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Manuscrito aceito

Caracterização do comportamento doentio em zebrafish

Karina Kirsten, Suelen Mendonça Soares, Gessi Koakoski, Luiz Carlos Kreutz,
Leonardo José Gil Barcellos

PII: S0889-1591(18)30303-9
DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbi.2018.07.004 YBRBI
Referência: 3439

Aparecer em: Cérebro, Comportamento e Imunidade

Data de Recebimento: 11 de abril de 2018

Data revisada: 12 de junho de 2018

Data aceita: 4 de julho de 2018

Por favor, cite este artigo como: Kirsten, K., Soares, SM, Koakoski, G., Carlos Kreutz, L., Barcellos, LJG, Characterization of disease
behavior in zebrafish, Brain, Behavior, and Immunity (2018), doi: https ://doi.org/ 10.1016/j.bbi.2018.07.004

Este é um arquivo PDF de um manuscrito não editado que foi aceito para publicação. Como um serviço aos nossos clientes, estamos
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de ser publicado em sua forma final. Observe que durante o processo de produção podem ser descobertos erros que podem afetar o
conteúdo, e todas as isenções legais que se aplicam à revista se aplicam.
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Caracterização do comportamento doentio em zebrafish

Karina Kirsten1,2, Suelen Mendonça Soares1 , Gessi Koakoski3 , Luiz Carlos

Kreutz2 , Leonardo José Gil Barcellos1,2,3

1. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade Federal de Santa Maria

(UFSM), Av. Roraima, 1000, Cidade Universitária, Camobi, Santa Maria, RS, 97105-

900, Brasil.

2. Laboratório de Microbiologia e Imunologia Avançada, Programa de Pós-Graduação

em Bioexperimentação, Universidade de Passo Fundo (UPF), BR 285, São José, Passo

Fundo, RS, 99052-900, Brasil.

3. Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais e Programa de Pós

médica em Bioexperimentação, Universidade de Passo Fundo, (UPF), BR 285, São

José, Passo Fundo, RS, 99052-900, Brasil.

Correspondência e pedidos de materiais devem ser endereçados a LJGB (e-mail:

lbarcellos@upf.br)
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Resumo

Em um estudo anterior, mostramos uma clara relação entre sistema imunológico e

comportamento em peixe-zebra e levantamos a hipótese de que o sistema imunológico é capaz de

induzindo mudanças comportamentais. Para aprofundar o assunto e abordar nossos principais

questão, aqui induzimos uma resposta inflamatória em um grupo de peixes pelo

inoculação de bacterina de Aeromonoas hydrophila inativada com formalina e comparou

comportamento social e exploratório com grupos de controle. Após os testes comportamentais, também

analisaram a expressão de genes de citocinas e marcadores de atividade neuronal em peixes

cérebro. Nos peixes inoculados com bacterina, a atividade locomotora, preferência social e

comportamento exploratório em relação a um novo objeto foram reduzidos em comparação com o peixe de controle

enquanto a expressão de citocinas pró-inflamatórias no cérebro foi regulada positivamente. Com

Neste estudo, demonstramos pela primeira vez que o sistema imunológico é capaz de

causando mudanças comportamentais que são consistentes com o comportamento doentio observado em

mamíferos.

Palavras-chave: Citocina, cérebro, sistema imunológico, comportamento social, comportamento exploratório

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1. Introdução

Zebrafish tem um sistema imunológico totalmente desenvolvido no qual a resposta imune inata é

a principal forma de defesa contra patógenos (Meeker e Trede 2008; Renshaw e

Trede 2012). Células imunes, receptores de reconhecimento de padrão (PRR), como toll-like

receptores (TLRs), defensinas e várias citocinas são semelhantes em estrutura e funções

aos mamíferos (Meeker e Trede 2008; Secombes, Wang e Bird 2011; Suarez

carmona et al. 2015). Sistema imunológico adaptativo teleósteo, embora primitivo quando

comparado aos mamíferos, é composto por linfócitos B que secretam pelo menos duas classes

de imunoglobulinas (IgM, IgZ) (Lagos et al. 2017) e linfócitos T com subconjuntos como

células T auxiliares, citotóxicas e reguladoras (Castro et al. 2011; Fischer, Koppang e

Nakanishi 2013; Nakanishi et ai. 2011; Renshaw e Trede 2012). Por causa disso, o

O uso do peixe-zebra como modelo de estudos translacionais de doenças humanas e animais tem

vem crescendo constantemente nos últimos anos.

