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PESQUISA ORIGINAL
Editado por:
Geert Wiegertjes,
Universidade de Wageningen e
Pesquisa, Holanda
Revisados pela:
Hetron Mweemba Munang'andu,
Universidade Norueguesa da Vida
Ciências, Noruega
Ryohei Furukawa,
Universidade Keio, Japão
*Correspondência:
Krzysztof Rakus
krzysztof.rakus@uj.edu.pl
Seção de especialidade:
Este artigo foi submetido a
Imunologia Comparada, uma
seção da revista
Fronteiras da Imunologia
Recebido: 18 de agosto de 2021
Aceito: 20 de setembro de 2021
Publicado: 11 de outubro de 2021
Citação:
Mojzesz M, Widziolek M, Adamek M,
Orzechowska U, Podlasz P,
Prajsnar TK, Pooranachandran N,
Pecio A, Michalik A, Surachetpong W,
Chadzinska M e Rakus K (2021)
Induzido por Tilapia Lake Virus
Neuroinflamação em Zebrafish:
Ativação da Microglia e
Comportamento Doente.
Frente. imunol. 12:760882.
doi: 10.3389/fimmu.2021.760882
Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org
publicado: 11 de outubro de 2021
doi: 10.3389/fimmu.2021.760882
Induzido por Tilapia Lake Virus
Neuroinflamação em Zebrafish:
Ativação da Microglia e
Comportamento de doença
Miriam Mojzesz 1, Madalena Widziolek 1, Mikolaj Adamek 2 , Urszula Orzechowska1 ,
3
Piotr Podlasz Tomasz 1 Niedharsan Pooranachandran1
, K. Prajsnar , , Anna Pecio4 ,
Anna Michalik , Ganhe Surachetpong6 , Magdalena Chadzinska1 e Krzysztof Rakus 1*
5
1 Departamento de Imunologia Evolutiva, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica, Faculdade de Biologia, Jagiellonian
Universidade, Cracóvia, Polônia, 2 Unidade de Pesquisa de Doenças de Peixes, Instituto de Parasitologia, Universidade de Medicina Veterinária,
Hanôver, Alemanha, 3 Departamento de Fisiopatologia, Medicina Veterinária Forense e Administração, Faculdade de
Medicina Veterinária, Universidade de Warmia e Mazury, Olsztyn, Polônia, 4 Departamento de Anatomia Comparada, Instituto de
Zoologia e Pesquisa Biomédica, Faculdade de Biologia, Universidade Jagiellonian, Cracóvia, Polônia, 5 Departamento de Invertebrados
Desenvolvimento e Morfologia, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica, Faculdade de Biologia, Universidade Jagiellonian,
Cracóvia, Polônia, 6 Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Kasetsart
Universidade, Bangkok, Tailândia
Nos mamíferos, a relação entre o sistema imunológico e o comportamento é amplamente estudada.
Em peixes, no entanto, o conhecimento sobre a resposta imune cerebral e as mudanças
comportamentais durante a infecção viral cerebral é muito limitado. Para investigar melhor este
assunto, usamos o modelo de infecção do peixe-zebra (Danio rerio) tilapia lake virus (TiLV), que foi
previamente desenvolvido em nosso laboratório. Demonstramos que o TiLV persiste no cérebro de
peixe-zebra adulto por pelo menos 90 dias, mesmo quando o vírus não é detectável em outros
órgãos periféricos. Os virions foram encontrados em todo o cérebro. Durante a infecção por TiLV, o
peixe-zebra exibiu um claro comportamento de doença: diminuição da atividade locomotora, redução
da ingestão de alimentos e localização principalmente perto da zona inferior dos aquários. Além
disso, durante a natação, peixes individuais também exibiram padrões incomuns de movimento em
espiral. O estudo de expressão gênica revelou que o TiLV induz no cérebro de peixes adultos uma
forte resposta antiviral e inflamatória e regula positivamente a expressão de genes que codificam
marcadores de micróglia/macrófagos. Finalmente, usando larvas de peixe-zebra, mostramos que a
infecção por TiLV induz anormalidades histopatológicas no cérebro e causa ativação da micróglia,
que se manifesta por mudanças na forma da célula de um estado ramificado de repouso em
infectados simulados para um estado ativo altamente amebóide em infectados por TiLV larvas. Este
é o primeiro estudo que apresenta uma análise abrangente da resposta imune do cérebro associada
à ativação da microglia e subsequente comportamento doentio durante a infecção viral sistêmica no
peixe-zebra.
Palavras-chave: resposta antiviral, interferons, neuroinflamação, micróglia, comportamento doentio, tilapia lake virus,
TiLV, peixe-zebra
1 Outubro 2021 | Volume 12 | Artigo 760882
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Mojzesz et ai.
1. INTRODUÇÃO
Durante a infecção ou lesão, os mecanismos de defesa do hospedeiro
são ativados, e isso induz não apenas uma resposta imune e profundas
alterações fisiológicas no organismo (por exemplo, indução de febre),
mas também alterações comportamentais, o chamado comportamento
de doença. Essas alterações comportamentais incluem letargia,
hiperalgesia, sonolência, ingestão alimentar reduzida, depressão da
atividade locomotora, exploratória e social, déficits cognitivos e de
memória, desorientação e atividade sexual reduzida (1-4 ). O
comportamento doentio evoluiu não apenas para economizar a energia
necessária para combater a infecção e facilitar o processo de cura,
mas também para minimizar o risco de disseminação da infecção ou
predação (5). O comportamento doentio é desencadeado por
mediadores pró-inflamatórios, principalmente citocinas (IL-1b, IL-6,
TNF-a e interferons tipo I (IFN)) e prostaglandinas (p. ou lesão tecidual,
podendo ultrapassar a barreira hematoencefálica, ativar células gliais
(astrócitos e micróglia) e promover alterações comportamentais (1, 6).
Microglia e astrócitos são responsáveis pela resposta imune inata
local no cérebro. Essas células são rapidamente ativadas em resposta
à inflamação cerebral, infecção e lesão (7-9). Mesmo após uma
infecção menor, a microglia altera o perfil de expressão gênica. Além
disso, a morfologia da micróglia também muda de um fenótipo de
repouso ramificado, escaneando dinamicamente o cérebro em células
móveis amebóides que subsequentemente migram para o local afetado
(10). Em mamíferos, a ativação da microglia durante a infecção viral
está bem documentada (11). Em peixes, no entanto, pouco se sabe
sobre a ativação da microglia durante a infecção viral do cérebro,
embora vírus neurotrópicos possam potencialmente afetar sua atividade/
função.
Zebrafish (Danio rerio) é um organismo modelo de laboratório
usado para estudos translacionais de doenças humanas e animais,
incluindo infecções virais (12-14). No entanto, o conhecimento sobre a
resposta imune cerebral e as mudanças comportamentais durante a
infecção viral cerebral do peixe-zebra é muito limitado. Apenas alguns
relatos descreveram a resposta imune do cérebro do peixe-zebra
durante a infecção pelo vírus da necrose nervosa (NNV) e pela viremia
da primavera do vírus da carpa (SVCV) (15, 16). Além disso, também
foi demonstrado que a infecção por SVCV ou a estimulação de poli(I:C)
induz febre comportamental em peixe-zebra (17, 18). Além disso, o
peixe-zebra também tem sido usado para estudar as rotas de entrada
no cérebro de vírus humanos que infectam o sistema nervoso central
(SNC), como o vírus Sindbis (SINV), o vírus Chikungunya (CHIKV) e o
vírus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1). (19–21).
Nos últimos anos, o tilapia lake virus (TiLV; gênero: Tilapinevirus,
família Amnoonviridae) foi descrito como um agente etiológico de
doença altamente contagiosa e emergente que tem efeitos prejudiciais
na criação de tilápia em todo o mundo (22-24). O TiLV tem um genoma
de RNA de fita simples de sentido negativo linear com 10 segmentos e
cerca de 10,323 kb de comprimento total (22, 23). Curiosamente, um
alto nível de TiLV foi observado no cérebro de tilápia infectada (23, 25),
e isso foi correlacionado com as claras alterações histopatológicas (23)
e ativação da expressão de genes envolvidos na resposta imune
antiviral no cérebro de tilápia (25, 26). Recentemente, descrevemos o
modelo de infecção por TiLV em adultos e larvas de
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zebrafish (27, 28), e nosso estudo de tropismo viral revelou que em
peixes adultos a maior carga viral de TiLV foi encontrada no cérebro
(27).
No presente estudo, demonstramos que o TiLV persiste no cérebro
do peixe-zebra adulto por um longo período e que, durante a infecção
pelo TiLV, o peixe-zebra expressa claramente um comportamento
doentio: diminuição da atividade locomotora e da ingestão de alimentos.
Além disso, TiLV induz no cérebro alterações histológicas, forte
resposta antiviral e inflamatória e ativa micróglia/macrófagos.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Vírus e células TiLV
(isolado VETKU-TV01) foi previamente isolado de tilápia vermelha
híbrida (Oreochromis spp.) na Tailândia (29). As células E-11 do peixe
