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Revista Internacional de
Ciências Moleculares

Artigo

Lactobacillus plantarum DR7 Intestino Modulado

Movimento e microbiota intestinal associados a
Vias de dopamina e serotonina em adultos estressados
Guoxia Liu 1, Hui Xian Chong 2
, Fiona Yi-Li Chung2, Yin Li 1,* e Min-Tze Liong 2,*

1
Laboratório Chave CAS de Engenharia Fisiológica e Metabólica Microbiana, Laboratório Chave Estadual de Recursos
Microbianos, Instituto de Microbiologia, Academia Chinesa de Ciências, Pequim 100101, China; liuguoxia@im.ac.cn Escola de
Tecnologia Industrial,
2
Universiti Sains Malaysia, Penang 11800, Malásia; huixian1126@gmail.com (H.-XC); fionacyl@outlook.com
(FY-LC)
* Correspondência: yli@im.ac.cn (YL); mintze.liong@usm.my (M.-TL); Tel.: +86-10-6480-7485 (YL);
+604-653-2114 (M.-TL); Fax: +86-10-6480-7468 (YL); +604-653-6375 (M.-TL)

Recebido: 18 de maio de 2020; Aceito: 23 de junho de 2020; Publicado: 29 de junho de 2020

Resumo: Relatamos anteriormente que a administração de Lactobacillus plantarum DR7 por 12

semanas reduziu o estresse e a ansiedade em adultos estressados em comparação ao grupo placebo,
em associação com alterações nas vias dos neurotransmissores cerebrais serotonina e dopamina-norepinefrina.
Nosso objetivo agora é avaliar os efeitos do DR7 nas funções intestinais, nas alterações na composição da microbiota
intestinal e determinar as correlações entre as alterações da microbiota e as vias dos neurotransmissores cerebrais.
A administração de DR7 evitou um aumento da frequência de defecação ao longo de 12 semanas em
comparação com o placebo (p = 0,044), modulando o aumento da evacuação induzida por estresse. Ao
longo de 12 semanas, a diversidade alfa da microbiota intestinal foi maior no DR7 do que no grupo
placebo em todos os níveis de classe (p = 0,005) e ordem (p = 0,018), enquanto a diversidade beta
diferiu entre os grupos nos níveis de classe e ordem (p < 0,001). Foram identificadas diferenças em
grupos bacterianos específicos, mostrando consistência em diferentes níveis taxonômicos que
sobreviveram à correção de multiplicidade, ao longo dos filos de Bacteroides e Firmicutes e ao longo
das classes de Deltaproteobacteria e Actinobacteria. Bacteroidetes, Bacteroidia e Bacteroidales que
foram reduzidos em abundância no grupo placebo mostraram correlação oposta com a expressão
gênica da dopamina beta hidrolase (DBH, via da dopamina; p <0,001), enquanto Bacteroidia e
Bacteroidales mostraram correlação com triptofano hidroxilase-II (TPH2, via da serotonina ; p = 0,001).
Foi observada correlação entre DAP e Firmicutes (p = 0,002), Clostridia (p < 0,001), Clostridiales (p =
0,001), Blautia (p < 0,001) e Romboutsia (p < 0,001), que aumentaram em abundância no grupo placebo.
Blautia também foi associada ao TDO (p = 0,001), enquanto Romboutsia teve correlação oposta com
TPH2 (p < 0,001). Deltaproteobacteria e Desulfovibrionales que estavam diminuídas em abundância no
grupo placebo mostraram correlação oposta com DAP (p = 0,001), enquanto Bilophila foi associada
com TPH2 (p = 0,001). Nossos dados atuais mostraram que alterações fisiológicas induzidas por L.
plantarum DR7 poderiam estar associadas a alterações em táxons específicos da microbiota intestinal ao longo das vias d

Palavras-chave: Lactobacillus plantarum; probiótico; microbiota; estresse; serotonina; dopamina; ensaio clínico

1. Introdução

Os sintomas do estresse afetam a anatomia humana além das percepções psicológicas. A crescente
conscientização dos consumidores sobre a saúde levou a uma melhor caracterização e compreensão do estresse,
tanto na etiologia quanto nas consequências. Uma das alterações corporais mais amplamente relatadas como
influenciadas pelo estresse inclui funções gastrointestinais, onde sintomas de azia, indigestão, náuseas e vômitos,

Internacional J. Mol. Ciência. 2020, 21, 4608; doi:10.3390/ijms21134608 www.mdpi.com/journal/ijms

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Internacional J. Mol. Ciência. 2020, 21, 4608 2 de 16

movimentos intestinais e dores abdominais aumentam em meio ao estresse. Avanços recentes no perfil da microbiota
intestinal reuniram muitas evidências de que esses habitantes intestinais desempenham papéis importantes na
sinalização e respostas fisiológicas do hospedeiro, incluindo condições psiquiátricas ao longo do eixo intestino-cérebro.
Evidências crescentes sugerem que componentes celulares microbianos e metabólitos da complexa microbiota
intestinal podem influenciar as funções cerebrais através de vias neuroimunes e neuroendócrinas, bem como o sistema
nervoso, enquanto diferenças na diversidade microbiana e composições taxonômicas foram observadas entre
indivíduos estressados e controle [1]. Embora a microbiota intestinal mude com o crescimento, atribuída principalmente
a fatores externos como ambiente, modo de parto, dieta e estilos de vida, a disbiose também ocorre após alterações
nas condições de saúde, como distúrbios intestinais e doenças inflamatórias e metabólicas [2]. Sugere-se assim que a
modulação da microbiota intestinal é crucial para um bem-estar geral mais saudável, incluindo o da saúde mental.

