UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM HIGIENE VETERINÁRIA E PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO

DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL DISCIPLINA DE TECNOLOGIA DOS PRODUTOS LÁCTEOS FERMENTADOS

MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DE QUEIJOS E OUTROS PRODUTOS LÁCTEOS FERMENTADOS

FABIO MACEDO DA COSTA JORGE LUIZ FORTUNA PAULO GOMES DE LIMA

Niterói-RJ 2010

FABIO MACEDO DA COSTA JORGE LUIZ FORTUNA PAULO GOMES DE LIMA

MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DE QUEIJOS E OUTROS PRODUTOS LÁCTEOS FERMENTADOS

Seminário apresentado à disciplina de Tecnologia dos Produtos Lácteos Fermentados do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, área de concentração de Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal.

Professor Dr. Marco Antônio Sloboda Cortez

Niterói-RJ 2010

SUMÁRIO

RESUMO, p. 1 1 INTRODUÇÃO, p. 2 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, p. 5 2.1 LEITE, p. 5 2.2 QUEIJOS, p. 6 2.3 OUTROS PRODUTOS LÁCTEOS FERMENTADOS, p. 8 2.3.1 Leites fermentados, p. 8 2.3.2 Bebida láctea fermentada, p. 8 2.4 PADRÕES MICROBIOLÓGICOS, p. 9 2.5 CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA, p. 10 2.6 FATORES LIMITANTES DO CRESCIMENTO MICROBIANO, p. 12 2.7 PRINCIPAIS MICRORGANISMOS, p. 13 2.7.1 Microrganismos patogênicos, p. 16 2.7.2 Microrganismos deteriorantes, p. 20 2.7.2.1 Bactérias lácticas, p. 20 2.7.2.2 Grupo coliforme, p. 22 2.7.2.3 Microrganismos psicrotróficos, p. 23 2.7.2.4 Bactérias termodúricas, p. 24 2.7.2.5 Bactérias esporuladas, p. 24 2.8 PRINCIPAIS PROBLEMAS CAUSADOS POR MICRORGANISMOS, p. 25 2.8.1 Putrefação, p. 26 2.8.2 Defeitos de sabor, p. 26 2.8.3 Manchas, p. 27 2.8.4 Formação de gás, p. 27 2.8.5 Crescimento de fungos, p. 27 2.9 CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO, p. 28 2.10 EPIDEMIOLOGIA, p. 30 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS, p. 32 4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 33

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RESUMO

A qualidade microbiológica do leite é um termo muito amplo e genérico. Os principais microrganismos envolvidos com a contaminação do leite são bactérias, vírus, fungos e leveduras. Um leite de baixa qualidade microbiológica não se conserva por longos períodos, mesmo sob refrigeração, principalmente pela sua contaminação por bactérias psicrotróficas formadoras ou não de esporos, que apesar de seu crescimento lento, produzem grandes quantidades de enzimas lipolíticas e proteolíticas que rapidamente alteram o produto. Os produtos derivados do leite, entre eles os queijos, por serem perecíveis, devem ser produzidos com matéria-prima de boa qualidade e submetidos a um eficiente controle em todas as etapas de processamento, incluindo as dentro do laticínio, o transporte, o armazenamento e a comercialização adequada, a fim de se evitar as toxinfecções alimentares para a população. A contaminação do queijo com patógenos de origem alimentar pode ocorrer em várias etapas do processo. Assim para o controle preventivo da qualidade dos diferentes tipos de queijos, deve-se conhecer as principais fontes de patógenos e os mecanismos pelos quais podem ingressar na cadeia produtiva destes laticínios. Com o objetivo de apresentar importantes informações acerca dos microrganismos associados com os queijos e produtos lácteos fermentados, o presente estudo reporta resumidamente suas principais propriedades, as vias através das quais pode ocorrer contaminação destes produtos, as implicações dessa contaminação para a qualidade dos produtos, e alguns dados sobre a qualidade microbiológica dos produtos lácteos fermentados.

PALAVRAS-CHAVE: Contaminantes; Queijos; Produtos Lácteos Fermentados.

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1 INTRODUÇÃO

O leite, por natureza, é um alimento rico em nutrientes contendo proteínas, carboidratos, gorduras, vitaminas e sais minerais. Sua qualidade é um dos temas mais discutidos atualmente dentro do cenário nacional de produção leiteira (SANTOS; FONSECA, 2010a). No Brasil, o leite in natura apresenta baixa qualidade quando comparado a outros países mais desenvolvidos, sendo que este fator está relacionado com a influência das estações do ano, as práticas de produção e manuseio na fazenda, localização geográfica, temperatura de permanência do leite e a distância do transporte entre a fazenda e a plataforma de recepção da indústria. Além dos fatores anteriores, também contribuem para a presença e o desenvolvimento de microrganismos contaminantes no leite: a qualidade bacteriológica das águas, qualidade do ar dos estábulos, sanidade dos ordenhadores e dos animais e principalmente, utensílios não perfeitamente higienizados (HUHN et al, 1980). A qualidade microbiológica do leite é um termo muito amplo e genérico. Os principais microrganismos envolvidos com a contaminação do leite são bactérias, vírus, fungos e leveduras. Um leite de baixa qualidade microbiológica não se conserva por longos períodos, mesmo sob refrigeração, principalmente pela sua contaminação por bactérias psicrotróficas formadoras ou não de esporos, que apesar de seu crescimento lento, produzem grandes quantidades de enzimas lipolíticas e proteolíticas que rapidamente alteram o produto (BRITO; BRITO, 1998). Esses grupos de microrganismos presentes no leite podem ser parcial e/ou quase que totalmente eliminados pelos processos de pasteurização e/ou

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esterilização comercial. A destruição de grupos patogênicos torna o leite mais seguro, eliminando potenciais riscos de infecção, mas não corrige defeitos relacionados ao sabor, à composição ou a adequação para a industrialização. A contaminação microbiana prejudica a qualidade do leite, interfere na industrialização, reduz o tempo de prateleira do leite fluido e derivados lácteos e pode colocar em risco a saúde do consumidor (LORENZETTI, 2006). A elevada população bacteriana é indesejável para o consumidor, pois coloca em risco a saúde do mesmo devido à maior probabilidade de veiculação doenças, muitas vezes de alta patogenicidade e para a indústria, devido a problemas na estocagem e no processamento do leite, além de características sensoriais indesejáveis (PICININ, 2003). Já os queijos são produtos, derivados do leite, que estão prontos para serem consumidos e que não sofrem nenhum tratamento adicional para garantir a segurança antes do consumo. Queijos são considerados por alguns autores (JOHNSON et al, 1990; LITTLE et al, 2008), como um dos produtos alimentares mais seguros, no entanto em 2006, segundo a “European Food Safety Authority” (EFSA), o consumo de queijo contaminado representou 0,4% do total de surtos de origem alimentar na Europa (EFSA, 2008). Além disso, a literatura científica tem relatado várias manifestações graves de toxinfecções gastrointestinais associadas a vários tipos de queijo (KOUSTA et al, 2010). A contaminação do queijo com patógenos de origem alimentar pode ocorrer em várias etapas do processo. Assim para o controle preventivo da qualidade dos diferentes tipos de queijos, deve-se conhecer as principais fontes de patógenos e os mecanismos pelos quais podem ingressar na cadeia produtiva destes laticínios. De acordo com Furtado (1991), os produtos derivados do leite, entre eles os queijos, por serem perecíveis, devem ser produzidos com matéria-prima de boa qualidade e submetidos a um eficiente controle em todas as etapas de processamento, incluindo as dentro do laticínio, o transporte, o armazenamento e a comercialização adequada, a fim de se evitar as toxinfecções alimentares para a população. Os contaminantes Listeria monocitogenes, Staphylococcus aureus,

Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7 e Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP), são os principais causadores de surtos de origem alimentar através do consumos de vários tipos de queijos (ARAÚJO et al, 2002; CONEDERA

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et al, 2004; DE VALK et al, 2000). Além disso, a presença desses contaminantes em queijos elaborados com leite cru ou queijos que se recontaminaram após o processo de pasteurização, torna-se uma ameaça para a saúde humana (KOUSTA, 2010). Ao considerarmos a fermentação que, segundo Tamine (1990), é um dos mais antigos métodos de preservação de alimentos conhecido pela humanidade. JAY (2005) relata que vários foram os conceitos de fermentação ao longo da história e baseando-se em vários outros autores, apresenta uma definição geral de que fermentação é um processo no qual transformações químicas são realizadas em um substrato orgânico pela ação de enzimas produzidas por microrganismos. Vários são os tipos de alimentos fermentados, com é o caso de queijos maturados, iogurtes, leites, conservas e linguiças fermentadas. Os microrganismos utilizados nessas fermentações realizam alterações que beneficiam o alimento e aumentam o prazo de validade em relação ao produto original. As alterações caracterizam-se pelo desenvolvimento de sabor e aroma, como resultado direto ou indireto da ação dos microrganismos fermentadores. Podendo ainda aumentar a digestibilidade e a concentração de vitaminas (ADAMS; MITCHELL, 2002; FERREIRA, 1987; JAY, 2005). Os alimentos fermentados podem ser considerados produtos com bom nível de segurança, principalmente quando se leva em consideração que cerca de 20% de todo o suprimento alimentar consumido no mundo ocorre na forma de alimento fermentado (KNORR, 1998). Quando se observam, exceções em que alimentos fermentados estão associados a surtos, explica-se a importância e a preocupação por parte da indústria e dos órgãos governamentais no que diz respeito a produção de alimentos seguros (ADAMS; MICHEL, 2002). Com o objetivo de apresentar importantes informações acerca dos microrganismos associados com os queijos e produtos lácteos fermentados, o presente estudo reporta resumidamente suas principais propriedades, as vias através das quais pode ocorrer contaminação destes produtos, as implicações dessa contaminação para a qualidade dos produtos, e alguns dados sobre a qualidade microbiológica dos produtos lácteos fermentados.

