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INFECÇÃO E IMUNIDADE, S e t . 2005, p . 5827-5834 Vol. 73, No. 9

0019-9567/05/$08.00+0 doi:10.1128/IAI.73.9.5827-5834.2005
Copyright © 2005, Sociedade Americana de Microbiologia. Todos os direitos reservados.

Rumo a um novo modelo experimental de infeção para estudar a

leishmaniose cutânea americana causada por Leishmania braziliensis
Tatiana R. de Moura,1 † Fernanda O. Novais,1 † Fabiano Oliveira,1 Jorge Clarˆencio, 1
Alm'e rio Noronha,1 Aldina Barral,1,2 Claudia Brodskyn,1,3 e Camila I. de Oliveira *1
Centro de Pesquisas Gon¸calo Moniz, Funda¸ca˜o Oswaldo Cruz, Rua Waldemar Falca˜o, 121, Salvador, BA 40295-001,1 Faculdade
de Medicina da Bahia, Universidade Federal da Bahia, Pra¸ca XV de novembro S/N, Largo do Terreiro de Jesus, Salvador, BA 40025-
010,2 e Departamento de Biointera¸ca˜o, Instituto de Ciˆencias da Sau'de, Universidade
Federal da Bahia, Av. Reitor Miguel Calmon, S/N, Salvador, BA 40110-160, Reitor Miguel Calmon, S/N, Salvador, BA 40110-160,3 Brasil
Recebido em 28 de janeiro de 2005/Reenviado para alteração em 8 de março de 2005/Aceite em 25 de março de 2005

Leishmania spp. causa um amplo espetro de doenças conhecidas coletivamente como leishmaniose.
Leishmania bra- ziliensis é o principal agente etiológico da leishmaniose cutânea americana (LCA) e da leish-
maniose mucocutânea. No presente estudo, desenvolvemos um modelo experimental de infeção que se
aproxima da LCA causada por L. braziliensis. Para isso, camundongos BALB/c foram infectados na derme
auricular com 105 parasitas e aspectos distintos da infeção foram avaliados. Após a inoculação, a expansão do
parasita na derme auricular foi acompanhada pelo desenvolvimento de uma lesão dérmica ulcerada, que
cicatrizou espontaneamente, como observado pela presença de uma cicatriz. A análise histológica das orelhas
infectadas mostrou a presença de um infiltrado inflamatório misto constituído por células mononucleares e
polimorfonucleares. Nos gânglios linfáticos drenados, a replicação do parasita foi detectada durante toda a
infeção. A reestimulação in vitro das células dos gânglios linfáticos de drenagem, seguida de coloração
intracelular, revelou um aumento da produção de interferão gama (IFN-v) e da frequência de células T CD4+ e
CD8+ secretoras de IFN-v. A transcrição reversa-PCR das células das orelhas e dos gânglios linfáticos de
drenagem mostrou a expressão de quimiocinas CC. O modelo dérmico de infeção por L. braziliensis aqui
apresentado é capaz de reproduzir aspectos da infeção natural, como a presença de uma lesão ulcerada, a
disseminação do parasita para áreas linfóides e o desenvolvimento de uma resposta imune do tipo Th1. Estes
resultados indicam que este modelo será útil para abordar questões relacionadas à imunidade concomitante à
reinfeção e à persistência do parasita que leva à leishmaniose mucocutânea.

