Visualização das células HeLa

em mitose
 Mitose
Processo de divisão celular conservativa:

O núcleo da célula mãe sofre transformações

que o dividem em dois núcleos geneticamente iguais
entre si e iguais ao núcleo original.

A mitose divide-se em 4 etapas

• Profase:
• Metafase
• Anafase
• Telofase
Mitose
 Objectivos
• Visualizar a β-tubulina,
componente principal
dos microtúbulos,
através de microscopia
de fluorescência ,
recorrendo a
anticorpos marcados
com fluoróforos.
Objectivos

• Visualizar o DNA,
recorrendo a um
corante que também
emite fluorescência.
 Microtúbulos
• Estruturas cilíndricas ocas formadas
por proteínas – tubulina.
 Microtúbulos
• Estão em constante reorganização, crescendo
numa extremidade (“mais”), graças à
polimerização local dos dímeros de tubulina, e
diminuindo na outra (“menos”), graças à
despolimerização local.
 Microtúbulos
• Cada microtúbulo é formado pela
associação de dímeros proteicos que se
encurvam em hélice.
 Microtúbulos
• Tubulina:
Formada por duas
proteínas globulares
semelhantes mas não
iguais – α-tubulina e
β-tubulina –, que estão
ligadas por ligações
não-covalentes.
 Microtúbulos
• Num corte transversal, vê-se que cada
microtúbulo é constituído por anéis com
13 dímeros.

• Pode ser encontrado no citoplasma de

todas as células.
 Microtúbulos
• Funções:
 Movimentação de cílios e flagelos;

 Transporte intracelular de partículas;

 Deslocamento de cromossomas na mitose;

 Estabelecimento e manutenção da forma

das células.
 Microscopia de Fluorescência
• Observar organismos capazes de fixar
substâncias fluorescentes – fluorocromos.
Microscopia de Fluorescência
Anticorpos ou Imunoglobulinas
• Glicoproteínas com uma
estrutura em Y.

• Constituídas por quatro

cadeias polipeptídicas:
duas cadeias leves, cada
uma delas ligada a uma
pesada por duas pontes
de enxofre.
Anticorpos ou Imunoglobulinas

• Cada extremo da
parte em V
transporta um sítio
activo,
complementar de
um antigénio.
Anticorpos ou Imunoglobulina
• Acções:

 Neutralização de toxinas;

 Recobrimento de antigénios;

 Destruição celular;

 Fagocitose auxiliada pelo sistema

complemento.
 Protocolo
Este protocolo tem como principal objectivo
demonstrar como se irão desenvolver as células HeLa em
lamelas.
As células deverão desenvolver-se em lamelas mas
de forma a não ficarem demasiado juntas dificultando a
sua visualização em TEM.
1. Fixação
 Usou-se como meio de limpeza o PBS;

 Solução de 4% paraformaldeído / 4%
sacarose.
2. Permeabilização
Neste momento pretende-se tornar a
célula permeável ao marcador;

Usou-se uma solução de PBS com 0,25%

Triton X-100.
3. Bloqueio

 Usou-se uma solução 0,2% de gelatina

em PBS.
4. Marcação da Tubulina
 Lavou-se com PBS desta vez com 0,1% de
gelatina;

Cobriu-se as lamelas com uma solução

contendo o anticorpo anti-β-tubulina diluído
em PBS com 0,1% de gelatina.
5. Marcação com Hoescht 33342

 Adicionou-se sobre as lamelas 200 μl

de Hoescht 33342;

 Incubou-se durante 10 minutos à

temperatura ambiente.
6. Montagem das Lamelas
 Colocou-se sobre a lâmina uma gota de
meio de montagem DAKO e colocar em cima
da lamela;

 Secou-se no escuro durante

aproximadamente 15 minutos, à temperatura
ambiente;

Selou-se as lamelas com verniz em volta.

7. Observação ao Microscópio

 Observou-se as preparações no
microscópio de fluorescência;

 Efectuou-se o registo fotográfico de

diferentes fases da mitose.
 Resultados
• Antes do processo da mitose
 Resultados
• Profase
 Resultados
• Metafase
 Resultados
• Passagem da metafase para a anafase
 Resultados
• Anafase
 Resultados
• Fim da Anafase
 Resultados
• Telofase
 Resultados
• Finalização do Processo Mitótico