cabeça de cobra listrado (Ophicephalus striatus) foram usadas para
produzir e titular TiLV conforme descrito anteriormente (27).
2.2 Manutenção do Zebrafish O Zebrafish
(Danio rerio) foi cultivado em tanques de 8 L em um sistema
ZebTEC Stand Alone (Tecniplast, Buguggiate, Itália) a uma
temperatura da água de 28°C e um ciclo dia/noite de 12/12 h. Antes
da infecção, peixes-zebra adultos foram colocados em aquários
individuais de 30 L com aeração e temperatura da água de 28°C
por 2 semanas de aclimatação. Os peixes foram alimentados duas
vezes ao dia com ração comercial para zebrafish (Gemma Micro
300ZF, Skretting, Stavangar, Noruega). Larvas de peixe-zebra foram
obtidas por incross e mantidas em meio E3 com azul de metileno a
28°C de acordo com protocolos padrão. O estudo animal foi
credenciado pelo 2º Comitê de Ética Local em Cracóvia, Polônia (nº
29/2021).
2.3 Infecção por TiLV e coleta de amostras
2.3.1 Peixe-zebra adulto
Antes da infecção, peixes-zebra adultos (estirpe Tuebingen, TU) foram
anestesiados em água contendo 0,2 g/L de solução tamponada de
MS-222 (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, EUA) e injetados
intraperitonealmente ( ip) com 10 ml de meio contendo TiLV (1 × 107
TCID50/ml). Os controles infectados simulados foram tratados de
forma semelhante e injetados ip com meio L15 coletado de células não
infectadas. Em pontos de tempo selecionados: dia 0 e 1, 3, 6, 14, 28,
45, 60 e 90 dias pós-infecção (dpi), peixes infectados (n = 7–8) foram
sacrificados e amostrados para carga viral e expressão gênica estudar.
Órgãos (cérebro, olho, baço, rim, fígado) foram coletados em fixRNA
(EURx) e armazenados a -20°C até o isolamento do RNA. Além disso,
aos 14 dpi, peixes infectados adicionais (n = 4) foram amostrados para
coletar três partes do cérebro (prosencéfalo, mesencéfalo e
rombencéfalo) para carga viral e estudo de microscopia eletrônica.
2.3.2 Larvas de peixe-zebra
Antes da infecção, larvas de peixe-zebra 54 h pós-fertilização (hpf):
cepa Tuebingen para carga viral e estudo de expressão gênica, e
linhagem transgênica Tg(mpeg1.1:mCherryF)ump2 (30) para microscopia
2 Outubro 2021 | Volume 12 | Artigo 760882
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avaliação da ativação da microglia, foram anestesiados e microinjetados
sistemicamente com 3 nl de meio contendo TiLV (1 × 107 TCID50/ml) ou
meio L15 controle (infecção simulada) no ducto de Cuvier, conforme
descrito anteriormente (28). Às 24 e 48 hpi, as larvas foram anestesiadas
e usadas para (i) coleta de amostras: as cabeças e o restante dos corpos
foram coletados separadamente no fixRNA (EURx) (oito larvas reunidas
por amostra) e armazenados a -20°C até que o RNA isolamento e (ii)
avaliação microscópica da ativação da microglia.
2.4 Isolamento de RNA e síntese de cDNA O RNA total foi isolado
usando o ReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep System (Promega, Madison,
WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A pureza e a
concentração de RNA foram medidas espectrofotometricamente com um
leitor Tecan Spark usando uma placa NanoQuant (Tecan, Männedorf,
Suíça). A síntese de cDNA foi realizada a partir de 100 ng de RNA total
usando o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied
Biosystems, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do
fabricante. Para amostras selecionadas, controles sem transcriptase
reversa (sem RT) foram usados para verificar a contaminação do DNA
genômico.
2.5 qPCR em tempo real 2.5.1
Análise da carga viral A
aproximação da carga viral foi realizada pela quantificação de cópias de
genes normalizadas conforme descrito anteriormente (27). A aproximação
da carga viral é mostrada como o número de cópias do gene TiLV
normalizado contra 1 × 105 cópias do gene de referência do hospedeiro,
fator de alongamento 1 alfa (ef1a). Os genes analisados e as sequências
de seus respectivos primers são apresentados na Tabela 1.
2.5.2 Análise de expressão gênica Para
análise de expressão gênica, as reações de qPCR em tempo real (RT-
qPCR) foram realizadas em duplicata para cada amostra usando SYBR
Select Master Mix (Applied Biosystems), primers específicos e cDNA (de
larvas: 20 × diluído; de órgãos de peixes adultos: 40 × diluído). A mistura
de reação e o protocolo de amplificação foram descritos anteriormente
(27). As análises da curva de fusão foram realizadas ao final de cada
execução. Controles sem RT e sem modelo foram incluídos em execuções
selecionadas. RT-qPCR foi realizado com um Rotor-Gene Q (Qiagen,
Hilden, Alemanha). As alterações induzidas por infecção na expressão
gênica foram apresentadas como uma proporção do gene alvo versus
gene de referência (rps11; gene da proteína ribossômica s11) em relação
à expressão em amostras de controle usando o método Pfaffl (32) de
acordo com a seguinte equação:
(Etarget) DCtTarget(control-sample)
Razão =
(Ereferência) DCtReference(control-sample)
onde E é a eficiência de amplificação e Ct é o número de ciclos de
PCR necessários para que o sinal exceda um valor limite predeterminado.
Os genes analisados e as sequências de seus respectivos primers são
apresentados na Tabela 1.
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2.6 Estudo Comportamental
2.6.1 Avaliação Comportamental
Para avaliar as mudanças comportamentais causadas por TiLV em peixe-
zebra adulto, três tanques (3,5 L, 11 cm × 17 cm × 28 cm; largura ×
profundidade × comprimento) com peixes infectados por TiLV (cinco
peixes em cada tanque) e três tanques com peixes simulados (cinco
peixes em cada tanque) foram usados para gravação dos vídeos por uma
câmera (NIKON Coolpix L340) localizada na frente do tanque. Depois de
colocar o tanque no local de gravação, os peixes foram deixados em
repouso por 5 min. Em seguida, o comportamento dos peixes foi registrado
em cada tanque por 29 min aos 6 e 11 dpi. Os tanques infectados
simuladamente e infectados com TiLV foram registrados em ordem
alternada. Os vídeos foram analisados por meio do software EthoVision
XT 15 (Noldus, Wageningen, Holanda). Os seguintes parâmetros foram
analisados: velocidade (a distância percorrida pelo ponto central, nariz ou
base da cauda do sujeito por unidade de tempo quando o peixe estava
em movimento) (cm/s), distância percorrida (a distância percorrida pelo
centro, nariz ou ponto base da cauda do sujeito da amostra anterior para
a atual) (cm), tempo em movimento/parado (s) e porcentagem de tempo
gasto na zona superior versus zona inferior do tanque (%) .
2.6.2 Avaliação do peso do peixe-zebra
Durante o curso dos experimentos, os peixes foram alimentados duas
vezes ao dia com ração comercial para peixe-zebra (Gemma Micro 300ZF,
Skretting). O peso do peixe-zebra infectado simuladamente (n = 10) e
infectado com TiLV (n = 10) foi avaliado a cada 3-4 dias, começando de
14 dias antes da infecção até 25 dpi. Os peixes foram pesados
individualmente em balança de precisão (WTB 2000, Radwag).
2.7 Histopatologia Seis
espécimes (3 simulados infectados e 3 infectados com TiLV) de larvas de
peixe-zebra a 48 hpi (102 hpf) foram eutanasiados com uma overdose de
MS-222 a 1% e fixados em formalina tamponada com PBS a 10%.
Em seguida, as larvas foram enxaguadas em água corrente por 4 horas,
desidratadas em álcool graduado, infiltradas em mistura 1:1 óxido de
propileno/Epon 812 e embebidas em Epon 812. As cabeças inteiras foram
seccionadas transversalmente em 0,5-1 µm de espessura usando vidro facas.
Os cortes foram corados com azul de metileno/azur II e analisados no
Nikon Eclipse E600. Seções selecionadas do prosencéfalo, mesencéfalo
e rombencéfalo foram digitalizadas usando o software NIS Elements F e
pós-processadas pelo CorelDraw Graphic Suite 2020.
2.8 Análise por Microscopia Eletrônica de Transmissão Os
cérebros dissecados foram fixados em solução de glutaraldeído a
2,5% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) a 4°C por 2 semanas. Após esse
tempo, as amostras foram lavadas com tampão fosfato 0,1 M com adição
de sacarose (5,8%), pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio a 1%,
desidratadas em série de etanol e acetona e embebidas em resina epóxi
Epon 812 (SERVA, Heidelberg, Alemanha). Para análises ultraestruturais,
os blocos de resina foram cortados em seções ultrafinas, contrastados
com citrato de chumbo e acetato de uranila e observados no microscópio
eletrônico de transmissão JEOL JEM 2100.
3 Outubro 2021 | Volume 12 | Artigo 760882
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TABELA 1 | Primers e sondas usados para RT-qPCR.