* Autor correspondente. Endereço para correspondência: Centro de

Os protozoários parasitas do género Leishmania causam um Pesquisas Gon-
amplo espetro de doenças, conhecidas coletivamente como ¸calo Moniz, Funda¸c˜ao Oswaldo Cruz, Rua Waldemar Falc˜ao, 121,
leishmaniose, que ocorrem predominantemente em regiões Salvador, BA 40295-001, Brasil. Telefone: 55-71-356 8785, ext. 211.
tropicais e subtropicais. As leishmanioses são transmitidas por Fax:
diferentes espécies de moscas da areia e, dependendo da 55-71-356 8785, ext. 261. E-mail: camila@cpqgm.fiocruz.br.
† T. R. de Moura e F. O. Novais contribuíram igualmente para este
espécie de Leishmania envolvida e da composição genética ou trabalho.
estado imunológico do hospedeiro, observam-se diferentes
manifestações clínicas da doença. Neste sentido, a
leishmaniose cutânea do Velho Mundo causada por
Leishmania major é geralmente benigna; a infeção de
hospedeiros humanos leva ao desenvolvimento de uma lesão
cutânea localizada que eventualmente se cura, levando à
geração de imunidade ao longo da vida. Em contraste, a
leishmaniose cutânea do Novo Mundo causada pela
Leishmania braziliensis distingue-se de outras leishmanioses
pela sua cronicidade, latência e tendência para metastizar no
hospedeiro humano (10). Na leishmaniose cutânea do Novo
Mundo, uma única úlcera com bordas elevadas e um centro
necrótico é freqüentemente observada e uma resposta
inflamatória crônica se desenvolve, apesar da escassez de
parasitas. Em 1 a 5% dos doentes, pode desenvolver-se
leishmaniose mucocutânea devido à capacidade desta espécie
de parasita persistir nas cicatrizes das lesões após a
cicatrização espontânea ou mediada por quimioterapia e à sua
capacidade de metastizar para a mucosa nasal (33, 44). Neste
caso, observa-se uma extensa destruição tecidular como
resultado da potente ação mediada por células
 descontroladas que conduzem a uma doença progressiva. Por
resposta imunitária desencadeada pela replicação do parasita,
conseguinte, após a infeção experimental com L. major, podem
uma caraterística da leishmaniose das mucosas (30). Mais
ser reproduzidos aspectos distintos do espetro clínico da
raramente, a invasão do parasita na corrente sanguínea resulta
leishmaniose cutânea humana e, neste sentido, os ratinhos
em lesões cutâneas disseminadas (15).
C57BL/6 representam o fenótipo resistente e os ratinhos
Os modelos murinos de leishmaniose cutânea são uma
BALB/c representam o fenótipo suscetível.
ferramenta valiosa para dissecar os mecanismos relacionados
No entanto, no curso natural da transmissão da Leishmania,
com a patogénese da doença, a resistência a uma infeção
um pequeno número de parasitas metacíclicos infecciosos é
secundária e o desenvolvimento de vacinas (revisto nas
introduzido na pele do hospedeiro vertebrado pelo mosquito da
referências 11, 21 e 42). O modelo murino de infeção por L.
areia. Por conseguinte, Belkaid e colegas estabeleceram um
major tem-se baseado geralmente na inoculação de um grande
modelo experimental de infeção dérmica que se assemelha
número de parasitas (105 a 107 ) em locais subcutâneos,
muito à infeção natural (5, 6). Nesta situação, a infeção é
normalmente a pata do rato. Nestas condições, a estirpe de
iniciada na pele, que está organizada em compartimentos
ratinho C57BL/6 desenvolve lesões cutâneas localizadas que
dérmicos e epidérmicos, cada um deles contendo células
desaparecem espontaneamente e fica protegida da doença
especializadas capazes de lidar com a exposição aos agentes
após uma segunda inoculação com L. major. Os ratinhos
infecciosos presentes no ambiente externo (revisto em
BALB/c, pelo contrário, desenvolvem lesões graves e

5827
5828 DE MOURA ET AL. INFECT. IMMUN.

estreptomicina, 10% de soro fetal de bezerro (todos da Life Technologies,

referência 24) após a injeção de um pequeno número de Rockville, MD) e 0,05 M de 2-mercaptoetanol dispensado em placas de 96 poços.
parasitas. Este tipo de modelo experimental foi recentemente As células foram activadas na presença de anti-CD3 (10 µg/ml) e anti-CD28 (10
estabelecido para outra espécie de Leishmania do Novo µg/ml) durante 12 h a 37°C em 5% CO2. Após incubação durante 4 h a 37°C na
presença de 10 µg/ml de Brefeldin A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), as
Mundo, nomeadamente, L. ama- zonensis (16, 36). No entanto,
células foram recolhidas e incubadas com anticorpo anti-recetor Fc (2,4G2). Cada
em contraste com L. amazonensis e
L. major, um número consideravelmente menor de trabalhos
experimentais foi realizado com L. braziliensis, apesar dos
sérios problemas de saúde colocados por esta espécie de
parasita na América do Sul. Isso provavelmente se deve ao fato
de que L. braziliensis não cresce facilmente in vitro e que sua
conversão em metacíclicos sob condições de cultura padrão é
ineficiente, exigindo que um grande inóculo de parasitas (107
parasitas) seja usado para obter sucesso na infeção (27). É
importante ressaltar que a maioria das linhagens de
camundongos parece ser resistente à infeção por L. braziliensis
(14, 35, 43). Este fenótipo tem sido associado à incapacidade
da L. braziliensis de inibir a resposta imune do tipo Th1
desenvolvida após a infeção (18). No presente trabalho, um
modelo experimental de leishmaniose cutânea americana,
causada por L. braziliensis, foi estabelecido em camundongos
BALB/c levando em conta características do curso natural da
transmissão, como a inoculação de um número menor de
parasitas (105 ) em um sítio dérmico. O resultado clínico
resultante é semelhante ao observado no hospedeiro humano,
particularmente em termos de ulceração da lesão, persistência
do parasita e resposta imunitária.

