UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA

PRÓ- REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

FABIANE OLIVEIRA FARIAS

PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DE SORO DE

LEITE E ÁGUA DE MACERAÇÃO DE MILHO

PONTA GROSSA
2015
 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PRÓ- REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

FABIANE OLIVEIRA FARIAS

PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DE SORO DE LEITE E

ÁGUA DE MACERAÇÃO DE MILHO

Dissertação apresentada como requisito para obtenção do

grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos da Universidade Estadual de Ponta Grossa.
Orientador: Prof. Dr. Ivo Mottin Demiate (UEPG)
Co-orientador: Prof. Dr. Alessandro Nogueira (UEPG)

PONTA GROSSA
2015
 Ficha Catalográfica
Elaborada pelo Setor de Tratamento da Informação BICEN/UEPG

Farias, Fabiane Oliveira

F224 Produção de etanol de segunda geração a
partir de soro de leite e água de
maceração de milho/ Fabiane Oliveira
Farias. Ponta Grossa, 2015.
76f.

Dissertação (Mestrado em Ciência e

Tecnologia de Alimentos - Área de
Concentração: Ciências e Tecnologia de
Alimentos), Universidade Estadual de Ponta
Grossa.
Orientador: Prof. Dr. Ivo Mottin
Demiate.
Coorientador: Prof. Dr. Alessandro
Nogueira.

1.Subprodutos. 2.Planejamento de
experimentos. 3.Cinética fermentativa.
4.Bioetanol. 5.Monensina sódica.
I.Demiate, Ivo Mottin. II. Nogueira,
Alessandro. III. Universidade Estadual de
Ponta Grossa. Mestrado em Ciência e
Tecnologia de Alimentos. IV. T.

CDD: 664
À minha família, dedico!
 AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus criador de todas as coisas, sem Ele não teria força e
coragem suficiente para continuar apesar das adversidades que surgem no decorrer da vida.
Aos professores e com certeza também amigos, Ivo Demiate e Alessandro Nogueira,
pela confiança em mim depositada e por estarem sempre disponíveis para auxiliar em todas as
dúvidas, não só científicas, mas também dando conselhos que certamente levarei comigo por
toda a vida.
Agradeço a minha mãe, Ione, que sempre me mostrou que quando acreditamos num
sonho a luta é sempre válida, e que desistir não deve fazer parte dos meus pensamentos,
obrigada por ser um exemplo de luta e coragem em minha vida!
Ao meu pai e anjo da guarda, Luiz Fernando, que acredito que dia a dia cuida de mim,
e mesmo longe dos olhos é meu exemplo de humildade, amor e fé.
A minha irmã, Fernanda, que muitas vezes além de irmã, foi mãe, pai e principalmente
amiga incentivando nos momentos difíceis, sendo exemplo de dedicação a ser seguido.
A minha afilhada, Lauren, alegria das nossas vidas, que na sua inocência de criança,
muitas vezes me fez rir e me esquecer dos problemas que me cercavam.
Ao meu namorado, Diulhio, que em todos esses anos sempre me apoiou
incondicionalmente em seguir meus sonhos. Acredito que ainda cresceremos muito juntos.
Às minhas amigas de anos, Ana Paula e Renata, e aquelas que o mestrado me trouxe,
Aline, Andressa, Tâmisa, Priscila e Mayara, pela convivência e companhia de cada dia.
A Denise e ao Vitor que sempre estiveram disponíveis para me ajudar quando precisei.
A CAPES ao CNPq pelo apoio financeiro, a Universidade Estadual de Ponta Grossa,
ao Departamento de Engenharia de Alimentos e ao laboratório multiusuário (C-LABMU) pela
estrutura disponibilizada, e a todas as empresas que forneceram materiais para serem
utilizados neste estudo.

E a todos que de maneira geral contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho e

realização deste sonho, muito obrigada!
 RESUMO

O crescimento da agroindústria gera além de impactos positivos, a preocupação pela alta

geração de subprodutos que necessitam de uma disposição adequada. O soro de leite e a
milhocina estão entre estes subprodutos que podem ser considerados de alto potencial
poluidor se simplesmente forem descartados no ambiente, ou matérias primas potenciais para
obtenção de novos produtos se considerarmos os nutrientes que ambos apresentam. Uma
possível utilização destes subprodutos é na produção de bioetanol diminuindo os impactos
tanto da alta geração de resíduos quanto do uso de combustíveis fósseis. O objetivo deste
trabalho foi produzir etanol via fermentativa utilizando os subprodutos soro de leite e água de
maceração de milho. Foram utilizadas ferramentas de planejamento de experimentos, para se
estudar diferentes meios para produção de etanol de segunda geração a partir destes
subprodutos. Neste estudo, dois meios fermentativos, um deles contendo 100 % de milhocina
e o outro 25 % de soro de leite com 75 % de milhocina, ambos suplementados com glucose
foram considerados os melhores para produção de bioetanol atingindo-se eficiência de
fermentação em torno de 90 % para ambos. Os referidos meios também apresentaram
resultados satisfatórios quando suplementados com melaço de cana de açúcar ou com açúcar
mascavo, condições próximas às utilizadas para fermentações em escala industrial. Um dos
principais problemas encontrados na produção de etanol foi a geração de ácido lático
resultante da contaminação do processo com bactérias ácido-láticas, sendo que tanto a
pasteurização quanto o uso de antibióticos foram eficientes para controlar esses
contaminantes. O uso de antibióticos, principalmente da monensina sódica, apresentou
vantagens reduzindo a velocidade máxima de crescimento da levedura (µ max), visto que
menores valores para µ max, segundo estudos, refletem em maiores índices de eficiência da
fermentação. De maneira geral os resultados obtidos foram considerados satisfatórios,
atingindo-se alto índice de produtividade em etanol (acima de 1 g L-1 h-1) e eficiência máxima
de fermentação (Nb) de 93,85 % para o experimento contendo 100 % de milhocina utilizando
o antibiótico monensina sódica como controle de contaminantes.

Palavras-Chave: subprodutos, planejamento de experimentos, cinética fermentativa, bioetanol,

monensina sódica.
 ABSTRACT

The agro-business growth beyond creating positive impacts generates the concern with the
high level of by-products generation that require proper disposal. Cheese whey and corn steep
liquor are among these by-products with high pollution potential if are simply discarded, but
if considered the nutrients present in both of them, they are potential raw materials for
obtaining new products. One possible use of those by-products is as substrates for bioethanol
production, decreasing the impacts in high waste generation as well as the use of fossil fuels.
The aim of this work was to produce bioethanol using the by-products whey and corn steep
liquor. Experimental design tools were used to examine their technical viability for second-
generation ethanol production. The worts, containing 100% corn steep liquor and 25% whey
with 75% corn steep liquor, supplemented with glucose were considered superior for
bioethanol production with fermentation efficiency reaching around 90 % for both of them.
The worts also showed satisfactory results when supplemented with sugar cane molasses or
brown sugar. One of the main problems found in ethanol fermentation was the lactic acid
generation resulting from contamination with lactic acid bacteria, and in order to overcome
that difficulty, pasteurization and use of antibiotics were made and showed good results in
controlling contaminants. The use of antibiotics, especially of sodium monensin showed
advantages by reducing the maximum rate of growth of yeast (µ max), and as reported
elsewhere lower µ max values reflects in higher rates of fermentation efficiency. In general the
results were considered satisfactory reaching high level of ethanol productivity (above 1 g L-1
h-1) and maximum fermentation efficiency (Nb) of 93.85 % for the experiment with 100 % of
corn steep liquor using monensin sodium antibiotic how to contaminants control.

Keywords: by-products, experimental design, fermentation kinetics, bioethanol, sodium

monensin.
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fluxograma da obtenção da farinha de milho biju e subprodutos gerados. ......... 13

Figura 2: Lactose em suas conformações α e β. .................................................................. 17
Figura 3: Esquema da hidrólise da lactose catalisada pela enzima β-d-galactosidase. ....... 17
Figura 4: Catabolismo da glucose e da galactose pela Saccharomyces cerevisiae. ............ 20
Figura 5: Evolução dos biocombustíveis no Brasil. ............................................................ 23
Figura 6: Perfil de aminoácidos dos subprodutos agroindustriais milhocina e soro de
leite utilizados neste estudo. ............................................................................... 36
Figura 7: Curva de liberação de CO2 durante o processo fermentativo de diferentes
mostos para a determinação do tempo de fermentação....................................... 42
Figura 8: Cinética Fermentativa para experimento 1: (a) consumo de açúcares
fermentescíveis totais (AFT) e produção de etanol; (b) Consumo de
nitrogênio e produção de biomassa. .................................................................... 45
Figura 9: Cinética Fermentativa para experimento 2: (a) consumo de açúcares
fermentescíveis totais (AFT) e produção de etanol; (b) Consumo de
nitrogênio e produção de biomassa. .................................................................... 46
Figura 10: Gráfico para determinação de µ máx pelo coeficiente angular da reta ajustada
aos dados experimentais na fase exponencial de crescimento para os ensaios:
(a) Experimento 1 e (b) Experimento 2. ............................................................. 48
Figura 11: Curva de liberação de CO2 durante o processo fermentativo dos diferentes
meios fermentativos utilizando diferentes fontes de açúcares. ........................... 50
Figura 12: Comparação da produção de ácido lático durante a fermentação pelo uso de
diferentes meios de controle das bactérias láticas............................................... 54
Figura 13: Curva de liberação de CO2 durante o processo fermentativo de diferentes
meios fermentativos utilizando como antibiótico a monensina sódica
cristalina em comparação com a pasteurização e ausência de controle de
contaminantes. .................................................................................................... 57
Figura 14: Comparação da produção de ácido lático após 27 horas de fermentação
utilizando diferentes métodos de controle de contaminantes.............................. 59
Figura 15: Cinética Fermentativa para experimento 1 utilizando antibiótico: (a)
consumo de açúcares fermentescíveis totais (AFT) e produção de etanol; (b)
Consumo de nitrogênio e produção de biomassa. ............................................... 60
Figura 16: Cinética Fermentativa para experimento 2 utilizando antibiótico: (a)
consumo de açúcares fermentescíveis totais (AFT) e produção de etanol; (b)
Consumo de nitrogênio e produção de biomassa. ............................................... 61
Figura 17: Gráfico para determinação de µ máx pelo coeficiente angular da reta ajustada
aos dados experimentais na fase exponencial de crescimento para os ensaios:
(a) Experimento 1 e (b) Experimento 2 utilizando antibiótico P. Maxx. ............ 62
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características físico-químicas da milhocina. .......................................................... 13

Tabela 2: Composição do soro de leite doce e ácido................................................................ 15
Tabela 3: Delineamento experimental do tipo simplex centróide para mistura binária. .......... 27
Tabela 4: Características físico-químicas da milhocina e do soro de leite. .............................. 33
Tabela 5: Compostos nitrogenados presentes na milhocina e soro de leite.............................. 35
Tabela 6: Eficiência da fermentação das diferentes misturas de subprodutos indicadas pelo
planejamento de experimentos. ................................................................................ 37
Tabela 7: Parâmetros resultantes da fermentação alcoólica das diferentes misturas de soro
de milhocina ............................................................................................................. 38
Tabela 8: Análise de variância (ANOVA) para Eficiência da Fermentação* em proporções
dadas pelo planejamento de mistura. ....................................................................... 41
Tabela 9: Coeficientes e respectivos erros padrão do modelo linear. ...................................... 41
Tabela 10: Parâmetros do mosto durante a fermentação para os diferentes experimentos. ..... 43
Tabela 11: Parâmetros resultantes da Fermentação dos experimentos avaliados em 27 h de
processo. ................................................................................................................... 47
Tabela 12: Comparação dos valores preditos através do modelo linear e dos valores
encontrados experimentalmente para eficiência da fermentação em 27 h de
processo. ................................................................................................................... 47
Tabela 13: Parâmetros avaliados do mosto antes e após a fermentação alcoólica utilizando
diferentes mostos e diferentes fontes de açúcares.................................................... 51
Tabela 14: Parâmetros resultantes da fermentação alcoólica para os substratos das
melhores misturas utilizando antibióticos. ............................................................... 55
Tabela 15: Parâmetros do mosto durante a fermentação utilizando como antibiótico a
monensina sódica. .................................................................................................... 58
Tabela 16: Resultados dos parâmetros da fermentação dos experimentos avaliados em 27 h
de processo comparando métodos de controle de contaminantes. ........................... 63
 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 10
2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 11
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 12
3.1. RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS .......................................................................... 12
3.1.1. Água de maceração de milho..................................................................................... 12
3.1.2. Soro de leite ............................................................................................................... 15
3.2. FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA ............................................................................. 18
3.2.1. Saccharomyces cerevisiae ......................................................................................... 19
3.2.2. Controle de Contaminantes........................................................................................ 21
3.3. BIOETANOL E ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO ......................................... 22
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 25
4.1. MATERIAIS.............................................................................................................. 25
4.2. MÉTODOS ................................................................................................................ 25
4.2.1. Caracterização físico-química dos subprodutos ........................................................ 25
4.2.2. Hidrólise do Soro de Leite ......................................................................................... 26
4.2.3. Delineamento experimental ....................................................................................... 27
4.2.4. Análise do etanol ....................................................................................................... 28
4.2.5. Determinação da biomassa seca ................................................................................ 28
4.2.6. Cinética Fermentativa ................................................................................................ 28
4.2.7. Efeito da adição de diferentes fontes de açúcares ao mosto ...................................... 31
4.2.8. Uso de antibióticos para controle da contaminação microbiana ............................... 31
4.2.9. Análise Estatística...................................................................................................... 32
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 33
5.1. Composição físico-química e compostos nitrogenados dos subprodutos ................. 33
5.2. Hidrólise do Soro de Leite ......................................................................................... 36
5.3. Delineamento Experimental ...................................................................................... 37
5.4. Cinética Fermentativa ................................................................................................ 42
5.4.1. Efeito da adição de diferentes fontes de açúcares ao mosto ...................................... 49
5.4.2. Uso de antibióticos para controle da contaminação microbiana ............................... 53
6. CONCLUSÕES............................................................................................................ 64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 66
 10

1. INTRODUÇÃO

O uso de novas tecnologias para produção agrícola assim como o aumento da

produção de alimentos resultam no crescimento da agroindústria brasileira. Junto a esse
crescimento surge a preocupação com a geração de resíduos, que causam danos ao meio
ambiente devido ao potencial poluidor resultante da sua disposição em lugares inadequados
ou da falta de tratamento. Os resíduos ou subprodutos gerados em indústrias de alimentos ou
agroindustriais recebem maior atenção por serem úteis na síntese de novos produtos, dentre
estes, estão a água de maceração do milho e o soro de leite.
A água de maceração de milho ou milhocina é um subproduto da moagem úmida do
milho, que apresenta baixo custo de obtenção e está amplamente disponível. Tem em sua
composição carboidratos e aminoácidos livres, o que a torna uma excelente fonte de
nutrientes para micro-organismos em inúmeros processos fermentativos de alta eficiência. O
soro de leite é o principal subproduto da produção de queijos gerado em grandes volumes e
apresenta elevada carga orgânica, atribuída ao alto teor de lactose, sendo uma fonte deficiente
em nitrogênio para processos biológicos.
Esses subprodutos podem ser utilizados como mostos para fermentação alcoólica,
sendo que nessa fermentação, compostos orgânicos como a glucose são transformados em
etanol e dióxido de carbono. Este processo fermentativo é feito principalmente pelo micro-
organismo Saccharomyces cerevisiae e a presença de carbono e nitrogênio é essencial para o
seu metabolismo. Sendo assim a mistura de soro de leite e milhocina pode suprir a
necessidade de nutrientes dessa levedura.
O etanol, principal produto da fermentação alcoólica, tem sido muito estudado, pois
quando é produzido por via biológica (bioetanol), evita o uso de combustíveis fósseis que são
poluentes e não renováveis. Se produzido a partir de materiais como cana-de-açúcar,
beterraba e milho, por exemplo, é chamado de etanol de primeira geração, e se produzido a
partir de resíduos e/ou fontes alternativas, pode ser denominado etanol de segunda geração.
Este trabalho teve por objetivo caracterizar a água de maceração de milho e o soro
de leite a fim de estabelecer misturas para a produção de etanol de segunda geração avaliando
a eficiência da fermentação e sugerindo um processo de alta produtividade.
 11

2. OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Produzir etanol via fermentativa utilizando água de maceração do milho e soro de leite como
substrato.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Caracterizar os subprodutos água de maceração de milho (proveniente da produção de

farinha de milho biju) e soro de leite quanto às suas características físico-químicas e ao perfil
de aminoácidos;
- Desenvolver um planejamento de misturas para otimização da composição do meio
fermentativo utilizando água de maceração e soro de leite hidrolisado para produção de etanol
de segunda geração tendo como variável de resposta o rendimento da fermentação;
- Avaliar o comportamento da cinética fermentativa utilizando diferentes fontes de açúcares e
diferentes formas de controle de contaminantes (pasteurização e antibióticos) no mosto de
melhor eficiência sugerido pela otimização do processo.
 12

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

O acentuado crescimento do agronegócio brasileiro o coloca em posição de destaque

no processo de desenvolvimento do país. A geração, adaptação, transferência e a adoção de
inovações tecnológicas possibilitaram ganhos de produtividade expressivos na agroindústria
(GASQUES; BASTOS, 2003). A agroindústria surge a partir do aumento da produção de
alimentos com sistemas agrícolas mais intensivos e junto a ela vem a preocupação sobre
geração de resíduos com potencial de causar danos ambientais, se não forem corretamente
direcionados ou tratados (SCHNEIDER et al., 2011).
A produção de resíduos pode representar perda de biomassa e de nutrientes, além de
aumentar o potencial poluidor associado à disposição inadequada dos mesmos, sendo
encontrados na forma de resíduos sólidos, como o bagaço de cana, por exemplo, e de líquidos.
Quando tratados ou transportados para disposição adequada, o alto custo desses
procedimentos tem efeito direto sobre o preço do produto final (ROSA et al., 2011).
Os resíduos agrícolas e da indústria de alimentos, são caracterizados pela alta
demanda química de oxigênio (DQO), demanda biológica de oxigênio (DBO) e sólidos
solúveis, e estes particularmente, estão recebendo maior atenção, pois representam matérias-
primas de possível utilização para a síntese de produtos úteis.
Embora muitos subprodutos já possuam alguma aplicação industrial, grande parte da
biomassa residual das atividades agrícolas do Brasil ainda é inutilizada (PANDEY et al.,
2000; SAAVEDRA et al., 2005; DIAS et al., 2013). Novas tecnologias são necessárias visto
que os padrões de efluentes ultimamente têm se tornado mais rigorosos quanto à redução da
carga orgânica e a exigência de remoção de nitrogênio está sendo especialmente reforçada
(AIHARA, 2002).

3.1.1. Água de maceração de milho

Um dos produtos da moagem úmida do milho é a farinha de milho biju, produto

típico de nosso país e muito utilizado na culinária em diferentes formas, sendo muito bem
aceito pelos consumidores (ALESSI et al., 2009). A água de maceração do milho, ou
milhocina, consiste em um importante subproduto da indústria de moagem úmida do milho
sendo um substrato de baixo custo e disponível em larga escala. No processamento em via
 13

úmida, a maceração do milho acontece após a limpeza e secagem do mesmo e esta água
utilizada na maceração segue para a estação de tratamento apresentando valores médios de
DQO de 14.000 mg L-1 e DBO de cerca de 11.000 mg L-1 (LOSS et al. 2009). O
processamento desta farinha biju está exemplificado na Figura 1:

Figura 1: Fluxograma da obtenção da farinha de milho biju e subprodutos gerados.

Fonte: adaptado de Alessi et al. (2009)

As características físico-químicas da milhocina proveniente da produção de farinha

de milho biju podem ser observadas na Tabela 1.

Tabela 1: Características físico-químicas da milhocina.

Parâmetros analíticos
Milhocina
(mg L-1)
Sólidos totais 7819
Nitrogênio Total 1026
Açúcares 1000
Gordura 8,0
DQO* 14670
pH** 4,5
-1
Fonte: Loss et al. (2009), *mgO2 L , ** adimensional.

Diferente da milhocina proveniente do processo de produção de farinha biju (Tabela

1) a milhocina proveniente da produção industrial de amido de milho possui sólidos solúveis
que podem representar cerca de 40-50 % (m m-1) do seu peso seco, em função do processo
industrial de alta tecnologia que inclui a concentração desse líquido, também conhecido como
Corn Steep Liquor. Independente da origem da milhocina, sua composição compreende uma
mistura de açúcares redutores, dos quais glucose e frutose são predominantes, aminoácidos,
 14

em sua maior parte na forma de aminoácidos livres, além de minerais, vitaminas e outros
nutrientes elementares, sendo uma excelente fonte de nutrientes para os micro-organismos e
que podem apresentar influência na produção de etanol (AMARTEY; JEFFRIES, 1994; GAO
et al., 2011). Quanto aos aminoácidos presentes, os principais são prolina, cisteína, ácido
aspártico e ácido glutâmico. Em relação aos elementos potássio, fósforo, enxofre, sódio e
silício, sua composição depende fortemente dos processos de tratamento do milho (CHOI et
al., 2013). A milhocina possui baixo custo e está amplamente disponível no mercado, além de
ser uma rica fonte de nitrogênio e nutrientes para a maioria dos micro-organismos. É um
produto agrícola renovável e economicamente viável utilizado com sucesso em inúmeros
processos fermentativos e também como matéria prima na indústria farmacêutica (PAREKH
et al., 1999; ALVIM et al., 2002; EDWINOLIVER et al., 2009; GAO et al., 2011).
A milhocina, em particular, constitui uma alternativa rentável para substituir os
suplementos amplamente utilizados em processos fermentativos, como a peptona e o extrato
de levedura, além de possuir vantagem para aplicação industrial se comparada a estes
suplementos de alto custo; a milhocina também apresentou bons resultados para a substituição
da peptona na suplementação de soro de leite utilizado em bioprocessos (AGARWAL et al.,
2008; SILVA et al., 2010). A suplementação com baixos níveis de milhocina também atende
às necessidades nutricionais compatíveis com o crescimento e fermentação de alto
desempenho, de micro-organismos dos gêneros Zymomonas, Streptomyces, Clostridium e
Saccharomyces, por exemplo, podendo diminuir os custos com adjuvantes nutricionais em
fermentações de larga escala (LAWFORD; ROUSSEAU, 1997; AZEREDO et al., 2006; LAU
et al., 2010; MADDIPATI et al., 2011). Além da suplementação, muitos estudos são feitos
para utilização da milhocina na obtenção de produtos de maior valor agregado, como ácido
succínico, enzimas, butanodiol, acetoína, acetona, butanol e etanol (CHOI et al., 2013; XI et
al., 2013; YANG, et al., 2013).
Segundo a Associação Brasileira das Indústrias do Milho (ABIMILHO, 2013) cerca
de 2,4 milhões de toneladas do milho produzido em 2013 foram utilizadas no consumo
industrial em moagem úmida, contra 2,2 milhões de toneladas utilizadas industrialmente na
moagem a seco e 1,02 milhões de toneladas utilizadas para o consumo humano “in natura”.
Este fato confirma a grande geração da milhocina, visto que para cada quilograma de milho
processado em via úmida utiliza-se um litro de água, aproximadamente, o que implica na
necessidade de buscar novas alternativas para este subproduto.
 15

3.1.2. Soro de leite

O soro de leite é o subproduto líquido obtido quando a caseína e gordura são

separadas a partir da coagulação do leite (FRIGON et al., 2009). Trata-se do principal
subproduto gerado na produção de queijos não só pela elevada carga orgânica como pelo
grande volume, relacionado com a produtividade de cada tipo de queijo e também com o tipo
de leite processado (CARVALHO et al., 2013). De maneira geral, são gerados cerca de nove
litros de soro de leite para cada quilograma de queijo produzido. Este soro pode ser
encontrado na forma de soro doce, com um pH de pelo menos 5,6, originado na produção de
queijos por coagulação enzimática (por coalho), e soro de leite ácido, com um pH máximo de
5,1 obtido a partir da fabricação de queijos de coagulação ácida (ONWULATA; HUTH,
2009), os quais possuem pequenas diferenças em termos de composição, conforme pode ser
observado na Tabela 2.

Tabela 2: Composição do soro de leite doce e ácido.

Parâmetros Analíticos
Soro Doce Soro Ácido
(g 100 mL-1, base úmida)
Sólidos totais (ST) 6,4 6,2
Proteína 0,8 0,75
Gordura 0,5 0,04
Lactose 4,6 4,2
Cinzas 0,5 0,8
Ácido lático 0,05 0,4
Fonte: Antunes (2003).

Segundo a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO,

2012), a produção brasileira de queijos em 2012 foi de 46.200 toneladas, o que equivale à
geração de aproximadamente 415 mil toneladas de soro de leite; em nível mundial, a
produção de queijos no mesmo ano foi de 20 milhões de toneladas. Além do grande volume
gerado, este subproduto possui uma alta carga poluente, sendo de risco considerável para a
eutrofização em águas receptoras, devido ao teor nitrogênio total e fósforo presentes no
mesmo representando um problema ambiental significativo. Apresenta também alta carga
orgânica, com valores de DBO e DQO entre 30-50.000 mg L-1 e 60-100.000 mg L-1,
respectivamente, atribuídos ao alto teor de lactose no soro (SISO, 1996; GELEGENIS et al.,
2007; PRAZERES et al., 2012).
 16

Por outro lado, o soro retém alguns nutrientes do leite, incluindo proteínas, lipídeos,
lactose, vitaminas e minerais de grande potencial para a obtenção de produtos
comercializáveis, o que desafia a indústria a enfrentar o soro como uma matéria-prima e não
apenas como um resíduo (GUIMARÃES et al., 2010). A composição química, em seu peso
seco, consiste principalmente de lactose, 70-75 % e proteínas solúveis, 10-15 % (FRIGON et
al., 2009). Considerando a sua composição em carbono e nitrogênio e fósforo, estes
componentes são encontrados na proporção aproximada de 200:3,5:1, o que, em princípio, faz
com que o mesmo possa ser considerado uma fonte deficiente de nitrogênio para processos
biológicos (PRAZERES et al., 2012).
Segundo Gänzle et al. (2008) existe um esforço contínuo para encontrar novos usos
para o soro de leite que está diretamente ligado à descoberta de novos usos para lactose, o
principal componente do soro, visto que as normas de descargas ambientais estão mais
difíceis de serem cumpridas. As autoridades estão se tornando mais vigilantes em todas as
regiões, e os tratamentos estão cada vez mais complexos e caros. O processo de fermentação
de lactose reduz fortemente a carga poluente do soro de leite, contribuindo para minimizar
problemas ambientais causados pelo excesso de soro gerado (SILVA et al., 2010).
A conversão da lactose presente no soro em etanol combustível, pode não apresentar
vantagens econômicas se comparada com os processos atualmente estabelecidos, utilizando
cana de açúcar ou milho. Porém visto que o soro é um subproduto, o uso da sua lactose
representa vantagem sob outros aspectos por não se tratar de um alimento humano. A
fermentação de soro de leite deve ser rápida para maximizar a produtividade de etanol do
processo, mas junto a isso é fundamental a minimização da concentração de açúcar residual
no efluente, uma vez que o tratamento de resíduos também faz parte dos objetivos do
processo. Além do etanol combustível, o etanol de soro de leite pode ser adequado para o uso
na indústria alimentícia, de bebidas, cosmética e farmacêutica, visto que o mesmo pode ser
considerado potável; outras aplicações para o soro de leite em bioprocessos são a obtenção de
ácidos orgânicos, glicerol, aminoácidos, goma xantana e até mesmo de compostos voláteis
(SISO, 1996; GUIMARÃES et al., 2010).

Hidrólise da Lactose
A lactose (α-lactose) ou β-D-Galactopiranosil-(1
4)-α-D-glucopiranose (IUPAC,
1969) (Figura 2) é um dissacarídeo que compreende uma molécula de glucose ligada a uma
molécula de galactose. Uma característica distintiva da lactose é sua manifestação em
 17

diferentes estados dependentes da temperatura e das inter-relações físico-químicas estando

presente em soluções aquosas nas formas α e β (GÄNZLE et al., 2008).

Figura 2: Lactose em suas conformações α e β.

Fonte: Gänzle et al. (2008)

A enzima responsável pela hidrólise da lactose (Figura 3) é a β-galactosidase,

comumente chamada de lactase.

.
Figura 3: Esquema da hidrólise da lactose catalisada pela enzima β-d-galactosidase.
Fonte: Gänzle et al. (2008)

A lactase pode ser obtida a partir de micro-organismos, plantas e animais, e suas

propriedades variam de acordo com a sua fonte, sendo que o uso de lactase de origem
microbiana oferece várias vantagens sobre as demais. As fontes microbianas mais utilizadas
para essa finalidade são Kluyveromyces sp e Aspergillus sp (PANESAR et al., 2007b).
 18

3.2. FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

De maneira geral podemos considerar como fermentação todo processo em que

micro-organismos atuam sobre substratos orgânicos originando novos produtos, como:
alimentos modificados, álcoois, solventes e ácidos orgânicos. Inúmeros produtos naturais ou
seus derivados, de natureza orgânica, podem ser a base ou substrato para processos
fermentativos (REGULY, 1996). No Brasil a via fermentativa é a maneira mais importante
para obtenção de etanol, devido ao grande número de matérias-primas existentes em todo o
país que podem ser utilizadas como substratos (LIMA et al., 2001).
A fermentação alcoólica é o processo onde os compostos orgânicos, principalmente a
glucose (C6H12O6), atuam como geradores e receptores de elétrons, gerando energia na forma
de adenosina trifosfato (ATP) e formando etanol (C2H6O) e dióxido de carbono (CO2). A
quebra anaeróbia da glucose é o mecanismo biológico mais antigo para obtenção de energia a
partir de moléculas orgânicas combustíveis. Estas reações catabólicas acontecem com uma
grande diminuição na energia livre de Gibbs (ΔG) e um valor negativo para ΔG corresponde
à liberação de energia pelo sistema, resultando na produção de calor. Um balanço energético
simplificado para a equação do catabolismo anaeróbio da glucose pela Saccharomyces
cerevisiae pode ser descrito da seguinte forma (LENHINGER et al., 1986; VOLPE, 1997;
STRYER et al., 2002; ANTONI et al., 2007):

C6H12O6
2 CO2 + 2 C2H6O; ΔG = -175 kJ/mol de glucose

O carbono, principal componente utilizado para produção de etanol, é utilizado

também na formação de biomassa e dos coprodutos da fermentação (EL-MANSI et al., 2006).
Muitos micro-organismos têm sido estudados para a produção de etanol por fermentação
alcoólica, porém a levedura Saccharomyces cerevisiae ainda permanece como a espécie de
primeira linha, enquanto a bactéria Zymomonas mobilis também tem sido intensamente
estudada e é considerada por alguns pesquisadores como potencial substituta da S. cerevisiae
na produção de etanol. Outro micro-organismo em potencial para produção de etanol é a
bactéria Clostridium thermocellum pela sua capacidade de converter resíduos celulósicos e
celulose cristalina diretamente em etanol (EL-MANSI et al., 2006; BAI et al., 2008).
O processo fermentativo pode ocorrer de diferentes formas, entre elas: contínuo,
semicontínuo e descontínuo. A fermentação descontínua é a mais utilizada e corresponde à
inoculação de um meio com nutrientes em fermentador de modo que a fermentação ocorra
 19

sobre condições ótimas, sem que nada seja adicionado durante o processo. O estudo cinético
de um processo fermentativo consiste na análise da evolução da concentração de um ou mais
componentes do sistema em função do tempo de fermentação podendo-se definir a velocidade
com que o substrato será convertido em etanol, a concentração de biomassa produzida, a
produtividade em etanol, a eficiência da fermentação e a velocidade de crescimento específico
da levedura (µ máx) (LIMA et al., 2001; SCHMIDELL et al., 2001) fatores estes importantes
para determinar a viabilidade do processo fermentativo.
Na fermentação descontínua a cinética de fermentação apresenta três fases
características: fase preliminar, ou fase lag, correspondente a multiplicação celular no mosto e
possui pequeno desprendimento de CO2. Fase tumultuosa, ou fase log, onde acontece maior
liberação de CO2, aumento exponencial de etanol e diminuição da concentração de açúcar, e
por fim, a fase estacionaria onde cessa a liberação de CO2 e a concentração de açúcares
fermentescíveis é mínima. Estas três fases podem ser observadas também na construção da
curva de liberação de CO2 em função do tempo (REGULY et al., 1998; LIMA et al., 2001;
SCHMIDELL et al., 2001).
Após a fermentação o mosto fermentado passa pelo processo de clarificação, para
retirada das células em suspensão (biomassa) e de destilação para obtenção do etanol na sua
forma pura. A destilação é o processo de separação de fases de uma mistura homogênea de
líquidos, utilizado em inúmeros processos industriais, envolvendo a evaporação parcial de um
líquido seguida pela total condensação do vapor, neste caso, correspondente ao etanol
(STICHLMAIR; FAIR, 1998; SCHMIDELL et al., 2001).

