desses
ligantes endógenos, foi adquirida após a divergência de peixes e
tetrápodes. Como Dro sophila Toll é um ativador e reconhece
diretamente o ligante endógeno Spaetzle em vez de padrões
microbianos estruturais (3), propomos que o ancestral do vertebrado
TLR4 foi originalmente dedicado ao reconhecimento de um ligante
endógeno desconhecido e sua associação em vertebrados superiores
com MD-2 e outros co-receptores, como CD14 ou CD44 (48),
aumentou sua promiscuidade. No entanto, em peixes, e provavelmente
em anfíbios, o TLR4 foi perdido na maioria das espécies, com
exceção da ordem Cypriniformes, onde a perda de mutação(ões) de
função do domínio TIR permitiu sua retenção como um regulador
negativo do TLR- via de sinalização, que foi duplicada posteriormente nestes peixes.
Uma das contribuições mais interessantes do presente estudo é
que o peixe-zebra TIR4 atua como um regulador negativo das funções
do TLR, enquanto o zfTLR4b não o faz. Isso sugere que o
envolvimento desse receptor por seu ligante desconhecido regularia
negativamente a sinalização de NF-B no peixe-zebra. Este resultado
é corroborado pela presença de uma substituição não conservativa
(alanina em vez de prolina) no domínio TIR de zfTLR4s (resíduo 681
do TLR4a e 713 do TLR4b, que correspondem ao resíduo 712 do
TLR4 de camundongo e 714 do TLR4 humano). Isso não é
surpreendente, uma vez que a mutação pontual Pro3His do TLR4 de
camundongo, encontrada na cepa C3H/HeJ não responsiva a LPS,
torna um TLR4 de camundongo não funcional (15), que exerce um
efeito negativo dominante na transdução do sinal de LPS (49). De
fato, a substituição dessa alanina por histidina no zfTIR4b também torna um15.TIR4b
main, que é incapaz de inibir a ativação do NF-B. Por outro lado, nem
zfTIR4b nem zfTLR4b tem efeito sobre a ativação de NF-B induzida
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depor EcLPS, confirmando ainda que TLR4 não é o ligante para LPS
no peixe-zebra e sugerindo que este receptor inibe especificamente
a ativação de NF-B via a via dependente de MyD88. Portanto, os
zfTLR4s podem atuar sequestrando os adaptadores TLR dentro da
via de sinalização TLR, como foi recentemente demonstrado para
ST2L de camundongo (50), um receptor transmembranar tipo 1 com
um domínio TIR citoplasmático e uma região extracelular que contém
três Ig- como domínios. No entanto, observe que há relatos
conflitantes sobre as ações do ST2L, como Schmitz et al. (51)
descreveram que o ST2L era um receptor para o recém-identificado
membro da família IL-1 IL-33, que exerce seus efeitos biológicos via
ativação de NF-B e MAPK intensificada por ST2L.
Seja qual for o caso, relatamos pela primeira vez a existência de um
TLR que regularia negativamente a sinalização do TLR ao interagir
com seu ligante específico. A identificação do ligante do zfTLR4 e do
receptor do LPS em peixes vai esclarecer a evolução da família Toll.
Acreditamos que nossa identificação de TLR4 como um regulador
negativo da sinalização de TLR no peixe-zebra, juntamente com a
ausência desse receptor na maioria das espécies de peixes, explicaria
a resistência dos peixes aos efeitos tóxicos do LPS e as altas
concentrações dessa substância necessárias para ativar as células
imunológicas desses animais.
Agradecimentos
Agradecemos I. Fuentes e EM García-Navarro pela excelente técnica
assistência, ao Dr. M. Lamphier pelas células HEK/Elam-luc, ao Dr. R. Hay pela construção
do repórter NF-B luciferase, ao Dr. R. Medzhitov pela construção huTIR4 e ao Dr. MF Smith,
Jr. as construções huTLR4, huMD-2 e huCD14.
VIA DE SINALIZAÇÃO LPS/TLR4 EM PEIXES
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse financeiros.
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