Resumo de Engenharia Enzimática

Enzima
Aceleram reações químicas sem

deslocar o equilíbrio químico como:
açúcar → CO2 + H2O + energia
*Reação exergônica, espontânea.
Atuam em condições amenas de pH

e T (normalmente), mas também
funcionam em condições extremas
(hipertermófilos e psicrófilos).
∆G++ é a energia de ativação
Há 6 grandes grupos de enzimas:
Hidrolases: lizam substratos e
A temperatura e o pH influenciam
são as mais importantes;
enzimas e substratos. A formação de
ligações covalentes contribui para ↑
Transferases;
a energia de ativação e a energia
de ligação que é liberada na
Ligases: sintetizam, são as mais
formação de ligações fracas (S-E) ↑
difíceis de trabalhar;
especificidade e ↓ a energia de
Oxiredutases; ativação.
Tipos de interações que contribuem

Isomerases; para a catálise de enzimas como:
Catálise geral ácido-base
Liases; (transferência de H+);
Toda enzima possui um sítio ativo, Catálise covalente (ativação de

onde o substrato interage e forma o substrato formando ligação covalente
complexo E-S que forma o produto ou transitória E-S);
que posteriormente é liberado.
Catálise por íons metálicos
(estabilizam estados de
transição, é a mais usada).
A reação enzimática é:
E + S ⇌ ES ⇌ EP ⇌ E + P
Quando há a presença do
catalisador:
Página 1 de Engenharia enzimática

Enzimas na indústria
Podem ser: poluente.
Produtos finais(biosensores,
detergente, farmácia); Complementação das enzimas
endógenas (amilase/protease) e
Adjuvantes em processos: exógenas (celulases e fitases).
facilitar o processamento, seta
desperdícios, prevenir problemas Enzimas degradam fibras com efeitos
técnicos (têxtil, papel, curtume); antinutricionais e suplementam a
capacidade digestiva.
Produção de alimentos e
bebidas (carne, óleos e gorduras, Fitases ↑ a disponibilidade de Porg, ↓
proteínas); a liberação no ambiente, pois é
transformado em ácido fítico é
Biotransformação (biorremediação, responsável pelo armazenamento de
antibiótico, biocombustível, resíduos). P em vegetais, quando o animal se
alimenta dele, ↑ peso e o transforma
Em sua maioria as enzimas são em inositol. O fítico induz a
hidrolases (despolimerizam eutrofização de rios, ou seja,
substâncias naturais), proteases acumulo de algas na superfície ↓
é o grupo principal por ser captação de O2
utilizada em alimentos e
produtos de limpeza. Tem as Indústria de detergentes e sabão
glucanases para tecido, em pó
cerveja, panificação e outros. A metade dos detergentes possuem
Importância nacional enzimas (celulase amacia a roupa, lipases
por ex.), para ↑ a eficiência dos
Agrega valor, biocatalisadores,
detergentes em lavagens de ↓T°C e
biodiversidade, processos
essas enzimas devem se manter
fermentativos e extrativos,
ativas em pH alcalino (devido ao
catálise química.
sabão) e T°C variadas.
A tecnologia enzimática trata
Indústria farmacêutica
com prioridade a produção e o
uso de enzimas industriais. Biocatalizadores in vivo.
Beneficia vários setores (alimentos, Um exemplo é a asparaginase

químicos, fármaco, têxtil, papel e indicada para terapia de leucemia.
celulose, biocombustíveis).
A célula tumoral não faz a síntese de
Indústria de alimentação asparagina a partir de aspartato
animal e rações por não conseguir produzir a enzima
Adição de enzimas exógenas responsável pela síntese.
(que não são do animal), ↑ a
digestibilidade e ↓ carga Há também os biocatalizadores
para diagnósticos como o método

ELISA (ensaio imunossorvente ligado a Lactase geralmente é imobilizada
enzima), geralmente os kits são para realizar a quebra da lactose
compostos por 3 enzimas no mínimo. em glucose e galactose,
acarretando num efeito edulcorante
(+ doce).
Indústria de papel
Xilanases (+ comuns depois da celulose) Indústria de antibióticos
dificultam o processo de tingimento
Penincilinas naturais se tornaram
do papel. Assim remove-se os xilanos
ineficazes (degrada do pH estomacal e
(hemicelulose) precipitada nas fibras
bactérias se tornaram resistentes), então
que serve de barreira para os
sintetizou-se a partir do ácido de
químicos do branqueamento.
uma bactéria que auxilia a síntese
Oxidoredutases (lacases) também são
de amoxilina por ex.
usadas.
Indústria do processamento de
Remoção de H2O do papel e amido
partículas de tinta.
Amido é um polímero de glicose
(como celulose, só muda a ligação
Lipases ajudam na remoção de
glicosídica), utiliza-se amilases e
lipídeos (pitch's) de coníferas (+
glicoses isomerase, substitui
resinosas) que dão fragilidade ao
processos químicos ↓ custos e
papel.
resíduos.
Indústria têxtil Indústria de química fina
O amido é adicionado ao algodão
e depois tira-se esse amido por meio Vitamina C, inseticida, ibuprofeno
(lipases, proteases de leveduras atuam na
de amilases (desencolagem), e melhora
resolução racêmica – Transforma R em S-
removendo ceras, pectinas e etc. ibuprofeno e separa-se o resto do R em
cromatografia, aumentando a
O branqueamento do algodão produtividade produzindo o isômero).
pode ser feito por peróxido de
hidrogênio, o qual deve ser Síntese de acrilamida por enzimas
removido depois pelas catalases hidratases.
(lise) para facilitar a remoção (↓ A via química possui muito mais
consumo de H2O na lavagem).
processos do que o microbiano
(enzimático).
Celulase ajuda na propriedades
das fibras e sua degradação
(maciez).
Indústria de laticínios
Proteases e lipases (quimosina) para
produção de queijos, lactase para
tratar o leite/soro, catalase para
remover peróxido de hidrogênio de
embalagens/equipamentos e por fim
as lipases dão flavor.
A quimosina (vinda do estômago do

vitelo ou de forma recombinante)
emulsiona a micela de caseína.

Estratégias de catálise
As enzimas podem ter mais de um conformação necessária para
mecanismo de catálise catálise.
acontecendo.
Grupo reativo (geralmente nucleófilo)

está no sítio catalítico. O qual inicia
Quimotripsina (serino-protease);
a reação, a partir de um ataque
nucleofílico ocorre a formação de Anidrase carbônica;
uma ligação covalente temporária
EcoRV (endonuclease que quebra
entre enzima e substrato (que se forma regiões específicas de DNA, sendo
e se desmancha rapidamente). enzimas de restrição);
Nucleosídeo monofosfato
quinase (quinase).
Participação de um doador/aceptor
de prótons (exceto H2O), que faz Proteases
parte da enzima.
Quebram proteínas por meio de
Ácido: doa próton. hidrólise, devendo haver H2O no
Básico: doa um elétron. meio.
Enzimas que conhecem 2 substratos

distintos (1° altera a conformação
quando o 1° substrato se liga, assim o 2° A entrada de H2O tem a ver com a
substrato se liga mudando novamente a atividade catalítica da protease
conformação). hidrolisando.
↑ a taxa da reação pela O caráter principal de uma ligação
aproximação dos 2 substratos. peptídica (em vermelho) é a “dupla
ligação” devido a ressonância,
dificultando a hidrólise. Conferindo
caráter coplanar e rigidez.
Íons metálicos podem facilitar a
formação de nucleófilos (tem que
haver íons metálicos para que isso ocorra). Promove a quebra seletiva de
ligações no lado carbóxi-terminal de
Podem também coordenar
grandes aminoácidos hidrofóbicos
diretamente o substrato, ↑ energia (triptofano, tirosina, fenilalanina e
de ligação e promovendo a metionina).

Os mecanismo de catálise são: Passo 1: Sítio ativo livre (se regenera)
catálise covalente e catálise geral e ocorre a desprotonação da serina
acidobásico. formando o íon alcóxido que vai
atuar como nucleófilo no substrato.
Passo 2: Há a formação da ligação

covalente transitória (serina e
substrato) e a histidina fica
protonada.
O nucleófilo ataca o carbono da

carbonila, por que ele tem uma Passo 3: Como a ligação covalente
carga parcial positiva (por conta do é instável ele não consegue manter,
oxigênio eletronegativo). o próton da histidina interage* com
o hidrogênio formando outra
ligação covalente.
*Estratégia geral base
Passo 4: Assim o grupo que contém

o nitrogênio é liberado e a
carbonila fica ligada a enzima.
*É um grupo acil/acila que se liga.

Passo 5: A molécula de H2O
acessando o sitio catalítico que
A serina é essencial para o está em uma ligação transiente, um
mecanismo catalítico da dos hidrogênios vai se ligar a um
quimiotripsina, poque o DIPF se liga nitrogênio da histidina.
a hidroxila da quimiotripsina,
sessando/inativando
irreversivelmente a atividade Passo 6 E 7: Assim ocorre a
catalítica. liberação do substrato (com a
A tríade catalítica da quimiotripsina hidroxila da H2O).
tem uma conformação na qual
favorece a desprotonação da
Passo 8: Por fim tem-se a estratégia
serina formando um potente
de catálise ácida, para recompor a
nucleófilo (íon alcóxido).
molécula de serina.
Importante para imobilização do

substrato na quimiotripsina, tripsina
(arginina, positivo) e elastase (serina,
glicina, aminoácidos <).

A anidrase é uma estratégia de
catálise de implicações de íons
metálicos, por possuir zinco. Em seu
Funcionam muito bem, a subtilisina sítio catalítico tem-se 3 histidinas
não é homóloga a quimiotripsina que coordenam esse zinco.
(não tem mesma origem evolutiva), está Há o fluxo dos prótons (por causa de
havendo evolução convergente. uma base forte como tampão) para fora
EX: Enzima do trigo (carboxipeptidase 2).
do sítio catalítico, assim pode
ocorrer-se a formação do nucleófilo.
Usam da estratégia de formação de

As endonucleases (diméricas, cada
nucleófilos. Pode ser a água.
dímero reconhecendo um sentido) atuam
*Ex: inibidores de proteases (aspartil) no HIV. como uma enzima de restrição no
Ininavir possui um grupo hidroxila DNA. A hidrólise do DNA ocorre na
que imita a H2O e é coordenado ligação fosfodiéster (3’-hidroxil livre e
5’-fosforil livre).
por um aspartato, se liga mas não
forma um nucleófilo e possui partes *reconhece sequências palindrômicas.
da molécula que interagem com a
protease (região próxima do flap* e
fecha a cavidade da proteína).
Não ocorre a hidrolise da ligação
fosfodiéster nas bactérias por que
*estrutura que abre e fecha a cavidade possuem metilases (inserção de um
da proteína.
grupo metil na base nitrogenada) que
dificultam as endonucleases de
reconhecer essas sequências
Metaloproteínas possuem um cofator
palindrômicas.
(zinco) que sem ele, ela não funciona.
Enzimas encontradas em bactérias e

arqueias que atacam o DNA,
Realizam a hidratação do CO2, participam da defesa destes
promovendo a formação de ácido microrganismos contra infecções
carbônico e íons bicarbonato. virais e apresentam elevada
especificidade (pelo modo de ação da
Tem papel essencial em processos enzima) para determinar sequências
de transporte e fenômenos de DNA.
enzimáticos dependentes da
disponibilidade de CO2 e HCO3-.
Dobra da sequência de DNA (kink)
deixando-a fácil para ser quebrada,
assim o magnésio ativa e posiciona
a H2O para o ataque nucleofílico à

ligação fosfodiéster.
Catálise por aproximação

Catalisam a transferência de um
grupo fosforil terminal de um
nucleosídeo trifosfato (NTP - ATP)
para um nucleosídeo monofosfato
(NMP).
Transferência direta sem a

participação da H2O (sem hidrólise).
É uma reação ↑ exergônica, para

isso acopla-se reações, para
“esconder” da H2O essa reação, há
a catálise por aproximação (loop P
com ATP).
O loop P se liga com o sítio

catalítico que se dobra, tem-se um
outro sítio ativo que o NMP entra
após ATP, fechando mais o loop
ainda. Assim se aproximam fechando
mais as estruturas (deixando-a
hidrofóbica).

Vídeos Catálise enzimática
pela quebra dessa ligação

Enzimas são catalizadores temporária para ser possível ser
biológicos que ↑ velocidade de usada novamente.
vários tipos de reações que
acontecem dentro de nossas células, Catálise por aproximação e/ou
unindo uma molécula do substrato orientação
com o sítio ativo, dentro deste há
uma mudança de conformação Baseado na teoria de colisão de
espacial que estabiliza a molécula química, as “enzimas trazem” as
do substrato. moléculas de substrato para uma
região pequena, o que cria um
As interações realizadas entre sitio micro-espaço dentro do sítio ativo
ativo e substrato liberam uma possibilitando maior proximidade e
energia de ligação que estabiliza o orientação 3D entre as moléculas
estado transitório da reação em si, para reação acontecer e os
o que ↓ energia de ativação da produtos sejam formados.
reação (assim fica mais fácil e rápido de
acontecer as reações).
Catálise por Ácido-Base
"↓ energia de ativação → ↑ *quimiotripsina - tem a serina como resíduo
velocidade de reação" catalítico participando para criar um
nucleófilo.
A enzima pode usar um desses

métodos ou pode fazer a Acontece por meio da transferência
combinação deles dentro de seu do íon H+ com os resíduos catalíticos
sítio ativo para a lição ocorrer: dentro do sítio ativo, a histidina
exerce um grande papel em muitas
enzimas dentro dos sítios ativos.
Catálise covalente
*tripsina e quimiotripsina e enzimas
digestivas. A transferência de íons H+ cria um
forte nucleófilo capaz de contribuir
Dentro do sítio ativo há resíduos nas reações enzimáticas criando
catalíticos, alguns aminoácidos que uma ligação covalente temporária.
são parte do sítio catalítico, são
responsáveis por formar uma ligação
covalente temporária para manter a Além disso, pode estabilizar
molécula do substrato no lugar em diferentes grupos químicos
que a reação acontece (sítio ativo). carregados negativamente dentro
dos resíduos catalíticos e ↑
eletrostática em conjunto com o sítio
A regeneração da enzima é feita

ativo para estabilizar o estado de nucleófilo e ataca o carbono da
transição da reação química. carbonila da ligação peptídica.
Quimiotripsina usa o método de Por conta de sua cadeia principal

catálise covalente e ácido-base ser um álcool, ela não é um
ao mesmo tempo! nucleófilo naturalmente muito forte,
porém para mudar isso o trabalho
em conjunto com o aspartato e
Catálise Metal-Íon histidina para transformar a cadeia
principal da serina em sua base
*mioglobina e hemoglobina, anidrase conjugada (alcóxido) devido a sua
carbônica.
melhor densidade eletrônica em
volta de oxigênio e, por ser mais
forte como nucleófilo.
Como os átomos dos metais tem a
capacidade de perder elétrons Aspartato 102
muito fácil, deixando a carga
positiva a qual pode ser usada
para interagir com diferentes tipos
de moléculas dentro do sítio ativo.
Esses átomos metálicos estabilizam o

estado de transição de modo que
as moléculas intermediárias das
reações são formadas no sítio ativo.
Ele se posiciona e interage com a
histidina para que ela se oriente a
Além disso, eles podem ajudar a fim de que o par de elétrons do
formar um nucleófilo forte e manter e nitrogênio se liguem ao H+ da serina
orientar a molécula de substrato no para formar o alcóxido e quebrar a
lugar certo do sítio ativo para ser ligação peptídica.
realizado a reação.
Histidina 57
Ela ajuda a transformar a molécula

de água em um hidróxido (o nitrogênio
da histidina pega o H+ da água) para
3 diferentes aminoácidos (asp – 102, atuar como um nucleófilo, visto que
his – 57 e ser – 197) que atuam juntos
ela sozinha não é forte o suficiente
para promover e catalisar a quebra para atacar o carbono da dupla
de ligações peptídicas por meio da ligação.
formação de um forte nucleófilo. A
tríade catalítica está dentro do sítio
ativo.
Serina 197
Esse resíduo atua como um