3.2.1. Saccharomyces cerevisiae

As leveduras fazem parte do grupo dos micro-organismos protistas de células

eucarióticas, e juntamente com os mofos, correspondem a um subnível dos fungos
(REGULY, 1996). A levedura Saccharomyces cerevisiae é, de modo geral, considerada um
micro-organismo seguro para uso em alimentos (GRAS), potente na utilização para a
produção industrial de etanol podendo fermentar a glucose e outras hexoses presentes no meio
fermentativo de forma eficiente, além de apresentar boa tolerância à presença de etanol, até 20
% (v v-1) (CHANDRAKANT; BISARIA, 2000; EL-MANSI et al., 2006; ANTONI et al.
2007). O uso de leveduras de panificação no Brasil em usinas de produção de álcool é
bastante comum devido ao seu baixo custo e grande disponibilidade (BASSO et al., 2008).
 20

A falta de completo conhecimento da via metabólica original da S. cerevisiae não

permite a produção de melhorias significativas na produção de etanol por intermédio desta
levedura. A principal via metabólica envolvida na fermentação do etanol é a glicólise, através
da qual uma molécula de glucose é metabolizada, e duas moléculas de piruvato são
produzidas (MADIGAN; BROCK, 2009). Diversas cepas de S. cerevisiae prontamente
fermentam, além da glucose, os monossacarídeos manose e frutose, e os dissacarídeos
sacarose e maltose pela via Emden-Meyerhof, e o dissacarídeo lactose não é consumido por
esta levedura. O monossacarídeo galactose, por sua vez, é fermentado por uma combinação da
via Leloir, onde a galactose será convertida a glucose-6-fosfato, e da glicólise. A
concentração de glucose geralmente conduzirá a uma completa repressão do metabolismo da
galactose impedindo assim o consumo simultâneo de glucose e galactose (LELOIR, 1951;
VAN MARIS et al., 2006). O catabolismo da glucose e da galactose pela S. cerevisiae pode
ser observado na figura 4.

Figura 4: Catabolismo da glucose e da galactose pela Saccharomyces cerevisiae.

Fonte: adaptado de Van Maris et al. (2006).
Nota: ATP - adenosina trifosfato; NADPH nicotinamida adenina dinucleótido fosfato; PP - via pentose fosfato;
DHAP - fosfato de diidroxiacetona; PEP- fosfoenolpiruvato; NADH - dinucleótido de nicotinamida e adenina.
 21

Os carboidratos, de grande importância para qualquer célula viva, compreendem a

principal matéria-prima dos processos fermentativos por S. cerevisiae. O nitrogênio também é
essencial para o metabolismo da levedura, sendo o segundo elemento mais utilizado durante o
seu crescimento. O teor de nitrogênio afeta diretamente a cinética da fermentação; um meio
deficiente de nitrogênio resulta em uma fermentação mais lenta (REGULY, 1996; ARIAS-
GIL et al., 2007), sendo que outros fatores nutricionais importantes para a S. cerevisiae são as
vitaminas, minerais, e os compostos fosfatados (SPIGNO et al., 2009). Quanto as condições
físicas ideias para a S. cerevisiae, deve-se considerar a faixa de pH de atuação da levedura
para produção de etanol, de 4,0 a 6,0, apresentando melhores resultados na faixa de 4,0 a 4,5,
e a temperatura na faixa de 20 a 35 °C, (REGULY, 1998) sendo que os melhores resultados
para obtenção de etanol se encontra em temperaturas próximas a 30 °C (ALDIGUIER et al.,
2004).

3.2.2. Controle de Contaminantes

Na fermentação alcoólica, principalmente na produção industrial, deve-se considerar

a contaminação bacteriana como um dos problemas mais comuns, causando danos ao
processo e redução no rendimento e na produtividade da fermentação (MENEGHIN et al.,
2010; MUTHAIYAN et al., 2011). A contaminação por gêneros Lactobacillus e Bacillus está
sempre presente comprometendo o rendimento do processo. A presença de bactérias no mosto
pode resultar na formação de compostos secundários, diminuindo a produção de etanol, pois
competem com a levedura pelos nutrientes utilizados para seu crescimento, dificultam a
conversão do carbono em etanol, reduzem o pH do meio e criam um ambiente desfavorável
para muitos outros organismos, incluindo as leveduras. Entre os compostos secundários
liberados no meio, com efeito inibitório para a Saccharomyces cerevisiae, estão os ácidos
orgânicos: lático e acético. A contaminação com produção de ácido lático considera-se a nível
industrial, a principal causa da floculação da levedura na fermentação alcoólica além de gerar
uma perda de produção estimada entre 2 e 22 % (LIMA et al., 2001; SKINEER et al., 2004;
NARENDRANATH; POWER, 2005; BECKNER et al., 2011; CAETANO et al., 2011).
Diversos métodos são utilizados para combate destes contaminantes, entre eles estão
os antissépticos, como sulfitos, peróxido de hidrogênio e ureia; antibióticos, tais como a
penicilina, virginiamicina e a monensina e também podem ser usados métodos térmicos, tais
como pasteurização e esterilização. Além destes, já existem estudos sobre o uso de compostos
naturais para redução da carga microbiana (VOLPE, 1996; CHANG et al., 1997;
 22

NARENDRANATH et al., 2000; SKINEER et al., 2004; MUTHAIYAN et al., 2011;

COMPART et al., 2013). Os antissépticos criam um ambiente favorável para as leveduras e
desfavorável para outros micro-organismos, entretanto, não são largamente utilizados e
possuem restrições devido aos resíduos nos destilados. Os antibióticos possuem ação
bacteriostática, são considerados econômicos, pois não exigem modificações nas técnicas e
equipamentos além da ocorrência de fermentações mais puras e regulares e da vantagem da
sua inativação durante a destilação. A escolha do antibiótico utilizado dependerá do seu custo
no processo e normalmente são utilizados antibióticos efetivos contra bactérias Gram+ em
concentração inferior a que afeta a levedura (PRESSMAN, 1976; HYNES et al., 1997; LIMA
et al., 2001). A implementação de antimicrobianos biológicos tem sido apontada como
alternativa que pode gerar um impacto positivo tanto na melhoria da fermentação quanto no
valor econômico da produção de bioetanol (MUTHAIYAN et al., 2011).

3.3. BIOETANOL E ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

Pesquisas nas áreas de biomassa e bioenergia ganham destaque reconhecendo que o

petróleo mundial pertence a uma fonte finita e que seu esgotamento está ocorrendo muito
mais rápido do que o previsto, além da degradação ambiental decorrente da geração de gases
de efeito estufa, bem como de vazamentos acidentais. Inúmeras alternativas de energias
renováveis, como o metanol, hidrogênio e o etanol, tornam-se importantes para substituição
dos combustíveis fósseis, mas ainda há necessidade do desenvolvimento de tecnologias para
reduções no custo de produção desses combustíveis de fontes renováveis (ZANIN et al., 2000;
CARDONA; SÁNCHEZ, 2001; BAI et al., 2008; BEHERA et al., 2012). O bioetanol, sendo
um produto proveniente de fontes renováveis de carbono e não de combustíveis fósseis, é um
importante meio para a diminuição dos impactos ambientais negativos decorrentes dos
poluentes gerados pela utilização dos combustíveis fósseis, além de reduzir a dependência das
fontes de petróleo convencionais (CARDONA; SÁNCHEZ, 2001; MADIGAN; BROCK,
2009).
No Brasil foi criado o Proálcool, Programa Nacional do Álcool, após o primeiro
choque do petróleo em 1974. Teve seu início em 1975 a fim de estimular a substituição da
gasolina por álcool da cana no uso em automóveis e intensificar o uso de misturas de etanol e
gasolina nos combustíveis para carros (SOCCOL et al., 2005) e desde então o consumo de
etanol combustível está cada vez maior. A evolução dos biocombustíveis no Brasil pode ser
observada na Figura 5:
 23

Figura 5: Evolução dos biocombustíveis no Brasil.

Fonte: Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis – ANP (2014).
Nota: B2 - Obrigatoriedade de 2 % de Biodiesel no Diesel; B5 – Obrigatoriedade de 5 % de Biodiesel no Diesel.

O etanol de cana já é bem conhecido como um biocombustível eficiente e renovável

promovendo, no Brasil, o desenvolvimento rural e a diversificação das fontes de energia. O
etanol da cana também é responsável por reduzir a dependência das importações de petróleo e
a geração de poluentes, sendo um substituto versátil para a gasolina, principalmente após a
utilização da tecnologia flex dos veículos automotores. Além do o uso como combustível o
bioetanol, proveniente da agricultura e de resíduos, pode ser utilizado também na indústria
farmacêutica e de perfumaria (ZANIN et al., 2000; COELHO et al., 2006; IBETO et al.,
2011). O Brasil, juntamente com os Estados Unidos, é pioneiro na produção de bioetanol
(USDA, 2014); segundo a Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis
(ANP, 2014), aproximadamente 45 % da energia e 18 % dos combustíveis consumidos no
Brasil são de fontes renováveis.
A matéria prima para produção de bioetanol pode variar muito de acordo com sua
origem e composição. Se for proveniente de materiais ricos em açúcar, principalmente de
culturas agrícolas típicas (amido, cana de açúcar, beterraba, milho e mandioca, por exemplo),
 24

resulta em etanol classificado como de primeira geração. Porém, a produção deste tipo de
bioetanol é controversa, pois o uso de água e recursos agrícolas para produção de combustível
ao invés da produção de alimentos pode gerar impactos no uso direto e indireto da terra
devido ao cultivo de matéria-prima para a produção de biocombustíveis. Tendo em vista a
necessidade de evitar esse impacto, surge o etanol de segunda geração, que deve ser
produzido a partir de fontes alternativas, como as matérias-primas e tecnologias de refino e os
resíduos agroindustriais, reduzindo o impacto na produção de alimentos e tornando-se uma
forma de valorização de subprodutos. Apesar de parecer promissora, a tecnologia de produção
de biocombustíveis de segunda geração ainda é muito complexa e necessita de intensos
estudos científicos ao longo das próximas décadas. O custo deste tipo de combustível é um
fator limitante para o uso em escala comercial, sendo que se pode assumir que esta tecnologia
apenas chegará às destilarias após provar sua viabilidade técnica e econômica, sendo ainda
necessária a produção responsável de etanol de primeira geração (LEITE et al., 2008;
AMORIM et al., 2011; HARVEY; PIGRIM, 2011; RAMÍREZ; TRIANA, 2011).
Os principais alvos de pesquisa sobre processos de fermentação alcoólica são altas
produtividades a partir de substratos baratos e renováveis reduzindo a demanda de energia.
Para isto, o desenvolvimento de tecnologias baratas para produção de bioetanol tem sido
destaque em muitas universidades, centros de pesquisas, empresas privadas e diferentes
governos. Neste âmbito o Brasil está entre os países mais avançados do mundo em segurança
energética e sustentabilidade atingindo altos níveis de energia renovável e ecologicamente
sustentável (CARDONA; SÁNCHEZ, 2007; CAZETTA et al., 2007; DODIĆ et al., 2009;
CHOI et al., 2010; HARVEY; PILGRIM et al., 2011).
 25

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. MATERIAIS

A água de maceração de milho utilizada neste estudo foi cedida por uma fábrica de
Farinha de milho do tipo biju da cidade de Irati, Paraná, Brasil. A milhocina foi coletada
diretamente do tanque de maceração após 48 horas de imersão do milho na mesma.
A maceração ocorre basicamente em duas etapas, sendo que numa primeira a canjica
é adicionada aos tanques e adiciona-se água que fica em contato com os grãos por
aproximadamente três horas, com o propósito de entumescimento do grão de milho, o qual
aumentará de volume preenchendo todo tanque. Em seguida, uma pequena parte dessa água é
escoada (o restante fica retida no grão de milho). Em uma segunda etapa de maceração
completa-se novamente o tanque com água que permanecerá em contato com o milho por 48
horas e depois é descartada. Este processo utiliza no total aproximadamente um litro de água
para cada quilograma de milho. O resíduo da segunda maceração consiste na milhocina que
foi utilizado neste trabalho.
O soro de leite do tipo doce, proveniente da produção de queijo tipo Camembert, foi
disponibilizado pela Escola Tecnológica de Leite e Queijos dos Campos Gerais da
Universidade Estadual de Ponta Grossa (Ponta Grossa, Paraná, Brasil).
Os subprodutos foram acondicionados em frascos de polímero PET (politereftalato de
etileno) e armazenados a -18 °C em freezer (Metalfrio, São Paulo, Brasil) até sua utilização.

4.2. MÉTODOS

4.2.1. Caracterização físico-química dos subprodutos

A composição físico-química dos subprodutos foi determinada através das seguintes

análises: pH; fração sólida, por secagem em estufa e DQO segundo as metodologias propostas
pela Associação Americana de Saúde Pública (APHA, 1998). Lipídios foram determinados
por extração através do método de Bligh-Dyer (1959). Proteínas e nitrogênio total pelo
método de Kjeldahl (AOAC 2000); para determinação de proteínas utilizou-se o fator de
correção de 6,25. O teor de cinzas foi por incineração em mufla, ambos seguindo os Métodos
Oficiais de Análises da AOAC (2000). O perfil de açúcares, ácidos orgânicos e aminoácidos
foram determinados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
 26

4.2.1.1. Cromatografia Líquida de Alta eficiência (CLAE)

Perfil de açúcares e ácidos orgânicos

A determinação de açúcares e ácidos orgânicos foi realizada por CLAE. Foi utilizado
um sistema cromatográfico equipado com uma bomba quaternária (Waters 2695 Alliance,
Milford MA, USA), degaseificador e um auto-injetor acoplado a um detector de arranjo de
diodos (Waters 2998, Milford, MA, USA) seguido do detector de índice de refração (Waters
RI 2414, Milford MA, USA). Os dados cromatográficos foram obtidos com o software
Empower® 2. As amostras previamente preparadas foram filtradas em filtro de seringa
0,22µm e analisadas em coluna de exclusão iônica Aminex HPX-87H (300×7.8 mm)
precedida por pré-coluna catiônica Cation-H (Bio-Rad) em condição isocrática utilizando
como eluente uma solução 3,0 mM de ácido sulfúrico preparada em água ultra-pura (Milli-Q
Integral®, Millipore®, São Paulo SP, Brasil) e filtrada em filtro de nylon de 45µm. O volume
de injeção foi de 10 µL a um fluxo de 0,5 mL min-1. A coluna e o detector de índice de
refração foram mantidos a temperatura de 30 °C. As amostras analisadas foram comparadas
com o tempo de retenção dos padrões de referência.