Gene Sequência de primer (5'!3') Número de referência ou acesso

TiLV F AGCCTGCCACACAGAAG (27)

R CTGCTTGAGTTGTGCTTCT
P FAM-CTCTACCAGCTAGTGCCCCA-BHQ
ef1a F TGCCAGTGTTGCCCTTCGT (27)
R GCTCAATCTTCCATCCCTTG
rps11 F TAAGAAATGCCCCTTCACTG NM_213377.1
R GTCTCTTCTCAAAACGGTTG
equipamento-eu
F TTGAGGAGCTGCATGAACAC JX462558.1
R CCGCTTGAATCTCCTCAGAC
tlr3 F AAAGGGCTACGTTTGGGTGTG NM_001013269.3
R GTTGGTGGAGTTCAGCCATT
irf3 F CAAAACCGCTGTTCGTGCC (31)
R CATCGTCGCTGTTGGAGTCCT
irf7 F AGGCAGTTCAACGTCAGCTACCAT (31)
R TTCCACCAAGTTGAGCAATTCCAG
infj1 F GAGCACATGAACTCGTGTGAA NM_207640.1
R TGCGTATCTTGCCACACATT
mxa F GACCGTCTCTGATGTGGTTA AJ544823.1
R GCATGCTTTAGACTCTGGCT
il-1b F GAACAGAATGAAGCACATCAAACC NM_212844.2
R ACGGCACTGAATCCACCAC
ifng1-2 F CTATGGGCGATCAAGGAAAA AB158361.1
R CTTTAGCCTGCCGTCTCTTG
tnf-a (cxcl8a) F GCGCTTTTCTGAATCCTACG NM_212859.2
R TGCCCAGTCTGTCTCCCTTCT
il-8 F GTCGCTGCATTGAAACAGAA XM_009306855.3
R CTTAACCCATGGAGCAGAGG
cox2b F CCCCAGAGTACTGGAAACCA NM_001025504.2
R ACATGGCCCGTTGACATTAT
il-10 F ATTTGTGGAGGGCTTTCCTT NM_001020785.2
R AGAGCTGTTGGCAGAATGGT
gfap F AGTCCCAGCGTTCCTTCTC NM_131373.2
R GGTCGTTTAGCCCCATCA
csf1r F CCTGATCCGCAACGTTCATCCT NM_131672.1
R GCTTTGGGCAGCATTCTTGAGG
apoeb F AGATGGGAGGAGATGGTGGA NM_131098.2
R GGAGCCCTTGATGTTTTGC
cd68 F CACCACACAGGCTACTGACG XM_002662803.5
R AATCCGTGCTTCATTTTCGT
npy F CTGTGATGTCCATGTGTCCTTCTG NM_131074.2
R GAGCCTAAAGAGCGCACATTGA
pomc F CAGAGTCTGAGCTTGGGTTTGCTT NM_001083051.1
R ACTTTTACCGGTCTGCGTTTGC
tmem119a F GCGAGAACCTACGAAAGCAC XM_682863.6
R CACCACTTCAACATCCTCCA
tmem119b F CATCTTCACCATCTCTCTCTC NM_001089443.1
R GCTTTGTCTTGCTCATCCAC
aif1 F TGAAGACAAAAAGGGAGAAGC NM_198870.1
R GCACGCACACACAAAACATAA

2.9 Análise Microscópica da Ativação da
Microglia Para analisar a ativação da
microglia após a infecção por TiLV, as larvas de peixe-zebra
Tg(mpeg1.1:mCherryF)ump2 transgênicas infectadas com TiLV
ou falsamente infectadas foram anestesiadas em 24 e 48 hpi e
posicionadas dorsalmente em 1% de baixo -agarose de ponto de
fusão (Sigma-Aldrich) em E3 sem azul de metileno em uma placa
de fundo de vidro cheia de meio E3 contendo 0,1 mg/ml de MS
222 (Sigma-Aldrich). A região do mesencéfalo de cada larva foi
visualizada com o microscópio confocal Zeiss LSM 900 Airyscan 2 usando
a objetiva de água C-Apochromat 40x/NA 1.2. Para análise de
imagens, foi utilizado o ImageJ/Fiji. Projeções de intensidade máxima
foram criadas e fotomicrografias de fluorescência foram convertidas
em imagens binárias representativas usando o protocolo descrito
anteriormente para quantificar a morfologia da microglia (33). Em
seguida, o índice de circularidade (0–1) foi analisado como uma
fórmula 4-pi (área/perímetro^2), onde o valor de 1,0 indica um círculo
perfeito. Cada imagem foi adicionalmente verificada manualmente
quanto aos valores discrepantes corretos da micróglia e quaisquer
artefatos rejeitados da análise.