Estudo dirigido
grupo hidroxila, de modo que fique
Questão 1 - Observar a estrutura posicionado para desprotonação.
da quimiotripsina em cartoon, Na presença do substrato, o resíduo
de histidina aceita o próton do
destacando as diferentes cadeias
grupo hidroxila da serina, assim o
polipeptídicas e ligações resíduo atua como catalizador
dissulfeto intra e intercadeias. básico geral. A retirada do próton
do grupo hidroxila gera um íon
alcóxido, que é um nucleófilo muito
mais poderoso que um álcool. O
resíduo aspartato (102) ajuda a
orientar o resíduo de histidina e a
torná-lo um melhor aceptor de
prótons por meio de pontes de
hidrogênio e efeitos eletrostáticos.
Questão 3 - Gerar superfície e
Nesta imagem observa-se as
ligações dissulfeto intracadeias na identificar a cavidade do sítio
cor vermelha e as ligações dissulfeto ativo. Identificar na superfície do
intercadeias na cor amarela. modelo a posição do íon alcóxido
Observa-se também as cadeias A no sítio ativo. Observar
(na cor verde), B (na cor azul) e C (na profundidade da cavidade e
cor rosa). discutir seu papel na
Questão 2 - Selecionar a tríade especificidade da enzima.
catalítica (resíduos 57,102 e 195).
Exibir resíduos como sticks e
observar a relação espacial entre
eles. Qual o papel de cada
resíduo da tríade catalítica?
Identificar o nucleófilo
responsável pelo ataque à Na imagem acima tem-se em rosa o
ligação peptídica do substrato. sítio catalítico.
O resíduo de histidina (57) serve

para posicionar a cadeia lateral da Na imagem acima tem-se em
serina (195) e para polarizar o seu

vermelho o íon alcóxido contido na da quimiotripsina. Assim haverá uma
serina. Ampliando a figura anterior ligação de uma cadeia lateral que
temos: posicionará o sítio ativo para a
clivagem.
Questão 1 - Com base na entrada

do PDB referente a este complexo,
identificar as cadeias da tripsina
e inibidor.
Nota-se que a direita da serina
temos a cavidade do sítio ativo.
Cada enzima possui uma cavidade

(seta azul) cujo formato é específico
para o substrato interagir com esta,
essa cavidade pode ser chamada
de bolsa, e no caso da
quimiotripsina é formada devido a
três resíduos diferentes (tríade Na imagem acima (como surface)
catalítica)acarretando em três temos a tripsina (em azul) e seu
especificidade diferentes. inibidor (em rosa).
Graças a profundidade desse Questão 2 - Separar cadeias em
arcabouço, favorece a ligação de dois arquivos PDB separados
resíduos com longas cadeias laterais utilizando o programa WordPad.
hidrofóbicas.
Questão 4 - Identificar cavidade
oxianiônica (resíduos 195 e 193).
Qual o papel desta cavidade no
mecanismo catalítico da
quimiotripsina?
Na imagem acima temos somente a
estrutura da tripsina (em cartoon).
Na imagem acima tem-se uma bolsa Na imagem acima temos somente a

(seta vermelha), e à esquerda tem-se estrutura do inibidor de tripsina (em
os resíduos 193 à 195 (em verde). cartoon).
Tal estrutura (cavidade) possui o Questão 3 - Selecione a tríade

papel de estabilizar esse catalítica (resíduos 57, 102 e 195)
intermediário tetraédrico da reação da tripsina. Exibir resíduos como

sticks e observar a relação azul escuro agora tem-se
espacial entre eles. representado a serina 189 da
tripsina.
Acima podemos observar os resíduos

de serina (195), histidina (57) e
asparagina (102).
Questão 4 - Gerar superfície da
tripsina e identificar cavidade do Na imagem acima temos a
sítio ativo. Identificar na superfície quimiotripsina, na seta vermelha
do modelo a posição do íon temos sua cavidade do sítio ativo e
alcóxido do sítio ativo. Observar acima em vermelho escuro temos a
posição do resíduo Asp189 e serina 189.
discutir seu papel na Na quimiotripsina um lado dos sítios
especificidade da tripsina de especificidade é composto pelos
(comparar com o resíduo Ser189 da resíduos desde o 189 ao 192. E
quimiotripsina). neste caso a cavidade não está
totalmente formada no zimogênio.
Na tripsina o resíduo 189 há uma

mutação transformando-a de serina
em aspartato, este faz uma ponte
salina com a lisina 15 (do inibidor).
Questão 5 - Observar interação
entre o inibidor e a tripsina. Por
que o inibidor é capaz de
Na imagem acima, tem-se em azul bloquear a atividade enzimática
escuro o íon alcóxido (presente na da tripsina?
serina) e na seta vermelha a Por que o inibidor se liga firmemente
cavidade do sítio ativo. ao sítio ativo e esse complexo não
dissocia com o tratamento de
agentes desnaturantes.
A estabilidade desse complexo
enzima-inibidor é alta (pode ser
devido a muitas pontes de hidrogênio
terem sido formadas) devido ao inibidor
ser análogo a um substrato muito
efetivo.
Na imagem acima ainda tem-se a
cavidade na seta vermelha, e em Questão 1 - Observar a estrutura

da anidrase carbônica II em Na imagem é possível observar em
cartoon, destacando os elementos rosa o íon Zn+, em azul o resíduo
os elementos de estrutura 119, em vermelho o resíduo 94, em
secundária presentes. amarelo o resíduo 96 e em preto o
íon bicarbonato.
O zinco facilita a liberação de um
próton de uma molécula de água,
gerando um íon hidróxido. O CO2
liga-se então ao sítio ativo da
anidrase e é posicionado para
reagir com o hidróxido formado, este
atacará o CO2, convertendo-o em
bicarbonato. Por fim o sítio catalítico
Na imagem acima temos estruturas é regenerado com a liberação do
secundárias representadas nas íon bicarbonato e a ligação de
cores azul (alfa-hélice) e vermelha outra molécula de água.
(folha beta).
Questão 4 - Identificar o resíduo
Questão 2 - Observar o sítio His64 e exibi-lo na forma de sticks.
ativo (resíduos 94, 96 e 119). Discutir a importância deste
Exibir resíduos como sticks e resíduo para a formação dos íons
observar a relação espacial entre bicarbonato.
eles, Identificar o íon Zn+ e exibi-
lo como esfera.
Em rosa temos o íon Zn+, em azul

temos o resíduo 119, em vermelho o Em roxo é possível identificar-se o
94 e em amarelo o 96. resíduo 64.
Questão 3 - Identificar o íon A histidina 64 faz parte de uma

"lançadeira de prótons", ou seja,
bicarbonato e exibi-lo na forma
esse resíduo transfere prótons da
de sticks. Discutir o papel do íon molécula de água ligada ao zinco
Zn+ na reação catalítica de para a superfície da proteína, em
formação do íon bicarbonato. seguida para o tampão, esta
evolução ocorreu por que muitos
tampões são grandes para alcançar
o sítio ativo da anidrase.
Questão 1 - Observar as
estruturas de adenilato quinase

com representação em cartoon e ATP), pois esta enzima atua na
identificar a adenilato quinase interconversão desses.
nativa e a complexada com o Questão 4 - Alinhar as duas
inibidor AP5A. estruturas (nativa e complexada ao
inibidor) e verificar o valor de RMSD
da sobreposição. Observe os
loops P das 2 estruturas e
destaque as principais diferenças
estruturais relacionadas com o
processo de ajuste induzido
Na imagem acima temos a adenilato (induced fit). Qual o papel deste
quinase nativa (em rosa) e a loop no mecanismo de catálise da
adenilato quinase complexada com
adenilato quinase?
o inibidor AP5A (em azul).
Questão 2 - Identifique e
destaque na estrutura nativa o
loop P, que possui uma sequência
típica de resíduos de aminoácidos
Gly-X-X-X-X-Gly-Lys.
Na imagem acima é possível verificar

a sobreposição.
Acima observa-se o loop P (cor azul).

Questão 3 - Identifique na
estrutura da adenilato quinase
complexada ao inibidor o loop P.
Destaque também o inibidor com a
representação em sticks. O Na imagem acima podemos notar a
inibidor ocupa a posição de qual sobreposição dos loops, cuja a
principal diferença é que há um
substrato no sítio catalítico dessa
deslocamento na horizontal, ou seja,
enzima?
eles não se sobrepõem
perfeitamente.
O valor do RMSD fora de 1,666 (140
para 140 átomos).
Na ausência desse loop-P a
proteína passa para seu estado
estável e não nativo. A lisina contida
no loop-P orienta o fosfato
O inibidor ocupa o lugar de nucleosídico a se ligar nos resíduos
nucleotídeos de adenina (AMP,ADP e do sítio ativo.

Cinética enzimática
A reação enzimática se dá em
diferentes fases:
A cinética enzimática é o estudo da

velocidade das reações enzimáticas
e como ela se modifica a partir da
variação de parâmetros
experimentais.
O Km é a constante de Michaelis,
Alguns fatores modificam a que é o valor da [substrato] quando
velocidade de uma reação a velocidade reacional é metade
catalisada por enzimas como: da velocidade máxima.
[enzima]; A constante de Michaelis constitui
uma importante característica de
T °C; uma reação catalisada por enzima
e é significativo devido sua função
biológica.
pH;
A Vmáx. pode ser interpretada como
o número de renovação de uma
↑ progressivo da [substrato]; enzima, ou seja, o número de
moléculas de substrato convertidas
Presença de inibidores. em produto por uma molécula de
enzima em uma unidade de tempo,
levando em conta o momento que a
enzima está totalmente saturada
com substrato.
O complexo enzima-substrato é a
chave para compreender o
comportamento catalítico das
enzimas.
A velocidade de catálise (V0) é o
número de moles de produto
formado, no início da reação (t ≈ 0), A interconversão entre substrato e
por segundo. produto no complexo enzima-
substrato possui ↑ velocidade, mas a
Essa V0 ↑ linearmente à medida que
etapa de interconversão o complexo
↑ [substrato] e, logo em seguida
enzima-substrato em enzima e
começa a se estabilizar e se
produto possui ↓ velocidade, ou
aproximas de um valor máximo em [ ]
seja, essa é a etapa limitante da
mais altas de substrato.
reação catalítica.

Quanto < a [substrato], mais teremos
a enzima sem estar complexada, se
o oposto ocorre, se houver >
[substrato], há a formação do Etapa 1
complexo E-S (enzima-substrato).
A velocidade de formação e quebra
do complexo E-S são determinadas
Estado pré-estacionário possui um ↑ pelas etapas governadas pelas
[complexo enzima-substrato], cuja constantes k1 (formação) e k-1 + k2
variação de tempo é muito ↓ (micro (quebra em reagentes e produtos).
segundos).
Velocidade de formação:
Briggs e Haldane sugeriram a ES = k1 ([Etotal] – [ES]) [S]
suposição do estado estacionário,
que é: Velocidade de quebra:
Num estado de equilíbrio dinâmico, ES = k-1 [ES] + k2 [ES]
as [intermediários] (neste caso o
complexo enzima-substrato) permanecem Etapa 2
as mesmas, mesmo se houver
alterações nas [materiais iniciais] (ou V0 reflete o estado estacionário da
seja, em V0) e dos produtos. Tal reação, no qual [ES] é constate.
estado de equilíbrio é alcançado Neste caso, a velocidade de
quando as velocidades tanto de formação e quebra de ES são iguais
formação quanto de degradação (hipótese do estado estacionário).
do complexo enzima-substrato as
k1 ([Etotal] – [ES]) [S] = k-1 [ES] + k2
mesmas. [ES]
A equação de Michaelis-Menten
busca explicar as características Etapa 3
cinéticas utilizando o complexo ES
(enzima-substrato), o qual é um
Passos algébricos para resolver a
equação da hipótese do estado
intermediário imprescindível na
catálise, cuja a finalidade era estacionário.
entender o comportamento k1 ([Etotal] – [ES]) [S] = k-1 [ES] + k2 [ES]
catalítico das enzimas.
k1 ([Etotal] [S] – k1 [ES]) [S] = (k-1 + k2)
[ES]
A razão entre a [substrato] e V0
pode ser expressada
quantitativamente por: Adicionando o termo k1 [ES, [S] aos
dois lados da equação e
simplificando:
k1 [Etotal] [S] = (k1 [S] + k-1 + k2) [ES]

Muitas enzimas deste tipo
(dependentes hiperbolicamente de V0
*Em negrito encontra-se a constante de sobre [S]) têm mais de 2 etapas de
Michaelis (Km). reação.
Vmáx e Km fornecem poucas

informações sobre o número, as
Etapa 4
velocidades ou a natureza química
V0 expresso em termos de [ES]. das etapas das reações.
V0 = k2 [ES] ⸫
Uma vez que Vmáx ocorre quando a

enzima está saturada (i.e., [ES] = [Etotal], O valor de Km é a medida da
V0) pode ser definida como k2 [Etotal]. afinidade da enzima pelo substrato.
A etapa E-P é a etapa limitante da

velocidade, assim a constante de
Temos uma relação importante: velocidade dessa etapa é Kcat
(número de renovação ou turnover).
Dividindo-se por Vmáx, obtém-se:

⸫ Km + [S] = 2 [S]
Ou, Km = 2 [S], quando
No gráfico acima pode-se notar

como uma reação de 1ª ordem
(estacionária) se comporta
comparado a uma reação de O Turnover é uma constante de
ordem zero (pré-estacionária). velocidade de 1ª ordem que

corresponde à etapa mais lenta da
reação catalítica.
O valor de Kcat é o número de ciclos

ou renovação que corresponde ao
número máximo de mols de
substratos convertidos em produtos
por mols de enzima por unidade de
tempo. Encontra-se esta condição
somente quando a enzima está
saturada de substrato.
A razão Kcat/Km define a constante

de velocidade para a interação
entre substrato e enzima, essa
constante também é uma medida da
eficiência catalítica, por levar em
consideração tanto a velocidade
de catálise com determinado
substrato (Kcat), quanto a força da
interação entre enzima e substrato
(Km).
Na tabela a maior razão é na

enzima crotonase, pois como dito
anteriormente a razão também é
uma medida de eficiência catalítica.
Possui uma altíssima velocidade de

catálise força de interação
relativamente baixa resultando num
↑ valor de Kcat/Km, indicando sua ↑
eficiência.
Ressalta-se que a velocidade de

catálise não pode ser maior que o
encontro controlado pela difusão
de uma enzima com seu substrato,
essa difusão se limita ao valor de k1,
ou seja, não pode ser maior do que
entre 108 e 109 M-1 s-1.