Perfil de aminoácidos
Os aminoácidos foram determinados por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência) através de sistema cromatográfico (Alliance 2695, Waters, Milford, MA, USA)
equipado com detector multi fluorescência (Waters 2475, Milford MA, USA) e coluna Pico
Tag (3,9 X 150 mm). A análise foi realizada segundo metodologia AccQ TagTM utilizando kit
completo da Waters.

4.2.2. Hidrólise do Soro de Leite

O soro de leite passou por uma fase prévia de hidrólise da lactose utilizando-se a
enzima β-Galactosidase (Granolab do Brasil S.A, Curitiba, Paraná, Brasil).
A hidrólise do soro foi conduzida utilizando os parâmetros ótimos de pH e
temperatura de atuação da enzima, de 6,5 e 40 °C, respectivamente, encontrados por Rossetto
et al (2012) para soro de leite. A eficiência da hidrólise foi avaliada a partir do teor de
glucose antes e depois da hidrólise pelo método enzimático de GOD (glucose PP, Gold
Analisa, Belo Horizonte, MG, Brasil) realizado segundo Dahlquist (1961). Os resultados
obtidos por esta metodologia foram confirmados pela análise cromatográfica.
 27

4.2.3. Delineamento experimental

Foram realizados testes preliminares (dados não mostrados) para a definição do

planejamento de experimentos a ser utilizado e optou-se pelo planejamento de misturas
binárias do tipo simplex centróide (BARROS et al., 2001). O planejamento foi composto por
5 diferentes misturas e realizando repetições dos ensaios com componentes puros totalizaram-
se 8 experimentos, como exposto na Tabela 3. As frações de soro e milhocina correspondem
as variáveis independentes e a resposta obtida para o planejamento, a variável dependente, é a
eficiência da fermentação (Nb).

Tabela 3: Delineamento experimental do tipo simplex centróide para mistura binária.

Fração de cada componente na mistura
Mistura Total
Soro (X1) Milhocina (X2)
1 1,00 0,00 1,00
2 1,00 0,00 1,00
3 1,00 0,00 1,00
4 0,00 1,00 1,00
5 0,00 1,00 1,00
6 0,50 0,50 1,00
7 0,75 0,25 1,00
8 0,25 0,75 1,00

O processo fermentativo o ocorreu de maneira descontínua e o tempo de fermentação

foi determinado através de pesagens do fermentador, em intervalos de tempo pré-
determinados de trinta minutos, que indicam a perda de massa resultante do CO2 liberado
(ROGER et al., 2002, ALBERTI et al., 2011).
Os experimentos foram realizados em fermentadores anaeróbios com 50 mL de
mosto previamente pasteurizado (60 °C durante 30 minutos). O teor de açúcares
fermentescíveis foi ajustado para aproximadamente 100 g L-1 utilizando-se glucose. Utilizou-
se um inóculo de 6 g L-1 de levedura S. cerevisiae de panificação (Levedura seca ativa,
Itaiquara, São Paulo, Brasil) adicionado diretamente ao mosto em temperatura ambiente. Ao
fim da fermentação, fez-se o uso de centrífuga para a recuperação dos produtos da
fermentação e remoção da levedura (REGULY, 2000), procedimento este citado na obtenção
da biomassa seca (item 4.2.5). Os parâmetros iniciais e finais do mosto, de teores de ácidos
orgânicos e de açúcares, foram determinados por CLAE. Também foram feitas análises de
densidade e etanol conforme metodologia exposta no (item 4.2.4).
 28

4.2.4. Análise do etanol

Foram retiradas 25 mL de amostra dos fermentadores e destiladas em micro

destilador TE-012 (TECNAL, São Paulo, Brasil). Uma alíquota de 3 mL da amostra destilada
foi analisada em densímetro digital (DMA 4500 M da Anton Paar, Graz, Áustria) que fornece
o teor de etanol (% v v-1) e a densidade (g cm-3). O teor de etanol foi utilizado para o cálculo
da eficiência da fermentação e demais cálculos da cinética fermentativa.

4.2.5. Determinação da biomassa seca

Amostras dos fermentadores foram centrifugadas em centrífuga Rotina 420R,

(Hettich, Tuttlingen, Alemanha) a 12000 g durante 10 min a 10 °C. O sobrenadante
(fermentado) foi retirado e sobre a biomassa decantada adicionou-se água destilada, para lavar
o precipitado retirando sólidos solúveis que podem provocar possíveis erros na análise.
Agitou-se formando novamente uma suspensão e repetiu-se à centrifugação nas mesmas
condições. A biomassa então foi transferida para o cadinho previamente calcinado (Mufla
Jung 2810, Jung, Blumenau SC, Brasil) e pesado; quando necessário utilizou-se água
destilada para auxiliar na retirada do precipitado dos tubos da centrífuga, evitando possíveis
perdas. Em seguida, os cadinhos foram mantidos em estufa (ODONTOBRAS EL-1.4,
Ribeirão Preto, SP, Brasil) a 105 °C por 24 horas, retirados e acondicionados em dessecador
até resfriamento à temperatura ambiente, e pesados.

4.2.6. Cinética Fermentativa

As misturas, provenientes do planejamento, que apresentaram os melhores resultados

em eficiência da fermentação (Nb), foram utilizadas para a determinação dos parâmetros da
cinética fermentativa. O tempo de fermentação foi fixado em 27 horas, sendo realizadas
pesagens dos fermentadores a cada trinta minutos e retiradas alíquotas de fermentados no
intervalo de 4,5 horas, totalizando sete pontos para a cinética. Para determinação dos
parâmetros no ponto inicial da fermentação foram retiradas alíquotas assim que o meio foi
inoculado e homogeneizado. Os parâmetros da cinética fermentativa foram calculados
conforme o descrito por Ribeiro e Horii (1999):
 29

- Concentração celular produzida, segundo a Equação 1:

= − (1)

X = concentração celular produzida (g matéria-seca L-1);

Xf = concentração celular final (g matéria-seca L-1);
X0 = concentração celular inicial (g matéria-seca L-1).
A concentração celular foi determinada conforme a metodologia de determinação de
biomassa seca, exposta no item 4.2.5.

- Açúcar consumido, Equação 2:

= −( − ) (2)

S = açúcar consumido (g L-1);

Sf = concentração final de açúcares (g L-1);
S0 = concentração inicial de açúcares (g L-1).

- Fator de conversão de substrato em biomassa, segundo a Equação 3:

(3)

Fator de conversão de substrato em biomassa.

X = Biomassa produzida (g L-1);

S = Substrato consumido (g L-1).

- Etanol produzido, Equação 4:

= − (4)

P = etanol produzido (g L-1);

Pf = concentração de etanol final (g L-1);
Pi = concentração de etanol inicial (g L-1).
 30

- Fator de conversão de substrato em etanol, Equação 5:

(5)

Fator de conversão de substrato em etanol.

P = etanol produzido (g L-1);

S = substrato consumido (g L-1).

- Produtividade em etanol, Equação 6:

= (6)

PR = produtividade de etanol (g L-1 h-1),

t = tempo de fermentação (h).

Eficiência de fermentação Nb(%), com base no rendimento teórico proveniente da equação de

Gay-Lussac (51,1 g etanol
100g glucose), Equação 7:

(%) =
,
∗ 100 (7)

Eficiência de processo Np(%) com base na concentração inicial de açúcar S0, Equação 8:

(%) = , ∗
∗ 100 (8)

- Determinação da velocidade específica máxima de crescimento (µ máx):

As velocidades específicas máximas de crescimento (μmáx) foram determinadas por

intermédio da construção do gráfico ln em função do tempo, obtendo-se o valor de µ máx

pelo coeficiente angular da reta ajustada aos dados experimentais na fase exponencial de
crescimento, através da equação 9 (STROPPA et al., 2009).
 31

ln = á ∗ + (9)

ln = logaritmo neperiano da concentração de leveduras na fase exponencial de

crescimento;
µ máx = velocidade específica máxima de crescimento (h-1);
t = tempo (h);
b = coeficiente linear da equação do logaritmo da concentração de leveduras em função do
tempo de fermentação, na fase exponencial de crescimento.

Com estes dados foi construída a curva de cinética para o processo fermentativo em
estudo, através de um modelo matemático não estruturado que considera quatro variáveis:
concentração de células (biomassa), concentração de substrato, concentração de produto, e a
taxa de evolução de CO2 (CARDONA; SÁNCHEZ, 2007).

4.2.7. Efeito da adição de diferentes fontes de açúcares ao mosto

Com a finalidade de se avaliar o potencial dos subprodutos como mosto para

fermentação alcoólica em condições próximas a produção industrial, repetiu-se os
experimentos que forneceram melhores resultados para Eficiência da Fermentação (Nb %)
utilizando diferentes fontes de açúcares para substituir o uso de glucose. O mosto foi
suplementado com o melaço de cana, comumente utilizado nas usinas sucroalcooleiras para
produção de etanol, e com açúcar mascavo. A composição em açúcares do melaço da cana e
do açúcar mascavo foi determinada através de CLAE. Os fermentados foram analisados em
função do açúcar e nitrogênio consumidos, da acidez produzida além dos parâmetros de
eficiência e produtividade. Paralelamente a estes experimentos substituiu-se o mosto
(subprodutos) por água para avaliar o potencial dos nutrientes presentes nos subprodutos.

4.2.8. Uso de antibióticos para controle da contaminação microbiana

Um dos principais problemas observados na produção de bioetanol é a contaminação

bacteriana, principalmente por bactérias produtoras de ácido lático. Desta forma, foram
realizados testes com diferentes antibióticos de uso em fermentação alcoólica fornecidos pela
empresa Phibro Ethanol Performance Group® (Guarulhos, São Paulo, Brasil) avaliando-se a
 32

eficiência do processo fermentativo (Nb %) e o teor de ácido lático produzido durante a

fermentação. Foram utilizados cinco diferentes antibióticos: um composto por virginiamicina,
outro por monensina sódica e os demais por uma combinação de antibióticos ionóforos e
inertes. Todos foram previamente diluídos em etanol e adicionados ao mosto na concentração
indicada pelo fornecedor de 5 mg L-1, exceto para o composto virginiamicina cuja
concentração adicionada foi de 2 mg L-1, seguindo dados encontrados na literatura
(BISCHOFF et al., 2009). Todos os antibióticos foram aplicados aos mostos de melhor
eficiência da fermentação, segundo o planejamento de experimentos, e os resultados foram
comparados com os obtidos pelo mesmo mosto pasteurizado. Realizou-se a cinética completa
do antibiótico com a melhor eficiência.

4.2.9. Análise Estatística

O delineamento experimental do tipo simplex centróide aplicado a uma mistura de

dois componentes foi obtido através do software Statistica 10.0 (StatSoft, Tulsa OK, USA)
para Windows. Dada a adequação do modelo, aplicou-se o método de otimização simultânea
proposto por Derringer e Suich (1980), o qual utiliza a função de desejabilidade do
experimento, neste caso maior eficiência da fermentação. Essa desejabilidade é dada através
da equação do modelo aplicado (Equação 10), na qual Y é a resposta previsível, no caso a
eficiência da fermentação, α 1 e α 2, são os coeficientes de regressão linear e X1 e X2, são as
variáveis independentes (BRUNS et al., 2006) neste caso as frações de soro e milhocina na
mistura.

Y = α1.X1 + α2.X2 (10)

O mesmo software foi utilizado para avaliar os dados experimentais quanto à

normalidade, segundo teste de Shapiro-Wilk (p>0,05 dados considerados normais) e para os
dados que não seguiram a distribuição normal, a transformação Box-Cox foi utilizada (Dados
não mostrados). Avaliou-se também a homogeneidade de variância, utilizando-se o teste de
Brown-Forsythe (p>0,05 foi considerado como dado homogêneo), e então os dados
paramétricos (normais e homogêneos) foram avaliados segundo análise de variância
(ANOVA, p valor<0,05 foi considerado significativo) seguida do teste de Fisher LSD para
comparação de médias.
 33

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Composição físico-química e compostos nitrogenados dos subprodutos

As características físico-químicas dos subprodutos, milhocina e soro de leite logo

após sua coleta, estão apresentadas na Tabela 4.

Tabela 4: Características físico-químicas da milhocina e do soro de leite.

Parâmetro (g L-1) Milhocina Soro
pH* 4,30 ± 0,07 5,70 ± 0,05
Acidez (ácido lático) 1,20 ± 0,10 0,49 ± 0,10
Sólidos Totais 20,80 ± 0,55 70,70 ± 0,56
Proteína 11,42 ± 1,13 8,58 ± 0,80
Cinzas 5,00 ± 0,10 5,45 ± 0,10
Lipídios 0,50 ± 0,11 4,43 ± 0,90
Açúcares 0,70 ± 0,15 48,52 ± 0,88
DQO 25,99 ± 1,02 97,59 ± 1,00
Nota: *adimensional

Loss et al. (2009) estudaram a milhocina proveniente da produção de farinha de

milho do tipo biju, obtendo resultados semelhantes para os parâmetros físico-químicos
avaliados no presente trabalho. Comumente os estudos científicos utilizam a milhocina
proveniente do processo de fabricação de amido de milho comercial, a qual apresenta
diferença na composição, visto que o teor de sólidos pode chegar a 50 % (MADDIPATI et al.
2011). Nesse processamento também ocorre adição de anidrido sulfuroso (SO2) com a
finalidade de auxiliar na liberação dos compostos solúveis do grão de milho; o SO2
adicionado reage com a água formando ácido sulfuroso que juntamente com os ácidos
orgânicos gerados por micro-organismos durante a maceração são responsáveis pelo baixo pH
do subproduto (CHOI et al. 2013).
Embora a milhocina utilizada neste estudo não tenha sofrido a adição de SO2, o pH
permanece baixo devido a formação dos mesmos ácidos orgânicos pelos micro-organismos,
fato comprovado pela grande quantidade de ácido lático produzido por espécies de
Lactobacillus durante a maceração do milho, mesmo em condições ácidas de pH (YANG et
al. 2013). Embora deficiente em carboidratos, a milhocina é uma substância complexa que
contém vários componentes nitrogenados, proteicos e não proteicos, sendo uma excelente
 34

fonte de nitrogênio orgânico e de minerais tais como sódio e potássio (FONTES et al., 2008;
GAO; YUAN, 2011; XI et al., 2013).
As características físico-químicas do soro de leite assim como a DQO estão de
acordo com os valores encontrados por diversos autores para soro de leite doce (ANTUNES
et al., 2003; SADDOUD et al., 2007; PRAZERES et al., 2012; YASMIN et al., 2013), sendo
que variações nas características do soro de leite podem ser atribuídas a composição o leite
e/ou diferentes técnicas de manipulação e processamento utilizadas pelas indústrias lácteas
(ALSAED et al., 2013). A lactose corresponde ao componente de maior fração presente no
soro de leite (considerando-se a fração sólida), e o teor de lipídios é relativamente baixo para
todos os tipos de soro (GLASS; HEDRICK, 1977). Os elevados teores de proteína e açúcares
são responsáveis pela alta carga poluente do soro de leite e também por dificultar o seu
tratamento (GUIMARÃES et al., 2010). Em relação ao teor de cinzas presente no soro, mais
de 50 % corresponde a NaCl e KCl (CHATZIPASCHALI; STAMATIS et al., 2012).
Devido ao alto teor de carboidratos, além das vitaminas, minerais e proteínas
presentes, diversos processos biotecnológicos estão sendo desenvolvidos para o uso do soro
de leite na obtenção de novos produtos. Além disso, as proteínas e peptídeos bioativos no soro
estão sendo utilizados em produtos alimentares e na indústria farmacêutica, como por
exemplo, na produção de enzimas como a protease (PANESAR et al., 2007a; GUIMARÃES
et al., 2010; LADEIRA et al., 2012).
O conteúdo de nitrogênio, proteína e aminoácidos dos subprodutos (Tabela 5) foi
analisado para avaliar o potencial dos mesmos como fonte de nitrogênio para a fermentação
alcoólica, visto que o nitrogênio é um dos compostos mais utilizados pela levedura, sendo
essencial para o seu crescimento.
Além dos componentes nitrogenados proteicos, ambos os subprodutos são ricos em
nitrogênio amoniacal, o qual também é consumido pela levedura S. cerevisiae. A presença da
amônia no meio pode também atrasar ou diminuir o consumo de vários aminoácidos,
resultando num aumento geral do consumo de nitrogênio durante a fermentação (JIRANEK et
al., 1995; VILANOVA et al., 2007; GAO; YUAN, 2011).
 35

Tabela 5: Compostos nitrogenados presentes na milhocina e soro de leite.