Estudos recentes refutaram o dogma de que o sistema nervoso central é um

órgão imunológico privilegiado e indicou uma possível relação entre

sistema e comportamento em mamíferos (Kipnis 2018) e peixes (Lee et al. 2015; Rakus et al.

2017). De fato, distúrbios neurológicos como depressão, autismo e esquizofrenia são

associado à disfunção do sistema imunológico (Dantzer 2009; Dantzer et al. 2008;

Estes e McAllister 2015; Gibney e Drexhage 2013; Müller e Schwarz 2010;

Ross et ai. 2013). Além disso, estudos recentes indicaram que células e moléculas do

sistema imunológico estão envolvidos em funções neurológicas, como aprendizado, memória,

ansiedade e comportamento social (Derecki et al. 2010; Filiano et al. 2016; Moon et al. 2015;

Nautiyal et al. 2008). Além disso, quando o organismo é infectado por um patógeno, o

A ativação da resposta imune leva a um padrão de alterações comportamentais conhecido como

“comportamento de doença” (Kelley et al. 2003).

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O comportamento doentio é um conjunto de alterações comportamentais caracterizadas por letargia,

ansiedade, função fisiológica reduzida, como atividade locomotora, ingestão de alimentos,

desempenho reprodutivo, atividade exploratória e interação social (Dantzer e

Kelly 2007; Grossberg et ai. 2011; Haba et al. 2012; Hennesey, Deak e Schiml

2014; Kelley et ai. 2003). Este padrão de comportamento é tipicamente induzido por

infecções e/ou lesões teciduais, visando evitar que o organismo gaste energia

e se expondo a outros patógenos, facilitando o processo de cicatrização (Dantzer 2008;

Kelley et ai. 2003). Como os neurônios não possuem receptores para identificar patógenos, doenças

O comportamento é desencadeado por moléculas derivadas de células imunes, que estão implicadas como

moduladores potenciais da função cerebral (Ashley e Demas 2017; Dunn 2006).

Citocinas pró-inflamatórias como IL-1ÿ, IL-6 e TNF-ÿ são moléculas-chave neste

processo (Kelley et al. 2003) e durante a infecção sistêmica pode atingir o cérebro onde

eles promovem essas mudanças de comportamento (Dantzer et al. 2008). Comportamento de doença é bem

descritos em mamíferos, incluindo humanos, mas em peixes ainda não há dados suficientes para

caracterizam esse fenômeno (Johnson 2002).

Em um estudo anterior, mostramos a relação entre sistema imunológico e

comportamento em zebrafish (Kirsten et al. 2018). De acordo com seu comportamento exploratório, os peixes

respondedores altos à novidade (HRN), que não exploram um novo objeto no tanque de teste (ou seja,

neofóbico), expressam citocinas com um perfil pró-inflamatório (subregulado por IL-1ÿ e

IL-10 regulada para baixo) em comparação com peixes com baixa resposta à novidade (LRN) que exploram

um novo objeto no tanque de teste. Em relação ao seu comportamento social, peixes menos responsivos a

estímulos sociais têm uma expressão reduzida de INF-ÿ (Kirsten et al. 2018). Apesar disso, um

questão fundamental permaneceu sem resposta: é o sistema imunológico que leva a

diferentes padrões comportamentais ou é o padrão comportamental que altera o sistema imunológico

resposta? Aqui mostramos que a ativação sistêmica da célula imune pode levar a um padrão
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de alterações comportamentais que podem ser caracterizadas como um comportamento doentio, bem descrito

em mamíferos (Johnson 2002), mas ainda não totalmente caracterizado em peixe-zebra.