Os probióticos são “microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem
benefícios à saúde do hospedeiro” [3]. Lactobacillus continua sendo um dos gêneros probióticos mais comumente
administrados, com uma longa história de uso seguro e documentação abrangente sobre a saúde intestinal e
propriedades protetoras antimicrobianas [4]. Evidências crescentes têm mostrado o potencial dos probióticos como um
agente natural para influenciar a saúde do cérebro e o bem-estar psicológico. Comportamentos ansiolíticos e
semelhantes a antidepressivos foram observados em camundongos administrados com Lactobacillus rhamnosus,
enquanto a resposta exagerada ao estresse hipotálamo-hipófise-adrenal em camundongos livres de germes foi
parcialmente revertida após o consumo oral de Bifidobacterium infantis [5]. Embora os comportamentos semelhantes
à depressão em um modelo de rato tenham sido revertidos após a administração de Bifidobacterium infantis [6],
estudos sobre a associação de transtornos depressivos maiores (TDM) com a microbiota intestinal revelaram que os
pacientes com TDM apresentaram uma abundância menor de Bifidobacterium e Lactobacillus intestinais do que controles saudáveis [7].
Já relatamos anteriormente o uso de Lactobacillus plantarum DR7 (agora Lactoplantibacillus plantarum
DR7 [8]) no alívio do estresse e da ansiedade em adultos estressados, acompanhado por melhores
características de memória e cognição, como atenção básica, cognição emocional e aprendizagem
associada. em comparação com o grupo placebo [9]. DR7 foi administrado em um estudo randomizado,
duplo-cego e controlado por placebo, onde os níveis plasmáticos de cortisol foram reduzidos acompanhados
por redução de citocinas pró-inflamatórias plasmáticas, como interferon-ÿ (IFN- ÿ) e fator de necrose tumoral-
ÿ (TNF). -ÿ) e aumento de citocinas antiinflamatórias plasmáticas, como a interleucina-10 (IL-10), em comparação com o placeb
A análise da expressão gênica plasmática revelou que o DR7 exerceu esses efeitos psicológicos ao longo da via dos
neurotransmissores cerebrais da síntese da serotonina a partir do triptofano e da via dopamina-norepinefrina. O estudo
começou durante o período do final do ano de 2017 na Península Oriental da Malásia, que também correspondeu ao
período da estação anual das monções, durante 12 semanas, que coincidiu com o rescaldo de uma inundação. Durante
as monções de 2017, ocorreu uma enorme inundação na Península Oriental da Malásia, afectando mais de 14.000
indivíduos e deslocando mais de 2.000 casas onde famílias estavam alojadas em abrigos [10], atribuída ao aumento
das chuvas em Novembro e Dezembro de 2017. Também já reportámos anteriormente que essas estações de
monções e enchentes impuseram grande estresse, disbiose intestinal e distúrbios abdominais nas vítimas das
enchentes e nas comunidades em geral da Península Oriental da Malásia [11].
Considerando que o eixo intestino-cérebro é bidirecional enquanto os probióticos são administrados por via oral
para chegar ao intestino, nosso objetivo foi avaliar e compreender melhor os efeitos do DR7 nos distúrbios intestinais
e nas alterações na composição da microbiota intestinal. Mais importante ainda, pretendemos determinar as relações
potenciais entre as alterações da microbiota e as vias dos neurotransmissores cerebrais que levaram a melhores
efeitos psicológicos em indivíduos estressados, conforme relatado anteriormente [9].

2. Resultados e Discussão

2.1. Linha de base

Como continuação de um estudo anterior, as características gerais de todos os sujeitos foram as relatadas
anteriormente, onde os sujeitos de ambos os grupos preencheram os critérios de inclusão de moderadamente
estressados, e diferenças insignificantes foram observadas na maioria das características gerais e demográficas
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2.1. Linha de base

Como continuação de um estudo anterior, as características gerais de todos os sujeitos foram as relatadas anteriormente, onde
osdiferenças
e sujeitos de 3 de 16
ambos os grupos preencheram os critérios de inclusão de moderadamente Int. J. Mol. Ciência. 2020, 21, 4608 enfatizaram,
insignificantes
foram observadas na maioria das características gerais e demográficas entre os grupos placebo e DR7 [9]. Um total de 124 indivíduos
foram avaliados entre os grupos placebo e DR7 [9]. Um total de 124 indivíduos foram avaliados quanto à elegibilidade, recrutados,
elegibilidade, recrutados e randomizados no grupo placebo ou DR7 (Figura 1). Um total
de 13 e randomizados
os indivíduos no grupo
desistiram durante placebo
o período ousemanas,
de 12 DR7 (Figura 1). Um
seja devido totalno
à falha derastreamento
13 sujeitos ou
desistiram
não
cumpriram
respondendo durante o período dede
ao questionário 12saúde
semanas, seja devido
intestinal, à falhaem
resultando no rastreamento ou não
um total de 111 cumpriram
indivíduos (n =a55
resposta
para ao intestino
placebo
para DR7). Nenhum efeito adverso foi reportado. Foram relatados um total de 44 indivíduos do grupo=placebo
en = 56 questionário de saúde, resultando em um total de 111 indivíduos (n = 55 para placebo en 56 para DR7). Não
e 55 de efeitos adversos. Um total de 44 indivíduos do grupo placebo e 55 do grupo DR7
o grupo DR7 forneceu conjuntos completos de amostras fecais, rendendo um total de 99 conjuntos completos
de amostras fecais fornecidas, rendendo um total de 99 conjuntos completos de amostras fecais.
conjuntos de amostras.

Avaliado quanto à
Inscrição
elegibilidade (n = 124)

Excluído (n = 0)

Randomizado (n = 124)

Alocação
Alocado para o grupo placebo (n = 62) Alocado no grupo DR7 (n = 62)

Seguir

Perda de acompanhamento (falha no rastreamento) (n = 2) Perda de acompanhamento (falha no rastreamento) (n = 3)

Intervenção descontinuada com dados incompletos Intervenção descontinuada com dados incompletos
(n = 5) (n = 3)

Análise
Analisados para questionários (n = 55): < Analisado para questionários (n = 56) <
idade 30 anos: n = 32 > idade idade 30 anos: n = 27 > idade
30 anos: n = 23 30 anos: n = 29

Amostras fecais fornecidas (n = 44): < Amostras fecais fornecidas (n = 55): <
idade 30 anos: n =28 > idade idade 30 anos: n = 26 > idade
30 anos: n =16 30 anos: n = 29

Figura 1. Fluxograma derecrutamento

Fluxograma de recrutamentododo Consorte
Consorte para
para ambos
ambos os grupos
os grupos de intervenção.
de intervenção.

2.2. Resultado Clínico

2.2. Resultado Clínico Gastrointestinal
Gastrointestinal

O questionáriogastrointestinal
O questionário gastrointestinalfoi foi desenvolvido
desenvolvido parapara avaliar
avaliar diversos
diversos parâmetros
parâmetros envolvendo
envolvendo
frequência
frequênciadededefecação
defecaçãoe esintomas gastrointestinais
sintomas diretos
gastrointestinais e indiretos,
diretos o que o
e indiretos, é que
relevante para o para o uso neste
é relevante
estudo. Foi relatado que desastres naturais como inundações e monções afectam frequentemente
saúde gastrointestinal, atribuída a mudanças nas dietas, estilos de vida, disponibilidade de abastecimento de água potável,
e maior propagação de doenças infecciosas em abrigos e centros de evacuação [11]. Embora as monções
e as tempestades costeiras muitas vezes aumentam a incidência de diarreia atribuída a um saneamento precário e
água contaminada, também foi relatado que a diarreia infecciosa aumenta após as inundações [12]. As incidências
 não. . outubro de 2020, , x; ó: www.mp.comournams
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neste estudo. Foi relatado que desastres naturais como inundações e monções frequentemente afetam a saúde
gastrointestinal, atribuídos a mudanças nas dietas, estilos de vida, disponibilidade de abastecimento de água potável e
maior propagação de doenças infecciosas em abrigos e centros de evacuação [11]. Embora as monções e as tempestades
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costeiras aumentem frequentemente a incidência de diarreia atribuída a um saneamento deficiente e à água contaminada,
também foi relatado que a diarreia infecciosa aumenta após as cheias [12]. As incidências de diarreia foram relatadas por
indivíduos nos grupos placebo e DR7 no presente estudo.
estudo,
embora umaembora tenha
diferença sido observada
insignificante uma diferença
na frequência insignificante
tenha sido na frequência
observada entre entre
os grupos ao os de
longo grupos ao longo
12 semanas de 12 semanas
(dados
(dados
não não mostrados).
mostrados). Em meio
Em meio a isso, a isso, a administração
a administração de DR7
de DR7 diminuiu diminuiu
a frequência deadefecação
frequênciaem
detodos
defecação em todos os casos
os indivíduos
indivíduos
em em com
comparação comparação
o placebocom
apósoaplacebo
semana após a semana
12 (Figura 12 (Figura
2A). Isto pode ser2A). Isto pode
explicado ser explicado
através da modulação
efeitos moduladores
o aumento da evacuaçãodo DR7
e da contra o desencadeados
defecação, aumento da evacuação e danervoso
pelo sistema defecação, desencadeados pelos efeitos do DR7 contra
central
sistema nervoso central (SNC) sob estresse. O estresse afeta os mecanismos regulatórios
(SNC) ao estresse. O estresse afeta os mecanismos regulatórios e as respostas do SNC, levando e as respostas do sistema
do SNC, levando
estimulada do cólon,àaumento
atividade motora
dos estimulada
movimentos do cólon,
intestinais aumento dos movimentos
e, subsequentemente, aumento intestinais e à atividade motora
posteriormente,
significativa aumento
de defecação daAssim,
[13]. frequência deodefecação
embora [13]. exercido
DR7 não tenha Assim, embora o significativo
um efeito DR7 não tenha exercido
de redução dauma frequência
diarreia, tal como
efeito
com de redução
o placebo, da diarreiade
a administração emDR7
comparação com omovimentos
pode ter aliviado placebo, a administração de DR7 pode ter aliviado em comparação
intestinais desnecessários
movimentos intestinais desnecessários
estresse. como induzido pelo estresse. induzidos pelo