Estudo dirigido
O KM é a constante de Michaelis, a
Com base nos diagramas abaixo qual é o valor da concentração do
defina o conceito de velocidade substrato quando a velocidade
reacional é metade da velocidade
inicial (V0) de uma reação química
máxima (Vmáx). A constante de
catalisada por uma enzima. Michaelis constitui uma importante
Relacione a influência da característica de uma reação
concentração inicial de substrato catalisada por enzima e é
com o V0 e explique o significado significativo devido sua função
dos parâmetros enzimáticos Km e biológica.
Vmáx. A Vmáx. pode ser interpretada como
o número de renovação de uma
enzima, ou seja, o número de
moléculas de substrato convertidas
em produto por uma molécula de
enzima em uma unidade de tempo,
levando em conta o momento que a
enzima está totalmente saturada
com substrato.
Qual a importância da equação

de Michaelis-Menten? Qual a
diferença entre os estados não-
estacionário e estacionário de
uma reação enzimática definidos
por Briggs e Haldane? Deduza
matematicamente a equação de
Michaelis-Menten com base no
conceito de estado estacionário e
A velocidade de catálise V0 é o na reação esquematizada abaixo:
número de moles de produto
formado a cada segundo, no início
da reação, ou seja, quando t ≈ 0.
A V0 aumenta linearmente à medida A equação de Michaelis-Menten
que aumenta-se a concentração de busca explicar as características
substrato e, logo após começa a se cinéticas por um complexo ES
estabilizar e se aproximar de um (enzima-substrato) específico sendo um
valor máximo em concentrações mais intermediário imprescindível na
altas de substrato. catálise, cuja a finalidade era
entender o comportamento catalítico

das enzimas.
Briggs e Haldane sugeriram a O que é o número de turnover ou
suposição do estado de equilíbrio Kcat de uma enzima?
dinâmico, que é : Turnover é uma constante de
Num estado de equilíbrio dinâmico, velocidade de 1ª ordem que
as concentrações dos intermediários corresponde à etapa mais lenta da
(neste caso o complexo enzima-substrato) reação catalítica.
permanecem as mesmas, mesmo se O valor de Kcat é o número de ciclos
houver alterações nas ou renovação que corresponde ao
concentrações dos materiais iniciais número máximo de mols de substratos
e dos produtos. convertidos em produtos por mols de
Tal estado de equilíbrio dinâmico é enzima por unidade de tempo.
alcançado quando as velocidades Encontra-se esta condição somente
tanto de formação quanto de quando a enzima está saturada de
degradação do complexo enzima- substrato.
substrato as mesmas.
Explique o conceito de constante
de especificidade de uma enzima
(Kcat / Km) e identifique na tabela
abaixo qual enzima apresenta a
maior eficiência catalítica.
Justifique sua resposta com base
nos conceitos de Kcat e Km e na
velocidade limite de difusão dos
prótons (108 a 109 M-1 s-1).
A razão Kcat / Km define a constante

de velocidade para a interação
entre substrato e enzima, essa
constante também é uma medida da
eficiência catalítica, por levar em
consideração tanto a velocidade
de catálise com determinado
substrato (Kcat), quanto a força da
interação entre enzima e substrato
(Km).
Na tabela a maior razão é na
enzima crotonase, pois como dito
anteriormente a razão também é
uma medida de eficiência catalítica.

Possui uma altíssima velocidade de
catálise força de interação
relativamente baixa resultando num
alto valor de Kcat/Km, indicando sua
alta eficiência.
Ressalta-se que a velocidade de
catálise não pode ser maior que o
encontro controlado pela difusão
de uma enzima com seu substrato,
essa difusão se limita ao valor de k1,
ou seja, não pode ser maior do que
entre 108 e 109 M-1 s-1.

Cinética enzimática 2
A formação do complexo enzima cinéticas, mas com relação a
substrato acarreta na formação de formação de produto.
um produto, o complexo também é
A partir da equação de Michaelis-
fundamental para entender o
Menten pode-se definir a
comportamento catalítico das
velocidade máxima, e a partir da [S]
enzimas.
e do V0 também podemos ter o valor
Equilíbrio químico: de Km (constante de Michaellis-Menten,
que é a [S] em que metade dos sítios
ativos estão ocupados, ou seja, a metade
O sítio ativo da enzima é exposto da Vmáx).
(restaurado) com a liberação do
produto. Quando K2 é muito < que K1
despreza-se K2, que tem-se K-1/K1
(constante de dissociação, ou seja,
mensura a afinidade a enzima pelo
substrato).
O Km dá uma ideia do quanto de

substrato a enzima necessita.
Quanto mais ↑ [substrato] mais Kcat= número de renovação

rápida vai ser a velocidade da (turnover), o qual mostra o número de
reação, tendo com relação que a moléculas de substratos que são
[enzima] não muda. quebradas pela enzima num certo
tempo, considerando 1 molécula de
enzima.
Vmáx = todos os sítios das
moléculas de enzimas presentes *capacidade de processamento
estão ocupados com um excesso de
substrato, que não ↑ a velocidade Exemplo: Kcat=5, são 5 substratos por
da reação. segundo por exemplo.
V0= depende da [substrato], que se Kat/Km = constante de especificidade,

estabiliza com o passar da reação. nos diz a eficiência dessa enzima,
mas não adianta ter um Km bom que
necessidade de uma ↑ quantidade
K1 e K-1 são as constantes cinéticas, de substratos produzindo menos
que se relaciona com a velocidade produtos.
da formação/quebra de complexo.
A velocidade depende do limite de
K2 e K-2 também são constantes difusão (que nesse caso utiliza-se o
próton como comparativo).

Em muitas reações há 2 ou mais A partir do gráfico nota-se que há
substratos, quando eles se ligam ao uma modificação na velocidade
mesmo tempo chama-se de inicial.
complexo ternário.
Quanto mais adiciona-se inibidor, ↓
Mecanismo ping pong será a velocidade máxima da
reação, mas com a adição de
Entra um substrato 1°, e depois da substrato começa-se ↑ a afinidade
reação enzimática entra o 2° da enzima pelo substrato que
substrato na reação. supera a afinidade pelo inibidor,
assim a formação do complexo
Inibidores enzimáticos enzima-inibidor cessa.
Faz-se um gráfico de duplos-
recíprocos pela equação de Gráfico de duplos-recíprocos dos
Lineweaver-Burk. Esses gráficos são inibidores competitivos:
uteis para diferenciação entre
certos tipos de mecanismos de
reação enzimática e pode-se
analisar a inibição enzimática.
Inibidores de enzimas
Moléculas que interferem na catálise,
↓ ou interrompendo as reações
enzimáticas. Esses inibidores podem
Km ↑ por que para eu atingir a
ser:
metade da velocidade máxima eu
Reversíveis preciso ↑ a quantidade de
substrato. Este Km é o coeficiente
Tem a ver com a afinidade, possui 4
angular (que corta eixo x).
tipos:
1. Competitivo
Se as retas passam pelo mesmo
A enzima compete com o substrato ponto no eixo y, temos uma inibição
pelo sítio ativo (composição e estrutura competitiva, sendo assim a
química semelhantes ao substrato). O Ki velocidade máxima não se altera.
será > do que Ks.
No quadrante negativo nota-se que
Há a introdução de um termo ao Km a reta tende a se aproximar da
da enzima (modificando a equação de origem quanto > [substrato].
Michaellis-Menten).
2. Incompetitiva
O inibidor só se liga na enzima se o
complexo enzima-substrato existir.

alostérico.
O inibidor pode se ligar a enzima e

se ligar ou não com o substrato, por
que seu sitio ativo é distante do sitio
ativo do substrato.
Gráfico de duplos-recíprocos dos

inibidores incompetitivos:
O Km não se altera por não estarmos

impedindo a ligação da enzima com
o substrato, mas a velocidade
máxima ↓, por que ↓ a quantidade
de enzima funcional.
Gráfico de duplos-recíprocos dos
Há uma redução na Vmáx e Km, mas
inibidores não-competitivos:
nota-se que não há alteração na
inclinação da reta.
Se retirarmos os inibidores não há o

retorno da Vmáx inicial.
3. Mista Inibição irreversível

Não se atentar muito, pois ela Se liga covalentemente de modo
guarda características dos outros que não pode se desfazer
tipos de inibição. (irreversível).
Tem-se um inibidor que se liga

quimicamente (covalentemente ou
destruindo o grupo funcional da enzima).
Também pode-se formar uma
ligação não covalente estável (difícil
de quebrar).
Não é possível reverter essa reação

devido ao fato da enzima ser
Ele não possui uma característica
quimicamente modificada.
especifica, tendo retas "malucas".
Há também os inativadores suicidas

4. Não-competitiva
que modificam o substrato
É basicamente um mecanismo quimicamente, acarretando na
inativação irreversível da enzima.

Estudo dirigido
duas enzimas, considerando que o
Qual a utilidade do chamado mesmo substrato foi utilizado em
gráfico dos duplos recíprocos ou ambos os ensaios de atividade
gráfico de Lineweaver-Burk? enzimática realizados.
Demonstre matematicamente como
é possível obter este gráfico a
partir da equação de Michaelis-
Menten.
Para demonstrar os dados de
cinética enzimática usa-se o gráfico
de Lineweaver-Burk.
Obtém-se a equação de
Lineweaver-Burk a partir da inversão
da equação de Michaelis-Menten:
Com o auxílio do Excel construiu-se
os seguintes gráficos:
*Equação de Lineweaver-Burk.
E na equação da reta:
A partir da equação da reta temos:
A partir da construção dos Sendo então os valores de V máx

gráficos de Lineweaver-Burk com o 10,204 e Km 3,087.
programa Excel determine os
valores de Km e Vmáx para as
enzimas A e B cujos dados de
atividade estão disponibilizados
nas tabelas abaixo.
Discuta com base nos resultados
as características cinéticas das

A partir da equação da reta temos:
Sendo então os valores de Vmáx Nota-se um aumento no Km.

1,261 e Km 0,271.
Inibidor incompetitivo
Explique cada um dos mecanismos

de inibição reversíveis das
enzimas e o gráfico de
Lineweaver-Burk correspondente a
cada um destes mecanismos de O inibidor incompetitivo só se liga
inibição enzimática. ao complexo enzima-substrato, ou
Há 3 tipos de inibidores reversíveis, seja, o sítio de ligação do inibidor
sendo esses: incompetitivo só existe quando há a
interação entre a enzima e o
Inibidor competitivo substrato, e esta não pode ser
superada pela adição de mais
substrato.
É quando a enzima se liga com o

substrato (formando um complexo E-S)
ou como se trata de um inibidor,
esse inibidor realiza o mesmo
(formando um complexo E-I), mas não Não afeta a inclinação, mas a Vmáx e
havendo a possibilidade da o Km são reduzidos em quantidades
ligação de ambos (E-S-I, ou seja, equivalentes.
complexo enzima-substrato-inibidor). Esse
inibidor competitivo se assemelha Inibidor não competitivo
frequentemente ao substrato e liga-
se ao sítio-ativo da enzima
impedindo o substrato de se ligar
ao mesmo sítio-ativo. Um inibidor
competitivo diminui a velocidade de O inibidor não competitivo e o
catálise ao reduzir a proporção de substrato podem se ligar
moléculas de enzima ligadas a um simultaneamente a uma
substrato, mas isso pode mudar, a enzima em diferentes sítios de
inibição competitiva pode ser ligação, ou seja, o inibidor não
removida pelo aumento da competitivo pode-se ligar ao
concentração de substrato. complexo enzima-substrato ou a
própria enzima livre. Este inibidor

atua reduzindo a concentração de o mecanismo de catálise gera um
enzima funcional e consiste na intermediário quimicamente
redução do número de turnover reativo, que inativa a enzima por
(renovação). Este inibidor não pode meio de uma modificação covalente.
ser anulado pelo aumento da
O fato de que a enzima participa
concentração de substrato.
de sua própria inibição irreversível
sugere que o grupo modificado
covalentemente na enzima é vital
para a catálise.
De modo a exemplificar esse tipo de
inibidor, podemos falar da N,N-
dimetilpropargilamina que inibi a
O Km não se altera, mas a Vmáx enzima monoamina oxidase (MAO).
diminui. Um grupo prostético flavina da
Há também uma inibição mista que é monoamina oxidase oxida a N,N-
quando um único inibidor dificulta a dimetilpropargilamina, que inativa a
ligação do substrato e diminui o enzima pela sua ligação ao N-5 do
número de renovação da enzima. grupo prostético da flavina.
O que caracteriza o mecanismo

de inibição irreversível de uma
enzima? O que são inativadores
"suicidas"? Explique o mecanismo
de ação de um inativador
"suicida" utilizando um exemplo de
sua escolha.
Pequenas moléculas ou íons
específicos podem inibir até mesmo
enzimas que não são alostéricas.
Quando falamos da inibição A monoamina oxidase desamina
irreversível, o inibidor está ligado de
neurotransmissores (dopamina e a
modo covalente (que fornecem um meio
serotonina), baixando seus níveis
de mapear o sítio ativo enzimático) à
no cérebro, isso acarreta na doença
enzima, ou está ligado tão de Parkinson (baixos níveis de
firmemente que a sua dissociação
dopamina) ou na depressão (baixos
da enzima é muito lenta. níveis de serotonina).
Os inibidores suicidas são substratos
O fármaco (–)deprenila utilizado no
modificados que fornecem o meio
tratamento de Parkinson e
mais específico de modificar o
depressão, é um inibidor suicida da
sítio ativo de uma enzima, neste
monoamina oxidase.
caso o inibidor liga-se à enzima
como um substrato e é inicialmente
processado pelo mecanismo
catalítico normal, conseguintemente

Estudo dirigido
Elaborar relatório a respeito da
importância da enzima identificada
pelo código PDB, identificação de
seu sítio ativo, de seu inibidor e de
seu mecanismo de inibição
enzimática. Outras informações
consideradas de importância para
o entendimento das propriedades
do complexo enzima/inibidor, como
os gráficos de Lineweaver-Burk Na imagem acima tem-se o sítio
referentes aos mecanismos de catalítico circulado em branco.
inibição enzimática, também devem
ser apresentadas e discutidas no Nos artigos apresentados o inibidor
relatório. Utilizar o artigo referente a da fosfodiesterase são o IBMX, o
cada complexo como fonte de Sildenafil e o Icarisid II:
pesquisa. Ilustrar o relatório com
imagens construídas com o emprego
do programa PyMOL e retiradas do
artigo referente a cada complexo
estrutural.
1. Fosfodiesterase
A fosfodiesterase-5 (PDE5) é o alvo (é
inibida) de alguns medicamentos
para o tratamento da disfunção
erétil e da hipertensão pulmonar. As
fosfodiesterases nucleotídicas
cíclicas (PDEs) controla a
concentração dos mensageiros
cAMP e cGMP, e estuda-se as PDEs
pela sua ampla aplicação
terapêutica. Esse tipo de inibição é uma inibição

competitiva, pois há o fechamento
do “bolso” após a ligação com
esses inibidores.
Na imagem acima temos a enzima

Caspase, cujo seu sítio ativo está
representado por um círculo branco.
No artigo apresentado o inibidor (de
forma absolutamente seletiva) é o
composto 3 juntamente ao VEID-
CHO:
Neste caso a inibição gerada é

Nos gráficos acima é possível incompetitiva, pois ela possui dois
perceber que quanto mais métodos de ocorrer, e ambos estão
aumentamos a quantidade de de acordo com o tipo de inibição
inibidor, menor é a atividade da citada anteriormente, sendo esses:
enzima. Nota-se que esses gráficos 1. Estabilizando o complexo enzima
apresentam mutantes de deleção substrato;
do tipo selvagem de enzima, e que 2. Estabilizando o intermediário
isso as estruturas gerais das formado.
mutadas são preservadas e a
divergência cinética não se deve a
efeitos conformacionais inespecíficos.
2. Caspase
Nota-se que no gráfico A quanto
A Caspase é atuante numa maior a concentração do composto
estratégia terapêutica em potencial 3, menor se torna a velocidade da
para algumas doenças enzima e no gráfico B nota-se que o
neurodegenerativas. São de uma Km e a Vmáx diminui.
família de proteases cisteínicas, o
quais são os principais mediadores
de apoptose (caspases executoras) e
inflamação.