2. Materiais e métodos

2.1 Animais e Manutenção

Foram utilizados 72 peixes-zebra (Danio rerio) mistos, com 180 dias de idade, provenientes de nosso

população de estoque, que resulta do acasalamento de diferentes machos e fêmeas. os peixes eram

mantidos em um tanque maior em nosso sistema de aquário e depois transferidos para 24 tanques menores

(3 peixes por tanque) para um período de aclimatação de sete dias. Todos os tanques foram equipados com

filtros biológicos e mantidos sob fotoperíodo natural (14 h luz:10 h escuro). Água

a temperatura foi mantida a 27 ± 2 C°, as concentrações de oxigênio dissolvido em 6,0 ± 0,4

mg/L, pH 7,0 ± 0,25, e a concentração total de amônia era inferior a 0,5 mg/L. o

os peixes foram alimentados duas vezes ao dia com ração comercial em flocos, e a água estava sob constante

aeração. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)

da Universidade de Passo Fundo, Rio Grande do Sul, Brasil (Protocolo nº 008/2017-

CEUA) e atendeu às orientações do Conselho Nacional de Controle de Animais

Experimentação (CONCEA).

2.2 Estratégia de estudo

Avaliar as alterações comportamentais causadas pela ativação sistêmica do sistema imunológico

resposta, separamos o zebrafish em três grupos O grupo experimental chamado

sistema imunológico estimulado (SIS), em que uma resposta inflamatória foi induzida por

a inoculação de bacterina de Aeromonas hydrophila inativada com formalina , e dois controles

grupos: um inoculado com PBS estéril (controle inoculado – IC) e outro grupo que

não realizou nenhum procedimento (Controle Negativo - NC). As mudanças comportamentais foram
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avaliado pelo teste de tanque novo, teste de objeto novo e teste de preferência social, 24 horas

após o desafio imune (grupo SIS) e inoculação com PBS (grupo IC). Depois de

testes comportamentais, analisamos a expressão de genes de citocinas e marcadores de

atividade no cérebro dos peixes. Para uma melhor compreensão, um esquema da metodologia é

representada na figura 1.

Figura 1. Representação esquemática da metodologia utilizada para avaliação comportamental

alterações nos peixes.

2.3 Estimulação do sistema imunológico

Para estimular a resposta imune, os peixes foram anestesiados em Eugenol (Sigma

Aldrich, Brasil, 50 mg/L) e imediatamente inoculados com 50 ÿl de formalina 4x105

bacterina de Aeromonas hydrophila inativada (grupo SIS) misturada a 10% de montanídeo

adjuvante (Seppic, França) ou 50 µl de PBS estéril (grupo IC) usando um BD ultrafino

seringa de insulina 0,25 mm. O grupo NC não foi submetido a nenhum procedimento antes do

testes comportamentais.
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2.4 Avaliação dos parâmetros de comportamento

Os testes comportamentais foram realizados em todos os grupos de zebrafish 24 horas após a

procedimento de injeção. Os testes realizados foram: teste de tanque novo, no qual parâmetros de

locomoção e ansiedade foram avaliadas; teste de preferência social, para discriminar peixes

de acordo com sua resposta a estímulos sociais; e o teste do objeto novo, para avaliar sua

comportamento exploratório. O desempenho dos peixes durante os testes foi registrado por um

Câmera Logitech Quickcam PRO 9000 localizada na frente do tanque e os vídeos

analisados com o software ANY-maze® (Stoelting CO, EUA). Após cada teste, a água

do tanque foi completamente alterado antes de testar um novo peixe.