Figura 2. Alterações nos resultados clínicos gastrointestinais após 12 semanas de administração de Lactobacillus
Figura 2. Alterações
Lactobacillus plantarumnos
DR7resultados clínicos
em comparação gastrointestinais
com o grupo placeboapós 12todos
em (A) semanas de administração
os indivíduos, dejovens (com idade <30 anos
(B) adultos
plantarum
(com idade <30DR7anos
em comparação
) e (C) adultoscom o grupo
normais (complacebo emanos).
idade> 30 (A) todos os indivíduos,
Os sintomas (B) adultos
gastrointestinais jovens
diretos incluíram vômitos,
idade) e (C) adultos normais (idade >30 anos). Os sintomas gastrointestinais diretos incluíam
disenteria (sangue nas fezes), dor abdominal, náusea e dor retal (forte e opaca, queimação, sensação devômitos,
disenteria
duro no reto);(sangue
sintomasnas fezes), dor abdominal,
gastrointestinais náusea perda
indiretos incluíram e dor de
retal (aguda,
apetite, opaca, ardente, parece um objeto
fadiga,
objetodesidratação
cabeça, duro no reto); os sintomas
e febre; gastrointestinais
O número indiretos
de vezes de defecação foi incluíram perda
calculado com de apetite,
base em um fadiga, tontura, dor de
Ostontura,
valores dor
de pde cabeça,adesidratação
indicaram e febre;
diferença entre o número
os grupos de vezes
de tratamento emde defecação
momentos foi calculado com base semanal.
individuais.
Ossemanalmente. Os valorescomo
resultados são expressos de p média,
indicaram a diferença
barras entre nos= grupos
de erro (SEM); dentratamento
111 (DR7 em momentos
= 56 e placebo n = 55). individuais.
Os resultados são expressos como média, barras de erro (SEM); n = 111 (DR7 n = 56 e placebo n = 55).
Relatamos anteriormente que a administração de DR7 foi mais eficaz na redução
sintomas de estresse e níveis plasmáticos de cortisol em adultos jovens em comparação com o placebo, enquanto
tal efeito foi menos observado em adultos normais [9]. Assim, na presente avaliação, também temos
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avaliaram sintomas clínicos gastrointestinais em ambos os subgrupos. Embora a administração de DR7 não
tenha mostrado quaisquer efeitos significativos contra distúrbios gastrointestinais em adultos normais com
idade superior a 30 anos, adultos jovens com menos de 30 anos pareceram beneficiar-se da administração
de DR7, onde foram observadas durações diminuídas para sintomas gastrointestinais diretos e indiretos. em
comparação com o grupo placebo já na semana 4 e continuamente até a semana 12 (Figura 2B,C). A
resposta a estressores relacionados à dor ou ao desconforto geralmente aumenta a secreção de cortisol,
levando a uma resposta sensibilizada ao estresse fisiológico. Para facilitar a consolidação do medo pela
sobrevivência e evitar o perigo, as reservas de glicose são mobilizadas para energia e modulação da inflamação pelo cortisol [14
As reduções nos sintomas gastrointestinais diretos e indiretos levaram à redução dos níveis de desconforto e,
posteriormente, à redução dos níveis de estresse e cortisol em adultos mais jovens.

2.3. Diversidade Alfa/Beta

A diversidade alfa mede diferenças dentro das amostras. O Índice Chao1 fornece uma medida da diversidade
alfa em termos de “riqueza” da unidade taxonômica operacional (OUT), levando igualmente em consideração OTUs
frequentes e raras. Enquanto isso, o Índice de Diversidade de Shannon também considera a “equidade” da OTU, pois
leva em consideração a frequência de cada OTU [15]. Ambos os grupos de estudo foram comparáveis em termos de
riqueza e equitabilidade no início do estudo em nível de classe, ordem e gênero (Figura 3). No entanto, no final do
período de intervenção, o grupo placebo apresentou riqueza significativamente menor em comparação com DR7 em
ambos os níveis de classe (p = 0,005) e ordem (p = 0,018), bem como redução da equidade em nível de classe (p = 0,034). .
Nossos dados atuais mostraram que a administração de DR7 evitou a redução da diversidade ecológica dentro do grupo,
levando em consideração o número de diferentes táxons e abundâncias relativas, que foram evidentemente reduzidas
no grupo placebo ao longo do tempo. A diversidade beta mede as diferenças entre as amostras. O Índice Bray-Curtis
considera tanto a coocorrência quanto a abundância diferencial de OTUs. Diferenças de composição não foram
observadas na semana 0 (Figura 4). No entanto, no final da intervenção, diferenças significativas foram observadas
consistentemente entre DR7 e placebo nos níveis de classe, ordem e género (todos com p < 0,001). Estes indicaram que
o DR7 evitou uma mudança nas alterações na composição da comunidade microbiana ao longo do tempo, o que
evidentemente ocorreu no grupo placebo. Um estudo recente de média escala envolvendo 671 seres humanos mostrou
que uma menor diversidade microbiana intestinal estava associada a níveis aumentados de estresse e ansiedade,
acompanhada por uma composição geral alterada da comunidade microbiana intestinal [16]. Além disso, tem sido
amplamente relatado que a diversidade da microbiota intestinal desempenha um papel importante na manutenção da
estabilidade do ecossistema intestinal, bem como nas funções ecológicas normais. Uma diversidade microbiana reduzida
foi relatada em uma série de doenças gastrointestinais, como a doença de Crohn [17] e a doença inflamatória intestinal
(DII) [18], enquanto casos mais leves , como diarréia, foram associados à diminuição da riqueza de filotipos [19].
Evidências recentes também mostraram que uma mudança na diversidade da microbiota intestinal está associada à
saúde mental e a distúrbios psiquiátricos, como estresse, sociabilidade, cognição, ansiedade, depressão e autismo [20].
Foi relatado que pacientes jovens com transtorno de déficit de atenção e hiperatividade apresentam diversidade alfa
reduzida e diferem na composição microbiana em comparação com controles saudáveis [15].