3. Frutose-1,6-bifosfato aldolase com ou sem o substrato ligado,
quando o substrato está ausente o
inibidor dificulta o acesso de
substratos a um local vazio.
O zinco desempenha papel

fundamental na catálise, pois sua
presença permite a ocupação total
do sítio ativo, e isso provavelmente
eliminaria sua disponibilidade para
catálise em um complexo enzima-
A enzima frutose-1,6-bifosfato substrato-inibidor.
aldolase pode estar presente em
animas, plantas, protozoários e
algas (classe 1) ou em bactérias,
fungos e cianobactérias (classe 2),
essas possuem a necessidade de um
íon bivalente para que a reação
enzimática ocorra, além disso Neste gráfico nota-se que quanto
cumprem um papel crítico na mais HCA, maior é a inibição.
glicólise e gliconeogênese desses
seres vivos.
Assim essa é considerada um
fármaco em potencial para
desenvolver antibióticos contra a
bactéria Mycobacterium
tuberculosis, causadora da
tuberculose.
Acima tem-se o gráfico de inibição
Observou-se que em concentrações de MtFBA pela HCA.
variadas de substrato e inibidor
apenas o Vmáx de MtFBA foi 4. Fosfolipase A2 homóloga
diminuído ao longo de um aumento
de 20 vezes da concentração do
inibidor, ao passo que o K H
permaneceu constante.
Mas com a incorporação de HCA, o
loop Z pareceu se deslocar, e ao
fazer isso bloqueia o acesso dos
substratos do MtFBA ao sítio ativo
da enzima.
O inibidor dessa enzima é o HCA As fosfolipases A2 são enzimas
que atua na forma de inibição não estáveis e onipresentes e possuem
competitiva imitando o substrato da 11 classes, 5 dessas são abundantes
enzima. O inibidor se liga próximo em secreções pancreáticas,
ao local de ligação do substrato exsudatos inflamatórios e venenos de
répteis e artrópodes.

Neste caso a PLA2s de veneno de pelo ligante pode surgir das
cobra mostram outros efeitos alterações oligoméricas na estrutura
tóxicos/farmacológicos, incluindo proteica.
mionecrose, neurotoxicidade,
cardiotoxicidade e hemolítica, Assim, este inibidor atua de
hemorrágica, hipotensora, irreversível, pois há modificações
anticoagulante, inibição da estruturais que estabilizam essa
agregação plaquetária e ligação.
atividades indutoras de edema.
A estrutura cristalina de PLA2 bovino
complexado com BPB, um inibidor
conhecido da atividade catalítica
dos PLA2s, apresentou uma
modificação estrutural por um
ligante.
O complexo contém 3 regiões que
são modificadas após a ligação do
inibidor:
O Ca+2 regiões de laço de ligação,
asa e C-terminal, este último pode
ser responsável pelo efeito inibidor
da agregação plaquetária.
O BthA-I quimicamente modificado
com BPB possui uma alteração
oligomérica após a ligação com o
inibidor. Embora a proteína nativa
pareça ser um monômero ou um
dímero, a proteína modificada
parece ser mais um dímero (energética
e conformacionalmente estável).
Assim, a ligação da BPB pode inibir
indiretamente o efeito
anticoagulante e talvez outros
efeitos farmacológicos, tais como
inibição hipotensora e agregação
plaquetária por alterações
estruturais oligoméricas.
Portanto nota-se que a modificação
do BthA-I pelo BPB leva a ambos
mudanças estruturais tanto
terciárias, quanto quaternárias, e a
nova conformação é mais estável
comparada a estrutura nativa e
inibição de efeitos farmacológicos

Engenharia de proteínas
É a síntese de proteínas com
propriedades novas e/ou Um dos 1° métodos usados para
melhoradas. elucidar as relações estrutura-
função.
Nos últimos 20 anos só se
preocupava em determinar Com o ↑ do volume de resíduos
estruturas proteicas, realizar modificados houve uma alteração
modelagem molecular e tecnologias da atividade que deve-se a
de DNA recombinantes. Mas após a modificações conformacionais da
revolução da ciência das proteínas proteína e não a modificação do
começa a se atentar ao estudo de aminoácido em si.
relações entre estrutura e função,
aplicações na indústria e Um método bastante utilizado é a
perspectiva de produção de síntese química de peptídeos e
proteínas de novo (são proteínas que imobilização/reticulação química.
não existem).
A limitação desse processo é que
não se sabe se ao mudar um resíduo
De um ponto de vista termodinâmico específico vai se obter um estudo
a proteína tem que atingir um certo específico.
nível de energia favorável pra ela,
onde há uma conformação Síntese química de peptídeos
específica. Mas Levinthals percebeu Se tivermos uma resina com uma
que matematicamente (utopia) é substância ligada nela, é possível ir
muito difícil uma proteína chegar ao carregando aminoácidos
seu menor nível de energia. quimicamente modificado (que sofre
processo químico) e se liga na
substância ligada a resina. Em
Realiza-se a clonagem de proteínas seguida faz-se uma lavagem (para
ou a partir da seleção de proteínas retirar os aminoácidos que não estão
mutadas, que em seguida vão para logados) e carrega-se mais um
a purificação da proteína. Após isso aminoácido (pois após a lavagem
é realizado uma determinação das sobra-se um grupo amina para realização
propriedades da proteína dado das ligações peptídicas).
origem a uma proteína modificada
ou seguindo para o processo de É uma tecnologia cara e quando
mutagênese que irá seguir para o aumenta-se o tamanho dessas
rastreio dos mutantes com as proteínas ao limite, não se consegue
propriedades desejadas uma ↑ eficiência. Então é um
acarretando na seleção da processo para formar peptídeos
proteína mutada. (pode ter atividade enzimática).

Imobilização/reticulação química Abordagem teórica ou design
É possível ligar a enzima em racional
determinados substratos ou Baseia-se em conhecimentos prévios
superfícies (absorção/adsorção, ligação (bases de dados de proteínas homólogas,
cruzada ou aprisionamento). Essa dados de estruturas, funções, etc), e
ligação possibilita a reutilização geralmente essas alterações são
dessas enzimas e afeta os muito precisas (na maioria das vezes
parâmetros cinéticos dessas enzimas envolvem mutações pontuais ou sítio-
(para o bem ou para o mal). dirigida*).
*mutações pontuais: podem ser realizadas em
Possui uma vantagem econômica resíduos, com a finalidade de alterar algum
parâmetro dessa proteína/enzima como a cinética.
(reaproveitamento dessas enzimas).
Tem-se um suporte sólido (tratado

quimicamente ou com propriedades
químicas em sua superfície) que reage
com determinadas grupos químicos
da enzima (como grupos amina). Assim
as enzimas ficam presas por
ligações covalentes na superfície
desse material.
No caso do sistema heterólogo você

produz ou insere através de técnicas
de clonagem, genes de interesse
para produção das enzimas de
interesse e assim posteriormente há a
Isso acarreta numa facilidade na
purificação da proteína,
separação de enzimas do produto,
cristalização, ensaios bioquímicos
substrato e célula.
(para entender como ela funciona),
análise biofísica dos cristas (para
Outro fato interessante é que essas
entender sua forma 3D).
ligações químicas podem trazer uma
alta estabilidade térmica (no caso da
Inserção do gene com mutação sítio
esterase), consequentemente aumenta
dirigida
o aproveitamento e a eficiência
Utiliza-se a tecnologia de DNA
dessa enzima (como catalizador de
recombinante.
reações).
Faz-se o uso de enzimas de restrição
para a inserção do gene no vetor.
Consegue-se produzir proteínas
recombinantes e produzir grandes Muitas proteases possuem
quantidades de proteínas que aplicações industriais (como a
funcionem melhor para determinadas subtilisina usada na produção de
aplicações. Essas técnicas podem detergentes).
ser de 2 tipos:
Determinados agentes oxidantes

possuem uma atividade deletéria na racional que implicam em
função da protease (subtilisina nativa). metodologias alternativas. Ou no
caso de resíduos de aminoácidos
Quando essa protease está distantes que entre si podem estar
presente num meio com agentes implicados em uma determinada
oxidantes, ela perde sua atividade. função não bastando uma única
mutação. Ou também para a
construção de bibliotecas utilizando
majoritariamente técnicas de
evolução molecular.
Técnica de DNA shuffling (embaralhar)

Pode-se pegar genes homólogos de
*Neste caso substituiu-se a metionina 222 por esses espécies diferentes, fragmentar esses
dois outros resíduos (no caso da alanina a enzima genes (podendo ser por enzimas de
se mantém sem oxidação e permanece ativa).
restrição), mistura esses DNAs e a
Pode-se realizar outras alterações partir de técnicas de PCR (primer
inespecíficos) remonta-se esses genes,
(na subtilisina) como a introdução de
2 pontes dissulfeto para ↑ a dando origem a genes quiméricos
estabilidade frente a temperatura
maiores e a substituição de outro
resíduo (glicina 166 para a lisina 166)
no canal hidrofóbico de ligação do
substrato para ↑ a relação Kcat/Km (↑
eficiência).
*quebra muito substrato (↑ Kcat) com
pouca quantidade de substrato muito
baixa (↓ Km).
A alanina quando substitui a

metionina possui uma queda na sua
atividade relativa específica de 47%
A partir dessa técnica é possível a
(alanina 53% e metionina 100%). A
criação de bibliotecas (ex: clones que
vantagem disso é que mesmo ela
sintetizam diferentes moléculas).
funcionando pela metade, ela não
vai sofrer ação dessas enzimas
Após a criação de quimeras pode-
oxidantes (que acarreta na perda de
se fazer uma triagem (através de
atividade em segundos).
reações específicas), assim pode-se
observar o aparecimento de uma
Abordagem experimental ou
enzima com propriedades melhores
intuitiva (design aleatório) ou similares às 3 enzimas juntas. É
Possui limitações da abordagem como uma evolução artificial.

Essa técnica faz a seleção positiva,
ou seja, seleciona mutações
favoráveis (enzimas melhores).
Evolução dirigida
É uma técnica semelhante a anterior
que utiliza a combinação de DNA
pela técnica de embaralhamento.
Os métodos de bioinformática são
A diferença é que nessa técnica é a úteis para a construção de um
limitação no número de mutantes modelo estrutural de uma proteína
(como 2 características). por modelagem (homologia ou
threading que é tipo "rosqueamento").
A partir de menos clones começa-se
a procurar mais características Dinâmica molecular
desejáveis. Técnica computacional para análise
do comportamento dinâmico,
dependente do tempo, dos átomos
individuais de um determinado
sistema.
Faz-se a simulação de como a

proteína se comporta em solução.
Técnica de bioprinting molecular

Complexa a enzima com o substrato
(ligante), faz-se a liofilização.
Quando faz-se a ressuspensão

dessa enzima em solução anidro (que
não possui água) não tem-se
alteração do sítio catalítico que
fora "moldado".
No caso da DNA polimerase
(pegando uma menos eficiente no reparo),
podemos realizar uma mutação nela
para que aumente sua taxa de erro,
assim ela irá gerar mais mutações
causando mais variabilidade.

A partir dessa técnica tem-se então purificação de proteínas
uma enzima com maior afinidade e recombinantes;
atividade catalítica (comparada a
enzima antes do processo). Atividade específica.
Propriedades que podem influenciar

*Anticorpos baseados no formato do sítio na estabilidade de uma enzima:
catalítico que funcionam como enzimas. Pontes dissulfeto;
Modificação de anticorpos, um
exemplo disso são as bibliotecas de Interações iônicas ou pontes
anticorpos expressos na superfície salinas;
de fagos.
Substituição de resíduos
Geração de anticorpos catalíticos, (estabilidade frente a oxidantes);
que podem ser feitos pelo uso de
análogos do estado de transição Substituição de resíduos e
de substratos. Sendo uma técnica grupos carboxílicos superficiais
interessantes para quando não (aumentam a estabilidade na
existem enzimas naturais que atuam presença de metais pesados -
em determinados Biorremediação).
substratos/processos.
Alterações da especificidade as
vezes é conveniente:
O seu aumento é interessante
para drogas e produtos
farmacêuticos;
Sua diminuição é interessante

para enzimas proteolíticas e
lipolíticas (nos detergentes, pois
melhora a quebra de compostos).
Propriedades que podem ser Medicina/farmácia:

modificadas por engenharia de Vacinas (epítopos, vacinas híbridas) e
proteínas: utilização em fármacos.
Estabilidade (T°C, pH e condições
reacionais específicas); Indústria:
Produção de detergentes, tecido e
Especificidade pelo substrato; alimentos.
Regulação (como a eliminação de

sítios alostéricos de regulação);
Propriedades úteis na

Estudo dirigido
Sabe-se que a saída deste
Explique o que é o paradoxo de paradoxo é reconhecer o poder da
Levinthals e quais as dificuldades seleção cumulativa, cuja sua
diferença é que o paradoxo faz
inerentes ao enovelamento de
uma busca completamente aleatória,
proteínas que dificultam a enquanto na seleção cumulativa os
produção de proteínas e enzimas intermediários parcialmente corretos
de novo. são retidos.
Para explicar melhor o paradoxo
considera-se uma pequena proteína
com 100 resíduos.
A figura abaixo se refere a um tipo
Cyrus Levinthal calculou que se específico de modificação
cada resíduo assumisse 3 enzimática. Quais as vantagens e
conformações distintas, o número desvantagens deste tipo de
total de estruturas seria 3100 (5 × processo. Se necessário, faça uma
1047). Se demorasse 10–13 segundos pesquisa na internet para
para converter uma estrutura em responder a esta questão com
outra, o tempo de busca seria 5 × mais propriedade.
1047 × 10–13 segundos (5 × 1034
segundos), o equivalente a 1,6 × 1027
anos.
Consequentemente demoraria muito

para uma pequena proteína se
enovelar apropriadamente tentando
todas as possíveis conformações.
A enorme diferença entre o tempo

teórico (calculado) e o tempo prático
A imagem se refere a modificação
(real) de enovelamento é chamado
química e estrutural (por meio de um
de paradoxo de Levinthal. ligante) da histidina 48 do sítio
Este paradoxo revela que as catalítico.
proteínas não se enovelam tentando
todas as combinações possíveis, na A ligação da BPB pode inibir
verdade elas devem seguir pelo indiretamente o efeito
menos uma via de enovelamento anticoagulante e talvez outros
parcialmente definida, formada por efeitos farmacológicos, como
intermediários entre a proteína inibição hipotensora e agregação
completamente desnaturada e sua plaquetária por alterações
estrutura nativa. estruturais oligoméricas.