2.4.1 Teste de tanque novo e teste de preferência social

O teste do novo tanque e o teste de preferência social foram realizados em conjunto, com

doze peixes de cada grupo. O novo teste do tanque foi realizado primeiro e cada peixe foi

colocados no tanque de teste (24 × 8 × 20 cm; largura × profundidade × altura) que tinha ambas as laterais

laterais fechadas por divisória opaca posicionada entre os tanques, conforme indicado na

Figura 1, e seu comportamento foi registrado por 6 minutos. Os seguintes parâmetros foram

analisados: distância percorrida (m), velocidade média de natação (m/s), número de cruzamentos de linha,

ângulo de giro absoluto e tempo gasto no fundo e no topo do tanque de teste. Depois de

disso, as partições foram cuidadosamente removidas para o teste de preferência social: um lado da

o tanque de teste não tinha peixes e o outro lado tinha 15 coespecíficos de sexo misto. O comportamento dos peixes

foi registrado por 60 segundos para avaliar sua preferência pelo lado vazio ou coespecíficos.

Para a análise das imagens, o tanque de teste foi praticamente dividido em três segmentos verticais, 8

cm de largura e 6,5 cm de altura cada. O primeiro segmento foi o mais próximo dos coespecíficos,

enquanto o terceiro segmento estava próximo ao tanque vazio. O tempo relativo que o peixe-zebra passou em

o primeiro segmento foi calculado como resposta a estímulos sociais.

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2.4.2 Novo teste de objeto

Doze peixes de cada grupo foram testados para determinar sua capacidade de resposta a

novidade, de acordo com o protocolo que publicamos recentemente (Kirsten et al. 2018). cada peixe

foi transferido individualmente para o tanque de teste (24 × 8 × 20 cm; largura × profundidade × altura),

que continham um objeto em cada extremidade (quadrados plásticos azuis e verdes medindo

4 × 4 cm). Um dos objetos estava coberto por uma divisória opaca próxima à extremidade

e não podia ser visto pelos peixes. O peixe foi introduzido no tanque e por 24

minutos estava em contato com apenas um objeto. Em seguida, a partição foi removida e os peixes

teve acesso ao “novo objeto” e seu comportamento foi registrado por 6 minutos. A cor

do novo objeto (azul ou verde) variou em cada teste. Para a análise, o tanque de teste foi

virtualmente dividido em seis segmentos e o tempo gasto no segmento do novo objeto

foi avaliado.

2.5 Eutanásia e extração cerebral

Imediatamente após a realização dos testes comportamentais, cada peixe foi anestesiado

com Eugenol e sacrificados por secção da medula espinhal. Em seguida, cada peixe foi

embalados separadamente em microtubos, congelados em nitrogênio líquido por 30 segundos e armazenados em

ÿ80 °C. Para a extração do cérebro, o crânio foi aberto, os nervos cranianos cortados e o

cérebro cuidadosamente removido (Vargas et al. 2011).

2.6 Extração de RNA, síntese de DNA e análises de expressão gênica

Como nos testes comportamentais os grupos IC e NC não apresentaram diferenças,

avaliamos a expressão gênica dos grupos SIS e IC.

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Devido ao pequeno tamanho do zebrafish, três cérebros de peixes do mesmo grupo foram

agrupados aleatoriamente e usados para extração de RNA total, totalizando seis amostras de RNA por

grupo. A lise tecidual foi realizada no Tissuelyser LT® (Qiagen, Brasil). RNA era

extraída com o RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Brasil) e o DNA genômico foi para eliminar

por tratamento de grau de amplificação de DNAse I (Invitrogen, EUA) A concentração de RNA

e a qualidade foi medida por espectrofotometria (Nanophotometer Pearl®, Implen,

Alemanha) e armazenado a -80 °C. A síntese de cDNA foi feita usando 500 ÿg de

RNA, usando o Kit de Síntese de cDNA de Primeira Cadeia de RNAse H Minus NextGeneration MMLV

(DNA expresso) e primers aleatórios.