MATERIAIS E MÉTODOS
Camundongos. Camundongos BALB/c fêmeas foram obtidos do Centro de
Pesquisas Gon¸calo Moniz/Funda¸c'ao Oswaldo Cruz, onde foram mantidos em
condições livres de patógenos. Os ratos foram utilizados para experiências com 6
a
8 semanas de idade por métodos aprovados pelo Comitê de Cuidados e
Utilização de Animais do CPqGM/FIOCRUZ.
Cultura do parasita, inoculação intradérmica e medição da lesão. A cepa
MHOM/BR/01/BA788 de L. bra- ziliensis foi isolada de um paciente com
leishmaniose cutânea do estado da Bahia (nordeste do Brasil) após breves (2-4)
passagens em meio de cultura. Esse isolado foi identificado como L. braziliensis
usando PCR (12) e anticorpos monoclonais (31). As formas promastigotas foram
cultivadas em meio Schnei- der (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
suplementado com 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 10%
de soro fetal de vitelo inativado pelo calor (todos da Life Technologies,
Rockville, MD) e 2% de urina humana estéril. As promastigotas em fase
estacionária (105 parasitas em 10 µl de solução salina) foram inoculadas na
derme da orelha direita de ratinhos BALB/c com a mesma idade, utilizando uma
agulha de calibre 27,5. O tamanho da lesão foi monitorizado semanalmente
durante 10 semanas utilizando um calibrador digital (Thomas Scientific,
Swedesboro, NJ).
Estimativa da carga parasitária. A carga parasitária foi determinada
utilizando um ensaio quantitativo de diluição limite, tal como descrito
anteriormente (48). Resumidamente, as orelhas infectadas e os gânglios linfáticos
de drenagem retromaxilares (LN) foram excisados assepticamente às 2, 4, 6, 8 e
10 semanas após a infeção e homogeneizados em meio Schneider (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO). Os homogenatos foram diluídos em série em
meio S c h n e i d e r suplementado como anteriormente e semeados em placas
de 96 poços contendo meio de ágar-sangue bifásico (Novy-Nicolle-McNeal). O
número de parasitas viáveis foi determinado a partir da diluição mais elevada em
que as formas promastigotas puderam crescer após um máximo de 2 semanas de
incubação a 25°C.
Análise histológica. As orelhas infectadas foram removidas post-mortem às 5
e 9 semanas pós-infeção e fixadas em formaldeído a 10%. Após 12 a 24 horas de
fixação, os tecidos foram processados e incluídos em parafina e secções de 5 µm
de espessura foram coradas com hematoxilina e eosina e analisadas por
microscopia ótica.
Deteção de citocinas intracelulares por citometria de fluxo. Os reagentes
para a coloração de marcadores de superfície celular e citocinas intracelulares
foram adquiridos da BD Bio- sciences, San Diego, CA. Suspensões de células
únicas de LNs drenantes foram preparadas assepticamente em 2, 4, 6 e 8 semanas
após a infeção com L. braziliensis ou após injeção intradérmica de solução salina
tamponada com fosfato (PBS). As células foram suspensas em RPMI 1640
suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de
VOL. 73, 2005 MODELO DE LEISHMANIOSE
infectados CUTÂNEA
com L. braziliensis. AMERICANA
Para investigar 5829
se havia uma
A marcação foi efectuada em 106 células durante 30 minutos em gelo num
volume de 100 µl. As células foram duplamente coradas simultaneamente com correlação entre o desenvolvimento da lesão e a replicação
CD4 (L3T4) e CD8 (53-6.7) de superfície de ratinho conjugados com do parasita, a carga parasitária foi estimada tanto no local de
isotiocianato de fluoresceína e Cy-Chrome, r e s p e t i v a m e n t e . Para a inoculação quanto nos LNs de drenagem. Na derme da orelha
coloração intracelular de citocinas, as células foram permeabilizadas com
(Fig. 2), a expansão do parasita foi observada na semana 2 e
Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) e incubadas com os seguintes anticorpos
anti-citocinas conjugados com ficoeritrina: para interferão gama (IFN-γ), progrediu
XMG1.2; para interleucina-4 (IL-4), BVD4-1D11; para IL-5, TRFK-5; e para
IL-10, JES5-16E3. Os controlos de isótipos utilizados foram a imunoglobulina
de rato G2b (A95-1) e a imunoglobulina de rato G2a (R35-95). Após a
coloração, as células foram fixadas em paraformaldeído a 1% e, para cada
amostra, foram analisadas 104 células. Os dados foram recolhidos e analisados
utilizando o software CELLQuest e um citómetro de fluxo FACSort (Becton
Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA).
Deteção de citocinas por ELISA. Para a medição da p r o d u ç ã o d e
citocinas in vitro, foram preparadas assepticamente suspensões unicelulares de
LNs de drenagem às 2, 4, 6 e 8 semanas após a infeção. As células foram
diluídas para 5 × 106 células/ml em RPMI 1640 suplementado com 2 mM L-
glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 10% de soro fetal
de vitelo (todos da Life Technologies, Rockville, MD), e 0.05 M 2-
mercaptoetanol e dispensados em placas de 96 poços com ou sem promastigotas
de L. braziliensis em fase estacionária (cinco parasitas para uma célula) ou con-
canavalina A (10 µg/ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). As
culturas foram incubadas a 37°C em 5% de CO2 . Os sobrenadantes foram
colhidos às 48 h e testados para IL-4 e IL-10 ou às 72 h e testados para IFN-γ.
A presença de citocinas foi determinada por um ensaio de imunoabsorção
enzimática (ELISA) utilizando kits comerciais (BD Biosciences, San Diego,
CA). A produção de citocinas das células dos gânglios linfáticos de ratinhos
injectados com PBS foi inferior ao nível de deteção d o s kits utilizados: para
IFN-γ, 55 pg/ml; para IL-4, 5,5 pg/ml; para IL-10, 3 pg/ml.
Isolamento do ARN e deteção de quimiocinas por RT-PCR. As orelhas
infectadas e os LNs drenados foram excisados 2, 4, 6 e 8 semanas após a
infeção e o ARN total foi extraído com o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad,
CA), conforme especificado pelo fabricante. A síntese do cDNA de primeira
cadeia foi efectuada em 1 µg de ARN total utilizando o SuperScript III First-Str
Synthesis System para t r a n s c r i ç ã o reversa (RT)-PCR (Invitrogen,
Carlsbad, CA). O cDNA resultante foi utilizado na PCR com primers para
CCL2/proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1), CCL3/proteína
inflamatória de macrófagos 1α (MIP-1α), CCL4/MIP-1β, CCL5/ RANTES
e β-actina, conforme descrito anteriormente (47). Os produtos de amplificação
foram visualizados em géis de poliacrilamida a 6% corados com brometo de
etídio.
Análise estatística. Os dados são apresentados como médias ± erros padrão
das médias. A significância dos resultados foi calculada por um teste não
paramétrico de análise de variância de uma via (Kruskal-Wallis) usando o Prism
(GraphPad Software, San Diego, CA), e um valor de P <0,05 foi considerado
significativo.