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2.10 Análise estatística A análise 3. RESULTADOS

estatística foi realizada usando GraphPad Prism 9 (GraphPad
Software). Teste de Shapiro-Wilk (para normalidade) e teste de Brown-
Forsythe (para homogeneidade) foram realizados para garantir a
adequação dos dados para testes de significância paramétrica.
Diferenças significativas na expressão gênica entre o peixe adulto
controle no dia 0 e o peixe adulto infectado por TiLV nos pontos de
amostragem seguintes foram avaliadas usando ANOVA de uma via
seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett nos casos
em que os dados foram normalmente distribuídos, ou com o não
-teste paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de
comparações múltiplas de Dunn quando os dados não foram
normalmente distribuídos. Diferenças significativas na expressão
gênica entre as larvas simuladas e infectadas com TiLV em cada
ponto de tempo foram avaliadas por ANOVA de duas vias seguida
pelo teste de Bonferroni. Diferenças significativas na velocidade,
distância percorrida, tempo em movimento/parado, tempo gasto nas
zonas do tanque e peso entre os peixes adultos infectados
simuladamente e infectados por TiLV em cada ponto de tempo foram
avaliados pelo teste Mann-Whitney U de duas caudas . Diferenças
significativas no índice circulatório entre as larvas simuladas e
infectadas com TiLV em cada ponto de tempo foram avaliadas pelo
teste de Mann Whitney bicaudal. Os dados são apresentados como
médias (+ desvio padrão). Os níveis de significância estão indicados com asteriscos: *p ÿ 0,05; **p ÿ 0,01; ***p ÿ 0,001; ****p ÿ 0,0001.
3.1 O cérebro é o órgão com a maior carga viral e com a maior
persistência de TiLV em peixe-zebra adulto A quantificação de
TiLV por RT-qPCR no cérebro, olho, baço, rim e fígado de
peixe-zebra adulto infectado os órgãos aumentaram progressivamente
até 6 dpi (para o baço, rim e fígado) e 14 dpi (para o cérebro e olho),
antes de diminuir gradualmente em pontos de tempo subseqüentes
(Figura 1A). A maior carga viral foi observada no cérebro em 14 dpi
(a média do número de cópias normalizado foi de 2,47 × 106 ).
Curiosamente, a carga viral no cérebro ainda estava em um nível alto
mesmo em 90 dpi, quando o vírus não foi detectado em órgãos
periféricos como baço, rim e fígado. A carga viral nos olhos estava
em nível moderado e também foi detectada em 90 dpi. Não houve
diferenças estatisticamente significativas na carga viral medida em 14
dpi nas três regiões do cérebro: prosencéfalo, mesencéfalo e
rombencéfalo (Figura 1B). Também confirmamos a presença de
partículas TiLV nas três partes do cérebro por microscopia eletrônica
de transmissão (TEM) (Figura 1C). O tamanho das partículas virais
era de aproximadamente 70-100 nm. Coletivamente, esses resultados
sugerem que o TiLV é capaz de invadir o cérebro de peixe-zebra
adulto e permanecer no SNC por um período de tempo substancial.

UMA

B C

FIGURA 1 | A presença de TiLV em tecidos de peixes-zebra adultos, incluindo cérebro. (A, B) Números de cópias normalizadas do RNA de TiLV em diferentes tecidos (n = 5–7) (A) e
em três partes do cérebro a 14 dpi (n = 4) (B) de peixes-zebra infectados por ip. Os dados são mostrados como gráficos de caixa e bigode indicando a faixa de 25% a 75% na caixa e
valores máximos e mínimos por bigodes. A linha no meio da caixa é traçada na mediana. As letras diferentes indicam diferenças significativas entre os tecidos em pontos de tempo
específicos revelados por ANOVA de um fator seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey ou pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn. p-valor ÿ
0,05 foi considerado significativo. O esquema cerebral do peixe-zebra foi obtido em scidraw.io (doi.org/10.5281/zenodo.3926217) (C). Micrografias eletrônicas de transmissão do cérebro
de peixes-zebra adultos infectados com TiLV mostrando partículas virais citoplasmáticas (setas brancas) no prosencéfalo (C1), mesencéfalo (C2) e rombencéfalo (C3).

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Mojzesz et ai. Neuroinflamação induzida por vírus em peixe-zebra

3.2 TiLV ativa a expressão de genes
relacionados ao sistema imunológico no cérebro
de peixe-zebra adulto e induz inflamação cerebral
Tendo determinado a presença duradoura de
TiLV no cérebro de peixe-zebra adulto, especulamos
se isso leva à resposta imune.
Descobrimos que a infecção por TiLV induziu uma regulação positiva da
expressão de genes que codificam proteínas envolvidas na via do IFN tipo
I, como os receptores de reconhecimento de padrão (PRR): rig-I e tlr3,
fatores de transcrição: irf3 e irf7, tipo I IFN (ifnf1) , e a proteína antiviral Mxa
(mxa). A regulação positiva da expressão da maioria desses genes foi
claramente associada à carga viral no cérebro e foi observada de 3 ou 6 dpi
até 45 ou 60 dpi (Figura 2A). Além disso, a infecção por TiLV induziu uma
regulação positiva significativa dos genes que codificam as citocinas pró-
inflamatórias il-1b, ifng1-2 (de 6 a 45 dpi), tnf-a (em 28 dpi), il-8 (cxcl8a) (em
6
dpi), enzima cox2b (3 e 6 dpi) e citocina anti-inflamatória il-10 (28 dpi) (Figura
2A). Finalmente, estudamos a expressão dos marcadores de ativação de
astrócitos: proteína glial fibrilar ácida (gfap) e micróglia/macrófagos: receptor
do fator 1 estimulador de colônias (csf1r), apolipoproteína EB (apoeb) e
cd68. Observou-se aumento da expressão de csf1r (de 14 até 45 dpi) e cd68
(de 6 até 45 dpi). A expressão de apoeb apareceu aumentada, embora sem
significância estatística, enquanto não foram observadas diferenças na
expressão de gfap (Figura 2B). Também estudamos a expressão de outros
marcadores de micróglia/macrófagos, como o fator inflamatório de aloenxerto
1 (aif1, também conhecido como molécula adaptadora de ligação ao cálcio
ionizada 1 (IBA1)), que é um marcador bem conhecido de micróglia em
camundongos e proteína transmembrana 119 ( tmem119), mas a expressão
desses genes não foi alterada (dados não mostrados). Juntos, esses dados
indicam que TiLV induz resposta antiviral no cérebro de