Porém a nova conformação é mais
estável comparada a estrutura Quais as principais diferenças
nativa e a inibição de efeitos entre os métodos de engenharia
farmacológicos pelo ligante pode
de proteínas relativos às
surgir das alterações oligoméricas
na estrutura proteica. chamadas abordagens teórica (ou
design racional) ou experimental (ou
Ou seja, a vantagem seria que a design aleatório)?
nova conformação é mais estável, A grande diferença dos métodos de
mas por outro lado perde-se engenharia de proteínas relativos é
indiretamente seus efeitos que nas abordagens teóricas tira-se
farmacológicos. uma base dos conhecimentos prévios
(base de dados) e geralmente as
alterações realizadas são muito
O que são mutações sítio- precisas. Já nas abordagens
experimentais não possui-se um
dirigidas e qual a utilidade deste
conhecimento prévio, ou este é muito
tipo de ferramenta no
superficial, o que implica na
desenvolvimento de enzimas realização de metodologias
"engenheiradas"? alternativas para obtenção de
É uma técnica semelhante a que dados sobre essas enzimas.
utiliza a combinação de DNA pela
técnica de embaralhamento (a partir
de genes homólogos de espécies
diferentes, fragmenta-se esses genes com Descreva os princípios das
enzimas de restrição, em seguida mistura técnicas de DNA shuffling e
esses DNAs e a partir de técnicas de PCR Evolução Dirigida. Cite um
remonta-se esses genes, dando origem a
genes quiméricos que passa por uma
exemplo de enzima industrial
triagem com reações específicas para desenvolvida ou aprimorada
observar se houve aparecimento de uma através de cada uma destas
enzima com propriedades melhores). técnicas. Se necessário, faça uma
pesquisa na internet para
A diferença é que nessa técnica é a responder a esta questão.
limitação no número de mutantes, ou
A técnica de DNA shuffling ocorre a
seja, a partir de menos clones
partir da fragmentação de genes (o
começa-se a procurar mais que pode ser feito por enzimas de
características desejáveis neles. restrição), em seguida faz-se o
shuffling (embaralhamento),
A grande utilidade é a produção conseguintemente remonta-se esses
de enzimas não existentes na genes gerando genes quiméricos.
natureza e que possam ter por
exemplo estabilidade térmica e uma A partir desses genes quiméricos
boa atividade enzimática. Assim pode-se realizar um screening
com a estabilidade térmica pode-se (triagem) para possibilitar a
utilizar o aumento de temperatura visualização do aparecimento de
como um catalizador da reação. uma enzima com propriedades
melhores ou similares as anteriores.

A evolução dirigida é uma técnica
semelhante a anterior que utiliza a
combinação de DNA pela técnica
de embaralhamento, mas a
diferença entre essas técnicas é que
na evolução dirigida possui-se uma
limitação no número de mutantes, ou
seja, a partir de menos clones
começa-se a procurar mais
características desejáveis.
Um exemplo de enzima que possui

aplicação industrial passou pela
técnica de DNA shuffling é a lipase
que fora melhorada com relação ao
aumento da sua
enantiosseletividade em hidrolises,
na evolução dirigida temos enzimas
endoglucanases como a celulase
que fora melhorada com relação a
modificação da sua capacidade
de ligação a substratos.

Imobilização de enzimas
sólida, assim essas enzimas tem um
sistema catalítico facilmente
Imobilização é pegar um monte de separado da mistura reacional com
moléculas de enzimas e imobilizá-las restrição da mobilidade (ligação a
em um suporte ou meio, com intuito outra molécula torna a enzima insolúvel no
de deixá-las prontas para uso. Além meio reacional).
disso, pode-se reaproveitá-las e
utilizá-las em escala industrial. Enzimas livres x imobilizadas
Célula intacta: centenas de

macromoléculas (distintas) dispostas
em um volume pequeno.
A maioria das enzimas estão

associadas às membranas, e
quando as enzimas estão em seu Razões para imobilizar
meio natural, elas podem atuar
Facilita a separação do produto;
como típicos catalisadores
heterogêneos (moléculas Permite a reutilização do
insolubilizadas*). biocatalizador;
*Por estarem ligadas em membranas, elas
são insolúveis (proteínas de membrana) Redução de efeitos de inibição por
produtos/substratos (reduz alosteria);
As enzimas podem ser imobilizadas
naturalmente ou artificialmente. Ideal para processos contínuos;
Estabiliza termicamente a enzima;
Facilitar a interrupção da reação
Enzimas imobilizadas são aquelas (retirada do biocatalizador);
que estão fisicamente confinadas ou Redução de custos;
localizadas em uma certa região do
espaço com retenção de suas Reduz a possibilidade de
atividades catalíticas, e que podem contaminação.
ser usadas repetidamente e
continuamente.
Não há método geral de
imobilização, nem suporte universal,
as condições são estabelecidas por
meio de testes, e a maior dificuldade
Devem ser enzimas ligadas a um é conseguir um método que funcione
suporte sólido ou fisicamente bem.
confinadas no interior de uma matriz

Imobiliza-se a enzima com vários Morfologia;
suportes e diferentes métodos, em
seguida avalia-se a atividade do Composição;
sistema e por fim escolhe-se o Resistência mecânica (tensão de
suporte e o método que apresentam corte, que é a tensão de
maiores vantagens. cisalhamento);
Resistência ao ataque
As propriedades das preparações microbiológico;
de enzimas imobilizadas são
Resistência à compactação.
influenciadas pelas propriedades da
própria enzima e do material do Características desejáveis dos
suporte, gerando um derivado suportes
imobilizado com propriedades
químicas, bioquímicas, mecânicas e Características morfológicas:
cinéticas específicas, diferentes das área superficial adequada, alta
propriedades da enzima livre (enzima porosidade e pequeno diâmetro
solúvel). do poro (diâmetro deve permitir o
acesso da enzima e do substrato, que
deve ser seletivo).
Características químicas: grupos

químicos que possam ser
Enzima
ativados ou modificados para
Características das enzimas permitir a ligação da enzima em
condições não-desnaturantes.
Propriedades bioquímicas:
massa molecular, grupos Insolubilidade: é a característica
funcionais da superfície e essencial, devido a prevenção
pureza. da liberação da enzima do
suporte, evitar a contaminação
Parâmetros cinéticos: atividade do produto (dissolução do suporte
específica, perfil do pH e e/ou contaminação do produto pela
temperatura, Km e Vmáx, inibição, enzima).
estabilidade térmica e solventes.
Resistência mecânica e térmica:
Suporte uso em filtração, centrifugação e
agitação (uso contínuo),
Suporte ideal resistência à expansão ou
Contribuições da superfície do contração* (pode levar a distorção
do sítio ativo).
suporte, ou seja, altera o pH,
possui natureza hidrofóbica ou *Um exemplo é o tratamento do suporte
hidrofílica, contém a presença para apresentar grupos glioxil (enzimas se
de íons metálicos (pode inibir a ligam de forma covalente nesses grupos a
enzima); partir do terminal amina), esse processo
aumenta a estabilidade térmica e se
Pode adsorver ou acumular houver expansão ou contração devido a
outras substâncias; mudanças térmicas, há alteração da

posição do grupo glioxil do suporte, Método produção de leite sem
podendo deformar a enzima, gerando lactose
mudanças na conformação e no sítio
catalítico da enzima (se ela for muito
sensível).
Exemplo de suportes simples: vidro, sílica,

alumina, fibra de casca de ovo, etc.
Beats são esferas com lactases,

onde-se passa o leite por essas
esferas e a enzima quebra a lactose,
ao final do processo tem-se um leite
livre de lactose (mais doce).
Tipos de suportes
Podem ser classificados em Método de imobilização
composição química* (orgânicos e A escolha se baseia em um
inorgânicos) e morfologia** (porosos,
conhecimento prévio da reação
não porosos, estrutura em gel).
desejada, das condições de reação
*Sintéticos costumam ser bem mais caros, e das modificações causadas na
porém mais resistentes e regeneráveis e os estabilidade, atividade e pH.
fabricados podem ser bem caros também.
*Há muitos métodos de imobilização disponíveis.
**Mais importante
Suportes porosos: grande área

superficial interna (liga mais
enzima), a enzima fica protegida
de condições de turbulência
externa e o diâmetro do poro
adequado.
Suportes não porosos:

desvantagem é a baixa área
superficial, mas a vantagem é a
eliminação de resistência à
difusão interna.
Ligação em suportes sólidos
Suportes com estrutura em gel: Adsorção física: é o mais simples,
severas limitações difusionais onde por meio de adsorção, a
(úteis para substratos de baixo peso enzima fica ligada no suporte.
molecular)
Ou seja, a enzima é imobilizada
*Alginato de sódio
sobre um suporte sólido, sem
qualquer modificação prévia da

matriz. Há interações fracas, estáveis, ↑ eficiência e
principalmente interações de estabilidade, não são tão
Van der Walls. suscetíveis a pH, força
iônica, solventes e
Vantagens: ↓ custo, ↑ temperaturas.
retenção da conformação
nativa da enzima e sua
Desvantagens: ↑custo,
atividade catalítica.
dificuldade de ativação de
Desvantagens: aplicação certos suportes que devem
limitada, pois a ligação é ocorrer por etapas de
de natureza reversível, e ativação, com uso de
podem ser influenciadas agentes de ativação
pelo meio, como pH, (glutaraldeído, epicloridrina, etc),
temperatura, etc. Há a tal processo pode não ser
possibilidade de dessorção tão simples.
da enzima, ou seja, ela
pode se soltar facilmente,
pois a interação é fraca. Ligação iônica: o suporte é
carregado (carga)
proporcionando a ligação
Ligação covalente: tem-se uma iônica. Ou seja, o suporte possui
preparação (química) do grupos funcionais ionizáveis que
suporte. É um dos métodos mais em determinado pH irão interagir
estudados, e ocorre a partir do especificamente com grupos da
estabelecimento de ligações enzima (ligações iônicas entre matriz
entre os resíduos de e biocatalizador), mas há a
aminoácidos da enzima e possível ocorrência de algum
grupos reativos do suporte. tipo de adsorção simultânea,
Tem-se uma etapa de ativação porém a força da interação
do suporte por meio de iônica é maior do que a de
interação de grupos reativos. adsorção e, portanto,
Por fim tem-se a ligação prevalece. Tem-se a atração da
covalente entre a enzima e o enzima pelo suporte sólido que
suporte (diretamente ou com contém íons residuais. Para o
espaçador). máximo de eficiência deve-se ter
um cuidado na escolha da
solução iônica com
propriedades tamponantes (elas
devem ser compatíveis com o suporte
e favorecer a substituição dos íons
deste pelos grupos ionizados da
Vantagens: o espaçador enzima).
proporciona uma facilidade
de acesso da enzima ao Vantagem: pode ser mais
substrato (principalmente nos barato que o método de
suportes porosos), são ligação covalente.
biocatalisadores muito Limitação: dessorção.

Confinamento associação de moléculas que
Se baseia na diferença de tamanho formam cápsulas muito pequenas,
entre a molécula do catalisador e onde internamente tem-se a ligação
do substrato (↓ peso molecular), porém dessas enzimas (minimiza o problema de
difusão de substrato).
a enzima tem sua mobilidade
mantida (dentro do gel) por não serem Desvantagem: separação
envolvidas em ligações físicas ou dessas microcápsulas do
químicas entre enzima e suporte. produto (requer uma filtração
eficiente).
Vantagem: grande área
superficial de contato entre Ou seja, é o aprisionamento da
enzima e substrato, e não enzima no interior de uma membrana
há alterações estruturais. semipermeável que é influenciada
pela natureza, porosidade e
Desvantagem: processo de dimensões (controláveis) da membrana.
difusão (↑) que dificulta o Possui uma menor dimensão da
processo catalítico (mais partícula se comparado às matrizes
demorado), possui ↑ custo. em gel, e com isso uma menor
restrição à transferência de massa,
Em matriz: é o mais comum portanto, são estruturas bem
(alginato de sódio), e é quando menores.
gera-se uma matriz sólida (como
um gel), e confina-se as enzimas
dentro desse "gel". Ou seja, é o
aprisionamento das moléculas
de enzimas no interior de uma
matriz (retenção na rede
tridimensional de um polímero
não há qualquer ligação química),
onde não se observam A enzima quebra a penicilina G em 2
alterações estruturais do porções. A 6-APA é utilizada para a
biocatalisador. Os substratos e produção de penicilina
os produtos se difundem através semissintética (metade sintética, metade
da matriz e a enzima não deve original). Com esse método, o tempo
sair da matriz. de semivida a 55ºC ↑ 9x, com
conservação da Vmáx. Ou seja, ↑ a
temperatura do biorreator para o
processo ocorrer mais rápido. Nesse
caso, com a imobilização, a enzima
fica mais resistente à ↑ temperaturas,
por não haver alterações
específicas de parâmetros cinéticos.
*No poliacrilamida o tamanho do poro é
definido pela [acrilamida]. A imobilização não garante que a
enzima funcionará com 100% de sua
Em microcápsula: é mais eficiência, às vezes, a enzima está
refinado, e ocorre pela funcionando a 40-70% de sua

eficiência, mas é vantajoso por ela
ficar estável por mais tempo e é
possível reutilizá-la mais vezes Ao se imobilizar a enzima em um
(vantagem econômica). material inerte, por mais suave que
seja o procedimento, é razoável
Ligação cruzada esperar algum tipo de efeito sobre
Ou também é denominada de sua atividade catalítica.
reticulação (Cross-linking), mas não é
tão usual. É o tratamento químico de
enzimas em solução, e estas se ligam Influência no pH:
de modo cruzado, formando uma
rede insolúvel.
Depois, é necessário separar as

enzimas que estão ligadas de forma
covalente dessa estrutura insolúvel,
mas altera-se propriedades
enzimáticas.
*Não existe um suporte, ligam entre si.
Melhor explicando, as enzimas são

reticuladas covalentemente por
ligações cruzadas, empregando-se A imobilização deslocou o pH ótimo
de reagentes específicos. Há a da enzima livre para um valor de pH
utilização de agentes específicos + básico, devido a mudanças
bifuncionais (como glutaraldeído). conformacionais da enzima ou
alterações de concentração das
Desvantagem: toxicidade espécies carregadas.
dos reagentes, sendo uma
limitação do processo.
Influência na temperatura:
Vantagens: fácil execução,
com ligação irreversível e
estável (desejada).
Exemplo, o resíduo de aminoácido

do glutaraldeído se liga com a
enzima, de forma cruzada, e as
enzimas se tornam insolúveis no meio
reacional.
A imobilização ↑ a temperatura
ótima, o que permite operações em
faixas ↑ de temperaturas.