RESULTADOS
Camundongos BALB/c inoculados com L. braziliensis na
derme da orelha desenvolvem uma lesão ulcerada. Para
estabelecer um modelo natural de leishmaniose cutânea
americana causada por L. braziliensis, os parasitas foram
inoculados na derme auricular de camundongos BALB/c. Em
experimentos preliminares, observamos que a inoculação de
105 promastigotas em fase estacionária foi capaz de induzir
lesões ulceradas na maioria dos camundongos infectados.
Após a inoculação intradérmica, o tamanho da lesão foi
examinado semanalmente durante um período de 10 semanas.
Os ratinhos infectados desenvolveram uma lesão detetável na
semana 3 (Fig. 1A). O tamanho da lesão progrediu de forma
constante e atingiu um máximo de 1 mm na semana 5.
Posteriormente, o tamanho da lesão regrediu e a cicatrização
completa da orelha foi observada na semana 9 pós-infeção.
Não se observou endurecimento da orelha ou recidivas da
lesão até 9 meses após a infeção (dados não apresentados). A
lesão dérmica observada na semana 5 era nodular e ulcerada,
com bordas elevadas e uma cratera acentuada (Fig. 1B),
semelhante à lesão dérmica observada em pacientes com
leishmaniose cutânea causada por L. braziliensis.
A carga parasitária na derme auricular difere da carga
parasitária nos LNs de drenagem de camundongos
5830 DE MOURA ET AL.
FIG. 1. A inoculação de L. braziliensis na derme auricular de
camundongos BALB/c leva ao desenvolvimento de uma lesão
ulcerada. (A) Camundongos foram infectados com 105 promastigotas
de L. braziliensis, e o desenvolvimento da lesão foi monitorado por 10
semanas. Os tamanhos das lesões (em milímetros) são expressos como
médias e erros padrão das médias de três experiências independentes,
cada uma realizada com cinco camundongos. (B) Fotomicrografia de
uma orelha de rato 5 semanas após a infeção, demonstrando a
ulceração da lesão.
A carga parasitária foi aumentando de forma constante até à
semana 6, altura em que foi detectado um aumento de 1000
vezes (~108 parasitas/ouvido) e o tamanho da lesão atingiu o
seu pico. A partir da 6ª semana, a carga parasitária diminuiu e,
após a 8ª semana, os parasitas deixaram de ser detectados na
derme da orelha, quer pelo ensaio de diluição limitante, quer
por imunohistoquímica utilizando um anticorpo anti-
Leishmania (dados não apresentados). Nesse momento, a lesão
cicatrizada mostrava a presença de uma cicatriz; a espessura da
orelha, no entanto, permanecia acima de 0,2 mm, a espessura
de base para uma orelha não infetada (Fig. 1A). Nos LNs de
drenagem (Fig. 2), a carga parasitária atingiu um pico de ~104
parasitas/ouvido na semana 2 e permaneceu neste nível durante
toda a infeção. Curiosamente, observámos um aumento do
número de células dos gânglios linfáticos que drenam o local
da infeção: 1 × 107 células às 2 semanas pós-infeção em
comparação com 3,6 × 107 células às 6 semanas pós-infeção,
indicando que o aumento dos gânglios linfáticos regionais, tal
como observado na infeção natural (4), também foi
reproduzido neste modelo experimental.
INFECT. IMMUN.
FIG. 2. Estimativa da carga parasitária em camundongos BALB/c
após inoculação intradérmica de L. braziliensis. Os camundongos foram
infectados com 105 promastigotas de L. braziliensis. A carga parasitária
na orelha (barras abertas) e no linfonodo drenante (barras sólidas) foi
determinada 2, 4, 6, 8 e 10 semanas após a infeção por meio de um
ensaio de diluição limitante. Os dados representam as médias e os
erros padrão das médias de três experiências independentes, cada uma
efectuada com cinco ratos.
Alterações da resposta inflamatória durante a evolução da
lesão em
L. braziliensis infectados com camundongos BALB/c, e isso se
correlaciona com o controle da carga parasitária. Para
analisar a resposta inflamatória nas lesões auriculares, foram
avaliados aspectos histológicos. Após a inoculação da derme
auricular com 105 promastigotas de L. braziliensis, as lesões
exibiram um aumento progressivo do infiltrado inflamatório.
Cinco semanas após a infeção (Fig. 3A), a resposta
inflamatória era composta por células polimorfonucleares,
numerosos macrófagos, a maioria deles fortemente parasitados,
e células espumosas (Fig. 3B). As alterações vasculares e a
necrose dos tecidos foram observadas em paralelo com a
formação de úlceras. Às 9 semanas após a infeção, observou-se
a deposição inicial de colagénio, indicando o início do