UMA

FIGURA 2 | Alterações induzidas por TiLV na expressão de genes envolvidos na resposta antiviral e marcadores de micróglia/macrófagos no cérebro de peixe-zebra adulto.
(A, B) Expressão de genes envolvidos na resposta antiviral e pró-inflamatória (A), micróglia/macrófagos e marcadores de astrócitos (B) no cérebro de zebrafish.
A expressão do gene é normalizada contra o gene de limpeza rps11. Alterações na expressão gênica de peixes infectados com TiLV (barras pretas) são mostradas como um aumento de x
vezes em comparação com o peixe controle no dia 0 (barras brancas). O símbolo (*) indica diferenças significativas entre o controle e os peixes infectados com TiLV, conforme revelado pela
ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett ou pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn (*p ÿ 0,05; **p ÿ 0,01; ***p ÿ 0,001;
****p < 0,0001). Os dados são a média + SD de n = 5–7 peixes.

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Mojzesz et ai. Neuroinflamação induzida por vírus em peixe-zebra

peixe-zebra adulto e regulação positiva de alguns dos marcadores microglia/
macrófagos.
3.3 TiLV induz comportamento doentio e leva à perda de peso em
peixes-zebra adultos Observamos que peixes-zebra infectados por
TiLV tendem a se agrupar no fundo de aquários e quase não reagem para
alimentação durante a progressão da infecção (vídeos complementares 1 e
2). Para avaliar as mudanças comportamentais causadas pela infecção por
TiLV, os seguintes parâmetros foram analisados em 6 e 11 dpi: velocidade
(cm/s), distância percorrida (cm), tempo em movimento/parado (s) e
porcentagem de tempo gasto em diferentes zonas (superior vs. inferior)
O peso dos peixes infectados sistemicamente diminuiu à medida que a
infecção progrediu. Uma perda significativa de massa corporal foi
demonstrada em animais infectados em 18, 21 e 25 dpi (Figura 3C). Além
disso, observamos um downregulation significativo de npy (que codifica o
neuropeptídeo orexígeno Y) em 14 e 28 dpi, com o mais forte downregulation
em 14 dpi (Figura 3D). Também notamos tendência de aumento da
expressão de pomc (que codifica a pró-opiomelanocortina anorexígena)
aos 3 dpi, embora sem significância estatística (Figura 3D). Esses resultados
mostram que a infecção por TiLV leva a profundas mudanças
comportamentais e pode afetar o apetite dos peixes infectados.

3.4 Cabeças e corpos de larvas de peixe-zebra mostraram carga viral

(%). O teste de velocidade e o teste de distância percorrida demonstraram
uma redução significativa na velocidade e distância nadada para peixes semelhante e resposta imune antiviral contra TiLV Especulamos que,

infectados por TiLV em comparação com peixes infectados simuladamente
em 6 e 11 dpi (Figuras 3A, B). Além disso, peixes infectados por TiLV
tendem a gastar menos tempo em movimento e mais tempo na parte inferior
do tanque quando comparados com peixes infectados simuladamente tanto
em 6 quanto em 11 dpi (Figuras 3A, B). Além disso, observamos que peixes
individuais exibiam padrões de movimento espiral incomuns durante a natação.
semelhante ao peixe-zebra adulto infectado por TiLV, as larvas infectadas
sistemicamente por TiLV também exibem maior carga viral na região da
cabeça. No entanto, a quantificação de TiLV por RT qPCR não mostrou
diferenças na carga viral entre as cabeças e os corpos das larvas de
zebrafish em 24 e 48 hpi. Ainda assim, um alto

UMA B

C D

FIGURA 3 | Alterações induzidas por TiLV nas atividades locomotoras e na ingestão de alimentos em peixe-zebra adulto. Testes de parâmetros comportamentais de peixes infectados simuladamente e infectados
por TiLV em 6 dpi (A) e 11 dpi (B). Os resultados em (A, B) são representativos de dois experimentos independentes. Peso corporal (g) de peixe-zebra adulto infectado simuladamente e infectado por TiLV (C).
O símbolo (*) indica diferenças significativas entre os peixes infectados simuladamente e os infectados por TiLV, conforme revelado pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney bicaudal. Os dados são a
média + DP de n = 15 (testes de parâmetros comportamentais) ou n = 9–11 (teste de peso corporal). (D) Expressão de npy e pomc no cérebro de peixe-zebra adulto. A expressão do gene é normalizada contra
o gene de limpeza rps11. Alterações na expressão gênica de peixes infectados com TiLV (barras pretas) são mostradas como um aumento de x vezes em comparação com o peixe controle no dia 0 (barras
brancas). O símbolo (*) indica diferenças significativas entre o controle e os peixes infectados com TiLV, conforme revelado pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn. Os dados
são a média + SD de n = 5–7 peixes. *p ÿ 0,05; **p ÿ 0,01, ***p ÿ 0,001, ****p < 0,0001.

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o aumento da carga viral em 48 hpi demonstrou que o TiLV
provavelmente poderia se replicar em ambas as partes analisadas
das larvas de peixe-zebra (Figura 4A). A presença de virions TiLV
no cérebro de larvas de zebrafish também foi confirmada por TEM (Figura
Finalmente, a regulação positiva da expressão de rig-I, ifnf1 e mxa
em ambas as cabeças e corpos de larvas de peixe-zebra foi
demonstrada durante a infecção por TiLV. A regulação positiva dos
genes estudados foi observada em 48 hpi e foi maior nos corpos do
que nas cabeças (Figura 4C). Esses resultados demonstraram que
nos primeiros pontos de amostragem durante a infecção por TiLV de
larvas de zebrafish não há diferenças na carga viral entre cabeças e corpos.
arranjo do corpo celular dos neurônios (ou pericário) e neurópilo
e forte adesão de todos os tecidos e órgãos, especialmente entre
cérebro, caixa craniana e órgãos dos sentidos (Figuras 5A1-C1).
O4B).
cérebro em desenvolvimento em larvas infectadas por TiLV na
área do prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo foi cercado por
espaço livre (ou por fluido, edema), fazendo com que a caixa
craniana em desenvolvimento fosse dobrada e se projetasse
amplamente, especialmente no lado dorsal (Figuras 5A2– C2). Em
todas as áreas do cérebro em larvas infectadas com TiLV, as
alterações histopatológicas relativas à degeneração no neurópilo
e desintegração do pericário eram visíveis (Figuras 5A3–C3).