Estudos em animais mostraram que o estresse causou redução na abundância e diversidade nos perfis da
microbiota intestinal, onde macacas grávidas estressadas apresentaram menor abundância de lactobacilos e
bifidobactérias [21], camundongos expostos ao estresse de perturbação social levaram a um agrupamento colônico
alterado em comparação com o controle, conforme observado via Parcelas de análise de coordenadas principais de
diversidade beta (PCoA) acompanhadas por uma abundância reduzida de Porphyromonadaceae e Lactobacillaceae [22],
enquanto camundongos deprimidos devido ao estresse leve crônico mostraram uma abundância reduzida de Lactobacillus
e Turicibacter [23]. Um estudo envolvendo estudantes de graduação também mostrou redução da carga microbiana fecal
total em meio ao estresse do exame [24]. Em meio ao estresse, a riqueza microbiana dentro da amostra foi reduzida,
levando ao aumento das dissimilaridades entre amostras no presente estudo. A administração de DR7 ajudou na
manutenção da riqueza e uniformidade microbiana intestinal, para evitar uma mudança na diversidade em meio ao estresse.
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Figura 3. Gráficos de diversidade alfa para adultos estressados no início do estudo (S0) e após a semana 12
(S12), após administração de Lactobacillus plantarum DR7 ou placebo. Diversidade medida pelo Índice de
Equidade de Shannon para (A) classe (W0: p = 0,264; W12: p = 0,034), (B) ordem (W0: p = 0,316; W12: p =
0,116) e (C) gênero (W0 : p = 0,919; W12: p = 0,351) e Índice de Riqueza Chao1 para classe (D) (W0: p = 0,876;
W12: p = 0,005), (E) ordem (W0: p = 0,781; W12: p = 0,018) e (F) gênero (W0: p = 0,416; W12: p = 0,123).
A linha dentro da caixa representa a mediana, enquanto os bigodes representam os valores mais baixos e mais altos dentro
do intervalo interquartil. Os valores discrepantes, bem como os valores de amostra individuais, são mostrados como pontos.
A significância estatística foi analisada pelo teste U de Mann-Whitney. n = 99 (DR7 n = 55 e placebo n = 44).

Figura 4. A diversidade beta medida pela dissimilaridade de Bray-Curtis e Análise de Coordenadas Principais
(PCoA) para classe (A), ordem (B) e gênero (C) é plotada para adultos estressados no início do estudo (W0)
e após a semana 12 ( W12), mediante administração de Lactobacillus plantarum DR7 ou placebo. A
diversidade na composição da comunidade microbiana foi alcançada por análise de variância permutacional
(PERMANOVA) para classe, ordem e gênero. PERMANOVA: classe (W0: p = 0,343, W12: p < 0,001), ordem
(W0: p = 0,338, W12: p < 0,001) e gênero (W0: p = 0,338, W12: p < 0,001). n = 99 (DR7 n = 55 e placebo n = 44).

2.4. Mudanças de composição entre DR7 e Placebo

Como as análises de diversidade alfa e beta produziram mudanças significativas entre os grupos DR7 e
placebo ao longo de 12 semanas, analisamos ainda as alterações da microbiota fecal ao longo de diferentes níveis
taxonômicos. Em comparação com DR7, os indivíduos que receberam placebo tiveram uma queda no filo
Bacteroidetes ao longo de 12 semanas (Figura Suplementar S2; p <0,001), o que pode ser atribuído a níveis
taxonômicos subsequentes da classe Bacteroidetes (Figura Suplementar S3; p <0,001) e ordem Bacteroidales
( Figura Suplementar S4; p < 0,001). É digno de nota que uma contagem mais baixa de Bacteroidetes foi observada em pacientes com a
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movimentos do cólon, como crianças pequenas hospitalizadas por diarréia infecciosa [25] e pacientes com
constipação funcional [26].
Por outro lado, embora ambos os grupos de estudo exibissem uma abundância comparável de filo Firmicutes
(e de níveis taxonômicos mais baixos, classe Clostridia e ordem Clostridiales), essas bactérias foram reduzidas no
final do estudo em indivíduos que receberam DR7, enquanto aumentaram no grupo placebo, resultando em
diferenças significativas no filo (Figura Suplementar S2; p = 0,002), classe (Figura Suplementar S3; p = 0,001) e
ordem Clostridiales (Figura Suplementar S4; p = 0,001). Essas diferenças podem ser atribuídas aos gêneros Blautia
e Romboutsia (Figura Suplementar S5; p <0,001), que aumentaram no grupo placebo no final do estudo. Este efeito
foi compensado por uma maior abundância da classe Negativicutes (Figura Suplementar S3; p = 0,003) e ordem
Selenomonadales (Figura Suplementar S4; p = 0,003) em indivíduos que consumiram DR7 em comparação com o
grupo placebo.
É digno de nota que, embora ambos os grupos tenham apresentado uma diminuição na abundância do gênero
Acidaminococcus (pertencente à ordem Selenomonadales), a administração de DR7 contribuiu para uma
diminuição maior que o placebo ao longo de 12 semanas (Figura Suplementar S5; p = 0,001). As ordens
Clostridiales e Selenomonadales são em grande parte habitantes comensais intestinais, sem exercer muitos
efeitos prejudiciais sobre os hospedeiros. No nível de gênero, embora Blautia tenha sido relatado como um
produtor de butirato benéfico para os colonócitos, uma maior abundância de Blautia também foi relatada em
pacientes com bolsite inflamatória [27], doença hepática gordurosa não alcoólica [28], lúpus eritematoso sistêmico
[27]. 29] e câncer de mama [30]. Acidaminococcus tem sido positivamente correlacionado com alturas de nanismo
em crianças desnutridas [31], atribuído à sua exigência exigente de glutamato como única fonte de carbono e
energia, onde o glutamato no intestino é um combustível oxidativo essencial para o epitélio intestinal [32].
Os indivíduos administrados com DR7 tiveram uma abundância aumentada de classe
Deltaproteobacteria (Figura S3; p <0,001), ordem Desulfovibrionales (Figura Suplementar S4; p <0,001)
e gêneros Bilophila (Figura Suplementar S5; p <0,001) e Desulfovibrio (p = 0,001 ) em comparação com
indivíduos que receberam placebo, que mostraram uma abundância diminuída ao longo de 12 semanas.
Embora muitas classes do filo Proteobacteria estejam associadas a patógenos humanos, como
Alphaproteobacteria (para os gêneros Brucella e Rickettsia), Betaproteobacteria (para os gêneros
Bordetella e Neisseria), Gammaproteobacteria (para os gêneros Escherichia, Shigella, Salmonella e
Yersinia) e Epsilobactérias (para o gênero Helicobacter), gêneros Bilophila e Desulfovibrio da classe
Deltaproteobacteria são amplamente identificadas como redutores de sulfato produzindo sulfeto de
hidrogênio (H2S) no intestino. Embora o conhecimento anterior tenha associado o H2S a danos no
intestino e ao aparecimento de DII, avanços recentes mostraram que o H2S é um mediador importante
para a defesa da mucosa gastrointestinal, reparação de lesões epiteliais, prevenção da disbiose devido
ao uso de anti-inflamatórios não esteróides e promovendo a resolução da inflamação [33]. O aumento da
abundância de níveis ao longo da linhagem de Deltaproteobacteria pareceu compensado por uma
diminuição da abundância em indivíduos que consumiram DR7 para a classe de Actinobactérias (Figura
Suplementar S3; p = 0,011), ordem Actinomycetales (Figura Suplementar S4; p = 0,002) e gênero
Actinomyces (Figura Suplementar S5; p <0,001) em comparação com indivíduos que receberam placebo
durante 12 semanas. Embora Actinobacteria seja comensal para a mucosa oral humana, tratos
nasofaríngeo, gastrointestinal e urogenital, o gênero Actinomyces foi isolado do cólon, ceco e apêndice
de pacientes com actinomicose, principalmente atribuído à sua capacidade de formar biofilme, induzir inflamação e agravar l
Além dos processos fisiológicos e fisiopatológicos, também foi relatado que o estresse afeta o ambiente
intestinal, ou seja, perda das funções da barreira intestinal [35], recaídas da DII [36] e enfraquecimento estrutural
das camadas da mucosa do cólon [37]. O DR7 modulou a microbiota intestinal como primeiro local alvo, levando
a um ecossistema intestinal mais saudável que posteriormente aliviou os resultados clínicos de estresse e os
parâmetros inflamatórios, conforme observado em nosso estudo anterior [9].
Foram levantadas limitações na precisão e no uso de níveis taxonômicos mais elevados, como o filo, para
prever e correlacionar com doenças e funções biológicas, atribuídas à vasta diversidade ao longo dos níveis
taxonômicos mais baixos da microbiota intestinal humana. É, portanto, crucial notar que no nosso presente estudo,
as alterações na microbiota intestinal após a administração de DR7 foram consistentes ao longo de diferentes níveis inferiores.
 .
Machine Translated bylevando
local alvo, Googlea um ecossistema intestinal mais saudável que posteriormente aliviou os resultados
clínicos de estresse e os parâmetros inflamatórios, conforme observado em nosso estudo anterior [9].
Limitações foram levantadas na precisão e no uso de níveis taxonômicos mais elevados, como filo, para prever e correlacionar
com doenças e funções biológicas, atribuídas à vasta diversidade ao longo do Int. J. Mol. Ciência. 2020, 21, 4608 níveis taxonômicos
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mais baixos da microbiota
intestinal humana. É, portanto, crucial notar que em nosso presente estudo, as mudanças na microbiota intestinal após a administração
de DR7 foram consistentes ao longo de diferentes níveis taxonômicos mais baixos, como aqueles ao longo dos filos de Bacteroides e
Firmicutes (Figura 5A,B), e níveis taxonômicos como como aquele ao longo dos filos de Bacteroides e Firmicutes (Figura 5A,B), e aqueles
aqueles ao longo
das classes das classes de Deltaproteobacteria
de Deltaproteobacteria e Actinobacteria
e Actinobacteria (Figura 5C,D). (Figura 5C,D). ao longo