processo de cicatrização (Fig. 3C). O infiltrado inflamatório
era constituído principalmente por macrófagos, células
epitelióides com escassas células espumosas, linfócitos e
parasitas. Foram observados poucos plasmócitos e
polimorfonucleares (Fig. 3D)
IFN-v é constantemente produzido por células T CD4+ e
CD8+ no LN de drenagem de camundongos infectados com
L. braziliensis. Como a morte do parasita está associada à
produção de IFN-γ, as células do LN de drenagem foram
coradas para a expressão de citocinas intracelulares e
analisadas por citometria de fluxo. As frequências de estado
estacionário de células positivas para citocinas foram
determinadas utilizando células de nódulos linfáticos de
ratinhos inoculados com PBS. A frequência de células T CD4+
que produzem IFN-γ e citocinas anti-inflamatórias é
apresentada na Fig. 4. A frequência de células T CD4+
produtoras de IFN-γ aumentou da semana 2 à semana 6 pós-
infeção e diminuiu na semana 8. Esta diminuição foi
estatisticamente significativa em comparação com a semana 6
(P < 0,05) (Fig. 4). A frequência de células T CD4+
produtoras de IL-4 aumentou das semanas 2 a 4 pós-infeção e
diminuiu na semana 8. Foram observadas diferenças
estatisticamente significativas na produção de IL-4 entre as
semanas 4 e 8 (P < 0,05) (Fig. 4). A secreção de IL-5 e IL-10
pelas células T CD4+ não se alterou significativamente ao
longo da infeção, embora a percentagem de células T CD4+
secretoras de IL-10 tenha sido superior à frequência de células
VOL. 73, 2005de IL-5 (Fig. 4). Analisámos também a frequência MODELO DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA AMERICANA
secretoras 5831
de células T CD8+ produtoras de citocinas (Fig. 5).
Observamos um aumento na produção de IFN-γ pelas
células T CD8+ da semana 2 para as semanas 6 e 8 pós-
infeção (P < 0,01) e
5832 DE MOURA ET AL.
FIG. 3. Aspectos histológicos das lesões auriculares em
camundongos BALB/c após inoculação intradérmica de L. braziliensis.
Camundongos BALB/c (cinco camundongos por grupo) foram
infectados com 105 promastigotas de L. braziliensis. As orelhas foram
removidas às 5 (A e B) e 9 (C e D) semanas após a infeção e coradas
com hematoxilina e eosina. (A) Lesão ulcerada mostrando
INFECT. IMMUN.
da semana 4 para a semana 6 (P < 0,05). A expressão mais
alta de IFN-γ foi na semana 6 e, surpreendentemente, essa
expressão foi mantida na semana 8, diferentemente das células
T CD4+ produtoras de IFN-γ. Além disso, a expressão média
de IFN-γ pelas células T CD8+ foi superior à das células T
CD4+ (7% versus 3,8%). Também em contraste com as células
T CD4+ , a frequência mais elevada de células T CD8+
produtoras de IL-4, IL-5 e IL-10 foi observada na semana 6
pós-infeção e diminuiu na semana 8.
Para determinar se a expressão de citocinas intracelulares em
células de LN de drenagem ativadas por CD3-CD28 se
correlacionava com a expressão de proteínas em células de LN
de drenagem estimuladas por L. braziliensis, os níveis de
IFN-γ, IL-4 e IL-10 em sobrenadantes de cultura de células de
LN foram determinados por ELISA (fig. 6). O
desenvolvimento da lesão e a multiplicação do parasita nos
LNs drenantes foram associados à produção de IFN-γ, IL-4 e
IL-10. Em conformidade, a secreção de citocinas foi mais
elevada 2 semanas após a infeção e, posteriormente, a secreção
de IL-4 e IL-10 diminuiu, enquanto a secreção de IFN-γ
permaneceu elevada até 8 semanas após a infeção. As
quimiocinas CC são expressas nas orelhas e nos LNs de
drenagem de
Camundongos infectados com L. braziliensis. Para estudar a
expressão das citocinas CC, o RNA das orelhas infectadas e
dos LNs drenantes foi testado por RT-PCR. A expressão de
citocinas em estado estacionário foi determinada usando
células da orelha e dos linfonodos de camundongos não
infectados. Na derme da orelha, CCL2/MCP-1 foi detectado às
2 e às 4 semanas pós-infeção (Fig. 7A), o que se correlacionou
com o tamanho máximo da lesão e a carga parasitária (Fig. 1A
e 2). A expressão de CCL5/RANTES no ouvido foi detectada
às 4 e 6 semanas pós-infeção (Fig. 7A). A expressão de
CCL3/MIP-1α ou CCL4/ MIP-1β não foi detectada neste
local. Nos LNs de drenagem, a expressão de CCL2/ MCP-1 foi
detectada de 2 a 6 semanas após a infeção, enquanto
CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β e CCL5/RANTES foram
expressos durante toda a infeção (Fig. 7B).
DISCUSSÃO
Atualmente, os modelos experimentais para o estudo da