3.5 TiLV causa anormalidades histopatológicas no 3.6 TiLV induz ativação de microglia em larvas de peixe-zebra
cérebro de larvas de peixe- zebra Imagens confocais representativas de microglia no mesencéfalo
de larvas de peixe-zebra infectadas com TiLV da linha transgênica
Tg(mpeg1.1:mCherryF)ump2 mostraram que em 24 hpi, apenas
uma leve

UMA B

FIGURA 4 | A presença de TiLV nas cabeças e corpos de larvas de peixe-zebra e alterações induzidas por TiLV na expressão de genes envolvidos na resposta antiviral.
(A) Números de cópias normalizados de RNA de TiLV em cabeças e corpos de larvas de zebrafish infectadas por TiLV (n = 6–8). Larvas de zebrafish foram infectadas aos 54 anos
de idade. Os dados são mostrados como gráficos de caixa e bigode indicando a faixa de 25% a 75% na caixa e valores máximos e mínimos por bigodes. A linha no meio da caixa é
traçada na mediana. As diferenças na carga viral foram analisadas usando o teste não paramétrico U de Mann-Whitney bicaudal. O esquema de larvas de peixe-zebra foi obtido em
scidraw.io (doi.org/10.5281/zenodo.3925957). (B) Micrografias eletrônicas de transmissão do cérebro de larvas de peixe-zebra infectadas com TiLV mostrando partículas virais
citoplasmáticas (setas brancas) em baixa (B1) e alta (B2) ampliação. n, núcleo. (C) Expressão de rig-I, ifnf1 e mxa em cabeças e corpos de larvas de zebrafish. A expressão do gene
é normalizada contra o gene de limpeza rps11. Alterações na expressão gênica de larvas infectadas com TiLV (barras pretas) são mostradas como aumento x vezes em comparação
com larvas infectadas simuladas (barras brancas) em cada ponto de tempo. O símbolo (*) indica diferenças significativas entre as larvas simuladas e infectadas por TiLV em cada
ponto de tempo, conforme revelado pela ANOVA de duas vias seguida por um teste de Bonferroni (*p ÿ 0,05; ***p ÿ 0,001; *** *p < 0,0001). Cada barra representa a média + SD de
n = 6–8 amostras derivadas de dois experimentos independentes.

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FIGURA 5 | Alterações histpatológicas induzidas por TiLV no cérebro de larvas de zebrafish. As seções transversais da cabeça e do cérebro de larvas de peixe-zebra infectadas
com simulação (A1–C1) e TiLV (A2–C3) a 48 hpi (102 hpf) coradas com azul de metileno/azur II. As linhas sólidas com uma seta (A1–C1) mostram uma forte adesão entre o cérebro
e a caixa craniana. As linhas pontilhadas com uma seta (A2–C2) mostram espaços livres aumentados (edema) entre o cérebro e a caixa craniana. (A3–C3) Maior ampliação da
estrutura cerebral de larvas infectadas por TiLV com espaços alveolares livres na área do neurópilo (setas) e distribuição irregular de corpos celulares nervosos. Ne, neurópilo; Pe, perikarya.

estava presente alteração na morfologia da micróglia [Figuras 6A1,
A2 (infecção simulada) e B1, B2 (infecção por TiLV)]. No entanto,
aos 48 hpi, a microglia mudou claramente a forma de um estado
ramificado em repouso em larvas infectadas simuladamente (Figuras
6C1, C2) para um estado altamente ameboide ativo em larvas
infectadas por TiLV (Figuras 6D1, D2). A quantificação das
alterações da forma da microglia foi realizada pela avaliação do
índice de circularidade. Esta análise não revelou mudanças
significativas entre as larvas infectadas com simulação e infectadas
com TiLV em 24 hpi (Figura 6E), embora as diferenças tenham sido
estatisticamente significativas em 48 hpi (Figura 6F). Além disso,
estudos de expressão gênica revelaram regulação positiva da
expressão de gfap e apoeb, mas não csf1r e cd64, a 48 hpi nas
cabeças de larvas de peixe-zebra (Figura 6G). Esses dados
demonstraram a ativação da microglia durante a infecção de peixe-zebra microglia
4. DISCUSSÃO
Estudos recentes usando biologia molecular e abordagens genéticas
demonstraram o papel da infecção viral no desenvolvimento de
distúrbios neurocomportamentais e seu amplo impacto na saúde e
bem-estar humano e animal. Além disso, esses estudos confirmaram
que as alterações induzidas pelo vírus no sistema nervoso podem
ser induzidas pelo próprio vírus ou por produtos virais; entretanto,
tais alterações também podem ser decorrentes da ação de
mediadores imunes produzidos no cérebro durante a resposta antiviral.
No presente estudo, provamos que os mecanismos envolvidos na
resposta imune induzida por vírus e no comportamento doentio são
evolutivamente conservados e operando plenamente já nos
primeiros vertebrados – peixes. Usando modelos de infecção TiLV-
zebrafish (27, 28), mostramos que o TiLV exibe neurotropismo,
permanece em um nível alto no cérebro por pelo menos 3 meses e
induz a resposta inflamatória e dependente de IFN tipo I no SNC.
Posteriormente, em peixes infectados, observamos ativação da
por TiLV.e profundas alterações no comportamento locomotor e
alimentar.
Zebrafish é um organismo modelo de laboratório utilizado em
diferentes áreas de pesquisa biológica, incluindo estudos de
resposta imune e interações patógeno-hospedeiro. Também tem
sido intensamente utilizado para estudar processos de
neurodesenvolvimento e doenças neurodegenerativas (34), pois seu cérebro apre

Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org 9 Outubro 2021 | Volume 12 | Artigo 760882

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E F

FIGURA 6 | Ativação da microglia induzida por TiLV em larvas de zebrafish. (A–D) Imagens confocais representativas da microglia no mesencéfalo de larvas de peixe-zebra Tg(mpeg1.1: mCherryF)ump2
transgênicas simuladas infectadas em 24 hpi (A1, A2) e 48 hpi (C1, C2) ou infectadas por TiLV em 24 hpi (B1, B2) e 48 hpi (D1, D2). Larvas de zebrafish foram infectadas aos 54 anos de idade. Barra de
escala, 10 µm. Os dados são representativos de dois experimentos independentes. (E, F) Índice de circularidade da microglia de larvas de zebrafish em 24 hpi (E) (n = 8 larvas) e 48 hpi (F) (n = 15 larvas).
Cada ponto representa uma única célula da micróglia e cada cor representa todas as células da micróglia de uma única larva. O símbolo (*) indica diferenças significativas entre as larvas de peixe-zebra
infectadas por simulação e infectadas por TiLV, conforme revelado pelo teste Mann Whitney U bicaudal não paramétrico. Os dados derivaram de dois experimentos independentes. (G) Expressão de genes
codificados astrócitos e marcadores microglia/macrófagos nas cabeças de larvas de peixe-zebra. A expressão do gene é normalizada contra o gene de limpeza rps11. Alterações na expressão gênica de
larvas infectadas com TiLV (barras pretas) são mostradas como aumento x vezes em comparação com larvas infectadas simuladas (barras brancas) em cada ponto de tempo. O símbolo (*) indica diferenças
significativas entre as larvas falsamente infectadas e infectadas por TiLV em cada ponto de tempo, conforme revelado pela ANOVA de duas vias seguida por um teste de Bonferroni (*p ÿ 0,05; ***p ÿ 0,001;
**** p < 0,0001; ns, não significativo). Cada barra representa a média + SD de n = 6–8 amostras derivadas de dois experimentos independentes.