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 LEITE

Do ponto de vista biológico, o leite pode ser considerado um dos alimentos mais completos por apresentar, entre outras características, alto teor de proteínas e sais minerais (BORGES et al, 1989). A qualidade do leite e derivados é uma constante preocupação de técnicos e autoridades ligadas às áreas de saúde e laticínios, principalmente pelo risco de veiculação de microrganismos patogênicos e deteriorantes (CARMO, 2001), uma vez que o leite é um meio de cultura ideal para o crescimento bacteriano (CORTEZ; CORTEZ, 2008). Basicamente, o leite, para ser caracterizado como de boa qualidade, deve apresentar as seguintes características sensoriais, nutricionais, físico-químicas e microbiológicas: sabor agradável, alto valor nutritivo, ausência de agentes patogênicos e contaminantes (antibióticos, pesticidas, adição de água, sujidades etc.), reduzida contagem de células somáticas, e baixa carga microbiana. Dentre essas características, destaca-se a qualidade microbiológica do leite, que pode ser um bom indicativo da saúde da glândula mamária do rebanho e das condições gerais de manejo e higiene adotadas na fazenda (PEREIRA JR. et al, 2001). Por sua composição, o leite é considerado um dos alimentos mais completos em termos nutricionais e fundamentais para dieta humana, mas pela mesma razão, constitui num excelente substrato para o desenvolvimento de uma grande diversidade de microrganismos, inclusive os patogênicos (SILVA et al, 2006).

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De acordo com Revillion (2006), os microrganismos são importantes para os produtos lácteos por três motivos: (1) produção de características físico-químicas e sensoriais (aroma/sabor, textura) desejáveis; (2) possibilidade de contaminação de produtos lácteos com microrganismos patogênicos ou toxinas e conseqüente contaminação/intoxicação do consumidor; e (3) possibilidade de degradação das características organolépticas ou físicas dos produtos lácteos pela ação de microrganismos de alteração ou de enzimas excretadas no meio pelos mesmos.

2.2 QUEIJOS

De acordo com Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA), entende-se por queijo o produto fresco ou maturado que se obtém por separação parcial do soro do leite reconstituído (integral, parcial ou totalmente desnatado ou de soros lácteos, coagulados pela ação física do coalho, enzimas específicas de bactérias específicas, de ácidos orgânicos, isolados ou combinados, todos de qualidade apta para uso alimentar, com ou sem agregação de substâncias alimentícias e/ou especiarias e/ou condimentos, aditivos

especificamente indicados, substâncias aromatizantes e matérias corantes (BRASIL, 1952). Para Oliveira (1986), tecnologicamente o queijo é um concentrado protéicogorduroso resultante da coagulação do leite, seguida da dessora do coágulo que causa o decréscimo na umidade. O componente mais importante do queijo é a proteína, sendo que a gordura pode variar dependendo do tipo de queijo. O teor de umidade também varia muito e é correlacionado com o tempo de conservação do queijo resultante, sendo que os queijos mais desidratados são mais duros e de maior conservação, mesmo em condições adversas. Os queijos são, em geral, produtos muito manipulados e, por este motivo, passíveis de contaminação, especialmente de origem microbiológica. Estas condições podem ser agravadas, quando processados com leite cru, sem o emprego das Boas Práticas e tecnologia adequada, ou sem se observar o tempo mínimo de maturação (PINTO et al, 2009). Para Oliveira (1986), sob o ponto de vista prático e/ou tecnológico, é difícil classificar um queijo de uma forma coerente e definida. A maior dificuldade se baseia na existência de um grande número de variedades, sendo que as

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diferenciações entre a maioria das variedades são baseadas em detalhes empíricos, regionais, climáticos, hábitos alimentares, etc. Com base nas características tecnológicas, os diferentes tipos de queijos se enquadram em cerca de 16 grupos (TABELA 1). TABELA 1 Classificação de queijos segundo as principais características tecnológicas do processo de fabricação e do produto acabado.
TRATAMENTO DA MASSA Massa Crua Massa Semicozida Massa Cozida Massa Filada CARACTERÍSTICAS DA CURA Sem Cura Cura por Bactéria Cura por Mofo Cura Rápida (1-2 meses) Cura Prolongada (>3 meses) Sem Olhadura Com Olhadura Sem Cura Curado Cremoso Frescal Curado Cremoso Consistente Frescal Consistente EXEMPLOS Minas Frescal Minas Meia-cura Gorgonzola, Camembert Prato, Colby, Gouda Cheddar Parmesão, Romano Suíço, Gruyere Mussarela Provolone Requeijão, Cream Cheese Cottage Cheese Queso Blanco Requeijão Requeijão do Norte, Queijo Pasteurizado Ricota Ricota Curada, Mysost

Massa Coagulação Ácida

Fundido

Proteína de Soro
Fonte: OLIVEIRA, 1986.

Além disso, ainda segundo Oliveira (1986), os queijos podem ser agrupados em quatro diferentes classes tomando como base o nível de desidratação sofrida pela massa, resultando em variações na consistência de acordo com o teor de umidade final do queijo (TABELA 2). TABELA 2 Diferentes classes de queijo de acordo com o nível de desidratação sofrida pela massa. TIPO Macio Firme (Semiduro) Duro Muito Duro
Fonte: OLIVEIRA, 1986.

UMIDADE > 50% 40-50% 37-40% <37%

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2.3 OUTROS PRODUTOS LÁCTEOS FERMENTADOS

2.3.1 Leites fermentados

De acordo com a Instrução Normativa (IN) nº 46 (BRASIL, 2007), entende-se por leites fermentados os produtos adicionados ou não de outras substâncias alimentícias, obtidas por coagulação e diminuição do pH do leite, ou reconstituído, adicionado ou não de outros produtos lácteos, por fermentação láctica mediante ação de cultivos de microrganismos específicos. Estes microrganismos específicos devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final durante seu prazo de validade. Esta mesma IN especifica os diferentes tipos de leites fermentados de acordo com os cultivos específicos para cada produto, sendo os principais: (1) Iogurte: cuja fermentação se realiza com cultivos protosimbióticos de Streptococcus salivarius thermophilus e Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, aos quais se podem

acompanhar, de forma complementar, outras bactérias ácido-lácticas que, por sua atividade, contribuem para a determinação das características do produto final; (2) Leite Fermentado ou Cultivado: fermentação se realiza com um ou vários dos seguintes cultivos: Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium sp., Streptococcus salivarius thermophilus e/ou outras bactérias ácido-lácticas; (3) Kefir: fermentação se realiza com cultivos ácido-lácticos elaborados com grãos de Kefir, Lactobacillus kefir, espécies dos gêneros Leuconostoc, Lactococcus e Acetobacter com produção de ácido láctico, etanol e dióxido de carbono. Os grãos de Kefir são constituídos por leveduras fermentadoras de lactose (Kluyveromyces marxianus) e leveduras não fermentadoras de lactose (Saccharomyces omnisporus, Saccharomyces cerevisae e Saccharomyces exiguus), Lactobacillus casei,

Bifidobacterium sp. e Streptococcus salivarius thermophilus; e (4) Coalhada: fermentação se realiza por cultivos individuais ou mistos de bactérias mesofílicas produtoras de ácido láctico.