Para análise da expressão gênica, foi realizada PCR em tempo real (qPCR) em um Rotor

equipamento gene Q (Qiagen) usando NextGeneration ECO SYBR Green HotStart qPCR

Kit (DNA express), primers específicos e cDNA (diluído 1:10). Os genes analisados,

seus respectivos primers e a eficiência de cada reação são indicados na Tabela 1. Não

controles modelo e a expressão de um gene de limpeza (ÿ-actina) também foram

analisados para fins de comparação. Todas as amostras foram realizadas em triplicado. Para o

curva de calibração, cada gene foi clonado no pGEM-TEasy Vector System

(Promega) e transformado em E. coli One Shot TOP10 competente (Promega) e

cultivadas em LB suplementadas com ampicilina. A clonagem foi confirmada por PCR e o

O plasmídeo resultante foi extraído usando a purificação de DNA de minipreps Wizard Plus SV

sistema (Promega). Em seguida, a curva de calibração consistiu em diluições decimais (1:10) de

cada gene clonado. Para comparar melhor os resultados de diferentes grupos, o mesmo

valor limite (0,100) foi usado. A quantificação relativa da expressão gênica foi

realizada pela fórmula 2ÿÿÿct (Rao et al. 2013).

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Gene Primer (5'- 3') Adesão de Eficiência

número

ÿ-Actina F: GCAAAGGGAGGTAGTTGTCTAA 104% AF057040.1

R: GAGGAGGGCCAAAGTGGTAAA

cFOS F: CAGCTCCACCACAGTGAAGA 104% DQ003339.2

R: GCTCCAGGTCAGTGTTAGCC

BDNF F: CGCCGTTACTCTTTCTCTTGG 96% NM_001308648.

R: CCATTAGTCACGGGGACCTTC 1

TNF-ÿ F: GACCACAGCACTTCTACCG 95% NM_212859

R: ACATTTTCCTCACTTTCGTTCAC

IL-1ÿ F: GCTGGAGATGTGGACTTC 101% NM_212844

R: ACTCTGTGGATTGGGGTTTG

INF-ÿ F: TGCCTCAAATGGTGCTACTC 98% AB158361.1

R: AATCGGGTTCTCGCTCCTG

IL-4 F: TCTCTGCCAAGCAGGAATG 100% AM403245.2

R: CAGTTTCCAGTCCCGGTATATG

IL-10 F: CTCTGCTCACGCTTCTTCTT 105% BC163038.1

R: GCTCCCTCAGTCTTAAAGGAAA

IL-6 F: GCGTCCTGACGTGGTATAAAG 96% NM_001261449.

R: GTCGTTTGGTGCTGTGTTTG 1

IL-12 F: CTGTAGGATCCATCCAAAACATCT 104% AB183002.1

R: CACTGGCACTTCTACCCTATTT

Tabela 1: primers qPCR

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2.7 Análises estatísticas

Para a análise dos fenótipos comportamentais, primeiro comparamos os dados do IC

e grupos NC pelo teste t de Student ou pelo teste de Mann-Whitney (dependendo dos dados

normalidade avaliada pelo teste de Bartlett) e verificamos que não houve

diferença entre os grupos em qualquer um dos testes comportamentais. Então nós comparamos o

agrupar SIS com IC pelos mesmos testes. As análises de expressão gênica também foram

realizada pelo teste t de Student ou por Mann-Whitney. Em todos os experimentos, P foi fixado em

<0,05.

3. Resultados

É importante ressaltar que todos os peixes do grupo SIS apresentaram lesões de pele na

local de inoculação, confirmando a ocorrência de uma resposta inflamatória. O grupo CI

não apresentou lesão após a inoculação.

3.1 Parâmetros de comportamento

Não houve diferença estatística entre os grupos NC e IC em nenhum dos

testes comportamentais (tabela 2). Assim, comparamos os resultados dos testes comportamentais e

expressão gênica dos grupos IC e SIS.

No novo tanque de teste, os peixes do grupo SIS percorreram uma distância menor

(p=0,03), apresentou menor velocidade média (p=0,01) e menor número de giros angulares (p=0,02).

Os demais parâmetros avaliados não diferiram significativamente entre os grupos (figura

2.A).

O teste de preferência social demonstrou que os peixes do grupo SIS gastaram menos

tempo próximo ao coespecífico (p<0,0001) e mais tempo no segmento oposto (p=0,002)

(figura 2.B).
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No novo objeto de teste, os peixes do grupo SIS passaram menos tempo explorando o novo

objeto (p=0,004) e demorou mais para entrar na zona do novo objeto (p=0,04) (figura

2.C).