semelhança com o cérebro dos mamíferos tanto na organização geral
quanto na composição celular (35). No entanto, pouco se sabe sobre a
resposta imune do cérebro do zebrafish durante a infecção viral e a
correlação entre a infecção viral do sistema nervoso central e o
comportamento doentio.
Anteriormente, a resposta imune antiviral no cérebro foi observada
em peixes (15, 16) e as alterações induzidas por TiLV no cérebro foram,
de forma limitada, observadas na tilápia do Nilo infectada (26). Em tilápia,
foi relatado que durante a infecção por TiLV, o título viral no cérebro
aumenta gradualmente até 17 dpi e permanece alto em 34 dpi (último
ponto de tempo estudado). Além disso, ISH
A análise revelou que o TiLV foi amplamente distribuído em várias partes
do cérebro da tilápia, com o sinal mais forte observado no prosencéfalo
(envolvido no aprendizado e regulação da ingestão de alimentos) e no
rombencéfalo (responsável pelo controle da locomoção e fisiologia basal)
(36). Em nosso estudo, a análise molecular não revelou nenhuma
diferença na carga viral em uma parte específica do cérebro (prosencéfalo,
mesencéfalo e rombencéfalo) do zebrafish adulto, enquanto a análise
TEM confirmou a presença dos virions em todas as três partes do cérebro.
Anteriormente, mostramos que as larvas de peixe-zebra parecem ser
mais suscetíveis ao TiLV em comparação com os peixes adultos, com alta

Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org 10 Outubro 2021 | Volume 12 | Artigo 760882

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Mojzesz et ai.
mortalidade observada já em 4-5 dpi (28). Usando o modelo de infecção
de larvas de peixe-zebra, notamos a replicação viral na cabeça e no corpo
das larvas de peixe-zebra. No entanto, não observamos diferenças na
carga viral entre a cabeça e o corpo das larvas nos tempos estudados (24
e 48 hpi). Embora seja bem conhecido que os peixes jovens são mais
suscetíveis a infecções por vírus em comparação com os adultos (37),
estudos futuros são necessários para determinar se o TiLV também
persiste no cérebro de larvas sobreviventes e por quanto tempo ele pode
ser detectado.
A análise histopatológica do cérebro mostrou alterações patológicas claras
nas larvas infectadas com TiLV, incluindo a degeneração no neurópilo e
desintegração do pericário.
Da mesma forma, dissociação e degeneração dentro dos locais infectados
do cérebro de tilápias infectadas com TiLV também foram demonstradas
(36). No peixe-zebra adulto, observamos apenas vasos sanguíneos
dilatados no cérebro de peixes infectados por TiLV (14 dpi; dados não mostrados).
No entanto, como descrevemos anteriormente (27), a infecção por TiLV
em peixe-zebra adulto é menos grave do que em tilápia e induz alterações
histopatológicas menores nos órgãos estudados e mortalidade muito baixa.
Alterações necróticas no cérebro de peixes-zebra adultos foram relatadas
durante a infecção por dois vírus neurotrópicos: SVCV e NNV, que induzem
a mortalidade de peixes-zebra adultos (15, 16, 38). Além disso, a infecção
por NNV leva a extensa vacuolização das células cerebrais em larvas de
robalo asiático (Lates calcarifer) (39).
Como mencionado anteriormente, a presença de TiLV no cérebro de
peixes-zebra infectados induz a neuroinflamação. No cérebro de peixes-
zebra infectados com TiLV, observamos alta regulação positiva da
expressão de genes envolvidos na resposta dependente de IFN tipo I e
genes que codificam mediadores pró-inflamatórios. De acordo com nossos
resultados, foi demonstrada a regulação positiva da expressão dos genes
tlr3, ifn-b e mx no cérebro de tilápia do Nilo infectada por TiLV (26).
Curiosamente, o TiLV minimizou a resposta imune inata durante o estágio
inicial da infecção em tilápia (26), o que não foi observado em nosso
estudo. Essas diferenças podem ser explicadas em parte pelas diferentes
espécies animais usadas para o estudo de TiLV. Relatórios anteriores
revelaram a ativação da resposta tipo I IFN-dependente e a indução de
inflamação no cérebro do peixe-zebra após a infecção com NNV e SVCV
(15, 16) e durante infecções por nodavírus de dourada (Sparus aurata) e
robalo (Dicentrarchus labrax) ( 40).
Ambas as citocinas pró-inflamatórias “transmitidas pelo cérebro” e
circulantes podem atuar no nível do SNC e induzir comportamento doentio
(4, 5, 41). Estudos anteriores demonstraram que a tilápia infectada com
TiLV apresenta perda de apetite, letargia, natação errática, perda de
equilíbrio, natação na superfície da água, interrupção da escolaridade ou
redemoinho (24, 29, 36, 42). Aqui, demonstramos que o zebrafish infectado
com TiLV reduziu a velocidade, encurtou a distância percorrida, reduziu o
tempo em movimento e aumentou o tempo gasto na zona inferior dos
aquários. Isso indica que o TiLV induz um claro comportamento de doença
do peixe-zebra.
Anteriormente, o comportamento doentio no zebrafish também foi
observado durante uma resposta inflamatória induzida pela inoculação de
Aeromonas hydrophila inativada por formalina (43). Peixes com resposta
imune induzida mostraram atividade locomotora reduzida, mudanças em
sua preferência social e comportamento exploratório
Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org
Neuroinflamação induzida por vírus em peixe-zebra
em direção a um novo objeto em comparação com peixes de controle (43).
Além disso, encontramos uma correlação entre a progressão da infecção
por TiLV e a perda de peso do zebrafish. Como nos mamíferos, a ingestão
de alimentos em peixes está sob o controle do sistema de alimentação,
localizado no cérebro, e é regulado por várias moléculas de proteínas
específicas, incluindo neuropeptídeos, peptídeos gastrointestinais,
hormônios e metabólitos sanguíneos (44). A ingestão reduzida de alimentos
é uma característica comum de peixes doentes e as citocinas parecem
estar envolvidas neste processo (45). Depois de examinar um amplo painel
de genes envolvidos no controle da ingestão de alimentos em peixes,
encontramos a regulação negativa de npy induzida por TiLV, que codifica
o neuropeptídeo orexígeno Y.
Pesquisas em mamíferos sugerem que, embora as citocinas produzidas
perifericamente possam atravessar a barreira hematoencefálica, a principal
fonte dessas moléculas no cérebro são as células gliais ativadas (micróglia
e astrócitos) (46). Além disso, essas células estão envolvidas nos
processos neuroinflamatórios que podem levar a patologias cerebrais (47,
48). Por outro lado, um modelo de camundongo de encefalite viral aguda
sugere o papel protetor da micróglia na neuroinflamação patogênica
causada por vírus e indica o papel dessas células na limitação da replicação
viral (11). Ainda assim, pouco se sabe sobre a ativação microglial durante
a infecção viral em peixes. No peixe-zebra, a ativação da microglia foi
estudada principalmente no contexto dos processos de desenvolvimento e
regeneração, incluindo a fagocitose de neurônios moribundos (49).
Além disso, uma resposta interessante da microglia durante a infecção
bacteriana com Mycobacterium marinum foi relatada em larvas de zebrafish
(50). Os autores sugeriram que a micróglia foi capaz de migrar reversamente
para se juntar aos focos de infecção no corpo e combater a infecção por
M. marinum juntamente com os macrófagos periféricos. Por outro lado, a
injeção inicial de larvas no rombencéfalo com bactérias mobilizou
macrófagos periféricos no local da infecção (50). Chiang e colaboradores
demonstraram que a infecção por NNV da cultura primária de células
cerebrais de garoupa gigante (Epinephelus lanceolatus) ativa a proliferação
de células microgliais e a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL 1b e
TNF-a) e subsequentemente a morte de células neurais (51).
O envolvimento da micróglia na neuroinflamação em peixes após infecção
bacteriana com Weissella cibaria também foi descrito in vitro usando
culturas de micróglia isoladas do cérebro de tilápia do Nilo (52).
Para entender a dinâmica dos processos de ativação da microglia
durante a infecção/inflamação, é necessário observá-los em um contexto
mais amplo do SNC no organismo vivo. O peixe-zebra é um excelente
modelo para estudos, pois a microglia pode ser visualizada in vivo usando
o peixe-zebra transgênico que expressa proteínas fluorescentes dirigidas
por promotores de genes específicos da microglia/macrófagos, como
mpeg1 (53), apoe (54) ou receptor purinérgico específico da microglia
p2y12 (55). Esses estudos foram realizados principalmente usando o
modelo de larvas de peixe-zebra devido à sua transparência, o que permite
observar a micróglia em seu ambiente natural sob mudanças muito rápidas.
Em contraste, a maior parte da abordagem experimental usando peixe-
zebra adulto inclui a fixação do cérebro. Os dados experimentais mostram
que métodos baseados na análise ex vivo de amostras cerebrais após
diferentes formas de fixação podem afetar muito a morfologia microglial
devido a
11 Outubro 2021 | Volume 12 | Artigo 760882
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Mojzesz et ai. Neuroinflamação induzida por vírus em peixe-zebra