Figura 5. Alterações
Alteraçõesna
namicrobiota
microbiotaintestinal apósapós
intestinal administração de Lactobacillus
administração plantarum
de Lactobacillus DR7 por 12
plantarum DR7semanas
por
12 semanas
em em comparação
comparação aoplacebo
com o grupo grupo placebo ao da
ao longo longo da linhagem
linhagem doBacteroidetes
do filo filo Bacteroidetes
(A) (A) e Firmicutes
e Firmicutes (B)(B) e classes
e Deltaproteobacteria
classes (C) e Actinobacteria
Deltaproteobactérias (D). Apenas
(C) e Actinobactérias grupos de
(D). Apenas os microbiota que apresentaram
grupos de microbiota resultados significativos
que apresentaram
alterações
são ao longo
mostradas de 12 significativas
alterações semanas entre aoos grupos
longo placebo
de 12 e DR7
semanas são
entre osmostrados (conforme
grupos placebo indicado
e DR7 pelos
(conforme valores de p dentro do
indicado
pela pirâmide
valores p; teste
dentro U de Mann-Whitney;
da pirâmide; Teste U de ÿ indica um aumentoÿ ao
Mann-Whitney; longoum
indica de 12 semanas
aumento aoe longo
ÿ indicade
uma
12 redução
semanasao elongo de 12 semanas).
ÿ indica
12 semanas).
uma redução Setas curvas indicam
ao longo correlações entre
de 12 semanas). Setas a microbiota intestinal correlações
curvas indicam e as expressões genéticas
entre do sangue de
a microbiota
intestinal egênicas
expressões a dopamina ÿ-hidroxilase
de dopamina (DBH) (DBH),
ÿ-hidroxilase sanguínea, triptofano
triptofano hidroxilase-2
hidroxilase-2 (TPH2) (TPH2) e triptofano
e (TDO) (valor p e rho 2,3-dioxigenase
(r)
obtido a partir
triptofano das correlações(TDO)
2,3-dioxigenase de classificação
(valor p ede Spearman.
rho n = a99partir
(r) obtidos para microbiota intestinalde(DR7
das correlações postos de Spearman.
n = 55 e placebo n = 44); n = 111 para expressões genéticas no sangue (DR7 n = 56 e placebo
n = 99 para microbiota intestinal (DR7 n = 55 e placebo n = 44); n = 111 para expressões genéticas n = no
55).sangue
(DR7 n = 56 e placebo n = 55).
2.5. Correlação entre microbiota intestinal e neurotransmissores de estresse

Nós relatamos anteriormente que o DR7 reduziu os níveis plasmáticos de cortisol e exerceu alterações ao longo
as vias de dois neurotransmissores, a saber, serotonina e dopamina. A administração de
DR7 por 12 semanas reduziu as expressões de dopamina ÿ-hidroxilase (DBH) e tirosina
hidroxilase (TH) ao longo da via da dopamina e também reduziu as expressões de indoleamina
2,3-dioxigenase (IDO) e triptofano 2,3-dioxigenase (TDO), enquanto aumenta as expressões de
triptofano hidroxilase-2 (TPH2) e receptor 5-hidroxitriptamina-6 (5-HT6) ao longo da serotonina
via em comparação com o placebo [9]. Assim, no presente estudo, foram realizadas análises de correlação
avaliar correlações entre grupos de microbiota que foram alterados com a administração de
DR7, com os genes envolvidos nas vias da serotonina e da dopamina. Embora o plasma
os níveis de cortisol e a frequência de defecação não mostraram correlações significativas com a microbiota intestinal
perfis, nossas atuais análises de correlação mostraram correlações significativas envolvendo DAP, TPH2 e
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Internacional J. Mol. Ciência. 2020, 21, 4608 9 de 16