Parâmetros NC CI p

Distância percorrida (m)1 18,06 ± 2,401 16,43 ± 1,897 0,59

Velocidade média (m/s)1 0,005 ± 0,0006 0,0045 ± 0,0005 0,43

Cruzamento de linha1 127,3 ± 28,14 117,4 ± 18,33 0,77

Ângulo de giro1 48764 ± 7362 54619 ± 6465 0,55

Tempo no(s) fundo(s)1 230,3 ± 20,86 251,8 ± 16,91 0,43

Tempo no(s) topo(s)1 46,65 ± 9,054 28,30 ± 6,645 0,11

Tempo no conspecífico
41,38 ± 5,03 43,52 ± 5,78 0,78

segmento(s)2

Tempo ao contrário
5,382 ± 1,93 3.318 ± 1.827 0,44

segmento(s) coespecífico(s)2

O tempo no objeto romance

38,39 ± 11,56 27,69 ± 11,53 0,52

zona(s)3

Latência para entrar no

69,67 ± 28,14 85,23 ± 32,44 0,72

nova(s) zona(s) de objeto 3

Tabela 2. Testes comportamentais dos grupos NC e IC. Os dados são expressos como a média ±

SEM. Na primeira coluna: 1. Teste de tanque novo; 2. Teste de preferência social; 3. Novo objeto

teste. P <0,05 foi significativo.

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Figura 2. Testes dos parâmetros comportamentais dos peixes dos grupos IC e SIS. (A) Novo tanque

teste (B), teste de preferência social e (C) teste de objeto novo. Cada dado representa a média

± SEM ou mediana ± intervalo interquartílico, dependendo da normalidade dos dados avaliada pelo

**
Teste de Barlett. Diferenças significativas são indicadas por asterisco (*p < 0,05; p < 0,01;

*** p < 0,001).

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3.2 Análises de expressão gênica

Os níveis de mRNA das citocinas pró-inflamatórias IL-1ÿ, IL-6 e TNF-ÿ

foram superexpressos no cérebro de peixes do grupo SIS (p < 0,01). Insignificante

diferenças foram encontradas nos níveis de mRNA das outras citocinas testadas, bem como em

a expressão dos genes BDNF e cFOS (figura 3).

Figura 3. Análises de expressão gênica no cérebro de peixes dos grupos IC e SIS.

Cada dado representa a média ± SEM ou mediana ± intervalo interquartílico, dependendo do

normalidade dos dados avaliada pelo teste de Bartlett. Diferenças significativas são indicadas por

asterisco (** p < 0,01).

4. Discussão
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Recentemente, descrevemos a relação entre comportamento e sistema imunológico em

peixe-zebra (Kirsten et al. 2018). A partir desse estudo, nos perguntamos se é o sistema imunológico

sistema que leva a diferentes padrões de comportamento ou é o padrão de comportamento que altera

a resposta imune? Para abordar este assunto realizamos estudos com bacterina

peixes-zebra injetados que foram então usados em testes de comportamento. Usamos peixes machos e fêmeas

selecionados aleatoriamente de nosso estoque que não foram previamente avaliados quanto

características de aclimatação ou comportamento. Em nossas mãos (dados inéditos), sociais e

o comportamento exploratório é semelhante entre homens e mulheres; assim, os resultados que encontramos

não são influenciados pelo gênero do peixe. Além disso, devido ao pequeno tamanho do peixe-zebra e à

dificuldades em obter sangue suficiente para avaliar as citocinas circulantes, optamos por

avaliar os níveis de mRNA de citocinas por qPCR. No entanto, isso não diminui a força

de nossos dados em que a medição dos níveis de mRNA de citocinas tem sido amplamente utilizada para

avaliar a ativação do sistema imunológico em várias espécies, incluindo peixes (Grossberg et al.