Influência no KM e Vmáx: Determinar um anticorpo, ver se uma
pessoa entrou em contato com um
patógeno. Basicamente há uma
enzima ligada preferencialmente no
anticorpo 2ª (pode ser 1ª), esta pode
catalisar um substrato, e pode ter um
produto que mude a cor do meio
para detecção por fluorescência.
*É um método clássico de diagnóstico.
Mediante imobilização, a afinidade *Utilidade nas técnicas de detecção e
da enzima pelo substrato ↓ (↑ valor purificação de proteínas.
de Km). Então, é necessário ↑ [S] para
atingir a Vmáx e ter uma produção
mais vantajosa. Poucas aplicações em escala
industrial
Devido aos suportes e reagentes
para imobilização serem caros,
possuírem ↓ estabilidade
operacional da enzima imobilizada,
↓ e também por que os equipamentos
Isso ocorre por meio de efeitos para operações contínuas são mais
conformacionais e estereoquímicos, sofisticados e pouco versáteis.
efeitos de transferência de massa ou
difusão, efeitos de temperatura e
estabilidade. Otimização dos parâmetros
(viabilização da aplicação em escala
industrial)
Custo da imobilização;
Aplicações mais promissoras em Retenção da atividade enzimática;
Estabilidade à Temperatura, ao pH e
relação às enzimas solúveis
a operação;
imobilizadas
Suportes mais resistentes e baratos
Alimentos (xaropes de glicose e
frutose);
Química fina (corantes, defensivos
agrícolas);
Indústria farmacêutica (penicilina
semissintética);
Biotransformação (biorremediação)
e biosensores;
Medicina (ELISA).
ELISA: *Desenvolvimento de um processo

enzimático.

Estudo dirigido
a maior dificuldade é conseguir um
O que define a tecnologia de método que funcione bem. Tem-se o
imobilização enzimática? Quais as fato das propriedades das
preparações de enzimas
vantagens e desvantagens da
imobilizadas serem influenciadas
imobilização de enzimas para fins pelas propriedades do material do
industriais/biotecnológicos? suporte e do método de
A definição de imobilização imobilização, gerando um derivado
enzimática é a seguinte: imobilizado com propriedades
Enzimas imobilizadas são aquelas químicas, bioquímicas, mecânicas e
que estão fisicamente confinadas ou cinéticas específicas, diferentes das
localizadas em uma certa região do propriedades da enzima livre, por
espaço com retenção de suas isso deve-se conhecer bem os
atividades catalíticas, e que podem métodos e suportes a serem
ser usadas repetidamente e utilizados. Há o fato de gerar uma
continuamente. grande heterogeneidade, e também
esse biocatalizador é mais caro que
Vantagens: facilita a separação a enzima nativa livre. Por fim, a
das enzimas do produto, permite a imobilização da enzima pode
reutilização do biocatalizador, tem- acarretar numa queda na
se uma redução de efeitos de especificidade e da atividade
inibição por produtos ou substratos catalítica da enzima.
(reduzindo a alosteria), é ideal para
processos contínuos (devido a
possibilidade de reutilização, minimização
de perda de enzimas e contaminações),
Quais os tipos de suportes
estabiliza termicamente a enzima, utilizados para a imobilização de
facilita a interrupção da reação enzimas? Cite as principais
(retirada do biocatalizador), redução vantagens e desvantagens da
de custos (mesmo com a queda na utilização de suportes orgânicos e
especificidade a reutilização garante inorgânicos.
essa alta viabilidade econômica) e Os principais suportes podem ser
reduz a possibilidade de classificados quanto a composição
contaminação. A imobilização química, sendo esses os suportes
garante uma maior estabilidade e orgânico e inorgânico, e quanto a
por fim facilita a separação da sua morfologia (classificação mais
enzima do produto. utilizada), sendo esses os suportes
porosos, os não porosos e por fim os
Desvantagens: não há método geral suportes com estrutura em gel.
de imobilização, nem suporte
universal, ou seja, as condições são Suportes orgânicos
estabelecidas por meio de testes, e Vantagens: no caso dos polímeros

naturais possuem a capacidade de conformação nativa da enzima (não
formar géis inertes, se liga facilmente mudando quimicamente esta) e sua
as enzimas de forma reversível e atividade catalítica.
irreversível, há uma alta
disponibilidade, possui baixo custo, Desvantagens: aplicação limitada
contém alta resistência térmica e (ligação é de natureza reversível, e
mecânica, tem uma fácil influenciáveis pelo meio, como pH,
degradação (não causa danos ao temperatura, etc). Há a possibilidade
meio ambiente). Já no caso dos de dessorção da enzima, ou seja,
sintéticos são mais resistentes (devido ela pode se soltar facilmente
a estrutura porosa), regeneráveis e são (interação fraca). Pode possuir um
inertes ao ataque microbiano. vazamento da enzima e gerar baixa
especificidade da reação (pode
haver sobreposição entre a adsorção e a
Desvantagens: há uma modificação
troca iônica).
na estrutura em uma larga faixa de
pressão, pH e temperatura, e no
caso dos sintéticos podem possuir Ligação em suportes sólidos (por
ligação covalente)
valores altos.
Vantagens: o espaçador
Suportes inorgânicos proporciona uma facilidade de
Vantagens: possuem rigidez, acesso da enzima ao substrato
porosidade, resistência térmica e (principalmente nos suportes porosos), são
mecânica, resistência microbiana biocatalisadores muito
completa (os substratos usados não estáveis, de alta eficiência e
permitem o crescimento de nenhuma
estabilidade, não são tão suscetíveis
bactéria ou fungo), não apresentam
a pH, força iônica, solventes e
modificação na estrutura em uma temperaturas. E por fim minimizam o
larga faixa de pressão, temperatura vazamento do catalizador.
e pH, possui uma fácil regeneração
por processo de pirólise.
Desvantagens: custo elevado,
dificuldade de ativação de certos
Desvantagens: contém baixa suportes que devem ocorrer por
quantidade, difícil degradação e etapas de ativação, com uso de
podem ser muito caro comparado agentes de ativação, tal processo
aos orgânicos. pode não ser tão simples e impede
a reutilização do suporte
(modificações químicas de natureza
Quais os métodos de imobilização irreversível). Modificações estéricas da
mais utilizados para a enzima podem ser presentes.
imobilização de enzimas? Cite as
vantagens e desvantagens destes Ligação em suportes sólidos (por
ligação iônica)
métodos.
Vantagem: pode ser mais barato
Ligação em suportes sólidos (por que o método de ligação covalente.
adsorção física)
Desvantagem: Limitação: dessorção

Vantagens: baixo custo, fácil
realização, alta retenção da

(ela pode se soltar facilmente, devido a
uma interação fraca).
Por que o método de imobilização
enzimática por ligação covalente
Confinamento
Possui 2 tipos, confinamento em pode alterar o acesso de
matriz e o confinamento em substratos aos sítios ativos das
microcápsula. enzimas e mesmo causar a
distorção física destes sítios
Vantagens: contém uma grande ativos?
área superficial de contato entre Pode-se fazer a ligação da enzima
enzima e substrato, não possui em um suporte com o espaçador, ou
modificação química, nem estrutural sem o espaçador, como pode-se
das enzimas, e estas devem reter a observar na imagem abaixo:
atividade catalítica nas condições
de polimerização. No caso do
confinamento em microcápsulas,
possuem menor restrição à
transferência de massa.
Sendo assim, em suportes porosos, o
Desvantagens: processo de difusão
uso de um espaçador facilita o
dificulta o processo catalítico (que
acesso dos substratos aos sítios
pode ser mais demorado que o processo
de difusão), caracterizando um
ativos das enzimas.
problema na transferência de massa.
Possui valor elevado, e ainda pode Mas a ligação covalente pode
ter vazamento de enzima. No caso alterar a conformação tridimensional
do confinamento em microcápsulas, da enzima (pode haver modificações
estéricas também) já que essa fora
a separação dessas do produto
requer uma filtração eficiente. fixada num ponto, e isso também
pode dificultar o acesso ao
Ligação cruzada substrato, devido à perda de sua
mobilidade. É importante lembrar que
Vantagens: é um método de fácil se houver uma expansão desse
execução, com ligação (entre as suporte, pode acarretar em
enzimas) irreversível e que estabilizam problemas de distorções físicas
as enzimas, há uma minimização do dessas enzimas, já que essas estão
vazamento de catalizador e não é intimamente ligadas ao suporte.
necessário um suporte.
Desvantagem: toxicidade dos O objetivo da imobilização

reagentes, podendo haver uma enzimática é sempre o de melhorar
possível modificação química os parâmetros cinéticos e a
maciça da enzima, sendo uma especificidade das enzimas de
limitação do processo. Há também o
interesse industrial/biotecnológico.
fato dos processos possuírem
Esta afirmação é correta?
problemas com a transferência de
massa (como o confinamento). Justifique sua resposta.
Não, pois nem sempre tende a

melhorar os parâmetros cinéticos e a
especificidade dessa enzima de
interesse. Na realidade, o intuito é
fazer com que o processo seja mais
viável economicamente, portanto, se
houver uma queda na
especificidade ou nos parâmetros
cinéticos da enzima, mas estes forem
compensados pela alta
estabilidade fazendo com que o
número de vezes que essa enzima
imobilizada possa ser utilizada em
um processo aumente, isso já
aumenta a rentabilidade do
processo enzimático.
Por que o teste de ELISA,

comumente utilizado para o
diagnóstico de doenças
infecciosas, é considerado um tipo
de tecnologia baseada na
imobilização de enzimas?
O teste de ELISA é baseado na
reação específica do antígeno-
anticorpo. Esse antígeno pode ser
uma enzima (imobilizada) ligada
preferencialmente no anticorpo 2ª.
Essa enzima pode catalisar um
substrato que em seguida pode ter
um produto que mude a coloração
do meio para detecção por
fluorescência.

Reatores enzimáticos
e leito fluidizado (contínuo)*.
*Mais comuns
Reator é o equipamento no qual as
enzimas imobilizadas são colocadas
em contato com o substrato para Cada tipo de reator tem uma
promoção duma reação bioquímica. desvantagem e vantagem, ou seja,
não tem como prever qual é o
A ideia é maximizar a geração de melhor reator (deve-se fazer testes).
produtos e aumentar o valor
agregado através de um processo
de menor custo e maior rendimento. Os reatores possuem 2 ou mais fases
(sólida com a enzima imobilizada e líquida,
Pode gerar produtos ou mas pode-se ter também a fase gasosa
intermediários para outros processos como no reator air lift).
e deve operar dentro de normas
pré-estabelecidas (biossegurança) e
de respeito ao meio-ambiente.
Deve possuir máxima produção de

um produto e de forma segura,
menor custo de produção possível,
rendimento aproximado de 100%,
menor consumo de energia possível,
ausência ou ↓ impacto ambiental
(isso deve-se principalmente a fase líquida
usada no reator).
Variáveis do processo com

relação ao tempo
Regime permanente
As variáveis (pressão, temperatura,
composição, vazão, etc) não se alteram
com o tempo.
Há vários reatores, como o tanque Regime transiente

agitado (batelada ou contínuo), air lift,
de membranas (enrolado em espiral), As variáveis se alteram com o tempo.
leito fluxo (ascendente e descendente)*

Modo de operação suporte poroso por exemplo.
Batelada
Contínuo
Também pode ser chamada de

descontínuo, e é quando há a
carga do substrato e descarga do Possui condições de alimentação
produto, comum em cristalização, constantes durante o tempo e a
polimerização. retirada do produto é feito com o
tempo também.
A alimentação é sempre no início do
processo, os produtos são retirados Possui uma parte pequena da
no final. operação em regime transiente até
que atinja o estado estacionário
Essa operação ocorre geralmente (permanente).
em regime transiente e em estado
não estacionário. A reação para São geralmente empregados em
quando atinge determinado grau processos com enzimas imobilizadas
de conversão. e em indústrias de grande escala.
Aplica-se em indústria de pequena Vantagens

escala e é operado
majoritariamente com enzimas livres Em relação ao modo descontinuo,
(solúveis), mas pode ser utilizado possui maior facilidade de controle
também com enzimas imobilizadas. automático e na operação do
sistema, possui também uma maior
precisão no controle de qualidade
do produto.
Semi-contínuo
Possui adição de reagente ou
retirada de produto no meio da
Desvantagens reação. Está basicamente entre o
Possui uma difícil manutenção, tem o continuo e a batelada, e possui
tempo morto (carga, descarga e reações mais complexas.
limpeza), tem uma maior demanda de
serviço equipamentos auxiliares e a Vantagens
agitação mecânica pode levar a
desativação catalítica (até na enzima Possui maior controle reacional das
imobilizada), uma solução seria um reações exotérmicas, ↑ seletividade,

uma minimização de reação reversa
devido ↑ [produto].
Características hidrodinâmicas
Mistura total
*resumo
Regime batelada com mistura total
O agitador auxilia a transferência

de massa (soluciona problemas de
difusão do processo como o uso de
suporte poroso) e calor, agita e torna
o meio homogêneo (importante para
enzimas imobilizadas).
Essa operação trabalha com
*problema do meio agitado: um suporte enzimas solúveis que permitem ↑
que resista a isso. No caso de suportes conversões, pois pode ser adotado
com ligações físicas ocasiona a perda de
enzimas. Ou desgaste muito fácil nesses, um longo tempo de residência de
inviabilizando-o mais rapidamente. reagente no reator. Possui um
controle de temperatura (serpentina),
são carregados no topo e
A força aplicada pelo agitador descarregados pelo fundo, e evita
produz movimento distribui e mistura tensão de cisalhamento (chicana).
de todos os componentes.
Comumente usado em processos de

Fluxo tipo pistão difícil controle e produtos de ↑ valor.
Mas possui ↑ custo de mão de obra.
Não possui agitação, ou seja, possui

condições menos uniformes
(*problema). E as enzimas devem estar
imobilizadas.
Seu grau de conversão varia ao

longo do reator e existem gradientes
Pode-se fazer uma bateria em série
de temperatura e de velocidade, há
de reatores do tipo batelada.
também a questão de dispersão
axial dos componentes que não
deve ocorrer.