TDO (Figura 5). Relatamos anteriormente que após a administração de DR7, as expressões de TPH2 no
sangue foram maiores que as do placebo em 3,7 vezes, enquanto as expressões de DBH e TDO foram menores
em 1,1 vezes e 1,3 vezes que as do placebo, respectivamente [9] . Aqui, relatamos essas mudanças
correlacionadas a mudanças na abundância relativa de grupos bacterianos específicos na microbiota intestinal.
Observa-se que a expressão basal de TPH2 no sangue era baixa, já que o TPH2 é expresso principalmente no
cérebro, enquanto o TPH1 é expresso no cérebro, no trato gastrointestinal e nas glândulas pituitárias [38]. No
entanto, nenhuma correlação significativa foi observada para TPH1.
Embora as alterações na microbiota intestinal após a administração de DR7 tenham sido consistentes ao
longo de diferentes níveis taxonômicos, as correlações das alterações nesses grupos microbianos com alterações
na expressão gênica de neurotransmissores também mostraram tal consistência. O filo Bacteroidetes apresentou
correlação negativa com a expressão gênica do DAP (p < 0,001, r = ÿ0,409; Figura 5A), o que foi consistente ao
longo de níveis taxonômicos mais baixos, como classe Bacteroidia (p < 0,001, r = ÿ0,355) e ordem Bacteroidales
(p < 0,001, r = ÿ0,346). O DBH catalisa a conversão de dopamina em norepinefrina, uma indicação de aumento
de estresse, como observado no grupo placebo com menor abundância de Bacteroidetes, Bacteroidia e
Bacteroidales. À medida que os níveis de cortisol aumentam, o cérebro noradrenérgico é ativado, onde os efeitos
pós-sinápticos da norepinefrina são acionados para induzir estado de alerta, consciência, vigília e também atenção
em meio a condições estressantes. Bacteroidia e Bacteroidales, que foram mantidos após a administração de
DR7 em comparação ao placebo, também apresentaram correlações positivas com TPH2 (p = 0,001; Figura 5A).
O TPH2 converte o triptofano em serotonina no cérebro, onde foi relatado um nível desequilibrado de serotonina
em pacientes com distúrbios psicológicos, incluindo humor e ansiedade . Bacteroidetes são supostamente
reduzidos em crianças com autismo [40] e pacientes com demência [41], enquanto pacientes com depressão
apresentam menor abundância de Bacteroidia e Bacteroidales [42].

Foi observada correlação positiva entre a expressão gênica do DAP e os níveis taxonômicos ao longo do filo
Firmicutes (p = 0,002, r = 0,311), classe Clostridia (p < 0,001, r = 0,351), ordem Clostridiales (p = 0,001, r = 0,340)
e gêneros Blautia (p < 0,001, r = 0,406) e Romboutsia (p < 0,001, r = 0,355)
(Figura 5B). A administração de DR7 também evitou o aumento na abundância de todos os níveis taxonômicos
ao longo do filo Firmicutes, enquanto o placebo mostrou um aumento em meio ao estresse. Blautia também tem
uma correlação positiva com o TDO (p = 0,001, r = 0,341), que compete com o TPH2 pelo triptofano no cérebro
para a conversão em quinurenina. O nível reduzido de serotonina e o nível aumentado de quinurenina foram
demonstrados em pacientes com ansiedade e transtornos depressivos [39]. Romboutsia tem correlação negativa
com TPH2 (p < 0,001, r = ÿ0,361), enquanto a classe Negativicutes, que aumentou em abundância com a
administração de DR7, apresentou correlação positiva com TPH2 (p = 0,004, r = 0,286). Embora o DR7 tenha
evitado o aumento na abundância de todos os níveis taxonômicos ao longo do filo Firmicutes, vários outros
estudos associaram Firmicutes à saúde mental, onde uma maior abundância de Firmicutes foi observada em
pacientes dementes em comparação com controles não dementes [41], Clostridiales foi mais abundante em
pacientes com depressão maior [43], e uma maior abundância de Blautia foi observada em pacientes com
doença de Alzheimer [37] e transtorno de depressão maior [44].

Deltaproteobacteria e seu nível taxonômico mais baixo da ordem Desulfovibrionales, ambos aumentados
em abundância após a administração de DR7, mostraram correlações negativas com DAP (p = 0,001, r = ÿ0,336;
Figura 5C). Deltaproteobacteria também apresentou correlação positiva com TPH2 (p = 0,003, r = 0,297),
enquanto seu gênero Bilophila também apresentou característica semelhante (p = 0,001, r = 0,002). Enquanto
isso, Actinobacteria, que apresentou menor aumento na abundância após administração de DR7 em comparação
ao placebo, exibiu uma correlação negativa com TPH2 (p = 0,003, r = ÿ0,300; Figura 5D). Relatórios anteriores
mostraram diferentes associações destes grupos microbianos com diferentes transtornos mentais. Foi
demonstrado que Bilophila diminui em abundância em indivíduos com transtornos do espectro do autismo [45] ,
mas aumenta em abundância em pacientes com doença de Alzheimer [37]. Embora as Actinobactérias tenham
sido positivamente associadas à sinalização no tálamo, no hipotálamo e na amígdala, levando a uma melhor capacidade cognitiva
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velocidade, atenção e flexibilidade em humanos [46], sequências de rRNA 16s de Actinobactérias foram encontradas
mais abundantes em amostras cerebrais autopsiadas congeladas e fixas de pacientes com esclerose múltipla [47].
Embora a serotonina seja um dos principais neurotransmissores cerebrais, aproximadamente 90% da
serotonina total em humanos está localizada nas células enterocromafins do trato gastrointestinal (GI) [48], onde a
serotonina desempenha papéis importantes na promoção da imunidade e na redução da inflamação em vários
modelos de mucosas. infecções [49]. Isto contrasta com o outro metabólito do triptofano e da quinurenina, onde foi
relatado que um aumento da conversão do triptofano em quinurenina aumenta a incidência de infecções do trato
respiratório superior (IVAS) [50]. Já relatamos anteriormente os efeitos do DR7 na melhora dos sintomas de IVAS
por meio da modulação da imunidade sistêmica e das respostas inflamatórias em adultos [51]. As informações
sobre os efeitos da microbiota intestinal nas vias da dopamina permanecem limitadas em comparação com as da
serotonina, onde uma diminuição no nível de serotonina tem sido associada à ausência de certas bactérias
intestinais em animais livres de germes já em 1967 [52 ]. Como a serotonina é produzida no intestino pelas células
enterocromafins, enquanto a microbiota intestinal influencia o número e a função das células enterocromafins,
promovendo assim a liberação de serotonina no intestino, a serotonina tem sido amplamente avaliada quanto às
propriedades do eixo intestino-cérebro. Enquanto isso, a dopamina e a noradrenalina são supostamente produzidas
pela microbiota intestinal, portanto associadas para desempenhar alguns papéis como moléculas sinalizadoras que
medeiam a função do eixo microbiota-intestino-cérebro há menos de 10 anos [53]. Estudos emergentes em todos
estes anos relataram, portanto, os efeitos da microbiota intestinal nos níveis de serotonina e dopamina e, em certa
medida geral, relataram alguns efeitos psicológicos. Até onde sabemos, os presentes dados são os primeiros a
relatar uma correlação entre a microbiota intestinal e os genes relacionados às vias da serotonina e da dopamina,
o que também é consistente em vários níveis taxonômicos.