2011; Kelley et ai. 2003; Krishnananthasivam et al. 2017; Vojtech et ai. 2009) Nossos dados

indicam que o comportamento dos peixes muda paralelamente à ativação de uma resposta imune sistêmica,

reforçando nossa hipótese anterior de que o sistema imunológico modula o comportamento

(Kirsten et al. 2018).

Para estimular uma resposta imune inflamatória, usamos um inativado por formalina

bactéria gram-negativa (A. hydrophila) geralmente associada a doenças hemorrágicas

septicemia em peixes (Rodríguez, Novoa e Figueras 2008). A quantidade de bactérias usadas

por peixe foi equivalente ao LC50 de A. hydrophila para zebrafish (Rodríguez et al.

2008). Além disso, para potencializar a resposta imune, a bactéria foi misturada com

Montanide (10% v/v) que é amplamente utilizado como adjuvante vacinal em espécies de aquicultura

(Håstein, Gudding e Evensen 2005; Lagos et al. 2017; Pavan et al. 2016). Porque

este é um estudo pioneiro com o objetivo de investigar possíveis alterações comportamentais induzidas por
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ativação das células imunes, optamos por avaliar todos os parâmetros (comportamentais e

imunológico) em um único momento (24h após a inoculação) em que

a ativação, aqui determinada pela expressão de genes de citocinas, estaria em nível superior,

conforme relatado anteriormente (Lagos et al., 2017). Assim, o peixe-zebra inoculado

intraperitonealmente com a bacterina teve uma resposta inflamatória sistêmica que alterou a

expressão do gene das citocinas no cérebro e isso levou a alterações no comportamento

parâmetros como redução da distância percorrida, velocidade média e número de ângulos

se transforma no novo teste de tanque, preferência social e comportamento exploratório para um novo objeto.

Padrão semelhante de mudanças comportamentais caracteriza o comportamento de doença, bem

descrito em mamíferos, principalmente roedores (Frenois et al. 2007; Haba et al. 2012; Layé et al.

2000) e humanos (Dantzer et al. 2008; Johnson 2002; Kipnis 2018), mas não totalmente

caracterizado em peixes (Lee et al. 2015; Rakus et al. 2017).

O comportamento de doença é uma resposta adaptativa bem organizada para aumentar a doença

resistência e facilitar a recuperação (Johnson 2002). As mudanças comportamentais encontradas neste

estudo, como redução da atividade locomotora, redução da preferência social e

exploração de um novo objeto são característicos do comportamento doentio dos roedores (Gaykema

e Goehler 2011; Grossberg et ai. 2011; Kelley et ai. 2003). Redução do locomotor

atividade ocorre para redistribuir as prioridades fisiológicas para combater a infecção e

minimizar o gasto de energia (Grossberg et al. 2011). Reforçando nossa hipótese,

zebrafish mostrou uma redução na atividade locomotora um dia após a infecção bacteriana (Lee et

al. 2015).

Peixes imunoestimulados apresentaram grande redução de preferência social, gasto

muito menos tempo no segmento próximo ao peixe coespecífico quando comparado ao sadio

animais. A interação social e o convívio com membros da mesma espécie potencializam a disseminação de

patógenos (Filby et al. 2010; Kelley et al. 2003). No entanto, a detecção de patógenos
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por células imunes alerta o sistema nervoso central que por sua vez reduz o comportamento social

e responsivo ao coespecífico, provavelmente como um mecanismo de autoproteção e como um

ferramenta evolutiva para preservar o cardume. Zebrafish é uma espécie social exibindo uma alta

preferência por estar perto de coespecíficos (Saverino e Gerlai 2008). Baseado nisso

comportamento altamente social do zebrafish, a redução da interação social é uma ferramenta sensível

para avaliar o comportamento doentio.