leishmaniose cutânea causada por L. braziliensis envolvem a
inoculação de um grande número de parasitas na pata de
camundongos (14, 22, 35). No modelo da pata, os
camundongos desenvolvem uma lesão transitória que se
resolve espontaneamente devido ao desenvolvimento de uma
forte resposta imune do tipo Th1 após a infeção (18). Numa
tentativa de reproduzir a biologia natural da transmissão de
Leishmania, Belkaid et al. estabeleceram um modelo dérmico
de infeção em que um número reduzido de promastigotas de L.
major é inoculado na derme auricular de ratinhos (5). No
presente estudo, estabelecemos um modelo semelhante usando
L. braziliensis. Após a inoculação dos parasitas na derme
auricular, camundongos BALB/c desenvolvem uma lesão
cutânea semelhante àquela desenvolvida por pacientes com
leishmaniose cutânea americana: localizada e ulcerada, com
bordas elevadas e uma cratera acentuada (23, 28),
extensa necrose fibrinoide e infiltrado inflamatório que se estende até a
epiderme. Ampliação, ×40. (B) Macrófagos parasitados são indicados
por setas finas, e células polimorfonucleares são indicadas por setas
largas. Ampliação, ×1.000. (C) A reconstituição epidérmica
VOL. 73, 2005 MODELO DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA AMERICANA 5833
acompanha o processo de cicatrização. Ampliação, ×100. (D) Os
macrófagos são indicados por setas finas e as células epitelioides são
indicadas por setas largas. Ampliação, ×400.
5834 DE MOURA ET AL.
FIG. 4. Produção de citocinas intracelulares por células T CD4+ de
camundongos BALB/c após inoculação intradérmica de L. braziliensis.
Os camundongos foram inoculados com PBS ou com 105
promastigotas de L. braziliensis. Às 2, 4, 6 e 8 semanas após a infeção,
os linfonodos de drenagem foram agrupados e as células foram pré-
incubadas com Brefeldina A por 4 h antes de serem coradas. Os dados
representam as percentagens de células com sinais para a citocina
específica que eram superiores aos sinais de fundo estabelecidos
utilizando controlos de isótipos. Os dados representam as médias e os
erros padrão das médias de três experiências independentes, cada uma
realizada com cinco ratos por grupo. *, P ≤ 0.05.
reforçando a noção de que o local de infeção desempenha um
papel importante na evolução da doença (3).
A conversão de L. braziliensis em parasitas metacíclicos é
muito ineficiente em condições de cultura padrão, e embora a
purificação metacíclica de L. braziliensis tenha sido relatada
(37), não conseguimos obter parasitas aglutinados para a
infeção intradérmica. Neste estudo, foram observadas lesões
dérmicas após a inoculação de 105 parasitas em fase
estacionária, enquanto estudos anteriores usando esta mesma
cepa de parasita mostraram que a inoculação de 107 parasitas
nas patas de camundongos BALB/c
INFECT. IMMUN.
FIG. 5. Produção de citocinas intracelulares por células T CD8+ de
camundongos BALB/c após inoculação intradérmica de L. braziliensis.
Os camundongos foram inoculados com PBS ou com 105
promastigotas de L. braziliensis. Às 2, 4, 6 e 8 semanas após a infeção,
os linfonodos de drenagem foram agrupados e as células foram pré-
incubadas com Brefeldina A por 4 h antes de serem coradas. Os dados
representam as percentagens de células com sinais para a citocina
específica que eram superiores aos sinais de fundo estabelecidos
utilizando controlos de isótipos. Os dados representam as médias e os
erros padrão das médias de três experiências independentes, cada uma
realizada com cinco ratos por grupo. *, P ≤ 0,05; **, P < 0,01.
conduz, comparativamente, a aumentos ligeiros da espessura
da almofada do pé (22).
No modelo da pata, os ratinhos BALB/c infectados com L.
bra- ziliensis desenvolvem uma inflamação local constituída
por macrófagos epitelióides e células polimorfonucleares (19,
22). Estas mesmas populações celulares foram recrutadas para
a derme auricular. No entanto, foi observado um recrutamento
acentuado de neutrófilos durante a infeção. A participação dos
neutrófilos nas lesões cutâneas da leishmaniose foi relatada
noutros estudos (2, 26). Em
 VOL. 73, 2005
FIG. 6. Produção de citocinas em camundongos BALB/c após inoculação intradérmica de L. braziliensis. Os camundongos foram infectados com 105
promastigotas. Às 2, 4, 6 e 8 semanas após a infeção, as células dos gânglios linfáticos drenantes foram recolhidas e estimuladas (barras sólidas) ou