2.3.2 Bebida láctea fermentada

A Instrução Normativa (IN) nº 36 (BRASIL, 2000), define como bebida láctea fermentada o produto obtido a partir de leite ou leite reconstituído e/ou derivados de

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leite, reconstituídos ou não, fermentado mediante a ação de cultivo de microrganismos específicos, e/ou adicionado de leite fermentado e/ou outros produtos lácteos fermentados, e que não poderá ser submetido a tratamento térmico após a fermentação, com ou sem adição de outros ingredientes onde a base láctea represente pelo menos 51% massa/massa (m/m) do total de ingredientes do produto. A contagem total de bactérias lácticas viáveis deve ser no mínimo de 106 UFC/g, no produto final, para o(s) cultivo(s) láctico(s) específico(s), durante todo o prazo de validade.

2.4 PADRÕES MICROBIOLÓGICOS

Segundo a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 5 (BRASIL, 2000), os leites fermentados devem apresentar, no mínimo, o número de 106 a 107 UFC/mL de bactérias lácticas totais dependendo do produto, não sendo esse valor alcançado, o produto se encontra em não conformidade com a legislação. Em se tratando de critérios microbiológicos de qualidade para leites fermentados, a Instrução Normativa (IN) nº 46 (BRASIL, 2007), preconiza os seguintes valores: 102 NMP/g para coliformes totais; 10 NMP/g para coliformes termotolerantes e 2,0x102 UFC/g para bolores e leveduras. Já os critérios microbiológicos de qualidade para bebida láctea fermentada, a IN nº 36 (BRASIL, 2000), preconiza 102 NMP/mL ou g para coliformes totais e 10 NMP/mL ou g para coliformes termotolerantes. Além disso, de acordo com a RDC nº 12 (BRASIL, 2001), os principais microrganismos que devem ser pesquisados para análise de qualidade

microbiológica do alimento, de modo geral, em leite de bovinos e de outros mamíferos e seus derivados lácteos, são: coliformes termotolerantes;

Staphylococcus coagulase positiva; Salmonella sp.; Listeria monocytogenes e Bacillus cereus. Sendo que para coliformes termotolerantes; Staphilococcus coagulase positiva e Bacillus cereus os limites podem variar de cinco a 5,0x103 UFC/mL ou g, de acordo com o tipo de produto, e que para Salmonella sp. e Listeria monocytogenes sempre deve ser ausência destes microrganismos em 25 g do produto analisado. Além disso, os produtos lácteos em embalagens herméticas não devem apresentar microrganismos patogênicos e causadores de alterações físicas,

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químicas e sensoriais do produto em condições normais de armazenamento, após sete dias de incubação deste a 35-37° com a embala gem fechada (íntegra). C

2.5 CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA

Em função da natureza, composição, origem, forma de obtenção, manuseio e locais de produção, diferentes microrganismos podem ser encontrados no leite. Alguns com atividade deteriorante, caracterizada basicamente pela ação enzimática de seu metabolismo. Outros, apresentando diferentes níveis de patogenicidade, caracterizando risco para a saúde pública (CORTEZ; CORTEZ, 2008). Um dos maiores problemas no tratamento e processamento do leite é a quantidade de microrganismos que contém. De um modo geral, no Brasil, a contaminação de leite pasteurizado por altas contagens de microrganismos deteriorantes e/ou patogênicos, tem sido atribuída a deficiências no manejo e higiene durante a ordenha, a elevados índices de mastites, a descuidos com a correta desinfecção e manutenção de equipamentos e à falta de treinamento para os colaboradores (CARDOSO; ARAÚJO, 2003). Do ponto de vista tecnológico, os microrganismos de maior importância são os que contaminam o leite durante e após a ordenha. Essa contaminação é variável, tanto qualitativa quanto quantitativa, em função das condições de higiene existentes (FERNANDES, 2002). De acordo com Marth e Steele (2001), as fontes desses microrganismos podem ser divididas em três categorias: alguns deles estão presentes no momento da ordenha, outros são incorporados pelo ordenhador e utensílios mal higienizados e outros pelo ambiente, incluindo água, solo, vegetação e material de cama. Em geral, a contaminação por psicrotróficos tem sido associada com material de cama, água não tratada, solo e vegetação, a contaminação por coliformes com o solo e a contaminação por esporos com material de cama. Uma higiene mal feita do úbere pode resultar na introdução de vegetação, solo e material de cama e os microrganismos associados no leite. Uma limpeza e secagem do úbere, imediatamente antes ordenha reduz o número total de bactérias, bem como coliformes e Staphylococcus spp. e diminui sedimentos no leite. A contaminação bacteriana de dentro do úbere é frequentemente resultado de mastite, a inflamação da glândula mamária que pode resultar em elevados níveis de bactérias no leite.

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Para Pereira Jr. et al (2001), a carga microbiana do leite é uma variável dependente da carga bacteriana inicial e da taxa de multiplicação dos microrganismos. A primeira pode ser definida como a concentração de microrganismos existente no leite armazenado no tanque resfriador imediatamente após o término da ordenha, e depende basicamente de quatro fatores. O primeiro diz respeito à carga microbiana do leite dentro da própria glândula mamária, ou seja, da saúde do rebanho em termos de mastite. O segundo fator está relacionado com a higiene da ordenha, e, mais especialmente, com a limpeza e desinfecção da superfície dos tetos. As condições de limpeza dos utensílios e equipamentos de ordenha também são fundamentais e, se forem negligenciadas, podem gerar altas contagens microbianas. Por fim, cabe destacar a importância da qualidade da água utilizada, tanto na lavagem dos tetos durante a ordenha, quanto na lavagem e desinfecção do sistema de ordenha. Segundo Pinto et al (2009), o leite e seus derivados são suscetíveis ao crescimento microbiano, podendo, consequentemente, ocasionar surtos de

intoxicações e/ou infecções alimentares. A temperatura e o período de armazenamento do leite antes da pasteurização determinam, de maneira seletiva e pronunciada, a intensidade de desenvolvimento das diversas espécies microbianas contaminantes. As temperaturas baixas inibem ou reduzem a multiplicação da maioria das bactérias e diminuem a atividade de enzimas degradativas. A obtenção do leite de vacas sadias, em condições higiênicas adequadas, e o seu resfriamento imediato a 4ºC são as medidas fundamentais e primárias para garantir a qualidade e a segurança do leite e seus derivados. No Brasil tem-se adotado a coleta de leite a granel. Nesse sistema, o leite cru, armazenado em tanques de expansão a 4ºC por até 48 horas, é transportado para a indústria em caminhão com tanque isotérmico (BRASIL, 2002; FERNANDES, 2002). A contaminação bacteriana pós pasteurização cria um grande obstáculo para a manutenção e prorrogação do prazo de validade do leite fluido. Duas fontes principais contribuem para a contaminação pós pasteurização: resíduos de leite nos equipamentos e aerossóis. Procedimentos de limpeza ineficazes nos equipamentos de processamento de leite criam resíduos que permitem que as bactérias se multipliquem e contaminem o fluxo de leite posterior. Biofilmes bacterianos, que são difíceis de remover com a limpeza, também podem se formar dentro de equipamentos e proporcionar uma constante fonte de contaminação para ambos,

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leite cru e pasteurizado. Além disso, superfícies de contato do leite proporcionam uma rota de aerossóis microbianos para contaminar o leite pasteurizado. Durante a limpeza ou o processamento, leveduras no ar, fungos, bactérias e esporos podem pousar em uma superfície de contato do leite e, assim, entrar no fluxo de produção (MARTH; STEELE, 2001).

2.6 FATORES LIMITANTES DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Segundo Revillion (2006), o leite fresco possui uma limitada capacidade “germicida” ou “bacteriostática” natural que pode inibir o crescimento de microrganismos por uma ou duas horas de acordo com a carga microbiana inicial. Essa característica é consequência da ação de uma série de fatores antimicrobianos: (1) Imunoglobulinas: são geradas na glândula mamária a partir do estímulo infeccioso e possuem a capacidade de facilitar a fagocitose, neutralizar toxinas e vírus e reduzir a fixação das células infecciosas na parede das células epiteliais. Sua função principal é proteger o terneiro no início de sua vida, porém, também faz parte dos mecanismos de defesa do úbere; (2) Fagocitose: juntamente com a destruição dos microrganismos por leucócitos polimorfonucleares (LPMN) é o principal mecanismo de defesa do úbere frente aos microrganismos causadores da mamite; (3) Sistema Peroxidase / Tiocianato / Peróxido de Hidrogênio: O leite possui uma enzima que degrada os peróxidos: a peroxidase; ela oxida o tiocianato naturalmente presente formando hipotiocianato o qual inibe o desenvolvimento de muitas espécies bacterianas prolongando a conservação do leite; (4) Lisozina e Lactoferrina: o leite contém uma enzima proteolítica, a lisozima, que ataca a parede celular de diversas bactérias matando-as ou diminuindo seu crescimento. A lactoferrina e a transferrina são proteínas naturais do leite fixadoras do ferro que possuem uma ação bacteriostática principalmente sobre os microrganismos que necessitam de muito ferro para seu desenvolvimento como coliformes, Salmonella, Pseudomonas; (5) Bacteriocinas: são proteínas ou complexos de proteínas com atividade antibiótica, produzidas por determinadas linhagens de bactérias lácticas que se caracterizam por apresentarem um espectro de ação restrito aos microrganismos Gram-positivos; (6) Competição por Niacina e Biotina: inibem a presença de Staphylococcus aureus.