Problema da batelada: danificação facilidade de construção e
do biocatalizador pelo atrito e o operação, possui ↑ produtividade
fato da enzima passar por um passo volumétrica.
subsequente como a filtração e
centrifugação que causam perdas e
O biocatalizador é mantido no
desativação das partículas do
interior do reator, enquanto
biocatalizador.
substrato e produto são bombeados
respectivamente, para dentro e para
Como alternativa pode-se empregar fora do reator.
reatores do tipo cesta (há diferentes
tipos de cestas) que isolam o sistema
Uma bomba é requerida para
imobilizado, minimizando o problema
manter o fluxo constante através do
do atrito.
leito, além de uma camisa de
aquecimento para a manutenção de
Outra alternativa é alterar a temperatura. E requerem um mínimo
hidrodinâmica do reator, como num de equipamentos auxiliares e são
reator do tipo pistão (leito fluxo ou muito eficientes.
fluidizado) com recirculação, para
uma conversão adequada.
O ideal é que haja um fluxo
ordenado de substrato através do
Regime contínuo com mistura total leito sem dispersão axial.
Possui regime permanente, o grau de

conversão independe do local do
reator (mistura completa por agitação). Vantagens:
Operam com ↑ concentrações, ↑
eficiência e não possuem problemas
de cisalhamento devido à agitação
mecânica.
Tem-se uma carga e descarga Desvantagens:

continua e o tempo morto é Mais propenso a entupir e sofrer
reduzido, o seu fluxo é do tipo compressão, por isso não podem ser
pistão com leito fixo (regime continuo) utilizados catalizadores com
ou fluidizado. diâmetro pequeno demais.
Regime contínuo com fluxo tipo Limitação:

pistão com leito fixo
Tipo de substrato, sendo esses
Mais utilizado com enzimas viscoso, coloidal e partículas solidas
imobilizadas, por possuir ↓ custo, em suspensão. A porosidade do

derivado imobilizado também é uma Vantagens:
limitação, pois pode promover
Elimina a formação de caminhos
limitações difusionais internas
preferenciais, não requer ↑ pressões
(caminhos preferenciais).
e não ocorre formação de
gradientes de concentração.
*caminhos preferenciais: rachaduras no
leito fixo que fazem o fluido escoar por ele
mais facilmente, por isso ele prefere tal Desvantagens:
caminho.
Menor quantidade de enzima é
*Processo de leito fixo: interesterificação empregada, pois é necessário o
da gordura de leite e óleo de soja. grande volume livre para manter
enzimas e suporte suspensos.
Regime permanente com fluxo tipo
pistão com leito fluidizado Regime continuo com fluxo tipo
pistão com membranas
Modificação do leito fixo, nesse

Processo de separação por
caso a enzima é imobilizada e
membranas (sob pressão), baseado na
suspensa por um fluxo ascendente
exclusão dos componentes de
de substrato sob alta vazão,
acordo com massas, formas
possuindo ↓ taxa de cisalhamento.
especificas ou interações do
componente e da superfície da
Possui diferença de densidade entre membrana.
as fases solida e fluida, esta deve
ser a maior possível por que melhora
A seleção de membrana se baseia
condições de mistura no interior (↑
no tamanho da enzima, substrato e
velocidade de circulação do fluido).
produtos e na natureza química da
membrana e substâncias. Esse
Comportamento intermediário entre processo contém uma fase aquosa e
CSTR (mistura total) e PFR (leito fixo). orgânica.
Na maioria das vezes ocorre Características importantes:

recirculação do substrato (↑
velocidades não permitem obtenção de Rejeição da membrana a
tempo suficiente de permanência para determinados solutos (por serem mais
atingir o grau de conversão desejado em frágeis), fluxos de permeado,
poucas passagens). resistência a ↑ temperaturas,
solventes e pressão.

As principais características são o produtividade), reutilização da enzima
tamanho dos poros e as densidades (avaliar a relação custo da imobilização e
destes. custo do processo e o tipo de reator deve
ser sempre que possível manter a
estabilidade do biocatalizador), tipo de
Geralmente são produzidas na
forma de feixes de fibras podendo reator (requisitos como pH, temperatura* e
custos e perdas**), características
ser hidrofílica ou hidrofóbica. E os
materiais mais utilizados para cinéticas (rendimento***, inibição por
substrato e produto, e perda de
construí-los, são: polietileno,
atividade****) e da corrente de
polipropileno, nylon e resinas
alimentação (viscosidade*****), suporte
acrílicas.
de imobilização (se frágil não deve-se
usar no tanque com agitação e no leito
Desvantagem: fixo não pode-se usar suportes
compressíveis e nem pequenos pela
↓ da atividade do biocatalizador variação de pressão), características
pela perda da enzima, ↓ da reacionais (tipo de sistema biocatalítico,
eficiência de transferência de massa número de fases e tipos de solventes, e
por causa da ↓ do fluxo de efeitos de transferência de massa) e a
permeado. característica do biocatalizador
(atividade enzimática, requisitos de água,
desnaturação por agitação e
estabilidade a temperatura, pH e solventes
tóxicos).
*Tanque agitado mais recomendado por

ser mais homogêneo.
**Nos processos contínuos deve-se avaliar
perdas de atividade catalítica.
A principal aplicação é na ***Geralmente é maior em leitos fluidizado e

fixo.
biotransformação (hidrólise) de
lipídeos (gorduras, óleos, triglicerídeos, ****Em reatores contínuos.
ácidos graxos e ésteres). *****Se for alta indica-se tanque agitado
*pode-se produzir biodiesel ou leito fluidizado, se for baixa indica-se
leito fixo (ausência de material
particulado).
Condução do processo (bateladas

são mais para pequena escala, contínuos
são para produções maiores por ter maior

Estudo dirigido
bomba é requerida para manter o
Quais as vantagens e fluxo constante através do leito, além
desvantagens do uso de um de uma camisa de aquecimento
para a manutenção de temperatura.
reator do tipo batelada com
Requerem também um mínimo de
enzimas isoladas? equipamentos auxiliares e de alta
Vantagens: o uso de enzimas livres, eficiência.
faz com que a enzimas não perca
sua conformação, estrutura e função Já no leito fluidizado tem-se uma
natural. Como é indicados para modificação do leito fixo, nesse caso
pequena escala, se torna um ótimo a enzima é imobilizada e suspensa
método experimental (piloto). por um fluxo ascendente de
substrato sob alta vazão, possuindo
Desvantagens: possui uma difícil baixa taxa de cisalhamento. Tem
manutenção, contendo tempo morto diferença na densidade entre as
(tempo de carga, descarga e limpeza), fases sólida e fluida, e esta deve ser
possui uma maior demanda de a maior possível para melhorar as
serviço equipamentos auxiliares condições de mistura no interior. Na
(como uso de suportes, e operações
unitárias posteriores, como uma filtração
maioria das vezes ocorre
excelente se a enzima for livre) e a
recirculação do substrato.
agitação mecânica pode levar a
O controle dos níveis de fluxo e
desativação catalítica (até na enzima pressão em reatores enzimáticos de
imobilizada), mas isso pode ser
leito fixo se faz importante devido
reduzido com o uso de um suporte ao fato de que se houver um alto
poroso. fluxo, tem-se uma alta velocidade, e
isso não permite a obtenção de
tempo suficiente de permanência do
Quais as diferenças entre os substrato para atingir o grau de
regimes contínuos operados com conversão desejado em poucas
fluxo tipo pistão em leito fixo e passagens, mas se a pressão for
muito baixa . Altas pressões não são
fluidizado? Por que é muito
necessárias, mas quando aplicadas
importante o controle dos níveis
podem aumentar os problemas de
de fluxo e pressão em reatores cisalhamento, há o fato de que
enzimáticos de leito fixo? pode vir a entupir, e em altas
No leito fixo o biocatalizador é pressões poderia danificar (por conta
mantido no interior do reator, da compressão) o reator se esse
enquanto substrato e produto são entupimento não for detectado a
bombeados respectivamente, para tempo.
dentro e para fora do reator (por um
fluxo ordenado, sem dispersão axial). Uma

interações do componente e da
Quais as principais vantagens de superfície da membrana. Ou seja, a
utilização de reatores enzimáticos seleção de membrana se baseia no
tamanho da enzima, substrato e
de leito fluidizado em
produtos e na natureza química
comparação com aqueles de leito destes, e esse processo contém uma
fixo? Em que possíveis situações a fase aquosa e orgânica.
utilização de um reator de leito Deve-se atentar aos solutos
fluidizado não é vantajoso em utilizados, e possui uma resistência a
relação ao leito fixo? altas temperaturas, a solventes e a
A principal vantagem de utilizar-se pressão. As principais características
o leito fluidizado em comparação que devem ser consideradas são o
ao leito fixo, é a eliminação da tamanho dos poros e as densidades
formação de caminhos preferenciais, destes. E podem ser hidrofílicas ou
os quais são comuns em reatores de hidrofóbicas.
leito fixo. Outra vantagem é a de
não possuir gradientes de Fouling é o termo em inglês que
concentração, ou seja, o processo melhor representa o entupimento
possui maior homogeneidade. dessas membranas por meio de uma
deposição de material.
O uso de um reator de leito
fluidizado não é tão vantajoso em O reator enzimático com fluxo do
relação ao leito fixo quando há a tipo pistão que opera com a
necessidade de uma alta utilização de membranas
produtividade, pois o leito semipermeáveis possui sua principal
fluidizado deve possuir um volume aplicação é na biotransformação
livre para manter as enzimas e o (hidrólise) de lipídeos (gorduras, óleos,
suporte em suspensão. triglicerídeos, ácidos graxos e ésteres).
Logo abaixo tem-se uma
representação do processo, é
Explique o funcionamento de um possível notar-se essa "membrana
reator enzimático com fluxo tipo semipermeável", a qual é composta
pistão que opera com a por uma tela, um filtro, as enzimas
imobilizadas (lipases nesse caso), e por
utilização de membranas
fim mais uma tela.
semipermeáveis. O que é fouling?
Através de pesquisa realizada na
internet, apresente um exemplo
prático que envolve este tipo de
problema muito comum em reatores
enzimáticos cujo funcionamento
depende do uso de membranas
semipermeáveis.
É um processo de separação por
membranas, e se baseia na exclusão
dos componentes de acordo com
massas, formas específicas ou

Biocatálise em meios não convencionais
Deslocamento do equilíbrio químico

A biocatálise em meios não (especificamente no caso das hidrolases),
convencionais é o uso de ou seja, há a ocorrência de hidrólise
biocatalizadores em diferentes em meio aquoso favorecendo
processos de biotransformação. reações de síntese (meio pobre em
água induz, pois é o inverso da hidrólise
Os meios não convencionais são em meio aquoso) pelo controle
meios que não são aquosos (sendo adequado da quantidade de água;
os solventes orgânicos, os fluidos
supercríticos, as fases gasosas e os ↑ estabilidade térmica devido ao
líquidos iônicos), assim existe um processo de desnaturação, pois eles
problema no uso de substratos requerem a presença de água;
hidrofóbicos, restringindo as Há a simplificação dos processos de
aplicações de biocatálise. recuperação de produto e enzima,
Para solucionar o problema com pois solventes tem ↓ ponto de
relação a substratos hidrofóbicos ebulição (consegue-se usar a
tem-se a incorporação (de solventes evaporação);
orgânicos, fluidos supercríticos, fases
↓ dos riscos de contaminação
gasosas e líquidos iônicos) ao meio
microbiana (não há muitos organismos
reacional.
que prosperam nesses meios);
Os meios não convencionais são
↑ oxigênio em meios orgânicos
definidos por uma reduzida (molécula apolar, solubiliza melhor em
quantidade de água disponível em meios aquosos);
comparação ao meio convencional
(soluções aquosas). Melhora da seletividade da enzima,
porque ↓ as reações secundárias
*Água é importante para o funcionamento
das enzimas (camadas de solvatação a (reação com outras substâncias);
qual da flexibilidade as enzimas), mas em Estereoespecificidade das enzimas
demasia induz a desativação enzimática
e afeta a desnaturação (quando reduz a
pode ser alterada, devido a rigidez
água, evita-se a desnaturação de estrutural conferida por meios não
enzimas de interesse, por que o processo convencionais, e isso pode afetar
não ocorre). interações entre enzimas e substrato.
Permitem a solubilização de
substratos/produtos hidrofóbicos;
Biocatálise em solventes orgânicos
Redução de possíveis efeitos
inibitórios e/ou (causando alosterismo) Com relação a operação do reator
tóxicos por parte de substratos/ e com relação ao isolamento e
produtos (o solvente pode atuar como purificação, tem-se:
diluente ↓ concentração interfacial);

Vantagens e eliminação de resíduos (descarte
adequado, o custo disso, tratamento, etc).
Solubilização de substratos e
produtos hidrofóbicos, deslocamento
Econômicos: custo.
do equilíbrio químico, ↓ da
inibição/toxicidade de substratos e Classificação dos sistemas
produtos, recuperação de biocatalítico com solventes
substratos e produtos (por meio da orgânicos
ebulição), ↑ concentração elevadas 1. Mistura homogênea de meio
de produtos (devido a diluição ↑ aquoso e solventes orgânicos
volume de rendimento). miscíveis com água (adição de
Desvantagens etanol/metanol, gera-se 1 fase e ↑ a
solubilidade de determinadas substâncias
Limitações à transferência de massa sem ser esses solventes orgânicos, ↑ o
(propriedades que façam o substrato ter
dificuldades para chegar ao sítio rendimento). Tem-se ↑ solubilidade de
catalítico, pode solucionar por reator substratos hidrofóbicos em meio
agitado), toxicidade para o aquoso (adição de solvente orgânico
biocatalizador (desnaturação/ miscível com água), ↑ toxicidade aos
degradação de determinadas proteínas, biocatalizadores
não se adaptam bem), formação de
emulsões (de difícil de separação do 2. Mistura de duas fases liquidas
produto). orgânico-aquosas, ou seja, tem-se a
utilização de solvente imiscível em
água. Tem-se 2 possibilidades nesse
sistema, uma fase orgânica (substrato
ou reservatório de substrato/produto
hidrofóbicos) contínua e uma fase
*Difícil separar. aquosa dispersa e/ou vice-versa. O
biocatalizador é solúvel na fase
Critérios para seleção do solvente aquosa e os substratos fluem da
orgânico fase orgânica para a aquosa, e os
Físico-químicos: capacidade de produtos da fase aquosa para
solubilização do substrato e orgânica. Pode ter-se uma 3ª fase,
produto, coeficiente de partição ,(o uma fase sólida onde o
quanto de substrato e produto que fica biocatalizador encontra-se
em cada fase) densidade (influencia na imobilizado. Nesses sistemas há a
viscosidade), pontos de fusão e necessidade de área interfacial
ebulição, tensão superficial e elevada, ou seja, uma interface entre
viscosidade (influencia na tensão as 2 fases (líquido-líquido e líquido
superficial). sólido) para haver uma transferência
de massa de substratos/produtos. Há
Biológicos: toxicidade para o um controle da partição de
biocatalizador. substrato e produto mediantes a
escolha do solvente orgânico. E por
Segurança: toxicidade e fim tem-se a acumulação preferencial
inflamabilidade. do substrato ou produto na fase
orgânica a qual irá minimizar a
Logísticos: facilidade de obtenção ação inibitória sobre o catalisador.

