UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA - UESB

 CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS E ZOOTECNIA 2019.1

Artur Pinheiro Júnior, Emilly Beatriz Braz da Paixão, Micaelle de Moraes Moreira, Monique
Martim de Oliveira Garcia, Rosane Pereira de Souza e Yandra Karina Macedo Pitanga.

TESTE PRESUNTIVO E CONFIRMATIVO

ITAPETINGA – BA
2021

Artur Pinheiro Júnior, Emilly Beatriz Braz da Paixão, Micaelle de Moraes Moreira, Monique
Martim de Oliveira Garcia, Rosane Pereira de Souza e Yandra Karina Macedo Pitanga.

TESTE PRESUNTIVO E CONFIRMATIVO

 Trabalho apresentado à docente Lígia Miranda
Menezes, ministrante da disciplina de
Microbiologia geral da Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia – UESB como requisito
avaliativo da 2ª unidade.

ITAPETINGA – BA
2021

SUMÁRIO

1. RESUMO 4

2. INTRODUÇÃO 5

3. OBJETIVOS 7

4. MATERIAL E MÉTODOS 8

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 10

6. CONCLUSÃO 12

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 13
1. RESUMO

O queijo é um dos principais produtos derivados do leite, sendo um dos produtos mais
consumidos pela população nos dias atuais. O objetivo deste trabalho foi realizar a avaliação
microbiológica de 25 g de queijo. A qualidade dos queijos é afetada por diversos fatores,
incluindo a contaminação por microrganismos. Estas contaminações são consideradas
indesejáveis pois podem afetar a qualidade do produto e a segurança quanto ao seu consumo.

A análise microbiológica constituiu-se da contagem de coliformes totais e fecais. Para

a análise de coliformes, utilizou-se os tubos de diluição seriada da 10-¹ a 10-³ . Houve, ao
todo, 9 tubos positivos para coliformes fecais contendo o meio EC. Essa confirmação também
foi possível por meio da turvação do meio de cultura EC e retenção de gás carbônico nos
tubos de duhan. Esses 9 tubos (3,3,3) representam 240 NMP/g permitido para coliformes
fecais em amostras de queijo, um valor muito acima do limite permitido pela RDC12
(5,0x10²NMP/g). Dessa forma, é possível afirmar que as amostras de queijo analisadas são
impróprias para o consumo (BRASIL, 2001).

Palavras chaves: queijo, análises, coliformes

2. INTRODUÇÃO

Segundo a Portaria n° 146 de 07 de março de 1996, entende-se por queijo o produto

fresco ou maturado que se obtém por separação parcial do soro do leite ou leite reconstituído
(integral, parcial ou totalmente desnatado), ou soros de lácteos, coagulados pela ação física do
coalho, de enzimas específicas, de bactéria específica, de ácido orgânico, isolado ou
combinado, todos de qualidade apta para uso alimentar, com ou sem agregação de substâncias
alimentícias e/ou especiarias e/ou condimentos, aditivos especificamente indicados,
substâncias aromatizantes e materiais corantes. (BRASIL, 1996).

A presença de coliformes nos alimentos é de grande importância para a indicação de

contaminação durante o processo de fabricação ou mesmo pós-processamento. Segundo
FRANCO (2005), os microrganismos indicadores são grupos ou espécies que, quando
presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação
fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial de um
alimento, além de poder indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento,
produção ou armazenamento.

A presença de coliformes totais e Escherichia coli em alimentos processados segundo

SILVA (1997), é considerada uma indicação útil de contaminação pós–sanitização ou pós-
processo, evidencialmente práticas de higiene e santificação aquém dos padrões requeridos
para o processamento de alimentos. A maioria dos coliformes são encontrados no meio
ambiente, essas bactérias possuem limitada relevância higiênica. Devido ao fato de os
coliformes serem destruídos com certa facilidade pelo calor, sua contagem pode ser útil em
testes de contaminações pós-processamento. (FORSYTHE, 2002)

Ademais, observa-se que eles são classificados em dois tipos de coliformes: totais e
fecais. Os coliformes totais compõem os grupos de bactérias gram-negativas que podem ser
aeróbicas ou anaeróbicas (isto dependerá do ambiente e da bactéria), não originam esporos e
fermentam a lactose, produzindo ácido e gás à 35/37°C.Além disso, coliformes fecais são
também conhecidos como “termotolerantes” por suportarem uma temperatura superior à
40°C, convivem em simbiose com humanos, bois, gatos, porcos e outros animais de sangue
quente. São excretados em grande quantidade nas fezes e normalmente não causam doenças
(quando estão no trato digestivo).Neste grupo está presente a bactéria gram-negativa
Escherichia coli, e ao se ingerir alimentos por ela contaminados, os resultados desagradáveis
(como uma gastrenterite, por exemplo) podem ser brandos ou desastrosos, dependendo do
grau de contaminação.