3. Materiais e Métodos

3.1. Lactobacillus plantarum DR7 e produtos placebo

Lactobacillus plantarum DR7 foi isolado de leite de vaca fresco em Penang, Malásia [9]. As culturas estoque
preservadas de DR7, em 20% de glicerol a -20 ÿC, foram ativadas em caldo estéril De Man, Rogosa, Sharpe (MRS)
(Hi-media, Mumbai, Índia) por três vezes sucessivas usando 10% (v/ v) inóculos e incubados a 37 ÿC por 24 horas
[54]. A identidade de todas as culturas de trabalho foi reconfirmada usando sequenciamento de 16S rRNA e dois
primers específicos de cepa de (i) (F) GCAAGGCCACTTGATCGTTG e (R) AATCAGTCGCATCCAGCCAA e (ii) (F)
AGCCATTCTCAGTTCGGATTGT e (R)
GCTCTTGTTCGACTTCCCCTAA. A amplificação por PCR do rDNA 16S foi realizada utilizando o iniciador universal
16S rDNA, com a sequência direta, 27F; 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 e reverso em um termociclador (Bio-
5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 CA, EUA). O programa de , Rad, Hercules, sequência iniciadora, 1492R;
amplificação consistiu em (i) desnaturação a 95 ÿC por 5 min, (ii) 35 ciclos de desnaturação a 95 ÿC por 30 s,
recozimento a 52 ÿC por 1 min e extensão a 72 ÿC por 2 minutos. min, e (iii) extensão final a 72 ÿC por 4 min e,
finalmente, mantida a 4 ÿC até uso posterior. Os amplicons de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de
agarose a 100 V por 60 min e visualizados utilizando o GeneGenius Imaging System (Syngene, Cambridge, UK). A
purificação e sequenciamento dos produtos de PCR foram realizados pela Apical Scientific Sdn Bhd. As sequências
de nucleotídeos dos isolados foram analisadas usando o programa BLAST do NCBI (//www.ncbi.nlm.nih.gov). O
número de acesso para todo o genoma do DR7 é CP031318. Tanto os produtos DR7 quanto os placebo foram
fabricados pela GN Pharmaceuticals Sdn. Bhd., Selangor, Malásia, sob uma fábrica com certificação GMP, que
também foi certificada como HALAL pela JAKIM, Malásia. As culturas vivas de DR7 são comprovadamente estáveis
em um meio livre de lactose, como leite de soja, a 4 ÿC por 168 h (Figura Suplementar S1). O consumo diário
consistiu de um sachê de alumínio (2 g) contendo pó amarelo claro de 109 ufc/sachê de DR7 e maltodextrina como
excipiente ou placebo apenas com maltodextrina. Todos os produtos foram armazenados longe da luz solar direta
e abaixo de 30 ÿC.
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3.2. Seleção de Assuntos

Os indivíduos foram recrutados em Penang e Kubang Kerian, na Malásia, e selecionados com base nos critérios de inclusão e
exclusão. Os critérios de inclusão foram homens ou mulheres, com idade entre 18 e 60 anos, dispostos a se comprometer durante todo
o experimento e com pontuação de nível de estresse moderado na Escala de Estresse Percebido de Cohen (PSS-10) [55]. Os critérios
de exclusão incluíram indivíduos com diabetes tipo I, tomando medicação a termo devido a certas doenças graves, portadores de HIV/
AIDS, deficientes em glicose-6-fosfato desidrogenase e que, na opinião do investigador, não tinham probabilidade de completar o teste.
julgamento por qualquer motivo. Antes do início do estudo, o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

3.3. Protocolo de estudo

Este foi um estudo duplo-cego, randomizado e controlado por placebo. Os indivíduos qualificados foram
randomizados de acordo com uma proporção de 1:1 para os dois braços do estudo, de acordo com uma lista gerada
por computador com códigos de tratamento. Essa lista foi elaborada pelo estatístico do estudo, que não teve contato
com os participantes, e a sequência de alocação não ficou disponível para nenhum membro da equipe de pesquisa
até o final do estudo. Este estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas na Declaração de
Helsinque. Todos os procedimentos envolvendo seres humanos foram aprovados pelo JEPeM-USM Review Panel
on Clinical Studies (número de aprovação USM/JEPeM/17040228, 24 de agosto de 2017) e foram registrados em
ClinicalTrials.gov (número de identificação NCT 03370458, 12 de dezembro de 2017). O tamanho da amostra foi
calculado para um desenho de estudo de grupo paralelo envolvendo um braço de prevenção e um braço de placebo
e foi baseado na análise do desenho de potência conforme descrito anteriormente [9], onde um total de 124
indivíduos foram necessários, compreendendo 62 indivíduos em cada grupo (tratamento e placebo; incluindo 15% de abandono).

3.4. Análises

Questionários

Os indivíduos elegíveis foram solicitados a preencher um questionário sobre a condição de saúde intestinal no início do estudo,
semana 4, semana 8 e semana 12, que registrou a ocorrência de sintomas gastrointestinais diretos (como vômito, disenteria (sangue nas
fezes), dor abdominal, náusea, dor retal (forte, opaca, ardente e parece um objeto duro no reto)), sintomas gastrointestinais indiretos
(como perda de apetite, fadiga, tontura, dor de cabeça, desidratação e febre) e o número de vezes que defecou . O desenvolvimento de
todos os questionários como ferramentas de avaliação também incluiu processos de tradução para os idiomas malaio e chinês, onde
todas as versões foram validadas através de estágios de desenvolvimento e validação facial [56,57] e também foram usadas em nosso
estudo anterior sobre saúde gastrointestinal [58] .

3.5. Análises da microbiota intestinal

3.5.1. Extração de DNA, amplificação por PCR e sequenciamento

Amostras fecais foram coletadas no início do estudo (semana 0) e na semana 12 em tubos de coleta de
fezes contendo solução RNAlater™ (Qiagen, Hilden, Alemanha) e esferas de vidro pelos indivíduos e
armazenadas em temperatura refrigerada (4–8 ÿC) para não mais de 3 dias, antes da entrega ao laboratório
e armazenado a -80 ÿC até análises posteriores. As amostras fecais foram homogeneizadas agitando o tubo
contendo esferas de vidro em vórtex antes da extração e purificação do DNA, conforme descrito anteriormente [10,11].
Os DNAs purificados foram determinados pelo espectrofotômetro NanoDrop 2000 UV-Vis (Thermo Scientific,
Wilmington, NC, EUA). As regiões hipervariáveis V3-V4 do gene 16S rRNA da bactéria foram amplificadas
com os primers 341F (5 -CCTAYGGGRBGCASCAG-3) e 806R (5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3) por
sistema de PCR termociclador (GeneAmp 9700, ABI, San Diego, CA, EUA) . As reações de PCR foram
realizadas em triplicata com 20 µL de mistura contendo 4 µL de 5 × FastPfu Buffer, 2 µL de dNTPs 2,5 mM ,
0,8 µL de cada primer (5 µM), 0,4 µL de FastPfu Polimerase e 10 ng de DNA modelo, na seguinte sequência:
3 min de desnaturação a 95 ÿC, 27 ciclos de 30 s a 95 ÿC, 30 s para recozimento a
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55 ÿC e 45 s para alongamento a 72 ÿC e extensão final a 72 ÿC por 10 min. Os produtos de PCR foram então extraídos
de um gel de agarose a 2% e posteriormente purificados usando o kit de extração de gel AxyPrep DNA (Axygen
Biosciences, Union City, CA, EUA) e quantificados usando QuantiFluor™-ST (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo
com ao protocolo do fabricante. Os amplicons purificados foram agrupados em sequências equimolares e pareadas (2
× 300) em uma plataforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA).