Na imagem acima tem-se em branco Acima tem-se um biocatalizador
a fase aquosa (disperso), onde o imobilizado (em preto) em um suporte
biocatalizador está solúvel e em poroso em sistema trifásico, onde
cinza a fase orgânica (contínua). tem-se a fase orgânica (disperso)
dada pela cor cinza e em branco a
fase aquosa (contínua).
*Tem-se uma questão a mais, por ter um

Na imagem acima tem-se em branco
suporte onde tem-se que o substrato
a fase aquosa (contínua), onde o passar.
biocatalizador está solúvel e em
cinza a fase orgânica (disperso).
3. Biocatalisadores dissolvidos em
solventes orgânicos: micelas
invertidas (microemulsões)* e enzimas
modificadas covalentemente.
*tem-se uma fase aquosa que não é
macroscopicamente discernível da fase
orgânica (contínua).
*Acima tem-se um problema da Tem-se agregados de agentes
diferença de massa.
tensoativos na presença de
solventes apolares e pequenas
quantidades de água, ou seja, uma
substância anfipática (hidrofílica e
hidrofóbica), cujo interior é aquoso
(hidrofílica) e tem biocatalizadores
imobilizados e fora é orgânico
Acima tem-se um biocatalizador (hidrofóbica). Há um ↑ da área
imobilizado (em preto) em um suporte interfacial com ↓ limitação à
poroso em sistema trifásico, onde transferência de massa (facilitando),
tem-se a fase orgânica (contínua) mas a presença de tensoativo pode
dada pela cor cinza e em branco a causar alguma inativação da
fase aquosa (disperso). enzima e problemas na etapa da
*Facilita a recuperação do recuperação do produto.
biocatalizador, mais tem-se o problema de
transferência de massa por ter mais uma
fase no sistema.

Na imagem acima tem-se em branco
a fase aquosa, em cinza a fase
orgânica e em preto a enzima
imobilizada (ou não).
Na imagem acima tem-se a fase

aquosa em branco, a orgânica em
cinza e em preto tem-se o
biocatalizador imobilizado
ressuspenso.
Na imagem acima tem-se um
biocatalizador modificado com
polietilenoglicol dissolvido em meio
orgânico, em cinza tem-se a fase
orgânica e em branco a fase
aquosa.
*enzima mais solúvel em fase orgânica.
Na imagem acima tem-se a fase
aquosa em branco, a orgânica em
cinza e o biocatalizador liofilizados
e na forma de cristais ressuspensos
(no meio do branco, em preto).
4. Biocatalisadores ressuspensos em
solventes orgânicos com ↓ teor de
água: enzimas e pó (liofilização ou
cristalização) ou biocatalizadores
imobilizados, na ausência de fase
aquosa. Nesse caso há uma Tecnologias para melhorar
redução de valores muito pequenos características do biocatalizador
do teor de água presente no meio
reacional implicando na redução
da flexibilidade dos
biocatalizadores, mas pode ser
crítico não ter flexibilidade, pois
pode não funcionar da forma
correta. Tem-se a utilização de
solventes orgânicos hidrofílicos e as
enzimas são imobilizadas em
suportes sólidos ou na forma de pó.
Acarreta no d estabilidade das
enzimas devido a remoção da
camada de solvatação de água
que participa do processo de
desnaturação.

Biocatálise na presença de Na imagem anterior tem-se o
líquidos iônicos diagrama de fases de uma
Líquidos iônicos são formados por substância pura, nesse caso sendo o
um cátion orgânico e um ânion CO2.
inorgânico/orgânico e que possuem
inúmeras aplicações. O fluido supercrítico pode ter
propriedades alteradas (ex: pressão),
A vantagem é dada pela produzindo variações de densidade,
combinação original de suas solubilidade, etc.
propriedades, sendo essas:
↓ ponto de fusão; O meio de reação possui ↑
Líquidos em ↑ temperaturas; difusividade, ↓ toxicidade (como o
Bons solventes para uma série CO2) e impacto ambiental, facilidade
de compostos orgânicos, de remoção (varia a pressão) e
inorgânicos e materiais propõem uma melhora na atividade
poliméricos; dessas enzimas (transferência de massa).
Fáceis de preparar e baratos;
Pouco tóxicos e seguros.
Mas algumas enzimas podem não

funcionar muito bem nesse meio.
O principal interesse é devido a

química verde, por ser processos
ambientalmente mais limpos e Acima tem-se alguns fluidos usados,
seletivos e se preocupando com como o CO2, o qual precisa de uma
relação a substituição de solventes ↓ temperatura e uma ↑ pressão. Ele é
orgânicos (ex: organo-halogenados), mais utilizado por não possuir
pois podem ser moldados de toxicidade e inflamabilidade, sua
acordo com as necessidades da remoção é fácil (por descompressão) e
reação. por fim possui características
semelhantes ao do hexano (solubiliza
Biocatálise em fluidos supercríticos compostos hidrofóbicos).
Fluidos supercríticos são compostos
submetidos a pressão e temperatura Possui uma densidade semelhante ao
acima dos valores críticos, dos líquidos e é por isso que é um
adquirindo propriedades físicas bom solvente, mas seu coeficiente de
intermediárias entre o estado líquido difusão é muito maior do que os dos
e o gasoso. líquidos. Possui também uma menor
viscosidade comparado aos líquidos
em geral e isso ↑ velocidade da
reação (facilita a difusão).
A desvantagem desse método é a

pressão elevada, assim tem-se a
necessidade do uso de
equipamentos caros e com maior
gasto de energia.

Ex: hidrólise por celulases, lipases em
reações de esterificação,
transesterificação e hidrólise.
Biocatálise em sistemas sólido-

sólido
É a utilização de substratos na
forma sólida com a presença de
uma pequena quantidade de *Indústrias de cosméticos, aromas e até
solvente, só para as enzimas alimentos.
funcionarem. Assim o substrato sólido No processo acima há a
se dissolve e é transformado em necessidade de reciclar o NADH2, e
produto na fase líquida pelo isso encarece o processo, pois junto
biocatalizador, mas se a [produto] com a enzima tem-se que imobilizar
excede a solubilidade há a também o cofator (nesse caso o
cristalização do produto (facilita NADH2), e isso é muito caro.
separação), entretanto consegue-se
quantidades muito pequenas deste. As vantagens desse sistema são:
↓ problemas de transferência de
Esse sistema possui maior segurança massa;
em termos de processo e menor ↑ [substrato/produto];
impacto ambiental por não utilizar ↑ facilidade de recuperação do
solventes orgânicos. biocatalizador;
↓ risco de contaminação
Pode-se observar 3 fases, e a microbiana (↑ temperaturas, 65 °C).
bioconversão sempre ocorre na fase
líquida (a qual é insignificante Desvantagem:
comparado ao sólido). Deve-se possuir uma ↓
quantidade de água mínima
Há a utilização de ↑ [substratos], para manter a camada de
consequentemente tendo uma hidratação de proteínas, porém
conversão e velocidade de reação não pode-se exceder esse limite
↑. (ocorre desnaturação devido a altas
temperaturas).
Esse processo pode ser empregado
Ex: esterificação e transesterificação por
em escala de mmolar (síntese de lipases e oxidação de etanol.
peptídeos, compostos enantipuros e
ésteres), e em molar (síntese do z-
aspartame).
Biocatálise em sistema sólido-gás

A fase sólida é onde tem-se o
biocatalizador e a fase gasosa
onde há o substrato, este o qual irá
escoar sobre o biocatalizador (ex:
síntese de aldeídos e álcoois*).
*Álcool desidrogenase converte aldeído
de cadeia curta em álcool.

Estudo dirigido
substratos. Mas por outro lado se
Cite três razões para o emprego houver uma grande quantidade de
de meios não-convencionais em água tem-se a redução da
estabilidade térmica da enzima, e
processos de biocatálise. É
isso pode induzir a uma
possível deslocar o equilíbrio desnaturação em altas temperaturas
químico de reações catalisadas (o processo de desnaturação requer a
por enzimas em meios não- presença de água).
convencionais? Justifique sua Ademais, não pode-se esquecer que
resposta. as reações de hidrólise dependem
Permitem a solubilização de da água também, assim se o
substratos e/ou produtos desejado for uma reação de síntese,
hidrofóbicos, aumenta a esta seria mais favorecida numa
estabilidade térmica (processo de quantidade mínima de água (somente
desnaturação requer a presença de para a camada de solvatação da
água) e melhora da seletividade da enzima).
enzima, porque reduz as reações
secundárias (reação com outras
substâncias). O que são líquidos iônicos? Quais
Sim, pode-se deslocar o equilíbrio as vantagens da utilização deste
químico de reações em meios não- tipo de meio reacional em
convencionais, isso ocorre por que a processos de biocatálise?
hidrólise acontece em meio aquoso Líquidos iônicos são formados por
favorecendo reações de síntese (já um cátion orgânico e um ânion
que o meio é pobre em água, pois é o
inverso da hidrólise que ocorre em meio
inorgânico ou orgânico.
aquoso) pelo controle adequado da
As vantagens são dadas pela
quantidade de água. combinação original de suas
propriedades. Possuem um alto
ponto de fusão, são líquidos em
altas temperaturas, são bons
Por que o controle da quantidade solventes para uma série de
de água (atividade de água) compostos orgânicos, inorgânicos e
presente no meio reacional é tão materiais poliméricos, possuem um
importante para os processos de fácil preparo, são baratos, podem
biocatálise? ser moldados de acordo com as
O controle se faz importante porque necessidade da reação, são pouco
as enzimas possuem uma camada tóxicos e seguros (é um processo mais
de solvatação (feita de água), a qual limpo ambientalmente).
se for muito reduzida faz com que a
enzima adquira uma rigidez
estrutural, afetando assim as Por que o CO2 é considerado um
interações entre enzimas e bom fluido supercrítico para

reações de biocatálise? específico mostrado abaixo?
O CO2 precisa de uma baixa
temperatura e uma alta pressão. Ele
é mais utilizado por não possuir
toxicidade e inflamabilidade, ser de
fácil remoção (por descompressão) e
por possuir características
semelhantes ao do hexano (solubiliza
compostos hidrofóbicos).
O processo abaixo é uma
biocatálise em sistema sólido-gás.
As vantagens com relação aos
Por que mesmo em processos de sistemas compostos por fases
biocatálise do tipo sólido-sólido é líquidas é que tem-se uma redução
necessária a presença de uma nos problemas de transferência de
pequena quantidade de água em massa, pode-se ter altas
termos de massa do sistema? Este concentrações de substrato e/ou
tipo de sistema é adequado para produto, tem uma alta facilidade de
aplicações que requerem recuperação do biocatalizador e
produção em grandes escalas? possui uma redução no risco de
Justifique sua resposta. contaminação microbiana (altas
temperaturas).
A utilização de substratos na forma
sólida deve-se ter a presença de
uma pequena quantidade de A desvantagem é que deve-se
solvente, só para as enzimas possuir uma baixa quantidade de
funcionarem, isso ocorre devido as água mínima para manter a camada
enzimas ficarem rígidas sem a de hidratação de proteínas, porém
presença da camada de não pode-se exceder esse limite
(ocorre desnaturação devido a altas
solvatação, e isso implica em seu
temperaturas). Tem-se uma outra
funcionamento.
problemática também que é quando
Não, pois consegue-se quantidades
a enzima necessita de um cofator,
muito pequenas deste, assim não é
com isso o processo se torna muito
um processo muito viável, exceto se
caro.
o produto possuir um valor
A necessidade de NADH2 é um fator
agregado muito alto, mas
dificultante do sistema por que há a
geralmente utiliza-se em escalas
necessidade de reciclar o NADH2
molares e milimolares.
(cofator da álcool desidrogenase), e isso
encarece o processo, pois junto com
a enzima tem-se que imobilizar
Que tipo de processo de também o cofator (nesse caso o
biocatálise está representado no NADH2).
esquema abaixo? Quais são as
vantagens e desvantagens deste
sistema em relação aos sistemas
compostos por fases líquidas? Por
que a necessidade de NADH2 é um
fator dificultante do sistema

Resumo de Engenharia Enzimática

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Enzima

Aceleram reações químicas sem

Atuam em condições amenas de pH

Tipos de interações que contribuem

Toda enzima possui um sítio ativo, Catálise covalente (ativação de

Página 1 de Engenharia enzimática

Beneficia vários setores (alimentos, Um exemplo é a asparaginase

Página 2 de Engenharia enzimática

A quimosina (vinda do estômago do

Página 3 de Engenharia enzimática

Grupo reativo (geralmente nucleófilo)

Enzimas que conhecem 2 substratos

Página 4 de Engenharia enzimática

Passo 2: Há a formação da ligação

O nucleófilo ataca o carbono da

Passo 4: Assim o grupo que contém

*É um grupo acil/acila que se liga.

Importante para imobilização do

Página 5 de Engenharia enzimática

Usam da estratégia de formação de

Enzimas encontradas em bactérias e

Página 6 de Engenharia enzimática

Catálise por aproximação

Transferência direta sem a

É uma reação ↑ exergônica, para

O loop P se liga com o sítio

Página 7 de Engenharia enzimática

pela quebra dessa ligação

A enzima pode usar um desses

Página 8 de Engenharia enzimática

Quimiotripsina usa o método de Por conta de sua cadeia principal

Esses átomos metálicos estabilizam o

Ela ajuda a transformar a molécula

Página 9 de Engenharia enzimática

O resíduo de histidina (57) serve

Página 10 de Engenharia enzimática

Questão 1 - Com base na entrada

Cada enzima possui uma cavidade

Na imagem acima tem-se uma bolsa Na imagem acima temos somente a

Tal estrutura (cavidade) possui o Questão 3 - Selecione a tríade

Página 11 de Engenharia enzimática

Acima podemos observar os resíduos

Na tripsina o resíduo 189 há uma

Página 12 de Engenharia enzimática

Em rosa temos o íon Zn+, em azul

Questão 3 - Identificar o íon A histidina 64 faz parte de uma

Página 13 de Engenharia enzimática

Na imagem acima é possível verificar

Acima observa-se o loop P (cor azul).

Página 14 de Engenharia enzimática

A cinética enzimática é o estudo da

Página 15 de Engenharia enzimática

Página 16 de Engenharia enzimática

Vmáx e Km fornecem poucas

Uma vez que Vmáx ocorre quando a

A etapa E-P é a etapa limitante da

Dividindo-se por Vmáx, obtém-se:

Ou, Km = 2 [S], quando

No gráfico acima pode-se notar

Página 17 de Engenharia enzimática

O valor de Kcat é o número de ciclos

A razão Kcat/Km define a constante

Na tabela a maior razão é na