Compostos Resíduos Agroindustriais
nitrogenados
Milhocina Soro de Leite
mg L-1
Proteína* 11,40 ± 1,30 8,5 ± 0,80
Nitrogênio Total* 1,80 ± 0,20 1,36 ± 0,10
NH3(amônia) 26,55 ± 0,23 73,73 ± 0,60
Aminoácidos totais 711,21 ± 3,81 236,96 ± 1,72
Aspartato 13,93 ± 0,07 12,38 ± 0,06
Serina 46,25 ± 1,57 3,57 ± 0,03
Glutamato 43,13 ± 1,64 43,32 ± 0,34
Glicina 28,89 ± 0,77 14,66 ± 0,12
Histidina 11,33 ± 0,08 12,43 ± 0,08
Arginina 14,99 ± 0,60 17,18 ± 0,16
Treonina 18,02 ± 1,23 44,83 ± 0,33
Alanina 75,56 ± 0,22 8,03 ± 0,03
Prolina 321,53 ± 0,53 1,86 ± 0,15
Cisteína 18,47 ± 0,27 Nd
Valina 7,22 ± 0,05 4,41 ± 0,02
Metionina 43,55 ± 0,20 14,22 ± 0,11
Lisina 15,42 ± 0,30 6,60 ± 0,02
Isoleucina Nd 27,65 ± 0,26
Leucina 40,32 ± 0,22 12,78 ± 0,08
Fenilalanina 12,56 ± 0,45 Nd
Nota: *g L-1; nd: não detectado.

A milhocina apresenta como aminoácidos predominantes a prolina seguida da

alanina, baixas concentrações de valina e a ausência isoleucina (Figura 6). Os aminoácidos da
milhocina desempenham papel importante como componentes nutricionais do metabolismo
básico celular (GAO; YUAN, 2011; CHOI et al., 2013; XIAO et al. 2013).
O soro de leite apresentou elevados teores dos aminoácidos isoleucina, treonina e
glutamato e os aminoácidos cisteína e fenilalanina não foram detectados (Figura 6); outros
autores também analisaram o perfil de aminoácidos do soro doce e encontraram altos teores
para os mesmos aminoácidos, e uma baixa concentração de cisteína (GLASS; HEDRICK,
1977; YASMIN et al. 2013).
A alanina, presente na milhocina, e a isoleucina, presente no soro são os aminoácidos
mais utilizados para o crescimento celular em bioprocessos (GAO; YUAN, 2011), o que
 36

revela a potencialidade de se utilizar estes subprodutos como matérias-primas de baixo custo

para obtenção de novos produtos e uso em bioprocessos.
Concentração de aminoácidos(mg L )
350
-1

Milhocina
300 Soro

250

200

150

100

50

0
Asp Ser Glu Gli His Arg Thr Ala Pro Cis Val Met Lis Ile Leu Fen
Aminoácidos
Figura 6: Perfil de aminoácidos dos subprodutos agroindustriais milhocina e soro de leite utilizados neste estudo.

Diferenças na composição de aminoácidos tanto do soro quanto da milhocina são

resultantes dos diferentes métodos de processamento e da matéria-prima. O alto teor de
aminoácidos totais da milhocina reforça a viabilidade do uso desta como fonte de nitrogênio
para processos biológicos. O consumo de cada aminoácido e nitrogênio total pela levedura é
diferente para cada linhagem, sendo que um meio suplementado ou rico em uma mistura de
aminoácidos estimula o crescimento da levedura, resultando em uma fermentação mais rápida
(THOMAS; INGLEDEW, 1990; JIRANEK et al., 1995).

5.2. Hidrólise do Soro de Leite

O uso de S. cerevisiae para a fermentação de lactose tem atraído muita atenção,

sendo uma das estratégias para seu uso a obtenção de uma solução de lactose pré-hidrolisada,
isto é, misturas de glucose e galactose visto que os dois açúcares podem ser fermentados pela
S. cerevisiae em etanol. Em sua forma in natura a composição de açúcares do soro de leite é
de 48,52 g L-1 de lactose. Após a hidrólise neste trabalho, a composição de açúcares do soro
correspondeu a: 15,60 g L-1 de lactose, 19,40 g L-1 de glucose e 13,52 g L-1 de galactose, o
que corresponde a uma eficiência de hidrólise de 66 %. Embora glucose e galactose sejam
 37

consumidas pela levedura, o consumo de glucose é maior e mais rápido enquanto a galactose
só passa a ser utilizada quando a glucose atinge níveis críticos (MEHAIA; CHERYAN, 1990;
GUIMARÃES et al., 2010).

5.3. Delineamento Experimental

O delineamento experimental ou planejamento de misturas é uma ferramenta

matemática utilizada para prever a resposta de saída com relação aos parâmetros de entrada,
no caso os diferentes componentes da mistura, podendo ser utilizado para uma mistura de 2 a
30 componentes (RAJA et al., 2014). A resposta para uma mistura binária qualquer é uma
média ponderada das respostas dos componentes puros, tendo como pesos as proporções Xl e
X2 presentes na mistura. Sendo assim, para aumentar a precisão do modelo, foram realizadas
repetições dos ensaios com os componentes puros (BARROS et al., 2001), como está
mostrado na Tabela 6.

Tabela 6: Eficiência da fermentação das diferentes misturas de subprodutos indicadas pelo planejamento de
experimentos.
Fração dos Componentes Variável de Resposta
Mistura
Soro (X1) Milhocina (X2) Eficiência da Fermentação (%)
1 1,00 0,00 78,88
2 1,00 0,00 77,72
3 1,00 0,00 71,88
4 0,00 1,00 91,86
5 0,00 1,00 93,07
6 0,50 0,50 79,83
7 0,75 0,25 77,27
8 0,25 0,75 89,83

Aplicando-se o planejamento de misturas, na prática, obteve-se maior eficiência para

o experimento contendo apenas milhocina (ensaios 4 e 5). Mesmo em experimentos utilizando
micro-organismos modificados o uso de soro de leite sem suplementação de nutrientes resulta
em baixa produção de etanol e a adição de componentes nitrogenados ao meio pode aumentar
significativamente esta produção (LEITE et al., 2000). Previamente ao cálculo de eficiência
da fermentação houve a necessidade de avaliar alguns parâmetros no mosto antes e após a
fermentação, assim como avaliar e calcular os parâmetros resultantes da fermentação (Tabela
7).
 38

Tabela 7: Parâmetros resultantes da fermentação alcoólica das diferentes misturas de soro de milhocina
Fração dos Componentes Parâmetros Iniciais do mosto Parâmetros Finais do mosto Parâmetros resultantes da fermentação
Soro Milhocina Acidez AT AF Acidez AT AF Etanol Nb Np PR
-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
(X1) (X2) (g L ) (g L ) (g L ) (g L ) (g L ) (g L ) (g L ) (%) (%) (g L-1 h-1)
1,00 0,00 2,15 ± 0,05e 140,94 ± 2,97b 123,82 ± 2,56b 4,84 ± 0,11e 37,87 ± 0,12b 20,15 ± 0,07b 41,77 ± 0,15d 78,88 ± 1,91cd 66,03 ± 1,32d 1,55 ± 0,01d
1,00 0,00 2,15 ± 0,05e 146,19 ± 0,76a 128,51 ± 0,62a 5,12 ± 0,10f 39,73 ± 0,11a 20,32 ± 0,07a 42,97 ± 0,12c 77,72 ± 0,00cd 65,43 ± 0,25d 1,59 ± 0,00c
1,00 0,00 2,27 ± 0,06e 145,00 ± 2,03a 127,56 ± 1,77a 5,18 ± 0,10f 25,23 ± 0,10c 12,22 ± 0,05c 42,37 ± 0,47cd 71,88 ± 1,21e 65,00 ± 1,04d 1,57 ± 0,02cd
0,00 1,00 5,30 ± 0,25a 107,14 ± 1,50f 107,14 ± 1,50e 6,90 ± 0,09a 0,18 ± 0,00g 0,18 ± 0,00g 50,20 ± 0,79a 91,86 ± 1,74ab 91,72 ± 1,74a 1,86 ± 0,03a
0,00 1,00 5,16 ± 0,17a 107,21 ± 1,52f 107,21 ± 1,52e 6,91 ± 0,08a 0,24 ± 0,00g 0,24 ± 0,00g 50,83 ± 0,23a 93,07 ± 1,11a 92,88 ± 1,10a 1,88 ± 0,01a
0,50 0,50 3,66 ± 0,05c 126,70 ± 0,70d 119,45 ± 0,70c 5,89 ± 0,02c 12,30 ± 0,03d 6,18 ± 0,02d 46,20 ± 0,30b 79,83 ± 0,94c 75,69 ± 0,89c 1,71 ± 0,01b
0,75 0,25 3,34 ± 0,07d 135,24 ± 0,54c 123,39 ± 0,49b 5,53 ± 0,05d 11,72 ± 0,06e 5,96 ± 0,03f 46,37 ± 0,12b 77,27 ± 0,23d 73,54 ± 0,19c 1,72 ± 0,01b
0,25 0,75 4,21 ± 0,01b 122,12 ± 2,62e 116,00 ± 2,59d 6,19 ± 0,12b 10,49 ± 0,04f 6,09 ± 0,04e 50,43 ± 0,23a 89,83 ± 2,41b 85,11 ± 2,21b 1,87 ± 0,01a
p – Brown Forsythe* 0,50 0,68 0,70 0,90 0,45 0,44 0,63 0,66 0,71 0,63
p – ANOVA** <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
Nota: AT – açúcares totais (lactose + glucose + galactose); AF – açúcares fermentescíveis (glucose + galactose); Nb - Eficiência de fermentação (%); Np - Eficiência de processo (%);
PR – produtividade em etanol.
* Valores de probabilidade obtidos segundo o teste de Brown-Forsythe para homogeneidade de variâncias.
** Valores de probabilidade obtidos segundo ANOVA fator único.
*** Letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher LSD (p<0,05).
 39

O teor de açúcares fermentescíveis foi ajustado para o intervalo aproximado de 100 a

-1
120 g L a fim de evitar um impacto negativo da presença de alto teor de açúcares que pode
ser responsável por aumento da pressão osmótica do sistema prejudicando a levedura (SILVA
et al., 2010). O maior teor de açúcares fermentescíveis finais (Tabela 7) nos experimentos
contendo soro, se comparados ao contendo apenas milhocina, podem estar relacionados à
baixa velocidade de consumo da galactose pela S. cerevisiae; da mesma forma, os açúcares
totais destas misturas mostram que a lactose ainda presente no soro de leite (visto que este foi
parcialmente hidrolisado) permanece intacta.
Comparando-se os valores de acidez dos experimentos contendo apenas soro e
apenas milhocina (Tabela 7) com os valores de acidez encontrados na composição físico-
química dos subprodutos (Tabela 4) pode-se observar um aumento considerável dos mesmos
sugerindo que o processo lento de congelamento, assim como o descongelamento para uso na
fermentação e o processamento térmico podem ter sido responsáveis por este fato devido à
presença de bactérias lácticas nos mesmos.
A produção de ácido lático é diretamente proporcional à concentração de milhocina
(LIMA et al., 2009); uma vez que a presença de ácido lático na milhocina acontece desde o
processo de maceração e este ácido é um dos principais produtos conhecidos resultantes da
maceração (GAO; YUAN, 2011). Se comparada à acidez dos experimentos contendo os
componentes puros (Tabela 7), a milhocina possui uma acidez até 2,4 vezes maior que o soro
antes da fermentação, mas esta diferença se reduz pela metade ao final da fermentação. O pH
do mosto antes da fermentação varia de 4,08 para a amostra contendo apenas milhocina até
4,88 para a amostra contendo apenas soro, mas ao final da fermentação essa variação diminui
de 3,98 para 4,16, sendo que quanto maior a proporção de soro na mistura, maior o pH da
mesma. O pH encontra-se dentro da faixa esperada para fermentação alcoólica, devido a
tolerância da levedura, que corresponde a faixa de pH de 4,0 a 6,0. A redução do pH está em
concordância com o aumento da acidez no decorrer da fermentação, devido a formação de
ácidos orgânicos, produtos secundários do metabolismo da glucose pela S. cerevisiae. O pH
do meio pode baixar até 3,5, mas se o valor for inferior a 3,0 pode ocorrer inibição da
levedura indicando ineficiência do processo de controle de contaminantes (DOMBEK et al.,
1987; NARENDRANATH et al., 2001).
O teor de etanol (Tabela 7) foi significativamente maior para os experimentos
contendo 100 % de milhocina e 25 % de soro com 75 % de milhocina, consequentemente
estes obtiveram maiores valores de eficiência de fermentação, 93,07 % e 89,83 %, e maior
produtividade, 1,88 g L-1 h-1 e 1,87 g L-1 h-1, respectivamente. Estes parâmetros foram
 40

inversamente proporcionais à fração de soro na mistura, visto que quanto maior a proporção
de soro na mistura maior a disponibilidade de galactose a qual é lentamente consumida pela S.
cerevisiae. Desta forma, o experimento contendo apenas soro de leite apresentou os fatores
produção de etanol, eficiência da fermentação e de processo e produtividade,
significativamente menores dos que os demais experimentos. A alta concentração de levedura
apresenta efeito positivo para um alto índice de etanol produzido, visto que quando estão
presentes em baixas concentrações pode haver o desgaste das mesmas, requerendo
regeneração, antes mesmo de consumir todo o substrato disponível para produção de etanol
(OSUNKOYA; OKWUDINKA, 2011).
Silva et al. (2010) realizaram um experimento semelhante, utilizando uma cepa de
Saccharomyces cerevisiae modificada que consome a lactose como fonte de carbono, e soro
de leite concentrado como substrato contendo 150 e 200 g L-1 de lactose. Os resultados
revelaram índices de produtividade de 0,74 e 0,63 g L-1 h-1 e suplementando os mesmos
substratos com 10 g L-1 de milhocina a produtividade foi para 1,22 e 0,57 g L-1 h-1,
respectivamente, indicando que a presença dos nutrientes provenientes da milhocina aumenta
a velocidade da fermentação assim como a maior concentração de açúcares apresenta efeito
negativo para a levedura.
Florêncio et al. (2013) estudaram diferentes concentrações de levedura e de sacarose
a serem adicionadas para produção de etanol a partir de soro de leite não hidrolisado
inoculado com S. cerevisiae de panificação atingindo nível máximo de eficiência da
fermentação de 76,14 % quando foram adicionados 100 g L-1 de sacarose ao soro de leite e
6,0 g L-1 de levedura.
Analisando os índices de produtividade e eficiência da fermentação, obtidos no
presente estudo, utilizando-se S. cerevisiae de panificação, os resultados foram considerados
satisfatórios, além de demonstrar que a milhocina é uma boa fonte de nutrientes, como
nitrogênio e vitaminas melhorando o desempenho da levedura.
Os dados do planejamento foram tratados estatisticamente, através de análise de
variância (ANOVA), e os resultados obtidos estão na Tabela 8.
 41

Tabela 8: Análise de variância (ANOVA) para Eficiência da Fermentação* em proporções dadas pelo
planejamento de mistura.
SQ GL QM F P
Modelo Linear 381,32 1 381,32 41,64 <0,01
Falta de ajuste 26,06 3 8,69 0,90 0,53
Erro Puro 28,88 3 9,63
R² 0,87
R²adj 0,85
Nota: *etanol produzido em 27 horas de fermentação;
SQ = soma dos quadrados; GL = graus de liberdade; QM = média dos quadrados residuais; F = distribuição de
Fisher; p= probabilidade de significância.