3.5.2. Análise de bioinformática no perfil do gene rRNA 16s

As sequências do gene 16s rRNA foram processadas usando QIIME v.1.9.1 (ref QIIME permite análise de dados
de sequenciamento comunitário de alto rendimento) e USEARCH v.10.0 (ref Search e agrupamento de ordens de
magnitude mais rápidas que o BLAST). Os arquivos FASTQ brutos foram filtrados com qualidade pelo Trimmomatic e
mesclados pelo USEARCH com os seguintes critérios: remoção de códigos de barras e primers, filtragem de leituras de
baixa qualidade e localização de leituras não redundantes. As leituras brutas mescladas foram de pelo menos 50.000
por amostra. Unidades taxonômicas operacionais (OTUs) foram agrupadas com corte de similaridade de 97% usando UPARSE.
A taxonomia para cada sequência do gene 16S rRNA foi analisada pelo algoritmo RDP Classifier (//rdp.cme.msu.edu/) contra o banco de
dados Silva 132 16S rRNA usando limite de confiança de 60%.
As estimativas de alfa (riqueza dentro da amostra) e beta-diversidade (dissimilaridade entre amostras) foram calculadas usando o
pacote MicrobiomeAnalyst phyloseq-R versão 3.6.1 (//www. microbiomeanalyst.ca/MicrobiomeAnalyst/home.xhtml) para classe, ordem e gênero.

3.6. Análise estatística

Os dados foram analisados no SPSS versão 20.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA). A hipótese primária deste estudo
envolveu eficácia diferencial entre os dois grupos de tratamento de DR7 e placebo.
Considerando a distribuição distorcida e a natureza não paramétrica de nossos dados, as diferenças na abundância
relativa de OTUs entre os grupos DR7 e placebo foram comparadas usando o teste U de Mann-Whitney, enquanto as
correlações entre a abundância relativa de OTUs e os dados de expressão gênica foram avaliadas usando as
correlações de classificação de Spearman com rho (r) como coeficiente de correlação. A diversidade alfa da microbiota
intestinal foi medida pelos índices de Shannon e Chao1 e comparada usando o teste U de Mann-Whitney , enquanto a
diversidade beta foi calculada pela análise de coordenadas principais (PCoA) na dissimilaridade de Bray-Curtis e
comparada usando análise de variância permutacional (PERMANOVA).
Dados de expressões genéticas sanguíneas de dopamina ÿ-hidroxilase (DBH), triptofano hidroxilase-2 (TPH2) e
triptofano 2,3-dioxigenase (TDO) usados em análises de correlação foram obtidos em nosso estudo anterior [9]. Todos
os testes foram bilaterais com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Ambas as diferenças na abundância
relativa e nas análises de correlação foram ajustadas para multiplicidade com base no número de OTUs detectadas em
cada nível taxonômico (classe, ordem e gênero) usando o procedimento de Benjamini e Hochberg em um limite de
Taxa de Descoberta Falsa (FDR) de 0,1.

4. Conclusões
Tomados em conjunto, os nossos dados actuais mostraram que a administração de DR7 modulou a evacuação
induzida pelo stress, diminuindo a frequência de defecação em comparação com o placebo após 12 semanas. A análise
da diversidade alfa também mostrou que o DR7 evitou a diminuição da riqueza e uniformidade da microbiota intestinal
OTU, enquanto a análise da diversidade beta mostrou que o DR7 manteve a distribuição dos perfis microbianos
intestinais em meio ao estresse. Observa-se que essas alterações na microbiota intestinal após a administração de
DR7 foram consistentes ao longo de diferentes níveis taxonômicos ao longo dos filos de Bacteroides e Firmicutes e das
classes de Deltaproteobacteria e Actinobacteria. Análises de correlação revelaram posteriormente que as alterações da
microbiota intestinal ao longo de diferentes níveis taxonômicos eram consistentes com várias expressões genéticas de
enzimas-chave envolvidas ao longo das vias dos neurotransmissores da serotonina e da dopamina. Até onde sabemos,
este é o primeiro estudo a correlacionar os efeitos de um probiótico com as alterações da microbiota intestinal e os
genes dos neurotransmissores cerebrais, fortalecendo a hipótese de benefícios à saúde ao longo do eixo intestino-
cérebro. Considerando que microrganismos probióticos
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são frequentemente utilizados em alimentos, a descoberta atual beneficiará as indústrias alimentícias, permitindo o
desenvolvimento de novos produtos alimentares funcionais direcionados especificamente para promoções de saúde mental.

Materiais Suplementares: Materiais suplementares podem ser encontrados em http://www.mdpi.com/1422-0067/21/13/ 4608/s1.

Contribuições dos autores: M.-TL e YL conceberam e projetaram os experimentos. GL, H.-XC, FY-LC e M.-TL realizaram o estudo e
analisaram os dados. GL, YL e M.-TL redigiram o trabalho, revisaram criticamente o conteúdo intelectual e escreveram o manuscrito. Todos
os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Agradecimentos: Os prebióticos foram obtidos por cortesia da Aqurate Ingredients Intl., Kuala Lumpur, Malásia, enquanto o DR7 foi obtido
por cortesia da Clinical Nutrition, Kuala Lumpur, Malásia. A Nutrição Clínica foi o patrocinador industrial aprovado. Os autores agradecem a
Jordi Espadaler Mazo por auxiliar na microbiota e nas análises estatísticas, e pela leitura abrangente e melhoria da redação do manuscrito.
Os autores também agradecem ao financiador por fornecer ideias nas etapas de concepção dos experimentos e leitura do manuscrito
quanto ao conteúdo intelectual antes da submissão de acordo com as decisões dos autores.

Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Abreviações

SNC Sistema nervoso central

DAP Dopamina ÿ-hidroxilase
IG Gastrointestinal
MDD Transtornos depressivos maiores
SRA De Man, Rogosa, Sharpe
OTUs Unidades taxonômicas operacionais
PCoA Análise de coordenadas principais
Análise permutacional de variância PERMANOVA
URTI Infecções do trato respiratório superior
TDO Triptofano 2,3-dioxigenase
TPH2 Triptofano hidroxilase-2

Referências

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© 2020 pelos autores. Licenciado MDPI, Basileia, Suíça. Este artigo é um artigo de acesso aberto
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