L. braziliensis por 48 h (IL-4 e IL-10) ou 72 h (IFN-γ). Os níveis de citocinas nos sobrenadantes foram determinados por ELISA. Os dados
representam as médias e os erros padrão das médias de três experiências independentes, cada uma realizada com cinco ratos por grupo.
Em ratinhos C57BL/6 resistentes, os neutrófilos impedem o
crescimento de L. major e a depleção de neutrófilos exacerba a
infeção (41). A ligação cruzada de CD28 nos neutrófilos
resulta na libertação de IFN-γ que, por sua vez, restringe a
replicação do parasita nos macrófagos (50). No entanto, em
ratinhos BALB/c infectados com L. major, a depleção
transitória de neutrófilos leva a uma diminuição da
FIG. 7. Expressão de mRNA de quimiocinas em camundongos
BALB/c após inoculação intra-dérmica de L. braziliensis. Os
camundongos foram infectados com 105 promastigotas de L.
braziliensis. Às 2, 4, 6 e 8 semanas pós-infeção, o RNA total foi obtido
de orelhas agrupadas (A), linfonodos drenantes (B) e camundongos
não infectados (UN). O ARN total foi utilizado em RT-PCR para a
amplificação de CCL2/MCP-1, CCL3/MIP1-α, CCL4-MIP1-β,
CCL5/ RANTES e β-actina. Os dados apresentados são de uma
única experiência representativa de três experiências separadas, cada
uma efectuada com cinco ratinhos.
MODELO DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA AMERICANA 5835
L. braziliensis
não (barras abertas) com
resposta imunitária do tipo Th2 e resolução parcial das lesões
nas patas (46). Por conseguinte, é possível que os neutrófilos
tenham desempenhado ativamente um papel protetor no nosso
modelo experimental, tal como observado em ratinhos B6
infectados com L. major. No entanto, ainda temos de
determinar como é que esta proteção é mediada.
Em modelos experimentais de leishmaniose cutânea, a
resistência depende do desenvolvimento de uma resposta Th1
predominante que leva ao controlo do crescimento do parasita,
à cicatrização da lesão e ao desenvolvimento de imunidade
protetora (29, 40, 42). A incapacidade de montar este tipo de
resposta resulta em doença progressiva. Assim, camundongos
BALB/c são relativamente resistentes à infeção por L.
braziliensis devido à potente resposta imune Th1 que se
desenvolve após a infeção, caracterizada por altos níveis de
IFN-γ e baixos níveis de IL-4 e IL-10 (18). Utilizando o
modelo de infeção por patas, foi demonstrado que as células T
CD8+ reativas à Leishmania são encontradas em maior
número em camundongos resistentes (49). O papel das células
T CD8+ foi recentemente reexaminado no contexto da infeção
dérmica com L. major, em que o desenvolvimento da lesão foi
acompanhado pela morte do parasita na derme auricular e este
resultado foi associado à acumulação de células T CD8+ na
pele e à sua capacidade de libertar IFN-γ após estimulação
(8). No presente estudo, a infeção da derme auricular em
ratinhos levou a uma forte produção de IFN-γ, segregada por
células T CD4+ e CD8+ . A presença precoce de IFN-γ
correlacionou-se com o controlo da replicação do parasita
na derme auricular e, consequentemente, com a cicatrização da
lesão. Uma vez que não foi observada qualquer patologia
evidente, concluímos que os efeitos pró-inflamatórios do IFN-
γ foram corretamente equilibrados pela presença de IL-4, IL-5
e IL-10, que também foram detectados durante a infeção. É
importante salientar que esta resposta imunitária foi eficaz na
eliminação de parasitas da derme da orelha; no entanto, foi
observada a persistência de parasitas nos gânglios linfáticos de
drenagem.
Utilizando o modelo do pedal, mostrámos recentemente que
esta par-
Uma cepa específica de L. braziliensis induz a expressão de
CCL2/ MCP-1, CCL3/MIP-1α e CXCL1/KC em
camundongos BALB/c (47). CCL2/MCP-1α e
CCL3/MIP-α são potentes quimioatraentes para monócitos
(20, 25), e sua expressão na orelha e nos LNs de drenagem de
camundongos infectados com L. braziliensis pode recrutar
células hospedeiras, promovendo a multiplicação do parasita e
5836
o DE MOURAde
desenvolvimento ETlesões.
AL. Mais tarde, durante a infeção, a INFECT. IMMUN.
expressão de CCL2/MCP-1 na derme da orelha pode estar
relacionada com a cicatrização da lesão, uma vez que essa
quimiocina participa da indução de atividades leishmanicidas
em macrófagos murinos (9). A expressão de CCL3/MIP-
1α, CCL4/MIP-1β e CCL5/RANTES nos LNs drenantes
pode
VOL. 73, 2005 MODELO DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA AMERICANA 5837