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2.7 PRINCIPAIS MICRORGANISMOS

Os principais microrganismos que contaminam o leite são as bactérias. Os vírus, bolores e leveduras têm participação reduzida, embora sejam importantes em determinadas situações. A microbiota do leite cru pode ser muito variada, podendo os microrganismos se agrupar de acordo com determinadas características (LANGE; BRITO, 2005). Quando o leite é proveniente de animais sadios e obtido em condições higiênicas adequadas, o número de microrganismos é baixo, sendo predominantes os gêneros Micrococcus, Streptococcus e Corynebacterium, além de lactobacilos saprófitas do úbere e canais galactóforos. Os vírus, fungos e leveduras apesar de serem potencialmente importantes em algumas situações, têm uma participação reduzida (JAY, 2005). Os microrganismos mais comuns e de maior significância envolvendo a qualidade do leite são as bactérias, mas também podem ser encontrados bolores, leveduras e vírus. Quando uma alta contagem bacteriana é encontrada, uma das principais suspeitas é a de que o processo de limpeza está sendo ineficiente ou mal realizado. Além disso, uma alta contagem de microrganismos pode estar associada a problemas de sanidade animal. Destacam-se os gêneros Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus, Serratia, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcos,

Flavobacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Achromobacter, Alcaligenes, Enterobacter e Clostridium, como os principais grupos de bactérias de importância na deterioração do leite e derivados (CORTEZ; CORTEZ, 2008). Com relação às bactérias, por conveniência, podemos classificá-las em três categorias distintas, segundo a faixa de temperatura ótima para o crescimento e multiplicação: as bactérias psicrófilas, as quais crescem em baixas temperaturas (0 e 20° as mesófilas, cuja temperatura ótima de cres cimento é entre 20 e 45° e as C), C, termófilas as quais preferem temperaturas entre 45 e 60° graus para o crescimento C ótimo. A taxa de temperatura preferida é específica de cada espécie de bactéria e, frequentemente, é muito estreita, especialmente para microrganismos que ocupam apenas habitats ecológicos como o trato intestinal de mamíferos. Além destes, dois outros termos foram introduzidos na microbiologia de alimentos para caracterizar a temperatura de preferência das bactérias: psicrotróficas, um grupo de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que podem crescer em alimentos como o leite sob

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temperaturas de refrigeração, apesar de ter temperatura ótima de crescimento entre 20 e 30° e termodúricas, cujas bactérias são em s ua maioria Gram-positivas e são C; capazes de crescer em temperaturas em torno de 50° sendo capazes de resistir ao C processo térmico de pasteurização (WALSTRA et al, 2006). Porém Cortez e Cortez (2008), descrevem que as mesófilas se desenvolvem bem em temperaturas na faixa entre 15 e 40ºC e têm importância principalmente na acidificação do leite. Destacam-se as bactérias dos grupos dos lactobacilos, estreptococos, lactococos e coliformes. As termodúricas representam riscos, pois podem resistir ao tratamento térmico de pasteurização, uma vez que suportam temperaturas mais elevadas. Além disso, algumas apresentam a capacidade de produzir esporos (destacando-se os gêneros Clostridium e Bacillus). Já as bactérias psicrotróficas são capazes de se multiplicar em temperaturas abaixo de 7ºC independentemente da temperatura ótima de crescimento, geralmente próxima a 20ºC. Entretanto, essa classificação não impede que uma bactéria mesófila ou termodúrica seja psicrotrófica. Basicamente os microrganismos mesófilos predominam em situações em que há falta de condições básicas de higiene de maneira geral, bem como falta de refrigeração do leite. Em tais circunstâncias, bactérias como as dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e algumas enterobactérias, atuam intensamente por meio da fermentação da lactose, produzindo ácido láctico e gerando, consequentemente, acidez do leite, que é um dos problemas mais frequentemente detectados em nível de plataforma (MENDES, 2006). O grupo dos mesófilos é muito importante, por incluir a maioria dos contaminantes do leite, tanto deterioradores como patógenos. É considerado um bom indicador de qualidade microbiológica, sendo a contagem microbiana em placa realizada para se avaliar as condições higiênicas na qual o produto foi processado (JAY, 2005). As bactérias psicrotróficas, na maioria, são mesofílicas, isto é, a temperatura ótima de multiplicação é entre 25 a 35° Entretant o, possuem a capacidade de se C. multiplicar nas temperaturas de refrigeração entre 2ºC até 10ºC, embora de forma mais lenta. Os principais gêneros são: Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Clostridium, Achromobacter, Lactobacillus e Flavobacterium (BRITO; BRITO, 1998). Esse grupo, além do crescimento substancial é capaz de produzir enzimas que

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resistem ao tratamento térmico, e podem causar alterações negativas nas propriedades do leite (LORENZETTI, 2006; MENDES, 2006). A grande maioria dessas bactérias é destruída na pasteurização, entretanto, os microrganismos psicrotróficos termodúricos por serem capazes de resistirem a temperaturas similares àquelas do processo de pasteurização (72-75° C). Os psicrotróficos Gram-positivos mais frequentes no leite cru resfriado pertencem aos gêneros Micrococcus, Bacillus e Arthrobacter. Mesmo quando presentes em pequenas quantidades no leite podem causar alterações decorrentes de multiplicação com degradação de seus componentes. Apesar de serem facilmente destruídos pela pasteurização, exceto os Bacillus que são esporulados, suas enzimas proteolíticas e lipolíticas são termorresistentes e promovem alterações físicas e organolépticas no leite e seus derivados mesmo após o tratamento térmico (PRATA, 2001). O gênero Pseudomonas é o mais importante dentre os psicrotróficos, pois sob más condições de refrigeração predomina rapidamente sobre a microbiota do leite cru e pasteurizado (ROQUE et al. 2003). Segundo a “International Comission on Microbiological Specifications for Foods” (ICMSF) as bactérias termófilas são definidas como aquelas cuja temperatura ótima de crescimento situa-se entre 45 a 65ºC, e para algumas espécies consideradas como termófilos extremos as temperaturas de crescimento podem atingir 90ºC e o mínimo em torno de 35ºC. O leite cru normalmente contém poucas bactérias termófilas, embora elas possam estar presentes em número suficiente para se desenvolverem no leite mantido a temperaturas elevadas, acarretando grande número desses microrganismos no produto (ICMSF, 1994). As bactérias termodúricas resistem à pasteurização porque suportam temperaturas mais altas (menos de 100° ou produze m esporos que são formas de C) resistência contra condições adversas. Exemplos de gêneros com espécies esporuladas são Clostridium e Bacillus. Os esporos são inertes, não apresentam atividade metabólica e não se multiplicam, podendo sobreviver por anos no ambiente. São extremamente resistentes ao calor necessitando-se, em geral, de 20 minutos a 120° para serem inativados. Como sobrevi vem à pasteurização, podem C reduzir o tempo de prateleira do leite, principalmente se as bactérias esporuladas forem também psicrotróficas (BRITO; BRITO, 1998). Do ponto de vista de consumo, os microrganismos presentes no leite podem ser patogênicos ou saprófitos, estes últimos também chamados de contaminantes ou

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deterioradores, que não causam doenças, mas promovem deteriorações dos produtos, dando origem a características sensoriais indesejáveis, interferindo nos processos de fermentação e diminuindo a vida de prateleira (LANGE; BRITO, 2005).