Em relação ao comportamento exploratório, os peixes SIS apresentaram uma redução significativa no

tempo gasto explorando um novo objeto. A atividade exploratória reduzida é uma característica de

comportamento doentio em mamíferos e atuam como um mecanismo de defesa para reduzir o risco de

predação, gasto de energia e exposição a outros patógenos (Bourke 2014). Na verdade,

peixes classificados como altamente responsivos à novidade (ou seja, neofóbicos) apresentaram maior

expressão de citocinas pró-inflamatórias (Kirsten et al. 2018), corroborando a

hipótese de que a resposta inflamatória reduz o perfil exploratório no

peixe-zebra.

O sistema imunológico se comunica com o cérebro secretando moléculas conhecidas

como citocinas (Dunn 2006). Na ausência de patógenos, a injeção periférica de

citocinas pró-inflamatórias causam as clássicas mudanças comportamentais do comportamento doentio

em roedores (Dantzer 2009). Aqui, o aumento da expressão de IL-1ÿ, TNF-ÿ e IL-6 em

peixes do grupo SIS, uma demonstração clara de que um processo inflamatório está em curso,

levam a alterações na expressão de genes imunes no cérebro, como demonstrado também

em mamíferos (Dunn 2006). Entre as citocinas, a IL-1ÿ sozinha pode desencadear doenças

comportamento, enquanto IL-6 e TNF-ÿ atuam potencializando os efeitos da IL-1ÿ (Dantzer 2009; Layé

e outros 2000)

Uma vez aceito que o sistema imunológico pode induzir

alterações usando citocinas como moléculas comunicantes, a questão é como isso

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acontecer? Avaliamos a expressão do fator de crescimento nervoso derivado do cérebro

fator neurotrófico (BDNF) e genes marcadores neuronais cFOS, mas eles foram semelhantes em

ambos os grupos. Alguns estudos relataram que aumentos de IL-1ÿ no hipocampo

diminui o BDNF no cérebro de ratos idosos e leva a um déficit de sinapse de longa duração

plasticidade (Cortese et al. 2011; Prieto et al. 2015); em peixe-zebra, níveis de mRNA de BDNF

e cFOS não foram alterados pela ativação imune sistêmica.

Além disso, a interação do sistema imunológico e do comportamento está sendo

investigado em diversas disfunções neurológicas como depressão e autismo

(Dantzer 2009; Estes e McAllister 2015; Gibney e Drexhage 2013; Meshalkina et

al. 2018; Oglodek et al. 2014). Assim, a caracterização do comportamento doentio em

peixe-zebra pode constituir um potencial modelo animal para estudos envolvendo o sistema imunológico

e distúrbios neurológicos. Embora o comportamento específico varie de espécie para

espécies, o comportamento doentio parece ser conservado entre todos os vertebrados (Hart 1988).

Tanto quanto sabemos, aqui demonstramos pela primeira vez a doença

comportamento em zebrafish, com atividade locomotora reduzida característica, preferência social

e exploração de um novo objeto após a ativação da resposta imune. Doença

comportamento é classicamente causado por patógenos, mas outras condições, como estresse e

contaminantes ambientais que causam distúrbios imunológicos podem levar a esse comportamento

padronizar. Numa perspectiva ecológica, o comportamento de doença tem um impacto negativo nos peixes

indivíduos, pois mudanças como a redução da interação social tornam os peixes mais

suscetível a predadores e tem um impacto negativo na reprodução, reduz a

atividades e a busca por alimentos. No entanto, do ponto de vista populacional, a doença

comportamento ocorre para melhorar a sobrevivência, reduzindo/bloqueando a propagação do patógeno entre

a população.
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Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Reconhecimentos

Este estudo foi financiado pela Universidade de Passo Fundo e pela Secretaria de

Desenvolvimento Econômico, Ciência e Tecnologia (SDECT). LJGB e LCK

bolsistas de pesquisa do CNPq (301992/2014-2 e 307900/2016-9, respectivamente). o

os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou

preparação do manuscrito.

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Destaques

* Após uma resposta inflamatória, o peixe-zebra reduz a locomoção, a interação social e a exploração.

* As citocinas pró-inflamatórias são reguladas positivamente no cérebro do peixe-zebra após um

processo inflamatório na periferia.

* O sistema imunológico causando mudanças de comportamento no peixe-zebra