mesmo pequenas condições isquêmicas em preparações (56). DECLARAÇÃO DE ÉTICA

Portanto, neste caso, a metodologia pode afetar artificialmente as
conclusões do estado imunológico dessas células altamente dinâmicas. O estudo animal foi revisado e aprovado pelo 2º Comitê de Ética
Métodos como imagens ao vivo e em tempo real no cérebro de Local em Cracóvia, Polônia.
peixes-zebra adultos foram descritos (57); no entanto, raramente é
usado devido a desafios técnicos, como a demanda por um
microscópio vertical de varredura pontual personalizado (57). Portanto,
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
nos presentes estudos, decidimos usar o protocolo bem descrito (53)
de observação in vivo da micróglia em larvas transgênicas de peixe-
KR e MC conceberam o estudo. KR adquiriu o financiamento. MM e
zebra Tg(mpeg1.1:mCherryF)ump2. Deve ser mencionado que os
MW realizaram os experimentos de infecção e comportamentais com
macrófagos primitivos do saco vitelino colonizam o cérebro do peixe-
a ajuda de NP. MM e UO realizaram estudo de expressão gênica.
zebra a partir de 48 hpf e se diferenciam rapidamente nas próximas
MA realizou análise de carga viral. PP analisou resultados de
24 h (58). No processo de maturação, a micróglia larval aumenta
experimentos comportamentais. TP e MW realizaram microscopia
significativamente a expressão de genes do núcleo microglial, como
confocal. MW analisou o índice de circularidade. AP realizou estudo
apoeb, p2ry12, hexb e csf1r (59) e regula negativamente a expressão de lcp1 (L-plastina) (60).
histopatológico. AM realizou análise TEM. WS forneceu TiLV. MM
Embora os genes centrais da microglia e sua expressão durante a
realizou análises estatísticas. MM, MW, MC e KR escreveram o corpo
maturação da microglia tenham sido estudados em peixes, pouco se
principal do manuscrito com contribuições de todos os outros autores.
sabe sobre os marcadores que indicam sua ativação durante a
Todos os autores contribuíram com o artigo e aprovaram a versão
infecção. Aqui, demonstramos que a infecção por TiLV induz uma
submetida.
regulação positiva da expressão dos marcadores microglia/macrófagos
csf1r e cd68 no cérebro de peixes adultos e apoeb nas larvas, bem
como o marcador de astrócitos gfap nas larvas. Em mamíferos, a
ativação da micróglia durante a morte, lesão ou infecção neuronal
leva a alterações na expressão de genes que codificam marcadores FINANCIAMENTO

celulares específicos, mas também à alteração de sua morfologia. A

microglia ativada tem um fenótipo circular, altamente móvel e
fagocítico (61). Em peixes, a ativação da microglia foi investigada
principalmente durante a lesão cerebral (62). Aqui, demonstramos
pela primeira vez a ativação da microglia durante a infecção viral. A
microglia ativada por TiLV mudou sua forma de células altamente
ramificadas presentes em larvas de controle para morfologia esférica
ameboide. Fenótipo semelhante de micróglia ativada foi relatado em
peixe-zebra devido à fagocitose de neurônios (54) ou bactérias (63).
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciências da Polônia
dentro do projeto Sonata Bis 5 (número da concessão UMO-2015/18/
E/NZ6/00516). O TP foi financiado pelo projeto NCN Sonata Bis 9
(número de concessão UMO-2019/34/E/NZ6/00137). A publicação
de acesso aberto deste artigo foi financiada pela Priority Research
Area BioS no âmbito do programa “Excellence Initiative – Research
University” da Jagiellonian University em Cracóvia.

Resta determinar se a micróglia ativada observada em nosso estudo

também está envolvida no processo de fagocitose de células cerebrais AGRADECIMENTOS
possivelmente danificadas pelo TiLV.
Os autores agradecem ao Sr. Albert Willemsen (Noldus, Holanda)
Em conclusão, este é o primeiro estudo que apresenta uma
análise abrangente da resposta imune do cérebro relacionada à por suas sugestões e discussões sobre estudos comportamentais, e
ativação da microglia e subsequente comportamento doentio durante à Sra. Kinga Sawa (Jagiellonian University, Polônia) por sua
a infecção viral sistêmica do peixe-zebra. Acreditamos que o contribuição para a análise da expressão gênica em larvas de peixe-
conhecimento ampliado da conservação evolutiva de importantes zebra.
ligantes e receptores envolvidos na regulação da resposta imune no
sistema nervoso e na indução de mudanças comportamentais apoiará
a hipótese quanto à importância funcional destes. Nesse contexto, o
MATERIAL SUPLEMENTAR
peixe-zebra forma um modelo perfeito para identificar ligantes e
receptores fundamentais e suas relações evolutivas.
O material suplementar para este artigo pode ser encontrado online
em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021. 760882/
completo#material-suplementar

DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
As contribuições originais apresentadas no estudo estão incluídas no
artigo/Material Suplementar. Dúvidas adicionais podem ser dirigidas
ao autor correspondente.
Vídeos complementares 1 e 2 | Zebrafish adultos foram infectados simuladamente (filme 1) ou
infectados por TiLV (filme 2). Os peixes foram alimentados duas vezes ao dia com ração comercial
para zebrafish (Gemma Micro 300ZF, Skretting). A observação do comportamento alimentar demonstrou
que a partir de 6 dpi os peixes infectados com TiLV quase não reagem para alimentação e tendem a
se agrupar na parte inferior do aquário. Os filmes foram gravados em 11 dpi.

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Conflito de Interesses: Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência
de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um
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14 Outubro 2021 | Volume 12 | Artigo 760882