2.7.1 Microrganismos patogênicos

Os microrganismos patogênicos (TABELA 3) geralmente não crescem muito bem no leite, ao contrário dos deteriorantes. Ocasionalmente, entretanto, ocorrem infecções alimentares causadas pelo consumo de leite cru, especialmente nos países tropicais e subtropicais, onde o risco de infecção é maior. Nos países desenvolvidos, a maioria dos patógenos transmitidos pelo leite são aqueles associados com doenças entéricas (WALSTRA et al, 2006). No caso de doenças ou infecção do úbere, mesmo o leite obtido higienicamente pode conter microrganismos patogênicos, ou seja, nocivos à saúde humana (SILVA; FERNANDES, 2003). De modo geral, os microorganismos patogênicos não sintetizam expressivamente as enzimas responsáveis pelas alterações nas características sensoriais e na composição do leite, e por isto não causam comprometimento aparente da qualidade industrial e do prazo de validade dos produtos lácteos pasteurizados. Por este motivo, a presença destes microrganismos no leite pode muitas vezes ser subestimada ou passar despercebida, o que é um fator gravíssimo se analisado sob o prisma da saúde pública (MENDES, 2006). Algumas bactérias causam doenças nos animais e podem ser eliminadas no leite. Essas incluem os agentes da mastite, da tuberculose e da brucelose. Vacas com mastite podem eliminar microrganismos como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli, que possuem o potencial de causar doenças no homem (BRITO et al, 2005). O S. aureus é um dos agentes patogênicos mais comuns, responsável por surtos de intoxicação alimentar. As peculiaridades do seu habitat tornam a sua presença largamente distribuída na natureza, sendo transmitido aos alimentos por manipuladores, mas também pode ter como origem dos próprios animais, pois este é um dos principais ocasionadores da mastite. A intoxicação é devido à ingestão de enterotoxinas produzidas e liberadas pela bactéria durante sua multiplicação nos alimentos, a enterotoxina é termoestável e está presente no alimento mesmo após a pasteurização (BEZERRA, 2009).

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Verifica-se que um dos patógenos, com predominância é o Staphylococcus aureus. Sua presença no leite é indicativa de infecção da glândula mamária e indica deficiências no controle da mastite. Sugere, ainda, risco de produção de enterotoxinas resistentes à pasteurização caso o leite não seja mantido à temperatura de refrigeração inferior a 4ºC (BRASIL, 2002; FLOWERS et al 1992). A concentração de enterotoxina capaz de causar sintomas de intoxicação ocorre quando o número de S. aureus excede 105 UFC/ml (FLOWERS et al, 1992). Outro patógeno contagioso da mastite, o Streptococcus agalactiae, que tem o úbere infectado como único reservatório, quando o S. aureus também estava presente. S. agalactiae pode causar diversas infecções humanas, como meningite, pneumonia, endometriose, pielonefrite e artrite séptica (FLOWERS et al, 1992). Algumas bactérias patogênicas produzem toxinas que permanecem no alimento mesmo após a eliminação do agente, durante o processamento industrial (pasteurização ou outro tratamento térmico). Quando o agente é uma toxina previamente elaborada por um determinado microrganismo no alimento, a doença resultante é denominada intoxicação. Células viáveis de bactérias não precisam estar presentes para que a doença ocorra. Exemplos de intoxicações alimentares são: botulismo, toxinose estafilocócica e quadro emético do Bacillus cereus (BRITO et al, 2005). Outras bactérias necessitam ser ingeridas com o alimento, para terem condições de se multiplicar no organismo, onde exercerão sua ação patogênica. Quando a doença envolve a ingestão de células viáveis do microrganismo patogênico, colonização e/ou invasão, a doença é denominada infecção alimentar. São exemplos de infecções: salmonelose, shigelose e listeriose (ibid). A Listeria monocytogenes é agente causador de enfermidades graves para homens e animais, amplamente distribuída na natureza, tem como característica a capacidade de multiplicação em temperatura de refrigeração e a relativa resistência térmica. Alguns relatos têm demonstrado o envolvimento de produtos lácteos em surtos alimentares, causando listeriose (ICMSF, 1996). Outro agente responsável por casos de infecções alimentares é a Salmonella sp., comumente observada em produtos lácteos. Normalmente, encontrada no trato intestinal de animais domésticos e selvagens, especialmente, aves e répteis, tem como principais veículos de disseminação alimentos e a água. A contaminação dos alimentos pode ocorrer

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devido ao controle inadequado de temperatura, manipulação incorreta ou contaminação cruzada (JAY, 2005). TABELA 3 Microrganismos patogênicos associados ao leite e derivados. MICRORGANISMOS
Enterobacteriaceae Escherichia coli, including O157:H7 Salmonella Yersinia enterocolitica (psicrotrófica) Outras Bactérias Gram-negativas Aeromonas hydrophila (psicrotrófica) Brucella spp. Campylobacter jejuni Pseudomonas aeruginosa Gram-positivas formadoras de esporos Bacillus cereus (algumas cepas psicrotrófica) Bacillus anthracis Anthrax Clostridium perfringens Clostridium botulinum (Tipo E é psicrotrófico) Cocos Gram-positivos Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes Streptococcus zooepidemicus Bactérias Gram-positivas diversas Corynebacterium spp. Listeria monocytogenes (psicrotrófica) Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium paratuberculosis Rickettsia Coxiella burnetii Vírus Enterovirus (poliovirus, rotavirus, vírus Coxsackie) FMD virus Vírus da Hepatite Fungos Leveduras Protozoários Entamoeba histolytica Giardia lamblia Giardiasis Toxoplasma gondii Fonte: MARTH; STEELE, 2001. Micotoxicoses Febre Q

DOENÇAS
Gastroenterite, Síndrome Urêmica Hemolítica Gastroenterites, Febre Tifóide Gastroenterites

Gastroenterites Brucelose Gastroenterites Gastroenterites

Gastroenterites Anthrax Gastroenterites Botulismo

Intoxicação Dor de garganta Febre Escarlatina / Dor de Garganta Faringite, seqüelas renais

Difteria Listeriose Tuberculose Tuberculose Doença Johne’s (ruminantes)

Infecção entérica Febre Aftosa Hepatite Infecciosa

Amebíase Giardíase Toxoplasmose

A salmonelose é motivo de preocupação à saúde pública, devido a sua capacidade de produzir infecções que variam, desde gastroenterites, a infecções

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sérias como septicemia, infecções localizadas, febre tifóide e paratifóide. A enfermidade é denominada de salmonelose e inclui o gênero Salmonella com várias espécies patogênicas para o homem e os animais. Pertence à família das Enterobacteriaciae, Gram-negativos, móveis por flagelos, anaeróbios facultativos, sendo, os focos principais de infecção as fezes humanas e de animais. O agente da febre tifóide a S. typhi é uma das mais importantes. Outras espécies estão associadas às infecções alimentares como S. typhimurium, S. enteritidis e S. newport, sendo à S. typhimurium causadora dos maiores surtos encontrados na literatura. Esta espécie produz uma proteína enterotoxina de natureza

lipopolissacarídio (ALVES; PINHEIRO, 2006). Há ainda os patógenos causadores de toxinfecção alimentar, termo usado para caracterizar o resultado da colonização do organismo com bactérias, seguido da ação de toxinas. São consideradas toxinfecções as doenças causadas por Bacillus cereus e Clostridium perfringens, cujos esporos são termorresistentes e cuja toxina termolábil, é formada durante a esporulação no trato intestinal (BRUM, 2004; BRITO et al, 2005). Os vírus são parasitas intracelulares e não se multiplicam no leite. Entretanto, alguns deles podem sobreviver por longos períodos. Eles são infectivos em doses baixas, e a maioria dos vírus transmitidos por alimentos causam gastroenterites. Alguns podem ter origem nas vacas e acessar o leite por contaminação fecal ou água poluída. Eles são inativados pela pasteurização do leite, inclusive o vírus da febre aftosa (WALSTRA et al, 2006). Algumas espécies de fungos como os gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium produzem produtos tóxicos no leite e derivados, chamados de micotoxinas. As micotoxinas são metabólitos na maioria termo-estável. Estes podem resistir a determinados tratamentos térmicos ou processos de desidratação, que são suficientes para destruir o micélio vegetativo dos fungos que as produzem (ALVES; PINHEIRO, 2006). Essas micotoxinas são tóxicas, carcinogênicas ou mutagênicas (WALSTRA et al, 2006). As mais amplamente conhecidas são as aflatoxinas, as quais são produzidas pelos microrganismos Aspergillus flavus, A. parasiticus, e A. nomius. Dentre as diversas aflatoxinas já identificadas, a que mais se destaca é a aflatoxina B1, uma das mais carcinogêncas conhecidas. O leite e derivados podem ser contaminados diretamente, pela contaminação do leite com fungos, seguido do seu crescimento, ou indiretamente, pela contaminação do alimento oferecido ao

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animal com subsequente passagem da micotoxina para o leite. Em ambas as ocasiões, a contaminação é largamente dependente das condições ambientais, que determinarão a habilidade do fungo de produzir toxinas (MARTH; STEELE, 2001). Entamoeba histolytica é um protozoário que causa amebíase, a terceira causa mais comum de morte por parasitas no mundo. A transmissão ocorre via ingestão de cistos em água ou comida contaminada. Cryptosporidium muris causa a criptosporidiose, com diarréia como primeiro sintoma da infecção. As vacas podem eliminar oocistos de C. muris nas fezes, o que pode levar à contaminação do leite. O veículo mais comum de transmissão dessa doença é a água contaminada. Toxoplasma gondii causa uma infecção parasitária em humanos e muitos outros animais de sangue quente, especialmente em cabras leiteiras. A infecção pode ocorrer pela ingestão de água contaminada com oocistos. O leite contaminado é considerado um potencial tipo de toxoplasmose humana. Entretanto, tanto os fungos quanto os protozoários são geralmente destruídos pela pasteurização (WALSTRA et al, 2006).