Existem diferentes formas de se avaliar a capacidade preditiva do modelo sendo elas:

a comparação entre os valores de QM e F, onde o valor de QM deve ser maior que o de F, a
falta de ajuste não deve ser significativa (p > 0,05), e também o valor dos coeficientes de
determinação (R²), sendo que para processos biológicos considera-se aceitável R² ≥ 0,70. Os
valores dos coeficientes de determinação (R²) podem explicar de 81 a 99 % a variância total
das respostas confirmando a adequabilidade dos modelos, porém é necessária a avaliação de
todos os parâmetros para indicar essa adequabilidade e não apenas o R², como muitos autores
consideram (LUNDSTEDT et al., 1998; BEZERRA et al., 2008; GRANATO et al., 2014).
Desta forma, e avaliando-se a Tabela 8, o modelo apresentou ajuste satisfatório
considerando todos os fatores avaliados, além de valores de R² e de R²adj superiores a 0,85,
sendo considerado preditivo e podendo ser utilizado para otimização do processo fermentativo
a fim de maximizar a eficiência da fermentação.
Os coeficientes do modelo linear estão listados na Tabela 9, na qual Y é a resposta
previsível, no caso a eficiência da fermentação (Nb), α 1 e α 2, são os coeficientes de regressão
linear e X1 (fração de soro na mistura) e X2 (fração de milhocina na mistura), são as variáveis
independentes (BRUNS et al., 2006).

Tabela 9: Coeficientes e respectivos erros padrão do modelo linear.

Coeficiente Valor Erro Padrão
α1 75,17 1,56
α2 92,02 1,82
Y = α1.X1 + α2.X2

Aplicando o método de otimização simultânea (DERRINGER; SUICH, 1980)

para máxima eficiência da fermentação obteve-se como ponto ótimo da produção de etanol
 42

utilizando subprodutos agroindustriais o experimento contendo apenas milhocina. Para fins de

validação do modelo, a condição otimizada foi aplicada para o desenvolvimento da cinética
fermentativa, utilizando os mesmos procedimentos feitos anteriormente, comparando os dados
previstos teóricos e os dados experimentais. Porém, devido à falta de diferença estatística
entre os pontos contendo 100 % de milhocina e 25 % de soro com 75 % de milhocina, como
pode ser observado na Tabela 7, para eficiência da fermentação e produtividade optou-se pela
repetição e desenvolvimento da cinética fermentativa de ambos os pontos. A partir deste
ponto serão denominados: experimento 1 (100 % de milhocina) e experimento 2 (25 % de
soro com 75 % de milhocina).

5.4. Cinética Fermentativa

A fermentação foi acompanhada por pesagens indicando a massa de dióxido de

carbono (CO2) liberada no decorrer do processo conforme a Figura 7.

Experimento 1
Experimento 2
Curva de liberação de CO2 (g L )
-1

40

20

0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

Figura 7: Curva de liberação de CO2 durante o processo fermentativo de diferentes mostos para a determinação
do tempo de fermentação.
Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75
% de milhocina.

Na curva de liberação de CO2 podem-se observar as três fases existentes no processo

fermentativo (Figura 7): fase preliminar ou fase lag (entre 0 e 4,5 h); fase tumultuosa ou fase
log (entre 4,5 e 18 h) e fase estacionária (a partir de 18 h). Na fase tumultuosa ocorre o maior
 43

desprendimento de CO2 e a glucose é rapidamente consumida pela levedura e

consequentemente há maior produção de etanol (MEHAIA et al., 1990; SCHMIDELL et al.,
2001). Todas estas fases podem ser facilmente observadas na Figura 7 e nos resultados da
Tabela 10.

Tabela 10: Parâmetros do mosto durante a fermentação para os diferentes experimentos.

Ácido lático Nitrogênio Etanol Densidade PR
Tempo (h) AF (g L-1)
(g L-1) (g L-1) (g L-1) (g cm-³) (g L-1 h-1)
Experimento 1
d a
0 5,38±0,27 1,06 ±0,33 106,82±3,20a 0,00±0,00g 0,99822±0,00a 0,00±0,00g
4,5 5,93±0,18c 0,87±0,14ab 91,98±4,08b 4,83±0,15f 0,99748±0,00b 1,07±0,03f
9 6,41±0,09ab 0,72±0,00bc 83,65±0,67c 10,87±0,06e 0,99657±0,00c 1,21±0,01e
13,5 6,43±0,11a 0,53±0,11cd 26,77±0,80d 27,63±0,06d 0,99419±0,00d 2,05±0,00c
18 6,08±0,07bc 0,43±0,00d 5,72±0,01e 42,30±0,17c 0,99211±0,00e 2,35±0,01a
22,5 6,24±0,29abc 0,41±0,15d 0,14±0,01f 47,93±0,06b 0,99137±0,00f 2,13±0,00b
27 6,51±0,21a 0,39±0,04d 0,13±0,33f 50,77±0,55a 0,99101±0,00g 1,88±0,02d
p – Brown
0,70 0,64 0,43 0,51 0,58 0,31
Forsythe*
p–
<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
ANOVA**
Experimento 2
b a
0 4,78±0,15 0,85±0,04 117,85±1,02a 0,00±0,00g 0,99825±0,00a 0,00±0,00g
4,5 5,84±1,04a 0,77±0,04a 97,50±0,90b 4,77±0,81f 0,99751±0,00b 1,06±0,18f
9 6,53±0,01a 0,68±0,08b 80,04±0,16c 13,07±0,06e 0,99624±0,00c 1,45±0,01e
13,5 6,22±0,03a 0,46±0,04c 15,69±0,28d 40,87±0,06d 0,99230±0,00d 3,03±0,00a
18 6,22±0,11a 0,39±0,04cd 4,78±0,03e 42,80±0,17c 0,99204±0,00e 2,38±0,01b
22,5 6,38±0,19a 0,34±0,04d 4,77±0,04e 45,33±0,29b 0,99168±0,00f 2,01±0,01c
27 6,31±0,14a 0,36±0,00d 4,68±0,28e 49,83±0,15a 0,99109±0,00g 1,85±0,01d
p – Brown
0,55 0,95 0,68 0,67 0,61 0,51
Forsythe*
p–
<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
ANOVA**
Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75
% de milhocina; AF - açúcares fermentescíveis (glucose + galactose); PR – produtividade em etanol.
* Valores de probabilidade obtidos segundo o teste de Brown-Forsythe para homogeneidade de variâncias;**
Valores de probabilidade obtidos segundo ANOVA fator único; *** Letras diferentes na mesma coluna
representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher LSD (p<0,05).

A curva representando o mosto contendo 25 % de soro de leite (Experimento 2) atingiu a fase

estacionária em menor tempo e teve perda de massa final menor que o mosto contendo 100 %
 44

de milhocina (Experimento 1), o que pode estar relacionado à presença da galactose nesse
meio, que embora seja utilizada pela S. cerevisiae, o seu consumo acontece em níveis
inferiores ao da glucose, mesmo após exaustão da mesma (MEHAIA et al., 1990; PARK et
al., 2014). Este fato pode ser confirmado com os dados da Tabela 10, na qual se observa que o
mosto contendo 100 % de milhocina (Experimento 1) apresenta açúcar fermentescível
residual de 0,13 g L-1 enquanto para o meio contendo 25 % de soro de leite (Experimento 2)
este foi de 4,68 g L-1, correspondendo à galactose.
Para ambos os experimentos a produção de ácido lático aconteceu nas primeiras
horas de fermentação, ou seja, na fase lag, na qual a levedura ainda está se adaptando ao meio
para produzir etanol e, então, após o início da produção máxima de etanol (fase log), a
concentração de ácido lático se torna constante. A duração da fase lag aumenta
proporcionalmente a concentração de ácido lático inicial do mosto e a concentração produzida
(ABBOTT e INGLEDEW, 2004).
Para avaliar a cinética da fermentação utilizam-se as seguintes variáveis: quantidade
de substrato transformado ou utilizado pela levedura, variação da concentração celular e a
quantidade de produto formado, que, se colocadas em gráficos em função do tempo da
fermentação representam a cinética do processo fermentativo (REGULY, 2000), como
exposto nas Figuras 8 e 9.
O consumo de nitrogênio durante a fermentação está diretamente associado com a
fase de crescimento e com a população máxima da levedura (ALBERTI et al., 2011). No
presente estudo observou-se esse fenômeno, e a partir de 18 horas de fermentação quando
termina a fase exponencial de crescimento e o consumo de nitrogênio é quase nulo (Figuras
8b e 9b). O mesmo pode ser observado para o consumo de açúcares e produção de etanol,
sendo que na fase exponencial estes são máximos, permanecendo praticamente estáveis a
partir de 18 horas de fermentação (Figuras 8a e 9a).
 45

120 60
AFT (a)
110
Etanol
100 50
90
80 40
AFT (g . L )

70

Etanol (g . L )
-1

60 30
50
40 20

-1
30
20 10
10
0 0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

12 1,2
Biomassa (b)
11 1,1
10 Nitrogênio 1,0
9 0,9

Nitrogênio (g . L )
8 0,8
Biomassa (g . L )
-1

7 0,7
6 0,6
5 0,5
4 0,4
3 0,3
-1

2 0,2
1 0,1
0 0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

Figura 8: Cinética Fermentativa para experimento 1: (a) consumo de açúcares fermentescíveis totais (AFT) e
produção de etanol; (b) Consumo de nitrogênio e produção de biomassa.
Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina.
 46

120 60
110 AFT (a)
100
Etanol 50
90
80 40
AFT (g . L )

Etanol (g . L )
70
-1

60 30
50
40 20

-1
30
20 10
10
0 0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

12 1,2
11
Biomassa (b) 1,1
Nitrogênio
10 1,0
9 0,9
8 0,8

Nitrogênio (g . L )
Biomassa (g . L )
-1

7 0,7
6 0,6
5 0,5
4 0,4
3 0,3
-1

2 0,2
1 0,1
0 0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

Figura 9: Cinética Fermentativa para experimento 2: (a) consumo de açúcares fermentescíveis totais (AFT) e
produção de etanol; (b) Consumo de nitrogênio e produção de biomassa.
Nota: Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75 % de milhocina.

Comparando-se a eficiência dos experimentos, para todos os parâmetros da

fermentação (Tabela 11) o experimento contendo 100 % de milhocina apresentou melhores
resultados, maior eficiência de fermentação e de processo como consequência do maior fator
de conversão de substrato em etanol, porém o experimento contendo 25 % de soro também
apresentou bons resultados. Todos os experimentos realizados obtiveram altos índices de
produtividade, visto que industrialmente considera-se satisfatória uma produtividade superior
 47

a 1,00 g L-1 h-1. Outros trabalhos também sugerem melhor produtividade em mostos
alternativos suplementados com milhocina (DIEN et al., 2003).

Tabela 11: Parâmetros resultantes da Fermentação dos experimentos avaliados em 27 h de processo.

Parâmetros Experimento 1 Experimento 2 p – Brown Forsythe* p – ANOVA**

PR (g L-1 h-1) 1,88±0,02a 1,85±0,01b 0,47 0,05

0,48±0,01a 0,44±0,00b 0,36 <0,001

Nb (%) 93,32±2,04a 86,33±0,32b 0,36 <0,001

a b
Np (%) 93,05±2,02 82,75±0,47 0,41 <0,001

0,06±0,00a 0,05±0,00b 0,21 <0,001

Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75
% de milhocina; PR - produtividade em etanol; - Fator de conversão de substrato em etanol (g g-1); Nb -
Eficiência de fermentação (%); Np - Eficiência de processo (%); - Fator de conversão de substrato em
biomassa.
* Valores de probabilidade obtidos segundo o teste de Brown-Forsythe para homogeneidade de variâncias.
** Valores de probabilidade obtidos segundo ANOVA fator único.
*** Letras diferentes na mesma linha representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher LSD
(p<0,05).

Na Tabela 12 são apresentados os valores de eficiência calculados pelo modelo, os

valores práticos obtidos com a repetição dos experimentos e o erro absoluto do planejamento.

Tabela 12: Comparação dos valores preditos através do modelo linear e dos valores encontrados
experimentalmente para eficiência da fermentação em 27 h de processo.
Fração dos Componentes
Valor Teórico (%) Valor Prático (%) Erro Absoluto (%)
Soro Milhocina
0,00 1,00 92,02 93,32 1,41
0,25 0,75 87,81 86,33 1,69

Comparando-se o valor teórico com o prático, o erro absoluto para ambos os

experimentos foi menor que 10 %, limite para se considerar um modelo válido. O baixo valor
do erro absoluto corresponde à boa reprodutibilidade dos experimentos.
A determinação de µ máx. foi obtida por regressão linear, considerando-se o intervalo
entre 9 e 18 horas de fermentação, correspondente a fase exponencial de crescimento,
conforme exposto na Figura 10, onde a velocidade máxima específica de crescimento da
levedura (µ máx.) foi de 0,07 h-1 para o experimento 1 e de 0,05 h-1para o experimento 2.
 48

1,2 y = 0,0701x - 0,2392 (a)

R² = 0,9593

0,9
ln X/X0

0,6

0,3

0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)
.

y = 0,0499x - 0,1126 (b)

0,8
R² = 0,8995

0,6
ln X/X0

0,4

0,2

0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

Figura 10: Gráfico para determinação de µ máx pelo coeficiente angular da reta ajustada aos dados experimentais
na fase exponencial de crescimento para os ensaios: (a) Experimento 1 e (b) Experimento 2.
Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75
% de milhocina.

Andrietta et al. (1999) estudaram 12 diferentes grupos de leveduras utilizados em

processos industriais de fermentação alcoólica e as classificaram levando em consideração
suas características cinéticas de rendimento e produtividade. Para µ máx. os níveis foram: menor
que 0,45 (baixo); entre 0,45 e 0,55 (médio) e maior que 0,55 h-1(alto). Para YX/S os níveis
foram: menor que 0,041 (baixo); entre 0,041 e 0,044 (médio) e maior que 0,044 g g-1 (alto).
Desta forma, a levedura utilizada neste estudo pode ser considerada de baixo nível de
velocidade específica máxima de crescimento e alto nível de conversão de produto em
biomassa. Um alto fator de conversão de substrato em biomassa é uma característica desejável
 49

na etapa de propagação do fermento, pois corresponde a um rápido crescimento da levedura

(OLIVEIRA et al., 2004; STROPPA et al., 2009).
Estudos em quimiostatos indicam que em estado estacionário a velocidade específica
máxima de crescimento habitualmente, se encontra na faixa entre 0,03 h-1 e 0,40 h-1. Alguns
estudos mostram que uma alta densidade de células assim como a reciclagem de células e uma
alta concentração de etanol podem contribuir para a redução do crescimento de leveduras e
que um baixo valor de crescimento da levedura (menor que 0,1 h-1) resulta em rendimentos
elevados de etanol (90 % da conversão teórica de açúcar em etanol), assim como uma
velocidade específica de crescimento inferior a 0,025 h-1 pode aumentar o índice de etanol em
até 3 % (BASSO et al., 2008; BASSO et al., 2011; BOENDER et al., 2009). Em ambos os
experimentos a velocidade específica máxima de crescimento da levedura foi inferior a 0,1 h-
1
, assim como ambos obtiverem eficiência de fermentação (rendimento) em torno de 90 %.