A classificação dos coliformes segundo SILVA (1997), apresenta o grupo de

Coliformes totais que inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram-negativos, não
esporogênicos, aeróbios ou aeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com
produção de gás, em 24 a 48 horas a 35o C. Apresenta-se cerca de 20 espécies, dentre as quais
encontram-se tanto bactérias originárias do trato intestinal de humanos e outros animais de
sangue quente.

Os Coliformes fecais são capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24h
a 44,5-45,5o C. Esse grupo inclui três gêneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, sendo a
cepas de Enterobacter e Klebsiella de origem não fecal. Por isso que E. coli é a mais
conhecida, sendo seu habitat o trato gastrintestinal ela é a indicadora de contaminação fecal,
em alimentos processados (SILVA,1997 p.31).
 Os microrganismos indicadores são grupos ou espécies que, quando presentes em um
alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal,
sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento, além
de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou
armazenamento (FRANCO, 2005).

O queijo é um alimento rico em nutrientes, o que favorece a proliferação de

microrganismos que podem levar a alterações nas características organolépticas do produto e
ou causar toxinfecções alimentares nos consumidores. Os coliformes, por exemplo, são
considerados microrganismos indicadores, ou seja, quando detectados em populações
elevadas no alimento indicam higiene inadequada no processamento e, no caso de coliformes
termotolerantes, provável presença de micro-organismos patogênicos (PIETROWSKI et al.,
2008). Além disso, o sabor do queijo é alterado, devido à produção de compostos decorrentes
do metabolismo bacteriano, como o ácido acético (SANTOS-KOELLN; MATTANA;
HERMES, 2009).

Um dos alimentos com maior índice de contaminação é o queijo, um concentrado

proteico – gorduroso, constituído por caseína em forma de gel, matéria gorda, ácido lácteo e
substâncias minerais, resultantes da coagulação do leite. A presença e o número de
microrganismos patogênicos acima dos padrões estabelecidos podem diminuir a qualidade e a
durabilidade do produto, além de apresentar sérios riscos à saúde do consumidor, tornando-se
assim um problema de saúde pública (SOUZA, 2003).

Perante o exposto se mostra importante controlar a qualidade para identificar a

contaminação por coliformes fecais em queijos prontos para o consumo, já que indústria
brasileira de produtos lácteos tem importância sócia – econômica, em especial a de queijos,
ocupando o sexto lugar em produção mundial, com 945 mil toneladas já em 2006
(EMBRAPA, 2006). O queijo é um produto de grande importância no grupo dos derivados de
leite, especialmente pelo seu grande valor nutritivo e suas características sensoriais
agradáveis, sendo por isso muito consumido pela população. Por sua fabricação muitas vezes
ser caseira, sem muitos recursos e fiscalização, é necessário manter certa preocupação com
relação à qualidade e a segurança nesse alimento.
3. OBJETIVOS

Através do teste presuntivo, verificar a presença de coliformes em amostras de queijo. Se

houver presença de coliformes, através do teste confirmativo, verificar se sua origem é fecal
ou total.

4. MATERIAL E MÉTODOS

Materiais Utilizados

Amostra de queijo (25g)

Água peptonada (225 ml)

Tubos de ensaio

Erlenmeyer

Tubos de Durham;

Pipetador

Bico de Bunsen

Alça de platina

Meio seletivo Escherichia coli (EC)

Meio seletivo Verde brilhante

Meio seletivo lauril sulfato triptose

Estufa

Métodos

Diluição Seriada

Para a diluição em série foi utilizada 25 gramas da amostra de queijo sendo diluídas
inicialmente em 225 ml água peptonada(diluente com o pH próximo a neutralidade que
favorece o crescimento de microrganismos) essa mistura então é homogeneizada concluindo
assim então a diluição 10-¹.Para as demais diluições utiliza-se uma pipeta completamente
esterilizada, retirando 1ml da diluição 10-1 e transferindo para outro tubo (10-²), e esse
processo se repete mais uma vez, chegando à diluição 10-³.

Teste Presuntivo

Para esta análise utiliza-se os tubos das diluições seriadas feitas anteriormente (10-¹,10-²,10-³)
e a partir de cada diluição são feitos 3 novos tubos de ensaio para cada, onde dentro dos
mesmos são colocados tubos de Durham, pequenos e invertidos (atuam retendo CO2,
produzido pela fermentação) e com meio seletivo para coliformes que fornece os nutrientes
necessários para fermentação (lauril sulfato triptose). Inicialmente esteriliza-se a pipeta com a
chama do bico de Bunsen introduzindo-a na diluição 10-¹ já homogeneizada, retirando-se 3
ml desta diluição onde é transferida 1ml para cada dos três tubos de ensaio com o meio
seletivo. Esse processo é repetido nos tubos de diluição 10-² e 10-³, após essa etapa os noves
tubos vão ser incubados a 35° graus por 24 horas.