2.7.2 Microrganismos deteriorantes

Grupos de microrganismos os quais são responsáveis por certos tipos de deterioração em leite e derivados lácteos.

2.6.2.1 Bactérias lácticas

Algumas espécies de bactérias lácticas termófilas resistem ao tratamento de pasteurização e provocam acidificação do leite em temperaturas acima de 30° C. Streptococcus thermophilus é uma bactéria normalmente presente no leite pasteurizado. Outras bactérias lácticas dos gêneros Lactobacillus e Lactococcus também podem contaminar o leite após o tratamento térmico e provocar sua acidificação, especialmente se o produto se mantém a temperaturas superiores a 10° (REVILLION, 2006). C As bactérias lácticas têm significativa importância econômica na fermentação de grande variedade de alimentos, como queijos, iogurtes, manteigas, dentre outros. São encontradas de forma natural, por exemplo, no leite cru, ou de forma industrializada, as quais são adicionadas intencionalmente nos alimentos. Suas

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atividades metabólicas contribuem para o desenvolvimento das características sensoriais desejáveis no produto, também permitem conservar e/ou aumentar o valor nutritivo da matéria-prima. O uso de culturas “starters” ou fermentos láticos, contendo Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é um requisito essencial na fabricação de diversos queijos. Essas culturas são conhecidas como “starters”, pelo fato de iniciarem a produção de ácido lático, sua principal função na produção de queijos. As bactérias do fermento desempenham muitas funções na fabricação e maturação de queijos. Quando produzem o ácido lático em quantidade suficiente, durante a fabricação, o grão “enxuga” mais rapidamente e a massa do queijo atinge seu pH sem maiores problemas. Quando presentes em elevado número, o queijo fermenta normalmente, no tempo certo, e apresenta consistência, aroma e sabor típicos do queijo. Além disso, o fermento lático pode ainda inibir contaminações indesejáveis, como as bactérias do grupo coliforme (CAVALCANTE, 2009). Em algumas pesquisas a qualidade microbiológica ruim tem sido associada à baixa incidência de patógenos. Entretanto, quando se verifica uma melhoria da qualidade microbiológica a incidência de patógenos tende a ser maior (GUERREIRO et al, 2005; JAY, 2005). Isso pode ser explicado principalmente devido à presença natural de uma microbiota com grande potencial inibitório no leite com altas contagens. Provavelmente as Bactérias Ácido Lácticas (BAL), naturalmente presentes no leite, são responsáveis por essa inibição. As BAL são produtoras de uma variedade de compostos antimicrobianos, incluindo ácidos, diacetil, peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono, álcool, aldeído e bacteriocina. Todos esses compostos podem prejudicar o desenvolvimento de bactérias deterioradoras e patogênicas presentes nos alimentos O grupo das bactérias lácticas é constituído de seis gêneros de bactérias, sendo acidúricas produtoras de ácido lático, Grampositivo, catalase negativa e microaerófilas: Lactobacillus, Leuconostoc, Pedioccus, Streptococcus, Lactococcus e Enterococcus. São microrganismos relacionados com a produção de alimentos de média e alta acidez, da qual podem participar como coadjuvantes da fabricação ou como deteriorantes, respondendo por perdas significativas na indústria. Nos alimentos onde sua enumeração é relevante, a microbiota competidora restringe-se quase que exclusivamente aos bolores e leveduras (SILVA et. al, 2007). As bactérias lácticas são basicamente mesófilas (com algumas linhagens termófilas) e são capazes de crescer num intervalo de temperatura de cinco a 45º C.

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Podem crescer em pH de 3,8 e são proteolíticas fastidiosas em relação a alguns aminoácidos. Esses microrganismos são assim chamados por produzirem ácido lático. Este pode ser um isômero L(+) ou D(-). As bactérias ácido lácticas produzem vários fatores antimicrobianos, tais como ácido lático, acético e propiônico, os quais interferem na força promotiva e dos mecanismos de transporte ativo da membrana citosplática bacteriana (FORSYTHE, 2002). Um dos papéis mais importantes das bactérias lácticas é a higiene. O outro é desenvolver as propriedades sensoriais dos alimentos fermentados. Por meio da produção de um grande número de enzimas glicolíticas, lipolíticas e proteolíticas, as bactérias lácticas transformam os nutrientes fundamentais dos produtos agrícolas em compostos com propriedades organolépticas complexas. Tais atividades permitem às bactérias lácticas alterar as estruturas e o aroma dos alimentos fermentados e de contribuir para o desenvolvimento das suas qualidades gastronômicas (JAY, 2005).

2.6.2.2 Grupo coliforme

Apesar dos coliformes estarem muito difundidos, podendo ser detectados em vários tipos de alimentos, não indicam, necessariamente, uma contaminação de origem fecal, no sentido de envolver contato direto ou indireto com fezes. A presença destes microrganismos em leites crus é frequentemente atribuída às práticas precárias de higiene durante a ordenha e nas etapas subsequentes de processamento do produto (MORENO et al, 1999). São bacilos Gram-negativos, não esporulados, aeróbios facultativos, oxidase negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares e que fermentam a lactose à temperatura de 35-37ºC, com a produção do aldeído, ácido e gás, num período de 48 horas. Crescem rapidamente no leite, especialmente acima de 20ºC, e degradam proteínas e lactose. Como resultado, gases CO2 e H2 são formados e o sabor do leite torna-se amargo. Fazem parte deste grupo principalmente as espécies dos gêneros Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella e a Escherichia coli mas outros gêneros e espécies estão envolvidos (SILVA et al, 2007; WALSTRA et al, 2006). Sua presença na água ou leite evidencia o risco da presença de organismos patogênicos de origem fecal. A identificação de Escherichia coli em água de bebida e alimentos representa a confirmação de contaminação recente destes produtos por

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fezes e a possível presença de bactérias patogênicas, vírus entéricos ou parasitas intestinais (COSTA, 2006). Por serem destruídos pela temperatura de pasteurização, associado ao fato de serem amplamente distribuídos na natureza, o grupo coliforme é utilizado como indicador das condições higiênico-sanitárias em alimentos (WALSTRA et al, 2006). Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentes no alimento, podem fornecer informações sobre a contaminação fecal, com provável presença de patógenos ou com deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

2.7.2.3 Microrganismos psicrotróficos

Os microrganismos psicrotróficos são um grupo importante presente na indústria de leite sob o ponto de vista da deterioração e, com a adoção da refrigeração do leite desde a ordenha até seu recebimento nos laticínios, a substituição da microbiota de bactérias mesofílicas produtoras de ácido láctico por uma microbiota psicrotrófica produtora de enzimas tem sido favorecida e tem levado a diferentes alterações na qualidade do leite e de seus derivados (LORENZETTI, 2006). As bactérias psicrotróficas, na maioria, são originalmente mesofílicas, isto é, a temperatura ótima de multiplicação é entre 25 a 35°C. Entretanto, possuem a capacidade de se multiplicar a baixas temperaturas, embora de forma mais lenta. A contaminação do leite com essas bactérias ocorre, geralmente, devido a falhas nos processos de higienização das tetas antes da ordenha e a falhas nos sistemas de limpeza e sanitização dos equipamentos de ordenha, tanque de refrigeração ou utensílios que entram em contato com o leite. Os principais gêneros são: Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Clostridium, Achromobacter, Lactobacillus e Flavobacterium (BRITO; BRITO, 1998). A maioria desses microrganismos produzem proteases e lipases, e atacam a proteína da gordura, causando sabores rancificados e pútridos. Eles não causam a queda do pH. As enzimas produzidas podem ser altamente resistentes ao calor e causar “off-flavors” e alteração das propriedades físico-químicas inclusive no leite “Ultra High Temperature” (UHT). Em leite pasteurizado ou leite cru, esses defeitos de

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sabor não ocorrem até o número de 107/mL, devido ao curto tempo e baixa temperatura de estocagem (WALSTRA et al, 2006). Pseudomonas fluorescens é a bactéria mais frequentemente isolada de leite cru refrigerado Espécies do gênero Pseudomonas são os organismos mais comuns, com um percentual aproximado de 50%. A principal espécie, P. fluorescens, é caracterizada pela produção de um pigmento fluorescente difusível durante o seu crescimento em meio apropriado (PINTO et al, 2006). SUHREN (1989) afirma que, entre os organismos psicrotróficos, o gênero mais frequentemente isolado do leite refrigerado é Pseudomonas, sendo as espécies P. fluorescens, P. fragi, P. putida e P. putrefaciens as que têm papel relevante na diminuição da qualidade do leite fluído e demais derivados lácteos. No leite in natura refrigerado a espécie P. fluorescens é predominante sobre as demais espécies. Este gênero microbiano, além de ser o mais prevalente, apresenta espécies capazes de produzir enzimas extracelulares resistentes às temperaturas comumente utilizadas no processamento térmico de leite e derivados (GRIFFITHS, 1990).

