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Introdução
Um dos iões mais importantes no organismo humano é o magnésio (Mg2+) devido à sua
actividade reguladora. Encontra-se principalmente no citosol mas certos organitos celulares
possuem-no na sua constituição em menor percentagem.
Entre esses organitos destacamos as mitocôndrias. Estas encontram-se dependentes do
magnésio devido às suas funções no metabolismo mitocondrial, na regulação de actividades
enzimáticas e no transporte de aniões e catiões.
No que toca à regulação de actividades enzimáticas devemos sublinhar que a ATP-
sintetase não funciona na ausência de grandes concentrações de magnésio na matriz
mitocondrial.
Para extrair o magnésio da matriz e poder observar os efeitos na actividade da ATP-
intetase pode-se utilizar o ionóforo de catiões A23187 (A23).
Materiais e Equipamento
Fracção de mitocôndria vegetal (tubérculo de batata) previamente preparada.
Sistema de medição de potencial eléctrico (ΔΨ) mitocondrial com eléctrodo de
TPP+.
Meio de reacção com 250 mM de sacarose, 20 mM de KCl, 2 mM de KH2PO4,
0.05% de BSA, 10 mM de HEPES, (pH 7.0).
Soluções:
1 mM de TPP+
100 mM de ADP
100 mM de ATP
1 mM de A23187
1 M de succinato de K
100 mM e 250 mM de MgCl2
100 mM e 250 mM de MnCl2
100 mM e 250 mM de CaCl2
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Resultados
1º Ensaio
2
2º Ensaio
3
3º Ensaio
4
4º Ensaio
5
5º Ensaio
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Discussão
1º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial relativamente
rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na
matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso
adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento verifica-se uma nova
fosforilação oxidativa, com uma velocidade semelhante à primeira. Assume-se então que a
actividade do A23 foi exercida mas sem resultados evidentes, isto porque a concentração de
magnésio no meio apresentava um valor apreciável relativamente à concentração de magnésio
na matriz mitocondrial, não permitindo uma movimentação (significativa) do magnésio para o
exterior.
Portanto, a 5 mM de magnésio a taxa de fosforilação é de 150 nmol ADP foforilado . mg-
1
proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
Taxa de fosforilação = Concentração de ADP
Unidade de Tempo
2º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, lenta. De seguida
foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na matriz mitocondrial
para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso adicionou-se
novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento a única alteração registada é a da própria
adição do ADP sem ocorrência de fosforilação oxidativa. Assume-se então que a actividade do
A23 foi exercida com sucesso, pois uma grande quantidade de magnésio existente na matriz
mitocondrial foi removida para o exterior, impedindo assim a actuação da ATP - sintetase.
Portanto, na ausência de magnésio a taxa de fosforilação é de 75 nmol ADP foforilado .
mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 75 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
4 min
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3º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, ligeiramente mais
rápida que a que foi verificada no ensaio anterior. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja
função é retirar o magnésio que existe na matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que
a actividade foi realizada com sucesso adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse
momento verifica-se uma nova fosforilação oxidativa, com uma velocidade significativamente
mais lenta que a primeira. Assume-se então que a actividade do A23 foi exercida com algum
sucesso visto que uma quantidade relativamente notória de magnésio foi removida para o
exterior, apesar de que ainda se manteve bastante na matriz para que a ATP – sintetase pudesse
actuar com algum resultado.
Portanto, a 0.5 mM de magnésio a taxa de fosforilação é de 90.9 nmol ADP foforilado .
mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 90.9 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
3.3 min
4º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, relativamente
rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na
matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso
adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento a única alteração registada é a
da própria adição de ADP sem ocorrência de fosforilação oxidativa. Assume-se então que a
actividade do A23 foi exercida com sucesso, pois uma grande quantidade de magnésio
existente na matriz mitocondrial foi removida para o exterior, impedindo assim a actuação da
ATP-sintetase.
Portanto, a 0.5 mM de cálcio a taxa de fosforilação é de 200 nmol ADP foforilado . mg-1
proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 200 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
1.5 min
5º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, relativamente
rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na
matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso
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adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento verifica-se uma nova
fosforilação oxidativa, com uma velocidade semelhante à da primeira. Assume-se então que a
actividade do A23 foi exercida mas sem sucesso, isto porque a concentração de manganésio no
meio apresenta um valor apreciável relativamente à concentração de magnésio na matriz
mitocondrial, não permitindo uma movimentação (significativa) de magnésio para o exterior.
Portanto, a 2 mM de manganésio a taxa de fosforilação é de 125 nmol ADP foforilado .
mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 125 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
2.4 min
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adicionado magnésio ao meio, foi adicionado cálcio. Verifica-se então que o cálcio não pode
substituir o magnésio, porque quando se adiciona A23 o magnésio presente na matriz sofre
transporte para o meio em grande quantidade. Este processo é igual ao que ocorre na ausência
de magnésio no meio.
Contrariamente a este último resultado, no quinto ensaio observa-se que quando se
adiciona manganésio ao meio vai ocorrer uma segunda fosforilação oxidativa, tal como no caso
em que existe magnésio no meio (1º e 3º ensaios). Assume-se então que o manganésio pode
substituir o magnésio no processo de respiração mitocondrial.
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