5.4.1. Efeito da adição de diferentes fontes de açúcares ao mosto

Foram realizadas fermentações utilizando diferentes fontes de carbono, como o

açúcar mascavo e o melaço da cana, aproximando-se da produção industrial de etanol.
Também se repetiu os ensaios com água mostrando a viabilidade do uso dos resíduos como
fonte de nutrientes para a fermentação.
A fermentação foi acompanhada por pesagens indicando a massa de dióxido de
carbono (CO2) liberado durante a fermentação conforme a Figura 11.
Na Tabela 13 podem-se observar os diferentes parâmetros dos mostos com diferentes fontes
de carbono.
 50

50
GLU (a)
MAS
MEL

Curva de liberação de CO2 (g L )

-1
40

30

20

10

0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

50
(b)
GLU
MAS
Curva de liberação de CO2 (g L )

MEL
-1

40

30

20

10

0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

50
GLU (c)
MAS
Curva de liberação de CO2 (g L )
-1

40 MEL

30

20

10

0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

Figura 11: Curva de liberação de CO2 durante o processo fermentativo dos diferentes meios fermentativos
utilizando diferentes fontes de açúcares.
Nota: (a) Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; (b) Experimento 2 - mosto contendo 25 % de
soro e 75 % de milhocina; (c) Experimento 3 - substituição dos subprodutos 99oooooooooooopor água;
GLU - mosto suplementado com glucose; MAS - mosto suplementado com açúcar mascavo; MEL - mosto
suplementado com melaço de cana.
 51

Tabela 13: Parâmetros avaliados do mosto antes e após a fermentação alcoólica utilizando diferentes mostos e diferentes fontes de açúcares.
Parâmetros Iniciais Parâmetros Finais Parâmetros resultantes da fermentação
Ácido Ácido
Experimentos AF Nitrogênio AF Nitrogênio Etanol PR
lático -1 -1
lático -1 -1 -1
Nb (%) Np (%)
-1
(g L ) (g L ) -1
(g L ) (g L ) (g L ) (g L-1 h-1)
(g L ) (g L )
c cd a
1 + GLU 5,38±0,27 106,82±3,20 1,06±0,33 6,51±0,21b 0,31±0,00e 0,39±0,04bc 50,77±0,55bc 0,48±0,01b 93,32±1,04b 93,05±1,02b 1,88±0,02bc
2 + GLU 4,78±0,15d 117,85±1,02a 0,85±0,04a 6,31±0,14bc 4,88±0,28d 0,36±0,00bc 49,83±0,15c 0,44±0,00c 86,33±0,32c 82,75±0,47c 1,85±0,01c
3 + GLU 0,00±0,00f 118,99±2,26a 0,09±0,02d 0,00±0,00f 73,13±4,40a 0,07±0,04d 13,67±0,45h 0,30±0,02f 58,56±0,29f 22,49±1,12f 0,51±0,02h
1 + MAS 3,62±0,14e 104,73±0,56d 1,00±0,08a 5,36±0,02d 2,17±0,09de 0,52±0,02ab 51,20±0,26b 0,50±0,00a 97,70±0,43a 95,67±0,37a 1,90±0,01b
2 + MAS 3,59±0,14e 113,34±3,92b 0,92±0,97a 3,88±0,03e 9,05±3,78c 0,63±0,08a 34,43±0,06e 0,33±0,02e 64,79±0,41e 59,50±0,50d 1,28±0,00e
3 + MAS 0,00±0,00f 114,36±0,29b 0,24±0,11cd 0,00±0,00f 24,46±0,05b 0,21±0,04cd 28,00±0,10g 0,31±0,00ef 60,95±0,42ef 47,92±0,28e 1,04±0,00g
1 + MEL 6,75±0,33a 109,93±0,75c 0,94±0,10a 8,08±0,21ca 2,00±0,00de 0,35±0,31bc 52,53±1,72a 0,49±0,01ab 95,25±0,79ab 93,51±0,74ab 1,95±0,06a
2 + MEL 5,88±0,07b 108,39±0,26c 0,54±0,01b 6,15±0,25c 9,10±2,63c 0,53±0,02ab 46,90±0,61d 0,47±0,02b 92,49±0,39b 84,68±1,15c 1,74±0,02d
3 + MEL 0,00±0,00f 107,11±1,23cd 0,37±0,02bc 0,00±0,00f 26,67±0,02b 0,30±0,10c 32,73±0,21f 0,41±0,00d 79,64±0,75d 59,81±0,32d 1,21±0,01f
p – Brown
0,31 0,64 0,71 0,59 0,63 0,40 0,19 0,40 0,39 0,62 0,19
Forsythe*
p–
<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
ANOVA**
Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75 % de milhocina; Experimento 3 - substituição dos
subprodutos como mosto por água; GLU - mosto suplementado com glucose; MAS - mosto suplementado com açúcar mascavo; MEL - mosto suplementado com melaço de
cana; AF - açúcares fermentescíveis; - Fator de conversão de substrato em etanol. Nb - Eficiência de fermentação; Np - Eficiência de processo; PR - produtividade em
etanol.
* Valores de probabilidade obtidos segundo o teste de Brown-Forsythe para homogeneidade de variâncias; ** Valores de probabilidade obtidos segundo ANOVA fator único;
*** Letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher LSD (p<0,05).
 52

O reflexo da ausência de nutrientes do mosto pode ser observado na Figura 11 e

Tabela 13 onde as curvas dos experimentos contendo água não apresentam as três fases
características de liberação de CO2 proveniente da fermentação e crescimento celular; sendo
que para o experimento com água e glucose os índices de produtividade e eficiência foram
ainda menores que os experimentos utilizando açúcar mascavo e melaço de cana, pois estes
devido ao seu processamento ainda possuem alguns nutrientes além dos açúcares que podem
de alguma maneira favorecer a levedura. Estes resultados indicam que a ausência dos
nutrientes encontrados nos subprodutos: como nitrogênio, aminoácidos, minerais e vitaminas
refletiram diretamente no crescimento da levedura resultando em alto teor de açúcar residual e
baixa produtividade.
O melaço utilizado neste estudo apresentou 22 % de umidade, e sua composição em
açúcares em base seca era de aproximadamente 53 % de frutose, 42 % de glucose e 5% de
sacarose. Osunkoya e Okwudinka (2011) obtiverem composição semelhante para total de
açúcares em melaço de cana e verificaram a existência de minerais no mesmo.
O açúcar mascavo utilizado contém 49 % de frutose, 40 % de glucose e 12 % de
sacarose, todos fermentescíveis pela S. cerevisiae. A semelhança na composição de açúcares
entre o melaço e o açúcar mascavo, se dá pelo fato do açúcar mascavo corresponder a uma
combinação de açúcar branco com melaço da cana (YANG et al., 2007).
A diferença da produção de etanol através destas fontes de carbono (melaço de cana
e açúcar mascavo), uma vez que a composição em glucose, frutose e sacarose de ambas são
semelhantes, acontece pela acidez inicial do mosto e a produzida durante a fermentação. Os
experimentos com melaço obtiveram acidez significativamente maiores que os experimentos
com açúcar mascavo, e segundo Beckner et al. (2011), o ácido lático possui efeito inibitório
sobre a produção de etanol pela S. cerevisiae. Observou-se também a ausência de ácido lático
nos experimentos onde se utilizou água comprovando a presença bactérias láticas
contaminantes nos subprodutos.
Em todos os experimentos em que melaço de cana foi utilizado houve maior perda
final pela liberação de dióxido de carbono se comparado com os demais.
Os experimentos que apresentaram maior eficiência de fermentação e processo foram
aqueles que utilizaram como mosto apenas milhocina e como fonte de carbono o açúcar
mascavo ou o melaço. Estes mostos se assemelham aos utilizados para produção de bioetanol
em escala industrial.
Com o uso de glucose a liberação de dióxido de carbono (CO2) foi similar para os
experimentos 1 (100% de milhocina) e 2 (25 % de soro e 75 % de milhocina). Com uso de
 53

açúcar mascavo, o experimento contendo soro teve uma maior velocidade de perda de massa
no início, porém atingiu a fase estacionária em menor tempo resultando em menor produção
final de etanol. Enquanto que, para o uso de melaço, o meio contendo apenas milhocina
apresentou maior liberação CO2 e a segunda maior produção de etanol em relação a todos os
experimentos sendo superado apenas pelo meio de fermentação contendo milhocina e açúcar
mascavo.
Basso et al. (2008) também realizaram ensaios fermentativos utilizando melaço e
caldo de cana em uma concentração de 100 g L-1 de açúcares utilizando leveduras de
panificação e obtiveram uma eficiência de fermentação de 88,1%. No presente trabalho
maiores eficiências foram obtidas para diluição de melaço e açúcar mascavo em milhocina
(Tabela 13).
O uso do melaço em sua forma pura apresenta efeito negativo para a fermentação
alcoólica devido à alta pressão osmótica do mesmo, além disso, o melaço apresenta ausência
de nutrientes para o crescimento da levedura sendo necessária a suplementação (SÁNCHEZ
et al., 2007).
A combinação de milhocina como fonte de nutrientes, principalmente de nitrogênio,
e o melaço, como fonte de carbono, apresenta vantagens tanto em relação aos índices de
etanol produzido e produtividade quanto ao fato de ambos serem subprodutos agroindustriais
produzidos em larga escala no Brasil, de baixo custo, e que podem ser utilizados como fonte
de novos produtos de maior valor agregado e de ampla utilização. O resultado do uso de soro
nestes experimentos poderia suprir uma parte da necessidade regional, de encontrar
alternativas para destino e/ou valorização do mesmo.
O uso de melaço para a produção de etanol combustível é bastante viável devido sua
alta disponibilidade principalmente em países tropicais com baixo custo e elevadas produções
de etanol reduzindo os impactos do uso de culturas alimentares como milho, beterraba e cana
para obtenção de bioetanol (SOCCOL et al., 2005; BEHERA et al., 2012).

5.4.2. Uso de antibióticos para controle da contaminação microbiana

A presença de ácido lático é de especial interesse aos produtores de etanol visto que
este é um potencial inibidor do crescimento das leveduras. Concentrações relativamente
baixas de ácido lático (2 a 6 g L-1) afetam diretamente as leveduras diminuindo suas taxas de
consumo de glucose e produção de etanol, enquanto concentrações maiores (8 a 10 g L-1)
reduzem fortemente o crescimento da levedura (NARENDRANATH et al., 2001). Tendo em
 54

vista essa necessidade de controle da contaminação bacteriana, diferentes antibióticos são

fornecidos para favorecer a fermentação alcoólica na produção de etanol combustível
(PHIBRO, 2014). Os antibióticos utilizados foram enumerados de 1 a 5 para uso nos testes.
A acidez inicial do mosto assim como acidez produzida durante as 27 horas de
fermentação utilizando os diferentes antibióticos em comparação com o mosto pasteurizado
podem ser observadas na Figura 12.

8 a a (a)

7 b b
b b
6
Ácido Lático (g . L )

c
-1

0
Inicial Pasteurizado 1 2 3 4 5

a (b)
b ab ab b
6 c

5
Ácido Lático (g . L )
-1

4
d

0
Inicial Pasteurizado 1 2 3 4 5

Figura 12: Comparação da produção de ácido lático durante a fermentação pelo uso de diferentes meios de
controle das bactérias láticas.
Nota: (a) Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; (b) Experimento 2 - mosto contendo 25 % de
soro e 75 % de milhocina; Colunas de 1 a 5: acidez final dos experimentos utilizando diferentes antibióticos em
comparação com a acidez inicial e final dos experimentos utilizando pasteurização. Letras diferentes
representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher LSD- p<0,05.

Os parâmetros resultantes da fermentação, utilizando diferentes antibióticos,

podem ser observados na tabela 14.
 55

Tabela 14: Parâmetros resultantes da fermentação alcoólica para os substratos das melhores misturas utilizando
antibióticos.
Etanol
Nb (%) Np (%)
Tratamentos (g L-1)
Experimento 1
a
Pasteurizado 50,77±0,55 0,48±0,01ab 93,32±2,04ab 93,05±2,02bc
1 45,17±0,42d 0,46±0,01b 89,95±1,07b 89,79±1,06c
2 45,73±0,50d 0,47±0,01b 91,14±2,49b 90,93±2,48c
3 47,93±0,15c 0,49±0,01a 95,36±1,86a 95,30±1,86ab
4 47,87±0,15c 0,49±0,01a 95,24±2,10a 95,17±2,09ab
5 48,57±0,38b 0,49±0,01a 96,76±1,90a 96,55±1,89a
p – Brown Forsythe* 0,86 0,99 0,99 0,99
p – ANOVA** <0,01 <0,01 <0,01 <0,01
Experimento 2
a
Pasteurizado 49,83±0,15 0,44±0,00a 86,33±0,32a 82,75±0,47a
1 45,17±0,42b 0,44±0,00a 86,75±0,42a 82,63±0,42a
2 44,13±0,12d 0,43±0,00ab 84,82±0,16c 80,74±0,13c
3 44,67±0,06c 0,44±0,00a 85,26±0,43bc 81,71±0,39b
4 45,13±0,12b 0,44±0,00a 86,00±0,79ab 82,57±0,46a
5 42,63±0,15e 0,42±0,00b 82,83±0,39d 77,99±0,35d
p – Brown Forsythe* 0,53 0,68 0,68 0,96
p – ANOVA** <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
Nota: * Valores de probabilidade obtidos segundo o teste de Brown-Forsythe para homogeneidade de variâncias.
** Valores de probabilidade obtidos segundo ANOVA fator único.
*** Letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher LSD
(p<0,05).
Nota: (a) Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; (b) Experimento 2 - mosto contendo 25 % de
soro e 75 % de milhocina; - Fator de conversão de substrato em etanol; Nb - Eficiência de fermentação; Np -
Eficiência de processo; Colunas de 1 a 5: experimentos utilizando diferentes antibióticos.

Entre os antibióticos utilizados, aquele com 100 % de virginiamicina é um

antibiótico composto que consiste em dois fatores (M e S) que interagem sinergicamente com
os ribossomos inibindo a síntese proteica das bactérias gram positivas sendo efetivo contra a
maioria das bactérias ácido-lácticas (HAMDY et al., 1996; HYNES et al., 1997;
ANDREOTTI; NICODEMO, 2004). Enquanto que os antibióticos ionóforos e inertes,
incluindo a monensina sódica, têm sua forma de ação inibitória desses antibióticos através da
catálise das trocas de sódio e prótons ou prótons e potássio na membrana da bactéria
(PRESSMAN, 1976).
Além dos antibióticos mostrados na Tabela 14 foi realizado teste com o antibiótico
formado por compostos naturais (Extrato cítrico 90 %, Ácido Ascórbico 2 %, Ácido Lático 2
 56

%, Ácido Cítrico 1 %) e este não apresentou efeito contra as bactérias do mosto impedindo a
produção de etanol (dados não mostrados).
Devido a diversidade de produtos fornecidos optou-se por selecionar aquele que
melhor se aplica aos meios de fermentação deste estudo utilizando-se como controle de
contaminação a produção de ácido lático e realizar a cinética fermentativa deste.
Um nível de ácido lático de 6 g L-1 deve ser considerado uma concentração industrial
relevante, devido a ação das bactérias lácticas contaminantes da fermentação causando
redução da eficiência da produção (NARENDRANATH et al., 2001). Relacionando-se esta
informação com os parâmetros resultantes da fermentação (Tabela 14), o antibiótico que
apresentou melhores resultados, menor acidez produzida e maior eficiência da fermentação,
para ambos os experimentos (100 % milhocina e 25 % de soro com 75 % de milhocina) foi o
de número 4, composto por 100% de monensina sódica cristalina.
A monensina sódica cristalina é um antibiótico poliéter e ionóforo, aplicado
principalmente na área de saúde animal, mas também como controle de contaminantes em
processos fermentativos e sua atividade antimicrobiana se dá por alterações de pH, que
seletivamente forma complexos e transporta cátions de sódio através das membranas lipídicas
dos micro-organismos levando a perturbações em processos celulares e culminando em morte
celular (PAREKH et al., 2000; STROPPA et al., 2000; LOWICKI; HUCZYNSKI, 2013).
A comparação da curva de liberação de dióxido de carbono dos diferentes controles
de contaminantes para os diferentes experimentos está na Figura 13.
 57

50 (a)
Ant.
Curva de liberação de CO2 (g L )
-1 Past.
40
ST

30

20

10

0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

50 (b)
Ant.
Curva de liberação de CO2 (g L )
-1

40 Past.
ST

30

20

10

0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

Figura 13: Curva de liberação de CO2 durante o processo fermentativo de diferentes meios fermentativos
utilizando como antibiótico a monensina sódica cristalina em comparação com a pasteurização e ausência de
controle de contaminantes.
Nota: (a) Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; (b) Experimento 2 - mosto contendo 25 % de
soro e 75 % de milhocina; Ant.: tratamento com antibiótico; Past.: tratamento térmico (pasteurização); ST: sem
tratamento.