5. Belkaid, Y., S. Kamhawi, G. Modi, J. Valenzuela, N. Noben-Trauth, E.

contribuem para o rápido desenvolvimento de uma resposta Rowton, J. Ribeiro, e D. L. Sacks. 1998. Desenvolvimento de um modelo
imunitária do tipo Th1 que, curiosamente, não consegue natural
eliminar os parasitas presentes nesse mesmo local. Por outro
lado, é possível que
L. braziliensis está a interferir com a apoptose das células
hospedeiras, como foi demonstrado na infeção de macrófagos
com promastigotas de Leishmania donovani (34).
A persistência do parasita pode estar relacionada quer com a
avaliação imunitária quer com a imunossupressão. Foi
demonstrado que tanto os ratos como os humanos continuam a
albergar parasitas no tecido linfoide após cura espontânea ou
mediada por quimioterapia (1, 39, 44). No modelo de infeção
por L. major, os parasitas persistentes foram associados a
fibroblastos do LN que, em comparação com macrófagos, têm
uma capacidade reduzida de matar L. major intracelular. Além
disso, foi demonstrado que os fibroblastos da pele humana são
capazes de absorver parasitas de Leishmania (13, 17, 45).
Embora não tenhamos determinado que tipo de célula está a
albergar
L. braziliensis nos LNs, os fibroblastos parecem ser um alvo
provável. Em termos de imunossupressão, também foi descrita
a participação de células T reguladoras na persistência da L.
major (7, 32). As células T reguladoras podem, portanto,
desempenhar um papel benéfico, controlando a patologia
evidente e assegurando a imunidade à re-infeção. É importante
ressaltar que observamos que camundongos curados são
imunes a uma infeção de desafio com L. braziliensis na derme
da orelha (dados não mostrados). Proteção contra desafio
homólogo e heterólogo foi observada em outros lugares após
uma infeção primária por L. braziliensis (27, 38).
O estudo aqui apresentado mostra que camundongos
BALB/c infectados na derme auricular com L. braziliensis
desenvolvem lesões ulceradas que se curam espontaneamente.
A regressão das lesões é garantida pelo desenvolvimento de
uma potente resposta imune Th1, onde as células T CD8+
podem ter um papel importante na eliminação do parasita. No
entanto, esta resposta imunitária celular é incapaz de controlar
a replicação do parasita nos LNs drenantes. Uma vez que a
inoculação dérmica de L. braziliensis mostrada aqui reproduz
ativamente muitos aspectos da infeção natural, este modelo
agora nos permite abordar os mecanismos imunológicos
básicos de persis- tência que levam à imunidade mucocutânea
ou, mais importante, à imunidade protetora.

AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Manoel Barral-Netto e Maria Jania Teixeira pela
leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a Margarida Pompeu e
Wash- ington L. C. Dos-Santos pela ajuda na análise histológica.
Este trabalho é apoiado por bolsas da FAPESB, PAPES/ FIOCRUZ
e CNPq. T.R.d.M. foi apoiado por uma bolsa do CNPq;
F.O.N. e C.I.d.O. foram apoiados por bolsas da FAPESB. A. Barral e
C. Brodskyn são investigadores sénior do CNPq e do Instituto de
Investiga¸c˜ao em Imunologia (iii).

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