Teste Confirmativo

Após o período de incubação inicia-se o teste confirmativo a partir dos tubos com resultado
positivo para coliformes sendo que para cada tubo positivo utiliza-se dois novos tubos de
ensaio contendo tubos de Durham dentro dos mesmos com meios de cultura seletivo
Escherichia coli (EC) que seleciona coliformes fecais e verde brilhante que seleciona
coliformes totais.O método inicia com a esterilização da alça de platina onde é inoculado no
teste positivo para coliforme e é retirada uma alçada colocando-a no meio de cultura EC
homogeneizando-o, em seguida inocula a alça de platina novamente no tubo positivo para
coliforme desta vez colocando-o no tubo com meio seletivo verde brilhante. Concluindo
assim o método a alça de platina é novamente esterilizada e ambos tubos vão ser incubados
por 24 horas em temperaturas diferentes, onde o tubo com EC ficará na temperatura média de
45° graus e o tubo com verde brilhante à 35° graus.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
 A análise microbiológica revelou que a amostra de queijo apresentava valores
maiores que o tolerado na legislação para coliformes fecais.

Observou-se que todos os nove tubos analisados no teste presuntivo de coliformes

apresentaram as características que indicam presença deste grupo de bactérias. Após 24 horas
de incubação em estufa a 35°C estes tubos apresentaram turvação do meio de cultura e
retenção de CO2 nos tubos de Durhan. Estimou-se que a quantidade de coliformes totais para
a combinação de tubos 3-3-3 é de 240 NMP/g de amostra.

Figura 1. Tubo positivo para coliformes

O teste confirmativo revelou que houve retenção de CO 2 nos tubos de Durham e

turvação do meio de cultura, tanto para os nove tubos contendo caldo verde brilhante (VB)
quanto para os nove que continham o caldo de Escherichia coli (EC), após 24 horas de
incubação em estufa a, respectivamente, 35ºC e 45°C. Confirmou-se a presença de coliformes
tanto de origem total quanto de origem fecal na amostra de queijo.
Figura 2. Tubos positivos para coliformes totais (direita) e fecais (esquerda)

Portanto, estimou-se que a quantidade de coliformes termotolerantes de origem fecal para a

combinação de tubos 3-3-3 é de 240 NMP/g. Encontrou-se o mesmo número mais provável
para coliformes totais, também para a combinação 3-3-3.A RDC nº 12/2001 da ANVISA e a
Portaria nº 146/1996 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento apresentam um
limite de tolerância de coliformes fecais de até 5,0 x 102 NMP/gda amostra. Apesar de a RDC
12/2001 não estabelecer um valor limite de tolerância para coliformes totais em queijos, a
presença deste grupo de microrganismos, juntamente a coliformes termotolerantes, em
alimentos indica que os produtos ou matérias-primas foram manuseados em condições
higiênicas insatisfatórias, pois a presença dos mesmos evidencia falhas durante ou após-
processo de pasteurização — os coliformes são facilmente destruídos em altas temperaturas
— e também que estes podem ter entrado em contato direto ou indireto com fezes (MORAIS;
REZENDE, 2013; AMORIM, 2013).Diante dos fatos mencionados, verifica-se que este
queijo está impróprio para a comercialização e o consumo humano de acordo com os padrões
da legislação brasileira.
 Esta quantidade de coliformes totais e fecais encontrada na amostra de queijo
analisada pode ser explicada,principalmente, pelo manuseio, armazenamento e transporte
inadequados de sua matéria prima, pois se o leite está contaminado o queijo,
consequentemente, estará também.As mãos são a principal via de transmissão de
microrganismos, entre eles a espécieE. coli (GAUER; SILVA, 2017). Além disso, os
utensílios comumente utilizados por manipuladores deste alimentopodem contribuir para esta
transmissão. Portanto, a má higienização das mãos — e também de utensílios — antes e
durante o processo de fabricação do queijo pode causar a contaminação do mesmo por este
grupo bactérias. Ainda mais, é preciso armazenar e transportar estes alimentos refrigerados a
temperatura entre 5 e 10°Cpara que o metabolismo destes microrganismos permaneça
inativado, impedido os mesmos de fermentarem a lactose e se multiplicarem. Caso o leite (cru
ou pasteurizado) e o queijo forem armazenados, manipulados ou transportados em
temperaturas acima do indicado, o número de coliformes e E. colijá presentes nestes produtos
tende a crescer, aumentando as chances de ocorrência de surtos e casos isolados de
toxinfecção alimentar(ROCHA et al., 2006).
6. CONCLUSÃO

Utilizou-se o teste presuntivo, no qual foi constatada a presença de coliformes. A confirmação

permitiu a realização do teste confirmativo, que detectou tanto coliformes fecais, quanto
coliformes totais nas amostras.Conclui-se que o queijo analisado se encontra fora dos padrões
permitidos pela legislação, sendo assim impróprio para comercialização e consumo humano.
Os resultados encontrados foram maiores do o permitido pela RDC 12/2001 da ANVISA
(5,0x102NMP/g). Recomenda- se uma fiscalização mais rígida durante a produção desses
produtos, para prevenir prováveis contaminações da matéria prima, ao produto final. E a
implementação de programas de boas práticas de fabricação.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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