Segundo Stroppa et al. (2000) o antibiótico monensina reduz a carga de bactérias

lácticas presentes na produção de etanol durante aproximadamente as seis primeiras horas de
fermentação. Este fato pode explicar a maior duração da fase preliminar de liberação de CO2
 58

(Figura 13) se comparada ao mesmo experimento que passou pela pasteurização, visto que no
mosto pasteurizado a redução da carga microbiana acontece previamente ao inóculo, enquanto
com o uso de antibiótico isso acontece no próprio fermentador, simultaneamente à produção
de etanol. Também se pode relacionar este fato a maior produção de ácido lático (Tabela 15)
durante as primeiras horas de fermentação tornando-se constante após certo tempo e a partir
desde ponto a produtividade em etanol se torna máxima.

Tabela 15: Parâmetros do mosto durante a fermentação utilizando como antibiótico a monensina sódica.
Acido Lático Nitrogênio AF Etanol Densidade PR
Tempo (h) -1 -1 -1 -1 -
(g L ) (g L ) (g L ) (g L ) (g cm ³) (g L-1 h-1)
Experimento 1
c a
0 5,80±0,27 0,80±0,02 106,45±1,82a 00,00±0,00f 0,996877±0,00a 0,00±0,00d
4,5 5,71±0,19c 0,73±0,02b 88,41±1,00b 10,27±0,77e 0,995343±0,00b 2,28±0,24b
9 5,82±0,04c 0,60±0,02c 72,49±0,92c 15,83±0,23d 0,994567±0,00c 1,76±0,03c
13,5 6,24±0,18b 0,58±0,02c 16,98±0,88d 37,20±0,10c 0,991573±0,00d 2,76±0,01 a
18 6,33±0,17ab 0,58±0,03c 2,71±0,03e 48,20±0,35b 0,990173±0,00e 2,68±0,02a
22,5 6,40±0,29ab 0,52±0,00d 2,29±0,00ef 49,60±0,26a 0,989967±0,00f 2,20±0,01b
27 6,65±0,07a 0,46±0,02e 0,77±0,06f 50,37±0,38a 0,989847±0,00f 1,87±0,01c
p – Brown
0,95 0,06 0,54 0,68 0,22 0,44
Forsythe*
p–
<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
ANOVA**
Experimento 2
d a
0 4,37±0,05 0,76±0,04 118,68±0,20a 00,00±0,00g 0,996850±0,00a 0,00±0,00f
4,5 4,91±0,11c 0,74±0,00a 99,39±0,84b 00,97±0,21f 0,996770±0,00a 0,21±0,05e
9 4,92±0,02c 0,65±0,02b 51,55±0,36c 22,33±0,47e 0,993647±0,00ab 2,48±0,05b
13,5 5,23±0,01b 0,63±0,04b 5,59±0,08d 42,23±0,15d 0,993333±0,00b 3,13±0,01 a
18 5,30±0,08b 0,55±0,00c 5,32±0,01d 44,73±0,06c 0,993395±0,00b 2,49±0,00b
22,5 5,49±0,07a 0,48±0,04d 4,42±0,05e 45,57±0,06b 0,990460±0,00bc 2,03±0,00c
27 5,57±0,06a 0,46±0,02d 4,26±0,09e 52,20±0,10a 0,989583±0,00c 1,93±0,00d
p – Brown
0,87 0,06 0,16 0,34 0,48 0,24
Forsythe*
p–
<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
ANOVA**
Nota: AF – açúcares fermentescíveis (glucose+galactose); Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina;
Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75 % de milhocina. * Valores de probabilidade obtidos segundo
o teste de Brown-Forsythe para homogeneidade de variâncias; ** Valores de probabilidade obtidos segundo
ANOVA fator único. *** Letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa de acordo com
o teste de Fisher LSD (p<0,05).
 59

A produção final de ácido lático para os diferentes tratamentos e para o experimento

onde nenhum tratamento foi realizado se encontra na figura 14. Sem aplicação de tratamento
prévio à fermentação (pasteurização ou uso de antibióticos) a acidez final dos experimentos
foi de: 7,63 g L-1 para o experimento contendo apenas milhocina e 7,28 g L-1 para o
experimento com 25% de soro, e não houve a produção de etanol devido à alta contaminação
bacteriana (Figura 14).

10 10
(a) (b)
9 9
Concentração de ácido lático produzido (g L )

Concentração de ácido lático produzido (g L )

-1

-1
8 a 8 a
7 b 7,63 7
b b
7,28
6
6,51 6 c
6,34 6,31
5 5 5,57
4 4

3 3

2 2

1 1

0 0
Ant. Past. ST Ant. Past. ST

Figura 14: Comparação da produção de ácido lático após 27 horas de fermentação utilizando diferentes métodos
de controle de contaminantes.
Nota: (a) Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; (b) Experimento 2 - mosto contendo 25 % de
soro e 75 % de milhocina; Ant.: tratamento com antibiótico; Past.: tratamento térmico (pasteurização); ST: sem
tratamento.
*Letras diferentes representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher LSD- p<0,05.

Com o uso da monensina sódica menores índices de ácido lático foram atingidos, o
que é favorável, pois segundo Makanjuola et al. (1992) a contaminação por bactérias inibe a
produção de etanol não só por competir com os açúcares junto a levedura, mas também por
tornar a levedura incapaz de fazer pleno uso dos açúcares presentes. Desta forma, nas curvas
de liberação de CO2 observa-se que para ambos os meios a ausência de tratamentos contra
contaminantes e a consequente alta presença de bactérias lácticas no mosto, inibe a ação da
levedura S. cerevisiae impedindo a liberação de dióxido de carbono e a produção de etanol.
Em termos de cinética fermentativa o perfil de consumo de açúcar e nitrogênio assim
como a produção de biomassa e etanol utilizando o antibiótico monensina sódica (Figuras 15
e 16) foi semelhante ao perfil resultante do mosto pasteurizado.
 60

120 60
110 AFT (a)
100 Etanol 50
90
80 40
AFT (g . L )
-1

Etanol (g . L )
70
60 30
50
40 20

-1
30
20 10
10
0 0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

12 0,9
11 Biomassa (b) 0,8
10 Nitrogênio
0,7
9
Biomassa (g . L )
-1

8 0,6

Nitrogênio (g . L )
7
0,5
6
0,4
5
4 0,3
3
-1

0,2
2
0,1
1
0 0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

Figura 15: Cinética Fermentativa para experimento 1 utilizando antibiótico: (a) consumo de açúcares
fermentescíveis totais (AFT) e produção de etanol; (b) Consumo de nitrogênio e produção de biomassa.
Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina.
 61

120 60
110 AFT (a)
100 Etanol 50
90
80 40

Etanol (g . L )
AFT (g . L )
70
-1

60 30
50

-1
40 20
30
20 10
10
0 0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

12 0,9
11 Biomassa (b)
0,8
10 Nitrogênio
0,7
9

Nitrogênio (g . L )
Biomassa (g . L )
-1

8 0,6
7
0,5
6
0,4
5
4 0,3 -1
3
0,2
2
0,1
1
0 0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

Figura 16: Cinética Fermentativa para experimento 2 utilizando antibiótico: (a) consumo de açúcares
fermentescíveis totais (AFT) e produção de etanol; (b) Consumo de nitrogênio e produção de biomassa.
Nota: Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75 % de milhocina.

Quanto à determinação de µ máx. realizada por regressão linear no intervalo entre 9 e

18 horas de fermentação, a velocidade máxima específica de crescimento da levedura (µ máx.)
utilizando o antibiótico como controle de contaminantes foi de 0,02 h-1 para o experimento
0,00-1,00 e de 0,03 h-1 para o experimento 0,25-0,75 (Figura 17). Ambos os valores foram
inferiores aos obtidos a partir da fermentação de mosto pasteurizado os quais foram de 0,07 h-
1
para o experimento 0,00-1,00 e de 0,05 h-1 para o experimento 0,25-0,75. Sendo assim, o uso
de antibiótico reduz a velocidade máxima específica de crescimento da levedura, o que é
 62

favorável, pois segundo alguns estudos, menores níveis de µ máx. resultam em rendimentos
elevados de etanol (BASSO et al., 2008; BASSO et al., 2011; BOENDER et al., 2009).

0,8
y = 0,0234x + 0,2047 (a)
R² = 0,9612

0,6
ln X/X0

0,4

0,2

0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0

Tempo (h)

y = 0,0311x + 0,2535 (b)

0,8 R² = 0,9961

0,6
ln X/X0

0,4

0,2

0,0
0,0 4,5 9,0 13,5 18,0 22,5 27,0
Tempo (h)

Figura 17: Gráfico para determinação de µ máx pelo coeficiente angular da reta ajustada aos dados experimentais
na fase exponencial de crescimento para os ensaios: (a) Experimento 1 e (b) Experimento 2 utilizando antibiótico
P. Maxx.
Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75
% de milhocina.

O menor valor de µ máx refletiu diretamente na eficiência da fermentação e de

processo. Na Tabela 16 pode-se observar que os mostos tratados com antibióticos
apresentaram maior eficiência que o mesmo mosto pasteurizado. Comparando os diferentes
 63

experimentos, o mosto contendo 100 % de milhocina apresentou melhores resultados do que

aquele que continha 25 % de soro.

Tabela 16: Resultados dos parâmetros da fermentação dos experimentos avaliados em 27 h de processo
comparando métodos de controle de contaminantes.
Experimento 1 Experimento 2 p – Brown
Parâmetros p – ANOVA**
Pasteurizado Antibiótico Pasteurizado Antibiótico Forsythe*

0,48±0,01a 0,48±0,01a 0,44±0,00c 0,46±0,00b 0,44 <0.01

Nb (%) 93,32±1,00a 93,85±0,98a 86,33±0,32c 89,28±0,06b 0,44 <0.01

Np (%) 93,05±1,02a 92,18±0,99a 82,75±0,47c 86,07±0,02b 0,48 <0.01

0,06±0,00a 0,06±0,00a 0,05±0,00b 0,05±0,00b 0,28 <0.01

Nota: Experimento 1 - mosto contendo 100 % de milhocina; Experimento 2 - mosto contendo 25 % de soro e 75
; PR - produtividade em etanol; - Fator de conversão de substrato em etanol (g g-1); Nb - Eficiência de

fermentação (%); Np - Eficiência de processo (%); - Fator de conversão de substrato em biomassa.

* Valores de probabilidade obtidos segundo o teste de Brown-Forsythe para homogeneidade de variâncias.
** Valores de probabilidade obtidos segundo ANOVA fator único.
*** Letras diferentes na mesma linha representam diferença significativa de acordo com o teste de Fisher
LSD (p<0,05).

Relacionando a Figura 14 com a Tabela 16, quanto maior a produção de ácido lático
menor o rendimento (Nb) da fermentação em produção de etanol durante as 27 horas de
fermentação para os experimentos em que foram utilizados os tratamentos.
O uso de antimicrobianos alternativos, como antibióticos, pode apresentar efeito
positivo tanto na melhoria da fermentação quanto no valor econômico da produção de
bioetanol em função de sua eficácia contra a maioria dos contaminantes presentes em sistemas
industriais de fermentação por leveduras (MUTHAIYAN et al., 2011). Além disso,
tratamentos como a pasteurização, necessitam de instalações diferenciadas, e elevado gasto
energético para geração de calor e a necessidade de reduzir a temperatura do mosto antes da
inoculação enquanto o antibiótico necessita de pequenas dosagens (2 a 5 ppm) para ser efetivo
contra os contaminantes, podendo ser utilizado para tratamento do mosto nas próprias dornas
de fermentação sem a necessidade de adaptação da planta de produção.
Quanto à biomassa e mosto residual, o resíduo de monensina, se controlada a sua
concentração, pode ser destinado à alimentação animal visto que a monensina é usada
extensivamente como promotora do crescimento principalmente em bovinos melhorando a
conversão alimentar (ANDREOTTI e NICODEMO, 2004) sugerindo-se, então, uma
utilização de toda biomassa residual gerada neste processo.
 64

6. CONCLUSÕES

A milhocina, subproduto proveniente da produção de farinha de milho do tipo biju,

apresenta-se deficiente em açúcares na sua composição físico-química, porém é rica em
nitrogênio e aminoácidos livres, com destaque para a presença de prolina, podendo ser
utilizado como fonte de nutrientes em inúmeros processos biológicos incluindo fermentação
alcoólica.
Diferente da milhocina, o soro de leite é rico em lactose, um açúcar não
fermentescível pela levedura alcoólica convencional. Porém, se o soro passar por um
tratamento prévio de hidrólise da lactose, esta se torna uma mistura dos açúcares glucose e
galactose, ambos consumidos pela levedura mais utilizada para produção de etanol, a
Saccharomyces cerevisiae. Quanto a compostos nitrogenados do soro, destaca-se a presença
de amônia, utilizada para crescimento microbiano.
Processos fermentativos em geral, necessitam tanto de fontes de carbono quanto de
nitrogênio para melhor desempenho e eficiência. Desta forma ambos os subprodutos foram
considerados aptos para o uso em bioprocessos. Através do planejamento de misturas binárias
verificou-se que o aumento da eficiência da fermentação (Nb %) foi proporcional à presença
de milhocina no meio.
Obteve-se um modelo preditivo que permitiu a otimização do processo fermentativo
e repetindo-se os experimentos o erro absoluto entre os valores teóricos e práticos foi baixo (<
10 %).
Através da cinética fermentativa observaram-se com clareza as três fases existentes
na fermentação alcoólica e obtiveram-se processos fermentativos considerados de alta
eficiência e alta produtividade em produção de etanol atingindo eficiência máxima de 93,32
% e produtividade máxima de 1,88 g L-1 h-1 de etanol. Quanto ao cálculo da velocidade
máxima de crescimento da levedura, ambos os experimentos avaliados apresentaram baixos
níveis de crescimento de levedura e alto nível de conversão de substrato em biomassa o que é
desejável para obtenção de rendimentos elevados de etanol.
Utilizando-se fontes alternativas de açúcares evidenciou-se que os nutrientes
presentes nos subprodutos são de grande importância para o processo fermentativo, e que a
mistura de melaço de cana de açúcar com milhocina é uma alternativa viável para a produção
de bioetanol, visto que ambos são subprodutos amplamente disponíveis em países como o
Brasil.
 65

Avaliando-se diferentes tipos de controles de contaminantes da fermentação

alcoólica pode-se observar que a produção de ácido lático pelos micro-organismos
contaminantes pode afetar fortemente a produção de etanol. Verificou-se que tanto o uso do
tratamento térmico (pasteurização), quanto o uso de antibióticos, principalmente da
monensina sódica cristalina, foram eficientes para o controle dos contaminantes presentes. O
uso de antibióticos pode ser vantajoso em relação ao tratamento térmico, pois é de fácil
aplicação, podendo ser utilizado na própria dorna de fermentação.
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