2.7.2.4 Bactérias termodúricas

Algumas

bactérias,

incluindo

Microbacterium

lacticum,

Streptococcus

themophilus e certas espécies de Micrococcus spp. não formam esporos mas suas células vegetativas sobrevivem à pasteurização. Temperaturas acima de 80° por C 20 segundos são capazes de destruí-las. São encontrados em locais onde outras bactérias morrem, devido sua resistência a altas temperaturas, como as usadas para higienizar as instalações industriais. Não são muito ativas em leite estocado sob refrigeração, mas são indesejáveis por estarem presentes em produtos

pasteurizados e podem crescer se as condições forem favoráveis, especialmente em ambientes com altas temperaturas (WALSTRA et al, 2006).

2.6.2.5 Bactérias esporuladas

Os gêneros Bacillus (aeróbico ou anaeróbio facultativo) e Clostridium (estritamente anaeróbio) podem formar esporos. A maioria deles sobrevivem à pasteurização. Eles originam-se especialmente do solo, poeira e fezes e também da alimentação dos bovinos. De acordo com Walstra et al (2006) o B. cereus pode

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deteriorar o leite pasteurizado causando a formação de "sweet curdling" ou coalho doce e “off-flavour” ou deterioração dos glóbulos de gordura. B. cereus não é muito resistente à pasteurização e pode crescer a temperaturas de até 7° B. subtilis e B. C; stearothermophilus são deteriorantes de leite esterilizado se insuficientemente tratado pelo calor; e o C. tyrobutyricum pertence às bactérias ácido butíricas e pode causar estufamento, um sério problema em queijos como o Gouda ou Emental, ocorrendo formação de gás, incluindo H2, levando a formação de bolhas e rachaduras. O ácido butírico em queijos provoca um sabor desagradável. Clostridium sporogenes é um bacilo anaeróbio que produz esporos. Ele é encontrado na silagem fermentada, água, solo e nos intestinos. O leite é facilmente infectado por essa bactéria ou seus esporos. Ele pode crescer anaerobiamente no queijo causando uma grande degradação (REVILLION, 2006).

2.8 PRINCIPAIS PROBLEMAS CAUSADOS POR MICRORGANISMOS

Antigamente, todos os derivados do leite, como queijo e iogurte, eram obtidos de maneira natural, somente pela ação dos microrganismos já existentes no leite. Hoje, para a obtenção desses derivados, são utilizadas culturas específicas de microrganismos, que conferem a estes produtos uma qualidade constante, que não depende da presença destes microrganismos no leite in natura (REHAGRO, 2005). Os principais gêneros de bactérias psicrotróficas que contaminam o leite são não-patogênicos, como, por exemplo, Pseudomonas, Aeromonas,

Chromobacterium, Flavobacterium, Lactobacillus, Arthrobacter. Entretanto, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica e Bacillus cereus são bactérias psicrotróficas associadas com intoxicações alimentares após consumo de leite ou produtos lácteos (EMBRAPA, 2010). Diversos tipos de defeitos podem afetar os produtos lácteos como bebidas fermentadas, iogurtes e queijos, e suas origens são diversas. Algumas decorrem da fabricação sem a técnica correta, outras da má qualidade de ingredientes ou ainda de deficiências técnicas no tratamento físico dos queijos, tais como, prensagem, maturação, temperatura, estocagem, etc. (FURTADO, 1991). Os principais problemas causados por microrganismos em produtos lácteos são: putrefação, defeitos de sabor, manchas, formação de gás, crescimento de mofos.

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2.8.1 Putrefação

Durante a maturação, o queijo pode apresentar zonas limitadas de putrefação, de coloração modificada, odor e sabor desagradáveis. O defeito, segundo Furtado (1991), seria causado por: (1) crescimento de Clostridium sporogenes, favorecido quando a maturação do queijo é feita a temperatura um pouco mais alta e apresenta um pH anormal (geralmente acima de 5,5, o que pode ser facilitado por excesso de lavagem da massa na elaboração). Manifesta-se através de formação de uma região esbranquiçada e amolecida e o microrganismo causador é termorresistente; (2) quando o pH do queijo é muito alto e o mesmo está sujeito a contaminações, o Bacillus proteoliticus pode se desenvolver e causar putrefação de cor azulada ou acinzentada. Aparece no final da maturação, de três a cinco meses; e (3) Bacillus polymixa (esporulado) causa formação de gás no queijo e aparecimento de sabor pútrido. Geralmente a origem da contaminação é água industrial de má qualidade.

2.8.2 Defeitos de sabor

Problemas de sabor nos queijos são muito complexos e muitas vezes estão relacionados com causas muito variadas e ligados entre si. De acordo com Furtado (1991), os principais defeitos de sabor causados por microrganismos são: (1) Sabor Amargo: acúmulo de peptídeos amargos de baixo peso molecular. As causas são variadas e estão relacionadas com o coalho, fermento e diversos parâmetros da elaboração. Alguns tipos de microrganismos como Streptococcus liquefaciens, Torula amara e Micrococcus casei amari podem contaminar a fabricação e, eventualmente, provocar sabor amargo; (2) Sabor Râncido: relacionado à rancidez hidrolítica, geralmente causada por bactérias psicrotróficas do grupo das Pseudomonas; (3) Sabor de Fruta: pode ser causado pela fermentação gasógena por coliformes, alguns tipos de leveduras e Pseudômonas fragi; (4) Sabor de Queimado (Caramelizado): contaminação por Streptococcus lactis maltigenes; (5) Sabor Adocicado: crescimento de coliformes; e (6) Sabor de Iogurte: formação excessiva de acetaldeído; excesso de S. lactis diacetilactis. Outros problemas relacionados à sabores estranhos em iogurtes são: sabor a malte, em casos de suspeita de contaminação por leveduras; sabor de ranço, podendo estar relacionado

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a má qualidade do leite em pó, alto teor de gordura e presença de bactérias lipolíticas; sabor amargo, podendo ser causado pelo excesso de fermento ou mesmo leite oriundo de coleta a granel onde ficou estocado por longo tempo favorecendo a proliferação de bactérias psicrofílicas que podem liberar enzimas que sobrevivem ao processo térmico; e produto muito ácido, que pode estar sendo provocada por contaminações pós fermentação por leveduras e por coliformes (MILKNET, 2010).

2.8.3 Manchas

Podem ocorrer em produtos lácteos fermentados como iogurte fermentação anormal e defeitos físicos devido a contaminação das culturas starter por bacteriófagos (REHAGRO, 2005). Segundo Furtado (1991), diversos microrganismos podem causar manchas na superfície dos queijos e em geral contaminam o produto na elaboração ou na cura, não sendo necessariamente presentes no leite. Os principais tipos de manchas causadas por microrganismos são: (1) Manchas Escuras: mofos da espécie Monillia nigra; (2) Manchas Marrons: mofos da espécie Penicillium casei; (3) Pontos Avermelhados: causados por Oospora aurantiaca ou O. caseivorans; (4) Manchas Vinho: crescimento de Streptococcus faecalis. Além disso, diversos outros micorganismos, sobretudo mofos, podem crescer na superfície dos queijos e causar manchas; principalmente em queijos moles, como o Camembert e o Brie (ibid).

2.8.4 Formação de gás

A formação de gás provoca estufamento tardio por bactérias do gênero Clostridium e estufamento precoce por bactérias do grupo Coliforme (FURTADO, 1991). A presença de gás também ocorre por ação de leveduras (REHAGRO, 2005).

2.8.5 Crescimento de fungos

Algumas culturas de bolores e leveduras são utilizadas na fabricação de lácteos, enquanto outras são contaminantes. Os Fungos serão agentes

deteriorantes quando o alimento oferecer condições para a sua multiplicação:

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acidez, umidade menor, temperatura entre 25° C e 28 ° C e substrato rico em carboidratos. Pode ocorrer o crescimento de fungos no teto e nas paredes dos laticínios, e a partir destes locais, contaminarem o leite e os produtos lácteos. Várias espécies de leveduras aparecem deteriorando leite condensado, leites fermentados e queijos frescos, como a cottage. Algumas delas podem causar alterações de odor e sabor em iogurtes e queijos. Alguns bolores são psicrotróficos, provocando deterioração de produtos estocados sob refrigeração (REHAGRO, 2005). A presença de leveduras e fungos filamentosos em iogurte é um indicativo de práticas sanitárias insatisfatórias na fabricação ou na embalagem. Iogurtes com açúcar ou frutas adicionados são especialmente susceptíveis ao crescimento de leveduras. (FLEET et al., 1987) Para Furtado (1991), o crescimento de fungos podem causar uma série de problemas: proteólise da casca em alguns tipos de queijos semiduros; aparecimento de manchas de cores variadas; modificação do sabor na região periférica; e rejeição pelo consumidor. Normalmente acredita-se que os fungos de queijos não são patogênicos. Entretanto, fungos da espécie Aspergillus flavus, produtores da aflatoxina B1, já foram observados em queijos, apesar de não ser uma ocorrência comum. Já os gêneros mais comuns de fungos que crescem na superfície de queijos são: Penicillium; Mucor; Aspergillus; Cladosporium; Monillia; Geotrichum (ibid).

2.9 CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO O crescimento de microrganismos no leite cru é geralmente indesejável. De todos os tratamentos conhecidos para reduzir esse crescimento, apenas a redução da temperatura é capaz de fazê-lo no leite cru. O tratamento pelo calor, diferentemente, destrói bactérias (WALSTRA et al, 2006). Os tratamentos térmicos do leite, assim como a refrigeração do leite cru e do leite processado, tornaram o alimento mais seguro para o consumo e aumentaram a durabilidade dos lácteos. A maioria dos microrganismos presentes no leite cru é destruída pela pasteurização. A redução no tempo entre a produção, a pasteurização e a manutenção do leite em baixas temperaturas ajuda a controlar a degradação enzimática do leite cru, causada pelo crescimento de microrganismos sensíveis ao calor.

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Entretanto, segundo Santos e Fonseca (2010b), o simples resfriamento do leite na propriedade não é solução mágica para superar todos os problemas de qualidade do leite e seus derivados. Logicamente que é uma das estratégias mais eficazes para garantir a boa qualidade microbiológica do produto, mas esta prática deve estar associada com medidas de controle de mastite, adequados

procedimentos de higiene durante a ordenha, limpeza e desinfecção adequados dos utensílios e equipamentos de ordenha e boa qualidade da água utilizada na fazenda. Os processos industriais utilizados para o controle das populações microbianas do leite, como o tratamento térmico e a refrigeração, não são suficientes para assegurar a qualidade do leite e de seus derivados, pois nenhum dos processos tem a capacidade de corrigir os problemas da matéria-prima. Portanto, é importante obter-se leite com a melhor qualidade higiênica possível, a qual somente será assegurada quando todos os elos da cadeia, da propriedade à comercialização, estiverem atuando em consonância, o sentido de obter um produto final de excelente nível nutricional e higiênico, e de longa durabilidade. Esforços devem ser feitos para que esses patógenos não estejam presentes no leite cru e que também não sejam introduzidos em outras etapas de beneficiamento do leite e produção de lácteos (REHAGRO, 2005). O leite contém alguns inibidores de crescimento de microrganismos natural. A adição de inibidores de bactérias ao leite, entretanto, não é permitida pelas autoridades de saúde pública pois podem causar riscos à saúde ou desenvolver o chamado “off-flavor”. Apesar da proibição, em alguns países tropicais, altas temperaturas e baixos padrões de higiene prevalecem; ao invés de transportar o leite em boas condições nos momentos e locais necessários para seu processamento, a adição de inibidor bacteriano parece inevitável (SANTOS e FONSECA, 2010b). Conscientes da importância de se identificar os agentes emergentes no leite, a indústria vem se armando através da implementação do chamado programa de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), o qual visa estabelecer um melhor sistema de controle de qualidade dentro das unidades processadoras, atuando sobre os pontos críticos da produção que, por definição, são as fases da produção e processamento que apresentam maiores riscos associados à possível contaminação do leite por microrganismos (SANTOS; FONSECA, 2010a).

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2.10 EPIDEMIOLOGIA

A partir da década de 80, começaram a ser registrados surtos de salmonelose e listeriose associados ao consumo de leite e derivados. Por isso, a temperatura e o tempo de pasteurização foram reavaliados pelo FDA (Food and Drug AdministrationEUA), que recomenda diferentes combinações de tempo e temperatura para oferecer uma margem de segurança ao processo de pasteurização (REHAGRO, 2005). A origem de contaminação do leite e seus derivados por bactérias patogênicas varia com o tipo de produto e processamento, sendo a contaminação de origem endógena ou exógena, sendo esta via ambiente (BRISABOIS et al., 1997). A presença de vários patógenos são relatados em produtos lácteos, principalmente em queijos. Em Belo Horizonte, 168 amostras de queijo Minas foram avaliadas, quanto à quantificação de coliformes fecais, sendo que 110 queijos continham número de coliformes fecais superior ao permitido por lei (PEREIRA et al., 1999). Como evidenciado no trabalho de Pereira et al. (1999) os produtos lácteos têm grande incidência de inconformidades com a legislação vigente. Em 1999 um surto de toxinose, ocorrido nos municípios de Manhuaçu e Passa-Quatro, causada por Staphylococcus aureus veiculado por queijo Minas frescal, foi relatado por Carmo et al. (2002). Também em Minas Gerais, em Nova Serrana, Balter (2000), verificou a ocorrência de glomerulonefrite relacionado à queijos contaminados por

Streptococcus zooepidemicus, após estudar a correlação desses casos com a ingestão de queijos frescos, iogurte e mozzarella. Segundo a ANVISA (BRASIL, 2001) leites fermentados não devem conter valores de coliformes termotolerantes, acima de 10 NMP/mL. Embora não se tenha encontrado na literatura relatos de sobrevivência de coliformes em iogurte ou bebidas lácteas, outros microrganismos são relatados. Dentre eles, encontra-se a Escherichia coli O157: H7 e outras cepas de E. coli que também apresentam a capacidade de sobreviver em alimentos ácidos como o iogurte, por considerável período (LEE & CHEN, 2005). Aleixo e Aver (1996) pesquisaram a ocorrência de E. coli enteropatogênica e enterotoxigênica em 36 amostras de alimentos de origem animal (leite pasteurizado, carne moída e queijo minas frescal). Em 86% das

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amostras analisadas houve presença de E. coli. A positividade para EPEC e ETEC foi de 11 (30%) e 24 (66%), respectivamente. Salmonella sp também é outro microrganismo que possui boa sobrevivência em iogurtes, mesmo com a acidificação provocada pela cultura starter (NASSIB et al., 2006). Além de bactérias, leveduras foram isoladas de várias amostras de iogurte. Foram avaliadas 128 amostras de iogurte e, nessas, foram encontradas leveduras dos gêneros Torulopsis, Kluyveromyces, Saccharomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia, Debaromyces e Sporobolomyces (FLEIT, 1981). Segundo a resolução nº 5, de 13 de novembro de 2000 do Ministério da Agricultura Pecuária e do Abastecimento, os leites fermentados devem apresentar, no mínimo, o número de 106 UFC/mL de bactérias láticas totais, não sendo esse valor alcançado, o produto se encontra em não-conformidade com seu Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade (BRASIL, 2000).

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3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os principais fatores que contribuem para a contaminação do leite e seus produtos derivados são: presença de doenças no rebanho (brucelose, tuberculose, mastite), falta de higiene durante a ordenha, limpeza e sanitização inadequadas dos equipamentos e utensílios de ordenha, má qualidade da água e acondicionamento e transporte em condições inapropriadas do ponto de vista de higiene e temperatura. A qualidade do leite que chega à indústria de processamento é determinada pela qualidade do leite que sai da fazenda. Mesmo após a pasteurização, as enzimas produzidas pelos microrganismos estarão presentes nos produtos lácteos e continuarão a exercer sua ação de degradação dos componentes do leite. Portanto, todos os esforços devem ser feitos para assegurar que o leite que sai da propriedade seja de alta qualidade. A crescente competitividade do mercado nacional somada à pretensão do Brasil em se inserir de vez no mercado internacional de lácteos, faz com que as indústrias busquem, cada vez mais, tecnologias que as tornem mais eficientes. Isto implica em produzir um produto final de excelente qualidade, a um baixo custo e com o maior rendimento industrial possível. Para que isso seja possível, é imprescindível produzir a matéria-prima, o leite, com excelente qualidade.

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